免疫分析に基づいた抗原検出用キット及び抗原検出方法
【課題】捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有して、蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を含む抗原検出用キット、及びこれを利用する抗原検出方法を提供する。
【解決手段】酵素を利用したシグナル増幅のために、両末端が蛍光物質及び蛍光消光物質で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に連結し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮａｓｅ（例えばＲＮａｓｅ Ｈ）を使用して、標的分子の存在時にＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡを切断することによって発生する蛍光シグナルの増加を利用してシグナル増幅を行うことを特徴とする。
【解決手段】酵素を利用したシグナル増幅のために、両末端が蛍光物質及び蛍光消光物質で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に連結し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮａｓｅ（例えばＲＮａｓｅ Ｈ）を使用して、標的分子の存在時にＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡを切断することによって発生する蛍光シグナルの増加を利用してシグナル増幅を行うことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、かつ蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を含む抗原検出用キット、及びこれを利用する抗原検出方法に関するものであって、１つの装置及び１種類のＲＮＡ分解酵素を使用することによって、２種類以上の抗原の分析が可能になることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
免疫分析方法のうちの一つであるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、試料内の分析しようとする特定の物質の量を、その物質の抗体との反応を利用して測定する方法である。ＥＬＩＳＡ法は、Ｅｎｇｖａｌｌらによって初めて開発され、後にＬｊｕｎｇｇｒｅｎやＫｅｍｎｅｙらによってさらに改善された。ＥＬＩＳＡ法の開発以前には、１９６０年代にＲｏｓａｌｙｎ Ｓｕｓｓｍａｎ Ｙａｌｏｗ及びＳｏｌｏｍｏｎ Ｂｅｒｓｏｎが初めて報告して以来、主に放射線同位元素が標識された抗原及び抗体を利用した免疫分析方法が使用されてきたが（Ｙａｌｏｗ Ｒ, Ｂｅｒｓｏｎ Ｓ, Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ. １９６０, ３９, １１５７‐７５）、有害な放射線物質の使用を避けるために、放射線でなく他のシグナルの感知によって分析を行うことができる免疫分析方法の開発が要求され、これによって開発されたＥＬＩＳＡ法は、試料内の多様な標的物質を敏感に検出するために現在最も広く使用される免疫分析法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）のうちの一つである。
【０００３】
一般に、ＥＬＩＳＡ法は、特定の分析物質を酵素が標識された抗体との酵素反応によって発色する基質を使用して検出する工程を伴う。２種類以上の物質をＥＬＩＳＡ法を利用して分析するためには、各々の物質に対する分析工程を別途に行わなければならないため、一つの試料内の、複数の物質の相対的な量を直接比較するのは難しいという問題がある。
【０００４】
一般的な免疫分析方法及びＥＬＩＳＡ法を区分する一つの基準は、酵素によるシグナル増幅工程の有無である。大部分の免疫分析方法は、酵素によるシグナル増幅工程を経ないので、相対的にシグナルの検出感度が高い蛍光シグナルに基づいた分析方法が主流を占める。酵素を利用せずに蛍光シグナルを免疫分析に使用すれば、異なる波長帯で蛍光発散する蛍光物質を、各々異なる物質の抗体に標識して使用することができるので、多様な物質を同時に検出しなければならない多重免疫分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が容易となる。反面、ＥＬＩＳＡ法の場合、基質が酵素によって反応した場合の吸光度または蛍光の変化を測定しなければならないため、多重分析のためには、各々の物質の抗体に、各々異なる基質に選択的に反応する酵素を付着しなければならない。この方法は、多様な酵素−基質ペアを発掘して利用しなければならないので、試料内の分析対象物質の種類が増加するほど、技術的に達成するのが非常に難しくなる。したがって、従来開発された多重分析方法は、蛍光を利用した免疫分析方法が主流を占める。
【０００５】
酵素を使用しない多重免疫分析方法のうちで最も広く知られているものは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社で開発したｘＭＡＰ技術である。この技術は、各々異なる蛍光物質を含む微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）上に、各々の物質に対する抗体を固定化して、物質が抗体と結合した場合の微小球の蛍光色を分析する工程を利用する。しかし、この方法は、高価な装置であるフローサイトメトリーが必要であるため、実験室で容易に取り扱うことができるＥＬＩＳＡ法に比べて費用的な面から非効率的である。これとは別に、最近、多重免疫分析を一つのマイクロプレート上で実行することができる方法が、いくつかの研究グループにより紹介された。Ｓｗａｒｚｍａｎらは、直径６マイクロメートル程度のポリスチレン球に、抗ＩｇＧ抗体を固定化した後、分析物質の捕獲抗体を結合させて、免疫分析に使用することを報告した（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １９９９, ２７１, １４３−１５１）。この方法では、多重分析のために、各々の物質の検出抗体に多様な蛍光物質を付着させて使用した。Ｎｉｃｈｋｏｖａらは、分析しようとする複数の物質に対する各々の抗体に、各々異なる波長の光を発光するＱｄｏｔを連結して、蛍光強度分析によって一つの試料内の多様な物質に対する免疫分析を同時に行う、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＥＬＩＳＡ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を報告した（Ａｎａｌ Ｌｅｔｔ. ２００７, ４０, １４２３‐１４３３）。これらの方法は、酵素によるシグナル増幅工程がないので、従来のＥＬＩＳＡ法に比べて検出限界があまり高くないという短所がある。ＧｅｎＴｅｌ社では、各々異なる蛍光物質を各々の抗体に直接付着させて蛍光強度を分析する、多重免疫分析方法を提供する。
【０００６】
酵素を利用した免疫分析方法であるＥＬＩＳＡ法に基づく多重分析方法には、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が提供する方法がある。この方法は、９６ウェルのマイクロプレートの一つのウェルの底に２０ナノリットル体積の点状配列（ｓｐｏｔ ａｒｒａｙ）を形成させ、一つの点が一つの標的物質に対するＥＬＩＳＡ法による分析結果を表わすようにする。この方法では、ペルオキシダーゼ及び基質の反応によって増幅した発光強度をイメージによって定量することによって、多重ＥＬＩＳＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ‐ＥＬＩＳＡ）フォーマットを提供する。この方法は、マイクロプレートのウェル内に予め点状配列作業が行われたプレートのみが使用されること、及びイメージ獲得及び分析のために高価な装置が必要であるという短所がある。また他の多重ＥＬＩＳＡ法としては、試料内の２種類の物質を分析するために、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが各々連結された２種類の抗体を使用して、酵素によるシグナル増幅によって２種類の物質を同時に検出した（米国特許出願第２００４０２４１７７６Ａ１号）。この方法は、原理的な面では多重ＥＬＩＳＡ法としての意味があるが、実質的に試料内の分析しようとする物質の数が２種類以上に増加する場合、ペルオキシダーゼ及びホスファターゼに対して独立的に反応する酵素を継続して発掘しなければならないだけでなく、多種類の酵素の使用による費用的な面から非効率的である。したがって、より容易な方法で多重免疫分析が可能な、新たな技術の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者は、従来のＥＬＩＳＡ法のような免疫分析方法で使用される抗体が施与された支持体、及び蛍光または吸光を利用する分析機器をそのまま使用すると同時に、一つの酵素のみを使用して多重免疫分析を行うことができる技術を開発した。
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有して、蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を含む抗原検出用キットを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明のまた他の態様は、前記捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有して、蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を使用して抗原を検出する抗原検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、従来のＥＬＩＳＡ法のような免疫分析方法を変形して、抗体を利用した新たな多重免疫分析を可能にする技術に関連するものである。
【００１１】
本発明による技術は、酵素を利用したシグナル増幅のために、従来のＥＬＩＳＡ法で主に利用されるペルオキシダーゼが融合された抗体を使用する代わりに、両末端が蛍光物質及び蛍光消光物質で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に連結し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮａｓｅ（例えばＲＮａｓｅ Ｈ）を使用して、標的分子の存在時にＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡを切断することによって発生する蛍光シグナルの増加を利用してシグナル増幅を行う方法である。このような技術は、酵素の代わりにオリゴヌクレオチドが抗体に連結されるので、「ＯＬＩＳＡ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）」と称する。
【００１２】
本発明のＯＬＩＳＡ法を利用すれば、分析しようとする試料に存在する２種類以上の多様な標的分子（抗原）を同時に検出することができる。２種類以上の抗原に対する各々の抗体に、各々異なる塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結し、前記各々のＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、かつ各々異なる蛍光物質及び蛍光消光物質で両末端が標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを利用すれば、ＲＮａｓｅ Ｈによる蛍光シグナル増幅を利用して、標的物質を多重分析方法によって同時に分析することができる。つまり、本発明によれば、１種類の酵素を用いて検出シグナル増幅工程を行うことにより、試料内の多様な種類の抗原を同時に分析することができる多重免疫分析が可能である。
【００１３】
このために、本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドを利用するＯＬＩＳＡ法に基づく新たな免疫分析方法を提供する。本発明の分析法の一態様は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合した検出抗体（ｄ−Ａｂ−ＤＮＡと称する）、両末端が各々蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ, Ｆ）及び蛍光消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ, Ｑ）で標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑと称する）、及びＲＮａｓｅ Ｈを使用して、検出シグナルを増幅して免疫分析を行う工程を含む。本発明では、ＯＬＩＳＡ法の原理及び実施例、そしてこれを利用した多重ＯＬＩＳＡ法、及びそのための多重ＯＬＩＳＡキットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
ＥＬＩＳＡ法は、現在抗原検出及び医療診断分野で最も幅広く利用されている免疫分析方法の一つであるが、１種類以上の物質をＥＬＩＳＡ技術を利用して分析するためには、各々の物質に該当する分析工程を別に行わなければならないため、一つの試料内の、分析しようとする多様な物質の相対的な量を直接比較するのが難しい。特に最近では、癌、痴呆などのように診断が難しい病気は一つのマーカーによって診断できるわけではなく、多様な関連タンパク質及び生理物質マーカーの増減による相対的な相関関係分析を行った場合にのみ、より正確な診断が可能であるといわれている。このような一つの試料内に存在する多様なマーカーのプロファイリングのためには、マイクロプレートの一つのウェルで多様なマーカーを同時に分析することができる多重ＥＬＩＳＡ法を使用しなければならない。従来の多重ＥＬＩＳＡ法は、多様な酵素−基質ペアを使用して分析を行う方法である反面、本発明で提供する多重ＯＬＩＳＡ法及びそのためのキットは、従来のＥＬＩＳＡ法で利用された形式の、抗体が施与されたマイクロウェルプレート及び蛍光または吸光を利用するマイクロウェルプレート分析機器をそのまま使用しつつ、１種類の酵素だけを使用して多重免疫分析を行うことができる。したがって、従来の方法に比べてより簡単であると同時に、費用を節減することができる。したがって、本発明の多重ＯＬＩＳＡ法は、多様な抗原を同時に検出しなければならない状況、特に多様な診断マーカーを同時に分析しなければならない医療診断分野に大きく貢献する技術である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】多重ＯＬＩＳＡ法の概略図である。
【図２】ＯＬＩＳＡ法を利用した大腸癌マーカーＣＥＡの検出グラフである。
【図３】多重ＯＬＩＳＡ法を利用した大腸癌マーカーＣＥＡ及び前立腺癌マーカーＰＳＡの同時検出グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下で、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
まず、本発明の一態様は、試料内に存在する１または２種類以上の標的物質（抗原）の検出のための、免疫分析に基づく抗原検出用キットに関するものである。
【００１８】
より具体的には、前記抗原検出用キットは、基本的に、支持体と、試料内に存在する標的物質（抗原）に選択的に結合可能で、前記支持体に固定された捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ： ｃ‐Ａｂ）とを含む。前記支持体は、固体基盤の免疫分析方法に通常使用されるものであれば全ての固体支持体が可能であり、従来のＥＬＩＳＡ法で幅広く使用されるマイクロタイタープレートのウェルを支持体として使用することができ、例えば形状によって平底プレート、Ｕ字型底プレート；リガンドあるいはタンパク質のコーティングの有無によってアビジンコーティングプレート（ａｖｉｄｉｎ‐ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、ストレプトアビジンコーティングプレート（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、グルタチオンコーティングプレート（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、抗ＧＳＴコーティングプレート（ａｎｔｉ‐ＧＳＴ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）；基板の材質によってポリスチレンプレート、ポリプロピレンプレート；などが使用されるが、これらに制限されない。捕獲抗体を支持体に固定させる方法には特に制限はなく、免疫分析法に通常使用される全ての方法が可能であり、例えば本発明の一実施例では、支持体に捕獲抗体をコーティングする方法によって固定させることができる。
【００１９】
このように、抗原抗体結合ペアの一方を固体上に固定化して行う方法は、溶液中で混合して行う場合に比べて、体液などの液体試料を利用する診断に適用する場合に特に効果的である。その理由は、溶液中で行う場合には、体液内に存在するＲＮａｓｅによってＤＮＡとの結合有無と関係なくＦ−ＲＮＡ−Ｑが切断されることによって偽陽性シグナル（ｆａｌｓｅ‐ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）が発生する恐れがあるので、正確な検出が難しいためである。これに反して、ＥＬＩＳＡ法及びＯＬＩＳＡ法のように抗体を固体支持体上に固定化して、体液内の抗原を検出すれば、抗体及び抗原が結合するようにした後で、付着しなかった残りの体液及び体液内の、ＲＮａｓｅ等を含む分析を妨害する物質を洗浄によって全て除去した後で、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＦ−ＲＮＡ−Ｑを加えてシグナルを得るので、溶液中でのような偽陽性シグナルが発生する恐れが著しく減少するという利点がある。
【００２０】
前記キットに試料を適用して十分な時間反応させれば、試料内に検出対象抗原が存在する場合には、前記抗原は捕獲抗体に結合するようになる。ここに前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ： ｄ−Ａｂ）及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体（ｄ‐Ａｂ‐ＤＮＡ）を適用すれば、捕獲抗体に結合された抗原の捕獲抗体との結合部位と異なる部位で、前記抗原及び検出抗体が結合して、捕獲抗体−抗原−検出抗体−ＤＮＡ接合体が形成される。ここに、前記検出抗体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）を適用すれば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮＡオリゴヌクレオチドが相補的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成するようになって、捕獲抗体−抗原−検出抗体−ＤＮＡ/Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ接合体が形成される。つまり、本発明では、前記検出抗体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＥＬＩＳＡ法における検出抗体の役割を果たす。
【００２１】
前記形成されたＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖にＲＮＡ分解酵素、例えばＲＮａｓｅ Ｈを処理すれば、前記ＤＮＡと結合されたＲＮＡが分解されて、蛍光物質が遊離して蛍光が発生する。この時に発生した蛍光の強度を測定することによって、標的物質（抗原）の存在の有無の判断及び定量的な分析が可能である。本明細書における「抗原検出」は、抗原の存在の有無の判断だけでなく、抗原の定量的な分析をも含む意味で使用される。
【００２２】
したがって、本発明のキットは、前記支持体−捕獲抗体に加えて、検出抗体−ＤＮＡ接合体、蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体、及びＲＮＡ分解酵素を追加的に含むことができ、これらを全て前記支持体−捕獲抗体と単一の構成で含んだり、これらのうちの１または２種類を前記支持体−捕獲抗体と単一の構成で含み、残りを別個の構成で含んだり、これらを各々別個の構成で含むことができる。
【００２３】
本発明のまた他の一態様は、試料内の特定の抗原（標的物質）の検出方法を提供する。より具体的には、前記検出方法は、以下のステップを含むことができる。
【００２４】
前記検出方法は、
検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体、及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体を、前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−ＤＮＡ接合体を結合させるステップと、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）を、前記捕獲抗体及び検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合した抗原に接触させ、前記ＤＮＡ及びＲＮＡをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成させるステップと、
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖にＲＮＡ分解酵素を処理して、前記二本鎖中のＲＮＡを切断し、前記ＲＮＡから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む。
【００２５】
本発明による検出方法は、単一抗原の存在の有無の判断、及び/または定量的な分析が可能であるだけでなく、検出しようとする抗原が２種類以上である場合にも、１種類のＲＮＡ分解酵素を使用して、１回の施行で、２種類以上の抗原の存在の有無の判断、及び/または定量的な分析が行われる多重分析が可能であるという利点がある。
【００２６】
また、前記のような偽陽性シグナルの発生を防止して検出効率を増加させるために、前記抗原と検出抗体とを結合させるステップ後に、蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体を接触させる前に、未結合試料を洗浄して、試料内のＲＮａｓｅを含む分析を妨害する物質を除去するステップを追加的に含むことができる。
【００２７】
検出しようとする抗原が２種類以上である場合、各々の抗原に特異的に結合された検出抗体と結合する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を、各抗原によって異なるように設計し、各抗原による一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド間で相補的配列が無いように設計して、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合が起こらないようにすることができる。このように抗原によって異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド配列に相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を設計し、その末端を抗原によって異なる蛍光物質で標識すれば、各抗原の存在の有無、または濃度によってその抗原に対応する蛍光物質から発生する蛍光強度が異なるので、１回の施行によって２種類以上の抗原を検出する多重分析が可能になる。
【００２８】
本発明による検出キットまたは検出方法において、検出対象抗原は、免疫分析方法によって検出可能である全ての生体活性物質（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）であって、特別な制限はなく、例えば自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに制限されない。このような抗原を含むか否か、またはその濃度を測定するための対象試料は、いかなる処理も経ていない状態、および／または適切な緩衝溶液によって希釈された状態で使用される。適当な時間でインキュベーションした後で、捕獲抗体とまだ結合していない標的物質及び結合が可能でない試料内の他の物質は、次のステップの前に洗浄して除去するステップを追加的に行うことができる。
【００２９】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記捕獲抗体及び検出抗体は、検出対象抗原に特異的に結合するように製作されたモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体である。前記捕獲抗体及び検出抗体は同一の抗原に結合するが、抗原の互いに異なる部位に結合するように設計することによって、捕獲抗体及び検出抗体が互いに非競争的に抗原に結合し、捕獲抗体−抗原−検出抗体接合体を形成することができるようにするのが望ましい。このように捕獲抗体及び検出抗体が、抗原の互いに異なる部位に結合するようにするために、抗原の互いに異なる部位から由来したエピトープを使用して抗体を製作するなど、関連技術分野で通常使用される全ての技術が使用可能である。最近では、このように一つの抗原の互いに異なる部位に結合する抗体のセットが購入可能であるので、標的物質（抗原）に応じて購入して使用することもできる。
【００３０】
前記検出抗体に結合される一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、標的物質（抗原）と結合された抗体（検出抗体）に連結され、蛍光物質で標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドと相補的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成させることによって、ＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を特異的に認識するＲＮＡ分解酵素がＲＮＡを分解して、蛍光物質を遊離させる役割を果たすものであるので、その配列は特定される必要がない。また、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、その長さにおいても制限はないが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドと効率的に結合して効率的に検出するために、２乃至１０００塩基長、好ましくは５乃至５００塩基長のヌクレオチドからなる。１種類の抗体あたり連結されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの分子数は、平均１または２以上、例えば２乃至１０分子が反復連結される。また、捕獲抗体及びＤＮＡの結合時にＲＮａｓｅ Ｈの作用部位が抗体と近すぎると、ＲＮａｓｅ Ｈ反応に影響を受ける恐れもあるため、このような反応阻害効果を防止するために、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合する部位以外に、５′末端に５乃至５０個、望ましくは１０乃至３０個の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が反復された塩基反復配列を、追加的に含むことができる。この時、Ｇ反復配列の場合には、Ｇ−ｑｕｄｒｕｐｌｅｘのように所望しない二次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成して酵素反応を阻害する恐れがあるため、前記塩基反復配列は、Ａ、Ｔ、またはＣからなるものが好ましいが、これらに制限されるわけではない。
【００３１】
また、前記のように、検出しようとする抗原が２種類以上である場合、各々の抗原に特異的に結合された検出抗体と結合する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は特定される必要はないが、効率的な検出のために、各抗原によって異なるようにし、各抗原による一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列が無いようにして、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合が起こらないように設計するのが望ましい。また、たとえ抗原によって異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的な結合が起こるとしても、そのＤＮＡ−ＤＮＡ間の結合が各ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的に結合するようになるＲＮＡオリゴヌクレオチドとの相補的な結合より安定していないので、ＤＮＡ−ＲＮＡ間の相補的結合が優勢であるように設計することができる。
【００３２】
本発明の一態様において、検出抗体にＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結するために、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合（共有結合）を利用することができる。このような化学結合を利用するためにクロスリンカーを使用することができるが、クロスリンカーの一方の端部は検出抗体とアミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合によって連結され、残りの他方の端部はＤＮＡオリゴヌクレオチドとアミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合によって連結されるようにすることができる。
【００３３】
クロスリンカーは、一般に二つの生体分子を連結するために使用される通常のクロスリンカーの全てが使用可能であり、例えばＳＭＰＨ（サクシニミジル‐６‐［β−マレイミドプロピオナミド］ヘキサノエート：Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＭＰＢ（サクシニミジル‐４‐［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート：Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４‐［ｐ‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ］ｂｕｔｙｒａｔｅ）、スルホ（Ｓｕｌｆｏ）‐ＬＣ‐ＳＰＤＰ（スルホサクシニミジル‐６‐（３’‐［２‐ピリジルジチオ］‐プロピオナミド）ヘキサノエート：Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６‐（３’‐［２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ］‐ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＩＡＢ（Ｎ‐サクシニミジル［４‐ヨードアセチル］アミノベンゾエート：Ｎ‐Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［４‐ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに制限ない。
【００３４】
このような化学結合及び/またはクロスリンカーによってＤＮＡオリゴヌクレオチドが抗体に共有結合で連結されているので、抗原認識時に、抗原−抗体間の複合体上に共有結合によって連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＥＬＩＳＡ法における酵素の役割を果たすことができる。
【００３５】
前記検出抗体−ＤＮＡ接合体は、一般的なＥＬＩＳＡ法で使用する検出抗体の代用として使用され、ここに付着されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、前述の通り、その後の段階で加えられるＦ−ＲＮＡ−Ｑと結合した後、ＲＮａｓｅ Ｈによって、Ｆ−ＲＮＡ−Ｑが基質となるようにする鋳型鎖の役割を果たす。
【００３６】
前記捕獲抗体−抗原複合体に選別的に結合する検出抗体−ＤＮＡ接合体を加え、適当な時間インキュベーティングした後で洗浄して、結合していない余分な検出抗体−ＤＮＡ接合体を除去するステップを追加的に行うことができる。
【００３７】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記蛍光物質及び蛍光消光物質が両末端に標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、前記ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を有するものであるため、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと選択的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成するものでなければならない。
【００３８】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合する蛍光物質は、免疫分析に使用される全ての蛍光物質が可能であり、例えば、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）系蛍光物質（例えば７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリンなど）；キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅ）系蛍光物質（例えばＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）など）；シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）系蛍光物質（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）；Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質（例えばＢｏｄｉｐｙ ＦＬ、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲなど）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２など）；ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質（例えばＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００など）；からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに限定されない。
【００３９】
また、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合する蛍光消光物質は、特に制限されないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質（例えばＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、ＱＳＹ−２１など）、及びＢＨＱ系物質（例えばＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３など）からなる群より選択された１種類以上であり、他にもＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）作用をする蛍光物質（例えばシアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）など）でもかまわない。このような蛍光消光物質は、他方の末端に結合された蛍光物質の種類に応じて決定される。蛍光物質及び蛍光消光物質は、各々５′末端及び３′末端、または３′末端及び５′末端の順序に標識される。
【００４０】
前記で形成された捕獲抗体−抗原−（ｄ−Ａｂ−ＤＮＡ/Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）では、ＲＮＡ一本鎖の一方の末端に標識された蛍光物質（Ｆ）が、他方の末端に標識されて近くに位置した蛍光消光物質によって蛍光が消光されている状態である。ここに、ＲＮａｓｅ ＨなどのＲＮＡ分解酵素を適用して酵素反応を起こせば、ｄ−Ａｂ−ＤＮＡに結合されたＦ−ＲＮＡ−Ｑに対するＲＮａｓｅ Ｈの分解反応が触発され、蛍光物質及び蛍光消光物質の間の距離が遠くなるので、十分な量のＲＮａｓｅ Ｈ及び十分な反応時間を適用した後には増幅された蛍光シグナルを得ることができる。捕獲抗体に結合された抗原の量が検出抗体であるｄ−Ａｂ−ＤＮＡに比例し、ｄ−Ａｂ−ＤＮＡのＤＮＡ量がＲＮａｓｅ ＨによるＦ−ＲＮＡ−Ｑの分解によって得られる蛍光シグナル増幅量に比例するので、結局、抗原の量及び増幅された蛍光シグナルの量の間が比例関係を示すので、結果として得られた蛍光シグナルによって抗原の定量が可能になる。前記ＲＮＡ分解酵素は、適切な緩衝溶液と共に適用されることができ、この時に使用可能な緩衝溶液は、本発明が属する技術分野にて通常に知られたものが使用可能である。
【００４１】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記ＲＮＡ分解酵素は、ＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖に対して特異的にＲＮＡ分解活性を有する全てのＲＮＡ分解酵素が可能であり、例えばＲＮａｓｅ Ｈである。特に、ＲＮａｓｅ Ｈは、配列特異性がないので、多様なＲＮＡ配列が使用される多重分析に非常に有用である。前記ＲＮａｓｅ Ｈは、細胞から抽出して精製されたもの、または再組合タンパク質の形態に発現及び精製されたものを使用することができる。ＲＮａｓｅ Ｈの代表的な例として、Ｅ．ｃｏｌｉから由来したＲＮａｓｅ Ｈ（ｇｅｎｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： Ｖ００３３７, ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ： ２４３‐７０７, ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＡＡ２３６２０）が挙げられるが、これに制限されない。
【００４２】
本発明によって２種類以上の抗原を一度に検出する多重分析（多重ＯＬＩＳＡ）の工程をより詳しく説明する。
【００４３】
まず、前記捕獲抗体は、検出しようとする試料内の多様な抗原を各々選別的に捕獲する多様な抗体が混合された形態の抗体混合物として使用される。多重ＯＬＩＳＡ法のために、前記検出抗体に付着されるＤＮＡオリゴヌクレオチドは、各々の抗原によって各々異なる塩基配列を有するように準備されるが、例えばｄ−Ａｂ１−ＤＮＡ１、ｄ−Ａｂ２−ＤＮＡ２、ｄ−Ａｂ３−ＤＮＡ３、ｄ−Ａｂｎ−ＤＮＡｎ（ｎは検出しようとする抗原の個数）などのように準備される。前記Ｆ−ＲＮＡ−ＱのＲＮＡは、各抗原に選別的に結合した検出抗体であるｄ−Ａｂ−ＤＮＡ内のＤＮＡに相補的な塩基配列を有するように準備する。この時、各ＲＮＡに標識される蛍光物質は、抗原によって互いに異なる波長で発光する物質を使用し、蛍光消光物質は、使用された蛍光物質と適切にセットになるものを使用するが、例えばＦ１−ＲＮＡ１−Ｑ１、Ｆ２−ＲＮＡ２−Ｑ２、Ｆ３−ＲＮＡ３−Ｑ３、Ｆｎ−ＲＮＡｎ−Ｑｎ（ｎは検出しようとする抗原の個数）などのように準備される。１種類の蛍光消光物質の使用によって、多様な蛍光物質の蛍光強度の消光も可能である。
【００４４】
多重ＯＬＩＳＡ法において、ＲＮａｓｅ Ｈによって分解されたＦｎ−ＲＮＡ−Ｑｎから発生及び増幅されたｎ種類の各々の蛍光シグナルを、適切な波長で検出する。各々の捕獲抗体は各々の抗原と結合し、ここに各々の検出抗体が結合して、各々の検出抗体内のＤＮＡに相補的な各々のＦ−ＲＮＡ−Ｑが結合する。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの酵素反応によって得られた各々の蛍光強度は各当該抗原の量に比例する。したがって、試料内に存在する多様な抗原の検出及び定量が、本発明によるＲＮａｓｅ Ｈによる蛍光シグナル増幅を利用した多重ＯＬＩＳＡ法によって可能になる。
【００４５】
従来のＥＬＩＳＡ法によって２種類以上の抗原を一度に検出する多重分析のためには、各抗原別に異なる酵素を使用しなければならないという短所があり、場合によっては、使用された酵素が対応抗原のみに特異的でない場合には、他の抗原の競争的基質として作用する場合もあるため、正確な検出結果を得るのが困難である。しかし、本発明によれば、各抗原別に異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド及びこれと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド、及び配列特異性なくＤＮＡ/ＲＮＡ二重結合を認識してＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈを使用することにより、標的抗原の個数に関係なく、多数の抗原を一度に容易な方法で検出可能であるという利点を有する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００４７】
［実施例１］ＲＮａｓｅ Ｈを利用した一つの抗原のＯＬＩＳＡ法
試料内の癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＣＥＡ, ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ, ＣＥＡ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｒａｄｅ, Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）の検出を以下の方法で行った。
【００４８】
１.１.検出プローブ（Ａｂ−ＤＮＡ）の製作
２.５ｍｇ/ｍＬ濃度の抗体溶液（ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（１）を含む、サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてＢｉｏｄｅｓｉｇｎ社よりセットで提供する製品、Ｃａｔ＃はＭ３７４０１Ｍであり、抗体認識部位は「Ｇｏｌｄ」エピトープグループ５）５０μｌにＰＢＳ緩衝溶液５０μｌ及び１００ｍＭのＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）溶液１μｌを入れた後、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れて、４℃で４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。この工程を３回繰り返して、残った上澄液Ａを取った。
【００４９】
これと同時に、１００μＭのＤＮＡ溶液（含まれているＤＮＡオリゴヌクレオチド配列：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧ−３′、配列番号：１）１００μｌに、１ＭのＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液１５μｌを添加して、常温で１５分間反応させた後、酢酸エチル１００μｌを添加して除去する工程を５回繰り返し、マイクロスピンＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させて、ＤＴＴ及びチオール断片を除去した。残ったＤＮＡ溶液を前記得られた上澄液Ａと混合して、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する工程を４回繰り返した。その結果として残った上澄液が前記モノクロナール抗体（１）及びＤＮＡ断片が接合されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（１）であり、ＯＬＩＳＡ法で検出プローブとして使用した。
【００５０】
１.２.捕獲プローブ及びＲＮＡ接合体の準備及びＯＬＩＳＡ法
ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（２）（サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてＢｉｏｄｅｓｉｇｎ社よりセットで提供する製品、Ｃａｔ＃Ｍ３７１２１Ｍ、抗体認識部位は「Ｇｏｌｄ］エピトープグループ４）をＰＢＳ緩衝溶液に１０μｇ/ｍＬの濃度に入れて９６ウェルのマイクロプレートに１００μｌずつ入れて、４℃で約１５時間保管した。ＰＢＳ緩衝溶液２００μｌで３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）/ＰＢＳ溶液２００μｌを入れて、常温で２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０.０５％（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液に多様な濃度（図２参照）に抗原（ＣＥＡ）を希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。
【００５１】
その後、２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、前記実施例１.１で製作されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（１）溶液を３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳに１/３０に希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ここに４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０.００３％のＢＳＡ、４００ｎＭのフルオレセイン（ＦＡＭ）−ＲＮＡ１−ｄａｂｃｙｌ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド塩基配列：ＦＡＭ−５′−ＣＡＣＵＧＵＧＧＵＵ（配列番号：２）−３′−ｄａｂｃｙｌ、抗体及びＤＮＡの結合によるＲＮａｓｅ Ｈの反応阻害効果を防止するために、ＤＮＡの５′末端に２０個のチミジンを添加した）、及び６ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（タカラバイオ株式会社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ２１５０Ａ）を含む反応液１００μｌを入れて、常温で２時間反応させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ, Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用してフルオレセイン放出波長（励起波長は４８５±１０ｎｍ、吸光波長は５３５±１０ｎｍ）での蛍光を測定した。
【００５２】
このようにして得られた結果を図２に示した。図２で確認できるように、標的物質であるＣＥＡの濃度に比例して蛍光強度が増加することが分かる。したがって、本実施例の方法によってＣＥＡが効率的に検出されることが分かる。
【００５３】
［実施例２］ＲＮａｓｅ Ｈを利用した多重ＯＬＩＳＡ法による一つの試料内の２種類の抗原の同時分析
試料内の癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＣＥＡ）及び前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＰＳＡ, Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ, Ｃａｔ ＃ ３０Ｃ‐ＣＰ１０１７Ｕ）を同時検出するために、以下の操作を行った。
【００５４】
２.１.検出プローブ（Ａｂ−ＤＮＡ）の製作
ＣＥＡ用検出プローブは前記実施例１.１と同一の方法で準備した。
【００５５】
ＰＳＡ用検出プローブは次の方法で準備した。２.２５ｍｇ/ｍＬ濃度の抗体溶液（ＰＳＡに対するモノクロナール抗体（３）を含む、Fitzgeerald社の全てのＰＳＡ分析用に使用される抗体、サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてセットで販売する製品、Ｃａｔ＃は１０−Ｐ２０Ｄである）５０μｌにＰＢＳ緩衝溶液５０μｌ及び１００ｍＭのＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）溶液１μｌを入れた後、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃で４,０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。この工程を３回繰り返して、残った上澄液Ｂを取った。
【００５６】
これと同時に、１００μＭのＤＮＡ溶液（含まれているＤＮＡオリゴヌクレオチド配列：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧ−３′、配列番号：３）１００μｌに１ＭＤＴＴ溶液１５μｌを添加して、常温で１５分間反応させた後、酢酸エチル１００μｌを添加して除去する工程を５回繰り返し、マイクロスピンＧ２５カラムに通過させて、ＤＴＴ及びチオール断片を除去した。残ったＤＮＡ溶液を前記得られた上澄液Ｂと混合して、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する工程を４回繰り返した。その結果として残った上澄液が前記モノクロナール抗体（３）及びＤＮＡ断片が接合されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（２）であり、ＯＬＩＳＡ法でＰＳＡ用検出プローブとして使用した。
【００５７】
２.２.捕獲プローブ及びＲＮＡ接合体の準備及びＯＬＩＳＡ法
ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（２）（実施例１.２参照）及びＰＳＡに対するモノクロナール抗体（４）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社, Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １０‐Ｐ２０Ｅ）をＰＢＳ緩衝溶液に各々１０μｇ/ｍＬの濃度に入れて９６ウェルのマイクロプレートに１００μｌずつ入れて、４℃で約１５時間保管した。２００μｌのＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液２００μｌを入れて、常温で２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０.０５％（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で３回洗浄した後、３％のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液に多様な濃度に各抗原（ＣＥＡ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ＰＳＡ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））を希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。
【００５８】
その後、２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、実施例２.１で製作された各抗原に相当する各々のＡｂ−ＤＮＡ接合体を３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳに１/３０に希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０.００３％のＢＳＡ、１μＭのフルオレセイン−ＲＮＡ１−ｄａｂｃｙｌ及びＲＯＸ−ＲＮＡ２−ＢＨＱ２（ＲＯＸ−５′−ＣＣＣＡＵＡＧＡＧＵ（配列番号：４）−３′−ＢＨＱ２）、そして６ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（タカラバイオ株式会社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ２１５０Ａ））を含む反応液１００μｌを入れて、常温で１時間反応させた後、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ, Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用してフルオレセイン及びＲＯＸの各々の放出波長（フルオレセイン：５３５±１０ｎｍ、ＲＯＸ：５８９±５ｎｍ）での蛍光を測定した。
【００５９】
このようにして得られた結果を図３に示した。図３で確認できるように、標的物質であるＣＥＡ及びＰＳＡの濃度に比例して蛍光強度が増加することが分かる。したがって、本実施例の方法によってＣＥＡ及びＰＳＡが互いに干渉せずに効率的に検出されることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、かつ蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を含む抗原検出用キット、及びこれを利用する抗原検出方法に関するものであって、１つの装置及び１種類のＲＮＡ分解酵素を使用することによって、２種類以上の抗原の分析が可能になることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
免疫分析方法のうちの一つであるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、試料内の分析しようとする特定の物質の量を、その物質の抗体との反応を利用して測定する方法である。ＥＬＩＳＡ法は、Ｅｎｇｖａｌｌらによって初めて開発され、後にＬｊｕｎｇｇｒｅｎやＫｅｍｎｅｙらによってさらに改善された。ＥＬＩＳＡ法の開発以前には、１９６０年代にＲｏｓａｌｙｎ Ｓｕｓｓｍａｎ Ｙａｌｏｗ及びＳｏｌｏｍｏｎ Ｂｅｒｓｏｎが初めて報告して以来、主に放射線同位元素が標識された抗原及び抗体を利用した免疫分析方法が使用されてきたが（Ｙａｌｏｗ Ｒ, Ｂｅｒｓｏｎ Ｓ, Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ. １９６０, ３９, １１５７‐７５）、有害な放射線物質の使用を避けるために、放射線でなく他のシグナルの感知によって分析を行うことができる免疫分析方法の開発が要求され、これによって開発されたＥＬＩＳＡ法は、試料内の多様な標的物質を敏感に検出するために現在最も広く使用される免疫分析法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）のうちの一つである。
【０００３】
一般に、ＥＬＩＳＡ法は、特定の分析物質を酵素が標識された抗体との酵素反応によって発色する基質を使用して検出する工程を伴う。２種類以上の物質をＥＬＩＳＡ法を利用して分析するためには、各々の物質に対する分析工程を別途に行わなければならないため、一つの試料内の、複数の物質の相対的な量を直接比較するのは難しいという問題がある。
【０００４】
一般的な免疫分析方法及びＥＬＩＳＡ法を区分する一つの基準は、酵素によるシグナル増幅工程の有無である。大部分の免疫分析方法は、酵素によるシグナル増幅工程を経ないので、相対的にシグナルの検出感度が高い蛍光シグナルに基づいた分析方法が主流を占める。酵素を利用せずに蛍光シグナルを免疫分析に使用すれば、異なる波長帯で蛍光発散する蛍光物質を、各々異なる物質の抗体に標識して使用することができるので、多様な物質を同時に検出しなければならない多重免疫分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が容易となる。反面、ＥＬＩＳＡ法の場合、基質が酵素によって反応した場合の吸光度または蛍光の変化を測定しなければならないため、多重分析のためには、各々の物質の抗体に、各々異なる基質に選択的に反応する酵素を付着しなければならない。この方法は、多様な酵素−基質ペアを発掘して利用しなければならないので、試料内の分析対象物質の種類が増加するほど、技術的に達成するのが非常に難しくなる。したがって、従来開発された多重分析方法は、蛍光を利用した免疫分析方法が主流を占める。
【０００５】
酵素を使用しない多重免疫分析方法のうちで最も広く知られているものは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社で開発したｘＭＡＰ技術である。この技術は、各々異なる蛍光物質を含む微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）上に、各々の物質に対する抗体を固定化して、物質が抗体と結合した場合の微小球の蛍光色を分析する工程を利用する。しかし、この方法は、高価な装置であるフローサイトメトリーが必要であるため、実験室で容易に取り扱うことができるＥＬＩＳＡ法に比べて費用的な面から非効率的である。これとは別に、最近、多重免疫分析を一つのマイクロプレート上で実行することができる方法が、いくつかの研究グループにより紹介された。Ｓｗａｒｚｍａｎらは、直径６マイクロメートル程度のポリスチレン球に、抗ＩｇＧ抗体を固定化した後、分析物質の捕獲抗体を結合させて、免疫分析に使用することを報告した（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １９９９, ２７１, １４３−１５１）。この方法では、多重分析のために、各々の物質の検出抗体に多様な蛍光物質を付着させて使用した。Ｎｉｃｈｋｏｖａらは、分析しようとする複数の物質に対する各々の抗体に、各々異なる波長の光を発光するＱｄｏｔを連結して、蛍光強度分析によって一つの試料内の多様な物質に対する免疫分析を同時に行う、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＥＬＩＳＡ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を報告した（Ａｎａｌ Ｌｅｔｔ. ２００７, ４０, １４２３‐１４３３）。これらの方法は、酵素によるシグナル増幅工程がないので、従来のＥＬＩＳＡ法に比べて検出限界があまり高くないという短所がある。ＧｅｎＴｅｌ社では、各々異なる蛍光物質を各々の抗体に直接付着させて蛍光強度を分析する、多重免疫分析方法を提供する。
【０００６】
酵素を利用した免疫分析方法であるＥＬＩＳＡ法に基づく多重分析方法には、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が提供する方法がある。この方法は、９６ウェルのマイクロプレートの一つのウェルの底に２０ナノリットル体積の点状配列（ｓｐｏｔ ａｒｒａｙ）を形成させ、一つの点が一つの標的物質に対するＥＬＩＳＡ法による分析結果を表わすようにする。この方法では、ペルオキシダーゼ及び基質の反応によって増幅した発光強度をイメージによって定量することによって、多重ＥＬＩＳＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ‐ＥＬＩＳＡ）フォーマットを提供する。この方法は、マイクロプレートのウェル内に予め点状配列作業が行われたプレートのみが使用されること、及びイメージ獲得及び分析のために高価な装置が必要であるという短所がある。また他の多重ＥＬＩＳＡ法としては、試料内の２種類の物質を分析するために、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが各々連結された２種類の抗体を使用して、酵素によるシグナル増幅によって２種類の物質を同時に検出した（米国特許出願第２００４０２４１７７６Ａ１号）。この方法は、原理的な面では多重ＥＬＩＳＡ法としての意味があるが、実質的に試料内の分析しようとする物質の数が２種類以上に増加する場合、ペルオキシダーゼ及びホスファターゼに対して独立的に反応する酵素を継続して発掘しなければならないだけでなく、多種類の酵素の使用による費用的な面から非効率的である。したがって、より容易な方法で多重免疫分析が可能な、新たな技術の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者は、従来のＥＬＩＳＡ法のような免疫分析方法で使用される抗体が施与された支持体、及び蛍光または吸光を利用する分析機器をそのまま使用すると同時に、一つの酵素のみを使用して多重免疫分析を行うことができる技術を開発した。
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有して、蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を含む抗原検出用キットを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明のまた他の態様は、前記捕獲抗体、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合された検出抗体、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有して、蛍光物質で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡ分解酵素を使用して抗原を検出する抗原検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、従来のＥＬＩＳＡ法のような免疫分析方法を変形して、抗体を利用した新たな多重免疫分析を可能にする技術に関連するものである。
【００１１】
本発明による技術は、酵素を利用したシグナル増幅のために、従来のＥＬＩＳＡ法で主に利用されるペルオキシダーゼが融合された抗体を使用する代わりに、両末端が蛍光物質及び蛍光消光物質で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを抗体に連結し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮａｓｅ（例えばＲＮａｓｅ Ｈ）を使用して、標的分子の存在時にＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡを切断することによって発生する蛍光シグナルの増加を利用してシグナル増幅を行う方法である。このような技術は、酵素の代わりにオリゴヌクレオチドが抗体に連結されるので、「ＯＬＩＳＡ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）」と称する。
【００１２】
本発明のＯＬＩＳＡ法を利用すれば、分析しようとする試料に存在する２種類以上の多様な標的分子（抗原）を同時に検出することができる。２種類以上の抗原に対する各々の抗体に、各々異なる塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結し、前記各々のＤＮＡオリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、かつ各々異なる蛍光物質及び蛍光消光物質で両末端が標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを利用すれば、ＲＮａｓｅ Ｈによる蛍光シグナル増幅を利用して、標的物質を多重分析方法によって同時に分析することができる。つまり、本発明によれば、１種類の酵素を用いて検出シグナル増幅工程を行うことにより、試料内の多様な種類の抗原を同時に分析することができる多重免疫分析が可能である。
【００１３】
このために、本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドを利用するＯＬＩＳＡ法に基づく新たな免疫分析方法を提供する。本発明の分析法の一態様は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合した検出抗体（ｄ−Ａｂ−ＤＮＡと称する）、両末端が各々蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ, Ｆ）及び蛍光消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ, Ｑ）で標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑと称する）、及びＲＮａｓｅ Ｈを使用して、検出シグナルを増幅して免疫分析を行う工程を含む。本発明では、ＯＬＩＳＡ法の原理及び実施例、そしてこれを利用した多重ＯＬＩＳＡ法、及びそのための多重ＯＬＩＳＡキットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
ＥＬＩＳＡ法は、現在抗原検出及び医療診断分野で最も幅広く利用されている免疫分析方法の一つであるが、１種類以上の物質をＥＬＩＳＡ技術を利用して分析するためには、各々の物質に該当する分析工程を別に行わなければならないため、一つの試料内の、分析しようとする多様な物質の相対的な量を直接比較するのが難しい。特に最近では、癌、痴呆などのように診断が難しい病気は一つのマーカーによって診断できるわけではなく、多様な関連タンパク質及び生理物質マーカーの増減による相対的な相関関係分析を行った場合にのみ、より正確な診断が可能であるといわれている。このような一つの試料内に存在する多様なマーカーのプロファイリングのためには、マイクロプレートの一つのウェルで多様なマーカーを同時に分析することができる多重ＥＬＩＳＡ法を使用しなければならない。従来の多重ＥＬＩＳＡ法は、多様な酵素−基質ペアを使用して分析を行う方法である反面、本発明で提供する多重ＯＬＩＳＡ法及びそのためのキットは、従来のＥＬＩＳＡ法で利用された形式の、抗体が施与されたマイクロウェルプレート及び蛍光または吸光を利用するマイクロウェルプレート分析機器をそのまま使用しつつ、１種類の酵素だけを使用して多重免疫分析を行うことができる。したがって、従来の方法に比べてより簡単であると同時に、費用を節減することができる。したがって、本発明の多重ＯＬＩＳＡ法は、多様な抗原を同時に検出しなければならない状況、特に多様な診断マーカーを同時に分析しなければならない医療診断分野に大きく貢献する技術である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】多重ＯＬＩＳＡ法の概略図である。
【図２】ＯＬＩＳＡ法を利用した大腸癌マーカーＣＥＡの検出グラフである。
【図３】多重ＯＬＩＳＡ法を利用した大腸癌マーカーＣＥＡ及び前立腺癌マーカーＰＳＡの同時検出グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下で、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
まず、本発明の一態様は、試料内に存在する１または２種類以上の標的物質（抗原）の検出のための、免疫分析に基づく抗原検出用キットに関するものである。
【００１８】
より具体的には、前記抗原検出用キットは、基本的に、支持体と、試料内に存在する標的物質（抗原）に選択的に結合可能で、前記支持体に固定された捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ： ｃ‐Ａｂ）とを含む。前記支持体は、固体基盤の免疫分析方法に通常使用されるものであれば全ての固体支持体が可能であり、従来のＥＬＩＳＡ法で幅広く使用されるマイクロタイタープレートのウェルを支持体として使用することができ、例えば形状によって平底プレート、Ｕ字型底プレート；リガンドあるいはタンパク質のコーティングの有無によってアビジンコーティングプレート（ａｖｉｄｉｎ‐ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、ストレプトアビジンコーティングプレート（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、グルタチオンコーティングプレート（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）、抗ＧＳＴコーティングプレート（ａｎｔｉ‐ＧＳＴ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）；基板の材質によってポリスチレンプレート、ポリプロピレンプレート；などが使用されるが、これらに制限されない。捕獲抗体を支持体に固定させる方法には特に制限はなく、免疫分析法に通常使用される全ての方法が可能であり、例えば本発明の一実施例では、支持体に捕獲抗体をコーティングする方法によって固定させることができる。
【００１９】
このように、抗原抗体結合ペアの一方を固体上に固定化して行う方法は、溶液中で混合して行う場合に比べて、体液などの液体試料を利用する診断に適用する場合に特に効果的である。その理由は、溶液中で行う場合には、体液内に存在するＲＮａｓｅによってＤＮＡとの結合有無と関係なくＦ−ＲＮＡ−Ｑが切断されることによって偽陽性シグナル（ｆａｌｓｅ‐ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）が発生する恐れがあるので、正確な検出が難しいためである。これに反して、ＥＬＩＳＡ法及びＯＬＩＳＡ法のように抗体を固体支持体上に固定化して、体液内の抗原を検出すれば、抗体及び抗原が結合するようにした後で、付着しなかった残りの体液及び体液内の、ＲＮａｓｅ等を含む分析を妨害する物質を洗浄によって全て除去した後で、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＦ−ＲＮＡ−Ｑを加えてシグナルを得るので、溶液中でのような偽陽性シグナルが発生する恐れが著しく減少するという利点がある。
【００２０】
前記キットに試料を適用して十分な時間反応させれば、試料内に検出対象抗原が存在する場合には、前記抗原は捕獲抗体に結合するようになる。ここに前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ： ｄ−Ａｂ）及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体（ｄ‐Ａｂ‐ＤＮＡ）を適用すれば、捕獲抗体に結合された抗原の捕獲抗体との結合部位と異なる部位で、前記抗原及び検出抗体が結合して、捕獲抗体−抗原−検出抗体−ＤＮＡ接合体が形成される。ここに、前記検出抗体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）を適用すれば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＲＮＡオリゴヌクレオチドが相補的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成するようになって、捕獲抗体−抗原−検出抗体−ＤＮＡ/Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ接合体が形成される。つまり、本発明では、前記検出抗体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＥＬＩＳＡ法における検出抗体の役割を果たす。
【００２１】
前記形成されたＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖にＲＮＡ分解酵素、例えばＲＮａｓｅ Ｈを処理すれば、前記ＤＮＡと結合されたＲＮＡが分解されて、蛍光物質が遊離して蛍光が発生する。この時に発生した蛍光の強度を測定することによって、標的物質（抗原）の存在の有無の判断及び定量的な分析が可能である。本明細書における「抗原検出」は、抗原の存在の有無の判断だけでなく、抗原の定量的な分析をも含む意味で使用される。
【００２２】
したがって、本発明のキットは、前記支持体−捕獲抗体に加えて、検出抗体−ＤＮＡ接合体、蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体、及びＲＮＡ分解酵素を追加的に含むことができ、これらを全て前記支持体−捕獲抗体と単一の構成で含んだり、これらのうちの１または２種類を前記支持体−捕獲抗体と単一の構成で含み、残りを別個の構成で含んだり、これらを各々別個の構成で含むことができる。
【００２３】
本発明のまた他の一態様は、試料内の特定の抗原（標的物質）の検出方法を提供する。より具体的には、前記検出方法は、以下のステップを含むことができる。
【００２４】
前記検出方法は、
検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体、及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体を、前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−ＤＮＡ接合体を結合させるステップと、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体（Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）を、前記捕獲抗体及び検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合した抗原に接触させ、前記ＤＮＡ及びＲＮＡをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成させるステップと、
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖にＲＮＡ分解酵素を処理して、前記二本鎖中のＲＮＡを切断し、前記ＲＮＡから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む。
【００２５】
本発明による検出方法は、単一抗原の存在の有無の判断、及び/または定量的な分析が可能であるだけでなく、検出しようとする抗原が２種類以上である場合にも、１種類のＲＮＡ分解酵素を使用して、１回の施行で、２種類以上の抗原の存在の有無の判断、及び/または定量的な分析が行われる多重分析が可能であるという利点がある。
【００２６】
また、前記のような偽陽性シグナルの発生を防止して検出効率を増加させるために、前記抗原と検出抗体とを結合させるステップ後に、蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体を接触させる前に、未結合試料を洗浄して、試料内のＲＮａｓｅを含む分析を妨害する物質を除去するステップを追加的に含むことができる。
【００２７】
検出しようとする抗原が２種類以上である場合、各々の抗原に特異的に結合された検出抗体と結合する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を、各抗原によって異なるように設計し、各抗原による一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド間で相補的配列が無いように設計して、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合が起こらないようにすることができる。このように抗原によって異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド配列に相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を設計し、その末端を抗原によって異なる蛍光物質で標識すれば、各抗原の存在の有無、または濃度によってその抗原に対応する蛍光物質から発生する蛍光強度が異なるので、１回の施行によって２種類以上の抗原を検出する多重分析が可能になる。
【００２８】
本発明による検出キットまたは検出方法において、検出対象抗原は、免疫分析方法によって検出可能である全ての生体活性物質（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）であって、特別な制限はなく、例えば自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに制限されない。このような抗原を含むか否か、またはその濃度を測定するための対象試料は、いかなる処理も経ていない状態、および／または適切な緩衝溶液によって希釈された状態で使用される。適当な時間でインキュベーションした後で、捕獲抗体とまだ結合していない標的物質及び結合が可能でない試料内の他の物質は、次のステップの前に洗浄して除去するステップを追加的に行うことができる。
【００２９】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記捕獲抗体及び検出抗体は、検出対象抗原に特異的に結合するように製作されたモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体である。前記捕獲抗体及び検出抗体は同一の抗原に結合するが、抗原の互いに異なる部位に結合するように設計することによって、捕獲抗体及び検出抗体が互いに非競争的に抗原に結合し、捕獲抗体−抗原−検出抗体接合体を形成することができるようにするのが望ましい。このように捕獲抗体及び検出抗体が、抗原の互いに異なる部位に結合するようにするために、抗原の互いに異なる部位から由来したエピトープを使用して抗体を製作するなど、関連技術分野で通常使用される全ての技術が使用可能である。最近では、このように一つの抗原の互いに異なる部位に結合する抗体のセットが購入可能であるので、標的物質（抗原）に応じて購入して使用することもできる。
【００３０】
前記検出抗体に結合される一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、標的物質（抗原）と結合された抗体（検出抗体）に連結され、蛍光物質で標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドと相補的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成させることによって、ＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を特異的に認識するＲＮＡ分解酵素がＲＮＡを分解して、蛍光物質を遊離させる役割を果たすものであるので、その配列は特定される必要がない。また、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、その長さにおいても制限はないが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドと効率的に結合して効率的に検出するために、２乃至１０００塩基長、好ましくは５乃至５００塩基長のヌクレオチドからなる。１種類の抗体あたり連結されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの分子数は、平均１または２以上、例えば２乃至１０分子が反復連結される。また、捕獲抗体及びＤＮＡの結合時にＲＮａｓｅ Ｈの作用部位が抗体と近すぎると、ＲＮａｓｅ Ｈ反応に影響を受ける恐れもあるため、このような反応阻害効果を防止するために、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合する部位以外に、５′末端に５乃至５０個、望ましくは１０乃至３０個の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が反復された塩基反復配列を、追加的に含むことができる。この時、Ｇ反復配列の場合には、Ｇ−ｑｕｄｒｕｐｌｅｘのように所望しない二次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成して酵素反応を阻害する恐れがあるため、前記塩基反復配列は、Ａ、Ｔ、またはＣからなるものが好ましいが、これらに制限されるわけではない。
【００３１】
また、前記のように、検出しようとする抗原が２種類以上である場合、各々の抗原に特異的に結合された検出抗体と結合する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は特定される必要はないが、効率的な検出のために、各抗原によって異なるようにし、各抗原による一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列が無いようにして、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合が起こらないように設計するのが望ましい。また、たとえ抗原によって異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的な結合が起こるとしても、そのＤＮＡ−ＤＮＡ間の結合が各ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的に結合するようになるＲＮＡオリゴヌクレオチドとの相補的な結合より安定していないので、ＤＮＡ−ＲＮＡ間の相補的結合が優勢であるように設計することができる。
【００３２】
本発明の一態様において、検出抗体にＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結するために、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合（共有結合）を利用することができる。このような化学結合を利用するためにクロスリンカーを使用することができるが、クロスリンカーの一方の端部は検出抗体とアミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合によって連結され、残りの他方の端部はＤＮＡオリゴヌクレオチドとアミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合などの化学結合によって連結されるようにすることができる。
【００３３】
クロスリンカーは、一般に二つの生体分子を連結するために使用される通常のクロスリンカーの全てが使用可能であり、例えばＳＭＰＨ（サクシニミジル‐６‐［β−マレイミドプロピオナミド］ヘキサノエート：Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＭＰＢ（サクシニミジル‐４‐［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート：Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４‐［ｐ‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ］ｂｕｔｙｒａｔｅ）、スルホ（Ｓｕｌｆｏ）‐ＬＣ‐ＳＰＤＰ（スルホサクシニミジル‐６‐（３’‐［２‐ピリジルジチオ］‐プロピオナミド）ヘキサノエート：Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６‐（３’‐［２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ］‐ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＩＡＢ（Ｎ‐サクシニミジル［４‐ヨードアセチル］アミノベンゾエート：Ｎ‐Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［４‐ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに制限ない。
【００３４】
このような化学結合及び/またはクロスリンカーによってＤＮＡオリゴヌクレオチドが抗体に共有結合で連結されているので、抗原認識時に、抗原−抗体間の複合体上に共有結合によって連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＥＬＩＳＡ法における酵素の役割を果たすことができる。
【００３５】
前記検出抗体−ＤＮＡ接合体は、一般的なＥＬＩＳＡ法で使用する検出抗体の代用として使用され、ここに付着されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、前述の通り、その後の段階で加えられるＦ−ＲＮＡ−Ｑと結合した後、ＲＮａｓｅ Ｈによって、Ｆ−ＲＮＡ−Ｑが基質となるようにする鋳型鎖の役割を果たす。
【００３６】
前記捕獲抗体−抗原複合体に選別的に結合する検出抗体−ＤＮＡ接合体を加え、適当な時間インキュベーティングした後で洗浄して、結合していない余分な検出抗体−ＤＮＡ接合体を除去するステップを追加的に行うことができる。
【００３７】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記蛍光物質及び蛍光消光物質が両末端に標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、前記ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を有するものであるため、前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドと選択的に結合してＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖を形成するものでなければならない。
【００３８】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合する蛍光物質は、免疫分析に使用される全ての蛍光物質が可能であり、例えば、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）系蛍光物質（例えば７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリンなど）；キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅ）系蛍光物質（例えばＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）など）；シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）系蛍光物質（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）；Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質（例えばＢｏｄｉｐｙ ＦＬ、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲなど）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２など）；ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質（例えばＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００など）；からなる群より選択された１種類以上であるが、これらに限定されない。
【００３９】
また、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合する蛍光消光物質は、特に制限されないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質（例えばＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、ＱＳＹ−２１など）、及びＢＨＱ系物質（例えばＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３など）からなる群より選択された１種類以上であり、他にもＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）作用をする蛍光物質（例えばシアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）など）でもかまわない。このような蛍光消光物質は、他方の末端に結合された蛍光物質の種類に応じて決定される。蛍光物質及び蛍光消光物質は、各々５′末端及び３′末端、または３′末端及び５′末端の順序に標識される。
【００４０】
前記で形成された捕獲抗体−抗原−（ｄ−Ａｂ−ＤＮＡ/Ｆ−ＲＮＡ−Ｑ）では、ＲＮＡ一本鎖の一方の末端に標識された蛍光物質（Ｆ）が、他方の末端に標識されて近くに位置した蛍光消光物質によって蛍光が消光されている状態である。ここに、ＲＮａｓｅ ＨなどのＲＮＡ分解酵素を適用して酵素反応を起こせば、ｄ−Ａｂ−ＤＮＡに結合されたＦ−ＲＮＡ−Ｑに対するＲＮａｓｅ Ｈの分解反応が触発され、蛍光物質及び蛍光消光物質の間の距離が遠くなるので、十分な量のＲＮａｓｅ Ｈ及び十分な反応時間を適用した後には増幅された蛍光シグナルを得ることができる。捕獲抗体に結合された抗原の量が検出抗体であるｄ−Ａｂ−ＤＮＡに比例し、ｄ−Ａｂ−ＤＮＡのＤＮＡ量がＲＮａｓｅ ＨによるＦ−ＲＮＡ−Ｑの分解によって得られる蛍光シグナル増幅量に比例するので、結局、抗原の量及び増幅された蛍光シグナルの量の間が比例関係を示すので、結果として得られた蛍光シグナルによって抗原の定量が可能になる。前記ＲＮＡ分解酵素は、適切な緩衝溶液と共に適用されることができ、この時に使用可能な緩衝溶液は、本発明が属する技術分野にて通常に知られたものが使用可能である。
【００４１】
本発明による検出キットまたは検出方法において、前記ＲＮＡ分解酵素は、ＤＮＡ/ＲＮＡ二本鎖に対して特異的にＲＮＡ分解活性を有する全てのＲＮＡ分解酵素が可能であり、例えばＲＮａｓｅ Ｈである。特に、ＲＮａｓｅ Ｈは、配列特異性がないので、多様なＲＮＡ配列が使用される多重分析に非常に有用である。前記ＲＮａｓｅ Ｈは、細胞から抽出して精製されたもの、または再組合タンパク質の形態に発現及び精製されたものを使用することができる。ＲＮａｓｅ Ｈの代表的な例として、Ｅ．ｃｏｌｉから由来したＲＮａｓｅ Ｈ（ｇｅｎｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： Ｖ００３３７, ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ： ２４３‐７０７, ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＡＡ２３６２０）が挙げられるが、これに制限されない。
【００４２】
本発明によって２種類以上の抗原を一度に検出する多重分析（多重ＯＬＩＳＡ）の工程をより詳しく説明する。
【００４３】
まず、前記捕獲抗体は、検出しようとする試料内の多様な抗原を各々選別的に捕獲する多様な抗体が混合された形態の抗体混合物として使用される。多重ＯＬＩＳＡ法のために、前記検出抗体に付着されるＤＮＡオリゴヌクレオチドは、各々の抗原によって各々異なる塩基配列を有するように準備されるが、例えばｄ−Ａｂ１−ＤＮＡ１、ｄ−Ａｂ２−ＤＮＡ２、ｄ−Ａｂ３−ＤＮＡ３、ｄ−Ａｂｎ−ＤＮＡｎ（ｎは検出しようとする抗原の個数）などのように準備される。前記Ｆ−ＲＮＡ−ＱのＲＮＡは、各抗原に選別的に結合した検出抗体であるｄ−Ａｂ−ＤＮＡ内のＤＮＡに相補的な塩基配列を有するように準備する。この時、各ＲＮＡに標識される蛍光物質は、抗原によって互いに異なる波長で発光する物質を使用し、蛍光消光物質は、使用された蛍光物質と適切にセットになるものを使用するが、例えばＦ１−ＲＮＡ１−Ｑ１、Ｆ２−ＲＮＡ２−Ｑ２、Ｆ３−ＲＮＡ３−Ｑ３、Ｆｎ−ＲＮＡｎ−Ｑｎ（ｎは検出しようとする抗原の個数）などのように準備される。１種類の蛍光消光物質の使用によって、多様な蛍光物質の蛍光強度の消光も可能である。
【００４４】
多重ＯＬＩＳＡ法において、ＲＮａｓｅ Ｈによって分解されたＦｎ−ＲＮＡ−Ｑｎから発生及び増幅されたｎ種類の各々の蛍光シグナルを、適切な波長で検出する。各々の捕獲抗体は各々の抗原と結合し、ここに各々の検出抗体が結合して、各々の検出抗体内のＤＮＡに相補的な各々のＦ−ＲＮＡ−Ｑが結合する。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの酵素反応によって得られた各々の蛍光強度は各当該抗原の量に比例する。したがって、試料内に存在する多様な抗原の検出及び定量が、本発明によるＲＮａｓｅ Ｈによる蛍光シグナル増幅を利用した多重ＯＬＩＳＡ法によって可能になる。
【００４５】
従来のＥＬＩＳＡ法によって２種類以上の抗原を一度に検出する多重分析のためには、各抗原別に異なる酵素を使用しなければならないという短所があり、場合によっては、使用された酵素が対応抗原のみに特異的でない場合には、他の抗原の競争的基質として作用する場合もあるため、正確な検出結果を得るのが困難である。しかし、本発明によれば、各抗原別に異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド及びこれと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド、及び配列特異性なくＤＮＡ/ＲＮＡ二重結合を認識してＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈを使用することにより、標的抗原の個数に関係なく、多数の抗原を一度に容易な方法で検出可能であるという利点を有する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００４７】
［実施例１］ＲＮａｓｅ Ｈを利用した一つの抗原のＯＬＩＳＡ法
試料内の癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＣＥＡ, ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ, ＣＥＡ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｒａｄｅ, Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）の検出を以下の方法で行った。
【００４８】
１.１.検出プローブ（Ａｂ−ＤＮＡ）の製作
２.５ｍｇ/ｍＬ濃度の抗体溶液（ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（１）を含む、サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてＢｉｏｄｅｓｉｇｎ社よりセットで提供する製品、Ｃａｔ＃はＭ３７４０１Ｍであり、抗体認識部位は「Ｇｏｌｄ」エピトープグループ５）５０μｌにＰＢＳ緩衝溶液５０μｌ及び１００ｍＭのＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）溶液１μｌを入れた後、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れて、４℃で４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。この工程を３回繰り返して、残った上澄液Ａを取った。
【００４９】
これと同時に、１００μＭのＤＮＡ溶液（含まれているＤＮＡオリゴヌクレオチド配列：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧ−３′、配列番号：１）１００μｌに、１ＭのＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液１５μｌを添加して、常温で１５分間反応させた後、酢酸エチル１００μｌを添加して除去する工程を５回繰り返し、マイクロスピンＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させて、ＤＴＴ及びチオール断片を除去した。残ったＤＮＡ溶液を前記得られた上澄液Ａと混合して、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する工程を４回繰り返した。その結果として残った上澄液が前記モノクロナール抗体（１）及びＤＮＡ断片が接合されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（１）であり、ＯＬＩＳＡ法で検出プローブとして使用した。
【００５０】
１.２.捕獲プローブ及びＲＮＡ接合体の準備及びＯＬＩＳＡ法
ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（２）（サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてＢｉｏｄｅｓｉｇｎ社よりセットで提供する製品、Ｃａｔ＃Ｍ３７１２１Ｍ、抗体認識部位は「Ｇｏｌｄ］エピトープグループ４）をＰＢＳ緩衝溶液に１０μｇ/ｍＬの濃度に入れて９６ウェルのマイクロプレートに１００μｌずつ入れて、４℃で約１５時間保管した。ＰＢＳ緩衝溶液２００μｌで３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）/ＰＢＳ溶液２００μｌを入れて、常温で２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０.０５％（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液に多様な濃度（図２参照）に抗原（ＣＥＡ）を希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。
【００５１】
その後、２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、前記実施例１.１で製作されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（１）溶液を３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳに１/３０に希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ここに４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０.００３％のＢＳＡ、４００ｎＭのフルオレセイン（ＦＡＭ）−ＲＮＡ１−ｄａｂｃｙｌ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド塩基配列：ＦＡＭ−５′−ＣＡＣＵＧＵＧＧＵＵ（配列番号：２）−３′−ｄａｂｃｙｌ、抗体及びＤＮＡの結合によるＲＮａｓｅ Ｈの反応阻害効果を防止するために、ＤＮＡの５′末端に２０個のチミジンを添加した）、及び６ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（タカラバイオ株式会社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ２１５０Ａ）を含む反応液１００μｌを入れて、常温で２時間反応させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ, Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用してフルオレセイン放出波長（励起波長は４８５±１０ｎｍ、吸光波長は５３５±１０ｎｍ）での蛍光を測定した。
【００５２】
このようにして得られた結果を図２に示した。図２で確認できるように、標的物質であるＣＥＡの濃度に比例して蛍光強度が増加することが分かる。したがって、本実施例の方法によってＣＥＡが効率的に検出されることが分かる。
【００５３】
［実施例２］ＲＮａｓｅ Ｈを利用した多重ＯＬＩＳＡ法による一つの試料内の２種類の抗原の同時分析
試料内の癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＣＥＡ）及び前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ, ＰＳＡ, Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ, Ｃａｔ ＃ ３０Ｃ‐ＣＰ１０１７Ｕ）を同時検出するために、以下の操作を行った。
【００５４】
２.１.検出プローブ（Ａｂ−ＤＮＡ）の製作
ＣＥＡ用検出プローブは前記実施例１.１と同一の方法で準備した。
【００５５】
ＰＳＡ用検出プローブは次の方法で準備した。２.２５ｍｇ/ｍＬ濃度の抗体溶液（ＰＳＡに対するモノクロナール抗体（３）を含む、Fitzgeerald社の全てのＰＳＡ分析用に使用される抗体、サンドイッチＥＬＩＳＡ用としてセットで販売する製品、Ｃａｔ＃は１０−Ｐ２０Ｄである）５０μｌにＰＢＳ緩衝溶液５０μｌ及び１００ｍＭのＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｎｉｍｉｄｙｌ‐６‐［β‐ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）溶液１μｌを入れた後、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃で４,０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。この工程を３回繰り返して、残った上澄液Ｂを取った。
【００５６】
これと同時に、１００μＭのＤＮＡ溶液（含まれているＤＮＡオリゴヌクレオチド配列：５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧ−３′、配列番号：３）１００μｌに１ＭＤＴＴ溶液１５μｌを添加して、常温で１５分間反応させた後、酢酸エチル１００μｌを添加して除去する工程を５回繰り返し、マイクロスピンＧ２５カラムに通過させて、ＤＴＴ及びチオール断片を除去した。残ったＤＮＡ溶液を前記得られた上澄液Ｂと混合して、常温で３０分間反応させた。得られた反応液を１５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に希釈してアミコンウルトラ１５（ウルトラセル３０Ｋ）に入れて、４℃、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する工程を４回繰り返した。その結果として残った上澄液が前記モノクロナール抗体（３）及びＤＮＡ断片が接合されたＡｂ−ＤＮＡ接合体（２）であり、ＯＬＩＳＡ法でＰＳＡ用検出プローブとして使用した。
【００５７】
２.２.捕獲プローブ及びＲＮＡ接合体の準備及びＯＬＩＳＡ法
ＣＥＡに対するモノクロナール抗体（２）（実施例１.２参照）及びＰＳＡに対するモノクロナール抗体（４）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社, Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １０‐Ｐ２０Ｅ）をＰＢＳ緩衝溶液に各々１０μｇ/ｍＬの濃度に入れて９６ウェルのマイクロプレートに１００μｌずつ入れて、４℃で約１５時間保管した。２００μｌのＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した後、３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液２００μｌを入れて、常温で２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０.０５％（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で３回洗浄した後、３％のＢＳＡ/ＰＢＳ溶液に多様な濃度に各抗原（ＣＥＡ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ＰＳＡ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））を希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。
【００５８】
その後、２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、実施例２.１で製作された各抗原に相当する各々のＡｂ−ＤＮＡ接合体を３％（ｗ/ｖ）のＢＳＡ/ＰＢＳに１/３０に希釈して、各ウェルに１００μｌずつ入れて、２時間定置させた。２００μｌのＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０.００３％のＢＳＡ、１μＭのフルオレセイン−ＲＮＡ１−ｄａｂｃｙｌ及びＲＯＸ−ＲＮＡ２−ＢＨＱ２（ＲＯＸ−５′−ＣＣＣＡＵＡＧＡＧＵ（配列番号：４）−３′−ＢＨＱ２）、そして６ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（タカラバイオ株式会社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ２１５０Ａ））を含む反応液１００μｌを入れて、常温で１時間反応させた後、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ, Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用してフルオレセイン及びＲＯＸの各々の放出波長（フルオレセイン：５３５±１０ｎｍ、ＲＯＸ：５８９±５ｎｍ）での蛍光を測定した。
【００５９】
このようにして得られた結果を図３に示した。図３で確認できるように、標的物質であるＣＥＡ及びＰＳＡの濃度に比例して蛍光強度が増加することが分かる。したがって、本実施例の方法によってＣＥＡ及びＰＳＡが互いに干渉せずに効率的に検出されることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、
抗原に選択的に結合して、前記支持体に固定された捕獲抗体と、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合する検出抗体及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体と、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体と、
ＲＮａｓｅ Ｈ
とを含む、抗原検出用キット。
【請求項２】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上である、請求項１に記載の抗原検出用キット。
【請求項３】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝体、遺伝体、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された２種類以上であり、
２種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項２に記載の抗原検出用キット。
【請求項４】
検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、各々の抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項３に記載の抗原検出用キット。
【請求項５】
前記検出抗体及びＤＮＡオリゴヌクレオチドは、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、及びチオエーテル結合からなる群より選択された１種類以上の化学結合によって結合されたものである、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項６】
前記検出抗体及びＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、及びＳＩＡＢからなる群より選択される１種類以上のクロスリンカーによって連結される、請求項５に記載の抗原検出用キット。
【請求項７】
前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質、及びＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質からなる群より選択された１種類以上である、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項８】
前記蛍光消光物質は、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質、ＢＨＱ系物質、及びＦＲＥＴからなる群より選択された１種類以上である、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項９】
検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体を前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−ＤＮＡ接合体を結合させるステップと、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体を前記捕獲抗体及び検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合した抗原に接触させ、前記ＤＮＡとＲＮＡをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成させるステップと、
ＲＮａｓｅ Ｈで処理することによって前記二本鎖中のＲＮＡを切断し、前記ＲＮＡから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む、抗原検出方法。
【請求項１０】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上である、請求項９に記載の抗原検出方法。
【請求項１１】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された２種類以上であり、
各々の抗原によって異なる蛍光物質と結合されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、２種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗原検出方法。
【請求項１２】
前記２種類以上の抗原に対する各々の検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項１１に記載の抗原検出方法。
【請求項１３】
前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質、及びＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質からなる群より選択された１種類以上である、請求項９乃至１２のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
【請求項１４】
前記蛍光消光物質は、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質、ＢＨＱ系物質、及びＦＲＥＴからなる群より選択された１種類以上である、請求項９乃至１２のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
【請求項１】
支持体と、
抗原に選択的に結合して、前記支持体に固定された捕獲抗体と、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合する検出抗体及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体と、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体と、
ＲＮａｓｅ Ｈ
とを含む、抗原検出用キット。
【請求項２】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上である、請求項１に記載の抗原検出用キット。
【請求項３】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝体、遺伝体、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された２種類以上であり、
２種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項２に記載の抗原検出用キット。
【請求項４】
検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、各々の抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項３に記載の抗原検出用キット。
【請求項５】
前記検出抗体及びＤＮＡオリゴヌクレオチドは、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合、及びチオエーテル結合からなる群より選択された１種類以上の化学結合によって結合されたものである、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項６】
前記検出抗体及びＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、及びＳＩＡＢからなる群より選択される１種類以上のクロスリンカーによって連結される、請求項５に記載の抗原検出用キット。
【請求項７】
前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質、及びＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質からなる群より選択された１種類以上である、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項８】
前記蛍光消光物質は、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質、ＢＨＱ系物質、及びＦＲＥＴからなる群より選択された１種類以上である、請求項１乃至４のうちのいずれか一つに記載の抗原検出用キット。
【請求項９】
検出しようとする抗原に選択的に結合可能な捕獲抗体に試料を接触させて、試料内の抗原及び捕獲抗体を結合させるステップと、
前記捕獲抗体と異なる部位で前記抗原に選択的に結合可能な検出抗体及び一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合された検出抗体−ＤＮＡ接合体を前記捕獲抗体と結合した抗原に接触させて、抗原及び検出抗体−ＤＮＡ接合体を結合させるステップと、
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一方の末端に結合された蛍光物質、及び前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他方の末端に結合された蛍光消光物質からなる蛍光物質−ＲＮＡ−蛍光消光物質接合体を前記捕獲抗体及び検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合した抗原に接触させ、前記ＤＮＡとＲＮＡをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成させるステップと、
ＲＮａｓｅ Ｈで処理することによって前記二本鎖中のＲＮＡを切断し、前記ＲＮＡから蛍光物質を遊離させて蛍光を発生させるステップと、
前記発生した蛍光強度を測定するステップ
とを含む、抗原検出方法。
【請求項１０】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された１種類以上である、請求項９に記載の抗原検出方法。
【請求項１１】
前記抗原は、自己抗体、リガンド、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、金属イオン、合成薬物、天然薬物、代謝物、遺伝子、ウイルス及びウイルスによる生成物、並びにバクテリア及びバクテリアによる生成物からなる群より選択された２種類以上であり、
各々の抗原によって異なる蛍光物質と結合されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、２種類以上の抗原を同時に検出可能であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗原検出方法。
【請求項１２】
前記２種類以上の抗原に対する各々の検出抗体−ＤＮＡ接合体に結合されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、抗原によって異なる塩基配列を有して、異なる抗原に対する検出抗体に連結されたＤＮＡオリゴヌクレオチド間の相補的配列を含まないことを特徴とする、請求項１１に記載の抗原検出方法。
【請求項１３】
前記蛍光物質は、クマリン系蛍光物質、キサンテン系蛍光物質、シアニン系蛍光物質、Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光物質、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質、及びＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ系蛍光物質からなる群より選択された１種類以上である、請求項９乃至１２のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
【請求項１４】
前記蛍光消光物質は、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ系物質、ＢＨＱ系物質、及びＦＲＥＴからなる群より選択された１種類以上である、請求項９乃至１２のうちのいずれか一つに記載の抗原検出方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−３３６１３（Ｐ２０１１−３３６１３Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０３４３４（Ｐ２０１０−１０３４３４）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】３９−１ Ｈａｗｏｌｇｏｋ−ｄｏｎｇ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １３６−７９１ＫＯＲＥＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】３９−１ Ｈａｗｏｌｇｏｋ−ｄｏｎｇ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １３６−７９１ＫＯＲＥＡ
【Ｆターム（参考）】
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