免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法
【課題】化学発光あるいは電気化学発光物質のように標識物質自体が検出シグナルを発する標識物質をヒンジ法に用いても、高い検出シグナルを得ることが出来る免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を提供する
【解決手段】抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬。
【解決手段】抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体標識法におけるビオチン・アビジンの結合反応を用いた免疫分析試薬及び免疫分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体標識法は、抗体に酵素・蛍光物質・化学発光物質・電気化学発光物質等の標識物質を結合した標識抗体を、抗原と抗原抗体反応させ、抗原濃度に応じて結合した標識抗体から発せられるシグナルを検出する高感度免疫分析法である。
【０００３】
抗体に酵素を標識した酵素標識抗体を用いる酵素免疫分析法は、酵素が有する基質に対する触媒活性の高さから容易に高感度分析ができる。しかしながら、酵素の安定性や、抗体に対して酵素の分子サイズが大きいことにより、抗原抗体反応の立体阻害を生じる等の理由から、近年では、分子サイズの小さいイソルミノールやアクリジニウムエステル等の化学発光物質を標識した化学発光免疫分析法や、分子サイズが小さくかつ比較的安定なトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体のような電気化学発光物質を抗体に標識した電気化学発光免疫分析法が実用化されている。
【０００４】
更に、抗体標識法には、ビオチン・アビジン反応を利用し、ビオチン標識抗体と、標識物質を修飾したアビジンの二試薬を用いたものがある。これは、酵素のような巨大分子の標識物質を抗体に直接結合した標識抗体は、抗原抗体反応の際に立体障害等により反応を阻害されるが、結合の強いビオチン・アビジン反応利用することで、立体障害等の反応を阻害することなく抗原を検出することができる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
一方、抗体への標識方法には、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つがある。ヒンジ法は、抗体フラグメントＦａｂ’あるいは抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2のヒンジ部のチオール基に標識物質を結合させ、ノンヒンジ法は、抗体のアミノ基またはカルボキシル基に標識体を結合させる方法である。ノンヒンジ法では、標識物質と結合が出来る反応活性なアミノ基が多いため、数多くの標識物質を導入することができる反面、抗原認識部のアミノ基に標識による修飾が生じるので、抗体の特異性が低下する。更に、抗体のＦｃ領域が、非特異吸着が増加する要因となる。そのため、抗原認識部とはならないヒンジ部のチオール基に標識を結合させ、Ｆｃ領域を除去したヒンジ法が行われている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
この方法を用いると、（１）標識を結合させても抗体の活性が保持されること、（２）抗体のＦｃ領域を除去しているため非特異吸着が抑制されること、（３）標識時に生じる抗体が重合したポリマー形成が起こりにくい等の利点がある。そのため、非特異結合によるシグナル増加が抑えられるため、広く利用されている。
【特許文献１】特開昭５８−３０６６７号公報
【特許文献２】特開昭５３−４４６２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、ヒンジ部のチオール基のみを選択的に利用しているため、アミノ基標識を行うノンヒンジ法に比べて、標識物質の結合量が少ない。そのため、標識物質に酵素のような基質生成反応する物質を用いれば、高い検出シグナルを得ることができる。しかし、化学発光あるいは電気化学発光物質のような標識物質自体の発光を検出シグナルとする場合は、検出シグナルが低いため検出感度が低下してしまうという、課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、化学発光あるいは電気化学発光物質のように標識物質自体が検出シグナルを発する標識物質をヒンジ法に用いても、高い検出シグナルを得ることが出来る免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法は、抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含むことを特徴としたものである。
【００１０】
また、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法は、分析サンプルを固相固定化抗体で捕捉する捕捉工程と、前記分析サンプルとビオチン導入抗体フラグメントと前記固相固定化抗体とを結合して複合体を形成する複合体形成工程と、前記複合体にアビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンを結合するビオチン・アビジン反応工程と、前記複合体に結合した標識物質導入アビジンから発生したシグナルを分析する分析工程と、からなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法によれば、ヒンジ法のような標識物質の結合量が低い標識方法を用いて、化学発光物質や電気化学発光物質等、標識物質そのものが、シグナルを発する場合においても、高いシグナルを保持した免疫分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。なお、本発明における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との双方を含む意味で用いている。
【００１３】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態における免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を示したものである。図１を用いて、本発明の測定原理を説明する。
【００１４】
図１において、１は固相固定化抗体であり、２は分析サンプルである。本発明での分析サンプルは、固相固定化抗体及びビオチン導入抗体フラグメントと特異的に結合できるものであれば良い。このようなものとして、抗原及び抗体がある。３は抗体フラグメントＦａｂ’であり、４は抗体フラグメントＦａｂ’が持つヒンジ部の反応活性基なチオール基を示す。５は抗体フラグメントＦａｂ’の反応活性基なチオール基とビオチンとの間の架橋であり、６は架橋されたビオチンを示す。
【００１５】
本発明では、３〜６の複合体をビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’という。また、７はアビジン、８はアビジンが持つ反応活性なアミノ基、９はこの反応活性なアミノ基と標識物質との架橋部であり、１０は架橋された標識物質である。１１はアビジンが持つ反応活性なカルボキシル基、１２はこの反応活性なカルボキシル基と標識物質との架橋部であり、１０は架橋された標識物質である。本発明では、７〜１２からなる複合体を標識物質導入アビジンという。
【００１６】
この標識物質導入アビジンは、ストレプトアビジン中のカルボキシル基及びアミノ基に対し、それぞれアミノ基及びカルボキシル基のリンカーを有するトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を標識した標識物質導入アビジンを導入した標識物質導入アビジンを用いた。分析サンプルには、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α（以下、ＴＮＦ−αと略す）を用いた。なお、固相固定化抗体の固相には、反応物と未反応物を容易に分離できる磁性ビーズを用いて行った。
【００１７】
アビジンへの標識は、化学修飾法が利用できる。このような化学修飾法として、例えば、カルボキシル基を修飾させた標識物質とアビジン中に存在するアミノ基とをアミド結合により標識する方法がある。また、アミノ基を修飾させた標識物質とアビジン中に存在するカルボキシル基とをアミド結合により標識する方法や、アミノ基を修飾させた標識物質とアビジン中のアミノ基に対してグルタルアルデヒドによりアミノ基同士を架橋する方法等がある。本発明では、カルボキシル基及びアミノ基を修飾したトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体をそれぞれ合成し、ストレプトアビジン中の反応活性なアミノ基及びカルボキシル基に対し、それぞれアミド結合により導入した。
【００１８】
次に、本発明に用いる標識物質の分子サイズは、発光種が０．５〜２ｎｍまでが好ましい。アビジン分子サイズが約６．０×５．５×４ｎｍであるので、このサイズの標識物質でなければ、ビオチン・アビジン反応時に標識物質同士が重なり合って立体障害を起こして、ビオチン・アビジン反応を阻害するからである。なお、本発明の実施の形態１においては、標識剤に電気化学発光物質を用いたが、化学発光物質を使用しても同様に高いシグナルが得られる。
【００１９】
また、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を用いた説明をしたが、ビオチン導入抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2あるいは還元抗体を用いても同様の効果が得られる。しかし、非特異吸着の要因の観点からビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、ビオチン導入抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2を用いることが望ましい。
【００２０】
以上説明した、ビオチン導入抗体フラグメントと標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬を用いた免疫分析方法を説明する。まず、図１の上段に示すように、抗原抗体反応により、固相固定化抗体１に抗原２を補足させる（捕捉工程）。抗原２が捕捉された固相固定化抗体１に対し、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’（３〜６）を抗原抗体反応させることにより、図１の中段に示すような複合体を形成させる（複合体形成工程）。次に形成した複合体中のビオチンに対し、図１の下段に示すように、標識物質導入アビジン（７〜１２）を結合させる（ビオチン・アビジン反応工程）。ビオチン・アビジン工程を経た複合体の標識物質から発するシグナルを検出することにより、抗原２の存在量を検出することにより免疫分析を行うものである。
【００２１】
次に、本発明で試用する試薬の具体的な調製方法を説明する。
【００２２】
＜アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体の合成＞
アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化１）は以下の手順により得た。
【００２３】
【化１】
【００２４】
テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略す）６０．０ｍｌに溶解させた４，４´−ジメチル−２，２´ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍｌ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、氷冷しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７．２％）。
【００２５】
次に窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍｌを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬ及び蒸留水２００ｍｌで洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１．５％）。
【００２６】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２´−ビピリジ
ン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍｌ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、１８時間４℃に冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍｌ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに１６時間４℃で静置した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た(収率６８．２％)。
【００２７】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｃ０．
７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍｌを加えた。９時間窒素雰囲気で還
流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。
この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。
【００２８】
さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを
１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍｌ（４．２１ｍｍ
ｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍｌ加え、メタノールを留去
した。
【００２９】
次に、濃塩酸を５．０ｍｌ加え、２時間還流して得られた反応液を４℃で１６時間静置し、析出した不純物を自然ろ過で除去した。
【００３０】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、蒸留水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、目的物である標識剤（化１）を得た(収率７１．４％)。
【００３１】
表１は、前述のようにして得た標識剤（化１）の1Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００３２】
【表１】
【００３３】
＜カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体の合成＞
カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化２）は、以下の手順により得た。
【００３４】
【化２】
【００３５】
遮光容器に、上記で調製したアミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化１）０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍｌに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００３６】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、（化２）を得た (収率８７．５％)。
【００３７】
表２は、前述のようにして得た標識剤（化２）の1Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００３８】
【表２】
【００３９】
＜トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体導入ストレプトアビジンの調製＞
標識物質導入アビジンである（トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体標識ストレプトアビジンは、以下の手順により得た。
【００４０】
アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体１．３ｍｇを５００ｕｌの精製水に溶解し、トリエチルアミン［以下、ＴＥＡと略す］１ｕｌを加える。次に、ストレプトアビジン１ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）３００ｕｌに溶解し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解した１．７ｍｇ／ｍｌのジチオビス（スクシンイミジルウンデカネート）［以下、ＮＨＳと略す］を１００ｕｌ及び、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解した１４ｍｇ／ｍｌ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［以下、ＷＳＣと略す］１００ｕｌを順に、ストレプトアビジンに加え、室温で３０分間反応させた。次に、反応させたストレプトアビジンとＲｕ−ＮＨ2とをあわせ、一晩反応させる。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析（分画分子量：１００００）を行った。
【００４１】
透析が完了したストレプトアビジンに対し、ＴＥＡ１ｕｌ加える。次に、カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体１．４５ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００ｕｌに溶解し、１．７ｍｇ／ｍｌＮＨＳ１００ｕｌ、及び１４ｍｇ／ｍｌＷＳＣ１００ｕｌを順に加え、室温で３０分間反応させた。次に反応させたＲｕ−ＣＯＯＨとストレプトアビジンを混合させ、一晩反応させる。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析（分画分子量：１００００）を行い、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体標識ストレプトアビジンを調製した。
【００４２】
＜抗体フラグメントＦａｂ’の調製＞
抗体フラグメントＦａｂ’は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍｏｕｓｅ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α，Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｌｙ（クローン：２８４０１）を用い、ＰＩＥＲＣＥ製ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂ ａｎｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて調製した。
【００４３】
＜ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’の調製＞
調製した抗体フラグメントＦａｂ’のビオチン導入化は、同仁化学研究所製Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨを用いて行った。
【００４４】
＜ＴＮＦ−αの免疫分析＞
以上の方法で調製した試薬を用いて、ＴＮＦ−αの免疫分析を、次の手順で行った。
【００４５】
磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）を２５ｕｌ（１×１０7ｂｅａｄｓ）採取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２度洗浄後、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｏａｔ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｙ（クローン：１７１−Ｐ１７９８）１００μｇを加えた。２４時間反応して、磁性ビーズ上にＧｏａｔ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｙ（クローン：１７１−Ｐ１７９８）を固定化した後、０．２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡを含有した０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）と、０．１％ＢＳＡを含有した０．２ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。その後、１％ＢＳＡを含有した０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で磁性ビーズ表面をブロッキングし、抗体固定化磁性ビーズを調製した。以後の免疫分析には、１アッセイ５×１０5ｂｅａｄｓを使用した。
【００４６】
分析サンプルであるＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ−αを、１％ＢＳＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、それぞれ、５０００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌの分析サンプル溶液を調製し、そのうち５００ｕｌを抗体固定化磁性ビーズに加え、２５℃、１時間、抗原抗体反応させた。
【００４７】
抗原抗体反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄した。
【００４８】
その後、０．５ｕｇ／ｍｌの調製したビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を５００ｕｌ加え、更に２５℃、１時間、抗原抗体反応させた。
【００４９】
抗原抗体反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄した。
【００５０】
次いで、調製した１ｍｇ／ｍｌのトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体導入ストレプトアビジンを５００ｕｌ加え、２５℃、３０分間、反応させた。
【００５１】
反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄し、１０ｕｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に反応が終了した磁性ビーズを懸濁させた。
【００５２】
懸濁させた磁性ビーズを２．５ｕｌ採取し、金電極チップの作用極（直径３ｍｍ）に滴下し、６５℃、５分間放置し、電極面を焼き付けた。なお、使用した金電極チップは、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成させ、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを用いた。
【００５３】
その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．１ＭＴＥＡからなる電解質溶液８０μＬを滴下し、０Ｖ〜１．３Ｖまで電圧走査し、５秒間の電気化学発光量を測定した。なお、電気化学発光量の測定には、光電子倍増管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における発光量積分値を分析した。
【００５４】
なお、コントロールとして、ストレプトアビジン中のカルボキシル基に対し、アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を標識させたストレプトアビジン同様の手順で、ＴＮＦ−αの免疫分析も行った。図２及び表３に本発明の実施の形態１における免疫分析結果を示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３に示すように、従来例では、ＴＮＦ−αを加えていないサンプル（ＴＮＦ−α濃度０）の発光量積分値が５６４０ＲＬＵ（発光量最大値は５７ＲＬＵ）に対し、ＴＮＦ−α濃度が５ｐｇ／ｍｌのサンプルの発光量積分値が５７１１ＲＬＵ（発光量最大値は５９ＲＬＵ）だった。一方、本発明では、ＴＮＦ−α濃度０のサンプルの発光量積分値は、６２９６ＲＬＵ（発光量最大値は６９ＲＬＵ）と従来技術とほぼ同一の値を示した。ところが、ＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌのサンプルでは、その発光量積分値が１４５１６ＲＬＵ（発光量最大値は２１６ＲＬＵ）と極めて高い値が得られた。従って、本発明を用いると、従来技術では、検出できなかったＴＮＦ−α濃度０とＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌとサンプルを明確に区別することが出来る。さらに、ＴＮＦ−α濃度が高くなるに従いＴＮＦ−α濃度に比例して発光量が増加した。
【００５７】
表３に示した結果を図示したものが図２である。横軸は対数目盛である。従来技術では、ＴＮＦ−α濃度５０ｐｇ／ｍｌ以上のサンプルでないと濃度と発光量積分値との間に比例関係は見られない。しかし、本発明手法を用いることで、ＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌ以上サンプルから濃度と発光量積分値との間に比例関係が見られるようになる。すなわち、本発明手法を用いれば、測定可能な濃度がＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌのサンプルまで広げられることを示している。
【００５８】
以上のことから、本発明の免疫分析法及びそれを用いた免疫分析法は、５ｐｇ／ｍｌ以下という低濃度のＴＮＦ−αを測定することが出来た。一方、従来例であるコントロールで検出できるＴＮＦ−αの濃度の限界は５０ｐｇ／ｍｌと、本発明より一桁濃度が高い。すなわち、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析法を用いることで、従来に比べて一桁高い検出シグナルを得ることができるので、低濃度の分析サンプルを感度よく分析することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明にかかる免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析法は、高いシグナルを発するため、標識率の低いＦａｂ化抗体を用いても、高感度に抗原を測定でき、食品・臨床検査分野等の免疫分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施の形態１における免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を示した図
【図２】本発明の実施の形態１における免疫分析結果を示す図
【符号の説明】
【００６１】
１ 固相固定化抗体
２ 分析サンプル
３ 抗体フラグメントＦａｂ’
４ 抗体フラグメントＦａｂ’が有するヒンジ部の反応活性なチオール基
５ 抗体フラグメントＦａｂ’が有するヒンジ部の反応活性なチオール基とビオチンとの架橋部
６ ビオチン
７ アビジン
８ アビジンが有する反応活性なアミノ基
９ アビジンが有する反応活性なアミノ基と標識物質との架橋部
１０ 標識物質
１１ アビジンが有する反応活性なカルボキシル基
１２ アビジンが有する反応活性なカルボキシル基と標識物質との架橋部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体標識法におけるビオチン・アビジンの結合反応を用いた免疫分析試薬及び免疫分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体標識法は、抗体に酵素・蛍光物質・化学発光物質・電気化学発光物質等の標識物質を結合した標識抗体を、抗原と抗原抗体反応させ、抗原濃度に応じて結合した標識抗体から発せられるシグナルを検出する高感度免疫分析法である。
【０００３】
抗体に酵素を標識した酵素標識抗体を用いる酵素免疫分析法は、酵素が有する基質に対する触媒活性の高さから容易に高感度分析ができる。しかしながら、酵素の安定性や、抗体に対して酵素の分子サイズが大きいことにより、抗原抗体反応の立体阻害を生じる等の理由から、近年では、分子サイズの小さいイソルミノールやアクリジニウムエステル等の化学発光物質を標識した化学発光免疫分析法や、分子サイズが小さくかつ比較的安定なトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体のような電気化学発光物質を抗体に標識した電気化学発光免疫分析法が実用化されている。
【０００４】
更に、抗体標識法には、ビオチン・アビジン反応を利用し、ビオチン標識抗体と、標識物質を修飾したアビジンの二試薬を用いたものがある。これは、酵素のような巨大分子の標識物質を抗体に直接結合した標識抗体は、抗原抗体反応の際に立体障害等により反応を阻害されるが、結合の強いビオチン・アビジン反応利用することで、立体障害等の反応を阻害することなく抗原を検出することができる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
一方、抗体への標識方法には、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つがある。ヒンジ法は、抗体フラグメントＦａｂ’あるいは抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2のヒンジ部のチオール基に標識物質を結合させ、ノンヒンジ法は、抗体のアミノ基またはカルボキシル基に標識体を結合させる方法である。ノンヒンジ法では、標識物質と結合が出来る反応活性なアミノ基が多いため、数多くの標識物質を導入することができる反面、抗原認識部のアミノ基に標識による修飾が生じるので、抗体の特異性が低下する。更に、抗体のＦｃ領域が、非特異吸着が増加する要因となる。そのため、抗原認識部とはならないヒンジ部のチオール基に標識を結合させ、Ｆｃ領域を除去したヒンジ法が行われている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
この方法を用いると、（１）標識を結合させても抗体の活性が保持されること、（２）抗体のＦｃ領域を除去しているため非特異吸着が抑制されること、（３）標識時に生じる抗体が重合したポリマー形成が起こりにくい等の利点がある。そのため、非特異結合によるシグナル増加が抑えられるため、広く利用されている。
【特許文献１】特開昭５８−３０６６７号公報
【特許文献２】特開昭５３−４４６２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、ヒンジ部のチオール基のみを選択的に利用しているため、アミノ基標識を行うノンヒンジ法に比べて、標識物質の結合量が少ない。そのため、標識物質に酵素のような基質生成反応する物質を用いれば、高い検出シグナルを得ることができる。しかし、化学発光あるいは電気化学発光物質のような標識物質自体の発光を検出シグナルとする場合は、検出シグナルが低いため検出感度が低下してしまうという、課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、化学発光あるいは電気化学発光物質のように標識物質自体が検出シグナルを発する標識物質をヒンジ法に用いても、高い検出シグナルを得ることが出来る免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法は、抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含むことを特徴としたものである。
【００１０】
また、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法は、分析サンプルを固相固定化抗体で捕捉する捕捉工程と、前記分析サンプルとビオチン導入抗体フラグメントと前記固相固定化抗体とを結合して複合体を形成する複合体形成工程と、前記複合体にアビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンを結合するビオチン・アビジン反応工程と、前記複合体に結合した標識物質導入アビジンから発生したシグナルを分析する分析工程と、からなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法によれば、ヒンジ法のような標識物質の結合量が低い標識方法を用いて、化学発光物質や電気化学発光物質等、標識物質そのものが、シグナルを発する場合においても、高いシグナルを保持した免疫分析が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。なお、本発明における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との双方を含む意味で用いている。
【００１３】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態における免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を示したものである。図１を用いて、本発明の測定原理を説明する。
【００１４】
図１において、１は固相固定化抗体であり、２は分析サンプルである。本発明での分析サンプルは、固相固定化抗体及びビオチン導入抗体フラグメントと特異的に結合できるものであれば良い。このようなものとして、抗原及び抗体がある。３は抗体フラグメントＦａｂ’であり、４は抗体フラグメントＦａｂ’が持つヒンジ部の反応活性基なチオール基を示す。５は抗体フラグメントＦａｂ’の反応活性基なチオール基とビオチンとの間の架橋であり、６は架橋されたビオチンを示す。
【００１５】
本発明では、３〜６の複合体をビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’という。また、７はアビジン、８はアビジンが持つ反応活性なアミノ基、９はこの反応活性なアミノ基と標識物質との架橋部であり、１０は架橋された標識物質である。１１はアビジンが持つ反応活性なカルボキシル基、１２はこの反応活性なカルボキシル基と標識物質との架橋部であり、１０は架橋された標識物質である。本発明では、７〜１２からなる複合体を標識物質導入アビジンという。
【００１６】
この標識物質導入アビジンは、ストレプトアビジン中のカルボキシル基及びアミノ基に対し、それぞれアミノ基及びカルボキシル基のリンカーを有するトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を標識した標識物質導入アビジンを導入した標識物質導入アビジンを用いた。分析サンプルには、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α（以下、ＴＮＦ−αと略す）を用いた。なお、固相固定化抗体の固相には、反応物と未反応物を容易に分離できる磁性ビーズを用いて行った。
【００１７】
アビジンへの標識は、化学修飾法が利用できる。このような化学修飾法として、例えば、カルボキシル基を修飾させた標識物質とアビジン中に存在するアミノ基とをアミド結合により標識する方法がある。また、アミノ基を修飾させた標識物質とアビジン中に存在するカルボキシル基とをアミド結合により標識する方法や、アミノ基を修飾させた標識物質とアビジン中のアミノ基に対してグルタルアルデヒドによりアミノ基同士を架橋する方法等がある。本発明では、カルボキシル基及びアミノ基を修飾したトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体をそれぞれ合成し、ストレプトアビジン中の反応活性なアミノ基及びカルボキシル基に対し、それぞれアミド結合により導入した。
【００１８】
次に、本発明に用いる標識物質の分子サイズは、発光種が０．５〜２ｎｍまでが好ましい。アビジン分子サイズが約６．０×５．５×４ｎｍであるので、このサイズの標識物質でなければ、ビオチン・アビジン反応時に標識物質同士が重なり合って立体障害を起こして、ビオチン・アビジン反応を阻害するからである。なお、本発明の実施の形態１においては、標識剤に電気化学発光物質を用いたが、化学発光物質を使用しても同様に高いシグナルが得られる。
【００１９】
また、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を用いた説明をしたが、ビオチン導入抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2あるいは還元抗体を用いても同様の効果が得られる。しかし、非特異吸着の要因の観点からビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’、ビオチン導入抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2を用いることが望ましい。
【００２０】
以上説明した、ビオチン導入抗体フラグメントと標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬を用いた免疫分析方法を説明する。まず、図１の上段に示すように、抗原抗体反応により、固相固定化抗体１に抗原２を補足させる（捕捉工程）。抗原２が捕捉された固相固定化抗体１に対し、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’（３〜６）を抗原抗体反応させることにより、図１の中段に示すような複合体を形成させる（複合体形成工程）。次に形成した複合体中のビオチンに対し、図１の下段に示すように、標識物質導入アビジン（７〜１２）を結合させる（ビオチン・アビジン反応工程）。ビオチン・アビジン工程を経た複合体の標識物質から発するシグナルを検出することにより、抗原２の存在量を検出することにより免疫分析を行うものである。
【００２１】
次に、本発明で試用する試薬の具体的な調製方法を説明する。
【００２２】
＜アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体の合成＞
アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化１）は以下の手順により得た。
【００２３】
【化１】
【００２４】
テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略す）６０．０ｍｌに溶解させた４，４´−ジメチル−２，２´ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍｌ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、氷冷しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７．２％）。
【００２５】
次に窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍｌを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬ及び蒸留水２００ｍｌで洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１．５％）。
【００２６】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２´−ビピリジ
ン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍｌ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、１８時間４℃に冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍｌ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに１６時間４℃で静置した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た(収率６８．２％)。
【００２７】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｃ０．
７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍｌを加えた。９時間窒素雰囲気で還
流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。
この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。
【００２８】
さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを
１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍｌ（４．２１ｍｍ
ｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍｌ加え、メタノールを留去
した。
【００２９】
次に、濃塩酸を５．０ｍｌ加え、２時間還流して得られた反応液を４℃で１６時間静置し、析出した不純物を自然ろ過で除去した。
【００３０】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、蒸留水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、目的物である標識剤（化１）を得た(収率７１．４％)。
【００３１】
表１は、前述のようにして得た標識剤（化１）の1Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００３２】
【表１】
【００３３】
＜カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体の合成＞
カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化２）は、以下の手順により得た。
【００３４】
【化２】
【００３５】
遮光容器に、上記で調製したアミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体（化１）０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍｌに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００３６】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、（化２）を得た (収率８７．５％)。
【００３７】
表２は、前述のようにして得た標識剤（化２）の1Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００３８】
【表２】
【００３９】
＜トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体導入ストレプトアビジンの調製＞
標識物質導入アビジンである（トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体標識ストレプトアビジンは、以下の手順により得た。
【００４０】
アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体１．３ｍｇを５００ｕｌの精製水に溶解し、トリエチルアミン［以下、ＴＥＡと略す］１ｕｌを加える。次に、ストレプトアビジン１ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）３００ｕｌに溶解し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解した１．７ｍｇ／ｍｌのジチオビス（スクシンイミジルウンデカネート）［以下、ＮＨＳと略す］を１００ｕｌ及び、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解した１４ｍｇ／ｍｌ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［以下、ＷＳＣと略す］１００ｕｌを順に、ストレプトアビジンに加え、室温で３０分間反応させた。次に、反応させたストレプトアビジンとＲｕ−ＮＨ2とをあわせ、一晩反応させる。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析（分画分子量：１００００）を行った。
【００４１】
透析が完了したストレプトアビジンに対し、ＴＥＡ１ｕｌ加える。次に、カルボキシル基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体１．４５ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００ｕｌに溶解し、１．７ｍｇ／ｍｌＮＨＳ１００ｕｌ、及び１４ｍｇ／ｍｌＷＳＣ１００ｕｌを順に加え、室温で３０分間反応させた。次に反応させたＲｕ−ＣＯＯＨとストレプトアビジンを混合させ、一晩反応させる。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析（分画分子量：１００００）を行い、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体標識ストレプトアビジンを調製した。
【００４２】
＜抗体フラグメントＦａｂ’の調製＞
抗体フラグメントＦａｂ’は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍｏｕｓｅ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α，Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｌｙ（クローン：２８４０１）を用い、ＰＩＥＲＣＥ製ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂ ａｎｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて調製した。
【００４３】
＜ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’の調製＞
調製した抗体フラグメントＦａｂ’のビオチン導入化は、同仁化学研究所製Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨを用いて行った。
【００４４】
＜ＴＮＦ−αの免疫分析＞
以上の方法で調製した試薬を用いて、ＴＮＦ−αの免疫分析を、次の手順で行った。
【００４５】
磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）を２５ｕｌ（１×１０7ｂｅａｄｓ）採取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２度洗浄後、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｏａｔ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｙ（クローン：１７１−Ｐ１７９８）１００μｇを加えた。２４時間反応して、磁性ビーズ上にＧｏａｔ由来Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α Ｈｕｍａｎ−Ｐｏｙ（クローン：１７１−Ｐ１７９８）を固定化した後、０．２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡを含有した０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）と、０．１％ＢＳＡを含有した０．２ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。その後、１％ＢＳＡを含有した０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で磁性ビーズ表面をブロッキングし、抗体固定化磁性ビーズを調製した。以後の免疫分析には、１アッセイ５×１０5ｂｅａｄｓを使用した。
【００４６】
分析サンプルであるＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ−αを、１％ＢＳＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、それぞれ、５０００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌの分析サンプル溶液を調製し、そのうち５００ｕｌを抗体固定化磁性ビーズに加え、２５℃、１時間、抗原抗体反応させた。
【００４７】
抗原抗体反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄した。
【００４８】
その後、０．５ｕｇ／ｍｌの調製したビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ’を５００ｕｌ加え、更に２５℃、１時間、抗原抗体反応させた。
【００４９】
抗原抗体反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄した。
【００５０】
次いで、調製した１ｍｇ／ｍｌのトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体導入ストレプトアビジンを５００ｕｌ加え、２５℃、３０分間、反応させた。
【００５１】
反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３度洗浄し、１０ｕｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に反応が終了した磁性ビーズを懸濁させた。
【００５２】
懸濁させた磁性ビーズを２．５ｕｌ採取し、金電極チップの作用極（直径３ｍｍ）に滴下し、６５℃、５分間放置し、電極面を焼き付けた。なお、使用した金電極チップは、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成させ、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを用いた。
【００５３】
その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．１ＭＴＥＡからなる電解質溶液８０μＬを滴下し、０Ｖ〜１．３Ｖまで電圧走査し、５秒間の電気化学発光量を測定した。なお、電気化学発光量の測定には、光電子倍増管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における発光量積分値を分析した。
【００５４】
なお、コントロールとして、ストレプトアビジン中のカルボキシル基に対し、アミノ基修飾トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を標識させたストレプトアビジン同様の手順で、ＴＮＦ−αの免疫分析も行った。図２及び表３に本発明の実施の形態１における免疫分析結果を示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３に示すように、従来例では、ＴＮＦ−αを加えていないサンプル（ＴＮＦ−α濃度０）の発光量積分値が５６４０ＲＬＵ（発光量最大値は５７ＲＬＵ）に対し、ＴＮＦ−α濃度が５ｐｇ／ｍｌのサンプルの発光量積分値が５７１１ＲＬＵ（発光量最大値は５９ＲＬＵ）だった。一方、本発明では、ＴＮＦ−α濃度０のサンプルの発光量積分値は、６２９６ＲＬＵ（発光量最大値は６９ＲＬＵ）と従来技術とほぼ同一の値を示した。ところが、ＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌのサンプルでは、その発光量積分値が１４５１６ＲＬＵ（発光量最大値は２１６ＲＬＵ）と極めて高い値が得られた。従って、本発明を用いると、従来技術では、検出できなかったＴＮＦ−α濃度０とＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌとサンプルを明確に区別することが出来る。さらに、ＴＮＦ−α濃度が高くなるに従いＴＮＦ−α濃度に比例して発光量が増加した。
【００５７】
表３に示した結果を図示したものが図２である。横軸は対数目盛である。従来技術では、ＴＮＦ−α濃度５０ｐｇ／ｍｌ以上のサンプルでないと濃度と発光量積分値との間に比例関係は見られない。しかし、本発明手法を用いることで、ＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌ以上サンプルから濃度と発光量積分値との間に比例関係が見られるようになる。すなわち、本発明手法を用いれば、測定可能な濃度がＴＮＦ−α濃度５ｐｇ／ｍｌのサンプルまで広げられることを示している。
【００５８】
以上のことから、本発明の免疫分析法及びそれを用いた免疫分析法は、５ｐｇ／ｍｌ以下という低濃度のＴＮＦ−αを測定することが出来た。一方、従来例であるコントロールで検出できるＴＮＦ−αの濃度の限界は５０ｐｇ／ｍｌと、本発明より一桁濃度が高い。すなわち、本発明の免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析法を用いることで、従来に比べて一桁高い検出シグナルを得ることができるので、低濃度の分析サンプルを感度よく分析することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明にかかる免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析法は、高いシグナルを発するため、標識率の低いＦａｂ化抗体を用いても、高感度に抗原を測定でき、食品・臨床検査分野等の免疫分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施の形態１における免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法を示した図
【図２】本発明の実施の形態１における免疫分析結果を示す図
【符号の説明】
【００６１】
１ 固相固定化抗体
２ 分析サンプル
３ 抗体フラグメントＦａｂ’
４ 抗体フラグメントＦａｂ’が有するヒンジ部の反応活性なチオール基
５ 抗体フラグメントＦａｂ’が有するヒンジ部の反応活性なチオール基とビオチンとの架橋部
６ ビオチン
７ アビジン
８ アビジンが有する反応活性なアミノ基
９ アビジンが有する反応活性なアミノ基と標識物質との架橋部
１０ 標識物質
１１ アビジンが有する反応活性なカルボキシル基
１２ アビジンが有する反応活性なカルボキシル基と標識物質との架橋部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、
アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬。
【請求項２】
前記官能基が、カルボキシル基とアミノ基である請求項１に記載の免疫分析試薬。
【請求項３】
前記標識物質が、前記カルボキシル基とアミノ基のそれぞれに架橋されている請求項２に記載の免疫分析試薬。
【請求項４】
前記標識物質は、発光種の分子サイズが０．５ｎｍから２ｎｍの範囲である請求項１に記載の免疫分析試薬。
【請求項５】
前記抗体フラグメントは、抗体フラグメントＦａｂ’、抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2あるいは還元抗体である請求項１〜４に記載の免疫分析試薬。
【請求項６】
前記アビジンは、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又はリコンビナントアビジンである請求項１〜５に記載の免疫分析試薬。
【請求項７】
前記標識物質は、化学発光物質若しくは電気化学発光物質である請求項１及び４に記載の免疫分析試薬。
【請求項８】
前記電気化学発光物質は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペレリン、ビナフチル、オクタテトラエン、ゲルマニウム粒子、シリコン粒子のいずれかである請求項７に記載の免疫分析試薬。
【請求項９】
前記金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である請求項８に記載の免疫分析試薬。
【請求項１０】
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン、金属フェナントロリン錯体のいずれかである請求項９に記載の免疫分析試薬。
【請求項１１】
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである請求項８〜１０に記載の免疫分析試薬。
【請求項１２】
分析サンプルを固相固定化抗体で捕捉する捕捉工程と、
前記分析サンプルとビオチン導入抗体フラグメントと前記固相固定化抗体とを結合して複合体を形成する複合体形成工程と、
前記複合体にアビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンを結合するビオチン・アビジン反応工程と、
前記複合体に結合した標識物質導入アビジンから発生したシグナルを分析する分析工程と、
からなる免疫分析方法。
【請求項１３】
前記分析サンプルは、固相固定化抗体及びビオチン導入抗体フラグメントと特異的に結合できる化合物を含む請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１４】
前記化合物は、抗原あるいは抗体のいずれか一方である請求項１３に記載の免疫分析方法。
【請求項１５】
前記ビオチン導入抗体フラグメントは、抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなる請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１６】
前記官能基が、カルボキシル基とアミノ基である請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１７】
前記標識物質が、前記カルボキシル基とアミノ基のそれぞれに架橋されている請求項１６に記載の免疫分析方法。
【請求項１８】
前記標識物質は、発光種の分子サイズが０．５ｎｍから２ｎｍの範囲である請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１】
抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなるビオチン導入抗体フラグメントと、
アビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンとを含む免疫分析試薬。
【請求項２】
前記官能基が、カルボキシル基とアミノ基である請求項１に記載の免疫分析試薬。
【請求項３】
前記標識物質が、前記カルボキシル基とアミノ基のそれぞれに架橋されている請求項２に記載の免疫分析試薬。
【請求項４】
前記標識物質は、発光種の分子サイズが０．５ｎｍから２ｎｍの範囲である請求項１に記載の免疫分析試薬。
【請求項５】
前記抗体フラグメントは、抗体フラグメントＦａｂ’、抗体フラグメント（Ｆａｂ’）2あるいは還元抗体である請求項１〜４に記載の免疫分析試薬。
【請求項６】
前記アビジンは、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又はリコンビナントアビジンである請求項１〜５に記載の免疫分析試薬。
【請求項７】
前記標識物質は、化学発光物質若しくは電気化学発光物質である請求項１及び４に記載の免疫分析試薬。
【請求項８】
前記電気化学発光物質は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペレリン、ビナフチル、オクタテトラエン、ゲルマニウム粒子、シリコン粒子のいずれかである請求項７に記載の免疫分析試薬。
【請求項９】
前記金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である請求項８に記載の免疫分析試薬。
【請求項１０】
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン、金属フェナントロリン錯体のいずれかである請求項９に記載の免疫分析試薬。
【請求項１１】
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである請求項８〜１０に記載の免疫分析試薬。
【請求項１２】
分析サンプルを固相固定化抗体で捕捉する捕捉工程と、
前記分析サンプルとビオチン導入抗体フラグメントと前記固相固定化抗体とを結合して複合体を形成する複合体形成工程と、
前記複合体にアビジンの反応活性な官能基に架橋された標識物質とからなる標識物質導入アビジンを結合するビオチン・アビジン反応工程と、
前記複合体に結合した標識物質導入アビジンから発生したシグナルを分析する分析工程と、
からなる免疫分析方法。
【請求項１３】
前記分析サンプルは、固相固定化抗体及びビオチン導入抗体フラグメントと特異的に結合できる化合物を含む請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１４】
前記化合物は、抗原あるいは抗体のいずれか一方である請求項１３に記載の免疫分析方法。
【請求項１５】
前記ビオチン導入抗体フラグメントは、抗体フラグメントの反応活性なカルボキシル基あるいはチオール基の少なくともいずれか一方に架橋されたビオチンとからなる請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１６】
前記官能基が、カルボキシル基とアミノ基である請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１７】
前記標識物質が、前記カルボキシル基とアミノ基のそれぞれに架橋されている請求項１６に記載の免疫分析方法。
【請求項１８】
前記標識物質は、発光種の分子サイズが０．５ｎｍから２ｎｍの範囲である請求項１２に記載の免疫分析方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１０７２０７（Ｐ２０１０−１０７２０７Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７６４０９（Ｐ２００８−２７６４０９）
【出願日】平成２０年１０月２８日（２００８．１０．２８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２８日（２００８．１０．２８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]