本開示は、組換えアデノウイルスの導入遺伝子に対する免疫応答を増強するため、かつ既存する抗アデノウイルス免疫を避けるためのアデノウイルスタンパク質の修飾に関する。一部の実施形態は、組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来する組換えアデノウイルスに関し、該組換えアデノウイルプラスミドベクターは、異種プロモーターに作用可能に連結したマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質またはその抗原部分と、修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質とをコードするヌクレオチド配列を含み、マラリア原虫スポロゾイト周囲の免疫原性エピトーブがカプシドタンパク質またはコアタンパク質の少なくとも一部に挿入されるか、または一部を置換する。別の実施形態は、上述の実施形態による組換えアデノウイルスを含む医薬組成物またはマラリアワクチン組成物に関する。さらなる実施形態は、上述の実施形態による医薬組成物またはマラリアワクチン組成物の治療量を投与することを含む、マラリアの治療法、予防法、または診断法を含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学および生物工学の分野に関する。より詳しくは、本発明はマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質などのマラリア寄生虫抗原に対して強力な免疫応答を誘発するためのカプシド修飾型アデノウイルスベクターの使用に関する。該ベクターはマラリアに対するワクチンに適している。
優先権主張
本出願は、２００９年８月１８日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／０５４２１２に対する優先権を主張し、かつ一部継続出願である。該国際出願の全体を完全に記述するように参照によって本明細書に組み入れる。

米国連邦政府による委託研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所の一部である国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって与えられた助成金番号１Ｒ０１Ａ１０８１５１０−０１Ａ１の下で政府支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、世界中の熱帯で最も蔓延している感染症に入る重篤な疾患である。毎年、およそ３億〜５億の人々が感染し、罹患率と死亡率が比較的高い。重度の罹患率と死亡率は、特に幼児と、これまでにマラリアに曝露されたことがないマラリア流行地に移住した成人に起こっている。世界保健機構（ＷＨＯ）では、アフリカだけでマラリアによる小児の死亡数が毎年２００万〜３００万人と推定している。多くの国では、薬剤耐性寄生虫（熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、最近では三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）も）および殺虫剤耐性ベクター（ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）蚊）によってもたらされるマラリアの広範な発生および発生率の増加のため、この疾患を制御する新規の方法を開発する必要性が強調されているる（ＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇおよびＬｏｎｇ １９９４）。
【０００３】
マラリア寄生虫は、前赤内期、赤血球期および生殖期の寄生形態からなる複雑なライフサイクルを有し、これらの形態はマラリアワクチンの開発のための潜在的標的を表す。前赤内期、赤血球期の形態は宿主内で見られるが、生殖形態はベクター内で起こる。弱毒化照射したスポロゾイト（ＩｒＳｐ）の生ワクチンによる免疫化は、マウスにおいて（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇら １９６７）、非ヒト霊長類（Ｇｗａｄｚら １９７９）およびヒト（（Ｃｌｙｄｅら １９７３、Ｅｄｅｌｍａｎら １９９３）において無菌の防御作用（すなわち、寄生体の攻撃に対する完全な耐性）を誘発することが示された。ＩｒＳｐによって与えられる防御作用は、体液性（Ｂ細胞）および細胞性（Ｔ細胞）の両免疫応答によるスポロゾイト中和によって媒介される（Ｔｓｕｊｉら ２００１）。ＩｒＳｐワクチン接種は魅力ある解決策ではあるが、スポロゾイトを採取する唯一の方法は蚊唾液腺を詳細に分析することにより、かつ大量のスポロゾイトをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる技術で現在知られているものはない。したがって、マラリアに対して同様に強い防御免疫を誘発することができる代替ワクチンのベクターが必要とされる。
【０００４】
かかるワクチンベクターの有望な標的の１つは、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパクであり、該タンパク質はスポロゾイトの表面に発現される。有効な中和抗体は、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の免疫優性で、種特異的な反復ドメインに向けられる。熱帯熱マラリア原虫（ヒトマラリア寄生虫）において、反復（ＮＡＮＰ）_ｎは、世界のすべての領域に由来する分離株の間で保存されている。この中心反復はＢ細胞エピトープの複数の反復を含み、したがってＣＳタンパク質はＢ細胞を誘発することによって強い体液性免疫反応を誘発することができる（Ｔｓｕｊｉら ２００１）。ＣＳタンパク質のＣ末端領域では、いくつかのＴ細胞エピトープが存在し、該エピトープが細胞性免疫応答を著しく誘発することができる（Ｔｓｕｊｉら ２００１）。体液性（抗体）応答は、肝細胞に入る前にスポロゾイト（細胞外寄生体）の感染力と相互作用して、中和することによって寄生虫を除去することができるが、一方細胞性（Ｔ細胞）応答は、インターフェロンγを分泌することによってＥＥＦ（細胞内寄生体）を攻撃することができる。これらの免疫応答は、ＥＥＦが成熟し、急速に分裂して、血液に再度浸入して赤血球に感染する何千ものメロゾイトを形成して、我々がマラリアと認識する疾患を引き起こすことを防ぐ。
【０００５】
現在ヒト臨床試験を受けているＣＳをベースにしたマラリアワクチンの１種は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社のＲＴＳ、Ｓ、Ｂ型肝炎表面抗原の融合タンパク質、およびウイルス様の粒子の形態での熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）の一部（１９９２年１１月１１日に、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｓ．Ａ．に対して出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ１９９２／００２５９１号）であり、臨床試験においてマラリア感染症を減少させることが示されている（Ａｌｏｎｓｏら ２００４， Ａｌｏｎｓｏら ２００５， Ｂｅｊｏｎら２００８）。ＲＴＳ、Ｓは、抗ＰｆＣＳＰ体液性免疫応答を誘発するが、ＰｆＣＳＰ特異的細胞（ＣＤ８＋）応答は比較的弱い（Ｋｅｓｔｅら ２００８）。これは、ＲＴＳ、Ｓによる防御作用が比較的弱いことが理由でありうる。対照的に、アデノウイルスベースのマラリアワクチンは、防御細胞性免疫応答を誘発することができる（２００３年１２月１６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０５１０１９号、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７）。しかし、現在のところマラリアワクチンとしてアデノウイルスベースのプラットフォームの利用を限定する障害が２つある：（１）導入遺伝子産物に対する強力な体液性免疫応答を誘発する能力の欠如と、（２）アデノウイルス、特に、アデノウイルスベースのワクチンの免疫原性を妨害するアデノウイルス血清型５に対する既存免疫との２つである。
【０００６】
アデノウイルスによって誘発される体液性免疫応答を増強する試みの中で最近なされている１つのアプローチは、Ｂ細胞抗原エピトープ（たとえば、細菌エピトープまたはウイルスエピトープ）をＨｅｘｏｎ、Ｆｉｂｅｒ、ＰｅｎｔｏｎおよびｐＩＸなどのアデノウイルスカプシドタンパク質に挿入することである（Ｗｏｒｇａｌｌら ２００５， ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら ２００６、Ｋｒａｕｓｅら２００６、Ｗｏｒｇａｌｌら ２００７）。
【０００７】
加えて、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に対する既存免疫を避けるために、アデノウイルス血清型１１、３５、２６、４８、４９および５０などの低い血清有病率を有する他のアデノウイルス血清型が、ワクチンプラットフォームとして評価され、抗Ａｄ５免疫が存在するにもかかわらず導入遺伝子に対する免疫応答を誘発することが示された（２００５年１０月１２日にＣｒｕｃｅｌｌ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂ．Ｖ．に対して出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５５１８３号）。既存の抗Ａｄ５免疫を回避するために、中和抗体の標的カプシドタンパク質であるＡｄ５ Ｈｅｘｏｎと他の血清型のそれとの置換が構築された（Ｗｕら ２００２、Ｒｏｂｅｒｔｓら ２００６）。
【０００８】
しかし、アデノウイルスベクターを上述のマラリアワクチンに適用する際に同時に前述の２つの障害を克服したと報告される改良型アデノウイルスベクターはない。マラリア流行地においてＡｄ５に対する血清有病率が高い（Ｏｐｈｏｒｓｔら ２００６）ことを考慮すると、アデノウイルスに対する既存免疫の存在下で、防御体液性免疫応答および細胞性免疫応答の双方を誘発するアデノウイルスベースのマラリアワクチンが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、組換えアデノウイルスワクチンの導入遺伝子に対する免疫応答を増強し、かつ既存の抗アデノウイルス免疫を回避するための種々のアデノウイルスタンパク質修飾に関する。
【００１０】
より具体的には、一実施形態は、組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来する組換えアデノウイルスに関し、該組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、（ｉ）異種プロモーターに作用可能に連結した、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質、またはその抗原部分と、（ｉｉ）修飾型カプシドタンパク質もしくはコアタンパク質とをコードするヌクレオチド配列を含み、マラリア原虫スポロゾイト周囲の免疫原性エピトープはカプシドタンパク質もしくはコアタンパク質に挿入されているまたはその少なくとも一部を置換する。
【００１１】
一部の実施形態では、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、熱帯熱マラリア原虫またはネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイト周囲タンパク質をさらに含む。該スポロゾイト周囲タンパク質は、コドン最適化した熱帯熱マラリア原虫またはネズミマラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質をさらに含むこともあり、一部の態様では、配列番号２または配列番号１それぞれののヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００１２】
別の実施形態では、該免疫原性エピトープは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＢ細胞エピトープをさら含む。該Ｂ細胞エピトープは、修飾型カプシドタンパク質に取り込まれることもあり、かつ一部の態様では、カプシドタンパク質はＨｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含みうる。該ＨＶＲは、ＨＶＲ１またはＨＶＲ５の一部がＢ細胞エピトープに置換されているＨＶＲ１またはＨＶＲ５をさらに含みうる。別の態様では、カプシドタンパク質は、Ｂ細胞エピトープがＦｉｂｅｒタンパク質に挿入されているカプシドＦｉｂｅｒタンパク質をさらに含みうる。一部の態様では、Ｂ細胞エピトープは、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｂ細胞エピトープであり、該Ｂ細胞エピトープが、たとえば（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）の反復配列であり、該反復配列が（ＮＡＮＰ）_４、（ＮＡＮＰ）_６、（ＮＡＮＰ）_８、（ＮＡＮＰ）_１０、（ＮＡＮＰ）_１２、（ＮＡＮＰ）_１４、（ＮＡＮＰ）_１６、（ＮＡＮＰ）_１８、（ＮＡＮＰ）_２０、（ＮＡＮＰ）_２２、または（ＮＡＮＰ）_２８でありうる。別の態様では、Ｂ細胞エピトープはネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｂ細胞エピトープであり、Ｂ細胞エピトープが、たとえば（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）の反復配列であり、該反復配列が（ＱＧＰＧＡＰ）_３、（ＱＧＰＧＡＰ）_４（ＱＧＰＧＡＰ）_５、（ＱＧＰＧＡＰ）_６、（ＱＧＰＧＡＰ）_７、（ＱＧＰＧＡＰ）_８、（ＱＧＰＧＡＰ）_９、（ＱＧＰＧＡＰ）_１１、または（ＱＧＰＧＡＰ）_１２でありうる。
【００１３】
さらに別の実施形態では、免疫原性エピトープは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞エピトープをさらに含む。該ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質に取り込まれることもある。一部の態様では、該カプシドタンパク質は、Ｈｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含みうる。該ＨＶＲは、ＨＶＲ１の一部がＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞エピトープに置換されているＨＶＲ１をさらに含みうる。別の態様では、該コアタンパク質は、ｐＶＩＩタンパク質をさらに含み、かつＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープが該ｐＶＩＩタンパク質に挿入されている。一部の態様では、該ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープであり、該ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープがＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）である。別の態様では、該ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープであり、該ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープがＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫ（配列番号６１）である。
【００１４】
別の実施形態は、上記の実施形態による組換えアデノウイルスを含む医薬組成物またはマラリアワクチン組成物に関する。さらなる実施形態は、上記の実施形態による該医薬組成物またはマラリアワクチン組成物の治療量を投与することを含むマラリアを治療する、予防する、または診断する方法を含む。
【００１５】
別の実施形態では、治療法は、初回刺激−追加免疫のワクチン接種の投与を含み、ここで被験者は、所定の時間間隔で用量を増やしてまたは同じ用量で一連の投与を与えられる。所定の時間間隔は、体液性および／または細胞性の免疫応答を生成するのに十分な任意の長さであってよい。たとえば、後述するように、該時間間隔は、３週間ごとであってもよいが、これに限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来する新しい、カプシド修飾型構造を有する新規の組換えアデノウイルスを見出した。新規の組換えアデノウイルスは哺乳類細胞を感染させ、哺乳類細胞にマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を発現させることができる。該組換えアデノウイルスは、所望の免疫原性の抗原、たとえばマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを有することによって修飾された１つまたは複数のカプシドタンパク質も有する。該組換えアデノウイルスは、直線化組換えアデノウイルスプラスミドベクターで細胞をトランスフェクトする方法によって得られる。得られた組換えアデノウイルスを用いて、本発明者らは、有効成分としてマラリア感染予防効果および治療効果がある組換えアデノウイルスを含有する医薬品について広範囲の研究を行った。その結果、発明者らは、得られた組換えアデノウイルスが所望の薬学的効果を有することを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本開示の実施形態によるカプシド修飾型組換えアデノウイルスの模式図である。
【図２】ＨＶＲ１修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターのＨＶＲ１修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図３】ＨＶＲ５修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターのＨＶＲ５修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図４】Ｆｉｂｅｒ修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターのＦｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図５】ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターの、ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図６】ＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターの、ＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図７】ＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターの、ＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図８】ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型組換えアデノウイルスプラスミドベクターの、ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスＤＮＡの構築を示す模式図である。
【図９】コドン最適化ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の核酸配列（ＰｙＣＳ、配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【図１０】コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の核酸配列（ＰｆＣＳＰ、配列番号２）および対応するアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。
【図１１−１】ＨＶＲ１（配列番号３、核酸；配列番号３１、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図１１−２】ＨＶＲ１（配列番号３、核酸；配列番号３１、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図１１−３】ＨＶＲ１（配列番号３、核酸；配列番号３１、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図１２−１】ＨＶＲ１（配列番号４、核酸；配列番号３２、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの４の反復（配列番号５９；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）４の配列は、下線で示す。
【図１２−２】ＨＶＲ１（配列番号４、核酸；配列番号３２、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの４の反復（配列番号５９；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）４の配列は、下線で示す。
【図１２−３】ＨＶＲ１（配列番号４、核酸；配列番号３２、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの４の反復（配列番号５９；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）４の配列は、下線で示す。
【図１３−１】ＨＶＲ１（配列番号５、核酸；配列番号３３、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの５の反復（配列番号５９；ｎ＝５）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_５の配列は、下線で示す。
【図１３−２】ＨＶＲ１（配列番号５、核酸；配列番号３３、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの５の反復（配列番号５９；ｎ＝５）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_５の配列は、下線で示す。
【図１３−３】ＨＶＲ１（配列番号５、核酸；配列番号３３、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの５の反復（配列番号５９；ｎ＝５）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_５の配列は、下線で示す。
【図１４−１】ＨＶＲ１（配列番号６、核酸；配列番号３４、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの６の反復（配列番号５９；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図１４−２】ＨＶＲ１（配列番号６、核酸；配列番号３４、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの６の反復（配列番号５９；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図１４−３】ＨＶＲ１（配列番号６、核酸；配列番号３４、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの６の反復（配列番号５９；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図１５−１】ＨＶＲ１（配列番号７、核酸；配列番号３５、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの７の反復（配列番号５９；ｎ＝７）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_７の配列は、下線で示す。
【図１５−２】ＨＶＲ１（配列番号７、核酸；配列番号３５、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの７の反復（配列番号５９；ｎ＝７）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_７の配列は、下線で示す。
【図１５−３】ＨＶＲ１（配列番号７、核酸；配列番号３５、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの７の反復（配列番号５９；ｎ＝７）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_７の配列は、下線で示す。
【図１６−１】ＨＶＲ１（配列番号８、核酸；配列番号３６、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの８の反復（配列番号５９；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図１６−２】ＨＶＲ１（配列番号８、核酸；配列番号３６、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの８の反復（配列番号５９；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図１６−３】ＨＶＲ１（配列番号８、核酸；配列番号３６、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの８の反復（配列番号５９；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図１７−１】ＨＶＲ１（配列番号９、核酸；配列番号３７、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの９の反復（配列番号５９；ｎ＝９）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_９の配列は、下線で示す。
【図１７−２】ＨＶＲ１（配列番号９、核酸；配列番号３７、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの９の反復（配列番号５９；ｎ＝９）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_９の配列は、下線で示す。
【図１７−３】ＨＶＲ１（配列番号９、核酸；配列番号３７、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの９の反復（配列番号５９；ｎ＝９）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_９の配列は、下線で示す。
【図１８−１】ＨＶＲ１（配列番号１０、核酸；配列番号３８、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１１の反復（配列番号５９；ｎ＝１１）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１１の配列は、下線で示す。
【図１８−２】ＨＶＲ１（配列番号１０、核酸；配列番号３８、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１１の反復（配列番号５９；ｎ＝１１）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１１の配列は、下線で示す。
【図１８−３】ＨＶＲ１（配列番号１０、核酸；配列番号３８、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１１の反復（配列番号５９；ｎ＝１１）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１１の配列は、下線で示す。
【図１９−１】ＨＶＲ１（配列番号１１、核酸；配列番号３９、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１２の反復（配列番号５９；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図１９−２】ＨＶＲ１（配列番号１１、核酸；配列番号３９、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１２の反復（配列番号５９；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図１９−３】ＨＶＲ１（配列番号１１、核酸；配列番号３９、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの１２の反復（配列番号５９；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図２０−１】ＨＶＲ１（配列番号１２、核酸；配列番号４４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの４の反復（配列番号６０；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_４の配列は、下線で示す。
【図２０−２】ＨＶＲ１（配列番号１２、核酸；配列番号４４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの４の反復（配列番号６０；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_４の配列は、下線で示す。
【図２０−３】ＨＶＲ１（配列番号１２、核酸；配列番号４４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの４の反復（配列番号６０；ｎ＝４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_４の配列は、下線で示す。
【図２１−１】ＨＶＲ１（配列番号１３、核酸；配列番号４５、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの６の反復（配列番号６０；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図２１−２】ＨＶＲ１（配列番号１３、核酸；配列番号４５、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの６の反復（配列番号６０；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図２１−３】ＨＶＲ１（配列番号１３、核酸；配列番号４５、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの６の反復（配列番号６０；ｎ＝６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_６の配列は、下線で示す。
【図２２−１】ＨＶＲ１（配列番号１４、核酸；配列番号４６、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの８の反復（配列番号６０；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図２２−２】ＨＶＲ１（配列番号１４、核酸；配列番号４６、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの８の反復（配列番号６０；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図２２−３】ＨＶＲ１（配列番号１４、核酸；配列番号４６、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの８の反復（配列番号６０；ｎ＝８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_８の配列は、下線で示す。
【図２３−１】ＨＶＲ１（配列番号１５、核酸；配列番号４７、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１０の反復（配列番号６０；ｎ＝１０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１０の配列は、下線で示す。
【図２３−２】ＨＶＲ１（配列番号１５、核酸；配列番号４７、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１０の反復（配列番号６０；ｎ＝１０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１０の配列は、下線で示す。
【図２３−３】ＨＶＲ１（配列番号１５、核酸；配列番号４７、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１０の反復（配列番号６０；ｎ＝１０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１０の配列は、下線で示す。
【図２４−１】ＨＶＲ１（配列番号１６、核酸；配列番号４８、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１２の反復（配列番号６０；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図２４−２】ＨＶＲ１（配列番号１６、核酸；配列番号４８、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１２の反復（配列番号６０；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図２４−３】ＨＶＲ１（配列番号１６、核酸；配列番号４８、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１２の反復（配列番号６０；ｎ＝１２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１２の配列は、下線で示す。
【図２５−１】ＨＶＲ１（配列番号１７、核酸；配列番号４９、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１４の反復（配列番号６０；ｎ＝１４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１４の配列は、下線で示す。
【図２５−２】ＨＶＲ１（配列番号１７、核酸；配列番号４９、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１４の反復（配列番号６０；ｎ＝１４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１４の配列は、下線で示す。
【図２５−３】ＨＶＲ１（配列番号１７、核酸；配列番号４９、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１４の反復（配列番号６０；ｎ＝１４）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１４の配列は、下線で示す。
【図２６−１】ＨＶＲ１（配列番号１８、核酸；配列番号５０、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１６の反復（配列番号６０；ｎ＝１６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１６の配列は、下線で示す。
【図２６−２】ＨＶＲ１（配列番号１８、核酸；配列番号５０、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１６の反復（配列番号６０；ｎ＝１６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１６の配列は、下線で示す。
【図２６−３】ＨＶＲ１（配列番号１８、核酸；配列番号５０、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１６の反復（配列番号６０；ｎ＝１６）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１６の配列は、下線で示す。
【図２７−１】ＨＶＲ１（配列番号１９、核酸；配列番号５１、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１８の反復（配列番号６０；ｎ＝１８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１８の配列は、下線で示す。
【図２７−２】ＨＶＲ１（配列番号１９、核酸；配列番号５１、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１８の反復（配列番号６０；ｎ＝１８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１８の配列は、下線で示す。
【図２７−３】ＨＶＲ１（配列番号１９、核酸；配列番号５１、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの１８の反復（配列番号６０；ｎ＝１８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_１８の配列は、下線で示す。
【図２８−１】ＨＶＲ１（配列番号２０、核酸；配列番号５２、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２０の反復（配列番号６０；ｎ＝２０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２０の配列は、下線で示す。
【図２８−２】ＨＶＲ１（配列番号２０、核酸；配列番号５２、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２０の反復（配列番号６０；ｎ＝２０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２０の配列は、下線で示す。
【図２８−３】ＨＶＲ１（配列番号２０、核酸；配列番号５２、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２０の反復（配列番号６０；ｎ＝２０）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２０の配列は、下線で示す。
【図２９−１】ＨＶＲ１（配列番号２１、核酸；配列番号５３、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２２の反復（配列番号６０；ｎ＝２２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２２の配列は、下線で示す。
【図２９−２】ＨＶＲ１（配列番号２１、核酸；配列番号５３、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２２の反復（配列番号６０；ｎ＝２２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２２の配列は、下線で示す。
【図２９−３】ＨＶＲ１（配列番号２１、核酸；配列番号５３、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２２の反復（配列番号６０；ｎ＝２２）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２２の配列は、下線で示す。
【図３０−１】ＨＶＲ１（配列番号２２、核酸；配列番号５４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２８の反復（配列番号６０；ｎ＝２８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２８の配列は、下線で示す。
【図３０−２】ＨＶＲ１（配列番号２２、核酸；配列番号５４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２８の反復（配列番号６０；ｎ＝２８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２８の配列は、下線で示す。
【図３０−３】ＨＶＲ１（配列番号２２、核酸；配列番号５４、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの２８の反復（配列番号６０；ｎ＝２８）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_２８の配列は、下線で示す。
【図３１−１】ＨＶＲ５（配列番号２３、核酸；配列番号４０、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３１−２】ＨＶＲ５（配列番号２３、核酸；配列番号４０、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３１−３】ＨＶＲ５（配列番号２３、核酸；配列番号４０、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｈｅｘｏｎの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３２−１】Ｆｉｂｅｒ（配列番号２４、核酸；配列番号４１、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｆｉｂｅｒの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３２−２】Ｆｉｂｅｒ（配列番号２４、核酸；配列番号４１、アミノ酸）においてＰｙＣＳ Ｂ細胞エピトープ配列（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの３の反復（配列番号５９；ｎ＝３）を有する修飾型Ｆｉｂｅｒの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３３−１】Ｆｉｂｅｒ（配列番号２５、核酸；配列番号５５、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの４の反復（配列番号６０；ｎ＝４）を有する修飾型Ｆｉｂｅｒの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３３−２】Ｆｉｂｅｒ（配列番号２５、核酸；配列番号５５、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ Ｂ細胞エピトープ配列（ＮＡＮＰ）_ｎの４の反復（配列番号６０；ｎ＝４）を有する修飾型Ｆｉｂｅｒの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_３の配列は、下線で示す。
【図３４】Ｎ末端ｐＶＩＩ（配列番号２６、核酸；配列番号４２、アミノ酸）においてＰｙＣＳ ＣＤ４＋エピトープ配列ＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫ（配列番号６１）を有する修飾型ｐＶＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入されたＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫの配列は、下線で示す。
【図３５】Ｃ末端ｐＶＩＩ（ｐＶＩＩ−１；配列番号２７、核酸；配列番号５６、アミノ酸）においてＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープ配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）を有する修飾型ｐＶＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入されたＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ配列は、下線で示す。
【図３６】ｐＶＩＩ（ｐＶＩＩ−２；配列番号２８、核酸；配列番号５７、アミノ酸）の第１の核移行シグナル（ＮＬＳ）の前にＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープ配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）を有する修飾型ｐＶＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入されたＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ配列は、下線で示す。
【図３７】ｐＶＩＩ（ｐＶＩＩ−３；配列番号２９、核酸；配列番号５８、アミノ酸）の２つＮＬＳの間にＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープ配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）を有する修飾型ｐＶＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。挿入されたＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ配列は、下線で示す。
【図３８】ＰｙＣＳ−ＧＦＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶによる一過性トランスフェクションの後、ＡＤ２９３細胞におけるＰｙＣＳタンパク質発現を示す。ＰｙＣＳタンパク質は、マウスモノクローナル抗ＰｙＣＳ抗体（９Ｄ３）を用いるウエスタンブロット法によって検出された。
【図３９】（ＱＧＰＧＡＰ）_３エピトープ（配列番号５９；ｎ＝３）のアデノウイルウスカプシドタンパク質への挿入を確認するために、精製したカプシド修飾型組換えＰｙＣＳ−ＧＦＰアデノウイルスの銀染色とウエスタンブロット法（Ａ）およびＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）による結果を示す。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートは精製アデノウイルスで直接コーティングされ、次いでアデノウイルス粒子に挿入されたエピトープは抗ＰｙＣＳ抗体で検出された。
【図４０】（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎエピトープ（配列番号５９）のアデノウイルウスカプシドタンパク質への挿入を確認するために、精製したカプシド修飾型組換えＰｙＣＳアデノウイルスの銀染色とウエスタンブロット法（Ａ）およびＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）による結果を示す。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートは精製アデノウイルスで直接コーティングされ、次いでアデノウイルス粒子に挿入されたエピトープは抗ＰｙＣＳ抗体で検出された。
【図４１】（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９、ｎ＝３、４、５、６、９、１２）を有するカプシド修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによる単回免疫レジメン（Ａ）と、免疫化から２週間後のＰｙＣＳ特異的ＣＤ８＋応答（Ｂ）とを示す。
【図４２】（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９、ｎ＝３）を有するカプシド修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、１０週目のＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答（Ｂ）と、スポロゾイト抗原投与から４２時間後の肝臓でのマラリア寄生虫の負荷（Ｃ）とを示す。
【図４３】図４２でのレジメンを与えられたマウスから調製され、プールした血清試料についての間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって測定された抗スポロゾイト抗体価（Ａ）と、ｉｎ ｖｉｔｒｏスポロゾイト中和活性（Ｂ）とを示す。
【図４４】ＨＶＲ１において（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９、ｎ＝４、６）を有するカプシド修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、９週目のＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答（Ｂ）と、スポロゾイト抗原投与から４２時間後の肝臓でのマラリア寄生虫負荷（Ｃ）と、プールした血清「試料のｉｎ ｖｉｔｒｏスポロゾイト中和活性（Ｄ）とを示す。マウスにアジュバントと共に、またはアジュバントを含まずに免疫した。
【図４５】ＨＶＲ１において（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９、ｎ＝６、９、１２）を有するカプシド修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、９週目のＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答（Ｂ）と、９週目のＰｙＣＳ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答（Ｃ）と、スポロゾイト抗原投与から４２時間後の肝臓でのマラリア寄生虫負荷（Ｄ）とを示す。マウスにアジュバントと共に、またはアジュバントを含まずに免疫した。
【図４６】ＰｆＣＳＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶによる一過性トランスフェクションの後のＡＤ２９３細胞におけるＰｆＣＳＰタンパク質の発現を示す。ＰｆＣＳＰは、マウスモノクローナル抗ＮＡＮＰ抗体（２Ａ１０）を用いるウエスタンブロット法によって検出された。
【図４７】（ＮＡＮＰ）_４エピトープ（配列番号６０、ｎ＝４）のアデノウイルウスカプシドタンパク質への挿入を確認するために、精製したカプシド修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスの銀染色とウエスタンブロット法（Ａ）およびＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）による結果を示す。挿入された（ＮＡＮＰ）_４のエピトープ（配列番号６０、ｎ＝４）は、マウスモノクローナル抗ＮＡＮＰ抗体（２Ａ１０）によって検出された。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートは、精製アデノウイルスで直接コーティングされた。
【図４８】（ＮＡＮＰ）_ｎエピトープ（配列番号６０、ｎ＝４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２）のアデノウイルウスカプシドタンパク質への挿入を確認するために、精製したカプシド修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスの銀染色とウエスタンブロット法（Ａ）およびＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）による結果を示す。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートは、精製アデノウイルスで直接コーティングされ、次いでアデノウイルス粒子に挿入されたエピトープは抗ＰｆＣＳＰ抗体（２Ａ１０）で検出された。
【図４９】（ＮＡＮＰ）_４（配列番号６０、ｎ＝４）を有するカプシド修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、９週目のＰｆＣＳＰ特異的体液性免疫応答（Ｂ）とを示す。
【図５０】ＨＶＲ１において（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０、ｎ＝４、６、８、１０）を有するカプシド修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、９週目のＰｆＣＳＰ特異的体液性免疫応答（Ｂ）とを示す。
【図５１】ＨＶＲ１において（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０、ｎ＝１０、１６、２２）を有するカプシド修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、９週目のＰｆＣＳＰ特異的体液性免疫応答（Ｂ）とを示す。マウスにアジュバントと共に、またはアジュバントを含まずに免疫した。
【図５２】精製した（ＱＧＰＧＡＰ）修飾型ＦｉｂｅｒおよびｐＶＩＩ−１（（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰ）のアデノウイルスの銀染色分析（Ａ）の結果と、図４９に記述したように（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰまたは（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰで免疫したマウスにおいて１０週目の抗ＱＧＰＧＡＰ抗体価（Ｂ）とを示す。２つの独立した実験の結果を、Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰで免疫した群において抗体価の中央値で規準化した後、図にプロットした。
【図５３】ｐＶＩＩ（ＰｆＣＤ４−ｐＶＩＩ−２；配列番号２８、核酸；配列番号５７、アミノ酸）の第１の核移行シグナル（ＮＬＳ）の前に、およびｐＶＩＩ（ＰｆＣＤ４−ｐＶＩＩ−３；配列番号２９、核酸;配列番号５８、アミノ酸）の２つのＮＬＳの間に挿入されたＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープ配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）（Ａ）と、ｐＶＩＩへのエピトープの挿入を確認するための銀染色の結果（Ｂ）とによるアデノウイルスｐＶＩＩタンパク質の構造の模式図を示す。
【図５４】ＨＶＲ１およびｐＶＩＩ修飾型組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスによる初回刺激および追加免疫の免疫レジメン（Ａ）と、６週目のＰｆＣＳＰ特異的体液性免疫応答（Ｂ）と、９週目のＰｆＣＳＰ特異的ＣＤ４＋（ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ；配列番号６２）の応答（Ｃ）とを示す。
【図５５】ヒト血清試料による組換えアデノウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え中和を示す。希釈ヒト血清の存在下でＡＤ２９３細胞を組換えアデノウイルスに終夜感染させ、次いでＧＦＰ発現を感染のマーカーとして測定した。
【図５６】抗アデノウイルス免疫の、カプシド修飾型ＰｙＣＳ−ＧＦＰアデノウイルスｉｎ ｖｉｖｏによるＰｙＣＳ特異的Ｔ細胞応答の誘発への影響を示す。（Ａ）は、研究デザインの簡単な説明である。（Ｂ）は、野生型（ｗｔ）／空のアデノウイルスで２回免疫して、続いてカプシド修飾型ＰｙＣＳ−ＧＦＰアデノウイルスで初回刺激したマウスにおけるＰｙＣＳ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を示す。
【図５７】抗アデノウイルス免疫の、カプシド修飾型ＰｙＣＳ−ＧＦＰアデノウイルスｉｎ ｖｉｖｏによるＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答の誘発への影響を示す。（Ａ）は、研究デザインの簡単な説明である。（Ｂ）は、野生型（ｗｔ）／空のアデノウイルスで２回、続いて２用量のカプシド修飾型ＰｙＣＳ−ＧＦＰアデノウイルスで免疫したマウスにおけるＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の記述は、本開示の記述、実施形態を十分に理解するため、および可能にするための具体的な詳細を提供する。しかし、当業者は、該開示がこれらの詳細なしでも実行されうることを理解するであろう。別の例では、周知の構造および機能は、本開示の実施形態の説明を不必要に不明瞭にしないように詳細に示されていない、または記述されていない。
【００１９】
本開示においてアミノ酸、ペプチド、塩基配列、および核酸のために使用された略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８：９（１９８４）， ”Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”（米国特許商標庁）に特定された略語に基づいており、かつ本技術分野で一般に使用されているものである。
【００２０】
本開示によって意図される「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」または「ＤＮＡ分子」は、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（すなわち、二本鎖ＤＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖）を含みうるが、その完全長に限定されるものではない。たとえば本明細書で以下に開示する免疫原性外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、特に明記しない限り、ゲノムＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡ；ｃＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）；センス鎖、合成ＤＮＡ、およびその断片に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）を包含する。
【００２１】
本明細書で用いる場合、ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子は、機能的な領域に限定されるものではなく、かつ発現抑制領域、コード領域、リーダー配列、エキソンおよびイントロンのうちの少なくとも１つを含みうる。さらに、ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドの例としては、ＲＮＡまたはＤＮＡを含みうる。特異的アミノ酸配列を含むポリペプチドおよび特異的ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの断片、相同体、誘導体および変異体を含みうる。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドの変異体の例（たとえば変異体ＤＮＡ）としては、天然に存在する対立遺伝子変異体；人工変異体；および欠失、置換、追加、および／または挿入を有する変異体が挙げられる。かかる変異体は、元の非変異型ポリペプチドによってコードされるポリペプチドと同じ機能を実質的に有するポリペプチドをコードすることを理解すべきである。
【００２２】
本開示は、マラリア原虫の抗原決定基を発現させることができ、および１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質を含む組換えアデノウイルスに関する。組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来し、この産生は以下の実施例で記述される。ベクターとしてのアデノウイルスの使用を、さらに以下で考察する。本明細書に記述する組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、マラリア原虫に対する体液性および細胞性の両免疫応答が誘発されるマラリアワクチンまたは医薬組成物として用いられてもよい。
【００２３】
マラリア原虫は、既知のマラリア原虫（Ｐ．）種、たとえば、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、マウスマラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）およびネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のいずれかから選択されうる。一部の実施形態では、抗原決定基は齧歯動物特異的ネズミマラリア原虫またはヒト特異的熱帯熱マラリア原虫に由来する。
【００２４】
一実施形態では、組換えアデノウイルスカプシド修飾型プラスミドベクター（本明細書では組換えアデノウイルスプラスミドベクターとも記述される）は、カプシドをコードして、生成するプラスミドであり、および／または１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質を含む構造を有するコア修飾型組換えアデノウイルスである。本開示の実施形態によれば、カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質の修飾は、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープを挿入することによって達成されうる。あるいは、カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質の少なくとも一部は、除去されてマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープと置換されうる。一部の実施形態では、該免疫原性エピトープは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＢ細胞および／またはＴ細胞のエピトープである。Ｂ細胞またはＴ細胞のピトープを追加することで、ＣＳタンパク質に対する液体性免疫応答を確立する、または増強することによってマラリアワクチンとして用いられるアデノウイルスベクターの有効性を増強するのに役立ちうる。修飾型カプシドタンパク質と、コアタンパク質と、本明細書に記述する組換えアデノウイルスでのこれらのタンパク質の使用に関するこれらの有意性とを以下でさらに考察する。
【００２５】
１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質は、修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質、修飾型Ｆｉｂｅｒタンパク質、修飾型ｐＶＩＩタンパク質またはそれらの組み合わせであってもよい。一実施形態では、Ｈｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）の一部および／またはＦｉｂｅｒタンパク質の一部は、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞のエピトープと置換される。あるいは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の１つもしくは複数のＢ細胞および／またはＴ細胞のエピトープは、Ｆｉｂｅｒタンパク質またはＨｅｘｏｎのＨＶＲに挿入されうる。一部の態様では、修飾型ＨＶＲは、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７でありうる。別の態様では、修飾型ＨＶＲは、ＨＶＲ１またはＨＶＲ５でありうる。一部の実施形態では、ＨＶＲ修飾型Ｈｅｘｏｎは、以下の配列番号の核酸配列を有すこともありうる：配列番号３（図１１−１〜図１１−３）、配列番号４（図１２−１〜図１２−３）、配列番号５（図１３−１〜図１３−３）、配列番号６（図１４−１〜図１４−３）、配列番号７（図１５−１〜図１５−３）、配列番号８（図１６−１〜図１６−３）、配列番号９（図１７−１〜図１７−３）、配列番号１０（図１８−１〜図１８−３）、配列番号１１（図１９−１〜図１９−３）、配列番号１２（図２０−１〜図２０−３）、配列番号１３（図２１−１〜図２１−３）、配列番号１４（図２２−１〜図２２−３）、配列番号１５（図２３−１〜図２３−３）、配列番号１６（図２４−１〜図２４−３）、配列番号１７（図２５−１〜図２５−３）、配列番号１８（図２６−１〜図２６−３）、配列番号１９（図２７−１〜図２７−３）、配列番号２０（図２８−１〜図２８−３）、配列番号２１（図２９−１〜図２９−３）、配列番号２２（図３０−１〜図３０−３）、または配列番号２３（図３１−１〜図３１−３）。別の実施形態では、修飾型Ｆｉｂｅｒタンパク質は、配列番号２４（図３２−１〜図３２−２）または配列番号２５（図３３−１〜図３３−２）の核酸配列を有すこともありうる。
【００２６】
別の実施形態では、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＴ細胞エピトープは、以下のいずれかの部位で、アデノウイルスコアｐＶＩＩタンパク質に挿入されうる：Ｃ末端、第１の核移行シグナル（ＮＬＳ）の前、または２つのＮＬＳの間。あるいは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のＴ細胞エピトープは、ｐＶＩＩタンパク質の一部を置換しうる。一部の実施形態では、修飾型ｐＶＩＩタンパク質は、配列番号２６（図３４）、配列番号２７（図３５）、配列番号２８（図３６）、または配列番号２９（図３７）の核酸配列を有することもある。
【００２７】
組換えアデノウイルスでは、トランスジェニックタンパク質または組換えトランスジェニックタンパク質が発現しうる。一部の実施形態では、トランスジェニックタンパク質または組換えトランスジェニックタンパク質は、本明細書に記述する組換えアデノウイルスプラスミドベクターによってコードされるマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質または抗原決定基であり、かつ１つまたは複数の宿主細胞の感染の後、前述の組換えアデノウイルスプラスミドベクターによって生成される組換えアデノウイルスによって発現される。
【００２８】
したがって、一部の実施形態では、組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、組換えトランスジェニックタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、組換えトランスジェニックタンパク質は、齧歯類特異的寄生虫であるネズミマラリア原虫の抗原決定基を含むこともあり、該抗原決定基が、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質遺伝子またはその抗原部分を含む。別の実施例形態では、組換えトランスジェニックタンパク質は、ヒト特異的寄生虫である熱帯熱マラリア原虫の抗原決定基を含むこともあり、該抗原決定基が熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲遺伝子（ＣＳ）タンパク質またはその抗原部分を含む。蚊媒介感染症に対するヒトにおける能動免疫の基礎として用いられるとき、熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質は、マラリアの予防を示した。抗原決定基は、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープなどの免疫原性エピトープをさらに含みうる。
【００２９】
一部の実施形態では、ＣＳタンパク質は、被験者において発現の増強のためにコドン最適化される。コドン最適化は、必要なアミノ酸含有量、関心の対象において一般的な最適コドンの使用、ならびに適切な発現を確実にするために回避されるべきいずれの態様に基づく。かかる態様は、スプライス供与部位または受容部位、終止コドン、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル、ＧＣリッチ配列とＡＴリッチ配列、内部ＴＡＴＡボックス、または当技術分野で既知の他のいかなる態様でありうる。一部の実施形態では、コドン最適化CS導入遺伝子のＤＮＡ配列は、図９（配列番号１、ネズミマラリア原虫）および図１０（配列番号２、熱帯熱マラリア原虫）に示される。
【００３０】
一部の実施形態では、組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、以下の修飾型熱帯熱マラリア原虫組換えアデノウイルスプラスミドベクターのうちの１つでありうる：（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図２に示すように構築されたＨＶＲ１修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＰｆＣＳＰ）；（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図４に示すように構築されたＦｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰ）；（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図５に示すように構築されたＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰ）；（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープコード配列およびＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図７に示すように構築されたＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰ）；（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープおよびＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図６に示すように構築されたＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰ）；ならびに（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）のＢ細胞エピトープおよびＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図８に示すように構築されたＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰ）。
【００３１】
別の実施形態では、組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、以下の修飾型ネズミマラリア原虫組換えアデノウイルスプラスミドベクターのうちの１つでありうる：（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図２に示すように構築されたＨＶＲ１修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ）；（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図４に示すように構築されたＦｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ）；（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープコード配列を用いて、図５に示すように構築されたＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ）；（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープおよびＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫ（配列番号６１）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図７に示すように構築されたＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ）；（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープおよびＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫ（配列番号６１）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図６に示すように構築されたＦｉｂｅｒ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ）；ならびに（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）のＢ細胞エピトープおよびＹＮＲＮＩＶＮＲＬＬＧＤＡＬＮＧＫＰＥＥＫ（配列番号６１）のＣＤ４エピトープコード配列を用いて、図８に示すように構築されたＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター（ＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰ）。
【００３２】
別の実施形態では、組換えアデノウイルスは、以下の修飾型熱帯熱マラリア原虫またはネズミマラリア原虫組換えアデノウイルスプラスミドベクターのうちの１つによって生成されうる：ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ（図２）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図４）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図５）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図７）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図６）、（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図８））。組換えアデノウイルスは、哺乳類宿主細胞で組換えトランスジェニックタンパク質（たとえばマラリア原虫ＣＳタンパク質）を発現させる能力を有する組換えアデノウイルスプラスミドベクターを生成するための本明細書に記述する方法によって生成されうる。
【００３３】
組換えアデノウイルスの精製は、既知のウイルス精製方法を用いて行われてもよい。たとえば、精製する０．５〜１．０ｍＬのストックウイルスは、ＡＤ２９３細胞などの昆虫細胞を播種する（１×１０^７細胞／１０ｃｍシャーレ）ことによる組換えアデノウイスタンパク質を生成する方法によって得た。次いで、感染から数日後に培養上清を収集し、次いで遠心によって得たウイルスペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で験濁する。得られた懸濁液を１０〜６０％のショ糖密度勾配にかけ、次いで遠心させて（４℃で、２５，０００ｒｐｍで６０分間）、ウイルスバンドを収集する。収集したウイルスをＰＢＳでさらに験濁させ、続いて上述と同じ条件下で遠心する。得られた精製組換えウイルスペレットをＰＢＳなどの緩衝液中、４℃で貯蔵する。
【００３４】
別の実施形態は、基本的に少なくとも１つの有効成分を含む医薬組成物に関する。一実施形態では、該医薬組成物の有効成分は、本明細書に記述する遺伝子工学技術によって得られうる組換えアデノウイルスを含みうる。より具体的には、該有効成分は、Ｈｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）の一部、Ｆｉｂｅｒタンパク質の一部、ｐＶＩＩタンパク質の一部、またはそれらの組み合わせがマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープと置換されている、修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質を含む組換えアデノウイルでありうる。あるいは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の１つもしくは複数のＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープが、Ｆｉｂｅｒタンパク質、Ｈｅｘｏｎ ＨＶＲまたはｐＶＩＩタンパク質に挿入されうる。組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、１つもしくは複数の宿主細胞に感染させた後に組換えアデノウイルスによって発現されるトランスジェニックタンパク質または組換えトランスジェニックタンパク質をさらに含む。トランスジェニックタンパク質または組換えトランスジェニックタンパク質は、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質またはマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質のマラリア抗原でありえ、ここで該マラリア抗原はマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープ（たとえばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープ）を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、医薬組成物の有効成分は、組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来する組換えアデノウイルスプラスミドベクターであり、該組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、以下の修飾型熱帯熱マラリア原虫またはネズミマラリア原虫組換えアデノウイルスプラスミドベクターのうちの１つである：ＮＡＮＰ−ＨＶＦＭ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＦＭ／ＰｙＣＳ（図２）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図４）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図５）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図７）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図６）、（ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図８）。これらの組換えアデノウイルスプラスミドベクターは、細胞（たとえばＡＤ２９３細胞）にトランスフェクトされると、組換えアデノウイルスを生成することができ、かつ該組換えトランスジェニックタンパク質がヒト細胞を含む哺乳類細胞で発現されうる。
【００３６】
下記の実施例でさらに説明するように、有効成分を含む医薬組成物は、本明細書に記述する組換えアデノウイルスであり、被験者に投与されると、マラリア感染性抗原に対するマラリア感染症予防効果を増強し、感染価を低下させる。したがって、組換えアデノウイルスは、標的細胞および組織の感染に付随したマラリア感染症の治療で用いられうる。かかるマラリア感染症に影響を受ける標的細胞の例としては、血球、肝細胞、腎細胞、脳細胞、肺細胞、上皮細胞、および筋細胞が挙げられる。かかる細胞を含む組織の例としては、肺、肝臓、腎臓、脳、動脈と静脈、胃、腸、尿道、皮膚、および筋肉が挙げられる。
【００３７】
一部の態様では、医薬組成物は、感染抗原、たとえば、マラリア寄生虫のスポロゾイト表面抗原（スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）およびトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ））などのマラリア抗原、メロゾイト表面膜タンパク質（ＭＳＰＩ）、マラリアに感染した赤血球から分泌されるマラリアスポロゾイト抗原、およびマラリアに感染した赤血球のノブ内に存在する熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質−１（ＰｆＭＰ１）に対するマラリア感染症予防効果を増強しうる。医薬組成物は、いずれの既知のマラリア原虫種、たとえば、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、マウスマラリア原虫、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）およびネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）から選択されるマラリア原虫に対して、感染価を低下させることによってマラリア感染症予防効果を増強しうる。被験者に投与されるとき、医薬組成物による感染価の低下は、該医薬組成物を投与されなかった被験者と比較すると、生存、無病生存、または無感染生存期間と生存、無病生存、または無感染生存率の増加をもたらしうる。したがって、一部の態様では、医薬組成物は、マラリア原虫などの病原体によってもたらされるマラリア感染症のための予防薬または治療薬として有用である。さらなる態様では、医薬組成物は、マラリア原虫などの病原体によってもたらされるマラリア感染症に起因する合併症のための予防薬または治療薬として有用である。
【００３８】
被験者における本発明の組換えアデノウイルスの感染症予防効果は、たとえば、本発明のカプシド修飾型組換えアデノウイルスと、医薬投与用の添加剤類とを含有する医薬組成物を、脊椎動物、特にヒトを含む哺乳類に、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、経鼻、または呼吸経路によって投与し、次いで有効成分として本明細書に記述する組換えアデノウイルスを含有する医薬組成物で脊椎動物に数回免疫することによって、もたらされうる。感染症予防効果を評価するために、該医薬組成物で数回免疫され、続いて標的病原体（たとえば選択されたマラリア原虫種）により感染した被験者の生存率、無病生存、または無感染生存を、該医薬組成物を投与されなかって被験者の生存率、無病生存、または無感染生存と比較してもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記述する薬学的に有効量のカプシドまたはコア修飾型組換えアデノウイルスと、以下にさらに記述する薬学的に許容される担体とをさらに含みうる。
【００４０】
別の実施形態は、少なくとも１つの有効成分を基本的に含むワクチン組成物に関する。一実施形態では、該ワクチン組成物の有効成分は、本明細書に記述する組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来する組換えアデノウイルスを含みうる。より具体的には、該有効成分は、Ｈｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）の一部、Ｆｉｂｅｒタンパク質の一部、ｐＶＩＩタンパク質の一部、またはそれらの組み合わせがマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープと置換されている、修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質を含む組換えアデノウイルでありうる。あるいは、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープが、ｐＶ１１タンパク質、Ｆｉｂｅｒタンパク質もしくはＨｅｘｏｎ ＨＶＲ、またはそれらの組み合わせに挿入されうる。一部の実施形態では、ワクチン組成物の有効成分は、図２〜８に示した組換えアデノウイルスプラスミドベクター、たとえば、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ（図２）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図４）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｂ−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ（図５）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図７）、ＮＡＮＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図６）、ＮＡＮＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｆＣＳＰまたはＱＧＰＧＡＰ−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ／ＰｙＣＳ（図８）に由来してもよい。
【００４１】
一部の態様では、被験者に投与される場合、ワクチン組成物は、カプシドタンパク質またはコアタンパク質の少なくとも一部に挿入されたまたは該一部を置換する、マラリア原虫ＣＳタンパク質（すなわち、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープまたは両方）の１つまたは複数の抗原部分を有する組換えアデノウイルスをまず含んでいる。次いで、該ワクチン組成物は、組換えトランスジェニックタンパク質がＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープまたは両方を含むマラリア原虫ＣＳタンパク質である組換えトランスジェニックタンパク質を発現しうる。マラリア原虫ＣＳタンパク質の抗原部分は、組換えトランスジェニックタンパク質に見出され、および下記の実施例に記述するように、修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質は後天性の体液性免疫、細胞性免疫または両方を促進する、または増強する。このように、一部の態様では、本明細書に記述する組換えアデノウイルスは、体液性免疫、細胞性免疫または両方を促進する、または増強するワクチンとして有用である。
【００４２】
一部の態様では、ワクチン組成物は、感染抗原、たとえば、マラリア寄生虫のスポロゾイト表面抗原（ＣＳＰおよびＴＲＡＰ）などのマラリア抗原、メロゾイト表面膜タンパク質（ＭＳＰＩ）、マラリアに感染した赤血球から分泌されるマラリアスポロゾイト抗原、マラリアに感染した赤血球のノブ内に存在するＰｆＥＭＰ１、セリンリッチ抗原（ＳＥＲＡ）タンパク質、チロシンリッチ酸性マトリクスタンパク質（ＴＲＡＭＰ）、および頂端膜抗原−１（ＡＭＡ１）に対するマラリア感染症予防効果を増強しうる。さらに、本明細書に記述するワクチン組成物の投与によって生ずる感染価（たとえばウイルス感染価）の低下は、該ワクチン組成物を投与されなかった被験者と比較すると、生存増加、無病生存期間もしくは無感染生存期間と生存、無病生存率もしくは無感染生存率をもたらしうる。したがって、一部の態様では、該ワクチン組成物は、マラリア原虫などの病原体によってもたらされるマラリア感染症のための予防薬または治療薬としても有用である。さらなる態様では、該ワクチン組成物は、マラリア原虫などの病原体によるマラリア感染症に起因する合併症のための予防薬または治療薬としても有用もある。
【００４３】
本明細書に記述するワクチン組成物は、本明細書に記述する治療有効量の組換えアデノウイルスを含むこともあり、かつ標準方法によって薬学的に許容される担体をさらに含む。許容される担体の例としては、生理学的に許容される溶液、たとえば無菌生理食塩水および無菌緩衝生理食塩水が含まれる。
【００４４】
一部の実施形態では、ワクチン組成物または医薬組成物を薬学的に有効量のアジュバントと組み合わせて用いて、抗マラリア効果を増強しうる。免疫系を刺激して、ワクチンに対する応答を増加させうるが、それ自体は何ら特定の抗原効果がない、任意の免疫アジュバントはアジュバントとして用いられうる。多くの免疫アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られている保存分子を進化的に模倣して、トール様受容体（ＴＬＲ）として知られている一連の免疫受容体によって認識される。本明細書に記述する実施形態によって用いられるうるアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３リガンド）；ＬＰＳ；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（ＴＬＲ４リガンド）などのＬＰＳ類似体；フラゲリン（ＴＬＲ５リガンド）；リポプロテイン；リポペプチド；一本鎖ＲＮＡ；一本鎖ＤＮＡ；イミダゾキノリン類似体（ＴＬＲ７およびＴＬＲのリガンド）；ＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９リガンド）；Ｒｉｂｉアジュバント（モノホスホリルリピドＡ／トレハロースジコリノミコラート）；糖脂質（α−ＧａｌＣｅｒ類似体）；非メチル化ＣｐＧアイランド；油乳剤；リポソーム；ビロゾーム；サポニン類（ＱＳ２１などのサポニンの活性画分）；ムラミールジペプチド；ミョウバン；水酸化アルミニウム；スクアレン；ＢＣＧ；ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２などのサイトカイン；ＭＩＰ １−αおよびＲＡＮＴＥＳなどのケモカイン；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）；チモシンα１、およびＭＦ５９が挙げられる。用いられるアジュバントの量は、皮膚の軟化、疼痛、紅斑、発熱、頭痛、および筋肉痛などの症状の程度に応じて適宜選択されることができる。これらの症状は、ヒトまたは動物においてこの種のワクチン投与後の免疫応答の一部として発現されることもある。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書に記述するワクチン組成物または医薬組成物は、他の既知の医薬品、たとえば免疫応答促進ペプチドおよび抗菌剤（合成抗菌剤）と組み合わせて用いられうる。該ワクチン組成物または医薬組成物は、他の薬物および添加剤をさらに含みうる。本明細書に記述するワクチン組成物または医薬組成物と組み合わせて用いられうる薬物ま添加剤の例としては、本発明の組換えアデノウイルスまたは組換えトランスジェニックタンパク質の細胞内取り込みを補助する薬物、トランスフェクションを促進するリポソームおよび他の薬物ならびに／または添加剤（たとえば、フルオロカーボン乳化剤、コキレート、チューブル、金粒子、生分解性マイクロスフェア、およびカチオン性ポリマー）が挙げられる。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書に記述するワクチン組成物または医薬組成物に含有される有効成分の量は、それが治療的にもしくは薬学的に有効な量である限り、広範囲の濃度、ウイルス粒子単位（ＶＰＵ）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）、質量対容量百分率（ｗ／ｖ%）または有効成分量の他の定量的測度から選択されうる。ワクチン組成物または医薬組成物の投与量は、所望の治療効果、投与方法（投与経路）、治療期間、患者の年齢、性別、および他の条件などによって広範囲から適切に選択されうる。
【００４７】
一部の態様では、組換えアデノウイルスがワクチン組成物または医薬組成物の有効成分としてヒト被験者に投与されるとき、組換えアデノウイルスの投与量は、組換えウイルスのＰＦＵとして算出され、患者一人あたりおよそ１０^２〜１０^１４ＰＦＵ、好ましくは１０^５〜１０^１２ＰＦＵ、より好ましくは１０^６〜１０^１０ＰＦＵに対応する量で投与されうる。
【００４８】
さらなる態様では、組換えアデノウイルスがワクチン組成物または医薬組成物の有効成分として被験者に投与されるとき、投与量は、ワクチンの宿主に導入される発現可能なＤＮＡの量または転写ＲＮＡの量に関して広範囲から選択されうる。該投与量は、使用されるいずれのトランスファーベクターで用いられる転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強度にも依存する。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書に記述するワクチン組成物または医薬組成物は、組換えアデノウイルスをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）または生理食塩水中で験濁させることで調製される組換えアデノウイルス験濁剤を直接局所部位に（たとえば肺組織、肝臓、筋肉もしくは脳内に）注射することによって、鼻腔急吸入もしくは呼吸吸入によって、または血管内（ｉ．ｖ．）（たとえば動脈内、静脈内、および門脈内）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｅ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、もしくは腹腔内（ｉ．ｐ．）への投与によって投与されうる。本発明のワクチン組成物または医薬組成物は、複数回投与されうる。より具体的には、最初の投与の後、１回または複数回の追加接種が、追加免疫として投与されうる。１回または複数回の追加免疫投与によって、所望の効果を増強することができる。ワクチン組成物または医薬組成物の投与の後、本明細書に記述する組換えアデノウイルスを含有する医薬組成物による追加免疫が実行されうる。
【００５０】
さらなる実施形態では、上述のように、本発明のワクチンと共に種々の他のアジュバント、薬物もしくは添加剤を使用することで、該ワクチン組成物または医薬組成物の投与によって達成される治療効果を増強しうる。薬学的に許容される担体は、等張性および化学安定性を増強する物質などの微量の添加剤を含んでもよい。かかる添加剤は、使用される投与量および濃度においてヒトまたは他の哺乳類の被験者に対して非毒性でなければならない。その例としてはリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸、ならびにその塩類；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（たとえば約１０未満の残基）ポリペプチド（たとえポリアルギニンおよびトリペプチド）タンパク質（たとえば血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリン）；アミノ酸（たとえばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびアルギニン）；単糖、二糖、および他の糖質（たとえばセルロースおよびその誘導体、グルコース、マンノース、およびデキストリン）、キレート化剤（たとえばＥＤＴＡ）；糖アルコール（たとえばマンニトールおよびソルビトール）；対イオン（たとえばナトリウム）；非イオン界面活性剤（たとえばポリソルベートおよびポロキサマー）；ならびにＰＥＧなどの緩衝剤が挙げられる。
【００５１】
本明細書に記述する組換えアデノウイルスを含有するワクチン組成物または医薬組成物は、密封アンプルまたはバイアルなどの単位用量または複数用量の容器に水溶液剤または凍結乾燥製剤として保存されうる。
【００５２】
さらなる別の実施形態は、有効量の組換えアデノウイルスワクチン、製剤または医薬組成物を投与することを含むマラリア感染症を予防する方法、またはマラリアを治療する方法を提供する。本発明は、有効量の組換えアデノウイルスワクチンの組成物、製剤、医薬組成物またはその組み合わせを被験者に投与することを含む免疫活性化の方法をさらに提供する。被験者は、ヒト、動物（たとえば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類および両生類）、またはマラリア寄生虫に感染しうる他のいずれの被験者も含みうる。マラリア寄生虫は、既知のマラリア原虫種、たとえば、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、マウスマラリア原虫、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）およびネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のいずれかから選択されマラリア原虫を含みうる。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書に記述する組換えアデノウイルスは、単独で形成されることもあり、または薬学的に許容される担体と共にワクチン組成物、製剤、または医薬組成物に形成されることもあり、かつ前述の被験者に投与されうる。投与経路は、たとえば、上記のいずれの投与経路であってもよい。本発明で使用する薬学的に許容される担体は、生成されるべき医薬組成物の形状によって、本技術分野で一般的に用いられる担体から適宜選択されることができる。たとえば、薬理組成物が水溶液に形成されるとき、純水（滅菌水）または生理的緩衝液が担体として使用されることができる。医薬組成物が他の適切な溶液に形成されるとき、注射されることができる有機エステル、たとえばグリコール、グリセロール、およびオリーブ油が担体として用いられうる。該組成物は、安定剤、賦形剤、および本技術分野で、特にワクチン製剤分野で一般的に使用される他の物質を含みうる。
【００５４】
さらなる実施形態では、ワクチン組成物、製剤、または医薬組成物で用いられる組換えアデノウイルスの量は、広範囲の濃度、ＶＰＵ、ＰＦＵ、質量対容量百分率（ｗ／ｖ%）または有効成分量の他の定量的測度から選択されうる。一部の態様では、組成物の組換えアデノウイルスの適切な範囲は、好ましくは約０．０００２〜約０．２（ｗ／ｖ %）、より好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ %）ある。一部の実施形態による組換えアデノウイルスワクチン組成物、製剤または医薬組成物の投与方法は、剤形、患者の年齢、性別、および疾患の重症度など他の条件によって適宜選択されうる。適切な剤形は、注射剤、滴下剤、点鼻薬および吸入剤などの非経口的投与のための形状である。該組成物が注射剤または滴下剤に形成される場合、該注射剤は、必要に応じてグルコース溶液またはアミノ酸溶液などの代替液と混合されて静脈内に投与されることができ、または筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｅ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、もしくは腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与されることができる。
【００５５】
別の実施態様では、組換えアデノウイルスワクチン組成物、製剤、または医薬組成物の１日投与量は、被験者の状態、体重、年齢、性別などに応じて異なりうる。一部の態様では、組換えアデノウイルスの投与量は、１日あたり約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。本発明のワクチン、製剤、または組成物は、１日あたり１回または複数回の投与で投与されうる。
【００５６】
さらなる実施形態では、組換えアデノウイルスがワクチン組成物、製剤または医薬組成物の有効成分としてヒト被験者に投与されるとき、組換えアデノウイルスの投与量は、組換えウイルス粒子のＰＦＵとして算出され、患者一人あたりおよそ１０^２〜１０^１４ＰＦＵ、好ましくは１０^５〜１０^１２ＰＦＵ、より好ましくは１０^６〜１０^１０ＰＦＵに対応する量で投与される。本発明のワクチンの組成物は、各患者の臨床症状（たとえば、予防または治療されるべき症状）、組換えアデノウイルスを含有するワクチン組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与量レジメン、および当業者にとって既知の他の因子を考慮して、良質の医療のための原則に従って投与されるべきである。したがって、本明細書のワクチン組成物の適当な投与量は、上記を考慮して決定される。
【００５７】
本開示のさらに別の実施形態は、被験者においてマラリア感染症を治療する、または予防する方法に関し、該方法は、組換えアデノウイルスを含むマラリアワクチン組成物の免疫量または治療量を投与することを含む。マラリアワクチンの組換えアデノウイルスは、マラリア原虫の抗原決定基を含んでもよく、かつ１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質をさらに含んでもよい。免疫量、薬理量、または治療量は、マラリア感染症が予防されるか、または重症度が低減されるように、強力な免疫応答が（ＣＳ）タンパク質（すなわち導入遺伝子、Ｂ細胞エピトープ、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ）の１つまたは複数の抗原部分に対して生成される、任意の適切な量であってよい。
【００５８】
被験者がアデノウイルスベクターに最初に曝露される、または「初回刺激される」とき、免疫系は、その特定のベクターに対して中和抗体を産生する。アデノウイルスに対する免疫応答は、通常カプシドタンパク質対して作られる。したがって、同じアデノウイルスベクターに対する次の曝露、すなわち「追加免疫」は、導入遺伝子発現の効力を低下させることができる。したがって、一部の実施形態では、上記のマラリア感染症を治療する、または予防する方法は、第１の組換えアデノウイルスベクターを用いる初回刺激ステップと、続いて１種または複数種の異なる組換えアデノウイルスベクターを用いる１回もしくは複数回の追加免疫のステップとを含みうる。野生型アデノウイルスにまだ曝露されたことのない被験者において、またはこれまでに野生型アデノウイルスベクターに曝露されたことのある被験者においてこの方法は、用いられてもよい。後述の被験者の場合、初回刺激ステップの組換えアデノウイルスベクターを用いて既存のアデノウイルス免疫を回避する。さらなる実施形態および実施例を後述する。
【００５９】
＜ベクターとしてのアデノウイルス＞
アデノウイルスは、一連のウイルスカプシドタンパク質（以下に記述する）と、１つのウイルスゲノムを含む非エンベロープ被覆型ＤＮＡウイルスであり、１種もしくは複数種の治療用導入遺伝子または抗原導入遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで種々の細胞に送達するために広範に用いられてきた。アデノウイルス血清型は数多く存在する。既知のアデノウイルス血清型のうち、血清型５（Ａｄ５）は、ｉｎ ｖｉｖｏでその高い感染性のために、外来遺伝子の導入のためのベクターとして好ましくは用いられている（Ａｂｂｉｎｋら ２００７）。抗原導入遺伝子の発現は、当技術分野で既知のいずれのプロモーターまたはエンハンサーのエレメントによって制御されうる。遺伝子発現を制御するのに用いられてもよいプロモーターはとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、細胞ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１）プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびテトラサイクリン調節（ＴＲ）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。コード配列の後のポリアデニル化（ｐＡ）シグナルは、効果的な転写および翻訳のためにも用いられうる。本明細書に記述する組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルゲノムの少なくともＥ１領域において欠失を有する複製欠損でありうる。これはＥ１領域が複製、転写、翻訳およびパッケージングのプロセスに必要とされるからである。一部の態様では、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４の領域も欠失しうる。さらなる態様において、Ｋｏｚａｋ共通配列は、より効果的な翻訳のために用いられうる（Ｋｏｚａｋ １９８７）。
【００６０】
アデノウイルス（Ａｄ）系は、いくつかの理由で組換えワクチンの開発のための魅力あるベクターである。１つの理由は、組換えアデノウイルスベクターは、これらに限定されないがマウスおよびヒトの細胞型を含む、大部分の哺乳類細胞型（複製型および非複製型の双方）を感染させるからである。したがって、同じベクターを、マウスモデルおよびヒト臨床試験でうまく用いることが可能である。別の理由は、転移されたいずれの遺伝情報がエピ染色体にとどまり、細胞遺伝子型の挿入変異および変化を回避するからである（Ｃｒｙｓｔａｌ １９９５）。さらに別の理由は、ウイルス複製のラウンドを連続した後でも、導入遺伝子が不変のままであるからである。アデノウイルスを用いる他の利点は、以下が挙げられる：組換えアデノウイルスは１）高いビリオン安定性を有する、２）耐容性がよい、３）高力価で増殖しうる、４）大きな導入遺伝子を収容することができる，５）長年にわたり広範囲に研究されたゲノムを有しており、その結果いくつかの血清型の全ＤＮＡ配列が分かり、組換えＤＮＡ技術によるＡｄゲノムの操作が容易になっている（ＧｒａｈａｍとＰｒｅｖｅｃ １９９２）。
【００６１】
一実施形態では、前赤内期のマラリア寄生虫を標的にするワクチンの開発のためのウイルスベクターとしてアデノウイルスワクチンプラットフォームを用いて、マラリア感染からの防御を提供する。既知の組換えウイルスベクター（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７、Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏら ２００１、Ａｎｄｅｒｓｏｎら ２００４、Ｔａｏら ２００５）のなかで、アデノウイルスは、前赤内期のマラリア寄生虫に対して強い防御の細胞性免疫応答を誘発することができる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７）。マラリア寄生虫は、マラリア原虫ファミリーのうちのいずれか１つで有りうる。一部の実施形態では、標的とされる該寄生虫は、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）または熱帯熱マラリア原虫でありうる。
【００６２】
＜導入遺伝子としてＰｙＣＳを発現するアデノウイルスベクターは、マラリア特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘発する＞
アデノウイルスは、マラリアに対して重要なＣＤ８＋ Ｔ細胞介在防御免疫を誘発するための魅力あるベクターである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９８）。ネズミマラリア原虫（齧歯目のマラリア寄生虫）ＣＳタンパク質（ＡｄＰｙＣＳ）を発現する組換えアデノウイルスの免疫原性は、齧歯目のマラリアモデルを使用して決定された。ＡｄＰｙＣＳをマウスに接種すると、かなりの割合のマウスにおいて、完全免疫が誘発され、寄生虫血症の発生を予防する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７）。Ｔ細胞集団を枯渇させることによって明らかになり、かつＡｄＰｙＣＳがマラリア寄生虫に対して高力価の抗体応答を誘発することができなかった事実によって実証されているように、この防御効果は、主にＣＤ８＋ Ｔ細胞によって介在される。
【００６３】
カプシド修飾型アデノウイルスの感染性を定量的に測定するために、シャトルベクターにＧＦＰ発現カセットと導入遺伝子のクローニング部位とを含ませてもよい。結果として生じるシャトルベクター（ＧＦＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ）は、デュアルｐＣＭＶプロモーターと、導入遺伝子のためのＳＶ４０ｐＡと、ｐｍａｘＧＦＰ（Ａｍａｘａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＧＦＰとを有する。最適化ＰｙＣＳ断片をＧＦＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩの部位に挿入した。
【００６４】
Ａｄ（ＰｙＣＳ＋ＧＦＰ）の免疫原性は、ＣＳ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の大きさと、マラリア原虫肝臓内期に対する防御免疫のレベルとを測定することによって決定された。異なる経路を介して、最適用量でＡｄ（ＰｙＣＳ＋ＧＦＰ）を投与することで、１０^１０ウイルス粒子（ｖ．ｐ．）は、ＡｄＰｙＣＳが誘発することを示した同じパターンの抗マラリア防御応答を誘発し、ｓ．ｃ．およびｉ．ｍ．経路で、最も強い応答を誘発し、生ネズミマラリア原虫スポロゾイトを投与されたマウスにおいて肝臓内期での最も高い程度の抑制をもたらした。これは、ワクチンとしてＡｄ（ＰｙＣＳ＋ＧＦＰ）がＡｄＰｙＣＳと同等に作用し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら １９９７）、かつａＡｄＰｙＣＳのｉｎ ｖｉｖｏ向性を決定する潜在的に有用なツールであることを示している。
【００６５】
＜アデノウイルスのカプシドタンパク質およびコアタンパク質＞
ＣＳタンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクターがＣＤ８＋ Ｔ細胞によって強力な細胞性免疫応答を誘発するが、はっきりと認識できる体液性応答は誘発されないことを上述の研究で確認された。したがって、野生型アデノウイルスに対する体液性応答がカプシドタンパク質に起因しうることが多いので、修飾型カプシドタンパク質およびコアタンパク質で組換えアデノウイルスベクターを構築することで、１）Ｂ細胞活性を介する体液性免疫を増強し、２）Ｔヘルパー細胞活性を介する体液性免疫を増強し、および３）既存するアデノウイルス免疫を回避する。
【００６６】
アデノウイルスは、正三角形の２０面を有する正二十面体の形状の非エンベロープ被覆型ネイキッド二重鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスカプシドは、２５２カプソメアからなり、そのうち２４０がＨｅｘｏｎ三量体であり、１２がＰｅｎｔｏｎ五量体である。各Ｐｅｎｔｏｎ塩基から突き出ているＦｉｂｅｒタンパク質は、細胞受容体との相互作用によって宿主細胞への接着を媒介する。二次的相互作用は、Ｐｅｎｔｏｎ塩基内のＲＧＤ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）モチーフ間でαｖβ３、αｖβ５および同様のインテグリンによって生じ、その後の細胞へのアデノウイルスの内部移行を容易にする（Ｍａｔｈｉａｓら １９９４、Ｗｉｃｋｈａｍら １９９３）。ほとんどのアデノウイルスは、細胞受容体として、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を使用する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら １９９７）。加えて、ＭＨＣクラス１分子、ＶＣＡＭ、およびヘパラン硫酸は、Ａｄ５の接着と侵入を媒介することが示されている（Ｃｈｕら ２００１、Ｈｏｎｇら １９９７）。エンドサイトーシスを介する侵入に続いて、Ａｄ５はエンドサイトーシス区画からサイトゾルに迅速に逃避する（ＭｅｉｅｒとＧｒｅｂｅｒ ２００３、ＬｅｏｐｏｌｄとＣｒｙｓｔａｌ ２００７）。次いで、ビリオンは、微小管を用いて核に移動する。Ｆｉｂｅｒタンパク質は、プロセスにおいて最も初期のカプシドタンパク質として脱落される（Ｎａｋａｎｏら ２０００、Ｈｏｎｇら ２００３）。異なる血清型のアデノウイルスは、異なる輸送パターンを示す（Ｍｉｙａｚａｗａら １９９９、Ｍｉｙａｚａｗａら ２００１）。Ｆｉｂｅｒタンパク質を変えるまたは修飾することで、輸送に影響を与えることができる。これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の感染に続いて、抗原プロセシングおよび提示に関して特に重要になりうる。
【００６７】
アデノウイルスＦｉｂｅｒは、Ｆｉｂｅｒ尾部、シャフト、およびノブのドメインに分けられる三量体である（Ｈｅｎｒｙら １９９４、ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２００４、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら １９９５）。ノブドメインの三次元構造は知られおり、変異原性研究と共に、これらの研究は、ＣＡＲ相互作用と三量体形成に関与する領域を視覚化させることを可能にする（Ｋｉｒｂｇｙら １９９９、Ｘｉａら １９９５）。Ｆｉｂｅｒシャフトは、ビリオンから突き出ており、Ｆｉｂｅｒノブはコサッキーおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）相互作用ドメインを含む（Ｒｏｅｌｖｉｎｋら １９９９、Ｂｅｗｌｅｙら １９９９）。ＦｉｂｅｒノブのＣＡＲ結合部位は、一次的にＡＢループとＣＤループからの残基からなり、二次的にＦＧとＨＩループ、次いでＢ、ＥおよびＦのβシートに伸長する（Ｒｏｅｌｖｉｎｋら １９９９、Ｂｅｗｌｅｙら １９９９）。ＨＩループは、最も研究されたＦｉｂｅｒノブ上の挿入部位（Ｗｏｒｇａｌｌら ２００４、ＭｉｚｕｇｕｃｈｉとＨａｙａｋａｗａ ２００４、Ｋｏｉｚｕｍｉら ２００３、Ｂｅｌｏｕｓｏｖａら ２００２、ＮｏｕｒｅｄｄｉｎｉとＣｕｒｉｅｌ ２００５、Ｎｉｃｋｌｉｎら ２００１）であり、ＨＩループ（残基５４３と５４４）へのエピトープの組み込みは、強力な抗エピトープ免疫をもたらす（Ｋｒａｕｓｅら ２００６）。したがって、免疫優性ＣＳ由来のＢ細胞エピトープは、Ｆｉｂｅｒタンパク質のＨＩループに最初に挿入された。
【００６８】
Ｈｅｘｏｎは、１ビリオンあたり７２０コピーを有する、アデノウイルスカプシドで最も豊富なタンパク質である。成熟したウイルスでは、Ｈｅｘｏｎは、正二十面体ビリオンの小面から構成されるホモ三量体のカプソメアとして存在する（ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２００４）。アデノウイルス血清型２および５（Ａｄ２およびＡｄ５）のＨｅｘｏｎのの結晶構造は解析されており、複合分子構造が明らかになった（Ａｔｈａｐｉｌｌｙら １９９４、Ｒｏｂｅｒｔｓら １９８６、ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２０００）。各単量体サブユニットのベースは、多くの正二十面体のウイルスのカプシドタンパク質に存在する２つのβ−バレルモチーフからなる。３つの長いループ（ＤＥ１、ＦＧ１、およびＦＧ２）は、ベース構造から伸びて、各分子のタワー領域を形成する（ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２００４）。これらのループドメイン内の配列は、カプシドの表面から突出して、ビリオンの外側を形成する。異なるアデノウイルス血清型からの配列比較は、カプシド外部上に位置する配列が長さとアミノ酸配列との両方で不完全に保存されていることを示している（Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａとＳｃｈｎｕｒｒ １９９６）。さらに、これらの不完全に保存されたドメイン（高頻度可変領域（ＨＶＲ）と名付けられる）に位置する配列が決定基を含み、それらの決定基に対して血清型特有の抗体が産生されることが示された（Ｔｏｐ １９７５、ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２０００、Ｔｏｐら １９７１）。
【００６９】
初期の配列比較に基づいて、Ｈｅｘｏｎ分子全体を通して７つのＨＶＲが同定された（Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａとＳｃｈｎｕｒｒ １９９６、Ｒｏｂｅｒｔｓら ２００６）。ＨＶＲは血清型間で不完全に保存されており、かつＨｅｘｏｎの構造的完全性を維持することに関与していないと思われるので、ウイルスの生存能に影響を及ぼすことなく少量の変化がこれらのドメインになされることができた（ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２０００）。ととえば、ヘキサヒスチジンタグは、ウイルス生存能を損なうことなく、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６、およびＨＶＲ７に挿入されることができる（Ｗｕら ２００５）。このようにして、Ｈｅｘｏｎ ＨＶＲを標的として用いて、Ｈｅｘｏｎ ＨＶＲ内に位置するペプチドに対する抗体応答を効率的に誘発させることが多い（Ｗｏｒｇａｌｌら ２００５、Ｃｒｏｍｐｔｏｎら １９９４）。血清型間でその長さが完全に保存されないこと、およびアデノウイルスカプシドの最外側表面上のその位置のために（ＲｕｘとＢｕｒｎｅｔｔ ２０００、Ｃｒａｗｆｏｒｄ−ＭｉｋｓｚａとＳｃｈｎｕｒｒ １９９６）、Ｈｅｘｏｎ ＨＶＲ５は、最初はエピトープ挿入のための部位として選択された。さらに、ＨＶＲ５がカプシド表面上の柔軟なループであることをＨｅｘｏｎの結晶構造が示しており、ＨＶＲ５がカプシドの構造的完全性を損なうことなく比較的大きなペプチドを収容することができることを示唆している（Ｒｏｂｅｒｔｓら １９８６）。Ｈｅｘｏｎ特異的ＣＤ４＋エピトープおよびＣＤ６＋エピトープが最近同定されて（Ｌｅｅｎら ２００８）、アデノウイルスへのＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、ヒトにおいてＨｅｘｏｎタンパク質内に保存された残基に対して集中する（Ｏｎｉｏｎら ２００７、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｔら ２００６）ことが判明した。
【００７０】
アデノウイルスのコアは、ウイルスゲノムと４種類のコアタンパク質で構成されている。末端タンパク質（ＴＰ）は、１ビリオンあたり２つのコピーで各直鎖状ウイルスＤＮＡ鎖の５’末端に共有結合される。他の３種類のコアタンパク質、ｍｕ（μ）、Ｖ（ｐＶ）およびＶＩＩ（ｐＶＩＩ）は、アルギニンリッチタンパク質を介して非共有結合的かつ非特異的にウイルスＤＮＡに結合している。ｐＶＩＩは、１ビリオンあたりおおよそ７００〜８００コピーを提供する主要なコアタンパク質であり、かつその周りをウイルスＤＮＡで包まれてヌクレオソーム構造を形成している、ヒストン様中枢として役立っている。
【００７１】
＜体液性免疫を増強するためのアデノウイルスカプシドタンパク質の修飾＞
一部の実施形態では、アデノウイルスカプシドタンパク質（ＨｅｘｏｎまたはＦｉｂｅｒに挿入された）内に免疫優性ＣＳタンパク質Ｂエピトープを有する、スポロゾイト周囲（ＣＳ）アデノウイルスベクターが記述されている。導入遺伝子は、ＣＳタンパク質に対する細胞介在免疫応答および体液性免疫応答を増強するために、ＣＭＶなどのプロモーター下に存在しうる。
【００７２】
中心反復領域は、マラリア原虫種間でＣＳタンパク質の保存された構造であり、かつこの反復配列に対する抗体は、スポロゾイト中和活性を有することが示されている。マラリア原虫ＣＳタンパク質内の反復配列の例として、（ＮＡＮＰ）_ｎ反復（熱帯熱マラリア原虫；配列番号６０）、ＡＮＧＡＧＮＱＰＧ反復（三日熱マラリア原虫；配列番号６３）、およびＮＡＡＧ反復（四日熱マラリア原虫；配列番号６４）があり、これらはアデノウイルスカプシドタンパク質に挿入されることができる。一部の実施形態では、ＰｆＣＳＰの４以上の（ＮＡＮＰ）_ｎ反復（配列番号６０）は、アデノウイルス血清型５ＨｅｘｏｎのＨＶＲ１に挿入されうる。一部の実施形態では、ＰｆＣＳＰの２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８の（ＮＡＮＰ）_ｎ反復（配列番号６０；ｎ＝２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８）は、アデノウイルス血清型５ＨｅｘｏｎのＨＶＲ１に挿入される。（ＮＡＮＰ）_ｎ反復配列は、ＦｉｂｅｒのＨＩループにさらに挿入されうる。
【００７３】
一部の実施形態では、改良型ＣＳタンパク質アデノウイルスワクチンを開発するために、ＣＳに対する免疫優性中和Ｂ細胞エピトープがマッピングされた。組換えネズミマラリア原虫ＣＳタンパク質（ＰｙＣＳ）で免疫されたマウスは、２つの主要免疫優性Ｂエピトープ、すなわちＱＧＰＧＡＰ（配列番号５９）とＱＱＰＰ（配列番号６５）に対して高力価を生成したが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイでは、（ＱＧＰＧＡＰ）_３のペプチド（配列番号５９；ｎ＝３）を培地に加えることによって中和が逆転されうるために、ＱＧＰＧＡＰエピトープ（配列番号５９）それ自体に対する体液性免疫応答が中和活性の主な原因となりうることを示した。一部の実施形態では、ＰｙＣＳの３以上の（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９）は、アデノウイルス血清型５ＨｅｘｏｎのＨＶＲ１に挿入される。一部の実施形態では、ＰｙＣＳの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９；ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）は、アデノウイルス血清型５ＨｅｘｏｎのＨＶＲ１に挿入されうる。（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復配列は、ＦｉｂｅｒのＨＩループにさらに挿入されうる。
【００７４】
Ｂ細胞エピトープペプチドは、免疫系がエピトープを効率的に認識することができるように、アデノウイルスビリオンの表面に提示されなければならない。かかる挿入部位は、ＨｅｘｏｎのＨＶＲおよびＦｉｂｅｒ内のループ構造でありえ、かつ異なる挿入部位が組み合わせられてもよい。
【００７５】
＜Ｔヘルパー細胞活性を増強するためのアデノウイルスカプシドタンパク質とコアタンパク質の修飾＞
別の実施例では、アデノウイルスベクターで用いられる導入遺伝子に特異的なＣＤ４＋エピトープを、ｐＶＩＩ、ｐＶおよびＨｅｘｏｎなどのアデノウイルスタンパク質に取り込んでアデノウイルスベースワクチンの免疫原性を増強させうる。樹状細胞（ＤＣ）およびＢ細胞などの専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、エンドサイトーシスを介して微粒子状の病原体様ウイルス粒子を取り込むことができ、次いで該病原体中のＣＤ４＋エピトープをＣＤ４＋ Ｔ細胞に提示し、それによって体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答のヘルパー細胞として作用する。１ビリオンあたりのコピー数がｐＶＩＩ（７００〜８００コピー）およびＨｅｘｏｎ（７２０コピー）と高いため、ｐＶＩＩおよびＨｅｘｏｎをアデノウイルス標的タンパク質として用いて、抗原ＣＤ４＋ペプチドに容易に挿入することができる。
【００７６】
＜既存のアデノウイルス免疫を増強するためのアデノウイルスカプシドタンパク質の修飾＞
一部の実施形態では、アデノウイルスに対する既存の免疫を克服するため、および／またはアデノウイルスワクチンに対する体液性応答を増強するために、アデノウイルスＦｉｂｅｒおよびＨｅｘｏｎのカプシドタンパク質は、Ｂ細胞エピトープまたはＴヘルパー細胞エピトープを挿入するよう修飾されうる。ヒト集団において若年成人の推定８０％がアデノウイルスに対する循環中和抗体（Ｄｏｕｇｌａｓ ２００７）、特に血清型５（Ａｄ５）を有する。遺伝子治療ベクターとしてアデノウイルスを利用する研究では、動物内の中和抗体の存在が、アデノウイルスによって送達される導入遺伝子の発現を限定していることが判明した。中和抗体に加えて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答も、組換え遺伝子発現を限定する一因となっている（Ｙａｎｇら １９９５、Ｙａｎｇら １９９６）。アデノウイルスに対するかかる既存の免疫は、組換えアデノウイルスワクチンの有効性を阻害することがいままでに報告されており（Ｐａｐｐら １９９９）、また臨床試験において、アデノウイルスベースワクチンの免疫原性を低下させている（Ｐｒｉｄｄｙら ２００８）。
【００７７】
Ｈｅｘｏｎは抗Ａｄカプシド免疫応答の主要な標的であり（Ｒｏｙら ２００５、Ｗｏｈｌｆａｒｔ １９８８）、ＣＤ４＋とＣＤ８＋のＴ細胞応答の誘発を含むアデノウイルスの強力なアジュバント効果の原因であると思われる。したがって、既存の抗アデノウイルス免疫を回避するために使用されてきた１つの戦略は、Ｈｅｘｏｎ全体または一部を異なるタンパク質、たとえばアデノウイルス１１、２４、２６および３５などのまれな血清型と置換することである。Ｈｅｘｏｎは抗アデノウイルス中和抗体の主要な標的である（Ｙｏｕｉｌら２００２、Ｓｕｍｉｄａら２００５）ために、全ＨｅｘｏｎまたはＨｅｘｏｎのＨＶＲはまれな血清型と交換されうる（Ｗｕら ２００２、Ｒｏｂｅｒｔｓら ２００６）。
【００７８】
本明細書の一実施形態で記述した別の戦略では、既存の抗アデノウウイルス免疫またはアデノウウイルスベクターによる以前のワクチン接種によって誘発された抗アデノウウイルス中和抗体を増強するために、アデノウイルスＨｅｘｏｎは、ＨＶＲ１またはＨＶＲ５と抗原ペプチドとの置換によって修飾されうる。一部の実施形態では、抗原ペプチドはマラリア原虫ＣＳタンパク質の免疫原性エピトープであってもよく、特定の態様では、該エピトープは中心反復配列、ＣＤ４＋エピトープ配列またはＣＤ８＋エピトープ配列を含みうる。
【００７９】
同じ血清型のＡｄベクターによる反復投与は、免疫化後の坑Ａｄ免疫のために阻止される。したがって、多くのＡｄワクチンは、導入遺伝子によってコードされた抗原の発現と提示を防ぐことでワクチンの追加免疫を妨げる（Ｙａｎｇら １９９５、Ｈａｃｋｅｔｔら ２０００、Ｈａｒｖｅｙら １９９９、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら １９９６）。後述の実施例に記述するように特異的エピトープをＡｄカプシドに追加することで、一部の実施形態によるこの妨害を低下しうる、または排除しうる。
【００８０】
実施形態をよりよく説明するため、およびクレームするいずれの実施形態の範囲を限定すると解釈されないようにするために以下の実施例を提供する。特定の材料が記載される範囲は、説明の目的だけであり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、発明能力を行使することなく、および本発明の範囲から逸脱することなく、同等の方法または反応物を開発しうる。本発明の範囲内に依然として留まりつつ、多くのバリエーションが本明細書に記述する方法でなされうることを理解されるであろう。かかるバリエーションが本発明の範囲内に含まれることは、本発明者らの意思である。
【実施例】
【００８１】
実施例１：カプシド修飾型マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質アデノウイルスプラスミドベクターおよび組換えアデノウイルス粒子の構築
【００８２】
エピトープマッピング
まず、ＰｙＣＳの免疫優性中和Ｂ細胞エピトープを選択した。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにフロイント不完全アジュバントと共に組換えＰｙＣＳタンパク質を３回免疫し、プールした血清を用いて、中和抗体の重要なエピトープを決定した。
【００８３】
簡単に言うと、中和アッセイでは、ヒトＣＤ８１発現ＨｅｐＧ２細胞を標的細胞として用いた。ＣＤ８１は、マラリア寄生虫が増殖して、シゾントになる肝細胞においてパラシトホーラスバキュオールを形成するために必要な分子であり（Ｓｉｌｖｉｅら ２００６）、したがってスポロゾイトのｉｎ ｖｉｔｒｏ感染力が極めて高い。
【００８４】
本アッセイでは、ＰｙＣＳ合成ペプチドをウェルに加えて、ペプチド特異的抗体を遮断した。エピトープマッピングの結果は、ＰｙＣＳ中心反復配列（ＱＧＰＧＡＰ；配列番号５９）がＰｙＣＳにおいてＱＱＰＰ（配列番号６５）よりもより強力な中和エピトープであることを示した。したがって、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎエピトープ（配列番号５９）の挿入を用いて、アデノウイルスカプシドタンパク質、Ｈｅｘｏｎおよび／またはＦｉｂｅｒを修飾した。
【００８５】
カプシド修飾型プラスミドベクターの構築
クローニング部位下にＧＦＰ発現カセットを挿入することでアデノウイルスシャトルベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を修飾した。まず、ｐｍａｘＧＦＰ（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢｓｍＢＩ−ＳａｃＩ断片（ｐＣＭＶ＋ＧＦＰ）とＳａｃＩ−ＢｓｍＢＩ断片（ＳＶ４０ポリＡｓｈｉｇｕｎａｒｕ）を平滑末端化して、ｐＵＣ１９の平滑末端化Ｓａｌｌ部位とＫｐｎＩ部位にそれぞれ挿入した。もたらされたｐＣＭＶ−ＧＦＰ／ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＳＶ４０ｐＡ／ｐＵＣ１９の同じ部位に挿入して、ＳＶ４０ｐＡ−ｐＣＭＶ−ＧＦＰ断片を作製した。該断片を平滑末端化して、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。結果として生じるシャトルベクター（ＧＦＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ）は、導入遺伝子とＧＦＰのためのデュアルｐＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ｐＡを有する。
【００８６】
アデノウイルスシャトルベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶの別の修飾を行って、ＣＭＶプロモーター領域をｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５（ＱＢＩＯｇｅｎｅ）からのＣＭＶ５プロモーターと置換した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ内でｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩ断片をＣＭＶ５プロモーター配列と、ＣＭＶプロモーターからの上流配列とを含む断片と置換して、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ５ベクターを構築した。
【００８７】
ネズミマラリア原虫ＣＳ（ＰｙＣＳ）遺伝子は、ＪＣａｔコドン最適化アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ ｊｃａｔ ｄｅ／）に基づいてＰＣＲ反応を重複させることによって、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９）を除いて、コドン最適化した。
【００８８】
熱帯熱マラリア原虫３Ｄ７株のＰｆＣＳＰアミノ酸配列をコドン最適化のための鋳型配列として用いた。ヒトにおいてタンパク質発現のためのコドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）の最適化ソフトウェアによって行った。Ｃ末端でＧＰＩアンカードモチーフを除く全ＰｆＣＳＰをコードするＤＮＡ断片（図１０；配列番号２）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成した。
【００８９】
コドン最適化ＰｙＣＳ遺伝子（図９；配列番号１）またはＰｆＣＳＰ遺伝子（図１０；配列番号２）を、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ５、またはＧＦＰ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。ＡｄＥａｓｙ−１による相同組換えのために、もたらされたマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターを用いて、マラリア原虫スポロゾイト周囲抗原遺伝子と、インタクトなアデノウイルスタンパク質コード配列とを有するアデノウイルスゲノムを構築した。簡単に言うと、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターをＰｍｅＩ消化によって直線化し、次いで相同組換えのために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３細胞を直線化シャトルベクターおよびｐＡｄＥａｓｙ−１ベクター（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏら ２００３）と同時形質転換させた。
【００９０】
アデノウイルスカプシドタンパク質の修飾を要約して、図１に示す。アデノウイルスゲノムＤＮＡのＨＶＲ１配列の修飾を図２に示す。簡単に言うと、ＡｄＥａｓｙ−１をＳｆｉＩで消化させて、６．４ｋｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＳｆｉＩおよびＰｓｔＩ−ＳｆｉＩリンカーオリゴマーを用いて、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位とＰｓｔＩ部位にサブクローニングさせた。ＨＶＲ１をマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｂ細胞エピトープと置換するために、ＡｇｅＩ部位とＮｄｅＩ部位を含む領域を、ＨＶＲ１配列の代わりにエピトープ配列を有するプライマーを用いる２ステップＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をＡｇｅＩとＮｄｅＩで消化させ、次いでこれを用いてＳｆｉＩ／ｐＵＣ１９ベクター中のＳｆｉＩ断片のナイーブＡｇｅＩ−ＮｄｅＩ領域を置換した。配列を確認した後に、アデノウイルスゲノムＤＮＡのＳｆｉＩ断片を、スポロゾイト周囲エピトープ配列を含むＳｆｉＩ断片と置換して、ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎを生成した。一部の実施形態では、ＨＶＲ修飾型Ｈｅｘｏｎは、配列番号３（図１１−１〜図１１−３）、配列番号４（図１２−１〜図１２−３）、配列番号５（図１３−１〜図１３−３）、配列番号６（図１４−１〜図１４−３）、配列番号７（図１５−１〜図１５−３）、配列番号８（図１６−１〜図１６−３）、配列番号９（図１７−１〜図１７−３）、配列番号１０（図１８−１〜図１８−３）、配列番号１１（図１９−１〜図１９−３）、配列番号１２（図２０−１〜図２０−３）、配列番号１３（図２１−１〜図２１−３）、配列番号１４（図２２−１〜図２２−３）、配列番号１５（図２３−１〜図２３−３）、配列番号１６（図２４−１〜図２４−３）、配列番号１７（図２５−１〜図２５−３）、配列番号１８（図２６−１〜図２６−３）、配列番号１９（図２７−１〜図２７−３）、配列番号２０（図２８−１〜図２８−３）、配列番号２１（図２９−１〜図２９−３）、配列番号２２（図３０−１〜図３０−３）、または配列番号２３（図３１−１〜図３１−３）の核酸配列を有することもある。
【００９１】
ＨＶＲ１に（ＮＡＮＰ）_２８（配列番号６０；ｎ＝２８）を挿入するために、コドン最適化ＰｆＣＳＰの中心反復領域の一部を、Ｈｅｘｏｎ特異的配列を５’に、ＮＡＮＰ特異的配列を３’に有するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。もたらされたＤＮＡ断片を第２のＰＣＲによってＡｇｅＩ−ＮｄｅＩ領域に挿入した。
【００９２】
ＨＶＲ５修飾の場合、図３に示すように、ＸｂａＩ部位を、ＡｄＥａｓｙ−１内のＨｅｘｏｎのＬ１ループ中のＨＶＲ５に導入し、次いで合成し、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質エピトープをコードするリン酸化二本鎖オリゴマーをＸｂａＩ部位に挿入した。配列決定（図３１；配列番号２３）によってこの挿入を確認した。
【００９３】
Ｆｉｂｅｒ修飾の場合、図４に示すように、ＡｄＥａｓｙ−１のＳｐｅＩ−ＰａｃＩ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩおよびＰｓｔＩ−ＳｐｅＩのリンカーオリゴマーを用いてｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位とＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｂ細胞エピトープ配列をＦｉｂｅｒノブのＨＩループに挿入するために、ＥｃｏＮＩ（またはＮｈｅｌ）部位とＭｆｅｌ部位を含む領域を、エピトープ配列を有するプライマーを用いる２ステップＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＮＩ（またはＮｈｅＩ）とＭｆｅＩで消化させ、次いでこれを用いてＳｐｅＩ−ＰａｃＩ／ｐＵＣ１９ベクター内のＦｉｂｅｒのナイーブＥｃｏＮＩ（またはＮｈｅＩ）−ＭｆｅＩ領域を置換した。配列（図３２−１〜図３２−２、配列番号２４；図３３−１〜図３２−２、配列番号２５）を確認した後、ＡｄＥａｓｙ−１のＳｐｅＩ−ＰａｃＩ断片を、エピトープ配列を含むＳｐｅＩ−ＰａｃＩ断片と置換した。マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターによる相同的組換えのために、もたらされたＦｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスＤＮＡを用いて、Ｆｉｂｅｒ修飾型マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質アデノウイルスＤＮＡを生成した。
【００９４】
２つのエピトープ挿入を有するＨＶＲ１およびＦｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスＤＮＡを構築するために、Ｆｉｂｅｒ修飾型アデノウイルスＤＮＡのＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片を、図５に示すようにＨＶＲ１内にスポロゾイト周囲タンパク質エピトープを有するＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片と置換した。
【００９５】
ｐＶＩＩのＣ末端を修飾するために、ＳｆｉＩ部位とＳａｌＩ部位を含む領域を、スポロゾイト周囲タンパク質エピトープ配列を有するプライマーを用いて２ステップＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をＳｆｉＩとＳａｉＩで消化させ、次いでこれを用いて、ＳｆｉＩ／ｐＵＣ１９ベクターのナイーブＳｆｉＩ−ＳａｌＩ領域を置換した。配列（図３４、配列番号２６；図３５、配列番号２７）を確認した後、ＨＶＲ１のＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片および／またはＦｉｂｅｒ修飾型スポロゾイト周囲タンパク質アデノウイルスＤＮＡを、ｐＶＩＩ内にスポロゾイト周囲タンパク質エピトープを有するＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片と置換した。
【００９６】
スポロゾイト周囲タンパク質ＣＤ４＋エピトープ配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）をｐＶＩＩの中央に挿入するために、ｐＡｄＥａｓｙ−１の約７．７ｋｂ断片をＲｓｒＩＩ消化によって調製して、ＲｓｒＩＩリンカー（ＲｓｒＩＩ／ｐＵＣ１９）を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄｉＩＩ部位との間にクローニングした。ＲｓｒＩＩ／ｐＵＣ１９内にＡｓｃＩ部位とＢｇＩＩＩ部位を含む領域を、エピトープ配列を有するプライマーを用いて２ステップＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩとＢｇＩＩＩで消化させ、次いでこれを用いて、ＲｓｒＩＩ／ｐＵＣ１９プラスミド内のナイーブＡｓｃＩとＢｇＩＩＩ領域を置換した。置換した領域（図３６、配列番号２８；図３７、配列番号２９）の配列を確認した後、ＨＶＲ１修飾型アデノウイルスＤＮＡのＲｓｒＩＩ断片を、エピトープ配列を含むＲｓｒＩＩ断片と置換した。
【００９７】
以下の表１（ネズミマラリア原虫）および表２（熱帯熱マラリア原虫）に記載する組換えアデノウイルスを作製して、エピトープ挿入の感染性、免疫原性、および既存の抗アデノウウイルス免疫に対する感受性への効果を評価した。使用した組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損、Ｅ１およびＥ３欠失アデノウイルス血清型５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）であった。図１は、カプシド修飾型マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質組換えアデノウイルスの構造の模式図を示す。
【００９８】
【表１】

【００９９】
【表２】

【０１００】
カプシド修飾型アデノウイルスゲノムＤＮＡプラスミドを精製し、Ｐａｄ消化によって直線化して、Ａｄ２９３細胞のトランスフェクションのために用いた。
【０１０１】
凍結／解凍を４回繰り返すことでトランスフェクトされたＡＤ２９３細胞からアデノウイルス粒子を調製して、さらなるウイルス増幅のために用いた。最後の増幅を終えてから、アデノウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。次いで、バンドを収集して、透析緩衝液に対して透析して、ＣｓＣｌを除去した。ウイルス粒子（ｖ．ｐ．）は、Ｏ．Ｄ．２６０（１ Ｏ．Ｄ．２６０＝１．２５×１０^１２ｖ．ｐ．／ｍＬ）（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏら ２００３）に基づいて算出した。
【０１０２】
アデノウイルス増幅処置の間、アデノウイルス増殖でのカプシド修飾型アデノウイルス間で観察された差異は小さく、アデノウイルスの感染力および産生力が、修飾によって悪影響を受けていなかったことを示していた。
【０１０３】
実施例２：ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質特的免疫応答
【０１０４】
ネズミマラリア原虫組換えアデノウイルスの検証
マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターを一過性トランスフェクションのために用いて、ＡＤ２９３細胞を用いてマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質発現を確認した（図３８）。トランスフェクションから２４時間後に、細胞をＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、続いてＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動および抗ＰｙＣＳモノクローナル抗体（９Ｄ３）によるウエスタンブロットを行った。
【０１０５】
アデノウイルスカプシドタンパク質へのエピトープ挿入を確認するために、精製した組換えアデノウイルスをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２×１０^９ｖ．ｐ．／レーン）によって分析し、図３９Ａおよび４０Ａに示すように（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）反復を認識する、抗スポロゾイト抗体によるウエスタンブロット（１×１０^９ｖ．ｐ．／レーン）を行った。図３９Ａでのバンドの強度は、アデノウイルスビリオン中のカプシドタンパク質のコピー数と相関した：Ｆｉｂｅｒのコピー数（１ビリオンあたり３６コピー）は、Ｈｅｘｏｎのそれ（１ビリオンあたり７２０コピー）の２０分の１に満たない。図３９Ａのレーン４の下位のバンドは、分解したＨｅｘｏｎと思われる。図４０Ａのバンドの強度は、ＨＶＲ１に挿入された（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）の反復数と相関した。
【０１０６】
ＰｙＣＳ−Ｂエピトープがアデノウイルスビリオンの外側に曝露されたかどうかを評価するために、連続希釈、精製した組換えアデノウイルス粒子を、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）プレート上にコーティングして、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ（配列番号５９）反復を認識する抗ＰｙＣＳ抗体で検出した。該抗体は、すべてのカプシド修飾型アデノウイルスを認識した（図３９Ｂおよび４０Ｂ）。ＥＬＩＳＡ分析の結果は、カプシドタンパク質に取り込まれたＰｙＣＳ−Ｂエピトープがアデノウイルスビリオンの外側に十分に曝露されたことを示唆する。
【０１０７】
カプシド修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによる免疫化後のネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質特異的免疫応答
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ， ＵＳＡ）から購入して，Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにおいて標準条件下で維持した。免疫化のために、アデノウイルスをＰＢＳで希釈して、表示された用量で筋肉内に注射した。
【０１０８】
単回免疫後に組換えアデノウイルスの免疫原性を評価するために、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１群あたり５匹）に、種々の組換えＰｙＣＳアデノウイルスを１×１０^９ｖ．ｐ．で筋肉内に免疫し、次いで免疫化から２週間後にＰｙＣＳ特異的細胞媒介免疫応答（ＣＭＩ）をＥＬＩＳＰＯＴで測定した（図４１Ａ）．
【０１０９】
免疫したマウスの脾臓のＰｙＣＳ特異的、予防接種ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数を、ＰｙＣＳタンパク質内のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ（ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ；配列番号６６）に対応する合成ペプチドを用いてＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。簡単に言うと、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｉｔｉｔｅｒ ＨＡ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスインターフェロンγモノクローナル抗体、Ｒ４で終夜コーティングした。室温での終夜インキュベーションの後、ウェルを培地で繰り返し洗浄し、次いで４時間培地で遮断した。免疫したマウスからの５×１０^５脾細胞を、１０μｇ／ｍＬのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドの存在下または非存在下でＥＬＩＳＰＯＴに加えて、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで、該プレートを十分に洗浄した後、ＰＢＳＴ中のビオチン化抗マウスインターフェロンγモノクーナル抗体、ＸＭＧ１．２を加えて、４０℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後に、該プレートをペルオキシダーゼ標識アビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートすることになる。ＡＥＣ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えることによって複数のスポットが発現した。
【０１１０】
カプシド修飾型アデノウイルスのすべては、この用量で、インタクトなカプシドタンパク質を有するアデノウイルスに対して同程度のＣＭＩを誘発した（図４１Ｂ）。
【０１１１】
次に、図４２Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに増加した用量（すなわち、１×１０^８、１×１０^９、および１×１０^１０ｖ．ｐ．）の組換えアデノウイルスを３週間間隔で複数回投与した。ＰｙＣＳ特異的体液性応答をＥＬＩＳＡで決定した。免疫したマウスの尾静脈から５マイクロリットルの血液を採取して、４９５μＬのＰＢＳで希釈し、次いでこれらの試料を５，０００ｒｐｍで５分間遠心して、希釈血漿試料（×１００）を調製した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを、０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液中の５μｇ／ｍＬのＣＳ特異的ペプチド（（ＱＧＰＧＡＰ）_３；配列番号５９、ｎ＝３）で、４０℃で終夜コーティングした。プレートを洗浄して、室温で、１×希釈液で２時間遮断した。プレートを再度洗浄して、１×希釈液中の１００μＬの連続２倍希釈した血漿または血清をプレートに加え、次いで該プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄して、１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。ペプチドのすべては、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）で合成されたものであった。
【０１１２】
この免疫レジメンを使用して、１０週目にすべてのカプシド修飾型アデノウイルスは、野生型ＰｙＣＳ−ＧＦＰよりも高いレベルの抗−（ＱＧＰＧＡＰ）_３抗体応答を有意に誘発した（図４２Ｂ）。
【０１１３】
カプシド修飾型アデノウイルスのワクチン有効性を決定するために、１０週目に、免疫したマウスに２×１０^４感染性ネズミマラリア原虫スポロゾイトを尾静脈注で投与した。スポロゾイト投与から４２時間後、マウスの肝臓内の寄生虫特異的リボソームＲＮＡの量を定量化することによって寄生虫負荷を決定し、次いで寄生虫リボソームＲＮＡの絶対コピー数対マウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの絶対コピー数の比として表した。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて差異を決定した。
【０１１４】
（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰ、（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰまたは（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰによるワクチン接種は、野生型ＰｙＣＳ−ＧＦＰよりも高いレベルの予防を誘発し、マラリアを投与されたマウスにおいて有意に低い寄生虫負荷をもたらした（図４２Ｃ）。
【０１１５】
次に、カプシド修飾型アデノウイルスによって誘発されたＰｙＣＳ特異的抗体の機能性を評価した。第１に、免疫されたマウスのアデノウイルスの血清が１０週目に、インタクトなスポロゾイトを認識することができるかどうかを調べるために、間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を行った。ＩＦＡでは、マルチスポットガラススライド上の風乾したスポロゾイトを、ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に１時間インキュベートし、次いで希釈血清と共に１時間インキュベートした。洗浄後、該スライドを蛍光標識二次抗体と共に１時間インキュベートした。該スライドを洗浄して、蛍光顕微鏡下でＩＦＡ力価を、蛍光を発する最高希釈として決定した。（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰと（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＦＭ／Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰは共に、スポロゾイトに対して最高のＩＦＡ力価を誘発し（図４３Ａ）、アデノウイルスＨｅｘｏｎのＨＶＲ１への（ＱＧＰＧＡＰ）_３のエピトープの挿入によってＰｙＣＳアデノウイルスが合成ペプチドだけでなく、マラリア寄生虫に存在するナイーブエピトープに対しても強い抗体応答を誘発することを可能にすることを示した。
【０１１６】
第２に、カプシド修飾型アデノウイルスで免疫したマウス（図４２Ａ）が、スポロゾイトの感染力の効力を中和することができうる「機能的」抗体を発現したかどうか決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏスポロゾイト中和アッセイを行った。
【０１１７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイでは、アデノウイルス免疫マウスに由来するプールした血清を３０倍に希釈して添加した９６ウェルプレート中のＣＤ８１／Ｈｅ−ｐＧ２にネズミマラリア原虫スポロゾイトを加えた。２時間のインキュベーションの後、非感染スポロゾイトを培地で洗い落とし、次いで該細胞を４２時間培養した。ヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対する寄生虫リボソームＲＮＡの相対量を、リアルタイムＰＣＲ（Ｏｐｈｏｒｓｔら ２００６）で測定した。
【０１１８】
カプシド修飾型アデノウイルス、特に（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰおよび（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰ）で免疫したマウスに由来するプールした血清は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでスポロゾイト感染力をほぼ完全に（９９％）阻害した（図４３Ｂ）。このアッセイでの阻害の程度は、図４３Ａに示すＩＦＡ力価と逆相関したことが注目される。
【０１１９】
赤血球期マラリア感染からの防御。
次に、スポロゾイト投与の後、カプシド修飾型ｒＡｄによる免疫化が赤血球期マラリア感染症の発現からマウスを防御するかどうかを決定した。実験を２回行った。各実験では、各群で２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、図４２Ａに示すように、野生型ＰｙＣＳ−ＧＦＰまたは（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰで３回免疫した。最後の免疫化から４週目に、マウスに５０ネズミマラリア原虫スポロゾイトを静脈内投与した。抗原投与から３〜１２日後に、Ｇｉｅｍｓａ染色した血液塗沫標本を分析して、赤血球期マラリア寄生虫感染を検出した。野生型ＣＳ−ＧＦＰ免疫群では、４０匹中３０匹（７５％）のマウスが感染し、一方ナイーブ群では４０匹中３５匹（８７．５％）が感染した（以下の表３）。（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲＩ／ＣＳ−ＧＦＰ予免疫マウスは、野生型ＣＳ−ＧＦＰよりもより防御された；４０匹中わずかに１５匹（３７．５％）が感染した。これは肝臓での寄生虫負荷によって測定された防御実験（図４２Ｃ）の結果と一致する。
【０１２０】
【表３】

【０１２１】
初回刺激−追加免疫による免疫化１
次に、図４４Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの４または６の反復（配列番号５９；ｎ＝４、６）を有するＨＶＲ１−修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスの「追加免疫」をアジュバントと共にまたはアジュバントを含まずに、用量を増加して（すなわち、１×１０^８、１×１０^９、および１×１０^１０ｖ．ｐ．）３週間間隔で投与した。この実験で使用したアジュバントは、２００μｇ／ｍＬのＳａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（１ｍＬ）のバイアルは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａミネソタ由来のモノホスホリルリピドＡ（解毒化内毒素）を０．５ｍｇおよび水中２％オイル（スクアレン）−Ｔｗｅｅｎ８０中の合成トレハロースジコリノミコラートを０．５ｍｇ含有する。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。１００マイクロリットルのアデノウイルス−アジュバント混合液を筋肉内に注射した。ＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答および細胞介在性免疫応答を上述のように測定した。６反復を有するＨＶＲ１修飾型アデノウイルスは、４反復を有する該修飾型アデノウイルスよりも高い抗体価を誘発し、かつアジュバントの使用が抗体価を増強する傾向が観察された（図４４Ｂ）。対照的に、ＣＭＩへのアジュバントの効果はみられなかった（データ図示せず）。
【０１２２】
ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスのワクチン有効性を決定するために、９週目に各群の５匹のマウスに２×１０^４の感染性ネズミマラリア原虫スポロゾイトを尾静脈から投与した。スポロゾイト投与から４２時間後の寄生虫負荷を上述のように決定した。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて差異を決定した。６反復を有するＨＶＲ１修飾型アデノウイルスは、４反復を有する該修飾型アデノウイルスよりも寄生虫負荷を減少させ、かつアジュバントの使用が防御を増強する傾向がみられた（図４４Ｃ）。
【０１２３】
ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスによって誘発される抗体の機能性を評価するために、我々は上述のようにｉｎ ｖｉｔｒｏスポロゾイト中和分析を行った。ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスで免疫したマウス由来のプールした血清試料を９週目に、５０倍希釈でスポロゾイト浸潤を中和させた（図４４Ｄ）。
【０１２４】
初回刺激−追加免疫による免疫化２
図４５Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの反復を６、９、または１２有する（配列番号５９；ｎ＝６、９、１２）ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスの「追加免疫」を、アジュバント共に、またはアジュバントを含まずに、１×１０^１０ｖ．ｐ．の用量で、３週間間隔で３回、投与した。この実験で使用したアジュバントは、２００μｇ／ｍＬのＳａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。ＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答および細胞介在性免疫応答を上述のように測定した。（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの反復を１２有する（配列番号５９；ｎ＝１２）ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスとアジュバントは、９週目に群の間で最も高い抗体価を誘発した（図４５Ｂ）。ＰｙＣＳ特異的ＣＭＩに関して、群の間で差はみられず、最高１２の長いエピトープ挿入がｉｎ ｖｉｖｏでアデノウイルス感染力を損なわないことを示した（図４５Ｃ）。さらに、アジュバンントはＣＭＩを誘発するるアデノウイルスの能力に影響を及ぼさなかった（図４５Ｃ）。
【０１２５】
ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスのワクチン有効性を決定するために、９週目に各群の５匹のマウスに２×１０^４の感染性ネズミマラリア原虫スポロゾイトを尾静脈から投与した。スポロゾイト投与から４２時間後の寄生虫負荷を上述のように決定した。（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎ反復（配列番号５９；ｎ＝６、９、１２）を有するすべてのＨＶＲ−１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスは、アジュバントの有無にかかわらず防御の増加を示した。しかし、（ＱＧＰＧＡＰ）_ｎの反復を１２有する（配列番号５９；ｎ＝１２）ＨＶＲ１修飾型ＰｙＣＳアデノウイルスとアジュバントは、最良の防御を示した（図４５Ｄ）。これは他のいずれの処置よりも有意により防御的であった。
【０１２６】
実施例３：熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質特異的免疫応答
【０１２７】
熱帯熱マラリア原虫組換えアデノウイルスの検証
一過性トランスフェクションのために、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターを用いて、ＡＤ２９３細胞を用いるマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質発現を確認した（図４６Ａ）。
トランスフェクションから２４時間後に、細胞をＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、続いてＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動および抗ＮＡＮＰモノクローナル抗体（２Ａ１０）によるウエスタンブロットを行った。
【０１２８】
アデノウイルスカプシドタンパク質へのエピトープ挿入を確認するために、精製した組換えアデノウイルスをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２×１０^９ｖ．ｐ．／レーン）によって分析し、図４７Ａおよび４８Ａに示すように（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）反復を認識する、抗スポロゾイト抗体によるウエスタンブロット（１×１０^９ｖ．ｐ．／レーン）を行った。図４７Ａのバンドの強度は、アデノウイルスビリオン中のカプシドタンパク質のコピー数と相関した；Ｆｉｂｅｒのコピー数（１ビリオンあたり３６コピー）は、Ｈｅｘｏｎのそれ（１ビリオンあたり７２０コピー）の２０分の１に満たない。図４８Ａのバンドの強度は、ＮＡＮＰ反復ＨＶＲ１の数と相関した。
【０１２９】
ＰｆＣＳＰ−Ｂエピトープがアデノウイルスビリオンの外側に曝露されたかどうか評価するために、連続希釈し、精製した組換えアデノウイルス粒子を、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）プレート上にコーティングし、次いで（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）反復を認識する抗ＰｙＣＳ抗体で検出した。該抗体は、すべてのカプシド修飾型アデノウイルスを認識した（図４７Ｂおよび４８Ｂ）。ＥＬＩＳＡ分析の結果は、カプシドタンパク質に取り込まれたＰｆＳＰ−Ｂエピトープがアデノウイルスビリオンの外側に十分に曝露されたことを示唆する。
【０１３０】
初回刺激−追加免疫による免疫化３
図４９Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに 、組換えＰｆＣＳＰアデノウイルスを複数回、用量を増加して（すなわち、１×１０^８、１×１０^９、および１×１０^１０ｖ．ｐ．）、３週間間隔で投与した。上述のように、ＰｆＣＳＰ特異的体液性応答を、（ＮＡＮＰ）_ｎ反復配列（配列番号６０）を含有する１μｇ／ｍＬ（Ｔ１Ｂ）_４、ＣＳ反復ペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＬＩＳＡによって決定した（Ｃａｌｖｏ−Ｃａｌｌｅら ２００６）。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて、野生型ＰｆＣＳＰとカプシド修飾型アデノウイルスとの差異を決定した。すべてのカプシド修飾型アデノウイルスは、野生型ＰｆＣＳＰよりも統計学的に高い抗ＮＡＮＰ抗体価を誘発した。
【０１３１】
初回刺激−追加免疫による免疫化４
次に、図５０Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、（ＮＡＮＰ）_ｎの反復を４、６、８、または１０有する（配列番号６０；ｎ＝４、６、８、１０）ＨＶＲ１修飾型ＰｆＣＳＰアデノウイルスの「追加免疫」を、用量を増加して複数回（すなわち、１×１０^８、１×１０^９、および１×１０^１０ｖ．ｐ．）、３週間間隔で投与した。ＰｆＣＳＰ特異的体液体性免疫応答を上述のように測定した。９週目に、すべてのＨＶＲ１修飾型アデノウイルスは、野生型ＰｆＣＳＰよりも有意に高い抗ＮＡＮＰ抗体価を誘発した（図５０Ｂ）。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて、差異を決定した。
【０１３２】
初回刺激-追加免疫による免疫化５
次に、図５１Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、（ＮＡＮＰ）_ｎの反復を１０、１６、または２２有する（配列番号６０；ｎ＝１０、１６、２２）ＨＶＲ１修飾型アデノウイルスの「追加免疫」を、アジュバントと共に、またはアジュバントを含まずに、１×１０^１０ｖ．ｐ．の用量で、３週間間隔で３回投与した。この実験で使用したアジュバントは、２００μｇ／ｍＬのＳａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。ＰｆＣＳＰ特異的液体性免疫応答を上述のように測定し、次いで長いＢエピトープを有するＨＶＲ１修飾型アデノウイルスがより高い抗体価を誘発したことを決定した（図５１Ｂ）。
【０１３３】
実施例４：アデノウイルスコアタンパク質ｐＶＩＩへのＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープの挿入
抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、抗原特異的Ｂ細胞の発現と増殖のために必要とされる。したがって、ＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープのアデノウイルスタンパク質への挿入によるカプシド修飾型アデノウイルスによってＰｙＣＳ特異的体液性免疫応答を増強することが可能であるかどうかを決定するために、ｐＶＩＩ内にＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープを有する（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰ、（（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰ）を構築した。ｐＶＩＩは、アデノウイルスコアタンパク質のうちの１つであり、１ビリオンあたりのコピー数は７００〜８００である。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上への効率的なＣＤ４エピトープ提示に理想的である。図５２Ａに示すように、ＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でｐＶＩＩに挿入することによってｐＶＩＩバンドを移動させる。
【０１３４】
ＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープのｐＶＩＩへの挿入の効果を試験するために、図４２Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスを（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰまたは（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰで免疫して、１０週目に抗ＱＧＰＧＡＰ抗体価をＥＬＩＳＡで決定した。（ＱＧＰＧＡＰ）_３−Ｆｉｂ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰは、（ＱＧＰＧＡＰ）３−Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰよりも有意に高い抗ＱＧＰＧＡＰ抗体価を誘発し（図５２Ｂ）、ｐＶＩＩへのＰｙＣＳ ＣＤ４エピトープの挿入が、カプシド修飾型アデノウイルスによって誘発された体液性免疫応答を増強したことを示した。
【０１３５】
アデノウイルスコアタンパク質ｐＶＩＩへのＰｆＣＳＰ ＣＤ４エピトープ挿入
アデノウイルスコアタンパク質内の異なる位置へのＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープ挿入の、アデノウイルス誘発免疫応答への効果を評価するために、第１の核移行シグナル（ＮＬＳ）の前、または２つのＮＬＳの間にＰｆＣＳＰ ＣＤ４＋エピトープを有するＨＶＲ１修飾型ＰｆＣＳＰアデノウイルスを構築した（図５３Ａ）。
【０１３６】
ｐＶＩＩへのエピトープ挿入を確認するために、上述のように精製組換えアデノウイルスをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図５３Ｂに示すように、（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−２／ＰｆＣＳＰおよび（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−３／ＰｆＣＳＰのｐＶＩＩバンドを、エピトープを挿入することによって上方に移動させた。
【０１３７】
ＨＶＲ１およびｐＶＩＩの修飾型ＰｆＣＳＰアデノウイルスによって誘発されたＰｆＣＳＰ特異的免疫応答
次に、図５４Ａに示すように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＶＲ１にＮＡＮＰの４反復と、ｐＶＩＩにＰｆＣＤ４＋エピトープとを有するＨＶＲ１およびｐＶＩＩの修飾型ＰｆＣＳＰアデノウイルスの「追加免疫」を、用量を増加して複数回（すなわち、１×１０^８、１×１０^９、および１×１０^１０ｖ．ｐ．）、３週間間隔で投与した。ＰｆＣＳＰ特異的体液性免疫応答を上述のように測定した。６週目に、（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−２／ＰｆＣＳＰおよび（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲＩ／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−３／ＰｆＣＳＰは、（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＰｆＣＳＰより有意に高い抗ＮＡＮＰ抗体価を誘発した。ＣＭＩに関して、（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＣＤ４−ｐＶＩＩ−３／ＰｆＣＳＰは、（ＮＡＮＰ）_４−ＨＶＲ１／ＰｆＣＳＰより有意に高いＩＦＮγおよびＩＬ−４分泌ＰｆＣＳＰ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘発した（図５４Ｃ）。
【０１３８】
実施例５：カプシド修飾の抗アデノウイルス免疫への効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏアデノウイルス中和実験のために、アデノウイルス感染の前に表示した希釈の血清をＡＤ２９３細胞に加えた。Ｃａｕｃａｓｉａｎ血清試料は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｏｖｉ，ＭＩ，ＵＳＡ）から入手した。すべてのフローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ８．８ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で分析した。表示した希釈のヒトアデノウイルス中和血清試料の存在下で、ＡＤ２９３細胞に各カプシド修飾型アデノウイルスを感染させ、続いてフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を測定した。ＨＶＲ１のＰｙＣＳ−Ｂエピトープとの置換によって、アデノウイルスは抗アデノウイルス血清型５血清に対して明らかに回復力があるようになり、一方ＨＶＲ５またはＦｉｂｅｒの修飾は効果がなかった（図５５）。
【０１３９】
次に、ＨＶＲ１がｉｎ ｖｉｖｏ中和にとって重要な分子であるかどうかを決定した。この目的のために、既存の抗アデノウイルス免疫を十分に開始させるために、マウスに１×１０^１０ｖ．ｐ．野生型空のアデノウイルスを２回感染させて、（図５６A)、次いでＥＬＩＳＡで決定したそれらの抗アデノウイルス抗体価に基づいてランダム化した。次いで、マウスにカプシド修飾型アデノウイルスまたは非修飾型アデノウイルスを単回免疫量で投与して、上述のようにＰｙＣＳ−特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のレベルを測定した。他のカプシド修飾型または非修飾型アデノウイルスによって誘発されたワクチン接種と比較すると、（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰまたは（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰによるワクチン接種だけが有意により強力なＣＳ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘発することができた（図５６Ｂ）。
【０１４０】
（ＱＧＰＧＡＰ）_３エピトープに対する抗体応答のレベルも、測定した。抗体応答は、野生型空のアデノウイルスに感染させ、続いてカプシド修飾型ｒＡｄでワクチン接種したマウスにおいて、ｒＡｄのカプシドタンパク質上で発現される（図５７Ａ）。（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／ＰｙＣＳ−ＧＦＰおよび（ＱＧＰＧＡＰ）_３−ＨＶＲ１／Ｆｉｂ／ＰｙＣＳ−ＧＦＰをワクチン接種したマウスだけが、野生型ＰｙＣＳ−ＧＦＰをワクチン接種したマウスよりも有意に高い抗ＱＧＰＧＡＰ抗体価を開始することができた。
【０１４１】
上述の実施例は、実施形態をより十分に説明するように意図され、クレームされるいずれの実施形態の範囲を限定すると解釈されるものではない。加えて、本開示内に引用した参照文献、および後述するすべての参照文献は、それら全体を参照することによって本明細書に十分に記載されているかのように本明細書によって組み込まれる。
【０１４２】
参考文献
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Ａｌｏｎｓｏ，Ｐ．Ｌ．， Ｓａｃａｒｌａｌ，Ｊ．， Ａｐｏｎｔｅ，Ｊ．Ｊ．， Ｌｅａｃｈ，Ａ．， Ｍａｃｅｔｅ，Ｅ．，ら ２００５． Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２Ａ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｍｏｚａｍｂｉｃａｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ：ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ． ３６６：２０１２−２０１８．

Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．， Ｈａｎｎａｎ，ＣＭ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．， Ｌａｉｄｌａｗ，Ｓ．Ｍ．， Ｓｈｅｕ，Ｅ．Ｇ．，ら ２００４． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ ｍａｌａｒｉａ ｂｙ ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：３０９４−３１００．

Ａｔｈａｐｐｉｌｌｙ，Ｆ．Ｋ．， Ｍｕｒａｌｉ，Ｒ．， Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．， Ｃａｉ， Ｚ． ＆ Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ． Ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｘｏｎ， ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２， ａｔ ２．９ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２４２，４３０−４５５（１９９４）．

Ｂａｒｒａｔ，Ｆ．Ｊ．， Ｍｅｅｋｅｒ，Ｔ，， Ｇｒｅｇｏｒｉｏ，Ｊ，， Ｃｈａｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｕｅｍａｔｓｕ，Ｓ．，ら． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｃａｎ ａｃｔ ａｓ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍａｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０２， １１３１−１１３９（２００５）．

Ｂｅｊｏｎ，Ｐ．， Ｌｕｓｉｎｇｕ，Ｊ．， Ｏｌｏｔｕ，Ａ．， Ｌｅａｃｈ，Ａ．， Ｌｉｅｖｅｎｓ，Ｍ．，ら ２００８． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１ Ｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ５ ｔｏ １７ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ａｇｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３５９：２５２１−２５３２．

Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，Ｎ．， Ｋｒｅｎｄｅｌｃｈｔｃｈｉｋｏｖａ，Ｖ．， Ｃｕｒｉｅｌ，ＤＴ． ＆ Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒｏｐｉｓｍ ｖｉａ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６， ８６２１−８６３１（２００２）．

Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ２ ａｎｄ ５． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ２７５， １３２０−１３２３（１９９７）．

Ｂｅｗｌｅｙ，Ｍ．Ｃ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．， Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｂ．， Ｆｒｅｉｍｕｔｈ，Ｐ． ＆ Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｊ．Ｍ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＣＡＲ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ２８６， １５７９−１５８３（１９９９）．

Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｏ．， Ｓｃｈｍｉｅｇ，Ｊ．， Ｄｅｌ Ｖａｌ，Ｍ．， Ｂｕｓｃｈｌｅ，Ｍ． ＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｍ． Ｔｈｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ， ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １， ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０， ３１９５−３２０３（２００３）．Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．， Ｋａｒａｙａｎ，Ｌ， Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．， Ｃｕｒｉｅｌ，ＤＴ． ＆ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｐ．Ａ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｐｈａ２ ｄｏｍａｉｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ １６， ２２９４−２３０６（１９９７）．

Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｏ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ，Ｇ．， Ｈａｆａｌｌａ，Ｊ．Ｃ， Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．，およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ． ２００１． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｓｍｏｄｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９８：１１４９１−１１４９６．

Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｏ．， Ｒｏｃｈａ，ＣＤ．， Ｔｓｕｊｉ，Ｍ． ＆ Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉ，ＲＴ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｂｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２２， ３５７５−３５８４（２００４）．

Ｃａｌｖｏ−Ｃａｌｌｅ，Ｊ．Ｍ．， Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｇ．Ａ．， Ｗａｔｔａ，ＣＯ．， Ｓｏｖｅｒｏｗ，Ｊ．， Ｐａｒｒａ−Ｌｏｐｅｚ，Ｃ，ら ２００６． Ａ ｌｉｎｅａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｎｉｍａｌ Ｔ− ａｎｄ Ｂ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ７４：６９２９−６９３９．

Ｃｌｙｄｅ，Ｄ．Ｆ．， Ｍｏｓｔ，Ｈ．， ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｖ．Ｃ，およびＶａｎｄｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐ． １９７３． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｏｒｏｚｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ． ２６６：１６９−１７７．

Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．， Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．＆ Ｃｕｓａｃｋ，Ｓ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｆｉｂｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９（Ｐｔ１）， １６３−２００（１９９５）．

Ｃｈｕ，Ｙ．， Ｈｅｉｓｔａｄ，Ｄ．， Ｃｙｂｕｌｓｋｙ，Ｍ．Ｉ．＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ａｕｇｍｅｎｔｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１， ２３８−２４２（２００１）．

Ｃｒａｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａ，Ｌ． ＆ Ｓｃｈｎｕｒｒ，Ｄ．Ｐ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １５ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｈｅｘｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０， １８３６−１８４４（１９９６）．

Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．， Ｔｏｏｇｏｏｄ，Ｃｌ．， Ｗａｌｌｉｓ，Ｎ． ＆ Ｈａｙ， ＲＴ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｈｅｘｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（Ｐｔ１）， １３３−１３９（１９９４）．

Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ． Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ：ｅａｒｌｙ ｌｅｓｓｏｎｓ ａｎｄ ｏｂｓｔａｃｌｅｓ ｔｏ ｓｕｃｃｅｓｓ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ２７０， ４０４−４１０（１９９５）．

Ｄｏｕｇｌａｓ，ＪＴ． Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６， ７１−８０（２００７）．

Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｒ．， Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．， Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｒ．， Ｂｅｉｅｒ，Ｍ．， Ｓｚｔｅｉｎ，Ｍ．Ｂ．，ら １９９３． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｘ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １６８： １０６６−１０７０．

Ｇｒｉｌｌｏｔ，Ｄ．， Ｖａｌｍｏｒｉ，Ｄ．， Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｐ．Ｈ．， Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，およびＤｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ，Ｇ． １９９３． Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ａｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６１：３０６４−３０６７．

Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．＆ Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｒｅａｄｉｎｇ， Ｍａｓｓ ２０， ３６３−３９０（１９９２）．

Ｇｗａｄｚ，Ｒ．Ｗ．， Ｃｏｃｈｒａｎｅ，Ａ．Ｈ．， Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｖ．，およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ． １９７９． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ｗｉｔｈ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｐａｒａｓｉｔｅｓ．Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．５７ Ｓｕｐｐｌ １：１６５−１７３．

Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｎ．Ｒ．ら． Ｕｓｅ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ ｔｒａｃｋ ｔｈｅ ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２， ６４９−６５６（２０００）．

Ｈａｒｖｅｙ，Ｂ．Ｇ．ら． Ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １０４， １２４５−１２５５（１９９９）．

Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｂ．ら． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｇｎａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７， ８８５１−８８５９（２００６）．

Ｈｅｎｒｙ，Ｌ．Ｊ．， Ｘｉａ，Ｄ．， Ｗｉｌｋｅ，Ｍ．Ｅ．， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ． ＆ Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｏｂ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８， ５２３９−５２４６（１９９４）．

Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．， Ｈａｂｉｂ，Ｎ．Ａ．， Ｆｒａｎｑｕｅｖｉｌｌｅ，Ｌ， Ｊｅｎｓｅｎ，Ｓ． ＆ Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｐ．Ａ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ （ａｄ） ｐｅｎｔｏｎ ｂａｓｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｈａｄ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄ （ａｄｄｌ１５２０） ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７， １０３６６−１０３７５（２００３）．

Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．， Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｆ．， Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｒ．， Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｔ．，ら ２００８． Ｐｈａｓｅ ２ａ ｔｒｉａｌ ｏｆ ０， １， ａｎｄ ３ ｍｏｎｔｈ ａｎｄ ０， ７， ａｎｄ ２８ ｄａｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ−ｎａｉｖｅ ａｄｕｌｔｓ ａｔ ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖａｃｃｉｎｅ． ２６：２１９１−２２０２．

Ｋｉｒｂｙ，Ｉ．ら． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＤＧ ｌｏｏｐ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｏｌｉｓｈ ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＡＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３， ９５０８−９５１４（１９９９）．

Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｎ．， Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．， Ｕｔｏｇｕｃｈｉ，．， Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ． ＆ Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ＨＩ ｌｏｏｐ ａｎｄ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， ２６７−２７６（２００３）．

Ｋｏｚａｋ Ｍ． １９８７．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５’−ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ６９９ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：８１２５−１４８．

Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．， Ｊｏｈ，Ｊ．Ｈ．， Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｎ．Ｒ．， Ｒｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗ．， Ｂｒｕｄｅｒ，Ｊ．Ｔ．，ら ２００６． Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ８０：５５２３−５５３０．

Ｌａｂｏｗ，Ｄ．， Ｌｅｅ，Ｓ．， Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｊ．， Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ． ＆ Ｋｏｒｓｔ， Ｒ．Ｊ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ１１，７５９−７６９（２０００）．

Ｌｅｅｎ，Ａ．Ｍ．ら． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｘｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２， ５４６−５５４（２００８）．

Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｐ．Ｌ． ＆ Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｍａｎｙ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｍａｎｙ ｅｎｄｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ５９， ８１０−８２１（２００７）．

Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ，Ａ．ら． ”Ｓｅｒｏ−ｓｗｉｔｃｈ” ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｖ／Ｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｅｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｐｅａｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ７， ７９−８７（１９９６）．

Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．， Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．， Ｍｏｏｒｅ，Ｍ． ＆ Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ｇ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｕｓｅ ａｌｐｈａ ｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８， ６８１１−６８１４（１９９４）．

ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．， Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ，Ｘ．，およびＩｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｍ．Ｊ． ２００６．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｈｅｘｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ８０：５３６１−５３７０．

Ｍｅｉｅｒ，Ｏ． ＆ Ｇｒｅｂｅｒ，Ｕ．Ｆ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， ４５１−４６２（２００３）．

Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｎ．ら． Ｆｉｂｅｒ ｓｗａｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ ａｌｔｅｒｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３， ６０５６−６０６５（１９９９）．

Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｎ．， Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ． ＆ Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｐ．Ｌ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ７ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｌａｔｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｃｙｔｏｓｏｌ ｅｓｃａｐｅ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５， １３８７−１４００（２００１）．

Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ． ＆ Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １５， １０３４−１０４４（２００４）．

Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｙ．， Ｂｏｕｃｋｅ，Ｋ．， Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ，Ｍ．， Ｓｔｉｄｗｉｌｌ，Ｒ．Ｐ． ＆ Ｇｒｅｂｅｒ，Ｕ．Ｆ． Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｃｃｕｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ， ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｓｃａｐｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４， ７０８５−７０９５（２０００）．

Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｓ．Ａ．ら． Ａｂｌａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｆｉｂｅｒ−ＣＡＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＨＩ ｌｏｏｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＩＧＹＰＬＰ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ４， ５３４−５４２（２００１）．

Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｉ，Ｓ．Ｃ． ＆ Ｃｕｒｉｅｌ，ＤＴ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２， ３４１−３４７（２００５）．

Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．， Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．， Ｍｏｓｔ，Ｈ．，およびＯｒｔｏｎ，Ｃ． １９６７． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｘ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ．Ｎａｔｕｒｅ． ２１６：１６０−１６２．

Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ． ＆ Ｌｏｎｇ， ＣＡ．Ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ ２６５， １３８１−１３８３（１９９４）．

Ｏｎｉｏｎ，Ｄ．ら． Ｔｈｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｆｏｃｕｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｘｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８８， ２４１７−２４２５（２００７）．

Ｏｐｈｏｒｓｔ，Ｏ．Ｊ．， Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．， Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．， Ｐａｕ，Ｍ．Ｇ．， Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，ら ２００６． ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３５−ｂａｓｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ７４：３１３−３２０．

Ｏｕａｌｉｋｅｎｅ，Ｗ．， Ｇｏｎｉｎ，Ｐ． ＆ Ｅｌｏｉｔ，Ｍ． Ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ （ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ） ａｎｄ ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ （ｍｏｕｓｅ） ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（Ｐｔ１０）， ２７６５−２７６８（１９９４）．

Ｐｒｉｄｄｙ，Ｆ．Ｈ．， Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．， Ｋｕｂｌｉｎ，Ｊ．， Ｍｏｎａｈａｎ，Ｋ．， Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｐ．，ら ２００８． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ＨＩＶ−１ ｃｌａｄｅ Ｂ ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｄｕｌｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ４６： １７６９−１７８１．

Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｍ．， Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｌ．， Ｇｒｕｔｔｅｒ，Ｍ．Ｇ． ＆ Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ． Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｅｘｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ ２３２， １１４８−１１５１（１９８６）．

Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｍ．， Ｎａｎｄａ，Ａ．， Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．， Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．， Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｍ．，ら ２００６． Ｈｅｘｏｎ−ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉ−ｖｅｃｔｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ． ４４１ ： ２３９−２４３．

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｅ．Ｇ．， Ｚａｖａｌａ，Ｆ．， Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，Ｄ．， Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，およびＴｓｕｊｉ，Ｍ． １９９７． Ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｄｏｓｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：１２６８−１２７４．

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｅ．Ｇ．， Ｚａｖａｌａ，Ｆ．， Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．， Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ． ＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｍ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｍａｌａｒｉａ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １６， １８１２−１８１７（１９９８）．

Ｒｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗ．， Ｍｉ Ｌｅｅ，Ｇ．， Ｅｉｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ａ．， Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ． ＆ Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＡＲ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ ２８６， １５６８−１５７１（１９９９）．

Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ． ＆ Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ． Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｈｅｘｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １，１８−３０（２０００）．

Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．＆ Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆ（Ｃ）５， １１６７−１１７６（２００４）．

Ｒｏｙ，Ｓ．ら． Ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｃａｐｓｉｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３３， ２０７−２１４（２００５）．

Ｓｉｌｖｉｅ，Ｏ．， Ｇｒｅｃｏ，Ｃ， Ｆｒａｎｅｔｉｃｈ，Ｊ．Ｆ．， Ｄｕｂａｒｔ−Ｋｕｐｐｅｒｓｃｈｍｉｔｔ，Ａ．， Ｈａｎｎｏｕｎ，Ｌ，ら ２００６． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８１ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｍａｌａｒｉａ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８：１１３４−１１４６．

Ｓｕｍｉｄａ，Ｓ．Ｍ．， Ｔｒｕｉｔｔ，Ｄ．Ｍ．， Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．， Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．， Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．，ら ２００５． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｈｅｘｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４：７１７９−７１８５．

Ｓｕｎ，Ｐ．， Ｓｃｈｗｅｎｋ，Ｒ．， Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．， Ｓｔｏｕｔｅ，Ｊ．Ａ．， Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，ら ２００３． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ， ＲＴＳ， Ｓ， ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１：６９６１−６９６７．

Ｔａｏ，Ｄ．， Ｂａｒｂａ−Ｓｐａｅｔｈ，Ｇ．， Ｒａｉ，Ｕ．， Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｖ．， Ｒｉｃｅ，ＣＭ．，およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ． ２００５． Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ １７Ｄ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０１：２０１−２０９．

Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｓ．ら． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ ａｇｅ ｏｎ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＬａｃＺ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ１ −ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５８， １９１４−１９１９（１９９８）．

Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．，Ｊｒ．， Ｄｕｄｄｉｎｇ，Ｂ．Ａ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．Ｋ． ＆ Ｂｕｅｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｌ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅｓ ４ ａｎｄ ７ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ９４， １４２−１４６（１９７１）．

Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．，Ｊｒ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｕ．Ｓ． Ａｒｍｙ ｔｒａｉｎｅｅｓ．Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ４８， １８５−１９５（１９７５）．

Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．， Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．， Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．，およびＺａｖａｌａ，Ｆ． １９９０． ＣＤ４＋ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｌａｒｉａ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７２：１３５３−１３５７．

Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｅ．Ｇ．＆ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｓ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ａ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｍａｌａｒｉａ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３８２， ５５３−５７０（２００１）．

Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．， Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．， Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ． ＆ Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ． ｌｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ａｎｄ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ５ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｖｉｒｕｓ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ７３， ３０９−３１９（１９９３）．

Ｗｏｈｌｆａｒｔ，Ｃ． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ， ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２， ２３２１−２３２８（１９８８）．

Ｗｏｒｇａｌｌ，Ｓ．ら． Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８， ２５７２−２５８０（２００４）．

Ｗｏｒｇａｌｌ，Ｓ．， Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．， Ｒｉｖａｒａ，Ｍ．， Ｈｅｅ，Ｋ．Ｋ．， Ｖｉｎｔａｙｅｎ，Ｅ．Ｖ．，ら ２００５． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ＯｐｒＦ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１２８１−１２８９．

Ｗｏｒｇａｌｌ，Ｓ．， Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．， Ｑｉｕ，Ｊ．， Ｊｏｈ，Ｊ．， Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｎ．Ｒ．，およびＣｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ． ２００７． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃａｐｓｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＯｐｒＦ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ８１：１３８０１−１３８０８．

Ｗｕ，Ｈ．， Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，Ｉ．， Ｋａｓｈｅｎｔｓｅｖａ，Ｅ．， Ｓｅｋｉ，Ｔ．， Ｗａｎｇ，Ｍ．，ら ２００２． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｐａｃｋａｇｅｄ ｂｙ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３ Ｈｅｘｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７６：１２７７５−１２７８２．

Ｗｕ，Ｈ．ら． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｈｅｘｏｎ ｆｏｒ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌ， ７８：３３８２−３３９０（２００５）．

Ｘｉａ，Ｄ．， Ｈｅｎｒｙ，Ｌ．， Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ． ＆ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ Ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９（Ｐｔ１）， ３９−４６（１９９５）．

Ｙａｎｇ，Ｙ．， Ｌｉ，Ｑ．， Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ． ＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｃｒｅａｔｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｌｕｎｇ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９， ２００４−２０１５（１９９５）．

Ｙｏｕｉｌ，Ｒ．， Ｔｏｎｅｒ，Ｔ．Ｊ．， Ｓｕ，Ｑ．， Ｃｈｅｎ，Ｍ．， Ｔａｎｇ，Ａ．，ら ２００２． Ｈｅｘｏｎ ｇｅｎｅ ｓｗｉｔｃｈ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １３：３１１−３２０．

【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１：コドン最適化ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質
配列番号２：コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質
配列番号３：（ＱＧＰＧＡＰ）３−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号４：（ＱＧＰＧＡＰ）４−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号５：（ＱＧＰＧＡＰ）５−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号６：（ＱＧＰＧＡＰ）６−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号７：（ＱＧＰＧＡＰ）７−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号８：（ＱＧＰＧＡＰ）８−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎ配列
配列番号９：（ＱＧＰＧＡＰ）９−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１０：（ＱＧＰＧＡＰ）１１−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１１：（ＱＧＰＧＡＰ）１２−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１２：（ＮＡＮＰ）４−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１３：（ＮＡＮＰ）６−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１４：（ＮＡＮＰ）８−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１５：（ＮＡＮＰ）１０−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１６：（ＮＡＮＰ）１２−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１７：（ＮＡＮＰ）１４−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１８：（ＮＡＮＰ）１６−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号１９：（ＮＡＮＰ）１８−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号２０：（ＮＡＮＰ）２０−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号２１：（ＮＡＮＰ）２２−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号２２：（ＮＡＮＰ）２８−ＨＶＲ１修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号２３：（ＱＧＰＧＡＰ）３−ＨＶＲ５修飾型Ｈｅｘｏｎタンパク質
配列番号２４：（ＱＧＰＧＡＰ）３修飾型Ｆｉｂｅｒタンパク質
配列番号２５：（ＮＡＮＰ）４修飾型Ｆｉｂｅｒタンパク質
配列番号２６：ネズミマラリア原虫ＣＤ４＋エピトープ修飾型ｐＶＩＩ配列
配列番号２７：熱帯熱マラリア原虫ＣＤ４＋エピトープ修飾型ｐＶＩＩ−１配列
配列番号２８：熱帯熱マラリア原虫ＣＤ４＋エピトープ修飾型ｐＶＩＩ−２配列
配列番号２９：熱帯熱マラリア原虫ＣＤ４＋エピトープ修飾型ｐＶＩＩ−３配列
配列番号３０：合成コンストラクト
配列番号３１：合成コンストラクト
配列番号３２：合成コンストラクト
配列番号３３：合成コンストラクト
配列番号３４：合成コンストラクト
配列番号３５：合成コンストラクト
配列番号３６：合成コンストラクト
配列番号３７：合成コンストラクト
配列番号３８：合成コンストラクト
配列番号３９：合成コンストラクト
配列番号４０：合成コンストラクト
配列番号４１：合成コンストラクト
配列番号４２：合成コンストラクト
配列番号４３：合成コンストラクト
配列番号４４：合成コンストラクト
配列番号４５：合成コンストラクト
配列番号４６：合成コンストラクト
配列番号４７：合成コンストラクト
配列番号４８：合成コンストラクト
配列番号４９：合成コンストラクト
配列番号５０：合成コンストラクト
配列番号５１：合成コンストラクト
配列番号５２：合成コンストラクト
配列番号５３：合成コンストラクト
配列番号５４：合成コンストラクト
配列番号５５：合成コンストラクト
配列番号５６：合成コンストラクト
配列番号５７：合成コンストラクト
配列番号５８：合成コンストラクト
配列番号５９：ネズミマラリア原虫
配列番号６０：熱帯熱マラリア原虫
配列番号６１：ネズミマラリア原虫
配列番号６２：熱帯熱マラリア原虫
配列番号６３：三日熱マラリア原虫
配列番号６４：四日熱マラリア原虫
配列番号６５：ネズミマラリア原虫
配列番号６６：ネズミマラリア原虫

【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスプラスミドベクター由来の組換えアデノウイルスであって、前記組換えアデノウイルスプラスミドベクターが、
異種プロモーター配列に作用可能に連結されたマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子またはその抗原部分をコードするヌクレオチド配列と、
１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質とをコードするヌクレオチド配列を含み、マラリア原虫スポロゾイト周囲の免疫原性エピトープ配列が前記１つもしくは複数の修飾型カプシドタンパク質および／またはコアタンパク質の少なくとも一部に挿入されている、または一部を置換する組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子またはネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子をさらに含む請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
前記マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子が、コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子またはコドン最適化ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
前記コドン最適化タンパク質遺伝子が、配列番号１または配列番号２によってコードされる請求項３に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記免疫原性エピトープ配列が、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子のＢ細胞エピトープ配列および／またはＴ細胞エピトープ配列をさらに含む請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
前記カプシドタンパク質遺伝子がＨｅｘｏｎ高頻度可変領域（ＨＶＲ）配列をさらに含む請求項５に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
前記ＨＶＲ配列がＨＶＲ１またはＨＶＲ５の配列をさらに含み、および前記Ｂ細胞エピトープが、
ａ）ＨＶＲ１配列またはＨＶＲ５配列に挿入される；または
ｂ）ＨＶＲ１配列またはＨＶＲ５配列の一部を置換する
請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
前記修飾型カプシドタンパク質遺伝子が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３からなる群から選択される核酸配列によってコードされる請求項７に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
前記ＨＶＲ配列がＨＶＲ１配列もしくはＨＶＲ５配列を含み、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞エピトープが、
ａ）ＨＶＲ１配列またはＨＶＲ５配列に挿入される；または
ｂ）ＨＶＲ１配列またはＨＶＲ５配列の一部を置換する
請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
前記カプシドタンパク質遺伝子がカプシドＦｉｂｅｒタンパク質遺伝子をさらに含み、前記Ｂ細胞エピトープ配列が該Ｆｉｂｅｒタンパク質遺伝子に挿入される請求項５に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
前記修飾型カプシドタンパク質遺伝子が配列番号２４または配列番号２５によってコードされる請求項１０に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞エピトープ配列が熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子Ｂ細胞エピトープ配列である請求項５から１１のいずれかに記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞エピトープ配列が（ＮＡＮＰ）_ｎ（配列番号６０）であり、ｎが４以上である請求項１２に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞エピトープ配列が（ＮＡＮＰ）_４、（ＮＡＮＰ）_６、（ＮＡＮＰ）_８、（ＮＡＮＰ）_１０、（ＮＡＮＰ）_１２、（ＮＡＮＰ）_１４、（ＮＡＮＰ）_１６、（ＮＡＮＰ）_１８、（ＮＡＮＰ）_２０、（ＮＡＮＰ）_２２または（ＮＡＮＰ）_２８である請求項１２に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
前記免疫原性エピトープ配列がマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子のＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ配列をさらに含む請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
前記コアタンパク質遺伝子がｐＶＩＩタンパク質遺伝子をさらに含み、および前記ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ配列が前記ｐＶＩＩタンパク質遺伝子に挿入される請求項１５に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
前記修飾型コアタンパク質遺伝子が配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９によってコードされる請求項１６に記載のアデノウイルス。
【請求項１８】
前記ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ配列が熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ配列である請求項１５から１７のいずれかに記載のアデノウイルス。
【請求項１９】
前記ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ配列がＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳＶＴ（配列番号６２）である請求項１６に記載のアデノウイルス。
【請求項２０】
前記アデノウイルスが、ＨＶＲ１−修飾型アデノウイルスベクター、Ｆｉｂｅｒ−修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスベクター、ＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、およびＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクターからなる群から選択されるいずれか１つの組換えアデノウイルスプラスミドベクターから生成される請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項２１】
被験者においてマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質に対する細胞性および体液性の免疫応答を誘発する方法であって、前記被験者に組換えアデノウイルスの少なくとも１用量を投与することを含み、前記組換えアデノウイルスが組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来し、前記組換えアデノウイルスプラスミドベクターが、
異種プロモーターに作用可能に連結されたマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質またはその抗原部分と、
修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質とをコードするヌクレオチド配列を含み、マラリア原虫スポロゾイト周囲の免疫原性エピトープがカプシドタンパク質もしくはコアタンパク質に挿入れているか、または一部を置換する方法。
【請求項２２】
前記組換えアデノウイルスと共にアジュバントを投与することをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アデノウイルス血清型に対する既存の中和抗体が欠乏している被験者においてマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質に対する細胞性および体液性の免疫応答を誘発する方法であって、前記被験者に
第１の組換えアデノウイルスの第１の初回刺激用量と、
続いて第２の組換えアデノウイルスの追加免疫の用量とを投与することを含み、
前記第１の組換えアデノウイルスが組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来し、および前記組換えアデノウイルスプラスミドベクターが、異種プロモーターに作用可能に連結したマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質またはその抗原部分をコードするヌクレオチド配列を含み、および
前記第２の組換えアデノウイルスが組換えアデノウイルスプラスミドベクターに由来し、および前記組換えアデノウイルスプラスミドベクターが、異種プロモーターに作用可能に連結したマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質またはその抗原部分と、修飾型カプシドタンパク質またはコアタンパク質とをコードするヌクレオチド配列を含み、マラリア原虫スポロゾイト周囲の免疫原性エピトープがカプシドタンパク質もしくはコアタンパク質の少なくとも一部に挿入されているか、または一部を置換する方法。
【請求項２４】
前記組換えアデノウイルスと共にアジュバントを投与することをさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組換えアデノウイルスを含む医療組成物であって、前記組換えアデノウイルスがＨＶＲ１−修飾型アデノウイルスベクター、Ｆｉｂｅｒ−修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスベクター、ＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、およびＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクターからなる群から選択されるいずれか１つの組換えアデノウイルスプラスミドベクターから生成される医療組成物。
【請求項２６】
組換えアデノウイルスを含むマラリア感染症用のワクチンであって、前記組換えアデノウイルスがＨＶＲ１−修飾型アデノウイルスベクター、Ｆｉｂｅｒ−修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとの修飾型アデノウイルスベクター、ＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、ＨＶＲ１とｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクター、およびＨＶＲ１とＦｉｂｅｒとｐＶＩＩとの修飾型アデノウイルスベクターからなる群から選択されるいずれか１つの組換えアデノウイルスプラスミドベクターから生成されるマラリア感染症用のワクチン。
【請求項２７】
前記ワクチンが前記被験者の筋肉内に、皮内に、または皮下に投与される請求項２６に記載のマラリア感染症用のワクチン。
【請求項２８】
前記ワクチンが前記被験者にアジュバントと共に投与される請求項２６に記載のマラリア感染症用のワクチン。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１１−３】

【図１２−１】

【図１２−２】

【図１２−３】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１３−３】

【図１４−１】

【図１４−２】

【図１４−３】

【図１５−１】

【図１５−２】

【図１５−３】

【図１６−１】

【図１６−２】

【図１６−３】

【図１７−１】

【図１７−２】

【図１７−３】

【図１８−１】

【図１８−２】

【図１８−３】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図１９−３】

【図２０−１】

【図２０−２】

【図２０−３】

【図２１−１】

【図２１−２】

【図２１−３】

【図２２−１】

【図２２−２】

【図２２−３】

【図２３−１】

【図２３−２】

【図２３−３】

【図２４−１】

【図２４−２】

【図２４−３】

【図２５−１】

【図２５−２】

【図２５−３】

【図２６−１】

【図２６−２】

【図２６−３】

【図２７−１】

【図２７−２】

【図２７−３】

【図２８−１】

【図２８−２】

【図２８−３】

【図２９−１】

【図２９−２】

【図２９−３】

【図３０−１】

【図３０−２】

【図３０−３】

【図３１−１】

【図３１−２】

【図３１−３】

【図３２−１】

【図３２−２】

【図３３−１】

【図３３−２】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【公表番号】特表２０１３−５０２２２１（Ｐ２０１３−５０２２２１Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５６７７（Ｐ２０１２−５２５６７７）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４５９５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２５２２
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５９６１７１８３４）ザ　ロックフェラー　ユニヴァーシティ (11)
【Ｆターム（参考）】