免疫反応を調節する組成物および方法
本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排出／分泌（ＥＳ）成分またはその分画を含む、炎症性免疫反応を抑制する組成物を提供する。組成物は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応および特に自己免疫疾患の処置および予防において特に有用である。本発明は、Ｔ細胞介在性免疫反応を調節する方法にまでさらに及び、この場合、反応の進行を抑制するために、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分の治療的有効量をこのような処置を必要とする被検体に投与する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、例えばＴｈ１またはＴｈＩＬ−１７介在性炎症状態、慢性炎症状態および自己免疫疾患等の、Ｔリンパ球細胞が病原性役割を有する疾患および／または状態を、予防または処置するために免疫反応を調節する新規の組成物および方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
自然免疫系の細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、未感作（ナイーブ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の、機能的に別個のＴｈ１、Ｔｈ２、ＴｈＩＬ−１７（Ｔｈ１７としても知られる）または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のサブタイプへの分化を方向付ける。保存微生物分子と病原体認識受容体（ＰＲＲ）、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインテグリンの結合を介した未成熟ＤＣの活性化は、ＤＣの成熟およびリンパ節へのホーミングを伴い、ここで、成熟ＤＣは、未感作Ｔ細胞に対して抗原（Ａｇ）を提示する。病原体由来分子による樹状細胞の活性化は、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の、別個のＴ細胞のサブタイプへの分化を制御する重要な役割を果たす。Ｔｈ１細胞は、細胞内感染に対して防御するが、さらに炎症反応および自己免疫疾患に関連し、一方、Ｔｈ２細胞は、アレルギー性反応に関与する。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴｈＩＬ−１７またはＴｈ１７）は、Ｔ細胞の病原性サブセットであり、これらは、自己免疫疾患に寄与する重要な炎症促進性サイトカインであるＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファおよび特に、ＩＬ−１７およびＩＬ−１７Ｆの産生を特徴とする。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７反応を抑制することができる。
【０００３】
免疫介在性状態
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患である。この疾患を有する個体は、自己反応性Ｔ細胞（自己抗原を認識するＴ細胞）を有し、これは、インターロイキン（ＩＬ）−１ベータおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファと合わせて、神経線維のミエリン鞘に沿った炎症性病変の形成に関与する。ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）は、活性化Ｔ細胞を含有し、これは、脳組織に浸潤し、特徴的な炎症性病変を引き起こし、ミエリンを破壊する。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの動物モデルである。これは、マウスまたはラットにおいて、完全フロインドアジュバントと、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）またはそのペプチドの注射により誘導される。この疾患はまた、ＩＬ−１７を分泌する（ＴｈＩＬ−１７細胞またはＴｈ１７細胞と呼ばれる）ＭＢＰまたはＭＯＧ特異的Ｔ細胞の移入によっても誘導することができる。動物は、中枢神経系のミエリン鞘の細胞浸潤を進行させ、脱髄およびついには麻痺を生じる。臨床兆候および病理学的変化は、ＭＳと似ている。
【０００４】
クローン病および潰瘍性大腸炎は、ヒトの炎症性腸疾患である。これらの自己免疫疾患は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介される腸の炎症状態である。
【０００５】
多くの自己免疫および慢性炎症性疾患は、満足できる処置がなく、多くの場合、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬を使用する。しかし、これらは、非特異的であり、副作用を有する。ごく最近、主要な炎症性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）を阻害する薬剤が開発されている。これらは、特定の自己免疫疾患に対して効果的な抗体または可溶性ＴＮＦ受容体を含むが、（再発性結核および癌を含めた）副作用と関連し、ＴＮＦ−アルファが病状の主要なメディエーターである疾患に限定される。別の治療的手法は、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の直接投与であるが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏのサイトカインの半減期が短いことにより効果が損なわれる。別の方法は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０を誘導する薬剤を使用し、これは、ｉｎ ｖｉｖｏで直接の免疫抑制効果を有する。サプレッサーまたは制御性Ｔ細胞の誘導を促進する分子は、炎症性Ｔｈ１介在性免疫反応を制限する可能性を有し、Ｔ細胞介在性自己免疫反応の炎症性反応を媒介する、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞（ＴｈＩＬ−１７）もまたそうである。
【０００６】
蠕虫感染
寄生蠕虫類の感染は、免疫抑制および低下したＴ細胞反応に関連する。マウスにおいて、肝吸虫であるＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、高濃度のサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０ならびにＩｇＧ１抗体を伴う、非常に分極されたＴｈ２反応を誘導する。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）反応および細菌病原体であるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する防御を抑制した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染はまた、Ｔｈ１反応および全細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンで誘導されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する防御を阻害した。
【０００７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分はまた、全細胞Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンにより誘導されたＴｈ１反応を抑制することが示されている。この抑制は、カテプシンＬプロテイナーゼの阻害剤により反転することが示され、これは、カテプシンＬプロテイナーゼが抑制効果の媒介に関与したことを示唆する。
【０００８】
さらに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ成分から精製されたカテプシンＬプロテイナーゼは、Ｐｗワクチンで誘導されたＴｈ１反応を抑制した。これらの試験はまた、免疫反応の抑制がＩＬ−４欠損マウスにおいて反転することが示されたことから、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａまたはカテプシンＬプロテイナーゼにより誘導された抑制が、ＩＬ−４により媒介されたことを明らかにした。
【０００９】
それゆえ、上記の試験の結論は、カテプシンＬプロテイナーゼが、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａおよびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ成分に関与し、これらの抑制効果を媒介し、かつこの抑制がＩＬ−４誘導を介して媒介されることであった。
【００１０】
自己免疫疾患、炎症状態または免疫介在性障害の発症および進行を、これらの状態の原因であるＴ細胞反応の調節を介して予防する方法は、これらの状態の予防および処置に非常に有利であるだろう。
【００１１】
本発明の発明者等は、驚くことに、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分が免疫反応の抑制を媒介するカテプシンＬプロテイナーゼ以外の化合物を含むことを同定した。カテプシンＬプロテイナーゼによる免疫反応の抑制がＩＬ−４サイトカイン産生により媒介されると考えられる一方、本発明者らは、ＥＳ成分が、免疫反応を調節するよう作用する多くの別のメカニズムを介した免疫抑制を媒介することを同定した。特に、本発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分が自然免疫系の細胞と相互作用し、樹状細胞をＴ制御性表現型へと活性化し（これは、ＩＬ−１０を産生する）、これがＴｈ１および／またはＴｈＩＬ−１７表現型を有するＴ細胞の産生から免疫応答を偏らせることによって、サイトカイン発現の調節、特にＩＬ−１０サイトカインレベルの上方制御を介して、免疫反応を調節することを同定した。
【００１２】
特に、本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分が抗炎症性サイトカイン、例えば免疫反応の強力な調節物質として作用することができるＩＬ−１０の産生を刺激することを同定した。
【００１３】
さらに、本発明者らはまた、驚くことに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を促進する表現型に樹状細胞を活性化することができることを示しており、続いて、これらのＴｒｅｇは、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７型反応の抑制を介して免疫反応を調節する。特に、このような樹状細胞は、未感作（ナイーブ）の樹状細胞の細胞表面マーカーの発現濃度に比べ、細胞表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの発現濃度が低い一方、ＣＣＲ５の発現濃度が高いことが観察されることが示された。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ｈ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６およびＴＮＦを含めたサイトカインプロフィールを分泌する。ＩＬ−１およびＩＬ−２３またはＩＬ−６およびＴＧＦ−ベータにより促進されるＩＬ−１７産生Ｔ（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７））細胞は、Ｔｈ１細胞とは別個の炎症性Ｔ細胞のサブタイプであり、多くの自己免疫疾患および慢性炎症状態の病原である。
【００１４】
これらの効果は、今までにカテプシンＬプロテイナーゼに関連して認められている免疫調節効果から独立している。本発明者らにより認められた免疫調節効果は、カテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤により抑制されず、ＩＬ−４依存性ではないことが重要である。理論に制約されることを望まないが、それゆえ、本発明者らは、ＥＳ成分により媒介される免疫調節効果が少なくとも部分的に、カテプシンＬプロテイナーゼ以外のＥＳ成分由来の成分または産物により媒介されると予測する。
【００１５】
免疫系の特定の細胞型により発現される反応およびサイトカインプロフィールの調節は、言い換えると、免疫反応全体のより広範囲の調節を導くことができる。本発明者らは、さらに驚くことに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画がＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７）細胞）およびＴｈ１細胞の誘導を、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−１２およびＩＬ−２３の阻害、またはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の活性化を阻害すること、あるいはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の機能を抑制することによるいずれかを介して阻害することを示した。
【００１６】
［発明の開示］
本発明の第１の態様において、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応の処置または予防のための組成物を提供し、この組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む。
【００１７】
組成物が、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分から単離されたタンパク質もしくはペプチドの分画、誘導体産物、突然変異体、断片または変異体を含む場合、次いで、前記分画または分子は、ＥＳ成分に関連して、本明細書において本発明者らにより同定されたものと同じ免疫調節活性、すなわち、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−１２およびＩＬ−２３の阻害、またはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の活性化を阻害すること、あるいはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の機能を抑制することによるいずれかを介して、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７）細胞）およびＴｈ１細胞の産生および／または活性の抑制を示す。
【００１８】
適切には、ＥＳ成分から単離されたタンパク質は、カテプシンＬではない。
適切には、組成物により処置されたＴ細胞介在性炎症性免疫反応は、炎症促進性免疫反応である。典型的な炎症促進性免疫反応は、Ｔｈ１介在性免疫反応であり、この進行は、本発明の本態様の組成物投与後に抑制される。特に、この組成物は、Ｔｈ１細胞の誘導および機能を抑制または阻害する。適切には、Ｔｈ１細胞産生の上記抑制または阻害は、抗炎症性サイトカイン、特にＩＬ−１０の産生により引き起こされる。適切には、ＩＬ−１０産生は、ＥＳ成分またはその分画あるいは産物の投与により誘導される樹状細胞の成熟後に誘導される。上記抑制は、サイトカインＴＧＦ−ベータの産生または機能の強化によりさらに媒介されることができる。さらに、前記炎症促進性免疫反応の抑制は、ＥＳ成分またはＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）を刺激するその成分に起因し、細胞間接触により炎症促進性免疫反応の抑制を媒介することができる。
【００１９】
適切には、ＥＳ成分は、寄生虫Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａにより放出される排泄／分泌産物を含む。一実施形態において、ＥＳ成分は、単離形態または精製形態として提供されることができる。ＥＳ成分は、生組織由来のＥＳ成分の回収により得ることができる。
【００２０】
他の実施形態において、ＥＳ成分は、複数の分画に分画されることができ、上記得られた分画の少なくとも１つは、本発明の本態様の組成物として使用される。さらなる実施形態において、具体的な分子が、ＥＳ成分から単離または精製されることができる。さらなる実施形態において、具体的な分子を組換え手段により産生することができる。
【００２１】
一実施形態において、ＥＳ成分は、少なくとも１つのカテプシンＬプロテイナーゼ（ＦｈＣａｔＬ）タンパク質が欠乏している。
【００２２】
さらなる実施形態において、ＥＳ成分内に存在する場合に単離または同定された分画またはペプチドは、組換え手段により産生される。このような産物は、ＥＳ成分から同定された、２つ以上のペプチド成分を含有することができる。
【００２３】
本発明の第２の態様は、Ｔ細胞介在性炎症促進性状態の予防および／または処置のための医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分または分画あるいはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
【００２４】
Ｔ細胞介在性炎症促進性状態により、本発明者らは、天然において炎症促進性であり、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）により媒介される免疫反応を意味する。炎症促進性反応は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−ガンマ等の炎症促進性サイトカインにより促進されることができる。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、このような処置を必要とする被検体においてＴ細胞介在性免疫反応を調節する方法を提供し、この方法は、
このような処置を必要とする被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画または誘導体産物、そこから単離されたタンパク質またはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む。
【００２６】
適切には、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分または分画または誘導体産物、突然変異体、またはそこから得られた断片またはタンパク質が、
被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する。
【００２７】
適切には、Ｔ細胞介在性免疫反応は、Ｔ細胞介在性炎症促進性免疫反応である。
【００２８】
適切には、被検体は、自己免疫疾患の処置またはそれに対する防御を必要とする。
【００２９】
本発明の本態様の一実施形態において、Ｔ細胞介在性炎症促進性免疫反応が抑制される。理論に制約されることを望まないが、本発明の本態様の方法に従い、この抑制は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分を含む薬剤と免疫細胞とが接触するステップに起因する。
【００３０】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の増加に関連して使用される場合の「上方制御」という語句は、そのサイトカインの活性または発現が休止細胞に認められたものに比べ大きいことを意味する。
【００３１】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の低下に関連して使用される場合の「抑制」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められたものに比べ小さいことを意味する。
【００３２】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の阻害に関連して使用される場合の「阻害」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められた活性または発現濃度に比較した場合、阻害または実質的に阻害されていることを意味する。
【００３３】
適切には、ＥＳ成分の投与は、ＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の炎症促進性サイトカインの抑制およびＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等の抗炎症性サイトカインの上方制御を生じる。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分または誘導体産物あるいはそこから単離されたタンパク質またはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む有効量の薬剤が、少なくとも１つの免疫細胞型の少なくとも１つの細胞表面活性分子と連結、結合または会合することを提供し、これは、その細胞の１つまたは複数の機能的活性の抑制、阻害または下方制御を生じる。
【００３５】
本発明の一実施形態において、機能が調節される免疫細胞は、自然免疫系の少なくとも１つの細胞である。適切には、細胞は、抗原プロセッシングおよび提示機能を有する細胞型であり、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞またはマクロファージあるいはＢ細胞である。
【００３６】
ＡＰＣが樹状細胞である場合、それは、未成熟樹状細胞、半成熟樹状細胞であってよく、または成熟樹状細胞であってよい。
【００３７】
さらなる実施形態において、自然免疫系の細胞は、抗原提示細胞として機能しない細胞、例えば、肥満細胞である。肥満細胞は、ＩＬ−４等のサイトカインを分泌し、したがって、免疫反応を促進する役割を有することが知られている。しかし、これらは、関連する抗原プロセッシング機能を有さない。
【００３８】
一実施形態において、被検体は、哺乳動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３９】
理論に制約されることを望まないが、本発明の発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分の投与後に生じるＴ細胞反応の下方制御が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および特に、免疫反応を抑制するＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等のサイトカインプロフィールを発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を誘導する、樹状細胞（ＤＣ）の活性を調節することにより引き起こされると考える。
【００４０】
理論に制約されることを望まないが、本発明者らは、少なくとも１つの特異的なタンパク質分子が免疫機能調節に関与する排泄／分泌（ＥＳ）成分内に存在し、この少なくとも１つのタンパク質が、認められた免疫調節に関与すると考える。さらに、またはタンパク質の存在以外のものとして、脂質、リポペプチドまたはペプチド分子がＥＳ成分に存在し、下方制御に関与するかも知れない。
【００４１】
ＩＬ−１０発現の促進に加え、ＥＳ成分分画はまた、自然免疫系の細胞由来の他の抗炎症性サイトカインの発現を誘導することができる。
【００４２】
さらに、本発明者らは、樹状細胞の機能が、ＥＳ成分に暴露後に調節されることを同定したが、自然免疫系の他の細胞、例えばマクロファージの機能もまた、調節されることができ、この調節は、抗炎症性反応を促進する。
【００４３】
さらに、ＥＳ成分は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドをさらに含むことができる。しかし、本発明の本態様の他の実施形態において、ＴＬＲリガンド（作動薬）を本発明の組成物とともに外部から投与することができる。
【００４４】
したがって、一実施形態において、本方法は、前記組成物とともに少なくとも１つのＴＬＲ作動薬を投与するステップをさらに含むことができる。
【００４５】
ＴＬＲ作動薬は、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９の少なくとも１つに結合特異性を有することができる。適切なＴＬＲ作動薬の具体例は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。さらに、上記のＴＬＲ作動薬の適切な類似体もまた使用することができ、この場合、この類似体は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体を活性化するよう機能する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、自己免疫疾患の処置方法を提供し、
（ｉ）Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）ＥＳ成分または分画あるいはペプチドの治療的有効量を、自己免疫疾患を患う個体に投与するステップ
を含む。
【００４７】
適切には自己免疫疾患は、リウマチ様関節炎または多発性硬化症からなる群から選択される。さらなる自己疾患について、以降に詳述する。
【００４８】
適切にはＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質は、
混合リンパ球反応を阻害し、
細胞傷害性Ｔリンパ球反応を阻害し、
Ｔｈ１リンパ球を誘導し、
Ｔｈ１サイトカインプロフィールを誘導し、
ＩＬ−２産生を阻害し、
ＩＬ−１２産生を阻害し、
インターフェロンガンマ産生を阻害すること
の少なくとも１つからなる群から選択される免疫反応を抑制することができる。
【００４９】
さらに、ＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質は、
ＩＬ−１０産生を強化し、
ＴＧＦ−ベータ産生を強化し、
制御性Ｔ細胞の機能を強化し、かつ／または
Ｔｈ２サイトカインプロフィールを強化すること
により免疫反応の進行をさらに抑制することができる。
【００５０】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の阻害に関連して使用される場合の「阻害」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められた活性または発現濃度に比較した場合、阻害または実質的に阻害されていることを意味する。
【００５１】
「ＥＳ成分タンパク質を投与する」という語句は、ＥＳ成分タンパク質の投与およびＥＳ成分タンパク質をコードする核酸配列の投与をともに含む。後者の場合において、ＥＳ成分タンパク質は、動物においてｉｎ ｖｉｖｏで産生される。
【００５２】
ＥＳ成分由来の分画またはペプチドを得るために、ＥＳ成分は、ゲル濾過クロマトグラフィー、例えばＳｅｐｈａｒｙｌ Ｓ−３０００により分離後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、続いてウェスタン法により分析することができる。
【００５３】
「有効量」により、それは、自己免疫疾患を患う患者に投与される場合、ＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の濃度が治療的に有益な効果を産生することを意味する。本発明のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量は、疾患状態、年齢、性別および被検動物の体重等の因子によって異なる。投与計画を調節し、至適治療反応を提供することができる。例えば、１日に用量を数回に分割して投与することができ、または用量を、緊急の治療状況である場合、比例的に減量することができる。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、レシピエント動物の移植された器官または組織に対する免疫寛容を誘導する方法を提供し、これは、器官または組織の移植前にレシピエント動物に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を投与することを含む。
【００５５】
本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用し、移植された器官または組織に対する免疫寛容を誘導することを含む。
【００５６】
「免疫寛容を誘導する」という語句は、長期の全身免疫欠損を誘導することなく、免疫系に特定抗原への非反応性を付与することを意味する。「抗原」という語句は、免疫反応を誘導することができる物質を意味する。自己免疫疾患の場合において、免疫寛容は、免疫系に、宿主が異物として認識しており、それゆえ、自己免疫反応を引き起こす自己抗原への非反応性を付与することを意味する。アレルギーの場合において、免疫寛容は、免疫系に、通常、宿主の免疫反応を引き起こすアレルギー抗原に、非反応性を付与することを意味する。移植の場合において、免疫寛容は、免疫系に、移植片上の抗原への非反応性を付与することを意味する。アロ抗原は、種のいくつかのメンバーにのみ見つけられる抗原、例えば、血液型抗原を指す。異種抗原は、ある種のメンバーに存在するが他のメンバーには存在しない抗原を指す。これに対応して、同種移植片は、同種のメンバー間の移植片であり、異種移植片は、異種のメンバー間の移植片である。
【００５７】
レシピエントは、げっ歯類、ブタ、ネコ、イヌ、反芻動物、非ヒト霊長類および好ましくはヒトを含めた動物界のいずれのメンバーであってもよい。移植される器官または組織は、レシピエントと同種由来（同種移植片）であってよく、または別種由来（異種移植片）であってよい。組織または器官は、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、膵島、脳組織、角膜、骨、腸、皮膚および造血細胞を含めたいずれの組織または器官であってもよい。
【００５８】
本発明の方法を使用して、移植片対宿主病を予防することができ、この場合、移植片の免疫細胞は、レシピエントの免疫系において免疫攻撃を開始する。これは、移植された組織が免疫細胞を含有する場合、例えば、骨髄またはリンパ組織を、例えば、白血病、再生不良性貧血および酵素もしくは免疫疾患を処置する場合に移植する場合に生じうる。
【００５９】
したがって、別の実施形態において、本発明は、器官または組織移植片を受け入れるレシピエント動物の移植片対宿主病を予防または阻害する方法を提供し、レシピエント動物に移植する前に、器官または組織に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を投与することを含む。
【００６０】
本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用して移植片対宿主病を予防または阻害することを含む。
【００６１】
本発明の方法を使用して、アレルギー性反応を処置または予防することもできる。アレルギー性反応において、免疫系は、通常無害、無毒な抗原またはアレルゲンに対する攻撃を開始する。本発明の方法を使用して予防または処置することができるアレルギーは、花粉症、喘息、アトピー性湿疹、およびウルシおよびツタ（ｉｖｙ）、イエダニ、ハチ花粉、ナッツ、貝、ペニシリンおよびその他多くのものに対するアレルギーを含むがそれだけに限定されない。
【００６２】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、アレルギーを予防または処置する方法を提供し、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を、アレルギーを有するまたは有する疑いのある動物に投与することを含む。本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用して、アレルギーを予防または処置することを含む。
【００６３】
別の態様において、本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染を患う宿主において媒介される免疫抑制を予防する方法を提供し、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画の有効量をその必要とする動物に投与することを含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、免疫反応の下方制御により有利となる疾患または状態の処置および／または予防の方法に関し、この方法は、
このような処置を必要する被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画、またはそこから単離されたタンパク質またはペプチドの誘導体、突然変異体、分画、断片もしくは変異体を含む薬剤の治療的有効量を投与するステップを含む。
【００６５】
適切には、免疫反応は、炎症性免疫反応、例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈＩＬ−１７細胞により媒介される免疫反応である。
【００６６】
被検体は、哺乳動物、特にヒトであってよい。適切には、被検体は、免疫介在性状態、例えば、アレルギーまたは自己免疫障害である状態を有する。一実施形態において、状態は、自己免疫疾患、特に、Ｔｈ１介在性および／またはＴｈＩＬ−１７介在性自己免疫疾患である。
【００６７】
具体的な実施形態において、免疫介在性疾患は、自己免疫状態および多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、乾癬、紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性貧血、血小板減少症、喘息またはアトピー性疾患を含むがそれだけに限定されない疾患を含むがそれだけに限定されない。
【００６８】
「免疫介在性疾患」の定義もまた、他の免疫介在性障害、例えば１つまたは複数の皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎、円形脱毛症、節足動物の刺咬傷反応によるアレルギー反応、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応（ｌｅｐｒｏｓｙ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、後ブドウ膜炎、間質性肺線維症およびセリアック病を含む。
【００６９】
さらなる実施形態において、疾患または状態は、具体的なサイトカインプロフィールの発現が疾患の発症または進行に寄与することが示された神経変性状態を含むことができる。このような状態および疾患は、アルツハイマー疾患（ＡＤ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ＣＪＤ等のプリオン病、ＡＩＤＳ関連性認知症、脳炎、脳卒中および頭部外傷を含むことができる。
神経変性状態はまた、細菌およびウィルス感染の結果として生じる脳の急性炎症状態を含むことができる。
【００７０】
上記の自己免疫状態に加えて、本発明は、望ましくないまたは不必要な免疫反応が抗原の提示により誘発されるいずれの免疫介在性障害にも及ぶことができる。
【００７１】
したがって、本発明のなお追加の態様は、被検体の異常な、不必要なまたは不適切な免疫介在性反応を特徴とする状態の予防および／または治療目的の処置の方法を提供し、この方法は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む有効量の薬剤を被検体に投与することを含み、これらの薬剤は、上記細胞型の免疫活性を十分に抑制、阻害または下方制御する時間および状態下において、自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型に連結し、結合しまたは会合する。
【００７２】
典型的な自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型は、樹状細胞（ＤＣ）または濾胞性ＤＣ、マクロファージあるいはＢ細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。別法として、自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型は、肥満細胞等の具体的な抗原提示細胞機能を呈しない少なくとも１つの細胞であってよい。
【００７３】
ＡＰＣが樹状細胞である場合、それは、未成熟、半成熟または成熟樹状細胞であってよい。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその断片、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の免疫介在性疾患の処置への使用を提供する。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその断片、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の免疫介在性疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００７６】
本発明のなお追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物もしくは突然変異体、断片もしくは変異体の自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００７７】
一実施形態において、ＥＳ成分は、カテプシンＬプロテイナーゼを欠乏する。
【００７８】
さらなる実施形態において、組成物は、さらにカテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤を含む。
【００７９】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の炎症状態の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８０】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の神経変性疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８１】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の心臓病または心疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８２】
樹状細胞調節
本発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分を使用して、サイトカイン発現プロフィールおよび樹状細胞の成熟状態を調節することができることをさらに同定した。
【００８３】
樹状細胞は、免疫反応の主要な調節因子である。これらが発現するサイトカインプロフィールは、免疫反応の進行において重要な影響を有する。特に、樹状細胞により発現されるサイトカインは、Ｔｈ１またはＴｈ２経路の下流に偏らせる場合またはＴｈＩＬ−１７またはサプレッサー活性を持つＴ細胞の産生を誘導する場合に重要となりうる。
【００８４】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から単離された樹状細胞は、高濃度のＩＬ−１０を分泌し、未感作マウス由来の樹状細胞に比べ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現は顕著に低いが、高濃度のＣＣＲ５を有した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａは、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータ等の樹状細胞産生のサイトカインを誘導することにより、Ｔ細胞反応を抑制することを示し、これは、サプレッサーＴ細胞活性を誘導する。
【００８５】
したがって、本発明のさらなる態様は、このような処置を必要とする被検体の免疫介在性疾患の処置に適切な免疫反応を抑制する方法を提供し、この方法は、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ−ｖｉｖｏで暴露し、
樹状細胞を被検体に投与する、
ステップを含み、これにより、続いて被検体内の樹状細胞により誘導された免疫反応は、免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する。
【００８６】
一実施形態において、樹状細胞を活性化して、高濃度のサイトカインＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータ等の他の抗炎症性サイトカインあるいはＴｒｅｇの誘導を促進する他のサイトカインを発現する。
【００８７】
本発明の本態様の一実施形態において、樹状細胞は、被検体に対して自家性である。
【００８８】
一実施形態において、樹状細胞は、未成熟樹状細胞である。
別法として、樹状細胞は、成熟樹状細胞である。
【００８９】
さらなる実施形態において、樹状細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドとともに投与することができ、この例は、Ｐａｍ３Ｃｙｓである。
【００９０】
さらに、自己抗原を、場合により、樹状細胞とともに共投与することができる。自己抗原の例は、ＭＯＧまたはミエリン塩基性タンパク質である。
【００９１】
本発明のなお追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分の自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製における樹状細胞の処置への使用を提供する。
【００９２】
ＩＬ−１７活性の阻害
本発明者らは、さらに驚くことに、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分がＩＬ−１７（いわゆるＴｈＩＬ−１７細胞）を発現するＴ細胞の誘導を抑制することを示した。ＩＬ−１７は、自己免疫疾患および慢性炎症状態、特に多発性硬化症、大腸炎およびリウマチ様関節炎の発症および進行の主要な調節因子として同定されている。したがって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤によるＩＬ−１７濃度の調節は、自己免疫疾患および慢性炎症状態の予防および／または処置に適用可能な新規の治療を提供する。
【００９３】
本発明のなお追加の態様において、免疫介在性状態の予防および／または処置の方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップ
を含み、この場合、薬剤投与がＩＬ−１７を分泌するＴ細胞の産生を抑制または阻害するよう作用する。
【００９４】
本発明のさらに追加の態様において、免疫介在性状態の予防および／または処置の方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップ
を含み、この場合、薬剤投与がＩＬ−２３の産生を抑制または阻害するよう作用する。
【００９５】
典型的には、ＩＬ−２３の阻害は、ＩＬ−１７の産生の阻害をさらに生じるだろう。
【００９６】
本発明のさらに追加の態様は、免疫介在性疾患の処置のためのＩＬ−１７産生を阻害する医薬品の調製において、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分、そこから単離されたタンパク質の誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体の使用を提供する。
【００９７】
ＩＬ−１２抑制
本発明者らは、ＥＳ投与の結果として、ＩＬ−１２の産生が抑制されることをさらに同定した。ＩＬ−１２は、免疫反応の促進を促す役割を有し、特に、これらは、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞により媒介される。この抑制は、ＩＬ−１２サイトカインファミリー、例えばＩＬ−２３およびＩＬ−２７のメンバーにまでさらに及ぶことができる。
【００９８】
したがって、本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１２産生の抑制またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制のための組成物を提供し、この組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【００９９】
さらに追加の態様は、ＩＬ−１２産生の抑制またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制において使用する医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。本発明のなお追加の態様は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生を抑制する方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップ
を含む。
【０１００】
一実施形態において、ＩＬ−１２ファミリーメンバーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−２７である。
【０１０１】
肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の投与に加え、組成物、上記組成物の使用および本発明の方法はまた、ＥＳ成分の代わりに肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）の使用を介して実現することができる。
【０１０２】
本発明者らは、驚くことに、ＬＦＨの投与が免疫介在性炎症状態において重要となる特定のサイトカインの発現を調節することができることを同定した。例えば、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体は、サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０の発現レベルを調節することができる。
【０１０３】
したがって、本発明のさらなる態様は、炎症状態の予防および／または処置のための組成物を提供し、この組成物は、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【０１０４】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０５】
本発明のなお追加の態様は、炎症状態の予防および／または処置のための医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【０１０６】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０７】
本発明のなお追加の態様は、炎症状態を調節する方法を提供し、この方法は、
このような処置を必要とする被検体に肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を被検体に投与するステップ
を含む。
【０１０８】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０９】
一実施形態において、炎症状態は、免疫介在性状態であり、例えば、アレルギーまたは自己免疫障害である。さらなる実施形態において、状態は、自己免疫疾患、特にＴｈ１介在性および／またはＴｈＩＬ−１７介在性自己免疫疾患である。具体的な実施形態において、免疫介在性疾患は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、乾癬、紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性貧血、血小板減少症、喘息またはアトピー性疾患を含むことができるがそれだけに限定されない。
【０１１０】
免疫介在性状態、例えば、上記のものの調節においてＬＦＨの新規および思いがけない使用を同定するのに加え、本発明者らはまた、驚くことに、ＬＦＨがＩＬ−４レベルを調節する場合、特に有効であることを同定した。
【０１１１】
本発明のさらに追加の態様において、認知機能障害の予防および／または処置のための方法を提供し、この方法は、このような治療を必要とする個体に、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含む。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は、認知機能障害の処置において、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の使用にまで及ぶ。
【０１１３】
さらに追加の態様は、認知機能障害の処置のための医薬品の調製において、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１４】
好ましい実施形態において、ＬＦＨの投与は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４の上方制御および炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１の下方制御を生じる。好ましくは、上方制御は、海馬においてであり、最も好ましくは、この抗炎症性サイトカインプロフィールの上方制御は、ミクログリア細胞に存在するだろう。ＬＦＨまたはＥＳを、脳または直接に中枢神経系（ＣＮＳ）の別の領域に投与することが好ましい。
【０１１５】
典型的に、上方制御される抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータである。下方制御される炎症促進性サイトカインは、典型的にＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファである。炎症促進性および抗炎症性サイトカインレベルの調節は、海馬において好ましく、サイトカインプロフィールのこの調節は、ミクログリア細胞において最も好ましい。
【０１１６】
本発明のなお追加の態様は、脳またはＣＮＳへの肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の直接投与を介した認知機能障害の処置方法を提供する。
【０１１７】
さらに追加の態様は、認知機能障害の処置のための、脳またはＣＮＳに直接投与する医薬品の調製における、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１８】
さらに追加の態様は、免疫介在性状態の処置のための医薬品の調製における、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１９】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬
本発明者らは、驚くことに、ＴＬＲ作動薬がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分に存在することを同定した。このＴＬＲ作動薬は、免疫反応の誘導においてアジュバントとして非常に有用でありうる。
【０１２０】
ＴＬＲ作動薬は、例えば、治療薬、例えば、癌または悪性状態の処置のためのワクチンとともにまたは感染性疾患に対するワクチンとともに投与することもできる。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、樹状細胞の成熟を誘導する方法において、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分内で同定されたＴＬＲ作動薬の使用にまで及ぶ。
【０１２２】
本発明のなお追加の態様において、癌または感染性疾患の処置に適切な被検体においてＴｈ１反応を誘導する方法を提供し、この方法は、
エフェクター細胞機能を促進する表現型に樹状細胞を成熟させるために、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分から単離されたワクチンおよびＴＬＲ作動薬の存在下において、単離された樹状細胞を疾患特異的抗原にｅｘ−ｖｉｖｏで暴露するステップと、
樹状細胞を被検体に投与するステップ
を含み、それにより被検体に産生された免疫反応が、癌の発症または進行を十分に予防し、または病原性微生物感染を十分に予防し、それにより感染性疾患を予防する。
【０１２３】
定義
本明細書において使用される、「免疫細胞」という語句は、造血系に由来する細胞を含み、免疫反応の役割を果たす。免疫細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球を含む。
【０１２４】
本明細書において使用される、「Ｔ細胞」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。「Ｔ細胞」という語句はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞ならびにさらにＴｈ−ＩＬ１７細胞を含む。
【０１２５】
本明細書において使用される、「１つまたは複数の抗原提示細胞」またはその省略形「１つまたは複数のＡＰＣ」は、抗原のエンドサイトーシス吸着、プロセッシングおよび提示することができる１つまたは複数の細胞を指す。この語句は、専門の抗原提示細胞、例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞ならびにケラチノサイト、内皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞および乏突起膠細胞等の他の抗原提示細胞を含む。「抗原提示」という語句は、細胞表面上においてＭＨＣ分子に結合されたペプチド断片としての抗原の表示を意味する。多くの様々な種類の細胞、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、濾胞性樹状細胞および樹状細胞を含めた細胞が、ＡＰＣとして機能することができる。
【０１２６】
本明細書において使用される、「免疫反応」という語句は、Ｔ細胞共刺激の調節により影響されるＴ細胞介在性および／またはＢ細胞介在性免疫反応を含む。免疫反応という語句は、Ｔ細胞活性化により間接的になされる抗体産生（液性反応）およびマクロファージ等のサイトカイン反応性細胞の活性化等の免疫反応をさらに含む。
【０１２７】
本明細書において使用される、「１つまたは複数の樹状細胞」（ＤＣ）という語句は、その最も広義の内容の、１つまたは複数の樹状細胞を指し、抗原提示することができるあらゆるＤＣを含む。この語句は、免疫反応を開始し、かつ／またはＴリンパ球に抗原を提示し、かつ／または免疫反応の刺激に必要な他のあらゆる活性化信号を有するＴ細胞を提供する全てのＤＣを含む。本明細書において、「ＤＣ」への言及は、樹状細胞の形態、表現型または機能活性を呈する細胞およびその突然変異体または変異体への言及を含めるものとして読むものとする。樹状細胞の形態学的特徴は、長い細胞質突起または多数の微細樹状突起を有する大細胞を含むことができるがそれだけに限定されない。表現型の特徴は、１つまたは複数のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ１またはＣＤ４の発現を含むことができるがそれだけに限定されない。
【０１２８】
本明細書において使用される、「抗原」という語句は、免疫反応を刺激することができるあらゆる有機または無機分子である。本明細書において使用される、「抗原」という語句は、免疫反応を刺激することができる、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸分子、炭水化物分子、有機または無機分子に限定されないあらゆる分子にまで及ぶ。
【０１２９】
本発明に関して「被検体」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよびロバ）、実験用試験動物、例えばマウス、ウサギ、ラットおよびモルモットならびにペット動物、例えばイヌおよびネコ等の哺乳動物を含み、包含する。本発明の目的において、哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【０１３０】
処置
本明細書において使用される「処置」という語句は、ヒトまたは非ヒト動物に有利となることができるあらゆる療法を指す。処置は、存在する状態に関してであってよく、または予防（予防的処置）であってよい。処置は、治癒、緩和または予防的効果を含むことができる。
【０１３１】
より具体的には、本明細書において「治療的」および「予防的」処置の言及は、その最も広義の内容において考慮される。「治療的」という語句は、被検体が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、被検体が最終的に疾患状態にかからないことを必ずしも意味しない。
【０１３２】
したがって、治療的および予防的処置は、特定の状態の症状の改善または特定の状態を進行する危険を予防あるいは低下させることを含む。「予防的」という語句は、特定の状態の重症度または発症を低下させるものとして見なすことができる。「治療的」はまた、存在する状態の重症度を低下させることができる。
【０１３３】
投与
本発明において使用するＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体は、単一で投与することができるが、医薬組成物として投与することが好ましく、これは、一般に、意図される投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を含むだろう。
【０１３４】
本発明において使用するＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を、あらゆる適切な経路を介して、処置を必要とする患者に投与することができる。正確な用量は、投与されるＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の形態の正確な性質を含めた多くの因子に応じて決定されるだろう。
【０１３５】
好ましい投与経路は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内を含む）であるが、いくつかのさらに適切な投与経路は、経口、経直腸、経鼻、局所（経頬および舌下を含む）、注入、経膣、皮内、腹腔内、頭蓋内、鞘内および硬膜外投与あるいは経口または鼻吸入を介した投与、例えば、ネブライザーまたは吸入器により、あるいは移植を含む（がそれだけに限定されない）。
【０１３６】
静脈内注射において、有効成分は、発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であるだろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液または乳酸加リンゲル注射液などの等張性ベヒクルを使用して適切な溶液を十分に調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要な場合含むことができる。
【０１３７】
経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態であってよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含むことができる。一般に、液体医薬組成物は、水、石油、動物または植物油、鉱油あるいは合成油等の液体担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールを含むことができる。
【０１３８】
また、組成物を、ミクロスフィア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含めた特定の組織に入れる徐放性製剤を介して投与することができる。徐放性担体の適切な例として、シェア製品（ｓｈａｒｅｄ ａｒｔｉｃｌｅｓ）の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、座剤またはマイクロカプセルがある。移植可能またはマイクロカプセル状の徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；欧州特許出願第００５８４８１（Ａ）号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１）：５４７−５５６，１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２）を含む。
【０１３９】
上記の技法およびプロトコールならびに本発明において使用することができる他の技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５，２０００）ＩＳＢＮ ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ ０−６８３３０５−７２−７に見つけることができ、これらの開示全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１４０】
医薬組成物
上記のように、本発明は、免疫反応の調節、特に、Ｔ細胞反応の下方制御のための医薬組成物にまで及び、この場合、組成物は、少なくともＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体あるいはその組換え形態の誘導体、断片、変異体、突然変異体を含む。
【０１４１】
本発明における医薬組成物および本発明に従う使用は、有効成分（すなわち、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体）に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に公知の他の材料を含むことができる。
【０１４２】
このような材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の効果と干渉しないものであるべきである。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて決定し、これは、例えば、経口、静脈内、鼻内または経口もしくは鼻吸入を介してであってよい。
【０１４３】
製剤は、液体、例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理食塩溶液または凍結乾燥もしくは冷凍乾燥粉末であってよい。
【０１４４】
用量
組成物は、治療的「有効量」または「所望量」において個体に投与することが好ましく、これは、個体に十分に役立つことを示す。
【０１４５】
本明細書において定義されるように、「有効量」という語句は、所望の反応を少なくとも部分的に得るために、または発症を遅延もしくは進行を阻害し、あるいは処置された特定の状態の発症または進行を完全に停止するために必要な量を意味する。
【０１４６】
量は、処置される被検体の健康および身体的状態、処置される被検体の分類群、所望される防御の程度、組成物の配合、医学的状況および他の関連因子の評価に応じて変化する。量は、相対的に広範囲であり、これは、所定の試験を介して決定することができることが期待される。
【０１４７】
処置の処方、例えば、用量等の判断は、最終的には一般開業医、内科医または他科の医師の責任の範囲および判断であり、典型的に、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および実施者の公知の他の因子を考慮する。
【０１４８】
至適用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置される状態の重症度、投与される有効成分および投与経路を含めた多くのパラメーターに基づいて医師により決定されることができる。
【０１４９】
広範囲の用量を適用することができる。患者を考慮して、例えば、薬剤約０．１ｍｇ〜約１ｍｇを１日当たり体重ｋｇ当たりで投与することができる。至適治療反応を得るために投与方法を調節することができる。例えば、１日毎、週毎、月毎または他の適切な時間間隔で数回に分割して投与することができ、または用量を、緊急の状況である場合、比例的に減量することができる。
【０１５０】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は全て、本発明の分野の当業者により通常、理解される意味を有する。
【０１５１】
本明細書を通して、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」という語句または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（三人称）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（進行形）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（三人称）」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（進行形）」等の変形は、明記された整数または整数群の包括を意味するが、いくつかの他の整数もしくは整数群を排除しないことが理解されるだろう。
【０１５２】
本明細書において使用される、Ｔ細胞反応の調節に関連して使用される場合の「阻害する」という語句は、Ｔ細胞の増殖および／または活性の部分的または完全な下方制御を意味する。
【０１５３】
本発明の各態様の好ましい特徴および実施形態は、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、他の態様のそれぞれに関して必要であれば変更を加える。
【０１５４】
本発明は、ここで、説明の目的において提供され、本発明を限定するように解釈されることを意図しない以下の実施例を参照し、さらに図を参照して記載される。
【実施例】
【０１５５】
材料および方法
動物および免疫化
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ Ｏｌａｃ（ビセスター、英国）から購入し、６〜８週齢、１群マウス４匹にて使用した。マウスを個別換気ケージで飼育し、全ての実験は、アイルランド保健局（Ｉｒｉｓｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、欧州連合およびＴｒｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎの倫理委員会の規則に従い行われた。マウスを脱発熱化したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（５μｇ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラホーヤ、カリフォルニア州）；ＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０または５０μｇ；またはダルベッコのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、プール、英国）で最終的に２００μｌを側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。免疫７日後に、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、血清および鼠径リンパ節を採集した。
【０１５６】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄−分泌産物の調製
生きた成熟吸虫を地域の食肉処理場にてウシ肝臓から採集した。吸虫をＣａ２＋非含有およびＭｇ２＋非含有ダルベッコＰＢＳを数回交換して洗浄後、空気中５％ＣＯ２、３７℃にてＰＢＳで一晩インキュベートした。排泄−分泌（ＥＳ）産物を含有する上清液を採取し、４℃、１３０００ｇにて１５分間遠心分離により浄化し、０．２２μｍフィルターに通した。ＥＳ調製物のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。抗原調製物を必要な時まで−８０℃で保存した。
【０１５７】
マウスのＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ注射
メタセルカリア（ｍｅｔａｃｅｒｃａｒｉａｅ）をＣｏｍｐｔｏｎ Ｐａｄｄｏｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バークシャー、英国）から得た。実態顕微鏡を使用して、生存能力を検討し、その後、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個をマウスに経口感染させた。これは、動物１００％に感染する結果となった。他に明記されない限り、マウスを感染３週間後に頸椎脱臼により屠殺した。
【０１５８】
骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の単離および培養
骨髄由来未成熟ＤＣを、マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ発現性細胞株（Ｊ５５８−ＧＭ−ＣＳＦ）由来の上清（１０％）を補充した１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０において培養することにより調製した。３日目に、１０％ＧＭ−ＣＳＦ細胞上清を含む新鮮な培地を付着細胞に添加した。７日目に、細胞を採集し、洗浄し、アッセイに使用した。ＢＭＤＣを細胞１×１０６個／ｍｌにて培養した。
【０１５９】
腹腔マクロファージ、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の精製
腹腔マクロファージの単離において、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）をマウスから洗浄により採取した。ＰＥＣを６ウェル組織培養プレートにおいて２時間インキュベートし、マクロファージを可塑的に付着させた。付着しなかった細胞を洗浄により除去し、付着マクロファージを、刺激するためにプレートから採取した。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ１１ｃ＋樹状細胞をＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、独国）およびａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離装置を用いた正の選択を使用して脾臓およびＰＥＣから単離した。赤血球細胞の溶解後、ＰＥＣまたは脾臓細胞のどちらかの単一細胞懸濁液をＭＡＣＳ ＣＤ４またはＣＤ１１ｃ免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のどちらかとともにインキュベートし、正の選択を使用してａｕｔｏＭＡＣＳに通した。ａｕｔｏＭＡＣＳ分離後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の純度をＦＩＴＣ標識ＣＤ４またはＣＤ１１ｃそれぞれを使用して、ＦＡＣＳｃａｎ分析により評価した場合、通常９０〜９５％であった。
【０１６０】
Ｊ７７４細胞培養
Ｊ７７４．Ａ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ６７）を組織培養フラスコにおいて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて空気中５％ＣＯ２、３７℃にて成長させた。細胞がコンフルエンスに達した場合、それらを培養物から取り出し、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、１×１０６個／ｍｌ濃度にて新鮮なフラスコに再播種した。細胞が実験に十分な数に達した場合、次いで、細胞を激しくピペッティングすることより採集し、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞を１０％ＲＰＭＩで１回洗浄後、刺激するために１ｍｌ／ウェルの容量で１×１０６個／ｍｌにて２４ウェル培養プレートに播種した。
【０１６１】
サイトカイン産生の誘導または阻害
Ｊ７７４および腹腔マクロファージ、骨髄由来ＤＣ、ＭＡＣＳ単離ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよび腹腔滲出細胞を１×１０６個／ｍｌの細胞密度にて２４ウェル組織培養プレートで培養した。いくつかの実験において、腹腔滲出細胞およびＪ７７４マクロファージは、１０ｍＭ濃度のカテプシン阻害剤Ｅ−６４（Ｓｉｇｍａ）の存在下のＥＳまたは１００℃で２０分間加熱した熱不活性化ＥＳで刺激した。空気中５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間インキュベーション後、上清を取り出し、市販の免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０濃度の分析まで、またはＩＬ−４およびＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＧＦ−ベータ用モノクローナル抗体の対（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する分析まで保存した。ＩＬ−１２産生におけるＥＳ効果を、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）を用いてＢＭＤＣまたはＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を２時間前刺激し、その後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−ガンマ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳのみを添加し、さらに２２時間インキュベーションして決定した。上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０および／またはＩＬ−１２ｐ７０の濃度を免疫アッセイにより決定した。ＣｏｎＡ誘導性サイトカインの産生および増殖におけるＥＳの効果は、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下においてＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）を用いて未感作マウス由来の脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を刺激することにより決定した。上清を空気中５％ＣＯ２、３７℃にて７２時間インキュベーション後に取り出し、Ｔ細胞サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。Ｔ細胞の増殖は、４８時間培養の最後の４時間における［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定した。ｉｎ ｖｉｖｏのＥＳによるサイトカイン誘導を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５０μｇのＥＳを合計２００μｌ／マウスｓ．ｃ．の容積で注射した。６時間後、鼠径リンパ節を取り出し、氷冷ＰＢＳ １ｍｌでホモジナイズした。４℃にて、１２００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を除去後、上清を取り出し、市販のサイトカインＤｕｏＳｅｔｓ（Ｒ＆Ｄ）を使用して、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の存在について分析した。別の実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹の群にＰＢＳまたはＥＳ（５０μｇ）のどちらかを３００μｌ注射した。２時間後、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を氷冷ＰＢＳの腹腔洗浄により採取した。細胞を５０％ＰＢＳ／ＦＣＳ（ｖ／ｖ）でブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、固定し、ＰＥ標識化抗ＩＬ−１０ならびにＦＩＴＣ標識化抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマモノクローナル抗体またはラット対照Ｉｇを添加することにより透過させ、細胞内サイトカイン標識した。氷上に３０分後、次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄し、速やかに回収した。試料当たり合計２００００個の細胞を得た。細胞をＣＤ１１ｃ＋集団上にゲートし、細胞内タンパク質の発現を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【０１６２】
抑制アッセイ
ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＡＣＳマイクロビーズおよびＡｕｔｏＭａｃｓ ｓｙｓｔｅｍ（上記）を使用して、ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニック（ＴＣＲ−Ｔｇ）マウスから精製した。ＯＶＡ−特異的Ｔ細胞（１×１０５個／ｍｌ）をＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（２μｇ／ｍｌ）、および、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、照射した脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）とともに培養した。このＯＶＡ特異反応は、対照として機能した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞（ＦＨ Ｔ細胞）をＣＤ４＋ＭＡＣＳマイクロビーズ（上記）を使用して感染３週間後に感染マウスの腹腔洗浄液から単離した。次いで、ＦＨ Ｔ細胞を、抗原もしくはＡＰＣを全く含まないか、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）２０μｇ／ｍｌまたはＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）を含むどちらかで、ＡＰＣとして未感作ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の照射された脾臓細胞とともに培養した。次いで、同じウェルまたは半透過膜（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）による分離されたウェルのどちらかにおいて、ＯＶＡ特異的およびＦＨ Ｔ細胞を１：１比で合わせて培養した。空気中５％ＣＯ２、３７℃にて７２時間インキュベーション後、ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度の決定のために、上清をｔｒａｎｓｗｅｌｌの上下から、およびに共培養細胞から取り出した。増殖を９６時間培養後の３Ｈチミジン取り込みにより決定した。
【０１６３】
ＦＡＣＳによる自然細胞活性化の分析
ＢＭＤＣまたはＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）中で培養した。細胞を取り出し、表面マーカー発現を蛍光により標識化した抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリーにより評価した。５０％ＦＣＳ／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）でブロックング後、細胞をマウスＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ（ＢＭＤＣのみ）、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＣＲ５に特異的な抗体を用いて暗室にて氷上で３０分間インキュベートした。非関連の特異性を有する適当なアイソタイプ適合抗体で標識した細胞は、対照として作用した。試料当たり合計２００００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。分析をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バーション３．３；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用して行った。
【０１６４】
Ｊ７７４表面マーカー発現の調節
ＬＰＳ誘導性細胞表面マーカー発現におけるＥＳの効果を、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）を用いてＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を２時間前刺激後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、さらに２２時間インキュベーションすることにより決定した。２４時間後、細胞を回収し、洗浄し、ブロックし、表面マーカー発現をＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩを使用して評価した。非関連の特異性を有するアイソタイプ適合した直接標識抗原でインキュベーションした細胞は、対照として作用した。暗室において、氷上で３０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、免疫蛍光分析をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析し、試料当たり細胞２００００個を分析した。
【０１６５】
細胞内サイトカイン合成のフローサイトメトリー分析
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来ＤＣおよびＴ細胞のサイトカイン産生を分析するため、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を最初に、５０％ＰＢＳ／ＦＣＳ（ｖ／ｖ）を用いて、室温にて２０分間インキュベートした。次いで、ＤＣおよびＴ細胞を抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＣＤ４それぞれを用いて染色した。細胞内ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマの検出において、細胞を固定し、市販の細胞内サイトカイン染色キット（Ｃａｌｔａｇ）を使用して透過処理した。ＰＥ標識抗ＩＬ−１０およびＦＩＴＣ標識ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマｍＡｂまたはラット対照Ｉｇを所定の飽和濃度にて３０分間添加した。次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄し、速やかに回収した。試料当たり合計５００００個の細胞を得た。細胞をＤＣおよびＴ細胞それぞれにおいてＣＤ１１ｃまたはＣＤ４上にゲートし、細胞内タンパク質の発現を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにおいて分析した。
【０１６６】
抗原特異的サイトカイン産生
免疫マウスまたは感染マウス由来の脾臓（２×１０６個／ｍｌ）またはリンパ節細胞（１×１０６個／ｍｌ）をＭＯＧペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）またはＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）あるいはホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）および抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）あるいは培地のみのいずれかを用いてＲＰＭＩ培地において３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。７２時間後、サイトカイン決定において上清を採集し、培地を置き換えた。増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより評価した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を免疫アッセイにより決定した。
【０１６７】
ＥＡＥの誘導およびＥＳ処置
各マウスにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）５ｍｇ／ｍｌを含有するＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチド１５０μｇを尾の根元にｓ．ｃ．注射した。全てのマウスに０日目および免疫化２日後にｉ．ｐ．注射によりｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（Ｓｉｇｍａ）５００ｎｇを投与した。ＥＳ処置において、ＰＢＳ中のＥＳ ５０μｇを２日毎にｉ．ｐ．注射した。マウスをＥＡＥの臨床兆候において毎日評価し、以下のようにスコアした：１＝尾の麻痺、２＝不安定な歩行、３＝後肢の筋力低下、４＝後肢の麻痺、５＝四肢の完全な麻痺、６＝死亡。疾患指数は、１日の平均疾患スコア全てを加算し、平均発症日を割り、１００を掛けることにより算出した。対照ＥＡＥマウスが臨床スコア３〜４を表示した場合、実験を終了した。マウスを頸椎脱臼により屠殺し、血清および脾臓を採取した。
【０１６８】
０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫し、０および２日目にｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＡＥ誘導１日前およびその後２日毎にＥＳ ５０μｇをｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導後２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。結果は、マウス４〜５匹の群において、３回調べた平均値である。
【０１６９】
結果
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、樹状細胞成熟を阻害する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａメタルセルカリアで経口感染後、寄生虫は、腹腔を通り、内臓から肝臓に移動する。それゆえ、腹腔が肝吸虫の産物に暴露される。本明細書において、本発明者らは、腹腔において自然免疫反応の細胞におけるＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染の影響を検討した。マウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、感染３週間後、細胞を腹腔から回収した。未感作マウスの細胞は、対照として機能した。成熟の指標である細胞表面マーカーの発現について、樹状細胞（ＤＣ）を検討した。対照マウス由来の細胞の比較において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現がかなり低く、ＣＣＲ５の発現は高かった（図１）。これは、感染がＤＣ成熟を阻害するか、または腹腔へ未成熟ＤＣの動員することを示唆する。
【０１７０】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来の樹状細胞は、高頻度でＩＬ−１０を分泌し、低頻度でＩＬ−４を分泌する。
マウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、感染３週間後に、細胞を腹腔から回収した。未感作マウス由来の細胞は、対照として機能した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣについて、細胞内ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを、免疫蛍光分析により検討した（図２）。未感作マウスの腹腔由来のＤＣと比較して、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＤＣは、高頻度でＩＬ−１０を分泌した（未感作２〜３％に対して感染３４〜３５％）。また、ＤＣ分泌性ＩＬ−４（未感作０．３７％に対して感染２．２６％）およびＩＦＮ−ガンマ（未感作０．４８％に対して感染１．５７％）の頻度もわずかに増加した。
【０１７１】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、制御性表現型を有するＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞が高頻度で検出される
ＩＬ−１０産生ＤＣがＩＬ−１０分泌性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の誘導を促進することが示されているため、本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＴｒｅｇ細胞の誘導にも関連する可能性を検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａに感染させ、感染３週間後、細胞を腹腔から回収した。未感作マウスの細胞は、対照として機能した。細胞内ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマにおいて、免疫蛍光分析によりＣＤ４＋Ｔ細胞を検討した（図３）。結果は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔のＴ細胞は、高頻度でＩＬ−１０を分泌することを示す（未感作３〜５％に対して感染６６〜６７％）。対照に、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の頻度は、顕著に強化されなかった。
【０１７２】
また、Ｔｒｅｇ細胞に関連することが知られている表面マーカーの表面発現において、腹腔由来のＴ細胞を評価した。特異的抗体を用いた免疫蛍光分析は、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＤ２８、Ｔ１／ＳＴ２およびＣＣＲ５の発現がＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の細胞において強化されることを明らかにした（図５）。対照に、ＣＤ２５発現は、低かった。これらの所見は、誘導性Ｔｒｅｇ細胞が産生され、またはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に腹腔に動員されることを示唆する。
【０１７３】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａは、ＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞を誘導する
図４は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が腹腔へのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の非常に顕著な動員に関連していることを示す。感染マウスのリンパ節の制御性Ｔ細胞数がわずかに増加（５％〜６．７％）したが、一方、腹腔での頻度は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染後に２４％〜９６％までに増加した。
【０１７４】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞は、サプレッサー活性を有する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞がＩＬ−１０を分泌し、制御性表現型を有することを明らかにしたので、本発明者らは、オボアルブミン（ＯＶＡ）Ｔ細胞受容体（ＴＬＲ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウス由来のＴ細胞を用いた共培養実験において、これらのサプレッサー活性を検討した。高頻度のＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウスは、ＯＶＡに特異的であり、抗原特異反応の読み出しに有用である。ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞は、増殖し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原（ＯＶＡ）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激後にＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を分泌する。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞を用いた共培養は、増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生において顕著な抑制効果を有した。これは、抗原（肝吸虫ホモジネート；Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＬＦＨまたは排泄／分泌分画；ＥＳ）を用いた刺激または未刺激において認められた。また、ＩＬ−４産生は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の未刺激Ｔ細胞で特に低下した。対照に、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生は、特にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の抗原刺激細胞で強化された（図６）。
【０１７５】
次に、本発明者らは、抑制のメカニズム、具体的に溶解性因子に対する細胞接触の役割を評価した。ここで、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞は、半透過膜によりＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞から分離した。ＬＦＨまたはＥＳを用いたＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞の刺激は、高濃度のＩＬ−５およびＩＬ−１０および低濃度ＩＦＮ−ガンマの産生を生じた。ＩＬ−４はまた、ＬＦＨで刺激後に検出されたが、ＥＳでは検出されなかった（図７）。ＯＶＡを用いたＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞の刺激は、強力な増殖およびＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の分泌を生じた。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞を用いた共培養は、増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を部分的に抑制したが、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生を強化した。
【０１７６】
これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスのＴ細胞がバイスタンダー様式において、非関連抗原に対するＴ細胞反応を抑制することを明らかにする。さらに、この抑制は、溶解性因子、おそらくＩＬ−１０により部分的に媒介され、これは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞により高濃度で分泌される。
【０１７７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中のＩＬ−１０産生は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−５およびＩＦＮ−ガンマ産生を制御する
ｉｎ ｖｉｖｏの免疫反応の抑制におけるＩＬ−１０の役割を検討するため、Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、腹水において、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原を用いて再刺激された腸管膜リンパ節細胞において、サイトカイン産生を検討した。
【０１７８】
ＩＬ−１０およびＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹水において検出されたがＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマは検出されなかった（図８）。対照に、顕著な濃度のＩＬ−４および強化されたＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａに感染させたＩＬ−１０ノックアウトマウスの腹水において検出された。ＩＬ−１０およびＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ刺激腸管膜リンパ節細胞で検出されたが、ＩＬ−５ならびにＩＦＮ−ガンマは検出されなかった（図９）。対照に、顕著な濃度のＩＦＮ−ガンマおよび強化されたＩＬ−５が、ＩＬ−１０ノックアウトマウス由来のＥＳ刺激腸管膜リンパ節細胞に検出された。これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスのＩＬ−１０産生細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン産生をともに抑制することを示す。
【０１７９】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ排泄／分泌（ＥＳ）産物は、自然ＩＬ−１０産生を刺激する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が自然細胞およびＴ細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを明らかにしたので、本発明者らは、自然免疫系の細胞によるＩＬ−１０産生におけるＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳの影響を検討した。腹腔滲出細胞、腹腔マクロファージ、Ｊ７７４マクロファージ、骨髄由来ＤＣおよび腹膜と脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣは全て、ＥＳに反応してＩＬ−１０を分泌した（図１０および１１）。本発明者らは、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もまた、腹腔マクロファージ由来のＩＬ−１０産生を刺激することを見出した。ＩＬ−１２ｐ４０産生は、骨髄由来ＤＣおよびＪ７７４細胞の上清において検出されたが、ＩＬ−１２ｐ７０は検出されなかった（図１１）。ＩＬ−１０産生は、ＥＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後６〜４８時間でマクロファージにおいて、および２４〜４８時間でＤＣにおいて検出された（図１２）。
【０１８０】
ＥＳは、ｉｎ ｖｉｖｏで自然ＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を刺激する
ｉｎ ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞によるＩＬ−１０の誘導を明らかにしたので、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＳの自然サイトカイン産生の刺激能を検討した。マウスの側腹部にｓ．ｃ．注射し、流入領域リンパ節を６時間後に取り出し、ホモジナイズし、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。別法として、マウスにｉ．ｐ．注射し、２時間後に腹膜ＤＣのサイトカイン産生を評価した。結果は、ＥＳのｓ．ｃ．注射が流入領域リンパ節における顕著な濃度のＩＬ−１０および低濃度のＩＬ−４の産生を刺激したことを明らかにした（図１３）。ｉ．ｐ．経路によるＥＳ注射はまた、腹腔のＩＬ−１０およびＩＬ−４産生ＤＣ細胞を刺激した。ＩＬ−１０分泌性ＤＣの頻度は、対照マウスの７〜１２％からＥＳ注射マウスの１５〜２１％まで増加し、ＩＬ−４産生細胞の頻度は、７．５から１７％まで増加した（図１４）。ＩＦＮ−ガンマ分泌性ＤＣの頻度において、１．９から４．０％と、あまり顕著な増加はなかった。
【０１８１】
ＥＳは、ＴＬＲ作動薬誘導性ＩＬ−１２ｐ７０産生を阻害する
自然細胞によるＩＬ−１０産生は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関連し、一方、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞の増殖を促進する。それゆえ、本発明者らは、マクロファージおよびＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０産生におけるＥＳの影響を検討した。ＥＳのみは、ＩＬ−１２ｐ７０を刺激しなかったが、Ｊ７７４マクロファージ由来のＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０産生を刺激した（図１５）。さらに、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０は、ＥＳを用いた２時間のプレインキュベーションにより阻害された。ＥＳは、ＤＣ由来のＩＬ−１２ｐ７０を誘導せず、ＬＰＳおよびＩＦＮ−ガンマにより誘導されたＩＬ−１２ｐ７０を阻害した。ＥＳの阻害効果は広範囲の濃度にわたり認められ、より高濃度において非常に顕著であった（図１６）。
【０１８２】
ＥＳの免疫調節効果は、カテプシン以外の熱感受性分子により媒介される
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のカテプシンＬプロテイナーゼが免疫調節特性を有することは以前に報告されている。ここで、本発明者らは、ＩＬ−１０産生の誘導において、カテプシンの役割を評価した。本発明者らは、最初に、ＥＳ活性の熱処理の効果を評価した。ＥＳの熱処理は、腹腔滲出細胞によるＩＬ−１０産生を刺激するその能力を顕著に低下させた（図１７）。対照的に、カテプシン阻害剤の添加は、ＩＬ−１０を刺激し、またはＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０あるいはｍＩＬ−１２ｐ７０の産生を阻害するＥＳの能力に全く影響しなかった（図１８および１９）。これらの所見は、ＩＬ−１０産生を刺激するＥＳ分画の免疫調節産物は、カテプシンではないが、熱感受性分子であることを示唆する。
【０１８３】
ＥＳは、ＤＣおよびマクロファージにおける表面マーカー発現を調節する
ＤＣおよびマクロファージは、強力な抗原提示細胞であるが、最初にＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子の発現を強化するよう活性化されなければならない。完全な成熟ＤＣは、エフェクターＴ細胞、特にＴｈ１細胞の増殖を促進し、一方、未成熟または部分的成熟ＤＣは、アネルギー性または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する。本明細書において、本発明者らは、ＥＳがＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＣのＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を強化することを見つけた。活性化のレベルは、ＬＰＳで認められたものと同様であった。しかし、ＣＣＲ５発現を抑制するＬＰＳと異なり（ＣＣＲ５発現は、通常、ＤＣ成熟後に低下する）、ＥＳは、ＣＣＲ５発現を強化した。ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、この強化は、認められなかった。さらに、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩは、ＩＬ−１０欠損マウス由来のＥＳ刺激ＤＣで強化された（図２０）。これは、ＤＣ成熟がＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生により強制されることを示唆する。
【０１８４】
ＥＳはまた、Ｊ７７４マクロファージのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を強化し（図２１）、ＥＳにより阻害されたＣＤ４０を除いて、これらのマーカーのＬＰＳ誘導性発現を強化した（図２２）。抑制されたＣＤ４０発現は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関連している。それゆえ、これらの所見は、ＥＳがＤＣおよびマクロファージの中間表現型への成熟を誘導することを示唆し、これは、Ｔｒｅｇ細胞を刺激するこれらの能力と一致する。
【０１８５】
ＥＳは、ＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、エフェクターＴ細胞による増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を抑制する
本発明者らは、モデル抗原であるＫＬＨに対するＴ細胞反応の誘導におけるＥＳの影響を検討した。マウスにＥＳのみ、ＫＬＨのみまたはＫＬＨおよびＥＳを注射し、流入領域リンパ節を７日後に取り出し、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原（ＫＬＨ）を用いて再刺激した。この実験において、陽性対照刺激である抗ＣＤ３およびＰＭＡに対して反応が検出されたが、ＫＬＨのみは、抗原特異的免疫反応を誘導しなかった。対照的に、ＥＳ（５０μｇ）を用いた共注射は、高濃度の抗原特異的ＩＬ−１０および低濃度のＩＬ−５を分泌するが、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマを分泌しないＴ細胞を産生した（図２３）。このサイトカインパターンは、Ｔｒｅｇ細胞の誘導と一致する。ＫＬＨのみの免疫に反応してＩＬ−５およびＩＦＮ−ガンマを検出した別の実験において、本発明者らは、ＥＳ共投与（２０μｇ）後にこのＫＬＨ特異的サイトカイン産生の抑制を認めた（図２４）。
【０１８６】
また、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、分裂促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対するＴ細胞反応におけるＥＳの影響を検討した。ＣｏｎＡで刺激された脾臓細胞は、増殖し、ＩＦＮ−ガンマおよび低濃度のＩＬ−１０を分泌した（図２５）。ＥＳの共インキュベーションは、特に、高濃度で使用された場合に（２０μｇ／ｍｌ）、これは、単独では増殖またはサイトカイン産生を誘導しないが、ＣｏｎＡ誘導性増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を顕著に阻害し、ＩＬ−１０を強化した。これらの所見により、ＥＳが優先的にＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ１細胞の誘導を抑制することが確認された。
【０１８７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して防御する
ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７を分泌する自己抗原特異的Ｔ細胞は、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含めた多くの自己免疫疾患の病原体を媒介した。正常な個体において、病原性Ｔ細胞を抑制する天然および誘導性Ｔｒｅｇ細胞により、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患が調整される。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＥＳがＩＬ−１０分泌性Ｔｒｅｇ細胞を誘導することを示したので、本発明者らは、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）を有する完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）中のミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドの投与を含む慢性疾患モデルのＥＡＥ進行におけるＥＡＥの感染または非経口投与の影響を検討した。未処置のマウスは、１２日後にＥＡＥの臨床症状を進行させ、２０日後にグレード３以上の臨床スコアに達し、この段階で屠殺しなければならなかった。対照的に、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスは、１４日まで症状が進行せず、ＥＳ処置マウスは、１６日まで症状が進行しなかった（図２６）。さらに、これらのマウスの疾患の重症度は、かなり低下した。これらの所見は、ＥＳの非経口送達が、マウスの自己免疫疾患に対して防御効果を有することを明らかにする。
【０１８８】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与は、ＥＡＥ進行中の病原性Ｔ細胞の誘導を抑制する
Ｔ細胞は、多くの自己免疫疾患を媒介し、従来、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞が炎症性病原体に関与すると考えられてきた。しかし、最近の証拠では、ＩＬ−１７分泌性Ｔ細胞が、リウマチ様関節炎、大腸炎、多発性硬化症および多発性硬化症のマウスモデルであるＥＡＥを含めた多くの慢性炎症性疾患および自己免疫疾患において多くの損傷を媒介することを示唆する。本明細書において、ＥＡＥ進行は、未処理のマウスのＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導に関連した（図２７）。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与（これは、ＥＡＥの臨床症状を低下させた）は、ＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞の誘導を抑制した。さらに、ポリクローナル刺激、抗ＣＤ３およびＰＭＡに対するＩＬ−１７産生も、感染またはＥＳ処置マウスにおいて抑制された。対照に、ＭＯＧ特異的ＩＬ−１０は、未処置マウスにおいて検出できなかったが、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳ処置マウスにおいてかなりの濃度にて検出可能であった。さらに、ＭＯＧ特異的ＩＬ−４は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスにおいて強化された。さらに、抗ＣＤ−３およびＰＭＡ誘導性ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、感染およびＥＳ処置マウスにおいて強化された。これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳ治療が、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０を強化し、自己抗原特異的病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞を抑制することにより、ＥＡＥの誘導を予防することを明らかにする。
【０１８９】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減する
図２８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減することを示し、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａによるＥＡＥの軽減がＩＬ−１０誘導により媒介されないことを示唆する。
【０１９０】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムによりＥＡＥ中の病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害する
図２９は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、野生型マウスのＩＬ−１０産生を強化することを示す。データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染による病原性Ｔ細胞の阻害がＩＬ−１０により媒介されないことを示唆する。
【０１９１】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減する
図３０は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳにより誘導された大腸炎の臨床兆候（下痢および糞便血）を軽減することを示す。
【０１９２】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸における炎症促進性サイトカイン産生を抑制する
図３１は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−アルファの誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染後に低下することを示す。これらのサイトカインは、大腸炎の病態を媒介することを示し、データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａが炎症促進性サイトカインの産生を阻害することにより、ある程度の防御を付与することを示唆する。
【０１９３】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物を用いた治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減する
図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の非経口投与が、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳにより誘導された大腸炎の臨床兆候（下痢、血便および体重減少）を軽減することを示す。
【０１９４】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物を用いた治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎中の炎症促進性サイトカイン産生を抑制する
図３３は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の投与により低下することを示す。ＩＬ−１およびＩＬ−１７は、大腸炎の病態を媒介することを示し、データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物がこれらの炎症促進性サイトカインの産生を阻害することにより、ある程度の防御を付与することを示唆する。
【０１９５】
ＥＳは、共投与抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害する
図３４は、ｉｎ ｖｉｖｏで外来抗原とＥＳの共投与が、抗原特異的Ｔ細胞、特に、ＩＦＮ−ガンマ（Ｔｈ１細胞）またはＩＬ−１７（Ｔｈ１７細胞）を分泌するＴ細胞の誘導を抑制することを示す。
【０１９６】
要約
本発明者らは、マウスへのＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳの投与が高頻度のＩＬ−１０分泌性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を誘導し、ＥＳ産物が自己免疫疾患の阻害能を有することを発見した。本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスが、腹腔において、ＩＬ−４の非存在下で非常に高濃度のＩＬ−１０を分泌する非常に高頻度のＣＤ４＋Ｔ細胞を有することを明らかにした。感染により誘導されたこれらのＴｒｅｇ細胞は、共培養系または半透過膜により分離された場合における、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、これは可溶性因子介在性抑制を示した。さらに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来の樹状細胞（ＤＣ）は、高濃度のＩＬ−１０を分泌し、未感作マウス由来のＤＣに比べＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現は顕著に低いが、ＣＣＲ５は高く、未成熟状態を示した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞において抗原提示細胞として使用された場合、Ｆ−ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＤＣは、未感作マウス由来のＤＣと比較した場合、顕著に低いサイトカイン産生を誘導した。これらの所見は、ＤＣ活性化およびＴｒｅｇ細胞誘導を調節することにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａがＴ細胞反応を抑制することを示す。
【０１９７】
また、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳがＤＣ成熟を調節し、ｉｎ ｖｉｒｔｏでＩＬ−１０産生を強化することが思いがけなく示された。カテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤の添加が、ＥＳの調節効果を反転しなかった。さらに、マウスへのＥＳ注射は、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を予防した。ＴｈＩＬ１７と呼ばれるＩＬ−１７を分泌するＴ細胞は、ＥＡＥの病原体であり、本発明者らのデータは、ＥＳがＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−２３を阻害することにより、またはＴｈＩＬ−１７細胞の活性化もしくは機能を阻害することによるどちらかでＴｈＩＬ−１７細胞の誘導を抑制することを示唆する。所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画がカテプシンＬプロテイナーゼ以外の成分を含み、これは、自然免疫系の細胞と相互作用し、抗炎症性サイトカインの誘導を刺激し、Ｔｒｅｇ細胞の誘導を促進する表現型に樹状細胞を活性化する一方、ＴｈＩＬ−１７細胞を阻害し、それにより自己免疫疾患の進行を予防することを示唆する。
【０１９８】
本明細書において参照する全ての文書は、本明細書において参照として組み込まれる。本発明の記載の実施形態に対する種々の修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとっては明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関して記載しているが、それは、請求される本発明がこのような具体的な実施形態に過度に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際、当業者であれば明らかである本発明を実施する記載様式の種々の修正は、本発明により包含されることを意図する。本明細書において、いくつかの従来技術への参照は、この従来技術のいずれかの国における通常の一般的な知識の部分を形成するものとしての承認、またはいずれかの形態における示唆とみなされるものではなく、またそのようにみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１−１】図１は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が樹状細胞（ＤＣ）成熟を調節することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａを経口感染させた。感染３週間後、腹腔滲出細胞を洗浄により、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスから単離し、細胞蛍光分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）において、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体（Ａｂ）または種およびアイソタイプ適合対照抗体で染色した。図１は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ集団上にゲートした細胞を表す。
【図１−２】図１は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が樹状細胞（ＤＣ）成熟を調節することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａを経口感染させた。感染３週間後、腹腔滲出細胞を洗浄により、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスから単離し、細胞蛍光分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）において、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体（Ａｂ）または種およびアイソタイプ適合対照抗体で染色した。図１は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ集団上にゲートした細胞を表す。
【図２】図２は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−１０産生樹状細胞を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を惹起２１日後に未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスから腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ１１ｃ＋集団においてゲートした。図２は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ産生を示す。数字は、ゲートしたＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を表す。
【図３】図３は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導することを示す。未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を惹起２１日後に腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。数字は、ゲートした細胞の割合を表す。
【図４】図４は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａがＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞を誘導することを示す。未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞（Ａ）および腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）（Ｂ）を感染２１日後に単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、その後、ＦＯＸＰ３の細胞内染色のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図４は、惹起２１日後に、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＭＬＮおよびＰＥＣのＣＤ４＋Ｔ細胞上のＦＯＸＰ３およびＣＤ２５発現の代表例を示す。数字は、ゲートした細胞の割合を表す。
【図５−１】図５は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が制御性の表現型を有することを示す。Ｔ細胞を未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス（惹起２１日後）の腹腔から磁気分離によりＣＤ４＋細胞の正の選択を使用して単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、細胞蛍光分析のために、ＣＤ２５、ＣＣＲ５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０ＲおよびＴ１／ＳＴ２を染色した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図５は、Ｔ細胞上の細胞表面マーカー発現を示す。
【図５−２】図５は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が制御性の表現型を有することを示す。Ｔ細胞を未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス（惹起２１日後）の腹腔から磁気分離によりＣＤ４＋細胞の正の選択を使用して単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、細胞蛍光分析のために、ＣＤ２５、ＣＣＲ５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０ＲおよびＴ１／ＳＴ２を染色した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図５は、Ｔ細胞上の細胞表面マーカー発現を示す。
【図６−１】図６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が抑制能力を有することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）と合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を図６に示されたように合わせて培養した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図６−２】図６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が抑制能力を有することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）と合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を図６に示されたように合わせて培養した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図７−１】図７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞の抑制能力が可溶性因子により部分的に媒介されることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）ならびに脾臓ＡＰＣと合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）産物またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を半透過膜により分離した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図７−２】図７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞の抑制能力が可溶性因子により部分的に媒介されることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）ならびに脾臓ＡＰＣと合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）産物またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を半透過膜により分離した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図８−１】図８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、ＩＬ−１０およびＩＬ−５が誘導され、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＬ−４が誘導されることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）マウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、腹水を洗浄により回収した。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの存在を免疫アッセイにより分析した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図８−２】図８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、ＩＬ−１０およびＩＬ−５が誘導され、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＬ−４が誘導されることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）マウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、腹水を洗浄により回収した。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの存在を免疫アッセイにより分析した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図９−１】図９は、腸管膜リンパ節において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−５およびＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞を強化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、ｅｘ ｖｉｖｏの腸管膜リンパ節細胞を培地のみ、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡおよび抗ＣＤ３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。インキュベーション７２時間後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図９−２】図９は、腸管膜リンパ節において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−５およびＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞を強化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、ｅｘ ｖｉｖｏの腸管膜リンパ節細胞を培地のみ、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡおよび抗ＣＤ３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。インキュベーション７２時間後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１０−１】図１０は、ＥＳが自然細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）、腹膜由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｃ）および脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｄ）を１×１０６個／ｍｌにて、ＥＳ（４．０、２０．０μｇ／ｍｌ）または肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ；２０μｇ／ｍｌ）、培地のみあるいはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０濃度を２４時間後に評価した。図１０は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１０−２】図１０は、ＥＳが自然細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）、腹膜由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｃ）および脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｄ）を１×１０６個／ｍｌにて、ＥＳ（４．０、２０．０μｇ／ｍｌ）または肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ；２０μｇ／ｍｌ）、培地のみあるいはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０濃度を２４時間後に評価した。図１０は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１１】図１１は、ＥＳがマクロファージおよび樹状細胞由来のＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０産生を誘導することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（Ａ）および骨髄由来ＤＣ（Ｂ）（１×１０６個／ｍｌ）をＥＳ（４．０、２０．０および１００μｇ／ｍｌ）、培地のみまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０濃度を２４時間後に評価した。図１１は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１２】図１２は、ＢＭＤＣおよびＰＥＣ由来のＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生の動態を示す。骨髄由来ＤＣ（Ａ）またはｅｘ ｖｉｖｏのＰＥＣ（Ｂ）（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。上清を６、１２、２４または４８時間後に取り出し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−１０産生について評価した。図１２は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１３】図１３は、ＥＳがｉｎ ｖｉｖｏで皮下投与後に流入領域リンパ節においてＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を誘導することを示す。マウス４匹の群にＰＢＳ２００μｌまたはＥＳ（５０μｇ）のどちらかを皮下注射した。６時間後、鼠径リンパ節を取り出し、１ｍｌ氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ濃度についてＥＬＩＳＡ法により分析した。図１３は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１４】図１４は、ＥＳがｉｎ ｖｉｖｏでｉ．ｐ．投与後に腹腔の樹状細胞によりＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を誘導することを示す。マウス４匹の群にＰＢＳまたはＥＳ（５０μｇ）をｉ．ｐ．注射した。２時間後、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のための固定および透過処理を行なった。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析し、ＣＤ１１ｃ＋細胞集団においてゲートした。図１４は、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来のＰＥＣ ＤＣのサイトカイン産生を示す。数字は、ゲートしたＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を表す。
【図１５】図１５は、ＥＳがＪ７７４マクロファージのＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０を阻害することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後にＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１５は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１６】図１６は、ＥＳが樹状細胞のＬＰＳ−ＩＦＮ−ガンマ誘導性ＩＬ−１２ｐ７０産生を阻害することを示す。骨髄由来ＤＣを培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−ガンマ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（４．０または２０．０μｇ／ｍｌ）、またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後にＬＰＳおよびＩＦＮ−ガンマで２４時間刺激した。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１６は、３回の培養における平均（±ＳＥ）ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０濃度を示す。
【図１７】図１７は、ＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生が熱不活性化ＥＳにより無効になることを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を冷ＰＢＳの腹腔洗浄により未感作マウスから単離した。次いで、ＰＥＣ（１×１０６個／ｍｌ）を天然または熱不活性化ＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）、陰性および陽性対照として、それぞれ培地のみまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。上清のサイトカイン濃度を２４時間後に評価した。図１７は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１８】図１８は、ＥＳによるＩＬ−１０誘導がカテプシンにより媒介されないことを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を冷ＰＢＳの腹腔洗浄により未感作マウスから単離した。次いで、ＰＥＣ（１×１０６個／ｍｌ）をカテプシン阻害剤Ｅ−６４（１０ｍＭ）の存在下または非存在下においてＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）で刺激した。培地またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた刺激は、それぞれ陰性および陽性対照として機能した。上清のサイトカイン濃度を２４時間後に評価した。図１８は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１９】図１９は、Ｊ７７４マクロファージのＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０の阻害がカテプシンにより媒介されないことを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）が媒体のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳを用いてＥ−６４（１０ｍＭ）の存在下または非存在下において２４時間刺激した。インキュベーション後、上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１９は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図２０−１】図２０は、ＥＳがＤＣの成熟を誘導することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ１０−／−）マウス由来の骨髄由来ＤＣ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。インキュベーション２４時間後、細胞を細胞蛍光分析において、ｍＡｂｓ ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩまたは種およびアイソタイプ適合対照Ａｂｓで染色した。細胞をＣＤ１１ｃ＋（ＤＣ）集団上でゲートした。
【図２０−２】図２０は、ＥＳがＤＣの成熟を誘導することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ１０−／−）マウス由来の骨髄由来ＤＣ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。インキュベーション２４時間後、細胞を細胞蛍光分析において、ｍＡｂｓ ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩまたは種およびアイソタイプ適合対照Ａｂｓで染色した。細胞をＣＤ１１ｃ＋（ＤＣ）集団上でゲートした。
【図２１−１】図２１は、ＥＳがマクロファージ上のＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激性分子発現を強化することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２１−２】図２１は、ＥＳがマクロファージ上のＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激性分子発現を強化することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２２−１】図２２は、ＥＳがマクロファージ上のＬＰＳ誘導性ＣＤ４０発現を抑制することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２２−２】図２２は、ＥＳがマクロファージ上のＬＰＳ誘導性ＣＤ４０発現を抑制することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２３−１】図２３は、ＥＳが、共投与した抗原に対して抗原特異的ＩＬ−１０産生を強化することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ（２０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０産生について免疫アッセイにより調べた。図２３は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２３−２】図２３は、ＥＳが、共投与した抗原に対して抗原特異的ＩＬ−１０産生を強化することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ（２０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０産生について免疫アッセイにより調べた。図２３は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２４−１】図２４は、ＥＳが、共投与した抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ、ＥＳ（５０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０において免疫アッセイにより調べた。図２４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２４−２】図２４は、ＥＳが、共投与した抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ、ＥＳ（５０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０において免疫アッセイにより調べた。図２４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２５】図２５は、ＥＳがＣｏｎＡ誘導性増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地またはＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）のみあるいは、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）の存在下において２４時間刺激した。上清をインキュベーション７２時間後に取り出し、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ産生についてＥＬＩＳＡ法により評価した。増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより４８時間後に決定した。図２５は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度および増殖数を示す。
【図２６】図２６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、ＥＡＥの臨床症状を改善することを示す。０日目に完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。図２６は、平均臨床ＥＡＥスコアおよび疾患指数を示す。
【図２７−１】図２７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫化および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２７は、マウス４〜５匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２７−２】図２７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫化および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２７は、マウス４〜５匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２８】図２８は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。図２８は、平均臨床ＥＡＥスコアを示す。
【図２９−１】図２９は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＥＡＥにおける病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウス（ｋ／ｏ）においてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＥＡＥ誘導２０日後（ＩＬ−１０ｋ／ｏにおいて）または２３日後（ＷＴマウスにおいて）において、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２９は、マウス６匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２９−２】図２９は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＥＡＥにおける病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウス（ｋ／ｏ）においてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＥＡＥ誘導２０日後（ＩＬ−１０ｋ／ｏにおいて）または２３日後（ＷＴマウスにおいて）において、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２９は、マウス６匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図３０】図３０は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＤＳＳ投与５日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）の毎日の観察によりモニターした。図３０は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３１】図３１は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸の炎症促進性サイトカイン産生を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＤＳＳ投与５日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。マウスを１２日目に屠殺し、結腸を取り出し、タンパク質分解性酵素で１時間処理後、１または２４時間インキュベートした。組織上清のＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−アルファ濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図３２−１】図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）ならびにＣ）体重（０日目の重量の割合として表した）の毎日の観察によりモニターした。図３２は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３２−２】図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）ならびにＣ）体重（０日目の重量の割合として表した）の毎日の観察によりモニターした。図３２は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３３】図３３は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の炎症促進性サイトカイン産生を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳを受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。マウスを１２日目に屠殺し、結腸を取り出し、タンパク質分解性酵素で１時間処理後、１または２４時間インキュベートした。ＩＬ−１７、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図３３は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の投与により低下することを示す。
【図３４−１】図３４は、ＥＳが、共投与された抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。ＯＶＡ−ＴｇマウスをＰＢＳ、ＯＶＡ（２００μｇ）またはＯＶＡ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）を用いて側腹部に皮下免疫した。１４日後、マウスをＯＶＡまたはＯＶＡおよびＥＳのどちらかで二次免疫した。二次免疫７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＯＶＡ（２０および２００μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７およびＩＬ−５産生を免疫アッセイにより調べた。図３４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図３４−２】図３４は、ＥＳが、共投与された抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。ＯＶＡ−ＴｇマウスをＰＢＳ、ＯＶＡ（２００μｇ）またはＯＶＡ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）を用いて側腹部に皮下免疫した。１４日後、マウスをＯＶＡまたはＯＶＡおよびＥＳのどちらかで二次免疫した。二次免疫７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＯＶＡ（２０および２００μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７およびＩＬ−５産生を免疫アッセイにより調べた。図３４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、例えばＴｈ１またはＴｈＩＬ−１７介在性炎症状態、慢性炎症状態および自己免疫疾患等の、Ｔリンパ球細胞が病原性役割を有する疾患および／または状態を、予防または処置するために免疫反応を調節する新規の組成物および方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
自然免疫系の細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、未感作（ナイーブ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の、機能的に別個のＴｈ１、Ｔｈ２、ＴｈＩＬ−１７（Ｔｈ１７としても知られる）または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のサブタイプへの分化を方向付ける。保存微生物分子と病原体認識受容体（ＰＲＲ）、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインテグリンの結合を介した未成熟ＤＣの活性化は、ＤＣの成熟およびリンパ節へのホーミングを伴い、ここで、成熟ＤＣは、未感作Ｔ細胞に対して抗原（Ａｇ）を提示する。病原体由来分子による樹状細胞の活性化は、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の、別個のＴ細胞のサブタイプへの分化を制御する重要な役割を果たす。Ｔｈ１細胞は、細胞内感染に対して防御するが、さらに炎症反応および自己免疫疾患に関連し、一方、Ｔｈ２細胞は、アレルギー性反応に関与する。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴｈＩＬ−１７またはＴｈ１７）は、Ｔ細胞の病原性サブセットであり、これらは、自己免疫疾患に寄与する重要な炎症促進性サイトカインであるＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファおよび特に、ＩＬ−１７およびＩＬ−１７Ｆの産生を特徴とする。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７反応を抑制することができる。
【０００３】
免疫介在性状態
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患である。この疾患を有する個体は、自己反応性Ｔ細胞（自己抗原を認識するＴ細胞）を有し、これは、インターロイキン（ＩＬ）−１ベータおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファと合わせて、神経線維のミエリン鞘に沿った炎症性病変の形成に関与する。ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）は、活性化Ｔ細胞を含有し、これは、脳組織に浸潤し、特徴的な炎症性病変を引き起こし、ミエリンを破壊する。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの動物モデルである。これは、マウスまたはラットにおいて、完全フロインドアジュバントと、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）またはそのペプチドの注射により誘導される。この疾患はまた、ＩＬ−１７を分泌する（ＴｈＩＬ−１７細胞またはＴｈ１７細胞と呼ばれる）ＭＢＰまたはＭＯＧ特異的Ｔ細胞の移入によっても誘導することができる。動物は、中枢神経系のミエリン鞘の細胞浸潤を進行させ、脱髄およびついには麻痺を生じる。臨床兆候および病理学的変化は、ＭＳと似ている。
【０００４】
クローン病および潰瘍性大腸炎は、ヒトの炎症性腸疾患である。これらの自己免疫疾患は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介される腸の炎症状態である。
【０００５】
多くの自己免疫および慢性炎症性疾患は、満足できる処置がなく、多くの場合、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬を使用する。しかし、これらは、非特異的であり、副作用を有する。ごく最近、主要な炎症性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）を阻害する薬剤が開発されている。これらは、特定の自己免疫疾患に対して効果的な抗体または可溶性ＴＮＦ受容体を含むが、（再発性結核および癌を含めた）副作用と関連し、ＴＮＦ−アルファが病状の主要なメディエーターである疾患に限定される。別の治療的手法は、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の直接投与であるが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏのサイトカインの半減期が短いことにより効果が損なわれる。別の方法は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０を誘導する薬剤を使用し、これは、ｉｎ ｖｉｖｏで直接の免疫抑制効果を有する。サプレッサーまたは制御性Ｔ細胞の誘導を促進する分子は、炎症性Ｔｈ１介在性免疫反応を制限する可能性を有し、Ｔ細胞介在性自己免疫反応の炎症性反応を媒介する、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞（ＴｈＩＬ−１７）もまたそうである。
【０００６】
蠕虫感染
寄生蠕虫類の感染は、免疫抑制および低下したＴ細胞反応に関連する。マウスにおいて、肝吸虫であるＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、高濃度のサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０ならびにＩｇＧ１抗体を伴う、非常に分極されたＴｈ２反応を誘導する。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）反応および細菌病原体であるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する防御を抑制した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染はまた、Ｔｈ１反応および全細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンで誘導されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する防御を阻害した。
【０００７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分はまた、全細胞Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンにより誘導されたＴｈ１反応を抑制することが示されている。この抑制は、カテプシンＬプロテイナーゼの阻害剤により反転することが示され、これは、カテプシンＬプロテイナーゼが抑制効果の媒介に関与したことを示唆する。
【０００８】
さらに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ成分から精製されたカテプシンＬプロテイナーゼは、Ｐｗワクチンで誘導されたＴｈ１反応を抑制した。これらの試験はまた、免疫反応の抑制がＩＬ−４欠損マウスにおいて反転することが示されたことから、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａまたはカテプシンＬプロテイナーゼにより誘導された抑制が、ＩＬ−４により媒介されたことを明らかにした。
【０００９】
それゆえ、上記の試験の結論は、カテプシンＬプロテイナーゼが、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａおよびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ成分に関与し、これらの抑制効果を媒介し、かつこの抑制がＩＬ−４誘導を介して媒介されることであった。
【００１０】
自己免疫疾患、炎症状態または免疫介在性障害の発症および進行を、これらの状態の原因であるＴ細胞反応の調節を介して予防する方法は、これらの状態の予防および処置に非常に有利であるだろう。
【００１１】
本発明の発明者等は、驚くことに、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分が免疫反応の抑制を媒介するカテプシンＬプロテイナーゼ以外の化合物を含むことを同定した。カテプシンＬプロテイナーゼによる免疫反応の抑制がＩＬ−４サイトカイン産生により媒介されると考えられる一方、本発明者らは、ＥＳ成分が、免疫反応を調節するよう作用する多くの別のメカニズムを介した免疫抑制を媒介することを同定した。特に、本発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分が自然免疫系の細胞と相互作用し、樹状細胞をＴ制御性表現型へと活性化し（これは、ＩＬ−１０を産生する）、これがＴｈ１および／またはＴｈＩＬ−１７表現型を有するＴ細胞の産生から免疫応答を偏らせることによって、サイトカイン発現の調節、特にＩＬ−１０サイトカインレベルの上方制御を介して、免疫反応を調節することを同定した。
【００１２】
特に、本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分が抗炎症性サイトカイン、例えば免疫反応の強力な調節物質として作用することができるＩＬ−１０の産生を刺激することを同定した。
【００１３】
さらに、本発明者らはまた、驚くことに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を促進する表現型に樹状細胞を活性化することができることを示しており、続いて、これらのＴｒｅｇは、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７型反応の抑制を介して免疫反応を調節する。特に、このような樹状細胞は、未感作（ナイーブ）の樹状細胞の細胞表面マーカーの発現濃度に比べ、細胞表面マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの発現濃度が低い一方、ＣＣＲ５の発現濃度が高いことが観察されることが示された。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ｈ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６およびＴＮＦを含めたサイトカインプロフィールを分泌する。ＩＬ−１およびＩＬ−２３またはＩＬ−６およびＴＧＦ−ベータにより促進されるＩＬ−１７産生Ｔ（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７））細胞は、Ｔｈ１細胞とは別個の炎症性Ｔ細胞のサブタイプであり、多くの自己免疫疾患および慢性炎症状態の病原である。
【００１４】
これらの効果は、今までにカテプシンＬプロテイナーゼに関連して認められている免疫調節効果から独立している。本発明者らにより認められた免疫調節効果は、カテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤により抑制されず、ＩＬ−４依存性ではないことが重要である。理論に制約されることを望まないが、それゆえ、本発明者らは、ＥＳ成分により媒介される免疫調節効果が少なくとも部分的に、カテプシンＬプロテイナーゼ以外のＥＳ成分由来の成分または産物により媒介されると予測する。
【００１５】
免疫系の特定の細胞型により発現される反応およびサイトカインプロフィールの調節は、言い換えると、免疫反応全体のより広範囲の調節を導くことができる。本発明者らは、さらに驚くことに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画がＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７）細胞）およびＴｈ１細胞の誘導を、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−１２およびＩＬ−２３の阻害、またはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の活性化を阻害すること、あるいはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の機能を抑制することによるいずれかを介して阻害することを示した。
【００１６】
［発明の開示］
本発明の第１の態様において、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応の処置または予防のための組成物を提供し、この組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む。
【００１７】
組成物が、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分から単離されたタンパク質もしくはペプチドの分画、誘導体産物、突然変異体、断片または変異体を含む場合、次いで、前記分画または分子は、ＥＳ成分に関連して、本明細書において本発明者らにより同定されたものと同じ免疫調節活性、すなわち、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−１２およびＩＬ−２３の阻害、またはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の活性化を阻害すること、あるいはＴｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞の機能を抑制することによるいずれかを介して、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１７（ＴｈＩＬ−１７）細胞）およびＴｈ１細胞の産生および／または活性の抑制を示す。
【００１８】
適切には、ＥＳ成分から単離されたタンパク質は、カテプシンＬではない。
適切には、組成物により処置されたＴ細胞介在性炎症性免疫反応は、炎症促進性免疫反応である。典型的な炎症促進性免疫反応は、Ｔｈ１介在性免疫反応であり、この進行は、本発明の本態様の組成物投与後に抑制される。特に、この組成物は、Ｔｈ１細胞の誘導および機能を抑制または阻害する。適切には、Ｔｈ１細胞産生の上記抑制または阻害は、抗炎症性サイトカイン、特にＩＬ−１０の産生により引き起こされる。適切には、ＩＬ−１０産生は、ＥＳ成分またはその分画あるいは産物の投与により誘導される樹状細胞の成熟後に誘導される。上記抑制は、サイトカインＴＧＦ−ベータの産生または機能の強化によりさらに媒介されることができる。さらに、前記炎症促進性免疫反応の抑制は、ＥＳ成分またはＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）を刺激するその成分に起因し、細胞間接触により炎症促進性免疫反応の抑制を媒介することができる。
【００１９】
適切には、ＥＳ成分は、寄生虫Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａにより放出される排泄／分泌産物を含む。一実施形態において、ＥＳ成分は、単離形態または精製形態として提供されることができる。ＥＳ成分は、生組織由来のＥＳ成分の回収により得ることができる。
【００２０】
他の実施形態において、ＥＳ成分は、複数の分画に分画されることができ、上記得られた分画の少なくとも１つは、本発明の本態様の組成物として使用される。さらなる実施形態において、具体的な分子が、ＥＳ成分から単離または精製されることができる。さらなる実施形態において、具体的な分子を組換え手段により産生することができる。
【００２１】
一実施形態において、ＥＳ成分は、少なくとも１つのカテプシンＬプロテイナーゼ（ＦｈＣａｔＬ）タンパク質が欠乏している。
【００２２】
さらなる実施形態において、ＥＳ成分内に存在する場合に単離または同定された分画またはペプチドは、組換え手段により産生される。このような産物は、ＥＳ成分から同定された、２つ以上のペプチド成分を含有することができる。
【００２３】
本発明の第２の態様は、Ｔ細胞介在性炎症促進性状態の予防および／または処置のための医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分または分画あるいはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
【００２４】
Ｔ細胞介在性炎症促進性状態により、本発明者らは、天然において炎症促進性であり、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）により媒介される免疫反応を意味する。炎症促進性反応は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−ガンマ等の炎症促進性サイトカインにより促進されることができる。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、このような処置を必要とする被検体においてＴ細胞介在性免疫反応を調節する方法を提供し、この方法は、
このような処置を必要とする被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画または誘導体産物、そこから単離されたタンパク質またはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む。
【００２６】
適切には、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ成分または分画または誘導体産物、突然変異体、またはそこから得られた断片またはタンパク質が、
被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する。
【００２７】
適切には、Ｔ細胞介在性免疫反応は、Ｔ細胞介在性炎症促進性免疫反応である。
【００２８】
適切には、被検体は、自己免疫疾患の処置またはそれに対する防御を必要とする。
【００２９】
本発明の本態様の一実施形態において、Ｔ細胞介在性炎症促進性免疫反応が抑制される。理論に制約されることを望まないが、本発明の本態様の方法に従い、この抑制は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分を含む薬剤と免疫細胞とが接触するステップに起因する。
【００３０】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の増加に関連して使用される場合の「上方制御」という語句は、そのサイトカインの活性または発現が休止細胞に認められたものに比べ大きいことを意味する。
【００３１】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の低下に関連して使用される場合の「抑制」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められたものに比べ小さいことを意味する。
【００３２】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の阻害に関連して使用される場合の「阻害」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められた活性または発現濃度に比較した場合、阻害または実質的に阻害されていることを意味する。
【００３３】
適切には、ＥＳ成分の投与は、ＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の炎症促進性サイトカインの抑制およびＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等の抗炎症性サイトカインの上方制御を生じる。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分または誘導体産物あるいはそこから単離されたタンパク質またはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む有効量の薬剤が、少なくとも１つの免疫細胞型の少なくとも１つの細胞表面活性分子と連結、結合または会合することを提供し、これは、その細胞の１つまたは複数の機能的活性の抑制、阻害または下方制御を生じる。
【００３５】
本発明の一実施形態において、機能が調節される免疫細胞は、自然免疫系の少なくとも１つの細胞である。適切には、細胞は、抗原プロセッシングおよび提示機能を有する細胞型であり、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞またはマクロファージあるいはＢ細胞である。
【００３６】
ＡＰＣが樹状細胞である場合、それは、未成熟樹状細胞、半成熟樹状細胞であってよく、または成熟樹状細胞であってよい。
【００３７】
さらなる実施形態において、自然免疫系の細胞は、抗原提示細胞として機能しない細胞、例えば、肥満細胞である。肥満細胞は、ＩＬ−４等のサイトカインを分泌し、したがって、免疫反応を促進する役割を有することが知られている。しかし、これらは、関連する抗原プロセッシング機能を有さない。
【００３８】
一実施形態において、被検体は、哺乳動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３９】
理論に制約されることを望まないが、本発明の発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分の投与後に生じるＴ細胞反応の下方制御が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および特に、免疫反応を抑制するＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等のサイトカインプロフィールを発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を誘導する、樹状細胞（ＤＣ）の活性を調節することにより引き起こされると考える。
【００４０】
理論に制約されることを望まないが、本発明者らは、少なくとも１つの特異的なタンパク質分子が免疫機能調節に関与する排泄／分泌（ＥＳ）成分内に存在し、この少なくとも１つのタンパク質が、認められた免疫調節に関与すると考える。さらに、またはタンパク質の存在以外のものとして、脂質、リポペプチドまたはペプチド分子がＥＳ成分に存在し、下方制御に関与するかも知れない。
【００４１】
ＩＬ−１０発現の促進に加え、ＥＳ成分分画はまた、自然免疫系の細胞由来の他の抗炎症性サイトカインの発現を誘導することができる。
【００４２】
さらに、本発明者らは、樹状細胞の機能が、ＥＳ成分に暴露後に調節されることを同定したが、自然免疫系の他の細胞、例えばマクロファージの機能もまた、調節されることができ、この調節は、抗炎症性反応を促進する。
【００４３】
さらに、ＥＳ成分は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドをさらに含むことができる。しかし、本発明の本態様の他の実施形態において、ＴＬＲリガンド（作動薬）を本発明の組成物とともに外部から投与することができる。
【００４４】
したがって、一実施形態において、本方法は、前記組成物とともに少なくとも１つのＴＬＲ作動薬を投与するステップをさらに含むことができる。
【００４５】
ＴＬＲ作動薬は、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９の少なくとも１つに結合特異性を有することができる。適切なＴＬＲ作動薬の具体例は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。さらに、上記のＴＬＲ作動薬の適切な類似体もまた使用することができ、この場合、この類似体は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体を活性化するよう機能する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、自己免疫疾患の処置方法を提供し、
（ｉ）Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）ＥＳ成分または分画あるいはペプチドの治療的有効量を、自己免疫疾患を患う個体に投与するステップ
を含む。
【００４７】
適切には自己免疫疾患は、リウマチ様関節炎または多発性硬化症からなる群から選択される。さらなる自己疾患について、以降に詳述する。
【００４８】
適切にはＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質は、
混合リンパ球反応を阻害し、
細胞傷害性Ｔリンパ球反応を阻害し、
Ｔｈ１リンパ球を誘導し、
Ｔｈ１サイトカインプロフィールを誘導し、
ＩＬ−２産生を阻害し、
ＩＬ−１２産生を阻害し、
インターフェロンガンマ産生を阻害すること
の少なくとも１つからなる群から選択される免疫反応を抑制することができる。
【００４９】
さらに、ＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質は、
ＩＬ−１０産生を強化し、
ＴＧＦ−ベータ産生を強化し、
制御性Ｔ細胞の機能を強化し、かつ／または
Ｔｈ２サイトカインプロフィールを強化すること
により免疫反応の進行をさらに抑制することができる。
【００５０】
本明細書において定義される、サイトカイン産生の阻害に関連して使用される場合の「阻害」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められた活性または発現濃度に比較した場合、阻害または実質的に阻害されていることを意味する。
【００５１】
「ＥＳ成分タンパク質を投与する」という語句は、ＥＳ成分タンパク質の投与およびＥＳ成分タンパク質をコードする核酸配列の投与をともに含む。後者の場合において、ＥＳ成分タンパク質は、動物においてｉｎ ｖｉｖｏで産生される。
【００５２】
ＥＳ成分由来の分画またはペプチドを得るために、ＥＳ成分は、ゲル濾過クロマトグラフィー、例えばＳｅｐｈａｒｙｌ Ｓ−３０００により分離後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、続いてウェスタン法により分析することができる。
【００５３】
「有効量」により、それは、自己免疫疾患を患う患者に投与される場合、ＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の濃度が治療的に有益な効果を産生することを意味する。本発明のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量は、疾患状態、年齢、性別および被検動物の体重等の因子によって異なる。投与計画を調節し、至適治療反応を提供することができる。例えば、１日に用量を数回に分割して投与することができ、または用量を、緊急の治療状況である場合、比例的に減量することができる。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、レシピエント動物の移植された器官または組織に対する免疫寛容を誘導する方法を提供し、これは、器官または組織の移植前にレシピエント動物に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を投与することを含む。
【００５５】
本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用し、移植された器官または組織に対する免疫寛容を誘導することを含む。
【００５６】
「免疫寛容を誘導する」という語句は、長期の全身免疫欠損を誘導することなく、免疫系に特定抗原への非反応性を付与することを意味する。「抗原」という語句は、免疫反応を誘導することができる物質を意味する。自己免疫疾患の場合において、免疫寛容は、免疫系に、宿主が異物として認識しており、それゆえ、自己免疫反応を引き起こす自己抗原への非反応性を付与することを意味する。アレルギーの場合において、免疫寛容は、免疫系に、通常、宿主の免疫反応を引き起こすアレルギー抗原に、非反応性を付与することを意味する。移植の場合において、免疫寛容は、免疫系に、移植片上の抗原への非反応性を付与することを意味する。アロ抗原は、種のいくつかのメンバーにのみ見つけられる抗原、例えば、血液型抗原を指す。異種抗原は、ある種のメンバーに存在するが他のメンバーには存在しない抗原を指す。これに対応して、同種移植片は、同種のメンバー間の移植片であり、異種移植片は、異種のメンバー間の移植片である。
【００５７】
レシピエントは、げっ歯類、ブタ、ネコ、イヌ、反芻動物、非ヒト霊長類および好ましくはヒトを含めた動物界のいずれのメンバーであってもよい。移植される器官または組織は、レシピエントと同種由来（同種移植片）であってよく、または別種由来（異種移植片）であってよい。組織または器官は、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、膵島、脳組織、角膜、骨、腸、皮膚および造血細胞を含めたいずれの組織または器官であってもよい。
【００５８】
本発明の方法を使用して、移植片対宿主病を予防することができ、この場合、移植片の免疫細胞は、レシピエントの免疫系において免疫攻撃を開始する。これは、移植された組織が免疫細胞を含有する場合、例えば、骨髄またはリンパ組織を、例えば、白血病、再生不良性貧血および酵素もしくは免疫疾患を処置する場合に移植する場合に生じうる。
【００５９】
したがって、別の実施形態において、本発明は、器官または組織移植片を受け入れるレシピエント動物の移植片対宿主病を予防または阻害する方法を提供し、レシピエント動物に移植する前に、器官または組織に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を投与することを含む。
【００６０】
本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用して移植片対宿主病を予防または阻害することを含む。
【００６１】
本発明の方法を使用して、アレルギー性反応を処置または予防することもできる。アレルギー性反応において、免疫系は、通常無害、無毒な抗原またはアレルゲンに対する攻撃を開始する。本発明の方法を使用して予防または処置することができるアレルギーは、花粉症、喘息、アトピー性湿疹、およびウルシおよびツタ（ｉｖｙ）、イエダニ、ハチ花粉、ナッツ、貝、ペニシリンおよびその他多くのものに対するアレルギーを含むがそれだけに限定されない。
【００６２】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、アレルギーを予防または処置する方法を提供し、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を、アレルギーを有するまたは有する疑いのある動物に投与することを含む。本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画あるいはそこから単離されたタンパク質の有効量を使用して、アレルギーを予防または処置することを含む。
【００６３】
別の態様において、本発明は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染を患う宿主において媒介される免疫抑制を予防する方法を提供し、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ成分またはその分画の有効量をその必要とする動物に投与することを含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、免疫反応の下方制御により有利となる疾患または状態の処置および／または予防の方法に関し、この方法は、
このような処置を必要する被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画、またはそこから単離されたタンパク質またはペプチドの誘導体、突然変異体、分画、断片もしくは変異体を含む薬剤の治療的有効量を投与するステップを含む。
【００６５】
適切には、免疫反応は、炎症性免疫反応、例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈＩＬ−１７細胞により媒介される免疫反応である。
【００６６】
被検体は、哺乳動物、特にヒトであってよい。適切には、被検体は、免疫介在性状態、例えば、アレルギーまたは自己免疫障害である状態を有する。一実施形態において、状態は、自己免疫疾患、特に、Ｔｈ１介在性および／またはＴｈＩＬ−１７介在性自己免疫疾患である。
【００６７】
具体的な実施形態において、免疫介在性疾患は、自己免疫状態および多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、乾癬、紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性貧血、血小板減少症、喘息またはアトピー性疾患を含むがそれだけに限定されない疾患を含むがそれだけに限定されない。
【００６８】
「免疫介在性疾患」の定義もまた、他の免疫介在性障害、例えば１つまたは複数の皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎、円形脱毛症、節足動物の刺咬傷反応によるアレルギー反応、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応（ｌｅｐｒｏｓｙ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、後ブドウ膜炎、間質性肺線維症およびセリアック病を含む。
【００６９】
さらなる実施形態において、疾患または状態は、具体的なサイトカインプロフィールの発現が疾患の発症または進行に寄与することが示された神経変性状態を含むことができる。このような状態および疾患は、アルツハイマー疾患（ＡＤ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ＣＪＤ等のプリオン病、ＡＩＤＳ関連性認知症、脳炎、脳卒中および頭部外傷を含むことができる。
神経変性状態はまた、細菌およびウィルス感染の結果として生じる脳の急性炎症状態を含むことができる。
【００７０】
上記の自己免疫状態に加えて、本発明は、望ましくないまたは不必要な免疫反応が抗原の提示により誘発されるいずれの免疫介在性障害にも及ぶことができる。
【００７１】
したがって、本発明のなお追加の態様は、被検体の異常な、不必要なまたは不適切な免疫介在性反応を特徴とする状態の予防および／または治療目的の処置の方法を提供し、この方法は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む有効量の薬剤を被検体に投与することを含み、これらの薬剤は、上記細胞型の免疫活性を十分に抑制、阻害または下方制御する時間および状態下において、自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型に連結し、結合しまたは会合する。
【００７２】
典型的な自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型は、樹状細胞（ＤＣ）または濾胞性ＤＣ、マクロファージあるいはＢ細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。別法として、自然免疫系に属する少なくとも１つの細胞型は、肥満細胞等の具体的な抗原提示細胞機能を呈しない少なくとも１つの細胞であってよい。
【００７３】
ＡＰＣが樹状細胞である場合、それは、未成熟、半成熟または成熟樹状細胞であってよい。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその断片、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の免疫介在性疾患の処置への使用を提供する。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその断片、誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の免疫介在性疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００７６】
本発明のなお追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物もしくは突然変異体、断片もしくは変異体の自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００７７】
一実施形態において、ＥＳ成分は、カテプシンＬプロテイナーゼを欠乏する。
【００７８】
さらなる実施形態において、組成物は、さらにカテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤を含む。
【００７９】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の炎症状態の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８０】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の神経変性疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８１】
本発明のさらに追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の心臓病または心疾患の処置のための医薬品の調製における使用を提供する。
【００８２】
樹状細胞調節
本発明者らは、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分を使用して、サイトカイン発現プロフィールおよび樹状細胞の成熟状態を調節することができることをさらに同定した。
【００８３】
樹状細胞は、免疫反応の主要な調節因子である。これらが発現するサイトカインプロフィールは、免疫反応の進行において重要な影響を有する。特に、樹状細胞により発現されるサイトカインは、Ｔｈ１またはＴｈ２経路の下流に偏らせる場合またはＴｈＩＬ−１７またはサプレッサー活性を持つＴ細胞の産生を誘導する場合に重要となりうる。
【００８４】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から単離された樹状細胞は、高濃度のＩＬ−１０を分泌し、未感作マウス由来の樹状細胞に比べ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現は顕著に低いが、高濃度のＣＣＲ５を有した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａは、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータ等の樹状細胞産生のサイトカインを誘導することにより、Ｔ細胞反応を抑制することを示し、これは、サプレッサーＴ細胞活性を誘導する。
【００８５】
したがって、本発明のさらなる態様は、このような処置を必要とする被検体の免疫介在性疾患の処置に適切な免疫反応を抑制する方法を提供し、この方法は、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ−ｖｉｖｏで暴露し、
樹状細胞を被検体に投与する、
ステップを含み、これにより、続いて被検体内の樹状細胞により誘導された免疫反応は、免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する。
【００８６】
一実施形態において、樹状細胞を活性化して、高濃度のサイトカインＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータ等の他の抗炎症性サイトカインあるいはＴｒｅｇの誘導を促進する他のサイトカインを発現する。
【００８７】
本発明の本態様の一実施形態において、樹状細胞は、被検体に対して自家性である。
【００８８】
一実施形態において、樹状細胞は、未成熟樹状細胞である。
別法として、樹状細胞は、成熟樹状細胞である。
【００８９】
さらなる実施形態において、樹状細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドとともに投与することができ、この例は、Ｐａｍ３Ｃｙｓである。
【００９０】
さらに、自己抗原を、場合により、樹状細胞とともに共投与することができる。自己抗原の例は、ＭＯＧまたはミエリン塩基性タンパク質である。
【００９１】
本発明のなお追加の態様は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分の自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製における樹状細胞の処置への使用を提供する。
【００９２】
ＩＬ−１７活性の阻害
本発明者らは、さらに驚くことに、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分がＩＬ−１７（いわゆるＴｈＩＬ−１７細胞）を発現するＴ細胞の誘導を抑制することを示した。ＩＬ−１７は、自己免疫疾患および慢性炎症状態、特に多発性硬化症、大腸炎およびリウマチ様関節炎の発症および進行の主要な調節因子として同定されている。したがって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤によるＩＬ−１７濃度の調節は、自己免疫疾患および慢性炎症状態の予防および／または処置に適用可能な新規の治療を提供する。
【００９３】
本発明のなお追加の態様において、免疫介在性状態の予防および／または処置の方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップ
を含み、この場合、薬剤投与がＩＬ−１７を分泌するＴ細胞の産生を抑制または阻害するよう作用する。
【００９４】
本発明のさらに追加の態様において、免疫介在性状態の予防および／または処置の方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップ
を含み、この場合、薬剤投与がＩＬ−２３の産生を抑制または阻害するよう作用する。
【００９５】
典型的には、ＩＬ−２３の阻害は、ＩＬ−１７の産生の阻害をさらに生じるだろう。
【００９６】
本発明のさらに追加の態様は、免疫介在性疾患の処置のためのＩＬ−１７産生を阻害する医薬品の調製において、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分、そこから単離されたタンパク質の誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体の使用を提供する。
【００９７】
ＩＬ−１２抑制
本発明者らは、ＥＳ投与の結果として、ＩＬ−１２の産生が抑制されることをさらに同定した。ＩＬ−１２は、免疫反応の促進を促す役割を有し、特に、これらは、Ｔｈ１およびＴｈＩＬ−１７細胞により媒介される。この抑制は、ＩＬ−１２サイトカインファミリー、例えばＩＬ−２３およびＩＬ−２７のメンバーにまでさらに及ぶことができる。
【００９８】
したがって、本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１２産生の抑制またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制のための組成物を提供し、この組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【００９９】
さらに追加の態様は、ＩＬ−１２産生の抑制またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制において使用する医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。本発明のなお追加の態様は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生を抑制する方法を提供し、この方法は、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップ
を含む。
【０１００】
一実施形態において、ＩＬ−１２ファミリーメンバーは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−２７である。
【０１０１】
肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の投与に加え、組成物、上記組成物の使用および本発明の方法はまた、ＥＳ成分の代わりに肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）の使用を介して実現することができる。
【０１０２】
本発明者らは、驚くことに、ＬＦＨの投与が免疫介在性炎症状態において重要となる特定のサイトカインの発現を調節することができることを同定した。例えば、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは分画もしくは誘導体産物、またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体は、サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０の発現レベルを調節することができる。
【０１０３】
したがって、本発明のさらなる態様は、炎症状態の予防および／または処置のための組成物を提供し、この組成物は、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【０１０４】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０５】
本発明のなお追加の態様は、炎症状態の予防および／または処置のための医薬組成物を提供し、この場合、組成物は、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む。
【０１０６】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０７】
本発明のなお追加の態様は、炎症状態を調節する方法を提供し、この方法は、
このような処置を必要とする被検体に肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を被検体に投与するステップ
を含む。
【０１０８】
一実施形態において、炎症状態は、Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応である。
【０１０９】
一実施形態において、炎症状態は、免疫介在性状態であり、例えば、アレルギーまたは自己免疫障害である。さらなる実施形態において、状態は、自己免疫疾患、特にＴｈ１介在性および／またはＴｈＩＬ−１７介在性自己免疫疾患である。具体的な実施形態において、免疫介在性疾患は、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、乾癬、紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性貧血、血小板減少症、喘息またはアトピー性疾患を含むことができるがそれだけに限定されない。
【０１１０】
免疫介在性状態、例えば、上記のものの調節においてＬＦＨの新規および思いがけない使用を同定するのに加え、本発明者らはまた、驚くことに、ＬＦＨがＩＬ−４レベルを調節する場合、特に有効であることを同定した。
【０１１１】
本発明のさらに追加の態様において、認知機能障害の予防および／または処置のための方法を提供し、この方法は、このような治療を必要とする個体に、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含む。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は、認知機能障害の処置において、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の使用にまで及ぶ。
【０１１３】
さらに追加の態様は、認知機能障害の処置のための医薬品の調製において、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１４】
好ましい実施形態において、ＬＦＨの投与は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４の上方制御および炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１の下方制御を生じる。好ましくは、上方制御は、海馬においてであり、最も好ましくは、この抗炎症性サイトカインプロフィールの上方制御は、ミクログリア細胞に存在するだろう。ＬＦＨまたはＥＳを、脳または直接に中枢神経系（ＣＮＳ）の別の領域に投与することが好ましい。
【０１１５】
典型的に、上方制御される抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータである。下方制御される炎症促進性サイトカインは、典型的にＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファである。炎症促進性および抗炎症性サイトカインレベルの調節は、海馬において好ましく、サイトカインプロフィールのこの調節は、ミクログリア細胞において最も好ましい。
【０１１６】
本発明のなお追加の態様は、脳またはＣＮＳへの肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の直接投与を介した認知機能障害の処置方法を提供する。
【０１１７】
さらに追加の態様は、認知機能障害の処置のための、脳またはＣＮＳに直接投与する医薬品の調製における、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１８】
さらに追加の態様は、免疫介在性状態の処置のための医薬品の調製における、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用に関する。
【０１１９】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬
本発明者らは、驚くことに、ＴＬＲ作動薬がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分に存在することを同定した。このＴＬＲ作動薬は、免疫反応の誘導においてアジュバントとして非常に有用でありうる。
【０１２０】
ＴＬＲ作動薬は、例えば、治療薬、例えば、癌または悪性状態の処置のためのワクチンとともにまたは感染性疾患に対するワクチンとともに投与することもできる。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、樹状細胞の成熟を誘導する方法において、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分内で同定されたＴＬＲ作動薬の使用にまで及ぶ。
【０１２２】
本発明のなお追加の態様において、癌または感染性疾患の処置に適切な被検体においてＴｈ１反応を誘導する方法を提供し、この方法は、
エフェクター細胞機能を促進する表現型に樹状細胞を成熟させるために、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分から単離されたワクチンおよびＴＬＲ作動薬の存在下において、単離された樹状細胞を疾患特異的抗原にｅｘ−ｖｉｖｏで暴露するステップと、
樹状細胞を被検体に投与するステップ
を含み、それにより被検体に産生された免疫反応が、癌の発症または進行を十分に予防し、または病原性微生物感染を十分に予防し、それにより感染性疾患を予防する。
【０１２３】
定義
本明細書において使用される、「免疫細胞」という語句は、造血系に由来する細胞を含み、免疫反応の役割を果たす。免疫細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球を含む。
【０１２４】
本明細書において使用される、「Ｔ細胞」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。「Ｔ細胞」という語句はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞ならびにさらにＴｈ−ＩＬ１７細胞を含む。
【０１２５】
本明細書において使用される、「１つまたは複数の抗原提示細胞」またはその省略形「１つまたは複数のＡＰＣ」は、抗原のエンドサイトーシス吸着、プロセッシングおよび提示することができる１つまたは複数の細胞を指す。この語句は、専門の抗原提示細胞、例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞ならびにケラチノサイト、内皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞および乏突起膠細胞等の他の抗原提示細胞を含む。「抗原提示」という語句は、細胞表面上においてＭＨＣ分子に結合されたペプチド断片としての抗原の表示を意味する。多くの様々な種類の細胞、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、濾胞性樹状細胞および樹状細胞を含めた細胞が、ＡＰＣとして機能することができる。
【０１２６】
本明細書において使用される、「免疫反応」という語句は、Ｔ細胞共刺激の調節により影響されるＴ細胞介在性および／またはＢ細胞介在性免疫反応を含む。免疫反応という語句は、Ｔ細胞活性化により間接的になされる抗体産生（液性反応）およびマクロファージ等のサイトカイン反応性細胞の活性化等の免疫反応をさらに含む。
【０１２７】
本明細書において使用される、「１つまたは複数の樹状細胞」（ＤＣ）という語句は、その最も広義の内容の、１つまたは複数の樹状細胞を指し、抗原提示することができるあらゆるＤＣを含む。この語句は、免疫反応を開始し、かつ／またはＴリンパ球に抗原を提示し、かつ／または免疫反応の刺激に必要な他のあらゆる活性化信号を有するＴ細胞を提供する全てのＤＣを含む。本明細書において、「ＤＣ」への言及は、樹状細胞の形態、表現型または機能活性を呈する細胞およびその突然変異体または変異体への言及を含めるものとして読むものとする。樹状細胞の形態学的特徴は、長い細胞質突起または多数の微細樹状突起を有する大細胞を含むことができるがそれだけに限定されない。表現型の特徴は、１つまたは複数のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ１またはＣＤ４の発現を含むことができるがそれだけに限定されない。
【０１２８】
本明細書において使用される、「抗原」という語句は、免疫反応を刺激することができるあらゆる有機または無機分子である。本明細書において使用される、「抗原」という語句は、免疫反応を刺激することができる、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸分子、炭水化物分子、有機または無機分子に限定されないあらゆる分子にまで及ぶ。
【０１２９】
本発明に関して「被検体」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよびロバ）、実験用試験動物、例えばマウス、ウサギ、ラットおよびモルモットならびにペット動物、例えばイヌおよびネコ等の哺乳動物を含み、包含する。本発明の目的において、哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【０１３０】
処置
本明細書において使用される「処置」という語句は、ヒトまたは非ヒト動物に有利となることができるあらゆる療法を指す。処置は、存在する状態に関してであってよく、または予防（予防的処置）であってよい。処置は、治癒、緩和または予防的効果を含むことができる。
【０１３１】
より具体的には、本明細書において「治療的」および「予防的」処置の言及は、その最も広義の内容において考慮される。「治療的」という語句は、被検体が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、被検体が最終的に疾患状態にかからないことを必ずしも意味しない。
【０１３２】
したがって、治療的および予防的処置は、特定の状態の症状の改善または特定の状態を進行する危険を予防あるいは低下させることを含む。「予防的」という語句は、特定の状態の重症度または発症を低下させるものとして見なすことができる。「治療的」はまた、存在する状態の重症度を低下させることができる。
【０１３３】
投与
本発明において使用するＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体は、単一で投与することができるが、医薬組成物として投与することが好ましく、これは、一般に、意図される投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を含むだろう。
【０１３４】
本発明において使用するＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を、あらゆる適切な経路を介して、処置を必要とする患者に投与することができる。正確な用量は、投与されるＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の形態の正確な性質を含めた多くの因子に応じて決定されるだろう。
【０１３５】
好ましい投与経路は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内を含む）であるが、いくつかのさらに適切な投与経路は、経口、経直腸、経鼻、局所（経頬および舌下を含む）、注入、経膣、皮内、腹腔内、頭蓋内、鞘内および硬膜外投与あるいは経口または鼻吸入を介した投与、例えば、ネブライザーまたは吸入器により、あるいは移植を含む（がそれだけに限定されない）。
【０１３６】
静脈内注射において、有効成分は、発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であるだろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液または乳酸加リンゲル注射液などの等張性ベヒクルを使用して適切な溶液を十分に調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要な場合含むことができる。
【０１３７】
経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態であってよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含むことができる。一般に、液体医薬組成物は、水、石油、動物または植物油、鉱油あるいは合成油等の液体担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールを含むことができる。
【０１３８】
また、組成物を、ミクロスフィア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含めた特定の組織に入れる徐放性製剤を介して投与することができる。徐放性担体の適切な例として、シェア製品（ｓｈａｒｅｄ ａｒｔｉｃｌｅｓ）の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、座剤またはマイクロカプセルがある。移植可能またはマイクロカプセル状の徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；欧州特許出願第００５８４８１（Ａ）号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１）：５４７−５５６，１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２）を含む。
【０１３９】
上記の技法およびプロトコールならびに本発明において使用することができる他の技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５，２０００）ＩＳＢＮ ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ ０−６８３３０５−７２−７に見つけることができ、これらの開示全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１４０】
医薬組成物
上記のように、本発明は、免疫反応の調節、特に、Ｔ細胞反応の下方制御のための医薬組成物にまで及び、この場合、組成物は、少なくともＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体あるいはその組換え形態の誘導体、断片、変異体、突然変異体を含む。
【０１４１】
本発明における医薬組成物および本発明に従う使用は、有効成分（すなわち、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体）に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に公知の他の材料を含むことができる。
【０１４２】
このような材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の効果と干渉しないものであるべきである。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて決定し、これは、例えば、経口、静脈内、鼻内または経口もしくは鼻吸入を介してであってよい。
【０１４３】
製剤は、液体、例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理食塩溶液または凍結乾燥もしくは冷凍乾燥粉末であってよい。
【０１４４】
用量
組成物は、治療的「有効量」または「所望量」において個体に投与することが好ましく、これは、個体に十分に役立つことを示す。
【０１４５】
本明細書において定義されるように、「有効量」という語句は、所望の反応を少なくとも部分的に得るために、または発症を遅延もしくは進行を阻害し、あるいは処置された特定の状態の発症または進行を完全に停止するために必要な量を意味する。
【０１４６】
量は、処置される被検体の健康および身体的状態、処置される被検体の分類群、所望される防御の程度、組成物の配合、医学的状況および他の関連因子の評価に応じて変化する。量は、相対的に広範囲であり、これは、所定の試験を介して決定することができることが期待される。
【０１４７】
処置の処方、例えば、用量等の判断は、最終的には一般開業医、内科医または他科の医師の責任の範囲および判断であり、典型的に、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および実施者の公知の他の因子を考慮する。
【０１４８】
至適用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置される状態の重症度、投与される有効成分および投与経路を含めた多くのパラメーターに基づいて医師により決定されることができる。
【０１４９】
広範囲の用量を適用することができる。患者を考慮して、例えば、薬剤約０．１ｍｇ〜約１ｍｇを１日当たり体重ｋｇ当たりで投与することができる。至適治療反応を得るために投与方法を調節することができる。例えば、１日毎、週毎、月毎または他の適切な時間間隔で数回に分割して投与することができ、または用量を、緊急の状況である場合、比例的に減量することができる。
【０１５０】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は全て、本発明の分野の当業者により通常、理解される意味を有する。
【０１５１】
本明細書を通して、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」という語句または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（三人称）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（進行形）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（三人称）」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（進行形）」等の変形は、明記された整数または整数群の包括を意味するが、いくつかの他の整数もしくは整数群を排除しないことが理解されるだろう。
【０１５２】
本明細書において使用される、Ｔ細胞反応の調節に関連して使用される場合の「阻害する」という語句は、Ｔ細胞の増殖および／または活性の部分的または完全な下方制御を意味する。
【０１５３】
本発明の各態様の好ましい特徴および実施形態は、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、他の態様のそれぞれに関して必要であれば変更を加える。
【０１５４】
本発明は、ここで、説明の目的において提供され、本発明を限定するように解釈されることを意図しない以下の実施例を参照し、さらに図を参照して記載される。
【実施例】
【０１５５】
材料および方法
動物および免疫化
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ Ｏｌａｃ（ビセスター、英国）から購入し、６〜８週齢、１群マウス４匹にて使用した。マウスを個別換気ケージで飼育し、全ての実験は、アイルランド保健局（Ｉｒｉｓｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、欧州連合およびＴｒｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎの倫理委員会の規則に従い行われた。マウスを脱発熱化したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（５μｇ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラホーヤ、カリフォルニア州）；ＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０または５０μｇ；またはダルベッコのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、プール、英国）で最終的に２００μｌを側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。免疫７日後に、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、血清および鼠径リンパ節を採集した。
【０１５６】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄−分泌産物の調製
生きた成熟吸虫を地域の食肉処理場にてウシ肝臓から採集した。吸虫をＣａ２＋非含有およびＭｇ２＋非含有ダルベッコＰＢＳを数回交換して洗浄後、空気中５％ＣＯ２、３７℃にてＰＢＳで一晩インキュベートした。排泄−分泌（ＥＳ）産物を含有する上清液を採取し、４℃、１３０００ｇにて１５分間遠心分離により浄化し、０．２２μｍフィルターに通した。ＥＳ調製物のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。抗原調製物を必要な時まで−８０℃で保存した。
【０１５７】
マウスのＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ注射
メタセルカリア（ｍｅｔａｃｅｒｃａｒｉａｅ）をＣｏｍｐｔｏｎ Ｐａｄｄｏｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バークシャー、英国）から得た。実態顕微鏡を使用して、生存能力を検討し、その後、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個をマウスに経口感染させた。これは、動物１００％に感染する結果となった。他に明記されない限り、マウスを感染３週間後に頸椎脱臼により屠殺した。
【０１５８】
骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の単離および培養
骨髄由来未成熟ＤＣを、マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ発現性細胞株（Ｊ５５８−ＧＭ−ＣＳＦ）由来の上清（１０％）を補充した１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０において培養することにより調製した。３日目に、１０％ＧＭ−ＣＳＦ細胞上清を含む新鮮な培地を付着細胞に添加した。７日目に、細胞を採集し、洗浄し、アッセイに使用した。ＢＭＤＣを細胞１×１０６個／ｍｌにて培養した。
【０１５９】
腹腔マクロファージ、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の精製
腹腔マクロファージの単離において、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）をマウスから洗浄により採取した。ＰＥＣを６ウェル組織培養プレートにおいて２時間インキュベートし、マクロファージを可塑的に付着させた。付着しなかった細胞を洗浄により除去し、付着マクロファージを、刺激するためにプレートから採取した。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ１１ｃ＋樹状細胞をＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、独国）およびａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離装置を用いた正の選択を使用して脾臓およびＰＥＣから単離した。赤血球細胞の溶解後、ＰＥＣまたは脾臓細胞のどちらかの単一細胞懸濁液をＭＡＣＳ ＣＤ４またはＣＤ１１ｃ免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のどちらかとともにインキュベートし、正の選択を使用してａｕｔｏＭＡＣＳに通した。ａｕｔｏＭＡＣＳ分離後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の純度をＦＩＴＣ標識ＣＤ４またはＣＤ１１ｃそれぞれを使用して、ＦＡＣＳｃａｎ分析により評価した場合、通常９０〜９５％であった。
【０１６０】
Ｊ７７４細胞培養
Ｊ７７４．Ａ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ６７）を組織培養フラスコにおいて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて空気中５％ＣＯ２、３７℃にて成長させた。細胞がコンフルエンスに達した場合、それらを培養物から取り出し、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、１×１０６個／ｍｌ濃度にて新鮮なフラスコに再播種した。細胞が実験に十分な数に達した場合、次いで、細胞を激しくピペッティングすることより採集し、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞を１０％ＲＰＭＩで１回洗浄後、刺激するために１ｍｌ／ウェルの容量で１×１０６個／ｍｌにて２４ウェル培養プレートに播種した。
【０１６１】
サイトカイン産生の誘導または阻害
Ｊ７７４および腹腔マクロファージ、骨髄由来ＤＣ、ＭＡＣＳ単離ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよび腹腔滲出細胞を１×１０６個／ｍｌの細胞密度にて２４ウェル組織培養プレートで培養した。いくつかの実験において、腹腔滲出細胞およびＪ７７４マクロファージは、１０ｍＭ濃度のカテプシン阻害剤Ｅ−６４（Ｓｉｇｍａ）の存在下のＥＳまたは１００℃で２０分間加熱した熱不活性化ＥＳで刺激した。空気中５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間インキュベーション後、上清を取り出し、市販の免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０濃度の分析まで、またはＩＬ−４およびＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＧＦ−ベータ用モノクローナル抗体の対（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する分析まで保存した。ＩＬ−１２産生におけるＥＳ効果を、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）を用いてＢＭＤＣまたはＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を２時間前刺激し、その後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−ガンマ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳのみを添加し、さらに２２時間インキュベーションして決定した。上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０および／またはＩＬ−１２ｐ７０の濃度を免疫アッセイにより決定した。ＣｏｎＡ誘導性サイトカインの産生および増殖におけるＥＳの効果は、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下においてＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）を用いて未感作マウス由来の脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を刺激することにより決定した。上清を空気中５％ＣＯ２、３７℃にて７２時間インキュベーション後に取り出し、Ｔ細胞サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。Ｔ細胞の増殖は、４８時間培養の最後の４時間における［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定した。ｉｎ ｖｉｖｏのＥＳによるサイトカイン誘導を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５０μｇのＥＳを合計２００μｌ／マウスｓ．ｃ．の容積で注射した。６時間後、鼠径リンパ節を取り出し、氷冷ＰＢＳ １ｍｌでホモジナイズした。４℃にて、１２００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を除去後、上清を取り出し、市販のサイトカインＤｕｏＳｅｔｓ（Ｒ＆Ｄ）を使用して、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の存在について分析した。別の実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹の群にＰＢＳまたはＥＳ（５０μｇ）のどちらかを３００μｌ注射した。２時間後、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を氷冷ＰＢＳの腹腔洗浄により採取した。細胞を５０％ＰＢＳ／ＦＣＳ（ｖ／ｖ）でブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、固定し、ＰＥ標識化抗ＩＬ−１０ならびにＦＩＴＣ標識化抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマモノクローナル抗体またはラット対照Ｉｇを添加することにより透過させ、細胞内サイトカイン標識した。氷上に３０分後、次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄し、速やかに回収した。試料当たり合計２００００個の細胞を得た。細胞をＣＤ１１ｃ＋集団上にゲートし、細胞内タンパク質の発現を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【０１６２】
抑制アッセイ
ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＡＣＳマイクロビーズおよびＡｕｔｏＭａｃｓ ｓｙｓｔｅｍ（上記）を使用して、ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニック（ＴＣＲ−Ｔｇ）マウスから精製した。ＯＶＡ−特異的Ｔ細胞（１×１０５個／ｍｌ）をＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（２μｇ／ｍｌ）、および、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、照射した脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）とともに培養した。このＯＶＡ特異反応は、対照として機能した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞（ＦＨ Ｔ細胞）をＣＤ４＋ＭＡＣＳマイクロビーズ（上記）を使用して感染３週間後に感染マウスの腹腔洗浄液から単離した。次いで、ＦＨ Ｔ細胞を、抗原もしくはＡＰＣを全く含まないか、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）２０μｇ／ｍｌまたはＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）を含むどちらかで、ＡＰＣとして未感作ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の照射された脾臓細胞とともに培養した。次いで、同じウェルまたは半透過膜（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）による分離されたウェルのどちらかにおいて、ＯＶＡ特異的およびＦＨ Ｔ細胞を１：１比で合わせて培養した。空気中５％ＣＯ２、３７℃にて７２時間インキュベーション後、ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度の決定のために、上清をｔｒａｎｓｗｅｌｌの上下から、およびに共培養細胞から取り出した。増殖を９６時間培養後の３Ｈチミジン取り込みにより決定した。
【０１６３】
ＦＡＣＳによる自然細胞活性化の分析
ＢＭＤＣまたはＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）中で培養した。細胞を取り出し、表面マーカー発現を蛍光により標識化した抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリーにより評価した。５０％ＦＣＳ／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）でブロックング後、細胞をマウスＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ（ＢＭＤＣのみ）、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＣＲ５に特異的な抗体を用いて暗室にて氷上で３０分間インキュベートした。非関連の特異性を有する適当なアイソタイプ適合抗体で標識した細胞は、対照として作用した。試料当たり合計２００００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。分析をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バーション３．３；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用して行った。
【０１６４】
Ｊ７７４表面マーカー発現の調節
ＬＰＳ誘導性細胞表面マーカー発現におけるＥＳの効果を、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）を用いてＪ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を２時間前刺激後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、さらに２２時間インキュベーションすることにより決定した。２４時間後、細胞を回収し、洗浄し、ブロックし、表面マーカー発現をＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩを使用して評価した。非関連の特異性を有するアイソタイプ適合した直接標識抗原でインキュベーションした細胞は、対照として作用した。暗室において、氷上で３０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、免疫蛍光分析をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析し、試料当たり細胞２００００個を分析した。
【０１６５】
細胞内サイトカイン合成のフローサイトメトリー分析
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来ＤＣおよびＴ細胞のサイトカイン産生を分析するため、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を最初に、５０％ＰＢＳ／ＦＣＳ（ｖ／ｖ）を用いて、室温にて２０分間インキュベートした。次いで、ＤＣおよびＴ細胞を抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＣＤ４それぞれを用いて染色した。細胞内ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマの検出において、細胞を固定し、市販の細胞内サイトカイン染色キット（Ｃａｌｔａｇ）を使用して透過処理した。ＰＥ標識抗ＩＬ−１０およびＦＩＴＣ標識ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマｍＡｂまたはラット対照Ｉｇを所定の飽和濃度にて３０分間添加した。次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドで洗浄し、速やかに回収した。試料当たり合計５００００個の細胞を得た。細胞をＤＣおよびＴ細胞それぞれにおいてＣＤ１１ｃまたはＣＤ４上にゲートし、細胞内タンパク質の発現を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにおいて分析した。
【０１６６】
抗原特異的サイトカイン産生
免疫マウスまたは感染マウス由来の脾臓（２×１０６個／ｍｌ）またはリンパ節細胞（１×１０６個／ｍｌ）をＭＯＧペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）またはＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）あるいはホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）および抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）あるいは培地のみのいずれかを用いてＲＰＭＩ培地において３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。７２時間後、サイトカイン決定において上清を採集し、培地を置き換えた。増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより評価した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を免疫アッセイにより決定した。
【０１６７】
ＥＡＥの誘導およびＥＳ処置
各マウスにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）５ｍｇ／ｍｌを含有するＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチド１５０μｇを尾の根元にｓ．ｃ．注射した。全てのマウスに０日目および免疫化２日後にｉ．ｐ．注射によりｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（Ｓｉｇｍａ）５００ｎｇを投与した。ＥＳ処置において、ＰＢＳ中のＥＳ ５０μｇを２日毎にｉ．ｐ．注射した。マウスをＥＡＥの臨床兆候において毎日評価し、以下のようにスコアした：１＝尾の麻痺、２＝不安定な歩行、３＝後肢の筋力低下、４＝後肢の麻痺、５＝四肢の完全な麻痺、６＝死亡。疾患指数は、１日の平均疾患スコア全てを加算し、平均発症日を割り、１００を掛けることにより算出した。対照ＥＡＥマウスが臨床スコア３〜４を表示した場合、実験を終了した。マウスを頸椎脱臼により屠殺し、血清および脾臓を採取した。
【０１６８】
０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫し、０および２日目にｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＡＥ誘導１日前およびその後２日毎にＥＳ ５０μｇをｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導後２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。結果は、マウス４〜５匹の群において、３回調べた平均値である。
【０１６９】
結果
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、樹状細胞成熟を阻害する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａメタルセルカリアで経口感染後、寄生虫は、腹腔を通り、内臓から肝臓に移動する。それゆえ、腹腔が肝吸虫の産物に暴露される。本明細書において、本発明者らは、腹腔において自然免疫反応の細胞におけるＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染の影響を検討した。マウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、感染３週間後、細胞を腹腔から回収した。未感作マウスの細胞は、対照として機能した。成熟の指標である細胞表面マーカーの発現について、樹状細胞（ＤＣ）を検討した。対照マウス由来の細胞の比較において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現がかなり低く、ＣＣＲ５の発現は高かった（図１）。これは、感染がＤＣ成熟を阻害するか、または腹腔へ未成熟ＤＣの動員することを示唆する。
【０１７０】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来の樹状細胞は、高頻度でＩＬ−１０を分泌し、低頻度でＩＬ−４を分泌する。
マウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、感染３週間後に、細胞を腹腔から回収した。未感作マウス由来の細胞は、対照として機能した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣについて、細胞内ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを、免疫蛍光分析により検討した（図２）。未感作マウスの腹腔由来のＤＣと比較して、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＤＣは、高頻度でＩＬ−１０を分泌した（未感作２〜３％に対して感染３４〜３５％）。また、ＤＣ分泌性ＩＬ−４（未感作０．３７％に対して感染２．２６％）およびＩＦＮ−ガンマ（未感作０．４８％に対して感染１．５７％）の頻度もわずかに増加した。
【０１７１】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、制御性表現型を有するＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞が高頻度で検出される
ＩＬ−１０産生ＤＣがＩＬ−１０分泌性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の誘導を促進することが示されているため、本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＴｒｅｇ細胞の誘導にも関連する可能性を検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａに感染させ、感染３週間後、細胞を腹腔から回収した。未感作マウスの細胞は、対照として機能した。細胞内ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマにおいて、免疫蛍光分析によりＣＤ４＋Ｔ細胞を検討した（図３）。結果は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔のＴ細胞は、高頻度でＩＬ−１０を分泌することを示す（未感作３〜５％に対して感染６６〜６７％）。対照に、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の頻度は、顕著に強化されなかった。
【０１７２】
また、Ｔｒｅｇ細胞に関連することが知られている表面マーカーの表面発現において、腹腔由来のＴ細胞を評価した。特異的抗体を用いた免疫蛍光分析は、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＤ２８、Ｔ１／ＳＴ２およびＣＣＲ５の発現がＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の細胞において強化されることを明らかにした（図５）。対照に、ＣＤ２５発現は、低かった。これらの所見は、誘導性Ｔｒｅｇ細胞が産生され、またはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に腹腔に動員されることを示唆する。
【０１７３】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａは、ＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞を誘導する
図４は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が腹腔へのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の非常に顕著な動員に関連していることを示す。感染マウスのリンパ節の制御性Ｔ細胞数がわずかに増加（５％〜６．７％）したが、一方、腹腔での頻度は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染後に２４％〜９６％までに増加した。
【０１７４】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞は、サプレッサー活性を有する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞がＩＬ−１０を分泌し、制御性表現型を有することを明らかにしたので、本発明者らは、オボアルブミン（ＯＶＡ）Ｔ細胞受容体（ＴＬＲ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウス由来のＴ細胞を用いた共培養実験において、これらのサプレッサー活性を検討した。高頻度のＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウスは、ＯＶＡに特異的であり、抗原特異反応の読み出しに有用である。ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞は、増殖し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原（ＯＶＡ）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激後にＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を分泌する。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞を用いた共培養は、増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生において顕著な抑制効果を有した。これは、抗原（肝吸虫ホモジネート；Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＬＦＨまたは排泄／分泌分画；ＥＳ）を用いた刺激または未刺激において認められた。また、ＩＬ−４産生は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の未刺激Ｔ細胞で特に低下した。対照に、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生は、特にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の抗原刺激細胞で強化された（図６）。
【０１７５】
次に、本発明者らは、抑制のメカニズム、具体的に溶解性因子に対する細胞接触の役割を評価した。ここで、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞は、半透過膜によりＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞から分離した。ＬＦＨまたはＥＳを用いたＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来のＴ細胞の刺激は、高濃度のＩＬ−５およびＩＬ−１０および低濃度ＩＦＮ−ガンマの産生を生じた。ＩＬ−４はまた、ＬＦＨで刺激後に検出されたが、ＥＳでは検出されなかった（図７）。ＯＶＡを用いたＤＯ１１．１０ ＴＣＲ Ｔｇマウス由来のＴ細胞の刺激は、強力な増殖およびＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の分泌を生じた。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞を用いた共培養は、増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を部分的に抑制したが、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生を強化した。
【０１７６】
これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスのＴ細胞がバイスタンダー様式において、非関連抗原に対するＴ細胞反応を抑制することを明らかにする。さらに、この抑制は、溶解性因子、おそらくＩＬ−１０により部分的に媒介され、これは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＴ細胞により高濃度で分泌される。
【０１７７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中のＩＬ−１０産生は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−５およびＩＦＮ−ガンマ産生を制御する
ｉｎ ｖｉｖｏの免疫反応の抑制におけるＩＬ−１０の役割を検討するため、Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスにＦ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させ、腹水において、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原を用いて再刺激された腸管膜リンパ節細胞において、サイトカイン産生を検討した。
【０１７８】
ＩＬ−１０およびＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａを感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹水において検出されたがＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマは検出されなかった（図８）。対照に、顕著な濃度のＩＬ−４および強化されたＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａに感染させたＩＬ−１０ノックアウトマウスの腹水において検出された。ＩＬ−１０およびＩＬ−５が、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ刺激腸管膜リンパ節細胞で検出されたが、ＩＬ−５ならびにＩＦＮ−ガンマは検出されなかった（図９）。対照に、顕著な濃度のＩＦＮ−ガンマおよび強化されたＩＬ−５が、ＩＬ−１０ノックアウトマウス由来のＥＳ刺激腸管膜リンパ節細胞に検出された。これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスのＩＬ−１０産生細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン産生をともに抑制することを示す。
【０１７９】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ排泄／分泌（ＥＳ）産物は、自然ＩＬ−１０産生を刺激する
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が自然細胞およびＴ細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを明らかにしたので、本発明者らは、自然免疫系の細胞によるＩＬ−１０産生におけるＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳの影響を検討した。腹腔滲出細胞、腹腔マクロファージ、Ｊ７７４マクロファージ、骨髄由来ＤＣおよび腹膜と脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣは全て、ＥＳに反応してＩＬ−１０を分泌した（図１０および１１）。本発明者らは、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もまた、腹腔マクロファージ由来のＩＬ−１０産生を刺激することを見出した。ＩＬ−１２ｐ４０産生は、骨髄由来ＤＣおよびＪ７７４細胞の上清において検出されたが、ＩＬ−１２ｐ７０は検出されなかった（図１１）。ＩＬ−１０産生は、ＥＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後６〜４８時間でマクロファージにおいて、および２４〜４８時間でＤＣにおいて検出された（図１２）。
【０１８０】
ＥＳは、ｉｎ ｖｉｖｏで自然ＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を刺激する
ｉｎ ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞によるＩＬ−１０の誘導を明らかにしたので、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＳの自然サイトカイン産生の刺激能を検討した。マウスの側腹部にｓ．ｃ．注射し、流入領域リンパ節を６時間後に取り出し、ホモジナイズし、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。別法として、マウスにｉ．ｐ．注射し、２時間後に腹膜ＤＣのサイトカイン産生を評価した。結果は、ＥＳのｓ．ｃ．注射が流入領域リンパ節における顕著な濃度のＩＬ−１０および低濃度のＩＬ−４の産生を刺激したことを明らかにした（図１３）。ｉ．ｐ．経路によるＥＳ注射はまた、腹腔のＩＬ−１０およびＩＬ−４産生ＤＣ細胞を刺激した。ＩＬ−１０分泌性ＤＣの頻度は、対照マウスの７〜１２％からＥＳ注射マウスの１５〜２１％まで増加し、ＩＬ−４産生細胞の頻度は、７．５から１７％まで増加した（図１４）。ＩＦＮ−ガンマ分泌性ＤＣの頻度において、１．９から４．０％と、あまり顕著な増加はなかった。
【０１８１】
ＥＳは、ＴＬＲ作動薬誘導性ＩＬ−１２ｐ７０産生を阻害する
自然細胞によるＩＬ−１０産生は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関連し、一方、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞の増殖を促進する。それゆえ、本発明者らは、マクロファージおよびＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０産生におけるＥＳの影響を検討した。ＥＳのみは、ＩＬ−１２ｐ７０を刺激しなかったが、Ｊ７７４マクロファージ由来のＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０産生を刺激した（図１５）。さらに、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０は、ＥＳを用いた２時間のプレインキュベーションにより阻害された。ＥＳは、ＤＣ由来のＩＬ−１２ｐ７０を誘導せず、ＬＰＳおよびＩＦＮ−ガンマにより誘導されたＩＬ−１２ｐ７０を阻害した。ＥＳの阻害効果は広範囲の濃度にわたり認められ、より高濃度において非常に顕著であった（図１６）。
【０１８２】
ＥＳの免疫調節効果は、カテプシン以外の熱感受性分子により媒介される
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来のカテプシンＬプロテイナーゼが免疫調節特性を有することは以前に報告されている。ここで、本発明者らは、ＩＬ−１０産生の誘導において、カテプシンの役割を評価した。本発明者らは、最初に、ＥＳ活性の熱処理の効果を評価した。ＥＳの熱処理は、腹腔滲出細胞によるＩＬ−１０産生を刺激するその能力を顕著に低下させた（図１７）。対照的に、カテプシン阻害剤の添加は、ＩＬ−１０を刺激し、またはＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０あるいはｍＩＬ−１２ｐ７０の産生を阻害するＥＳの能力に全く影響しなかった（図１８および１９）。これらの所見は、ＩＬ−１０産生を刺激するＥＳ分画の免疫調節産物は、カテプシンではないが、熱感受性分子であることを示唆する。
【０１８３】
ＥＳは、ＤＣおよびマクロファージにおける表面マーカー発現を調節する
ＤＣおよびマクロファージは、強力な抗原提示細胞であるが、最初にＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子の発現を強化するよう活性化されなければならない。完全な成熟ＤＣは、エフェクターＴ細胞、特にＴｈ１細胞の増殖を促進し、一方、未成熟または部分的成熟ＤＣは、アネルギー性または制御性Ｔ細胞の増殖を促進する。本明細書において、本発明者らは、ＥＳがＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＣのＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を強化することを見つけた。活性化のレベルは、ＬＰＳで認められたものと同様であった。しかし、ＣＣＲ５発現を抑制するＬＰＳと異なり（ＣＣＲ５発現は、通常、ＤＣ成熟後に低下する）、ＥＳは、ＣＣＲ５発現を強化した。ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、この強化は、認められなかった。さらに、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩは、ＩＬ−１０欠損マウス由来のＥＳ刺激ＤＣで強化された（図２０）。これは、ＤＣ成熟がＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生により強制されることを示唆する。
【０１８４】
ＥＳはまた、Ｊ７７４マクロファージのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を強化し（図２１）、ＥＳにより阻害されたＣＤ４０を除いて、これらのマーカーのＬＰＳ誘導性発現を強化した（図２２）。抑制されたＣＤ４０発現は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関連している。それゆえ、これらの所見は、ＥＳがＤＣおよびマクロファージの中間表現型への成熟を誘導することを示唆し、これは、Ｔｒｅｇ細胞を刺激するこれらの能力と一致する。
【０１８５】
ＥＳは、ＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、エフェクターＴ細胞による増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を抑制する
本発明者らは、モデル抗原であるＫＬＨに対するＴ細胞反応の誘導におけるＥＳの影響を検討した。マウスにＥＳのみ、ＫＬＨのみまたはＫＬＨおよびＥＳを注射し、流入領域リンパ節を７日後に取り出し、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原（ＫＬＨ）を用いて再刺激した。この実験において、陽性対照刺激である抗ＣＤ３およびＰＭＡに対して反応が検出されたが、ＫＬＨのみは、抗原特異的免疫反応を誘導しなかった。対照的に、ＥＳ（５０μｇ）を用いた共注射は、高濃度の抗原特異的ＩＬ−１０および低濃度のＩＬ−５を分泌するが、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマを分泌しないＴ細胞を産生した（図２３）。このサイトカインパターンは、Ｔｒｅｇ細胞の誘導と一致する。ＫＬＨのみの免疫に反応してＩＬ−５およびＩＦＮ−ガンマを検出した別の実験において、本発明者らは、ＥＳ共投与（２０μｇ）後にこのＫＬＨ特異的サイトカイン産生の抑制を認めた（図２４）。
【０１８６】
また、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、分裂促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対するＴ細胞反応におけるＥＳの影響を検討した。ＣｏｎＡで刺激された脾臓細胞は、増殖し、ＩＦＮ−ガンマおよび低濃度のＩＬ−１０を分泌した（図２５）。ＥＳの共インキュベーションは、特に、高濃度で使用された場合に（２０μｇ／ｍｌ）、これは、単独では増殖またはサイトカイン産生を誘導しないが、ＣｏｎＡ誘導性増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を顕著に阻害し、ＩＬ−１０を強化した。これらの所見により、ＥＳが優先的にＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ１細胞の誘導を抑制することが確認された。
【０１８７】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して防御する
ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７を分泌する自己抗原特異的Ｔ細胞は、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含めた多くの自己免疫疾患の病原体を媒介した。正常な個体において、病原性Ｔ細胞を抑制する天然および誘導性Ｔｒｅｇ細胞により、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患が調整される。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＥＳがＩＬ−１０分泌性Ｔｒｅｇ細胞を誘導することを示したので、本発明者らは、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）を有する完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）中のミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドの投与を含む慢性疾患モデルのＥＡＥ進行におけるＥＡＥの感染または非経口投与の影響を検討した。未処置のマウスは、１２日後にＥＡＥの臨床症状を進行させ、２０日後にグレード３以上の臨床スコアに達し、この段階で屠殺しなければならなかった。対照的に、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスは、１４日まで症状が進行せず、ＥＳ処置マウスは、１６日まで症状が進行しなかった（図２６）。さらに、これらのマウスの疾患の重症度は、かなり低下した。これらの所見は、ＥＳの非経口送達が、マウスの自己免疫疾患に対して防御効果を有することを明らかにする。
【０１８８】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与は、ＥＡＥ進行中の病原性Ｔ細胞の誘導を抑制する
Ｔ細胞は、多くの自己免疫疾患を媒介し、従来、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞が炎症性病原体に関与すると考えられてきた。しかし、最近の証拠では、ＩＬ−１７分泌性Ｔ細胞が、リウマチ様関節炎、大腸炎、多発性硬化症および多発性硬化症のマウスモデルであるＥＡＥを含めた多くの慢性炎症性疾患および自己免疫疾患において多くの損傷を媒介することを示唆する。本明細書において、ＥＡＥ進行は、未処理のマウスのＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導に関連した（図２７）。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳの非経口投与（これは、ＥＡＥの臨床症状を低下させた）は、ＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞の誘導を抑制した。さらに、ポリクローナル刺激、抗ＣＤ３およびＰＭＡに対するＩＬ−１７産生も、感染またはＥＳ処置マウスにおいて抑制された。対照に、ＭＯＧ特異的ＩＬ−１０は、未処置マウスにおいて検出できなかったが、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳ処置マウスにおいてかなりの濃度にて検出可能であった。さらに、ＭＯＧ特異的ＩＬ−４は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスにおいて強化された。さらに、抗ＣＤ−３およびＰＭＡ誘導性ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、感染およびＥＳ処置マウスにおいて強化された。これらの所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＥＳ治療が、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０を強化し、自己抗原特異的病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞を抑制することにより、ＥＡＥの誘導を予防することを明らかにする。
【０１８９】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減する
図２８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減することを示し、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａによるＥＡＥの軽減がＩＬ−１０誘導により媒介されないことを示唆する。
【０１９０】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムによりＥＡＥ中の病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害する
図２９は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＭＯＧ特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、野生型マウスのＩＬ−１０産生を強化することを示す。データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染による病原性Ｔ細胞の阻害がＩＬ−１０により媒介されないことを示唆する。
【０１９１】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減する
図３０は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳにより誘導された大腸炎の臨床兆候（下痢および糞便血）を軽減することを示す。
【０１９２】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸における炎症促進性サイトカイン産生を抑制する
図３１は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−アルファの誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染後に低下することを示す。これらのサイトカインは、大腸炎の病態を媒介することを示し、データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａが炎症促進性サイトカインの産生を阻害することにより、ある程度の防御を付与することを示唆する。
【０１９３】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物を用いた治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減する
図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の非経口投与が、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳにより誘導された大腸炎の臨床兆候（下痢、血便および体重減少）を軽減することを示す。
【０１９４】
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物を用いた治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎中の炎症促進性サイトカイン産生を抑制する
図３３は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の投与により低下することを示す。ＩＬ−１およびＩＬ−１７は、大腸炎の病態を媒介することを示し、データは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物がこれらの炎症促進性サイトカインの産生を阻害することにより、ある程度の防御を付与することを示唆する。
【０１９５】
ＥＳは、共投与抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害する
図３４は、ｉｎ ｖｉｖｏで外来抗原とＥＳの共投与が、抗原特異的Ｔ細胞、特に、ＩＦＮ−ガンマ（Ｔｈ１細胞）またはＩＬ−１７（Ｔｈ１７細胞）を分泌するＴ細胞の誘導を抑制することを示す。
【０１９６】
要約
本発明者らは、マウスへのＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染またはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳの投与が高頻度のＩＬ−１０分泌性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を誘導し、ＥＳ産物が自己免疫疾患の阻害能を有することを発見した。本発明者らは、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスが、腹腔において、ＩＬ−４の非存在下で非常に高濃度のＩＬ−１０を分泌する非常に高頻度のＣＤ４＋Ｔ細胞を有することを明らかにした。感染により誘導されたこれらのＴｒｅｇ細胞は、共培養系または半透過膜により分離された場合における、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、これは可溶性因子介在性抑制を示した。さらに、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔由来の樹状細胞（ＤＣ）は、高濃度のＩＬ−１０を分泌し、未感作マウス由来のＤＣに比べＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現は顕著に低いが、ＣＣＲ５は高く、未成熟状態を示した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞において抗原提示細胞として使用された場合、Ｆ−ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＤＣは、未感作マウス由来のＤＣと比較した場合、顕著に低いサイトカイン産生を誘導した。これらの所見は、ＤＣ活性化およびＴｒｅｇ細胞誘導を調節することにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａがＴ細胞反応を抑制することを示す。
【０１９７】
また、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳがＤＣ成熟を調節し、ｉｎ ｖｉｒｔｏでＩＬ−１０産生を強化することが思いがけなく示された。カテプシンＬプロテイナーゼ阻害剤の添加が、ＥＳの調節効果を反転しなかった。さらに、マウスへのＥＳ注射は、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を予防した。ＴｈＩＬ１７と呼ばれるＩＬ−１７を分泌するＴ細胞は、ＥＡＥの病原体であり、本発明者らのデータは、ＥＳがＴｈＩＬ−１７細胞の増殖を促進するＩＬ−２３を阻害することにより、またはＴｈＩＬ−１７細胞の活性化もしくは機能を阻害することによるどちらかでＴｈＩＬ−１７細胞の誘導を抑制することを示唆する。所見は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ由来のＥＳ分画がカテプシンＬプロテイナーゼ以外の成分を含み、これは、自然免疫系の細胞と相互作用し、抗炎症性サイトカインの誘導を刺激し、Ｔｒｅｇ細胞の誘導を促進する表現型に樹状細胞を活性化する一方、ＴｈＩＬ−１７細胞を阻害し、それにより自己免疫疾患の進行を予防することを示唆する。
【０１９８】
本明細書において参照する全ての文書は、本明細書において参照として組み込まれる。本発明の記載の実施形態に対する種々の修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとっては明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関して記載しているが、それは、請求される本発明がこのような具体的な実施形態に過度に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際、当業者であれば明らかである本発明を実施する記載様式の種々の修正は、本発明により包含されることを意図する。本明細書において、いくつかの従来技術への参照は、この従来技術のいずれかの国における通常の一般的な知識の部分を形成するものとしての承認、またはいずれかの形態における示唆とみなされるものではなく、またそのようにみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１−１】図１は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が樹状細胞（ＤＣ）成熟を調節することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａを経口感染させた。感染３週間後、腹腔滲出細胞を洗浄により、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスから単離し、細胞蛍光分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）において、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体（Ａｂ）または種およびアイソタイプ適合対照抗体で染色した。図１は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ集団上にゲートした細胞を表す。
【図１−２】図１は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染が樹状細胞（ＤＣ）成熟を調節することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａを経口感染させた。感染３週間後、腹腔滲出細胞を洗浄により、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスから単離し、細胞蛍光分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）において、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体（Ａｂ）または種およびアイソタイプ適合対照抗体で染色した。図１は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ集団上にゲートした細胞を表す。
【図２】図２は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−１０産生樹状細胞を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を惹起２１日後に未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスから腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ１１ｃ＋集団においてゲートした。図２は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ産生を示す。数字は、ゲートしたＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を表す。
【図３】図３は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導することを示す。未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を惹起２１日後に腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。数字は、ゲートした細胞の割合を表す。
【図４】図４は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａがＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞を誘導することを示す。未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞（Ａ）および腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）（Ｂ）を感染２１日後に単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、その後、ＦＯＸＰ３の細胞内染色のために固定および透過処理した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図４は、惹起２１日後に、未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来のＭＬＮおよびＰＥＣのＣＤ４＋Ｔ細胞上のＦＯＸＰ３およびＣＤ２５発現の代表例を示す。数字は、ゲートした細胞の割合を表す。
【図５−１】図５は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が制御性の表現型を有することを示す。Ｔ細胞を未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス（惹起２１日後）の腹腔から磁気分離によりＣＤ４＋細胞の正の選択を使用して単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、細胞蛍光分析のために、ＣＤ２５、ＣＣＲ５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０ＲおよびＴ１／ＳＴ２を染色した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図５は、Ｔ細胞上の細胞表面マーカー発現を示す。
【図５−２】図５は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が制御性の表現型を有することを示す。Ｔ細胞を未感作およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス（惹起２１日後）の腹腔から磁気分離によりＣＤ４＋細胞の正の選択を使用して単離した。細胞をブロックし、抗ＣＤ４で表面標識し、細胞蛍光分析のために、ＣＤ２５、ＣＣＲ５、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０ＲおよびＴ１／ＳＴ２を染色した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＣＤ４＋細胞集団においてゲートした。図５は、Ｔ細胞上の細胞表面マーカー発現を示す。
【図６−１】図６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が抑制能力を有することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）と合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を図６に示されたように合わせて培養した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図６−２】図６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞が抑制能力を有することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）と合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を図６に示されたように合わせて培養した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図７−１】図７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞の抑制能力が可溶性因子により部分的に媒介されることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）ならびに脾臓ＡＰＣと合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）産物またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を半透過膜により分離した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図７−２】図７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染中に誘導されたＴ細胞の抑制能力が可溶性因子により部分的に媒介されることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を感染３週間後のＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔から精製した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウス由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；２×１０６／ｍｌ）として照射された脾臓細胞のみ、または精製されたＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡペプチド（２μｇ／ｍｌ）ならびに脾臓ＡＰＣと合わせてＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）産物またはＬＦＨ（２０μｇ／ｍｌ）と培養した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ特異的Ｔ細胞を半透過膜により分離した。ＯＶＡペプチドおよびＡＰＣとともに培養されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、対照として機能した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を特異免疫アッセイにより決定した。増殖は、培養９６時間後のチミジン取り込みを測定することにより決定した。
【図８−１】図８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、ＩＬ−１０およびＩＬ−５が誘導され、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＬ−４が誘導されることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）マウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、腹水を洗浄により回収した。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの存在を免疫アッセイにより分析した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図８−２】図８は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染マウスの腹腔において、ＩＬ−１０およびＩＬ−５が誘導され、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＬ−４が誘導されることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）マウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、腹水を洗浄により回収した。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの存在を免疫アッセイにより分析した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図９−１】図９は、腸管膜リンパ節において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−５およびＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞を強化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、ｅｘ ｖｉｖｏの腸管膜リンパ節細胞を培地のみ、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡおよび抗ＣＤ３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。インキュベーション７２時間後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図９−２】図９は、腸管膜リンパ節において、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＩＬ−５およびＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を誘導し、ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞を強化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＬ−１０ノックアウトマウスをＦ．ｈｅｐａｔｉｃａで感染させた。感染３週間後、ｅｘ ｖｉｖｏの腸管膜リンパ節細胞を培地のみ、ＥＳ（４および２０μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡおよび抗ＣＤ３を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。インキュベーション７２時間後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。データは、個々のマウス由来の平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１０−１】図１０は、ＥＳが自然細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）、腹膜由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｃ）および脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｄ）を１×１０６個／ｍｌにて、ＥＳ（４．０、２０．０μｇ／ｍｌ）または肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ；２０μｇ／ｍｌ）、培地のみあるいはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０濃度を２４時間後に評価した。図１０は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１０−２】図１０は、ＥＳが自然細胞由来のＩＬ−１０産生を誘導することを示す。腹腔滲出細胞（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）、腹膜由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｃ）および脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ｄ）を１×１０６個／ｍｌにて、ＥＳ（４．０、２０．０μｇ／ｍｌ）または肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ；２０μｇ／ｍｌ）、培地のみあるいはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０濃度を２４時間後に評価した。図１０は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１１】図１１は、ＥＳがマクロファージおよび樹状細胞由来のＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０産生を誘導することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（Ａ）および骨髄由来ＤＣ（Ｂ）（１×１０６個／ｍｌ）をＥＳ（４．０、２０．０および１００μｇ／ｍｌ）、培地のみまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０濃度を２４時間後に評価した。図１１は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を表す。
【図１２】図１２は、ＢＭＤＣおよびＰＥＣ由来のＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生の動態を示す。骨髄由来ＤＣ（Ａ）またはｅｘ ｖｉｖｏのＰＥＣ（Ｂ）（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。上清を６、１２、２４または４８時間後に取り出し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−１０産生について評価した。図１２は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１３】図１３は、ＥＳがｉｎ ｖｉｖｏで皮下投与後に流入領域リンパ節においてＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を誘導することを示す。マウス４匹の群にＰＢＳ２００μｌまたはＥＳ（５０μｇ）のどちらかを皮下注射した。６時間後、鼠径リンパ節を取り出し、１ｍｌ氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。遠心分離後、上清を取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ濃度についてＥＬＩＳＡ法により分析した。図１３は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１４】図１４は、ＥＳがｉｎ ｖｉｖｏでｉ．ｐ．投与後に腹腔の樹状細胞によりＩＬ−１０およびＩＬ−４産生を誘導することを示す。マウス４匹の群にＰＢＳまたはＥＳ（５０μｇ）をｉ．ｐ．注射した。２時間後、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を腹腔洗浄により採取した。細胞をブロックし、抗ＣＤ１１ｃで表面標識し、その後、蛍光標識した抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−ガンマ抗体による細胞内サイトカイン標識のための固定および透過処理を行なった。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析し、ＣＤ１１ｃ＋細胞集団においてゲートした。図１４は、ＰＢＳ注射およびＥＳ注射マウス由来のＰＥＣ ＤＣのサイトカイン産生を示す。数字は、ゲートしたＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を表す。
【図１５】図１５は、ＥＳがＪ７７４マクロファージのＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０を阻害することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後にＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１５は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１６】図１６は、ＥＳが樹状細胞のＬＰＳ−ＩＦＮ−ガンマ誘導性ＩＬ−１２ｐ７０産生を阻害することを示す。骨髄由来ＤＣを培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−ガンマ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（４．０または２０．０μｇ／ｍｌ）、またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後にＬＰＳおよびＩＦＮ−ガンマで２４時間刺激した。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１６は、３回の培養における平均（±ＳＥ）ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０濃度を示す。
【図１７】図１７は、ＥＳ誘導性ＩＬ−１０産生が熱不活性化ＥＳにより無効になることを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を冷ＰＢＳの腹腔洗浄により未感作マウスから単離した。次いで、ＰＥＣ（１×１０６個／ｍｌ）を天然または熱不活性化ＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）、陰性および陽性対照として、それぞれ培地のみまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。上清のサイトカイン濃度を２４時間後に評価した。図１７は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１８】図１８は、ＥＳによるＩＬ−１０誘導がカテプシンにより媒介されないことを示す。腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を冷ＰＢＳの腹腔洗浄により未感作マウスから単離した。次いで、ＰＥＣ（１×１０６個／ｍｌ）をカテプシン阻害剤Ｅ−６４（１０ｍＭ）の存在下または非存在下においてＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）で刺激した。培地またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた刺激は、それぞれ陰性および陽性対照として機能した。上清のサイトカイン濃度を２４時間後に評価した。図１８は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図１９】図１９は、Ｊ７７４マクロファージのＬＰＳ誘導性ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０の阻害がカテプシンにより媒介されないことを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）が媒体のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳを用いてＥ−６４（１０ｍＭ）の存在下または非存在下において２４時間刺激した。インキュベーション後、上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。図１９は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度を示す。
【図２０−１】図２０は、ＥＳがＤＣの成熟を誘導することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ１０−／−）マウス由来の骨髄由来ＤＣ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。インキュベーション２４時間後、細胞を細胞蛍光分析において、ｍＡｂｓ ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩまたは種およびアイソタイプ適合対照Ａｂｓで染色した。細胞をＣＤ１１ｃ＋（ＤＣ）集団上でゲートした。
【図２０−２】図２０は、ＥＳがＤＣの成熟を誘導することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ１０−／−）マウス由来の骨髄由来ＤＣ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。インキュベーション２４時間後、細胞を細胞蛍光分析において、ｍＡｂｓ ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ５およびＭＨＣクラスＩＩまたは種およびアイソタイプ適合対照Ａｂｓで染色した。細胞をＣＤ１１ｃ＋（ＤＣ）集団上でゲートした。
【図２１−１】図２１は、ＥＳがマクロファージ上のＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激性分子発現を強化することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２１−２】図２１は、ＥＳがマクロファージ上のＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激性分子発現を強化することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２２−１】図２２は、ＥＳがマクロファージ上のＬＰＳ誘導性ＣＤ４０発現を抑制することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２２−２】図２２は、ＥＳがマクロファージ上のＬＰＳ誘導性ＣＤ４０発現を抑制することを示す。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＳ（２０．０μｇ／ｍｌ）またはＥＳで２時間のプレインキュベーション後のＬＰＳで２４時間刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体またはアイソタイプ適合対照で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
【図２３−１】図２３は、ＥＳが、共投与した抗原に対して抗原特異的ＩＬ−１０産生を強化することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ（２０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０産生について免疫アッセイにより調べた。図２３は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２３−２】図２３は、ＥＳが、共投与した抗原に対して抗原特異的ＩＬ−１０産生を強化することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ（２０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（２０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０産生について免疫アッセイにより調べた。図２３は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２４−１】図２４は、ＥＳが、共投与した抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ、ＥＳ（５０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０において免疫アッセイにより調べた。図２４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２４−２】図２４は、ＥＳが、共投与した抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ、ＥＳ（５０μｇ）、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）で側腹部に皮下免疫した。７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０において免疫アッセイにより調べた。図２４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図２５】図２５は、ＥＳがＣｏｎＡ誘導性増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地またはＥＳ（４．０および２０μｇ／ｍｌ）のみあるいは、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）の存在下において２４時間刺激した。上清をインキュベーション７２時間後に取り出し、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ産生についてＥＬＩＳＡ法により評価した。増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより４８時間後に決定した。図２５は、３回の培養における平均（±ＳＥ）サイトカイン濃度および増殖数を示す。
【図２６】図２６は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、ＥＡＥの臨床症状を改善することを示す。０日目に完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。図２６は、平均臨床ＥＡＥスコアおよび疾患指数を示す。
【図２７−１】図２７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫化および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２７は、マウス４〜５匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２７−２】図２７は、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染およびＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ処置が、病原性ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫化および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを誘導した。１つのマウス群は、処置しないままにした。２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個で感染させた。３つ目は、ＥＳ ５０μｇを、ＥＡＥ誘導１日前におよびその後は２日毎にｉ．ｐ．注射した。ＥＡＥ誘導２０日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２７は、マウス４〜５匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２８】図２８は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＣ５７ＢＬ／６野生型およびＩＬ−１０欠損マウスのＥＡＥの発症を遅延し、臨床兆候を軽減することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。図２８は、平均臨床ＥＡＥスコアを示す。
【図２９−１】図２９は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＥＡＥにおける病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウス（ｋ／ｏ）においてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＥＡＥ誘導２０日後（ＩＬ−１０ｋ／ｏにおいて）または２３日後（ＷＴマウスにおいて）において、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２９は、マウス６匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図２９−２】図２９は、ＩＬ−１０非依存性メカニズムにより、Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＥＡＥにおける病原性ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１７分泌性細胞を阻害することを示す。０日目の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いた免疫および０日および２日目のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素の注射により、Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０ノックアウトマウス（ｋ／ｏ）においてＥＡＥを誘導した。各種のマウスにおいて、１つの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＥＡＥ誘導１日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＥＡＥ誘導２０日後（ＩＬ−１０ｋ／ｏにおいて）または２３日後（ＷＴマウスにおいて）において、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）を培地のみ、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（１０および１００μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３およびＰＭＡで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図２９は、マウス６匹の群において３回調べた平均値を示す。
【図３０】図３０は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＤＳＳ投与５日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）の毎日の観察によりモニターした。図３０は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３１】図３１は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ感染がＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸の炎症促進性サイトカイン産生を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、ＤＳＳ投与５日前にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａのメタセルカリア１０個を投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。マウスを１２日目に屠殺し、結腸を取り出し、タンパク質分解性酵素で１時間処理後、１または２４時間インキュベートした。組織上清のＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−アルファ濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。
【図３２−１】図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）ならびにＣ）体重（０日目の重量の割合として表した）の毎日の観察によりモニターした。図３２は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３２−２】図３２は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の臨床兆候を軽減することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ感染を受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。大腸炎の臨床症状は、Ａ）下痢（以下のスコア１〜３：０、正常なペレット；１、わずかに緩いペレット；２、緩いペレット；３水様便）およびＢ）糞便血（以下のスコア：０、正常；１、わずかに血性；２、血性；３、全結腸内の出血）ならびにＣ）体重（０日目の重量の割合として表した）の毎日の観察によりモニターした。図３２は、マウス６〜８匹／群の平均スコアを示す。
【図３３】図３３は、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物による治療がＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＳＳ誘導性大腸炎の炎症促進性サイトカイン産生を抑制することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、０日目から実験期間中５％デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を飲水投与することにより、大腸炎を誘導した。１つのマウスの群は、処置しないままにし、２つ目の群は、−１、＋１、３、５、７および９日目にＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ ５０μｇを投与した。ＤＳＳまたはＦ．ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳを受けていない追加のマウスの群は、対照として機能した。マウスを１２日目に屠殺し、結腸を取り出し、タンパク質分解性酵素で１時間処理後、１または２４時間インキュベートした。ＩＬ−１７、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。図３３は、ＤＳＳ誘導性大腸炎中の結腸におけるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の誘導がＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ＥＳ産物の投与により低下することを示す。
【図３４−１】図３４は、ＥＳが、共投与された抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。ＯＶＡ−ＴｇマウスをＰＢＳ、ＯＶＡ（２００μｇ）またはＯＶＡ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）を用いて側腹部に皮下免疫した。１４日後、マウスをＯＶＡまたはＯＶＡおよびＥＳのどちらかで二次免疫した。二次免疫７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＯＶＡ（２０および２００μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７およびＩＬ−５産生を免疫アッセイにより調べた。図３４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【図３４−２】図３４は、ＥＳが、共投与された抗原に対する抗原特異的ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。ＯＶＡ−ＴｇマウスをＰＢＳ、ＯＶＡ（２００μｇ）またはＯＶＡ（５μｇ）およびＥＳ（５０μｇ）を用いて側腹部に皮下免疫した。１４日後、マウスをＯＶＡまたはＯＶＡおよびＥＳのどちらかで二次免疫した。二次免疫７日後、鼠径リンパ節を単離し、ＯＶＡ（２０および２００μｇ／ｍｌ）、培地のみならびにＰＭＡおよび抗ＣＤ３と陰性および陽性対照それぞれで刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７およびＩＬ−５産生を免疫アッセイにより調べた。図３４は、マウス４匹／群の平均（±ＳＥ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応の処置または予防のための組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がカテプシンＬを含まない、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物がＩＬ−４濃度を調節しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫反応を調節する場合、
被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少、または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｔ細胞介在性炎症促進性状態の予防および／または処置のための医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｔ細胞介在性免疫反応を調節する方法であって、
このような処置を必要とする被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項９】
前記免疫反応を調節する場合、前記薬剤が
前記被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
前記被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少、または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤がＰａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ＬＰＳ、フラジェリンおよびＣｐＧ−ＯＤＮを含む群から選択される、ＴＬＲ作動薬とともに投与される、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔｈ１免疫反応の下方制御により有利となる状態を有する被検体を処置する方法であって、
当該被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
免疫介在性疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項１３】
自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項１４】
このような処置を必要とする被検体において、免疫介在性疾患の処置に適切な免疫反応を抑制する方法であって、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された当該樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより、続いて前記被検体中で前記樹状細胞により誘導される免疫反応が、前記免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する方法。
【請求項１５】
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、リウマチ様関節炎または多発性硬化症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫介在性疾患の処置に適切な被検体の免疫反応を誘発する方法であって、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された当該樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画またはそこから単離されたペプチドの誘導体産物、突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより、前記被検体中で産生される免疫反応が、前記免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する方法。
【請求項１８】
免疫介在性状態の予防および／または処置の方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含み、当該薬剤の投与がＩＬ−１７を分泌するＴ細胞の産生を阻害するよう作用する方法。
【請求項１９】
免疫介在性状態の予防および／または処置の方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含み、当該薬剤の投与がＩＬ−２３産生を阻害するよう作用する方法。
【請求項２０】
免疫介在性疾患の処置のための、ＩＬ−１７産生を阻害する医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画またはそこから単離されたタンパク質の誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２１】
神経変性疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２２】
心疾患または状態のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２３】
癌または感染性疾患の処置に適切な被検体のＴｈ１反応を誘導する方法であって、
樹状細胞を、エフェクター細胞機能を促進する表現型に成熟させるために、単離された当該樹状細胞を、ワクチンおよびＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分から単離されたＴＬＲ作動薬の存在下において、疾患特異的抗原にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより前記被検体中に産生された免疫反応が、癌の発症または進行を十分に予防し、あるいは病原性微生物感染を十分に予防し、それにより感染性疾患を予防する方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１２産生またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制のための組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２５】
ＩＬ−１２産生または前記ＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制において使用される医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２６】
ＩＬ−１２またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生を抑制する方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与する
ステップを含む方法。
【請求項２７】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２８】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２９】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
炎症状態の予防および／または処置のための組成物であって、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項３１】
炎症状態の予防および／または処置のための医薬組成物であって、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項３２】
炎症状態を調節する方法であって、
肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
認知機能障害の予防および／または処置の方法であって、このような治療を必要とする個体に、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
認知機能障害の処置のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の使用。
【請求項３５】
認知機能障害の処置のための医薬品の調製のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項３６】
免疫介在性状態の処置のための医薬品の調製のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項１】
Ｔ細胞介在性炎症性免疫反応の処置または予防のための組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がカテプシンＬを含まない、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物がＩＬ−４濃度を調節しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫反応を調節する場合、
被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少、または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｔ細胞介在性炎症促進性状態の予防および／または処置のための医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｔ細胞介在性免疫反応を調節する方法であって、
このような処置を必要とする被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ由来の排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項９】
前記免疫反応を調節する場合、前記薬剤が
前記被検体のＩＬ−１０サイトカインレベルの増加、
前記被検体のＴＧＦ−ベータサイトカインレベルの増加、
制御性Ｔ細胞の増加、
ＩＬ−１２、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ガンマ等の少なくとも１つの炎症促進性サイトカインの減少、
細胞傷害性Ｔリンパ球の減少、
Ｔｈ１細胞の減少、または
混合リンパ球反応の低下
の少なくとも１つを媒介するよう作用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤がＰａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ＬＰＳ、フラジェリンおよびＣｐＧ−ＯＤＮを含む群から選択される、ＴＬＲ作動薬とともに投与される、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔｈ１免疫反応の下方制御により有利となる状態を有する被検体を処置する方法であって、
当該被検体に、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
免疫介在性疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項１３】
自己免疫疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項１４】
このような処置を必要とする被検体において、免疫介在性疾患の処置に適切な免疫反応を抑制する方法であって、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された当該樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより、続いて前記被検体中で前記樹状細胞により誘導される免疫反応が、前記免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する方法。
【請求項１５】
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、リウマチ様関節炎または多発性硬化症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫介在性疾患の処置に適切な被検体の免疫反応を誘発する方法であって、
樹状細胞の機能を調節するために、単離された当該樹状細胞を、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画またはそこから単離されたペプチドの誘導体産物、突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより、前記被検体中で産生される免疫反応が、前記免疫介在性疾患の発症または進行を十分に予防する方法。
【請求項１８】
免疫介在性状態の予防および／または処置の方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含み、当該薬剤の投与がＩＬ−１７を分泌するＴ細胞の産生を阻害するよう作用する方法。
【請求項１９】
免疫介在性状態の予防および／または処置の方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含み、当該薬剤の投与がＩＬ−２３産生を阻害するよう作用する方法。
【請求項２０】
免疫介在性疾患の処置のための、ＩＬ−１７産生を阻害する医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画またはそこから単離されたタンパク質の誘導体、突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２１】
神経変性疾患の処置のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２２】
心疾患または状態のための医薬品の調製のための、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体の使用。
【請求項２３】
癌または感染性疾患の処置に適切な被検体のＴｈ１反応を誘導する方法であって、
樹状細胞を、エフェクター細胞機能を促進する表現型に成熟させるために、単離された当該樹状細胞を、ワクチンおよびＦａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａのＥＳ（排泄／分泌）成分から単離されたＴＬＲ作動薬の存在下において、疾患特異的抗原にｅｘ ｖｉｖｏで暴露し、
前記樹状細胞を前記被検体に投与する
ステップを含み、それにより前記被検体中に産生された免疫反応が、癌の発症または進行を十分に予防し、あるいは病原性微生物感染を十分に予防し、それにより感染性疾患を予防する方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１２産生またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制のための組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２５】
ＩＬ−１２産生または前記ＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生の抑制において使用される医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２６】
ＩＬ−１２またはＩＬ−１２ファミリーメンバーの産生を抑制する方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与する
ステップを含む方法。
【請求項２７】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項２８】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する医薬組成物であって、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２９】
制御性Ｔ細胞の活性化、増殖および／または産生を促進する方法であって、
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａの排泄／分泌（ＥＳ）成分もしくはその分画もしくは突然変異体またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの誘導体産物、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
炎症状態の予防および／または処置のための組成物であって、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む組成物。
【請求項３１】
炎症状態の予防および／または処置のための医薬組成物であって、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体とともに薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項３２】
炎症状態を調節する方法であって、
肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
認知機能障害の予防および／または処置の方法であって、このような治療を必要とする個体に、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
認知機能障害の処置のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体を含む薬剤の使用。
【請求項３５】
認知機能障害の処置のための医薬品の調製のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【請求項３６】
免疫介在性状態の処置のための医薬品の調製のための、肝吸虫ホモジネート（ＬＦＨ）もしくは誘導体産物またはそこから単離されたタンパク質もしくはペプチドの突然変異体、断片もしくは変異体の使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２８】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図３０】
【図３１】
【図３２−１】
【図３２−２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図１−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２８】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図３０】
【図３１】
【図３２−１】
【図３２−２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【公表番号】特表２００９−５１８３８７（Ｐ２００９−５１８３８７Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３９９６（Ｐ２００８−５４３９９６）
【出願日】平成１８年１２月５日（２００６．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００６／０００１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６３１３
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月５日（２００６．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００６／０００１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６３１３
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]