免疫増幅
【課題】血液などの臨床関連試料のための高度に感度のよい、ハイスループット免疫増幅アッセイを提供する。
【解決手段】このアッセイは、オリゴヌクレオチドに複合体形成している分析物特異的結合成分を含む２つの近接構成要素の使用を含む。分析物を結合させることにより、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部はアンプリコンを形成するのに十分に近くなる。次いで、アンプリコンの増幅および増幅した核酸の検出により、分析物の存在を検出する。本発明のアッセイの感度は、分析物と複合体化しない近接構成要素により誤ったまたは非特異的アンプリコンの形成を妨げることによって向上している。一実施形態では、互いにハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチド部に結合するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することにより、標的非依存性アンプリコンの形成を妨げる。捕捉された複合体が放出されるまでアンプリコンの形成を妨げる固相捕捉オリゴヌクレオチドを提供することにより、バックグラウンドはさらに減少している。
【解決手段】このアッセイは、オリゴヌクレオチドに複合体形成している分析物特異的結合成分を含む２つの近接構成要素の使用を含む。分析物を結合させることにより、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部はアンプリコンを形成するのに十分に近くなる。次いで、アンプリコンの増幅および増幅した核酸の検出により、分析物の存在を検出する。本発明のアッセイの感度は、分析物と複合体化しない近接構成要素により誤ったまたは非特異的アンプリコンの形成を妨げることによって向上している。一実施形態では、互いにハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチド部に結合するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することにより、標的非依存性アンプリコンの形成を妨げる。捕捉された複合体が放出されるまでアンプリコンの形成を妨げる固相捕捉オリゴヌクレオチドを提供することにより、バックグラウンドはさらに減少している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の分析物を検出および定量する超高感度、ハイスループットアッセイを提供するための、分析物特異的結合成分および核酸増幅の新規な適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
興味のある分析物を検出および定量する研究分野における主要目的は、血液、血清、血漿、尿またはその他の体液などの複雑な環境にあるごく少量の分析物を検出することが可能な、高度に特異的かつ感度のよいアッセイシステムを開発することである。診断上重要な分子は、体液のその他の成分と比較して極めて微量で構成または存在し得るので、許容できるアッセイ形態は、試料中の総生体材料の割合のごく少量に相当するであろう分析物を識別しなければならない。従来の手順では分析物特異的抗体を使用して必要な識別をしていたが、抗体はその他の非標的分析物との交差反応性により限定される。高い特異性を有する抗体であっても、低い親和性で抗体に結合する分析物が豊富な環境にその抗体がごく少量で存在すれば、わずかな交差反応性により、克服できない問題が引き起こされることがある。
【０００３】
免疫増幅は、免疫アッセイの感度を増大させる手段として使用されてきた。この手順では、増幅することができるＤＮＡマーカー分子に複合体形成している抗体と抗原を接触させる。検出可能に標識された抗−抗体で抗体−抗原複合体を標識するなどの従来の手順で抗体の存在を検出する代わりに、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）によるＤＮＡマーカーの増幅を介して、抗原−抗体−マーカー複合体を間接的に検出する。さらに、増幅したＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡに挿入すると蛍光を発する染料の使用などの従来の方法で検出してもよい。「免疫ＰＣＲ」として知られるこの方法は、検出に抗−抗体を使用する従来のアッセイと比較して、免疫アッセイの理論感度を１００００倍超増大させるのに使用されてきた。しかし、実際には抗体−核酸複合体の他の分析物への非特異的結合、または反応場所を提供するために使用している支持体表面への非特異的結合によって、免疫ＰＣＲの感度は制限されている。さらに、試料は、前回の反応の残りの増幅された標識（「アンプリコン」）によって汚染されることがある。これは、臨床的に許容されるハイスループットアッセイにこの技術を適用するには問題である。
【０００４】
これらの問題を解決する努力がいくつかなされてきた。例えば、研究者らは固定化された抗体を使用して抗体−核酸−抗原複合体を固体支持体に捕捉した。これはＤＮＡ増幅の前に、複合体化していない抗原および結合していない抗体−核酸複合体の除去を促進する。別の場合では、抗原の異なる決定基に特異的な２つの抗体は、抗原を結合させることによって近接させることができる。各抗体は、隣接する抗体−オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる一本鎖オリゴヌクレオチド部で修飾して二本鎖領域を形成する。オリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成は、同じ抗原に結合したときに２つの抗体が近接することによって促進される。次いで、ＤＮＡの二本鎖領域は、抗原の存在を示す検出可能なシグナルを生じさせる増幅の対象となる。この技術は、いずれかの抗体のみの非特異的結合ではアンプリコンを形成できるには不十分なため、検出の感度を高めるのに有利である。しかし、この方法の感度は、とりわけ、誤った抗原非依存性アンプリコンの形成につながる抗体部同士の非特異的相互作用によって限定される可能性がある。
【０００５】
したがって、本技術分野では、さらにより感度のよい分析物の検出方法および定量方法を提供することが引き続き必要とされている。臨床環境で有用な方法は、所望の分析物に対して極めて選択的であり、ハイスループットスクリーニング法に容易に適合することが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献４】米国特許第４９６５１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５２７０１８４号明細書
【特許文献６】米国特許第５６４８２１１号明細書
【特許文献７】米国特許第５７４４３１１号明細書
【特許文献８】米国特許第５１３０２３８号明細書
【特許文献９】米国特許第５４２７９３０号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８４９８７８号明細書
【特許文献１１】米国特許第５６６５５３９号明細書
【特許文献１２】米国特許第６５１１８０９号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００２／００６７７９号明細書
【特許文献１４】米国特許第５９２８８６９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５９１９６３０号明細書
【特許文献１６】米国特許第５９３５７９１号明細書
【特許文献１７】米国特許第６３１６２００号明細書
【特許文献１８】米国特許第６３７９８８８号明細書
【特許文献１９】米国特許第５８４０４８７号明細書
【特許文献２０】米国特許第５９１９６３０号明細書
【特許文献２１】米国特許第５８４６７２６号明細書
【特許文献２２】米国特許第６０５４７２９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５８６３７３６号明細書
【特許文献２４】米国特許第６０６６４５８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Walker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 392 (1992)
【非特許文献２】Walker et al., Nucl. Acids Res. 20: 1691 (1992)
【非特許文献３】Guatelli et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 1874-78 (1990)
【非特許文献４】Lizardi et al., Bio Technology 6: 1197 (1988)
【非特許文献５】Hirose et al., Clin. Chem. 44: 2446-2452 (1998)
【非特許文献６】Kwoh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 1173-77 (1989)
【非特許文献７】Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed., 2001)
【非特許文献８】Nadeau et al., "Real-time Sequence-specific Detection of Nucleic Acids during Strand Displacement Amplification," Anal. Biochem. 276: 177-187 (1999)
【非特許文献９】http://www.bioinfo.rpi.edu/application/mfold
【非特許文献１０】Zuker, Nucl. Acids. Res. 31: 3406-15 (2003)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ハイスループットアッセイに適した合理化された作業の流れを与える高感度、低バックグラウンドのアッセイを提供することによって、これらの要求を達成する。本発明のアッセイは、２つの「分析物特異的結合単位」、例えば抗体（「近接対」）の同じ分析物の異なるエピトープまたは近接している分析物のエピトープとの相互作用により分析物特異的アンプリコンを形成することによって分析物を検出および定量する。近接対の各構成要素（「近接構成要素」）は、一本鎖核酸、好ましくはＤＮＡ（「オリゴヌクレオチド部」または「プローブ」）に複合体形成している分析物特異的結合単位を含む。オリゴヌクレオチド部は、標的または分析物（本明細書を通じて「標的」と「分析物」は同義的に使用する）との相互作用により近接構成要素が密接に接触したときに、アンプリコンを直接的または間接的に形成する。近接構成要素と分析物との相互作用により、オリゴヌクレオチド部は密接に近接し、分析物と結合していない近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の濃度に比べ、その有効な局所濃度を高める。この濃度効果は、結合していない近接構成要素のオリゴヌクレオチド部に比べ、アンプリコンを形成する２つのオリゴヌクレオチド部の相互作用を大いに促進させる。次いで、近接対−分析物複合体を、当技術分野でよく知られているＤＮＡ増幅技術を使用してアンプリコンを増幅することにより検出する。したがって、他のオリゴヌクレオチド部と相互作用していないオリゴヌクレオチド部は増幅することが不可能であり、アンプリコンの形成は近接対−分析物複合体のオリゴヌクレオチド部の局所的濃度の増大によって大いに促進されるため、アンプリコンの形成は標的の存在に対して高感度である。
【０００９】
本発明のアッセイの感度は、分析物と複合体化していない溶液中の近接構成要素同士の誤った不要なアンプリコンの形成を妨げることにより向上するのに有利である。本発明は、１つには、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の一方または両方とハイブリッド形成する１つまたは複数のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド（または「ハイブリッド形成ブロッカー」）を提供することによって、この目的を達成する。ハイブリッド形成ブロッカーは、分析物と複合体化していない近接構成要素同士の溶液内でのアンプリコン形成を妨げるのに有利である。ハイブリッド形成ブロッカーを使用する方法は、少なくとも１つの近接構成要素のオリゴヌクレオチド部がハイブリッド形成ブロッカーとハイブリッド形成する反応混合物中の、第１および第２の近接構成要素と分析物を接触させることを含む。混合物を加温するか、イオン強度を低下させて十分にハイブリッド形成ブロッカーを解離させ、そして混合物を冷却するか、混合物のイオン強度を増大させて、分析物に結合した近接構成要素間にアンプリコンを形成させる。一実施形態では、分析物に結合した近接構成要素の大部分は、加温ステップの間、分析物に結合したままである。別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーを近接構成要素のオリゴヌクレオチド部にモル過剰で加える。さらに別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは「スプリントオリゴヌクレオチド」とハイブリッド形成して、スプリントオリゴヌクレオチドが近接構成要素のオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成できないようにする。さらなる実施形態では、「デブロッカーオリゴヌクレオチド」（または「デブロッカー」）とも呼ばれる相補配列とハイブリッド形成させることによってハイブリッド形成ブロッカーを近接構成要素のオリゴヌクレオチド部から除去する。すなわち、デブロッカーは過剰に加えた場合、ハイブリッド形成ブロッカーがオリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できないように、ハイブリッド形成ブロッカーを二重鎖にして隔絶する。したがって、デブロッカーは、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとその相補配列との間のハイブリッドの存在を減少させる。
【００１０】
ハイブリッド形成ブロッカーは、その末端の一方にヘアピンループを含んでいてもよく、このヘアピン構造はＤＮＡポリメラーゼの二本鎖「プライマー」として働く。本発明の便宜上、「プライマー」は、鋳型核酸の一本鎖とハイブリッド形成できるヌクレオチド、典型的にはＤＮＡの短い一続きと定義する。プライマーとその相補配列との間の二重鎖ハイブリッドは、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるプライマーの伸長のための、あるいはＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の合成のための開始部位を提供する。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長がハイブリッド形成ブロッカーをオリゴヌクレオチド部から鎖置換によって除去するように、ハイブリッド形成ブロッカーはヘアピン構造の下流領域でオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成してもよい。この実施形態は、オリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドから反応混合物を加温する必要なくハイブリッド形成ブロッカーを除去するのに有利であり、それにより分析物との近接構成要素の解離を回避または低減する。別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは、近接対−分析物複合体の形成後および近接対のオリゴヌクレオチド部が互いにハイブリッド形成した後に加えられる。ハイブリッド形成ブロッカーは、まだ溶液中にある少なくとも１つの近接構成要素のオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成し、それにより分析物と結合していない近接対によるアンプリコンの分析物非依存的な形成を妨げる。この実施形態でも、バックグラウンドシグナルを減少させるための反応混合物の加熱は必要ではない。ヘアピン構造を他の場所でも使用してもよい。例えば、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の一方または両方は、アンプリコンの形成をブロックするヘアピン構造を含んでいてもよい。ヘアピンのループ内またはヘアピンに隣接する不対塩基によるオリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成（あるいは穏やかな加熱）は、ヘアピン構造を分裂させ、それによりアンプリコンを形成および増幅させる。
【００１１】
バックグラウンドシグナルは、特異的な放出オリゴヌクレオチドが提供されるまでアンプリコンの形成を妨げるか、近接対／分析物複合体を捕捉して結合していない成分を除去する固相捕捉オリゴヌクレオチドを提供することによって、好都合にさらに減少させることができる。
【００１２】
さらなる利点は、抗体が結合できる任意の分析物を検出するのに利用できる一般的な試薬を使用することによって提供される。例えば、オリゴヌクレオチド部は抗Ｆｃ抗体またはプロテインＡもしくはＧとカップリングすることができ、これは抗体−分析物複合体の免疫グロブリン定常領域と反応する。一部の実施形態では、一方または両方の抗体は、アプタマー、受容体分析物に特異的なリガンド、またはリガンド分析物に特異的な受容体などの任意の適切な特異的検出物−標的単位と置き替えられる。一方または両方の抗体部分のこの置き換えにより、それがなければ抗体部分同士の非特異的相互作用から生じるかもしれない誤ったアンプリコンの形成が減少する。その他の適切な特異的分析物−標的単位としては、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の機能的断片、がある。抗原の結合と関係していない抗体構造のサイズが小さくなると、抗原又は分析物との特異的相互作用を減少させることなく、抗体同士の非特異的相互作用が減少すると考えられている。
【００１３】
本発明によって提供される利点により、血液およびその他の体液などの臨床関連試料中の分析物を検出および定量するのに使用することができるハイスルーアウトかつ極めて感度のよいアッセイが可能になる。本発明の方法によって検出および定量できる分析物は、複雑な混合物（例えば、体液）にかつてないほどごく少量で存在してもよい。一実施形態では、本発明を使用して、サイトカインなどの分析物約８０ｆｇ／ｍｌを検出している。これは、そのような低モル重量の分析物の少なくとも約１０ｆＭのモル濃度を検出する能力に換算される。
【００１４】
したがって、本発明は、標的分析物ばかりでなく本発明の方法を実施するのに有用な組成物を検出および／または定量する種々の方法を提供する。例えば、任意の適切な増幅方法を本発明の方法で使用してもよい。そのような方法には、これらだけに限定するものではないが、ＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」；非特許文献１；非特許文献２；およびその開示の全体が本明細書に組み込まれる特許文献５参照）、好熱性鎖置換増幅（「ｔＳＤＡ」；その開示の全体が本明細書に組み込まれる特許文献６および特許文献７参照）、自己保持配列複製（「３ＳＲ」；非特許文献３参照）、核酸配列に基づく増幅（「ＮＡＳＢＡ」；特許文献８参照）、Ｑβレプリカーゼシステム（非特許文献４参照）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」；特許文献９参照）、転写介在増幅（「ＴＭＡ」；非特許文献５）；および転写に基づく増幅（非特許文献６参照）がある。好ましい増幅方法はＳＤＡである。
【００１５】
アンプリコン自体は、近接対の隣接するオリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成を含む多くの方法で形成してもよい。例えば、隣接するオリゴヌクレオチド部はそれらの長さの全体または一部分にわたってハイブリッド形成してよい。隣接するオリゴヌクレオチドが各末端部分でハイブリッド形成する場合、得られた二重鎖はＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長し得る。増幅反応がＳＤＡ反応を含む場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部またはそれらの伸長産物の一方または両方に組み込まれてもよい。
【００１６】
また、アンプリコンは、近接対のオリゴヌクレオチド部を、オリゴヌクレオチド部の各末端とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド「スプリント」と接触させることによって形成してもよい。オリゴヌクレオチドスプリントは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、第１のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第１の配列をさらに含んでもよい。さらに、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、第２のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第２の配列を含んでもよい。スプリントは、第１および第２のプローブを加えるステップと、オリゴヌクレオチド部と相補的な配列をＤＮＡポリメラーゼで伸長するステップとを含む方法で使用してもよい。第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は置換され、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部との複合体形成を介して第１の近接構成要素に付いたアンプリコンが残る。本発明の便宜上、増幅されていない置換されたオリゴヌクレオチド部を「テザー（ｔｅｔｈｅｒ）オリゴヌクレオチド」と呼ぶ。本発明の便宜上、「置換」は、鎖の置換、又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより触媒作用を受けた置換された鎖の加水分解などの方法により達成されてもよい。さらに、この方法は、ＳＤＡなどの任意のよく知られた増幅方法でアンプリコンを増幅するステップを含んでもよい。
【００１７】
別の実施形態では、アンプリコンは近接対と分析物との複合体から放出されるのに有利であり、これにより、アッセイ支持体表面に吸着された抗体−オリゴヌクレオチド複合体からシグナルを除去することによりバックグラウンドを減少させる。この実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドスプリントを使用してアンプリコンを形成し、近接構成要素の両方のオリゴヌクレオチド部はテザーオリゴヌクレオチドである。第１の橋かけプローブは第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端とハイブリッド形成し、第２の橋かけプローブは第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端とハイブリッド形成する。第１および第２の橋かけプローブは、それぞれの各３’末端で互いにハイブリッド形成する。ポリメラーゼで伸長すると、第１および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は置換され、近接対−分析物複合体の残りの成分からアンプリコンが放出される。次いで、任意のよく知られた増幅方法によってこのアンプリコンを増幅する。
【００１８】
別の実施形態では、近接対−分析物複合体を固体支持体に固定する。アンプリコンを上記の方法を使用して複合体から溶液へ放出し、一方、近接対−分析物の残りの成分は固体支持体に結合したままである。この実施形態では、アンプリコンを含む溶液は、増幅の前に複合体の残りの成分から完全に除去することができ、これによりバックグラウンドをさらに減少させる。
【００１９】
上記に従い２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用することによって、標的を介在したプローブサイクル方法が可能になる。この方法は、近接対を第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、オリゴヌクレオチド部の相補体をＤＮＡポリメラーゼで伸長して、アンプリコンを近接対から置換するステップと、アンプリコンを増幅するステップと、近接対を追加の第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドと接触させるステップとを含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端と任意選択的にハイブリッド形成してもよい。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端と場合によってハイブリッド形成することができる。この両方のスプリントオリゴヌクレオチドは、第１と第２のスプリントオリゴヌクレオチドの間に架橋を形成する第３のスプリントオリゴヌクレオチドの相補配列と任意選択的にハイブリッド形成してもよい。
【００２０】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドスプリントは、オリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成せず、且つ第１のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第１の配列の上流である、すなわち５’方向に位置するプローブの領域に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含んでもよい。さらに、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、第２のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第２の配列を含んでもよい。スプリントは、第１および第２のプローブを加えるステップと、オリゴヌクレオチド部と相補的な配列をＤＮＡポリメラーゼで伸長するステップとを含む方法で使用してもよい。第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は伸長した鎖で置換されて、これまでのところ無傷の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を含み、第１の近接構成要素に付いたアンプリコンを残す。さらに、この方法は、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位をＲＮＡポリメラーゼと接触させることによって一本鎖ＲＮＡを転写するステップを含む。ＲＮＡは、標識プローブとのハイブリッド形成を含む当技術分野でよく知られた手段により検出してもよい。鎖置換に加えて、第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して除去してもよい。
【００２１】
あるいは、一本鎖ＲＮＡ転写物を、ＲＮＡとその３’領域でハイブリッド形成するプライマーと接触させて、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成する逆転写酵素によりＲＮＡを転写することができる。このＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化すると、相補ＤＮＡ鎖が得られる。このＤＮＡ鎖を、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位に対する相補体を含むプライマーと接触させると、無傷の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位が再生する。ＤＮＡ鎖を、一本鎖ＲＮＡ転写物の合成を触媒するＲＮＡポリメラーゼと接触させる。転写物をプライマーと接触させるステップ、プライマー−転写物ハイブリッドを逆転写酵素と接触させるステップ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを消化するステップ、および得られる一本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を再構成するプライマーと接触させるステップを繰り返して、アンプリコンを指数関数的に増幅することができる。
【００２２】
本発明の増幅方法は、「均一な形態」の溶液で行ってもよく、または「不均一な形態」中で反応の成分を固体支持体に固定することを含んでもよい。不均一な形態を使用する増幅の方法では、近接構成要素、分析物、または近接構成要素もしくは近接対と分析物との複合体は、粒子または反応容器の表面などの固体支持体に固定される。この目的のため、近接構成要素または分析物は、支持体に複合体形成しているオリゴヌクレオチド（「捕捉オリゴヌクレオチド」）と相補的なオリゴヌクレオチド部を含む。近接構成要素または分析物のオリゴヌクレオチド部と捕捉オリゴヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。捕捉された近接構成要素または分析物は、適切な制限エンドヌクレアーゼと認識部位を接触させるステップを含む方法で固体支持体から放出される。あるいは、結合した近接構成要素または分析物を放出する方法は、温度を上昇させるか、イオン強度を低下させるか、反応混合物のｐＨを変更するか、ハイブリッドの変性を促進するキレート剤を加えるような手段によって、捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素または分析物のオリゴヌクレオチド部とのハイブリッドを変性するステップを含む。さらに別の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば物理的、酵素的、化学的または光化学的手段による開裂を特に受け易い、切れ易い連結を含む。さらなる実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドまたは近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物は、プライマーと相補的な配列を含む。プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物との間に形成したハイブリッドとハイブリッド形成できる。次いで、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物は、ポリメラーゼ連鎖伸長および鎖置換によってハイブリッドから置換されてもよい。関連の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドはポリメラーゼ伸長の鋳型を形成するヘアピン構造を形成でき、捕捉された近接構成要素または分析物を鎖置換により放出させる。
【００２３】
捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物との間のハイブリッドは、任意選択的にＲＮＡ配列を含んでもよい。近接構成要素または分析物は、ハイブリッドをＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼと接触させることにより表面から放出される。一実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、アンプリコンの形成に関与するオリゴヌクレオチド部である。このオリゴヌクレオチド部は捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している限りアンプリコンを形成できないが、例えば鎖置換によりハイブリッドからオリゴヌクレオチド部が放出されるとアンプリコンを形成できる。
【００２４】
不均一な形態を使用する増幅は、分析物を反応混合物中の第１の近接構成要素と接触させるステップと、固体支持体に固定された、又はアンプリコンを含む近接対−分析物複合体を形成するのに十分な条件下で固体支持体に固定されうる第２の近接構成要素を加えるステップと、結合した近接対−分析物複合体を洗浄して固体支持体に固定されていない近接構成要素を除去するステップと、アンプリコンを増幅するステップと、増幅産物を検出するステップとを含んでもよい。第２の近接構成要素を、第１の近接構成要素を加える前、後またはそれと同時に加えてもよい。第２の近接構成要素は、任意選択的に、洗浄後だが増幅前に開裂する切れ易い連結によって固体支持体に固定してもよい。上記の近接構成要素を固体支持体に固定し、近接構成要素を上記の固体支持体から開裂する方法を使用してもよい。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドを加えるステップを含む方法など、上記のアンプリコンを形成する方法のいずれかを不均一な形態で使用することができる。
【００２５】
本発明は、上記の増幅方法のいずれでも使用できる一般的な成分を提供するのに有利である。好ましい実施形態では、分析物を、第１のエピトープと結合する第１の抗体および第２のエピトープと結合する第２の抗体と接触させる。ここで、第１および第２のエピトープおよび抗体は同じでも異なってもよい。第１および第２の抗体はそれぞれ、異なるハプテン部（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、トリニトロフェノール、ジニトロフェノールなど）で任意選択的に標識されてもよい。抗体は、第１および／または第２の抗体と特異的に結合してアンプリコンを含む近接対を形成する１つまたは複数の近接構成要素を含む一般的な成分と接触させる。一般的な成分は、例えばオリゴヌクレオチド部に複合体形成したプロテインＡまたはプロテインＧでもよい。あるいは、一般的な成分は、オリゴヌクレオチドに複合体形成している抗免疫グロブリン定常領域の抗体であってもよい。第１および第２の抗体がハプテン部で標識されていれば、一般的な成分は特定のハプテン標識に特異的な抗体（またはストレプトアビジンなどのその他の作用物質）でもよい。一般的な成分を使用することは、各分析物に特異的な分析物結合単位をオリゴヌクレオチド部で修飾する必要性をなくすのに有利である。
【００２６】
近接構成要素は、２つの異なるオリゴヌクレオチド部に複合体形成している抗原でもよい。この実施形態の分析物は、ＩｇＧまたは任意のその他のタイプの抗体でもよい抗原特異的抗体である。結合した抗原−オリゴヌクレオチド複合体が異なるオリゴヌクレオチド部を含む場合、抗体による抗原−オリゴヌクレオチド複合体の結合により、アンプリコンを含み得る近接対が形成される。したがって、この方法を使用して、特定の抗体の存在を高感度で検出することができる。
【００２７】
また、本発明は、緩衝液、化学試薬、酵素、オリゴヌクレオチド、近接構成要素などの本発明の方法を実施するのに有用な個々のまたは組み合わせた成分および試薬、ならびにこれらの成分または試薬を使用するための指示書を含むことができるキットを提供する。例えば、このキットは本明細書に記載の増幅方法および検出方法を実施するのに適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含んでいてもよい。さらにキットは、放射標識、酵素基質、抗体などの増幅した核酸を検出するための試薬および溶液を含んでもよい。適切な溶液および試薬はよく知られており、例えば非特許文献７に記載されている。キットの構成品は、一般的な容器に一緒にパッケージされており、通常、本明細書で開示の方法の実施形態を実施するための指示書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】抗原とオリゴヌクレオチドに複合体形成している抗体との混合を示す図である。
【図１Ｂ】隣接するプローブのハイブリッド形成を示す図である。
【図１Ｃ】ポリメラーゼ伸長および制限酵素ニック形成を示す図である。
【図１Ｄ】伸長、置換および線形増幅を示す図である。
【図１Ｅ】ハイブリッド形成、ポリメラーゼ伸長、ニック形成および指数関数的増幅を示す図である。
【図１Ｆ】抗原とオリゴヌクレオチドに複合体形成している抗体との混合を示す図である。
【図１Ｇ】隣接するプローブのハイブリッド形成を示す図である。
【図１Ｈ】プローブのポリメラーゼによる伸長を示す図である。
【図１Ｉ】プローブ伸長二重鎖の変性およびＳＤＡプライマーの結合を示す図である。
【図１Ｊ】反対の配列方向のハイブリッド形成したプローブからのアンプリコン形成を示す図である。
【図２Ａ】スプリントオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を示す図である。
【図２Ｂ】隣接するプローブの連結を示す図である。
【図２Ｃ】ＤＮＡポリメラーゼ伸長および置換を示す図である。
【図２Ｄ】第３のプローブを連結するための２つのハイブリッド形成した近接プローブの使用を示す図である。
【図２Ｅ】第３のプローブを連結するための反対の配列方向の２つのハイブリッド形成した近接プローブの使用を示す図である。
【図３Ａ】一本鎖テザープローブを示す図である。
【図３Ｂ】一本鎖テザープローブの伸長および置換を示す図である。
【図３Ｃ】ニック形成、伸長、置換および捕捉を示す図である。
【図３Ｄ】ニック形成、伸長、置換および捕捉を示す図である。
【図３Ｅ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｆ】スプリントオリゴヌクレオチドの伸長／置換を示す図である。
【図３Ｇ】標的介在プローブサイクルを示す図である。
【図３Ｈ】５’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｉ】５’／５’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｊ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｋ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｌ】スプリントオリゴヌクレオチドの捕捉された複合体からの置換を示す図である。
【図４Ａ】単純な競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｂ】陥入型競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｃ】無能力化ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｄ】置換可能なハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｅ】自己置換型ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４ＥＥ】プローブ−ブロッカー二重鎖を安定化するための３’プローブ末端の使用を示す図である。
【図４Ｆ】二元免疫ＳＤＡ反応での競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｇ】二元免疫ＳＤＡ反応での無能力化ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｈ】二元免疫ＳＤＡ反応での段階的ブロッキングを示す図である。
【図４Ｉ】二元免疫ＳＤＡ反応でのハイブリッド形成ブロッカーの結合後の添加を示す図である。
【図５Ａ】スプリントオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を示す図である。
【図５Ｂ】伸長および置換を示す図である。
【図５Ｃ】ＲＮＡポリメラーゼ活性、ハイブリッド形成および伸長を示す図である。
【図５Ｄ】ＲＮアーゼＨ活性、ハイブリッド形成および伸長を示す図である。
【図６Ａ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｂ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｃ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｄ】ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｅ】ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｆ】物理的放出を示す図である。
【図６Ｇ】切れやすい連結および化学的開裂を示す図である。
【図６ＧＧ】切れやすい連結および化学的開裂を示す図である。
【図６Ｈ】オリゴヌクレオチド置換を示す図である。
【図６Ｉ】オリゴヌクレオチド伸長を示す図である。
【図６Ｊ】オリゴヌクレオチド伸長を示す図である。
【図６Ｋ】ＲＮアーゼＨ放出を示す図である。
【図６Ｌ】ＲＮアーゼＨ放出を示す図である。
【図６Ｍ】自己プライミング捕捉／置換オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図６Ｎ】置換されたプローブ部のアンプリコン形成への関与を示す図である。
【図７Ａ】第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成による第１の近接構成要素の固定化を示す図である。
【図７Ｂ】固定化された第１の近接構成要素への標的分析物の結合を示す図である。
【図７Ｃ】標的分析物と第１の近接構成要素との間の固定化複合体への第２の近接構成要素の結合による固定化された２部位の「サンドイッチ」の形成を示す図である。
【図７Ｄ】標的非依存性アンプリコンが形成するメカニズムを示す図である。
【図７Ｅ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｆ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｇ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｈ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｉ】低イオン強度を使用する、標的分析物と２つの近接構成要素との間の固定化された複合体の放出を示す図である。
【図７Ｊ】捕捉オリゴヌクレオチドの使用および不均一なアッセイ形態への放出を示す図である。
【図８Ａ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｂ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｃ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｄ】切れやすい連結による不均一な免疫増幅を示す図である。
【図９】スプリントオリゴヌクレオチドによる不均一な免疫増幅を示す図である。
【図１０】一般的な免疫増幅システムを示す図である。
【図１１Ａ】ヘアピン放出プローブを示す図である。
【図１１Ｂ】ヘアピンハイブリッド形成ブロッカープローブを示す図である。
【図１１Ｃ】ヘアピンハイブリッド形成ブロッカープローブの置換を示す図である。
【図１２】抗原特異的免疫グロブリンの検出を示す図である。
【図１３】二元免疫ＳＤＡ用の代表的なプローブ、プライマーおよびテザーオリゴヌクレオチドの地図を表す図である。
【図１４Ａ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着したが、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｂ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着したが、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｃ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｄ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｅ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１５Ａ】ＩＬ−８の免疫ＳＤＡ検出のための２色のリアルタイム蛍光プロファイルを示す図である。
【図１５Ｂ】ＩＬ−８の定量のための検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明により、ごく少量の分析物を高い感度で検出することができる。本発明は、アンプリコンを形成できるオリゴヌクレオチド部に複合体形成した、抗体などの分析物特異的結合因子の複合体を提供する。抗体とオリゴヌクレオチドを有するその他のタンパク質との間の複合体形成は、当技術分野で知られており、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献１０および特許文献１１で教示されている。分析物特異的結合因子が核酸、例えばアプタマーである場合、分析物特異的結合因子及びオリゴヌクレオチド部またはプローブ部は、１つの隣接した鎖内において、当技術分野で知られた化学合成方法を使用して合成され得る。さらに、用語「複合体形成（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、そのようなアプタマー−プローブ単位にも適用される。抗体にそれぞれ複合体形成しているオリゴヌクレオチドを結びつけることによりアンプリコンを構築する条件も知られており、例えば特許文献１２で教示されている。アンプリコンを増幅するための、およびそれらの存在を検出するための条件および方法論も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１２および特許文献１３で教示されているように当技術分野で知られている。また、増幅産物を検出するために標識プローブを使用することも、例えば特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８で教示されており、それらすべての全体は参照により本明細書に組み込まれる。特許文献１９は、恒温核酸増幅反応での内部対照の使用を教示しており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本発明によれば、ＳＤＡによる好ましい増幅方法は図１で詳述する。Ａｂ１およびＡｂ２はそれぞれ、隣接するエピトープ１および２を認識し、オリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２に複合体形成している抗体である（図１Ａ）。抗体は、この例に限定するわけではないが、本発明で有用な分析物特異的結合成分の代表的なものである。例えば、当技術分野で知られている有用な分析物特異的結合成分には、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の機能的断片が含まれる。分析物特的結合成分のその他の例は、アプタマー、受容体分析物に特異的なリガンド、またはリガンド分析物に特異的な受容体を含む。さらに、種々の異なるタイプの分析物特異的結合成分を組み合わせて使用してもよいことを当業者は理解するであろう。「オリゴヌクレオチドプローブ」および「オリゴヌクレオチド部」は本発明の便宜上、同義的に使用する。用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の便宜上、核酸部のサイズの上限を設けるものと理解するべきではない。したがって、本明細書の使用では「オリゴヌクレオチド」は「ポリヌクレオチド」と同義である。本発明の便宜上、オリゴヌクレオチドは、全体的または部分的にＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体もしくは誘導体で構成されていてもよい。この実施形態では、Ｐ１およびＰ２は、相補的な３’末端配列および上流のＳＤＡニック部位を含む。ＳＤＡのためのニック部位の使用および一般的なＳＤＡの条件は、特許文献１５、特許文献２０および特許文献２１に記載されており、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。Ｐ１とＰ２の３’末端は、連結されている２つの抗体がそれらの各エピトープに結合することにより近くに近接して保持されている場合に、互いにハイブリッド形成する（図１Ｂ）。核酸のハイブリッド形成した部分の塩基対またはミスマッチの数ならびにハイブリッド形成が生じる緩衝液の温度およびイオン強度を含む、核酸ハイブリッド形成につながる条件は、当技術分野でよく知られており、例えば非特許文献７で概説されている。Ａｂ１およびＡｂ２のバルク溶液濃度は、Ｐ１とＰ２の抗原非依存性ハイブリッド形成が最少になるように、抗原の表面の濃度と比較して相対的に低い。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰ１：Ｐ２ハイブリッドの陥入した３’末端を平滑化する（図１Ｃ）。これは、ＳＤＡニック形成酵素が認識する二本鎖制限部位の生成に役立つ。ニック形成酵素は二本鎖ＤＮＡ鋳型の一本鎖のみの開裂を触媒する。ニック形成およびニックの部位からのポリメラーゼ伸長は下流のＤＮＡ鎖を溶液に置換し、ニック部位を再生する（図１Ｄ）。ニック形成および伸長／置換ステップの繰返しサイクルを使用して、置換された鎖の多数のコピーを産生することができる。置換された鎖は相補的なＳＤＡプライマーによって捕捉される（図１Ｅ）。捕捉した鎖およびハイブリッド形成したＳＤＡプライマーの３’末端からの伸長により、一連の中間体を経て指数関数的に増幅できる二本鎖ＤＮＡ分子を産生される。代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２の一方のみがＳＤＡニック部位を含む。
【００３１】
別の実施形態（図１Ｆ〜Ｉ）では、プローブＰ１およびＰ２はＳＤＡニック部位を欠くが、代わりに配列ｃおよびｄ’を含み、これはそれぞれＳＤＡプライマーＳＰ２およびＳＰ１にも存在する（図１Ｉ参照）。Ｐ１およびＰ２の３’末端を伸長することにより、Ｐ１の伸長産物に相補配列ｄとＰ２の伸長産物に相補配列ｃ’とを含有する二重鎖を作製する（図１Ｈ参照）。次いで、例えば加熱により二重鎖伸長産物の鎖を分けると、ＳＤＡプライマーＳＰ１およびＳＰ２は、伸長したプローブの新たに合成された配列ｄおよびｃ’の相補体とハイブリッド形成する。伸長したプローブは、伸長したＰ１の配列ｅおよび伸長したＰ２の配列ｂ’として示した、ＳＤＡプライマーの結合性部位の３’側に位置する配列を任意選択的に含んでもよい。これらの配列はバンパープライマーＳＢ１およびＳＢ２とハイブリッド形成する（図１Ｉ参照）。ＳＤＡの間、ＳＤＡプライマーＳＰ１およびＳＰ２はポリメラーゼによって伸長される（図示せず）。もし存在するならば、バンパープライマーの伸長によりＳＤＡプライマー伸長産物をプローブ鎖から置換され、次いで置換された鎖は、特許文献５、特許文献１５、特許文献２０および特許文献２１で記載されたように、ＳＤＡで増幅される。もし伸長したプローブがＳＰ１およびＳＰ２結合性部位に対して配列３’を含有しない場合（図示せず）は、ＳＤＡプライマーとハイブリッド形成するプローブの３’末端はポリメラーゼによって伸長されて、その後のニック形成および上記のＳＤＡによる鎖置換を可能にするニック形成可能な制限部位を作製する。
【００３２】
前述の実施形態では、オリゴヌクレオチド部（Ｐ１およびＰ２）は、それらの５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介してそれらの各分析物結合単位（Ａｂ１およびＡｂ２）に複合体形成していた。図１Ｊで説明した代替的な実施形態では、複合体形成Ａｂ１−Ｐ１はＰ１の３’末端または３’末端の近くに位置する連結を介して形成され、一方、複合体形成Ａｂ２−Ｐ２はＰ２の５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介して形成される。Ｐ１は配列（ａｂｃｄｅｆ）（５’側から３’側に読む）を含み、Ｐ２は配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’）（５’側から３’側に読む）を含む。さらに、Ａｂ２−Ｐ２は、伸長可能な３’末端（すなわち３’末端ヒドロキシル基）を含む。示した通り、Ｐ２の配列（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成することが可能なＰ１の配列（ｅｆ）は、Ｐ１がＡｂ１に複合体形成する部位の５’に位置し、一方、（ｆ’ｅ’）はＰ２がＡｂ２に複合体形成する部位の３’に位置する。したがって、プローブＰ１およびＰ２は、反対の配列方向のそれらの各分析物結合単位（Ａｂ１またはＡｂ２）と連結するといえる。Ｐ１とＰ２が、例えばそれらの各近接構成要素の同じ標的分析物分子への結合を介して、近くに近接している場合、Ｐ１の配列（ｅｆ）は、図１Ｊの左側で示した通り、Ｐ２の（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成する。次いでポリメラーゼを使用してＰ２の３’末端を伸長して、示した通り、新たな配列を含有する伸長産物（すなわち、アンプリコン）Ｐ２−ｅｘｔを作製することができる。次いで、当技術分野で知られた方法により新たな配列（ｄ’ｃ’ｂ’ａ’）の全体または部分を使用してＰ２−ｅｘｔを検出して、Ｐ２−ｅｘｔを変換されていないＰ２と区別することができる。例えば、Ｐ２−ｅｘｔは、上記の核酸増幅法で増幅してもよい。溶液を加熱することによってＰ２−ｅｘｔをＰ１から分離することができ、プライマーはＰ２−ｅｘｔの３’末端で新たな配列とハイブリッド形成し、伸長してＰ２−ｅｓｔの相補体を作製することができる。増幅の次の期間は、Ｐ２−ｅｘｔからの相補体の分離およびＰ２の５’末端の近くに位置する配列から構成される異なるプライマーを相補体にハイブリッド形成することを含む。好ましい実施形態では、配列ｂは、ＳＤＡ適合性制限酵素の認識配列の一本鎖成分を含有する。次いで、Ｐ２−ｅｘｔを形成することにより、制限酵素により切断される二本鎖認識配列を作製する。ニックからの伸長により、Ｐ２−ｅｘｔと相補的な新たな鎖を作製し、ニック形成可能な認識配列を再生する。この産物を、前述したＳＤＡ法により増幅し、検出してもよい。任意選択的に、Ｐ２の配列ｉ’はまた、ＳＤＡのための認識配列の一本鎖成分を含んでもよく、そうであるならば、Ｐ２−ｅｘｔとその完全長相補鎖との間に形成した二重鎖は、２つのニック形成可能な制限酵素認識配列を含有する。別の実施形態では、配列ｂはＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位の一本鎖成分であってもよい。次いでＰ２−ｅｘｔを形成することにより、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを作製し、これを使用してＲＮＡポリメラーゼの活性を、Ｐ２−ｅｘｔの配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’ｄ’ｃ’）と相補的なＲＮＡ分子を合成するように方向づける。これらのＲＮＡ分子は直接検出してもよく、あるいは３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡまたは転写に基づく増幅などの方法でさらに増幅してもよい。任意選択的に、Ｐ２の配列ｉ’はＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一本鎖成分を含んでもよい。この場合、Ｐ２−ｅｘｔの３’末端とハイブリッド形成したプライマーを伸長することにより、ＲＮＡポリメラーゼの活性を、直接検出することができ、または上記の方法を使用して増幅することができる配列（ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’ｄ’ｃ’ｂ’ａ’）を含むＲＮＡ分子を合成するように方向づけるのに使用できる二本鎖プロモーター部位を作製する。Ｐ２−ｅｘｔの検出または増幅の方法にかかわらず、図１Ｊで示した実施形態は、反対の配列方向のそれらの各分析物結合要素Ａｂ１またはＡｂ２と連結するプローブ部Ｐ１およびＰ２を含み、この２つのプローブは標的介在プロセスで互いにハイブリッド形成して、後で伸長してアンプリコンを作製する伸長可能な３’末端を有する二重鎖を作製する。標的分析物が存在しない場合、Ｐ１とＰ２は近くに近接せず、以下で言及する誤った（すなわち、標的非依存性の）相互作用による以外は、Ｐ２−ｅｘｔは形成しない。この誤った相互作用は、これも以下で記載するハイブリッド形成ブロッキングオリゴヌクレオチドによって抑制することができる。したがって、Ｐ２−ｅｘｔは標的分析物の存在の結果として、かつ存在する標的分析物の量に比例して産生される。したがって、産生したＰ２−ｅｘｔの量の判定を使用することによって、試料に存在する標的分析物の量を定量することができる。
【００３３】
図２Ａ〜Ｃは、スプリントオリゴヌクレオチドの代表的な使用を詳述する。Ａｂ１およびＡｂ２は隣接するエピトープ１および２を認識する抗体であり、それぞれオリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２に複合体形成している（図２Ａ）。Ｐ１はＡｂ１にその５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介して複合体形成しており、３’末端ヒドロキシル基および上流のＳＤＡニック部位を含む。プローブＰ２はＡｂ１にその３’末端で複合体形成しており、ＳＤＡプライマー結合性部位および５’末端ホスフェート基を含む。スプリントオリゴヌクレオチドＳの配列は、抗体がそれらの各エピトープに結合することにより近くに近接している場合に、オリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２がスプリントＳと二本鎖ハイブリッドを形成するように、プローブＰ１の３’末端およびプローブＰ２の５’末端と相補的である。スプリントオリゴヌクレオチドＳとハイブリッド形成した場合、Ｐ１の３’−ＯＨとＰ２の５’−ＰＯ４は隣接し、ＤＮＡリガーゼを使用してＰ１とＰ２の配列を連結するリン酸ジエステル結合の形成を触媒する（図２Ｂ）。ＳＤＡプライマーＳＰ１はスプリントオリゴヌクレオチドＳの上流のプローブＰ２とハイブリッド形成する。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーＳＰ１の３’末端およびスプリントオリゴヌクレオチドＳの３’末端から伸長する。プライマーＳＰ１の伸長はスプリントオリゴヌクレオチドＳの伸長産物を置換し（図２Ｃ）、ＳＤＡ制限酵素ニック部位をいずれかの末端に有する二本鎖ＤＮＡ分子を作製する。この分子は図１Ｃで示したものと類似している。ニック形成、ニックからのポリメラーゼ伸長および下流の鎖の置換は、指数関数的増幅につながる（図１Ｄ〜Ｅ）。一実施形態では、プローブＰ１はＳＤＡニック部位を含まない。別の実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドＳは、スプリントＳの３’伸長を妨げる３’キャップを含む。
【００３４】
図２Ｄおよび２Ｅは、近接構成要素の対を使用する、標的介在性で且つリガーゼで触媒されたアンプリコン形成の代替的な実施形態を説明する。プローブＰ１およびＰ２はそれらの各抗体（またはその他の分析物結合単位）Ａｂ１およびＡｂ２に連結されるか、複合体形成される。複合体形成は、図２Ｄで示した通り、両方のプローブの５’末端または５’末端の近くの連結を介して生じてもよく、あるいは２つのプローブ（Ｐ１）の一方は、プローブの３’末端または３’末端の近くに位置する連結を介して複合体形成してもよい。Ｐ１は配列（ａｂｃｄｅｆ）（５’側から３’側に読む）を含み、Ｐ２は配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’）を含む（５’側から３’側に読む）。複合体Ａｂ２−Ｐ２は３’末端ヒドロキシル基をさらに含む。図２Ｄまたは２Ｅのいずれかで示された構造では、Ｐ１の配列（ｅｆ）およびＰ２の（ｆ’ｅ’）は互いにハイブリッド形成することが可能である。第３のプローブＰ３は配列（ｄ’ｃ’ｂ’ｘ’ｙ’）を含み、さらに５’末端ホスフェート基を含む。Ｐ３はプローブＰ１の配列（ｂｃｄ）（Ｐ１の配列（ｅｆ）に隣接）とハイブリッド形成することが可能である。標的分析物の存在下では、Ｐ１とＰ２は近くに近接し、配列（ｅｆ）と（ｆ’ｅ’）とのハイブリッド形成により二重鎖を形成する。示した通り、プローブＰ３は、Ｐ１とＰ２とのハイブリッド形成の前または後のいずれかに、Ｐ１とハイブリッド形成してもよい。いずれの場合も、Ｐ３の５’ヌクレオチドはＰ２の３’ヌクレオチドに隣接して位置し、この構造では、Ｐ２とＰ３はＤＮＡリガーゼ（またはその他の連結メカニズム）で共有結合して、示した通り、アンプリコンＰ２：Ｐ３を形成することができる。次いで、Ｐ２：Ｐ３は、図１Ｊで示した実施形態について上記したものなどの増幅を含む種々の方法によって検出することができる。しかし、この場合、配列ｘ’および／またはｙ’は、プライマーハイブリッド形成のための部位として使用することとなる。標的分析物が不在の場合、Ｐ１とＰ２は近くに近接せず、以下で言及するＰ１とＰ２との間の誤った（すなわち、標的非依存性の）相互作用による以外は、Ｐ２：Ｐ３は形成しない。この誤った相互作用は、これも以下で記載するハイブリッド形成ブロッキングオリゴヌクレオチドによって抑制することができる。したがって、Ｐ２：Ｐ３は標的分析物の存在の結果として、かつ存在する標的分析物の量に比例して産生される。したがって、産生されたＰ２：Ｐ３の量の定量を使用して、試料に存在する標的分析物の量を定量することができる。近接構成要素のオリゴヌクレオチド部を連結することによって形成されたアンプリコンの増幅中、ハイブリッド形成ブロッカーは不要である。なぜなら、連結によってつなぐことができるプローブは通常互いにハイブリッドを形成せず、したがって、オリゴヌクレオチドの３’伸長を含む増幅中、誤ったプローブ変換をする可能性がないからである。
【００３５】
図３は、近接構成要素の２つのオリゴヌクレオチド部間のギャップを架橋するように設計されたスプリントオリゴヌクレオチドを含む本発明の代表的な実施形態を示す。一実施形態（図３Ａ）では、近接抗体Ａｂ１の１つはテザーオリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端の近くの連結を介して複合体形成している。今後、「テザーオリゴヌクレオチド」は、アンプリコンから置換されるが、分析物特異的結合性部に複合体形成したままであるオリゴヌクレオチド部を指す。テザーオリゴヌクレオチドＴＯは、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１のセグメント（好ましくは５’末端または５’末端の近くにある）と相補的である。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１は、変換されたプローブの増幅を促進するプライマー配列および変換されたプローブの検出を促進する検出領域を含んでもよい。また、Ｐ１は、ＳＤＡによる増幅を促進する制限認識配列を含んでもよい。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドの３’配列は、その５’末端を介して抗体Ａｂ２に複合体形成しているプローブＰ２の３’末端と相補的である。図３Ａで示した通り、Ｐ１の５’末端は、Ａｂ１に付いたテザーオリゴヌクレオチドＴＯと相補的である。任意選択的に、テザーオリゴヌクレオチドはＰ１の５’末端上ではない配列と相補的であってもよい。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合している場合、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１はＴＯおよびＰ２の両方とハイブリッド形成することができる（図３Ａ）。プローブＰ２およびスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端からの伸長はテザーオリゴヌクレオチドＴＯを置換し、抗体Ａｂ２と連結した二本鎖ＤＮＡ分子を作製する（図３Ｂ）。この二本鎖産物をニック形成し、ポリメラーゼで伸長し、下流の鎖を置換することにより、相補的なＳＤＡプライマーとハイブリッドを形成し得る一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる（図３Ｃ）。これは、一連の中間ニック形成、伸長、置換およびプライミング事象を介する指数関数的増幅につながる（図３Ｄ）。
【００３６】
図３Ｅは抗体間のギャップを架橋する第２の実施形態を示す。この構造では、各抗体（Ａｂ１およびＡｂ２）は、異なるテザーオリゴヌクレオチド、Ａｂ１はａ’、Ａｂ２はｊに複合体形成している。通常、抗体Ａｂ１のテザーオリゴヌクレオチドは第２の抗体Ａｂ２のテザーオリゴヌクレオチドとは異なる。この場合、ａ’およびｊは配列において等価ではない。スプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２はそれぞれ、オリゴヌクレオチド配列ａ’およびｊと相補的な配列（場合により５’末端の近く）を含有する。例えば、Ｐ１は配列ａを含有し、Ｐ２は配列ｊ’を含有する。プローブＰ１の配列ａはＡｂ１の配列ａ’とハイブリッド形成し、Ａｂ２の配列ｊはＰ２の配列ｊ’とハイブリッド形成する。この実施形態では、Ｐ１およびＰ２はそれぞれ、他方のプローブと相補的な短い３’配列を含有し、したがってＰ１の配列（ｅｆ）はＰ２の（ｆ’ｅ’）と相補的である。Ｐ１およびＰ２のこれらの相補的な３’配列の明らかなハイブリッド形成は、プローブＰ１とＰ２が、近接したエピトープに結合した抗体のテザーオリゴヌクレオチド（ａ’およびｊ）とハイブリッド形成した結果、空間的に近接した場合のみに高い効率で生じる。Ｐ１とＰ２の３’末端のハイブリッド形成により、陥入した３’末端を有する短い二重鎖が生じ、次いでこれをポリメラーゼで伸長することができる。一実施形態では、３’末端の伸長はスプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２をテザーオリゴヌクレオチド（および抗体）から置換するように働き、一方同時に、両方のプローブの伸長産物（Ｐ１−ｅｘｔおよびＰ２−ｅｘｔ）で構成された二重鎖を作製する（図３Ｆ）。次いで、Ｐ１およびＰ２伸長産物を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、リガーゼ連鎖反応、３ＳＲ、Ｑβレプリカーゼに基づく増幅、固相増幅およびＮＡＳＢＡを含む、当技術分野で知られた種々の増幅方法で検出することができる。Ｐ１の配列（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）およびＰ２の（ｅ’、ｆ’、ｇ’、ｈ’、ｉ’、ｊ’）などのプローブが含有する配列、またはプローブ伸長産物を使用して、プローブの増幅および検出を促進してもよい。増幅を促進するのに使用できる特別な配列には、プライマー結合性部位、制限エンドヌクレアーゼ部位、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することが可能な配列、ＲＮＡプロモーター部位などがある。増幅した産物は、当技術分野でよく知られた不均一法または均一法で検出することができる。あるいは、図３Ｆの二重鎖ＩＩを、当技術分野でよく知られた方法で増幅することなく直接検出してもよい。方法が、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、テザーオリゴヌクレオチド（ａ’またはｊ）は伸長プロセス中に分解することがあり、この分解産物は標的抗原の存在を示すものとして検出することができる。
【００３７】
図３Ｅおよび３Ｆは、テザーオリゴヌクレオチドの３’末端に複合体形成している抗体を示し、図３Ｈは、近接対の両方の抗体がテザーオリゴヌクレオチドの５’末端に複合体形成している別の構造を示す。同様に、図３Ｉは、１つのテザーオリゴヌクレオチドが抗体に５’連結を介して複合体形成し、他のオリゴヌクレオチドが３’連結を介して複合体形成している実施形態を示す。これらの後者の２つの構造のそれぞれにおいて、プローブ配列Ｐ１およびＰ２を３’伸長することにより、結果としてプローブをテザーオリゴヌクレオチドから置換し、図３Ｆで示したものと同一の二本鎖の二重鎖を作製することになる。
【００３８】
テザーオリゴヌクレオチドが置換プロセス中に分解しない場合には、プローブ分子Ｐ１およびＰ２の第２の組は、標的に結合した近接構成要素の空いたテザーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる（図３Ｇ）。前記のとおり、Ｐ１とＰ２の３’末端はアニールし、再び伸長することによって、結果としてプローブを置換し、Ｐ１−ｅｘｔおよびＰ２−ｅｘｔで構成された二重鎖を作製することになる。存在する場合ならば、空いたテザーオリゴヌクレオチドは再び、伸長していないプローブ（Ｐ１およびＰ２）の新たな対とアニールし、Ａｂ１およびＡｂ２が近接エピトープに結合し且つＰ１およびＰ２の供給が存在する限り、伸長していないプローブの３’ハイブリッド形成、伸長、置換およびそれに続く結合のサイクルは続く。このサイクルプロセスの結果として、検出可能なプローブ伸長二重鎖の多数のコピーが、存在する各標的から形成される。
【００３９】
図３Ａ〜３Ｌで示した例のすべてにおいて、プローブのテザーオリゴヌクレオチドへの最初のハイブリッド形成は、使用した実験プロトコル次第で、抗体が標的分子に結合する前または後のいずれでも生じる。一実施形態では、抗体Ａｂ１およびＡｂ２の少なくとも一方は、常磁性粒子（図９）またはその他の固体表面（図３Ｌ）、例えばマイクロウェルの内壁に共有結合的または非共有結合的に連結しているか、連結し得る。少なくとも１つの抗体がビーズ、固体表面またはその他の固体マトリックスと連結し、プローブＰ１およびＰ２の両方（図３Ｌ）がテザーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって抗体に間接的に付いている構造では、プローブを伸長することにより抗体−標的複合体から置換された二重鎖が作製され、一方、複合体自体はビーズ、固体表面またはその他の固体マトリックスに付いたままである。所望により次いで、マトリックス表面に非特異的に結合した複合体および任意の物質は残して、置換された二重鎖を含有する溶液を取り出し、別のウェルまたは区画で分析または増幅してもよい。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、連結スプリントオリゴヌクレオチドは、例えば図３Ｊで示したスプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２の両方の部分と相補的であってもよい。連結スプリントオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した場合、プローブＰ１とＰ２はＰ１の３’末端がＰ２の５’末端と共有結合するように図２で記載の通りに連結されてもよい（図３Ｊ）。次いでこれらを図２で記載の通りに増幅してもよい。
【００４１】
別の実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、図３Ｋで例示した通りにテザーオリゴヌクレオチド（ｊ’）および１つのプローブ分子Ｐ２とハイブリッド形成する。次いで、スプリント結合したＰ２の３’末端は空間的に近接したＰ１の相補的な３’末端とハイブリッド形成することができる。このプローブの３’を伸長すると、プローブはスプリントおよびテザーオリゴヌクレオチドから置換され、図３で示した前述の例で産生したものと類似の完全長の増幅可能な二重鎖が形成する。
【００４２】
図４は、近接したエピトープに結合していない抗体に連結したプローブ分子同士のハイブリッド形成の拡がりを減少させるように設計されたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを示す。そのような標的非依存性ハイブリッド形成は、真正な標的結合事象で産生したものと区別できないプローブ伸長産物となるため、バックグラウンドシグナルの原因であり、バックグラウンドシグナルは検出方法の全体的な感度を減少させる。本発明は、バックグラウンドシグナルにつながる誤った標的非依存性プローブの相互作用を低減するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド（または「ハイブリッド形成ブロッカー」）の使用を含む。図４Ａは、ハイブリッド形成ブロッカーの近接に基づく増幅方法での使用の基礎となる基本原理を示す。相互相補性の短い配列（ｅｆ及びｆ’ｅ’）（５’側から３’側に読む）は、Ｐ１およびＰ２の３’末端を含む。これらの配列は互いにハイブリッド形成して、示した通り、５’側が突出した二重鎖を形成し得る。二重鎖状態に対する一本鎖状態にあるプローブ分子の数は、総プローブ濃度および二重鎖の本質的な安定性により決まり、これは二重鎖の長さおよび組成に関係する。Ｐ１とＰ２との間の相互作用を、プローブに対して好ましくはモル過剰の、Ｐ１とハイブリッド形成すると、２つのプローブ間の相互作用を競合的にブロックするハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを加えることによって減少させるか、反対にすることができる。このブロッカーは、Ｐ２と相互作用する部分配列全体にわたってＰ１と相補的である必要はない。この部位との部分的な相補性でも、Ｐ１のＰ２に対するハイブリッド形成を減少させる。
【００４３】
一実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、Ｐ１と相補的なＰ２の部分（部分配列ｅｆ）の一部または全体と同一の第１の部分配列（ｅ’またはｆ’ｅ’）を含む。第２の実施形態（図４Ｂ）では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、上記定義の第１の部分配列と、Ｐ１のセグメントと相補的であるがＰ２の部分配列とは同一でない第２の部分配列（図４Ｂのｄ’）とを含む。ハイブリッド形成ブロッカーの第２の部分配列は、Ｐ１−Ｐ２の相互作用と比較してブロッカー−Ｐ１相互作用を安定化させることによって、ブロッキング効果を向上させる。第２の部分配列はまた、Ｐ２分子がＰ１と既にハイブリッド形成している場合に、Ｐ１−ブロッカー二重鎖の核形成部位としても働くことができる。次いで核形成に続いて、完全なＰ１−ブロッカー二重鎖の形成は、Ｐ２をＰ１から置換する。この実施形態のＰ１の部分配列ｄは、図４Ｂで示した通り、プローブの部分配列ｅと直接隣接していてもよく、あるいは部分配列ｅから数ヌクレオチド離れて位置していてもよい（図示せず）。後者の場合、ハイブリッド形成ブロッカー部分配列ｄ’は、追加のヌクレオチドおよび／またはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）部などの非ヌクレオチドリンカーを含むスペーサーを介してハイブリッド形成ブロッカー部分配列ｅ’と間接的に連結していてもよい。
【００４４】
第３の実施形態（図４Ｃ）では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第１の部分配列（上記定義）、任意選択的に第２の部分配列（上記定義）、および第１の配列の５’に位置し、Ｐ１の３’伸長の鋳型として働くことができる第３の部分配列（図４Ｃのｔ’ｓ’）を含んでいてもよい。第３の部分配列は、当技術分野でよく知られた、適切な非ヌクレオチド部ｍ’（すなわち、「５’キャップ」）を任意選択的に含有し、非鋳型ヌクレオチドがＰ１の３’伸長産物に付加するのを妨げ、かつポリメラーゼがＰ１の伸長によって形成した平滑末端の二重鎖に結合するのを抑えることができる（図４Ｃ参照）。ブロッカー−鋳型でのＰ１の３’伸長により、Ｐ２の配列と相補的でないその３’末端に新たな配列（ｓｔ）を含有するＰ１−伸長産物を得るのが好ましい。したがって、３’配列（ｓｔ）の付加は、Ｐ２の鋳型でＤＮＡ合成のための機能的プライマーとしてのＰ１の使用を不可能にするように働く。また、配列（ｓｔ）の付加は、２つの分子間の相補的塩基対の数を増加させることによって、ブロッカー−Ｐ１の相互作用を安定化するように働く。任意選択的に、この実施形態で産生された新たな３’配列（ｓｔ）は、伸長されたＰ１とハイブリッド形成ブロッカーが解離した場合、伸長されたＰ１がステムループ（ヘアピン）構造に折り畳まれて、Ｐ２との任意の相互作用が減少するように、Ｐ１のセグメントと全体的または部分的に相補的である。この場合、Ｐ１のヘアピンの３’末端はヘアピンのステムを伸ばすように場合によって伸長されてもよく、この伸長はニック形成可能または開裂可能な制限エンドヌクレアーゼ部位をＰ１分子内に任意選択的に作製することができる。
【００４５】
第４の実施形態では、プロセスのある段階の間、Ｐ１とＰ２との間の相互作用を可逆的にブロックすることが望ましい場合がある。図４Ｄは、可逆的なブロックを可能にするハイブリッド形成ブロッカーの設計を示す。この実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは、ブロックされるプローブ（図４ＤのＰ１）と相補的な部分配列（ｅ’ｄ’）およびプローブと相補的でない１つまたは複数のテール配列（ｔ’および／またはｋ’）を含む。ハイブリッド形成ブロッカーのＰ１とのハイブリッド形成は、Ｐ１−Ｐ２の相互作用を妨げる。所望の時点で、脱ブロック化（デブロッキング）オリゴヌクレオチドを加えてハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドをＰ１から置換して、Ｐ１をＰ２と自由に相互作用できるようにすることができる。デブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成ブロッカーのテール配列と相補的な１つまたは複数のテール配列（ｔおよび／またはｋ）を含む。このテール配列は、ブロッカー−デブロッカーハイブリッド形成の核形成の部位として働く。相補的テール配列のハイブリッド形成が核形成されると、ブロッカーがＰ１から置換されるまで、ハイブリッド形成ブロッカーとデブロッカーとの間に追加的塩基対が形成する。ブロッカーのプローブからの置換を確実にするために、ブロッカー−デブロッカー複合体の全体的な熱力学的安定性は、プローブ−ブロッカー複合体よりも高くなければならない。デブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッカー−デブロッカー二重鎖の熱力学的安定性がプローブ−ブロッカー二重鎖の安定性よりも高いならば、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと完璧に相補的である必要はない。例えば、デブロッカーは、得られるブロッカー−デブロッカー二重鎖がプローブ−ブロッカー二重鎖よりも安定であるならば、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとミスマッチを形成する１つまたは複数のヌクレオチドを含有していることが望ましいことがある。特に、デブロッカーの配列ｅが、ブロッカーの配列ｅ’と１つまたは複数のミスマッチを形成する１つまたは複数のヌクレオチドを含有することが好ましい場合がある。デブロッカーのこれらのミスマッチヌクレオチドの主要な機能は、デブロッカーの配列ｅとＰ２の配列ｅ’との間の潜在的な相互作用を不安定化することである。この実施形態のひとつの変形において、ハイブリッド形成ブロッカーは、図４Ｅで示した通り、配列ｋのポリメラーゼで触媒した伸長によって置換されてもよい。この場合、デブロッキング配列は、ブロッキング配列で直接合成され、分離させるデブロッカーオリゴヌクレオチドを加える必要はない。さらに別の実施形態では、プローブは、プローブ分子間の相互作用をブロックするように働くその３’末端または３’末端の近くに３’ステム−ループ構造を含んでもよい（図１１Ａ〜Ｃ参照）。
【００４６】
ブロッカーのポリメラーゼによる３’伸長を妨げるために、図４Ｅで示したヘアピン構造を有するハイブリッド形成ブロッカーを除いて、上記のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはすべて、３’末端のヌクレオチドにキャップを含んでもよい。３’キャップを有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、「キャップされたオリゴヌクレオチド」と呼ぶ。そのような３’キャップは当技術分野でよく知られており、逆位ヌクレオチド、２’−３’ジデオキシリボヌクレオチドおよび３’デオキシリボヌクレオチドを含む。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成ブロッカーがプローブと二重鎖を形成する場合に、プローブヌクレオチドと相補的な塩基対を形成しない３’テール配列を含んでもよい。また、非塩基対形成３’テールは、ハイブリッド形成ブロッカーがプローブと二重鎖を形成している場合、ブロッカーの３’伸長を妨げるように働き、したがって「３’キャップ」としても働く。
【００４７】
図４ＥＥは、Ｐ１ブロッカー二重鎖の安定性を促進するための、プローブ１（Ｐ１）での３’テールの使用を説明する。Ｐ１の３’テールは配列ｘｙで構成され、プローブ２（Ｐ２）の配列（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成することが可能な配列（ｅｆ）の３’側に位置する。Ｐ１の３’テールは、Ｐ２とハイブリッド形成しない。ハイブリッド形成ブロッカーは、配列（ｙ’ｘ’ｆ’）および任意選択的にｅ’を含む。したがって、ハイブリッド形成ブロッカーは、Ｐ１とハイブリッド形成して、Ｐ１の３’テールならびにＰ１の配列ｅｆのすべてまたは一部を転換させる二重鎖を形成することが可能である。ブロッカー：Ｐ１二重鎖の形成は、上記の通り、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドの拡がりを減少させる。Ｐ１の（ｘｙ）とハイブリッド形成ブロッカーの（ｙ’ｘ’）との間の塩基対形成は、ブロッカー：Ｐ１二重鎖を安定化するように働く。ハイブリッド形成ブロッカーは、配列（ｙ’ｘ’）の５’に位置する配列ｚ’を任意選択的に含む。配列ｚ’は、上記の方法においてデブロッカーオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を開始するための部位として働くことができる。
【００４８】
図４Ｆは、二元免疫増幅反応におけるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を説明する。Ｐ１およびＰ２はそれぞれ、抗体Ａｂ１およびＡｂ２に直接複合体形成している。プローブが抗体にテザーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を介して間接的に結合している場合、または分析物特異的結合成分がアプタマーまたは抗体以外のその他の分析物特異的結合分子である場合も関係なく、同じ原理が当てはまる。示した通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはＰ１の３’末端とハイブリッド形成して、Ｐ２とのその相互作用を妨げる。ハイブリッド形成ブロッカーのハイブリッド形成は、抗体が標的分析物に結合するのを妨げず、当初ハイブリッド形成ブロッカーは、Ａｂ１が分析物と複合体形成しているか、溶液中で自由であるかにかかわらずＰ１鎖とハイブリッド形成する（状態Ｉ）。通常、自由なＡｂ１およびＡｂ２（および複合体形成しているプローブ）のバルク溶液中の濃度は、１ｆＭと１０ｎＭとの間である。通常ハイブリッド形成ブロッカーの濃度はプローブ濃度よりも１０〜１０００００倍高いため、ブロッカー−Ｐ１の相互作用は、標的に結合していない抗体に複合体形成しているプローブについてＰ１−Ｐ２の相互作用を上回る。しかし、標的分子のエピトープ１および２がそれぞれＡｂ１およびＡｂ２と結合する場合、三元標的−抗体複合体でのＰ２に比べたＰ１の有効局所濃度は、バルク溶液中のプローブおよびハイブリッド形成ブロッカーの濃度よりもはるかに高く（通常１〜１００μＭ）なる。その結果、標的に結合した抗体と連結しているプローブでは、Ｐ１：Ｐ２二重鎖がＰ１：ブロッカー二重鎖よりも優勢である（状態ＩＩ）。したがって、Ｐ１：２ハイブリッドの３’末端をポリメラーゼ触媒伸長させることにより、標的−Ａｂ１−Ａｂ２複合体上での増幅可能な二重鎖が生じ（状態ＩＩＩ）、一方、標的複合体と連結していないプローブは、ブロックされ、伸長されず、増幅不可能なままである。図４Ｆは、プローブの１つのみとハイブリッド形成する単一のハイブリッド形成ブロッカーの使用を示すが、その他のプローブとハイブリッド形成する第２のハイブリッド形成ブロッカーを第１のブロッカーと連結して使用してもよい。
【００４９】
図４Ｇは、伸長の鋳型として機能することにより、Ｐ１分子を「無能力」にすることが可能なハイブリッド形成ブロッカーを用いる同様の反応スキームを示す（上記図４Ｃ参照）。上記の理由により、バルク溶液中のプローブではブロッカー：Ｐ１二重鎖がＰ１：Ｐ２二重鎖よりも優勢であり、一方、三元標的−抗体複合体ではＰ１：Ｐ２二重鎖が優勢である。ブロッカー：Ｐ１二重鎖をポリメラーゼ触媒伸長させることにより、「無能力化された」Ｐ１伸長産物が生じ（図４Ｃ参照）、一方、Ｐ１：Ｐ２二重鎖の伸長により、図４Ｆの通り、増幅可能な二重鎖が生じる。
【００５０】
図４Ｈは、置換可能なハイブリッド形成ブロッカーＡがＰ２とハイブリッド形成してブロッカーＡ：Ｐ２二重鎖を形成する段階的ブロッキングプロセスを示す。任意選択的に、このスキームのハイブリッド形成ブロッカーＡは、バルク溶液中および三元標的−Ａｂ１−Ａｂ２複合体上の両方において、ブロッカーＡ：Ｐ２二重鎖をＰ１：Ｐ２二重鎖よりも安定にするのに十分な長さまたは濃度を有することができる。Ｐ１のセグメントと相補的な第２のハイブリッド形成ブロッカーＢおよび置換可能なハイブリッド形成ブロッカーＡと相補的なデブロッカーＤを溶液に加えることにより、ＡをＰ２から置換させ、バルク溶液中でのＰ１：ブロッカーＢ二重鎖を形成し、そして三元標的−抗体複合体でのＰ１：Ｐ２二重鎖を形成する。任意選択的に、ハイブリッド形成ブロッカーＢは、上記の通りＰ１を無能力化させる「無能力化」配列を含んでもよい（図４Ｃおよび４Ｆ参照）。前述の通り、プローブ−プローブハイブリッドをポリメラーゼ触媒伸長させることにより増幅可能な二重鎖が生じ、一方、Ｐ１：ブロッカーＢ二重鎖を場合によって伸長することにより、「無能力化された」Ｐ１伸長産物が生じる。
【００５１】
図４Ｉは、Ｐ１：Ｐ２二重鎖がバルク溶液中および三元標的−抗体複合体上の両方において形成することができる反応スキームを示す。次いで、バルク溶液と三元複合体とは有効プローブ濃度が異なるので、ハイブリッド形成ブロッカーを加えることにより、三元標的複合体上のものよりもバルク溶液中のＰ１：Ｐ２二重鎖を優先的に分裂させる（図４Ｆ参照）。
【００５２】
一実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを、常磁性粒子またはその他の固体表面と共有結合的または非共有結合的に連結してもよく、さらに近接構成要素を表面に可逆的に結合するために使用してもよい（図６参照）。本発明の別の実施形態では、抗体Ａｂ１およびＡｂ２の少なくとも１つは、常磁性粒子（図９参照）またはその他の固体表面と共有結合的または非共有結合的に連結しているか、連結することができる。
【００５３】
図５で示した本発明の実施形態は、２つの近接構成要素間のギャップを架橋するように設計されたスプリントオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドＳは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、下流のプライマー結合配列および検出領域を含む（図５Ａ）。スプリントＳの５’配列は、抗体Ａｂ１にその３’末端で複合体形成するＰ１の５’末端と相補的である。さらに、スプリントＳの３’配列は、抗体Ａｂ２にその５’末端で複合体形成するプローブＰ２の３’末端と相補的である。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープと結合する場合、スプリントオリゴヌクレオチドＳはＰ１およびＰ２の両方とハイブリッド形成することができる（図５Ａ）。プローブＰ２およびスプリントＳの３’末端からの伸長により、プローブＰ１は置換され、抗体Ａｂ２と連結した機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖分子を作製する（図５Ｂ）。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖プロモーター配列を使用して一本鎖ＲＮＡを産生する。一実施形態（図示せず）では、一本鎖オリゴヌクレオチドを、当技術分野で知られた任意の適切な方法で直接検出する。第２の実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子は、伸長してＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生じる相補的プライマーとハイブリッド形成する（図５Ｃ）。これらのハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮアーゼで分離することにより、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマーがハイブリッド形成できる一本鎖ＤＮＡ分子を産生する（図５Ｄ）。ハイブリッド形成したプライマーおよびそれらの標的鎖の３’末端から伸長することにより、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が生じ、指数関数的増幅となる。
【００５４】
図６で説明した本発明の別の態様は、固体表面、ポリマー、ヒドロゲルまたはその他の表面であってもよい支持体に直接付着した捕捉オリゴヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって、抗体、抗原または抗原−抗体複合体を固体表面に付着するための異なる方法を含む。本発明に適切な、粒子またはマイクロタイターウェル表面などの支持体は、当技術分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドを種々の支持体に安定に複合体形成させる方法は、当技術分野でよく知られている。捕捉オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成によってオリゴヌクレオチド部と相互作用することができ、あるいは近接構成要素の分析物結合性部に複合体形成している別のオリゴヌクレオチドと相互作用することができる。さらに、本発明は、捕捉した分子を表面から種々の化学的、物理的または酵素的手段で選択的に放出する方法を含む。
【００５５】
図６Ａで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その５’末端で固体表面に付着している相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。固相からの複合体Ｃの放出は、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。図６のすべてのパネルのＰ１は近接構成要素の増幅可能なオリゴヌクレオチド部であってよく（図６Ｎ参照）、あるいは分析物特異的結合性部に複合体形成している別のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５６】
図６Ｂで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その５’末端で固体表面に付いた相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。Ｐ２は、オリゴヌクレオチドＰ１の相補体および３’非相補的テールを含む。複合体Ｃの固相からの放出は、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。開裂したＰ１オリゴヌクレオチドは、置換オリゴヌクレオチドＤのハイブリッド形成を介して一本鎖にされる。
【００５７】
図６Ｃで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその３’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その３’末端で固体表面に付いた相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。複合体Ｃの固相からの放出は、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。
【００５８】
図６Ｄで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いたオリゴヌクレオチドＰ２の３’末端と相補的な配列を含む。Ｐ２は、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含む。Ｐ１の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長により、Ｐ２の相補体が合成され、そして選択的に開裂して複合体Ｃを放出することができる二本鎖制限酵素認識配列が形成される。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドＰ２の３’末端はキャップされて伸長を妨げる。
【００５９】
図６Ｅで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列を、任意選択のフランキングＤＮＡ、およびその５’末端で固体表面に付いているオリゴヌクレオチドＰ２の３’末端と相補的な配列と共に含む。Ｐ２の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長により、オリゴヌクレオチドＰ１の相補体が合成され、そして選択的に開裂して複合体Ｃを放出することができる二本鎖制限酵素認識配列が形成される。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドＰ１の３’末端はキャップされて伸長を妨げる。
【００６０】
図６Ｆで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いている別のオリゴヌクレオチドＰ２と相補的な配列を含む。複合体Ｃの固相からの放出は、イオン強度の低下、キレート剤の添加、ｐＨの変更または温度の上昇、あるいはこれらの因子の組合せなどの物理的な環境の変化によって生じる。適切な条件下では、複合体Ｃの物理的放出は可逆的である。
【００６１】
図６Ｇで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いている別のオリゴヌクレオチドＰ２と相補的な配列を含む。Ｐ２の配列は、Ｐ１の少なくとも部分的な相補体と、物理的、化学的または光化学的手段で開裂して複合体Ｃを溶液中に放出することができる切れやすい連結とを含む。切れやすい連結の具体例は、これらだけに限定するものではないが、ジスルフィド結合（例えば、ＤＴＴにより開裂）およびｃｉｓ−ヒドロキシル基（過ヨウ素酸塩により開裂）を含む。図６ＧＧでは、抗体、抗原または抗体−抗原複合体を担持するプローブＰ１は、切れやすい連結、例えばジスルフィド、ｃｉｓ−グリコールなどを介して固体表面に付着している。この連結の物理的、酵素的、化学的または光化学的開裂を使用して、Ｐ１−担持複合体を表面から遊離させることができる。
【００６２】
図６Ｈで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の５’配列および３’配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着されており、配列ａおよび上流の配列ｂを含む。ａとａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは支持体に付着される。複合体Ｃの選択的放出は、配列ａ’およびｂ’を含む置換オリゴヌクレオチドＤの添加によって達成される。Ｐ２の配列ａおよびｂへのＤのハイブリッド形成は、配列ａおよびａ’のみのハイブリッド形成よりも熱力学的に好ましく、Ｐ１を置換させ、複合体Ｃを溶液中への放出させることとなる。第２の実施形態では、置換プローブはＰ１のすべてまたは一部と相補的であることができる。第３の実施形態では、抗体または抗体−抗原複合体は、表面に結合されたオリゴヌクレオチドおよびＰ１の両方に相補的な配列を含むスプリントオリゴヌクレオチドを介して間接的に表面に結合されたオリゴヌクレオチドＰ２と連結することができる（図示せず）。この後者の場合、置換は、オリゴヌクレオチドＤのＰ１、Ｐ２のいずれか、またはスプリントオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって生じることができる。
【００６３】
図６Ｉで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の３’配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着し、Ｐ２は、配列ａおよび下流の配列ｂを含む。オリゴヌクレオチドＰ２の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ１の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの選択的放出は、配列ｂ’を含む置換オリゴヌクレオチドＤのＰ２の配列ｂとのハイブリッド形成および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用するオリゴヌクレオチドＤのその３’末端からの伸長によって達成される。さらなる実施形態では、伸長反応に使用するポリメラーゼは、Ｐ１の配列ａ’を分解して、ハイブリッド形成したＰ２オリゴヌクレオチドを放出する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。別の実施形態では、Ｐ２は３’ヘアピン構造を含み（図６Ｍ）、ヘアピンの３’末端からのポリメラーゼによる伸長により、Ｐ１が置換される。この実施形態では、置換オリゴヌクレオチドＤは不要である。任意選択的に、スプリントオリゴヌクレオチドを図６Ｉおよび６Ｍで示した実施形態で使用してもよい。
【００６４】
図６Ｊで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその３’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、３’配列ｂおよび５’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その３’末端を介して固体支持体に付着しており、配列ａ’および任意選択の下流の配列を含む。オリゴヌクレオチドＰ１のａとオリゴヌクレオチドＰ２のａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの選択的放出は、置換オリゴヌクレオチドＤのＰ１の配列ｂとのハイブリッド形成および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する３’末端からの伸長によって達成される。さらなる実施形態では、伸長反応に使用するポリメラーゼは、Ｐ２の配列ａ’を分解して、ハイブリッド形成したＰ１オリゴヌクレオチドを放出する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。
【００６５】
図６Ｋで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の５’配列ｂおよび３’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、ＲＮＡでできており、その５’末端を介して固体支持体に付着しており、配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ１の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ２の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの放出は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を選択的に分解するＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼの添加によって達成される。別の実施形態では、Ａｂ１へのＰ１の複合体形成およびＰ２の固体支持体への付着は、各オリゴヌクレオチドの３’末端を介して生じる。
【００６６】
図６Ｌで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡでできており、任意選択の５’配列ｂおよび３’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着ており、配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ１の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ２の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの放出は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を選択的に分解するＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼの添加によって達成される。別の実施形態では、Ａｂ１へのＰ１の複合体形成およびＰ２の固体支持体への付着は、各オリゴヌクレオチドの３’末端を介して生じる。
【００６７】
図６Ｎで説明した実施形態では、固定化された近接構成要素は、制限エンドヌクレアーゼによる開裂によって放出される。Ａｂ１は、配列（ａｂｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成している。抗体Ａｂ２は、配列（ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成しており、ここで、領域ｄは制限エンドヌクレアーゼ認識部位に相当する。抗体Ａｂ２はその特異的エピトープに結合しており、抗体−抗原複合体は、オリゴヌクレオチドＰ２の相補的捕捉オリゴヌクレオチドＣ（表面に付着している）とのハイブリッド形成によって固体支持体に捕捉されている。任意選択的に、支持体は洗浄され、結合していない抗原および試料のその他の成分を除去する。次いで抗体Ａｂ１を加えると、その結果、それはエピトープ１を結合する。オリゴヌクレオチドＰ２と捕捉プローブＣとの間の相補性の程度は、Ｐ２とオリゴヌクレオチドＰ１との間のものよりも大きく、したがって、Ｐ１と捕捉プローブＣとの間のハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２とのハイブリッド形成よりも熱力学的に好ましい。抗原−抗体複合体は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位ｄが開裂すると放出される。抗体Ａｂ２に付着したオリゴヌクレオチドＰ２の残りの断片は、配列（ａ’ｂ’ｃ’）を含み、抗体Ａｂ１上のプローブＰ１と相補的である。（ａ’ｂ’ｃ’）のその相補体とのハイブリッド形成は、熱力学的に好ましく、伸長可能な３’末端を有するオリゴヌクレオチドハイブリッドを介する抗体Ａｂ１とＡｂ２とを連結させる。この複合体は、図１で示したような適切な増幅反応で使用することができる。
【００６８】
図７Ａは、オリゴヌクレオチド部の捕捉オリゴヌクレオチドとの相互作用を介する近接構成要素の固定化を示す。ここで、オリゴヌクレオチド部は、オリゴヌクレオチド部が捕捉オリゴヌクレオチドから放出された場合にアンプリコンを形成することが可能である。領域ｂ、ｃおよびｙを含む捕捉オリゴヌクレオチドは固体支持体にその５’末端で複合体形成されているように示されているが、その３’末端で付着していてもよい。領域ｂおよびｃは、オリゴヌクレオチド部Ｐ１のそれぞれ領域ｂ’およびｃ’とのハイブリッド形成により相互作用している。領域ｙは、図６Ａ〜６Ｎで示したものを含む上記の方法のいずれかによって放出を促進する部位を表す。Ａｂ２は、分析物Ａｇに結合する前または後に固体支持体に固定化することができる。図７Ｂは、Ａｂ２が分析物Ａｇと結合する前にＡｂ２が固定化されている実施形態を示す。一実施形態では、結合された近接構成要素−分析物複合体を増幅の前に洗浄して、結合していない分子を除去することによってバックグラウンドシグナルを減少させる。Ａｂ２、Ａｂ１および標的分析物間の完全な複合体を図７Ｃで示す。
【００６９】
図７Ｄは、２つの近接構成要素間の非特異的相互作用によって生じる標的非依存性増幅の原因と考えられるものを説明する。非特異的相互作用のその他の原因も考えられるが、示した通り、Ａｂ１とＡｂ２との間でこの非特異的相互作用が起きる。Ａｂ１とＡｂ２との間の相互作用は、アンプリコンの形成に使用される、この場合それぞれ領域（ｄｅ）および（ｄ’ｅ’）の相補的な領域を介して、Ｐ１とＰ２の相互作用を促進する。Ｐ１：Ｐ２の相互作用の形成は同様に、Ａｂ１とＡｂ２との間の継続した連関を促進することができ、したがって、Ｐ１：Ｐ２の相互作用の不安定化により、標的非依存性シグナルを全体的に低減し得る。これは、Ｐ１の領域（ｄｅ）と相互作用するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを提供することにより、例えば、この領域とＰ２のその相補体（ｄ’ｅ’）との相互作用を防ぐことによって達成できる。
【００７０】
増幅により分析物を検出する方法におけるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を図７Ｅ〜７Ｈで説明する。反応混合物にＡｂ１を加える前またはＡｂ１を加えるのと同時にＡｂ２は分析物のエピトープ２と結合し、Ａｂ２は、捕捉オリゴヌクレオチドとの相互作用によって表面に固定化される。この実施形態の捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｐ２の領域（ｂ’ｃ’）とハイブリッド形成する。任意選択的に、結合した複合体をＡｂ２と分析物との間の複合体の形成前または後に洗浄して、結合していない分子を除去する。Ｐ１の領域（ｄｅ）とハイブリッド形成している領域（ｄ’ｅ’）を含むハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下でＡｂ１を加えて、上記の通りＡｂ１とＡｂ２との相互作用を抑制する。結合していないＡｂ１は、Ａｂ１が分析物のエピトープ１と複合体を形成した後に、反応容器から洗浄してもよい。図７Ｅ〜７Ｈで示した通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的特異的複合体の形成を妨害しない。捕捉オリゴヌクレオチドからのＰ２の放出により、Ｐ２の領域（ｄ’ｅ’）はＰ１の（ｄｅ）の領域と相互作用して、増幅のための二本鎖開始部位を形成することができる。Ｐ２は、上記の任意の手段により、捕捉オリゴヌクレオチドから放出されてもよい。例えば、図７Ｉで示した通り、Ｐ２は緩衝液のイオン強度を変更することによって放出される（捕捉オリゴヌクレオチドからの物理的放出を示す図６Ｆ参照）。図７Ｉで示した通り、Ｐ２が放出されると、それはＰ１と自由に相互作用して、増幅することができる二本鎖配列を形成する。あるいは、図７Ｊで示した経路に従って、置換オリゴヌクレオチドを使用してＰ２を捕捉オリゴヌクレオチドから解離してもよい（図６Ｈも参照）。
【００７１】
図７Ｉは、イオン強度の変更をどのように使用して選択的にＰ２を放出し、それに続くＰ１とＰ２の相互作用を促進するかを説明する。図７Ｉでは、Ａｂ１−Ｐ１、Ａｂ２−Ｐ２および標的分析物間の複合体の形成が、三元複合体の形成に最適なイオン強度を有し得る緩衝液で達成される。結合していないか非特異的に結合したＡｂ１−Ｐ１は、非特異的相互作用は弱めるが、Ｐ２の配列（ｂ’ｃ’）と捕捉オリゴヌクレオチドとの間で形成した二重鎖ならびにＡｂ１、Ａｂ２および標的分析物間で形成した複合体は、維持する高イオン強度の緩衝液中で洗い流してもよい。緩衝液のイオン強度を低イオン強度に変更することは、Ｐ２と捕捉オリゴヌクレオチドとの間の二重鎖を溶かす効果がある。イオン強度を低下させることによる核酸二重鎖の不安定化の程度は、ヌクレオチドの任意の配列について、例えば非特許文献７に挙げられた方法を使用して計算することができる。複合体が捕捉オリゴヌクレオチドから解離した後にイオン強度を高イオン強度に戻すことにより、Ｐ１とＰ２はハイブリッド形成して増幅可能な配列を形成することができる。
【００７２】
図８Ａでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１およびＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ２は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１は、Ａｂ２で被覆された常磁性粒子を加える前に、その特異的エピトープに結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成を最小化させるように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ１抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを、図１で示したものなどの適切な増幅反応に使用してもよい。
【００７３】
図８Ｂでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１とＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１は、抗体Ａｂ２を加える前に、その特異的エピトープに結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成は最小化するように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを増幅反応に使用してもよい。
【００７４】
図８Ｃでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１とＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、それらの特異的エピトープに同時に結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成は最小化するように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを増幅反応で使用してもよい。
【００７５】
図８Ｄでは、プローブＰ２を担持する抗体Ａｂ２は、表面、例えばビーズまたはマイクロウェルの壁に、切れやすい連結を介して付着しているか、付着できる（図６ＧＧ参照）。Ｐ１を担持する抗体Ａｂ１は、標的抗原のエピトープ１に結合しており、この複合体は、表面に連結したＡｂ１とエピトープ２を結合することにより固定化されている。結合していないＡｂ１は洗い流し、次いで切れやすい連結を開裂し、三元複合体は表面から遊離される。次いで、分離された三元複合体を含有する溶液相を増幅用の第２の反応ウェルに移し、最初の表面に非特異的に結合したＡｂ１を残す。
【００７６】
本発明の別の態様を図９で説明する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識する。オリゴヌクレオチドＰ１は、その３’末端で抗体Ａｂ１に複合体形成している。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端で抗体Ａｂ２に複合体形成している。抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子と連結している。この２つの抗体を抗原と混合し、それらの各エピトープに結合させる。得られる抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体および試料マトリックスのその他の成分を洗浄によって除去する。次いで、プローブＰ１の５’末端およびプローブＰ２の３’末端と相補的なスプリントオリゴヌクレオチドＳを加える。スプリントオリゴヌクレオチドＳとプローブＰ１の５’末端およびプローブ２の３’末端との間のハイブリッド形成により、２つの抗体間のギャップが架橋される。次いで、Ｐ１：Ｌ：Ｐ２ハイブリッドを図３で示したように増幅反応で使用してもよい。図３で示したその他のリンカー構造も使用してよい。さらに、Ａｂ１は、図６Ａ〜６Ｌで記載の通りの開裂可能な連結を介して常磁性またはその他の粒子に付着してもよい。
【００７７】
本発明のさらに別の態様を図１０に挙げる。標識していないＡｂ１およびＡｂ２は、標的抗原の近接エピトープに結合している。第２の抗体Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２、例えば抗Ｆｃ１および抗Ｆｃ２をそれぞれ、互いに相補的な３’末端を含むオリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２で標識する。次いで、第２の抗体は標識していない最初の抗体Ａｂ１およびＡｂ２と結合し、オリゴヌクレオチドプローブを近くに近接させて、３’末端のハイブリッド形成および伸長によりプローブを増幅可能な鎖に変換する。任意選択的に、Ａｂ１およびＡｂ２はハプテン部（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、トリニトロフェノール、ジニトロフェノールなど）で標識されていてもよい。この場合、プローブで標識した第２の抗体Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２は、Ａｂ１およびＡｂ２の各ハプテン標識に対して結合特異性を有する。
【００７８】
さらなる実施形態では、第２の抗体は、連結スプリントオリゴヌクレオチドと互いに塩基対形成した場合に連結できるプローブで標識されている（図２）。第２の抗体の対が、近接エピトープに結合している標識していない抗体の対に結合している場合、プローブは連結スプリントオリゴヌクレオチドと互いに塩基対形成し、連結が生じる。
【００７９】
第３の実施形態では、標識した第２の抗体は、抗原とインキュベーションする前またはインキュベーションしている間に最初の抗体と結合する（または結合することができる）。第４の実施形態では、第２の抗体の少なくとも１つは固体表面、例えばマイクロウェル壁または電磁ビーズに連結している。第５の実施形態では、第２の抗体は固体表面に可逆的に連結している（図６Ａ〜６Ｌ、７Ａ〜７Ｄ、および８Ａ〜８Ｄ）。第６の実施形態では、表面に連結された抗体が固体表面から放出され、放出された抗体が増幅反応にかけられる。第７の実施形態では、Ａｂ１および／またはＡｂ２は、アプタマー、受容体またはその他のエピトープ結合単位であってもよく、Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２はＡｂ１およびＡｂ２に結合しているプローブで標識された認識分子である。第８の実施形態では、Ｓｅｃ１および／またはＳｅｃ２は、Ｆａｂ’断片、アプタマー、抗体に対する抗体、またはＡｂ１もしくはＡｂ２を特異的に認識する任意の分子であってもよい。
【００８０】
プロテインＧまたはプロテインＡを、図１０で説明した通り、任意選択的にＳｅｃ１およびＳｅｃ２の代わりにすることができる。プロテインＧおよびプロテインＡは、１つのプロテインＧまたはプロテインＡがＩｇＧ分子ごとに結合して、ほとんどのＩｇＧ分子およびＦｃ領域に結合する。特に、プロテインＧまたはプロテインＡは、「一般的なオリゴヌクレオチド」プローブで修飾されることができる（図１０の標識されたＰ１およびＰ２）。例えば、修飾されたプロテインＧ分子は、エピトープ１およびエピトープ２を認識する抗体に先に結合していることができる。この場合、Ｐ１で修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡはＡｂ１に先に結合しているであろう。同様に、Ｐ２で修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡは、Ａｂ２に先に結合しているであろう。あるいは、プローブで修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡ分子は、一緒に混合して、図１０で示した通りに使用することができる。
【００８１】
このアプローチには確かな利点がある。第１に、修飾する必要があるのは、ただ１つの試薬、すなわちプロテインＧまたはプロテインＡである。第２に、ほとんどの任意の一次検出抗体を、例えばラット、マウスまたはウサギ抗体に対する抗原に結合するのに使用することができる。第３に、主要な抗体に先に結合する修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡは、特に、任意のＡｂ１またはＡｂ２での一般的な使用で使用可能な印の付いた試薬である。得られるアッセイ成分の標準化は、定量および再現性を向上させると期待される。
【００８２】
ある場合には、プロテインＡまたはプロテインＧの代わりにプロテインＡ／プロテインＧの融合産物を使用することが有利である。また、「プロテインＡ」または「プロテインＧ」は、天然の細菌産物、または例えばプロテインＧのアルブミン結合能力を排除することによってＩｇＧ分子に最適に結合するように設計された遺伝子操作されたバージョンもしくは組換えバージョンを指すことができることも理解されよう。
【００８３】
本発明の別の態様を図１１Ａ〜Ｃで示す。ここでは、本発明は、ヘアピン構造を取り入れることにより非特異的プライマー−プライマー相互作用に関与できないようにされた免疫増幅反応で使用するための、オリゴヌクレオチドで標識された抗体を含む。抗体Ａｂ１は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ａｂａ’ｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成しており、ここで、ａとａ’はハイブリッド形成してヘアピン構造を形成する相補配列である。ヘアピンのＴｍは十分に低いので、オリゴヌクレオチド標識の一部は、増幅反応の条件下で、開いて弛緩した形態で存在する。核酸二重鎖のＴｍは、温度とイオン強度の所与の組合せの下で、例えば非特許文献７で記載の方法の１つを使用して、ヌクレオチドの任意の配列に関して当技術分野でよく知られた方法で計算されることができる。３’末端配列ｃは、ヘアピン構造の一部を形成せず、ＤＮＡポリメラーゼ伸長の自己プライミングを妨げるように設計されている。抗体Ａｂ２は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ａｂ’）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成している。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合する場合、プローブＰ１のヘアピンの揺らぎ（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）によって、２つのオリゴヌクレオチド標識間で塩基対形成が生じる。配列（ｂａ’）と（ａｂ’）の対形成で形成したＰ１：Ｐ２ハイブリッドのＴｍは、Ｐ１ヘアピンのものよりも大きい。したがって、Ｐ１とＰ２とのハイブリッド形成は熱力学的に好ましい。次いで、ＤＮＡポリメラーゼはＰ２の３’末端を伸長して、ニック形成可能な二本鎖制限部位を生じる。ニック形成、伸長および鎖置換により、ニック形成可能な制限部位をいずれかの末端に有する二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。この構造物は、指数関数的ＳＤＡ反応で使用してもよい。
【００８４】
別の実施形態では、抗体Ａｂ１は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ｂ’ａｂａ’ｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成していてもよく、ここで、ａとａ’はハイブリッド形成してヘアピン構造を形成する相補配列である。配列ｂとｂ’も相補的だが、ａとａ’のハイブリッド形成で形成したものよりも不安定な構造を形成する。したがって、ａ：ａ’ヘアピンの形成が好ましい。３’末端配列ｃはヘアピン構造の一部を形成せず、ＤＮＡポリメラーゼ伸長の自己プライミングを妨げるように設計されている。抗体Ａｂ２は、配列（ｂ’ａ’ｂ）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成しており、ここで、ｂとｂ’は相補的で、且つヘアピン構造を形成する。プローブＰ２はＳＤＡニック形成部位を欠く。したがって、ＤＮＡポリメラーゼ伸長が３’末端から生じると、線形増幅をすることができないデッドエンド産物が生じる。ａ：ａ’およびｂ：ｂ’ヘアピンのＴｍは十分に低いので、各オリゴヌクレオチドの一部は、反応の条件下で、開いて弛緩した形態で存在する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合する場合、プローブＰ１およびＰ２のヘアピンの揺らぎによって、２つのオリゴヌクレオチド標識間で塩基対形成が生じる。配列（ｂ’ａｂ）と（ｂａ’ｂ’）との対形成で形成したＰ１：Ｐ２ハイブリッドのＴｍは、いずれのヘアピン構造のものよりも大きい。したがって、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成は熱力学的に好ましい。次いで、ＤＮＡポリメラーゼはＰ２の３’末端を伸長して、ニック形成可能な二本鎖制限部位を生じる。ニック形成、伸長および鎖置換により、指数関数的ＳＤＡ反応で用いることができる二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。
【００８５】
さらなる実施形態を図１１Ｃで示す。プローブＰ１は、ヘアピン配列ｂ、ｄ、ｂ’、ヘアピン配列の５’である配列ａ、およびヘアピン配列の３’であり、伸長不可能な３’キャップを任意選択的に含有する配列ｃを含む。配列ｂとｂ’は相補的であり、ハイブリッド形成してヘアピン構造のステムを形成する。配列ｄはヘアピンのループを形成する。任意選択的に、配列ｄの一部はそれ自体と塩基対形成して、ｂおよびｂ’と共にステム構造の一部を形成してもよい。プローブＰ２は、Ｐ１の配列ｄと相補的な配列ｄ’を含む。ヘアピン構造の存在により、ｄとｄ’とのハイブリッド形成が妨げられる。置換オリゴヌクレオチドＤを加えると、最初にＰ１の配列ａとハイブリッド形成し、次いでステムのｂ’アームを置換することによってヘアピンを開く。次いで、Ｐ２の配列ｄ’はＰ１の折り畳まれていない配列ｄとハイブリッド形成し、Ｐ２はポリメラーゼで伸長されて、オリゴヌクレオチドＤを置換し、ニック形成可能な二本鎖制限部位をＰ１上に作製する。次いで、増幅は、図１１Ｂで示した実施形態と類似の方法に従う。
【００８６】
図１２は、試験試料中の抗原特異的免疫グロブリン抗体の存在を検出する方法を示す。プローブＰ１およびＰ２は、各Ａｇ分子がＰ１またはＰ２のいずれか（ただし、両方ではない）によって標識されるように、抗原分子Ａｇに複合体形成している。標識された抗原は、試験試料と混合され、示したようにＡｇ特異的免疫グロブリンに結合する。Ｐ１とＰ２の両方を含有する複合体は、増幅可能であり、検出可能であり、Ａｇ特異的免疫グロブリンの存在を示す。Ａｇ特異的免疫グロブリンの不在下では、検出可能な複合体は形成しない。同様のアプローチを使用して、２つ以上の同一のリガンド結合性部位または２つ以上の異なるリガンドの結合性部位のいずれかを含む任意のリガンド−受容体の相互作用を検出することができる。後者の場合、各リガンドは異なるプローブ配列で標識されている。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するプロテインＧはＰ１で標識してもよく、ＡｇはＰ２で標識してもよい。標識したＡｇおよびプロテインＧを同じＩｇＧ分子に結合することにより、本発明の方法により増幅可能で、且つ検出可能な複合体が生じるであろう。
【００８７】
図１３は、二元免疫ＳＤＡで有用な、代表的なプローブ、プライマー、アダプター、レポーターおよびテザーオリゴヌクレオチドを示す。これらのオリゴヌクレオチドの構造およびそれらの使用は、以下の実施例で挙げる。以下の実施例には、一切、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例１】
【００８８】
（二元免疫ＳＤＡに有用なプローブ、プライマー、アダプター、レポーターの代表的な配列）
以下に示したプローブ、プライマー、アダプターおよびレポーターのいくつかの配列は、図１３で挙げられている。
【００８９】
（プローブ（Ｐ１、Ｐ２））
ＲＨＰ−１（右側のプローブ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９０】
【００９１】
ＲＨＰ−３（右側のプローブ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９２】
【００９３】
ＲＢＤ−３ｖ３（右側のプローブ；Ｘ＝ビオチン標識ｄＴ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９４】
【００９５】
ＬＨＰ−１（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ Ｃ
【００９６】
ＬＨＰ−２（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ
【００９７】
ＬＨＰ−３（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ｔ
【００９８】
ＬＨＰ−４（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ
【００９９】
ＬＨＰ−５（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴ
【０１００】
（プライマー）
ＳＲＨ−１（右側のプライマー；太字の配列はＲＨＰ−１と共通である）：
【０１０１】
【０１０２】
ＳＬＨ−２（左側のプライマー；太字の配列はＬＨＰ−１、２、３、４および５と共通であり；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
【０１０３】
【０１０４】
（アダプター）
ＡＤＲ−２（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＴＧ ＡＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＡＧＡ Ｃ
【０１０５】
ＡＤＲ−５（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＣ
【０１０６】
ＡＤＲ−８（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＡＧ Ｃ
【０１０７】
ＡＤＩＱＳ−１（ＩＱＳアダプター）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＧ
【０１０８】
ＡＤＱＳ−２（ＩＱＳ−２のアダプター；下線の塩基はａｌｔＤ６．９（Ｆ／Ｄ）の３’末端と同一である）：
５’ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴ ＡＣ ＴＣＡ
ＧＡＧ ＴＧＡ ＴＣＡ ＡＧＴ
【０１０９】
（レポーター）
ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）（下線の塩基はＡＤＲ−２およびＡＤＲ−５の５’末端と同一である）：
５’（ｄａｂｃｙｌ）−ＴＡＧ ＣＧＣ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＣＧ ＴＴ（ｒｏｘ）Ａ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴ
【０１１０】
ａｌｔＤ６．９（Ｆ／Ｄ）：
５’（ｆａｍ）−ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＣＴ（ｄａｂｃｙｌ）ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴ
【０１１１】
（テザーオリゴヌクレオチド）
ＲＣＰ−１（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−１の５’末端と相補的である）：
５’ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＣＴＧ Ｇａｔ ａｔ
【０１１２】
ＬＣＰ−２（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＬＨＰ１−５の５’末端と相補的である）：
５’ ＣＧＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ Ｔｔｔ ｔｔ
【０１１３】
ＬＣＰ−４（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＬＨＰ１−５の５’末端と相補的である）：
５’ｔ ｔｔａ ｔｔｔ ｔａｔ ＣＧＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ Ｔ
【０１１４】
（捕捉および置換オリゴ）
ＲＣＰ−１３ｖ１（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端近くの配列と相補的であり；下線の塩基はＤＯ−１３ｖ１と相補的であり；Ｘ＝テトラ−エチレングリコール；Ｚ＝ヘキサ−エチレングリコール；ＸはＺにリン酸ジエステル部を介して連結しており；Ｚはオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸ジエステル部を介して連結している）：
【０１１５】
５’ビオチン−Ｘ−Ｚ−ｃｃｔ ｇｇｔ ａｃｇ ａｇｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｃｃｔ ＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ａＣＧ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＧ ｔ
【０１１６】
ＤＯ−１３ｖ１（置換オリゴヌクレオチド［キャップ］＝３’デオキシルイジン）：
５’ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＡＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ Ｇ−［キャップ］３’
【０１１７】
ＲＣＰ−９ｖ２．２（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端近くの塩基と相補的であり；下線の塩基は置換オリゴＣＭＰＲ−９ｖ２と相補的であり；Ｘ＝テトラ−エチレングリコール；Ｚ＝ヘキサ−エチレングリコール；ＸはＺにリン酸ジエステル部を介して連結しており；Ｚはオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸ジエステル部を介して連結している）：
５’ビオチン−Ｘ−Ｚ−ｔ ｔｔａ ＣＡＣ ＴＧＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ｔＣＣ
ｔＡＧ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＴ ｃｃｇ ｔｇｇ ｃＡｇ
ｃｇｔ
【０１１８】
ＣＭＰＲ−９ｖ２（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端と相補的であり；［キャップ］＝３’デオキシウリジン）：
５’ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴｔ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＴ−［キャップ］３’
（ブロッキングオリゴヌクレオチド（［キャップ］＝２’，３’ジデオキシシチジン））
【０１１９】
ＬＢＫ−１（大文字の塩基はＬＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ Ｔａａ ｔｔｔ−［キャップ］３’
【０１２０】
ＲＤＢ−３ｐ５（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＣ ａａ−［キャップ］３’
【０１２１】
ＲＤＢ−３ｐ８（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＡ ａａ−［キャップ］３’
【０１２２】
ＲＤＢ−３ｐ１０（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧ Ｔ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＡＴ Ｃｔａ−［キャップ］３’
【０１２３】
ＲＤＢ−３ｚ８（大文字の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃ ａａ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ
ＡＧＣ ＴＣＡ ａａｃ−［キャップ］３’
【０１２４】
ＲＤＢ−３ｚ０（大文字の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃ ａａ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ｔ ａａｃ−［キャップ］３’
【０１２５】
（定量化標準および品質管理（「ＱＣ」）ヌクレオチド）
ＬＴＡＲ−１（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌ）製のＱＣオリゴヌクレオチド；下線の塩基はＩＱＳ−１とは異なる）：
５’ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ Ｔ
【０１２６】
ＩＱＳ−１（定量化内部標準；下線の塩基はＬＴＡＲ−１とは異なる）：
５’ ＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＴ
ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＣ
【０１２７】
ＩＱＳ−２（定量化内部標準；下記の場合の塩基は標的誘導アンプリコンとは異なる）：
５’ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＡ Ｃ ａｔ ｃｔｇ ｔｃａ ｃｔｔ ｇａｔ ｃａｃ ｔｃｔ ｇａ Ｇ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＣ
【実施例２】
【０１２８】
（均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
以下の一連の実験では、近接構成要素の分析物特異的結合性部はビオチン部であり、選択した試験分析物はストレプトアビジン（「ＳＡ」）であった。ビオチンは、オリゴヌクレオチド部Ｐ１（ＲＨＰ−１）およびＰ２（ＬＨＰ−１またはＬＨＰ−３）の５’末端に連結させた。（実施例１参照、上記）。Ｐ１およびＰ２はそれぞれ濃度１μＭであり、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および任意選択的に０．２５μＭのＳＡと混合した。室温で１０分後、最終的なプローブ濃度がｐＭの範囲になるように混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマー（ＳＲＨ１、ＳＬＨ２）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポータープローブ（ＴＢＤ１０．２）と混合し、混合物を７２℃に１０分間加熱した。試料を５２℃に冷却し、ｄＮＴＰを含むＳＤＡ成分の乾燥カクテルを含有する「増幅ウェル」に加えた。最終的なプローブ濃度は１ｆＭまたは１０ｆＭのいずれかであり、最終的なＳＡ濃度はゼロまたは各プローブ濃度の２分の１であった。次いで、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）を混合物に加え、等温増幅を５２℃で１時間実施した。特許文献１７で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を監視した。
【０１２９】
ＭＯＴＡ値（１時間の反応の過程にわたって統合した蛍光強度の測定値）を表１で報告する。Ｐ２が、Ｐ１（ＲＨＰ−１）とハイブリッド形成した場合に１３塩基対の二重鎖を形成するＬＨＰ−３である場合、分析物ＳＡを含有する試料では、ＳＡを含有しなかった対照よりもＭＯＴＡ値が１００〜１０００倍高く、ｆＭ未満の濃度でＳＡタンパク質を検出するこのＳＤＡに基づく二元プローブシステムの能力を証明している。
【０１３０】
【表１】
【実施例３】
【０１３１】
（不均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、５’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず５’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのＲＨＰ−１はＰ１として働き、５’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず５’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのＬＨＰ−１はＰ２として働いた。１００ｎＭのプローブをＳＡで被覆したビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）と混合し、時々撹拌しながら室温で４５分間インキュベートした。次いで、ビーズを管の脇に集め、溶液を除去した。ビーズを０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡに再懸濁し、それらを管の脇に集め、溶液相を廃棄した。これらの洗浄ステップを４回繰り返し、最後にビーズをＳＤＡ反応緩衝液に再懸濁した。得られる懸濁液を、ＳＤＡプライマー（ＳＬＨ−２、ＳＲＨ−１）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポーター（ＴＢＤ．１０．２）を含有する混合物に加えた。これらの混合物中のビーズに結合したＳＡの最終濃度は４０または４００ｆＭであった。次いで、上記の実施例２の記載の通りにＳＤＡを実施した。
【０１３２】
結果を表２に示す。期待した通り、ビオチン化プローブおよびＳＡを４０または４００ｆＭのいずれかで含有する反応において、強いＭＯＴＡ値が観察され、ＳＡに結合したプローブが増幅可能な伸長産物に変換したことを示した。対照的に、ＳＡと、ビオチンの代わりに５’アミノ連結基で標識したプローブとを含有する対照反応では、ＭＯＴＡ値は非常に低かった。これらの対照反応について期待した通り、ビオチンを欠くプローブはビーズに連結したＳＡに結合することはできず、その結果、洗浄ステップ中に排除され、したがって増幅可能な伸長産物には変換されなかった。対照反応に現れた低いシグナルは、アミノに連結したプローブのビーズ表面への非特異的結合の結果の可能性がある。
【０１３３】
【表２】
【実施例４】
【０１３４】
（単一のテザーオリゴヌクレオチドによる免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、非ビオチン化ＲＨＰ−１（上記参照）はＰ１として、ＬＨＰ−３（５’ビオチンを担持している）はＰ２として、ＲＣＰ−１（３’ビオチンを担持している）はテザーオリゴ、ＴＯとして働いた。プローブＰ１およびＰ２ならびにテザーオリゴＴＯを等モル比で混合し、ＳＡを含有しているか欠いているかのいずれかの管に加えた。この管を短時間室温でインキュベートし、次いで管の内容物を連続的に希釈して、プローブの濃度をｐＭ範囲にした。次いで、希釈した混合物を、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ１、ＳＬＨ２）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポータープローブ（ＴＢＢ１０．２）と混合して、ＳＡの最終濃度を０または０．２５ｆＭのいずれかに、Ｐ１、Ｐ２およびＴＯのそれぞれの濃度を１ｆＭとした。次いで、混合物を「熱スパイク」（７２℃で１０分間）にかけるか、５２℃で１０分間インキュベートした（「熱スパイクなし」）。推定Ｔｍ６４℃を有するＰ１：ＴＯ二重鎖は５２℃では安定で、７２℃のインキュベーションで分裂すると予想される。分裂すると、Ｐ１：ＴＯ二重鎖は、極めて非常にゆっくりと（ｔ１／２＞１００時間）、希釈した（１ｆＭ）プローブ濃度で再形成することとなる。ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの乾燥カクテルを加えることによって試料をＳＤＡにかけ、次いで５２℃においてＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置でインキュベートした。プローブＰ１およびＰ２がそれぞれＴＯまたはビオチンを介して共通のＳＡ分子に結合すると、それらの相補的な３’末端はハイブリッド形成し伸長して、ＳＤＡプライマー（ＳＬＨ−２およびＳＲＨ−１）およびアダプターＡＤＲ−５のためのハイブリッド形成部位を作製する。これにより、伸長したＰ１およびＰ２分子の同時の増幅および検出が可能になる。フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴うアダプターが介在する蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した（アダプター介在型レポータープローブ変換の詳細については特許文献１７参照）。
【０１３５】
結果を表３に示す。分析物０．２５ｆＭのＳＡおよび１ｆＭのプローブを含む「熱スパイクなし」試料は、蛍光の強い増加（平均ＭＯＴＡ＝１６６０００）を示したが、ＳＡを欠くが１ｆＭのプローブを含有する対照試料は、ちょうど３０００の平均ＭＯＴＡ値を示した。これはＰ１：ＴＯ二重鎖がＳＤＡの前に７２℃の熱スパイクで分裂された試料から得られた値と同程度である。ＳＡを欠く試料では、ＭＯＴＡ値は低いままであり、これはＰ１−Ｐ２二重鎖の形成が１ｆＭのプローブ濃度では測定可能な効率で生じないからである。
【０１３６】
【表３】
【実施例５】
【０１３７】
（二元免疫ＳＤＡによる分析物定量）
試料中の標的分析物のレベルは、標的介在型プローブ伸長産物と共増幅された内部標準（例えば、実施例１のＩＱＳ−１）を入れることによって定量的に測定してもよい。内部標準および標的依存性プローブ伸長産物は、ＳＤＡプライマーの共通の対によって増幅されるが、それぞれの識別可能に標識されたレポータープローブ（例えば、実施例１のＴＢＤ１０．２およびＡｌｔＤ６．９）により検出される。２つのレポータープローブの相対的なシグナルを比較することにより、内部標準の既知の量と相対的なプローブ特異的伸長産物の濃度を推定することができる。分析物の絶対濃度の測定では、バックグラウンド修正済み標的／対照シグナル対標的分析物シグナルの比の「標準曲線」を作製することが有利な場合がある。次いで、試験試料について観察したシグナル比を標準曲線と比較して、絶対分析物濃度を作製する。核酸標的レベルを定量する同様の方法が当技術分野で知られている（例えば、非特許文献８参照）。
【実施例６】
【０１３８】
（２つのテザーオリゴヌクレオチドを用いる免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、非ビオチン化ＲＨＰ−１（上記参照）はＰ１として、非ビオチン化ＬＨＰ−３はＰ２として、一方、ＲＣＰ−１（３’ビオチンを担持している）およびＬＣＰ−４（５’ビオチンを担持している）はテザーオリゴヌクレオチドとして働いた。Ｐ１、Ｐ２およびテザーオリゴヌクレオチド間の相互作用を図３Ｈに図示する。プローブＰ１およびＰ２ならびにテザーオリゴヌクレオチドを等モル比（ここで、モル濃度は近接構成要素のテザーオリゴヌクレオチド部のみに関して測定された）で混合し、ＳＡを含有しているか又は欠いているかのいずれかの管に加えた。７２℃の「熱スパイク」実験を実施しなかった以外は、実施例４で記載の通りに反応を実施した。結果を表４に示す。ＳＡを含有する試料は、強い蛍光の増加（平均ＭＯＴＡ値＝１３６０００）を示したが、ＳＡを欠く試料は、ごくわずかな増加を示した（ＭＯＴＡ＝５３３）。
【０１３９】
【表４】
【実施例７】
【０１４０】
（分析物としてＩＬ−８を用いる均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
ヒトＩＬ−８を対象としたＭＡｂ Ｇ２６５−８（Ａｂ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳＡと共有結合させて、ＩｇＧ当たり１つのＳＡ１を含有する抗−ＩＬ−８ ＩｇＧ−ＳＡ複合体（Ａｂ１−ＳＡ）を得た。ＭＡｂ Ｇ２６５−８とＳＡは当技術分野でよく知られた方法を使用して複合体形成させた。２０ｎＭの５’ビオチン標識プローブＲＨＰ−３（Ｐ１）、１０ｎＭのＡｂ１−ＳＡ複合体、１０ｎＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する混合物を調製し、一夜４℃でインキュベートしてビオチン化オリゴヌクレオチドをＡｂ１−ＳＡ複合体に結合させて、Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１を形成した。
【０１４１】
ＭＡｂ Ｇ２６５−８のものとは異なるＩＬ−８エピトープに結合するＭＡｂ Ｇ２６５−５（Ａｂ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、プローブＬＨＰ−３（Ｐ２）のアミノ修飾された形態と直接、共有結合的にカップリングさせて、Ａｂ２を１個当たり平均して２．５個のＰ２部を有するＡｂ２−Ｐ２複合体を産生した。ＬＨＰ−３は５’末端に連結した第１脂肪族アミン基を含んでおり、ＭＡｂ Ｇ２６５−５とＬＨＰ−３は本質的に特許文献１２で記載の通りに複合体形成させた。
【０１４２】
それぞれ１ｎＭのＡｂ−プローブ複合体濃度を有するＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液およびＢＳＡおよび任意選択的に０．０１〜１ｎＭのＩＬ−８と混合した。室温で３０分後、Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合した。混合物を３７℃に１０分間加温した後、各試料の一部を増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。ここで、各増幅反応はＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼを含有していた。Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度は１ｆＭであり、ＩＬ−８の最終濃度は０、０．０１、０．１または１ｆＭであった。その他の成分の濃度は実施例２で記載の通りであった。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１４３】
平均ＭＯＴＡ値を表５に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８によりＭＯＴＡ値は増加され、均一な免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。この実験では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは用いなかったが、近接対−ＩＬ−８複合体の形成後に試料を約１００万倍に希釈して、標的非依存性プローブの増幅の発生を低減させた。
【０１４４】
【表５】
【実施例８】
【０１４５】
（ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用によるバックグラウンド抑制の実験的証明）
この実験は、標的分析物を伴わないＰ１とＰ２分子との塩基対形成から生じる標的非依存性増幅を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を説明する。この実験では、プローブＰ１は５’ビオチン化ＲＨＰ−３であり、プローブＰ２は５’ビオチン化ＬＨＰ−３である（上記参照）。Ｐ１およびＰ２の３’末端を含む１０ヌクレオチド配列は、互いに相補的である。実施例２と同様に、標的分析物はＳＡであり、これは、その四量体に４つのビオチン結合性部位を含有する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ＲＨＰ−３の３’末端と相補的な１８ヌクレオチド配列を含むＲＤＢ−３ｐ８（実施例１）である。したがって、Ｐ１とハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｐ８との間に形成された二重鎖は、Ｐ２と相補的なＰ１の３’末端での１０ヌクレオチド、ならびにＰ２と相補的ではないＰ１のさらなる８ヌクレオチドを含む。さらに、ＲＤＢ−３ｐ８は、１４ヌクレオチドの５’テール配列を含み（実施例１のＲＤＰ−３ｐ８の下線の塩基の塩基５’）、これは、その上でＲＨＰ−３の３’末端が伸長することができる無能力化鋳型として働く（図４Ｃで示した）。本発明のハイブリッド形成ブロッカーの特徴は、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部に共有結合的に付着しない、または連結しないということである。オリゴヌクレオチド部の３’末端の伸長に依拠して分析物特異的アンプリコンを産生する本発明の方法では、ハイブリッド形成ブロッカー−プローブ二本鎖が、３’末端の伸長を必要とし、二重鎖が不安定化する高温で一般に生じるポリメラーゼ触媒増幅方法（例えば、ＳＤＡおよびＰＣＲ）中で安定性を維持する必要がある。一般に、ポリメラーゼベースの増幅方法（例えば、ＰＣＲおよびＳＤＡ）で使用する高温は、プローブ−ブロッカーハイブリッドの拡がりを、誤ったプローブ変換の抑制の効力がなくなる点まで減少させることができる。本発明では、プローブ間で形成するハイブリッドよりも安定なプローブ−ブロッカーハイブリッドを形成することが可能なハイブリッド形成ブロッカーを選択することにより、かつ高温でプローブ−ブロッカー鋳型を安定化する無能力化鋳型を使用することにより、この困難を克服している。
【０１４６】
免疫ＳＤＡによるＳＡ含有溶液の分析は、以下の通りに実施した。それぞれ２０ｐＭの５’ビオチン標識プローブＲＨＰ−３（Ｐ１）および５’ビオチン標識ＬＨＰ−３（Ｐ２）、５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する溶液を調製した。また、各溶液は、ＳＡを０、０．１、１、１０または１００ｆＭで含有していた。この溶液を２時間３７℃でインキュベートし、混合物を免疫ＳＤＡ緩衝液中で１０倍に希釈した。次いで、希釈した試料１００μＬを、ＳＲＨ−１ＳＤＡプライマー１．５μＭ、ＳＬＨ−２ＳＤＡプライマー３．７５μＭ、ＡＤＲ−８アダプター２．２５μＭ、ＴＢＤ１０．２レポータープローブ３．７５μＭおよびＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド０．３７５μＭを含有するプライミング溶液２０μＬと混合した。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドすべての配列は、実施例１に見出すことができる。免疫ＳＤＡ反応を開始するために、５２℃で予備平衡され、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ制限酵素、ならびにリン酸カリウム、ＢＳＡおよびｄＮＴＰを含むその他のＳＤＡ成分で構成されたＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する増幅マイクロウェルに、各混合物８０μＬを移した。次いで、マイクロウェルを直ちに密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、各マイクロウェルの蛍光を観測しながら、５２℃で１時間維持した。ＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有しない一連の対照反応物を上記のものと一緒に調製し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内で同時に観測した。
【０１４７】
最初の結合性混合物の希釈度を考慮した結果、各免疫ＳＤＡ混合物は、１．３ｐＭのＰ１およびＰ２と、０、０．６、６、６６、６６６または６６６６ａＭのいずれかの濃度のＳＡとを含有していた。また、免疫ＳＤＡ反応物は、３０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、７５ｍＭのビシン、５０ｍＭの水酸化カリウム、３．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５ｍＭの酢酸マグネシウム、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５００ｎＭのＳＬＨ−２、２００ｎＭのＳＲＨ−１、５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８、３００ｎＭのＡＤＲ−８、５００ｎＭのＴＢＤ１０．２、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、０．１ｍＭのｄＴＴＰ、０．５ｍＭの２’−デオキシシチジン５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）Ｓ異性体（ｄＣＴＰαＳ）、約８単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび１８単位のＢｓｏＢＩ制限酵素を含有していた。Ｐ１とＰ２との相互のハイブリッド形成および伸長から生じた産物の増幅は（図１参照）、特許文献１７で記載のアダプター介在型プロセスによるＴＢＤ１０．２レポーターオリゴヌクレオチドの増幅に伴うＲＯＸ蛍光の増加を観測することによって検出した。各ウェルについて、反応の過程の間１分間に１回ＲＯＸを読み取った。各試料のＲＯＸ蛍光の読取り値を６０分間にわたってプロットした。
【０１４８】
ＭＯＴＡ値を表６に報告する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを用いない標的を含まない反応（すなわち、０ａＭ ＳＡ）では、相対的に高い平均ＭＯＴＡ値４９３８２が得られた。このバックグラウンドシグナルは、免疫増幅の感度をかなり制限し、標的分析物の不在下でさえプローブを増幅可能な産物に変換するＰ１とＰ２の標的非依存性のハイブリッド形成およびそれに続くそれらの３’末端の伸長から生じると考えられる。しかし、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれるる場合、ＲＤＢ−３ｐ８を用いる標的を含まない混合物から得られた低い平均ＭＯＴＡ値３７６により明らかになったように、バックグラウンドシグナルは劇的に減少した。これらの反応では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはＰ１の３’末端に競合的に結合し、これによりＰ２がＰ１とハイブリッド形成するのを妨げ、プローブの増幅可能な産物への標的非依存性の変換を本質的に排除する。
【０１４９】
標的分析物ＳＡおよびＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの両方を含有する反応混合物は高いＭＯＴＡ値を示し、これはハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下であっても標的結合プローブが効率的に増幅されることを示す。本発明者らは、プローブＰ１とＰ２が同じＳＡ分子に同時に結合することにより、バルク溶液中の結合していないプローブと比較して、２つのプローブの局所濃度が１０００万倍超高められると推定する。ＳＡ分子上のこの２つのプローブの推定有効局所濃度は１０μＭを超え、これはバルク溶液中のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度５０ｎＭを大きく上回る。競合的ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在にもかかわらず、標的に結合したＰ１およびＰ２の高い局所濃度により、プローブ同士のハイブリッド形成およびプローブの増幅可能な産物への変換は促進される。対照的に、標的に結合していないプローブＰ１およびＰ２は、バルク溶液内の濃度が１．３ｐＭであり、これらの結合していないプローブ同士のハイブリッド形成は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとＰ１との競合的ハイブリッド形成によって効果的に抑制されている。ブロッカーを用いない６６６ａＭ ＳＡでの反応と比較して、ハイブリッド形成ブロッカーを含有する６６６ａＭ ＳＡでのＳＤＡ反応においてＭＯＴＡスコアが減少していることが示す通り、標的結合プローブの変換がある程度抑制されていると思われるが、標的シグナル／バックグラウンドシグナルの比は、ハイブリッド形成ブロッカーを含有する反応に関して２００倍近く大きい。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
一般的に、より高い濃度の結合していないプローブＰ１およびＰ２を含有する反応混合物は、より低いプローブ濃度を含有する試料と同程度のバックグラウンド抑制を提供するために、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度をより増大することが必要となる。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度を経験的に調整して、適切な程度のバックグラウンド抑制を提供するのに必要な濃度を特定することができる。また、高濃度のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは標的結合プローブの増幅をある程度抑制する可能性があるので、適切なバックグラウンド抑制を与えることが見出されたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの最低濃度が一般的に最適である。
【０１５２】
ＲＤＢ−３ｐ８のＲＨＰ−３とのハイブリッド形成が１８塩基対の二重鎖および各オリゴヌクレオチドの５’末端上の対形成していない一本鎖のテールを作製するように、この実施例で用いたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド、ＲＤＢ−３ｐ８は、プローブＰ１、ＲＨＰ−３の３’末端と相補的な１８ヌクレオチドの配列を含有する。ＲＤＢ−３ｐよりも長いか短いいずれかの相補的配列（例えば、それぞれＲＤＢ−３ｐ１０またはＲＤＢ−３ｐ５）を有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドも用いてよい。一般的に、所与の濃度では、プローブの相補性がより短いセグメントを有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブの相補性がより長いセグメントを有するものよりも安定性がより低い（より低いＴｍ）Ｐ１との二重鎖を形成する。一般的に、所与のプローブと安定性のより低い二重鎖を形成するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブとより安定な二重鎖を形成するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと同程度のバックグラウンド抑制を提供するためには、より高い濃度で用いられる必要がある。また、Ｐ１：Ｐ２二重鎖の安定性により、所与のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの効率に影響が及ぼされることとなる。一般的に、Ｐ１：Ｐ２二重鎖が安定であればあるほど、適切なレベルのバックグラウンド抑制を与えるのに用いなければならない所与のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は高くなる。同様に、Ｐ１：Ｐ２二重鎖が安定であればあるほど、固定濃度のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドに対して同程度のバックグラウンド抑制を与えるのにプローブ−ブロッカー二重鎖はより安定でなければならない。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとプローブとの間に形成した二重鎖の安定性は、プローブと相補的なハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド配列の長さまたは配列組成を変えることによって調節されることができる。オリゴヌクレオチド配列および濃度などのパラメータから二重鎖の安定性を推定するためのソフトウェアは、ＯＬＩＧＯ（登録商標）（英国Ｃａｍｂｉｏ）およびＭｆｏｌｄ（著作権、１９９６、Ｄｒ．Ｍ．Ｚｕｋｅｒ）など、当技術分野でよく知られている（参照により本明細書に組み込まれる非特許文献９参照、非特許文献１０に記載）。
【０１５３】
各プローブに特異的な２種のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを同時に用いてバックグラウンドシグナルを抑制してもよい。一般的に、単一のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドで得たものと同程度のバックグラウンド抑制を与えるのに必要とされる各ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度はより低くなる。
【実施例９】
【０１５４】
（免疫ＳＤＡによるピコモル未満のＩＬ−８濃度の均一検出）
抗体−プローブ複合体Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７で記載の通りであった。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのマウスγグロブリン、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｚ８および０、０．００５、０．０１０または０．０２５ｐＭのＩＬ−８を含有する試料５０μＬを調製した。室温で３時間インキュベートした後、各試料の分量５μＬを１：１０（ｖ／ｖ）に希釈して、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液とし、次いでさらに１：１０（ｖ／ｖ）に希釈して、ＳＤＡプライマーＳＲＨ−１（１００ｎＭ）およびＳＬＨ−２（５００ｎＭ）、３００ｎＭのアダプタープライマーＡＤＲ−８、５００ｎＭのレポータープローブＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）ならびに５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｚ８を含有する溶液１００μＬとした。そのように希釈した４つの混合物は、最初の試料のそれぞれから調製された。次いで、希釈した混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。参照により本明細書中に組み込まれる特許文献１７で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。得られるＭＯＴＡ値を表７に報告する。０．００５ｐＭと低いＩＬ−８濃度を含有する結合性混合物の平均ＭＯＴＡ値は、ＩＬ−８ゼロの試料から得られる対応値よりも著しく高く、これは本発明の均一法が、未結合の抗体から結合抗体を分離せずに、低フェムトモル範囲の分析物濃度を検出できることを立証している。
【０１５５】
ＩＬ−８ゼロの試料のＭＯＴＡスコアで表されたバックグラウンドシグナルは、標的に結合していない抗体同士の弱い相互作用から生じる誤ったアンプリコン形成による結果と考えられる（実施例１６参照）。この実施例のＳＤＡ反応での抗体濃度は、前述の実施例よりも少なくとも２００倍高いため、この実施例におけるバックグラウンドレベルは実施例７よりも高い。
【０１５６】
【表７】
【実施例１０】
【０１５７】
（テザーオリゴヌクレオチドおよび架橋プローブを用いてＩＬ−８を検出する免疫ＳＤＡの実験的証明）
実施例９のＡｂ１−ＳＡ複合体１０ｎＭを、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中で２０ｎＭの３’−ビオチン標識ＲＣＰ−１テザーオリゴヌクレオチド（ＴＯ）と混合した。この混合物を一晩４℃でインキュベートして、ビオチン化オリゴヌクレオチドをＡｂ１−ＳＡ複合体に結合させてＡｂ１−ＳＡ−ＴＯを形成した。
【０１５８】
１ｎＭのＡｂ１−ＳＡ−ＴＯ、ビオチン標識を有さない１ｎＭのＲＨＰ−３（Ｐ１）、１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２（実施例８参照）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０、１０または１００ｐＭのＩＬ−８を含有する混合物を調製した。３０分間室温でインキュベートした後、Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合し、この混合物を３７℃に１０分間加温した。希釈した試料それぞれの部分を、ＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをも含有する乾燥した増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。得られるＳＤＡ混合物中のＡｂ−プローブ複合体の濃度は１ｆＭであり、ＩＬ−８の濃度は０、０．０１または０．１ｆＭのいずれかであった。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。上記の実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１５９】
ＭＯＴＡ値を表８に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８によりＭＯＴＡ値は増加され、図３Ａで示す通り、テザーオリゴヌクレオチドＴＯとのハイブリッド形成を介して分析物結合性部Ａｂ１と間接的に連結したスプリントオリゴヌクレオチドとしてＰ１を用いる免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。この実験では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは用いなかったが、近接対−ＩＬ−８複合体の形成後に試料を約１００万倍に希釈して、標的非依存性プローブの増幅の発生を減少させた。
【０１６０】
【表８】
【実施例１１】
【０１６１】
（ＩＬ−８の検出において検出物結合性部としてＦａｂ’断片を用いる免疫ＳＤＡの実験的証明）
ＭＡｂ Ｇ２６５−８（実施例９参照）をペプシンで消化して、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ領域の断片を得た。Ｆ（ａｂ’）２を精製し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）でさらに処理して、Ｆａｂ’断片を連結しているジスルフィド架橋を減少させた。得られるＦａｂ’断片（Ａｂ１）を２つのＲＨＰ−３オリゴヌクレオチド（Ｐ１）とカップリングさせて、Ａｂ１−Ｐ１複合体を形成した。
【０１６２】
０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１、０．１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２（実施例８参照）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｐ８（実施例１参照）および０、０．１または１ｐＭのＩＬ−８を含有する混合物を調製した。３７℃で３時間インキュベートした後、Ａｂ−プローブ複合体の得られる濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、最終濃度を１０ｎＭにするまでの追加のハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｐ８、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合した。得られる混合物を３７℃で１０分間維持した。次いで、各試料の部分を、ＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをも含有する乾燥した増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。得られるＳＤＡ混合物において、Ａｂ−プローブ複合体の濃度は１００ｆＭであり、ＩＬ−８の濃度は０、０．１または１ｆＭのいずれかであった（表９）。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１６３】
【表９】
【０１６４】
反復試験４回の平均ＭＯＴＡ値を表９に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８により、ＭＯＴＡ値は増加され、Ｆａｂ’をＡｂ１−Ｐ１の分析物結合性部として用いる免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。
【実施例１２】
【０１６５】
（ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するバックグラウンド抑制と組み合わせた、可逆的に固定化されたた近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成）
この実施例で使用した緩衝液は以下の通りである：
・ ＴＢＳ：２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ；
・ 希釈液Ａ：希釈液Ｂプラス０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、８００μＭのＤ−ビオチンおよび５ｍＭのＥＤＴＡ；
・ 希釈液Ｂ：ＴＢＳ、０．５％スキムミルクパウダー（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、英国）、０．１ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級のＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ）；
・ ブロッキング溶液：ＴＢＳ、４．５％スキムミルクパウダー、１ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級のＤＮＡ、２ｍｇ／ｍＬのアジ化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ
・ 洗浄緩衝液：ＴＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；
・ ＳＤＡ反応緩衝液（濃縮）：９０ｍＭのビシン、６０ｍＭのＫＯＨ、１２ｍＭのリン酸カリウム、６．５７％グリセロール、４．２３％ＤＭＳＯ；
・ ＳＤＡプライマー混合物：７．５μＭのＳＲＨ−１、３７．５μＭのＳＬＨ−２、３００μＭのＡＤＲ−５、３７．５μＭのＴＢＤ１０．２（水中）；ならびに
・ ＳＤＡ酵素混合物：７５ｍＭのビシン中１８単位のＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼおよび８単位のＢｓｔポリメラーゼ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｍＭの水酸化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）
選択した標的分析物はＩＬ−８であり、ＭＡｂ Ｇ２６５−５およびＭａｂ Ｇ２６５−８が分析物結合性部である。ＭＡｂ Ｇ２６５−５はプローブＬＨＰ−３に複合体形成して、Ａｂ１−Ｐ１を産生した。ＭＡｂ Ｇ２６５−８はＳＡに複合体形成し、この複合体をＡｂ分子１個当たりの２種のプローブの割合で５’ビオチン化プローブＲＨＰ−３と混合して、Ａｂ２−Ｐ２を産生した。
【０１６６】
以下の手順に従って、捕捉ヌクレオチドを固体支持体に固定した。ＳＡで被覆された９６マイクロウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号１５１２１）をＴＢＳ中で３回すすぎ、ブロッキング溶液中で一晩インキュベートし、次に洗浄緩衝液で４回洗浄した。８０ｎＭの５’ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドを含有する溶液１００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、８００μＭのＤ−ビオチンを含有する洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄した。
【０１６７】
Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を以下の通りに実施した：希釈液Ａ中に０．１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２を１００μＬずつ各マイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。希釈液Ｂ中の０または５０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する試料溶液１００μＬを各マイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。このステップの結果、ＩＬ−８と固定化したＡｂ２−Ｐ２との間に複合体が形成された。
【０１６８】
ＩＬ−８と固定化されたＡｂ２−Ｐ２との間の複合体へのＡｂ１−Ｐ１の結合を、以下の通り実施した：１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有するかハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有しない、希釈液Ａ中の０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体の溶液１００μＬを、ＩＬ−８とＡｂ２−Ｐ２との間の複合体を含有するマイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有するマイクロウェルを、１μＭのＬＢＫ−１を含有する洗浄緩衝液で５回、次いでＬＢＫ−１のない洗浄緩衝液で２回洗浄した。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドに曝露しなかったマイクロウェルを洗浄緩衝液で７回洗浄した。両方の組のウェルに対して、ＴＢＳで最後に２回洗浄した。
【０１６９】
上記の通りに調製した捕捉された複合体を、ＳＤＡ反応緩衝液（濃縮）１２０μＬを加えることによって支持体から溶離し、室温で２０分間インキュベートした。溶離した複合体を含有する体積１００μＬを各マイクロウェルから、ＳＤＡプライマーミックス２０μＬを含有する新たなマイクロウェルに移した。これらのマイクロウェルを２０分間室温でインキュベートし、次いで３７℃のヒートブロック上に１０分間置いた。ＳＤＡによる増幅を開始するために、３７℃の各マイクロウェルから８０μＬを取り出し、５２℃に予め加熱しておいたＳＤＡ酵素混合物２０μＬを含有する別のマイクロウェルに移した。次いで、マイクロウェルを素早くＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間維持して、増幅の過程の間、蛍光強度を観測した。各増幅反応のＭＯＴＡ値を、反応の過程の間に得た動的蛍光プロファイルから測定した。
【０１７０】
図７Ｄで示した通り、抗体−プローブ複合体Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２のプローブ部Ｐ１とＰ２との間の塩基対形成により、この２つの抗体−プローブ複合体間の標的を含まない二元複合体の形成が促進される。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＬＢＫ−１を結合性混合物に含めることは、Ｐ１とＰ２との間の塩基対形成を妨げることによって、標的を含まない複合体の形成を抑制する。ＩＬ−８もＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドも含まない結合性混合物に対する高い平均ＭＯＴＡ値により表１０に示された通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの不在下における標的非含有二元複合体の存在によって、免疫増幅反応中の高レベルのバックグラウンドシグナルが生じた。対照的に、１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、「ＩＬ−８なし」の結合性混合物の平均ＭＯＴＡ値を２０分の１に減少させ、標的を含まない複合体の形成のかなりの減少を示している。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、ＩＬ−８特異的シグナルの強度をわずかに減少させる（ＬＢＫ−１ありおよびなしの５０ｐＭのＩＬ−８混合物のＭＯＴＡ値を比較）；しかし、特異的シグナル対バックグラウンドシグナルの比は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する結合性混合物に関する方がそれを含まないものに関するものよりも１２倍高い。
【０１７１】
さらに、この結果は、図７Ａ〜７Ｇで示す通り、標的抗原（ＩＬ−８）を捕捉または固定し、かつ標的抗原および近接対（Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２）の両方の構成要素を含む固定化した三元複合体を形成するための固定化した近接構成要素（Ａｂ２−Ｐ２）の使用を証明している。また、この実施例は、固定化するハイブリッド（捕捉オリゴヌクレオチドとプローブ部Ｐ２との間に形成した二重鎖）の推定半減期が２０分間の溶離時間よりもはるかに長いにもかかわらず、検出可能な数の固定化された三元複合体が、濃縮したＳＤＡ緩衝液添加後の２０分間の室温での溶離時間中に固相から離れることを示す。
【０１７２】
【表１０】
【実施例１３】
【０１７３】
（可逆的に固定化した近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成：低イオン強度溶液の適用による固定化された複合体の放出）
この実施例で使用したＭＡｂ、分析物および緩衝液は実施例１２で記載のものと同じである。ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例１２で記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例１２で記載の通りに実施された。次いで、０または１０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する１００μＬの希釈液Ｂを各マイクロウェルに加え、これを室温で１時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体および１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Ａを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で１時間インキュベートした。次いで、最後の２回の洗浄ステップがＴＢＳではなく１０ｍＭのＮａＣｌを含有していたことを除き、実施例１２で記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
【０１７４】
ＩＬ−８と、Ａｂ１−Ｐ１の複合体と、Ａｂ２−Ｐ２の複合体との間で得られる固定化された複合体を放出するために、各マイクロウェルを７５μＬの水または濃縮していないＳＤＡ緩衝液で処理した。２０分間室温でインキュベートした後、この溶液７０μＬを取り出し、実施例１２で記載の通りにＳＤＡで分析した。
【０１７５】
この実施例は、低イオン強度溶液を使用して、近接対Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２に同時に結合したＩＬ−８分子で構成された固定化した三元複合体を無傷で放出することを証明している。この実施例の結果は表１１に示す。水（低イオン強度）で溶離した１０ｐＭのＩＬ−８を含有する試料について得られた平均ＭＯＴＡ値は、ＳＤＡ緩衝液（中程度のイオン強度）で溶離した試料の平均ＭＯＴＡ値よりも１０倍近く高く、図７Ｉで示した通り、低イオン強度溶液の適用による三元複合体の放出を立証している。
【０１７６】
【表１１】
【実施例１４】
【０１７７】
（可逆的に固定化した近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成：置換オリゴヌクレオチドの適用による固定化された複合体の放出）
ＭＡｂ、分析物および緩衝液は実施例１２に記載のものと同じである。ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例１２に記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例１２に記載の通りに実施された。次いで、０または１０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する希釈液Ｂ１００μＬを各マイクロウェルに加え、これを室温で１時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体および１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Ａを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で１時間インキュベートした。次いで、実施例１２に記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
【０１７８】
ＩＬ−８と、Ａｂ１−Ｐ１の複合体と、Ａｂ２−Ｐ２の複合体との間で得られる固定化された複合体を放出するために、各マイクロウェルを０．１μＭのＣＭＰＲ−９ｖ２置換オリゴヌクレオチドを含有するか、または置換オリゴヌクレオチドを含有しない、１２０μＬのＳＤＡ緩衝液（濃縮）で処理した。２０分間室温でインキュベートした後、この溶液を実施例１２に記載の通りにＳＤＡで分析した。
【０１７９】
この実施例は、置換オリゴヌクレオチドを使用して、近接対Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２に同時に結合したＩＬ−８分子で構成された固定化された三元複合体を無傷で放出することを証明している。この実施例の結果を表１２に示す。１０ｐＭのＩＬ−８を含有し、置換オリゴヌクレオチドで処理した試料に対して得られた平均ＭＯＴＡ値は、置換オリゴヌクレオチドで処理しなかった１０ｐＭのＩＬ−８試料のＭＯＴＡ値よりも１０倍高く、図７Ｊで示した放出メカニズムを立証している。
【０１８０】
【表１２】
【実施例１５】
【０１８１】
（３’キャップされた近接プローブを使用する免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実施例は、図１４で示したプロセス、すなわち免疫増幅によって検出物を検出するための３’キャップした伸長不可能な近接プローブの使用の実験的証明を提供する。この実施例の標的分析物はＳＡである。３’キャップした近接プローブＰ１はＬＨＰ−３［キャップ］である（実施例１で示した）。ＬＨＰ−３［キャップ］は、ＬＨＰ−３［キャップ］が相補的な鋳型鎖Ｐ２とハイブリッド形成した場合にプローブの伸長を妨げる３’デオキシウリジン部を含む。この実施例では、分析物結合性部は、ＬＨＰ−３［キャップ］の５’末端に付着したビオチン部である。近接対の第２のプローブ、Ｐ２は、５’ビオチン部および伸長可能な３’末端を含むＲＨＰ−３（実施例１で示した）である。キャップしていない対照プローブ、ＬＨＰ−３は、５’ビオチン部および伸長可能な３’末端を含む。増幅プライマー、アダプターオリゴヌクレオチド、レポータープローブ、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドおよびその他の反応成分は実施例８と同じである。
【０１８２】
２０ｐＭの５’ビオチンＲＨＰ−３、２０ｐＭの５’ビオチンＬＨＰ−３［キャップ］、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、５μｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０または１０ｆＭのいずれかのＳＡを含有する溶液を調製した。結合性混合物は、１００ｎＭのＲＤＢ−３ｐ５ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを任意選択的に含有した（表１３参照）。この結合性混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで１０倍に希釈し、実施例８に記載の通りにＳＤＡにかけた。ＬＨＰ−３［キャップ］がキャップしていないＬＨＰ−３に置き換えられた対照混合物も調製し、上記の通りＳＤＡにかけた。種々のＳＤＡ反応からの平均ＭＯＴＡ値を表１３に示す。
【０１８３】
【表１３】
【０１８４】
ＳＡなしの試料のＭＯＴＡ値により示された通り、近接プローブＰ１が３’伸長キャップを含有する反応（「ＬＨＰ−３［キャップ］）は、キャップされていないプローブを含有する反応（ＬＨＰ−３）よりも著しく低いバックグラウンドシグナルを示した。キャップされたプローブおよびキャップされていないプローブの両方に対して、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドのない同じ反応混合物と比較して約１２倍バックグラウンドシグナルを抑制した。キャップされたプローブではバックグラウンドシグナルが低かったが、１０ｆＭのＳＡの存在下のシグナルは、キャップされていないプローブに対してキャップされたプローブではわずかに高く、標的分析物の存在下におけるキャップされたＰ１プローブおよびキャップされていないＰ２プローブの増幅可能な産物への効率的な変換を示す。さらに、この実施例は、プローブ−プローブハイブリッドで形成された重なり合った３’末端の一方のみが３’ＯＨ基を含む場合に、分析物特異的アンプリコンの形成が生じ得ることを証明している。
【実施例１６】
【０１８５】
（標的非依存性アンプリコン形成の原因としての抗体−抗体の相互作用を明らかにする実験）
この実施例は、近接構成要素のＡｂ部同士の間の相互作用が標的非依存性増幅の一因となることを証明する。実施例９で記載の通り、以下に挙げた成分を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液中に含有する４つの試験溶液を調製した。
・ 試験溶液１：１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１および１ｎＭのＡｂ２−ＳＡ−Ｐ２；
・ 試験溶液２：１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１、１ｎＭの複合体形成していないＡｂ２および２ｎＭの複合体形成していないＰ２；
・ 試験溶液３：１ｎＭの複合体形成していないＡｂ１、２ｎＭの複合体形成していないＰ１および１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２；ならびに
・ 試験溶液４：２ｎＭの複合体形成していないＰ１、２ｎＭの複合体形成していないＰ２。
【０１８６】
試験溶液を３０分間３７℃でインキュベートし、次いで、抗体、プローブおよびコンジュゲートの得られる濃度がｐＭの範囲になるように、連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーおよび酵素と混合し、ＳＤＡ反応混合物が５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを任意選択的に含む以外は、実施例９で記載の通りにＳＤＡにかけた。さらに、複合体形成していないプローブを抗体−プローブ複合体のモル比の２倍で使用して、複合体中２：１の既知のプローブ：抗体比を反映させた。標的分析物は反応に存在しなかったので、生成したＭＯＴＡ値は標的非依存性プローブの変換のみに起因する。
【０１８７】
種々の試験溶液からの平均ＭＯＴＡ値を表１４に報告する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドなしの反応混合物では、すべての試験溶液について平均ＭＯＴＡ値は１０００００を上回った。５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する試験溶液４では、平均ＭＯＴＡ値は２００００未満に減少しており、５倍を超えるバックグラウンドシグナルの抑制を示している。対照的に、試験溶液１のＭＯＴＡ値は、そのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在によってわずか約２分の１に減少して約５９０００になり、ＲＤＢ−３ｐ８によりもたらされるブロッキング効率は、複合体形成していないプローブＰ１およびＰ２の存在中よりも、２つの無傷の抗体プローブ複合体の存在中のほうが低いことを示している。試験溶液１のＭＯＴＡ値が試験溶液４のＭＯＴＡ値よりも高いことは、試験溶液１で抗体介在型アンプリコンの形成が生じていることを暗示し、さらにＡｂ１とＡｂ２が互いに標的非依存性付着することにより、付着したプローブ部が十分に近く近接されて誤ったアンプリコン形成を促進することを示唆する。明らかに、互いに付着した抗体対の局所プローブ濃度はバルク溶液のプローブ濃度全体よりもかなり高いので、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは試験溶液１の標的非依存性プローブ変換を、付着した抗体対が形成できない試験溶液４ほど効率的に抑制することはできない。これは、試験溶液４のＭＯＴＡ値と匹敵するＭＯＴＡ値を示す試験溶液２および３の結果と一致しており、これは、試験溶液１で見られた抗体介在型プローブ変換の一因となる高いＭＯＴＡ値を生じるために、近接対の両方のプローブ部は抗体に複合体形成していなければならないことを示している。
【０１８８】
【表１４】
【実施例１７】
【０１８９】
（反転した反対の配列方向を有するプローブを用いる免疫SDAによるＩＬ−８の検出）
この実施例は、図１Ｊで示した概念の実験的証明を与える。抗体複合体Ａｂ１−ＳＡおよびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７に記載した通りである。Ａｂ１−ＳＡを、プローブＲＢＤ−３ｖ３とプローブ：抗体比２：１で、４℃で一晩インキュベートしてＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１を形成した。実施例１で言及した通り、ＲＢＤ−３ｖ３はビオチン部をその３’末端の近くに含有している。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｚ８ならびに０、０．１、０．２５、０．５および１．０ｐＭのＩＬ−８を含有する試料を調製した。室温で３時間インキュベートした後、各標準試料の分量を、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈し、さらに、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２）、アダプタープライマー（ａｄｒ−８）、レポータープローブ（ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ））およびハイブリッド形成ブロッカー（ＲＤＢ−３ｚ８）５０ｎＭを含有する溶液中に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈した。ＳＤＡ反応では、プライマー、アダプターおよびレポーターの濃度は実施例１８で記載の通りであり、ハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｚ８の濃度は５０ｎＭであった。これらの希釈混合物の反復試験試料４点を、それぞれの最初の試料から調製した。次いで、希釈混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。実施例９に記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１９０】
平均ＭＯＴＡ値を表１５に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、ＩＬ−８のレベルが増大することにより、徐々により高いＭＯＴＡ値になり、図１Ｊで記載の通り、プローブの１つが抗体とその３’末端の近くの連結を介してつながれている免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証している。さらに、この結果は、伸長可能な３’ＯＨ基を１つだけ含むプローブ−プローブ（Ｐ１−Ｐ２）二重鎖が分析物特異的アンプリコンを産生できることを立証している。
【０１９１】
【表１５】
【実施例１８】
【０１９２】
（内部の核酸対照および近接対を用いる免疫ＳＤＡによるＩＬ−８の定量）
この実施例は、核酸対照およびそれぞれ分析物に結合した近接構成要素から産生された標的アンプリコンの共増幅から得られる２つの蛍光シグナルの比を使用する試験試料中の標的分析物（この場合、ＩＬ−８）の絶対定量を説明する。本発明によれば、複数の標準試料および少なくとも１つの試験試料が最初に形成される。複数の標準試料はそれぞれ、既知の開始量の核酸対照配列、既知の開始量の標的分析物およびある量の本発明の近接対を含有する。通常、複数の標準試料の異なる構成要素は、既知の量の標的分析物を有することとなる。試験試料は、既知の開始量の核酸対照配列、未知の量の非核酸標的分析物およびある量の近接対を含有する。絶対定量法で測定されるのは、この未知の量の標的分析物である。
【０１９３】
標準試料および試験試料では、同じ標的分析物分子に同時に結合している近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、上記の本発明方法のいずれかによってアンプリコンに変換される。次いで、各標準試料および試験試料で得られるアンプリコンおよび核酸対照配列を共増幅する。各試料中、同じ試料中のアンプリコンおよび対照核酸の増幅が、増幅の過程の間、異なる蛍光放出波長で独立して観測することができるように、アンプリコンおよび対照配列の増幅により、検出可能な蛍光の放出を別個に発生させることができる。
【０１９４】
増幅の間に得られた蛍光値は、「リアルタイム蛍光プロファイル」と呼ばれ、測定時点を横座標に割り当て、蛍光値を縦座標に割り当てた二次元のグラフとして表示することができる。図１５Ａは、下記の実験における標的と対照アンプリコンとの共増幅から得られる試料の２色のリアルタイム蛍光プロファイルの実施例を示す。この実施例で使用した検出波長は、それぞれ標的アンプリコンおよび対照核酸に特異的なレポーターオリゴヌクレオチドの標識に使用した蛍光色素ローダミンおよびフルオレセインに特徴的なものであった。
【０１９５】
標準試料および試験試料のそれぞれについて、蛍光強度を２つの独立した検出波長で、増幅間隔を含む複数ｎの時点にわたって測定した。所与の試料ｉに対し、各時点（ｔｐ）は一方は増幅した標的アンプリコン（ＦＴ（ｔｐ）ｉ）に対応し、他方は増幅した対照核酸（ＦＣ（ｔｐ）ｉ）に対応した２つの関連した蛍光値を有する。同じ試料から同じ時間間隔で集められたこれらの２つの読取り値は、蛍光値の「マッチした対」と呼ばれる。
【０１９６】
分析の便宜上、２種以上の異なる試料のリアルタイム蛍光プロファイルは同期していると考えられる。すなわち、２種以上の異なる試料からの同じ時点は、各試料での増幅開始後の同じ尺度の経過時間に対応している。異なる試料からのこれらの等価な時点を「同時」という。異なる試料の未加工の蛍光プロファイルが同期していない場合、当技術分野で知られた方法を用いて、未加工データから同期した「正規化した」プロファイルを構築することができる（例えば、それらの開示の全体は参照により本明細書内に組み込まれる特許文献２２および特許文献２３参照）。
【０１９７】
所与の試料ｉのリアルタイム蛍光プロファイル内の各時点（ｔｐ）について、蛍光値の各マッチした対を使用して、関係（式１）に従ってシグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを算出することができる。
【０１９８】
SR(tp)i=[FT(tp)i-FT(base)i]/[FC(tp)i-FC(base)i] 式１
【０１９９】
式中、基準蛍光測定値、ＦＴ（ｂａｓｅ）ｉおよびＦＣ（ｂａｓｅ）ｉは、標的と対照アンプリコンの検出可能な増幅前の各蛍光強度に対応している。基準蛍光のその他の近似を用いてもよいが、実際には、ＦＴ（ｂａｓｅ）ｉは、試料ｉの増幅中の最初のいくつかの時点にわたって測定した標的アンプリコンの蛍光の平均値とし、ＦＣ（ｂａｓｅ）ｉは、それらの同じ時点にわたって測定した平均核酸対照蛍光とする。
【０２００】
したがって、増幅した試料から得られる、標的および対照のリアルタイム蛍光プロファイルの各対は、ｎをプロファイル中の時点の数とすると、ｎ個のシグナル比を生じることとなる。同様に、複数のｋ個の試料にわたって同時である各時点は、それに伴って、各シグナル比が一致した時点ｔｐにおいて試料ｉに対応しているｋ個の「同時」シグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを有している。
【０２０１】
試料によって生じたシグナル比と試料が含有する分析物（ＩＬ−８）の量とを相関させるために、種々の既知の量のＩＬ−８を含有する複数のｋ個の標準試料について測定したシグナル比を以下の通りに分析した。同時シグナル比の各組（すなわち、ｋ個すべての標準試料にわたって同じ時点、ｔｐから導出したシグナル比）をまず式２に従って既知の分析物濃度に対する線形回帰にかける。式２は、量ｌｏｇ（ＳＲ（ｔｐ）ｉ）およびｌｏｇ（［ＩＬ−８］ｉ）を関連付け、回帰手順で決定した勾配ｍ（ｔｐ）および切片ｂ（ｔｐ）の値を有する「検量」線を定義する。
【０２０２】
log(SR(tp)i)={m(tp)xlog([IL-8]i)}+b(tp) 式２
【０２０３】
この操作をｎ組の同時シグナル比のそれぞれについて繰り返して、各対は複数の標準試料ｋ個にわたる個々の同時時点に対応しながら、ｎ対の勾配と切片の値で定義したｎ個の検量線を作製する。この分析から得られたｎ個の検量線の１つ（ｔｐ＝８分）を図１５Ｂで示す。
【０２０４】
次いで、勾配と切片の値の「最高の」対に対応する「最高の」測定時点（ｔｐｂｅｓｔ）を適合度基準に基づいて選択し、試験試料についてのシグナル比を式１に従って、選択した「最高の」時点と同時の時点で得られた蛍光測定値から算出する。次に、試験試料ｊ中の分析物ＩＬ−８の量を、最高の測定時点の試験試料のシグナル比、ＳＲ（ｔｐｂｅｓｔ）ｊ、および勾配、ｍ（ｔｐｂｅｓｔ）と切片、ｂ（ｔｐｂｅｓｔ）「最高の」対の値から式３によって計算することができる。
【０２０５】
log([IL-8]j)={log(SR(tpbest))-b(tpbest)}/m((tpbest) 式３
【０２０６】
種々の統計的基準を用いて「最高の」検量線または対応する「最高の」測定時間、ｔｐｂｅｓｔを決定することができる。多くのこれらの統計的基準は、特許文献２２および特許文献２３に記載されている。最高の時間を選択するその他の統計的方法も用いることができる。
【０２０７】
実験手順を以下の通りに実施した。抗体−プローブ複合体Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７に記載した通りである。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、２５ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｐ８および０．０１、０．１、１．０、１０．０および１００ｐＭのＩＬ−８を含有する標準試料を調製した。室温で３時間インキュベートした後、各標準試料の分量を、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈し、次いでさらに、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２）、アダプタープライマー（ａｄｒ−８およびａｄｑｓ−２）、レポータープローブ（ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）およびＡＬＴＤ６．９（Ｆ／Ｄ））、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカー（ＲＤＢ−３ｐ８）ならびに対照核酸（ＩＱＳ−２）１０００００コピーを含有する溶液中に１：１００（ｖ／ｖ）に希釈した。２つのそのように希釈された混合物は、最初の標準試料のそれぞれから調製された。次いで、希釈された標準混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。次に、このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。この１時間のインキュベーションの間、各マイクロウェルの蛍光を、一方はローダミン蛍光に特異的であり、他方はフルオレセイン蛍光に特異的である２つの光学的チャネルを介して記録した。１対の蛍光読取り値（１つのフルオレセインと１つのローダミン）をそれぞれ１分間隔で１時間の反応過程の間記録し、各ＳＤＡ反応について６０対の蛍光読取り値が得られた。
【０２０８】
濃度０．０１、０．１、１．０、１０．０および１００．０ｐＭのＩＬ−８を含有する１組の試験試料を調製し、標準試料に対して上記した通り、競合的な２色のＳＤＡにかけた。対照オリゴヌクレオチド（ＩＱＳ−２）の量は標準試料のものと同等であった。
【０２０９】
この実施例では、５つのＩＬ−８標準試料それぞれの合計１０個の複製ＳＤＡ反応からの２色の蛍光データを使用して、以下の検量線式を構築した。１０個の増幅した標準試料（ｉ）のそれぞれについて、シグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを式１に従って６０個の時点（ｔｐ）それぞれに対して計算した。標準試料からの同時シグナル比の各組を、上記の式２に記載の通りに既知のＩＬ−８濃度に対する線形回帰にかけると、６０個の時点のそれぞれについて、異なる「検量」線に対応する勾配（ｍ（ｔｐ））および切片（ｂ（ｔｐ））値が得られた。適合度基準を検量線に適用して、この複数の標準試料の最高の測定時間はｔｐ＝８分であると決定した。ｌｏｇ（ＳＲ（ｔｐ＝８分））対ｌｏｇ（［ＩＬ−８］）のプロットおよび対応する検量線を図１５Ｂに示す。これは、分析物濃度の１００００倍の範囲にわたるシグナル比とＩＬ−８濃度との間の線形関係を表す。
【０２１０】
上記の種々の試験試料の蛍光データ（ｔｐ＝８分）からシグナル比を算出した。次いで、標準曲線から導出したｔｐ＝８分の検量線に対応する最高の勾配および切片値を使用し、式３を使用して、試験試料のＩＬ−８濃度を計算した。
【０２１１】
表１６に示した結果は、計算したＩＬ−８濃度と実際のＩＬ−８濃度との間でほぼ一致しており、本発明の方法による標的分析物の正確な定量を立証している。
【０２１２】
【表１６】
【０２１３】
これまで特定の代表的な実施形態および詳細を参照して本発明を完全に記載してきたが、本明細書に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく変更および修正を加えられることができることは当業者には明らかであろう。本明細書に記載された方法および手順のすべては、当業者が容易に実施できるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の分析物を検出および定量する超高感度、ハイスループットアッセイを提供するための、分析物特異的結合成分および核酸増幅の新規な適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
興味のある分析物を検出および定量する研究分野における主要目的は、血液、血清、血漿、尿またはその他の体液などの複雑な環境にあるごく少量の分析物を検出することが可能な、高度に特異的かつ感度のよいアッセイシステムを開発することである。診断上重要な分子は、体液のその他の成分と比較して極めて微量で構成または存在し得るので、許容できるアッセイ形態は、試料中の総生体材料の割合のごく少量に相当するであろう分析物を識別しなければならない。従来の手順では分析物特異的抗体を使用して必要な識別をしていたが、抗体はその他の非標的分析物との交差反応性により限定される。高い特異性を有する抗体であっても、低い親和性で抗体に結合する分析物が豊富な環境にその抗体がごく少量で存在すれば、わずかな交差反応性により、克服できない問題が引き起こされることがある。
【０００３】
免疫増幅は、免疫アッセイの感度を増大させる手段として使用されてきた。この手順では、増幅することができるＤＮＡマーカー分子に複合体形成している抗体と抗原を接触させる。検出可能に標識された抗−抗体で抗体−抗原複合体を標識するなどの従来の手順で抗体の存在を検出する代わりに、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）によるＤＮＡマーカーの増幅を介して、抗原−抗体−マーカー複合体を間接的に検出する。さらに、増幅したＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡに挿入すると蛍光を発する染料の使用などの従来の方法で検出してもよい。「免疫ＰＣＲ」として知られるこの方法は、検出に抗−抗体を使用する従来のアッセイと比較して、免疫アッセイの理論感度を１００００倍超増大させるのに使用されてきた。しかし、実際には抗体−核酸複合体の他の分析物への非特異的結合、または反応場所を提供するために使用している支持体表面への非特異的結合によって、免疫ＰＣＲの感度は制限されている。さらに、試料は、前回の反応の残りの増幅された標識（「アンプリコン」）によって汚染されることがある。これは、臨床的に許容されるハイスループットアッセイにこの技術を適用するには問題である。
【０００４】
これらの問題を解決する努力がいくつかなされてきた。例えば、研究者らは固定化された抗体を使用して抗体−核酸−抗原複合体を固体支持体に捕捉した。これはＤＮＡ増幅の前に、複合体化していない抗原および結合していない抗体−核酸複合体の除去を促進する。別の場合では、抗原の異なる決定基に特異的な２つの抗体は、抗原を結合させることによって近接させることができる。各抗体は、隣接する抗体−オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる一本鎖オリゴヌクレオチド部で修飾して二本鎖領域を形成する。オリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成は、同じ抗原に結合したときに２つの抗体が近接することによって促進される。次いで、ＤＮＡの二本鎖領域は、抗原の存在を示す検出可能なシグナルを生じさせる増幅の対象となる。この技術は、いずれかの抗体のみの非特異的結合ではアンプリコンを形成できるには不十分なため、検出の感度を高めるのに有利である。しかし、この方法の感度は、とりわけ、誤った抗原非依存性アンプリコンの形成につながる抗体部同士の非特異的相互作用によって限定される可能性がある。
【０００５】
したがって、本技術分野では、さらにより感度のよい分析物の検出方法および定量方法を提供することが引き続き必要とされている。臨床環境で有用な方法は、所望の分析物に対して極めて選択的であり、ハイスループットスクリーニング法に容易に適合することが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献４】米国特許第４９６５１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５２７０１８４号明細書
【特許文献６】米国特許第５６４８２１１号明細書
【特許文献７】米国特許第５７４４３１１号明細書
【特許文献８】米国特許第５１３０２３８号明細書
【特許文献９】米国特許第５４２７９３０号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８４９８７８号明細書
【特許文献１１】米国特許第５６６５５３９号明細書
【特許文献１２】米国特許第６５１１８０９号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００２／００６７７９号明細書
【特許文献１４】米国特許第５９２８８６９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５９１９６３０号明細書
【特許文献１６】米国特許第５９３５７９１号明細書
【特許文献１７】米国特許第６３１６２００号明細書
【特許文献１８】米国特許第６３７９８８８号明細書
【特許文献１９】米国特許第５８４０４８７号明細書
【特許文献２０】米国特許第５９１９６３０号明細書
【特許文献２１】米国特許第５８４６７２６号明細書
【特許文献２２】米国特許第６０５４７２９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５８６３７３６号明細書
【特許文献２４】米国特許第６０６６４５８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Walker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 392 (1992)
【非特許文献２】Walker et al., Nucl. Acids Res. 20: 1691 (1992)
【非特許文献３】Guatelli et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 1874-78 (1990)
【非特許文献４】Lizardi et al., Bio Technology 6: 1197 (1988)
【非特許文献５】Hirose et al., Clin. Chem. 44: 2446-2452 (1998)
【非特許文献６】Kwoh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 1173-77 (1989)
【非特許文献７】Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed., 2001)
【非特許文献８】Nadeau et al., "Real-time Sequence-specific Detection of Nucleic Acids during Strand Displacement Amplification," Anal. Biochem. 276: 177-187 (1999)
【非特許文献９】http://www.bioinfo.rpi.edu/application/mfold
【非特許文献１０】Zuker, Nucl. Acids. Res. 31: 3406-15 (2003)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ハイスループットアッセイに適した合理化された作業の流れを与える高感度、低バックグラウンドのアッセイを提供することによって、これらの要求を達成する。本発明のアッセイは、２つの「分析物特異的結合単位」、例えば抗体（「近接対」）の同じ分析物の異なるエピトープまたは近接している分析物のエピトープとの相互作用により分析物特異的アンプリコンを形成することによって分析物を検出および定量する。近接対の各構成要素（「近接構成要素」）は、一本鎖核酸、好ましくはＤＮＡ（「オリゴヌクレオチド部」または「プローブ」）に複合体形成している分析物特異的結合単位を含む。オリゴヌクレオチド部は、標的または分析物（本明細書を通じて「標的」と「分析物」は同義的に使用する）との相互作用により近接構成要素が密接に接触したときに、アンプリコンを直接的または間接的に形成する。近接構成要素と分析物との相互作用により、オリゴヌクレオチド部は密接に近接し、分析物と結合していない近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の濃度に比べ、その有効な局所濃度を高める。この濃度効果は、結合していない近接構成要素のオリゴヌクレオチド部に比べ、アンプリコンを形成する２つのオリゴヌクレオチド部の相互作用を大いに促進させる。次いで、近接対−分析物複合体を、当技術分野でよく知られているＤＮＡ増幅技術を使用してアンプリコンを増幅することにより検出する。したがって、他のオリゴヌクレオチド部と相互作用していないオリゴヌクレオチド部は増幅することが不可能であり、アンプリコンの形成は近接対−分析物複合体のオリゴヌクレオチド部の局所的濃度の増大によって大いに促進されるため、アンプリコンの形成は標的の存在に対して高感度である。
【０００９】
本発明のアッセイの感度は、分析物と複合体化していない溶液中の近接構成要素同士の誤った不要なアンプリコンの形成を妨げることにより向上するのに有利である。本発明は、１つには、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の一方または両方とハイブリッド形成する１つまたは複数のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド（または「ハイブリッド形成ブロッカー」）を提供することによって、この目的を達成する。ハイブリッド形成ブロッカーは、分析物と複合体化していない近接構成要素同士の溶液内でのアンプリコン形成を妨げるのに有利である。ハイブリッド形成ブロッカーを使用する方法は、少なくとも１つの近接構成要素のオリゴヌクレオチド部がハイブリッド形成ブロッカーとハイブリッド形成する反応混合物中の、第１および第２の近接構成要素と分析物を接触させることを含む。混合物を加温するか、イオン強度を低下させて十分にハイブリッド形成ブロッカーを解離させ、そして混合物を冷却するか、混合物のイオン強度を増大させて、分析物に結合した近接構成要素間にアンプリコンを形成させる。一実施形態では、分析物に結合した近接構成要素の大部分は、加温ステップの間、分析物に結合したままである。別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーを近接構成要素のオリゴヌクレオチド部にモル過剰で加える。さらに別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは「スプリントオリゴヌクレオチド」とハイブリッド形成して、スプリントオリゴヌクレオチドが近接構成要素のオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成できないようにする。さらなる実施形態では、「デブロッカーオリゴヌクレオチド」（または「デブロッカー」）とも呼ばれる相補配列とハイブリッド形成させることによってハイブリッド形成ブロッカーを近接構成要素のオリゴヌクレオチド部から除去する。すなわち、デブロッカーは過剰に加えた場合、ハイブリッド形成ブロッカーがオリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できないように、ハイブリッド形成ブロッカーを二重鎖にして隔絶する。したがって、デブロッカーは、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとその相補配列との間のハイブリッドの存在を減少させる。
【００１０】
ハイブリッド形成ブロッカーは、その末端の一方にヘアピンループを含んでいてもよく、このヘアピン構造はＤＮＡポリメラーゼの二本鎖「プライマー」として働く。本発明の便宜上、「プライマー」は、鋳型核酸の一本鎖とハイブリッド形成できるヌクレオチド、典型的にはＤＮＡの短い一続きと定義する。プライマーとその相補配列との間の二重鎖ハイブリッドは、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるプライマーの伸長のための、あるいはＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の合成のための開始部位を提供する。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長がハイブリッド形成ブロッカーをオリゴヌクレオチド部から鎖置換によって除去するように、ハイブリッド形成ブロッカーはヘアピン構造の下流領域でオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成してもよい。この実施形態は、オリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドから反応混合物を加温する必要なくハイブリッド形成ブロッカーを除去するのに有利であり、それにより分析物との近接構成要素の解離を回避または低減する。別の実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは、近接対−分析物複合体の形成後および近接対のオリゴヌクレオチド部が互いにハイブリッド形成した後に加えられる。ハイブリッド形成ブロッカーは、まだ溶液中にある少なくとも１つの近接構成要素のオリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成し、それにより分析物と結合していない近接対によるアンプリコンの分析物非依存的な形成を妨げる。この実施形態でも、バックグラウンドシグナルを減少させるための反応混合物の加熱は必要ではない。ヘアピン構造を他の場所でも使用してもよい。例えば、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の一方または両方は、アンプリコンの形成をブロックするヘアピン構造を含んでいてもよい。ヘアピンのループ内またはヘアピンに隣接する不対塩基によるオリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成（あるいは穏やかな加熱）は、ヘアピン構造を分裂させ、それによりアンプリコンを形成および増幅させる。
【００１１】
バックグラウンドシグナルは、特異的な放出オリゴヌクレオチドが提供されるまでアンプリコンの形成を妨げるか、近接対／分析物複合体を捕捉して結合していない成分を除去する固相捕捉オリゴヌクレオチドを提供することによって、好都合にさらに減少させることができる。
【００１２】
さらなる利点は、抗体が結合できる任意の分析物を検出するのに利用できる一般的な試薬を使用することによって提供される。例えば、オリゴヌクレオチド部は抗Ｆｃ抗体またはプロテインＡもしくはＧとカップリングすることができ、これは抗体−分析物複合体の免疫グロブリン定常領域と反応する。一部の実施形態では、一方または両方の抗体は、アプタマー、受容体分析物に特異的なリガンド、またはリガンド分析物に特異的な受容体などの任意の適切な特異的検出物−標的単位と置き替えられる。一方または両方の抗体部分のこの置き換えにより、それがなければ抗体部分同士の非特異的相互作用から生じるかもしれない誤ったアンプリコンの形成が減少する。その他の適切な特異的分析物−標的単位としては、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の機能的断片、がある。抗原の結合と関係していない抗体構造のサイズが小さくなると、抗原又は分析物との特異的相互作用を減少させることなく、抗体同士の非特異的相互作用が減少すると考えられている。
【００１３】
本発明によって提供される利点により、血液およびその他の体液などの臨床関連試料中の分析物を検出および定量するのに使用することができるハイスルーアウトかつ極めて感度のよいアッセイが可能になる。本発明の方法によって検出および定量できる分析物は、複雑な混合物（例えば、体液）にかつてないほどごく少量で存在してもよい。一実施形態では、本発明を使用して、サイトカインなどの分析物約８０ｆｇ／ｍｌを検出している。これは、そのような低モル重量の分析物の少なくとも約１０ｆＭのモル濃度を検出する能力に換算される。
【００１４】
したがって、本発明は、標的分析物ばかりでなく本発明の方法を実施するのに有用な組成物を検出および／または定量する種々の方法を提供する。例えば、任意の適切な増幅方法を本発明の方法で使用してもよい。そのような方法には、これらだけに限定するものではないが、ＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」；非特許文献１；非特許文献２；およびその開示の全体が本明細書に組み込まれる特許文献５参照）、好熱性鎖置換増幅（「ｔＳＤＡ」；その開示の全体が本明細書に組み込まれる特許文献６および特許文献７参照）、自己保持配列複製（「３ＳＲ」；非特許文献３参照）、核酸配列に基づく増幅（「ＮＡＳＢＡ」；特許文献８参照）、Ｑβレプリカーゼシステム（非特許文献４参照）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」；特許文献９参照）、転写介在増幅（「ＴＭＡ」；非特許文献５）；および転写に基づく増幅（非特許文献６参照）がある。好ましい増幅方法はＳＤＡである。
【００１５】
アンプリコン自体は、近接対の隣接するオリゴヌクレオチド部のハイブリッド形成を含む多くの方法で形成してもよい。例えば、隣接するオリゴヌクレオチド部はそれらの長さの全体または一部分にわたってハイブリッド形成してよい。隣接するオリゴヌクレオチドが各末端部分でハイブリッド形成する場合、得られた二重鎖はＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長し得る。増幅反応がＳＤＡ反応を含む場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部またはそれらの伸長産物の一方または両方に組み込まれてもよい。
【００１６】
また、アンプリコンは、近接対のオリゴヌクレオチド部を、オリゴヌクレオチド部の各末端とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド「スプリント」と接触させることによって形成してもよい。オリゴヌクレオチドスプリントは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、第１のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第１の配列をさらに含んでもよい。さらに、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、第２のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第２の配列を含んでもよい。スプリントは、第１および第２のプローブを加えるステップと、オリゴヌクレオチド部と相補的な配列をＤＮＡポリメラーゼで伸長するステップとを含む方法で使用してもよい。第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は置換され、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部との複合体形成を介して第１の近接構成要素に付いたアンプリコンが残る。本発明の便宜上、増幅されていない置換されたオリゴヌクレオチド部を「テザー（ｔｅｔｈｅｒ）オリゴヌクレオチド」と呼ぶ。本発明の便宜上、「置換」は、鎖の置換、又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより触媒作用を受けた置換された鎖の加水分解などの方法により達成されてもよい。さらに、この方法は、ＳＤＡなどの任意のよく知られた増幅方法でアンプリコンを増幅するステップを含んでもよい。
【００１７】
別の実施形態では、アンプリコンは近接対と分析物との複合体から放出されるのに有利であり、これにより、アッセイ支持体表面に吸着された抗体−オリゴヌクレオチド複合体からシグナルを除去することによりバックグラウンドを減少させる。この実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドスプリントを使用してアンプリコンを形成し、近接構成要素の両方のオリゴヌクレオチド部はテザーオリゴヌクレオチドである。第１の橋かけプローブは第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端とハイブリッド形成し、第２の橋かけプローブは第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端とハイブリッド形成する。第１および第２の橋かけプローブは、それぞれの各３’末端で互いにハイブリッド形成する。ポリメラーゼで伸長すると、第１および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は置換され、近接対−分析物複合体の残りの成分からアンプリコンが放出される。次いで、任意のよく知られた増幅方法によってこのアンプリコンを増幅する。
【００１８】
別の実施形態では、近接対−分析物複合体を固体支持体に固定する。アンプリコンを上記の方法を使用して複合体から溶液へ放出し、一方、近接対−分析物の残りの成分は固体支持体に結合したままである。この実施形態では、アンプリコンを含む溶液は、増幅の前に複合体の残りの成分から完全に除去することができ、これによりバックグラウンドをさらに減少させる。
【００１９】
上記に従い２つのスプリントオリゴヌクレオチドを使用することによって、標的を介在したプローブサイクル方法が可能になる。この方法は、近接対を第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、オリゴヌクレオチド部の相補体をＤＮＡポリメラーゼで伸長して、アンプリコンを近接対から置換するステップと、アンプリコンを増幅するステップと、近接対を追加の第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドと接触させるステップとを含む。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の５’末端と任意選択的にハイブリッド形成してもよい。スプリントオリゴヌクレオチドは、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端および第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の３’末端と場合によってハイブリッド形成することができる。この両方のスプリントオリゴヌクレオチドは、第１と第２のスプリントオリゴヌクレオチドの間に架橋を形成する第３のスプリントオリゴヌクレオチドの相補配列と任意選択的にハイブリッド形成してもよい。
【００２０】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドスプリントは、オリゴヌクレオチド部とハイブリッド形成せず、且つ第１のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第１の配列の上流である、すなわち５’方向に位置するプローブの領域に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含んでもよい。さらに、第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、第２のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な第２の配列を含んでもよい。スプリントは、第１および第２のプローブを加えるステップと、オリゴヌクレオチド部と相補的な配列をＤＮＡポリメラーゼで伸長するステップとを含む方法で使用してもよい。第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は伸長した鎖で置換されて、これまでのところ無傷の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を含み、第１の近接構成要素に付いたアンプリコンを残す。さらに、この方法は、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位をＲＮＡポリメラーゼと接触させることによって一本鎖ＲＮＡを転写するステップを含む。ＲＮＡは、標識プローブとのハイブリッド形成を含む当技術分野でよく知られた手段により検出してもよい。鎖置換に加えて、第２の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して除去してもよい。
【００２１】
あるいは、一本鎖ＲＮＡ転写物を、ＲＮＡとその３’領域でハイブリッド形成するプライマーと接触させて、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成する逆転写酵素によりＲＮＡを転写することができる。このＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化すると、相補ＤＮＡ鎖が得られる。このＤＮＡ鎖を、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位に対する相補体を含むプライマーと接触させると、無傷の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位が再生する。ＤＮＡ鎖を、一本鎖ＲＮＡ転写物の合成を触媒するＲＮＡポリメラーゼと接触させる。転写物をプライマーと接触させるステップ、プライマー−転写物ハイブリッドを逆転写酵素と接触させるステップ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを消化するステップ、および得られる一本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を再構成するプライマーと接触させるステップを繰り返して、アンプリコンを指数関数的に増幅することができる。
【００２２】
本発明の増幅方法は、「均一な形態」の溶液で行ってもよく、または「不均一な形態」中で反応の成分を固体支持体に固定することを含んでもよい。不均一な形態を使用する増幅の方法では、近接構成要素、分析物、または近接構成要素もしくは近接対と分析物との複合体は、粒子または反応容器の表面などの固体支持体に固定される。この目的のため、近接構成要素または分析物は、支持体に複合体形成しているオリゴヌクレオチド（「捕捉オリゴヌクレオチド」）と相補的なオリゴヌクレオチド部を含む。近接構成要素または分析物のオリゴヌクレオチド部と捕捉オリゴヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。捕捉された近接構成要素または分析物は、適切な制限エンドヌクレアーゼと認識部位を接触させるステップを含む方法で固体支持体から放出される。あるいは、結合した近接構成要素または分析物を放出する方法は、温度を上昇させるか、イオン強度を低下させるか、反応混合物のｐＨを変更するか、ハイブリッドの変性を促進するキレート剤を加えるような手段によって、捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素または分析物のオリゴヌクレオチド部とのハイブリッドを変性するステップを含む。さらに別の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば物理的、酵素的、化学的または光化学的手段による開裂を特に受け易い、切れ易い連結を含む。さらなる実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドまたは近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物は、プライマーと相補的な配列を含む。プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物との間に形成したハイブリッドとハイブリッド形成できる。次いで、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物は、ポリメラーゼ連鎖伸長および鎖置換によってハイブリッドから置換されてもよい。関連の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドはポリメラーゼ伸長の鋳型を形成するヘアピン構造を形成でき、捕捉された近接構成要素または分析物を鎖置換により放出させる。
【００２３】
捕捉オリゴヌクレオチドと近接構成要素のオリゴヌクレオチド部または分析物との間のハイブリッドは、任意選択的にＲＮＡ配列を含んでもよい。近接構成要素または分析物は、ハイブリッドをＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼと接触させることにより表面から放出される。一実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、アンプリコンの形成に関与するオリゴヌクレオチド部である。このオリゴヌクレオチド部は捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している限りアンプリコンを形成できないが、例えば鎖置換によりハイブリッドからオリゴヌクレオチド部が放出されるとアンプリコンを形成できる。
【００２４】
不均一な形態を使用する増幅は、分析物を反応混合物中の第１の近接構成要素と接触させるステップと、固体支持体に固定された、又はアンプリコンを含む近接対−分析物複合体を形成するのに十分な条件下で固体支持体に固定されうる第２の近接構成要素を加えるステップと、結合した近接対−分析物複合体を洗浄して固体支持体に固定されていない近接構成要素を除去するステップと、アンプリコンを増幅するステップと、増幅産物を検出するステップとを含んでもよい。第２の近接構成要素を、第１の近接構成要素を加える前、後またはそれと同時に加えてもよい。第２の近接構成要素は、任意選択的に、洗浄後だが増幅前に開裂する切れ易い連結によって固体支持体に固定してもよい。上記の近接構成要素を固体支持体に固定し、近接構成要素を上記の固体支持体から開裂する方法を使用してもよい。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドを加えるステップを含む方法など、上記のアンプリコンを形成する方法のいずれかを不均一な形態で使用することができる。
【００２５】
本発明は、上記の増幅方法のいずれでも使用できる一般的な成分を提供するのに有利である。好ましい実施形態では、分析物を、第１のエピトープと結合する第１の抗体および第２のエピトープと結合する第２の抗体と接触させる。ここで、第１および第２のエピトープおよび抗体は同じでも異なってもよい。第１および第２の抗体はそれぞれ、異なるハプテン部（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、トリニトロフェノール、ジニトロフェノールなど）で任意選択的に標識されてもよい。抗体は、第１および／または第２の抗体と特異的に結合してアンプリコンを含む近接対を形成する１つまたは複数の近接構成要素を含む一般的な成分と接触させる。一般的な成分は、例えばオリゴヌクレオチド部に複合体形成したプロテインＡまたはプロテインＧでもよい。あるいは、一般的な成分は、オリゴヌクレオチドに複合体形成している抗免疫グロブリン定常領域の抗体であってもよい。第１および第２の抗体がハプテン部で標識されていれば、一般的な成分は特定のハプテン標識に特異的な抗体（またはストレプトアビジンなどのその他の作用物質）でもよい。一般的な成分を使用することは、各分析物に特異的な分析物結合単位をオリゴヌクレオチド部で修飾する必要性をなくすのに有利である。
【００２６】
近接構成要素は、２つの異なるオリゴヌクレオチド部に複合体形成している抗原でもよい。この実施形態の分析物は、ＩｇＧまたは任意のその他のタイプの抗体でもよい抗原特異的抗体である。結合した抗原−オリゴヌクレオチド複合体が異なるオリゴヌクレオチド部を含む場合、抗体による抗原−オリゴヌクレオチド複合体の結合により、アンプリコンを含み得る近接対が形成される。したがって、この方法を使用して、特定の抗体の存在を高感度で検出することができる。
【００２７】
また、本発明は、緩衝液、化学試薬、酵素、オリゴヌクレオチド、近接構成要素などの本発明の方法を実施するのに有用な個々のまたは組み合わせた成分および試薬、ならびにこれらの成分または試薬を使用するための指示書を含むことができるキットを提供する。例えば、このキットは本明細書に記載の増幅方法および検出方法を実施するのに適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含んでいてもよい。さらにキットは、放射標識、酵素基質、抗体などの増幅した核酸を検出するための試薬および溶液を含んでもよい。適切な溶液および試薬はよく知られており、例えば非特許文献７に記載されている。キットの構成品は、一般的な容器に一緒にパッケージされており、通常、本明細書で開示の方法の実施形態を実施するための指示書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】抗原とオリゴヌクレオチドに複合体形成している抗体との混合を示す図である。
【図１Ｂ】隣接するプローブのハイブリッド形成を示す図である。
【図１Ｃ】ポリメラーゼ伸長および制限酵素ニック形成を示す図である。
【図１Ｄ】伸長、置換および線形増幅を示す図である。
【図１Ｅ】ハイブリッド形成、ポリメラーゼ伸長、ニック形成および指数関数的増幅を示す図である。
【図１Ｆ】抗原とオリゴヌクレオチドに複合体形成している抗体との混合を示す図である。
【図１Ｇ】隣接するプローブのハイブリッド形成を示す図である。
【図１Ｈ】プローブのポリメラーゼによる伸長を示す図である。
【図１Ｉ】プローブ伸長二重鎖の変性およびＳＤＡプライマーの結合を示す図である。
【図１Ｊ】反対の配列方向のハイブリッド形成したプローブからのアンプリコン形成を示す図である。
【図２Ａ】スプリントオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を示す図である。
【図２Ｂ】隣接するプローブの連結を示す図である。
【図２Ｃ】ＤＮＡポリメラーゼ伸長および置換を示す図である。
【図２Ｄ】第３のプローブを連結するための２つのハイブリッド形成した近接プローブの使用を示す図である。
【図２Ｅ】第３のプローブを連結するための反対の配列方向の２つのハイブリッド形成した近接プローブの使用を示す図である。
【図３Ａ】一本鎖テザープローブを示す図である。
【図３Ｂ】一本鎖テザープローブの伸長および置換を示す図である。
【図３Ｃ】ニック形成、伸長、置換および捕捉を示す図である。
【図３Ｄ】ニック形成、伸長、置換および捕捉を示す図である。
【図３Ｅ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｆ】スプリントオリゴヌクレオチドの伸長／置換を示す図である。
【図３Ｇ】標的介在プローブサイクルを示す図である。
【図３Ｈ】５’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｉ】５’／５’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｊ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｋ】３’／３’構造を有するスプリントオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図３Ｌ】スプリントオリゴヌクレオチドの捕捉された複合体からの置換を示す図である。
【図４Ａ】単純な競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｂ】陥入型競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｃ】無能力化ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｄ】置換可能なハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｅ】自己置換型ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４ＥＥ】プローブ−ブロッカー二重鎖を安定化するための３’プローブ末端の使用を示す図である。
【図４Ｆ】二元免疫ＳＤＡ反応での競合的ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｇ】二元免疫ＳＤＡ反応での無能力化ハイブリッド形成ブロッカーを示す図である。
【図４Ｈ】二元免疫ＳＤＡ反応での段階的ブロッキングを示す図である。
【図４Ｉ】二元免疫ＳＤＡ反応でのハイブリッド形成ブロッカーの結合後の添加を示す図である。
【図５Ａ】スプリントオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を示す図である。
【図５Ｂ】伸長および置換を示す図である。
【図５Ｃ】ＲＮＡポリメラーゼ活性、ハイブリッド形成および伸長を示す図である。
【図５Ｄ】ＲＮアーゼＨ活性、ハイブリッド形成および伸長を示す図である。
【図６Ａ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｂ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｃ】付着した複合体の制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｄ】ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｅ】ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ介在型放出を示す図である。
【図６Ｆ】物理的放出を示す図である。
【図６Ｇ】切れやすい連結および化学的開裂を示す図である。
【図６ＧＧ】切れやすい連結および化学的開裂を示す図である。
【図６Ｈ】オリゴヌクレオチド置換を示す図である。
【図６Ｉ】オリゴヌクレオチド伸長を示す図である。
【図６Ｊ】オリゴヌクレオチド伸長を示す図である。
【図６Ｋ】ＲＮアーゼＨ放出を示す図である。
【図６Ｌ】ＲＮアーゼＨ放出を示す図である。
【図６Ｍ】自己プライミング捕捉／置換オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図６Ｎ】置換されたプローブ部のアンプリコン形成への関与を示す図である。
【図７Ａ】第１の近接構成要素のオリゴヌクレオチド部の捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成による第１の近接構成要素の固定化を示す図である。
【図７Ｂ】固定化された第１の近接構成要素への標的分析物の結合を示す図である。
【図７Ｃ】標的分析物と第１の近接構成要素との間の固定化複合体への第２の近接構成要素の結合による固定化された２部位の「サンドイッチ」の形成を示す図である。
【図７Ｄ】標的非依存性アンプリコンが形成するメカニズムを示す図である。
【図７Ｅ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｆ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｇ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｈ】標的非依存性アンプリコンの形成につながるプローブ−プローブ相互作用を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す図である。
【図７Ｉ】低イオン強度を使用する、標的分析物と２つの近接構成要素との間の固定化された複合体の放出を示す図である。
【図７Ｊ】捕捉オリゴヌクレオチドの使用および不均一なアッセイ形態への放出を示す図である。
【図８Ａ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｂ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｃ】不均一な免疫増幅を示す図である。
【図８Ｄ】切れやすい連結による不均一な免疫増幅を示す図である。
【図９】スプリントオリゴヌクレオチドによる不均一な免疫増幅を示す図である。
【図１０】一般的な免疫増幅システムを示す図である。
【図１１Ａ】ヘアピン放出プローブを示す図である。
【図１１Ｂ】ヘアピンハイブリッド形成ブロッカープローブを示す図である。
【図１１Ｃ】ヘアピンハイブリッド形成ブロッカープローブの置換を示す図である。
【図１２】抗原特異的免疫グロブリンの検出を示す図である。
【図１３】二元免疫ＳＤＡ用の代表的なプローブ、プライマーおよびテザーオリゴヌクレオチドの地図を表す図である。
【図１４Ａ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着したが、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｂ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着したが、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｃ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｄ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１４Ｅ】第１の近接構成要素および第２の近接構成要素に付着した、ただし、両方の近接構成要素に同時には付着していないアンプリコンを形成するための３’キャップされたオリゴヌクレオチド部の使用を示す図である。
【図１５Ａ】ＩＬ−８の免疫ＳＤＡ検出のための２色のリアルタイム蛍光プロファイルを示す図である。
【図１５Ｂ】ＩＬ−８の定量のための検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明により、ごく少量の分析物を高い感度で検出することができる。本発明は、アンプリコンを形成できるオリゴヌクレオチド部に複合体形成した、抗体などの分析物特異的結合因子の複合体を提供する。抗体とオリゴヌクレオチドを有するその他のタンパク質との間の複合体形成は、当技術分野で知られており、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献１０および特許文献１１で教示されている。分析物特異的結合因子が核酸、例えばアプタマーである場合、分析物特異的結合因子及びオリゴヌクレオチド部またはプローブ部は、１つの隣接した鎖内において、当技術分野で知られた化学合成方法を使用して合成され得る。さらに、用語「複合体形成（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、そのようなアプタマー−プローブ単位にも適用される。抗体にそれぞれ複合体形成しているオリゴヌクレオチドを結びつけることによりアンプリコンを構築する条件も知られており、例えば特許文献１２で教示されている。アンプリコンを増幅するための、およびそれらの存在を検出するための条件および方法論も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１２および特許文献１３で教示されているように当技術分野で知られている。また、増幅産物を検出するために標識プローブを使用することも、例えば特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８で教示されており、それらすべての全体は参照により本明細書に組み込まれる。特許文献１９は、恒温核酸増幅反応での内部対照の使用を教示しており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本発明によれば、ＳＤＡによる好ましい増幅方法は図１で詳述する。Ａｂ１およびＡｂ２はそれぞれ、隣接するエピトープ１および２を認識し、オリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２に複合体形成している抗体である（図１Ａ）。抗体は、この例に限定するわけではないが、本発明で有用な分析物特異的結合成分の代表的なものである。例えば、当技術分野で知られている有用な分析物特異的結合成分には、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の機能的断片が含まれる。分析物特的結合成分のその他の例は、アプタマー、受容体分析物に特異的なリガンド、またはリガンド分析物に特異的な受容体を含む。さらに、種々の異なるタイプの分析物特異的結合成分を組み合わせて使用してもよいことを当業者は理解するであろう。「オリゴヌクレオチドプローブ」および「オリゴヌクレオチド部」は本発明の便宜上、同義的に使用する。用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の便宜上、核酸部のサイズの上限を設けるものと理解するべきではない。したがって、本明細書の使用では「オリゴヌクレオチド」は「ポリヌクレオチド」と同義である。本発明の便宜上、オリゴヌクレオチドは、全体的または部分的にＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体もしくは誘導体で構成されていてもよい。この実施形態では、Ｐ１およびＰ２は、相補的な３’末端配列および上流のＳＤＡニック部位を含む。ＳＤＡのためのニック部位の使用および一般的なＳＤＡの条件は、特許文献１５、特許文献２０および特許文献２１に記載されており、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。Ｐ１とＰ２の３’末端は、連結されている２つの抗体がそれらの各エピトープに結合することにより近くに近接して保持されている場合に、互いにハイブリッド形成する（図１Ｂ）。核酸のハイブリッド形成した部分の塩基対またはミスマッチの数ならびにハイブリッド形成が生じる緩衝液の温度およびイオン強度を含む、核酸ハイブリッド形成につながる条件は、当技術分野でよく知られており、例えば非特許文献７で概説されている。Ａｂ１およびＡｂ２のバルク溶液濃度は、Ｐ１とＰ２の抗原非依存性ハイブリッド形成が最少になるように、抗原の表面の濃度と比較して相対的に低い。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰ１：Ｐ２ハイブリッドの陥入した３’末端を平滑化する（図１Ｃ）。これは、ＳＤＡニック形成酵素が認識する二本鎖制限部位の生成に役立つ。ニック形成酵素は二本鎖ＤＮＡ鋳型の一本鎖のみの開裂を触媒する。ニック形成およびニックの部位からのポリメラーゼ伸長は下流のＤＮＡ鎖を溶液に置換し、ニック部位を再生する（図１Ｄ）。ニック形成および伸長／置換ステップの繰返しサイクルを使用して、置換された鎖の多数のコピーを産生することができる。置換された鎖は相補的なＳＤＡプライマーによって捕捉される（図１Ｅ）。捕捉した鎖およびハイブリッド形成したＳＤＡプライマーの３’末端からの伸長により、一連の中間体を経て指数関数的に増幅できる二本鎖ＤＮＡ分子を産生される。代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２の一方のみがＳＤＡニック部位を含む。
【００３１】
別の実施形態（図１Ｆ〜Ｉ）では、プローブＰ１およびＰ２はＳＤＡニック部位を欠くが、代わりに配列ｃおよびｄ’を含み、これはそれぞれＳＤＡプライマーＳＰ２およびＳＰ１にも存在する（図１Ｉ参照）。Ｐ１およびＰ２の３’末端を伸長することにより、Ｐ１の伸長産物に相補配列ｄとＰ２の伸長産物に相補配列ｃ’とを含有する二重鎖を作製する（図１Ｈ参照）。次いで、例えば加熱により二重鎖伸長産物の鎖を分けると、ＳＤＡプライマーＳＰ１およびＳＰ２は、伸長したプローブの新たに合成された配列ｄおよびｃ’の相補体とハイブリッド形成する。伸長したプローブは、伸長したＰ１の配列ｅおよび伸長したＰ２の配列ｂ’として示した、ＳＤＡプライマーの結合性部位の３’側に位置する配列を任意選択的に含んでもよい。これらの配列はバンパープライマーＳＢ１およびＳＢ２とハイブリッド形成する（図１Ｉ参照）。ＳＤＡの間、ＳＤＡプライマーＳＰ１およびＳＰ２はポリメラーゼによって伸長される（図示せず）。もし存在するならば、バンパープライマーの伸長によりＳＤＡプライマー伸長産物をプローブ鎖から置換され、次いで置換された鎖は、特許文献５、特許文献１５、特許文献２０および特許文献２１で記載されたように、ＳＤＡで増幅される。もし伸長したプローブがＳＰ１およびＳＰ２結合性部位に対して配列３’を含有しない場合（図示せず）は、ＳＤＡプライマーとハイブリッド形成するプローブの３’末端はポリメラーゼによって伸長されて、その後のニック形成および上記のＳＤＡによる鎖置換を可能にするニック形成可能な制限部位を作製する。
【００３２】
前述の実施形態では、オリゴヌクレオチド部（Ｐ１およびＰ２）は、それらの５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介してそれらの各分析物結合単位（Ａｂ１およびＡｂ２）に複合体形成していた。図１Ｊで説明した代替的な実施形態では、複合体形成Ａｂ１−Ｐ１はＰ１の３’末端または３’末端の近くに位置する連結を介して形成され、一方、複合体形成Ａｂ２−Ｐ２はＰ２の５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介して形成される。Ｐ１は配列（ａｂｃｄｅｆ）（５’側から３’側に読む）を含み、Ｐ２は配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’）（５’側から３’側に読む）を含む。さらに、Ａｂ２−Ｐ２は、伸長可能な３’末端（すなわち３’末端ヒドロキシル基）を含む。示した通り、Ｐ２の配列（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成することが可能なＰ１の配列（ｅｆ）は、Ｐ１がＡｂ１に複合体形成する部位の５’に位置し、一方、（ｆ’ｅ’）はＰ２がＡｂ２に複合体形成する部位の３’に位置する。したがって、プローブＰ１およびＰ２は、反対の配列方向のそれらの各分析物結合単位（Ａｂ１またはＡｂ２）と連結するといえる。Ｐ１とＰ２が、例えばそれらの各近接構成要素の同じ標的分析物分子への結合を介して、近くに近接している場合、Ｐ１の配列（ｅｆ）は、図１Ｊの左側で示した通り、Ｐ２の（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成する。次いでポリメラーゼを使用してＰ２の３’末端を伸長して、示した通り、新たな配列を含有する伸長産物（すなわち、アンプリコン）Ｐ２−ｅｘｔを作製することができる。次いで、当技術分野で知られた方法により新たな配列（ｄ’ｃ’ｂ’ａ’）の全体または部分を使用してＰ２−ｅｘｔを検出して、Ｐ２−ｅｘｔを変換されていないＰ２と区別することができる。例えば、Ｐ２−ｅｘｔは、上記の核酸増幅法で増幅してもよい。溶液を加熱することによってＰ２−ｅｘｔをＰ１から分離することができ、プライマーはＰ２−ｅｘｔの３’末端で新たな配列とハイブリッド形成し、伸長してＰ２−ｅｓｔの相補体を作製することができる。増幅の次の期間は、Ｐ２−ｅｘｔからの相補体の分離およびＰ２の５’末端の近くに位置する配列から構成される異なるプライマーを相補体にハイブリッド形成することを含む。好ましい実施形態では、配列ｂは、ＳＤＡ適合性制限酵素の認識配列の一本鎖成分を含有する。次いで、Ｐ２−ｅｘｔを形成することにより、制限酵素により切断される二本鎖認識配列を作製する。ニックからの伸長により、Ｐ２−ｅｘｔと相補的な新たな鎖を作製し、ニック形成可能な認識配列を再生する。この産物を、前述したＳＤＡ法により増幅し、検出してもよい。任意選択的に、Ｐ２の配列ｉ’はまた、ＳＤＡのための認識配列の一本鎖成分を含んでもよく、そうであるならば、Ｐ２−ｅｘｔとその完全長相補鎖との間に形成した二重鎖は、２つのニック形成可能な制限酵素認識配列を含有する。別の実施形態では、配列ｂはＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位の一本鎖成分であってもよい。次いでＰ２−ｅｘｔを形成することにより、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを作製し、これを使用してＲＮＡポリメラーゼの活性を、Ｐ２−ｅｘｔの配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’ｄ’ｃ’）と相補的なＲＮＡ分子を合成するように方向づける。これらのＲＮＡ分子は直接検出してもよく、あるいは３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡまたは転写に基づく増幅などの方法でさらに増幅してもよい。任意選択的に、Ｐ２の配列ｉ’はＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一本鎖成分を含んでもよい。この場合、Ｐ２−ｅｘｔの３’末端とハイブリッド形成したプライマーを伸長することにより、ＲＮＡポリメラーゼの活性を、直接検出することができ、または上記の方法を使用して増幅することができる配列（ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’ｄ’ｃ’ｂ’ａ’）を含むＲＮＡ分子を合成するように方向づけるのに使用できる二本鎖プロモーター部位を作製する。Ｐ２−ｅｘｔの検出または増幅の方法にかかわらず、図１Ｊで示した実施形態は、反対の配列方向のそれらの各分析物結合要素Ａｂ１またはＡｂ２と連結するプローブ部Ｐ１およびＰ２を含み、この２つのプローブは標的介在プロセスで互いにハイブリッド形成して、後で伸長してアンプリコンを作製する伸長可能な３’末端を有する二重鎖を作製する。標的分析物が存在しない場合、Ｐ１とＰ２は近くに近接せず、以下で言及する誤った（すなわち、標的非依存性の）相互作用による以外は、Ｐ２−ｅｘｔは形成しない。この誤った相互作用は、これも以下で記載するハイブリッド形成ブロッキングオリゴヌクレオチドによって抑制することができる。したがって、Ｐ２−ｅｘｔは標的分析物の存在の結果として、かつ存在する標的分析物の量に比例して産生される。したがって、産生したＰ２−ｅｘｔの量の判定を使用することによって、試料に存在する標的分析物の量を定量することができる。
【００３３】
図２Ａ〜Ｃは、スプリントオリゴヌクレオチドの代表的な使用を詳述する。Ａｂ１およびＡｂ２は隣接するエピトープ１および２を認識する抗体であり、それぞれオリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２に複合体形成している（図２Ａ）。Ｐ１はＡｂ１にその５’末端または５’末端の近くに位置する連結を介して複合体形成しており、３’末端ヒドロキシル基および上流のＳＤＡニック部位を含む。プローブＰ２はＡｂ１にその３’末端で複合体形成しており、ＳＤＡプライマー結合性部位および５’末端ホスフェート基を含む。スプリントオリゴヌクレオチドＳの配列は、抗体がそれらの各エピトープに結合することにより近くに近接している場合に、オリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２がスプリントＳと二本鎖ハイブリッドを形成するように、プローブＰ１の３’末端およびプローブＰ２の５’末端と相補的である。スプリントオリゴヌクレオチドＳとハイブリッド形成した場合、Ｐ１の３’−ＯＨとＰ２の５’−ＰＯ４は隣接し、ＤＮＡリガーゼを使用してＰ１とＰ２の配列を連結するリン酸ジエステル結合の形成を触媒する（図２Ｂ）。ＳＤＡプライマーＳＰ１はスプリントオリゴヌクレオチドＳの上流のプローブＰ２とハイブリッド形成する。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーＳＰ１の３’末端およびスプリントオリゴヌクレオチドＳの３’末端から伸長する。プライマーＳＰ１の伸長はスプリントオリゴヌクレオチドＳの伸長産物を置換し（図２Ｃ）、ＳＤＡ制限酵素ニック部位をいずれかの末端に有する二本鎖ＤＮＡ分子を作製する。この分子は図１Ｃで示したものと類似している。ニック形成、ニックからのポリメラーゼ伸長および下流の鎖の置換は、指数関数的増幅につながる（図１Ｄ〜Ｅ）。一実施形態では、プローブＰ１はＳＤＡニック部位を含まない。別の実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドＳは、スプリントＳの３’伸長を妨げる３’キャップを含む。
【００３４】
図２Ｄおよび２Ｅは、近接構成要素の対を使用する、標的介在性で且つリガーゼで触媒されたアンプリコン形成の代替的な実施形態を説明する。プローブＰ１およびＰ２はそれらの各抗体（またはその他の分析物結合単位）Ａｂ１およびＡｂ２に連結されるか、複合体形成される。複合体形成は、図２Ｄで示した通り、両方のプローブの５’末端または５’末端の近くの連結を介して生じてもよく、あるいは２つのプローブ（Ｐ１）の一方は、プローブの３’末端または３’末端の近くに位置する連結を介して複合体形成してもよい。Ｐ１は配列（ａｂｃｄｅｆ）（５’側から３’側に読む）を含み、Ｐ２は配列（ｊ’ｉ’ｈ’ｇ’ｆ’ｅ’）を含む（５’側から３’側に読む）。複合体Ａｂ２−Ｐ２は３’末端ヒドロキシル基をさらに含む。図２Ｄまたは２Ｅのいずれかで示された構造では、Ｐ１の配列（ｅｆ）およびＰ２の（ｆ’ｅ’）は互いにハイブリッド形成することが可能である。第３のプローブＰ３は配列（ｄ’ｃ’ｂ’ｘ’ｙ’）を含み、さらに５’末端ホスフェート基を含む。Ｐ３はプローブＰ１の配列（ｂｃｄ）（Ｐ１の配列（ｅｆ）に隣接）とハイブリッド形成することが可能である。標的分析物の存在下では、Ｐ１とＰ２は近くに近接し、配列（ｅｆ）と（ｆ’ｅ’）とのハイブリッド形成により二重鎖を形成する。示した通り、プローブＰ３は、Ｐ１とＰ２とのハイブリッド形成の前または後のいずれかに、Ｐ１とハイブリッド形成してもよい。いずれの場合も、Ｐ３の５’ヌクレオチドはＰ２の３’ヌクレオチドに隣接して位置し、この構造では、Ｐ２とＰ３はＤＮＡリガーゼ（またはその他の連結メカニズム）で共有結合して、示した通り、アンプリコンＰ２：Ｐ３を形成することができる。次いで、Ｐ２：Ｐ３は、図１Ｊで示した実施形態について上記したものなどの増幅を含む種々の方法によって検出することができる。しかし、この場合、配列ｘ’および／またはｙ’は、プライマーハイブリッド形成のための部位として使用することとなる。標的分析物が不在の場合、Ｐ１とＰ２は近くに近接せず、以下で言及するＰ１とＰ２との間の誤った（すなわち、標的非依存性の）相互作用による以外は、Ｐ２：Ｐ３は形成しない。この誤った相互作用は、これも以下で記載するハイブリッド形成ブロッキングオリゴヌクレオチドによって抑制することができる。したがって、Ｐ２：Ｐ３は標的分析物の存在の結果として、かつ存在する標的分析物の量に比例して産生される。したがって、産生されたＰ２：Ｐ３の量の定量を使用して、試料に存在する標的分析物の量を定量することができる。近接構成要素のオリゴヌクレオチド部を連結することによって形成されたアンプリコンの増幅中、ハイブリッド形成ブロッカーは不要である。なぜなら、連結によってつなぐことができるプローブは通常互いにハイブリッドを形成せず、したがって、オリゴヌクレオチドの３’伸長を含む増幅中、誤ったプローブ変換をする可能性がないからである。
【００３５】
図３は、近接構成要素の２つのオリゴヌクレオチド部間のギャップを架橋するように設計されたスプリントオリゴヌクレオチドを含む本発明の代表的な実施形態を示す。一実施形態（図３Ａ）では、近接抗体Ａｂ１の１つはテザーオリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端の近くの連結を介して複合体形成している。今後、「テザーオリゴヌクレオチド」は、アンプリコンから置換されるが、分析物特異的結合性部に複合体形成したままであるオリゴヌクレオチド部を指す。テザーオリゴヌクレオチドＴＯは、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１のセグメント（好ましくは５’末端または５’末端の近くにある）と相補的である。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１は、変換されたプローブの増幅を促進するプライマー配列および変換されたプローブの検出を促進する検出領域を含んでもよい。また、Ｐ１は、ＳＤＡによる増幅を促進する制限認識配列を含んでもよい。さらに、スプリントオリゴヌクレオチドの３’配列は、その５’末端を介して抗体Ａｂ２に複合体形成しているプローブＰ２の３’末端と相補的である。図３Ａで示した通り、Ｐ１の５’末端は、Ａｂ１に付いたテザーオリゴヌクレオチドＴＯと相補的である。任意選択的に、テザーオリゴヌクレオチドはＰ１の５’末端上ではない配列と相補的であってもよい。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合している場合、スプリントオリゴヌクレオチドＰ１はＴＯおよびＰ２の両方とハイブリッド形成することができる（図３Ａ）。プローブＰ２およびスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端からの伸長はテザーオリゴヌクレオチドＴＯを置換し、抗体Ａｂ２と連結した二本鎖ＤＮＡ分子を作製する（図３Ｂ）。この二本鎖産物をニック形成し、ポリメラーゼで伸長し、下流の鎖を置換することにより、相補的なＳＤＡプライマーとハイブリッドを形成し得る一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる（図３Ｃ）。これは、一連の中間ニック形成、伸長、置換およびプライミング事象を介する指数関数的増幅につながる（図３Ｄ）。
【００３６】
図３Ｅは抗体間のギャップを架橋する第２の実施形態を示す。この構造では、各抗体（Ａｂ１およびＡｂ２）は、異なるテザーオリゴヌクレオチド、Ａｂ１はａ’、Ａｂ２はｊに複合体形成している。通常、抗体Ａｂ１のテザーオリゴヌクレオチドは第２の抗体Ａｂ２のテザーオリゴヌクレオチドとは異なる。この場合、ａ’およびｊは配列において等価ではない。スプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２はそれぞれ、オリゴヌクレオチド配列ａ’およびｊと相補的な配列（場合により５’末端の近く）を含有する。例えば、Ｐ１は配列ａを含有し、Ｐ２は配列ｊ’を含有する。プローブＰ１の配列ａはＡｂ１の配列ａ’とハイブリッド形成し、Ａｂ２の配列ｊはＰ２の配列ｊ’とハイブリッド形成する。この実施形態では、Ｐ１およびＰ２はそれぞれ、他方のプローブと相補的な短い３’配列を含有し、したがってＰ１の配列（ｅｆ）はＰ２の（ｆ’ｅ’）と相補的である。Ｐ１およびＰ２のこれらの相補的な３’配列の明らかなハイブリッド形成は、プローブＰ１とＰ２が、近接したエピトープに結合した抗体のテザーオリゴヌクレオチド（ａ’およびｊ）とハイブリッド形成した結果、空間的に近接した場合のみに高い効率で生じる。Ｐ１とＰ２の３’末端のハイブリッド形成により、陥入した３’末端を有する短い二重鎖が生じ、次いでこれをポリメラーゼで伸長することができる。一実施形態では、３’末端の伸長はスプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２をテザーオリゴヌクレオチド（および抗体）から置換するように働き、一方同時に、両方のプローブの伸長産物（Ｐ１−ｅｘｔおよびＰ２−ｅｘｔ）で構成された二重鎖を作製する（図３Ｆ）。次いで、Ｐ１およびＰ２伸長産物を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、リガーゼ連鎖反応、３ＳＲ、Ｑβレプリカーゼに基づく増幅、固相増幅およびＮＡＳＢＡを含む、当技術分野で知られた種々の増幅方法で検出することができる。Ｐ１の配列（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）およびＰ２の（ｅ’、ｆ’、ｇ’、ｈ’、ｉ’、ｊ’）などのプローブが含有する配列、またはプローブ伸長産物を使用して、プローブの増幅および検出を促進してもよい。増幅を促進するのに使用できる特別な配列には、プライマー結合性部位、制限エンドヌクレアーゼ部位、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することが可能な配列、ＲＮＡプロモーター部位などがある。増幅した産物は、当技術分野でよく知られた不均一法または均一法で検出することができる。あるいは、図３Ｆの二重鎖ＩＩを、当技術分野でよく知られた方法で増幅することなく直接検出してもよい。方法が、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、テザーオリゴヌクレオチド（ａ’またはｊ）は伸長プロセス中に分解することがあり、この分解産物は標的抗原の存在を示すものとして検出することができる。
【００３７】
図３Ｅおよび３Ｆは、テザーオリゴヌクレオチドの３’末端に複合体形成している抗体を示し、図３Ｈは、近接対の両方の抗体がテザーオリゴヌクレオチドの５’末端に複合体形成している別の構造を示す。同様に、図３Ｉは、１つのテザーオリゴヌクレオチドが抗体に５’連結を介して複合体形成し、他のオリゴヌクレオチドが３’連結を介して複合体形成している実施形態を示す。これらの後者の２つの構造のそれぞれにおいて、プローブ配列Ｐ１およびＰ２を３’伸長することにより、結果としてプローブをテザーオリゴヌクレオチドから置換し、図３Ｆで示したものと同一の二本鎖の二重鎖を作製することになる。
【００３８】
テザーオリゴヌクレオチドが置換プロセス中に分解しない場合には、プローブ分子Ｐ１およびＰ２の第２の組は、標的に結合した近接構成要素の空いたテザーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる（図３Ｇ）。前記のとおり、Ｐ１とＰ２の３’末端はアニールし、再び伸長することによって、結果としてプローブを置換し、Ｐ１−ｅｘｔおよびＰ２−ｅｘｔで構成された二重鎖を作製することになる。存在する場合ならば、空いたテザーオリゴヌクレオチドは再び、伸長していないプローブ（Ｐ１およびＰ２）の新たな対とアニールし、Ａｂ１およびＡｂ２が近接エピトープに結合し且つＰ１およびＰ２の供給が存在する限り、伸長していないプローブの３’ハイブリッド形成、伸長、置換およびそれに続く結合のサイクルは続く。このサイクルプロセスの結果として、検出可能なプローブ伸長二重鎖の多数のコピーが、存在する各標的から形成される。
【００３９】
図３Ａ〜３Ｌで示した例のすべてにおいて、プローブのテザーオリゴヌクレオチドへの最初のハイブリッド形成は、使用した実験プロトコル次第で、抗体が標的分子に結合する前または後のいずれでも生じる。一実施形態では、抗体Ａｂ１およびＡｂ２の少なくとも一方は、常磁性粒子（図９）またはその他の固体表面（図３Ｌ）、例えばマイクロウェルの内壁に共有結合的または非共有結合的に連結しているか、連結し得る。少なくとも１つの抗体がビーズ、固体表面またはその他の固体マトリックスと連結し、プローブＰ１およびＰ２の両方（図３Ｌ）がテザーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって抗体に間接的に付いている構造では、プローブを伸長することにより抗体−標的複合体から置換された二重鎖が作製され、一方、複合体自体はビーズ、固体表面またはその他の固体マトリックスに付いたままである。所望により次いで、マトリックス表面に非特異的に結合した複合体および任意の物質は残して、置換された二重鎖を含有する溶液を取り出し、別のウェルまたは区画で分析または増幅してもよい。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、連結スプリントオリゴヌクレオチドは、例えば図３Ｊで示したスプリントオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２の両方の部分と相補的であってもよい。連結スプリントオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した場合、プローブＰ１とＰ２はＰ１の３’末端がＰ２の５’末端と共有結合するように図２で記載の通りに連結されてもよい（図３Ｊ）。次いでこれらを図２で記載の通りに増幅してもよい。
【００４１】
別の実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、図３Ｋで例示した通りにテザーオリゴヌクレオチド（ｊ’）および１つのプローブ分子Ｐ２とハイブリッド形成する。次いで、スプリント結合したＰ２の３’末端は空間的に近接したＰ１の相補的な３’末端とハイブリッド形成することができる。このプローブの３’を伸長すると、プローブはスプリントおよびテザーオリゴヌクレオチドから置換され、図３で示した前述の例で産生したものと類似の完全長の増幅可能な二重鎖が形成する。
【００４２】
図４は、近接したエピトープに結合していない抗体に連結したプローブ分子同士のハイブリッド形成の拡がりを減少させるように設計されたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを示す。そのような標的非依存性ハイブリッド形成は、真正な標的結合事象で産生したものと区別できないプローブ伸長産物となるため、バックグラウンドシグナルの原因であり、バックグラウンドシグナルは検出方法の全体的な感度を減少させる。本発明は、バックグラウンドシグナルにつながる誤った標的非依存性プローブの相互作用を低減するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド（または「ハイブリッド形成ブロッカー」）の使用を含む。図４Ａは、ハイブリッド形成ブロッカーの近接に基づく増幅方法での使用の基礎となる基本原理を示す。相互相補性の短い配列（ｅｆ及びｆ’ｅ’）（５’側から３’側に読む）は、Ｐ１およびＰ２の３’末端を含む。これらの配列は互いにハイブリッド形成して、示した通り、５’側が突出した二重鎖を形成し得る。二重鎖状態に対する一本鎖状態にあるプローブ分子の数は、総プローブ濃度および二重鎖の本質的な安定性により決まり、これは二重鎖の長さおよび組成に関係する。Ｐ１とＰ２との間の相互作用を、プローブに対して好ましくはモル過剰の、Ｐ１とハイブリッド形成すると、２つのプローブ間の相互作用を競合的にブロックするハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを加えることによって減少させるか、反対にすることができる。このブロッカーは、Ｐ２と相互作用する部分配列全体にわたってＰ１と相補的である必要はない。この部位との部分的な相補性でも、Ｐ１のＰ２に対するハイブリッド形成を減少させる。
【００４３】
一実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、Ｐ１と相補的なＰ２の部分（部分配列ｅｆ）の一部または全体と同一の第１の部分配列（ｅ’またはｆ’ｅ’）を含む。第２の実施形態（図４Ｂ）では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、上記定義の第１の部分配列と、Ｐ１のセグメントと相補的であるがＰ２の部分配列とは同一でない第２の部分配列（図４Ｂのｄ’）とを含む。ハイブリッド形成ブロッカーの第２の部分配列は、Ｐ１−Ｐ２の相互作用と比較してブロッカー−Ｐ１相互作用を安定化させることによって、ブロッキング効果を向上させる。第２の部分配列はまた、Ｐ２分子がＰ１と既にハイブリッド形成している場合に、Ｐ１−ブロッカー二重鎖の核形成部位としても働くことができる。次いで核形成に続いて、完全なＰ１−ブロッカー二重鎖の形成は、Ｐ２をＰ１から置換する。この実施形態のＰ１の部分配列ｄは、図４Ｂで示した通り、プローブの部分配列ｅと直接隣接していてもよく、あるいは部分配列ｅから数ヌクレオチド離れて位置していてもよい（図示せず）。後者の場合、ハイブリッド形成ブロッカー部分配列ｄ’は、追加のヌクレオチドおよび／またはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）部などの非ヌクレオチドリンカーを含むスペーサーを介してハイブリッド形成ブロッカー部分配列ｅ’と間接的に連結していてもよい。
【００４４】
第３の実施形態（図４Ｃ）では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第１の部分配列（上記定義）、任意選択的に第２の部分配列（上記定義）、および第１の配列の５’に位置し、Ｐ１の３’伸長の鋳型として働くことができる第３の部分配列（図４Ｃのｔ’ｓ’）を含んでいてもよい。第３の部分配列は、当技術分野でよく知られた、適切な非ヌクレオチド部ｍ’（すなわち、「５’キャップ」）を任意選択的に含有し、非鋳型ヌクレオチドがＰ１の３’伸長産物に付加するのを妨げ、かつポリメラーゼがＰ１の伸長によって形成した平滑末端の二重鎖に結合するのを抑えることができる（図４Ｃ参照）。ブロッカー−鋳型でのＰ１の３’伸長により、Ｐ２の配列と相補的でないその３’末端に新たな配列（ｓｔ）を含有するＰ１−伸長産物を得るのが好ましい。したがって、３’配列（ｓｔ）の付加は、Ｐ２の鋳型でＤＮＡ合成のための機能的プライマーとしてのＰ１の使用を不可能にするように働く。また、配列（ｓｔ）の付加は、２つの分子間の相補的塩基対の数を増加させることによって、ブロッカー−Ｐ１の相互作用を安定化するように働く。任意選択的に、この実施形態で産生された新たな３’配列（ｓｔ）は、伸長されたＰ１とハイブリッド形成ブロッカーが解離した場合、伸長されたＰ１がステムループ（ヘアピン）構造に折り畳まれて、Ｐ２との任意の相互作用が減少するように、Ｐ１のセグメントと全体的または部分的に相補的である。この場合、Ｐ１のヘアピンの３’末端はヘアピンのステムを伸ばすように場合によって伸長されてもよく、この伸長はニック形成可能または開裂可能な制限エンドヌクレアーゼ部位をＰ１分子内に任意選択的に作製することができる。
【００４５】
第４の実施形態では、プロセスのある段階の間、Ｐ１とＰ２との間の相互作用を可逆的にブロックすることが望ましい場合がある。図４Ｄは、可逆的なブロックを可能にするハイブリッド形成ブロッカーの設計を示す。この実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーは、ブロックされるプローブ（図４ＤのＰ１）と相補的な部分配列（ｅ’ｄ’）およびプローブと相補的でない１つまたは複数のテール配列（ｔ’および／またはｋ’）を含む。ハイブリッド形成ブロッカーのＰ１とのハイブリッド形成は、Ｐ１−Ｐ２の相互作用を妨げる。所望の時点で、脱ブロック化（デブロッキング）オリゴヌクレオチドを加えてハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドをＰ１から置換して、Ｐ１をＰ２と自由に相互作用できるようにすることができる。デブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成ブロッカーのテール配列と相補的な１つまたは複数のテール配列（ｔおよび／またはｋ）を含む。このテール配列は、ブロッカー−デブロッカーハイブリッド形成の核形成の部位として働く。相補的テール配列のハイブリッド形成が核形成されると、ブロッカーがＰ１から置換されるまで、ハイブリッド形成ブロッカーとデブロッカーとの間に追加的塩基対が形成する。ブロッカーのプローブからの置換を確実にするために、ブロッカー−デブロッカー複合体の全体的な熱力学的安定性は、プローブ−ブロッカー複合体よりも高くなければならない。デブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッカー−デブロッカー二重鎖の熱力学的安定性がプローブ−ブロッカー二重鎖の安定性よりも高いならば、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと完璧に相補的である必要はない。例えば、デブロッカーは、得られるブロッカー−デブロッカー二重鎖がプローブ−ブロッカー二重鎖よりも安定であるならば、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとミスマッチを形成する１つまたは複数のヌクレオチドを含有していることが望ましいことがある。特に、デブロッカーの配列ｅが、ブロッカーの配列ｅ’と１つまたは複数のミスマッチを形成する１つまたは複数のヌクレオチドを含有することが好ましい場合がある。デブロッカーのこれらのミスマッチヌクレオチドの主要な機能は、デブロッカーの配列ｅとＰ２の配列ｅ’との間の潜在的な相互作用を不安定化することである。この実施形態のひとつの変形において、ハイブリッド形成ブロッカーは、図４Ｅで示した通り、配列ｋのポリメラーゼで触媒した伸長によって置換されてもよい。この場合、デブロッキング配列は、ブロッキング配列で直接合成され、分離させるデブロッカーオリゴヌクレオチドを加える必要はない。さらに別の実施形態では、プローブは、プローブ分子間の相互作用をブロックするように働くその３’末端または３’末端の近くに３’ステム−ループ構造を含んでもよい（図１１Ａ〜Ｃ参照）。
【００４６】
ブロッカーのポリメラーゼによる３’伸長を妨げるために、図４Ｅで示したヘアピン構造を有するハイブリッド形成ブロッカーを除いて、上記のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはすべて、３’末端のヌクレオチドにキャップを含んでもよい。３’キャップを有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、「キャップされたオリゴヌクレオチド」と呼ぶ。そのような３’キャップは当技術分野でよく知られており、逆位ヌクレオチド、２’−３’ジデオキシリボヌクレオチドおよび３’デオキシリボヌクレオチドを含む。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成ブロッカーがプローブと二重鎖を形成する場合に、プローブヌクレオチドと相補的な塩基対を形成しない３’テール配列を含んでもよい。また、非塩基対形成３’テールは、ハイブリッド形成ブロッカーがプローブと二重鎖を形成している場合、ブロッカーの３’伸長を妨げるように働き、したがって「３’キャップ」としても働く。
【００４７】
図４ＥＥは、Ｐ１ブロッカー二重鎖の安定性を促進するための、プローブ１（Ｐ１）での３’テールの使用を説明する。Ｐ１の３’テールは配列ｘｙで構成され、プローブ２（Ｐ２）の配列（ｆ’ｅ’）とハイブリッド形成することが可能な配列（ｅｆ）の３’側に位置する。Ｐ１の３’テールは、Ｐ２とハイブリッド形成しない。ハイブリッド形成ブロッカーは、配列（ｙ’ｘ’ｆ’）および任意選択的にｅ’を含む。したがって、ハイブリッド形成ブロッカーは、Ｐ１とハイブリッド形成して、Ｐ１の３’テールならびにＰ１の配列ｅｆのすべてまたは一部を転換させる二重鎖を形成することが可能である。ブロッカー：Ｐ１二重鎖の形成は、上記の通り、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドの拡がりを減少させる。Ｐ１の（ｘｙ）とハイブリッド形成ブロッカーの（ｙ’ｘ’）との間の塩基対形成は、ブロッカー：Ｐ１二重鎖を安定化するように働く。ハイブリッド形成ブロッカーは、配列（ｙ’ｘ’）の５’に位置する配列ｚ’を任意選択的に含む。配列ｚ’は、上記の方法においてデブロッカーオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を開始するための部位として働くことができる。
【００４８】
図４Ｆは、二元免疫増幅反応におけるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を説明する。Ｐ１およびＰ２はそれぞれ、抗体Ａｂ１およびＡｂ２に直接複合体形成している。プローブが抗体にテザーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を介して間接的に結合している場合、または分析物特異的結合成分がアプタマーまたは抗体以外のその他の分析物特異的結合分子である場合も関係なく、同じ原理が当てはまる。示した通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはＰ１の３’末端とハイブリッド形成して、Ｐ２とのその相互作用を妨げる。ハイブリッド形成ブロッカーのハイブリッド形成は、抗体が標的分析物に結合するのを妨げず、当初ハイブリッド形成ブロッカーは、Ａｂ１が分析物と複合体形成しているか、溶液中で自由であるかにかかわらずＰ１鎖とハイブリッド形成する（状態Ｉ）。通常、自由なＡｂ１およびＡｂ２（および複合体形成しているプローブ）のバルク溶液中の濃度は、１ｆＭと１０ｎＭとの間である。通常ハイブリッド形成ブロッカーの濃度はプローブ濃度よりも１０〜１０００００倍高いため、ブロッカー−Ｐ１の相互作用は、標的に結合していない抗体に複合体形成しているプローブについてＰ１−Ｐ２の相互作用を上回る。しかし、標的分子のエピトープ１および２がそれぞれＡｂ１およびＡｂ２と結合する場合、三元標的−抗体複合体でのＰ２に比べたＰ１の有効局所濃度は、バルク溶液中のプローブおよびハイブリッド形成ブロッカーの濃度よりもはるかに高く（通常１〜１００μＭ）なる。その結果、標的に結合した抗体と連結しているプローブでは、Ｐ１：Ｐ２二重鎖がＰ１：ブロッカー二重鎖よりも優勢である（状態ＩＩ）。したがって、Ｐ１：２ハイブリッドの３’末端をポリメラーゼ触媒伸長させることにより、標的−Ａｂ１−Ａｂ２複合体上での増幅可能な二重鎖が生じ（状態ＩＩＩ）、一方、標的複合体と連結していないプローブは、ブロックされ、伸長されず、増幅不可能なままである。図４Ｆは、プローブの１つのみとハイブリッド形成する単一のハイブリッド形成ブロッカーの使用を示すが、その他のプローブとハイブリッド形成する第２のハイブリッド形成ブロッカーを第１のブロッカーと連結して使用してもよい。
【００４９】
図４Ｇは、伸長の鋳型として機能することにより、Ｐ１分子を「無能力」にすることが可能なハイブリッド形成ブロッカーを用いる同様の反応スキームを示す（上記図４Ｃ参照）。上記の理由により、バルク溶液中のプローブではブロッカー：Ｐ１二重鎖がＰ１：Ｐ２二重鎖よりも優勢であり、一方、三元標的−抗体複合体ではＰ１：Ｐ２二重鎖が優勢である。ブロッカー：Ｐ１二重鎖をポリメラーゼ触媒伸長させることにより、「無能力化された」Ｐ１伸長産物が生じ（図４Ｃ参照）、一方、Ｐ１：Ｐ２二重鎖の伸長により、図４Ｆの通り、増幅可能な二重鎖が生じる。
【００５０】
図４Ｈは、置換可能なハイブリッド形成ブロッカーＡがＰ２とハイブリッド形成してブロッカーＡ：Ｐ２二重鎖を形成する段階的ブロッキングプロセスを示す。任意選択的に、このスキームのハイブリッド形成ブロッカーＡは、バルク溶液中および三元標的−Ａｂ１−Ａｂ２複合体上の両方において、ブロッカーＡ：Ｐ２二重鎖をＰ１：Ｐ２二重鎖よりも安定にするのに十分な長さまたは濃度を有することができる。Ｐ１のセグメントと相補的な第２のハイブリッド形成ブロッカーＢおよび置換可能なハイブリッド形成ブロッカーＡと相補的なデブロッカーＤを溶液に加えることにより、ＡをＰ２から置換させ、バルク溶液中でのＰ１：ブロッカーＢ二重鎖を形成し、そして三元標的−抗体複合体でのＰ１：Ｐ２二重鎖を形成する。任意選択的に、ハイブリッド形成ブロッカーＢは、上記の通りＰ１を無能力化させる「無能力化」配列を含んでもよい（図４Ｃおよび４Ｆ参照）。前述の通り、プローブ−プローブハイブリッドをポリメラーゼ触媒伸長させることにより増幅可能な二重鎖が生じ、一方、Ｐ１：ブロッカーＢ二重鎖を場合によって伸長することにより、「無能力化された」Ｐ１伸長産物が生じる。
【００５１】
図４Ｉは、Ｐ１：Ｐ２二重鎖がバルク溶液中および三元標的−抗体複合体上の両方において形成することができる反応スキームを示す。次いで、バルク溶液と三元複合体とは有効プローブ濃度が異なるので、ハイブリッド形成ブロッカーを加えることにより、三元標的複合体上のものよりもバルク溶液中のＰ１：Ｐ２二重鎖を優先的に分裂させる（図４Ｆ参照）。
【００５２】
一実施形態では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを、常磁性粒子またはその他の固体表面と共有結合的または非共有結合的に連結してもよく、さらに近接構成要素を表面に可逆的に結合するために使用してもよい（図６参照）。本発明の別の実施形態では、抗体Ａｂ１およびＡｂ２の少なくとも１つは、常磁性粒子（図９参照）またはその他の固体表面と共有結合的または非共有結合的に連結しているか、連結することができる。
【００５３】
図５で示した本発明の実施形態は、２つの近接構成要素間のギャップを架橋するように設計されたスプリントオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドＳは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、下流のプライマー結合配列および検出領域を含む（図５Ａ）。スプリントＳの５’配列は、抗体Ａｂ１にその３’末端で複合体形成するＰ１の５’末端と相補的である。さらに、スプリントＳの３’配列は、抗体Ａｂ２にその５’末端で複合体形成するプローブＰ２の３’末端と相補的である。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープと結合する場合、スプリントオリゴヌクレオチドＳはＰ１およびＰ２の両方とハイブリッド形成することができる（図５Ａ）。プローブＰ２およびスプリントＳの３’末端からの伸長により、プローブＰ１は置換され、抗体Ａｂ２と連結した機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖分子を作製する（図５Ｂ）。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖プロモーター配列を使用して一本鎖ＲＮＡを産生する。一実施形態（図示せず）では、一本鎖オリゴヌクレオチドを、当技術分野で知られた任意の適切な方法で直接検出する。第２の実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子は、伸長してＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生じる相補的プライマーとハイブリッド形成する（図５Ｃ）。これらのハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮアーゼで分離することにより、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプライマーがハイブリッド形成できる一本鎖ＤＮＡ分子を産生する（図５Ｄ）。ハイブリッド形成したプライマーおよびそれらの標的鎖の３’末端から伸長することにより、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が生じ、指数関数的増幅となる。
【００５４】
図６で説明した本発明の別の態様は、固体表面、ポリマー、ヒドロゲルまたはその他の表面であってもよい支持体に直接付着した捕捉オリゴヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって、抗体、抗原または抗原−抗体複合体を固体表面に付着するための異なる方法を含む。本発明に適切な、粒子またはマイクロタイターウェル表面などの支持体は、当技術分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドを種々の支持体に安定に複合体形成させる方法は、当技術分野でよく知られている。捕捉オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成によってオリゴヌクレオチド部と相互作用することができ、あるいは近接構成要素の分析物結合性部に複合体形成している別のオリゴヌクレオチドと相互作用することができる。さらに、本発明は、捕捉した分子を表面から種々の化学的、物理的または酵素的手段で選択的に放出する方法を含む。
【００５５】
図６Ａで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その５’末端で固体表面に付着している相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。固相からの複合体Ｃの放出は、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。図６のすべてのパネルのＰ１は近接構成要素の増幅可能なオリゴヌクレオチド部であってよく（図６Ｎ参照）、あるいは分析物特異的結合性部に複合体形成している別のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５６】
図６Ｂで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その５’末端で固体表面に付いた相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。Ｐ２は、オリゴヌクレオチドＰ１の相補体および３’非相補的テールを含む。複合体Ｃの固相からの放出は、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。開裂したＰ１オリゴヌクレオチドは、置換オリゴヌクレオチドＤのハイブリッド形成を介して一本鎖にされる。
【００５７】
図６Ｃで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその３’末端を介して複合体形成してもよい。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含み、その３’末端で固体表面に付いた相補的オリゴヌクレオチドＰ２とハイブリッド形成する。複合体Ｃの固相からの放出は、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成で形成した二重鎖認識配列を開裂する制限酵素の特異的活性を介して生じる。
【００５８】
図６Ｄで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、Ｐ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いたオリゴヌクレオチドＰ２の３’末端と相補的な配列を含む。Ｐ２は、制限酵素認識配列および任意選択のフランキング配列を含む。Ｐ１の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長により、Ｐ２の相補体が合成され、そして選択的に開裂して複合体Ｃを放出することができる二本鎖制限酵素認識配列が形成される。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドＰ２の３’末端はキャップされて伸長を妨げる。
【００５９】
図６Ｅで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列を、任意選択のフランキングＤＮＡ、およびその５’末端で固体表面に付いているオリゴヌクレオチドＰ２の３’末端と相補的な配列と共に含む。Ｐ２の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長により、オリゴヌクレオチドＰ１の相補体が合成され、そして選択的に開裂して複合体Ｃを放出することができる二本鎖制限酵素認識配列が形成される。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドＰ１の３’末端はキャップされて伸長を妨げる。
【００６０】
図６Ｆで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いている別のオリゴヌクレオチドＰ２と相補的な配列を含む。複合体Ｃの固相からの放出は、イオン強度の低下、キレート剤の添加、ｐＨの変更または温度の上昇、あるいはこれらの因子の組合せなどの物理的な環境の変化によって生じる。適切な条件下では、複合体Ｃの物理的放出は可逆的である。
【００６１】
図６Ｇで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、その５’末端で固体表面に付いている別のオリゴヌクレオチドＰ２と相補的な配列を含む。Ｐ２の配列は、Ｐ１の少なくとも部分的な相補体と、物理的、化学的または光化学的手段で開裂して複合体Ｃを溶液中に放出することができる切れやすい連結とを含む。切れやすい連結の具体例は、これらだけに限定するものではないが、ジスルフィド結合（例えば、ＤＴＴにより開裂）およびｃｉｓ−ヒドロキシル基（過ヨウ素酸塩により開裂）を含む。図６ＧＧでは、抗体、抗原または抗体−抗原複合体を担持するプローブＰ１は、切れやすい連結、例えばジスルフィド、ｃｉｓ−グリコールなどを介して固体表面に付着している。この連結の物理的、酵素的、化学的または光化学的開裂を使用して、Ｐ１−担持複合体を表面から遊離させることができる。
【００６２】
図６Ｈで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の５’配列および３’配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着されており、配列ａおよび上流の配列ｂを含む。ａとａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは支持体に付着される。複合体Ｃの選択的放出は、配列ａ’およびｂ’を含む置換オリゴヌクレオチドＤの添加によって達成される。Ｐ２の配列ａおよびｂへのＤのハイブリッド形成は、配列ａおよびａ’のみのハイブリッド形成よりも熱力学的に好ましく、Ｐ１を置換させ、複合体Ｃを溶液中への放出させることとなる。第２の実施形態では、置換プローブはＰ１のすべてまたは一部と相補的であることができる。第３の実施形態では、抗体または抗体−抗原複合体は、表面に結合されたオリゴヌクレオチドおよびＰ１の両方に相補的な配列を含むスプリントオリゴヌクレオチドを介して間接的に表面に結合されたオリゴヌクレオチドＰ２と連結することができる（図示せず）。この後者の場合、置換は、オリゴヌクレオチドＤのＰ１、Ｐ２のいずれか、またはスプリントオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって生じることができる。
【００６３】
図６Ｉで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の３’配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着し、Ｐ２は、配列ａおよび下流の配列ｂを含む。オリゴヌクレオチドＰ２の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ１の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの選択的放出は、配列ｂ’を含む置換オリゴヌクレオチドＤのＰ２の配列ｂとのハイブリッド形成および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用するオリゴヌクレオチドＤのその３’末端からの伸長によって達成される。さらなる実施形態では、伸長反応に使用するポリメラーゼは、Ｐ１の配列ａ’を分解して、ハイブリッド形成したＰ２オリゴヌクレオチドを放出する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。別の実施形態では、Ｐ２は３’ヘアピン構造を含み（図６Ｍ）、ヘアピンの３’末端からのポリメラーゼによる伸長により、Ｐ１が置換される。この実施形態では、置換オリゴヌクレオチドＤは不要である。任意選択的に、スプリントオリゴヌクレオチドを図６Ｉおよび６Ｍで示した実施形態で使用してもよい。
【００６４】
図６Ｊで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその３’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、３’配列ｂおよび５’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その３’末端を介して固体支持体に付着しており、配列ａ’および任意選択の下流の配列を含む。オリゴヌクレオチドＰ１のａとオリゴヌクレオチドＰ２のａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの選択的放出は、置換オリゴヌクレオチドＤのＰ１の配列ｂとのハイブリッド形成および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する３’末端からの伸長によって達成される。さらなる実施形態では、伸長反応に使用するポリメラーゼは、Ｐ２の配列ａ’を分解して、ハイブリッド形成したＰ１オリゴヌクレオチドを放出する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。
【００６５】
図６Ｋで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、任意選択の５’配列ｂおよび３’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、ＲＮＡでできており、その５’末端を介して固体支持体に付着しており、配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ１の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ２の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの放出は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を選択的に分解するＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼの添加によって達成される。別の実施形態では、Ａｂ１へのＰ１の複合体形成およびＰ２の固体支持体への付着は、各オリゴヌクレオチドの３’末端を介して生じる。
【００６６】
図６Ｌで示した通り、抗体、抗原または抗体−抗原複合体Ｃは、オリゴヌクレオチドＰ１にその５’末端を介して複合体形成している。複合体形成したオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡでできており、任意選択の５’配列ｂおよび３’配列ａを含む。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端を介して固体支持体に付着ており、配列ａ’を含む。オリゴヌクレオチドＰ１の配列ａとオリゴヌクレオチドＰ２の配列ａ’とのハイブリッド形成により、複合体Ｃは表面に付着する。複合体Ｃの放出は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を選択的に分解するＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼの添加によって達成される。別の実施形態では、Ａｂ１へのＰ１の複合体形成およびＰ２の固体支持体への付着は、各オリゴヌクレオチドの３’末端を介して生じる。
【００６７】
図６Ｎで説明した実施形態では、固定化された近接構成要素は、制限エンドヌクレアーゼによる開裂によって放出される。Ａｂ１は、配列（ａｂｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成している。抗体Ａｂ２は、配列（ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成しており、ここで、領域ｄは制限エンドヌクレアーゼ認識部位に相当する。抗体Ａｂ２はその特異的エピトープに結合しており、抗体−抗原複合体は、オリゴヌクレオチドＰ２の相補的捕捉オリゴヌクレオチドＣ（表面に付着している）とのハイブリッド形成によって固体支持体に捕捉されている。任意選択的に、支持体は洗浄され、結合していない抗原および試料のその他の成分を除去する。次いで抗体Ａｂ１を加えると、その結果、それはエピトープ１を結合する。オリゴヌクレオチドＰ２と捕捉プローブＣとの間の相補性の程度は、Ｐ２とオリゴヌクレオチドＰ１との間のものよりも大きく、したがって、Ｐ１と捕捉プローブＣとの間のハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２とのハイブリッド形成よりも熱力学的に好ましい。抗原−抗体複合体は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位ｄが開裂すると放出される。抗体Ａｂ２に付着したオリゴヌクレオチドＰ２の残りの断片は、配列（ａ’ｂ’ｃ’）を含み、抗体Ａｂ１上のプローブＰ１と相補的である。（ａ’ｂ’ｃ’）のその相補体とのハイブリッド形成は、熱力学的に好ましく、伸長可能な３’末端を有するオリゴヌクレオチドハイブリッドを介する抗体Ａｂ１とＡｂ２とを連結させる。この複合体は、図１で示したような適切な増幅反応で使用することができる。
【００６８】
図７Ａは、オリゴヌクレオチド部の捕捉オリゴヌクレオチドとの相互作用を介する近接構成要素の固定化を示す。ここで、オリゴヌクレオチド部は、オリゴヌクレオチド部が捕捉オリゴヌクレオチドから放出された場合にアンプリコンを形成することが可能である。領域ｂ、ｃおよびｙを含む捕捉オリゴヌクレオチドは固体支持体にその５’末端で複合体形成されているように示されているが、その３’末端で付着していてもよい。領域ｂおよびｃは、オリゴヌクレオチド部Ｐ１のそれぞれ領域ｂ’およびｃ’とのハイブリッド形成により相互作用している。領域ｙは、図６Ａ〜６Ｎで示したものを含む上記の方法のいずれかによって放出を促進する部位を表す。Ａｂ２は、分析物Ａｇに結合する前または後に固体支持体に固定化することができる。図７Ｂは、Ａｂ２が分析物Ａｇと結合する前にＡｂ２が固定化されている実施形態を示す。一実施形態では、結合された近接構成要素−分析物複合体を増幅の前に洗浄して、結合していない分子を除去することによってバックグラウンドシグナルを減少させる。Ａｂ２、Ａｂ１および標的分析物間の完全な複合体を図７Ｃで示す。
【００６９】
図７Ｄは、２つの近接構成要素間の非特異的相互作用によって生じる標的非依存性増幅の原因と考えられるものを説明する。非特異的相互作用のその他の原因も考えられるが、示した通り、Ａｂ１とＡｂ２との間でこの非特異的相互作用が起きる。Ａｂ１とＡｂ２との間の相互作用は、アンプリコンの形成に使用される、この場合それぞれ領域（ｄｅ）および（ｄ’ｅ’）の相補的な領域を介して、Ｐ１とＰ２の相互作用を促進する。Ｐ１：Ｐ２の相互作用の形成は同様に、Ａｂ１とＡｂ２との間の継続した連関を促進することができ、したがって、Ｐ１：Ｐ２の相互作用の不安定化により、標的非依存性シグナルを全体的に低減し得る。これは、Ｐ１の領域（ｄｅ）と相互作用するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを提供することにより、例えば、この領域とＰ２のその相補体（ｄ’ｅ’）との相互作用を防ぐことによって達成できる。
【００７０】
増幅により分析物を検出する方法におけるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を図７Ｅ〜７Ｈで説明する。反応混合物にＡｂ１を加える前またはＡｂ１を加えるのと同時にＡｂ２は分析物のエピトープ２と結合し、Ａｂ２は、捕捉オリゴヌクレオチドとの相互作用によって表面に固定化される。この実施形態の捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｐ２の領域（ｂ’ｃ’）とハイブリッド形成する。任意選択的に、結合した複合体をＡｂ２と分析物との間の複合体の形成前または後に洗浄して、結合していない分子を除去する。Ｐ１の領域（ｄｅ）とハイブリッド形成している領域（ｄ’ｅ’）を含むハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下でＡｂ１を加えて、上記の通りＡｂ１とＡｂ２との相互作用を抑制する。結合していないＡｂ１は、Ａｂ１が分析物のエピトープ１と複合体を形成した後に、反応容器から洗浄してもよい。図７Ｅ〜７Ｈで示した通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的特異的複合体の形成を妨害しない。捕捉オリゴヌクレオチドからのＰ２の放出により、Ｐ２の領域（ｄ’ｅ’）はＰ１の（ｄｅ）の領域と相互作用して、増幅のための二本鎖開始部位を形成することができる。Ｐ２は、上記の任意の手段により、捕捉オリゴヌクレオチドから放出されてもよい。例えば、図７Ｉで示した通り、Ｐ２は緩衝液のイオン強度を変更することによって放出される（捕捉オリゴヌクレオチドからの物理的放出を示す図６Ｆ参照）。図７Ｉで示した通り、Ｐ２が放出されると、それはＰ１と自由に相互作用して、増幅することができる二本鎖配列を形成する。あるいは、図７Ｊで示した経路に従って、置換オリゴヌクレオチドを使用してＰ２を捕捉オリゴヌクレオチドから解離してもよい（図６Ｈも参照）。
【００７１】
図７Ｉは、イオン強度の変更をどのように使用して選択的にＰ２を放出し、それに続くＰ１とＰ２の相互作用を促進するかを説明する。図７Ｉでは、Ａｂ１−Ｐ１、Ａｂ２−Ｐ２および標的分析物間の複合体の形成が、三元複合体の形成に最適なイオン強度を有し得る緩衝液で達成される。結合していないか非特異的に結合したＡｂ１−Ｐ１は、非特異的相互作用は弱めるが、Ｐ２の配列（ｂ’ｃ’）と捕捉オリゴヌクレオチドとの間で形成した二重鎖ならびにＡｂ１、Ａｂ２および標的分析物間で形成した複合体は、維持する高イオン強度の緩衝液中で洗い流してもよい。緩衝液のイオン強度を低イオン強度に変更することは、Ｐ２と捕捉オリゴヌクレオチドとの間の二重鎖を溶かす効果がある。イオン強度を低下させることによる核酸二重鎖の不安定化の程度は、ヌクレオチドの任意の配列について、例えば非特許文献７に挙げられた方法を使用して計算することができる。複合体が捕捉オリゴヌクレオチドから解離した後にイオン強度を高イオン強度に戻すことにより、Ｐ１とＰ２はハイブリッド形成して増幅可能な配列を形成することができる。
【００７２】
図８Ａでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１およびＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ２は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１は、Ａｂ２で被覆された常磁性粒子を加える前に、その特異的エピトープに結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成を最小化させるように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ１抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを、図１で示したものなどの適切な増幅反応に使用してもよい。
【００７３】
図８Ｂでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１とＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１は、抗体Ａｂ２を加える前に、その特異的エピトープに結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成は最小化するように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを増幅反応に使用してもよい。
【００７４】
図８Ｃでは、抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識し、５’末端の連結を介してそれぞれオリゴヌクレオチドＰ１およびＰ２に複合体形成している。Ｐ１とＰ２の３’末端は相補的であり、抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子にも連結する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、それらの特異的エピトープに同時に結合させることができる。Ａｂ２がＡｂ１に隣接して結合することにより、オリゴヌクレオチドＰ１とＰ２の３’末端はハイブリッド形成することができる。Ｐ１とＰ２の抗原非依存性のハイブリッド形成は最小化するように、Ａｂ１およびＡｂ２の溶液中の濃度は、抗原の表面に結合したものと比較して低い。抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体を洗浄によって除去する。次いで、Ｐ１：Ｐ２ハイブリッドを増幅反応で使用してもよい。
【００７５】
図８Ｄでは、プローブＰ２を担持する抗体Ａｂ２は、表面、例えばビーズまたはマイクロウェルの壁に、切れやすい連結を介して付着しているか、付着できる（図６ＧＧ参照）。Ｐ１を担持する抗体Ａｂ１は、標的抗原のエピトープ１に結合しており、この複合体は、表面に連結したＡｂ１とエピトープ２を結合することにより固定化されている。結合していないＡｂ１は洗い流し、次いで切れやすい連結を開裂し、三元複合体は表面から遊離される。次いで、分離された三元複合体を含有する溶液相を増幅用の第２の反応ウェルに移し、最初の表面に非特異的に結合したＡｂ１を残す。
【００７６】
本発明の別の態様を図９で説明する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２は、隣接する抗原性エピトープを認識する。オリゴヌクレオチドＰ１は、その３’末端で抗体Ａｂ１に複合体形成している。オリゴヌクレオチドＰ２は、その５’末端で抗体Ａｂ２に複合体形成している。抗体Ａｂ１は共有結合的または非共有結合的のいずれかで常磁性粒子と連結している。この２つの抗体を抗原と混合し、それらの各エピトープに結合させる。得られる抗体−抗原複合体を磁場を適用することによって捕捉し、結合していないＡｂ２抗体および試料マトリックスのその他の成分を洗浄によって除去する。次いで、プローブＰ１の５’末端およびプローブＰ２の３’末端と相補的なスプリントオリゴヌクレオチドＳを加える。スプリントオリゴヌクレオチドＳとプローブＰ１の５’末端およびプローブ２の３’末端との間のハイブリッド形成により、２つの抗体間のギャップが架橋される。次いで、Ｐ１：Ｌ：Ｐ２ハイブリッドを図３で示したように増幅反応で使用してもよい。図３で示したその他のリンカー構造も使用してよい。さらに、Ａｂ１は、図６Ａ〜６Ｌで記載の通りの開裂可能な連結を介して常磁性またはその他の粒子に付着してもよい。
【００７７】
本発明のさらに別の態様を図１０に挙げる。標識していないＡｂ１およびＡｂ２は、標的抗原の近接エピトープに結合している。第２の抗体Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２、例えば抗Ｆｃ１および抗Ｆｃ２をそれぞれ、互いに相補的な３’末端を含むオリゴヌクレオチドプローブＰ１およびＰ２で標識する。次いで、第２の抗体は標識していない最初の抗体Ａｂ１およびＡｂ２と結合し、オリゴヌクレオチドプローブを近くに近接させて、３’末端のハイブリッド形成および伸長によりプローブを増幅可能な鎖に変換する。任意選択的に、Ａｂ１およびＡｂ２はハプテン部（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、トリニトロフェノール、ジニトロフェノールなど）で標識されていてもよい。この場合、プローブで標識した第２の抗体Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２は、Ａｂ１およびＡｂ２の各ハプテン標識に対して結合特異性を有する。
【００７８】
さらなる実施形態では、第２の抗体は、連結スプリントオリゴヌクレオチドと互いに塩基対形成した場合に連結できるプローブで標識されている（図２）。第２の抗体の対が、近接エピトープに結合している標識していない抗体の対に結合している場合、プローブは連結スプリントオリゴヌクレオチドと互いに塩基対形成し、連結が生じる。
【００７９】
第３の実施形態では、標識した第２の抗体は、抗原とインキュベーションする前またはインキュベーションしている間に最初の抗体と結合する（または結合することができる）。第４の実施形態では、第２の抗体の少なくとも１つは固体表面、例えばマイクロウェル壁または電磁ビーズに連結している。第５の実施形態では、第２の抗体は固体表面に可逆的に連結している（図６Ａ〜６Ｌ、７Ａ〜７Ｄ、および８Ａ〜８Ｄ）。第６の実施形態では、表面に連結された抗体が固体表面から放出され、放出された抗体が増幅反応にかけられる。第７の実施形態では、Ａｂ１および／またはＡｂ２は、アプタマー、受容体またはその他のエピトープ結合単位であってもよく、Ｓｅｃ１およびＳｅｃ２はＡｂ１およびＡｂ２に結合しているプローブで標識された認識分子である。第８の実施形態では、Ｓｅｃ１および／またはＳｅｃ２は、Ｆａｂ’断片、アプタマー、抗体に対する抗体、またはＡｂ１もしくはＡｂ２を特異的に認識する任意の分子であってもよい。
【００８０】
プロテインＧまたはプロテインＡを、図１０で説明した通り、任意選択的にＳｅｃ１およびＳｅｃ２の代わりにすることができる。プロテインＧおよびプロテインＡは、１つのプロテインＧまたはプロテインＡがＩｇＧ分子ごとに結合して、ほとんどのＩｇＧ分子およびＦｃ領域に結合する。特に、プロテインＧまたはプロテインＡは、「一般的なオリゴヌクレオチド」プローブで修飾されることができる（図１０の標識されたＰ１およびＰ２）。例えば、修飾されたプロテインＧ分子は、エピトープ１およびエピトープ２を認識する抗体に先に結合していることができる。この場合、Ｐ１で修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡはＡｂ１に先に結合しているであろう。同様に、Ｐ２で修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡは、Ａｂ２に先に結合しているであろう。あるいは、プローブで修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡ分子は、一緒に混合して、図１０で示した通りに使用することができる。
【００８１】
このアプローチには確かな利点がある。第１に、修飾する必要があるのは、ただ１つの試薬、すなわちプロテインＧまたはプロテインＡである。第２に、ほとんどの任意の一次検出抗体を、例えばラット、マウスまたはウサギ抗体に対する抗原に結合するのに使用することができる。第３に、主要な抗体に先に結合する修飾されたプロテインＧまたはプロテインＡは、特に、任意のＡｂ１またはＡｂ２での一般的な使用で使用可能な印の付いた試薬である。得られるアッセイ成分の標準化は、定量および再現性を向上させると期待される。
【００８２】
ある場合には、プロテインＡまたはプロテインＧの代わりにプロテインＡ／プロテインＧの融合産物を使用することが有利である。また、「プロテインＡ」または「プロテインＧ」は、天然の細菌産物、または例えばプロテインＧのアルブミン結合能力を排除することによってＩｇＧ分子に最適に結合するように設計された遺伝子操作されたバージョンもしくは組換えバージョンを指すことができることも理解されよう。
【００８３】
本発明の別の態様を図１１Ａ〜Ｃで示す。ここでは、本発明は、ヘアピン構造を取り入れることにより非特異的プライマー−プライマー相互作用に関与できないようにされた免疫増幅反応で使用するための、オリゴヌクレオチドで標識された抗体を含む。抗体Ａｂ１は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ａｂａ’ｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成しており、ここで、ａとａ’はハイブリッド形成してヘアピン構造を形成する相補配列である。ヘアピンのＴｍは十分に低いので、オリゴヌクレオチド標識の一部は、増幅反応の条件下で、開いて弛緩した形態で存在する。核酸二重鎖のＴｍは、温度とイオン強度の所与の組合せの下で、例えば非特許文献７で記載の方法の１つを使用して、ヌクレオチドの任意の配列に関して当技術分野でよく知られた方法で計算されることができる。３’末端配列ｃは、ヘアピン構造の一部を形成せず、ＤＮＡポリメラーゼ伸長の自己プライミングを妨げるように設計されている。抗体Ａｂ２は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ａｂ’）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成している。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合する場合、プローブＰ１のヘアピンの揺らぎ（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）によって、２つのオリゴヌクレオチド標識間で塩基対形成が生じる。配列（ｂａ’）と（ａｂ’）の対形成で形成したＰ１：Ｐ２ハイブリッドのＴｍは、Ｐ１ヘアピンのものよりも大きい。したがって、Ｐ１とＰ２とのハイブリッド形成は熱力学的に好ましい。次いで、ＤＮＡポリメラーゼはＰ２の３’末端を伸長して、ニック形成可能な二本鎖制限部位を生じる。ニック形成、伸長および鎖置換により、ニック形成可能な制限部位をいずれかの末端に有する二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。この構造物は、指数関数的ＳＤＡ反応で使用してもよい。
【００８４】
別の実施形態では、抗体Ａｂ１は、ＳＤＡ制限酵素ニック形成部位および下流の配列（ｂ’ａｂａ’ｃ）を含むオリゴヌクレオチドＰ１に複合体形成していてもよく、ここで、ａとａ’はハイブリッド形成してヘアピン構造を形成する相補配列である。配列ｂとｂ’も相補的だが、ａとａ’のハイブリッド形成で形成したものよりも不安定な構造を形成する。したがって、ａ：ａ’ヘアピンの形成が好ましい。３’末端配列ｃはヘアピン構造の一部を形成せず、ＤＮＡポリメラーゼ伸長の自己プライミングを妨げるように設計されている。抗体Ａｂ２は、配列（ｂ’ａ’ｂ）を含むオリゴヌクレオチドＰ２に複合体形成しており、ここで、ｂとｂ’は相補的で、且つヘアピン構造を形成する。プローブＰ２はＳＤＡニック形成部位を欠く。したがって、ＤＮＡポリメラーゼ伸長が３’末端から生じると、線形増幅をすることができないデッドエンド産物が生じる。ａ：ａ’およびｂ：ｂ’ヘアピンのＴｍは十分に低いので、各オリゴヌクレオチドの一部は、反応の条件下で、開いて弛緩した形態で存在する。抗体Ａｂ１およびＡｂ２がそれらの各エピトープに結合する場合、プローブＰ１およびＰ２のヘアピンの揺らぎによって、２つのオリゴヌクレオチド標識間で塩基対形成が生じる。配列（ｂ’ａｂ）と（ｂａ’ｂ’）との対形成で形成したＰ１：Ｐ２ハイブリッドのＴｍは、いずれのヘアピン構造のものよりも大きい。したがって、Ｐ１とＰ２のハイブリッド形成は熱力学的に好ましい。次いで、ＤＮＡポリメラーゼはＰ２の３’末端を伸長して、ニック形成可能な二本鎖制限部位を生じる。ニック形成、伸長および鎖置換により、指数関数的ＳＤＡ反応で用いることができる二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。
【００８５】
さらなる実施形態を図１１Ｃで示す。プローブＰ１は、ヘアピン配列ｂ、ｄ、ｂ’、ヘアピン配列の５’である配列ａ、およびヘアピン配列の３’であり、伸長不可能な３’キャップを任意選択的に含有する配列ｃを含む。配列ｂとｂ’は相補的であり、ハイブリッド形成してヘアピン構造のステムを形成する。配列ｄはヘアピンのループを形成する。任意選択的に、配列ｄの一部はそれ自体と塩基対形成して、ｂおよびｂ’と共にステム構造の一部を形成してもよい。プローブＰ２は、Ｐ１の配列ｄと相補的な配列ｄ’を含む。ヘアピン構造の存在により、ｄとｄ’とのハイブリッド形成が妨げられる。置換オリゴヌクレオチドＤを加えると、最初にＰ１の配列ａとハイブリッド形成し、次いでステムのｂ’アームを置換することによってヘアピンを開く。次いで、Ｐ２の配列ｄ’はＰ１の折り畳まれていない配列ｄとハイブリッド形成し、Ｐ２はポリメラーゼで伸長されて、オリゴヌクレオチドＤを置換し、ニック形成可能な二本鎖制限部位をＰ１上に作製する。次いで、増幅は、図１１Ｂで示した実施形態と類似の方法に従う。
【００８６】
図１２は、試験試料中の抗原特異的免疫グロブリン抗体の存在を検出する方法を示す。プローブＰ１およびＰ２は、各Ａｇ分子がＰ１またはＰ２のいずれか（ただし、両方ではない）によって標識されるように、抗原分子Ａｇに複合体形成している。標識された抗原は、試験試料と混合され、示したようにＡｇ特異的免疫グロブリンに結合する。Ｐ１とＰ２の両方を含有する複合体は、増幅可能であり、検出可能であり、Ａｇ特異的免疫グロブリンの存在を示す。Ａｇ特異的免疫グロブリンの不在下では、検出可能な複合体は形成しない。同様のアプローチを使用して、２つ以上の同一のリガンド結合性部位または２つ以上の異なるリガンドの結合性部位のいずれかを含む任意のリガンド−受容体の相互作用を検出することができる。後者の場合、各リガンドは異なるプローブ配列で標識されている。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するプロテインＧはＰ１で標識してもよく、ＡｇはＰ２で標識してもよい。標識したＡｇおよびプロテインＧを同じＩｇＧ分子に結合することにより、本発明の方法により増幅可能で、且つ検出可能な複合体が生じるであろう。
【００８７】
図１３は、二元免疫ＳＤＡで有用な、代表的なプローブ、プライマー、アダプター、レポーターおよびテザーオリゴヌクレオチドを示す。これらのオリゴヌクレオチドの構造およびそれらの使用は、以下の実施例で挙げる。以下の実施例には、一切、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例１】
【００８８】
（二元免疫ＳＤＡに有用なプローブ、プライマー、アダプター、レポーターの代表的な配列）
以下に示したプローブ、プライマー、アダプターおよびレポーターのいくつかの配列は、図１３で挙げられている。
【００８９】
（プローブ（Ｐ１、Ｐ２））
ＲＨＰ−１（右側のプローブ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９０】
【００９１】
ＲＨＰ−３（右側のプローブ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９２】
【００９３】
ＲＢＤ−３ｖ３（右側のプローブ；Ｘ＝ビオチン標識ｄＴ；太字の配列は下記のプライマーＳＲＨ−１と共通である）：
【００９４】
【００９５】
ＬＨＰ−１（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ Ｃ
【００９６】
ＬＨＰ−２（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ
【００９７】
ＬＨＰ−３（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ｔ
【００９８】
ＬＨＰ−４（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ
【００９９】
ＬＨＰ−５（左側のプローブ；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＴＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴ
【０１００】
（プライマー）
ＳＲＨ−１（右側のプライマー；太字の配列はＲＨＰ−１と共通である）：
【０１０１】
【０１０２】
ＳＬＨ−２（左側のプライマー；太字の配列はＬＨＰ−１、２、３、４および５と共通であり；下線の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的である）：
【０１０３】
【０１０４】
（アダプター）
ＡＤＲ−２（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＴＧ ＡＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＡＧＡ Ｃ
【０１０５】
ＡＤＲ−５（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＣ
【０１０６】
ＡＤＲ−８（下線の塩基はＴＢＤ１０．２［Ｄ／Ｒ］の３’末端と同一である）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＡＧ Ｃ
【０１０７】
ＡＤＩＱＳ−１（ＩＱＳアダプター）：
５’ ＡＣＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＧ
【０１０８】
ＡＤＱＳ−２（ＩＱＳ−２のアダプター；下線の塩基はａｌｔＤ６．９（Ｆ／Ｄ）の３’末端と同一である）：
５’ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴ ＡＣ ＴＣＡ
ＧＡＧ ＴＧＡ ＴＣＡ ＡＧＴ
【０１０９】
（レポーター）
ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）（下線の塩基はＡＤＲ−２およびＡＤＲ−５の５’末端と同一である）：
５’（ｄａｂｃｙｌ）−ＴＡＧ ＣＧＣ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＣＧ ＴＴ（ｒｏｘ）Ａ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＴ
【０１１０】
ａｌｔＤ６．９（Ｆ／Ｄ）：
５’（ｆａｍ）−ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＣＴ（ｄａｂｃｙｌ）ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴ
【０１１１】
（テザーオリゴヌクレオチド）
ＲＣＰ−１（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−１の５’末端と相補的である）：
５’ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＣＴＧ Ｇａｔ ａｔ
【０１１２】
ＬＣＰ−２（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＬＨＰ１−５の５’末端と相補的である）：
５’ ＣＧＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ Ｔｔｔ ｔｔ
【０１１３】
ＬＣＰ−４（テザーオリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＬＨＰ１−５の５’末端と相補的である）：
５’ｔ ｔｔａ ｔｔｔ ｔａｔ ＣＧＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ Ｔ
【０１１４】
（捕捉および置換オリゴ）
ＲＣＰ−１３ｖ１（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端近くの配列と相補的であり；下線の塩基はＤＯ−１３ｖ１と相補的であり；Ｘ＝テトラ−エチレングリコール；Ｚ＝ヘキサ−エチレングリコール；ＸはＺにリン酸ジエステル部を介して連結しており；Ｚはオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸ジエステル部を介して連結している）：
【０１１５】
５’ビオチン−Ｘ−Ｚ−ｃｃｔ ｇｇｔ ａｃｇ ａｇｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｃｃｔ ＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ａＣＧ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＧ ｔ
【０１１６】
ＤＯ−１３ｖ１（置換オリゴヌクレオチド［キャップ］＝３’デオキシルイジン）：
５’ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＡＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣＧ ＴＡＣ ＣＡＧ Ｇ−［キャップ］３’
【０１１７】
ＲＣＰ−９ｖ２．２（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端近くの塩基と相補的であり；下線の塩基は置換オリゴＣＭＰＲ−９ｖ２と相補的であり；Ｘ＝テトラ−エチレングリコール；Ｚ＝ヘキサ−エチレングリコール；ＸはＺにリン酸ジエステル部を介して連結しており；Ｚはオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸ジエステル部を介して連結している）：
５’ビオチン−Ｘ−Ｚ−ｔ ｔｔａ ＣＡＣ ＴＧＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ｔＣＣ
ｔＡＧ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＣＴ ｃｃｇ ｔｇｇ ｃＡｇ
ｃｇｔ
【０１１８】
ＣＭＰＲ−９ｖ２（捕捉オリゴヌクレオチド；大文字の塩基はＲＨＰ−３の５’末端と相補的であり；［キャップ］＝３’デオキシウリジン）：
５’ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴｔ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＴ−［キャップ］３’
（ブロッキングオリゴヌクレオチド（［キャップ］＝２’，３’ジデオキシシチジン））
【０１１９】
ＬＢＫ−１（大文字の塩基はＬＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ Ｔａａ ｔｔｔ−［キャップ］３’
【０１２０】
ＲＤＢ−３ｐ５（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＣ ａａ−［キャップ］３’
【０１２１】
ＲＤＢ−３ｐ８（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＡ ａａ−［キャップ］３’
【０１２２】
ＲＤＢ−３ｐ１０（大文字の塩基はＲＨＰ−１の３’末端と相補的であり；下線の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＧ Ｔ ＣＴＡ ＧＣＴ ＣＡＴ Ｃｔａ−［キャップ］３’
【０１２３】
ＲＤＢ−３ｚ８（大文字の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃ ａａ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ
ＡＧＣ ＴＣＡ ａａｃ−［キャップ］３’
【０１２４】
ＲＤＢ−３ｚ０（大文字の塩基はＲＨＰ−３の３’末端と相補的である）：
５’ ｃａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ａｃ ａａ ＧＴＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ｔ ａａｃ−［キャップ］３’
【０１２５】
（定量化標準および品質管理（「ＱＣ」）ヌクレオチド）
ＬＴＡＲ−１（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌ）製のＱＣオリゴヌクレオチド；下線の塩基はＩＱＳ−１とは異なる）：
５’ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ Ｔ
【０１２６】
ＩＱＳ−１（定量化内部標準；下線の塩基はＬＴＡＲ−１とは異なる）：
５’ ＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＴ
ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＣ
【０１２７】
ＩＱＳ−２（定量化内部標準；下記の場合の塩基は標的誘導アンプリコンとは異なる）：
５’ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＡ Ｃ ａｔ ｃｔｇ ｔｃａ ｃｔｔ ｇａｔ ｃａｃ ｔｃｔ ｇａ Ｇ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＣ
【実施例２】
【０１２８】
（均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
以下の一連の実験では、近接構成要素の分析物特異的結合性部はビオチン部であり、選択した試験分析物はストレプトアビジン（「ＳＡ」）であった。ビオチンは、オリゴヌクレオチド部Ｐ１（ＲＨＰ−１）およびＰ２（ＬＨＰ−１またはＬＨＰ−３）の５’末端に連結させた。（実施例１参照、上記）。Ｐ１およびＰ２はそれぞれ濃度１μＭであり、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および任意選択的に０．２５μＭのＳＡと混合した。室温で１０分後、最終的なプローブ濃度がｐＭの範囲になるように混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマー（ＳＲＨ１、ＳＬＨ２）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポータープローブ（ＴＢＤ１０．２）と混合し、混合物を７２℃に１０分間加熱した。試料を５２℃に冷却し、ｄＮＴＰを含むＳＤＡ成分の乾燥カクテルを含有する「増幅ウェル」に加えた。最終的なプローブ濃度は１ｆＭまたは１０ｆＭのいずれかであり、最終的なＳＡ濃度はゼロまたは各プローブ濃度の２分の１であった。次いで、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）を混合物に加え、等温増幅を５２℃で１時間実施した。特許文献１７で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を監視した。
【０１２９】
ＭＯＴＡ値（１時間の反応の過程にわたって統合した蛍光強度の測定値）を表１で報告する。Ｐ２が、Ｐ１（ＲＨＰ−１）とハイブリッド形成した場合に１３塩基対の二重鎖を形成するＬＨＰ−３である場合、分析物ＳＡを含有する試料では、ＳＡを含有しなかった対照よりもＭＯＴＡ値が１００〜１０００倍高く、ｆＭ未満の濃度でＳＡタンパク質を検出するこのＳＤＡに基づく二元プローブシステムの能力を証明している。
【０１３０】
【表１】
【実施例３】
【０１３１】
（不均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、５’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず５’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのＲＨＰ−１はＰ１として働き、５’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず５’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのＬＨＰ−１はＰ２として働いた。１００ｎＭのプローブをＳＡで被覆したビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）と混合し、時々撹拌しながら室温で４５分間インキュベートした。次いで、ビーズを管の脇に集め、溶液を除去した。ビーズを０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡに再懸濁し、それらを管の脇に集め、溶液相を廃棄した。これらの洗浄ステップを４回繰り返し、最後にビーズをＳＤＡ反応緩衝液に再懸濁した。得られる懸濁液を、ＳＤＡプライマー（ＳＬＨ−２、ＳＲＨ−１）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポーター（ＴＢＤ．１０．２）を含有する混合物に加えた。これらの混合物中のビーズに結合したＳＡの最終濃度は４０または４００ｆＭであった。次いで、上記の実施例２の記載の通りにＳＤＡを実施した。
【０１３２】
結果を表２に示す。期待した通り、ビオチン化プローブおよびＳＡを４０または４００ｆＭのいずれかで含有する反応において、強いＭＯＴＡ値が観察され、ＳＡに結合したプローブが増幅可能な伸長産物に変換したことを示した。対照的に、ＳＡと、ビオチンの代わりに５’アミノ連結基で標識したプローブとを含有する対照反応では、ＭＯＴＡ値は非常に低かった。これらの対照反応について期待した通り、ビオチンを欠くプローブはビーズに連結したＳＡに結合することはできず、その結果、洗浄ステップ中に排除され、したがって増幅可能な伸長産物には変換されなかった。対照反応に現れた低いシグナルは、アミノに連結したプローブのビーズ表面への非特異的結合の結果の可能性がある。
【０１３３】
【表２】
【実施例４】
【０１３４】
（単一のテザーオリゴヌクレオチドによる免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、非ビオチン化ＲＨＰ−１（上記参照）はＰ１として、ＬＨＰ−３（５’ビオチンを担持している）はＰ２として、ＲＣＰ−１（３’ビオチンを担持している）はテザーオリゴ、ＴＯとして働いた。プローブＰ１およびＰ２ならびにテザーオリゴＴＯを等モル比で混合し、ＳＡを含有しているか欠いているかのいずれかの管に加えた。この管を短時間室温でインキュベートし、次いで管の内容物を連続的に希釈して、プローブの濃度をｐＭ範囲にした。次いで、希釈した混合物を、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ１、ＳＬＨ２）、アダプター（ＡＤＲ−５）およびレポータープローブ（ＴＢＢ１０．２）と混合して、ＳＡの最終濃度を０または０．２５ｆＭのいずれかに、Ｐ１、Ｐ２およびＴＯのそれぞれの濃度を１ｆＭとした。次いで、混合物を「熱スパイク」（７２℃で１０分間）にかけるか、５２℃で１０分間インキュベートした（「熱スパイクなし」）。推定Ｔｍ６４℃を有するＰ１：ＴＯ二重鎖は５２℃では安定で、７２℃のインキュベーションで分裂すると予想される。分裂すると、Ｐ１：ＴＯ二重鎖は、極めて非常にゆっくりと（ｔ１／２＞１００時間）、希釈した（１ｆＭ）プローブ濃度で再形成することとなる。ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの乾燥カクテルを加えることによって試料をＳＤＡにかけ、次いで５２℃においてＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置でインキュベートした。プローブＰ１およびＰ２がそれぞれＴＯまたはビオチンを介して共通のＳＡ分子に結合すると、それらの相補的な３’末端はハイブリッド形成し伸長して、ＳＤＡプライマー（ＳＬＨ−２およびＳＲＨ−１）およびアダプターＡＤＲ−５のためのハイブリッド形成部位を作製する。これにより、伸長したＰ１およびＰ２分子の同時の増幅および検出が可能になる。フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴うアダプターが介在する蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した（アダプター介在型レポータープローブ変換の詳細については特許文献１７参照）。
【０１３５】
結果を表３に示す。分析物０．２５ｆＭのＳＡおよび１ｆＭのプローブを含む「熱スパイクなし」試料は、蛍光の強い増加（平均ＭＯＴＡ＝１６６０００）を示したが、ＳＡを欠くが１ｆＭのプローブを含有する対照試料は、ちょうど３０００の平均ＭＯＴＡ値を示した。これはＰ１：ＴＯ二重鎖がＳＤＡの前に７２℃の熱スパイクで分裂された試料から得られた値と同程度である。ＳＡを欠く試料では、ＭＯＴＡ値は低いままであり、これはＰ１−Ｐ２二重鎖の形成が１ｆＭのプローブ濃度では測定可能な効率で生じないからである。
【０１３６】
【表３】
【実施例５】
【０１３７】
（二元免疫ＳＤＡによる分析物定量）
試料中の標的分析物のレベルは、標的介在型プローブ伸長産物と共増幅された内部標準（例えば、実施例１のＩＱＳ−１）を入れることによって定量的に測定してもよい。内部標準および標的依存性プローブ伸長産物は、ＳＤＡプライマーの共通の対によって増幅されるが、それぞれの識別可能に標識されたレポータープローブ（例えば、実施例１のＴＢＤ１０．２およびＡｌｔＤ６．９）により検出される。２つのレポータープローブの相対的なシグナルを比較することにより、内部標準の既知の量と相対的なプローブ特異的伸長産物の濃度を推定することができる。分析物の絶対濃度の測定では、バックグラウンド修正済み標的／対照シグナル対標的分析物シグナルの比の「標準曲線」を作製することが有利な場合がある。次いで、試験試料について観察したシグナル比を標準曲線と比較して、絶対分析物濃度を作製する。核酸標的レベルを定量する同様の方法が当技術分野で知られている（例えば、非特許文献８参照）。
【実施例６】
【０１３８】
（２つのテザーオリゴヌクレオチドを用いる免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実験では、非ビオチン化ＲＨＰ−１（上記参照）はＰ１として、非ビオチン化ＬＨＰ−３はＰ２として、一方、ＲＣＰ−１（３’ビオチンを担持している）およびＬＣＰ−４（５’ビオチンを担持している）はテザーオリゴヌクレオチドとして働いた。Ｐ１、Ｐ２およびテザーオリゴヌクレオチド間の相互作用を図３Ｈに図示する。プローブＰ１およびＰ２ならびにテザーオリゴヌクレオチドを等モル比（ここで、モル濃度は近接構成要素のテザーオリゴヌクレオチド部のみに関して測定された）で混合し、ＳＡを含有しているか又は欠いているかのいずれかの管に加えた。７２℃の「熱スパイク」実験を実施しなかった以外は、実施例４で記載の通りに反応を実施した。結果を表４に示す。ＳＡを含有する試料は、強い蛍光の増加（平均ＭＯＴＡ値＝１３６０００）を示したが、ＳＡを欠く試料は、ごくわずかな増加を示した（ＭＯＴＡ＝５３３）。
【０１３９】
【表４】
【実施例７】
【０１４０】
（分析物としてＩＬ−８を用いる均一な免疫ＳＤＡの実験的証明）
ヒトＩＬ−８を対象としたＭＡｂ Ｇ２６５−８（Ａｂ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳＡと共有結合させて、ＩｇＧ当たり１つのＳＡ１を含有する抗−ＩＬ−８ ＩｇＧ−ＳＡ複合体（Ａｂ１−ＳＡ）を得た。ＭＡｂ Ｇ２６５−８とＳＡは当技術分野でよく知られた方法を使用して複合体形成させた。２０ｎＭの５’ビオチン標識プローブＲＨＰ−３（Ｐ１）、１０ｎＭのＡｂ１−ＳＡ複合体、１０ｎＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する混合物を調製し、一夜４℃でインキュベートしてビオチン化オリゴヌクレオチドをＡｂ１−ＳＡ複合体に結合させて、Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１を形成した。
【０１４１】
ＭＡｂ Ｇ２６５−８のものとは異なるＩＬ−８エピトープに結合するＭＡｂ Ｇ２６５−５（Ａｂ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、プローブＬＨＰ−３（Ｐ２）のアミノ修飾された形態と直接、共有結合的にカップリングさせて、Ａｂ２を１個当たり平均して２．５個のＰ２部を有するＡｂ２−Ｐ２複合体を産生した。ＬＨＰ−３は５’末端に連結した第１脂肪族アミン基を含んでおり、ＭＡｂ Ｇ２６５−５とＬＨＰ−３は本質的に特許文献１２で記載の通りに複合体形成させた。
【０１４２】
それぞれ１ｎＭのＡｂ−プローブ複合体濃度を有するＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液およびＢＳＡおよび任意選択的に０．０１〜１ｎＭのＩＬ−８と混合した。室温で３０分後、Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合した。混合物を３７℃に１０分間加温した後、各試料の一部を増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。ここで、各増幅反応はＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼを含有していた。Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度は１ｆＭであり、ＩＬ−８の最終濃度は０、０．０１、０．１または１ｆＭであった。その他の成分の濃度は実施例２で記載の通りであった。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１４３】
平均ＭＯＴＡ値を表５に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８によりＭＯＴＡ値は増加され、均一な免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。この実験では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは用いなかったが、近接対−ＩＬ−８複合体の形成後に試料を約１００万倍に希釈して、標的非依存性プローブの増幅の発生を低減させた。
【０１４４】
【表５】
【実施例８】
【０１４５】
（ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用によるバックグラウンド抑制の実験的証明）
この実験は、標的分析物を伴わないＰ１とＰ２分子との塩基対形成から生じる標的非依存性増幅を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を説明する。この実験では、プローブＰ１は５’ビオチン化ＲＨＰ−３であり、プローブＰ２は５’ビオチン化ＬＨＰ−３である（上記参照）。Ｐ１およびＰ２の３’末端を含む１０ヌクレオチド配列は、互いに相補的である。実施例２と同様に、標的分析物はＳＡであり、これは、その四量体に４つのビオチン結合性部位を含有する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ＲＨＰ−３の３’末端と相補的な１８ヌクレオチド配列を含むＲＤＢ−３ｐ８（実施例１）である。したがって、Ｐ１とハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｐ８との間に形成された二重鎖は、Ｐ２と相補的なＰ１の３’末端での１０ヌクレオチド、ならびにＰ２と相補的ではないＰ１のさらなる８ヌクレオチドを含む。さらに、ＲＤＢ−３ｐ８は、１４ヌクレオチドの５’テール配列を含み（実施例１のＲＤＰ−３ｐ８の下線の塩基の塩基５’）、これは、その上でＲＨＰ−３の３’末端が伸長することができる無能力化鋳型として働く（図４Ｃで示した）。本発明のハイブリッド形成ブロッカーの特徴は、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部に共有結合的に付着しない、または連結しないということである。オリゴヌクレオチド部の３’末端の伸長に依拠して分析物特異的アンプリコンを産生する本発明の方法では、ハイブリッド形成ブロッカー−プローブ二本鎖が、３’末端の伸長を必要とし、二重鎖が不安定化する高温で一般に生じるポリメラーゼ触媒増幅方法（例えば、ＳＤＡおよびＰＣＲ）中で安定性を維持する必要がある。一般に、ポリメラーゼベースの増幅方法（例えば、ＰＣＲおよびＳＤＡ）で使用する高温は、プローブ−ブロッカーハイブリッドの拡がりを、誤ったプローブ変換の抑制の効力がなくなる点まで減少させることができる。本発明では、プローブ間で形成するハイブリッドよりも安定なプローブ−ブロッカーハイブリッドを形成することが可能なハイブリッド形成ブロッカーを選択することにより、かつ高温でプローブ−ブロッカー鋳型を安定化する無能力化鋳型を使用することにより、この困難を克服している。
【０１４６】
免疫ＳＤＡによるＳＡ含有溶液の分析は、以下の通りに実施した。それぞれ２０ｐＭの５’ビオチン標識プローブＲＨＰ−３（Ｐ１）および５’ビオチン標識ＬＨＰ−３（Ｐ２）、５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する溶液を調製した。また、各溶液は、ＳＡを０、０．１、１、１０または１００ｆＭで含有していた。この溶液を２時間３７℃でインキュベートし、混合物を免疫ＳＤＡ緩衝液中で１０倍に希釈した。次いで、希釈した試料１００μＬを、ＳＲＨ−１ＳＤＡプライマー１．５μＭ、ＳＬＨ−２ＳＤＡプライマー３．７５μＭ、ＡＤＲ−８アダプター２．２５μＭ、ＴＢＤ１０．２レポータープローブ３．７５μＭおよびＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド０．３７５μＭを含有するプライミング溶液２０μＬと混合した。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドすべての配列は、実施例１に見出すことができる。免疫ＳＤＡ反応を開始するために、５２℃で予備平衡され、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ制限酵素、ならびにリン酸カリウム、ＢＳＡおよびｄＮＴＰを含むその他のＳＤＡ成分で構成されたＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する増幅マイクロウェルに、各混合物８０μＬを移した。次いで、マイクロウェルを直ちに密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、各マイクロウェルの蛍光を観測しながら、５２℃で１時間維持した。ＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有しない一連の対照反応物を上記のものと一緒に調製し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内で同時に観測した。
【０１４７】
最初の結合性混合物の希釈度を考慮した結果、各免疫ＳＤＡ混合物は、１．３ｐＭのＰ１およびＰ２と、０、０．６、６、６６、６６６または６６６６ａＭのいずれかの濃度のＳＡとを含有していた。また、免疫ＳＤＡ反応物は、３０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、７５ｍＭのビシン、５０ｍＭの水酸化カリウム、３．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５ｍＭの酢酸マグネシウム、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５００ｎＭのＳＬＨ−２、２００ｎＭのＳＲＨ−１、５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８、３００ｎＭのＡＤＲ−８、５００ｎＭのＴＢＤ１０．２、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、０．１ｍＭのｄＴＴＰ、０．５ｍＭの２’−デオキシシチジン５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）Ｓ異性体（ｄＣＴＰαＳ）、約８単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび１８単位のＢｓｏＢＩ制限酵素を含有していた。Ｐ１とＰ２との相互のハイブリッド形成および伸長から生じた産物の増幅は（図１参照）、特許文献１７で記載のアダプター介在型プロセスによるＴＢＤ１０．２レポーターオリゴヌクレオチドの増幅に伴うＲＯＸ蛍光の増加を観測することによって検出した。各ウェルについて、反応の過程の間１分間に１回ＲＯＸを読み取った。各試料のＲＯＸ蛍光の読取り値を６０分間にわたってプロットした。
【０１４８】
ＭＯＴＡ値を表６に報告する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを用いない標的を含まない反応（すなわち、０ａＭ ＳＡ）では、相対的に高い平均ＭＯＴＡ値４９３８２が得られた。このバックグラウンドシグナルは、免疫増幅の感度をかなり制限し、標的分析物の不在下でさえプローブを増幅可能な産物に変換するＰ１とＰ２の標的非依存性のハイブリッド形成およびそれに続くそれらの３’末端の伸長から生じると考えられる。しかし、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれるる場合、ＲＤＢ−３ｐ８を用いる標的を含まない混合物から得られた低い平均ＭＯＴＡ値３７６により明らかになったように、バックグラウンドシグナルは劇的に減少した。これらの反応では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドはＰ１の３’末端に競合的に結合し、これによりＰ２がＰ１とハイブリッド形成するのを妨げ、プローブの増幅可能な産物への標的非依存性の変換を本質的に排除する。
【０１４９】
標的分析物ＳＡおよびＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの両方を含有する反応混合物は高いＭＯＴＡ値を示し、これはハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下であっても標的結合プローブが効率的に増幅されることを示す。本発明者らは、プローブＰ１とＰ２が同じＳＡ分子に同時に結合することにより、バルク溶液中の結合していないプローブと比較して、２つのプローブの局所濃度が１０００万倍超高められると推定する。ＳＡ分子上のこの２つのプローブの推定有効局所濃度は１０μＭを超え、これはバルク溶液中のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度５０ｎＭを大きく上回る。競合的ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在にもかかわらず、標的に結合したＰ１およびＰ２の高い局所濃度により、プローブ同士のハイブリッド形成およびプローブの増幅可能な産物への変換は促進される。対照的に、標的に結合していないプローブＰ１およびＰ２は、バルク溶液内の濃度が１．３ｐＭであり、これらの結合していないプローブ同士のハイブリッド形成は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとＰ１との競合的ハイブリッド形成によって効果的に抑制されている。ブロッカーを用いない６６６ａＭ ＳＡでの反応と比較して、ハイブリッド形成ブロッカーを含有する６６６ａＭ ＳＡでのＳＤＡ反応においてＭＯＴＡスコアが減少していることが示す通り、標的結合プローブの変換がある程度抑制されていると思われるが、標的シグナル／バックグラウンドシグナルの比は、ハイブリッド形成ブロッカーを含有する反応に関して２００倍近く大きい。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
一般的に、より高い濃度の結合していないプローブＰ１およびＰ２を含有する反応混合物は、より低いプローブ濃度を含有する試料と同程度のバックグラウンド抑制を提供するために、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度をより増大することが必要となる。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度を経験的に調整して、適切な程度のバックグラウンド抑制を提供するのに必要な濃度を特定することができる。また、高濃度のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは標的結合プローブの増幅をある程度抑制する可能性があるので、適切なバックグラウンド抑制を与えることが見出されたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの最低濃度が一般的に最適である。
【０１５２】
ＲＤＢ−３ｐ８のＲＨＰ−３とのハイブリッド形成が１８塩基対の二重鎖および各オリゴヌクレオチドの５’末端上の対形成していない一本鎖のテールを作製するように、この実施例で用いたハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド、ＲＤＢ−３ｐ８は、プローブＰ１、ＲＨＰ−３の３’末端と相補的な１８ヌクレオチドの配列を含有する。ＲＤＢ−３ｐよりも長いか短いいずれかの相補的配列（例えば、それぞれＲＤＢ−３ｐ１０またはＲＤＢ−３ｐ５）を有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドも用いてよい。一般的に、所与の濃度では、プローブの相補性がより短いセグメントを有するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブの相補性がより長いセグメントを有するものよりも安定性がより低い（より低いＴｍ）Ｐ１との二重鎖を形成する。一般的に、所与のプローブと安定性のより低い二重鎖を形成するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブとより安定な二重鎖を形成するハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと同程度のバックグラウンド抑制を提供するためには、より高い濃度で用いられる必要がある。また、Ｐ１：Ｐ２二重鎖の安定性により、所与のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの効率に影響が及ぼされることとなる。一般的に、Ｐ１：Ｐ２二重鎖が安定であればあるほど、適切なレベルのバックグラウンド抑制を与えるのに用いなければならない所与のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度は高くなる。同様に、Ｐ１：Ｐ２二重鎖が安定であればあるほど、固定濃度のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドに対して同程度のバックグラウンド抑制を与えるのにプローブ−ブロッカー二重鎖はより安定でなければならない。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドとプローブとの間に形成した二重鎖の安定性は、プローブと相補的なハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチド配列の長さまたは配列組成を変えることによって調節されることができる。オリゴヌクレオチド配列および濃度などのパラメータから二重鎖の安定性を推定するためのソフトウェアは、ＯＬＩＧＯ（登録商標）（英国Ｃａｍｂｉｏ）およびＭｆｏｌｄ（著作権、１９９６、Ｄｒ．Ｍ．Ｚｕｋｅｒ）など、当技術分野でよく知られている（参照により本明細書に組み込まれる非特許文献９参照、非特許文献１０に記載）。
【０１５３】
各プローブに特異的な２種のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを同時に用いてバックグラウンドシグナルを抑制してもよい。一般的に、単一のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドで得たものと同程度のバックグラウンド抑制を与えるのに必要とされる各ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度はより低くなる。
【実施例９】
【０１５４】
（免疫ＳＤＡによるピコモル未満のＩＬ−８濃度の均一検出）
抗体−プローブ複合体Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７で記載の通りであった。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのマウスγグロブリン、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｚ８および０、０．００５、０．０１０または０．０２５ｐＭのＩＬ−８を含有する試料５０μＬを調製した。室温で３時間インキュベートした後、各試料の分量５μＬを１：１０（ｖ／ｖ）に希釈して、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液とし、次いでさらに１：１０（ｖ／ｖ）に希釈して、ＳＤＡプライマーＳＲＨ−１（１００ｎＭ）およびＳＬＨ−２（５００ｎＭ）、３００ｎＭのアダプタープライマーＡＤＲ−８、５００ｎＭのレポータープローブＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）ならびに５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｚ８を含有する溶液１００μＬとした。そのように希釈した４つの混合物は、最初の試料のそれぞれから調製された。次いで、希釈した混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。参照により本明細書中に組み込まれる特許文献１７で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、ＴＢＤ１０．２の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。得られるＭＯＴＡ値を表７に報告する。０．００５ｐＭと低いＩＬ−８濃度を含有する結合性混合物の平均ＭＯＴＡ値は、ＩＬ−８ゼロの試料から得られる対応値よりも著しく高く、これは本発明の均一法が、未結合の抗体から結合抗体を分離せずに、低フェムトモル範囲の分析物濃度を検出できることを立証している。
【０１５５】
ＩＬ−８ゼロの試料のＭＯＴＡスコアで表されたバックグラウンドシグナルは、標的に結合していない抗体同士の弱い相互作用から生じる誤ったアンプリコン形成による結果と考えられる（実施例１６参照）。この実施例のＳＤＡ反応での抗体濃度は、前述の実施例よりも少なくとも２００倍高いため、この実施例におけるバックグラウンドレベルは実施例７よりも高い。
【０１５６】
【表７】
【実施例１０】
【０１５７】
（テザーオリゴヌクレオチドおよび架橋プローブを用いてＩＬ−８を検出する免疫ＳＤＡの実験的証明）
実施例９のＡｂ１−ＳＡ複合体１０ｎＭを、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中で２０ｎＭの３’−ビオチン標識ＲＣＰ−１テザーオリゴヌクレオチド（ＴＯ）と混合した。この混合物を一晩４℃でインキュベートして、ビオチン化オリゴヌクレオチドをＡｂ１−ＳＡ複合体に結合させてＡｂ１−ＳＡ−ＴＯを形成した。
【０１５８】
１ｎＭのＡｂ１−ＳＡ−ＴＯ、ビオチン標識を有さない１ｎＭのＲＨＰ−３（Ｐ１）、１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２（実施例８参照）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０、１０または１００ｐＭのＩＬ−８を含有する混合物を調製した。３０分間室温でインキュベートした後、Ａｂ−プローブ複合体の最終濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合し、この混合物を３７℃に１０分間加温した。希釈した試料それぞれの部分を、ＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをも含有する乾燥した増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。得られるＳＤＡ混合物中のＡｂ−プローブ複合体の濃度は１ｆＭであり、ＩＬ−８の濃度は０、０．０１または０．１ｆＭのいずれかであった。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。上記の実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１５９】
ＭＯＴＡ値を表８に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８によりＭＯＴＡ値は増加され、図３Ａで示す通り、テザーオリゴヌクレオチドＴＯとのハイブリッド形成を介して分析物結合性部Ａｂ１と間接的に連結したスプリントオリゴヌクレオチドとしてＰ１を用いる免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。この実験では、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは用いなかったが、近接対−ＩＬ−８複合体の形成後に試料を約１００万倍に希釈して、標的非依存性プローブの増幅の発生を減少させた。
【０１６０】
【表８】
【実施例１１】
【０１６１】
（ＩＬ−８の検出において検出物結合性部としてＦａｂ’断片を用いる免疫ＳＤＡの実験的証明）
ＭＡｂ Ｇ２６５−８（実施例９参照）をペプシンで消化して、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ領域の断片を得た。Ｆ（ａｂ’）２を精製し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）でさらに処理して、Ｆａｂ’断片を連結しているジスルフィド架橋を減少させた。得られるＦａｂ’断片（Ａｂ１）を２つのＲＨＰ−３オリゴヌクレオチド（Ｐ１）とカップリングさせて、Ａｂ１−Ｐ１複合体を形成した。
【０１６２】
０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１、０．１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２（実施例８参照）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｐ８（実施例１参照）および０、０．１または１ｐＭのＩＬ−８を含有する混合物を調製した。３７℃で３時間インキュベートした後、Ａｂ−プローブ複合体の得られる濃度がｆＭの範囲になるように、混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２、アダプターＡＤＲ−５、最終濃度を１０ｎＭにするまでの追加のハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｐ８、ならびにレポータープローブＴＢＤ１０．２と混合した。得られる混合物を３７℃で１０分間維持した。次いで、各試料の部分を、ＢｓｏＢＩ制限酵素およびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをも含有する乾燥した増幅ウェルに５２℃で実施例２に記載の通りに加えた。得られるＳＤＡ混合物において、Ａｂ−プローブ複合体の濃度は１００ｆＭであり、ＩＬ−８の濃度は０、０．１または１ｆＭのいずれかであった（表９）。試料を直ちにＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置に移し、そこで等温増幅を５２℃で１時間実施した。実施例２で記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１６３】
【表９】
【０１６４】
反復試験４回の平均ＭＯＴＡ値を表９に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、より高いレベルのＩＬ−８により、ＭＯＴＡ値は増加され、Ｆａｂ’をＡｂ１−Ｐ１の分析物結合性部として用いる免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証した。
【実施例１２】
【０１６５】
（ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するバックグラウンド抑制と組み合わせた、可逆的に固定化されたた近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成）
この実施例で使用した緩衝液は以下の通りである：
・ ＴＢＳ：２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ；
・ 希釈液Ａ：希釈液Ｂプラス０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、８００μＭのＤ−ビオチンおよび５ｍＭのＥＤＴＡ；
・ 希釈液Ｂ：ＴＢＳ、０．５％スキムミルクパウダー（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、英国）、０．１ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級のＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ）；
・ ブロッキング溶液：ＴＢＳ、４．５％スキムミルクパウダー、１ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級のＤＮＡ、２ｍｇ／ｍＬのアジ化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ
・ 洗浄緩衝液：ＴＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；
・ ＳＤＡ反応緩衝液（濃縮）：９０ｍＭのビシン、６０ｍＭのＫＯＨ、１２ｍＭのリン酸カリウム、６．５７％グリセロール、４．２３％ＤＭＳＯ；
・ ＳＤＡプライマー混合物：７．５μＭのＳＲＨ−１、３７．５μＭのＳＬＨ−２、３００μＭのＡＤＲ−５、３７．５μＭのＴＢＤ１０．２（水中）；ならびに
・ ＳＤＡ酵素混合物：７５ｍＭのビシン中１８単位のＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼおよび８単位のＢｓｔポリメラーゼ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｍＭの水酸化カリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）
選択した標的分析物はＩＬ−８であり、ＭＡｂ Ｇ２６５−５およびＭａｂ Ｇ２６５−８が分析物結合性部である。ＭＡｂ Ｇ２６５−５はプローブＬＨＰ−３に複合体形成して、Ａｂ１−Ｐ１を産生した。ＭＡｂ Ｇ２６５−８はＳＡに複合体形成し、この複合体をＡｂ分子１個当たりの２種のプローブの割合で５’ビオチン化プローブＲＨＰ−３と混合して、Ａｂ２−Ｐ２を産生した。
【０１６６】
以下の手順に従って、捕捉ヌクレオチドを固体支持体に固定した。ＳＡで被覆された９６マイクロウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号１５１２１）をＴＢＳ中で３回すすぎ、ブロッキング溶液中で一晩インキュベートし、次に洗浄緩衝液で４回洗浄した。８０ｎＭの５’ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドを含有する溶液１００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、８００μＭのＤ−ビオチンを含有する洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄した。
【０１６７】
Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を以下の通りに実施した：希釈液Ａ中に０．１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２を１００μＬずつ各マイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。希釈液Ｂ中の０または５０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する試料溶液１００μＬを各マイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。このステップの結果、ＩＬ−８と固定化したＡｂ２−Ｐ２との間に複合体が形成された。
【０１６８】
ＩＬ−８と固定化されたＡｂ２−Ｐ２との間の複合体へのＡｂ１−Ｐ１の結合を、以下の通り実施した：１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有するかハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有しない、希釈液Ａ中の０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体の溶液１００μＬを、ＩＬ−８とＡｂ２−Ｐ２との間の複合体を含有するマイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有するマイクロウェルを、１μＭのＬＢＫ−１を含有する洗浄緩衝液で５回、次いでＬＢＫ−１のない洗浄緩衝液で２回洗浄した。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドに曝露しなかったマイクロウェルを洗浄緩衝液で７回洗浄した。両方の組のウェルに対して、ＴＢＳで最後に２回洗浄した。
【０１６９】
上記の通りに調製した捕捉された複合体を、ＳＤＡ反応緩衝液（濃縮）１２０μＬを加えることによって支持体から溶離し、室温で２０分間インキュベートした。溶離した複合体を含有する体積１００μＬを各マイクロウェルから、ＳＤＡプライマーミックス２０μＬを含有する新たなマイクロウェルに移した。これらのマイクロウェルを２０分間室温でインキュベートし、次いで３７℃のヒートブロック上に１０分間置いた。ＳＤＡによる増幅を開始するために、３７℃の各マイクロウェルから８０μＬを取り出し、５２℃に予め加熱しておいたＳＤＡ酵素混合物２０μＬを含有する別のマイクロウェルに移した。次いで、マイクロウェルを素早くＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間維持して、増幅の過程の間、蛍光強度を観測した。各増幅反応のＭＯＴＡ値を、反応の過程の間に得た動的蛍光プロファイルから測定した。
【０１７０】
図７Ｄで示した通り、抗体−プローブ複合体Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２のプローブ部Ｐ１とＰ２との間の塩基対形成により、この２つの抗体−プローブ複合体間の標的を含まない二元複合体の形成が促進される。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＬＢＫ−１を結合性混合物に含めることは、Ｐ１とＰ２との間の塩基対形成を妨げることによって、標的を含まない複合体の形成を抑制する。ＩＬ−８もＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドも含まない結合性混合物に対する高い平均ＭＯＴＡ値により表１０に示された通り、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの不在下における標的非含有二元複合体の存在によって、免疫増幅反応中の高レベルのバックグラウンドシグナルが生じた。対照的に、１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、「ＩＬ−８なし」の結合性混合物の平均ＭＯＴＡ値を２０分の１に減少させ、標的を含まない複合体の形成のかなりの減少を示している。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、ＩＬ−８特異的シグナルの強度をわずかに減少させる（ＬＢＫ−１ありおよびなしの５０ｐＭのＩＬ−８混合物のＭＯＴＡ値を比較）；しかし、特異的シグナル対バックグラウンドシグナルの比は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する結合性混合物に関する方がそれを含まないものに関するものよりも１２倍高い。
【０１７１】
さらに、この結果は、図７Ａ〜７Ｇで示す通り、標的抗原（ＩＬ−８）を捕捉または固定し、かつ標的抗原および近接対（Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２）の両方の構成要素を含む固定化した三元複合体を形成するための固定化した近接構成要素（Ａｂ２−Ｐ２）の使用を証明している。また、この実施例は、固定化するハイブリッド（捕捉オリゴヌクレオチドとプローブ部Ｐ２との間に形成した二重鎖）の推定半減期が２０分間の溶離時間よりもはるかに長いにもかかわらず、検出可能な数の固定化された三元複合体が、濃縮したＳＤＡ緩衝液添加後の２０分間の室温での溶離時間中に固相から離れることを示す。
【０１７２】
【表１０】
【実施例１３】
【０１７３】
（可逆的に固定化した近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成：低イオン強度溶液の適用による固定化された複合体の放出）
この実施例で使用したＭＡｂ、分析物および緩衝液は実施例１２で記載のものと同じである。ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例１２で記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例１２で記載の通りに実施された。次いで、０または１０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する１００μＬの希釈液Ｂを各マイクロウェルに加え、これを室温で１時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体および１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Ａを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で１時間インキュベートした。次いで、最後の２回の洗浄ステップがＴＢＳではなく１０ｍＭのＮａＣｌを含有していたことを除き、実施例１２で記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
【０１７４】
ＩＬ−８と、Ａｂ１−Ｐ１の複合体と、Ａｂ２−Ｐ２の複合体との間で得られる固定化された複合体を放出するために、各マイクロウェルを７５μＬの水または濃縮していないＳＤＡ緩衝液で処理した。２０分間室温でインキュベートした後、この溶液７０μＬを取り出し、実施例１２で記載の通りにＳＤＡで分析した。
【０１７５】
この実施例は、低イオン強度溶液を使用して、近接対Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２に同時に結合したＩＬ−８分子で構成された固定化した三元複合体を無傷で放出することを証明している。この実施例の結果は表１１に示す。水（低イオン強度）で溶離した１０ｐＭのＩＬ−８を含有する試料について得られた平均ＭＯＴＡ値は、ＳＤＡ緩衝液（中程度のイオン強度）で溶離した試料の平均ＭＯＴＡ値よりも１０倍近く高く、図７Ｉで示した通り、低イオン強度溶液の適用による三元複合体の放出を立証している。
【０１７６】
【表１１】
【実施例１４】
【０１７７】
（可逆的に固定化した近接構成要素を使用する標的介在型アンプリコン形成：置換オリゴヌクレオチドの適用による固定化された複合体の放出）
ＭＡｂ、分析物および緩衝液は実施例１２に記載のものと同じである。ビオチン化ＲＣＰ−９ｖ２．２捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例１２に記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ａｂ２−Ｐ２複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例１２に記載の通りに実施された。次いで、０または１０ｐＭのいずれかのＩＬ−８を含有する希釈液Ｂ１００μＬを各マイクロウェルに加え、これを室温で１時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、０．１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１複合体および１μＭのＬＢＫ−１ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Ａを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で１時間インキュベートした。次いで、実施例１２に記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
【０１７８】
ＩＬ−８と、Ａｂ１−Ｐ１の複合体と、Ａｂ２−Ｐ２の複合体との間で得られる固定化された複合体を放出するために、各マイクロウェルを０．１μＭのＣＭＰＲ−９ｖ２置換オリゴヌクレオチドを含有するか、または置換オリゴヌクレオチドを含有しない、１２０μＬのＳＤＡ緩衝液（濃縮）で処理した。２０分間室温でインキュベートした後、この溶液を実施例１２に記載の通りにＳＤＡで分析した。
【０１７９】
この実施例は、置換オリゴヌクレオチドを使用して、近接対Ａｂ１−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２に同時に結合したＩＬ−８分子で構成された固定化された三元複合体を無傷で放出することを証明している。この実施例の結果を表１２に示す。１０ｐＭのＩＬ−８を含有し、置換オリゴヌクレオチドで処理した試料に対して得られた平均ＭＯＴＡ値は、置換オリゴヌクレオチドで処理しなかった１０ｐＭのＩＬ−８試料のＭＯＴＡ値よりも１０倍高く、図７Ｊで示した放出メカニズムを立証している。
【０１８０】
【表１２】
【実施例１５】
【０１８１】
（３’キャップされた近接プローブを使用する免疫ＳＤＡの実験的証明）
この実施例は、図１４で示したプロセス、すなわち免疫増幅によって検出物を検出するための３’キャップした伸長不可能な近接プローブの使用の実験的証明を提供する。この実施例の標的分析物はＳＡである。３’キャップした近接プローブＰ１はＬＨＰ−３［キャップ］である（実施例１で示した）。ＬＨＰ−３［キャップ］は、ＬＨＰ−３［キャップ］が相補的な鋳型鎖Ｐ２とハイブリッド形成した場合にプローブの伸長を妨げる３’デオキシウリジン部を含む。この実施例では、分析物結合性部は、ＬＨＰ−３［キャップ］の５’末端に付着したビオチン部である。近接対の第２のプローブ、Ｐ２は、５’ビオチン部および伸長可能な３’末端を含むＲＨＰ−３（実施例１で示した）である。キャップしていない対照プローブ、ＬＨＰ−３は、５’ビオチン部および伸長可能な３’末端を含む。増幅プライマー、アダプターオリゴヌクレオチド、レポータープローブ、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドおよびその他の反応成分は実施例８と同じである。
【０１８２】
２０ｐＭの５’ビオチンＲＨＰ−３、２０ｐＭの５’ビオチンＬＨＰ−３［キャップ］、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、５μｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０または１０ｆＭのいずれかのＳＡを含有する溶液を調製した。結合性混合物は、１００ｎＭのＲＤＢ−３ｐ５ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを任意選択的に含有した（表１３参照）。この結合性混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで１０倍に希釈し、実施例８に記載の通りにＳＤＡにかけた。ＬＨＰ−３［キャップ］がキャップしていないＬＨＰ−３に置き換えられた対照混合物も調製し、上記の通りＳＤＡにかけた。種々のＳＤＡ反応からの平均ＭＯＴＡ値を表１３に示す。
【０１８３】
【表１３】
【０１８４】
ＳＡなしの試料のＭＯＴＡ値により示された通り、近接プローブＰ１が３’伸長キャップを含有する反応（「ＬＨＰ−３［キャップ］）は、キャップされていないプローブを含有する反応（ＬＨＰ−３）よりも著しく低いバックグラウンドシグナルを示した。キャップされたプローブおよびキャップされていないプローブの両方に対して、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドのない同じ反応混合物と比較して約１２倍バックグラウンドシグナルを抑制した。キャップされたプローブではバックグラウンドシグナルが低かったが、１０ｆＭのＳＡの存在下のシグナルは、キャップされていないプローブに対してキャップされたプローブではわずかに高く、標的分析物の存在下におけるキャップされたＰ１プローブおよびキャップされていないＰ２プローブの増幅可能な産物への効率的な変換を示す。さらに、この実施例は、プローブ−プローブハイブリッドで形成された重なり合った３’末端の一方のみが３’ＯＨ基を含む場合に、分析物特異的アンプリコンの形成が生じ得ることを証明している。
【実施例１６】
【０１８５】
（標的非依存性アンプリコン形成の原因としての抗体−抗体の相互作用を明らかにする実験）
この実施例は、近接構成要素のＡｂ部同士の間の相互作用が標的非依存性増幅の一因となることを証明する。実施例９で記載の通り、以下に挙げた成分を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液中に含有する４つの試験溶液を調製した。
・ 試験溶液１：１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１および１ｎＭのＡｂ２−ＳＡ−Ｐ２；
・ 試験溶液２：１ｎＭのＡｂ１−Ｐ１、１ｎＭの複合体形成していないＡｂ２および２ｎＭの複合体形成していないＰ２；
・ 試験溶液３：１ｎＭの複合体形成していないＡｂ１、２ｎＭの複合体形成していないＰ１および１ｎＭのＡｂ２−Ｐ２；ならびに
・ 試験溶液４：２ｎＭの複合体形成していないＰ１、２ｎＭの複合体形成していないＰ２。
【０１８６】
試験溶液を３０分間３７℃でインキュベートし、次いで、抗体、プローブおよびコンジュゲートの得られる濃度がｐＭの範囲になるように、連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をＳＤＡプライマーおよび酵素と混合し、ＳＤＡ反応混合物が５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを任意選択的に含む以外は、実施例９で記載の通りにＳＤＡにかけた。さらに、複合体形成していないプローブを抗体−プローブ複合体のモル比の２倍で使用して、複合体中２：１の既知のプローブ：抗体比を反映させた。標的分析物は反応に存在しなかったので、生成したＭＯＴＡ値は標的非依存性プローブの変換のみに起因する。
【０１８７】
種々の試験溶液からの平均ＭＯＴＡ値を表１４に報告する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドなしの反応混合物では、すべての試験溶液について平均ＭＯＴＡ値は１０００００を上回った。５０ｎＭのＲＤＢ−３ｐ８ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する試験溶液４では、平均ＭＯＴＡ値は２００００未満に減少しており、５倍を超えるバックグラウンドシグナルの抑制を示している。対照的に、試験溶液１のＭＯＴＡ値は、そのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在によってわずか約２分の１に減少して約５９０００になり、ＲＤＢ−３ｐ８によりもたらされるブロッキング効率は、複合体形成していないプローブＰ１およびＰ２の存在中よりも、２つの無傷の抗体プローブ複合体の存在中のほうが低いことを示している。試験溶液１のＭＯＴＡ値が試験溶液４のＭＯＴＡ値よりも高いことは、試験溶液１で抗体介在型アンプリコンの形成が生じていることを暗示し、さらにＡｂ１とＡｂ２が互いに標的非依存性付着することにより、付着したプローブ部が十分に近く近接されて誤ったアンプリコン形成を促進することを示唆する。明らかに、互いに付着した抗体対の局所プローブ濃度はバルク溶液のプローブ濃度全体よりもかなり高いので、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは試験溶液１の標的非依存性プローブ変換を、付着した抗体対が形成できない試験溶液４ほど効率的に抑制することはできない。これは、試験溶液４のＭＯＴＡ値と匹敵するＭＯＴＡ値を示す試験溶液２および３の結果と一致しており、これは、試験溶液１で見られた抗体介在型プローブ変換の一因となる高いＭＯＴＡ値を生じるために、近接対の両方のプローブ部は抗体に複合体形成していなければならないことを示している。
【０１８８】
【表１４】
【実施例１７】
【０１８９】
（反転した反対の配列方向を有するプローブを用いる免疫SDAによるＩＬ−８の検出）
この実施例は、図１Ｊで示した概念の実験的証明を与える。抗体複合体Ａｂ１−ＳＡおよびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７に記載した通りである。Ａｂ１−ＳＡを、プローブＲＢＤ−３ｖ３とプローブ：抗体比２：１で、４℃で一晩インキュベートしてＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１を形成した。実施例１で言及した通り、ＲＢＤ−３ｖ３はビオチン部をその３’末端の近くに含有している。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｚ８ならびに０、０．１、０．２５、０．５および１．０ｐＭのＩＬ−８を含有する試料を調製した。室温で３時間インキュベートした後、各標準試料の分量を、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈し、さらに、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２）、アダプタープライマー（ａｄｒ−８）、レポータープローブ（ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ））およびハイブリッド形成ブロッカー（ＲＤＢ−３ｚ８）５０ｎＭを含有する溶液中に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈した。ＳＤＡ反応では、プライマー、アダプターおよびレポーターの濃度は実施例１８で記載の通りであり、ハイブリッド形成ブロッカーＲＤＢ−３ｚ８の濃度は５０ｎＭであった。これらの希釈混合物の反復試験試料４点を、それぞれの最初の試料から調製した。次いで、希釈混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。実施例９に記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
【０１９０】
平均ＭＯＴＡ値を表１５に報告する。ＩＬ−８を欠く試料では低いＭＯＴＡ値が得られたが、一方、ＩＬ−８のレベルが増大することにより、徐々により高いＭＯＴＡ値になり、図１Ｊで記載の通り、プローブの１つが抗体とその３’末端の近くの連結を介してつながれている免疫ＳＤＡ法によるＩＬ−８の検出を立証している。さらに、この結果は、伸長可能な３’ＯＨ基を１つだけ含むプローブ−プローブ（Ｐ１−Ｐ２）二重鎖が分析物特異的アンプリコンを産生できることを立証している。
【０１９１】
【表１５】
【実施例１８】
【０１９２】
（内部の核酸対照および近接対を用いる免疫ＳＤＡによるＩＬ−８の定量）
この実施例は、核酸対照およびそれぞれ分析物に結合した近接構成要素から産生された標的アンプリコンの共増幅から得られる２つの蛍光シグナルの比を使用する試験試料中の標的分析物（この場合、ＩＬ−８）の絶対定量を説明する。本発明によれば、複数の標準試料および少なくとも１つの試験試料が最初に形成される。複数の標準試料はそれぞれ、既知の開始量の核酸対照配列、既知の開始量の標的分析物およびある量の本発明の近接対を含有する。通常、複数の標準試料の異なる構成要素は、既知の量の標的分析物を有することとなる。試験試料は、既知の開始量の核酸対照配列、未知の量の非核酸標的分析物およびある量の近接対を含有する。絶対定量法で測定されるのは、この未知の量の標的分析物である。
【０１９３】
標準試料および試験試料では、同じ標的分析物分子に同時に結合している近接構成要素のオリゴヌクレオチド部は、上記の本発明方法のいずれかによってアンプリコンに変換される。次いで、各標準試料および試験試料で得られるアンプリコンおよび核酸対照配列を共増幅する。各試料中、同じ試料中のアンプリコンおよび対照核酸の増幅が、増幅の過程の間、異なる蛍光放出波長で独立して観測することができるように、アンプリコンおよび対照配列の増幅により、検出可能な蛍光の放出を別個に発生させることができる。
【０１９４】
増幅の間に得られた蛍光値は、「リアルタイム蛍光プロファイル」と呼ばれ、測定時点を横座標に割り当て、蛍光値を縦座標に割り当てた二次元のグラフとして表示することができる。図１５Ａは、下記の実験における標的と対照アンプリコンとの共増幅から得られる試料の２色のリアルタイム蛍光プロファイルの実施例を示す。この実施例で使用した検出波長は、それぞれ標的アンプリコンおよび対照核酸に特異的なレポーターオリゴヌクレオチドの標識に使用した蛍光色素ローダミンおよびフルオレセインに特徴的なものであった。
【０１９５】
標準試料および試験試料のそれぞれについて、蛍光強度を２つの独立した検出波長で、増幅間隔を含む複数ｎの時点にわたって測定した。所与の試料ｉに対し、各時点（ｔｐ）は一方は増幅した標的アンプリコン（ＦＴ（ｔｐ）ｉ）に対応し、他方は増幅した対照核酸（ＦＣ（ｔｐ）ｉ）に対応した２つの関連した蛍光値を有する。同じ試料から同じ時間間隔で集められたこれらの２つの読取り値は、蛍光値の「マッチした対」と呼ばれる。
【０１９６】
分析の便宜上、２種以上の異なる試料のリアルタイム蛍光プロファイルは同期していると考えられる。すなわち、２種以上の異なる試料からの同じ時点は、各試料での増幅開始後の同じ尺度の経過時間に対応している。異なる試料からのこれらの等価な時点を「同時」という。異なる試料の未加工の蛍光プロファイルが同期していない場合、当技術分野で知られた方法を用いて、未加工データから同期した「正規化した」プロファイルを構築することができる（例えば、それらの開示の全体は参照により本明細書内に組み込まれる特許文献２２および特許文献２３参照）。
【０１９７】
所与の試料ｉのリアルタイム蛍光プロファイル内の各時点（ｔｐ）について、蛍光値の各マッチした対を使用して、関係（式１）に従ってシグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを算出することができる。
【０１９８】
SR(tp)i=[FT(tp)i-FT(base)i]/[FC(tp)i-FC(base)i] 式１
【０１９９】
式中、基準蛍光測定値、ＦＴ（ｂａｓｅ）ｉおよびＦＣ（ｂａｓｅ）ｉは、標的と対照アンプリコンの検出可能な増幅前の各蛍光強度に対応している。基準蛍光のその他の近似を用いてもよいが、実際には、ＦＴ（ｂａｓｅ）ｉは、試料ｉの増幅中の最初のいくつかの時点にわたって測定した標的アンプリコンの蛍光の平均値とし、ＦＣ（ｂａｓｅ）ｉは、それらの同じ時点にわたって測定した平均核酸対照蛍光とする。
【０２００】
したがって、増幅した試料から得られる、標的および対照のリアルタイム蛍光プロファイルの各対は、ｎをプロファイル中の時点の数とすると、ｎ個のシグナル比を生じることとなる。同様に、複数のｋ個の試料にわたって同時である各時点は、それに伴って、各シグナル比が一致した時点ｔｐにおいて試料ｉに対応しているｋ個の「同時」シグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを有している。
【０２０１】
試料によって生じたシグナル比と試料が含有する分析物（ＩＬ−８）の量とを相関させるために、種々の既知の量のＩＬ−８を含有する複数のｋ個の標準試料について測定したシグナル比を以下の通りに分析した。同時シグナル比の各組（すなわち、ｋ個すべての標準試料にわたって同じ時点、ｔｐから導出したシグナル比）をまず式２に従って既知の分析物濃度に対する線形回帰にかける。式２は、量ｌｏｇ（ＳＲ（ｔｐ）ｉ）およびｌｏｇ（［ＩＬ−８］ｉ）を関連付け、回帰手順で決定した勾配ｍ（ｔｐ）および切片ｂ（ｔｐ）の値を有する「検量」線を定義する。
【０２０２】
log(SR(tp)i)={m(tp)xlog([IL-8]i)}+b(tp) 式２
【０２０３】
この操作をｎ組の同時シグナル比のそれぞれについて繰り返して、各対は複数の標準試料ｋ個にわたる個々の同時時点に対応しながら、ｎ対の勾配と切片の値で定義したｎ個の検量線を作製する。この分析から得られたｎ個の検量線の１つ（ｔｐ＝８分）を図１５Ｂで示す。
【０２０４】
次いで、勾配と切片の値の「最高の」対に対応する「最高の」測定時点（ｔｐｂｅｓｔ）を適合度基準に基づいて選択し、試験試料についてのシグナル比を式１に従って、選択した「最高の」時点と同時の時点で得られた蛍光測定値から算出する。次に、試験試料ｊ中の分析物ＩＬ−８の量を、最高の測定時点の試験試料のシグナル比、ＳＲ（ｔｐｂｅｓｔ）ｊ、および勾配、ｍ（ｔｐｂｅｓｔ）と切片、ｂ（ｔｐｂｅｓｔ）「最高の」対の値から式３によって計算することができる。
【０２０５】
log([IL-8]j)={log(SR(tpbest))-b(tpbest)}/m((tpbest) 式３
【０２０６】
種々の統計的基準を用いて「最高の」検量線または対応する「最高の」測定時間、ｔｐｂｅｓｔを決定することができる。多くのこれらの統計的基準は、特許文献２２および特許文献２３に記載されている。最高の時間を選択するその他の統計的方法も用いることができる。
【０２０７】
実験手順を以下の通りに実施した。抗体−プローブ複合体Ａｂ１−ＳＡ−Ｐ１およびＡｂ２−Ｐ２は、実施例７に記載した通りである。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、２０ｐＭのＡｂ１−ＳＡ−Ｐ１、１００ｐＭのＡｂ２−Ｐ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、２５ｎＭのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドＲＤＢ−３ｐ８および０．０１、０．１、１．０、１０．０および１００ｐＭのＩＬ−８を含有する標準試料を調製した。室温で３時間インキュベートした後、各標準試料の分量を、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に１：１０（ｖ／ｖ）に希釈し、次いでさらに、ＳＤＡプライマー（ＳＲＨ−１およびＳＬＨ−２）、アダプタープライマー（ａｄｒ−８およびａｄｑｓ−２）、レポータープローブ（ＴＢＤ１０．２（Ｄ／Ｒ）およびＡＬＴＤ６．９（Ｆ／Ｄ））、５０ｎＭのハイブリッド形成ブロッカー（ＲＤＢ−３ｐ８）ならびに対照核酸（ＩＱＳ−２）１０００００コピーを含有する溶液中に１：１００（ｖ／ｖ）に希釈した。２つのそのように希釈された混合物は、最初の標準試料のそれぞれから調製された。次いで、希釈された標準混合物を３７℃で約１０分間インキュベートし、５２℃に予め加温したＳＤＡ酵素溶液２０μＬを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量８０μＬを移した。次に、このマイクロウェルを密封し、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ装置内に置き、５２℃で１時間インキュベートした。この１時間のインキュベーションの間、各マイクロウェルの蛍光を、一方はローダミン蛍光に特異的であり、他方はフルオレセイン蛍光に特異的である２つの光学的チャネルを介して記録した。１対の蛍光読取り値（１つのフルオレセインと１つのローダミン）をそれぞれ１分間隔で１時間の反応過程の間記録し、各ＳＤＡ反応について６０対の蛍光読取り値が得られた。
【０２０８】
濃度０．０１、０．１、１．０、１０．０および１００．０ｐＭのＩＬ−８を含有する１組の試験試料を調製し、標準試料に対して上記した通り、競合的な２色のＳＤＡにかけた。対照オリゴヌクレオチド（ＩＱＳ−２）の量は標準試料のものと同等であった。
【０２０９】
この実施例では、５つのＩＬ−８標準試料それぞれの合計１０個の複製ＳＤＡ反応からの２色の蛍光データを使用して、以下の検量線式を構築した。１０個の増幅した標準試料（ｉ）のそれぞれについて、シグナル比、ＳＲ（ｔｐ）ｉを式１に従って６０個の時点（ｔｐ）それぞれに対して計算した。標準試料からの同時シグナル比の各組を、上記の式２に記載の通りに既知のＩＬ−８濃度に対する線形回帰にかけると、６０個の時点のそれぞれについて、異なる「検量」線に対応する勾配（ｍ（ｔｐ））および切片（ｂ（ｔｐ））値が得られた。適合度基準を検量線に適用して、この複数の標準試料の最高の測定時間はｔｐ＝８分であると決定した。ｌｏｇ（ＳＲ（ｔｐ＝８分））対ｌｏｇ（［ＩＬ−８］）のプロットおよび対応する検量線を図１５Ｂに示す。これは、分析物濃度の１００００倍の範囲にわたるシグナル比とＩＬ−８濃度との間の線形関係を表す。
【０２１０】
上記の種々の試験試料の蛍光データ（ｔｐ＝８分）からシグナル比を算出した。次いで、標準曲線から導出したｔｐ＝８分の検量線に対応する最高の勾配および切片値を使用し、式３を使用して、試験試料のＩＬ−８濃度を計算した。
【０２１１】
表１６に示した結果は、計算したＩＬ−８濃度と実際のＩＬ−８濃度との間でほぼ一致しており、本発明の方法による標的分析物の正確な定量を立証している。
【０２１２】
【表１６】
【０２１３】
これまで特定の代表的な実施形態および詳細を参照して本発明を完全に記載してきたが、本明細書に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく変更および修正を加えられることができることは当業者には明らかであろう。本明細書に記載された方法および手順のすべては、当業者が容易に実施できるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分と第２のオリゴヌクレオチド部の部分とを含むハイブリッドを形成するステップ；
（ｉｉｉ）３’末端を伸長してアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は共に隣接した塩基を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリッドは第１または第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を含み、前記アンプリコンを産生するステップは３’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組み合わせるステップの後に、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップの後に、支持体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記支持体を洗浄するステップの後に、支持体から第１の近接構成要素を放出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、且つ前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドをポリメラーゼ触媒伸長して制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成するステップをさらに含み、前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの物理的解離によるものであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
放出するステップは、物理的、化学的または酵素的開裂であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから第１のオリゴヌクレオチド部を置換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
放出するステップは、第１のオリゴヌクレオチド部の二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから捕捉オリゴヌクレオチドを置換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの一本鎖または二本鎖はＲＮＡを含み、且つ放出するステップは前記一本鎖または二本鎖をＲＮアーゼで分解することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Ｑβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）（ｉ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）テザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分、スプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分、および、オリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドのいずれかの伸長可能な末端を含む第１のハイブリッドと；および
（ｂ）テザーオリゴヌクレオチドの第１の部分およびテザーオリゴヌクレオチドの第２の部分を含む第２のハイブリッドと；
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）伸長可能な末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチド部が伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
スプリントオリゴヌクレオチドが伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記伸長可能な末端を伸長するステップは、テザーオリゴヌクレオチドを第２のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
テザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
テザーオリゴヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Ｑβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
スプリントオリゴヌクレオチドは、第２の部分の３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’および第１の部分の５’に位置する第１のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部はオリゴヌクレオチド部の第１の部分の５’に位置する第２のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅するステップは、それぞれ第１および第２のプライマー結合性部位とハイブリッド形成する第１および第２のプライマーならびにその同源の認識部位にニック形成する制限エンドヌクレアーゼを使用することを含む鎖置換増幅によるものであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）（ｉ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと；
（ｅ）（ｉ）第２のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）（ａ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分および第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含む第１のハイブリッドと；
（ｂ）第２のテザーオリゴヌクレオチドの第１の部分および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含む第２のハイブリッドと；
（ｃ）第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端、ならびに第２のスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端を含む第３のハイブリッドと；
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）第３のハイブリッドの３’末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項３３】
第１のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成し、第２のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンプリコンを産生するステップは、第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドを第１および第２のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記伸長するステップの後で且つ前記増幅するステップの前に、第１および第２の近接構成要素からアンプリコンを実質的に除去する洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
検出は定量的であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素であって、第１のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ＤＮＡポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチド部の３’伸長を妨げる３’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’である第１の部分を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッドを形成できる第１の部分を含む第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分ならびに第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含むハイブリッドを形成するステップ；
（ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を伸長することによって、二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作製するステップ；
（ｉｖ）第１のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位にニック形成するステップ；
（ｖ）ニックから第１のオリゴヌクレオチド部を伸長して、第１のオリゴヌクレオチド部の下流部分を置換するステップ；
（ｖｉ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位から鎖置換増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖｉｉ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項４１】
第２のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、鎖置換増幅は第１および第２のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位からのものであることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出は定量的であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
第１のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分を含む少なくとも１つのハイブリッドを形成するステップであって、その少なくとも一つのハイブリッドは、伸長されて５’末端を含む第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分の相補体を形成することができる３’末端を含むステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのハイブリッドは、第１および第２のオリゴヌクレオチドの第１の部分を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１のハイブリッドは第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含み、且つ第２のハイブリッドは第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分を含む２つのハイブリッドが形成されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記アンプリコンを産生するステップは、３’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンプリコンを産生するステップは、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分と第３のオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッドを形成すること、および（ｉｉ）少なくとも１つのハイブリッドの３’末端を第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結することを含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）少なくとも２つの抗原特異的結合性部位を含む分析物と；
（ｂ）第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の抗原を含む第１の近接構成要素であって、第１の抗原は分析物の抗原結合性部位の１つと複合体を形成することができる第１の近接構成要素と；
（ｃ）第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の抗原を含む第２の近接構成要素であって、第２の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分を含むハイブリッドを形成してアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｉｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項５０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
検出物は抗原特異的免疫グロブリンであることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ハイブリッドは第１または第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を含むことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項５４】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は隣接した塩基を共に含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５６】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
捕捉オリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド部は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の１つの鎖を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５８】
捕捉オリゴヌクレオチドは二本鎖部分を含むことを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項５９】
捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
捕捉オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド部とハイブリッドを形成できるＲＮＡ部分を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項６１】
第１のオリゴヌクレオチド部は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成できるＲＮＡ部分を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項６２】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）（ｉ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）テザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６３】
テザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、オリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
スプリントオリゴヌクレオチドは、第２の部分の３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’および第１の部分の５’に位置する第１のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部は、オリゴヌクレオチド部の第１の部分の５’に位置する第２のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）（ｉ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと；
（ｄ）（ｉ）第２のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６６】
第１のテザーオリゴヌクレオチドの３’または５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素であって、第１のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ＤＮＡポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチド部の３’伸長を妨げる３’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’である第１の部分を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッドを形成することができる第１の部分を含む第２の近接構成要素と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６８】
第２のオリゴヌクレオチド部は、第１の部分の５’である制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
第１のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
キットであって、
（ａ）第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の抗原を含む第１の近接構成要素であって、第１の抗原は少なくとも２つの抗原特異的結合性部位を含む分析物の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第１の近接構成要素と；
（ｂ）第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の抗原を含む第２の近接構成要素であって、第２の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第２の近接構成要素と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項７１】
非核酸分析物の定量方法であって、
（ｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第１および第２の近接構成要素と、
（ｂ）既知の出発量の核酸対照と、
（ｃ）既知の量の非核酸分析物と、
を含む複数の標準試料を形成することにより、第１および第２のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ；
（ｉｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第１および第２の近接構成要素と、
（ｂ）同じ既知の出発量の核酸対照と、
（ｃ）未知の量の非核酸分析物と、
を含む少なくとも１つの試験試料を形成することにより、第１および第２のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンおよび核酸対照を増幅するステップ；
（ｉｖ）増幅したアンプリコンおよび核酸対照を測定して表示測定値を決定するステップ；
（ｖ）複数の標準試料の表示測定値から検量曲線を決定するステップ；ならびに
（ｖｉ）少なくとも１つの試験試料の表示測定値を検量曲線と比較して試験試料中の非核酸分析物の量を決定するステップ；
を含むことを特徴とする非核酸分析物の定量方法。
【請求項１】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分と第２のオリゴヌクレオチド部の部分とを含むハイブリッドを形成するステップ；
（ｉｉｉ）３’末端を伸長してアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は共に隣接した塩基を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリッドは第１または第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を含み、前記アンプリコンを産生するステップは３’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組み合わせるステップの後に、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップの後に、支持体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記支持体を洗浄するステップの後に、支持体から第１の近接構成要素を放出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、且つ前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドをポリメラーゼ触媒伸長して制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成するステップをさらに含み、前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの物理的解離によるものであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
放出するステップは、物理的、化学的または酵素的開裂であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから第１のオリゴヌクレオチド部を置換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
放出するステップは、第１のオリゴヌクレオチド部の二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから捕捉オリゴヌクレオチドを置換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
捕捉オリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの一本鎖または二本鎖はＲＮＡを含み、且つ放出するステップは前記一本鎖または二本鎖をＲＮアーゼで分解することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Ｑβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）（ｉ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）テザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分、スプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分、および、オリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドのいずれかの伸長可能な末端を含む第１のハイブリッドと；および
（ｂ）テザーオリゴヌクレオチドの第１の部分およびテザーオリゴヌクレオチドの第２の部分を含む第２のハイブリッドと；
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）伸長可能な末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチド部が伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
スプリントオリゴヌクレオチドが伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記伸長可能な末端を伸長するステップは、テザーオリゴヌクレオチドを第２のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
テザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
テザーオリゴヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Ｑβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
スプリントオリゴヌクレオチドは、第２の部分の３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’および第１の部分の５’に位置する第１のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部はオリゴヌクレオチド部の第１の部分の５’に位置する第２のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅するステップは、それぞれ第１および第２のプライマー結合性部位とハイブリッド形成する第１および第２のプライマーならびにその同源の認識部位にニック形成する制限エンドヌクレアーゼを使用することを含む鎖置換増幅によるものであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｄ）（ｉ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと；
（ｅ）（ｉ）第２のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）（ａ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分および第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含む第１のハイブリッドと；
（ｂ）第２のテザーオリゴヌクレオチドの第１の部分および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含む第２のハイブリッドと；
（ｃ）第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分、第１のスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端、ならびに第２のスプリントオリゴヌクレオチドの３’末端を含む第３のハイブリッドと；
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）第３のハイブリッドの３’末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項３３】
第１のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成し、第２のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンプリコンを産生するステップは、第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドを第１および第２のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
第１および第２のテザーオリゴヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記伸長するステップの後で且つ前記増幅するステップの前に、第１および第２の近接構成要素からアンプリコンを実質的に除去する洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
検出は定量的であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素であって、第１のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ＤＮＡポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチド部の３’伸長を妨げる３’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’である第１の部分を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッドを形成できる第１の部分を含む第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分ならびに第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含むハイブリッドを形成するステップ；
（ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を伸長することによって、二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作製するステップ；
（ｉｖ）第１のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位にニック形成するステップ；
（ｖ）ニックから第１のオリゴヌクレオチド部を伸長して、第１のオリゴヌクレオチド部の下流部分を置換するステップ；
（ｖｉ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位から鎖置換増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖｉｉ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項４１】
第２のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、鎖置換増幅は第１および第２のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位からのものであることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出は定量的であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
第１のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）分析物と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｃ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分を含む少なくとも１つのハイブリッドを形成するステップであって、その少なくとも一つのハイブリッドは、伸長されて５’末端を含む第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分の相補体を形成することができる３’末端を含むステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンを産生するステップ；
（ｉｖ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのハイブリッドは、第１および第２のオリゴヌクレオチドの第１の部分を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１のハイブリッドは第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第１の部分を含み、且つ第２のハイブリッドは第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分を含む２つのハイブリッドが形成されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記アンプリコンを産生するステップは、３’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンプリコンを産生するステップは、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分と第３のオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッドを形成すること、および（ｉｉ）少なくとも１つのハイブリッドの３’末端を第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結することを含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
（ｉ）（ａ）少なくとも２つの抗原特異的結合性部位を含む分析物と；
（ｂ）第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の抗原を含む第１の近接構成要素であって、第１の抗原は分析物の抗原結合性部位の１つと複合体を形成することができる第１の近接構成要素と；
（ｃ）第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の抗原を含む第２の近接構成要素であって、第２の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第２の近接構成要素と；
を組み合わせるステップ；
（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチド部の第１の部分を含むハイブリッドを形成してアンプリコンを産生するステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ；および
（ｉｖ）増幅産物を検出するステップ；
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項５０】
検出は定量的であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
検出物は抗原特異的免疫グロブリンであることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ハイブリッドは第１または第２のオリゴヌクレオチド部の３’末端を含むことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分および第２の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチド部の第２の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項５４】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は隣接した塩基を共に含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５６】
第１のオリゴヌクレオチドの第１および第２の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
捕捉オリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド部は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の１つの鎖を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５８】
捕捉オリゴヌクレオチドは二本鎖部分を含むことを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項５９】
捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
捕捉オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド部とハイブリッドを形成できるＲＮＡ部分を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項６１】
第１のオリゴヌクレオチド部は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成できるＲＮＡ部分を含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項６２】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）（ｉ）オリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）テザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６３】
テザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、オリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
スプリントオリゴヌクレオチドは、第２の部分の３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’および第１の部分の５’に位置する第１のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部は、オリゴヌクレオチド部の第１の部分の５’に位置する第２のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第１のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１の部分を含む第２のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素と；
（ｃ）（ｉ）第１のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと；
（ｄ）（ｉ）第２のテザーオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッド形成できる第１の部分および（ｉｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリッド形成できる第２の部分を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドと；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６６】
第１のテザーオリゴヌクレオチドの３’または５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のテザーオリゴヌクレオチドの３’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
キットであって、
（ａ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の分析物特異的結合単位を含む第１の近接構成要素であって、第１のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ＤＮＡポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチド部の３’伸長を妨げる３’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の３’である第１の部分を含む第１の近接構成要素と；
（ｂ）分析物と複合体を形成することができて、且つ第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の分析物特異的結合単位を含む第２の近接構成要素であって、第２のオリゴヌクレオチド部は第１のオリゴヌクレオチド部の第１の部分とハイブリッドを形成することができる第１の部分を含む第２の近接構成要素と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６８】
第２のオリゴヌクレオチド部は、第１の部分の５’である制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
第１のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第１の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第２のオリゴヌクレオチド部の５’末端は第２の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
キットであって、
（ａ）第１の部分を含む第１のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第１の抗原を含む第１の近接構成要素であって、第１の抗原は少なくとも２つの抗原特異的結合性部位を含む分析物の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第１の近接構成要素と；
（ｂ）第１の部分を含む第２のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第２の抗原を含む第２の近接構成要素であって、第２の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第２の近接構成要素と；
を含むことを特徴とするキット。
【請求項７１】
非核酸分析物の定量方法であって、
（ｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第１および第２の近接構成要素と、
（ｂ）既知の出発量の核酸対照と、
（ｃ）既知の量の非核酸分析物と、
を含む複数の標準試料を形成することにより、第１および第２のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ；
（ｉｉ）（ａ）オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第１および第２の近接構成要素と、
（ｂ）同じ既知の出発量の核酸対照と、
（ｃ）未知の量の非核酸分析物と、
を含む少なくとも１つの試験試料を形成することにより、第１および第２のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ；
（ｉｉｉ）アンプリコンおよび核酸対照を増幅するステップ；
（ｉｖ）増幅したアンプリコンおよび核酸対照を測定して表示測定値を決定するステップ；
（ｖ）複数の標準試料の表示測定値から検量曲線を決定するステップ；ならびに
（ｖｉ）少なくとも１つの試験試料の表示測定値を検量曲線と比較して試験試料中の非核酸分析物の量を決定するステップ；
を含むことを特徴とする非核酸分析物の定量方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４ＥＥ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６ＧＧ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図６Ｋ】
【図６Ｌ】
【図６Ｍ】
【図６Ｎ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４ＥＥ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６ＧＧ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図６Ｋ】
【図６Ｌ】
【図６Ｍ】
【図６Ｎ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−１２５２５０（Ｐ２０１２−１２５２５０Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−３７４７５（Ｐ２０１２−３７４７５）
【出願日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【分割の表示】特願２００６−５１３０９８（Ｐ２００６−５１３０９８）の分割
【原出願日】平成１６年４月１９日（２００４．４．１９）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−３７４７５（Ｐ２０１２−３７４７５）
【出願日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【分割の表示】特願２００６−５１３０９８（Ｐ２００６−５１３０９８）の分割
【原出願日】平成１６年４月１９日（２００４．４．１９）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
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