説明

免疫応答を誘導するための組成物

本発明は、とりわけ、(a)第1の抗原と、(b)少なくとも第1および第2のアジュバントと(c)医薬的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物を提供し、ここで第1のアジュバントは微粒子を含み、第2のアジュバントはイミダゾキノリン化合物を含み、この組成物は脊椎動物対象に投与されるときに免疫応答を誘発する。本発明は、免疫原性組成物を生成する方法および(例、処置のために)免疫原性組成物を使用する方法、その他の利益をも提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般的に免疫原性組成物に関し、加えて1つまたはそれ以上の選択された抗原の免疫応答を惹起する薬剤に関する。
【背景技術】
【0002】
組換えDNA技術によって作成されるサブユニットワクチンの出現によって、安全かつ有効なアジュバント含有組成物に対する要求が強くなった。サブユニットワクチンは、安全性および生産コストの観点からは伝統的な生ワクチンおよび死滅ワクチンよりも顕著な利点を提供するが、一般的に免疫系に単離ポリペプチドまたは単離ポリペプチドの混合物を与えるために、たとえばウイルス全体、バクテリアおよびその他の微生物などに比べて免疫原性が制限される。その結果、これらのワクチンは一般的に免疫賦活性能力を有するアジュバントの利益を得ており、アジュバントはワクチンが疾患の処置における最大能力に達するのを助ける。
【0003】
他方で、伝統的な生ワクチンは通常アジュバントを必要としない。さらに、死滅ワクチンは一般的にサブユニットワクチンよりも免疫原性であり、通常アジュバントを必要としない。それにもかかわらず、これらのワクチンもサブユニットワクチンと同様に免疫賦活性能力を有するアジュバントの利益を得ることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は(a)第1の抗原と、(b)少なくとも第1および第2のアジュバントとを含み、ここで第1のアジュバントは微粒子を含み、第2のアジュバントはイミダゾキノリン化合物を含み、この免疫原性組成物はさらに(c)医薬的に許容できる賦形剤を含み、この組成物は脊椎動物対象に投与されるときに免疫応答を誘発する。
【0005】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に従った免疫原性組成物を含む注射可能なワクチン組成物を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態において、本発明は免疫原性組成物を調製するためのキットを提供し、このキットは抗原を含む第1の容器と、イミダゾキノリン化合物を含む第2の容器と、微粒子を含む第3の容器とを含むか、または抗原を含む第1の容器と、イミダゾキノリン化合物および微粒子を含む第2の容器とを含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、本発明は脊椎動物対象において免疫応答を誘発するための方法を提供し、この方法は、本発明に従った免疫原性組成物の有効量を脊椎動物対象に投与するステップを含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、本発明は脊椎動物対象において細胞障害性Tリンパ球(cytotoxic−T lymphocyte:CTL)応答を誘発するための方法を提供し、この方法は、本発明の免疫原性組成物の有効量を脊椎動物対象に投与するステップを含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、本発明は脊椎動物対象個体において抗体の介在する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、本発明の免疫原性組成物の有効量を脊椎動物対象に投与するステップを含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるものなどの免疫原性組成物を作成する方法を提供する。
【0012】
本明細書の開示に鑑みて、通常の当業者は本発明のこれらの実施形態およびその他の実施形態を容易に考え付くであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】4つの異なる製剤からのイミダゾキノリン090放出を時間の関数として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の実施には、別様に示されない限り、当該技術の範囲内のウイルス学、化学、生化学、組換え技術、免疫学および薬理学の従来の方法が使用される。こうした技術は文献において十分に説明されている。たとえば、Virology,第3版,vol.I & II(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編,1996);Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1990);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編,Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology,Vols.I−IV(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,1986,Blackwell Scientific Publications);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);およびDNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II(D.Glover編)などを参照されたい。
【0015】
A.定義
本明細書において用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明らかに別様を示さない限り、複数の言及を含む。
【0016】
本明細書において用いられる「約(about)」という用語は、値の+/−10%を示す。
【0017】
本明細書において用いられる「注射可能な組成物」という語句またはその変形は、脊椎動物対象への注射のために好適な医薬的に許容できる組成物を示し、この組成物は典型的に無菌であり、発熱物質を含まず、注射に好適な特定のpHおよび等張性の値を有する。
【0018】
「医薬的に許容できる」または「薬理的に許容できる」とは、生物学的または別様に望ましくないものではない材料を意味し、たとえばその材料はいかなる望ましくない生物学的影響ももたらすことも、その材料が含まれている組成物のいずれかの構成要素と有害な態様で相互作用することもなく個体に投与されてもよい。
【0019】
「脊椎動物対象」とは、限定なしに以下を含む脊索動物亜門のあらゆるメンバーを意味する:ヒトおよびその他の霊長類、たとえばチンパンジーならびにその他の類人猿およびサルの種などのヒト以外の霊長類を含む;家畜、たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなど;家庭用の哺乳動物、たとえばイヌおよびネコなど;マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物;家庭用のトリ、野生のトリおよび猟鳥を含む鳥類、たとえばニワトリ、シチメンチョウおよびその他の家禽のトリ、カモ、ガチョウなど。この用語は特定の年齢を示すものではない。よって成体および新生の個体の両方がカバーされることが意図される。
【0020】
「生理的pH」または「生理的範囲のpH」とは、約7.2から8.0を含む範囲、より典型的には約7.2から7.6を含む範囲のpHを意味する。
【0021】
本明細書において用いられる「処置」とは、(i)問題(たとえば癌または病原性の感染症、伝統的なワクチンの場合と同様)の状態(例、疾患または障害)の予防、(ii)問題の状態に関連する症状の低減または除去、および(iii)問題の状態の実質的または完全な除去のうちのいずれかを示す。処置は予防的(問題の状態の出現前)にもたらされても、治療的(問題の状態の出現後)にもたらされてもよい。
【0022】
本明細書において、本発明の免疫原性組成物の「有効量」または「医薬的に有効な量」という用語は、目的とする状態の処置または診断のための免疫原性組成物の十分量を示す。必要とされる正確な量は、たとえば以下の因子などに依存して対象ごとに変動する:対象の種、年齢および全身状態;処置される状態の深刻度;目的とする特定の抗原;免疫学的応答の場合には、たとえば対象の免疫系が抗体を合成する能力および所望の保護の程度;ならびに投与のモード、その他の因子。あらゆる個別の場合における適切な「有効」量は、通常の当業者によって決定され得る。よって「治療的に有効な量」は典型的に、ルーチン試験を通じて決定できる比較的広い範囲内になる。
【0023】
本明細書において用いられる「微粒子」という用語は、直径が約10nm以下から約150μm、たとえば10nmから25nmから50nmから100nmから250nmから500nmから1μmから2.5μmから5μmから10μmから25μmから50μmから100μmから150μmの範囲の粒子を示す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される微粒子は一般的に球形であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される微粒子は不規則な外形であり得る。
【0024】
本明細書において用いられる「タンパク質粒子」という用語は少なくとも50wt%のタンパク質を含む粒子を示し、「多糖粒子」という用語は少なくとも50wt%の多糖を含む粒子を示し、他も同様である。
【0025】
いくつかの状況下では、微粒子が凝集してより大きな塊になることがある。特定の例として、DNAが吸着された微粒子は、たとえば凍結乾燥前に直径が約0.5〜2μmであってもよいが、凍結乾燥後には同じ粒子がたとえば直径約5〜15μmの凝集体になっていてもよい。微粒子は一般的に、針および毛細管を塞ぐことなく非経口または粘膜投与を可能にするような直径である。微粒子のサイズは、たとえば光子相関分光法、レーザー回折法および/または走査電子顕微鏡法などの、当該技術分野において周知の技術によって容易に決定される。本明細書において定義される微粒子を示すために「粒子」という用語も用いられることがある。
【0026】
「ポリペプチド」という用語はアミノ酸残基のポリマーを示し、生成物の最小の長さに制限されない。よって、全長タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義に含まれる。
【0027】
「ポリペプチド含有種」とは、少なくともその一部がポリペプチドであるような分子のことである。その例には、ポリペプチド、糖タンパク質、金属タンパク質およびリポタンパク質を含むタンパク質、担体タンパク質に結合体化された多糖抗原などが含まれる。本発明において用いるためのタンパク質は、全長タンパク質およびその断片を含む。特定の実施形態においては、天然の配列に対する変更、たとえば欠失、付加および置換など(一般的に性質は保存される)が用いられる。
【0028】
本明細書において用いられる「断片」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を示す。タンパク質の場合には、断片はそのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義されてもよく、少なくとも3〜5アミノ酸、少なくとも6〜10アミノ酸、少なくとも11〜15アミノ酸、少なくとも16〜24アミノ酸、少なくとも25〜30アミノ酸、および少なくとも30〜45アミノ酸であってもよい。ポリヌクレオチドの場合には、断片はそのポリヌクレオチドの核酸配列の連続した部分によって定義され、少なくとも9〜15ヌクレオチド、少なくとも15〜30ヌクレオチド、少なくとも31〜45ヌクレオチド、少なくとも46〜74ヌクレオチド、少なくとも75〜90ヌクレオチド、および少なくとも90〜130ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態においては、生体分子の断片は免疫原性の断片である。
【0029】
いくつかの実施形態において、抗原はタンパク質粒子である。タンパク質粒子は以下の物理的特徴を有していてもよい。タンパク質粒子は一般的に形が球形であり、一般的に直径が約150nm、約200nmから約500nmから約1μmから約2μmから約5μmから約10μmである。タンパク質粒子は、O’Haganらに対する米国特許第6,534,064号またはO’Haganらに対する公開番号US2005/0107322号に記載されるとおりに形成されてもよい。
【0030】
「ポリヌクレオチド」とは核酸ポリマーのことである。ポリヌクレオチドは5、6、7または8個などの少数のヌクレオチドを含んでいてもよい。さらに、「ポリヌクレオチド」は二本鎖および一本鎖配列の両方を含んでいてもよく、ウイルス、原核生物または真核生物のmRNAからのcDNA、ウイルス(例、RNAおよびDNAウイルスならびにレトロウイルス)、原核生物または真核生物からのゲノムRNAおよびDNA配列、ならびに合成DNA配列を示すがこれらに限定されない。この用語は、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も表わす。この用語はさらに、たとえば核酸分子が抗原タンパク質をコードしているときなどの、天然配列に対するたとえば欠失、付加および置換などの変更(一般的に性質は保存される)も含む。これらの変更は、部位特異的変異誘発などによって計画的に行なわれても、抗原を生産する宿主の突然変異などによって偶発的に起こってもよい。
【0031】
「ポリヌクレオチド含有種」とは、少なくともその一部がポリヌクレオチドである分子のことである。その例には、RNAベクターコンストラクト、DNAベクターコンストラクトなどが含まれる。
【0032】
本明細書において用いられる「糖」という用語は、単糖、オリゴ糖および多糖を含む。「糖含有種」とは、少なくともその一部が糖である分子のことである。その例には、糖抗原、担体ペプチドに結合体化された糖を含む抗原などが含まれる。
【0033】
本明細書において用いられる「単離」という用語は、化学種が天然に発生する環境とは異なる環境にあるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体などの化学種を示す。単離された化学種は一般的に実質的に精製されている。細胞を単離する方法も当業者に周知である。
【0034】
「精製」タンパク質とは、(たとえば組換えまたは合成によって)生成されるか、または天然の宿主から単離されて、組成物中に存在するタンパク質の量が粗調製物に存在するタンパク質の量よりもかなり多くなったタンパク質のことである。一般的に、精製タンパク質は少なくとも約50%均質であり、より好ましくは少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上均質である。
【0035】
本明細書において用いられる、抗原または組成物に対する「免疫学的応答」とは、対象において抗原または組成物に対する体液性および/または細胞性免疫応答が発達することである。本発明の目的に対して、「体液性免疫応答」とは抗体分子が介在する免疫応答を示すのに対し、「細胞性免疫応答」とはTリンパ球および/またはその他の白血球が介在する免疫応答である。細胞性免疫の重要な局面の1つは、細胞溶解性T細胞(cytolytic T−cells)(「CTL」)による抗原特異的応答を含む。CTLは、MHCによってコードされて細胞の表面に発現されるタンパク質に関連して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこうした微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の局面は、表面にMHC分子に関連してペプチド抗原を表示する細胞に対する、非特異的エフェクタ細胞の機能を刺激して活性を集中させることを助けるように作用するヘルパーT細胞による抗原特異的応答を含む。「細胞性免疫応答」は、サイトカインおよびケモカインの生成、ならびにCD4+およびCD8+T細胞に由来するものを含む、活性化T細胞および/またはその他の白血球によって生成されるその他のこうした分子の生成のことも示す。
【0036】
「抗原」とは、免疫学的応答を誘発する1つまたはそれ以上のエピトープ(直鎖状、高次構造的、またはその両方)を含有する分子を示す。この用語は「免疫原」という用語と互いに交換可能に用いられてもよい。「エピトープ」とは、所与の種(例、抗原性分子または抗原性複合体)の免疫学的特異性を定める部分のことである。エピトープはこの抗原の定義の範囲に含まれる。通常、エピトープは天然に発生する抗原中のポリペプチドまたは多糖である。人工的な抗原におけるエピトープは、アルサニル酸誘導体などの低分子量の物質であり得る。通常、B細胞エピトープは少なくとも約5個のアミノ酸を含むが、3〜4アミノ酸などの小ささであってもよい。CTLエピトープなどのT細胞エピトープは典型的に少なくとも約7〜9個のアミノ酸を含み、ヘルパーT細胞エピトープは典型的に少なくとも約12〜20個のアミノ酸を含む。「抗原」という用語は、サブユニット抗原、すなわち天然においてその抗原が関連している生物または細胞全体から分離および独立した抗原に加えて、死滅、弱毒化または不活性化したバクテリア、ウイルス、真菌、寄生体もしくはその他の微生物または腫瘍細胞のことも示す。抗イディオタイプ抗体などの抗体またはその断片、および抗原または抗原決定基を模倣できる合成ペプチドミモトープも本明細書において用いられる抗原の定義によって表わされる。同様に、たとえば遺伝子療法およびDNA免疫化適用などにおいて、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、本明細書における抗原の定義に含まれる。
【0037】
よって本発明の目的に対して、抗原はさまざまなウイルス、バクテリア、寄生体、真菌およびその他の微生物のいずれに由来してもよいし、さまざまな腫瘍抗原のいずれに由来してもよい。抗原には、インビボで抗原または抗原決定基を発現する核酸も含まれる。いくつかの特定の例として、抗原は以下のものであってもよい:ヘルペスウイルスファミリーからのタンパク質またはそれに由来するタンパク質であって、単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus:HSV)1型および2型に由来するタンパク質、たとえばHSV−1およびHSV−2糖タンパク質gB、gDおよびgHなどを含むタンパク質;サイトメガロウイルス(cytomegalovirus:CMV)に由来するタンパク質であって、CMV gBおよびgHを含むタンパク質;A型肝炎ウイルス(hepatitis A virus:HAV)、B型肝炎ウイルス(hepatitis B virus:HBV)、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus:HCV)、デルタ型肝炎ウイルス(delta hepatitis virus:HDV)、E型肝炎ウイルス(hepatitis E virus:HEV)およびG型肝炎ウイルス(hepatitis G virus:HGV)を含む、ウイルスの肝炎ファミリーに由来するタンパク質;HIV単離体のさまざまな遺伝子サブタイプHIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV−1CM235、HIV−1US4、HIV−2のメンバーを含むHIVに由来する、gp120、gp160、gp41、p24gagおよびp55gagエンベロープタンパク質を含むタンパク質;サル免疫不全ウイルス(simian immunodeficiency virus:SIV)に由来するタンパク質;ならびにNeisseria meningitidis(A,B,C,Y)、Hemophilus influenza B型(HIB)、Helicobacter pyloriに由来するタンパク質;ヒト血清アルブミンおよびオボアルブミン、その他多数。
【0038】
細胞性免疫応答を誘発する免疫原性組成物またはワクチンは、細胞表面におけるMHC分子に関連する抗原の提示によって、脊椎動物対象を感作する働きをしてもよい。細胞の介在する免疫応答は、表面に抗原を提示している細胞またはその近くで指示される。加えて、抗原特異的なTリンパ球が生成されることによって、免疫化された宿主の将来的な保護を可能にしてもよい。特定の抗原が細胞の介在する免疫学的応答を刺激する能力は、たとえばリンパ球増殖(リンパ球活性化)アッセイ、CTL細胞障害性細胞アッセイ、または感作された対象における抗原に特異的なTリンパ球に対するアッセイなどのいくつかのアッセイによって定められてもよい。こうしたアッセイは当該技術分野において周知である。たとえば、Ericksonら、J.Immunol.(1993)151:4189−4199;Doeら、Eur.J.Immunol.(1994)24:2369−2376などを参照されたい。よって、本明細書において用いられる免疫学的応答は、CTLの生成および/またはヘルパーT細胞の生成もしくは活性化を刺激するものであってもよい。目的とする抗原は、抗体の介在する免疫応答を誘発してもよい。よって、免疫学的応答は以下の効果の1つまたはそれ以上を含んでもよい:たとえばB細胞などだがこれに限定されないものによる抗体の生成;ならびに/または、目的とする組成物もしくはワクチンに存在する1つもしくは複数の抗原に特異的に向けられたサプレッサーT細胞および/もしくはγΔT細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、および/または抗体−補体を仲介し、または抗体依存性細胞障害(antibody dependent cell cytotoxicity:ADCC)を仲介することによって、免疫化された宿主に対する保護を提供する働きをしてもよい。こうした応答は、当該技術分野において周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて定めることができる。
【0039】
本発明に従った抗原を含有する免疫原性組成物は、たとえば抗原が可溶性タンパク質として投与されるような異なる送達系を用いて投与された同等量の抗原によって誘発される免疫応答よりも免疫応答を誘発する能力が大きいときに、「強化された免疫原性」を示す。すなわち、免疫原性組成物またはワクチン組成物が「強化された免疫原性」を示すのは、抗原の免疫原性がより強いか、または抗原が投与される対象における免疫応答を得るために必要な抗原がより低用量もしくはより少用量であるためであり得る。こうした強化された免疫原性は、抗原組成物および抗原対照を動物に投与して、本明細書に記載される標準的なアッセイを用いてこれら2つに対する抗体価および/または細胞の介在する免疫を比較することによって定めることができる。
【0040】
「アジュバント」という用語は、免疫系における抗原の作用を補助または変更するあらゆる物質を示す。アジュバントは体液性および/または細胞性の免疫を強化できる。
【0041】
「賦形剤」という用語は、完成した剤形に存在し得るあらゆる本質的に補助的な物質を示す。たとえば、「賦形剤」という用語は媒体、結合剤、崩壊剤、充填剤(希釈剤)、懸濁/分散剤などを含む。
【0042】
本明細書において用いられる「ベクターコンストラクト」という語句は一般的に、目的とする核酸配列または遺伝子の発現を指示できるあらゆる構築物を示す。「DNAベクターコンストラクト」は、目的とする核酸配列または遺伝子の発現を指示できるDNA分子を示す。1つの特定のタイプのDNAベクターコンストラクトはプラスミドであり、これは宿主細胞内での自律増殖が可能な環状のエピソームDNA分子である。典型的に、プラスミドは環状の二本鎖DNAループであり、その中に付加的なDNAセグメントを連結できる。pCMVは当該技術分野において周知の特定的なプラスミドの1つである。RNAウイルスに基づいた他のDNAベクターコンストラクトが公知である。これらのDNAベクターコンストラクトは典型的に、真核細胞中で機能するプロモーターと、転写産物がRNAベクターコンストラクト(例、アルファウイルスRNAベクターレプリコン)であるcDNA配列の5’と、3’末端領域とを含む。ベクターコンストラクトの他の例は、RNAベクターコンストラクト(例、アルファウイルスベクターコンストラクト)などを含む。本明細書において用いられる「RNAベクターコンストラクト」、「RNAベクターレプリコン」および「レプリコン」とは、典型的には標的細胞内で、インビボで自身の増幅または自己複製を指示できるRNA分子を示す。RNAベクターコンストラクトは直接使用され、細胞にDNAを導入して転写が起こる核に輸送させる必要はない。宿主細胞の細胞質への直接送達のためにRNAベクターを用いることによって、異種核酸配列の自律増殖および翻訳が効率的に起こる。
【0043】
B.全般
本発明は免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は(a)第1の抗原と、(b)少なくとも第1および第2のアジュバントとを含み、ここで第1のアジュバントは微粒子を含み、第2のアジュバントはイミダゾキノリンを含み、この免疫原性組成物はさらに(c)医薬的に許容できる賦形剤を含み、前記組成物は脊椎動物対象に投与されるときに免疫応答を誘発する。
【0044】
いくつかの実施形態において、第1の抗原は死滅または生の(例、弱毒化または不活性化した)病原性生物である。いくつかの実施形態において、第1の抗原はポリペプチド含有抗原(例、全長タンパク質、タンパク質断片など)である。いくつかの実施形態において、第1の抗原は多糖含有抗原(例、莢膜多糖、多糖−タンパク質タンパク質結合体など)である。いくつかの実施形態において、第1の抗原はポリヌクレオチド含有抗原(例、ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列につながれたポリヌクレオチドなど)である。いくつかの実施形態において、第1の抗原は、前述の抗原の1つなどの抗原から形成される安定化した微粒子の形であり、この微粒子は、たとえばO’Haganらに対する米国特許第6,534,064号もしくは公開番号US2005/0107322号に記載されるとおりに生成されてもよいし、当業者に公知のその他の手段によって生成されてもよい。こうした安定化した微粒子はウイルス様の粒子ではないが、いくつかの実施形態において、第1の抗原はウイルス様の粒子である。こうした安定化した微粒子は典型的には遊離した粒子であり、担体内に封入されていない。
【0045】
本発明に従う免疫原性組成物は、脊椎動物対象において、たとえば細胞障害性Tリンパ球(CTL)応答、抗体の介在する免疫応答、またはその両方などの免疫応答を誘発するための方法に用いることもでき、この方法は、免疫原性組成物を脊椎動物対象に投与するステップを含む。
【0046】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、たとえば病原体または腫瘍を処置するために注射可能なワクチンに用いられる。
【0047】
本発明に従う免疫原性組成物は、医薬組成物として調製することもできる。
【0048】
本発明は、免疫原性組成物を調製するためのキットも提供する。このキットは、たとえば抗原を含む第1の容器と、微粒子およびイミダゾキノリンを含む第2の容器とを含んでもよい。このキットは、たとえば抗原を含む第1の容器と、微粒子を含む第2の容器と、イミダゾキノリンを含む第3の容器とを含んでもよい。
【0049】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は少なくとも第3のアジュバントをさらに含むことができ、いくつかの場合には3つ、4つ、5つまたはそれ以上のアジュバントを含んでもよい。
【0050】
いくつかの実施形態において、この組成物は第2の抗原をさらに含む。第1の抗原と同様に、第2の抗原はたとえば死滅または生の病原性生物、ポリペプチド含有抗原、多糖含有抗原、ポリヌクレオチド含有抗原、および安定化した微粒子などであってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は2つ、3つ、4つまたはそれ以上の抗原をさらに含むことができる。
【0051】
C.イミダゾキノリン
好ましいイミダゾキノリンは次式のものであり、
【0052】
【化1】

ここでRおよびRは以下からなる群より独立に選択される:水素、1個から10個の炭素原子のアルキル、1個から10個の炭素原子のヒドロキシアルキル、1個から10個の炭素原子のアルコキシアルキル、アシルオキシ部分が1個から5個の炭素原子のアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、かつアルキル部分が1個から6個の炭素原子を含有するアシルオキシアルキル、
【0053】
【化2】

ここでRおよびRは、水素および1個から10個の炭素原子のアルキルからなる群より独立に選択される、ベンジル、(フェニル)エチルおよびフェニル、ここでベンジル、(フェニル)エチルまたはフェニル置換基はベンゼン環において、1個から4個の炭素原子のアルキル、1個から4個の炭素原子のアルコキシおよびハロゲンからなる群より独立に選択される1つまたは2つの部分によって任意に置換される。前述のアルキル基は直鎖、分岐鎖および/または環状であってもよい。本発明の実施のために特に好ましいイミダゾキノリンは、イミキモド、レシキモド、および
【0054】
【化3】

を含み、後者を本明細書においては「イミダゾキノリン090」とも呼ぶ。たとえば、Valianteらに対する国際公開2006/031878号およびSuttonらに対する国際公開2007/109810号などを参照されたい。
【0055】
本発明の組成物における抗原のイミダゾキノリンに対する典型的なwt/wt比は、1:1から2:1から5:1から10:1の範囲であり、その他の可能性もある。
【0056】
D.微粒子
上に示されるとおり、特定の実施形態に従う組成物は、1つまたはそれ以上の抗原および1つまたはそれ以上のイミダゾキノリンに加えて、1つまたはそれ以上のタイプの微粒子を含む。微粒子の例には、(a)無機微粒子(例、リン酸カルシウムを含む微粒子、アルミニウム塩[ミョウバン]、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含む微粒子)、および(b)有機微粒子、たとえば低溶解度アミノ酸(例、L−チロシン微粒子など)、生分解性ポリマー(例、PLGなど)、代謝可能な油(例、MF59など)などに基づく微粒子が含まれる。
【0057】
微粒子が固体微粒子であるとき、抗原、イミダゾキノリン、およびさまざまな任意の補助的構成要素は、独立にたとえば以下のとおりであってもよい:(a)微粒子内に確立される、(b)微粒子に付着される、たとえば微粒子の表面に吸着もしくは結合体化される、および/または(c)別様でさまざまな程度に微粒子に関連付けられる、たとえば液体分散中で微粒子と混合される、固体組成物中で微粒子と混合される(例、微粒子とともに凍結乾燥される)など。抗原、イミダゾキノリン、およびさまざまな任意の補助的構成要素は、微粒子の別個の集団に吸着、結合体化または確立されてもよい。
【0058】
微粒子が液体微粒子(例、水中油型エマルションにおける油小滴など)であるとき、抗原、イミダゾキノリン、およびさまざまな補助的構成要素は、独立にたとえば以下のとおりであってもよい:エマルションの油相内に溶解または分散される(油小滴の別個の集団を含む)、エマルションの水相内に溶解または分散される、および/またはエマルションの水相および油相の間の界面に配置される。
【0059】
抗原、イミダゾキノリン、またはさまざまな補助的構成要素は、たとえば微粒子製造プロセスの間にこれらの種を導入することによって、微粒子内に確立されてもよい(例、微粒子中に封入、被包、溶解または分散される)。抗原、イミダゾキノリン、またはさまざまな補助的構成要素は、たとえばこれらの種を予め形成された微粒子に導入することなどによって、微粒子に付着されても、微粒子に吸着されても、別様で微粒子に関連付けられてもよい。
【0060】
抗原の微粒子に対する典型的なwt/wt比は、100:1から200:1から500:1から1000:1の範囲であり、その他の可能性もある。
【0061】
いくつかの実施形態において、微粒子は1つまたはそれ以上の無機種を含む(例、リン酸カルシウムを含む微粒子、アルミニウム塩[ミョウバン]、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含む微粒子)。たとえば、水酸化アルミニウムおよびリン酸カルシウムは、Brenntag Biosector,Denmarkおよびその他の供給源から得られてもよい。
【0062】
いくつかの実施形態において、微粒子は1つまたはそれ以上の低溶解度アミノ酸を含む(例、L−チロシン微粒子など)。L−チロシン微粒子懸濁液は、たとえばM.Singhら、Vaccine 24(2006)1680−1686およびそこに引用される文献などに記載されている。
【0063】
いくつかの実施形態において、微粒子は1つまたはそれ以上の代謝可能な油を含む。代謝可能な油は通常、約6個から約30個の炭素原子を有する油であり、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにそれらの対応する酸およびアルコール、そのエーテルおよびエステル、ならびにその混合物を含むがこれらに限定されない。この油は直鎖または分岐鎖構造を有し得る。この油は完全に飽和していても、1つまたはそれ以上の二重結合または三重結合を有していてもよい。モノまたはポリエステルまたはエーテルに基づく油が用いられるとき、約6個から約30個の炭素という限定は、合計炭素数ではなく個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用される。油は本質的に、宿主動物の身体で代謝可能なあらゆる植物油、魚油、動物性油または合成により調製された油であってもよい。たとえば、本発明の油構成要素は、あらゆる長鎖アルカン、アルケンもしくはアルキン、またはその酸もしくはアルコール誘導体、たとえば遊離酸など、その塩もしくはエステル、たとえばモノエステルもしくはジエステルもしくはトリエステル、たとえばトリグリセリド、1,2−プロパンジオールもしくは類似のポリヒドロキシアルコールのエステルなどであってもよい。たとえば酢酸、プロパン酸、クエン酸などのアミノ官能性または多官能性の酸を用いてアルコールをアシル化してもよい。長鎖アルコールに由来するエーテルで、本明細書において示される基準を満たす油であるものも用いられ得る。
【0064】
特定の例として、多くの魚は容易に回収できる代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などのクジラ油は、本発明において使用され得る魚油のいくつかを例示するものである。いくつかの分岐鎖油は5炭素イソプレン単位で生化学的に合成でき、これは一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレンとして公知である分岐鎖不飽和テルペノイド、2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサエンを含有する。スクアレンおよびスクアレンの飽和類似体であるスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であるし、当該技術分野において公知の方法によって得られてもよい。代謝可能な油は、1つまたはそれ以上の好適な界面活性剤を用いてエマルションの形で安定化されてもよい。免疫原性エマルション組成物は典型的に以下を含む:(1)約0.5から1から2から6から10から20体積%の油、より典型的には1から10体積%の油、さらにより典型的には2から6体積%の油、(2)約80から90から95から98から99から99.5体積%の水、より典型的には90から99体積%の水;および(3)油小滴(微粒子)を安定化するために十分な量の1つまたはそれ以上の界面活性剤。
【0065】
好ましくは、実質的にすべての油小滴が直径1ミクロンよりも小さく、より典型的には250nmよりも小さい。「実質的にすべて」とは、少なくとも約80%(数で)、典型的には少なくとも約90%、より典型的には少なくとも約95%または少なくとも98%を意味する。こうしたエマルションを生成するためにいくつかの技術を用いることができる。たとえば市販の乳化装置が用いられてもよく、この乳化装置は、高圧下で小さい開口に流体を強制的に通すことによって発達される高い剪断力の原理によって動作してもよい。市販の乳化装置の例は、Model 110Y microfluidizer(Microfluidics,Newton,Mass.),Gaulin Model 30CD(Gaulin,Inc.,Everett,Mass.)およびRainnie Minilab Type 8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy,Inc.,Hudson,Wis.)を限定なしに含む。個々のエマルションとともに用いるための適切な圧力は、当業者によって容易に定められる。油小滴のサイズは、たとえば界面活性剤の油に対する比率(比率を高くすると典型的に小滴サイズが小さくなる)、動作圧力(動作圧力を高くすると典型的に小滴サイズが小さくなる)および動作温度(温度を高くすると典型的に小滴サイズが小さくなる)を変えることなどによって変更できる。乳化のときに用いられる特定の界面活性剤および油、ならびにもしあれば存在するその他の構成要素(例、イミダゾキノリン、抗原、および/または以下に考察されるあらゆる任意の追加の化合物)によっても小滴サイズが変わる。
【0066】
いくつかの界面活性剤が生物学的状況のために特定的に設計されて、一般的に用いられている。たとえば、Sigma Chemical Companyによる1987 Catalog of Biochemical and Organic Compoundsの310〜316頁にはこうしたいくつかの生物学的界面活性剤が列挙されている。界面活性剤は4つの基本的なタイプに分けられてもよい:アニオン性、カチオン性、双性イオン性、および非イオン性である。アニオン性界面活性剤の例は、アルギン酸、カプリル酸、コール酸、1−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、1−ドデカンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl sulfate:SDS)、・ラウリル硫酸ナトリウム(sodium lauryl sulfate:SLS)、ジオクチルソジウムスルホサクシネート(dioctyl sodium sulfosuccinate:DSS)、N−ラウロイルザルコシン,およびタウロコール酸、その他を含む。カチオン性界面活性剤の例は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(cetyltrimethylammonium bromide)または「CTAB」(例、セトリミド)、ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロミド(dimethyl dioctodecyl ammonium bromide:DDA)、ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(dioleoyl−3−trimethylammonium−propane:DOTAP)塩化ベンザルコニウム、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウム、および4−ピコリンドデシル硫酸塩、その他を含む。双性イオン性界面活性剤の例は、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸塩(3−[(3−cholamidopropyl)−dimethylammonio]−1−propanesulfonate)(通常CHAPSと略される)、3−[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸塩(3−[(cholamidopropyl)dimethylammonio]−2−hydroxy−1−propanesulfonate)(通常CHAPSOと略される)、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸塩、およびリゾ−アルファ−ホスファチジルコリン、その他を含む。非イオン性界面活性剤の例は、ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol:PVA)、ポビドン(ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)またはPVPとしても公知)、ポリソルベート、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポロキサマー、デカノイル−N−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、n−ドデシルベータ−D−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物(例、Lubrolの商品名で販売されるもの)、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル、脂肪酸(特にC12〜C20脂肪酸)のポリオキシエチレンエーテル、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例、Tween(登録商標)の商品名で販売される)およびソルビタン脂肪酸エステル(例、Span(登録商標)の商品名で販売される)を含むソルビタンエステル、その他を含む。
【0067】
特定の実施形態において、1つまたはそれ以上のソルビタン誘導体、たとえば選択されたソルビタン脂肪酸モノエステル、ソルビタン脂肪酸セスキエステル(sesquiesters)、ソルビタン脂肪酸トリエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸モノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸トリエステルなどを用いて、油微粒子を安定化してもよい。たとえば、ソルビタンエステル(例、トリオレイン酸ソルビタン)およびポリオキシエチレンソルビタンエステル(例、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)を用いて、油微粒子を安定化してもよい。
【0068】
界面活性剤で安定化した微粒子組成物の特定的な例の1つはMF59であり、これは4〜5%w/vのスクアレン微粒子を含有する油微粒子の水性分散であって、0.25〜0.5w/v%のポリソルベート80(Tween 80)、0.5%w/vのトリオレイン酸ソルビタン(Span 85)、および任意にさまざまな量のMTP−PE(例、0〜100μg/用量)によって安定化されている。界面活性剤で安定化した微粒子組成物の別の特定的な例はSAFであり、これは10%のスクアラン、0.4%のTween 80、5%のプルロニックブロックされたポリマーL121、およびthr−MDP(下記を参照)を含有する。界面活性剤で安定化した微粒子組成物のさらに別の特定的な例はRibiアジュバント系(Ribi adjuvant system:RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)であり、これは2%のスクアレン、0.2%のTween 80、ならびにモノホスホリルリピドA(monophosphorylipid A:MPL)、トレハロースジミコール酸(trehalose dimycolate:TDM)、および細胞壁骨格(cell wall skeleton:CWS)からなる群からの1つまたはそれ以上のバクテリア細胞壁成分、好ましくはMPL+CWS(Detox)を含有する。
【0069】
本発明において用いるための好適な微粒子およびそれらを形成する方法のさらなる説明については、米国特許第6,086,901号、第6,299,884号および第6,451,325号、ならびに国際公開00/50006号を参照されたい。
【0070】
いくつかの実施形態において、微粒子は1つまたはそれ以上の生分解性ポリマーを含む。生分解性ポリマーの例には、生分解性ポリエステル、たとえばポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ吉草酸、およびポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート(例、ポリアルキルシアノアクリレート(polyalkylcyanoacrylate)または「PACA」)が含まれる。より典型的には、本発明とともに用いるための微粒子は、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、たとえばポリ(ラクチド)(poly(lactide))(「PLA」)、またはラクチドおよびグリコリドの共重合体、たとえばポリ(L−ラクチド−コ−グリコリド)またはポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(poly(D,L−lactide−co−glycolide))(「PLG」)などに由来するポリマー微粒子である。ポリマー微粒子は、さまざまな分子量を有し、PLGなどの共重合体の場合にはさまざまな単量体比(例、ラクチド:グリコリド)を有するさまざまなポリマー出発材料のいずれに由来してもよく、ポリマー出発材料の選択は主に、同時投与される種および望ましい分解速度に部分的に依存する選択の問題である。ラクチド/グリコリドのモル比は、たとえば10:90またはそれ未満から15:85から25:75から40:60から45:55から50:50から55:45から60:40から75:25から85:15から90:10またはそれ以上などの範囲であってもよく、生分解性ポリマーの分子量は、たとえば5,000ダルトンまたはそれ未満から10,000ダルトンから20,000ダルトンから40,000ダルトンから50,000ダルトンから70,000ダルトンから100,000ダルトンから200,000ダルトンまたはそれ以上などの範囲であってもよい。たとえば、50%のD,L−ラクチドおよび50%のグリコリドを含有する50:50PLGポリマーは速く再吸収する共重合体を提供するのに対し、75:25PLGはラクチド成分が増えたためにもっと遅く分解し、85:15および90:10はさらにもっと遅くなる。所望の放出動力学を達成するために、さまざまなラクチド:グリコリド比を有する微粒子の混合物も本発明において使用されてもよい。本発明の微粒子の分解速度は、たとえばポリマーの分子量およびポリマーの結晶化度などの因子によっても制御できる。
【0071】
さまざまなラクチド:グリコリド比および分子量を有するPLG共重合体は、Boehringer Ingelheim,GermanyおよびBirmingham Polymers,Inc.,Birmingham,AL,USAを含むいくつかの供給源から容易に商業的に入手可能である。いくつかの例示的なPLG共重合体は以下を含む:(a)RG502、50:50のラクチド/グリコリドのモル比および約12,000Daの分子量を有するPLG;(b)RG503、50:50のラクチド/グリコリドのモル比および約34,000Daの分子量を有するPLG;(c)RG504、50:50のラクチド/グリコリドのモル比および約48,000Daの分子量を有するPLG;(d)RG752、75:25のラクチド/グリコリドのモル比および約22,000Daの分子量を有するPLG;(e)RG755、75:25のラクチド/グリコリドのモル比および約68,000Daの分子量を有するPLG;および(f)RG502H、50/50のラクチド/グリコリド共重合体比を有し、遊離カルボキシル末端基を有し、約7800Daの分子量を有するPLG。PLGポリマーは、たとえばTabataら、J.Biomed.Mater.Res.(1988)22:837−858に記載されるものなど、当該技術分野において周知の技術を用いて、乳酸成分の簡単な重縮合によって合成することもできる。
【0072】
ポリマー微粒子は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかを用いて調製される。たとえば、いくつかの実施形態においては、米国特許第3,523,907号およびOgawaら、Chem.Pharm.Bull.(1988)36:1095−1103に記載されるものなどのダブルエマルション/溶媒蒸発技術を本発明において用いて微粒子を作成できる。これらの技術は、ポリマー溶液の小滴からなる一次エマルションの形成を含み、その後この一次エマルションが粒子安定剤/界面活性剤を含有する連続的な水相と混合される。他の実施形態においては、以下の技術を用いて微粒子を形成することもできる:たとえばThomasinら、J.Controlled Release(1996)41:131;米国特許第2,800,457号;Masters,K.(1976)Spray Drying 第2版、Wiley,New Yorkに記載されるとおりの噴霧乾燥およびコアセルベーション;Hallら、(1980)The Wurster Process in Controlled Release Technologies:Methods,Theory,and Applications(A.F.Kydonieus編),Vol.2,pp.133−154 CRC Press,Boca Raton,Florida、およびDeasy,P.B.,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.(1988)S(2):99−139に記載されるとおりのエアサスペンションコーティング技術、たとえばパンコーティングおよびWursterコーティング;ならびに、たとえばLimら、Science(1980)210:908−910に記載されるとおりのイオン性ゲル化。2006年12月1日に出願された国際出願PCT/US06/46212号に記載されるとおりの溶媒置換法を用いて、ポリマーナノ粒子を形成することもできる。
【0073】
特定の実施形態においては、O’Haganら、Vaccine(1993)11:965−969,O’Haganらに対する国際出願PCT/US99/17308号(国際公開00/06123号)、およびJefferyら、Pharm.Res.(1993)10:362に記載されるラインに沿って、水中油中水型(water−in−oil−in−water:w/o/w)溶媒蒸発系を用いて微粒子を形成してもよい。一般に、PLGなど目的とするポリマーは、たとえば酢酸エチル、ジメチルクロリド(メチレンクロリドおよびジクロロメタンとも呼ばれる)、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解されている。ポリマーは典型的に、有機溶媒中で約1〜30%、より典型的には約2〜15%、さらにより典型的には約3〜10%、最も典型的には約4〜8%の溶液として与えられる。次いでポリマー溶液は第1の体積の水溶液と組合され、乳化されてo/wエマルションを形成する。水溶液はたとえば脱イオン水、生理食塩水、緩衝溶液、たとえばリン酸緩衝食塩水(phosphate−buffered saline:PBS)またはクエン酸ナトリウム/エチレンジアミン四酢酸(sodium citrate/ethylenediaminetetraacetic acid)(クエン酸ナトリウム/ETDA)緩衝溶液などであってもよい。後者の溶液は、(a)正常な生理的流体と本質的に同じ浸透圧すなわち重量オスモル濃度を提供でき、かつ(b)正常な生理的状態に適合するpHを維持できる。代替的には、微粒子形成後および投与前に、本発明の組成物の浸透圧および/またはpH特性を調整できる。好ましくは、ポリマー溶液の水溶液に対する体積比は約5:1から約20:1の範囲であり、より好ましくは約10:1である。乳化はこの作業に適したあらゆる機器を用いて行なわれ、その機器は典型的には高剪断装置、たとえばホモジナイザーなどである。
【0074】
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の付加的な構成要素が微粒子内に確立される。たとえば、抗原、イミダゾキノリンおよび/または以下に記載される任意の追加構成要素を、(a)油溶性または油分散可能な形であるときにはポリマー溶液に加え、(b)水溶性または水分散可能な形であるときには水溶液に加えることによって、導入できる。
【0075】
次いで、ある体積のo/wエマルションを、より大きな第2の体積の典型的には界面活性剤を含有する水溶液と組合せる。水溶液のo/wエマルションに対する体積比は、典型的に約2:1から10:1の範囲であり、より典型的には約4:1である。本発明の実施に対して適切な界面活性剤の例は上記に挙げている。通常の当業者は、吸着させる種のタイプに対して適切な界面活性剤を容易に選択するであろう。たとえば、アニオン性またはカチオン性界面活性剤などの帯電した界面活性剤の存在下で製造された微粒子は、表面が正味で負または正味で正の荷電を有する微粒子をもたらしてもよく、これは多様な分子を吸着できる。たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などのアニオン性界面活性剤によって製造された微粒子、たとえばSDS−PLG微粒子などは、正に帯電した種、たとえばタンパク質などのポリペプチド含有種などを容易に吸着する。同様に、CTABなどのカチオン性界面活性剤によって製造された微粒子、たとえばCTAB−PLG微粒子などは、負に帯電した種、たとえばDNAなどのポリヌクレオチド含有種などを容易に吸着する。特定の種は、界面活性剤の組合せを有する微粒子により容易に吸着することがある。さらに、いくつかの場合には、上述の有機溶液に界面活性剤を加えることが望ましいことがある。
【0076】
次いでこの混合物を均質化して安定なw/o/wダブルエマルションを生成する。上述の均質化ステップの各々は典型的に室温(すなわち25℃)またはそれ未満で行なわれ、より典型的にはたとえば氷浴中で冷却しながら室温未満で行なわれる。
【0077】
次いで有機溶媒を蒸発させる。調製後の微粒子はそのまま使用されてもよいし、将来の使用のために凍結乾燥されてもよい。
【0078】
製剤パラメータを操作して、0.05μm(50nm)のオーダの小さい微粒子から50μmまたはそれ以上のより大きな微粒子までの調製を可能にできる。たとえば、Jefferyら、Pharm.Res.(1993)10:362−368;McGeeら、J.Microencap.(1996)を参照されたい。たとえば、撹拌を減少させると、典型的により大きな微粒子がもたらされ、内側相体積の増加およびポリマー濃度の増加も同様である。小さい粒子は典型的に、撹拌の増加の他に、水相体積を小さくし、エマルション安定剤の濃度を高くし、ポリマー濃度を減少させることによって生成される。
【0079】
E.抗原
本発明において有用な抗原は、たとえば限定なしに以下を含む:ヘルペスウイルスファミリーに由来する抗原であって、単純ヘルペスウイルス(HSV)1型および2型に由来する抗原、たとえばHSV−1およびHSV−2糖タンパク質gB、gDおよびgHなどを含む抗原;水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus:VZV)、エプスタインバーウイルス(Epstein−Barr virus:EBV)およびサイトメガロウイルス(CMV)に由来する抗原であって、CMV gBおよびgHを含む抗原;ならびにその他のヒトヘルペスウイルス、たとえばHHV6およびHHV7などに由来する抗原。(たとえば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の概説についてはCheeら、Cytomegaloviruses(J.K.McDougall編,Springer−Verlag 1990)pp.125−169;さまざまなHSV−1にコードされるタンパク質の考察についてはMcGeochら、J.Gen.Virol.(1988)69:1531−1574;HSV−1およびHSV−2 gBおよびgDタンパク質ならびにそれをコードする遺伝子の考察については米国特許第5,171,568号;EBVゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定についてはBaerら、Nature(1984)310:207−211;VZVの概説についてはDavison and Scott,J.Gen.Virol.(1986)67:1759−1816を参照。)
A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、デルタ型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)およびG型肝炎ウイルス(HGV)を含む、ウイルスの肝炎ファミリーからの抗原も、本明細書に記載される技術において便利に用いられ得る。たとえば、HCVのウイルスゲノム配列およびその配列を得るための方法が公知である。たとえば、本明細書においてその全体を引用により援用する国際公開89/04669号;国際公開90/11089号;および国際公開90/14436号を参照されたい。HCVゲノムは、以下にさらに考察されるいくつかのウイルスタンパク質をコードしている。これらのタンパク質およびその抗原性断片は、本発明において使用できる。同様に、HDVからのデルタ抗原に対する配列が公知であり(たとえば米国特許第5,378,814号を参照)、この配列も本発明において便利に使用できる。加えて、HBVに由来する抗原、たとえばコア抗原、表面抗原(surface antigen)sAgなど、ならびにプレ表面(presurface)配列pre−S1およびpre−S2(以前はpre−Sと呼ばれた)、ならびに上記の組合せ、たとえばsAg/pre−S1、sAg/pre−S2、sAg/pre−S1/pre−S2、およびpre−S1/pre−S2なども本発明において使用できる。たとえば、HBV構造の考察についてはMackett,M.and Williamson,J.D.,Human Vaccines and Vaccination,pp.159−176における“HBV Vaccines−from the laboratory to license:a case study”;および本明細書においてその全体を引用により援用する米国特許第4,722,840号、第5,098,704号、第5,324,513号;Beamesら、J.Virol.(1995)69:6833−6838,Birnbaumら、J.Virol.(1990)64:3319−3330;およびZhouら、J.Virol.(1991)65:5457−5464などを参照されたい。
【0080】
その他のウイルスに由来する抗原も本発明において使用でき、その抗原の例には限定なしに以下が含まれる:Picornaviridae(例、ポリオウイルスなど);Caliciviridae;Togaviridae(例、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど);Flaviviridae;Coronaviridae;Reoviridae;Birnaviridae;Rhabodoviridae(例、狂犬病ウイルスなど);Filoviridae;Paramyxoviridae(例、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど);Orthomyxoviridae(例、インフルエンザウイルスA型、B型およびC型など);Bunyaviridae;Arenaviridae;Retroviradae(例、HTLV−I;HTLV−II;HIV−1(HTLV−III、LAV、ARV、hTLRなどとしても公知))のファミリーのメンバーに由来する抗原であって、以下の単離体からの抗原を含むがこれに限定されない:HIVIIIb、HIVSV2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN);HIV−1CM235、HIV−1US4;HIV−2;サル免疫不全ウイルス(SIV)、その他。加えて、抗原はヒトパピローマウイルス(human papillomavirus:HPV)およびダニ媒介性脳炎ウイルスにも由来してもよい。たとえば、これらおよびその他のウイルスの説明についてはVirology,第3版(W.K.Joklik編、1988);Fundamental Virology,第2版(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編、1991)などを参照されたい。
【0081】
より特定的には、HIVのさまざまな遺伝子サブタイプのメンバーを含む上述のHIV単離体のいずれかからのgp120エンベロープタンパク質が公知であって報告されており(例、さまざまなHIV単離体のエンベロープ遺伝子配列の比較についてはMyersら、Los Alamos Database,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,N.Mex.(1992);Myersら、Human Retroviruses and Aids,1990,Los Alamos,N.Mex.:Los Alamos National Laboratory;およびModrowら、J.Virol.(1987)61:570−578を参照)、これらの単離体のいずれに由来する配列もこの方法において使用できる。さらに本発明は、さまざまなHIV単離体のいずれかに由来するその他の免疫原性タンパク質にも同等に適用可能であり、そのタンパク質には、たとえばgp160、gp140およびgp41などのさまざまなエンベロープタンパク質のいずれか、たとえばp24gagおよびp55gagなどのgag抗原、ならびにpol領域に由来するタンパク質が含まれる。
【0082】
本発明が有用であるウイルスの別の例はインフルエンザウイルスである。特定的には、インフルエンザウイルスに由来する抗原は、インフルエンザA型のエンベロープ糖タンパク質HAおよびNAを含み、これは免疫応答を生じるために特に興味深いタンパク質である。インフルエンザA型の多数のHAサブタイプが同定されている(Kawaokaら、Virology(1990)179:759−767;Websterら、“Antigenic variation among type A influenza viruses,”p.127−168.In:P.PaleseおよびD.W.Kingsbury(編),Genetics of influenza viruses.Springer−Verlag,New York)。よって、これらの単離体のいずれに由来するタンパク質も本明細書に記載される本発明において使用できる。
【0083】
本明細書に記載される組成物および方法において用いるための抗原は、多数のバクテリア抗原に由来していてもよく、たとえばジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎およびその他の病原性の状態をもたらす生物からの抗原であってもよく、それらの生物には、Meningococcus A、BおよびC、Hemophilus influenza B型(HIB)、ならびにHelicobacter pylori(例、Cag、Vac、Nap、HopX、HopY、ウレアーゼなど)が限定なしに含まれる。寄生性抗原の例には、マラリアおよびライム病をもたらす生物に由来する抗原が含まれる。
【0084】
さらに、本明細書に記載される組成物および方法は、さまざまな悪性癌を処置するための手段を提供する。たとえば、本発明を用いて、目的とする癌に特異的な特定のタンパク質、たとえば活性化した癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカーなどに対する体液性および細胞介在型免疫応答の両方を起こすことができる。こうした腫瘍抗原は以下を含む:さまざまなMAGE(メラノーマ関連抗原E(melanoma associated antigen E))のいずれか、MAGE1、2、3、4などを含む(Boon,T.Scientific American(March 1993):82−89);さまざまなチロシナーゼのいずれか;MART 1(T細胞によって認識されるメラノーマ抗原(melanoma antigen recognized by T cells))、変異体ras;変異体p53;p97メラノーマ抗原;CEA(癌胎児抗原(carcinoembryonic antigen))、その他。
【0085】
本発明を用いて、診断および免疫精製の目的のために多数の抗原に対する抗体を増やす他に、広範囲の疾患を予防または処置できることが容易に明らかになる。
【0086】
上に説明したとおり、本発明の組成物および方法はHCV抗原を利用してもよい。C型肝炎ウイルスのゲノムは典型的に約9,600ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含有し、これは転写されてポリタンパク質になる。このポリタンパク質の全長配列は、本明細書においてその全体を引用により援用するヨーロッパ公開388,232号および米国特許第6,150,087号に開示されている。表1に示されるとおり、HCVポリタンパク質は切断されて少なくとも10個の異なる産物を生成し、その順番はNH−コア−E1−E2−p7−NS2−NS3−NS4a−NS4b−NS5a−NS5b−COOHである。コアポリペプチドは、HCV−1に関して数えた位置1〜191に存在する(HCV−1ゲノムについては、Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455を参照されたい)。このポリペプチドはさらにプロセシングされて、アミノ酸約1〜173を有するHCVポリペプチドを生じる。エンベロープポリペプチドE1およびE2はそれぞれ位置約192〜383および384〜746に存在する。P7ドメインは位置約747〜809に見出される。NS2はタンパク質分解活性を有する膜内在性タンパク質であり、ポリタンパク質の位置約810〜1026に見出される。NS2は単独で、またはNS3(位置約1027〜1657に見出される)と組合せて、NS2−NS3シスル(sissle)結合を切断し、これは次にNS3 N末端を生成して、セリンプロテアーゼおよびRNAヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。位置約1027〜1207に見出されるNS3プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングする働きをする。ヘリカーゼ活性は位置約1193〜1657に見出される。ポリタンパク質成熟の完了は、NS3セリンプロテアーゼによって触媒されるNS3−NS4a接合部における自己触媒的切断によって起こる。その後のNS3が介在するHCVポリタンパク質の切断は、別のポリペプチドのNS3分子によるポリタンパク質切断接合部の認識を伴うことが示される。これらの反応において、NS3はNS3補助因子(位置約1658〜1711に見出されるNS4a)と、2つのタンパク質(位置約1712〜1972に見出されるNS4bおよび位置約1973〜2420に見出されるNS5a)と、RNA依存性RNAポリメラーゼ(位置約2421〜3011に見出されるNS5b)とを解放する。
【0087】
HCVポリタンパク質産物およびそれに由来する免疫原性ポリペプチドの配列は公知である(たとえば、本明細書においてその全体を引用により援用する米国特許第5,350,671号を参照)。たとえば、HCVポリタンパク質に由来するいくつかの一般的および特定的な免疫原性ポリペプチドが記載されている。たとえば、Houghtonら、欧州公開318,216号および388,232号;ChooらScience(1989)244:359−362;KuoらScience(1989)244:362−364;HoughtonらHepatology(1991)14:381−388;ChienらProc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;ChienらJ.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開94/01778号などを参照されたい。これらの出版物は一般的なHCVならびにHCVポリペプチドの免疫学的試薬の製造および使用に対する広範囲の背景を提供する。したがって、簡潔のためにこれらの出版物の開示を本明細書において引用により援用する。
【0088】
あらゆる所望の抗原性HCVポリペプチドを本発明とともに用いることができ、そこにはたとえばHCVのE1および/またはE2エンベロープ糖タンパク質、ならびに非共有または共有相互作用のいずれかによって関連付けられたE1E2複合体が含まれる。こうした複合体は、エピトープを含むE1およびE2の免疫原性断片でできていてもよい。たとえば、E1ポリペプチドの断片は、分子の約5個のアミノ酸からほぼ全長まで、たとえばE1ポリペプチドの6、10、25、50、75、100、125、150、175、185個またはそれ以上のアミノ酸、または記載される数の間のあらゆる整数を含み得る。同様に、E2ポリペプチドの断片は、E2ポリペプチドの6、10、25、50、75、100、150、200、250、300、または350個のアミノ酸、または記載される数の間のあらゆる整数を含み得る。E1およびE2ポリペプチドは、同じかまたは異なるHCV株からのものであってもよい。たとえば、E2の高頻度可変領域に由来するエピトープ、たとえばアミノ酸384〜410または390〜410にわたる領域などがE2ポリペプチドに含まれていてもよい。E2配列またはE1E2複合体に組み込むための特に有効なE2エピトープは、この領域に由来する共通配列、たとえばHCV1型ゲノムのアミノ酸390〜410に対する共通配列などを含むエピトープである。E1およびE2の付加的なエピトープは公知であり、たとえば本明細書においてその全体を引用により援用するChienら、国際公開93/00365号などに記載されている。
【0089】
さらに、E1およびE2ポリペプチドは膜貫通ドメインのすべてまたは一部を失っていてもよい。膜アンカー配列は、ポリペプチドを小胞体に関連付けるために機能する。通常こうしたポリペプチドは、そのタンパク質を発現する生物を培養している生育培地に分泌できる。しかし、国際公開98/50556号に記載されるとおり、こうしたポリペプチドが細胞内でも回収されてもよい。生育培地への分泌は、いくつかの検出技術を用いて容易に定められ、その技術にはたとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動など、およびたとえば1996年2月15日に公開された国際公開96/04301号などに記載されるとおりの免疫沈降アッセイなどの免疫学的技術が含まれる。E1については、一般的にアミノ酸位置約370およびそれ以上(HCV1 E1の番号付けに基づく)によって終結するポリペプチドは、ERによって保持されるために生育培地に分泌されない。E2については、アミノ酸位置約731およびそれ以上(これもHCV1 E2配列の番号付けに基づく)によって終結するポリペプチドは、ERによって保持されるために分泌されない。(たとえば1996年2月15日に公開された国際公開96/04301号を参照。)なお、これらのアミノ酸位置は絶対的なものではなく、ある程度変動することがある。よって本発明は、膜貫通型結合ドメインを保持するE1およびE2ポリペプチドの使用を予期しており、加えて、アミノ酸約369およびそれ以下で終結するE1ポリペプチドおよびアミノ酸約730およびそれ以下で終結するE2ポリペプチドを含む、膜貫通型結合ドメインのすべてまたは一部を失ったポリペプチドも本発明によって表わされることが意図される。さらに、C末端トランケ−ションがN末端に向かって膜貫通ドメインを超えて伸長してもよい。よってたとえば、360などよりも低い位置で起こるE1トランケ−ションと、715などよりも低い位置で起こるE2トランケ−ションとも本発明に包含されている。トランケートされたE1およびE2ポリペプチドが意図される目的に対する機能を残すことだけが必要である。しかし、特に好ましいトランケートされたE1コンストラクトは、アミノ酸約300を超えて伸長していないものである。最も好ましいのは、位置360において終結しているE1コンストラクトである。好ましいトランケートされたE2コンストラクトは、C末端トランケ−ションがアミノ酸位置約715を超えて伸長していないものである。特に好ましいE2トランケ−ションは、アミノ酸715〜730のいずれか、たとえば725などの後ろでトランケートされた分子である。トランケートされた分子が用いられるときは、どちらもトランケートされたE1およびE2分子を用いることが好ましい。
【0090】
E2は複数の種として存在し(Spaeteら、Virol.(1992)188:819−830;Selbyら、J.Virol.(1996)70:5177−5182;Grakouiら、J.Virol.(1993)67:1385−1395;Tomeiら、J.Virol.(1993)67:4017−4026)、E1およびE2ポリペプチドのN末端およびC末端においてクリッピングおよびタンパク質分解が起こることがある。よって本発明において用いるためのE2ポリペプチドは、全長HCV−1ポリタンパク質に関して数えて、HCVポリタンパク質の少なくともアミノ酸405〜661、たとえば400、401、402...から661、たとえば384〜661、384〜715、384〜746、384〜749または384〜809、または384から661〜809の間のあらゆるC末端を含んでいてもよい。同様に、本発明において用いるための好ましいE1ポリペプチドは、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜326、192〜330、192〜333、192〜360、192〜363、192〜383、または192から326〜383の間のあらゆるC末端を含み得る。
【0091】
ElおよびE2ポリペプチドならびにその複合体は、アシアロ糖タンパク質として存在してもよい。こうしたアシアロ糖タンパク質は、たとえば末端糖鎖付加が遮断された細胞の使用によるものなど、当該技術分野において公知の方法によって生成される。これらのタンパク質がこうした細胞中で発現されてGNAレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって単離されるとき、ElおよびE2タンパク質は自発的に凝集する。これらのElE2凝集体を生成するための詳細な方法は、たとえば本明細書においてその全体を引用により援用する米国特許第6,074,852号などに記載されている。たとえば、ElE2複合体は組換えによって、融合タンパク質として、またはたとえば目的とするE1およびE2ポリペプチドをコードするコンストラクトを宿主細胞に同時導入することなどによって、容易に生成される。同時導入はトランスまたはシスのいずれで達成することもでき、すなわち別個のベクターを用いて達成することも、E1およびE2遺伝子の両方を有する単一のベクターを用いて達成することもできる。単一のベクターを用いて行なわれるとき、単一組の調節領域によって両方の遺伝子が駆動されてもよいし、代替的には、遺伝子はベクター上の別個の調節領域によって駆動される別個の発現カセット中に存在してもよい。発現に続いて、E1およびE2タンパク質は自発的に結合する。代替的には、精製または半精製された形の、別々に生成された別個のタンパク質を混ぜ合せることによって複合体を形成してもよいし、タンパク質が分泌されるときには、タンパク質を発現する宿主細胞が培養されている培養培地を混合することによって複合体を形成してもよい。最後に、本発明のE1E2複合体は、所望の部分のE1を所望の部分のE2に融合させた融合タンパク質として発現されてもよい。
【0092】
さらに、E1E2複合体は、前述のとおりのクリッピングおよびタンパク質分解性の切断によって、分子のヘテロ混合物として存在することがある。よってE1E2複合体を含む組成物は複数種のE1E2を含んでもよく、たとえばアミノ酸746で終結するE1E2(E1E2746)、アミノ酸809で終結するE1E2(E1E2809)、または前述のその他のさまざまなE1およびE2分子のいずれか、たとえば1〜20アミノ酸のN末端トランケ−ションを有するE2分子、たとえばアミノ酸387、アミノ酸402、アミノ酸403などから始まるE2種などを含んでもよい。
【0093】
ElE2複合体は組換えによって、融合タンパク質として、またはたとえば目的とするE1およびE2ポリペプチドをコードするコンストラクトを宿主細胞に同時導入することなどによって、容易に生成される。同時導入はトランスまたはシスのいずれで達成することもでき、すなわち別個のベクターを用いて達成することも、E1およびE2遺伝子の両方を有する単一のベクターを用いて達成することもできる。単一のベクターを用いて行なわれるとき、単一組の調節領域によって両方の遺伝子が駆動されてもよいし、代替的には、遺伝子はベクター上の別個の調節領域によって駆動される別個の発現カセット中に存在してもよい。発現に続いて、E1およびE2タンパク質は自発的に結合する。代替的には、精製または半精製された形の、別々に生成された別個のタンパク質を混ぜ合せることによって複合体を形成してもよいし、タンパク質が分泌されるときには、そのタンパク質を発現する宿主細胞が培養されている培養培地を混合することによって複合体を形成してもよい。最後に、本発明のE1E2複合体は、所望の部分のE1を所望の部分のE2に融合させた融合タンパク質として発現されてもよい。
【0094】
培地に分泌される全長またはトランケートされたE1およびE2タンパク質、ならびに細胞内で生成されたトランケートされたタンパク質からE1E2複合体を生成するための方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、こうした複合体は、以下に記載されるとおりに組換えによって生成されてもよい:米国特許第6,121,020号;Ralstonら、J.Virol.(1993)67:6753−6761,Grakouiら、J.Virol.(1993)67:1385−1395;およびLanfordら、Virology(1993)197:225−235。
【0095】
本発明においてその他のHCVポリペプチドを用いてもよい。たとえばコア領域に由来するHCVポリペプチド、たとえばアミノ酸1〜191;アミノ酸10〜53;アミノ酸10〜45;アミノ酸67〜88;アミノ酸86〜100;81〜130;アミノ酸121〜135;アミノ酸120〜130;アミノ酸121〜170の間に見出される領域に由来するポリペプチド、ならびにたとえば本明細書においてその開示の全体を引用により援用する以下の文献などにおいて同定されるコアエピトープのいずれかを対象の組成物および方法とともに使用できる:Houghtonら、米国特許第5,350,671号;ChienらProc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;ChienらJ.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開94/01778号;および米国特許第6,150,087号。
【0096】
加えて、ウイルスの非構造(nonstructural)領域に由来するポリペプチドも本発明において使用できる。HCVポリタンパク質のNS3/4a領域が報告されており、このタンパク質のアミノ酸配列および全体構造は、YaoらStructure(1999年11月)7:1353−1363に開示されている。本明細書においてその全体を引用により援用するDasmahapatraらの米国特許第5,843,752号も参照されたい。上記に示すとおり、対象製剤には天然配列または免疫原性類似体のいずれが用いられてもよい。Dasmahapatraらの米国特許第5,843,752号およびZhangらの米国特許第5,990,276号は、どちらもNS3/4aの類似体およびその作成方法を記載している。
【0097】
さらに、対象組成物および方法において用いるためのポリペプチドは、HCVポリタンパク質のNS3領域に由来していてもよい。いくつかのこうしたポリペプチドが公知であり、そこにはc33cおよびc100領域に由来するポリペプチド、ならびにc25などのNS3エピトープを含む融合タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。これらおよびその他のNS3ポリペプチドは本組成物において有用であり、当該技術分野において公知であり、たとえば本明細書においてその開示の全体を引用により援用するHoughtonら、米国特許第5,350,671号;ChienらProc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011−10015;ChienらJ.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chienら、国際公開93/00365号;Chien,D.Y.,国際公開94/01778号;および米国特許第6,150,087号などに記載されている。
【0098】
さらに、国際公開97/44469号に記載されるとおりの複数のエピトープ融合抗原(multiple epitope fusion antigens)(「MEFA」と名付けられる)が本発明において用いられてもよい。こうしたMEFAは、さまざまなウイルス領域の2つまたはそれ以上に由来する複数のエピトープを含む。エピトープは好ましくは2つ以上のHCV株からのものであることによって、単一のワクチンにおいてHCVの複数の株に対する保護の付加的能力を与える。
【0099】
なお、利便性のために、さまざまなHCV領域は一般的に、HCV−1aのゲノムによってコードされるポリタンパク質に関するアミノ酸数に関して定義されており、これはChooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451に記載されるとおりであり、ここではイニシエータのメチオニンが位置1に指定される。しかし、本発明とともに用いるための抗原は、HCV−1a配列に由来するものに限定されない。HCVのあらゆる株または単離体が、本発明とともに用いるための抗原配列を提供するための基礎となることができる。これに関して、2つの単離体からの配列を、それらの配列が最大のアライメントになるような態様で整列させることによって、別のHCV単離体中の対応する領域を容易に定めることができる。
【0100】
HCVのさまざまな株および単離体が当該技術分野において公知であり、これらはヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化によって互いに異なっている。たとえば、単離体HCV J1.1は、Kubo et al(1989)Japan.Nucl.Acids Res.17:10367−10372;Takeuchiら(1990)Gene 91:287−291;Takeuchiら(1990)J.Gen.Virol.71:3027−3033;およびTakeuchiら(1990)Nucl.Acids Res.18:4626に記載されている。2つの独立した単離体HCV−JおよびBKの完全なコード配列は、それぞれKatoら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524−9528およびTakamizawaら、(1991)J.Virol.65:1105−1113に記載されている。HCV−1単離体は、Chooら(1990)Brit.Med.Bull.46:423−441;Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451−2455およびHanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1711−1715に記載されている。HCV単離体HC−J1およびHC−J4は、Okamotoら(1991)Japan J.Exp.Med.60:167−177に記載されている。HCV単離体のHCT18.about.、HCT23、Th、HCT27、EC1およびEC10は、Weinerら(1991)Virol.180:842−848に記載されている。HCV単離体のPt−1、HCV−K1およびHCV−K2は、Enomotoら(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170:1021−1025に記載されている。HCV単離体A、C、DおよびEは、Tsukiyama−Koharaら(1991)Virus Genes 5:243−254に記載されている。本発明の組成物および方法において用いるためのHCVポリペプチドは、HCVの上記に引用された株のいずれかから得ることも、感染患者の組織または体液から単離された新たに発見された単離体から得ることもできる。
【0101】
本発明において有用なその他の抗原は、HIVに由来するものである。HIVゲノムは、Gag(p55gag)、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu、Envおよび/またはNefとして公知の領域を含む。これらの領域のいずれかからのHIV抗原、ならびにたとえばHIVサブタイプBおよびHIVサブタイプCなどのさまざまなサブタイプのいずれか、ならびにさまざまな単離体のいずれかからのHIV抗原を本発明とともに使用できる。通常の当業者には、本開示の教示に鑑みて、他のHIV株または変異体(例、単離体HIVIIIb、HIVSF2、HIV−1SF162、HIV−1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV−1CM235、HIV−1US4、多様なサブタイプからのその他のHIV−1株(例、サブタイプAからGおよびO)、HIV−2株および多様なサブタイプ、ならびにサル免疫不全ウイルス(SIV)(たとえば以下を参照:Virology,第3版(W.K.Joklik編、1988);Fundamental Virology,第2版(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編、1991);Virology,第3版(Fields,B N,D M Knipe,P M Howley,編集,1996,Lippincott−Raven,Philadelphia,Pa.;これらおよびその他の関連ウイルスの説明について)における対応する領域を、たとえば配列比較プログラム(例、BLASTおよび本明細書に記載されるその他のプログラム)または構造的特徴の識別およびアライメント(例、さまざまな領域を識別できる、本明細書に記載される「ALB」プログラムなどのプログラム)などを用いて、どのように定めるかが容易に明らかになる。
【0102】
HIVのエンベロープタンパク質は、約160kdの糖タンパク質(glycoprotein)(gp160)である。宿主細胞のウイルス感染の際に、gp160は宿主細胞プロテアーゼによって切断されて、gp120および膜内在性タンパク質gp41を形成する。gp41部分はビリオンの膜二重層において係留されているが、gp120セグメントは周囲環境に突出している。gp120およびgp41はより共有結合的に関連しており、ビリオンおよび感染細胞の表面から遊離gp120が放出され得る。gp120ポリペプチドは、宿主細胞への進入を仲介する助けをする。最近の研究から、CD4がgp120に結合することによって、Envの立体構造変化が誘導されて、共受容体(例、ケモカイン受容体)への結合およびそれに続くウイルスの細胞への進入が可能になることが示された。(Wyatt,R.,et al.(1998)Nature 393:705−711;Kwong,P.,et al.(1998)Nature 393:648−659。)CD4は、gp120の外側ドメインと、内側ドメインと、架橋シートとの界面に形成される窪みに結合される。
【0103】
所望の領域が同定されてから、さまざまなHIV抗原を得るための組換え法は当該技術分野において周知である。本明細書においてその全体を引用により援用する米国特許第5,614,612号も参照されたい。
【0104】
さらに、これらのHIV領域のいずれかの修正された配列、たとえば修正されたgp120およびp55gagなどを本発明において用いることができる。最適なコドン使用に対して配列を修正することによって、ヒトのコドンを模して毒性を低減できる。こうした修正配列は当該技術分野において公知であり、その配列およびその生成法は、すべて本明細書においてその全体を引用により援用する、共有される国際公開00/39304号および国際公開00/39302号ならびに国際公開98/34640号に詳細に記載されている。
【0105】
本発明は、バクテリア性髄膜炎および敗血症の原因物質であるN.meningitidisなどのNeisseria種に由来する抗原に対しても有用である。髄膜炎菌(Meningococci)は、莢膜および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学的な群に分けられる。現在認識されている血清群は、A、B、C、W−135、X、Y、Zおよび29Eを含む。本発明の目的に対して、髄膜炎菌抗原はさまざまな公知の血清群のいずれに由来していてもよい。これらの群のうち、A、B、C、W−135およびYを含むいくつかから、血清群特異性の原因となる多糖が精製されている。血清群A、C、YおよびW135によってもたらされる髄膜炎菌性疾患に対する効果的な莢膜多糖ベースのワクチンが開発されており、これらのワクチン抗原のいずれも本組成物および方法において使用できる。たとえば、本発明において使用できるさまざまな髄膜炎菌タンパク質抗原の説明については、すべて本明細書においてその全体を引用により援用する国際公開96/29412号、国際公開96/14086号、国際公開99/57280号、国際公開00/22430号、国際公開99/24578号、国際公開99/36544、ならびにTettelinら(2000)Science 287:1809−1815およびPizzaら(2000)Science 287:1816−1820を参照されたい。加えて、たとえばN.meningitidis血清群A、C、W135および/またはYからのものなどの糖抗原、たとえばCostantinoら(1992)Vaccine 10:691−698およびCostantinoら(1999)Vaccine 17:1251−1263に記載されるものなども本発明において使用できる。その他の有用なNeisseria抗原には、N.gonorrhoreaに由来するもの、たとえば国際公開99/57280号、国際公開99/24578号および国際公開99/36544号に記載されるものなどが含まれる。
【0106】
たとえば、N.meningitidis血清群B(本明細書において「MenB」と名付ける)は、米国および欧州に居住する幼児および子供のバクテリア性髄膜炎の原因として大きなパーセンテージを占める。したがって、MenBに由来する抗原、たとえばMenBゲノムのさまざまなオープンリーディングフレーム(open reading frame:ORF)によって発現される抗原のいずれかなどは、本組成物および方法とともに特に有用である。たとえば国際公開99/57280号を参照されたい。こうした抗原の例には、MenBタンパク質961および287が含まれる。本発明において使用するためのその他の髄膜炎菌性抗原には、莢膜MenB多糖(polysaccharide)の誘導体(本明細書において「MenB PS誘導体」と名付ける)が含まれる。MenB PS誘導体の例は、欧州公開504,202B号および米国特許第4,727,136号に記載されている。米国特許第6,030,619号に記載されるような、MenB PSの一意のエピトープの分子擬態も有用である。加えて、たとえば国際出願PCT/IB01/00166号、Bjuneら(1991)Lancet 338:1093−1096、Fukasawaら(1999)Vaccine 17:2951−2958およびRosenquistら(1998)Dev.Biol.Stand.92:323−333に記載されるものなどの、MenBからの外膜小胞調製物。上記の文献はすべて、本明細書においてその全体を引用により援用する。
【0107】
MenBのMC58株の完全なゲノム配列が報告されている。Tettelinら、Science(2000)287:1809。全ゲノム配列決定によって、血清殺菌抗体応答を誘発したいくつかのタンパク質が同定された。これらのタンパク質の多くは、Neisseria meningitidisの間で高度に保存された配列を有する。Pizzaら、Science(2000)287:1816。したがって、こうした抗原も本発明において使用できる。
【0108】
上述のとおり、いくつかの実施形態において、抗原は、O’Haganらに対する米国特許第6,534,064号およびO’Haganらに対する公開番号US2005/0107322号に記載されるようなタンパク質粒子の形で提供されてもよい。こうした粒子は、上述のものおよびその他から選択される好適な抗原から形成されてもよい。
【0109】
たとえば、いくつかの実施形態において、抗原は以下のステップを含むプロセスによって生成される微粒子である:(a)水溶液から粒子を形成するステップ;(b)安定化処理によって抗原粒子を安定化するステップ;および(c)水溶液から抗原粒子を回収するステップ。
【0110】
いくつかの実施形態において、抗原微粒子を生成するプロセスは、溶媒蒸発技術を含む。溶媒蒸発技術は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。
【0111】
いくつかの実施形態において、抗原微粒子を生成するプロセスは沈降剤の使用に基づくものであり、それはたとえば抗原の水溶液に沈降剤を加えて、得られた混合物を撹拌して粒子を形成することなどによるものである。沈降剤の例は、油、炭化水素またはコアセルベーション剤の1つまたはそれ以上を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態において、このプロセスはさらに酸を含み得る。酸の例は、酢酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸、塩酸または乳酸を含むが、それに限定されない。
【0112】
たとえば、熱処理または化学的架橋剤による処理の1つまたはそれ以上などを含み得る安定化処理が行なわれてもよい。熱処理または化学的架橋のプロセスは公知である。たとえば、O’Haganらに対する米国特許第6,534,064号およびO’Haganらに対する公開番号US2005/0107322号を参照されたい。
【0113】
1つまたはそれ以上の生物に由来する抗原の組合せを便利に用いて、単一のワクチンにおいて複数の病原体に対する免疫を誘発できる。複数病原体ワクチン中の抗原の例は、MenCおよびHibに由来するバクテリア表面オリゴ糖の組合せが、たとえばCRM197として公知のジフテリア毒素の非毒性変異体などの、バクテリア毒素に由来する非毒性変異体担体に結合体化されたものである。この結合体はバクテリア性髄膜炎の予防に対して有用であり、1996年5月17日に公開された国際公開96/14086号に記載されている。
【0114】
F.追加の構成要素
本発明の組成物は、さまざまな追加の構成要素を任意に含む。こうした任意の追加構成要素は、以下に記載されるものなどの医薬的に許容できる賦形剤および補助的な免疫学的アジュバントその他を含む。
【0115】
上に示すとおり、微粒子が固体微粒子であるとき、任意の追加構成要素は、たとえば以下のとおりであってもよい:(a)微粒子内に確立される、たとえば微粒子の別個の集団を含む微粒子内に封入、被包、溶解または分散される、(b)微粒子に付着される、たとえば微粒子の別個の集団を含む微粒子の表面に吸着もしくは結合体化される、または(c)別様でさまざまな程度に微粒子に関連付けられる、たとえば液体分散中で微粒子と混合される、固体組成物中で微粒子と混合される(例、微粒子とともに凍結乾燥される)など。
【0116】
微粒子が液体微粒子(例、水中油型エマルションにおける油小滴など)であるとき、任意の追加構成要素は、独立にたとえば以下のとおりであってもよい:エマルションの油相内に溶解または分散される(油小滴の別個の集団を含む)、エマルションの水相内に溶解または分散される、および/またはエマルションの水相および油相の間の界面に配置される。
【0117】
任意の追加構成要素は補助的な免疫学的アジュバントを含み、この免疫学的アジュバントは免疫原性組成物の効果をさらに高めるために用いられてもよい。たとえば、こうした免疫学的アジュバントは、たとえば同じ組成物中で(例、先行する段落に記載されるとおり)、または別個の組成物中で、本発明の免疫原性組成物と同時に投与されてもよい。こうしたアジュバントは、本発明の免疫原性組成物の前または後に投与されてもよい。
【0118】
補助的な免疫学的アジュバントは、以下を含むがこれらに限定されない:(1)サポニンアジュバント、たとえばQuil AまたはQS21(例、Stimulon(Cambridge Bioscience、Worcester、MA))が用いられてもよいし、それから生成されるISCOM(免疫賦活性複合体(immunostimulating complexes))であってもよく、このICOMSは付加的な界面活性剤を欠いていてもよい、例、国際公開00/07621号;(2)Complete Freunds Adjuvant(CFA)およびIncomplete Freunds Adjuvant(IFA);(3)サイトカイン、たとえばインターロイキン(例、IL−I、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(国際公開99/44636号)など)、インターフェロン(例、ガンマインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony stimulating factor:M−CSF)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor:TNF)など;(4)リン脂質アジュバントであって、リポ多糖およびリポ糖リン酸塩アジュバント、たとえばモノホスホリルリピドA(monophosphoryl lipid A:MPL)、3−O−脱アシルMPL(3−O−deacylated MPL:3dMPL)などを含む、例、GB−2220221号、EP−A−0689454号、任意には、肺炎球菌の糖とともに用いられるときにはミョウバンが実質的に不在である、例、国際公開00/56358号;ならびに、たとえば米国特許第6,355,257号に記載されるものなどのアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物、およびたとえば公開番号US2004/0202669号に記載されるものなどの直鎖アルカン基を有するリン脂質;(5)CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活性オリゴヌクレオチド(
【0119】
【化4】

国際特許出願国際公開96/02555号、国際公開98/16247号、国際公開98/18810号、国際公開98/40100号、国際公開98/55495号、国際公開98/37919号および国際公開98/52581号)、すなわち少なくとも1つのCGジヌクレオチド(シトシンヌクレオチドに続くグアノシンヌクレオチド)を含有し、シトシンの代わりに5つのメチルシトシンが任意に用いられる;(6)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例、国際公開99/52549号;(7)オクトキシノールと組合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(国際公開01/21207号)またはオクトキシノールなどの少なくとも1つの付加的な非イオン性界面活性剤と組合せたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(国際公開01/21152号);(8)サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド(例、CpGオリゴヌクレオチド)(国際公開00/62800号);(9)サポニンおよび水中油型エマルション、例、国際公開99/11241号;(10)サポニン(例、QS21)+3dMPL+IL−12(任意には+ステロール)例、国際公開98/57659号;(11)バクテリアのADPリボシル化毒素、たとえばコレラ毒素(cholera toxin:CT)、百日咳毒素(pertussis toxin:PT)またはE. coliの熱不安定性毒素(heat−labile toxin:LT)などの無毒化変異体、特にLT−K63(位置63における野生型アミノ酸がリジンに置換されている)、LT−R72(位置72における野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている)、CT−S109(位置109における野生型アミノ酸がセリンに置換されている)、およびPT−K9/G129(位置9における野生型アミノ酸がリジンに置換されており、位置129がグリシンに置換されている)(たとえば国際公開093/13202号および国際公開092/19265号などを参照);(12)アミノアルキルグルコサミニド4リン酸塩(aminoalkyl glucosaminide 4−phosphates:AGP’s)、例、Johnson,D.A.et al.;Bioorg.Med.Chem.Lett,1999年8月2日;9(15):2273−8を参照;(13)リポ多糖擬態(モノホスホリルリピドA擬態を含む)、たとえばHawkins,L.D.et al;J.Pharmacol.Exp.Ther.,2002年2月;300(2):655−61および米国特許第6,290,973号に記載される非糖リン脂質(例、二糖を欠く簡略化したリピドA類似体)など;(14)天然または合成二本鎖RNA(double−stranded RNA)(「dsRNA」)を含むアジュバントであって、一般的に断続的なリボグアニル酸−リボシチジル酸(riboguanylic acid−ribocytidylic acid)([rG−rC])およびリボアデニル酸−ポリリボウリジル酸(riboadenylic acid−polribouridylic acid)([rA−rU])塩基対で構成される;さらなる情報については、たとえば共有される国際出願PCT/US02/30423号を参照;(15)ムラミルペプチド、たとえばN−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(N−acetyl−muramyl−L−threonyl−D−isoglutamine:thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(N−acteyl−normuramyl−L−alanyl−D−isogluatme:nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(N−acetylmuramyl−L−alanyl−D−isogluatminyl−L−alanine−2−(1’−2’−dipalmitoyl−sn−glycero−3−huydroxyphosphoryloxy)−ethylamine:MTP−PE)など;(16)チオセミカルバゾン化合物、たとえば国際公開04/60308号に記載されるものなど;(17)トリプタントリン化合物、たとえば国際公開04/64759号に記載されるものなど;(18)ポリホスファゼン(PCPP)製剤、たとえばAndrianovら(1998)Biomaterials 19(1−3):109−115およびPayneら(1998)Adv.Drug Del.Rev.31(3):185−196などに記載されるものなど;(19)リピドA誘導体であって、OM−174などのEscherichia coliからのリピドAの誘導体を含み、これはたとえばMeraldiら(2003)Vaccine 21:2485−2491およびPajakら(2003)Vaccine 21:836−842などに記載される;ならびに(20)組成物の有効性を高める免疫賦活剤として作用するその他の物質。
【0120】
アジュバントの付加的な例については、Vaccine Design,The Subunit and the Adjuvant Approach,Powell,M.F.およびNewman,M.J.編,Plenum Press,1995)を参照されたい。
【0121】
G.製剤および投与
上記に示すとおり、本発明の組成物の抗原、イミダゾキノリン、またはさまざまな補助的構成要素は、たとえば微粒子製造プロセスの間にこれらの種を導入することによって、固体または液体微粒子内に確立(例、封入、被包、溶解または分散)されてもよい。抗原、イミダゾキノリン、またはさまざまな補助的構成要素は、たとえばこれらの種を予め形成した微粒子に導入することによって、微粒子に付着(例、結合体化または吸着)されるか、または別様で微粒子に関連付けられてもよい。吸着およびその他の関連付けは、これらの種と微粒子とを単純に混合することによって確立されてもよい。こうした種の微粒子への結合体化は、カルボジイミド結合および溶解性プロファイルを含む、当該技術分野において公知のさまざまな結合化学に基づいていてもよい。いくつかの実施形態において、抗原、イミダゾキノリン、またはさまざまな補助的構成要素は、たとえば液体分散中で微粒子と混合されたり、固体組成物中で微粒子と混合されたり(例、微粒子とともに凍結乾燥される)などすることによって、別様でさまざまな程度に微粒子に関連付けられる。
【0122】
本発明の組成物は通常、1つまたはそれ以上の医薬的に許容できる賦形剤を含む。たとえば、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの医薬的に許容できる媒体が用いられてもよい。たとえば湿潤剤または乳化剤、浸透圧剤、生物学的緩衝物質など、その他の賦形剤が存在してもよい。生物学的緩衝液は実質的に、薬理的に許容でき、かつ製剤に所望のpHすなわち生理的範囲のpHを提供するようなあらゆる溶液であり得る。その例には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびヒスチジン緩衝液、ならびにリン酸緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、Hank’s緩衝食塩水などを含む食塩水緩衝液の組合せが含まれる。浸透圧剤の例は、塩、砂糖などを含む。
【0123】
最終的な剤形に依存して、当該技術分野において公知のその他の賦形剤も導入されてもよく、そこには結合剤、崩壊剤、充填剤(希釈剤)、潤滑剤、グライダント(流れ促進剤)、圧縮補助剤、保存剤、懸濁/分散剤、膜形成剤/コーティングなどが含まれる。
【0124】
調製後、本発明の組成物は、たとえば注射などによって非経口的に投与され得る。組成物は、皮下、腹膜内、静脈内または筋内のいずれかに注射され得る。その他の投与モードは、経口および肺投与、座薬、粘膜および経真皮適用を含む。投薬処置は単一投与計画であっても、複数投与計画であってもよい。複数投与計画においては、1〜10個の別個の用量によって一次コースのワクチン接種が行なわれた後に、免疫応答を維持および/または強化するために選択される時間間隔にて他の用量が与えられてもよく、たとえば1〜4ヶ月にて第2の用量が与えられ、必要であれば数ヶ月後にその後の用量が与えられてもよい。投与計画は少なくとも部分的に、対象の要求することによって決定され、医師の判断に依存して決まる。さらに、疾患の予防が望まれるとき、一般的にワクチンは目的とする病原体による一次感染よりも前、または腫瘍細胞の出現よりも前に投与される。治療的処置が望まれるとき、一般的にワクチンは一次感染または腫瘍細胞の出現の後に投与される。
【0125】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物を部位特異的標的送達に用いることができる。たとえば、肺、肝臓、脾臓、血液循環または骨髄を標的とするために組成物の静脈内投与を用いることができる。
【実施例】
【0126】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は例示的な目的のためにのみ提供され、いかなる態様でも本発明の範囲を限定することは意図されない。
【0127】
使用される数値(例、量、温度など)に関する正確さを確実にするために努力したが、ある程度の実験誤差および偏差は当然許されるべきである。
【0128】
(実施例1)
製剤調製。
【0129】
この実施例に対する材料は次のとおりである:(1)RG503 PLG、ラクチド/グリコリド共重合体比50/50を有し、Boehringer Ingelheim,USAより得られる、(2)RG502H PLG、ラクチド/グリコリド共重合体比50/50を有し、かつ遊離カルボキシル末端基を有し、Boehringer Ingelheim,USAより得られる、(3)ジオクチルスルホサクシネート(DSS)、Sigma Chemicals,St.Louis,MO,USAより得られる、(4)イミダゾキノリン090(Valianteらに対する国際公開2006/031878号およびSuttonらに対する国際公開2007/109810号に合成が記載される)。
【0130】
溶媒蒸発技術を用いて、被包されたイミダゾキノリン090を有するアニオン性PLG微粒子を調製した。簡単には、IKAホモジナイザーを用いて、4mLの塩化メチレン中の15%w/vポリマー溶液(RG503またはRG502H)を1.0mLのPBS1×とともに高速で乳化することによって、微粒子を調製した。イミダゾキノリン090は乳化前に油相に分散されており、PLGに関して1%w/wに等しい量で微粒子製剤に用いられた。次いでこの一次エマルションを、DSS(0.5%w/w)を含有する32mLの蒸留水に加え、Omniホモジナイザーを用いて均質化した。その結果w/o/wエマルションが形成され、このエマルションを室温にて12時間撹拌することによって塩化メチレンを蒸発させた。
【0131】
上記の被包されたイミダゾキノリン090を有するPLG微粒子に抗原を吸着させることによって、製剤を形成した。抗原であるMenB287タンパク質は、実験用ロッカー(lab rocker)上で4℃にて一晩、1%w/wPLGの量で粒子に吸着させた。糖(再構成体積の4.5%のマンニトールおよび1.5%のショ糖)を加え、次いで製剤の一定分量を小さなガラスバイアルに入れて凍結乾燥した。
【0132】
凍結乾燥した抗原吸着PLG微粒子を次の手順で形成した:溶媒蒸発技術を用いてアニオン性PLG微粒子を調製した。簡単には、IKAホモジナイザーを用いて、4mLの塩化メチレン中の6%w/vポリマー溶液(RG503)を1.0mLのPBS1×とともに高速で乳化することによって、微粒子を調製した。次いでこの一次エマルションを、DSS(0.05%w/w)を含有する32mLの蒸留水に加え、Omniホモジナイザーを用いて均質化した。その結果w/o/wエマルションが形成され、このエマルションを室温にて12時間撹拌することによって塩化メチレンを蒸発させた。抗原であるMenB287を、実験用ロッカー上で4℃にて一晩、1%w/wPLGの量で上記アニオン性PLG微粒子に吸着させることによって製剤を形成した。糖(再構成体積の4.5%のマンニトールおよび1.5%のショ糖)を加え、次いで製剤の一定分量を小さなガラスバイアルに入れて凍結乾燥した。
【0133】
前の段落に従って、再構成した凍結乾燥抗原吸着PLG微粒子にイミダゾキノリン090溶液(100μg/ml)を加えることによって、可溶性イミダゾキノリン090製剤を形成した。10%w/wPLGの量に可溶性イミダゾキノリン090を加えた。抗原用量は1μgであった。
【0134】
MenB287タンパク質抗原を、実験用ロッカー上で4℃にて一晩、1%w/wPLGの量でイミダゾキノリン090吸着PLG微粒子に吸着させることによって、共凍結乾燥されたイミダゾキノリン090製剤を形成した。イミダゾキノリン090吸着PLG微粒子は、上述のとおり形成されたアニオン性PLG微粒子にイミダゾキノリン090を吸着させることによって形成され、これはイミダゾキノリン090の溶液(100ug/ml)をPLG微粒子(1μgの抗原を含有する群に対して10%w/wPLG)に加えることによって行なわれ、吸着は実験用ロッカー上で4℃にて一晩行なわれた。糖(再構成体積の4.5%のマンニトールおよび1.5%のショ糖)を加え、次いで製剤の一定分量を小さなガラスバイアルに入れて凍結乾燥した。
【0135】
(実施例2)
インビトロ放出プロファイル。
【0136】
次の手順によってインビトロ放出を測定した:上記イミダゾキノリン090含有製剤の各々のバイアルを室温にてロッカー上に保持した(凍結乾燥した製剤を水中に再構成した後)。0、7日、14日、28日および42日の時間にサンプルを回収して遠心分離した。RP−HPLCによって上清中でイミダゾキノリン090を測定した。
【0137】
結果を図1に示す。図1から分かるとおり、可溶性製剤はイミダゾキノリン090の即時放出を行ない、共凍結乾燥したイミダゾキノリン090製剤からの放出は本質的に即時的であり、被包されたイミダゾキノリン090(RG502Hを使用)は28日までに本質的にすべて放出され、被包されたイミダゾキノリン090(RG503を使用)のかなりの量が42日後にも放出されずに残った。
【0138】
(実施例3)
インビボ研究。
【0139】
下記の表1における群1「PLG/287」に対して、実施例1と同様に調製した、動物当り0.1mgのPLGおよび1μgの吸着287抗原を含有するPLG/287バイアルを、免疫化のときに注射用水(Water for Injection)で再構成した。
【0140】
下記の表1における群2「PLG/287+可溶性090」に対して、MenB287(実施例1と同様に調製した、動物当り0.1mgのPLGに吸着した1μgの287)を含有するバイアルを注射用水で再構成し、免疫化のときに可溶性イミダゾキノリン090を加えた(動物当り10μg)。
【0141】
下記の表1における群3「PLG/共凍結乾燥090/287」に対して、実施例1と同様に調製した、PLG(動物当り0.1mg)ならびに共凍結乾燥した吸着イミダゾキノリン090(動物当り10μg)および吸着MenB287(動物当り1μg)を含有するバイアルを、免疫化のときに注射用水で再構成した。
【0142】
下記の表1における群4「RG503PLG/090被包/287」に対して、実施例1と同様に調製した、PLG RG503(動物当り0.1mg)と被包イミダゾキノリン090(動物当り10μg)と吸着MenB287(動物当り1μg)とを含有するバイアルを、免疫化のときに注射用水で再構成した。
【0143】
下記の表1における群4「RG502H/090被包/287」に対して、実施例1と同様に調製した、PLG RG502H(動物当り0.1mg)と被包イミダゾキノリン090(動物当り10μg)と吸着MenB287(動物当り1μg)とを含有するバイアルを、免疫化のときに注射用水で再構成した。
【0144】
すべての群に対して、10匹のメスのCD−1マウスの群に0、21日および35日にサンプルを筋肉内注射した。39日および56日にSingh,M.et al.(2004)J.Pharm.Sci.93(2):273−282に記載されるとおりに血清ELISA力価を分析し、56日にPizza,M.et al.(2000)Science 287(5459):1816−1820に記載されるとおりに血清殺菌活性(serum bactericidal activity:SBA)を分析した。SBA分析に用いたMenBの株は2996である。
【0145】
結果を下の表1に示す。表から分かるとおり、イミダゾキノリン090をRG503PLGに封入する(群4)ことによって、吸着MenB287単独(群1)および吸着MenB287と可溶性イミダゾキノリン090(群2)に比べて抗体力価(IgG)が約2倍、血清殺菌力価(SBA)が4倍高くなった。イミダゾキノリン090のRG502H PLGへの封入(群5)は、吸着MenB287単独(群1)および吸着MenB287と可溶性イミダゾキノリン090(群2)にもっと類似していた。共凍結乾燥製剤(群3)は、吸着MenB287単独(群1)および吸着MenB287と可溶性イミダゾキノリン090(群2)に類似していたが、SBA力価は減少した。
【0146】
【表1】

よって、新規の組成物ならびにその使用および作成のための方法が開示される。本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、さまざまな変更が行なわれてもよく、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく同等物が置換されてもよいことが当業者に理解されるべきである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫原性組成物であって、(a)第1の抗原と、(b)少なくとも第1および第2のアジュバントと、(c)医薬的に許容できる賦形剤とを含み、該第1のアジュバントは微粒子を含み、該第2のアジュバントはイミダゾキノリン090を含み、該組成物は脊椎動物対象に投与されるときに免疫応答を誘発する、免疫原性組成物。
【請求項2】
前記第1のアジュバントは前記組成物の少なくとも50wt%(乾燥ベース)を構成する、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
前記微粒子は生分解性ポリマーを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
前記生分解性ポリマーはポリヒドロキシ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
前記生分解性ポリマーは、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)、およびその組合せから選択されるポリ(α−ヒドロキシ酸)を含む、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
前記微粒子は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤から選択される界面活性剤を含む、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記微粒子は沈降プロセスによって形成される、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
前記微粒子は溶媒蒸発プロセスによって形成される、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
前記微粒子はL−チロシンを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
前記微粒子はリン酸カルシウムを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
前記微粒子はアルミニウム塩を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
前記微粒子は代謝可能な油を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
前記代謝可能な油はテルペノイドである、請求項12に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
前記代謝可能な油はスクアレンである、請求項12に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
前記免疫原性組成物はMF59を含む、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項16】
前記第2のアジュバントは、前記微粒子を形成する材料に関して5%w/wから20%w/wを構成する、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
前記第2のアジュバントは前記微粒子内に確立される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項18】
前記第2のアジュバントは前記微粒子に吸着される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
前記第2のアジュバントは前記微粒子と混合される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
前記第1の抗原は、前記微粒子を形成する材料に関して0.5%w/wから10.0w/wを構成する、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
前記第1の抗原は前記微粒子内に確立される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項22】
前記第1の抗原は前記微粒子に吸着される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項23】
前記第1の抗原は前記微粒子と混合される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項24】
前記第1の抗原はポリペプチド含有抗原を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項25】
前記第1の抗原は多糖含有抗原を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項26】
前記第1の抗原は結合体抗原を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項27】
前記第1の抗原はポリヌクレオチド含有抗原を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項28】
前記第1の抗原は微粒子の形である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項29】
前記第1の抗原は腫瘍細胞由来の抗原である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項30】
前記第1の抗原は病原性生物由来の抗原である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項31】
前記病原性生物は、ウイルス、バクテリア、真菌および寄生体から選択される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項32】
前記病原性生物は、肝炎ウイルス、水痘、ポリオウイルス、麻疹、耳下腺炎、風疹、インフルエンザウイルス、Neisseria meningitidis、百日咳、Haemophilus influenzae b型、HIV、単純ヘルペスウイルス2型、百日咳、ジフテリア、破傷風、H.pylori、およびStreptococcus pneumoniaeから選択される、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項33】
前記病原性生物は、HIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、髄膜炎B、Haemophilus influenza b型、およびインフルエンザAウイルスから選択される、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項34】
前記抗原は、死滅または弱毒化した病原性生物を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項35】
前記第1および第2のアジュバントとは別の第3のアジュバントをさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項36】
前記第1の抗原とは別の第2の抗原をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項37】
前記免疫原性組成物は注射可能な組成物である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項38】
前記組成物は脊椎動物対象における細胞性免疫応答を誘発し、前記第1の抗原は腫瘍、ウイルス、バクテリア、真菌、および寄生体からなる群より選択される実体に由来する、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項39】
前記脊椎動物対象はヒトである、請求項38に記載の免疫原性組成物。
【請求項40】
前記細胞性免疫応答は細胞障害性Tリンパ球(CTL)応答である、請求項38に記載の免疫原性組成物。
【請求項41】
請求項3に記載の微粒子組成物を生成する方法であって、(a)水と、有機溶媒と、生分解性ポリマーと、第2のアジュバントとを含むエマルションを提供するステップと、(b)該エマルションから該有機溶媒を除去して微粒子を形成するステップとを含み、該第1の抗原は該微粒子に吸着されるか、該微粒子内に確立されるか、または該微粒子と混合される、方法。
【請求項42】
第1の水相は前記第1の抗原をさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
前記第1の抗原は前記微粒子に吸着される、請求項41に記載の方法。
【請求項44】
第1の抗原と、イミダゾキノリンと、生分解性ポリマーを含む微粒子とを含む微粒子組成物を形成する方法であって、該方法は(a)該生分解性ポリマーと、該イミダゾキノリンと、有機溶媒とを含む有機相を、水を含む第1の水相と乳化することによって油中水型エマルションを形成するステップと;(b)水を含む第2の水相をステップ(a)で形成されたエマルションと乳化して水中油中水型エマルションを形成するステップと;(c)該水中油中水型エマルションから該有機溶媒を除去して微粒子を形成するステップとを含み、該第1の抗原は該微粒子に吸着されるか、該微粒子内に確立されるか、または該微粒子と混合される、方法。
【請求項45】
前記第1の水相は前記第1の抗原をさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項46】
前記第1の抗原は前記微粒子に吸着される、請求項44に記載の方法。
【請求項47】
前記第2の水相は界面活性剤をさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項48】
前記界面活性剤はアニオン性界面活性剤である、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
脊椎動物対象中の免疫応答を惹起する方法であって、請求項1に記載の免疫原性組成物を前記脊椎動物対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項50】
前記免疫原性組成物は、筋肉内、気管内、鼻腔内、経皮、皮内、皮下、眼内、膣、直腸、腹膜内、腸内、または吸入投与の経路によって投与される、請求項49に記載の方法。
【請求項51】
前記第1の抗原は、肝炎ウイルス、水痘、ポリオウイルス、麻疹、耳下腺炎、風疹、インフルエンザウイルス、Neisseria meningitidis、百日咳、Haemophilus influenzae b型、HIV、単純ヘルペスウイルス2型、百日咳、ジフテリア、破傷風、H.pylori、およびStreptococcus pneumoniaeから選択される病原性生物に由来する、請求項50に記載の方法。
【請求項52】
請求項1に記載の免疫原性組成物を含む、医薬組成物。
【請求項53】
請求項1に記載の免疫原性組成物を調製するためのキットであって、第1の抗原を含む第1の容器と、第1のアジュバントを含む第2の容器と、微粒子を含む第3の容器とを含む、キット。
【請求項54】
請求項1に記載の免疫原性組成物を調製するためのキットであって、第1の抗原を含む第1の容器と、第1のアジュバントおよび微粒子を含む第2の容器とを含む、キット。

【図1】
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【公表番号】特表2011−506334(P2011−506334A)
【公表日】平成23年3月3日(2011.3.3)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−537045(P2010−537045)
【出願日】平成20年12月4日(2008.12.4)
【国際出願番号】PCT/US2008/085506
【国際公開番号】WO2009/076158
【国際公開日】平成21年6月18日(2009.6.18)
【出願人】(504389991)ノバルティス アーゲー (806)
【Fターム(参考)】