免疫応答を誘発または誘導する方法
ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与し、前記組成物は、肺内経路によって被検体に投与される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、被検体、特にヒト被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法に関し、さらには、投与で針を用いない経路に有用な方法に関し、それによって皮下および筋肉経路のようなワクチンの投与の従来の注入経路に代わる方法を提供できる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
長年にわたって、非生ワクチン抗原を送達する手段として気道を利用したさまざまな試みがなされている。この経路は、ワクチン受容性に関する長所を示し（「針恐怖症」を避ける）、局所免疫応答を誘導する機会、および粘膜免疫系の想定される統一性を考えれば、遠位粘膜サイトでの応答を誘導する可能性を有する。ヒトおよび動物において鼻腔内経路によるワクチン送達は多くの配慮が注がれる。現在までの結果によれば、この経路は、抗原接種と免疫誘導とを確保するために、非常に高い抗原投与量および／または特別な送達技術の利用が必要であることが分かっている。同様に、従来、肺内または肺経路を通じるワクチン送達は、免疫応答を最適化するために、概して、マイクロカプセル化（たとえば、オヤ アルパ（Ｏｙａ Ａｌｐａ）ら、２００５参照）などの特別な送達の技術が要求された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明の先行する研究として、本発明者らは鼻腔内経路によるワクチン投与は、高い抗原投与量であったとしても、あまり効果的ではなく、局所免疫はほとんど誘導されないことを調べた。さらに、本発明者らは、「針恐怖症」を避ける長所を保ったワクチン投与の別の方法を発明した。
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らは、免疫応答を誘導する手段として、鼻腔内経路によるワクチン送達を超えて、肺にワクチン送達することの優位性について示した。彼らは、強い全身性免疫応答は、肺を通じてアジュバントと送達された際にとても少ない抗原量で誘導することができることも示した。特に、本発明者は、抗原とアジュバントとを組み合わせた単純なワクチンが、特別な接種技術を必要とせず、肺内送達によって強い全身性免疫応答を有することを示した。意義深いことに、肺を通じてアジュバントとわずか少量の抗原量とが送達されたときでさえ、従来の非経口免疫付与によって誘導される免疫応答よりも１００倍強い肺粘膜免疫応答が得られることが示された。
【０００５】
グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）ら（１９９７）には、水酸化アルミニウムと一緒のリポソームまたはまたはＰＢＳ中のいずれかで製剤化されたリシン類毒素の気管内送達が記載されている。リポソーム処方群は、一番の保護を示した；水酸化アルミニウムは、ＰＢＳに対して保護（作用）を改善しなかった。ＷＯ２００５／１１０３７９には、微粒子マラリアワクチンの肺送達について説明している。その製剤は、微粒子製剤として送達され、抗原の持続的な放出を可能とした。
【０００６】
この明細書において先行文献（またはそれから得られる情報）または、知られている事項についての参照は、先行文献（またはそれから得られる情報）またはこの明細書が関連する活動の分野における一般常識を構成するものであると認識、承認、提案すると解釈されず、かつ解釈するべきではない。
【０００７】
本明細書および請求の範囲を通して、文脈から別の解釈を要求されるときを除き、記載した整数もしくは工程、または整数もしくは工程以外を除外するものではないと解釈される。「含む」および／または「含んでいる」のようなバリエーションは、記載した整数もしくは工程の包含、または整数もしくは工程の群を包含することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概略
本発明は、ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与することを含み、該組成物は、肺内経路または肺経路によって被検体に投与される前記方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、組成物は、肺内または肺投与に適した処方物である。
【００１０】
別の局面では、本発明は、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用に関する。
【００１１】
また、さらに別の局面では、本発明は、肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】上部および下部（または深部）肺に対応する領域を示すヒツジ肺の略図である（ニッケルら、１９７９から改良した肺略図）。
【図２ａ】最初の実験で得られた結果を説明する図である。ヒツジの群は、インフルエンザウイルス抗原（インフルエンザ抗原）単独、または、１００μｇイスコマトリックス（以下、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM）アジュバント（ＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント）と処方された抗原の３週間間隔をあけた３回の投与で皮下（ｓ／ｃ）または肺内（肺）経路によって免疫された。血（血清）および肺（気管支肺胞洗浄液−ＢＡＬ）サンプルは、第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。抗体応答（１５μｇインフルエンザウイルス抗原単独からなる処方物（現在利用されているインフルエンザウイルスの１価の投与量と同等）、および１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたインフルエンザ抗原の量を減らした処方物を１、２および３回投与量（１°、２°および３°）の後の酵素イムノアッセイにおけるインフルエンザ特異的エンドポイントタイター）を示す。血清およびＢＡＬ（肺）サンプルに対してＩｇＧおよびＩｇＡの両方についのアッセイした。（＊：マンホイットニー分析を用いた有意差）水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図２ｂ】図２ａに同じ。
【図２ｃ】図２ａに同じ。
【図２ｄ】図２ａに同じ。
【図３ａ】最初の実験で得られた結果を説明する図である。ヒツジの群は、インフルエンザウイルス抗原（インフルエンザ抗原）単独、または、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバント（ＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバント）と処方された抗原の３週間間隔をあけた３回の投与で皮下（ｓ／ｃ）または肺内（肺）経路によって免疫付与された。血（血清）および肺（気管支肺胞洗浄液−ＢＡＬ）サンプルは、第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。 図２と同じ免疫とサンプリングスケジュールおよびアッセイ手順による抗体応答を示す。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバントと一緒またはなしでインフルエンザ抗原（０．０４μｇ）のとても低い投与量で皮下経路および肺内経路によって免疫を行なった。（＃，＊，＾，§，☆：マンホイットニー分析を用いた有意差）水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図３ｂ】図３ａに同じ。
【図３ｃ】図３ａに同じ。
【図３ｄ】図３ａに同じ。
【図４】上部または下部肺（図１）のいずれかに送達された１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMと処方された０．０４μｇインフルエンザ抗原を３回投与量で免疫した後のヒツジの群における抗体応答を示す。血清とＢＡＬ（肺）サンプルは、３回目の投与後１週間後採取した。 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図５】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）△ｇＢタンパク質をＮＨＳ−活性化ＨＰカラムと結合させたｇＢ特異的５８−１５モノクローナル抗体のアフィニティークロマトグラフィで精製したのち、精製された該タンパク質のクーマシー−ストレインＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動ゲルである。レーン１〜４は、４つの異なるアフィニティ精製から精製された△ｇＢが流れた様子を示す。
【図６ａ】皮下または肺内経路のいずれかで送達された１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMと処方されたＣＭＶ△ｇＢを３回投与後の８匹ヒツジからなる群におけるＣＭＶ△ｇＢ特異的抗体応答を示す。血清およびＢＡＬサンプル中の抗体応答はアッセイされ、ＩｇＧおよびＩｇＡのエンドポイントタイターを△ｇＢ特異的ＥＩＡを用いて決定した。グラフは、最初の投与の２週間後（第１後）、そして、第２（第２後）および第３（第３後）投与の１週間後の抗体応答を示す。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図６ｂ】図６ａに同じ。
【図６ｃ】図６ａに同じ。
【図６ｄ】図６ａに同じ。
【図７】図６と同じヒツジの群における、ＣＭＶに対する個体ごとの中和タイター率を示す。１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢの第１投与の１週間前（免疫前）、第１投与の２週間後（第２）、第２投与の１週間後（第３）および第３投与の１週間後（第３）に得られた血液からの血清サンプルでＣＭＶ中和活性のアッセイした。それぞれの丸点は、定めた投与点で採取された個々のヒツジ血清の中和率である。処方の２および３回投与量の後の血清ＣＭＶ中和タイターは、肺内および皮下送達の免疫前血清よりとても高い値を示した。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。
【図８】△ｇＢとインキュベーションした後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のインビトロ再刺激の結果を示す。ＰＢＭＣｓは、実施例７と同様に同じヒツジの末梢血から１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢの第３投与量の投与の１週間後に採取した。△ｇＢで刺激した後、細胞増殖は、細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンのアッセイで決定した。刺激インデックス（ＳＩ）は、刺激していないコントロール細胞に取り込まれたトリチウムの割合と、△ｇＢで刺激された細胞に取り込まれたトリチウムの割合とから計算された。ＳＩ≧４は、ポジティブ増殖応答とみなす、
【図９ａ】さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原による免疫されたヒツジの群（アジュバントなしインフルエンザ抗原付与群に４ヒツジ。それぞれのアジュバンドの群には７ヒツジ）における抗体応答を示す。免疫付与とサンプリングスケジュールとアッセイ手順は、図１と同様とした。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図９ｂ】図９ａに同じ。
【図９ｃ】図９ａに同じ。
【図９ｄ】図９ａに同じ。
【図１０ａ】図９におけるヒツジと同じ群の血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイ結果を示す。それぞれのサンプルのＨＡＩタイターは、七面鳥の赤血球におけるエンドポイント阻害によって決定した。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図１０ｂ】図１０ａに同じ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ひとつの局面として、本発明は、ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与し、前記組成物は、肺内経路によって被検体に投与される方法を提供する。
【００１４】
好ましくは、被検体はヒトである。しかしながら、本発明の方法は、家畜動物（たとえばヒツジ、ウシまたはウマ）、研究試験用動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、ペット（たとえば犬または猫）または野生動物のような動物被検体における免疫応答を誘発または誘導することにまで拡大することもできる。
【００１５】
本明細書において、組成物の「肺内」または「肺」送達への言及は、肺の粘膜表面への組成物の送達を言及する。組成物の活性構成要素（言い換えれば抗原とアジュバント）は、肺および／または粘膜免疫系における毛細系を含むことができる。これらの用語は、組成物の「深部肺」または「下部肺」送達を含み、それは、肺の深部気管支、細気管支および／または肺胞への組成物の送達である。
【００１６】
好ましくは、本発明にしたがって、抗原とアジュバントとを含む組成物は、噴霧器または、同様の機器を用いたエアロゾルまたは乾燥パウダーとともにエアロゾルまたは乾燥パウダーフォームで被検体の肺に投与される。薬剤活性製品の肺内または肺送達のための標準的な機器または製品は、当業者によく知られている。
【００１７】
上述したように、別の局面として、本発明は、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用を提供する。
【００１８】
さらに別の局面として、本発明は、肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品を提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明に従って投与される抗原は、肺の病原体に対して免疫応答を誘発または誘導するであろう抗原である。前記病原体は、たとえばインフルエンザ、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｉａｅ）、呼吸器合胞体ウイルス、または、肺炎球菌等である。しかしながら、抗原は、ほかの粘膜サイトの病原体を含む他の病原体に対する免疫応答を誘発または誘導するものから選ばれてもよい。これは、たとえば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、コレラ、ＨＩＶ、または、性感染症生物などである。本発明に従って投与される抗原は、高い受容体受容性の利点を有する（「針恐怖症」の回避および投与の容易性）。特に、強い粘膜および全身性免疫応答の双方を生じさせ、そのことは全身性免疫応答に依存しているすべてのワクチンにとって有益であろうことを示す。
【００２０】
抗原は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原であってもよい。好ましくは、腫瘍は、粘膜サイトに関連するものである。粘膜サイトに関連する腫瘍は、肺腫瘍に限定されるものではなく、消化管の腫瘍、または、生殖管腫瘍を含む。
【００２１】
抗原は、ヒトまたは動物における免疫応答を誘発または誘導できる化学物質であってもよく、不活性細菌全細胞またはそれらのサブユニット、完全不活性ウイルスまたはそれらのサブユニット、タンパク質またはペプチド、グリコタンパク質、炭水化物、ガングリオシド、ポリサッカライド、リポポリサッカライドまたはリポペプチドを含むが、これらに限定されず、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２２】
好ましくは、アジュバントは免疫刺激アジュバントであり、より好ましくは、サポニンベースアジュバントであり、さらにより好ましくは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM（イスコマトリックス）アジュバントのような免疫刺激複合体（またはＩＳＣＯＭTM）である。しかしながら、本発明は、単独またはそのほかのアジュバントと組み合わせた他の免疫刺激アジュバントの使用も含む。他の免疫刺激アジュバントとは、たとえば、リポソーム、ＭＦ５９のような水中油型アジュバント、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩アジュバント、リピッドＡおよびモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピッドＡ（ＭＰＬ）のようなリポポリサッカライドアジュバント、ＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバントのようなオリゴヌクレオチドアジュバントおよびコレラ毒素のような粘膜アジュバントを含む免疫刺激複合体のようなものを挙げることができる。好ましい免疫刺激アジュバントは、コックス（Ｃｏｘ）とコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、１９９７による例に説明されている。
【００２３】
本発明の組成物は、現存する多くの技術と研究過程における同等の技術をもちいて肺に送達してもよい。薬を送達できる機械機器、または肺へのタンパク質調製物が存在し、および噴霧およびエアロゾル機器の多くの例がここ数十年間、喘息の治療に用いられている（ゴンダ（Ｇｏｎｄａ）、２０００参照）。主に、これらの機器は、経口吸入による肺への送達手段を含む。本分野の近年の進歩は、３Ｍコーポレーション（ショエル（Ｓｈｏｙｅｌｅ）とスロウェイ（Ｓｌｏｗｅｙ）、２００６）およびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ システムＩｎｃ．（クオ（Ｋｕｏ）とレチュガ−バレステロス（Ｌｅｃｈｕｇａ−Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ）、２００３）によってつくられたものを含む。
【００２４】
本発明に従うと、本組成物は、免疫学的に効果的な量がヒトまたは動物被検体に投与される。ここで、免疫学的に効果的な量とは、少なくとも部分的に所望の免疫応答を達成するために、治療すべき特定の状態の（１）開始を遅延、（２）進行を阻止、（３）完全に停止するために必要な量である。この量は、治療される個体、治療される個体の分類学群、個体の免疫適格、所望の保護度合い、ワクチンの処方、医学状況の判定、そして他の関連のある要素に応じて変化する。この量は、通常の試行を通じて決定される比較的広い範囲にあることが期待される。
【００２５】
注目すべきことは、しかしながら、本発明の特に重要な効果は、抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物の肺内投与において、粘膜応答と同様の抗原に対する全身性抗体応答を引き起こすだけではなく、そのような全身性および粘膜応答を誘発または誘導するために必要な抗原投与量の大きな減少を可能とすることを発見したという事実を含むことである。加えて、本発明に従ったワクチン組成物の効果的な肺内投与は、マイクロカプセル化、または粘膜接着、または技術粘膜サイトにおけるワクチン摂取を増加するためのほかのテクノロジーのような複雑な送達システムの必要性を回避することができる。
【００２６】
その上、大いに改良された粘膜抗体応答の誘導は、肺内免疫付与が、粘膜感染のワクチン有効性を高め、そして、潜在的に免疫化／感染化したヒトからの病原体伝達を減少することができることを示す。
【００２７】
特に、粘膜抗体は、インフルエンザ攻撃に対する保護免疫の改良／改善において、大きな価値を有する可能性がある。近年のＷＨＯ協議レポート（ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔ）（カセッティ（Ｃａｓｓｅｔｉ）ら、２００６））は、以下のように述べている：マウスモデルにおいて、粘膜ＩｇＡは、攻撃に対する保護と関連している。そして、ヒトにおける生きた衰弱ワクチンの研究において、粘膜ＩｇＡの存在はウイルス排泄の減少と実験感染に対する耐性とに関連する。粘膜ＩｇＡは、インフルエンザウイルス感染に対して保護する役割を果たすようであること、および多くの研究で、粘膜免疫応答を減少させるウイルスの能力を向上させるべきであること．．．．．．と結論付けている。
【００２８】
さらに、本発明の肺内送達経路は、他の感染に対するワクチンの潜在的価値を有し、そして、一次全身性抗体応答を要するワクチンのための代替送達経路を提供する。
【００２９】
その上、本発明に従って投与される抗原は、強い細胞性免疫応答を誘導する。肺内経路によって送達されるアジュバントと一緒の抗原は、抗原に応答して、特異的に増殖する末梢血細胞の生成を刺激する。これらの細胞は、抗体応答を高め、ウイルス感染細胞の殺傷のようなエフェクター機能をなす機能を有するＴ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋クラスの双方に属する。抗体応答に加えて細胞免疫応答を誘導する能力は、感染物質、特にＨＩＶ、ヘルペスウイルスおよびマイコバクテリア、クラミジア菌およびリステリア菌のようなライフサイクルで細胞内相を含むバクテリアに対するワクチン接種において潜在的価値を有する。
【００３０】
本発明のさらなる特徴は、以下の実施例でさらに十分に説明する。しかしながら、この詳細な説明は、単に本発明を例示する目的のために含めたものであって、上述に説明した本発明の広範な説明を制限するものと理解されてはならない。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞
≪背景≫
本発明の背景として、発明者は、カニューレ処置されたヒツジをモデルとしてワクチン送達の形態について調べた。カニューレ処置は、詳細に調査すべき流入領域リンパ節の流出を可能とする。この研究は、ヒツジに対して、ワクチンモデルとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM（イスコマトリックス）アジュバントインフルエンザウイルスワクチンを用いて行なった。この研究の重要な発見は、鼻腔内投与においては、高い抗原投与であったとしても、あまり効率的でなく、弱い局所免疫を誘導することである。
これらの発見は、ワクチンを肺葉深くに送達することによる肺内経路によって、カニューレ処置されていないヒツジに対するワクチン送達の効果を調査する方向への研究の変化を促進した。
【００３２】
≪実験方法≫
血液採取
ヒツジを拘束し、１０ｍＬシリンジと１８Ｇ針を用いて頚動脈から血液１０ｍＬを採取した。
【００３３】
免疫付与
本研究では、スクロースグラディエント精製Ａ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａ ２０／９９Ｈ１Ｎ１ウイルスをインフルエンザ抗原として用いた。該ウイルスは不活化されており、界面活性剤で破壊しておいた（Ｃｏｕｌｔｅｒら、１９９８）。抗原濃度は、血球凝集素含有量をベースにして一元放射免疫拡散法で決定した。ＧＭＰグレードＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドは、以前説明されているプロセスに従ってＣＳＬリミテッドより準備した（ＰｅａｒｓｅとＤｒａｎｅ、２００５）。免疫付与の前に、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドと好ましい量の抗原とを混合したものをワクチン処方物とした。
肺内免疫付与において、ヒツジを慎重にハーネスに拘束した。そして、左鼻腔から左肺の下葉に気管支鏡を注入した。
皮下免疫付与のために、ワクチン処方物を１ｍＬシリンジと２５Ｇ針を用いて大腿部内部に２００μｌの全容量を送達した。
【００３４】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）採取
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルを採取するために、免疫のためと同様に拘束しているヒツジに気管支鏡を挿入し、気管支鏡に取り付けたシリンジを用いて肺葉にＰＢＳ（リン酸バッファーｐＨ７．２）１０ｍＬを送達した。その際、同じシリンジを用いて気管支鏡によってＢＡＬ流体を回収した。
【００３５】
ＥＩＡによる抗体応答評価
ＢＡＬにおける抗インフルエンザ抗体と血清サンプルは、ＥＩＡ（エンザイム イムノエッセイ）によって二連で評価した。つまり、濃度１０μｌ／ｍＬでインフルエンザ抗原を含む炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）５０μＬで、９６ウェルマキシソープフラットボトムプレート（ＮＵＮＵ、ロスキルド（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）の表面を被覆して一晩おいた。プレートは１％カゼイン酸ナトリウムでブロッキングしてから、二連でサンプルの１／５系列希釈の１００μＬ添加した。特異的抗インフルエンザ抗体の結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼと抱合するウサギ抗ヒツジ全Ｉｇ、または、ウサギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼによって結合させた抗ウシ／ヒツジＩｇＡ（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、オクスフォード）を用いて検出した。色度はＴＭＢ物質（ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシスコ）を添加することで発色させ、２ＭのＨ2ＳＯ4を添加することで停止させた。４５０ｎｍ光学濃度をＢｉＯ−Ｔｅｌ ＥＬｘ８００プレートリーダーで検出し、抗体エンドポイントタイターを計算した。
【００３６】
血球凝集抑制の評価
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体応答を示した血清およびＢＡＬサンプルは、血球凝集抑制（ＨＡＩ）についても調べた。このアッセイは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集の阻害状態を測定することで、機能的抗体のタイターを決定するものである。サンプルは、七面鳥の赤血球を用いてタマゴで増殖させたＡ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａ ２０／９９ウイルス（Ｈ１Ｎ１）に対してＨＡＩテストした。ＨＡＩタイターは、赤血球のインフルエンザ凝集を阻害したエンドポイント希釈物によって決定した。ＨＡＩアッセイは、オーストラリアのメルボルンにあるＷＨＯとのインフルエンザ委託研究共同研究所（ＷＨＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）で行なった。
【００３７】
末梢血単核球細胞のインビトロ抗原再刺激
シリンジおよび１８Ｇ針を用いて頸静脈から採取された血液サンプル（５０ｍＬ）を５０００Ｕ／ｍＬのヘパリン１００μＬが入った５０ｍＬチューブに入れた。該細胞が壊れないように８００ｇで２０分間遠心分離し、バフィーコートを１５ｍＬチューブに入れ、ＰＢＳで８ｍＬになるよう希釈した。トランスファーピペットを用いてフイコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）の３．５ｍＬを細胞懸だく液の底に加えて、そして、サンプルが壊れないように１０００ｇで３０分間遠心分離した。次に、末梢単核球細胞は、フイコール−ＰＢＳの界面から採取され、ＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したダルベッコ 修正イーグル培地）に５×１０6／ｍＬで再度懸だくした。
抗原再刺激アッセイに擱いて、細胞１００μＬ（５×１０5／ウェル）を９６ウェル組織培養プレートに分注した。該プレートには、培地のみ、または、Ａ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａインフルエンザ抗原を１０または２０μｇ／ｍＬ含む培地いずれかを３連で１００μＬ加えた（最終濃度５または１０μｇ／ｍＬ抗原）。加湿インキュベーターにて３７℃で５日間培養した後に、すべてのウェルを１μＣｉのトリチウム化チミジン２０μＬでパルスラベルした。細胞は、パッカードハーベスターを用いてグラスファイバフィルタの上に播種した。そして、細胞はマイクロスキント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）シンチレーション液とカセットに回収され、β放射線を自動マイクロプレートスキントカウンターを用いて測定した。
【００３８】
上部および下部肺への免疫付与の評価
上部肺への送達、および下部肺への送達による免疫付与の有効性の評価は、以下に説明するように行なった。図１（Ｎｉｃｋｅｌら、１９７９）は、上部および下部肺への送達に用いられたヒツジ肺の場所（部位）を示す。
ワクチンは「上部肺」に送達した。−ワクチンは、ファイバ光学気管支鏡を用いて上部肺に送達された。ワクチンは、主気管分岐点の１ｃｍ先の主気管支に導入された。
ワクチンは、「下部肺」に送達した。−ワクチンは、ファイバ光学気管支鏡をもちいて下葉に深く送達された。ワクチンは、尾部気管支（ｃａｕｄａｌ ｂｒｏｎｃｈｕｓ）が尾部区気管支（ｃａｕｄａｌ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｒｏｎｃｈｉ）とつながる１０ｃｍ先の気管分岐点に導入された。
免疫付与、採血、ＢＡＬ採取およびＥＬＩＳＡアッセイは、ほかの実験で説明されるように行なった。ヒツジは、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドに０．０４μｇインフルエンザ抗原の３回投与した。
【００３９】
≪結果≫
肺内経路への免疫付与による抗体誘導
３回の別々の実験で、ヒツジに肺内経路によって免疫した。採血は、１回（°）投与から２週間後、そして、２回および３回投与から１週間後に行なわれた。
実験１ ヒツジに１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを加えた抗原をそれぞれ１、５または１５μｇ免疫した。３回免疫付与は、３週間間隔をあけて行なった。血清サンプルは、始まる前、および、それぞれワクチン接種した後採取した。
肺内に送達されたアジュバントインフルエンザ抗原の１μｇは１５μｇと同様に有効であるという驚くべき発見に続いて、２番目の実験（実験２）では、抗原投与量のさらなる減少について調べた。
実験２ ヒツジに１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを加えた抗原をそれぞれ０．０４、０．２、１、５または１５μｇ免疫した。３回免疫付与は、３週間別々に行なった。血清サンプルは、始まる前、および、それぞれ免疫付与した後採取した。
これらの実験ですべての抗原投与量（たとえ０．０４μｇ抗原ほど低くても）が受容性動物に十分な抗体応答を誘導することが示された。低い抗原投与量は１回目の投与後ごくわずかな抗体を誘導する。しかしながら、受容性動物での免疫は、次の２および３回目の投与後は、高い抗原投与量の免疫と同様である。これらの抗体応答は、機能的に血球凝集抑制（ＨＡＩ）を含む。
０．０４μｇ抗原および１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを有するヒツジ免疫化肺内における血清ＩｇＧおよびＩｇＡレベルは、抗原単独で１５μｇ皮下免疫付与して得られたものと同様であった（現在のワクチン投与量）。低い投与量の肺内免疫付与は、肺における特異的ＩｇＡおよびＩｇＧの非常によいレベルをつくりだす（ＢＡＬ−気管支肺胞洗浄）。低い投与量の肺内免疫付与は、皮下注入で高い投与量による誘導より優れている。
【００４０】
実験３ 第３の実験は、（ｉ）低い抗原投与量による特異的免疫誘導のためのアジュバントの要件、（ｉｉ）肺内に送達された低い抗原投与量（０．０４μｇ）と皮下に送達された低い投与量との直接比較、（ｉｉｉ）より低い抗原投与量を調べる（０．００８μｇ 抗原）。
第３の実験により：
（ａ）第１、２による知見が再現された。
（ｂ）アジュバントがとても低い抗原投与量に対して免疫の誘導に有効であることが示された。
（ｃ）肺内にアジュバント添加した低い抗原投与量を送達することは、皮下に送達された同じ抗原の低い投与量ワクチンまたは現在のワクチン投与量とアジュバント添加と同様な血清抗体および優れた肺抗体を誘導することが見出された。
（ｄ）皮下注入したとても低い投与量の抗原を２回以上投与するとトレランスを誘導することを示すようであり、または、第３の投与後の血清抗体としての阻害効果は減少したようである。この阻害は、以下の肺送達では起こらない。
（ｅ）１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．０４μｇ抗原とから誘導されるより少ないが、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．００８μｇ抗原でさえ肺内免疫付与は十分な抗体誘導を誘導したことが分かった。
実験１〜３の結合データは、図２および表１にまとめた。
【００４１】
表１：インフルエンザ抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとの投与量の肺内免疫付与によって誘導される血球凝集阻害（ＨＡＩ）活性
【００４２】
表１説明： データは、別々の３回の実験のものを一緒にした。ヒツジの群（１群につきｎ＝８、ただし、１５μｇｆｌｕ（インフルエンザ抗原）群（ｎ＝１２）と０．０４μｇｆｌｕ＋ＩＭＸ群（ｎ＝１６）とを除く）は、ウイルス粒子成分（ｓｐｒｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザ抗原の投与量を減らし、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）の１００μｇを加えて左肺を免疫した。ワクチンコントロールヒツジの群（Ｓ／Ｃ）は、現行のヒトインフルエンザワクチン１系統の同様の抗原投与量を皮下に免疫付与された（１５μｇインフルエンザ抗原単独）。ヒツジは３週間あけて３回免疫付与された。血清および左肺洗浄液（ＢＡＬ）は、すべてのヒツジから第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。これらのインフルエンザ介在血球凝集が阻害されたサンプルの滴定はその際決定された。すべての免疫付与前のサンプルは、ＨＡＩ活性を示さなかった（データ示さず）。
＊ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．００４）
【００４３】
表２および図３は、実験３のデータを示す。
【００４４】
表２：極めて低いインフルエンザ抗原投与量によって誘導される免疫付与による血球凝集阻害活性のアジュバントおよび送達経路の要件
【００４５】
表２説明： ヒツジの群（ｎ＝８）は、ウイルス粒子成分（ｓｐｒｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザ抗原の極めて低い投与量（０．０４μｇ）と１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）（またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）を含まない）とによって左肺に免疫した。ほかの群は、皮下に注入された同じワクチンを付与された（Ｓ／Ｃ）。コントロールヒツジのひとつの群は、現行のヒトインフルエンザワクチン１株の同様の抗原投与量を皮下に免疫付与された（１５μｇインフルエンザ抗原単独）。ヒツジは３週間あけて３回免疫付与された。血清および左肺洗浄液（ＢＡＬ）は、すべてのヒツジから第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後で採取された。これらのインフルエンザ介在血球凝集が阻害されたサンプルの滴定はその際決定された。すべての免疫付与前のサンプルは、ＨＡＩ活性を示さなかった（データ示さず）。
＃ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に低いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．００２）
＊ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．０２８）
＾ アジュバントを含まない群と比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．０１）
【００４６】
図１および２において
水平バー：中央値
オープンバー：値の中間５０％
垂線：１０および９０％
ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント
バーは、上述したように第１（１°）、第２（２°）および第３（３°）の後の免疫付与インフルエンザ特異的エンドポイント抗体タイターを示す。
図１： ＊１５μｇ ｓ／ｃ群より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０３）
図２において、
＃ １５μｇ ｓ／ｃ群より有意に低い（マンホイットニー；ｐ＜０．０１）
＊ １５μｇ ｓ／ｃ群より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０３８）
＾ 同じ経路に向かうアジュバントなしワクチン送達より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０３８）
§ 皮下、同じワクチン送達肺内より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０２８）
☆ 肺内、同じワクチン送達皮下より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０２１）
【００４７】
実験４ この実験では、上記実験で用いられた下部肺への送達と比較して、上部肺へのアジュバント化インフルエンザ抗原の送達の有効性を評価した。８ヒツジの２群は、０．０４μｇインフルエンザ抗原と１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとを含む処方物をそれぞれ上部肺または下部肺のいずれかに３回付与され、血清とＢＡＬ抗体応答は、ＥＩＡによって調べた（図４）。
これらの結果は、３回の投与の後、上部肺への送達は血清とＢＡＬ応答を誘導したけれども、ＩｇＧおよびＩｇＡ双方の血清およびＢＡＬ双方の有意によい応答は、下部肺送達によって誘導されたことを示した。
【００４８】
≪要約≫
１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとインフルエンザウイルス抗原とを用いて肺内免疫付与することで、全身性および粘膜の双方の抗体誘導においてＨＡＩ活性を伴う高い有効性が証明された。
強い血清抗体応答は、抗原の極めて低いレベル（１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントおよび０．０４μｇインフルエンザ抗原）でさえ観測することができる。これらの応答は、インフルエンザ抗原単独で１５μｇの皮下注入（現行のワクチンと同様に）によって誘導される応答よりも強いものであり、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと皮下０．０４μｇインフルエンザ抗原とによって誘導される応答と同等であった。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．０４μｇインフルエンザ抗原との肺内送達によって誘導される粘膜抗体応答は、皮下にインフルエンザ抗原１５μｇ注入する場合、または皮下にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとインフルエンザ抗原０．０４μｇとを注入する場合よりも、高く評価された。後者のいずれもが、検出できる粘膜（肺）応答を誘導しなかった。
【００４９】
＜実施例２＞
≪肺内経路を通じたワクチンによる細胞免疫誘導≫
ヒツジは、０．０４μｇインフルエンザ抗原単独、または０．０４μｇインフルエンザ＋１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントのいずれかで４回肺内免疫付与された。最後の免疫付与の後１週間後、末梢血を採取し、培地のみ（ネガティブコントロール）で、または５または１０μｇインフルエンザ抗原と一緒に（再刺激）単細胞を９６ウェルプレートで培養した。５日後、ウェルは、２４時間トリチル化チミジンでパルスした。その際、放射線を測定して、細胞増殖を数えた。刺激インデックスは、培地単独のコントロール群の平均ｃｐｍで再刺激された群の１分間あたりの平均カウント（ｃｐｍ）を割ることで、計算された。
細胞増殖調査の結果は、表３に示す。ヒツジを抗原単独で肺内にワクチン接種した場合、末梢血において増殖応答は検出することができなかった。しかしながら、そのような応答は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと抗原とを受けたヒツジにおいては、検出された。これらのデータは、アジュバントの必要性、次に肺ワクチン送達することで、末梢循環における細胞増殖記憶応答を誘導することが示された。
【００５０】
表３：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントがある場合とない場合とに分けて、インフルエンザ刺激された、低い投与量抗原で肺内を免疫付与したヒツジから得られた末梢血単細胞の増殖応答
【００５１】
＜実施例３＞
≪微小流動化水中油アジュバントを含む肺内経路による投与のための抗原処方物≫
好ましい濃度の抗原（結果として０．０１〜５００μｇの範囲の単位用量を生成する最終抗原濃度）は、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２のＰＢＳ中における５％ｖ／ｖスクアラン、０．５ｖ／ｖトゥイーン８０、０．５％ｖ／ｖスパン８５と混合した。次に、この混合液は、１平方インチ（６．４５２ｃｍ2）あたり（ｐｓｉ）１９〜２０，０００ポンド（８．６１８〜９０７１．８４９ｋｇ）の圧力で高圧流動化を行なった。この処方物は、上述された方法による肺内経路を通じて送達された。
【００５２】
＜実施例４＞
≪ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方した組換え型サイトメガロウイルスｇＢ抗原で肺内経路を通じた免疫付与によって誘導された全身性および粘膜免疫≫
インフルエンザ抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントから得られた結果を確証し、拡張するために、組換えウイルス抗原の肺内送達によって誘導された免疫応答をヒツジで調べて研究した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたサイトメガロウイルスｇＢグリコタンパク質の短縮形態を肺内、および皮下経路で送達し、ＥＩＡによって血清および肺における抗体応答を評価した。加えて、機能的抗体の誘導を、血清におけるＣＭＶ中性抗体アッセイで評価した。肺内にＴ細胞応答の誘導をもたらした処方の能力は、末梢血単細胞のｇＢ特異的細胞増殖を評価することでも調べられた。
【００５３】
≪実験方法≫
短縮組換えヒトＣＭＶｇＢタンパク質（△ｇＢ）の製造
１．ＣＭＶ△ｇＢタンパク質をコードしたＤＮＡを含むプラスミドの作製
タンパク質の膜貫通領域を取り除いて設計されたＣＭＶｇＢの短縮形態をコードしたＤＮＡをオーストラリアのブリズベンのクイーンズランドメディカルリサーチ研究所の准教授ラージ ハーナ（Ｒａｊｉｖ Ｋｈａｎｎａ）からいただいた。このＤＮＡは、ｇＢの細胞外、および細胞質内ドメイン（ＮＣＢＩ Ｐ０６４７３）がインフレームで融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナル配列を含むタンパク質をコードしている。なお、そのＤＮＡは、発現タンパク質の開裂を防止するためのアミノ酸４６０／４６１周辺の領域をコードしたヌクレオチドにポイントミューテーションを導入した。そのＤＮＡを、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＣＥＰ４ベクターにクローン化した。得られたプラスミド（ｐＣＥＰ４△ｇＢ）は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で増殖させ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）マキシキットを用いて精製プラスミドを調製した。
【００５４】
２．哺乳類細胞における△ｇＢタンパク質発現
振とうフラスコにおいて３７℃でＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM発現培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させたＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３−Ｆの培養物を２９３フェクチントランスフェクションリージェント（インビトロゲン）を用いてｐＣＥＰ４△ｇＢでトランスフェクションした。培養中ハイグロマイシンＢを用いてセレクションをかけたタンパク質△ｇＢの分泌発現は細胞上澄みサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で決定した。細胞培養上澄みを採取し、２５００ｒｐｍで遠心分離機によって浄化した。次に、０．４５μｍフィルターを通した後にクロマトグラフィにかけた。
【００５５】
３．△ｇＢタンパク質の精製
ｇＢ特異的モノクローナル抗体５８−１５（シング（Ｓｉｎｇｈ）とコンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、２０００）で捕獲するアフィニティークロマトグラフィを用いて△ｇＢタンパク質を精製した。抗体は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア）タンパク質Ａカラムで精製した。△ｇＢタンパク質の精製のため、精製された抗体を、平衡バッファー（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3／０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）中でＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化ＨＰカラムとカップリングした。浄化した細胞培養上澄みは、１００ｍＭホウ酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．５で、１：１に希釈した。希釈した上澄みを、ＨｉＴｒａｐカラムにアプライし、平衡バッファーで平衡化し、そして、まず、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．５、続いて平衡バッファーで溶出し、今度は、０．１５Ｍ水酸化アンモニウムで再び溶出した。溶出した画分は、３ＭトリスｐＨ８または１ＭグリシンｐＨ２．５のいずれかを用いて中和させた。タンパク質精製はクーマシー−ストレインＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法で調べた（図５）。タンパク質濃度は、２８０ｎｍのＯＤを決定することで測定した。
【００５６】
≪△ｇＢを用いたヒツジの免疫付与≫
血液採取
方法は、実施例１で説明した方法と同じとした。
免疫付与
ヒツジは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢ
タンパク質とで免疫付与された（表４）。サイトメガロウイルスの△ｇＢタンパク質は上述したように調製した。
すべてのヒツジは、３回ワクチン投与を受けた。血液採取スケジュールを含む詳細は、実施例１で説明したとおりである。
【００５７】
表４：ヒツジの群は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢタンパク質とで免疫付与された。
【００５８】
ＢＡＬ採取
ＢＡＬの採取は、実施例１で説明したとおり行なった。
ＥＩＡによる抗体応答の評価
ヒツジＩｇＧおよびＩｇＡを検出する方法は、以下の例外を含めて実施例１の方法と同様とした。プレート（９６ウェル）に、１ウェルあたり１００μｌの２μｇ／ｍＬ精製△ｇＢタンパク質を含むＰＢＳで一晩コートした。固定したヒツジＩｇＧは、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ヒツジ全ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出した。ＩｇＧおよびＩｇＡ双方の場合において、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質は、それぞれＫＰＬキークガード（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）およびペリー（Ｐｅｒｒｙ）ラボラトリーズから供給された。１ウェルあたり、０．５ＭのＨ2ＳＯ4を５０μｌ添加することで反応をとめた。
【００５９】
ＣＭＶに対する機能活性の評価
機能的血清抗体を誘導するワクチンの能力は、ＭＲＣ−５細胞の組換えヒトサイトメガロウイルス感染を基礎とした中和アッセイを用いて評価した。アッセイは、オーストラリアのブリズベンのクイーンズランドメディカルリサーチ研究所の准教授ラージ ハーナ（Ｒａｊｉｖ Ｋｈａｎｎａ）と同業者とが、緑色蛍光タンパク質を発現する組換えＣＭＶＡｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰを用いて行なった（マースチェル（Ｍａｒｓｃｈａｌｌ）ら、２０００；ワング（Ｗａｎｇ）ら、２００４）。血清希釈物にＣＭＶＡｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰをさらした後にヒト繊維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に感染するウイルスの能力をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて細胞核蛍光の割合を定量化することで評価した。
【００６０】
１． ヒツジの血清を５６℃で３０分間インキュベートした。
２． ヒツジの血清（ストレート、１００μｌＤＭＥＭの２倍、４倍希釈物）を９６ウェルトレイに分注した。
３． ２５μｌ（２．５×１０4ＰＦＵ）Ａｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰウイルスをそれぞれの血清サンプルに添加した。
４． 血清／ウイルスサンプルを空気中７％ＣＯ2の雰囲気で２時間３７℃インキュベートした。
５． あらかじめ、空気中７％ＣＯ2の雰囲気において２時間３７℃でインキュベートした１０％胎児ウシ血清（ＤＭＥＭ−１０）を含むＤＭＥＭで生育させたＭＲＣ−５細胞を含む４８ウェル平板底トレイを準備し、使用するときまで細胞密集度８０〜９０％とした。
６． 細胞培養培地をＭＲＣ−５細胞から取り除いた。その際、それぞれのウイルス／血清サンプル５０μｌを、ＭＲＣ−５細胞を含む４８ウェル平板底トレイにおいて対応するウェルに移動させた。５０μｌＤＭＥＭを加え、４８ウェルトレイはゆるやかにゆすって空気中７％中ＣＯ2の雰囲気で２時間３７℃インキュベートした。
７． 接種物は、４８ウェルトレイから吸引され、ウェルは３回ＤＭＥＭ−１０で洗浄し、その後それぞれのウェルに５００μｌのＤＭＥＭ−１０を添加し、空気中７％中ＣＯ2の雰囲気で一晩３７℃インキュベートした。
８． 翌日、細胞培地と細胞（トリプシンを使用）とを４８ウェルトレイから集め、遠心分離によって細胞ペレット化した。
９． ペレットは、ＰＢＳに再懸だくし、そして、再度遠心分離によってペレット化した。
１０． １ｍｇ／ｍＬの７−アミノクチンマイシン（Ａｍｉｎｏｃｔｉｎｍｙｃｉｎ）Ｄを０．２μｌ含む低張バッファー（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）１００μｌに、ペレットを激しく再懸だくし、暗所室温で２０分間静置した。
１１． それぞれのペレットのサンプルは、ＦＡＣＳ分析に適したチューブに移され、１％パラホルムアルデヒドを含む１００μｌのＰＢＳを添加した。混合物は、ＦＡＣＳ分析の前３０分間氷上で静置させた。
１２． サンプルは、ベクトンディッキンソンＦＡＣＳＣａｎｔｏで分析し、サンプル中の蛍光核の割合を定量化した。
１３． それぞれのサンプルの中和百分率は以下の式を用いて計算した。
％中和＝［蛍光核の割合（血清不添加）−蛍光核の割合（血清サンプル）÷蛍光核の割合（血清不添加）］×１００
【００６１】
末梢血単核球細胞のインビトロ抗原再刺激
シリンジおよび１８Ｇ針を用いて頸静脈から採取された血液サンプル（５０ｍＬ）を５０００Ｕ／ｍＬのヘパリン１００μＬが入った５０ｍＬチューブに入れた。該細胞が壊れないように８００ｇで２０分間遠心分離し、バフィーコートを１５ｍＬチューブに入れ、ＰＢＳで８ｍＬになるよう希釈した。トランスファーピペットを用いてフイコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）の３．５ｍＬを細胞懸だく液の底に加えて、そして、サンプルが壊れないように１０００ｇで３０分間遠心分離した。その際、末梢単核球細胞は、フイコール−ＰＢＳの接触面から採取し、ＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したダルベッコ 修正イーグル培地）に５×１０6／ｍＬで再度懸だくした。
抗原再刺激アッセイのため、細胞１００μＬ（５×１０5／ウェル）を９６ウェル組織培養プレートに分注した。該プレートには、培地のみ、または、ｇＢタンパク質を５、１０、２０または４０μｇ／ｍＬ含む培地いずれかを３連で１００μＬ加えた（最終濃度２．５、５、１０または２０μｇ／ｍＬ）。加湿インキュベーターにて３７℃で５日間培養した後に、すべてのウェルを１μＣｉのトリチウム化チミジン２０μＬでパルスした。細胞は、パッカードハーベスターを用いてグラスファイバフィルタの上に播種した。そして、細胞をマイクロスキント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）シンチレーション液とともにカセットに設置し、β放射線を自動マイクロプレートスキントカウンターを用いて測定した。
【００６２】
≪結果≫
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方した組換えＣＭＶ△ｇＢ抗原を肺内および皮下に免疫付与して起こる免疫応答
ヒツジは、３週間間隔で皮下または肺内にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢ抗原を３回投与量受けた。血清とＢＡＬサンプルは、第１投与の１週間前、第２投与の２週間後、ならびに第２および第３投与の１週間後に採取された。抗体ＥＩＡデータにおいて、着床前の抗体タイターは、差し引いた。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢにおけるこれらの実験の結果（図６）は、概して、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された低用量インフルエンザ抗原（０．０４μｇ）と実施例２と同様であった。肺内におけるＩｇＧおよびＩｇＡ応答は、３回目の投与後、皮下送達における応答と同様であった。しかしながら、インフルエンザ抗原処方から得られた結果と比較して、肺内経路で送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、血清ＩｇＧおよびＩｇＡを２回投与のみののちの皮下送達と同様に誘導した。肺内経路で送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、１回投与量後の応答を調べたとき、有意に高い血清ＩｇＧを誘導した（図６ａおよびｂ）。
【００６３】
肺における抗体応答の場合には、再度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢで免疫付与した後の応答は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された低い投与量のインフルエンザ抗原で免疫付与した実験と同様の結果であった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、肺内に送達したとき、同じ処方を皮下送達した場合と比較して、３回目の投与の後、肺で有意に高い抗体応答を誘導した（図６ｃおよびｄ）。
機能的抗体誘導の場合、血清におけるＣＭＶ中和アッセイの結果は、ＥＩＡにおいて得られる血清ＩｇＧ応答の結果と合致した（図７）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢ処方の肺内および皮下の送達の中和抗体応答は、十分に着床前の血清と比較して有意に高かった。中和応答は、３回目の投与の後さらに増加した。この結果は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された抗原は、肺内および皮下経路によって送達されたとき、中和抗体の誘導における同等性を示している。
【００６４】
△ｇＢと末梢血単核細胞の再刺激のアッセイ結果（図８）において、肺内または皮下経路のいずれかで送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された抗原を、２〜３回投与量（４またはそれ以上の刺激インデックス）の後、Ｔ細胞応答が誘導されることが示された。
【００６５】
＜実施例５＞
肺内を通じたさまざまなアジュバント技術によるワクチン接種によって誘導される全身性および粘膜免疫
これらの実験は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントよりも他のアジュバントが肺内経路による送達をされたときに抗原特異的粘膜および全身性抗体応答を誘導することができるかどうかを調べるために行なわれた。ヒツジ群は、肺内経路で、さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原で免疫付与した（表５）。
【００６６】
表５：肺内経路で、さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原による免疫付与されたヒツジ群
【００６７】
≪実験方法≫
アジュバント処方物の調製
Ａ．リポソームは以下の方法によって調製した。：
バッファー溶液：
ＩＲバッファー： ０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＫＣｌ， ８ｍＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4， ０．０５ｍＭ ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ， １．５ｍＭ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4 ｐＨ７．２
ＩＶＤバッファー： ０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ３．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4， １．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4．２Ｈ2Ｏ ｐＨ７．２
【００６８】
１．１１．４ｍｇ／ｍＬコレステロール、１２．４ｍｇ／ｍＬジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびメガ（Ｍｅｇａ）１０の溶液をＩＲバッファー中で調製した（Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ）。
２．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣは、ＩＶＤバッファーを３０分以上かけて徐々に添加することで１／４０に希釈した。
３．希釈溶液は、ＳＴ ２００ Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ （Ｎｅｐｈｒａｌ）を用いてはじめの薄められた体積の１／４０に濃縮した。
４．濃縮溶液は、ＩＶＤバッファーの２５倍体積で限外ろ過することで洗浄した。
５．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣは、さらに限外ろ過することで、２倍に濃縮した。
６．脂質押出しに先立ちＣｈｏｌ／ＤＰＰＣは、少なくとも１時間４０℃でインキュベートした。
７．手順どおり、４２℃に保った１０ｍＬサーモバーレルエクストラダー（Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を装備した脂質押出し機（Ｔ．００１ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，カナダ）を用いてＣｈｏｌ／ＤＰＰＣからリポソームを押出した。
８．１４００−２０００ｋＰａの圧力を用いて０．１μｍ ＰＣ ディスクフィルターを通してＣｈｏｌ／ＤＰＰＣの１０ｍＬロットで押出しを行なった。
９．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ溶液すべてがこの系を１０回供するまで、この工程を繰り返した。
１０．結果物のリポソームは、コレステロールとＤＰＰＣ内容物について測定し、そして、ネガティブ染色を用いて電子顕微鏡下で大きさと均質性とを評価した。
【００６９】
Ｂ．ＭＰＬの調製
脂質Ａモノホスホリル（ＭＰＬ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ６８９５）は、２ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｄ２６５０）に再懸だくされ、使用するまで４℃で保った。
【００７０】
Ｃ．ＣｐＧの調製
ＣｐＧ （Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ １０６２ ４８５６−０１１）をｐＨ８の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸だくし、使用するまで４℃で保った。
【００７１】
Ｄ．アジュバント処方物の調製
すべてのアジュバント処方物は、インフルエンザ抗原の添加前の希釈としてＰＢＳを用いた関連組成物を混合して調製した（表５）。このあとに、リポソームを含む処方物を１／８インチ（０．３１７５ｃｍ）プローブを用いてセッティング４にてＶｉｒＳｏｎｉｃソニケーターで超音波処理にさらした。処方物は、３０秒間空けて５秒２回の超音波処理を施し、すべての操作は氷上で行なった。
【００７２】
免疫付与
実施例１で説明した方法を用いて表５に示すように、ヒツジの群は、インフルエンザ抗原とアジュバントとの処方物で免疫付与し、採血した。
ＢＡＬ採取
ＢＡＬの採取は、実施例１で説明したとおり行なった。
ＥＬＩＳＡによる抗体応答の評価
血清中およびＢＡＬサンプル中のインフルエンザ抗原への抗体応答のアッセイは、実施例１で説明したとおり行なった。
血球凝集抑制の評価
血清中およびＢＡＬサンプル中のＨＡＩ活性アッセイは、実施例１で説明したとおり行なった。
【００７３】
≪結果≫
さまざまなアジュバントとインフルエンザ抗原との処方物の肺内ワクチン接種後における免疫応答の評価
ヒツジは、３週間の間隔で３回投与量を受けた。血清と肺（ＢＡＬ）サンプルとは、最初の投与量の前と２週間後、そして２回目および３回目の投与量の１週間後に採取した。抗体ＥＬＩＳＡデータにおいて、免疫付与前抗体タイターは差し引いた。
これらの実験結果において、さまざまなアジュバント処方物は、アジュバントが抗原と併用され、肺内経路によって送達されたとき、抗体応答を誘導する能力は多様であることが示された（図９および図１０）。
【００７４】
すべてのアジュバントは、血清中の抗体の誘導において、抗原単独と比較していくつかの利益をもたらす。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントを含む処方物は、３回目の投与の抗原単独に比較して、血清およびＢＡＬ中の双方において有意に大きな応答を誘導し、ならびに、２回投与の後大きな応答が誘導された血清ＩｇＧの場合は、２回投与後優れた応答を誘導した。
特に注目すべきであるのは、２回投与量の後の血清中および３回投与量の後のＢＡＬ中双方におけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント処方によって、機能的（ＨＡＩ）抗体の誘導が示されたデータである（図１０）。そのデータ（図９）からは、抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント＋ＭＰＬとを含む処方物で免疫されたヒツジに１回および２回投与ののち、それぞれ血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体においてアジュバント単独に比較して有意な増加が生じたという点でＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントへＭＰＬを添加することによる長所も示される。
【００７５】
参照文献:
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【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、被検体、特にヒト被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法に関し、さらには、投与で針を用いない経路に有用な方法に関し、それによって皮下および筋肉経路のようなワクチンの投与の従来の注入経路に代わる方法を提供できる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
長年にわたって、非生ワクチン抗原を送達する手段として気道を利用したさまざまな試みがなされている。この経路は、ワクチン受容性に関する長所を示し（「針恐怖症」を避ける）、局所免疫応答を誘導する機会、および粘膜免疫系の想定される統一性を考えれば、遠位粘膜サイトでの応答を誘導する可能性を有する。ヒトおよび動物において鼻腔内経路によるワクチン送達は多くの配慮が注がれる。現在までの結果によれば、この経路は、抗原接種と免疫誘導とを確保するために、非常に高い抗原投与量および／または特別な送達技術の利用が必要であることが分かっている。同様に、従来、肺内または肺経路を通じるワクチン送達は、免疫応答を最適化するために、概して、マイクロカプセル化（たとえば、オヤ アルパ（Ｏｙａ Ａｌｐａ）ら、２００５参照）などの特別な送達の技術が要求された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明の先行する研究として、本発明者らは鼻腔内経路によるワクチン投与は、高い抗原投与量であったとしても、あまり効果的ではなく、局所免疫はほとんど誘導されないことを調べた。さらに、本発明者らは、「針恐怖症」を避ける長所を保ったワクチン投与の別の方法を発明した。
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らは、免疫応答を誘導する手段として、鼻腔内経路によるワクチン送達を超えて、肺にワクチン送達することの優位性について示した。彼らは、強い全身性免疫応答は、肺を通じてアジュバントと送達された際にとても少ない抗原量で誘導することができることも示した。特に、本発明者は、抗原とアジュバントとを組み合わせた単純なワクチンが、特別な接種技術を必要とせず、肺内送達によって強い全身性免疫応答を有することを示した。意義深いことに、肺を通じてアジュバントとわずか少量の抗原量とが送達されたときでさえ、従来の非経口免疫付与によって誘導される免疫応答よりも１００倍強い肺粘膜免疫応答が得られることが示された。
【０００５】
グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）ら（１９９７）には、水酸化アルミニウムと一緒のリポソームまたはまたはＰＢＳ中のいずれかで製剤化されたリシン類毒素の気管内送達が記載されている。リポソーム処方群は、一番の保護を示した；水酸化アルミニウムは、ＰＢＳに対して保護（作用）を改善しなかった。ＷＯ２００５／１１０３７９には、微粒子マラリアワクチンの肺送達について説明している。その製剤は、微粒子製剤として送達され、抗原の持続的な放出を可能とした。
【０００６】
この明細書において先行文献（またはそれから得られる情報）または、知られている事項についての参照は、先行文献（またはそれから得られる情報）またはこの明細書が関連する活動の分野における一般常識を構成するものであると認識、承認、提案すると解釈されず、かつ解釈するべきではない。
【０００７】
本明細書および請求の範囲を通して、文脈から別の解釈を要求されるときを除き、記載した整数もしくは工程、または整数もしくは工程以外を除外するものではないと解釈される。「含む」および／または「含んでいる」のようなバリエーションは、記載した整数もしくは工程の包含、または整数もしくは工程の群を包含することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概略
本発明は、ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与することを含み、該組成物は、肺内経路または肺経路によって被検体に投与される前記方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、組成物は、肺内または肺投与に適した処方物である。
【００１０】
別の局面では、本発明は、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用に関する。
【００１１】
また、さらに別の局面では、本発明は、肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】上部および下部（または深部）肺に対応する領域を示すヒツジ肺の略図である（ニッケルら、１９７９から改良した肺略図）。
【図２ａ】最初の実験で得られた結果を説明する図である。ヒツジの群は、インフルエンザウイルス抗原（インフルエンザ抗原）単独、または、１００μｇイスコマトリックス（以下、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM）アジュバント（ＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント）と処方された抗原の３週間間隔をあけた３回の投与で皮下（ｓ／ｃ）または肺内（肺）経路によって免疫された。血（血清）および肺（気管支肺胞洗浄液−ＢＡＬ）サンプルは、第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。抗体応答（１５μｇインフルエンザウイルス抗原単独からなる処方物（現在利用されているインフルエンザウイルスの１価の投与量と同等）、および１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたインフルエンザ抗原の量を減らした処方物を１、２および３回投与量（１°、２°および３°）の後の酵素イムノアッセイにおけるインフルエンザ特異的エンドポイントタイター）を示す。血清およびＢＡＬ（肺）サンプルに対してＩｇＧおよびＩｇＡの両方についのアッセイした。（＊：マンホイットニー分析を用いた有意差）水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図２ｂ】図２ａに同じ。
【図２ｃ】図２ａに同じ。
【図２ｄ】図２ａに同じ。
【図３ａ】最初の実験で得られた結果を説明する図である。ヒツジの群は、インフルエンザウイルス抗原（インフルエンザ抗原）単独、または、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバント（ＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバント）と処方された抗原の３週間間隔をあけた３回の投与で皮下（ｓ／ｃ）または肺内（肺）経路によって免疫付与された。血（血清）および肺（気管支肺胞洗浄液−ＢＡＬ）サンプルは、第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。 図２と同じ免疫とサンプリングスケジュールおよびアッセイ手順による抗体応答を示す。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸＴＭアジュバントと一緒またはなしでインフルエンザ抗原（０．０４μｇ）のとても低い投与量で皮下経路および肺内経路によって免疫を行なった。（＃，＊，＾，§，☆：マンホイットニー分析を用いた有意差）水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図３ｂ】図３ａに同じ。
【図３ｃ】図３ａに同じ。
【図３ｄ】図３ａに同じ。
【図４】上部または下部肺（図１）のいずれかに送達された１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMと処方された０．０４μｇインフルエンザ抗原を３回投与量で免疫した後のヒツジの群における抗体応答を示す。血清とＢＡＬ（肺）サンプルは、３回目の投与後１週間後採取した。 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図５】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）△ｇＢタンパク質をＮＨＳ−活性化ＨＰカラムと結合させたｇＢ特異的５８−１５モノクローナル抗体のアフィニティークロマトグラフィで精製したのち、精製された該タンパク質のクーマシー−ストレインＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動ゲルである。レーン１〜４は、４つの異なるアフィニティ精製から精製された△ｇＢが流れた様子を示す。
【図６ａ】皮下または肺内経路のいずれかで送達された１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMと処方されたＣＭＶ△ｇＢを３回投与後の８匹ヒツジからなる群におけるＣＭＶ△ｇＢ特異的抗体応答を示す。血清およびＢＡＬサンプル中の抗体応答はアッセイされ、ＩｇＧおよびＩｇＡのエンドポイントタイターを△ｇＢ特異的ＥＩＡを用いて決定した。グラフは、最初の投与の２週間後（第１後）、そして、第２（第２後）および第３（第３後）投与の１週間後の抗体応答を示す。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図６ｂ】図６ａに同じ。
【図６ｃ】図６ａに同じ。
【図６ｄ】図６ａに同じ。
【図７】図６と同じヒツジの群における、ＣＭＶに対する個体ごとの中和タイター率を示す。１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢの第１投与の１週間前（免疫前）、第１投与の２週間後（第２）、第２投与の１週間後（第３）および第３投与の１週間後（第３）に得られた血液からの血清サンプルでＣＭＶ中和活性のアッセイした。それぞれの丸点は、定めた投与点で採取された個々のヒツジ血清の中和率である。処方の２および３回投与量の後の血清ＣＭＶ中和タイターは、肺内および皮下送達の免疫前血清よりとても高い値を示した。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。
【図８】△ｇＢとインキュベーションした後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のインビトロ再刺激の結果を示す。ＰＢＭＣｓは、実施例７と同様に同じヒツジの末梢血から１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢの第３投与量の投与の１週間後に採取した。△ｇＢで刺激した後、細胞増殖は、細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンのアッセイで決定した。刺激インデックス（ＳＩ）は、刺激していないコントロール細胞に取り込まれたトリチウムの割合と、△ｇＢで刺激された細胞に取り込まれたトリチウムの割合とから計算された。ＳＩ≧４は、ポジティブ増殖応答とみなす、
【図９ａ】さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原による免疫されたヒツジの群（アジュバントなしインフルエンザ抗原付与群に４ヒツジ。それぞれのアジュバンドの群には７ヒツジ）における抗体応答を示す。免疫付与とサンプリングスケジュールとアッセイ手順は、図１と同様とした。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図９ｂ】図９ａに同じ。
【図９ｃ】図９ａに同じ。
【図９ｄ】図９ａに同じ。
【図１０ａ】図９におけるヒツジと同じ群の血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイ結果を示す。それぞれのサンプルのＨＡＩタイターは、七面鳥の赤血球におけるエンドポイント阻害によって決定した。（＊：ＡＮＯＶＡを用いた有意差） 統計分析は、データをｌｏｇ変換した後に行ない、ＳＰＳＳソフトウェアバーション１３を用いたダネットポスト−ホック分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって群を比較した。水平バー：中央値、オープンバー：値の中間５０％、垂線：１０および９０％
【図１０ｂ】図１０ａに同じ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ひとつの局面として、本発明は、ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与し、前記組成物は、肺内経路によって被検体に投与される方法を提供する。
【００１４】
好ましくは、被検体はヒトである。しかしながら、本発明の方法は、家畜動物（たとえばヒツジ、ウシまたはウマ）、研究試験用動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、ペット（たとえば犬または猫）または野生動物のような動物被検体における免疫応答を誘発または誘導することにまで拡大することもできる。
【００１５】
本明細書において、組成物の「肺内」または「肺」送達への言及は、肺の粘膜表面への組成物の送達を言及する。組成物の活性構成要素（言い換えれば抗原とアジュバント）は、肺および／または粘膜免疫系における毛細系を含むことができる。これらの用語は、組成物の「深部肺」または「下部肺」送達を含み、それは、肺の深部気管支、細気管支および／または肺胞への組成物の送達である。
【００１６】
好ましくは、本発明にしたがって、抗原とアジュバントとを含む組成物は、噴霧器または、同様の機器を用いたエアロゾルまたは乾燥パウダーとともにエアロゾルまたは乾燥パウダーフォームで被検体の肺に投与される。薬剤活性製品の肺内または肺送達のための標準的な機器または製品は、当業者によく知られている。
【００１７】
上述したように、別の局面として、本発明は、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用を提供する。
【００１８】
さらに別の局面として、本発明は、肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品を提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明に従って投与される抗原は、肺の病原体に対して免疫応答を誘発または誘導するであろう抗原である。前記病原体は、たとえばインフルエンザ、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｉａｅ）、呼吸器合胞体ウイルス、または、肺炎球菌等である。しかしながら、抗原は、ほかの粘膜サイトの病原体を含む他の病原体に対する免疫応答を誘発または誘導するものから選ばれてもよい。これは、たとえば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、コレラ、ＨＩＶ、または、性感染症生物などである。本発明に従って投与される抗原は、高い受容体受容性の利点を有する（「針恐怖症」の回避および投与の容易性）。特に、強い粘膜および全身性免疫応答の双方を生じさせ、そのことは全身性免疫応答に依存しているすべてのワクチンにとって有益であろうことを示す。
【００２０】
抗原は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原であってもよい。好ましくは、腫瘍は、粘膜サイトに関連するものである。粘膜サイトに関連する腫瘍は、肺腫瘍に限定されるものではなく、消化管の腫瘍、または、生殖管腫瘍を含む。
【００２１】
抗原は、ヒトまたは動物における免疫応答を誘発または誘導できる化学物質であってもよく、不活性細菌全細胞またはそれらのサブユニット、完全不活性ウイルスまたはそれらのサブユニット、タンパク質またはペプチド、グリコタンパク質、炭水化物、ガングリオシド、ポリサッカライド、リポポリサッカライドまたはリポペプチドを含むが、これらに限定されず、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２２】
好ましくは、アジュバントは免疫刺激アジュバントであり、より好ましくは、サポニンベースアジュバントであり、さらにより好ましくは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM（イスコマトリックス）アジュバントのような免疫刺激複合体（またはＩＳＣＯＭTM）である。しかしながら、本発明は、単独またはそのほかのアジュバントと組み合わせた他の免疫刺激アジュバントの使用も含む。他の免疫刺激アジュバントとは、たとえば、リポソーム、ＭＦ５９のような水中油型アジュバント、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩アジュバント、リピッドＡおよびモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピッドＡ（ＭＰＬ）のようなリポポリサッカライドアジュバント、ＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバントのようなオリゴヌクレオチドアジュバントおよびコレラ毒素のような粘膜アジュバントを含む免疫刺激複合体のようなものを挙げることができる。好ましい免疫刺激アジュバントは、コックス（Ｃｏｘ）とコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、１９９７による例に説明されている。
【００２３】
本発明の組成物は、現存する多くの技術と研究過程における同等の技術をもちいて肺に送達してもよい。薬を送達できる機械機器、または肺へのタンパク質調製物が存在し、および噴霧およびエアロゾル機器の多くの例がここ数十年間、喘息の治療に用いられている（ゴンダ（Ｇｏｎｄａ）、２０００参照）。主に、これらの機器は、経口吸入による肺への送達手段を含む。本分野の近年の進歩は、３Ｍコーポレーション（ショエル（Ｓｈｏｙｅｌｅ）とスロウェイ（Ｓｌｏｗｅｙ）、２００６）およびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ システムＩｎｃ．（クオ（Ｋｕｏ）とレチュガ−バレステロス（Ｌｅｃｈｕｇａ−Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ）、２００３）によってつくられたものを含む。
【００２４】
本発明に従うと、本組成物は、免疫学的に効果的な量がヒトまたは動物被検体に投与される。ここで、免疫学的に効果的な量とは、少なくとも部分的に所望の免疫応答を達成するために、治療すべき特定の状態の（１）開始を遅延、（２）進行を阻止、（３）完全に停止するために必要な量である。この量は、治療される個体、治療される個体の分類学群、個体の免疫適格、所望の保護度合い、ワクチンの処方、医学状況の判定、そして他の関連のある要素に応じて変化する。この量は、通常の試行を通じて決定される比較的広い範囲にあることが期待される。
【００２５】
注目すべきことは、しかしながら、本発明の特に重要な効果は、抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物の肺内投与において、粘膜応答と同様の抗原に対する全身性抗体応答を引き起こすだけではなく、そのような全身性および粘膜応答を誘発または誘導するために必要な抗原投与量の大きな減少を可能とすることを発見したという事実を含むことである。加えて、本発明に従ったワクチン組成物の効果的な肺内投与は、マイクロカプセル化、または粘膜接着、または技術粘膜サイトにおけるワクチン摂取を増加するためのほかのテクノロジーのような複雑な送達システムの必要性を回避することができる。
【００２６】
その上、大いに改良された粘膜抗体応答の誘導は、肺内免疫付与が、粘膜感染のワクチン有効性を高め、そして、潜在的に免疫化／感染化したヒトからの病原体伝達を減少することができることを示す。
【００２７】
特に、粘膜抗体は、インフルエンザ攻撃に対する保護免疫の改良／改善において、大きな価値を有する可能性がある。近年のＷＨＯ協議レポート（ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔ）（カセッティ（Ｃａｓｓｅｔｉ）ら、２００６））は、以下のように述べている：マウスモデルにおいて、粘膜ＩｇＡは、攻撃に対する保護と関連している。そして、ヒトにおける生きた衰弱ワクチンの研究において、粘膜ＩｇＡの存在はウイルス排泄の減少と実験感染に対する耐性とに関連する。粘膜ＩｇＡは、インフルエンザウイルス感染に対して保護する役割を果たすようであること、および多くの研究で、粘膜免疫応答を減少させるウイルスの能力を向上させるべきであること．．．．．．と結論付けている。
【００２８】
さらに、本発明の肺内送達経路は、他の感染に対するワクチンの潜在的価値を有し、そして、一次全身性抗体応答を要するワクチンのための代替送達経路を提供する。
【００２９】
その上、本発明に従って投与される抗原は、強い細胞性免疫応答を誘導する。肺内経路によって送達されるアジュバントと一緒の抗原は、抗原に応答して、特異的に増殖する末梢血細胞の生成を刺激する。これらの細胞は、抗体応答を高め、ウイルス感染細胞の殺傷のようなエフェクター機能をなす機能を有するＴ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋クラスの双方に属する。抗体応答に加えて細胞免疫応答を誘導する能力は、感染物質、特にＨＩＶ、ヘルペスウイルスおよびマイコバクテリア、クラミジア菌およびリステリア菌のようなライフサイクルで細胞内相を含むバクテリアに対するワクチン接種において潜在的価値を有する。
【００３０】
本発明のさらなる特徴は、以下の実施例でさらに十分に説明する。しかしながら、この詳細な説明は、単に本発明を例示する目的のために含めたものであって、上述に説明した本発明の広範な説明を制限するものと理解されてはならない。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞
≪背景≫
本発明の背景として、発明者は、カニューレ処置されたヒツジをモデルとしてワクチン送達の形態について調べた。カニューレ処置は、詳細に調査すべき流入領域リンパ節の流出を可能とする。この研究は、ヒツジに対して、ワクチンモデルとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTM（イスコマトリックス）アジュバントインフルエンザウイルスワクチンを用いて行なった。この研究の重要な発見は、鼻腔内投与においては、高い抗原投与であったとしても、あまり効率的でなく、弱い局所免疫を誘導することである。
これらの発見は、ワクチンを肺葉深くに送達することによる肺内経路によって、カニューレ処置されていないヒツジに対するワクチン送達の効果を調査する方向への研究の変化を促進した。
【００３２】
≪実験方法≫
血液採取
ヒツジを拘束し、１０ｍＬシリンジと１８Ｇ針を用いて頚動脈から血液１０ｍＬを採取した。
【００３３】
免疫付与
本研究では、スクロースグラディエント精製Ａ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａ ２０／９９Ｈ１Ｎ１ウイルスをインフルエンザ抗原として用いた。該ウイルスは不活化されており、界面活性剤で破壊しておいた（Ｃｏｕｌｔｅｒら、１９９８）。抗原濃度は、血球凝集素含有量をベースにして一元放射免疫拡散法で決定した。ＧＭＰグレードＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドは、以前説明されているプロセスに従ってＣＳＬリミテッドより準備した（ＰｅａｒｓｅとＤｒａｎｅ、２００５）。免疫付与の前に、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドと好ましい量の抗原とを混合したものをワクチン処方物とした。
肺内免疫付与において、ヒツジを慎重にハーネスに拘束した。そして、左鼻腔から左肺の下葉に気管支鏡を注入した。
皮下免疫付与のために、ワクチン処方物を１ｍＬシリンジと２５Ｇ針を用いて大腿部内部に２００μｌの全容量を送達した。
【００３４】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）採取
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルを採取するために、免疫のためと同様に拘束しているヒツジに気管支鏡を挿入し、気管支鏡に取り付けたシリンジを用いて肺葉にＰＢＳ（リン酸バッファーｐＨ７．２）１０ｍＬを送達した。その際、同じシリンジを用いて気管支鏡によってＢＡＬ流体を回収した。
【００３５】
ＥＩＡによる抗体応答評価
ＢＡＬにおける抗インフルエンザ抗体と血清サンプルは、ＥＩＡ（エンザイム イムノエッセイ）によって二連で評価した。つまり、濃度１０μｌ／ｍＬでインフルエンザ抗原を含む炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）５０μＬで、９６ウェルマキシソープフラットボトムプレート（ＮＵＮＵ、ロスキルド（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）の表面を被覆して一晩おいた。プレートは１％カゼイン酸ナトリウムでブロッキングしてから、二連でサンプルの１／５系列希釈の１００μＬ添加した。特異的抗インフルエンザ抗体の結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼと抱合するウサギ抗ヒツジ全Ｉｇ、または、ウサギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼによって結合させた抗ウシ／ヒツジＩｇＡ（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、オクスフォード）を用いて検出した。色度はＴＭＢ物質（ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシスコ）を添加することで発色させ、２ＭのＨ2ＳＯ4を添加することで停止させた。４５０ｎｍ光学濃度をＢｉＯ−Ｔｅｌ ＥＬｘ８００プレートリーダーで検出し、抗体エンドポイントタイターを計算した。
【００３６】
血球凝集抑制の評価
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体応答を示した血清およびＢＡＬサンプルは、血球凝集抑制（ＨＡＩ）についても調べた。このアッセイは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集の阻害状態を測定することで、機能的抗体のタイターを決定するものである。サンプルは、七面鳥の赤血球を用いてタマゴで増殖させたＡ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａ ２０／９９ウイルス（Ｈ１Ｎ１）に対してＨＡＩテストした。ＨＡＩタイターは、赤血球のインフルエンザ凝集を阻害したエンドポイント希釈物によって決定した。ＨＡＩアッセイは、オーストラリアのメルボルンにあるＷＨＯとのインフルエンザ委託研究共同研究所（ＷＨＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）で行なった。
【００３７】
末梢血単核球細胞のインビトロ抗原再刺激
シリンジおよび１８Ｇ針を用いて頸静脈から採取された血液サンプル（５０ｍＬ）を５０００Ｕ／ｍＬのヘパリン１００μＬが入った５０ｍＬチューブに入れた。該細胞が壊れないように８００ｇで２０分間遠心分離し、バフィーコートを１５ｍＬチューブに入れ、ＰＢＳで８ｍＬになるよう希釈した。トランスファーピペットを用いてフイコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）の３．５ｍＬを細胞懸だく液の底に加えて、そして、サンプルが壊れないように１０００ｇで３０分間遠心分離した。次に、末梢単核球細胞は、フイコール−ＰＢＳの界面から採取され、ＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したダルベッコ 修正イーグル培地）に５×１０6／ｍＬで再度懸だくした。
抗原再刺激アッセイに擱いて、細胞１００μＬ（５×１０5／ウェル）を９６ウェル組織培養プレートに分注した。該プレートには、培地のみ、または、Ａ／ＮＥＷ Ｃｌｅｄｏｎｉａインフルエンザ抗原を１０または２０μｇ／ｍＬ含む培地いずれかを３連で１００μＬ加えた（最終濃度５または１０μｇ／ｍＬ抗原）。加湿インキュベーターにて３７℃で５日間培養した後に、すべてのウェルを１μＣｉのトリチウム化チミジン２０μＬでパルスラベルした。細胞は、パッカードハーベスターを用いてグラスファイバフィルタの上に播種した。そして、細胞はマイクロスキント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）シンチレーション液とカセットに回収され、β放射線を自動マイクロプレートスキントカウンターを用いて測定した。
【００３８】
上部および下部肺への免疫付与の評価
上部肺への送達、および下部肺への送達による免疫付与の有効性の評価は、以下に説明するように行なった。図１（Ｎｉｃｋｅｌら、１９７９）は、上部および下部肺への送達に用いられたヒツジ肺の場所（部位）を示す。
ワクチンは「上部肺」に送達した。−ワクチンは、ファイバ光学気管支鏡を用いて上部肺に送達された。ワクチンは、主気管分岐点の１ｃｍ先の主気管支に導入された。
ワクチンは、「下部肺」に送達した。−ワクチンは、ファイバ光学気管支鏡をもちいて下葉に深く送達された。ワクチンは、尾部気管支（ｃａｕｄａｌ ｂｒｏｎｃｈｕｓ）が尾部区気管支（ｃａｕｄａｌ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｒｏｎｃｈｉ）とつながる１０ｃｍ先の気管分岐点に導入された。
免疫付与、採血、ＢＡＬ採取およびＥＬＩＳＡアッセイは、ほかの実験で説明されるように行なった。ヒツジは、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドに０．０４μｇインフルエンザ抗原の３回投与した。
【００３９】
≪結果≫
肺内経路への免疫付与による抗体誘導
３回の別々の実験で、ヒツジに肺内経路によって免疫した。採血は、１回（°）投与から２週間後、そして、２回および３回投与から１週間後に行なわれた。
実験１ ヒツジに１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを加えた抗原をそれぞれ１、５または１５μｇ免疫した。３回免疫付与は、３週間間隔をあけて行なった。血清サンプルは、始まる前、および、それぞれワクチン接種した後採取した。
肺内に送達されたアジュバントインフルエンザ抗原の１μｇは１５μｇと同様に有効であるという驚くべき発見に続いて、２番目の実験（実験２）では、抗原投与量のさらなる減少について調べた。
実験２ ヒツジに１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを加えた抗原をそれぞれ０．０４、０．２、１、５または１５μｇ免疫した。３回免疫付与は、３週間別々に行なった。血清サンプルは、始まる前、および、それぞれ免疫付与した後採取した。
これらの実験ですべての抗原投与量（たとえ０．０４μｇ抗原ほど低くても）が受容性動物に十分な抗体応答を誘導することが示された。低い抗原投与量は１回目の投与後ごくわずかな抗体を誘導する。しかしながら、受容性動物での免疫は、次の２および３回目の投与後は、高い抗原投与量の免疫と同様である。これらの抗体応答は、機能的に血球凝集抑制（ＨＡＩ）を含む。
０．０４μｇ抗原および１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバンドを有するヒツジ免疫化肺内における血清ＩｇＧおよびＩｇＡレベルは、抗原単独で１５μｇ皮下免疫付与して得られたものと同様であった（現在のワクチン投与量）。低い投与量の肺内免疫付与は、肺における特異的ＩｇＡおよびＩｇＧの非常によいレベルをつくりだす（ＢＡＬ−気管支肺胞洗浄）。低い投与量の肺内免疫付与は、皮下注入で高い投与量による誘導より優れている。
【００４０】
実験３ 第３の実験は、（ｉ）低い抗原投与量による特異的免疫誘導のためのアジュバントの要件、（ｉｉ）肺内に送達された低い抗原投与量（０．０４μｇ）と皮下に送達された低い投与量との直接比較、（ｉｉｉ）より低い抗原投与量を調べる（０．００８μｇ 抗原）。
第３の実験により：
（ａ）第１、２による知見が再現された。
（ｂ）アジュバントがとても低い抗原投与量に対して免疫の誘導に有効であることが示された。
（ｃ）肺内にアジュバント添加した低い抗原投与量を送達することは、皮下に送達された同じ抗原の低い投与量ワクチンまたは現在のワクチン投与量とアジュバント添加と同様な血清抗体および優れた肺抗体を誘導することが見出された。
（ｄ）皮下注入したとても低い投与量の抗原を２回以上投与するとトレランスを誘導することを示すようであり、または、第３の投与後の血清抗体としての阻害効果は減少したようである。この阻害は、以下の肺送達では起こらない。
（ｅ）１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．０４μｇ抗原とから誘導されるより少ないが、１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．００８μｇ抗原でさえ肺内免疫付与は十分な抗体誘導を誘導したことが分かった。
実験１〜３の結合データは、図２および表１にまとめた。
【００４１】
表１：インフルエンザ抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとの投与量の肺内免疫付与によって誘導される血球凝集阻害（ＨＡＩ）活性
【００４２】
表１説明： データは、別々の３回の実験のものを一緒にした。ヒツジの群（１群につきｎ＝８、ただし、１５μｇｆｌｕ（インフルエンザ抗原）群（ｎ＝１２）と０．０４μｇｆｌｕ＋ＩＭＸ群（ｎ＝１６）とを除く）は、ウイルス粒子成分（ｓｐｒｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザ抗原の投与量を減らし、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）の１００μｇを加えて左肺を免疫した。ワクチンコントロールヒツジの群（Ｓ／Ｃ）は、現行のヒトインフルエンザワクチン１系統の同様の抗原投与量を皮下に免疫付与された（１５μｇインフルエンザ抗原単独）。ヒツジは３週間あけて３回免疫付与された。血清および左肺洗浄液（ＢＡＬ）は、すべてのヒツジから第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後に採取された。これらのインフルエンザ介在血球凝集が阻害されたサンプルの滴定はその際決定された。すべての免疫付与前のサンプルは、ＨＡＩ活性を示さなかった（データ示さず）。
＊ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．００４）
【００４３】
表２および図３は、実験３のデータを示す。
【００４４】
表２：極めて低いインフルエンザ抗原投与量によって誘導される免疫付与による血球凝集阻害活性のアジュバントおよび送達経路の要件
【００４５】
表２説明： ヒツジの群（ｎ＝８）は、ウイルス粒子成分（ｓｐｒｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザ抗原の極めて低い投与量（０．０４μｇ）と１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）（またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント（ＩＭＸ）を含まない）とによって左肺に免疫した。ほかの群は、皮下に注入された同じワクチンを付与された（Ｓ／Ｃ）。コントロールヒツジのひとつの群は、現行のヒトインフルエンザワクチン１株の同様の抗原投与量を皮下に免疫付与された（１５μｇインフルエンザ抗原単独）。ヒツジは３週間あけて３回免疫付与された。血清および左肺洗浄液（ＢＡＬ）は、すべてのヒツジから第１投与の１週間前および第１投与の２週間後および第２および第３投与の１週間後で採取された。これらのインフルエンザ介在血球凝集が阻害されたサンプルの滴定はその際決定された。すべての免疫付与前のサンプルは、ＨＡＩ活性を示さなかった（データ示さず）。
＃ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に低いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．００２）
＊ 皮下免疫付与コントロールと比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．０２８）
＾ アジュバントを含まない群と比較して有意に高いＨＡＩタイター（マンホイットニー；ｐ＜０．０１）
【００４６】
図１および２において
水平バー：中央値
オープンバー：値の中間５０％
垂線：１０および９０％
ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント
バーは、上述したように第１（１°）、第２（２°）および第３（３°）の後の免疫付与インフルエンザ特異的エンドポイント抗体タイターを示す。
図１： ＊１５μｇ ｓ／ｃ群より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０３）
図２において、
＃ １５μｇ ｓ／ｃ群より有意に低い（マンホイットニー；ｐ＜０．０１）
＊ １５μｇ ｓ／ｃ群より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０３８）
＾ 同じ経路に向かうアジュバントなしワクチン送達より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０３８）
§ 皮下、同じワクチン送達肺内より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０２８）
☆ 肺内、同じワクチン送達皮下より有意に高い（マンホイットニー；ｐ＜０．０２１）
【００４７】
実験４ この実験では、上記実験で用いられた下部肺への送達と比較して、上部肺へのアジュバント化インフルエンザ抗原の送達の有効性を評価した。８ヒツジの２群は、０．０４μｇインフルエンザ抗原と１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとを含む処方物をそれぞれ上部肺または下部肺のいずれかに３回付与され、血清とＢＡＬ抗体応答は、ＥＩＡによって調べた（図４）。
これらの結果は、３回の投与の後、上部肺への送達は血清とＢＡＬ応答を誘導したけれども、ＩｇＧおよびＩｇＡ双方の血清およびＢＡＬ双方の有意によい応答は、下部肺送達によって誘導されたことを示した。
【００４８】
≪要約≫
１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとインフルエンザウイルス抗原とを用いて肺内免疫付与することで、全身性および粘膜の双方の抗体誘導においてＨＡＩ活性を伴う高い有効性が証明された。
強い血清抗体応答は、抗原の極めて低いレベル（１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントおよび０．０４μｇインフルエンザ抗原）でさえ観測することができる。これらの応答は、インフルエンザ抗原単独で１５μｇの皮下注入（現行のワクチンと同様に）によって誘導される応答よりも強いものであり、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと皮下０．０４μｇインフルエンザ抗原とによって誘導される応答と同等であった。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと０．０４μｇインフルエンザ抗原との肺内送達によって誘導される粘膜抗体応答は、皮下にインフルエンザ抗原１５μｇ注入する場合、または皮下にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントとインフルエンザ抗原０．０４μｇとを注入する場合よりも、高く評価された。後者のいずれもが、検出できる粘膜（肺）応答を誘導しなかった。
【００４９】
＜実施例２＞
≪肺内経路を通じたワクチンによる細胞免疫誘導≫
ヒツジは、０．０４μｇインフルエンザ抗原単独、または０．０４μｇインフルエンザ＋１００μｇＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントのいずれかで４回肺内免疫付与された。最後の免疫付与の後１週間後、末梢血を採取し、培地のみ（ネガティブコントロール）で、または５または１０μｇインフルエンザ抗原と一緒に（再刺激）単細胞を９６ウェルプレートで培養した。５日後、ウェルは、２４時間トリチル化チミジンでパルスした。その際、放射線を測定して、細胞増殖を数えた。刺激インデックスは、培地単独のコントロール群の平均ｃｐｍで再刺激された群の１分間あたりの平均カウント（ｃｐｍ）を割ることで、計算された。
細胞増殖調査の結果は、表３に示す。ヒツジを抗原単独で肺内にワクチン接種した場合、末梢血において増殖応答は検出することができなかった。しかしながら、そのような応答は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと抗原とを受けたヒツジにおいては、検出された。これらのデータは、アジュバントの必要性、次に肺ワクチン送達することで、末梢循環における細胞増殖記憶応答を誘導することが示された。
【００５０】
表３：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントがある場合とない場合とに分けて、インフルエンザ刺激された、低い投与量抗原で肺内を免疫付与したヒツジから得られた末梢血単細胞の増殖応答
【００５１】
＜実施例３＞
≪微小流動化水中油アジュバントを含む肺内経路による投与のための抗原処方物≫
好ましい濃度の抗原（結果として０．０１〜５００μｇの範囲の単位用量を生成する最終抗原濃度）は、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２のＰＢＳ中における５％ｖ／ｖスクアラン、０．５ｖ／ｖトゥイーン８０、０．５％ｖ／ｖスパン８５と混合した。次に、この混合液は、１平方インチ（６．４５２ｃｍ2）あたり（ｐｓｉ）１９〜２０，０００ポンド（８．６１８〜９０７１．８４９ｋｇ）の圧力で高圧流動化を行なった。この処方物は、上述された方法による肺内経路を通じて送達された。
【００５２】
＜実施例４＞
≪ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方した組換え型サイトメガロウイルスｇＢ抗原で肺内経路を通じた免疫付与によって誘導された全身性および粘膜免疫≫
インフルエンザ抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントから得られた結果を確証し、拡張するために、組換えウイルス抗原の肺内送達によって誘導された免疫応答をヒツジで調べて研究した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたサイトメガロウイルスｇＢグリコタンパク質の短縮形態を肺内、および皮下経路で送達し、ＥＩＡによって血清および肺における抗体応答を評価した。加えて、機能的抗体の誘導を、血清におけるＣＭＶ中性抗体アッセイで評価した。肺内にＴ細胞応答の誘導をもたらした処方の能力は、末梢血単細胞のｇＢ特異的細胞増殖を評価することでも調べられた。
【００５３】
≪実験方法≫
短縮組換えヒトＣＭＶｇＢタンパク質（△ｇＢ）の製造
１．ＣＭＶ△ｇＢタンパク質をコードしたＤＮＡを含むプラスミドの作製
タンパク質の膜貫通領域を取り除いて設計されたＣＭＶｇＢの短縮形態をコードしたＤＮＡをオーストラリアのブリズベンのクイーンズランドメディカルリサーチ研究所の准教授ラージ ハーナ（Ｒａｊｉｖ Ｋｈａｎｎａ）からいただいた。このＤＮＡは、ｇＢの細胞外、および細胞質内ドメイン（ＮＣＢＩ Ｐ０６４７３）がインフレームで融合した組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナル配列を含むタンパク質をコードしている。なお、そのＤＮＡは、発現タンパク質の開裂を防止するためのアミノ酸４６０／４６１周辺の領域をコードしたヌクレオチドにポイントミューテーションを導入した。そのＤＮＡを、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＣＥＰ４ベクターにクローン化した。得られたプラスミド（ｐＣＥＰ４△ｇＢ）は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で増殖させ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）マキシキットを用いて精製プラスミドを調製した。
【００５４】
２．哺乳類細胞における△ｇＢタンパク質発現
振とうフラスコにおいて３７℃でＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM発現培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させたＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３−Ｆの培養物を２９３フェクチントランスフェクションリージェント（インビトロゲン）を用いてｐＣＥＰ４△ｇＢでトランスフェクションした。培養中ハイグロマイシンＢを用いてセレクションをかけたタンパク質△ｇＢの分泌発現は細胞上澄みサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で決定した。細胞培養上澄みを採取し、２５００ｒｐｍで遠心分離機によって浄化した。次に、０．４５μｍフィルターを通した後にクロマトグラフィにかけた。
【００５５】
３．△ｇＢタンパク質の精製
ｇＢ特異的モノクローナル抗体５８−１５（シング（Ｓｉｎｇｈ）とコンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、２０００）で捕獲するアフィニティークロマトグラフィを用いて△ｇＢタンパク質を精製した。抗体は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア）タンパク質Ａカラムで精製した。△ｇＢタンパク質の精製のため、精製された抗体を、平衡バッファー（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3／０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）中でＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化ＨＰカラムとカップリングした。浄化した細胞培養上澄みは、１００ｍＭホウ酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．５で、１：１に希釈した。希釈した上澄みを、ＨｉＴｒａｐカラムにアプライし、平衡バッファーで平衡化し、そして、まず、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．５、続いて平衡バッファーで溶出し、今度は、０．１５Ｍ水酸化アンモニウムで再び溶出した。溶出した画分は、３ＭトリスｐＨ８または１ＭグリシンｐＨ２．５のいずれかを用いて中和させた。タンパク質精製はクーマシー−ストレインＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法で調べた（図５）。タンパク質濃度は、２８０ｎｍのＯＤを決定することで測定した。
【００５６】
≪△ｇＢを用いたヒツジの免疫付与≫
血液採取
方法は、実施例１で説明した方法と同じとした。
免疫付与
ヒツジは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢ
タンパク質とで免疫付与された（表４）。サイトメガロウイルスの△ｇＢタンパク質は上述したように調製した。
すべてのヒツジは、３回ワクチン投与を受けた。血液採取スケジュールを含む詳細は、実施例１で説明したとおりである。
【００５７】
表４：ヒツジの群は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢタンパク質とで免疫付与された。
【００５８】
ＢＡＬ採取
ＢＡＬの採取は、実施例１で説明したとおり行なった。
ＥＩＡによる抗体応答の評価
ヒツジＩｇＧおよびＩｇＡを検出する方法は、以下の例外を含めて実施例１の方法と同様とした。プレート（９６ウェル）に、１ウェルあたり１００μｌの２μｇ／ｍＬ精製△ｇＢタンパク質を含むＰＢＳで一晩コートした。固定したヒツジＩｇＧは、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ヒツジ全ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出した。ＩｇＧおよびＩｇＡ双方の場合において、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質は、それぞれＫＰＬキークガード（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）およびペリー（Ｐｅｒｒｙ）ラボラトリーズから供給された。１ウェルあたり、０．５ＭのＨ2ＳＯ4を５０μｌ添加することで反応をとめた。
【００５９】
ＣＭＶに対する機能活性の評価
機能的血清抗体を誘導するワクチンの能力は、ＭＲＣ−５細胞の組換えヒトサイトメガロウイルス感染を基礎とした中和アッセイを用いて評価した。アッセイは、オーストラリアのブリズベンのクイーンズランドメディカルリサーチ研究所の准教授ラージ ハーナ（Ｒａｊｉｖ Ｋｈａｎｎａ）と同業者とが、緑色蛍光タンパク質を発現する組換えＣＭＶＡｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰを用いて行なった（マースチェル（Ｍａｒｓｃｈａｌｌ）ら、２０００；ワング（Ｗａｎｇ）ら、２００４）。血清希釈物にＣＭＶＡｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰをさらした後にヒト繊維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に感染するウイルスの能力をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて細胞核蛍光の割合を定量化することで評価した。
【００６０】
１． ヒツジの血清を５６℃で３０分間インキュベートした。
２． ヒツジの血清（ストレート、１００μｌＤＭＥＭの２倍、４倍希釈物）を９６ウェルトレイに分注した。
３． ２５μｌ（２．５×１０4ＰＦＵ）Ａｄ１６９ｗｔ８６−ＥＧＦＰウイルスをそれぞれの血清サンプルに添加した。
４． 血清／ウイルスサンプルを空気中７％ＣＯ2の雰囲気で２時間３７℃インキュベートした。
５． あらかじめ、空気中７％ＣＯ2の雰囲気において２時間３７℃でインキュベートした１０％胎児ウシ血清（ＤＭＥＭ−１０）を含むＤＭＥＭで生育させたＭＲＣ−５細胞を含む４８ウェル平板底トレイを準備し、使用するときまで細胞密集度８０〜９０％とした。
６． 細胞培養培地をＭＲＣ−５細胞から取り除いた。その際、それぞれのウイルス／血清サンプル５０μｌを、ＭＲＣ−５細胞を含む４８ウェル平板底トレイにおいて対応するウェルに移動させた。５０μｌＤＭＥＭを加え、４８ウェルトレイはゆるやかにゆすって空気中７％中ＣＯ2の雰囲気で２時間３７℃インキュベートした。
７． 接種物は、４８ウェルトレイから吸引され、ウェルは３回ＤＭＥＭ−１０で洗浄し、その後それぞれのウェルに５００μｌのＤＭＥＭ−１０を添加し、空気中７％中ＣＯ2の雰囲気で一晩３７℃インキュベートした。
８． 翌日、細胞培地と細胞（トリプシンを使用）とを４８ウェルトレイから集め、遠心分離によって細胞ペレット化した。
９． ペレットは、ＰＢＳに再懸だくし、そして、再度遠心分離によってペレット化した。
１０． １ｍｇ／ｍＬの７−アミノクチンマイシン（Ａｍｉｎｏｃｔｉｎｍｙｃｉｎ）Ｄを０．２μｌ含む低張バッファー（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）１００μｌに、ペレットを激しく再懸だくし、暗所室温で２０分間静置した。
１１． それぞれのペレットのサンプルは、ＦＡＣＳ分析に適したチューブに移され、１％パラホルムアルデヒドを含む１００μｌのＰＢＳを添加した。混合物は、ＦＡＣＳ分析の前３０分間氷上で静置させた。
１２． サンプルは、ベクトンディッキンソンＦＡＣＳＣａｎｔｏで分析し、サンプル中の蛍光核の割合を定量化した。
１３． それぞれのサンプルの中和百分率は以下の式を用いて計算した。
％中和＝［蛍光核の割合（血清不添加）−蛍光核の割合（血清サンプル）÷蛍光核の割合（血清不添加）］×１００
【００６１】
末梢血単核球細胞のインビトロ抗原再刺激
シリンジおよび１８Ｇ針を用いて頸静脈から採取された血液サンプル（５０ｍＬ）を５０００Ｕ／ｍＬのヘパリン１００μＬが入った５０ｍＬチューブに入れた。該細胞が壊れないように８００ｇで２０分間遠心分離し、バフィーコートを１５ｍＬチューブに入れ、ＰＢＳで８ｍＬになるよう希釈した。トランスファーピペットを用いてフイコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）の３．５ｍＬを細胞懸だく液の底に加えて、そして、サンプルが壊れないように１０００ｇで３０分間遠心分離した。その際、末梢単核球細胞は、フイコール−ＰＢＳの接触面から採取し、ＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したダルベッコ 修正イーグル培地）に５×１０6／ｍＬで再度懸だくした。
抗原再刺激アッセイのため、細胞１００μＬ（５×１０5／ウェル）を９６ウェル組織培養プレートに分注した。該プレートには、培地のみ、または、ｇＢタンパク質を５、１０、２０または４０μｇ／ｍＬ含む培地いずれかを３連で１００μＬ加えた（最終濃度２．５、５、１０または２０μｇ／ｍＬ）。加湿インキュベーターにて３７℃で５日間培養した後に、すべてのウェルを１μＣｉのトリチウム化チミジン２０μＬでパルスした。細胞は、パッカードハーベスターを用いてグラスファイバフィルタの上に播種した。そして、細胞をマイクロスキント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）シンチレーション液とともにカセットに設置し、β放射線を自動マイクロプレートスキントカウンターを用いて測定した。
【００６２】
≪結果≫
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方した組換えＣＭＶ△ｇＢ抗原を肺内および皮下に免疫付与して起こる免疫応答
ヒツジは、３週間間隔で皮下または肺内にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方されたＣＭＶ△ｇＢ抗原を３回投与量受けた。血清とＢＡＬサンプルは、第１投与の１週間前、第２投与の２週間後、ならびに第２および第３投与の１週間後に採取された。抗体ＥＩＡデータにおいて、着床前の抗体タイターは、差し引いた。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢにおけるこれらの実験の結果（図６）は、概して、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された低用量インフルエンザ抗原（０．０４μｇ）と実施例２と同様であった。肺内におけるＩｇＧおよびＩｇＡ応答は、３回目の投与後、皮下送達における応答と同様であった。しかしながら、インフルエンザ抗原処方から得られた結果と比較して、肺内経路で送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、血清ＩｇＧおよびＩｇＡを２回投与のみののちの皮下送達と同様に誘導した。肺内経路で送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、１回投与量後の応答を調べたとき、有意に高い血清ＩｇＧを誘導した（図６ａおよびｂ）。
【００６３】
肺における抗体応答の場合には、再度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢで免疫付与した後の応答は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された低い投与量のインフルエンザ抗原で免疫付与した実験と同様の結果であった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢは、肺内に送達したとき、同じ処方を皮下送達した場合と比較して、３回目の投与の後、肺で有意に高い抗体応答を誘導した（図６ｃおよびｄ）。
機能的抗体誘導の場合、血清におけるＣＭＶ中和アッセイの結果は、ＥＩＡにおいて得られる血清ＩｇＧ応答の結果と合致した（図７）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された△ｇＢ処方の肺内および皮下の送達の中和抗体応答は、十分に着床前の血清と比較して有意に高かった。中和応答は、３回目の投与の後さらに増加した。この結果は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された抗原は、肺内および皮下経路によって送達されたとき、中和抗体の誘導における同等性を示している。
【００６４】
△ｇＢと末梢血単核細胞の再刺激のアッセイ結果（図８）において、肺内または皮下経路のいずれかで送達されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントと処方された抗原を、２〜３回投与量（４またはそれ以上の刺激インデックス）の後、Ｔ細胞応答が誘導されることが示された。
【００６５】
＜実施例５＞
肺内を通じたさまざまなアジュバント技術によるワクチン接種によって誘導される全身性および粘膜免疫
これらの実験は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントよりも他のアジュバントが肺内経路による送達をされたときに抗原特異的粘膜および全身性抗体応答を誘導することができるかどうかを調べるために行なわれた。ヒツジ群は、肺内経路で、さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原で免疫付与した（表５）。
【００６６】
表５：肺内経路で、さまざまなアジュバント処方物と一緒に処方されたインフルエンザ抗原による免疫付与されたヒツジ群
【００６７】
≪実験方法≫
アジュバント処方物の調製
Ａ．リポソームは以下の方法によって調製した。：
バッファー溶液：
ＩＲバッファー： ０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＫＣｌ， ８ｍＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4， ０．０５ｍＭ ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ， １．５ｍＭ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4 ｐＨ７．２
ＩＶＤバッファー： ０．１４Ｍ ＮａＣｌ， ３．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4， １．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4．２Ｈ2Ｏ ｐＨ７．２
【００６８】
１．１１．４ｍｇ／ｍＬコレステロール、１２．４ｍｇ／ｍＬジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびメガ（Ｍｅｇａ）１０の溶液をＩＲバッファー中で調製した（Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ）。
２．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣは、ＩＶＤバッファーを３０分以上かけて徐々に添加することで１／４０に希釈した。
３．希釈溶液は、ＳＴ ２００ Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ （Ｎｅｐｈｒａｌ）を用いてはじめの薄められた体積の１／４０に濃縮した。
４．濃縮溶液は、ＩＶＤバッファーの２５倍体積で限外ろ過することで洗浄した。
５．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣは、さらに限外ろ過することで、２倍に濃縮した。
６．脂質押出しに先立ちＣｈｏｌ／ＤＰＰＣは、少なくとも１時間４０℃でインキュベートした。
７．手順どおり、４２℃に保った１０ｍＬサーモバーレルエクストラダー（Ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を装備した脂質押出し機（Ｔ．００１ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，カナダ）を用いてＣｈｏｌ／ＤＰＰＣからリポソームを押出した。
８．１４００−２０００ｋＰａの圧力を用いて０．１μｍ ＰＣ ディスクフィルターを通してＣｈｏｌ／ＤＰＰＣの１０ｍＬロットで押出しを行なった。
９．Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ溶液すべてがこの系を１０回供するまで、この工程を繰り返した。
１０．結果物のリポソームは、コレステロールとＤＰＰＣ内容物について測定し、そして、ネガティブ染色を用いて電子顕微鏡下で大きさと均質性とを評価した。
【００６９】
Ｂ．ＭＰＬの調製
脂質Ａモノホスホリル（ＭＰＬ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ６８９５）は、２ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｄ２６５０）に再懸だくされ、使用するまで４℃で保った。
【００７０】
Ｃ．ＣｐＧの調製
ＣｐＧ （Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ １０６２ ４８５６−０１１）をｐＨ８の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸だくし、使用するまで４℃で保った。
【００７１】
Ｄ．アジュバント処方物の調製
すべてのアジュバント処方物は、インフルエンザ抗原の添加前の希釈としてＰＢＳを用いた関連組成物を混合して調製した（表５）。このあとに、リポソームを含む処方物を１／８インチ（０．３１７５ｃｍ）プローブを用いてセッティング４にてＶｉｒＳｏｎｉｃソニケーターで超音波処理にさらした。処方物は、３０秒間空けて５秒２回の超音波処理を施し、すべての操作は氷上で行なった。
【００７２】
免疫付与
実施例１で説明した方法を用いて表５に示すように、ヒツジの群は、インフルエンザ抗原とアジュバントとの処方物で免疫付与し、採血した。
ＢＡＬ採取
ＢＡＬの採取は、実施例１で説明したとおり行なった。
ＥＬＩＳＡによる抗体応答の評価
血清中およびＢＡＬサンプル中のインフルエンザ抗原への抗体応答のアッセイは、実施例１で説明したとおり行なった。
血球凝集抑制の評価
血清中およびＢＡＬサンプル中のＨＡＩ活性アッセイは、実施例１で説明したとおり行なった。
【００７３】
≪結果≫
さまざまなアジュバントとインフルエンザ抗原との処方物の肺内ワクチン接種後における免疫応答の評価
ヒツジは、３週間の間隔で３回投与量を受けた。血清と肺（ＢＡＬ）サンプルとは、最初の投与量の前と２週間後、そして２回目および３回目の投与量の１週間後に採取した。抗体ＥＬＩＳＡデータにおいて、免疫付与前抗体タイターは差し引いた。
これらの実験結果において、さまざまなアジュバント処方物は、アジュバントが抗原と併用され、肺内経路によって送達されたとき、抗体応答を誘導する能力は多様であることが示された（図９および図１０）。
【００７４】
すべてのアジュバントは、血清中の抗体の誘導において、抗原単独と比較していくつかの利益をもたらす。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントを含む処方物は、３回目の投与の抗原単独に比較して、血清およびＢＡＬ中の双方において有意に大きな応答を誘導し、ならびに、２回投与の後大きな応答が誘導された血清ＩｇＧの場合は、２回投与後優れた応答を誘導した。
特に注目すべきであるのは、２回投与量の後の血清中および３回投与量の後のＢＡＬ中双方におけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント処方によって、機能的（ＨＡＩ）抗体の誘導が示されたデータである（図１０）。そのデータ（図９）からは、抗原とＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバント＋ＭＰＬとを含む処方物で免疫されたヒツジに１回および２回投与ののち、それぞれ血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体においてアジュバント単独に比較して有意な増加が生じたという点でＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸTMアジュバントへＭＰＬを添加することによる長所も示される。
【００７５】
参照文献:
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Oya Alpa, H., et al. Biodegradeable mucoadhesive particulates for nasal and pulmonary antigen and DNA delivery. Advanced Drug Delivery Reviews (2005), 57:411-430.
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、
抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与することを含み、前記組成物は、肺内経路によって被検体に投与される方法。
【請求項２】
組成物が、肺内経路用に処方されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、エアロゾルまたは乾燥粉末フォームである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、前記被検体に経口投与で送達される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組成物が、前記被検体の下部肺に送達される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、免疫刺激アジュバントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組成物が、サポニンベースアジュバント、リポソーム、水中油型アジュバント、アルミニウム塩アジュバント、リポポリサッカライドアジュバント、オリゴヌクレオチドアジュバントおよび粘膜アジュバントからなる群から選ばれる少なくとも１つのアジュバントを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、免疫刺激複合体を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組成物が、イスコマトリックスアジュバントを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、ほかの免疫刺激アジュバントと組み合わされた免疫刺激複合体を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、リポポリサッカライドアジュバントと組み合わされた免疫刺激複合体を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）と組み合わされたイスコマトリックスアジュバントを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原が、粘膜病原体に対する免疫応答を誘発または誘導する抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記粘膜病原体が、インフルエンザウイルス、クラミジア肺炎病原体、呼吸器合胞体ウイルス、または、肺炎球菌である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原が、非粘膜部の病原体に対する免疫応答を誘発または誘導する抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記病原体が、ピロリ菌、サルモネラ菌、大腸菌、コレラ、ＨＩＶ、または、性感染症生物である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、腫瘍特異的、または腫瘍関連抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が、粘膜部と関連する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、肺腫瘍、消化管の腫瘍、または、生殖管腫瘍である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用。
【請求項２１】
肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、
抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品。
【請求項１】
ヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導する方法であって、
抗原およびアジュバントを含む組成物を前記被検体に投与することを含み、前記組成物は、肺内経路によって被検体に投与される方法。
【請求項２】
組成物が、肺内経路用に処方されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、エアロゾルまたは乾燥粉末フォームである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、前記被検体に経口投与で送達される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組成物が、前記被検体の下部肺に送達される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、免疫刺激アジュバントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組成物が、サポニンベースアジュバント、リポソーム、水中油型アジュバント、アルミニウム塩アジュバント、リポポリサッカライドアジュバント、オリゴヌクレオチドアジュバントおよび粘膜アジュバントからなる群から選ばれる少なくとも１つのアジュバントを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、免疫刺激複合体を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組成物が、イスコマトリックスアジュバントを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、ほかの免疫刺激アジュバントと組み合わされた免疫刺激複合体を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、リポポリサッカライドアジュバントと組み合わされた免疫刺激複合体を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）と組み合わされたイスコマトリックスアジュバントを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原が、粘膜病原体に対する免疫応答を誘発または誘導する抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記粘膜病原体が、インフルエンザウイルス、クラミジア肺炎病原体、呼吸器合胞体ウイルス、または、肺炎球菌である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原が、非粘膜部の病原体に対する免疫応答を誘発または誘導する抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記病原体が、ピロリ菌、サルモネラ菌、大腸菌、コレラ、ＨＩＶ、または、性感染症生物である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、腫瘍特異的、または腫瘍関連抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が、粘膜部と関連する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、肺腫瘍、消化管の腫瘍、または、生殖管腫瘍である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与における抗原およびアジュバントを含む組成物の使用、または、
被検体に免疫応答を誘発または誘導するためのヒトまたは動物被検体に肺内投与用の医薬製造のための抗原およびアジュバントを含む組成物の使用。
【請求項２１】
肺内経路によってヒトまたは動物被検体の免疫応答を誘発または誘導するための医薬品であって、
抗原とアジュバントとを含む組成物である医薬品。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５０１５９５（Ｐ２０１０−５０１５９５Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５８６１（Ｐ２００９−５２５８６１）
【出願日】平成１９年８月３１日（２００７．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１２７７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２５０９５
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５０００２１４１３）シーエスエル、リミテッド (28)
【出願人】（５０９０６００３９）ユニヴァーシティー オブ メルボルン (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３１日（２００７．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１２７７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２５０９５
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５０００２１４１３）シーエスエル、リミテッド (28)
【出願人】（５０９０６００３９）ユニヴァーシティー オブ メルボルン (6)
【Ｆターム（参考）】
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