免疫抱合体
【課題】生物活性を有するリガンドを特異的標的細胞または組織に到達させるための、例えば腫瘍治療に用い得る新たな融合タンパク質の免疫抱合体を提供する。
【解決手段】本発明にかかる融合タンパク質は、腫瘍関連標的エレメント、好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に表現される分子を認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および増殖および／または分化因子などの生物活性を有するリガンドからなる。
【解決手段】本発明にかかる融合タンパク質は、腫瘍関連標的エレメント、好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に表現される分子を認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および増殖および／または分化因子などの生物活性を有するリガンドからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび成長および／または分化因子のような生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体は腫瘍の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
多様な治療概念が癌患者の治療のために用いられてきた。過去数年、悪性細胞上で発現される細胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクローナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答のサイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、１）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／細胞制圧効果２）ＬＡＫ活性または単球／マクロファージ媒介細胞毒性などの腫瘍−抗原−非特異的メカニズム３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍−抗原−特異的免疫応答。この場合、腫瘍に対する全身性免疫が動物モデルにおいて観察された。あいにく、ＩＬ−２またはＴＮＦαなどのサイトカインの全身性適用はそれらの毒性によって妨げられている（Ｒｕｂｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．、１１、４６０−４７２、１９９０；Ｂａｌｋｗｉｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３６１、２０６−２０７、１９９３）。
【０００３】
腫瘍部位における充分なサイトカイン濃度を確実にするためにはかなり多量の投与が必要であるが、最大許容量は有効用量以下である。したがって、サイトカインのマイナス効果は主に全身的適用の結果もたらされるが、腫瘍治療におけるそれらの臨床的効果は疑いの余地がない。動物モデルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ることが示された（Ｈｏｃｋら、ＰＮＡＳ、９０、２７７４−２７７８、１９９３；Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２，３９３１−３９３７、１９９２；Ｔｅｐｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、５４８−５５１、１９９２；Ｍｕｌｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、６０２０−６０２４、１９９２；Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３、１０４７−１０５２、１９９１；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２、１２１７−１２２４、１９９０）。これらのシステムでは、サイトカインは腫瘍の増殖は障害しないが、迅速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。したがって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的組み合わせは、周辺部の存在を減らして生物活性を有するリガンドの腫瘍内での利用を促進する。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、これらの分子の標的となり得る。
【０００４】
抗体特異性標的のための生物活性を有するリガンドは、直接的にまたは標的細胞に対する致死的環境をつくり出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければならない。生物活性を有するリガンドとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、ＴＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインがある。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的にあるいは宿主の防護機構を活性化するかのいずれかによって発揮することが示された（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１、７４−７７、１９９３；Ｃｏｌｕｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；ＴｈｏｍａｓおよびＢａｌｋｗｉｌｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、５２、３０７−３３０、１９９１）。
【０００５】
例えば、ＩＬ−２は免疫応答の中心メディエーターと考えられている。ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激することおよびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を誘導することが示されている。腫瘍浸潤Ｔリンパ球はＩＬ−２に応答して増殖する。さらに、ＩＬ−２はＴ細胞および単球の細胞毒性を増強する。加えて、ＩＬ−２は、免疫応答をさらに増強するＴ細胞、ＮＫ細胞および単球によって分泌されるサイトカインカスケードを誘導する。
【０００６】
ＴＮＦαは、主にある種の腫瘍細胞に対するその直接的な細胞毒性および腫瘍の出血性退行の誘導のために腫瘍治療における広範な適用が見出だされている。加えて、ＴＮＦαは免疫応答を増強する。すなわち、これはＴ細胞増殖に対して共刺激作用を有し、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII抗原の発現およびマクロファージによるＴＮＦα、ＩＦＮおよびＩＬ−１の分泌を誘導する。ＩＬ−４は、最初はＢ細胞増殖因子として記述された。さらなる研究で、ＩＬ−４は抗原特異性細胞毒性Ｔ細胞を刺激することおよびＮＫ細胞様ＬＡＫよりもむしろＴ細胞様ＬＡＫ細胞に特異的に作用することが示された。ＩＬ−４は、ヒトメラノーマ細胞の成長を阻害して、それらのＭＨＣクラスＩおよびIIの発現を促進する。ＩＬ−４によるマクロファージ媒介抗腫瘍効果の誘導についてはまだ議論の余地がある。
【０００７】
ＩＬ−７は、ｐｒｅＢ細胞およびヒト末梢ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖因子である。ＩＬ−７は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞亜集団の細胞毒性を増強する。加えて、ＩＬ−７は、末梢単球によるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの産生を誘導する。インビトロにおいて、単球／マクロファージの腫瘍殺傷活性はＩＬ−７によって刺激され、これはおそらくＴＮＦαなどのサイトカインによって媒介される。
【０００８】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂ プロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【０００９】
ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５はヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣ ＲＬ１５５５）に対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが見出だされた。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７、３６９２、１９８７）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２／１５６８３から公知である。
【００１０】
活性タンパク質の指向的送達のための多様な組み合わせの抗体−サイトカイン免疫抱合体については、既に記述がある。ＩＬ−２は、ヒト癌腫特異性抗体Ｌ６（Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６、２４４６−２４５２、１９９１、ＥＰ−ＯＳ−０４３９０９５）と、または抗ガングリオシドＧＤ２抗体（Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ、８９、１４２８−１４３２、１９９２、ＷＯ９２／０８４９５）と組み合わされた。抗ダンシル抗体およびＩＧＦ１からなる免疫抱合体はホルモンの指向的送達のためにつくられた（ＳｈｉｎおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、ＰＮＡＳ、８７、５３２２−５３２６、１９９０、ＷＯ９１／１４４３８）。
【特許文献１】ＷＯ ９２／１５６８３
【特許文献２】ＥＰ−ＯＳ−０４３９０９５
【特許文献３】ＷＯ ９２／０８４９５
【特許文献４】ＷＯ ９１／１４４３７
【非特許文献１】Ｒｕｂｉｎ， Ｃｎａｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １１：４６０−４７２， １９９０
【非特許文献２】Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２０６−２０７， １９９３
【非特許文献３】Ｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ９０：２７７４−２７７８， １９９３
【非特許文献４】Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８５３−４８５７， １９９２
【非特許文献５】ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：３９３１−３９３７， １９９２
【非特許文献６】Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：５４８−５５１， １９９２
【非特許文献７】Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：６０２０−６０２４， １９９２
【非特許文献８】Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０４７−１０５２， １９９１
【非特許文献９】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４， １９９０
【非特許文献１０】Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：７４−７７， １９９３
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ５２：３０７−３３０， １９９１
【非特許文献１２】Ｒｐｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：３６９２， １９８７
【非特許文献１３】Ｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２， １９９１
【非特許文献１４】Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２， １９９２
【非特許文献１５】Ｓｈｉｎ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ＰＮＡＳ ８７：５３２２−５３２６， １９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、本発明の目的は、（１）腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープおよび（２）細胞毒性の誘導にきわめて有力な生物活性を有するリガンドからなり、したがってその場での抗腫瘍効果を増強する抗体またはそのフラグメントをつくり出すことであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、モノクローナル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位または完全なモノクローナル抗体を、生物活性を有するリガンドと組み合わせる免疫抱合体に関する。これらの免疫抱合体をコードする構築物は、組み換えＤＮＡ技術によって作出される。免疫抱合体は、抗体重鎖の可変部ならびに定常部のＣＨ１ドメイン（抗体−ＣＨ１抱合体）、または定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン（抗体−ＣＨ２抱合体）、または定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（抗体−ＣＨ３抱合体）を、生物活性を有するリガンドに融合して含む。適合する軽鎖を加えることによって、抗原保有細胞を標的にして、活性リガンドを生体の特定の部位に送達するような免疫抱合体を作出することができる（図１ ａ〜ｃ）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の免疫抱合体を用いることによって、メラノーマ、神経膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
このように、本発明の目的は、（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する腫瘍細胞に特異性のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および（２）該抗体または抗体フラグメントに融合し、腫瘍細胞をとくにその場で溶解する細胞毒性を有するかまたは腫瘍特異性免疫応答を誘導するような生物活性を有するリガンド、好ましくはサイトカインからなる免疫抱合体を提供することである。
【００１５】
本発明による好ましい実施態様においては、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施態様においては、抗体または抗体フラグメントは、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する。
【００１７】
本発明のさらなる好ましい実施態様においては、免疫抱合体は、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−７、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−７およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１８】
さらに、本発明の目的は上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供することであって、これは、宿主生物を用いて、抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を互いに融合させて、得られる構築物を発現ベクターに導入して、これで該宿主生物を形質転換させて、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現させることによって行われる。
【００１９】
本発明による好ましい実施態様においては、抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させるという手法が用いられる。
さらに、本発明の目的は、少なくとも上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体からなる薬剤組成物を提供することにある。
【００２０】
最後に、本発明の目的は、上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の腫瘍に向けた薬物の調製のための使用である。
【００２１】
とくに、例えば、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦαなどの抗体−ＣＨ２および抗体−ＣＨ３抱合体の場合、細胞性細胞毒性の誘導は、カップリングさせないＴＮＦαよりも優れていた。これは、おそらく、結合的性質ならびに、モノクローナル抗体の定常部およびサイトカイン活性によるＡＤＣＣの誘導に関する組み合わせによるものと考えられる。
【００２２】
本発明による抗体−ＣＨ１抱合体は、小分子であること、および原核細胞における発現が可能であるという点で有利である。さらに、サイズが小さいことによって（腫瘍）組織への進入が促進される。
【００２３】
本発明の免疫抱合体はさらに、好ましくはＭＡｂ４２５またはそのフラグメントなどのモノクローナル抗体と比較して、良好な結合および増殖特性を示す。
【００２４】
材料および方法
モノクローナル抗体
ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対するＩｇＧ１ネズミモノクローナル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦ受容体の外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、ＥＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビボで腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４７、３６９２、１９８７）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。
【００２５】
サイトカイン
サイトカインをコードするｃＤＮＡは、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｂｉｅｒｍａｎｎ ＧＭＢＨ、Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ ＦＲＧ；ヒトＩＬ−２ ＢＢＧ３０、ヒトＩＬ−４ ＢＢＧ１５、ヒトＩＬ−７ ＢＢＧ４３、ヒトＴＮＦα ＢＢＧ１８）から購入した。市販のｃＤＮＡは、タンパク質分泌に必要なシグナル配列を欠いている。サイトカインをコードするｃＤＮＡは、サイトカイン産生細胞から分離されるｍＲＮＡから作出することができる。
【００２６】
ベクター
ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクローニングベクターの一部であって、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに続く多クローニング部位を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、３３、１０３−１０９、１９８５）。ｐＵＣベクターは、市販されている（例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなど）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／ＳＫ−ファージミド・ベクターはｐＵＣ１９に由来する。これらベクターは市販されている（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【００２７】
真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｃｅｌｌ、３３、７１７、１９８３）は、シミアン（アカゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点およびヒトサイトメガロウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニング部位（ｍｃｓ）が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重鎖可変部のキメラ型およびΔＳａｃII ｃγ１領域とそれにＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの末端でそれぞれ融合したエフェクター分子とを組み合わせて、ＭＡｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融合Ｉｇ鎖を、適合する軽鎖と組み合わせることによって、一価の抗原結合領域を形成して、これを免疫抱合体に組み立てることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二価の免疫抱合体を産生するができる（図１）。重鎖および軽鎖構築物は、同一のまたは別々のベクターに導入することができる。
【００２８】
原核細胞発現ベクターは、ｐＳＷ１ベクター（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−５４６、１９８９）に基づき、これはｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドをコードする配列を含む（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８７）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列の後に、読み枠を揃えて導入して、ペリプラズム中へのタンパク質発現を行わせることができる。
【００２９】
［図面および表の簡単な説明］
［表１］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質の作出のために用いたＰＣＲプライマー（真核細胞発現）
* ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＳＫ＋／−およびＫＳ＋／−とハイブリダイズするリバース・プライマー（市販品）
** このプライマーは、単一のＳａｃＩＩ部位を含むＣｇ１定常部とハイブリダイズする。
【００３０】
*** Ｍ１３由来のベクターとハイブリダイズするリバース・プライマー（市販品）
［表２］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質の作出のために用いたＰＣＲプライマー（原核細胞発現）
［図１］ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図
Ｃ＝サイトカイン；ＶＨ＝重鎖可変部；ＶＬ＝軽鎖可変部；ＣＨ＝重鎖定常部；ＣＬ＝軽鎖定常部。
【００３１】
（ａ）抗体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）抗体−ＣＨ３抱合体。
【００３２】
［図２］ ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡにおける免疫抱合体のＥＧＦ−Ｒへの結合
過渡的にトランスフェクトさせたＣＯＳ−７細胞の上清の免疫抱合体含量を調べた。
【００３３】
縦軸：４９０ｎｍでの％吸収、横軸：上清希釈（ｌｏｇ２）。
【００３４】
黒丸：ＭＡｂ４２５ＣＨ１−ＴＮＦα、黒四角：ＭＡｂ４２５ＣＨ２−ＴＮＦα、黒三角：ＭＡｂ４２５ＣＨ３−ＴＮＦα、黒菱：ＭＡｂ４２５−対照、黒逆三角：ＭＡｂ４２５ＦＡｂ−対照、黒六角：再成形したＭＡｂ４２５Ｆ（ａｂ’）2（精製タンパク質）。
【００３５】
［図３Ａ］ ＣＯＳ−７細胞において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性
ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用いた。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２を含む連続希釈したＣＯＳ上清の増殖活性を左図に示す（黒丸）。ＭＡｂ４２５Ｆａｂ−対照を含むＣＯＳ上清を対照として用いた（白丸）。組み換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあるいはＩＬ−２を伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ−２細胞の増殖応答を右図に示した。
【００３６】
［図３Ｂ］ 大腸菌において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性
ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用いた。大腸菌中で発現させて抗ＭＡｂ４２５イディオタイプカラム上でアフィニティークロマト精製したＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２の連続希釈物の増殖活性を左図に示す（黒三角）。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−を含むＣＯＳ上清を対照として用いた（黒丸）。透析緩衝液（黒四角）。緩衝液がＩＬ−活性に影響しなかったことを確認するために、透析緩衝液を一定濃度のＩＬ−２（１Ｕ／ｍｌ）の存在下で滴定した（逆黒三角）。組み換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあるいはＩＬ−２を伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ−２細胞の増殖応答を右図に示した。
【００３７】
［図３Ｃ］ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体によるＴＩＬ増殖の誘導
メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下または非存在（ＫＯ）下で培養した（左図）。組み換え市販ＩＬ−２を用いた活性化時のＴＩＬの増殖応答を右図に示す。
【００３８】
［図４］ ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱合体によるＨＰＢＬ増殖の誘導
ＰＨＡ活性化ＨＰＢＬを、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−４（黒丸）、ＭＡｂ４３５−ＣＨ３−ＩＬ−４（黒三角）融合タンパク質を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下で培養した。ＭＡｂ４２５（黒四角）、ＩＬ−４（黒菱）およびベクター対照（黒逆三角）を含む上清を対照として用いた。組み換え市販ＩＬ−４を伴うおよび成長因子と伴わない（ＫＯ）活性化時のＨＰＢＬの増殖応答を右図（上）に示す。
【００３９】
［図５］ ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性
ＴＮＦα感受性ネズミ線維肉腫細胞系ＷＥＨＩ１６４を、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα免疫抱合体（黒四角）、またはＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα免疫抱合体（黒三角）、またはＭＡｂ４２５Ｆａｂ−対照（黒丸）を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下で４８時間培養した（左図：上）。市販の組み換えヒトＴＮＦαによって誘導されるインジケーター細胞の増殖阻害を右図（下）に示す。
【００４０】
［図６］ ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体媒介腫瘍細胞溶解
非活性化ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いて、異質遺伝子的ＥＧＦ−Ｒ陽性の51Ｃｒ標識Ｃ８１６１標的細胞とともに、エフェクター／標的細胞比３０：１の割合で共培養した。特異的溶解（％）をＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα免疫抱合体を含む連続希釈したＣＯＳ培養上清の非存在または存在下で１８時間培養した後に調べる（ハッチングを施したバー）。組み換えＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ）は３６ｋＤダイマーとして大腸菌中で発現させた（ドットを施したバー）。
【実施例】
【００４１】
一般：
本出願に記載の他の微生物、細胞系、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかまたは他の手段でふつうに入手が可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されているもので、本発明に必須ではなく、他の適当な手段および生物学的材料で置き換えることができる。
【００４２】
本発明に必須の方法技術を、以下に詳細に記述する。詳細な記述のない他の方法技術は、当業者に公知の標準法であるかまたは引用参考文献および特許出願または標準的文献（例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）により詳細に記述されている。
【００４３】
融合タンパク質の真核細胞における発現
Ｆａｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質発現のための真核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５およびサイトカインのループ・アウト手法による融合：
ＴＮＦα構築物の作出：
ΔＳａｃII ｃγ１クローンのＳａｃII／ＸｂａＩフラグメントを、ＴＮＦαｃＤＮＡなどのサイトカインをコードする配列を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿入した。ＴＮＦα ｃＤＮＡをＳｍａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に導入した。得られる構築物を適当なヘルパーファージを加えることによって一本鎖ＤＮＡに調製した。ＣＨ２またはＣＨ３ドメインをＴＮＦαコード配列の５’末端と読み枠を合わせて融合させた。下記のオリゴヌクレオチド、すなわち
【００４４】
【化１】
【００４５】
は、それぞれＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの３’末端、およびＴＮＦαコード配列と一致する。一本鎖ＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドによって一体にして、間の不要な配列を構築物から除去する。上方の鎖が一本鎖ＤＮＡとして作出されたので、オリゴヌクレオチドは逆配向を有している。
ＤＮＡを配列合成酵素（シクエナーゼ・ポリメラーゼ）によって二本鎖型に形成した。この酵素は、ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼのようにエラーを生じる傾向にはないので、単離されたクローンの接合部のＤＮＡ配列のみを決定した。正しい配列を有するこれらクローンを、完全なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するために必要な配列と組み合わせて、真核細胞での発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００４６】
ＩＬ−４構築物の作出：
これらの構築のために、完全なΔＳａｃＩＩｃγ１クローンをＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋に挿入した。ＩＬ−４をＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩフラグメントとして同じベクターにクローニングした。融合を上記のＴＮＦα構築物と同様にして下記のそれぞれＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融合のためのオリゴヌクレオチド、すなわち
【００４７】
【化２】
【００４８】
を用いて行った。
【００４９】
正しい配列を有するこれらクローンを完全なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するために必要な配列と組み合わせて、真核細胞での発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５０】
ＰＣＲ手法によるＭＡｂ４２５とサイトカインとの融合
ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼはエラーを生じがちであるので、エラーがなかったことを確認するためにＰＣＲ手法によって増幅されたこれら配列を決定した。これらの実験に用いたプライマーを、表１に纏めて示す。
【００５１】
ＣＨ１融合タンパク質の作出
ｐＵＨ５プラスミドは原核細胞発現のための重鎖ＦＡｂ４２５フラグメントのてめの配列、それにＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するタンパク質分泌を確実にするＮ末端ｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８７）を含む。ＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクターに再クローニングした。サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−７をＰＣＲ手法によって増幅して、５’ＮｃｏＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＴＮＦαは５’ＮｃｏＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位を既に含んでいる。すべてのサイトカインをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてＣＨ１ドメインの後にクローニングした。これらの構築物において、サイトカイン配列は読み枠は揃っていなかった。したがって、アダプター（５’ ＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧ ３’）をＳａｌＩとＮｃｏＩ制限部位間に導入した。その結果、得られる構築物においては重鎖およびサイトカインはアダプター配列によって導入された一つのアミノ酸（Ａｌａ）の追加された融合タンパク質として発現される。ＤｒａIII／ＢａｍＨＩフラグメントを、完全ＭＡｂ４２５重鎖ｃＤＮＡクローンを含むｐＨＣＭＶ発現ベクターにクローニングした。この構築物において、ｐｅｌＢリーダー配列はＭＡｂ４２５重鎖ｃＤＮＡのリーダー配列に置き換えられた。
【００５２】
ＣＨ２およびＣＨ３融合タンパク質の作出
ΔＳａｃII ｃγ１ＤＮＡの増幅をＰＣＲ手法によって、ＩＬ−２およびＩＬ−７などの対応するサイトカインの５’末端と、読み枠を揃えてオーバーラップするＣＨ２−３’末端プライマーを用いる二つの別々の反応で行った。ＩＬ−２およびＩＬ−７ｃＤＮＡクローンもまた、ＰＣＲによって増幅した。ＳＫ＋ベクターおよび続いてのｐＨＣＭＶ発現ベクターへのサブクローニングを促進するために、３’末端において、唯一のＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位をＩＬ−２構築物に、唯一のＸｂａＩ部位をＩＬ−７構築物にそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＩＬ−７ＰＣＲ産生物の完全ΔＳａｃII ｃγ１領域との融合をＰＣＲ組み換えによって行った。得られるＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ ΔＳａｃII ｃγ１ ＣＨ２−ＩＬ−２フラグメントを、ＭＡｂ４２５重鎖可変部を含むＳＫ＋にサブクローニングした。ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩ ΔＳａｃII ｃγ１ ＣＨ２−ＩＬ−７フラグメントを、ＭＡｂ４２５重鎖可変部およびＳａｃＩＩ部位までのΔＳａｃII ｃγ１領域を含むＳＫ＋ベクターにサブクローニングした。この工程によって完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２およびＩＬ−７融合遺伝子がそれぞれ作出された。完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−２も同様にして作出されるが、この場合はΔＳａｃII ｃγ１を５’末端として唯一ＳａｃII部位から増幅した。ＣＨ２−ＩＬ−２融合物を含むＳＫ＋中のＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２のＳａｃII／ＰｓｔＩフラグメントを、次いでＣＨ３−ＩＬ−２融合物を含むＳａｃII／ＰｓｔＩフラグメントに置き換えた。完全なＭＡｂ４２５融合遺伝子を次いで真核細胞中における発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５３】
免疫抱合体の発現
ＣＨ１ドメインのみを含む一価の免疫抱合体またはＣＨ２およびＣＨ２プラスＣＨ３ドメインを含む二価の免疫抱合体の発現のためのベクター構築物の宿主細胞への導入は、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、リポフェクチンまたはプロトプラスト融合によって行うことができる。免疫抱合体および適当な軽鎖をコードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞において正しくｍＲＮＡに転写される限り、いかなる宿主細胞型を用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＤＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムスター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、またはＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が用いられる。
【００５４】
免疫抱合体の過渡的発現
発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。したがって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅されて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−受容体結合およびサイトカイン濃度について調べた。
【００５５】
免疫抱合体の定常的発現
免疫抱合体の発現のための組み換え構築物を含むベクターを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築物を同一または別々のベクターに入れることができる。後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはｄｈＦｒなどの同一の選択マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクターの選択検出のために含ませればよい。ｄｈＦｒマーカーの選択は、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−などのｄｈＦｒ陰性細胞系においてのみ可能である。クローンを免疫抱合体の発現についてＥＧＦ−受容体特異性ＥＬＩＳＡを用いて分析する。選択されたクローンを、次いで、限定希釈クローニングによってさらに精製する。
【００５６】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−サイトカイン融合タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５軽鎖および重鎖のＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、ｐＳＷ１ベクターの多クローニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列および成熟重鎖コード配列は、細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの先に位置する。重鎖コード配列は、３’ＮｃｏＩ部位を含む。サイトカインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾して、ＮｃｏＩ（５’末端）およびＮｏｔＩ（３’末端）制限部位を導入した。サイトカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインに直接に融合させた。これらの実験に用いたプライマーを表２に纏めて示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
これらのベクターによって、機能的Ｆａｂ−サイトカイン融合タンパク質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖および重鎖サイトカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃプロモーターのコントロール下にあるジシストロン・メッセンジャーＲＮＡ（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、１０３８−１０４、１９８８）上に位置される。したがって、Ｆａｂ−融合タンパク質の発現は、培養条件の要求に従って誘導することができる。両タンパク質のジシストロン・メッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量のＦｄ−ＩＬ−２融合タンパク質および軽鎖の合成に好都合であるので、その結果、機能性Ｆａｂ−融合タンパク質への正しい組立のチャンスが高まる。二つのポリペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで、折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性ＦＡｂ４２５−ＣＨ１融合タンパク質への組立がなされる。細菌培養の延長下で、タンパク質は培養培地中に分泌される。
【００６０】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２融合タンパク質の大腸菌における発現、および精製
タンパク質発現に適する大腸菌株を、発現プラスミドによって形質転換させた。細胞をＯＤ580０．５になるまで増殖させて、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を回収した。上清を抗ＭＡｂ４２５抗イディオタイプカラムに載せる。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ−リン酸緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。溶出された液を、２．５Ｍ トリス（ｐＨ８）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２を含むフラクションをプールし、濃縮して、ＰＢＳに対して透析した。
【００６１】
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦ受容体特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイクロタイタープレートを、精製ＥＧＦ受容体を用いて４℃で一晩被覆して、未結合タンパク質を洗浄除去した。プレートを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂまたはＦａｂフラグメントを含む上清または精製したかたちのタンパク質とともにインキュベートした。プレートを洗浄して、ペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）とともにインキュベートした。基質を加えて、結合したＥＧＦ受容体特異性タンパク質の量を４５０ｎｍで測定して決定した（図２）。サイトカイン濃度は、それぞれのサイトカインに特異的な市販のＥＬＩＳＡを用いて、製造元の指示に従って決定した（データ表示せず）。
【００６２】
白血球の増殖
腫瘍特異性エフェクター細胞
末梢血単核白血球およびメラノーマ患者から分離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、照射（３０Ｇｙ）した同原性腫瘍細胞と培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％胎児ウシ血清、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４）中で共培養した。応答細胞を同原性腫瘍細胞で毎週刺激した。
【００６３】
増殖の測定
サイトカイン媒介増殖は次のような細胞を用いて測定することができる。すなわち、
ａ）適当なインジケーター細胞系。
【００６４】
ＩＬ−２の場合、ＩＬ−２依存性マウス細胞系ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２４１）（図３ Ａ）、または他のＩＬ−２依存性細胞系を用いることができる。
【００６５】
ｂ）インビトロ 培養 腫瘍浸潤リンパ球（図３ Ｂ）
ｃ）ＰＨＡ−Ｍ（シグマ）によって前処理した、新たに分離した血液単球細胞。この場合、実験は、ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４融合タンパク質を用いて行った（図４）。
【００６６】
健康な供血者またはメラノーマ患者から調製した、新鮮なヒト末梢血白血球、またはメラノーマ患者から分離したＴＩＬを、インビトロで増殖させた（上記を参照されたい）。融合タンパク質を分析するために、白血球を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で１×１０5細胞／ウェルの密度で最終容量２００μｌにして培養した。細胞を、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む上清または精製タンパク質とともにインキュベートした。７２時間後、細胞を０．５μＣｉ 3Ｈ−チミジンで処理した。放射能の取り込みを、一晩インキュベートした後に、液体シンチレーションβプレートカウンターを用いて測定した。結果を平均ｃｐｍで表す。
【００６７】
ＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体の細胞毒性の測定
ＴＮＦα媒介細胞毒性の測定
ＴＮＦαは種々の腫瘍細胞を含むある種の細胞には直接的に細胞毒性を示すことが報告された。ＴＮＦαの直接的細胞毒性は、Ｌ９２９ネズミ線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１）またはＷＥＨＩ１６４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７５１）、または他のＴＮＦα感受性細胞系を用いて、決定することができる（ＦｌｉｃｋおよびＧｉｆｆｏｒｄ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６８、１６７、１９８４）。図４において、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦαの細胞毒性は、ＷＥＨＩ１６４細胞をインジケーター細胞系として示されている。
【００６８】
ＴＮＦα誘導細胞毒性の測定
高浸潤性で自然転移性のＥＧＦ受容体陽性細胞系Ｃ８１６１（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７、２２７、１９９１およびその引用文献）などのＥＧＦ受容体陽性細胞系を、同原性腫瘍浸潤リンパ球、またはメラノーマ患者または健康な供血者から分離された、新鮮なヒト末梢血リンパ球による、細胞溶解の標的細胞として使用することができる。腫瘍細胞およびＴＩＬの培養条件は、既に記載されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１、６１５３、１９９１）。
【００６９】
インビトロ細胞毒性アッセイを、51Ｃｒ−標識腫瘍標的細胞を用いて行った。標的細胞を51Ｃｒ（１００μＣｉ／１０7細胞）で１時間標識して、次いで３回洗浄して過剰の51Ｃｒを除去した。２ｘ１０3標識細胞／ウェルを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む上清（対照）または精製タンパク質の存在下でエフェクター細胞と９６ウェルマイクロタイタープレート中で共インキュベートした。上清または精製タンパク質を培養培地で連続希釈して、アッセイは三重に行った。プレートを、３７℃、４時間、１０％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって除去して、上清中の放射能を、γカウンターを用いて測定した。次の計算式によって特異的51Ｃｒ放出（％）を算出した。
【００７０】
特異的51Ｃｒ放出（％）＝１００×（実験的放出−自然放出）/（最大放出−自然放出）
【００７１】
免疫抱合体の治療的使用
本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、上記および請求の範囲に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬物調製物を提供することにある。
【００７２】
通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体の投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られる範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で、１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００７３】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００７４】
本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび成長および／または分化因子のような生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体は腫瘍の治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図；（ａ）抗体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）抗体−ＣＨ３抱合体。
【図２】ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡにおける免疫抱合体のＥＧＦ−Ｒへの結合。
【図３】図３中、Ａは、ＣＯＳ−７細胞において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性、Ｂは、大腸菌において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性、Ｃは、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体によるＴＩＬ増殖の誘導。
【図４】ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱合体によるＨＰＢＬ増殖の誘導。
【図５】ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性。
【図６】ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体媒介腫瘍細胞溶解
【符号の説明】
【００７７】
Ｃ＝サイトカイン
ＶＨ＝重鎖可変部
ＶＬ＝軽鎖可変部
ＣＨ＝重鎖定常部
ＣＬ＝軽鎖定常部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび成長および／または分化因子のような生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体は腫瘍の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
多様な治療概念が癌患者の治療のために用いられてきた。過去数年、悪性細胞上で発現される細胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクローナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答のサイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、１）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／細胞制圧効果２）ＬＡＫ活性または単球／マクロファージ媒介細胞毒性などの腫瘍−抗原−非特異的メカニズム３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍−抗原−特異的免疫応答。この場合、腫瘍に対する全身性免疫が動物モデルにおいて観察された。あいにく、ＩＬ−２またはＴＮＦαなどのサイトカインの全身性適用はそれらの毒性によって妨げられている（Ｒｕｂｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．、１１、４６０−４７２、１９９０；Ｂａｌｋｗｉｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３６１、２０６−２０７、１９９３）。
【０００３】
腫瘍部位における充分なサイトカイン濃度を確実にするためにはかなり多量の投与が必要であるが、最大許容量は有効用量以下である。したがって、サイトカインのマイナス効果は主に全身的適用の結果もたらされるが、腫瘍治療におけるそれらの臨床的効果は疑いの余地がない。動物モデルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ることが示された（Ｈｏｃｋら、ＰＮＡＳ、９０、２７７４−２７７８、１９９３；Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２，３９３１−３９３７、１９９２；Ｔｅｐｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、５４８−５５１、１９９２；Ｍｕｌｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、６０２０−６０２４、１９９２；Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３、１０４７−１０５２、１９９１；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２、１２１７−１２２４、１９９０）。これらのシステムでは、サイトカインは腫瘍の増殖は障害しないが、迅速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。したがって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的組み合わせは、周辺部の存在を減らして生物活性を有するリガンドの腫瘍内での利用を促進する。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、これらの分子の標的となり得る。
【０００４】
抗体特異性標的のための生物活性を有するリガンドは、直接的にまたは標的細胞に対する致死的環境をつくり出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければならない。生物活性を有するリガンドとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、ＴＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインがある。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的にあるいは宿主の防護機構を活性化するかのいずれかによって発揮することが示された（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１、７４−７７、１９９３；Ｃｏｌｕｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２、４８５３−４８５７、１９９２；ＴｈｏｍａｓおよびＢａｌｋｗｉｌｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、５２、３０７−３３０、１９９１）。
【０００５】
例えば、ＩＬ−２は免疫応答の中心メディエーターと考えられている。ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激することおよびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を誘導することが示されている。腫瘍浸潤Ｔリンパ球はＩＬ−２に応答して増殖する。さらに、ＩＬ−２はＴ細胞および単球の細胞毒性を増強する。加えて、ＩＬ−２は、免疫応答をさらに増強するＴ細胞、ＮＫ細胞および単球によって分泌されるサイトカインカスケードを誘導する。
【０００６】
ＴＮＦαは、主にある種の腫瘍細胞に対するその直接的な細胞毒性および腫瘍の出血性退行の誘導のために腫瘍治療における広範な適用が見出だされている。加えて、ＴＮＦαは免疫応答を増強する。すなわち、これはＴ細胞増殖に対して共刺激作用を有し、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII抗原の発現およびマクロファージによるＴＮＦα、ＩＦＮおよびＩＬ−１の分泌を誘導する。ＩＬ−４は、最初はＢ細胞増殖因子として記述された。さらなる研究で、ＩＬ−４は抗原特異性細胞毒性Ｔ細胞を刺激することおよびＮＫ細胞様ＬＡＫよりもむしろＴ細胞様ＬＡＫ細胞に特異的に作用することが示された。ＩＬ−４は、ヒトメラノーマ細胞の成長を阻害して、それらのＭＨＣクラスＩおよびIIの発現を促進する。ＩＬ−４によるマクロファージ媒介抗腫瘍効果の誘導についてはまだ議論の余地がある。
【０００７】
ＩＬ−７は、ｐｒｅＢ細胞およびヒト末梢ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖因子である。ＩＬ−７は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞亜集団の細胞毒性を増強する。加えて、ＩＬ−７は、末梢単球によるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの産生を誘導する。インビトロにおいて、単球／マクロファージの腫瘍殺傷活性はＩＬ−７によって刺激され、これはおそらくＴＮＦαなどのサイトカインによって媒介される。
【０００８】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂ プロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【０００９】
ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５はヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣ ＲＬ１５５５）に対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが見出だされた。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７、３６９２、１９８７）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２／１５６８３から公知である。
【００１０】
活性タンパク質の指向的送達のための多様な組み合わせの抗体−サイトカイン免疫抱合体については、既に記述がある。ＩＬ−２は、ヒト癌腫特異性抗体Ｌ６（Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６、２４４６−２４５２、１９９１、ＥＰ−ＯＳ−０４３９０９５）と、または抗ガングリオシドＧＤ２抗体（Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ、８９、１４２８−１４３２、１９９２、ＷＯ９２／０８４９５）と組み合わされた。抗ダンシル抗体およびＩＧＦ１からなる免疫抱合体はホルモンの指向的送達のためにつくられた（ＳｈｉｎおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、ＰＮＡＳ、８７、５３２２−５３２６、１９９０、ＷＯ９１／１４４３８）。
【特許文献１】ＷＯ ９２／１５６８３
【特許文献２】ＥＰ−ＯＳ−０４３９０９５
【特許文献３】ＷＯ ９２／０８４９５
【特許文献４】ＷＯ ９１／１４４３７
【非特許文献１】Ｒｕｂｉｎ， Ｃｎａｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １１：４６０−４７２， １９９０
【非特許文献２】Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２０６−２０７， １９９３
【非特許文献３】Ｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ９０：２７７４−２７７８， １９９３
【非特許文献４】Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８５３−４８５７， １９９２
【非特許文献５】ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：３９３１−３９３７， １９９２
【非特許文献６】Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：５４８−５５１， １９９２
【非特許文献７】Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：６０２０−６０２４， １９９２
【非特許文献８】Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０４７−１０５２， １９９１
【非特許文献９】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４， １９９０
【非特許文献１０】Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：７４−７７， １９９３
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ５２：３０７−３３０， １９９１
【非特許文献１２】Ｒｐｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：３６９２， １９８７
【非特許文献１３】Ｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２， １９９１
【非特許文献１４】Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２， １９９２
【非特許文献１５】Ｓｈｉｎ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ＰＮＡＳ ８７：５３２２−５３２６， １９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、本発明の目的は、（１）腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープおよび（２）細胞毒性の誘導にきわめて有力な生物活性を有するリガンドからなり、したがってその場での抗腫瘍効果を増強する抗体またはそのフラグメントをつくり出すことであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、モノクローナル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位または完全なモノクローナル抗体を、生物活性を有するリガンドと組み合わせる免疫抱合体に関する。これらの免疫抱合体をコードする構築物は、組み換えＤＮＡ技術によって作出される。免疫抱合体は、抗体重鎖の可変部ならびに定常部のＣＨ１ドメイン（抗体−ＣＨ１抱合体）、または定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン（抗体−ＣＨ２抱合体）、または定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（抗体−ＣＨ３抱合体）を、生物活性を有するリガンドに融合して含む。適合する軽鎖を加えることによって、抗原保有細胞を標的にして、活性リガンドを生体の特定の部位に送達するような免疫抱合体を作出することができる（図１ ａ〜ｃ）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の免疫抱合体を用いることによって、メラノーマ、神経膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
このように、本発明の目的は、（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する腫瘍細胞に特異性のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および（２）該抗体または抗体フラグメントに融合し、腫瘍細胞をとくにその場で溶解する細胞毒性を有するかまたは腫瘍特異性免疫応答を誘導するような生物活性を有するリガンド、好ましくはサイトカインからなる免疫抱合体を提供することである。
【００１５】
本発明による好ましい実施態様においては、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施態様においては、抗体または抗体フラグメントは、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する。
【００１７】
本発明のさらなる好ましい実施態様においては、免疫抱合体は、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−７、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−７およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−７からなる群から選択される。
【００１８】
さらに、本発明の目的は上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供することであって、これは、宿主生物を用いて、抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を互いに融合させて、得られる構築物を発現ベクターに導入して、これで該宿主生物を形質転換させて、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現させることによって行われる。
【００１９】
本発明による好ましい実施態様においては、抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させるという手法が用いられる。
さらに、本発明の目的は、少なくとも上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体からなる薬剤組成物を提供することにある。
【００２０】
最後に、本発明の目的は、上記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の腫瘍に向けた薬物の調製のための使用である。
【００２１】
とくに、例えば、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦαなどの抗体−ＣＨ２および抗体−ＣＨ３抱合体の場合、細胞性細胞毒性の誘導は、カップリングさせないＴＮＦαよりも優れていた。これは、おそらく、結合的性質ならびに、モノクローナル抗体の定常部およびサイトカイン活性によるＡＤＣＣの誘導に関する組み合わせによるものと考えられる。
【００２２】
本発明による抗体−ＣＨ１抱合体は、小分子であること、および原核細胞における発現が可能であるという点で有利である。さらに、サイズが小さいことによって（腫瘍）組織への進入が促進される。
【００２３】
本発明の免疫抱合体はさらに、好ましくはＭＡｂ４２５またはそのフラグメントなどのモノクローナル抗体と比較して、良好な結合および増殖特性を示す。
【００２４】
材料および方法
モノクローナル抗体
ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対するＩｇＧ１ネズミモノクローナル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦ受容体の外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、ＥＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビボで腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４７、３６９２、１９８７）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。
【００２５】
サイトカイン
サイトカインをコードするｃＤＮＡは、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｂｉｅｒｍａｎｎ ＧＭＢＨ、Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ ＦＲＧ；ヒトＩＬ−２ ＢＢＧ３０、ヒトＩＬ−４ ＢＢＧ１５、ヒトＩＬ−７ ＢＢＧ４３、ヒトＴＮＦα ＢＢＧ１８）から購入した。市販のｃＤＮＡは、タンパク質分泌に必要なシグナル配列を欠いている。サイトカインをコードするｃＤＮＡは、サイトカイン産生細胞から分離されるｍＲＮＡから作出することができる。
【００２６】
ベクター
ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクローニングベクターの一部であって、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに続く多クローニング部位を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、３３、１０３−１０９、１９８５）。ｐＵＣベクターは、市販されている（例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなど）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／ＳＫ−ファージミド・ベクターはｐＵＣ１９に由来する。これらベクターは市販されている（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【００２７】
真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｃｅｌｌ、３３、７１７、１９８３）は、シミアン（アカゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点およびヒトサイトメガロウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニング部位（ｍｃｓ）が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重鎖可変部のキメラ型およびΔＳａｃII ｃγ１領域とそれにＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの末端でそれぞれ融合したエフェクター分子とを組み合わせて、ＭＡｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融合Ｉｇ鎖を、適合する軽鎖と組み合わせることによって、一価の抗原結合領域を形成して、これを免疫抱合体に組み立てることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二価の免疫抱合体を産生するができる（図１）。重鎖および軽鎖構築物は、同一のまたは別々のベクターに導入することができる。
【００２８】
原核細胞発現ベクターは、ｐＳＷ１ベクター（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−５４６、１９８９）に基づき、これはｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドをコードする配列を含む（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８７）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列の後に、読み枠を揃えて導入して、ペリプラズム中へのタンパク質発現を行わせることができる。
【００２９】
［図面および表の簡単な説明］
［表１］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質の作出のために用いたＰＣＲプライマー（真核細胞発現）
* ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＳＫ＋／−およびＫＳ＋／−とハイブリダイズするリバース・プライマー（市販品）
** このプライマーは、単一のＳａｃＩＩ部位を含むＣｇ１定常部とハイブリダイズする。
【００３０】
*** Ｍ１３由来のベクターとハイブリダイズするリバース・プライマー（市販品）
［表２］ ＭＡｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質の作出のために用いたＰＣＲプライマー（原核細胞発現）
［図１］ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図
Ｃ＝サイトカイン；ＶＨ＝重鎖可変部；ＶＬ＝軽鎖可変部；ＣＨ＝重鎖定常部；ＣＬ＝軽鎖定常部。
【００３１】
（ａ）抗体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）抗体−ＣＨ３抱合体。
【００３２】
［図２］ ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡにおける免疫抱合体のＥＧＦ−Ｒへの結合
過渡的にトランスフェクトさせたＣＯＳ−７細胞の上清の免疫抱合体含量を調べた。
【００３３】
縦軸：４９０ｎｍでの％吸収、横軸：上清希釈（ｌｏｇ２）。
【００３４】
黒丸：ＭＡｂ４２５ＣＨ１−ＴＮＦα、黒四角：ＭＡｂ４２５ＣＨ２−ＴＮＦα、黒三角：ＭＡｂ４２５ＣＨ３−ＴＮＦα、黒菱：ＭＡｂ４２５−対照、黒逆三角：ＭＡｂ４２５ＦＡｂ−対照、黒六角：再成形したＭＡｂ４２５Ｆ（ａｂ’）2（精製タンパク質）。
【００３５】
［図３Ａ］ ＣＯＳ−７細胞において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性
ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用いた。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２を含む連続希釈したＣＯＳ上清の増殖活性を左図に示す（黒丸）。ＭＡｂ４２５Ｆａｂ−対照を含むＣＯＳ上清を対照として用いた（白丸）。組み換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあるいはＩＬ−２を伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ−２細胞の増殖応答を右図に示した。
【００３６】
［図３Ｂ］ 大腸菌において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性
ＣＴＬＬ−２細胞をインジケーター細胞系として用いた。大腸菌中で発現させて抗ＭＡｂ４２５イディオタイプカラム上でアフィニティークロマト精製したＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２の連続希釈物の増殖活性を左図に示す（黒三角）。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−を含むＣＯＳ上清を対照として用いた（黒丸）。透析緩衝液（黒四角）。緩衝液がＩＬ−活性に影響しなかったことを確認するために、透析緩衝液を一定濃度のＩＬ−２（１Ｕ／ｍｌ）の存在下で滴定した（逆黒三角）。組み換え市販ＩＬ−２タンパク質を伴うあるいはＩＬ−２を伴わない（ＫＯ）活性化時のＣＴＬＬ−２細胞の増殖応答を右図に示した。
【００３７】
［図３Ｃ］ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体によるＴＩＬ増殖の誘導
メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下または非存在（ＫＯ）下で培養した（左図）。組み換え市販ＩＬ−２を用いた活性化時のＴＩＬの増殖応答を右図に示す。
【００３８】
［図４］ ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱合体によるＨＰＢＬ増殖の誘導
ＰＨＡ活性化ＨＰＢＬを、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−４（黒丸）、ＭＡｂ４３５−ＣＨ３−ＩＬ−４（黒三角）融合タンパク質を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下で培養した。ＭＡｂ４２５（黒四角）、ＩＬ−４（黒菱）およびベクター対照（黒逆三角）を含む上清を対照として用いた。組み換え市販ＩＬ−４を伴うおよび成長因子と伴わない（ＫＯ）活性化時のＨＰＢＬの増殖応答を右図（上）に示す。
【００３９】
［図５］ ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性
ＴＮＦα感受性ネズミ線維肉腫細胞系ＷＥＨＩ１６４を、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα免疫抱合体（黒四角）、またはＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα免疫抱合体（黒三角）、またはＭＡｂ４２５Ｆａｂ−対照（黒丸）を含む連続希釈したＣＯＳ上清の存在下で４８時間培養した（左図：上）。市販の組み換えヒトＴＮＦαによって誘導されるインジケーター細胞の増殖阻害を右図（下）に示す。
【００４０】
［図６］ ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体媒介腫瘍細胞溶解
非活性化ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いて、異質遺伝子的ＥＧＦ−Ｒ陽性の51Ｃｒ標識Ｃ８１６１標的細胞とともに、エフェクター／標的細胞比３０：１の割合で共培養した。特異的溶解（％）をＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα免疫抱合体を含む連続希釈したＣＯＳ培養上清の非存在または存在下で１８時間培養した後に調べる（ハッチングを施したバー）。組み換えＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ）は３６ｋＤダイマーとして大腸菌中で発現させた（ドットを施したバー）。
【実施例】
【００４１】
一般：
本出願に記載の他の微生物、細胞系、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかまたは他の手段でふつうに入手が可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されているもので、本発明に必須ではなく、他の適当な手段および生物学的材料で置き換えることができる。
【００４２】
本発明に必須の方法技術を、以下に詳細に記述する。詳細な記述のない他の方法技術は、当業者に公知の標準法であるかまたは引用参考文献および特許出願または標準的文献（例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）により詳細に記述されている。
【００４３】
融合タンパク質の真核細胞における発現
Ｆａｂ４２５−サイトカイン融合タンパク質発現のための真核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５およびサイトカインのループ・アウト手法による融合：
ＴＮＦα構築物の作出：
ΔＳａｃII ｃγ１クローンのＳａｃII／ＸｂａＩフラグメントを、ＴＮＦαｃＤＮＡなどのサイトカインをコードする配列を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿入した。ＴＮＦα ｃＤＮＡをＳｍａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に導入した。得られる構築物を適当なヘルパーファージを加えることによって一本鎖ＤＮＡに調製した。ＣＨ２またはＣＨ３ドメインをＴＮＦαコード配列の５’末端と読み枠を合わせて融合させた。下記のオリゴヌクレオチド、すなわち
【００４４】
【化１】
【００４５】
は、それぞれＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの３’末端、およびＴＮＦαコード配列と一致する。一本鎖ＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドによって一体にして、間の不要な配列を構築物から除去する。上方の鎖が一本鎖ＤＮＡとして作出されたので、オリゴヌクレオチドは逆配向を有している。
ＤＮＡを配列合成酵素（シクエナーゼ・ポリメラーゼ）によって二本鎖型に形成した。この酵素は、ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼのようにエラーを生じる傾向にはないので、単離されたクローンの接合部のＤＮＡ配列のみを決定した。正しい配列を有するこれらクローンを、完全なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するために必要な配列と組み合わせて、真核細胞での発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００４６】
ＩＬ−４構築物の作出：
これらの構築のために、完全なΔＳａｃＩＩｃγ１クローンをＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋に挿入した。ＩＬ−４をＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩフラグメントとして同じベクターにクローニングした。融合を上記のＴＮＦα構築物と同様にして下記のそれぞれＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融合のためのオリゴヌクレオチド、すなわち
【００４７】
【化２】
【００４８】
を用いて行った。
【００４９】
正しい配列を有するこれらクローンを完全なＭＡｂ４２５融合タンパク質を作出するために必要な配列と組み合わせて、真核細胞での発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５０】
ＰＣＲ手法によるＭＡｂ４２５とサイトカインとの融合
ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼはエラーを生じがちであるので、エラーがなかったことを確認するためにＰＣＲ手法によって増幅されたこれら配列を決定した。これらの実験に用いたプライマーを、表１に纏めて示す。
【００５１】
ＣＨ１融合タンパク質の作出
ｐＵＨ５プラスミドは原核細胞発現のための重鎖ＦＡｂ４２５フラグメントのてめの配列、それにＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するタンパク質分泌を確実にするＮ末端ｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１６９、４３７９−４３８３、１９８７）を含む。ＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクターに再クローニングした。サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−７をＰＣＲ手法によって増幅して、５’ＮｃｏＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＴＮＦαは５’ＮｃｏＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位を既に含んでいる。すべてのサイトカインをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてＣＨ１ドメインの後にクローニングした。これらの構築物において、サイトカイン配列は読み枠は揃っていなかった。したがって、アダプター（５’ ＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧ ３’）をＳａｌＩとＮｃｏＩ制限部位間に導入した。その結果、得られる構築物においては重鎖およびサイトカインはアダプター配列によって導入された一つのアミノ酸（Ａｌａ）の追加された融合タンパク質として発現される。ＤｒａIII／ＢａｍＨＩフラグメントを、完全ＭＡｂ４２５重鎖ｃＤＮＡクローンを含むｐＨＣＭＶ発現ベクターにクローニングした。この構築物において、ｐｅｌＢリーダー配列はＭＡｂ４２５重鎖ｃＤＮＡのリーダー配列に置き換えられた。
【００５２】
ＣＨ２およびＣＨ３融合タンパク質の作出
ΔＳａｃII ｃγ１ＤＮＡの増幅をＰＣＲ手法によって、ＩＬ−２およびＩＬ−７などの対応するサイトカインの５’末端と、読み枠を揃えてオーバーラップするＣＨ２−３’末端プライマーを用いる二つの別々の反応で行った。ＩＬ−２およびＩＬ−７ｃＤＮＡクローンもまた、ＰＣＲによって増幅した。ＳＫ＋ベクターおよび続いてのｐＨＣＭＶ発現ベクターへのサブクローニングを促進するために、３’末端において、唯一のＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位をＩＬ−２構築物に、唯一のＸｂａＩ部位をＩＬ−７構築物にそれぞれ導入した。ＩＬ−２およびＩＬ−７ＰＣＲ産生物の完全ΔＳａｃII ｃγ１領域との融合をＰＣＲ組み換えによって行った。得られるＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ ΔＳａｃII ｃγ１ ＣＨ２−ＩＬ−２フラグメントを、ＭＡｂ４２５重鎖可変部を含むＳＫ＋にサブクローニングした。ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩ ΔＳａｃII ｃγ１ ＣＨ２−ＩＬ−７フラグメントを、ＭＡｂ４２５重鎖可変部およびＳａｃＩＩ部位までのΔＳａｃII ｃγ１領域を含むＳＫ＋ベクターにサブクローニングした。この工程によって完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２およびＩＬ−７融合遺伝子がそれぞれ作出された。完全ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−２も同様にして作出されるが、この場合はΔＳａｃII ｃγ１を５’末端として唯一ＳａｃII部位から増幅した。ＣＨ２−ＩＬ−２融合物を含むＳＫ＋中のＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ−２のＳａｃII／ＰｓｔＩフラグメントを、次いでＣＨ３−ＩＬ−２融合物を含むＳａｃII／ＰｓｔＩフラグメントに置き換えた。完全なＭＡｂ４２５融合遺伝子を次いで真核細胞中における発現のためにｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５３】
免疫抱合体の発現
ＣＨ１ドメインのみを含む一価の免疫抱合体またはＣＨ２およびＣＨ２プラスＣＨ３ドメインを含む二価の免疫抱合体の発現のためのベクター構築物の宿主細胞への導入は、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、リポフェクチンまたはプロトプラスト融合によって行うことができる。免疫抱合体および適当な軽鎖をコードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞において正しくｍＲＮＡに転写される限り、いかなる宿主細胞型を用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＤＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムスター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、またはＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が用いられる。
【００５４】
免疫抱合体の過渡的発現
発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。したがって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅されて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−受容体結合およびサイトカイン濃度について調べた。
【００５５】
免疫抱合体の定常的発現
免疫抱合体の発現のための組み換え構築物を含むベクターを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築物を同一または別々のベクターに入れることができる。後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはｄｈＦｒなどの同一の選択マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクターの選択検出のために含ませればよい。ｄｈＦｒマーカーの選択は、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−などのｄｈＦｒ陰性細胞系においてのみ可能である。クローンを免疫抱合体の発現についてＥＧＦ−受容体特異性ＥＬＩＳＡを用いて分析する。選択されたクローンを、次いで、限定希釈クローニングによってさらに精製する。
【００５６】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−サイトカイン融合タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５軽鎖および重鎖のＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、ｐＳＷ１ベクターの多クローニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列および成熟重鎖コード配列は、細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの先に位置する。重鎖コード配列は、３’ＮｃｏＩ部位を含む。サイトカインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾して、ＮｃｏＩ（５’末端）およびＮｏｔＩ（３’末端）制限部位を導入した。サイトカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインに直接に融合させた。これらの実験に用いたプライマーを表２に纏めて示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
これらのベクターによって、機能的Ｆａｂ−サイトカイン融合タンパク質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖および重鎖サイトカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃプロモーターのコントロール下にあるジシストロン・メッセンジャーＲＮＡ（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、１０３８−１０４、１９８８）上に位置される。したがって、Ｆａｂ−融合タンパク質の発現は、培養条件の要求に従って誘導することができる。両タンパク質のジシストロン・メッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量のＦｄ−ＩＬ−２融合タンパク質および軽鎖の合成に好都合であるので、その結果、機能性Ｆａｂ−融合タンパク質への正しい組立のチャンスが高まる。二つのポリペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで、折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性ＦＡｂ４２５−ＣＨ１融合タンパク質への組立がなされる。細菌培養の延長下で、タンパク質は培養培地中に分泌される。
【００６０】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２融合タンパク質の大腸菌における発現、および精製
タンパク質発現に適する大腸菌株を、発現プラスミドによって形質転換させた。細胞をＯＤ580０．５になるまで増殖させて、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を回収した。上清を抗ＭＡｂ４２５抗イディオタイプカラムに載せる。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ−リン酸緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。溶出された液を、２．５Ｍ トリス（ｐＨ８）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２を含むフラクションをプールし、濃縮して、ＰＢＳに対して透析した。
【００６１】
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦ受容体特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイクロタイタープレートを、精製ＥＧＦ受容体を用いて４℃で一晩被覆して、未結合タンパク質を洗浄除去した。プレートを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂまたはＦａｂフラグメントを含む上清または精製したかたちのタンパク質とともにインキュベートした。プレートを洗浄して、ペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）とともにインキュベートした。基質を加えて、結合したＥＧＦ受容体特異性タンパク質の量を４５０ｎｍで測定して決定した（図２）。サイトカイン濃度は、それぞれのサイトカインに特異的な市販のＥＬＩＳＡを用いて、製造元の指示に従って決定した（データ表示せず）。
【００６２】
白血球の増殖
腫瘍特異性エフェクター細胞
末梢血単核白血球およびメラノーマ患者から分離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、照射（３０Ｇｙ）した同原性腫瘍細胞と培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％胎児ウシ血清、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４）中で共培養した。応答細胞を同原性腫瘍細胞で毎週刺激した。
【００６３】
増殖の測定
サイトカイン媒介増殖は次のような細胞を用いて測定することができる。すなわち、
ａ）適当なインジケーター細胞系。
【００６４】
ＩＬ−２の場合、ＩＬ−２依存性マウス細胞系ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２４１）（図３ Ａ）、または他のＩＬ−２依存性細胞系を用いることができる。
【００６５】
ｂ）インビトロ 培養 腫瘍浸潤リンパ球（図３ Ｂ）
ｃ）ＰＨＡ−Ｍ（シグマ）によって前処理した、新たに分離した血液単球細胞。この場合、実験は、ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４融合タンパク質を用いて行った（図４）。
【００６６】
健康な供血者またはメラノーマ患者から調製した、新鮮なヒト末梢血白血球、またはメラノーマ患者から分離したＴＩＬを、インビトロで増殖させた（上記を参照されたい）。融合タンパク質を分析するために、白血球を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で１×１０5細胞／ウェルの密度で最終容量２００μｌにして培養した。細胞を、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む上清または精製タンパク質とともにインキュベートした。７２時間後、細胞を０．５μＣｉ 3Ｈ−チミジンで処理した。放射能の取り込みを、一晩インキュベートした後に、液体シンチレーションβプレートカウンターを用いて測定した。結果を平均ｃｐｍで表す。
【００６７】
ＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体の細胞毒性の測定
ＴＮＦα媒介細胞毒性の測定
ＴＮＦαは種々の腫瘍細胞を含むある種の細胞には直接的に細胞毒性を示すことが報告された。ＴＮＦαの直接的細胞毒性は、Ｌ９２９ネズミ線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１）またはＷＥＨＩ１６４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７５１）、または他のＴＮＦα感受性細胞系を用いて、決定することができる（ＦｌｉｃｋおよびＧｉｆｆｏｒｄ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６８、１６７、１９８４）。図４において、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦαおよびＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦαの細胞毒性は、ＷＥＨＩ１６４細胞をインジケーター細胞系として示されている。
【００６８】
ＴＮＦα誘導細胞毒性の測定
高浸潤性で自然転移性のＥＧＦ受容体陽性細胞系Ｃ８１６１（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７、２２７、１９９１およびその引用文献）などのＥＧＦ受容体陽性細胞系を、同原性腫瘍浸潤リンパ球、またはメラノーマ患者または健康な供血者から分離された、新鮮なヒト末梢血リンパ球による、細胞溶解の標的細胞として使用することができる。腫瘍細胞およびＴＩＬの培養条件は、既に記載されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１、６１５３、１９９１）。
【００６９】
インビトロ細胞毒性アッセイを、51Ｃｒ−標識腫瘍標的細胞を用いて行った。標的細胞を51Ｃｒ（１００μＣｉ／１０7細胞）で１時間標識して、次いで３回洗浄して過剰の51Ｃｒを除去した。２ｘ１０3標識細胞／ウェルを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂを含む上清または非抱合サイトカインを含む上清（対照）または精製タンパク質の存在下でエフェクター細胞と９６ウェルマイクロタイタープレート中で共インキュベートした。上清または精製タンパク質を培養培地で連続希釈して、アッセイは三重に行った。プレートを、３７℃、４時間、１０％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって除去して、上清中の放射能を、γカウンターを用いて測定した。次の計算式によって特異的51Ｃｒ放出（％）を算出した。
【００７０】
特異的51Ｃｒ放出（％）＝１００×（実験的放出−自然放出）/（最大放出−自然放出）
【００７１】
免疫抱合体の治療的使用
本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、上記および請求の範囲に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬物調製物を提供することにある。
【００７２】
通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体の投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られる範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で、１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００７３】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００７４】
本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび成長および／または分化因子のような生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体は腫瘍の治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデル図；（ａ）抗体−ＣＨ１抱合体、（ｂ）抗体−ＣＨ２抱合体、（ｃ）抗体−ＣＨ３抱合体。
【図２】ＥＧＲ−Ｒ特異性ＥＬＩＳＡにおける免疫抱合体のＥＧＦ−Ｒへの結合。
【図３】図３中、Ａは、ＣＯＳ−７細胞において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性、Ｂは、大腸菌において発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体のＩＬ−２活性、Ｃは、ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−２免疫抱合体によるＴＩＬ増殖の誘導。
【図４】ＭＡｂ４２５−ＩＬ−４免疫抱合体によるＨＰＢＬ増殖の誘導。
【図５】ＷＥＨＩ１６４細胞に対するＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体細胞毒性。
【図６】ＰＢＭＣによるＭＡｂ４２５−ＴＮＦα免疫抱合体媒介腫瘍細胞溶解
【符号の説明】
【００７７】
Ｃ＝サイトカイン
ＶＨ＝重鎖可変部
ＶＬ＝軽鎖可変部
ＣＨ＝重鎖定常部
ＣＬ＝軽鎖定常部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび（２）該抗体または抗体フラグメントと融合し、腫瘍細胞をその場で特異的に溶解する細胞毒性を有するか腫瘍特異性免疫応答を誘導する生物活性を有するリガンドからなる免疫抱合体。
【請求項２】
生物活性を有するリガンドがサイトカインである
請求項１に記載の免疫抱合体。
【請求項３】
サイトカインがＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−７からなる群から選択される
請求項２に記載の免疫抱合体。
【請求項４】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントである（抗体−ＣＨ１抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項５】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になる抗体フラグメントである（抗体−ＣＨ２抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項６】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になる（抗体−ＣＨ３抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項７】
該抗体または抗体フラグメントが、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。
【請求項８】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ２からなる群から選択される免疫抱合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫抱合体の調製法であって、
抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列をともに融合して、
得られる構築物を発現ベクターに導入してそれで宿主細胞を形質転換して、
その宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現する
ことからなる調製法。
【請求項１０】
抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を、所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させる
ことを特徴とする請求項９に記載の調製法。
【請求項１１】
大腸菌宿主における抗体−ＣＨ１抱合体の発現のための
請求項９または１０に記載の調製法。
【請求項１２】
真核細胞宿主における抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体の発現のための
請求項９または１０に記載の調製法。
【請求項１３】
請求項１〜８に記載の少なくとも一つの免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体からなる薬剤組成物。
【請求項１４】
腫瘍に向けた薬物の調製のための請求項１〜８項のいずれか１項に記載の免疫抱合体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはその抗体フラグメント、および（２）該抗体またはその抗体フラグメントのＣ末端に融合されている、系内において腫瘍細胞を特異的に溶解する細胞毒性を有するか、腫瘍特異的な免疫応答を誘導する、生物活性を有するリガンドからなる免疫抱合体であり、その際、
該生物活性を有するリガンドは、ＴＮＦαであり、
該抗体またはその抗体フラグメントのＣ末端に、該生物活性を有するリガンドのＮ末端が融合されており、
該抗体またはその抗体フラグメントは、
本質的に、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインおよび、対応する全抗体分子に由来する軽鎖とからなる抗体； または、本質的に、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインおよび、対応する全抗体分子に由来する軽鎖とからなる抗体フラグメントであり、
該抗体またはその抗体フラグメントは、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する
ことを特徴とする免疫抱合体。
【請求項２】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦαからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫抱合体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫抱合体の調製法であって、
該抗体または抗体フラグメントおよび該生物活性を有するＴＮＦαをコードするＤＮＡ配列を、オリゴ核酸を利用して、所望の融合ＤＮＡ配列に対して相補的である一本鎖ＤＮＡ上において、相互に融合する工程；
得られる構築物を発現ベクターに導入して、それで宿主細胞を形質転換する工程；
ならびに、
その宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現する工程とを含んでなる
ことを特徴とする調製法。
【請求項４】
発現される融合タンパク質は、請求項１に記載の抗体−ＣＨ３抱合体である
ことを特徴とする請求項３に記載の調製法。
【請求項５】
大腸菌宿主中において、抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体を発現するための請求項３に記載の調製法。
【請求項６】
真核細胞宿主中において、抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体を発現するための請求項３に記載の調製法。
【請求項７】
請求項１または２に記載される免疫抱合体の少なくとも一つ、および生物学的に容認し得る担体を含んでなる、腫瘍の治療に利用可能な薬剤組成物。
【請求項８】
腫瘍を対象とする治療に利用可能な医薬の調製において、その活性成分として、請求項１または２に記載の免疫抱合体を使用する方法。
【請求項１】
（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメントおよび（２）該抗体または抗体フラグメントと融合し、腫瘍細胞をその場で特異的に溶解する細胞毒性を有するか腫瘍特異性免疫応答を誘導する生物活性を有するリガンドからなる免疫抱合体。
【請求項２】
生物活性を有するリガンドがサイトカインである
請求項１に記載の免疫抱合体。
【請求項３】
サイトカインがＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−７からなる群から選択される
請求項２に記載の免疫抱合体。
【請求項４】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントである（抗体−ＣＨ１抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項５】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になる抗体フラグメントである（抗体−ＣＨ２抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項６】
該抗体が、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖から本質的になる（抗体−ＣＨ３抱合体）
請求項１、２または３に記載の免疫抱合体。
【請求項７】
該抗体または抗体フラグメントが、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。
【請求項８】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ２、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＩＬ２およびＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ２からなる群から選択される免疫抱合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫抱合体の調製法であって、
抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列をともに融合して、
得られる構築物を発現ベクターに導入してそれで宿主細胞を形質転換して、
その宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現する
ことからなる調製法。
【請求項１０】
抗体または抗体フラグメントおよび生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列を、所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上に融合させる
ことを特徴とする請求項９に記載の調製法。
【請求項１１】
大腸菌宿主における抗体−ＣＨ１抱合体の発現のための
請求項９または１０に記載の調製法。
【請求項１２】
真核細胞宿主における抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体の発現のための
請求項９または１０に記載の調製法。
【請求項１３】
請求項１〜８に記載の少なくとも一つの免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体からなる薬剤組成物。
【請求項１４】
腫瘍に向けた薬物の調製のための請求項１〜８項のいずれか１項に記載の免疫抱合体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはその抗体フラグメント、および（２）該抗体またはその抗体フラグメントのＣ末端に融合されている、系内において腫瘍細胞を特異的に溶解する細胞毒性を有するか、腫瘍特異的な免疫応答を誘導する、生物活性を有するリガンドからなる免疫抱合体であり、その際、
該生物活性を有するリガンドは、ＴＮＦαであり、
該抗体またはその抗体フラグメントのＣ末端に、該生物活性を有するリガンドのＮ末端が融合されており、
該抗体またはその抗体フラグメントは、
本質的に、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインおよび、対応する全抗体分子に由来する軽鎖とからなる抗体； または、本質的に、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインおよび、対応する全抗体分子に由来する軽鎖とからなる抗体フラグメントであり、
該抗体またはその抗体フラグメントは、ネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来する
ことを特徴とする免疫抱合体。
【請求項２】
ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−ＴＮＦα、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＴＮＦαからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫抱合体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫抱合体の調製法であって、
該抗体または抗体フラグメントおよび該生物活性を有するＴＮＦαをコードするＤＮＡ配列を、オリゴ核酸を利用して、所望の融合ＤＮＡ配列に対して相補的である一本鎖ＤＮＡ上において、相互に融合する工程；
得られる構築物を発現ベクターに導入して、それで宿主細胞を形質転換する工程；
ならびに、
その宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現する工程とを含んでなる
ことを特徴とする調製法。
【請求項４】
発現される融合タンパク質は、請求項１に記載の抗体−ＣＨ３抱合体である
ことを特徴とする請求項３に記載の調製法。
【請求項５】
大腸菌宿主中において、抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体を発現するための請求項３に記載の調製法。
【請求項６】
真核細胞宿主中において、抗体−ＣＨ２または抗体−ＣＨ３抱合体を発現するための請求項３に記載の調製法。
【請求項７】
請求項１または２に記載される免疫抱合体の少なくとも一つ、および生物学的に容認し得る担体を含んでなる、腫瘍の治療に利用可能な薬剤組成物。
【請求項８】
腫瘍を対象とする治療に利用可能な医薬の調製において、その活性成分として、請求項１または２に記載の免疫抱合体を使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２９８９３６（Ｐ２００６−２９８９３６Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７８４０９（Ｐ２００６−１７８４０９）
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【分割の表示】特願平６−３２０９７８の分割
【原出願日】平成６年１２月２２日（１９９４．１２．２２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【分割の表示】特願平６−３２０９７８の分割
【原出願日】平成６年１２月２２日（１９９４．１２．２２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]