免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクター
【課題】免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクターを提供する。
【解決手段】シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を備えたレトロウイルス又はレトロウイルス様の組換えベクターからなる。該ベクターは、所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）及びレトロウイルス又はレトロウイルス様の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節遺伝子を含み、細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性リンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能である。
【解決手段】シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を備えたレトロウイルス又はレトロウイルス様の組換えベクターからなる。該ベクターは、所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）及びレトロウイルス又はレトロウイルス様の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節遺伝子を含み、細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性リンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インビトロで、及び好ましい実施態様ではインビボで、ベクター中に存在するヌクレオチド配列によってコードされたエピトープに対する免疫反応の発生若しくは増強を誘導し、又はこれらに寄与することが可能な組成物を調製するためのレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの使用に関する。
【０００２】
本発明者等は、本発明に従って調製したベクターによって、細胞性免疫応答、特にエピトープに対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を得ることが可能であることを示した。
【０００３】
さらに、この細胞性免疫応答がベクターに含まれるヌクレオチド配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対して得られた特異的応答であり得ることを示すデータが得られた。
【０００４】
従って、本発明は腫瘍及び癌に対する治療プロトコールに使用でき、特に腫瘍に対する免疫療法又は予防接種療法のプロトコールに使用できる手段を提供する。
【０００５】
本発明は、感染症、特にウイルス感染、例えばレトロウイルス感染に関連した疾患の治療また予防に使用できる手段も開示する。
【０００６】
本発明者らは、さらに、本発明の組成物による治療に関連した細胞性免疫応答、特にＣＴＬ応答は腫瘍若しくはウイルスの抗原、又はウイルス感染細胞の抗原に特異的であることが可能で、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の特定の分子に限定され得ることを示す結果を得た。
【０００７】
特に本発明は、ＭＨＣ複合体のクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２又はＢ７分子に限定した細胞性免疫応答を得るために、免疫原組成物に前記ベクターを使用することに関する。
【０００８】
従って、本発明はシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を包含するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む免疫原組成物に関する。ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列は、逆転写中に３本鎖ＤＮＡ構造（本明細書ではＤＮＡ３重鎖と称する）の形成を誘導する。このＤＮＡ３重鎖は、ベクターＤＮＡゲノムの核移入を刺激し、これらの領域の起源はレトロウイルス又はレトロウイルス様で、前記ベクターは所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）に加えて、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、発現、及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含み、この組成物はベクター内に存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）又はＣＤ４の応答を誘導又は刺激することが可能である。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様では、細胞性免疫応答、特に１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ応答又はＣＤ４応答は記憶ＣＴＬ又はＣＤ４応答である。
【００１０】
ベクター内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在すると、３重鎖ＤＮＡ構造が形成されることが可能で、それによって前記ベクターで組換えられた細胞でのベクターゲノムの核移入が影響を受け、特に増強され得ることが強調される。
【００１１】
本発明による免疫原組成物は記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導、改良し、又は一般にその発生に関与することができるので、（前記免疫原組成物の投与後、前記免疫応答が長期間にわたって誘導されなければならない場合、又は少なくとも応答が必要とされる期間に（前記応答の長期誘導であってもよい）誘導可能でなければならない場合を含む）抗腫瘍治療又は抗ウイルス治療又は抗病原性治療のプロトコールにおいて前記免疫原組成物の使用を企図することが可能である。言い換えると、前記免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ応答又は記憶応答の発生を誘導又は刺激し、又はそれに寄与することによって、腫瘍疾患又は感染性疾患（例えば細菌又はウイルスによる）を治療するための治療用組成物の調製に使用することができる。
【００１２】
本発明の免疫原組成物は、ベクターの配列中に３重鎖構造が存在する結果、ベクター及びベクター粒子内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在するため、標的細胞においてベクターゲノムの核移入を刺激させ得ることが注目される。ベクター内で誘導されるエピトープは細胞自身のものであってもよいし、細胞以外のものであってもよい。
【００１３】
本発明は、標的細胞又は受容細胞の核への核酸配列又はペプチド配列の移入を増加させるために、レトロウイルス由来又は合成によるｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むヌクレオチド配列の使用も含む。
【００１４】
例えば、前記３重鎖配列には受容細胞の外来配列又は自己配列が含まれることが理解されよう。
【００１５】
従って、本発明は、腫瘍治療、特に抗癌治療又は抗感染性疾患治療のための予防接種プロトコールと類似した治療プロトコールにおいて使用可能な組成物を開示する。
【００１６】
本発明では、目的の該導入遺伝子又は配列が、１又は数個の腫瘍細胞の１又は数個のエピトープ、例えば腫瘍に対する細胞性免疫を誘導することが可能な標的抗原に同定されたエピトープをコードする配列である得ることに注目すると興味深い。
【００１７】
ポリペプチドを形成する数個のエピトープは、本発明の導入遺伝子によってコードすることができる。特定の実施態様では、それらは腫瘍で確認された標的抗原から得ることができ、コーディング配列が一緒になって導入遺伝子を形成するとき、細胞性免疫応答がエピトープ全て又はエピトープのほとんどに対して得られるような方法で選択され得る。細胞性免疫応答はインビトロ、又は好ましい実施態様ではインビボでアッセイすることができる。このようなアッセイの実施を可能にするプロトコールは実施例で説明する。
【００１８】
標的抗原はいくつかの種類の腫瘍、特にメラノーマ又は腎癌、膀胱癌、大腸癌、肺癌、乳癌、白血病及びリンパ腫などを含む癌腫で同定されている。
【００１９】
本発明の他の態様では、前記免疫原組成物はウイルス関連感染症、又はミコバクテリア、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む任意の種類の病原体に関連する感染症を含めた感染性疾患において、細胞性免疫応答を得るために使用することができる。
【００２０】
この場合、細胞性免疫応答を引き起こすことが可能な特定の抗原を同定して、そのコーディング配列をベクターに挿入して前記免疫原組成物で使用することができる。例えば、Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｄｅｓ遺伝子が使用できる。
【００２１】
本発明では、前記免疫原組成物で使用されるベクターは、エピトープを発現するか、又は腫瘍細胞若しくはウイルス感染細胞上の標的抗原として同定された（糖タンパク質又はその他のタンパク質由来化合物を含む）タンパク質上に提示することが可能であることも付け加えなければならない。
【００２２】
さらに、エピトープ、エピトープを提供するために使用されたポリペプチド又はタンパク質は、例えば変異、欠失又は挿入によって変更することが可能で、例えば安定性を高めるために変更することが可能であることにも留意すべきである。
【００２３】
本発明は、
１）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含有する組換えヌクレオチド配列と、
２）シス作用性中心開始領域（ＣＴＳ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を包含するポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、又はトランスポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入されたポリヌクレオチドと
を備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、
ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は刺激することができる免疫原組成物に関する。
【００２４】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性配列を包含するＤＮＡ配列は、逆転写後に３本鎖ＤＮＡ構造「ＤＮＡ３重鎖」を採り、ベクターＤＮＡの核移入を刺激することができる。
【００２５】
特定の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は刺激することが可能な前記免疫原組成物は、
ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポリペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポリペプチド）と、
ｄ）転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれ、１又は数個のエピトープをコードする所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含有する配列と、並びにシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含有するポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、上記レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されているポリヌクレオチドとを備えた組換えヌクレオチド配列と
を具備する組換えレトロウイルスベクター粒子を含む。
【００２６】
他の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向挿入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列を具備する組換えレトロウイルス様粒子と
を含む。
【００２７】
好ましい実施態様では、前記の定義の何れか１つに応じた免疫原組成物に存在する組換えレトロウイルスベクター粒子は、記憶細胞性免疫応答、特に記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導、増強するか、又は関連することが可能である。
【００２８】
前記で開示した定義に従って、ベクター又はベクター粒子を含む免疫組成物は、いくつか可能な実施態様によって調製することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、レトロウイルス起源の配列をレンチウイルスゲノムから得る方法で免疫原組成物は調製される。
【００３０】
他の実施態様では、これらの配列の起源はレトロウイルス様であり、レトロトランスポゾンからも得られる。
【００３１】
本発明の他の実施態様では、又は前記で定義した特徴に加えて、組換えベクターに含有される目的の導入遺伝子又は配列は、転写及び発現の調節シグナルを含有する発現カセットに含まれる。
【００３２】
あるいは、ベクターの逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルはレンチウイルス起源であり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えたポリヌクレオチドもレンチウイルス起源である。
【００３３】
他の実施態様では、ベクター内の逆転写、発現、及びウイルス粒子形成の調節シグナル並びにｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドは、ＨＩＶ型、特にＨＩＶ−２又はＨＩＶ−２のレトロウイルスから得られる。
【００３４】
他のウイルス、特にレンチウイルスは、逆転写発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを設計するために、さらにはｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドを得るために使用することができる。従って、特にレンチウイルスＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶを使用することができる。
【００３５】
本発明の免疫原組成物の組換えレトロウイルス粒子を獲得するため、ベクターのトランス相補性に必要なポリペプチド又はタンパク質をコードする配列は、例えばレンチウイルス、特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２レトロウイルスを含むＨＩＶ由来のＧＡＧ、ＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質である。
【００３６】
あるいは、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列は、ＥＮＶ配列とは異なるウイルスに由来してもよい。例えば、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列はＨＩＶレトロウイルス由来であり、ＥＮＶ配列は他のウイルス又はレトロウイルス由来し、且つアンフォトロピック又はエコトロピックＥＮＶ配列の何れであってもよい。
【００３７】
他の実施態様では、ＥＮＶ配列は水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られる。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾンから得られ、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向に挿入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を含む組換えヌクレオチド配列と
を備えた組換えレトロウイルス様粒子を含む。
【００３９】
好ましい実施態様では、組換えレトロウイルス様粒子を含む本発明の免疫原組成物は、前記で開示した特徴によって、記憶細胞性応答、特に記憶ＣＴＬ応答を引き起こすことが可能である。
【００４０】
本発明は、１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ａｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたベクター構築物にも関する。
【００４１】
第１のベクターは、１９９９年１０月１１日にｌ−２３２６号として寄託されたｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであり、第２のベクターはｐＴＲＩＰ−ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと称し、１９９９年１０月１１日にｌ−２３２７号として寄託された。
【００４２】
第３のベクター、ｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、１９９９年１０月１１日にｌ−２３３１号としてＣＮＣＭに寄託された。
【００４３】
前記構築物に存在する抗原をコードする配列は、前記で引用したＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの完全なＤＥＳ遺伝子を含む、他の任意の目的の抗原又はエピトープによって置き換えることができる。
【００４４】
本発明の他の態様では、ベクター、ベクター粒子及び同物を含む免疫原組成物は、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心に位置するように設計される。
【００４５】
「中心に位置する」とは、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心、又はこの配列のほぼ中心にあることを意味する。特に、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域は逆転写された直鎖状ベクターＤＮＡの中央の３分の１以内にあることが可能である。
【００４６】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列が存在する結果としてウイルス逆転写中に形成された３重鎖配列が中央に位置することによって、そのベクター又はベクター粒子と接触する細胞の形質導入量を増大させることが可能である。
【００４７】
あるいは、前記ベクターの変種によっては、導入遺伝子を含むベクターの転写単位はＬＴＲ領域のＵ３領域内に挿入することができる。従って、逆転写の後、導入遺伝子は複製され、従って３重鎖配列のそれぞれの鎖に現れ、従って導入遺伝子の大きさにかかわらず、３重鎖配列がベクターの中心部分に位置することが可能となる。
【００４８】
本発明は、本発明による免疫原組成物と接触するように置かれた細胞に関し、特に免疫原組成物のベクター又はベクター粒子によって形質導入された組換え細胞にも関する。
【００４９】
これらの細胞は、有利には、抗原提示細胞である。例えば、これらの細胞は、肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択することができる。
【００５０】
従って、本発明の免疫原組成物は、一次細胞性免疫応答、特に、有利には記憶ＣＴＬ応答であるＣＴＬ応答を発生させ、腫瘍、特に癌の治療方法又は治療処置のための治療組成物の調製に使用することができる。あるいは、その他公知の抗癌治療の補助処置として使用することができる。
【００５１】
例えば、本発明の免疫原組成物は、化学療法又は免疫化学療法又は抗癌治療のその他のアプローチと関連させて使用することができる。
【００５２】
「抗癌治療」という表現は、本発明では、腫瘍の増殖又は腫瘍が増殖する可能性を阻害すること、若しくは転移巣形成の制御を含めた悪性細胞の拡散を阻害することを意味するか、又はその両者を意味するものである。
【００５３】
従って、本発明では、「抗癌治療」という表現は、特にこの免疫原組成物が記憶細胞性応答を誘導又は増強し、一般的には関与することが可能であるという事実を考慮すると、疾患の治癒を期待して、悪性細胞の増殖及び腫瘍の拡散を制御するために使用する方法に関している。
【００５４】
本発明の組成物で治療し得る腫瘍は、例えば、メラノーマ又は（肺、膀胱、腎臓、大腸）含めた癌腫及びリンパ滲出である。
【００５５】
治療可能な腫瘍も、変異した自己タンパク質及び／又は過剰発現した自己タンパク質を含む腫瘍特異的抗原を発現している全ての腫瘍である。
【００５６】
エキソビボ段階を含む投与方法、例えば、標的細胞にエキソビボ導入した後、標的細胞を治療する患者に投与することを含めて、受容可能な本発明の免疫原組成物の投与方法はいずれも興味深い。
【００５７】
あるいは、本発明の免疫原組成物は、全身（ＩＶ）、局所、又は皮膚、皮下、例えば筋肉内投与経路を含めた通常の投与経路によって患者に直接投与し得る。
【００５８】
特定の実施態様では、本発明の免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ性免疫応答の発生をインビボで誘導、増強、又は関与する方法で患者に直接投与し得る。
【００５９】
他の実施態様では、前記免疫原組成物は、長期間記憶細胞性応答を発生させるために使用される。
【００６０】
本発明の前記免疫原組成物は、ベクター又はベクター粒子に存在するｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列の特性によって、標的細胞内でベクターゲノムの核移入を誘導又は促進するので特に興味深いことが強調される。
【００６１】
本発明の免疫原組成物が特に優位なのは、これらがベクター又はベクター粒子に存在する関心のあるヌクレオチド配列又は導入遺伝子によってコードされた複数のエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するために使用できること、及び完全な遺伝子配列、例えば病原性物質の遺伝子の産物又は少なくとも８から１５アミノ酸、好ましくは９から１２アミノ酸をコードし得る前記遺伝子の断片の産物に対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するためにも使用できることである。本発明はまた、細胞性応答を誘導する前記アミノ酸配列の複数反復（少なくとも２回の同一配列）及び／又は異なる病原性抗原又は腫瘍抗原の２個のエピトープに対応する少なくとも２種の異なる配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明のその他の特性又は利点を、以下の実施例及び図面で開示する。
【００６３】
実施例
レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を含む細胞を形質導入する能力を有しており、遺伝子治療にとってますます重要となっている。最近、ポリプリン広域シス作用性配列（中心ＤＮＡ３重鎖）を含むレンチウイルスベクターが中心ＤＮＡ３重鎖を欠失したものよりもヒト及びマウスをより効果的に形質導入することが示された（Ｃｈａｒｎｅａｕ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４、２４１、６５１〜６６２）。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、又は含まず、同様のＨＬＡ−Ａ２．１限定メラノーマＣＴＬポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターのＴＬ応答を誘導する能力を本明細書で試験した。ＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ２．１純系）マウスにおいて、中心ＤＮＡを含むレンチウイルスベクターを直接インビボ投与すると、ポリエピトープ配列によってコードされたエピトープペプチド全てに対する強いＣＴＬ応答が誘導された。レンチウイルスベクターはＤＮＡ３重鎖を含むと明らかに有利であることが示された。さらに、ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスが３重鎖を含まないベクターよりもヒト樹状細胞を７倍も効果的に形質導入することが示された。これらのエキソビボ導入した樹状細胞は、メラノーマエピトープペプチドのほとんどに対して効果的かつ特異的な１次ＣＴＬ応答を引き起こす。変更したレンチウイルスの安全性の問題がほぼ解決されたので、このベクターをインビボにおけるヒトの遺伝子治療だけでなく、癌患者の免疫療法にも使用することを提案する。
【００６４】
緒言
レトロウイルスの亜種レンチウイルスは、非分裂細胞を含めたほとんどの細胞種に感染することができる。この特性があるため、レンチウイルスは遺伝子治療にとって魅力的な存在である。いくつかの複製欠失組換えレンチウイルスベクターは、既に様々なグループによって構築されている（Ｎａｌｄｉｎｉ ＰＮＡＳ ９３、１１３８２〜８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６）。再操作し、無毒化したこれらのレンチウイルスベクターは最も効果的かつ安全な遺伝子治療用ベクターとして提案されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ、＆ Ｋｉｍ Ｖ．Ｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２、９８７３〜８０、１９９８）。本発明者等は、水疱性口炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶＧ）偽型レンチウイルス（ＨＩＶ）をベースとしたベクターを開発した（Ｂｕｒｎｓ Ｊ．Ｃ．、１９９３ ＰＮＡＳ ９０、８０３３〜７）。このベクターは非必須なウイルスタンパク質をほとんど欠失しているが、ポリプリン領域シス作用性配列（ｃＰＰＴ、中心ＤＮＡ３重鎖）を含む。この中心ＤＮＡ３重鎖は、逆転写されたＨＩＶ−ＤＮＡ分子の核移入をかなり促進する。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスは、この３重鎖を含まないベクターよりも効果的にマウス及びヒト細胞を形質導入させることが認められた。
【００６５】
ＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ２．１純系）トランスジェニックマウス（Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：２０４３〜２０５１）を用いると、実験的に制御したエピトープペプチドの免疫原性の評価及び様々な免疫戦略の評価が可能である。これらのＨＨＤマウスを使用して、異なる組換えベクターによってコードされたメラノーマポリペプチドが単一の動物個体内で同時にＣＴＬ応答を誘導する能力が報告された。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、又は含まず、同様のメラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターが、ＨＨＤトランスジェニックマウスにおいてインビボＣＴＬを誘導する能力について最初に調べた。さらに同様の組換えレンチウイルスによって形質導入されたヒト樹状細胞（ｈＤＣ）がエキソビボでメラノーマポリエピトープモチーフに対して１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかについても調べた。本発明の結果によって、組換えベクターを直接投与するか、又はエキソビボで形質導入した樹状細胞を使用すると、ＤＮＡ３重鎖によってレンチウイルスベクターがインビボで特異的なＣＴＬ応答を誘導する能力が著しく増強されることが示された。
【００６６】
結果
実施例１：メラノーマポリエピトープの免疫
メラノーマから得られたポリエピトープモチーフをコードする組換えＤＮＡをＨＨＤマウスに注射することによって、いくつかのメラノーマエピトープに対して同時にＣＴＬ応答を惹起することができることを証明した後、同様のメラノーマポリペプチドモチーフ（図１及び表１）をコードするレンチウイルスの免疫原能を試験した。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（ＣＮＣＭ １−２１８５として１９９９年４月２０日に寄託）をマウス当たり１．２５μｇ／ｐ２４で静脈内、腹腔内、又は皮下内に投与した。１群当たり少なくとも３匹のマウスを使用した。
【００６７】
１０個のメラノーマエピトープのほとんどに対して特異的な複数のＣＴＬ応答が同時に誘導された。投与経路に関わらず、負荷したペプチド（表２）及びＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで形質導入したＨＨＤトランスフェクトＨｅＬａ細胞（データは示していない）の両者に対して同様のＣＴＬ応答が認められた。しかし、腹腔内注射によって、わずかに良好なＣＴＬ応答が誘導された。強い応答がＮＡ１７−Ａ．ｎｔ３８及びｇｐ１００．１５４エピトープペプチドに対して引き起こされた。ｇｐ１００．４５７、ＭＡＲＴ．１．２７、Ｍａｇｅ−３、及びチロシナーゼ３６８−Ｄに対してまた、著しい応答が認められた。ｇｐ．１００．２０９、ｇｐ．１００．２８０、ＭＡＲＴ−１．３２、及びチロシナーゼ１に対するＣＴＬ応答は弱かった。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した後に弱いＣＴＬ応答が引き起こされたエピトープは全て、その他のレンチウイルスベクター以外を投与したときのＣＴＬ非誘導群に分類された。
【００６８】
インビボで検出可能なＣＴＬを誘導するために必要なレンチウイルスベクターの最小用量
著しいＣＴＬ応答を引き起こすレンチウイルスベクターの最小用量は、６種の異なる用量のＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを腹腔内投与して（１用量あたり４匹のＨＨＤマウス）決定した。５１Ｃｒ試験の直前に２匹のマウスのエフェクター細胞を混合して同一のＥ／Ｔ比を得る実験を２回実施した。ほとんどの実験において、メラノーマエピトープペプチド全てに対するＣＴＬ応答を試験した。結果は非常に類似しており、極めて同質であったので、「線量−効果」関係を明確かつ簡潔に比較するためにＮＡ１７／Ａエピトープペプチドに対するＣＴＬ応答のみを考慮した。マウス当たり５００ｎｇと２５００ｎｇ／ｐ２４との間の用量を使用して、最良のＣＴＬ応答が得られた。いくつかのメラノーマエピトープに対して検出可能なＣＴＬ応答が得られたが、レンチウイルスの用量が高くても用量の低い場合よりも良好なＣＴＬ応答が誘導されるわけではなかった。いくつかのメラノーマペプチドに対するいくつかの特異的なＣＴＬ応答が実証されたとしても、マウス当たり５００ｎｇ／ｐ２４未満の用量では、効果的なＣＴＬ応答を誘導するには不十分であった。マウス当たり１２５０ｎｇ／ｐ２４の用量で、何匹かのマウスにおいてポリエピトープモチーフに含まれる１０個のエピトープ全てに対してＣＴＬ応答が生じたことは注目に値する（図３）。
【００６９】
長期の記憶ＣＴＬ誘導
マウス８匹にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを注射した。免疫後、このマウスを１２日目又は５ヶ月目に殺処分した。５日間はメラノーマエピトープペプチドで、さらに２日間は１０％ＴＣＧＦでインビトロ誘発した後、マウス４匹のエフェクター細胞を混合してペプチドを負荷したＨＨＤトランスフェクトＲＭＡＳ細胞に対して試験した。１２日前に免疫したマウスでは、ｇｐ１００．２９及びＭａｒｔ１．３２以外のメラノーマエピトープペプチド全てについてＣＴＬ応答が証明された。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注射して５ヶ月経つと、１次ＣＴＬ誘導エピトープ全てがまだ強いＣＴＬ応答を誘導した（図２）。マウス免疫後、１２日目又は５ヶ月目のＣＴＬ応答のレベルは、驚くほど同等であった。レンチウイルスベクターによってインビボ導入された細胞は、免疫系によって破壊されずにコードされたメラノーマポリエピトープを産生し続けることが示唆された。
【００７０】
インビボ免疫における中心ＤＮＡ３重鎖の役割
ＨＨＤマウスそれぞれに、同時にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＨＲ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターをマウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ、５０ｎｇ、１２ｎｇ、及び３ｎｇ／ｐ２４の用量で腹腔内投与して免疫した。別個の２回の実験において、各用量について少なくとも４匹のマウスを試験した。合成ペプチドでインビトロ誘発した後、ペプチドを加えたＲＭＡＳ−ＨＨＤ標的細胞を使用して脾細胞の細胞溶解能を試験した。結果は極めて似通っていたので、明確かつ簡潔にするためにＮＡ１７／Ａ、Ｍａｒｔ−１．２７、ｇｐ１００．１５４、及びチロシナーゼ．３６８−Ｄエピトープペプチドに対するＣＴＬ応答のみを試験した。
【００７１】
結果を表３に示す。一般に、マウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ、５０ｎｇ／ｐ２４の用量のＴＲＩＰ−ＬＶベクターで免疫したマウスはＨＲ−ＬＶベクターで免疫したマウスよりも強いＣＴＬ応答を引き起こした。使用したベクターにかかわらず、マウス当たりの１２ｎｇ／ｐ２４未満の用量では検出可能なＣＴＬ応答は認められなかった（データは示さず）。これによって、中心ＤＮＡ複合体を含むレンチウイルスベクターの形質導入能はこの複合体を欠失したものよりも増強されていることが確認された。
【００７２】
レンチウイルスベクターによる樹状細胞の形質導入
ＭＴ４及びＨｅＬａ細胞などの腫瘍細胞が中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスによって中心ＤＮＡ３重鎖を持たないベクターよりも３０倍まで効果的に形質導入されることが最初に観察された。次に、様々な濃度でこれら２種のレンチウイルスベクターの形質導入能を健常提供者又はＨＨＤマウスのＤＣについて試験した。ＧＦＰを発現するＤＣのパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによって測定し、２種のレンチウイルスベクターによるＤＣの形質導入濃度と見なした。
【００７３】
ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターは、どのベクター濃度でもＨＲ−ＧＦＰよりも効果的に細胞を形質導入した。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたマウス及びヒトＤＣのＧＦＰ発現は、それぞれＨＲ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたＧＦＰの発現の３倍及び７倍に達した（図４）。
【００７４】
ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたヒト樹状細胞を使用した１次ＣＴＬ誘発
健常なＨＬＡ−Ａ２．１提供者から得られた単核細胞（ＭＮＣ）を、同提供者から得られたＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによって形質導入したＤＣを使用して週に１回インビトロで誘発した。樹状細胞におけるＧＦＰ発現の存在をＦＡＣＳによって分析し、形質導入の効果を確かめた。３週間後、ＭＮＣ細胞障害性は、ＦＣＳを含まない培養条件で標的としてペプチドを付加したＴ２細胞を使用した５１Ｃｒアッセイによって試験した。
【００７５】
ＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで形質導入したｈＤＣは、Ｍａｒｔ１．３１以外のメラノーマエピトープペプチド全てに対して著しいＣＴＬ応答を誘発したが、形質導入しなかったｈＤＣでは通常のバックグランドの応答しか誘発しなかった（図５）。
【００７６】
考察
複製欠失レンチウイルス由来のベクターが様々な非分裂細胞を形質導入できることは、近年報告で示されている（Ｍａｌｄｉｎｉ、１９９６、Ｋａｆｒｉ、１９９７）。レンチウイルスは非分裂細胞の完全な核膜を通過して移入することができる（Ｃａｓｅ、１９９９）。本明細書では、この方法と中心ＤＮＡ３重鎖と称したポリプリン領域シス作用性配列を組み合わせると、大いに可能性が広がることを実証した。この配列をレンチウイルス由来ベクターに導入すると、ニューロン、肝細胞、及び造血幹細胞／始原細胞を含めた数種の細胞の安定したインビボ及びエキソビボ形質導入を３０倍高めることが可能であった。
【００７７】
最近、レンチウイルス由来のベクターの安全性及び遺伝子治療での使用に関する取り組みで、進歩が認められた（Ｎａｒｒｙ Ｋｉｍ Ｖ ｅｔ ａｌ １９８８、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ、１９９９）。しかし、古典的なマウスのレトロウイルスベクター及びレトロウイルスではないベクターの使用が成功した免疫治療で（Ｃｏｎｄｏｎ、１９９６、Ｓｏｎｇ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、１９９７）、レンチウイルスベクターを適用することについては研究されなかった。有望なワクチン戦略を開発するために、中心ＤＮＡ３重鎖を含み、メラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターの免疫原能を試験した。最初に、このベクターを直接注射して、メラノーマエピトープに対してインビボで特異的なＣＴＬ応答が引き起こされ得るかどうかについて調べた。今までに、ＨＨＤ ＨＬＡ−Ａ２．１（純系）トランスジェニックマウスにおいていくつかの免疫戦略の比較が行われた。組換えｐＣＭＶ−Ｂ１０（ＨＢｓ）ＤＮＡ又は同様のメラノーマポリエピトープをコードする組換えワクチンを使用すると、１個体マウスにおいて、メラノーマポリエピトープに含まれる４から６個の異なるペプチドに対するＣＴＬ応答が同時に誘導されることが可能であった。同様のメラノーマポリエピトープをコードするＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターでは、特異的細胞溶解についてだけでなく、ＣＴＬ応答を誘発するポリペプチドの数についても、同様のポリエピトープモチーフをコードするその他のベクターよりも顕著に優れた結果が得られた。特に、ベクターを腹腔内及び皮下注射すると、ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによってコードされたエピトープ全てに対してＣＴＬ応答が誘導されるマウスがいた。
【００７８】
形質導入又はペプチド付加された樹状細胞は、様々なガン細胞に対して有望な免疫方法として使用できることがいくつかのグループによって報告された（Ｍａｙａｒｄｏｍｏ、ＪＩ、１９９５、Ｓｏｎｇ Ｗ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、ＪＭ、１９９７）。従って、本発明の目的のために、マウス及びヒトの樹状細胞が効果的に形質導入され、インビトロで１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかを調べた。本発明の結果によって、これらの細胞が容易に形質導入され得ることが示唆された。さらに、これらの形質導入細胞は組換えレンチウイルスによってコードされたエピトープ全てを提示した。興味深いことに、ヒト樹状細胞は最も容易に形質導入された。細胞をインビトロ形質導入することによって、レンチウイルスベクターが様々な宿主細胞にゲノムを有害な方法で組み込むことを回避できる。この理由によって、インビトロ形質導入された細胞は、最初の臨床応用で適切かつ安全な送達方法となるだろう。
【００７９】
Ｗａｒｎｅｒ等は、マウスのレトロウイルスベクターによって形質導入したＨＩＶ−タンパク質を発現する繊維芽細胞を使用して、レトロウイルスベクターがいくつかの動物モデルだけでなく、ＨＩＶ患者のＣＴＬ応答を誘導する能力を初めて示した（１９９８年にＷａｒｎｅｒによって概説されている）。マウスに直接注射すると、プロウイルスのＤＮＡが効果的に抗原を提示する樹状細胞で検出された（Ｓｏｎｇ、１９９７）。しかし、レンチウイルスとは対照的に、マウスのレトロウイルスベクターはＤＣなどの非分裂細胞を形質導入することができず、コードされた遺伝子のインビボ発現は「遮断される」ことが多い。結果的に、これらのレトロウイルスベクターはヒトの免疫治療にとって有力な候補とはならない（Ｋａｆｒｉ）。
【００８０】
我々の結果によって、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスベクターは、ＨＨＤマウスにおいて中心ＤＮＡ３重鎖を含まないベクターよりも強くインビボでＣＴＬ応答を誘導することが示唆される。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスベクターはインビトロで容易にｈＤＣを形質導入することができ、ひいては臨床的免疫治療に使用することができよう。
【００８１】
材料及び方法
レンチウイルスベクター構造
ベクタープラスミド：ＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺ由来のｐＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ ９３、１１３８２〜８、１９９６）。ＬａｃＺリポーター遺伝子は、ＥＧＦＰ遺伝子で置き換えた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ＴＲＩＰ−ＥＧＦＰでは、ＥＧＦＰ遺伝子をｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１ＬＡＩの中心断片のＣｌａｌ部位に挿入した。
【００８２】
ＥＧＦＰ遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドからＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲによって増幅し、５′及び３′それぞれにＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を付加した。ＰＣＲプライマは以下の通りであった。
【００８３】
Ｂａｍ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ３′
Ｘｈｏ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ３′
ＨＲ ＧＦＰベクターは、このＰＣＲ断片をｐＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングし直して、ＬａｃＺ ＯＲＦをＥＧＦＰに置き換えることによって構築した。
【００８４】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含むｐＬＡＩ３の１７８ｂｐ断片（４７９３から４９７１）をＰＣＲによって増幅した。この断片をＨＲ ＧＦＰの特有のＣｌａＩ部位に挿入するために、ＮａｒＩ制限部位をプライマの５′に付加した。
【００８５】
Ｎａｒ ＴＲＩＰ＋： ５′ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＧＡＡＴＴＣ ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＣ ３′
Ｎａｒ ＴＲＩＰ−： ５′ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ Ｃ ３′
正方向でこの３重鎖配列を挿入すると、ＴＲＩＰ ＧＦＰプラスミドベクターが生じ、逆向きだとＴＲＩＰｉｎｖ ＧＦＰが生じた。あるいは、同様の３重鎖断片をｐｃＰＰＴ−ＡＧ、ｐｃＰＰＴ−Ｄ、ｐｃＰＰＴ−２２５及びｐＣＴＳプラスミドから増幅して、対応するウイルスのようにｃＰＰＴ又はＣＴＳに同様の変異を含むベクターを作製した。
【００８６】
まず、ＴＲＩＰ ＧＦＰベクター又はＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（ＣＮＣＭに１９９８年４月１５日Ｉ−２００５号として寄託）に存在するＥｃｏＲＩ部位を充填して、ＴＲＩＰ ＧＦＰΔＥベクターを作製した。次に、ＴＲＩＰ ＧＦＰ ΔＥベクターの０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＥＧＦＰの代わりに、ピコナウイルスの内部リボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含む１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片をＥＧＦＰの上流にクローニングして、ＴＲＩＰ ΔＥ ＩＲＥＳ ＧＦＰベクターを作製した。ＣＭＶプロモータとＩＲＥＳ ＧＦＰ配列の間に存在する部位は、ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＸＩ−ＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩである。ＣＴＬポリエピトープメラノーマ（ｍｅｌ）断片をＰＣＲによってｐＢＳ ｍｅｌ ｐｏｌｙ上に作製し、プライマ５ＢｇｌＭｌｕ Ｍｅｌ：
５′ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴ ３′
３ＲＩＭｅｌ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧＡＴＧ３′
の内部にｋｏｚａｃコンセンサス配列を挿入した。
【００８７】
ｍｅｌ ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、ＴＲＩＰ ΔＥ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰとも称するＴＲＩＰ ΔＥ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰを作製した。
【００８８】
ＨＲ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰは、メラノーマポリエピトープ及びＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＩＲＥＳ ＧＦＰを含むＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＨＲ ＧＦＰのものと交換して作製した。ＮｄｅＩ部位はＣＭＶプロモータの末端に位置している。
【００８９】
ウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターは、既に記載されたように（Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｉ．Ｍ．ＰＮＡＳ １９９６ 及びｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）、リン酸−カルシウム法を用いて、２９３Ｔ細胞を３種のプラスミドによって一過性にトランスフェクトすることによって作製した。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞にＶＳＶエンベローププラスミド（ｐＭＤＧ）２０μｇ及び様々なパッケージング（８．２又は８．９１）プラスミド及びレンチウイルスベクタープラスミド４０μｇをトランスフェクトした。トランスフェクトして６０ｈ後及び８４ｈ後に、調整培地を収集した。次いで、ウイルスを濃縮して、ｄＮＴＰを既に記載されたように処理した（Ｎａｌｄｉｎｉ ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。ＨｅＬａ Ｐ４．２細胞及びＭＴ３細胞に対するウイルス力価は、系列希釈及びｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。
【００９０】
ＤＥＡＥ−デキストラン２０μＭ存在下で、９６ウェルプレートに接種したＰ４細胞に等量の粒子（ウェル当たりｐ２４ウイルス抗原１ｎｇ）を感染させることによって、ウイルスの１サイクル力価測定を実施した。実験全体を通して、プロテアーゼ阻害剤サキナビル（Ｒｏｃｈｅ）を１μＭで添加して、感染１回に限定した分析を行った。細胞の有糸分裂は、感染前日にアフィコリン（ａｐｈｉｃｏｌｉｎ）（８μＭ）処理して阻害した。β−ガラクトシダーゼ活性は、化学ルミネセンスβ−Ｇａｌリポーター遺伝子アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、感染４８時間後に測定した。
【００９１】
ＨｅＬａ細胞を等量のベクター粒子（ウェル当たりｐ２４ ５ｎｇ）で３回感染させた。形質導入後４８時間して、培地をＴＮＢ（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ５０ｍＭ）２００μｌに置換して、生細胞の蛍光をマイクロプレート蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ）及びＥＧＦＰ対応フィルター（励起：４８５ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を使用して定量した。
【００９２】
マウス
ＨＨＤマウスについては既に説明されている（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）。このマウスは、ヒトｂ２ｍのＣ末端がペプチドのアーム（ＧＧＧＧＳ）ｘ３によってキメラ重鎖（ＨＬＡ−Ａ２．１、ａ１−ａ２、Ｈ−２Ｄｂ ａ３−膜間ドメイン、及び細胞質内ドメイン）のＮ末端に共有結合したトランスジェニック１本鎖組織適合クラスＩ分子を発現する。これらのマウスのＨ−２Ｄｂ及びマウスｂ２ｍ遺伝子はさらに相同的組換えによって分断され、マウス組織適合クラス１分子の細胞表面での発現が完全に欠如しており、血清学的に検出されなくなっている。
【００９３】
ｈＤＣ及び１次ＣＴＬ誘導の発生
ヒト樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１ハプロタイプの健常提供者のサイタフェレシス生成物（ＩＤＭ、パリ、フランス）から得られた。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲに対するｍＡｂを使用したこれらのＤＣのＦＡＣＳ分析によって、未熟ＤＣ表現型が示された。レンチウイルスベクターを１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、及び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度で含むＡＭＶ−５培地中で、このｈＤＣを１０日間形質導入した。２種のレンチウイルスベクターで形質導入したｈＤＣにおけるＧＦＰ発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによって測定した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ、ＵＳＡ）。
【００９４】
同一提供者の単核細胞（ＭＮＣ）をｈＤＣ又は形質導入したｈＤＣで１ｈＤＣに対して４ＭＮＣの比でインビトロ誘発した。このＭＮＣを同一の低温保存した形質導入ｈＤＣを使用して２回再誘発して、次いで関連ペプチド又は陰性対照（ｌｎｆ．ｍ．５８）ペプチドを付加したＴ２細胞を標的として使用した４ｈ５１Ｃｒ−放出アッセイで細胞溶解活性を試験した（１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細胞／ｍｌ、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地、室温で２時間）。
【００９５】
マウス樹状細胞の生成
骨髄由来樹状細胞を既に記載されたように生成した［４３、５１］。骨髄の単核細胞を１０％ＦＣＳ、Ｌグルタミン ２ｍＭ、ペニシリン ５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌ、メルカプトエタノール ５．１０５Ｍを補足したＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ培地）に、さらに組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ及び組換えマウスＩＬ４ １００ｎｇ／ｍｌ（いずれもＧＥＮＺＹＭＥ（ケンブリッジ、ＭＡ）製）を補足して培養した。２日目及び６日目に、付着しなかった細胞を注意深く除去して、マウスＧＮ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌ及びマウスＩＬ４ ５０ｎｇを補足した新鮮な完全ＲＰＭＩ培地を添加した。７日目に、培養培地を１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、及び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度のレンチウイルスベクターを補足したＲＰＭＩ完全培地１ｍｌで置換した。９日目に集めた樹状細胞を適切なｍＡｂで評価したところ、純度は９５％を上回っていた（ＩＡｂ＋、ＨＨＤ＋、ＣＤ−３、３３Ｄ１＋、ＮＤＬ１４５＋、及びＣＤ１１ｃ＋）。次いで、マウスＤＣにおけるＧＦＰ発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳで９日目及び１２日目に測定した。
【００９６】
ベクターによる免疫及びインビトロ再誘導及び細胞溶解アッセイ
ＨＨＤマウスにレンチウイルスベクターを１２日間腹腔内、静脈内又は皮下内注射した。次いで感作されたマウスの脾細胞を各エピトープペプチドで独立してＲＰＭＩ完全培地中で７日間再誘導した。最後の２日間に、培養細胞を１０％ＴＣＧＦによって再誘導した。７日目に、培養した細胞の細胞溶解活性は、既に記載されたように（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）、関連ペプチド又は陰性対照ペプチド（ｌｎｆ．ｍ．５８）を付加したＨＨＤトランスフェクトＴＡＰ−ＲＭＡ−Ｓ細胞を標的として使用して、４ｈ ５１Ｃｒ−放出アッセイで試験した（ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細胞／ｍｌ、室温で２時間）。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＴＥＳ−ＧＦＰで形質導入した、又は形質導入していないＨＨＤトランスフェクトＨｅＬａ細胞を並行して標的細胞として使用した。特異的溶解のパーセントを以下の通りに算出した：（実験上の放出−自発放出）（総放出−自発放出）ｘ１００。
【００９７】
実施例ＩＩ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子をコードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫したＨＨＤマウスのＣＴＬ応答の評価
ＤＥＳ遺伝子についてはＷＯ９８／０４７１１で開示している。
【００９８】
実験方法
第１段階では、ＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを使用してＨｅＬａ−ＨＤＤ細胞を形質導入した。これらの細胞を形質導入して、限界希釈によってクローニングした。ＧＦＰを高濃度で発現しているクローンを選択して、古典的な５１ＣｒＣＴＬ試験の標的細胞として使用した。
【００９９】
第２段階では、ＨＤＤマウスにＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター粒子をマウス当たり１．２ｍｉｃｇ／ｐ２４で腹腔内注射した。注射後１２日目に、これらのマウスの脾細胞を、ベクター粒子０．２ｍｉｃｇ、又は１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌ（ｍｌ当たり２１０６細胞）、あるいはＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで形質導入し、ＬＰＳで誘導した同系繊維芽細胞１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌ／２１０６細胞／ｍｌで誘発した。インビトロ誘発後６日目に、細胞の細胞溶解活性をｄｅｓ形質導入ＨｅＬａ−ＨＤＤ標的細胞を使用した５１Ｃｒ試験で試験した。対照の標的細胞はメラノーマポリエピトープによって形質導入した（ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）ＨｅＬａ−ＨＤＤ細胞とした。
【０１００】
結果
これらの実験は、全遺伝子をコードするＨＩＶ由来の３重鎖陽性ベクターが細胞を形質導入したり、同遺伝子を発現する標的細胞に対して特異的なＣＴＬ応答を誘導したりできるかどうかを調べるために実施した。図９に例示したように、特異的な細胞溶解が全ての条件で認められる。形質導入したＬＰＳ−繊維芽細胞では弱いＣＴＬ応答が誘導された。ベクター粒子１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌを使用すると最も良い結果が得られた。これらの結果によって、完全な遺伝子が宿主のゲノムに導入され、その産物が処理されて、提示されて著しいＣＴＬ応答が誘導され得ることが示される。これらの結果によってまた、ｄｅｓ遺伝子は少なくとも１個又は複数のＨＬＡ−Ａ２．１に限定されたＣＴＬエピトープペプチドを含んでいることが示唆される。
【参照文献】
【０１０１】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】メラノーマポリペプチドをコードするＨＩＶ−１由来の３重鎖ＤＮＡ陽性の組換えベクター。
【図２】ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した後のＨＨＤマウスのＣＴＬ応答。
【図３】中心ＤＮＡ３重鎖陽性又は陰性ＨＩＶ由来ベクターによる形質導入後５日目のヒト細胞でのＧＦＰ発現。
【図４】ヒト樹状細胞を使用したインビトロＣＴＬ応答。
【図５】ｐＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カード。メラノーマ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの構築 ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを構築するために、１９９９年４月２０日に１−２１８５号としてＣＮＣＭに寄託されたＣＭＶプロモータの一部、ポリペプチドＭＥＬ及びＩＲＥＳ−ＧＦＰを含むＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＣＭＶプロモータの一部及びＧＦＰを含むＨＲ ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントと置き換えた。
【図６】ｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カードＨＩＶ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列、そのエピトープはＩ９Ｖ．（ＩＬＫＥ）；（ＲＴ４７６−４８４）ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１９９９年１０月６日、＿号としてＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託）の構築 ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間にＩＬＫＥのＰＣＲ産物を挿入することによって構築した。ＩＬＫＥによって始まるＣＴＬエピトープの周りの領域は、プライマ５ ＩＬＫＥ：５′ＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＣ ３′ ３ ＲＩＩＬＫＥ：５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣ ３′を用いてマトリックスｐＬＡＩ上にＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。 このベクターは、ＧＦＰ及びエピトープのクラスタに対応し、特にＨＬＡ．Ａ２．１に限定されたＩ９Ｖエピトープ（ＲＴ４７６〜４８４）を含むＶＩＨのＲＴ遺伝子の領域をコードするバイシストロン性情報を発現する（Ｗａｌｋｅｒ Ｂ．Ｄ．、１９８９ ＰＮＡＳ ８６ ｐ．９５１４〜９５１８）。
【図７】ｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限地図ＴＥＬ／ＡＭＬ配列の転座 ＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＥＬ／ＡＭＬのＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間に挿入することによって構築した。ＴＥＬとＡＭＬとの間の転座周囲の領域は、プライマ５ ＢｇＩ ＴＡ： ５′ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴ ３′ ３ ＲＩＴＡ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣ ３′ を用いてＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【図８Ａ】（ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトランスジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図８Ｂ】（ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトランスジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図９】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子をコードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫したＨＨＤマウスのＣＴＬ応答の評価。
【図１０】１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭに寄託されたｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの制限地図。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インビトロで、及び好ましい実施態様ではインビボで、ベクター中に存在するヌクレオチド配列によってコードされたエピトープに対する免疫反応の発生若しくは増強を誘導し、又はこれらに寄与することが可能な組成物を調製するためのレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの使用に関する。
【０００２】
本発明者等は、本発明に従って調製したベクターによって、細胞性免疫応答、特にエピトープに対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を得ることが可能であることを示した。
【０００３】
さらに、この細胞性免疫応答がベクターに含まれるヌクレオチド配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対して得られた特異的応答であり得ることを示すデータが得られた。
【０００４】
従って、本発明は腫瘍及び癌に対する治療プロトコールに使用でき、特に腫瘍に対する免疫療法又は予防接種療法のプロトコールに使用できる手段を提供する。
【０００５】
本発明は、感染症、特にウイルス感染、例えばレトロウイルス感染に関連した疾患の治療また予防に使用できる手段も開示する。
【０００６】
本発明者らは、さらに、本発明の組成物による治療に関連した細胞性免疫応答、特にＣＴＬ応答は腫瘍若しくはウイルスの抗原、又はウイルス感染細胞の抗原に特異的であることが可能で、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の特定の分子に限定され得ることを示す結果を得た。
【０００７】
特に本発明は、ＭＨＣ複合体のクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２又はＢ７分子に限定した細胞性免疫応答を得るために、免疫原組成物に前記ベクターを使用することに関する。
【０００８】
従って、本発明はシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を包含するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む免疫原組成物に関する。ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列は、逆転写中に３本鎖ＤＮＡ構造（本明細書ではＤＮＡ３重鎖と称する）の形成を誘導する。このＤＮＡ３重鎖は、ベクターＤＮＡゲノムの核移入を刺激し、これらの領域の起源はレトロウイルス又はレトロウイルス様で、前記ベクターは所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）に加えて、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、発現、及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含み、この組成物はベクター内に存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）又はＣＤ４の応答を誘導又は刺激することが可能である。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様では、細胞性免疫応答、特に１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ応答又はＣＤ４応答は記憶ＣＴＬ又はＣＤ４応答である。
【００１０】
ベクター内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在すると、３重鎖ＤＮＡ構造が形成されることが可能で、それによって前記ベクターで組換えられた細胞でのベクターゲノムの核移入が影響を受け、特に増強され得ることが強調される。
【００１１】
本発明による免疫原組成物は記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導、改良し、又は一般にその発生に関与することができるので、（前記免疫原組成物の投与後、前記免疫応答が長期間にわたって誘導されなければならない場合、又は少なくとも応答が必要とされる期間に（前記応答の長期誘導であってもよい）誘導可能でなければならない場合を含む）抗腫瘍治療又は抗ウイルス治療又は抗病原性治療のプロトコールにおいて前記免疫原組成物の使用を企図することが可能である。言い換えると、前記免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ応答又は記憶応答の発生を誘導又は刺激し、又はそれに寄与することによって、腫瘍疾患又は感染性疾患（例えば細菌又はウイルスによる）を治療するための治療用組成物の調製に使用することができる。
【００１２】
本発明の免疫原組成物は、ベクターの配列中に３重鎖構造が存在する結果、ベクター及びベクター粒子内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在するため、標的細胞においてベクターゲノムの核移入を刺激させ得ることが注目される。ベクター内で誘導されるエピトープは細胞自身のものであってもよいし、細胞以外のものであってもよい。
【００１３】
本発明は、標的細胞又は受容細胞の核への核酸配列又はペプチド配列の移入を増加させるために、レトロウイルス由来又は合成によるｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むヌクレオチド配列の使用も含む。
【００１４】
例えば、前記３重鎖配列には受容細胞の外来配列又は自己配列が含まれることが理解されよう。
【００１５】
従って、本発明は、腫瘍治療、特に抗癌治療又は抗感染性疾患治療のための予防接種プロトコールと類似した治療プロトコールにおいて使用可能な組成物を開示する。
【００１６】
本発明では、目的の該導入遺伝子又は配列が、１又は数個の腫瘍細胞の１又は数個のエピトープ、例えば腫瘍に対する細胞性免疫を誘導することが可能な標的抗原に同定されたエピトープをコードする配列である得ることに注目すると興味深い。
【００１７】
ポリペプチドを形成する数個のエピトープは、本発明の導入遺伝子によってコードすることができる。特定の実施態様では、それらは腫瘍で確認された標的抗原から得ることができ、コーディング配列が一緒になって導入遺伝子を形成するとき、細胞性免疫応答がエピトープ全て又はエピトープのほとんどに対して得られるような方法で選択され得る。細胞性免疫応答はインビトロ、又は好ましい実施態様ではインビボでアッセイすることができる。このようなアッセイの実施を可能にするプロトコールは実施例で説明する。
【００１８】
標的抗原はいくつかの種類の腫瘍、特にメラノーマ又は腎癌、膀胱癌、大腸癌、肺癌、乳癌、白血病及びリンパ腫などを含む癌腫で同定されている。
【００１９】
本発明の他の態様では、前記免疫原組成物はウイルス関連感染症、又はミコバクテリア、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む任意の種類の病原体に関連する感染症を含めた感染性疾患において、細胞性免疫応答を得るために使用することができる。
【００２０】
この場合、細胞性免疫応答を引き起こすことが可能な特定の抗原を同定して、そのコーディング配列をベクターに挿入して前記免疫原組成物で使用することができる。例えば、Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｄｅｓ遺伝子が使用できる。
【００２１】
本発明では、前記免疫原組成物で使用されるベクターは、エピトープを発現するか、又は腫瘍細胞若しくはウイルス感染細胞上の標的抗原として同定された（糖タンパク質又はその他のタンパク質由来化合物を含む）タンパク質上に提示することが可能であることも付け加えなければならない。
【００２２】
さらに、エピトープ、エピトープを提供するために使用されたポリペプチド又はタンパク質は、例えば変異、欠失又は挿入によって変更することが可能で、例えば安定性を高めるために変更することが可能であることにも留意すべきである。
【００２３】
本発明は、
１）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含有する組換えヌクレオチド配列と、
２）シス作用性中心開始領域（ＣＴＳ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を包含するポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、又はトランスポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入されたポリヌクレオチドと
を備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、
ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は刺激することができる免疫原組成物に関する。
【００２４】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性配列を包含するＤＮＡ配列は、逆転写後に３本鎖ＤＮＡ構造「ＤＮＡ３重鎖」を採り、ベクターＤＮＡの核移入を刺激することができる。
【００２５】
特定の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は刺激することが可能な前記免疫原組成物は、
ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポリペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポリペプチド）と、
ｄ）転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれ、１又は数個のエピトープをコードする所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含有する配列と、並びにシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含有するポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、上記レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されているポリヌクレオチドとを備えた組換えヌクレオチド配列と
を具備する組換えレトロウイルスベクター粒子を含む。
【００２６】
他の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向挿入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列を具備する組換えレトロウイルス様粒子と
を含む。
【００２７】
好ましい実施態様では、前記の定義の何れか１つに応じた免疫原組成物に存在する組換えレトロウイルスベクター粒子は、記憶細胞性免疫応答、特に記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導、増強するか、又は関連することが可能である。
【００２８】
前記で開示した定義に従って、ベクター又はベクター粒子を含む免疫組成物は、いくつか可能な実施態様によって調製することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、レトロウイルス起源の配列をレンチウイルスゲノムから得る方法で免疫原組成物は調製される。
【００３０】
他の実施態様では、これらの配列の起源はレトロウイルス様であり、レトロトランスポゾンからも得られる。
【００３１】
本発明の他の実施態様では、又は前記で定義した特徴に加えて、組換えベクターに含有される目的の導入遺伝子又は配列は、転写及び発現の調節シグナルを含有する発現カセットに含まれる。
【００３２】
あるいは、ベクターの逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルはレンチウイルス起源であり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えたポリヌクレオチドもレンチウイルス起源である。
【００３３】
他の実施態様では、ベクター内の逆転写、発現、及びウイルス粒子形成の調節シグナル並びにｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドは、ＨＩＶ型、特にＨＩＶ−２又はＨＩＶ−２のレトロウイルスから得られる。
【００３４】
他のウイルス、特にレンチウイルスは、逆転写発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを設計するために、さらにはｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドを得るために使用することができる。従って、特にレンチウイルスＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶを使用することができる。
【００３５】
本発明の免疫原組成物の組換えレトロウイルス粒子を獲得するため、ベクターのトランス相補性に必要なポリペプチド又はタンパク質をコードする配列は、例えばレンチウイルス、特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２レトロウイルスを含むＨＩＶ由来のＧＡＧ、ＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質である。
【００３６】
あるいは、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列は、ＥＮＶ配列とは異なるウイルスに由来してもよい。例えば、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列はＨＩＶレトロウイルス由来であり、ＥＮＶ配列は他のウイルス又はレトロウイルス由来し、且つアンフォトロピック又はエコトロピックＥＮＶ配列の何れであってもよい。
【００３７】
他の実施態様では、ＥＮＶ配列は水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られる。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾンから得られ、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向に挿入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を含む組換えヌクレオチド配列と
を備えた組換えレトロウイルス様粒子を含む。
【００３９】
好ましい実施態様では、組換えレトロウイルス様粒子を含む本発明の免疫原組成物は、前記で開示した特徴によって、記憶細胞性応答、特に記憶ＣＴＬ応答を引き起こすことが可能である。
【００４０】
本発明は、１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ａｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたベクター構築物にも関する。
【００４１】
第１のベクターは、１９９９年１０月１１日にｌ−２３２６号として寄託されたｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであり、第２のベクターはｐＴＲＩＰ−ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと称し、１９９９年１０月１１日にｌ−２３２７号として寄託された。
【００４２】
第３のベクター、ｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、１９９９年１０月１１日にｌ−２３３１号としてＣＮＣＭに寄託された。
【００４３】
前記構築物に存在する抗原をコードする配列は、前記で引用したＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの完全なＤＥＳ遺伝子を含む、他の任意の目的の抗原又はエピトープによって置き換えることができる。
【００４４】
本発明の他の態様では、ベクター、ベクター粒子及び同物を含む免疫原組成物は、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心に位置するように設計される。
【００４５】
「中心に位置する」とは、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心、又はこの配列のほぼ中心にあることを意味する。特に、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域は逆転写された直鎖状ベクターＤＮＡの中央の３分の１以内にあることが可能である。
【００４６】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列が存在する結果としてウイルス逆転写中に形成された３重鎖配列が中央に位置することによって、そのベクター又はベクター粒子と接触する細胞の形質導入量を増大させることが可能である。
【００４７】
あるいは、前記ベクターの変種によっては、導入遺伝子を含むベクターの転写単位はＬＴＲ領域のＵ３領域内に挿入することができる。従って、逆転写の後、導入遺伝子は複製され、従って３重鎖配列のそれぞれの鎖に現れ、従って導入遺伝子の大きさにかかわらず、３重鎖配列がベクターの中心部分に位置することが可能となる。
【００４８】
本発明は、本発明による免疫原組成物と接触するように置かれた細胞に関し、特に免疫原組成物のベクター又はベクター粒子によって形質導入された組換え細胞にも関する。
【００４９】
これらの細胞は、有利には、抗原提示細胞である。例えば、これらの細胞は、肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択することができる。
【００５０】
従って、本発明の免疫原組成物は、一次細胞性免疫応答、特に、有利には記憶ＣＴＬ応答であるＣＴＬ応答を発生させ、腫瘍、特に癌の治療方法又は治療処置のための治療組成物の調製に使用することができる。あるいは、その他公知の抗癌治療の補助処置として使用することができる。
【００５１】
例えば、本発明の免疫原組成物は、化学療法又は免疫化学療法又は抗癌治療のその他のアプローチと関連させて使用することができる。
【００５２】
「抗癌治療」という表現は、本発明では、腫瘍の増殖又は腫瘍が増殖する可能性を阻害すること、若しくは転移巣形成の制御を含めた悪性細胞の拡散を阻害することを意味するか、又はその両者を意味するものである。
【００５３】
従って、本発明では、「抗癌治療」という表現は、特にこの免疫原組成物が記憶細胞性応答を誘導又は増強し、一般的には関与することが可能であるという事実を考慮すると、疾患の治癒を期待して、悪性細胞の増殖及び腫瘍の拡散を制御するために使用する方法に関している。
【００５４】
本発明の組成物で治療し得る腫瘍は、例えば、メラノーマ又は（肺、膀胱、腎臓、大腸）含めた癌腫及びリンパ滲出である。
【００５５】
治療可能な腫瘍も、変異した自己タンパク質及び／又は過剰発現した自己タンパク質を含む腫瘍特異的抗原を発現している全ての腫瘍である。
【００５６】
エキソビボ段階を含む投与方法、例えば、標的細胞にエキソビボ導入した後、標的細胞を治療する患者に投与することを含めて、受容可能な本発明の免疫原組成物の投与方法はいずれも興味深い。
【００５７】
あるいは、本発明の免疫原組成物は、全身（ＩＶ）、局所、又は皮膚、皮下、例えば筋肉内投与経路を含めた通常の投与経路によって患者に直接投与し得る。
【００５８】
特定の実施態様では、本発明の免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ性免疫応答の発生をインビボで誘導、増強、又は関与する方法で患者に直接投与し得る。
【００５９】
他の実施態様では、前記免疫原組成物は、長期間記憶細胞性応答を発生させるために使用される。
【００６０】
本発明の前記免疫原組成物は、ベクター又はベクター粒子に存在するｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列の特性によって、標的細胞内でベクターゲノムの核移入を誘導又は促進するので特に興味深いことが強調される。
【００６１】
本発明の免疫原組成物が特に優位なのは、これらがベクター又はベクター粒子に存在する関心のあるヌクレオチド配列又は導入遺伝子によってコードされた複数のエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するために使用できること、及び完全な遺伝子配列、例えば病原性物質の遺伝子の産物又は少なくとも８から１５アミノ酸、好ましくは９から１２アミノ酸をコードし得る前記遺伝子の断片の産物に対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するためにも使用できることである。本発明はまた、細胞性応答を誘導する前記アミノ酸配列の複数反復（少なくとも２回の同一配列）及び／又は異なる病原性抗原又は腫瘍抗原の２個のエピトープに対応する少なくとも２種の異なる配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本発明のその他の特性又は利点を、以下の実施例及び図面で開示する。
【００６３】
実施例
レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を含む細胞を形質導入する能力を有しており、遺伝子治療にとってますます重要となっている。最近、ポリプリン広域シス作用性配列（中心ＤＮＡ３重鎖）を含むレンチウイルスベクターが中心ＤＮＡ３重鎖を欠失したものよりもヒト及びマウスをより効果的に形質導入することが示された（Ｃｈａｒｎｅａｕ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４、２４１、６５１〜６６２）。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、又は含まず、同様のＨＬＡ−Ａ２．１限定メラノーマＣＴＬポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターのＴＬ応答を誘導する能力を本明細書で試験した。ＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ２．１純系）マウスにおいて、中心ＤＮＡを含むレンチウイルスベクターを直接インビボ投与すると、ポリエピトープ配列によってコードされたエピトープペプチド全てに対する強いＣＴＬ応答が誘導された。レンチウイルスベクターはＤＮＡ３重鎖を含むと明らかに有利であることが示された。さらに、ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスが３重鎖を含まないベクターよりもヒト樹状細胞を７倍も効果的に形質導入することが示された。これらのエキソビボ導入した樹状細胞は、メラノーマエピトープペプチドのほとんどに対して効果的かつ特異的な１次ＣＴＬ応答を引き起こす。変更したレンチウイルスの安全性の問題がほぼ解決されたので、このベクターをインビボにおけるヒトの遺伝子治療だけでなく、癌患者の免疫療法にも使用することを提案する。
【００６４】
緒言
レトロウイルスの亜種レンチウイルスは、非分裂細胞を含めたほとんどの細胞種に感染することができる。この特性があるため、レンチウイルスは遺伝子治療にとって魅力的な存在である。いくつかの複製欠失組換えレンチウイルスベクターは、既に様々なグループによって構築されている（Ｎａｌｄｉｎｉ ＰＮＡＳ ９３、１１３８２〜８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６）。再操作し、無毒化したこれらのレンチウイルスベクターは最も効果的かつ安全な遺伝子治療用ベクターとして提案されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ、＆ Ｋｉｍ Ｖ．Ｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２、９８７３〜８０、１９９８）。本発明者等は、水疱性口炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶＧ）偽型レンチウイルス（ＨＩＶ）をベースとしたベクターを開発した（Ｂｕｒｎｓ Ｊ．Ｃ．、１９９３ ＰＮＡＳ ９０、８０３３〜７）。このベクターは非必須なウイルスタンパク質をほとんど欠失しているが、ポリプリン領域シス作用性配列（ｃＰＰＴ、中心ＤＮＡ３重鎖）を含む。この中心ＤＮＡ３重鎖は、逆転写されたＨＩＶ−ＤＮＡ分子の核移入をかなり促進する。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスは、この３重鎖を含まないベクターよりも効果的にマウス及びヒト細胞を形質導入させることが認められた。
【００６５】
ＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ２．１純系）トランスジェニックマウス（Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：２０４３〜２０５１）を用いると、実験的に制御したエピトープペプチドの免疫原性の評価及び様々な免疫戦略の評価が可能である。これらのＨＨＤマウスを使用して、異なる組換えベクターによってコードされたメラノーマポリペプチドが単一の動物個体内で同時にＣＴＬ応答を誘導する能力が報告された。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、又は含まず、同様のメラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターが、ＨＨＤトランスジェニックマウスにおいてインビボＣＴＬを誘導する能力について最初に調べた。さらに同様の組換えレンチウイルスによって形質導入されたヒト樹状細胞（ｈＤＣ）がエキソビボでメラノーマポリエピトープモチーフに対して１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかについても調べた。本発明の結果によって、組換えベクターを直接投与するか、又はエキソビボで形質導入した樹状細胞を使用すると、ＤＮＡ３重鎖によってレンチウイルスベクターがインビボで特異的なＣＴＬ応答を誘導する能力が著しく増強されることが示された。
【００６６】
結果
実施例１：メラノーマポリエピトープの免疫
メラノーマから得られたポリエピトープモチーフをコードする組換えＤＮＡをＨＨＤマウスに注射することによって、いくつかのメラノーマエピトープに対して同時にＣＴＬ応答を惹起することができることを証明した後、同様のメラノーマポリペプチドモチーフ（図１及び表１）をコードするレンチウイルスの免疫原能を試験した。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（ＣＮＣＭ １−２１８５として１９９９年４月２０日に寄託）をマウス当たり１．２５μｇ／ｐ２４で静脈内、腹腔内、又は皮下内に投与した。１群当たり少なくとも３匹のマウスを使用した。
【００６７】
１０個のメラノーマエピトープのほとんどに対して特異的な複数のＣＴＬ応答が同時に誘導された。投与経路に関わらず、負荷したペプチド（表２）及びＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで形質導入したＨＨＤトランスフェクトＨｅＬａ細胞（データは示していない）の両者に対して同様のＣＴＬ応答が認められた。しかし、腹腔内注射によって、わずかに良好なＣＴＬ応答が誘導された。強い応答がＮＡ１７−Ａ．ｎｔ３８及びｇｐ１００．１５４エピトープペプチドに対して引き起こされた。ｇｐ１００．４５７、ＭＡＲＴ．１．２７、Ｍａｇｅ−３、及びチロシナーゼ３６８−Ｄに対してまた、著しい応答が認められた。ｇｐ．１００．２０９、ｇｐ．１００．２８０、ＭＡＲＴ−１．３２、及びチロシナーゼ１に対するＣＴＬ応答は弱かった。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した後に弱いＣＴＬ応答が引き起こされたエピトープは全て、その他のレンチウイルスベクター以外を投与したときのＣＴＬ非誘導群に分類された。
【００６８】
インビボで検出可能なＣＴＬを誘導するために必要なレンチウイルスベクターの最小用量
著しいＣＴＬ応答を引き起こすレンチウイルスベクターの最小用量は、６種の異なる用量のＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを腹腔内投与して（１用量あたり４匹のＨＨＤマウス）決定した。５１Ｃｒ試験の直前に２匹のマウスのエフェクター細胞を混合して同一のＥ／Ｔ比を得る実験を２回実施した。ほとんどの実験において、メラノーマエピトープペプチド全てに対するＣＴＬ応答を試験した。結果は非常に類似しており、極めて同質であったので、「線量−効果」関係を明確かつ簡潔に比較するためにＮＡ１７／Ａエピトープペプチドに対するＣＴＬ応答のみを考慮した。マウス当たり５００ｎｇと２５００ｎｇ／ｐ２４との間の用量を使用して、最良のＣＴＬ応答が得られた。いくつかのメラノーマエピトープに対して検出可能なＣＴＬ応答が得られたが、レンチウイルスの用量が高くても用量の低い場合よりも良好なＣＴＬ応答が誘導されるわけではなかった。いくつかのメラノーマペプチドに対するいくつかの特異的なＣＴＬ応答が実証されたとしても、マウス当たり５００ｎｇ／ｐ２４未満の用量では、効果的なＣＴＬ応答を誘導するには不十分であった。マウス当たり１２５０ｎｇ／ｐ２４の用量で、何匹かのマウスにおいてポリエピトープモチーフに含まれる１０個のエピトープ全てに対してＣＴＬ応答が生じたことは注目に値する（図３）。
【００６９】
長期の記憶ＣＴＬ誘導
マウス８匹にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを注射した。免疫後、このマウスを１２日目又は５ヶ月目に殺処分した。５日間はメラノーマエピトープペプチドで、さらに２日間は１０％ＴＣＧＦでインビトロ誘発した後、マウス４匹のエフェクター細胞を混合してペプチドを負荷したＨＨＤトランスフェクトＲＭＡＳ細胞に対して試験した。１２日前に免疫したマウスでは、ｇｐ１００．２９及びＭａｒｔ１．３２以外のメラノーマエピトープペプチド全てについてＣＴＬ応答が証明された。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注射して５ヶ月経つと、１次ＣＴＬ誘導エピトープ全てがまだ強いＣＴＬ応答を誘導した（図２）。マウス免疫後、１２日目又は５ヶ月目のＣＴＬ応答のレベルは、驚くほど同等であった。レンチウイルスベクターによってインビボ導入された細胞は、免疫系によって破壊されずにコードされたメラノーマポリエピトープを産生し続けることが示唆された。
【００７０】
インビボ免疫における中心ＤＮＡ３重鎖の役割
ＨＨＤマウスそれぞれに、同時にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＨＲ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターをマウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ、５０ｎｇ、１２ｎｇ、及び３ｎｇ／ｐ２４の用量で腹腔内投与して免疫した。別個の２回の実験において、各用量について少なくとも４匹のマウスを試験した。合成ペプチドでインビトロ誘発した後、ペプチドを加えたＲＭＡＳ−ＨＨＤ標的細胞を使用して脾細胞の細胞溶解能を試験した。結果は極めて似通っていたので、明確かつ簡潔にするためにＮＡ１７／Ａ、Ｍａｒｔ−１．２７、ｇｐ１００．１５４、及びチロシナーゼ．３６８−Ｄエピトープペプチドに対するＣＴＬ応答のみを試験した。
【００７１】
結果を表３に示す。一般に、マウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ、５０ｎｇ／ｐ２４の用量のＴＲＩＰ−ＬＶベクターで免疫したマウスはＨＲ−ＬＶベクターで免疫したマウスよりも強いＣＴＬ応答を引き起こした。使用したベクターにかかわらず、マウス当たりの１２ｎｇ／ｐ２４未満の用量では検出可能なＣＴＬ応答は認められなかった（データは示さず）。これによって、中心ＤＮＡ複合体を含むレンチウイルスベクターの形質導入能はこの複合体を欠失したものよりも増強されていることが確認された。
【００７２】
レンチウイルスベクターによる樹状細胞の形質導入
ＭＴ４及びＨｅＬａ細胞などの腫瘍細胞が中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスによって中心ＤＮＡ３重鎖を持たないベクターよりも３０倍まで効果的に形質導入されることが最初に観察された。次に、様々な濃度でこれら２種のレンチウイルスベクターの形質導入能を健常提供者又はＨＨＤマウスのＤＣについて試験した。ＧＦＰを発現するＤＣのパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによって測定し、２種のレンチウイルスベクターによるＤＣの形質導入濃度と見なした。
【００７３】
ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターは、どのベクター濃度でもＨＲ−ＧＦＰよりも効果的に細胞を形質導入した。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたマウス及びヒトＤＣのＧＦＰ発現は、それぞれＨＲ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたＧＦＰの発現の３倍及び７倍に達した（図４）。
【００７４】
ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたヒト樹状細胞を使用した１次ＣＴＬ誘発
健常なＨＬＡ−Ａ２．１提供者から得られた単核細胞（ＭＮＣ）を、同提供者から得られたＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによって形質導入したＤＣを使用して週に１回インビトロで誘発した。樹状細胞におけるＧＦＰ発現の存在をＦＡＣＳによって分析し、形質導入の効果を確かめた。３週間後、ＭＮＣ細胞障害性は、ＦＣＳを含まない培養条件で標的としてペプチドを付加したＴ２細胞を使用した５１Ｃｒアッセイによって試験した。
【００７５】
ＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで形質導入したｈＤＣは、Ｍａｒｔ１．３１以外のメラノーマエピトープペプチド全てに対して著しいＣＴＬ応答を誘発したが、形質導入しなかったｈＤＣでは通常のバックグランドの応答しか誘発しなかった（図５）。
【００７６】
考察
複製欠失レンチウイルス由来のベクターが様々な非分裂細胞を形質導入できることは、近年報告で示されている（Ｍａｌｄｉｎｉ、１９９６、Ｋａｆｒｉ、１９９７）。レンチウイルスは非分裂細胞の完全な核膜を通過して移入することができる（Ｃａｓｅ、１９９９）。本明細書では、この方法と中心ＤＮＡ３重鎖と称したポリプリン領域シス作用性配列を組み合わせると、大いに可能性が広がることを実証した。この配列をレンチウイルス由来ベクターに導入すると、ニューロン、肝細胞、及び造血幹細胞／始原細胞を含めた数種の細胞の安定したインビボ及びエキソビボ形質導入を３０倍高めることが可能であった。
【００７７】
最近、レンチウイルス由来のベクターの安全性及び遺伝子治療での使用に関する取り組みで、進歩が認められた（Ｎａｒｒｙ Ｋｉｍ Ｖ ｅｔ ａｌ １９８８、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ、１９９９）。しかし、古典的なマウスのレトロウイルスベクター及びレトロウイルスではないベクターの使用が成功した免疫治療で（Ｃｏｎｄｏｎ、１９９６、Ｓｏｎｇ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、１９９７）、レンチウイルスベクターを適用することについては研究されなかった。有望なワクチン戦略を開発するために、中心ＤＮＡ３重鎖を含み、メラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベクターの免疫原能を試験した。最初に、このベクターを直接注射して、メラノーマエピトープに対してインビボで特異的なＣＴＬ応答が引き起こされ得るかどうかについて調べた。今までに、ＨＨＤ ＨＬＡ−Ａ２．１（純系）トランスジェニックマウスにおいていくつかの免疫戦略の比較が行われた。組換えｐＣＭＶ−Ｂ１０（ＨＢｓ）ＤＮＡ又は同様のメラノーマポリエピトープをコードする組換えワクチンを使用すると、１個体マウスにおいて、メラノーマポリエピトープに含まれる４から６個の異なるペプチドに対するＣＴＬ応答が同時に誘導されることが可能であった。同様のメラノーマポリエピトープをコードするＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターでは、特異的細胞溶解についてだけでなく、ＣＴＬ応答を誘発するポリペプチドの数についても、同様のポリエピトープモチーフをコードするその他のベクターよりも顕著に優れた結果が得られた。特に、ベクターを腹腔内及び皮下注射すると、ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによってコードされたエピトープ全てに対してＣＴＬ応答が誘導されるマウスがいた。
【００７８】
形質導入又はペプチド付加された樹状細胞は、様々なガン細胞に対して有望な免疫方法として使用できることがいくつかのグループによって報告された（Ｍａｙａｒｄｏｍｏ、ＪＩ、１９９５、Ｓｏｎｇ Ｗ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、ＪＭ、１９９７）。従って、本発明の目的のために、マウス及びヒトの樹状細胞が効果的に形質導入され、インビトロで１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかを調べた。本発明の結果によって、これらの細胞が容易に形質導入され得ることが示唆された。さらに、これらの形質導入細胞は組換えレンチウイルスによってコードされたエピトープ全てを提示した。興味深いことに、ヒト樹状細胞は最も容易に形質導入された。細胞をインビトロ形質導入することによって、レンチウイルスベクターが様々な宿主細胞にゲノムを有害な方法で組み込むことを回避できる。この理由によって、インビトロ形質導入された細胞は、最初の臨床応用で適切かつ安全な送達方法となるだろう。
【００７９】
Ｗａｒｎｅｒ等は、マウスのレトロウイルスベクターによって形質導入したＨＩＶ−タンパク質を発現する繊維芽細胞を使用して、レトロウイルスベクターがいくつかの動物モデルだけでなく、ＨＩＶ患者のＣＴＬ応答を誘導する能力を初めて示した（１９９８年にＷａｒｎｅｒによって概説されている）。マウスに直接注射すると、プロウイルスのＤＮＡが効果的に抗原を提示する樹状細胞で検出された（Ｓｏｎｇ、１９９７）。しかし、レンチウイルスとは対照的に、マウスのレトロウイルスベクターはＤＣなどの非分裂細胞を形質導入することができず、コードされた遺伝子のインビボ発現は「遮断される」ことが多い。結果的に、これらのレトロウイルスベクターはヒトの免疫治療にとって有力な候補とはならない（Ｋａｆｒｉ）。
【００８０】
我々の結果によって、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスベクターは、ＨＨＤマウスにおいて中心ＤＮＡ３重鎖を含まないベクターよりも強くインビボでＣＴＬ応答を誘導することが示唆される。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスベクターはインビトロで容易にｈＤＣを形質導入することができ、ひいては臨床的免疫治療に使用することができよう。
【００８１】
材料及び方法
レンチウイルスベクター構造
ベクタープラスミド：ＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺ由来のｐＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ ９３、１１３８２〜８、１９９６）。ＬａｃＺリポーター遺伝子は、ＥＧＦＰ遺伝子で置き換えた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ＴＲＩＰ−ＥＧＦＰでは、ＥＧＦＰ遺伝子をｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１ＬＡＩの中心断片のＣｌａｌ部位に挿入した。
【００８２】
ＥＧＦＰ遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドからＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲによって増幅し、５′及び３′それぞれにＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を付加した。ＰＣＲプライマは以下の通りであった。
【００８３】
Ｂａｍ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ３′
Ｘｈｏ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ３′
ＨＲ ＧＦＰベクターは、このＰＣＲ断片をｐＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングし直して、ＬａｃＺ ＯＲＦをＥＧＦＰに置き換えることによって構築した。
【００８４】
ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含むｐＬＡＩ３の１７８ｂｐ断片（４７９３から４９７１）をＰＣＲによって増幅した。この断片をＨＲ ＧＦＰの特有のＣｌａＩ部位に挿入するために、ＮａｒＩ制限部位をプライマの５′に付加した。
【００８５】
Ｎａｒ ＴＲＩＰ＋： ５′ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＧＡＡＴＴＣ ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＣ ３′
Ｎａｒ ＴＲＩＰ−： ５′ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ Ｃ ３′
正方向でこの３重鎖配列を挿入すると、ＴＲＩＰ ＧＦＰプラスミドベクターが生じ、逆向きだとＴＲＩＰｉｎｖ ＧＦＰが生じた。あるいは、同様の３重鎖断片をｐｃＰＰＴ−ＡＧ、ｐｃＰＰＴ−Ｄ、ｐｃＰＰＴ−２２５及びｐＣＴＳプラスミドから増幅して、対応するウイルスのようにｃＰＰＴ又はＣＴＳに同様の変異を含むベクターを作製した。
【００８６】
まず、ＴＲＩＰ ＧＦＰベクター又はＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（ＣＮＣＭに１９９８年４月１５日Ｉ−２００５号として寄託）に存在するＥｃｏＲＩ部位を充填して、ＴＲＩＰ ＧＦＰΔＥベクターを作製した。次に、ＴＲＩＰ ＧＦＰ ΔＥベクターの０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＥＧＦＰの代わりに、ピコナウイルスの内部リボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含む１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片をＥＧＦＰの上流にクローニングして、ＴＲＩＰ ΔＥ ＩＲＥＳ ＧＦＰベクターを作製した。ＣＭＶプロモータとＩＲＥＳ ＧＦＰ配列の間に存在する部位は、ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＸＩ−ＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩである。ＣＴＬポリエピトープメラノーマ（ｍｅｌ）断片をＰＣＲによってｐＢＳ ｍｅｌ ｐｏｌｙ上に作製し、プライマ５ＢｇｌＭｌｕ Ｍｅｌ：
５′ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴ ３′
３ＲＩＭｅｌ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧＡＴＧ３′
の内部にｋｏｚａｃコンセンサス配列を挿入した。
【００８７】
ｍｅｌ ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、ＴＲＩＰ ΔＥ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰとも称するＴＲＩＰ ΔＥ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰを作製した。
【００８８】
ＨＲ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰは、メラノーマポリエピトープ及びＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＩＲＥＳ ＧＦＰを含むＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＨＲ ＧＦＰのものと交換して作製した。ＮｄｅＩ部位はＣＭＶプロモータの末端に位置している。
【００８９】
ウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターは、既に記載されたように（Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｉ．Ｍ．ＰＮＡＳ １９９６ 及びｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）、リン酸−カルシウム法を用いて、２９３Ｔ細胞を３種のプラスミドによって一過性にトランスフェクトすることによって作製した。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞にＶＳＶエンベローププラスミド（ｐＭＤＧ）２０μｇ及び様々なパッケージング（８．２又は８．９１）プラスミド及びレンチウイルスベクタープラスミド４０μｇをトランスフェクトした。トランスフェクトして６０ｈ後及び８４ｈ後に、調整培地を収集した。次いで、ウイルスを濃縮して、ｄＮＴＰを既に記載されたように処理した（Ｎａｌｄｉｎｉ ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。ＨｅＬａ Ｐ４．２細胞及びＭＴ３細胞に対するウイルス力価は、系列希釈及びｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。
【００９０】
ＤＥＡＥ−デキストラン２０μＭ存在下で、９６ウェルプレートに接種したＰ４細胞に等量の粒子（ウェル当たりｐ２４ウイルス抗原１ｎｇ）を感染させることによって、ウイルスの１サイクル力価測定を実施した。実験全体を通して、プロテアーゼ阻害剤サキナビル（Ｒｏｃｈｅ）を１μＭで添加して、感染１回に限定した分析を行った。細胞の有糸分裂は、感染前日にアフィコリン（ａｐｈｉｃｏｌｉｎ）（８μＭ）処理して阻害した。β−ガラクトシダーゼ活性は、化学ルミネセンスβ−Ｇａｌリポーター遺伝子アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、感染４８時間後に測定した。
【００９１】
ＨｅＬａ細胞を等量のベクター粒子（ウェル当たりｐ２４ ５ｎｇ）で３回感染させた。形質導入後４８時間して、培地をＴＮＢ（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ５０ｍＭ）２００μｌに置換して、生細胞の蛍光をマイクロプレート蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ）及びＥＧＦＰ対応フィルター（励起：４８５ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を使用して定量した。
【００９２】
マウス
ＨＨＤマウスについては既に説明されている（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）。このマウスは、ヒトｂ２ｍのＣ末端がペプチドのアーム（ＧＧＧＧＳ）ｘ３によってキメラ重鎖（ＨＬＡ−Ａ２．１、ａ１−ａ２、Ｈ−２Ｄｂ ａ３−膜間ドメイン、及び細胞質内ドメイン）のＮ末端に共有結合したトランスジェニック１本鎖組織適合クラスＩ分子を発現する。これらのマウスのＨ−２Ｄｂ及びマウスｂ２ｍ遺伝子はさらに相同的組換えによって分断され、マウス組織適合クラス１分子の細胞表面での発現が完全に欠如しており、血清学的に検出されなくなっている。
【００９３】
ｈＤＣ及び１次ＣＴＬ誘導の発生
ヒト樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１ハプロタイプの健常提供者のサイタフェレシス生成物（ＩＤＭ、パリ、フランス）から得られた。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲに対するｍＡｂを使用したこれらのＤＣのＦＡＣＳ分析によって、未熟ＤＣ表現型が示された。レンチウイルスベクターを１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、及び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度で含むＡＭＶ−５培地中で、このｈＤＣを１０日間形質導入した。２種のレンチウイルスベクターで形質導入したｈＤＣにおけるＧＦＰ発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによって測定した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ、ＵＳＡ）。
【００９４】
同一提供者の単核細胞（ＭＮＣ）をｈＤＣ又は形質導入したｈＤＣで１ｈＤＣに対して４ＭＮＣの比でインビトロ誘発した。このＭＮＣを同一の低温保存した形質導入ｈＤＣを使用して２回再誘発して、次いで関連ペプチド又は陰性対照（ｌｎｆ．ｍ．５８）ペプチドを付加したＴ２細胞を標的として使用した４ｈ５１Ｃｒ−放出アッセイで細胞溶解活性を試験した（１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細胞／ｍｌ、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地、室温で２時間）。
【００９５】
マウス樹状細胞の生成
骨髄由来樹状細胞を既に記載されたように生成した［４３、５１］。骨髄の単核細胞を１０％ＦＣＳ、Ｌグルタミン ２ｍＭ、ペニシリン ５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌ、メルカプトエタノール ５．１０５Ｍを補足したＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ培地）に、さらに組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ及び組換えマウスＩＬ４ １００ｎｇ／ｍｌ（いずれもＧＥＮＺＹＭＥ（ケンブリッジ、ＭＡ）製）を補足して培養した。２日目及び６日目に、付着しなかった細胞を注意深く除去して、マウスＧＮ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌ及びマウスＩＬ４ ５０ｎｇを補足した新鮮な完全ＲＰＭＩ培地を添加した。７日目に、培養培地を１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、及び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度のレンチウイルスベクターを補足したＲＰＭＩ完全培地１ｍｌで置換した。９日目に集めた樹状細胞を適切なｍＡｂで評価したところ、純度は９５％を上回っていた（ＩＡｂ＋、ＨＨＤ＋、ＣＤ−３、３３Ｄ１＋、ＮＤＬ１４５＋、及びＣＤ１１ｃ＋）。次いで、マウスＤＣにおけるＧＦＰ発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳで９日目及び１２日目に測定した。
【００９６】
ベクターによる免疫及びインビトロ再誘導及び細胞溶解アッセイ
ＨＨＤマウスにレンチウイルスベクターを１２日間腹腔内、静脈内又は皮下内注射した。次いで感作されたマウスの脾細胞を各エピトープペプチドで独立してＲＰＭＩ完全培地中で７日間再誘導した。最後の２日間に、培養細胞を１０％ＴＣＧＦによって再誘導した。７日目に、培養した細胞の細胞溶解活性は、既に記載されたように（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）、関連ペプチド又は陰性対照ペプチド（ｌｎｆ．ｍ．５８）を付加したＨＨＤトランスフェクトＴＡＰ−ＲＭＡ−Ｓ細胞を標的として使用して、４ｈ ５１Ｃｒ−放出アッセイで試験した（ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細胞／ｍｌ、室温で２時間）。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＴＥＳ−ＧＦＰで形質導入した、又は形質導入していないＨＨＤトランスフェクトＨｅＬａ細胞を並行して標的細胞として使用した。特異的溶解のパーセントを以下の通りに算出した：（実験上の放出−自発放出）（総放出−自発放出）ｘ１００。
【００９７】
実施例ＩＩ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子をコードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫したＨＨＤマウスのＣＴＬ応答の評価
ＤＥＳ遺伝子についてはＷＯ９８／０４７１１で開示している。
【００９８】
実験方法
第１段階では、ＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを使用してＨｅＬａ−ＨＤＤ細胞を形質導入した。これらの細胞を形質導入して、限界希釈によってクローニングした。ＧＦＰを高濃度で発現しているクローンを選択して、古典的な５１ＣｒＣＴＬ試験の標的細胞として使用した。
【００９９】
第２段階では、ＨＤＤマウスにＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター粒子をマウス当たり１．２ｍｉｃｇ／ｐ２４で腹腔内注射した。注射後１２日目に、これらのマウスの脾細胞を、ベクター粒子０．２ｍｉｃｇ、又は１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌ（ｍｌ当たり２１０６細胞）、あるいはＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで形質導入し、ＬＰＳで誘導した同系繊維芽細胞１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌ／２１０６細胞／ｍｌで誘発した。インビトロ誘発後６日目に、細胞の細胞溶解活性をｄｅｓ形質導入ＨｅＬａ−ＨＤＤ標的細胞を使用した５１Ｃｒ試験で試験した。対照の標的細胞はメラノーマポリエピトープによって形質導入した（ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）ＨｅＬａ−ＨＤＤ細胞とした。
【０１００】
結果
これらの実験は、全遺伝子をコードするＨＩＶ由来の３重鎖陽性ベクターが細胞を形質導入したり、同遺伝子を発現する標的細胞に対して特異的なＣＴＬ応答を誘導したりできるかどうかを調べるために実施した。図９に例示したように、特異的な細胞溶解が全ての条件で認められる。形質導入したＬＰＳ−繊維芽細胞では弱いＣＴＬ応答が誘導された。ベクター粒子１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌを使用すると最も良い結果が得られた。これらの結果によって、完全な遺伝子が宿主のゲノムに導入され、その産物が処理されて、提示されて著しいＣＴＬ応答が誘導され得ることが示される。これらの結果によってまた、ｄｅｓ遺伝子は少なくとも１個又は複数のＨＬＡ−Ａ２．１に限定されたＣＴＬエピトープペプチドを含んでいることが示唆される。
【参照文献】
【０１０１】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】メラノーマポリペプチドをコードするＨＩＶ−１由来の３重鎖ＤＮＡ陽性の組換えベクター。
【図２】ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した後のＨＨＤマウスのＣＴＬ応答。
【図３】中心ＤＮＡ３重鎖陽性又は陰性ＨＩＶ由来ベクターによる形質導入後５日目のヒト細胞でのＧＦＰ発現。
【図４】ヒト樹状細胞を使用したインビトロＣＴＬ応答。
【図５】ｐＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カード。メラノーマ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの構築 ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを構築するために、１９９９年４月２０日に１−２１８５号としてＣＮＣＭに寄託されたＣＭＶプロモータの一部、ポリペプチドＭＥＬ及びＩＲＥＳ−ＧＦＰを含むＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＣＭＶプロモータの一部及びＧＦＰを含むＨＲ ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントと置き換えた。
【図６】ｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カードＨＩＶ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列、そのエピトープはＩ９Ｖ．（ＩＬＫＥ）；（ＲＴ４７６−４８４）ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１９９９年１０月６日、＿号としてＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託）の構築 ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間にＩＬＫＥのＰＣＲ産物を挿入することによって構築した。ＩＬＫＥによって始まるＣＴＬエピトープの周りの領域は、プライマ５ ＩＬＫＥ：５′ＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＣ ３′ ３ ＲＩＩＬＫＥ：５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣ ３′を用いてマトリックスｐＬＡＩ上にＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。 このベクターは、ＧＦＰ及びエピトープのクラスタに対応し、特にＨＬＡ．Ａ２．１に限定されたＩ９Ｖエピトープ（ＲＴ４７６〜４８４）を含むＶＩＨのＲＴ遺伝子の領域をコードするバイシストロン性情報を発現する（Ｗａｌｋｅｒ Ｂ．Ｄ．、１９８９ ＰＮＡＳ ８６ ｐ．９５１４〜９５１８）。
【図７】ｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限地図ＴＥＬ／ＡＭＬ配列の転座 ＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＥＬ／ＡＭＬのＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間に挿入することによって構築した。ＴＥＬとＡＭＬとの間の転座周囲の領域は、プライマ５ ＢｇＩ ＴＡ： ５′ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴ ３′ ３ ＲＩＴＡ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣ ３′ を用いてＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【図８Ａ】（ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトランスジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図８Ｂ】（ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトランスジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図９】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子をコードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫したＨＨＤマウスのＣＴＬ応答の評価。
【図１０】１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭに寄託されたｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの制限地図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えベクターを含む免疫原組成物であって、
前記ベクターがシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）とシス作用性終止領域（ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含み、該領域はレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、前記ベクターはさらに所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）とレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の制御シグナルとを含み、前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は刺激することができることを特徴とする免疫原組成物。
【請求項２】
発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答である請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項３】
レトロウイルス起源の前記配列がレンチウイルスのゲノムから得られたことを特徴とする請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項４】
前記目的の導入遺伝子又は配列が転写及び発現の調節シグナルを含む発現カセットに含有されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項５】
１）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含有する組換えヌクレオチド配列と、２）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、トランスポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入されているポリヌクレオチドとを備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、
前記免疫原組成物が細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は刺激することができる免疫組成物。
【請求項６】
ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポリペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポリペプチド）と、
ｄ）１又は数個のエピトープをコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御下におかれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含有する配列と、シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列であって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の上記調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入された組換えヌクレオチド配列と
を備えた組換えレトロウイルスベクター粒子を含む免疫原組成物であって、
前記組成物が、前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することができる免疫原組成物。
【請求項７】
前記組換えレトロウイルス様粒子が、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来であり、レトロトランスポゾン調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されているポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列と
を含む免疫原組成物であって、
前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することができ、前記組成物は前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対して細胞性応答ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することができる免疫原組成物。
【請求項８】
発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答又はＣＤ４応答である請求項５〜７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項９】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの起源がレンチウイルスであり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドの起源がレンチウイルスであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１０】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ型レトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２由来であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１１】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドが、レンチウイルスＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶから選択されたウイルス由来であることを特徴とする請求項１０に記載の免疫原組成物。
【請求項１２】
前記ベクターの前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ−１レトロウイルスゲノムのシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及び終止領域（ＣＴＳ）を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１３】
前記ベクター粒子のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列がＨＩＶレトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の配列由来であることを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１４】
ｇａｇ及びｐｏｌ配列がＨＩＶレトロウイルスの配列由来であり、ｅｎｖ配列が異なるＨＩＶレトロウイルス又はウイルス由来であることを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１５】
前記ｅｎｖ配列がアンフォトロピックＥＮＶポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１６】
前記ｅｎｖ配列がエコトロピックＥＮＶポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１７】
前記ｅｎｖ配列が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られたことを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１８】
ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３２６号として寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、又はＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３１号として寄託されたＰｔｒｉｐ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３７号として寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物と接触した組換え細胞。
【請求項２１】
抗原提示細胞又は肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択された細胞である請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
腫瘍又は感染性疾患を治療的に処置するための請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物又は組換え細胞。
【請求項２３】
前記ベクターに含まれた導入遺伝子が腫瘍細胞又は感染性病原体から得られたエピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド、タンパク質である請求項１から１７のいずれかに記載の免疫原組成物。
【請求項２４】
前記エピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド又は前記タンパク質がメラノーマ細胞由来である請求項２３に記載の免疫原組成物。
【請求項２５】
前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が前記ベクターの前記配列内の中心に位置する請求項１〜１７の組成物、又は請求項１〜１７のいずれかに定義されたベクター又はベクター粒子。
【請求項２６】
前記導入遺伝子が逆転写の調節シグナルのＵ３領域に挿入された請求項１〜１７の何れか１項に記載された組成物又は請求項１〜１７の何れか１項に記載されたベクター又はベクター粒子。
【請求項２７】
シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性末端領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、前記ベクターがさらに定義されたヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を含み、前記ヌクレオチド配列が病原体の遺伝子配列、及びレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルであり、前記組成物が細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１個又はいくつかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２８】
前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子が細菌、例えばミコバクテリア、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項２９】
前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子がウイルス又はレトロウイルスの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項３０】
前記ＴＥＬ／ＡＭＬ又は前記ＩＬＫＥエピトープが病原体の遺伝子、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子の一部と置換された請求項１８又は１９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ベクターのゲノムの標的細胞核への移入を誘導又は促進することが可能な請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項３２】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物における請求項１８又は１９又は２７又は３１の何れかに記載のベクターの使用。
【請求項３３】
レンチウイルス又はレトロトランスポゾンベクター中で逆転写後に３本鎖ＤＮＡ構造（ＤＮＡ３重鎖）をとるｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含み、前記ベクターＤＮＡの形質導入細胞核への侵入速度を促進するヌクレオチド配列の使用。
【請求項３４】
細胞又は患者の細胞性応答を誘導するための請求項３３に記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項３５】
前記ベクターＤＮＡの速い侵入速度を誘導するか、又は前記ベクターＤＮＡの核移入速度を増加させることが可能なｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導された３本鎖ＤＮＡ配列。
【請求項１】
組換えベクターを含む免疫原組成物であって、
前記ベクターがシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）とシス作用性終止領域（ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含み、該領域はレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、前記ベクターはさらに所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）とレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の制御シグナルとを含み、前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は刺激することができることを特徴とする免疫原組成物。
【請求項２】
発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答である請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項３】
レトロウイルス起源の前記配列がレンチウイルスのゲノムから得られたことを特徴とする請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項４】
前記目的の導入遺伝子又は配列が転写及び発現の調節シグナルを含む発現カセットに含有されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項５】
１）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含有する組換えヌクレオチド配列と、２）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、トランスポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入されているポリヌクレオチドとを備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、
前記免疫原組成物が細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は刺激することができる免疫組成物。
【請求項６】
ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、
ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポリペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポリペプチド）と、
ｄ）１又は数個のエピトープをコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御下におかれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルを含有する配列と、シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列であって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の上記調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入された組換えヌクレオチド配列と
を備えた組換えレトロウイルスベクター粒子を含む免疫原組成物であって、
前記組成物が、前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促進することができる免疫原組成物。
【請求項７】
前記組換えレトロウイルス様粒子が、
ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来であり、レトロトランスポゾン調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されているポリヌクレオチドと、
ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、
ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、
ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、
ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列と
を含む免疫原組成物であって、
前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することができ、前記組成物は前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対して細胞性応答ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することができる免疫原組成物。
【請求項８】
発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答又はＣＤ４応答である請求項５〜７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項９】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの起源がレンチウイルスであり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドの起源がレンチウイルスであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１０】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ型レトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２由来であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１１】
前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドが、レンチウイルスＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶから選択されたウイルス由来であることを特徴とする請求項１０に記載の免疫原組成物。
【請求項１２】
前記ベクターの前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ−１レトロウイルスゲノムのシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及び終止領域（ＣＴＳ）を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１３】
前記ベクター粒子のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列がＨＩＶレトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の配列由来であることを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１４】
ｇａｇ及びｐｏｌ配列がＨＩＶレトロウイルスの配列由来であり、ｅｎｖ配列が異なるＨＩＶレトロウイルス又はウイルス由来であることを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１５】
前記ｅｎｖ配列がアンフォトロピックＥＮＶポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１６】
前記ｅｎｖ配列がエコトロピックＥＮＶポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１７】
前記ｅｎｖ配列が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られたことを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
【請求項１８】
ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３２６号として寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、又はＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３１号として寄託されたＰｔｒｉｐ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３７号として寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物と接触した組換え細胞。
【請求項２１】
抗原提示細胞又は肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択された細胞である請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
腫瘍又は感染性疾患を治療的に処置するための請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物又は組換え細胞。
【請求項２３】
前記ベクターに含まれた導入遺伝子が腫瘍細胞又は感染性病原体から得られたエピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド、タンパク質である請求項１から１７のいずれかに記載の免疫原組成物。
【請求項２４】
前記エピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド又は前記タンパク質がメラノーマ細胞由来である請求項２３に記載の免疫原組成物。
【請求項２５】
前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が前記ベクターの前記配列内の中心に位置する請求項１〜１７の組成物、又は請求項１〜１７のいずれかに定義されたベクター又はベクター粒子。
【請求項２６】
前記導入遺伝子が逆転写の調節シグナルのＵ３領域に挿入された請求項１〜１７の何れか１項に記載された組成物又は請求項１〜１７の何れか１項に記載されたベクター又はベクター粒子。
【請求項２７】
シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性末端領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、前記ベクターがさらに定義されたヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を含み、前記ヌクレオチド配列が病原体の遺伝子配列、及びレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルであり、前記組成物が細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１個又はいくつかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能であることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２８】
前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子が細菌、例えばミコバクテリア、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項２９】
前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子がウイルス又はレトロウイルスの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベクター。
【請求項３０】
前記ＴＥＬ／ＡＭＬ又は前記ＩＬＫＥエピトープが病原体の遺伝子、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子の一部と置換された請求項１８又は１９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ベクターのゲノムの標的細胞核への移入を誘導又は促進することが可能な請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項３２】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物における請求項１８又は１９又は２７又は３１の何れかに記載のベクターの使用。
【請求項３３】
レンチウイルス又はレトロトランスポゾンベクター中で逆転写後に３本鎖ＤＮＡ構造（ＤＮＡ３重鎖）をとるｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含み、前記ベクターＤＮＡの形質導入細胞核への侵入速度を促進するヌクレオチド配列の使用。
【請求項３４】
細胞又は患者の細胞性応答を誘導するための請求項３３に記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項３５】
前記ベクターＤＮＡの速い侵入速度を誘導するか、又は前記ベクターＤＮＡの核移入速度を増加させることが可能なｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域によって誘導された３本鎖ＤＮＡ配列。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−７８４２０（Ｐ２０１１−７８４２０Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２５１７７１（Ｐ２０１０−２５１７７１）
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【分割の表示】特願２００１−５３０５０３（Ｐ２００１−５３０５０３）の分割
【原出願日】平成１２年１０月１０日（２０００．１０．１０）
【出願人】（５９６００９６７４）アンスティテュ・パストゥール (23)
【出願人】（５９８１２５９８１）
【氏名又は名称原語表記】Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５１７７１（Ｐ２０１０−２５１７７１）
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【分割の表示】特願２００１−５３０５０３（Ｐ２００１−５３０５０３）の分割
【原出願日】平成１２年１０月１０日（２０００．１０．１０）
【出願人】（５９６００９６７４）アンスティテュ・パストゥール (23)
【出願人】（５９８１２５９８１）
【氏名又は名称原語表記】Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ
【Ｆターム（参考）】
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