免疫測定用粒子懸濁液及び免疫測定用試薬キット
【課題】
免疫測定用粒子懸濁液及び免疫測定用試薬キットにおいて、安価で簡便に粒子の分散性を向上した、免疫測定に用いられる免疫測定用粒子懸濁液及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供することを目的とする。
【解決手段】
免疫測定に用いられる粒子とシリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液、並びに、粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、目的物質及び粒子に結合可能な抗原又は抗体を含む試薬と、目的物質に結合可能な標識抗原又は標識抗体を含む試薬とを含む免疫測定用試薬キットを提供する。
免疫測定用粒子懸濁液及び免疫測定用試薬キットにおいて、安価で簡便に粒子の分散性を向上した、免疫測定に用いられる免疫測定用粒子懸濁液及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供することを目的とする。
【解決手段】
免疫測定に用いられる粒子とシリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液、並びに、粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、目的物質及び粒子に結合可能な抗原又は抗体を含む試薬と、目的物質に結合可能な標識抗原又は標識抗体を含む試薬とを含む免疫測定用試薬キットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用粒子懸濁液及び免疫測定用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の抗体又は抗原を検出するための免疫測定法として、検出対象の抗体又は抗原に結合する抗原又は抗体を固定化した粒子を用いる方法が知られている。この方法では、検出対象の抗体又は抗原を前記の粒子と接触させることで、粒子上で抗原−抗体複合体を形成する。そして、粒子上に形成された抗原−抗体複合体を標識物質で標識することで、検出対象の抗体又は抗原を検出する。
【０００３】
一般的に、上述した免疫測定法では、抗原又は抗体を固定化した粒子を懸濁した試薬が用いられる。ここで、粒子を懸濁した試薬に含まれる粒子は、凝集する場合がある。凝集した粒子を含む試薬を測定に用いると、検査の精度が低下する恐れがある。そのため、試薬を使用する際、試薬中の粒子を十分に分散させる必要がある。
【０００４】
ここで、粒子を懸濁した試薬における、粒子の分散性を向上させるために、粒子表面に所定の化合物を、被覆又は吸着させることも知られている。例えば、特許文献１には、粒子表面を化学修飾によりクエン酸で被覆し、粒子の分散性を向上させる方法が開示されている。また、特許文献２には、粒子表面に所定量の二塩基性有機酸化合物及び／または三塩基性有機酸化合物を吸着させ、粒子の分散性を向上させる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１及び２の方法は、粒子表面の処理が煩雑で、且つ費用がかかるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２８２５８２号公報
【特許文献２】特開２００７−１６９２０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、このような事情を鑑みてなされたものであり、安価で簡便に粒子の分散性を向上した、免疫測定用粒子懸濁液及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、免疫測定用粒子懸濁液にシリコン系消泡剤を添加することにより、粒子の分散性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は
（１）免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液；
（２）前記シリコン系消泡剤が、水溶性のシリコン系消泡剤である上記（１）に記載の懸濁液；
（３）前記水溶性のシリコン系消泡剤が、エマルジョン型又は自己乳化型のシリコン系消泡剤である上記（２）に記載の懸濁液；
（４）多価カルボン酸又はその塩をさらに含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の懸濁液；
（５）前記多価カルボン酸が、クエン酸又は酒石酸である上記（４）に記載の懸濁液；
（６）前記粒子が、磁性粒子である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の懸濁液：
（７）粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、目的物質及び粒子に結合可能な、抗原又は抗体を含む試薬と、目的物質に結合可能な、標識抗原又は標識抗体を含む試薬と、を含む免疫測定用試薬キット；
（８）標的物質が酵素であり、酵素と反応するための基質を含む試薬をさらに含む上記（７）に記載の免疫測定用試薬キット；
（９）前記基質が、発光基質、蛍光基質又は発色基質である上記（８）に記載の免疫測定用試薬キット；
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安価で簡便に粒子の分散性を向上した免疫測定用粒子懸濁液、及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】免疫分析装置の全体構成を示す斜視図である。
【図２】図１に示した免疫分析装置の平面図である。
【図３】図１に示した試薬設置部の全体構成を示す斜視図である。
【図４】図３に示した試薬設置部の試薬保持部の平面図である。
【図５】懸濁液１〜３を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図６】懸濁液１、２及び４を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図７】懸濁液１及び５〜７を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図８】懸濁液１及び８〜１０を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施形態における免疫測定用粒子懸濁液は、免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤が含まれている。
【００１２】
ここで、免疫測定は、固相として粒子を用いる免疫測定であれば、特に制限されない。一般的な、粒子を用いる免疫測定では、後述する目的物質を、目的物質に結合可能な抗原又は抗体を介して粒子上に結合させる。これにより、粒子上に、目的物質と、抗原又は抗体とを含む複合体が形成される。そして、粒子上に形成された複合体を標識し、その標識を用いて目的物質を検出する。
【００１３】
また、粒子は、上記の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に限定されない。免疫測定で用いられる具体的な粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。本実施形態における粒子としては、磁性粒子が好ましい。
【００１４】
ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、上記の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に制限されない。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材として例えばＦｅ２Ｏ３及び／又はＦｅ３Ｏ４、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。
【００１５】
本実施形態においてシリコン系消泡剤は、珪素化合物を含む消泡剤であればよく、特に制限されない。ここで、本実施形態におけるシリコン系消泡剤としては、水系での使用という観点から、水溶性のシリコン系消泡剤が好ましい。具体的な水溶性のシリコン系消泡剤としては、エマルジョン型又は自己乳化型のシリコン系消泡剤が挙げられる。また、これらのシリコン系消泡剤は市販されており、容易に入手可能である。市販のシリコン系消泡剤の具体例としては、ＫＳ−５３８（信越シリコーン（株））、ＫＭ−７０（信越シリコーン（株））、ＫＭ−７２Ｆ（信越シリコーン（株））、ＴＳＡ７７０（コメンタティブ（株））、ＴＳＡ７３２（コメンタティブ（株））、ＴＳＡ７３４１（コメンタティブ（株）、ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬工業（株））、ＳＭ５５７１（東レシリコーン（株））などが挙げられる。これら市販のシリコン系消泡剤の中で、商品名「ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ」は、特に優れた分散作用を発揮できるので好適である。
【００１６】
また、本実施形態の粒子の懸濁液は、多価カルボン酸又はその塩をさらに含むことができる。多価カルボン酸又はその塩をさらに含むことで、懸濁液に含まれる粒子の分散性をさらに向上させることができる。ここで、多価カルボン酸又はその塩としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、エチレンジアミン二酢酸、イミノ二酢酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、トリカルバリル酸、アコニット酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ジアミノプロパン四酢酸、ジアミノプロパノール四酢酸、及びグリコールエーテルジアミン四酢酸、又はそれらの塩などが挙げられる。好ましい多価カルボン酸又はその塩としては、クエン酸及び酒石酸、又はそれらの塩が挙げられ、特にクエン酸又はその塩が好ましい。より具体的な、多価カルボン酸又はその塩としては、クエン酸三ナトリウム二水和物や酒石酸カリウムナトリウム四水和物などが挙げられる。
【００１７】
本実施形態の免疫測定用粒子懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、懸濁液中の粒子の分散性や免疫測定の条件などに応じて適宜調整すればよく、特に制限されない。なお、懸濁液中の粒子の分散性を向上させるために、懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、０．１ｍM以上が好ましく、特に１ｍM以上が好ましい。免疫測定におけるｐHの影響を抑えるために、懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、２０ｍM以下が好ましく、特に１０ｍM以下が好ましい。すなわち、該濃度は、０．１ｍM〜２０ｍMが好ましく、特に１ｍM〜１０ｍMが好ましい。
【００１８】
なお、本実施形態の免疫測定用粒子懸濁液は、免疫測定の試薬に含むことができる、その他の成分をさらに含んでもよい。その他の成分としては、例えば、緩衝剤、保存剤、及び血清タンパク質などが挙げられる。
【００１９】
本実施形態における免疫測定用試薬キットには、目的物質及び粒子に結合可能な抗原又は抗体を含む第１試薬と、粒子及びシリコン系消泡剤を含む第２試薬と、目的物質に結合可能な標識抗原又は標識抗体を含む第３試薬とが含まれている。
【００２０】
ここで、本実施形態における第２試薬は、上述の免疫測定用粒子懸濁液と同様である。
【００２１】
本実施形態において、目的物質は、免疫測定により検出可能な物質であれば、特に限定されない。すなわち、目的物質は、抗原抗体反応により、粒子上に目的物質と抗原又は抗体とを含む複合体の形成が可能であれば良い。目的物質の例としては、タンパク質、核酸、糖、及び脂質などが挙げられる。より具体的な目的物質としてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれに対する抗体、ヒトＴ細胞向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）及びそれに対する抗体、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びそれに対する抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びそれに対する抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ、ＰｒｏＧＲＰ、梅毒トレポネーマ（ＴＰ）抗体、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、トロポニン、α１−アンチトリプシン、α１−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン、ＴＰＡｂ、ＴｇＡｂ、ＴＰＯＡｂ，ＴＲＡｂ，ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ１、ヘモグロビンＡ１Ｃ、ミオグロビン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、アポリポタンパクＡ１、アポリポタンパクＥ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体（ＰＩＣ）、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、組織プラスミノゲンアクチベーター・プラスミノゲンアクチベーターインヒビターＩ複合体（ｔＰＡＩ・Ｃ）、甲状腺ホルモン（サイロキシン（Ｔ３）、遊離サイロキシン（ＦＴ３）、トリオードサイロニン（Ｔ４）、遊離トリオードサイロニン（ＦＴ４））、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン、ＳＰ−Ａ、ＨCG、プロラクチン（ＰＲＬ）、Ｅ２、プロゲステロンなどが挙げられる。
【００２２】
本実施形態の第１試薬における、「目的物質及び粒子に結合可能な抗原または抗体」の抗原または抗体は、上述した目的物質と抗原抗体反応により結合する抗体または抗原であれば良い。また、この抗原または抗体は、上述の粒子に結合可能である。抗原または抗体を粒子に結合可能にする様式としては、当該技術において公知の様式を用いることができる。好ましくは、抗原または抗体に粒子結合部位を結合させ、粒子に粒子結合部位に結合可能な結合物質を固定化する。これにより、粒子結合部位と結合物質との結合を利用して、抗原または抗体を、粒子に結合可能にすることができる。
【００２３】
上記の粒子結合部位と結合物質は、本実施形態の免疫測定用試薬キットによる免疫測定の条件下で、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとして、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。粒子結合部位と結合物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン類との組み合わせが好ましい。粒子結合部位と結合物質との組み合わせに用いられる各々の物質は、どちらを粒子結合部位または結合物質に使用しても良い。より好ましい組み合わせとしては、粒子結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類を含む組み合わせが挙げられる。なお、本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びストレプトアビジンを含むことを意味する。
【００２４】
なお、粒子結合部位を抗原または抗体に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、粒子結合部位がビオチンを含む場合、抗原または抗体中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗体に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはNHS基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。
【００２５】
また、結合物質を粒子に固定化する方法も、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、結合物質がアビジン類である場合、物理的吸着によりアビジンを粒子に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した粒子にアビジン類を結合させることで、アビジン類を粒子に固定化することもできる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を粒子に固定化することも可能である。なお、アビジン類を結合させた粒子は、例えばＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから購入することもできる。
【００２６】
本実施形態において、第３試薬における「目的物質に結合可能な標識抗原または標識抗体」の抗原または抗体は、標識物質により標識され、且つ、上述の「目的物質及び粒子に結合可能な抗原または抗体」における抗原または抗体とは異なる目的物質の結合部位を認識する抗原または抗体であれば良い。
【００２７】
上記の標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。ここで、酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、及び酸性ホスファターゼなどが挙げられる。また、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、及び３２Ｐなどが挙げられる。本実施形態における標識物質としては、酵素が好ましい。
【００２８】
また、標識物質が酵素である場合、上記の試薬キットは、該酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含むことが好ましい。ここで、基質としては、当該技術において公知の基質を用いればよく、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２'―（５'−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。
【００２９】
なお、抗原や抗体を標識物質で標識する方法は、当該分野において公知である。例えば、抗原または抗体のチオール（−ＳＨ基）を用いて上記の標識物質を抗原または抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗原または抗体と反応させることにより、抗原または抗体を標識物質で標識できる。
【００３０】
なお、標識抗原または標識抗体は、標識物質の種類に応じて、当該分野で用いられる公知の方法で検出することができる。例えば、標識物質が酵素である場合、上述の基質との反応で生じた発光、蛍光または発色を、分光光度計やルミノメータなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。また、標識物質が蛍光物質である場合、蛍光物質からの蛍光を、分光光度計やルミノメータなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。また、標識物質が放射性同位体である場合、放射性同位体からの放射線を、シンチレーションカウンターなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。
【００３１】
本実施形態における免疫測定用試薬キットに含まれる各試薬は、液体であってもよいし、用時に水などを加えて用いるため固体であってもよい。
【００３２】
液体の形態の試薬は、適切な溶媒中に、少なくとも上記の各成分を溶解したものであればよい。適切な溶媒としては、水、ｐＨ６〜１０の緩衝液などが挙げられる。該緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＳ）などを用いることができる。該緩衝液は、界面活性剤、保存液、血清タンパク質などの公知の添加剤を含んでいてもよい。
【００３３】
上記の固体の形態の試薬は、上記の成分が溶解された適切な溶媒を、凍結乾燥などにすることにより得ることができる。
【００３４】
また、本実施形態の免疫測定用試薬キットは、免疫分析装置に好適に用いることができる。以下、本実施形態の免疫測定用試薬キット１０００を用いた免疫分析装置１による、血液などの検体に含まれる測定対象の抗原（目的物質）の測定について説明する。
【００３５】
免疫測定用試薬キット１０００は、目的物質及び前記磁性粒子に結合可能な捕捉抗体を含む第１試薬と、磁性粒子及びシリコン系消泡剤を含む第２試薬と、目的物質に結合可能な標識抗体を含む第３試薬と、発光基質を有する第４試薬が含まれている。
【００３６】
この免疫分析装置１は、図１および図２に示すように、測定機構部２と、測定機構部２の前面側に配置された検体搬送部（サンプラ）３と、測定機構部２に電気的に接続されたＰＣ（パーソナルコンピュータ）からなる制御装置４とを備えている。また、測定機構部２は、検体分注アーム５と、試薬設置部６および７と、試薬分注アーム８、９および１０と、１次反応部１１および２次反応部１２と、キュベット供給部１３と、ＢＦ分離部１４と、検出部１５とから構成されている。
【００３７】
まず、検体搬送部３により吸引位置１ａに搬送された試験管１００内の検体は、検体分注アーム５により、１次反応部１１に保持されるキュベット１５０内に分注される。次に、試薬設置部６に保持された第１試薬が、試薬分注アーム８により、１次反応部１１に保持されている検体が分注されたキュベット１５０内に分注される。これにより、検体中の目的物質と捕捉抗体が結合し、目的物質と捕捉抗体からなる第１複合体が形成される。次に、試薬設置部７に保持された第２試薬が、試薬分注アーム９により、１次反応部１１に保持されている第１複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第１複合体と磁性粒子が結合し、第１複合体と磁性粒子からなる第２複合体が形成される。次に、１次反応部１１の容器搬送部１１ｃによりキュベット１５０は、ＢＦ分離部１４に搬送される。そして、ＢＦ分離部１４によって、キュベット１５０内の試料から未反応の捕捉抗体が、第２複合体から分離される。次に、２次反応部１２の容器搬送部１２ｃにより、ＢＦ分離部１４により処理されたキュベット１５０が、２次反応部１２に搬送される。そして、試薬設置部７に保持された第３試薬が、試薬分注アーム９により、２次反応部１２に保持されている第２複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第２複合体と標識抗体が結合し、第２複合体と標識抗体からなる第３複合体が形成される。次に、容器搬送部１２ｃによりキュベット１５０は、ＢＦ分離部１４に搬送される。そして、ＢＦ分離部１４によって、キュベット１５０内の試料から未反応の標識抗体が、第３複合体から分離される。次に、容器搬送部１２ｃにより、ＢＦ分離部１４により処理されたキュベット１５０が、２次反応部１２に搬送される。そして、第４試薬が、第４試薬分注アーム（図示せず）により、２次反応部１２に保持されている第３複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第３複合体に含まれる標識抗体と、発光基質とが反応し光が生じる。そして、検出部１５により、前記光を光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）で取得することにより、その検体に含まれる抗原の量を測定する。
【００３８】
試薬設置部７は、図３に示すように、第２試薬が収容される試薬容器３１０を保持する試薬収容具３００を設置するために設けられている。ここで、図４に示すように、第２試薬を収容する試薬容器３１０（試薬収容具３００）を保持するラック６００は、ステッピングモータ２３の駆動により回転軸２２が矢印Ａ方向及び矢印Ｂ方向に往復回転可能に構成されている。すなわち、ラック６００を矢印Ａ方向及び矢印Ｂ方向に往復回転させることにより第２試薬を攪拌して、一般的な粒子と比較して重量の大きい粒子である磁性粒子が沈殿するのを抑制している。より具体的には、ラック６００は、一定の速さで、一定の角度αの角度範囲を往復動する。ここで、速度を早くし、且つ角度αを大きくすれば、当然試薬を十分に撹拌できる。しかしながら、本実施形態の免疫測定用試薬キット１０００の第２試薬は、シリコン系消泡剤を含有するため、従来よりも遅い各速度で十分に磁性粒子を分散させることができる。
【実施例１】
【００３９】
＜懸濁液１〜３及び磁性粒子保存バッファーの調製＞
懸濁液１〜３及び磁性粒子保存バッファーを、以下の通りに調製した。
（１）懸濁液１
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
（２）懸濁液２
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
（３）懸濁液３
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
（４）磁性粒子保存バッファー
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
【００４０】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液１〜４をそれぞれに対応する容器へ４ｍＬ分注し、十分に攪拌／静置した後、磁性粒子が沈殿した状態でＨＩＳＣＬ−２０００ｉ（シスメックス株式会社）に設置した。
次いで、ＨＩＳＣＬ−２０００ｉによる攪拌動作を開始し、該動作開始から２分後、４分後、６分後及び１０分後に懸濁液１〜４の上澄みを２０μＬサンプリングし、磁性粒子保存バッファー ９８０μＬで希釈後、分光光度計により６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００４１】
ここで磁性粒子が完全に分散したときの吸光度を１００％としたときの相対吸光度（％）を次式で求め、分散性の評価を実施した。
【００４２】
【数１】
【００４３】
懸濁液１〜４の相対吸光度の値をグラフにして、図５に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤を含有する懸濁液を用いることにより、磁性粒子の分散性が向上し、かつ磁性粒子が短時間で分散できることがわかる。
また、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液を用いることにより、クエン酸ナトリウムが含まれることによって、磁性粒子の分散性がさらに向上することがわかる。
【００４４】
次に、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液による分散性の向上が、クエン酸のみに起因するものであるか、多価カルボン酸に起因するものであるかを調べるため、クエン酸以外の多価カルボン酸として酒石酸カリウムナトリウム四水和物を用いて実施例２を行った。
【実施例２】
【００４５】
＜懸濁液４の調製＞
懸濁液４を、以下の通りに調製した。
懸濁液４
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
酒石酸カリウムナトリウム四水和物 １０ｍＭ
【００４６】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液４、実施例１で調製された懸濁液１及び２を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００４７】
懸濁液１、２及び４の相対吸光度の値をグラフにして、図６に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤及び酒石酸カリウムナトリウム四水和物を含有する懸濁液を用いることにより、磁性粒子の分散性が向上し、かつ磁性粒子が短時間で分散できることがわかる。
また、磁性粒子の分散性を向上する効果は、クエン酸ナトリウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物とともに多価カルボン酸からなる群より選択される少なくとも１つを用いることにより、より向上することがわかる。
【００４８】
次に、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有する懸濁液による分散性の向上が、多価カルボン酸の濃度に起因するかを調べるため、多価カルボン酸としてクエン酸ナトリウムを用いて実施例３を行った。
【実施例３】
【００４９】
＜懸濁液５〜７の調製＞
懸濁液５〜７を、以下の通りに調製した。
懸濁液５
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム ０．１ｍＭ
（２）懸濁液６
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １ｍＭ
懸濁液７
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
【００５０】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液５〜７及び実施例１で調製された懸濁液１を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００５１】
懸濁液１及び５〜７の相対吸光度の値をグラフにして、図７に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液において、クエン酸ナトリウム濃度が高くなると、磁性粒子の分散性が増し、かつ磁性粒子がより短時間で分散できることがわかる。
また、懸濁液１の値と比較して、懸濁液７は磁性粒子の分散性が向上した。これにより、懸濁液に含有するクエン酸濃度が０．１ｍＭ以上であれば分散性の効果を得られることがわかる。
【００５２】
次に、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有する懸濁液による分散性の向上が、多価カルボン酸のみに起因するかを調べるため、シリコン系消泡剤の非存在下で、多価カルボン酸としてクエン酸ナトリウムを用いて実施例４を行った。
【実施例４】
【００５３】
＜懸濁液８〜１０の調製＞
懸濁液８〜１０を、以下の通りに調製した。
（１）懸濁液８
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム ０．１ｍＭ
（２）懸濁液９
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム １ｍＭ
懸濁液１０
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
【００５４】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液８〜１０及び実施例１で調製された懸濁液１を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００５５】
懸濁液１及び８〜１０の相対吸光度の値をグラフにして、図８に示す。
これらの結果から、懸濁液８〜１０では、顕著な磁性粒子の分散性が見られなかった。また、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有しない懸濁液１では、前記同様に、顕著な磁性粒子の分散性が見られなかった。これにより、多価カルボン酸における磁性粒子の分散性は、シリコン系消泡剤存在下に起因するものであり、多価カルボン酸のみに起因するものではないことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用粒子懸濁液及び免疫測定用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の抗体又は抗原を検出するための免疫測定法として、検出対象の抗体又は抗原に結合する抗原又は抗体を固定化した粒子を用いる方法が知られている。この方法では、検出対象の抗体又は抗原を前記の粒子と接触させることで、粒子上で抗原−抗体複合体を形成する。そして、粒子上に形成された抗原−抗体複合体を標識物質で標識することで、検出対象の抗体又は抗原を検出する。
【０００３】
一般的に、上述した免疫測定法では、抗原又は抗体を固定化した粒子を懸濁した試薬が用いられる。ここで、粒子を懸濁した試薬に含まれる粒子は、凝集する場合がある。凝集した粒子を含む試薬を測定に用いると、検査の精度が低下する恐れがある。そのため、試薬を使用する際、試薬中の粒子を十分に分散させる必要がある。
【０００４】
ここで、粒子を懸濁した試薬における、粒子の分散性を向上させるために、粒子表面に所定の化合物を、被覆又は吸着させることも知られている。例えば、特許文献１には、粒子表面を化学修飾によりクエン酸で被覆し、粒子の分散性を向上させる方法が開示されている。また、特許文献２には、粒子表面に所定量の二塩基性有機酸化合物及び／または三塩基性有機酸化合物を吸着させ、粒子の分散性を向上させる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１及び２の方法は、粒子表面の処理が煩雑で、且つ費用がかかるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２８２５８２号公報
【特許文献２】特開２００７−１６９２０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、このような事情を鑑みてなされたものであり、安価で簡便に粒子の分散性を向上した、免疫測定用粒子懸濁液及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、免疫測定用粒子懸濁液にシリコン系消泡剤を添加することにより、粒子の分散性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は
（１）免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液；
（２）前記シリコン系消泡剤が、水溶性のシリコン系消泡剤である上記（１）に記載の懸濁液；
（３）前記水溶性のシリコン系消泡剤が、エマルジョン型又は自己乳化型のシリコン系消泡剤である上記（２）に記載の懸濁液；
（４）多価カルボン酸又はその塩をさらに含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の懸濁液；
（５）前記多価カルボン酸が、クエン酸又は酒石酸である上記（４）に記載の懸濁液；
（６）前記粒子が、磁性粒子である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の懸濁液：
（７）粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、目的物質及び粒子に結合可能な、抗原又は抗体を含む試薬と、目的物質に結合可能な、標識抗原又は標識抗体を含む試薬と、を含む免疫測定用試薬キット；
（８）標的物質が酵素であり、酵素と反応するための基質を含む試薬をさらに含む上記（７）に記載の免疫測定用試薬キット；
（９）前記基質が、発光基質、蛍光基質又は発色基質である上記（８）に記載の免疫測定用試薬キット；
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安価で簡便に粒子の分散性を向上した免疫測定用粒子懸濁液、及びそれを含む免疫測定用試薬キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】免疫分析装置の全体構成を示す斜視図である。
【図２】図１に示した免疫分析装置の平面図である。
【図３】図１に示した試薬設置部の全体構成を示す斜視図である。
【図４】図３に示した試薬設置部の試薬保持部の平面図である。
【図５】懸濁液１〜３を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図６】懸濁液１、２及び４を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図７】懸濁液１及び５〜７を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【図８】懸濁液１及び８〜１０を用いて、磁性粒子の分散性測定を行った場合の、相対吸光度のパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施形態における免疫測定用粒子懸濁液は、免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤が含まれている。
【００１２】
ここで、免疫測定は、固相として粒子を用いる免疫測定であれば、特に制限されない。一般的な、粒子を用いる免疫測定では、後述する目的物質を、目的物質に結合可能な抗原又は抗体を介して粒子上に結合させる。これにより、粒子上に、目的物質と、抗原又は抗体とを含む複合体が形成される。そして、粒子上に形成された複合体を標識し、その標識を用いて目的物質を検出する。
【００１３】
また、粒子は、上記の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に限定されない。免疫測定で用いられる具体的な粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。本実施形態における粒子としては、磁性粒子が好ましい。
【００１４】
ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、上記の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に制限されない。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材として例えばＦｅ２Ｏ３及び／又はＦｅ３Ｏ４、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。
【００１５】
本実施形態においてシリコン系消泡剤は、珪素化合物を含む消泡剤であればよく、特に制限されない。ここで、本実施形態におけるシリコン系消泡剤としては、水系での使用という観点から、水溶性のシリコン系消泡剤が好ましい。具体的な水溶性のシリコン系消泡剤としては、エマルジョン型又は自己乳化型のシリコン系消泡剤が挙げられる。また、これらのシリコン系消泡剤は市販されており、容易に入手可能である。市販のシリコン系消泡剤の具体例としては、ＫＳ−５３８（信越シリコーン（株））、ＫＭ−７０（信越シリコーン（株））、ＫＭ−７２Ｆ（信越シリコーン（株））、ＴＳＡ７７０（コメンタティブ（株））、ＴＳＡ７３２（コメンタティブ（株））、ＴＳＡ７３４１（コメンタティブ（株）、ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬工業（株））、ＳＭ５５７１（東レシリコーン（株））などが挙げられる。これら市販のシリコン系消泡剤の中で、商品名「ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ」は、特に優れた分散作用を発揮できるので好適である。
【００１６】
また、本実施形態の粒子の懸濁液は、多価カルボン酸又はその塩をさらに含むことができる。多価カルボン酸又はその塩をさらに含むことで、懸濁液に含まれる粒子の分散性をさらに向上させることができる。ここで、多価カルボン酸又はその塩としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、エチレンジアミン二酢酸、イミノ二酢酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、トリカルバリル酸、アコニット酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ジアミノプロパン四酢酸、ジアミノプロパノール四酢酸、及びグリコールエーテルジアミン四酢酸、又はそれらの塩などが挙げられる。好ましい多価カルボン酸又はその塩としては、クエン酸及び酒石酸、又はそれらの塩が挙げられ、特にクエン酸又はその塩が好ましい。より具体的な、多価カルボン酸又はその塩としては、クエン酸三ナトリウム二水和物や酒石酸カリウムナトリウム四水和物などが挙げられる。
【００１７】
本実施形態の免疫測定用粒子懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、懸濁液中の粒子の分散性や免疫測定の条件などに応じて適宜調整すればよく、特に制限されない。なお、懸濁液中の粒子の分散性を向上させるために、懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、０．１ｍM以上が好ましく、特に１ｍM以上が好ましい。免疫測定におけるｐHの影響を抑えるために、懸濁液における多価カルボン酸又はその塩の濃度は、２０ｍM以下が好ましく、特に１０ｍM以下が好ましい。すなわち、該濃度は、０．１ｍM〜２０ｍMが好ましく、特に１ｍM〜１０ｍMが好ましい。
【００１８】
なお、本実施形態の免疫測定用粒子懸濁液は、免疫測定の試薬に含むことができる、その他の成分をさらに含んでもよい。その他の成分としては、例えば、緩衝剤、保存剤、及び血清タンパク質などが挙げられる。
【００１９】
本実施形態における免疫測定用試薬キットには、目的物質及び粒子に結合可能な抗原又は抗体を含む第１試薬と、粒子及びシリコン系消泡剤を含む第２試薬と、目的物質に結合可能な標識抗原又は標識抗体を含む第３試薬とが含まれている。
【００２０】
ここで、本実施形態における第２試薬は、上述の免疫測定用粒子懸濁液と同様である。
【００２１】
本実施形態において、目的物質は、免疫測定により検出可能な物質であれば、特に限定されない。すなわち、目的物質は、抗原抗体反応により、粒子上に目的物質と抗原又は抗体とを含む複合体の形成が可能であれば良い。目的物質の例としては、タンパク質、核酸、糖、及び脂質などが挙げられる。より具体的な目的物質としてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれに対する抗体、ヒトＴ細胞向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）及びそれに対する抗体、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びそれに対する抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びそれに対する抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ、ＰｒｏＧＲＰ、梅毒トレポネーマ（ＴＰ）抗体、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、トロポニン、α１−アンチトリプシン、α１−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン、ＴＰＡｂ、ＴｇＡｂ、ＴＰＯＡｂ，ＴＲＡｂ，ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ１、ヘモグロビンＡ１Ｃ、ミオグロビン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、アポリポタンパクＡ１、アポリポタンパクＥ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体（ＰＩＣ）、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、組織プラスミノゲンアクチベーター・プラスミノゲンアクチベーターインヒビターＩ複合体（ｔＰＡＩ・Ｃ）、甲状腺ホルモン（サイロキシン（Ｔ３）、遊離サイロキシン（ＦＴ３）、トリオードサイロニン（Ｔ４）、遊離トリオードサイロニン（ＦＴ４））、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インスリン、ＳＰ−Ａ、ＨCG、プロラクチン（ＰＲＬ）、Ｅ２、プロゲステロンなどが挙げられる。
【００２２】
本実施形態の第１試薬における、「目的物質及び粒子に結合可能な抗原または抗体」の抗原または抗体は、上述した目的物質と抗原抗体反応により結合する抗体または抗原であれば良い。また、この抗原または抗体は、上述の粒子に結合可能である。抗原または抗体を粒子に結合可能にする様式としては、当該技術において公知の様式を用いることができる。好ましくは、抗原または抗体に粒子結合部位を結合させ、粒子に粒子結合部位に結合可能な結合物質を固定化する。これにより、粒子結合部位と結合物質との結合を利用して、抗原または抗体を、粒子に結合可能にすることができる。
【００２３】
上記の粒子結合部位と結合物質は、本実施形態の免疫測定用試薬キットによる免疫測定の条件下で、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとして、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。粒子結合部位と結合物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン類との組み合わせが好ましい。粒子結合部位と結合物質との組み合わせに用いられる各々の物質は、どちらを粒子結合部位または結合物質に使用しても良い。より好ましい組み合わせとしては、粒子結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類を含む組み合わせが挙げられる。なお、本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びストレプトアビジンを含むことを意味する。
【００２４】
なお、粒子結合部位を抗原または抗体に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、粒子結合部位がビオチンを含む場合、抗原または抗体中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗体に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはNHS基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。
【００２５】
また、結合物質を粒子に固定化する方法も、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、結合物質がアビジン類である場合、物理的吸着によりアビジンを粒子に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した粒子にアビジン類を結合させることで、アビジン類を粒子に固定化することもできる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を粒子に固定化することも可能である。なお、アビジン類を結合させた粒子は、例えばＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから購入することもできる。
【００２６】
本実施形態において、第３試薬における「目的物質に結合可能な標識抗原または標識抗体」の抗原または抗体は、標識物質により標識され、且つ、上述の「目的物質及び粒子に結合可能な抗原または抗体」における抗原または抗体とは異なる目的物質の結合部位を認識する抗原または抗体であれば良い。
【００２７】
上記の標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。ここで、酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、及び酸性ホスファターゼなどが挙げられる。また、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、及び３２Ｐなどが挙げられる。本実施形態における標識物質としては、酵素が好ましい。
【００２８】
また、標識物質が酵素である場合、上記の試薬キットは、該酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含むことが好ましい。ここで、基質としては、当該技術において公知の基質を用いればよく、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２'―（５'−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。
【００２９】
なお、抗原や抗体を標識物質で標識する方法は、当該分野において公知である。例えば、抗原または抗体のチオール（−ＳＨ基）を用いて上記の標識物質を抗原または抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗原または抗体と反応させることにより、抗原または抗体を標識物質で標識できる。
【００３０】
なお、標識抗原または標識抗体は、標識物質の種類に応じて、当該分野で用いられる公知の方法で検出することができる。例えば、標識物質が酵素である場合、上述の基質との反応で生じた発光、蛍光または発色を、分光光度計やルミノメータなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。また、標識物質が蛍光物質である場合、蛍光物質からの蛍光を、分光光度計やルミノメータなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。また、標識物質が放射性同位体である場合、放射性同位体からの放射線を、シンチレーションカウンターなどを用いて検出することで、標識抗原または標識抗体を検出することができる。
【００３１】
本実施形態における免疫測定用試薬キットに含まれる各試薬は、液体であってもよいし、用時に水などを加えて用いるため固体であってもよい。
【００３２】
液体の形態の試薬は、適切な溶媒中に、少なくとも上記の各成分を溶解したものであればよい。適切な溶媒としては、水、ｐＨ６〜１０の緩衝液などが挙げられる。該緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＳ）などを用いることができる。該緩衝液は、界面活性剤、保存液、血清タンパク質などの公知の添加剤を含んでいてもよい。
【００３３】
上記の固体の形態の試薬は、上記の成分が溶解された適切な溶媒を、凍結乾燥などにすることにより得ることができる。
【００３４】
また、本実施形態の免疫測定用試薬キットは、免疫分析装置に好適に用いることができる。以下、本実施形態の免疫測定用試薬キット１０００を用いた免疫分析装置１による、血液などの検体に含まれる測定対象の抗原（目的物質）の測定について説明する。
【００３５】
免疫測定用試薬キット１０００は、目的物質及び前記磁性粒子に結合可能な捕捉抗体を含む第１試薬と、磁性粒子及びシリコン系消泡剤を含む第２試薬と、目的物質に結合可能な標識抗体を含む第３試薬と、発光基質を有する第４試薬が含まれている。
【００３６】
この免疫分析装置１は、図１および図２に示すように、測定機構部２と、測定機構部２の前面側に配置された検体搬送部（サンプラ）３と、測定機構部２に電気的に接続されたＰＣ（パーソナルコンピュータ）からなる制御装置４とを備えている。また、測定機構部２は、検体分注アーム５と、試薬設置部６および７と、試薬分注アーム８、９および１０と、１次反応部１１および２次反応部１２と、キュベット供給部１３と、ＢＦ分離部１４と、検出部１５とから構成されている。
【００３７】
まず、検体搬送部３により吸引位置１ａに搬送された試験管１００内の検体は、検体分注アーム５により、１次反応部１１に保持されるキュベット１５０内に分注される。次に、試薬設置部６に保持された第１試薬が、試薬分注アーム８により、１次反応部１１に保持されている検体が分注されたキュベット１５０内に分注される。これにより、検体中の目的物質と捕捉抗体が結合し、目的物質と捕捉抗体からなる第１複合体が形成される。次に、試薬設置部７に保持された第２試薬が、試薬分注アーム９により、１次反応部１１に保持されている第１複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第１複合体と磁性粒子が結合し、第１複合体と磁性粒子からなる第２複合体が形成される。次に、１次反応部１１の容器搬送部１１ｃによりキュベット１５０は、ＢＦ分離部１４に搬送される。そして、ＢＦ分離部１４によって、キュベット１５０内の試料から未反応の捕捉抗体が、第２複合体から分離される。次に、２次反応部１２の容器搬送部１２ｃにより、ＢＦ分離部１４により処理されたキュベット１５０が、２次反応部１２に搬送される。そして、試薬設置部７に保持された第３試薬が、試薬分注アーム９により、２次反応部１２に保持されている第２複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第２複合体と標識抗体が結合し、第２複合体と標識抗体からなる第３複合体が形成される。次に、容器搬送部１２ｃによりキュベット１５０は、ＢＦ分離部１４に搬送される。そして、ＢＦ分離部１４によって、キュベット１５０内の試料から未反応の標識抗体が、第３複合体から分離される。次に、容器搬送部１２ｃにより、ＢＦ分離部１４により処理されたキュベット１５０が、２次反応部１２に搬送される。そして、第４試薬が、第４試薬分注アーム（図示せず）により、２次反応部１２に保持されている第３複合体を含むキュベット１５０内に分注される。これにより、第３複合体に含まれる標識抗体と、発光基質とが反応し光が生じる。そして、検出部１５により、前記光を光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）で取得することにより、その検体に含まれる抗原の量を測定する。
【００３８】
試薬設置部７は、図３に示すように、第２試薬が収容される試薬容器３１０を保持する試薬収容具３００を設置するために設けられている。ここで、図４に示すように、第２試薬を収容する試薬容器３１０（試薬収容具３００）を保持するラック６００は、ステッピングモータ２３の駆動により回転軸２２が矢印Ａ方向及び矢印Ｂ方向に往復回転可能に構成されている。すなわち、ラック６００を矢印Ａ方向及び矢印Ｂ方向に往復回転させることにより第２試薬を攪拌して、一般的な粒子と比較して重量の大きい粒子である磁性粒子が沈殿するのを抑制している。より具体的には、ラック６００は、一定の速さで、一定の角度αの角度範囲を往復動する。ここで、速度を早くし、且つ角度αを大きくすれば、当然試薬を十分に撹拌できる。しかしながら、本実施形態の免疫測定用試薬キット１０００の第２試薬は、シリコン系消泡剤を含有するため、従来よりも遅い各速度で十分に磁性粒子を分散させることができる。
【実施例１】
【００３９】
＜懸濁液１〜３及び磁性粒子保存バッファーの調製＞
懸濁液１〜３及び磁性粒子保存バッファーを、以下の通りに調製した。
（１）懸濁液１
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
（２）懸濁液２
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
（３）懸濁液３
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
（４）磁性粒子保存バッファー
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
【００４０】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液１〜４をそれぞれに対応する容器へ４ｍＬ分注し、十分に攪拌／静置した後、磁性粒子が沈殿した状態でＨＩＳＣＬ−２０００ｉ（シスメックス株式会社）に設置した。
次いで、ＨＩＳＣＬ−２０００ｉによる攪拌動作を開始し、該動作開始から２分後、４分後、６分後及び１０分後に懸濁液１〜４の上澄みを２０μＬサンプリングし、磁性粒子保存バッファー ９８０μＬで希釈後、分光光度計により６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００４１】
ここで磁性粒子が完全に分散したときの吸光度を１００％としたときの相対吸光度（％）を次式で求め、分散性の評価を実施した。
【００４２】
【数１】
【００４３】
懸濁液１〜４の相対吸光度の値をグラフにして、図５に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤を含有する懸濁液を用いることにより、磁性粒子の分散性が向上し、かつ磁性粒子が短時間で分散できることがわかる。
また、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液を用いることにより、クエン酸ナトリウムが含まれることによって、磁性粒子の分散性がさらに向上することがわかる。
【００４４】
次に、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液による分散性の向上が、クエン酸のみに起因するものであるか、多価カルボン酸に起因するものであるかを調べるため、クエン酸以外の多価カルボン酸として酒石酸カリウムナトリウム四水和物を用いて実施例２を行った。
【実施例２】
【００４５】
＜懸濁液４の調製＞
懸濁液４を、以下の通りに調製した。
懸濁液４
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
酒石酸カリウムナトリウム四水和物 １０ｍＭ
【００４６】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液４、実施例１で調製された懸濁液１及び２を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００４７】
懸濁液１、２及び４の相対吸光度の値をグラフにして、図６に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤及び酒石酸カリウムナトリウム四水和物を含有する懸濁液を用いることにより、磁性粒子の分散性が向上し、かつ磁性粒子が短時間で分散できることがわかる。
また、磁性粒子の分散性を向上する効果は、クエン酸ナトリウム、酒石酸カリウムナトリウム四水和物とともに多価カルボン酸からなる群より選択される少なくとも１つを用いることにより、より向上することがわかる。
【００４８】
次に、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有する懸濁液による分散性の向上が、多価カルボン酸の濃度に起因するかを調べるため、多価カルボン酸としてクエン酸ナトリウムを用いて実施例３を行った。
【実施例３】
【００４９】
＜懸濁液５〜７の調製＞
懸濁液５〜７を、以下の通りに調製した。
懸濁液５
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム ０．１ｍＭ
（２）懸濁液６
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １ｍＭ
懸濁液７
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
ＡｎｔｉｆｏａｍＳＩ（和光純薬（株）） ０．０１５％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
【００５０】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液５〜７及び実施例１で調製された懸濁液１を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００５１】
懸濁液１及び５〜７の相対吸光度の値をグラフにして、図７に示す。
これらの結果から、シリコン系消泡剤及びクエン酸ナトリウムを含有する懸濁液において、クエン酸ナトリウム濃度が高くなると、磁性粒子の分散性が増し、かつ磁性粒子がより短時間で分散できることがわかる。
また、懸濁液１の値と比較して、懸濁液７は磁性粒子の分散性が向上した。これにより、懸濁液に含有するクエン酸濃度が０．１ｍＭ以上であれば分散性の効果を得られることがわかる。
【００５２】
次に、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有する懸濁液による分散性の向上が、多価カルボン酸のみに起因するかを調べるため、シリコン系消泡剤の非存在下で、多価カルボン酸としてクエン酸ナトリウムを用いて実施例４を行った。
【実施例４】
【００５３】
＜懸濁液８〜１０の調製＞
懸濁液８〜１０を、以下の通りに調製した。
（１）懸濁液８
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム ０．１ｍＭ
（２）懸濁液９
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム １ｍＭ
懸濁液１０
市販の磁性粒子（平均粒径２μｍ） ０．５％
ＭＥＳ(2-morpholonoethanesulphonic acid)(pH6.5) ２０ｍＭ
ＢＳＡ ０．１％
ＮａＮ３ ０．１％
クエン酸ナトリウム １０ｍＭ
【００５４】
＜粒子の分散性評価＞
懸濁液８〜１０及び実施例１で調製された懸濁液１を、前記実施例１の粒子の分散性評価を用いて分散性の評価を実施した。
【００５５】
懸濁液１及び８〜１０の相対吸光度の値をグラフにして、図８に示す。
これらの結果から、懸濁液８〜１０では、顕著な磁性粒子の分散性が見られなかった。また、シリコン系消泡剤及び多価カルボン酸を含有しない懸濁液１では、前記同様に、顕著な磁性粒子の分散性が見られなかった。これにより、多価カルボン酸における磁性粒子の分散性は、シリコン系消泡剤存在下に起因するものであり、多価カルボン酸のみに起因するものではないことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液。
【請求項２】
前記シリコン系消泡剤が、水溶性のシリコン系消泡剤である請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記水溶性のシリコン系消泡剤が、エマルジョン型又は自己乳化型である請求項２記載の懸濁液。
【請求項４】
多価カルボン酸又はその塩をさらに含む請求項１乃至３のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項５】
前記多価カルボン酸又はその塩は、クエン酸、酒石酸、クエン酸塩又は酒石酸塩である請求項４に記載の懸濁液。
【請求項６】
前記粒子が、磁性粒子である請求項１乃至５のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項７】
粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、
目的物質及び粒子に結合可能な、抗原又は抗体を含む試薬と、
目的物質に結合可能な、標識抗原又は標識抗体を含む試薬と、
を含む免疫測定用試薬キット。
【請求項８】
標的物質が酵素であり、酵素と反応するための基質を含む試薬をさらに含む請求項７に記載の免疫測定用試薬キット。
【請求項９】
前記基質が、発光基質、蛍光基質又は発色基質である請求項８に記載の免疫測定用試薬キット。
【請求項１】
免疫測定に用いられる粒子と、シリコン系消泡剤とを含む免疫測定用粒子懸濁液。
【請求項２】
前記シリコン系消泡剤が、水溶性のシリコン系消泡剤である請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記水溶性のシリコン系消泡剤が、エマルジョン型又は自己乳化型である請求項２記載の懸濁液。
【請求項４】
多価カルボン酸又はその塩をさらに含む請求項１乃至３のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項５】
前記多価カルボン酸又はその塩は、クエン酸、酒石酸、クエン酸塩又は酒石酸塩である請求項４に記載の懸濁液。
【請求項６】
前記粒子が、磁性粒子である請求項１乃至５のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項７】
粒子及びシリコン系消泡剤を含む試薬と、
目的物質及び粒子に結合可能な、抗原又は抗体を含む試薬と、
目的物質に結合可能な、標識抗原又は標識抗体を含む試薬と、
を含む免疫測定用試薬キット。
【請求項８】
標的物質が酵素であり、酵素と反応するための基質を含む試薬をさらに含む請求項７に記載の免疫測定用試薬キット。
【請求項９】
前記基質が、発光基質、蛍光基質又は発色基質である請求項８に記載の免疫測定用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−４７７８８（Ｐ２０１１−４７７８８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９６３６５（Ｐ２００９−１９６３６５）
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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