免疫測定試薬
【課題】 ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法、および、該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、および、アクリルアミド検出キットの製造方法を提供すること。
【解決手段】 ＣＴＢＡ−ＫＬＨ複合体を、非ヒト動物に免疫することにより、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造することができる。また、このＣＴＢＡに特異的な抗体を含有させることによって、アクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、およびアクリルアミド検出キットを製造することができる。
【解決手段】 ＣＴＢＡ−ＫＬＨ複合体を、非ヒト動物に免疫することにより、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造することができる。また、このＣＴＢＡに特異的な抗体を含有させることによって、アクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、およびアクリルアミド検出キットを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸に対する特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、アクリルアミドの検出や測定は、ＬＣ/ＭＳあるいはＧＣ/ＭＳ等の質量分析法によって行われていた（例えば、特許文献１参照）。しかし、これらの方法には高価な機器と熟練が必要であると同時に時間がかかるため、安価かつ簡便・迅速なアクリルアミドの検出、測定方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１８４２１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸（[(2-carbamoylethyl)thio]benzonic acid、以下、ＣＴＢＡと称する）に特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明に係る複合体は、ＣＴＢＡとスカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）との複合体である。ここで、ＣＴＢＡは３−ＣＴＢＡ (３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)または４−ＣＴＢＡ (４−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)であることが好ましい。
【０００６】
本発明に係るＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法は、上記の複合体により非ヒト動物を免疫する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るアクリルアミド検出試薬の製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明に係るアクリルアミド検出器の製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るアクリルアミド検出キットの製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態において、アクリルアミドに３−ＭＢＡを反応させることにより得られた３−ＣＴＢＡの１３Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。
【図２】本発明の一実施形態において、アクリルアミドに３−ＭＢＡを反応させることにより得られた３−ＣＴＢＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨおよび４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による３−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡの検量線を比較して示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による、アクリルアミドの検量線と検出下限値を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による、３−ＣＴＢＡの検量線とアクリルアミドの検量線を比較して示すグラフである。
【図６】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系によりアクリルアミドを測定した場合の、誤差プロファイルを示したグラフである。
【図７】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いた測定系によるアクリルアミド構造類似体（アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、アクリル酸、マレイン酸、マレアミド酸）の交差反応性を示したグラフである。
【図８】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いた測定系と従来のＬＣ/ＭＳ機器分析測定系により測定した、食品試料中のアクリルアミド含有量の相関を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法＝＝
本発明に係るＣＴＢＡに特異的な抗体（以下、抗ＣＴＢＡ抗体とも称する）は、周知の方法により、宿主となる非ヒト動物に対して免疫原となるＣＴＢＡを接種することにより製造することができる。
【００１６】
ＣＴＢＡを非ヒト動物に接種する際、抗体産生効率を向上させるために、周知の担体タンパク質と結合させてもよい。担体タンパク質は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の担体タンパク質であってもよいが、スカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１７】
免疫原のＣＴＢＡは、非ヒト動物において抗ＣＴＢＡ抗体の産生を誘起する範囲で制限されず、２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡ等の何れのＣＴＢＡであってもよいが、担体タンパク質、特にＫＬＨと結合させて免疫する場合には、３−ＣＴＢＡあるいは４−ＣＴＢＡであることが好ましい。以下に、３−ＣＴＢＡと４−ＣＴＢＡの構造式を示す。
【化１】
【００１８】
ＣＴＢＡと担体タンパク質との結合方法は特に制限されず、周知の方法から当業者が適宜選択できる。例えば、ＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide）などのカルボジイミドを用いる方法や縮合法（mixed carbonic anhydride法）等を用いてもよいが、カルボジイミド−サクシニミド法を用いることが好ましい。
【００１９】
また、抗体産生効率を向上させるために、免疫原を、１種類以上の免疫応答増強物質（アジュバント）と共に非ヒト動物に接種してもよい。アジュバントとしては、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどの鉱物塩、グラム陰性菌のリポ多糖類等を例示できるが、これらに制限されず、周知の物質から当業者が適宜選択できる。
【００２０】
非ヒト動物の種類は特に制限されず、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類、または、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類であってもよい。
【００２１】
免疫原の接種方法は特に制限されないが、抗体産生効率を考慮すると注射による接種が好ましく、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が例示できる。
【００２２】
非ヒト動物への免疫原の接種スケジュールは、製造する抗体の種類、動物の種類、コスト、設備等を考慮し、周知の方法に従って当業者が適宜決定することができるが、初回免疫後に１回、あるいは複数回の追加免疫を行うことが好ましい。
【００２３】
本発明に係る抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、使用目的、製造に係るコスト、設備等を考慮して当業者が適宜選択すればよい。ポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法に従って、非ヒト動物に免疫原を接種し、血清を回収することにより製造することができる。血清の回収後、周知の方法に従って、抗体を単離精製してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、マウスの脾臓細胞やリンパ球細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、ＣＴＢＡに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ・クローンを単離し、そのクローンの培養上清を回収することにより製造することができる。あるいは、培養上清を採取する代わりに、得られたハイブリドーマをマウス腹腔に注入し、腹水を回収してもよい。また、得られた培養上清や腹水から、周知の方法に従って、抗体を単離精製してもよい。
【００２４】
ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の精製方法は特に制限されず、例えば、塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、当業者に周知の方法から適宜選択することができる。
【００２５】
なお、本明細書において、抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体、及び部分抗体を含む。部分抗体とは、抗原結合部位を含み、抗原結合活性を有する抗体の断片であり、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ‘）２断片を例示できる。
【００２６】
＝＝ＣＴＢＡに特異的な抗体の使用方法＝＝
アクリルアミドをメルカプト安息香酸（以下、ＭＢＡと略す）と反応させることにより、ＣＴＢＡへと変換することができる。従って、合成されたＣＴＢＡを検出することにより、アクリルアミドを検出することができる。
【００２７】
ＭＢＡの一般試薬として２−メルカプト安息香酸（２−ＭＢＡ）、３−メルカプト安息香酸（３−ＭＢＡ）、４−メルカプト安息香酸（４−ＭＢＡ）が知られている。これらのＭＢＡと反応させることにより、アクリルアミドはそれぞれ２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡへと変換される。本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体は、２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡ等のＣＴＢＡのうちいずれか一つを認識する抗体であっても、あるいは、複数のＣＴＢＡを認識することのできる抗体であってもよい。
【００２８】
また、過剰量のＭＢＡと反応させることにより、アクリルアミドを定量的にＣＴＢＡに変換することができる。このように変換されたＣＴＢＡの量はアクリルアミドの量を反映するため、ＣＴＢＡの量を測定することにより、アクリルアミドの量を測定することができる。従って、ＣＴＢＡに特異的な抗体を用いて、例えば、アクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、あるいはアクリルアミド検出キットを製造することができる。
【００２９】
アクリルアミド検出試薬は、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を１種類あるいは２種類以上含有させて製造することができる。アクリルアミド検出試薬は、抗ＣＴＢＡ抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、アジ化ナトリウム等の防腐剤、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等の非特異反応を抑制するための物質、標識物質等の免疫学的手法によりＣＴＢＡを検出するために必要な物質、ＢＳＡ、ヤギ血清等の安定剤をはじめとする、抗原の検出試薬に含ませる一般的な物質が１種類あるいは複数種類、抗体以外に含んでいてもよい。
【００３０】
また、抗ＣＴＢＡ抗体やＣＴＢＡを媒体に固定化することにより、アクリルアミド検出器を製造することができる。ここで、媒体に固定化するＣＴＢＡは、１種類あるいは２種類以上の抗ＣＴＢＡ抗体が結合性を有する物質であって、例えば、ＣＴＢＡ自体であってもよく、抗体との結合性を有するＣＴＢＡ断片等であってもよい。媒体としては、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロンやプラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ、ラテックス粒子等を例示することができる。
【００３１】
このような検出器の形状は特に限定されないが、一例として、抗ＣＴＢＡ抗体やＣＴＢＡが固定化されたイムノプレートやプラスチックチューブ等の、試料を受け入れることができる形状の検出器を挙げることができる。これらの検出器は、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法、およびＲＩＡ(radioimmunoassay)法等によるアクリルアミドの検出や測定に使用することが可能である。
【００３２】
例えば、検出器の一例として、直接競合ＥＬＩＳＡ法のためのイムノプレートが挙げられる。この場合、抗ＣＴＢＡ抗体がイムノプレートに固定化されている。使用方法としては、まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドに過剰量のＭＢＡを反応させてアクリルアミドを定量的にＣＴＢＡへ変換する。次に、このＣＴＢＡ液体試料と一定量の標識ＣＴＢＡとを検出器に添加する。この時、液体試料中のＣＴＢＡと標識ＣＴＢＡが検出器に固定化された抗ＣＴＢＡ抗体を競争的に奪い合うことになり、試料に含まれるＣＴＢＡが少ないほど抗体と標識ＣＴＢＡの複合体形成が多く、試料に含まれるＣＴＢＡが多いほど抗体と標識ＣＴＢＡの複合体形成は少ない。続いて、イムノプレートに固定化された抗体に結合しなかった、余剰の液体試料と標識ＣＴＢＡを洗浄除去した後、イムノプレートに残存する標識物質の量を測定する。予めイムノプレートに添加したＣＴＢＡ量と残存標識物質量の関係を表す検量線を作成しておき、この検量線を用いて試料中のＣＴＢＡ量を求める。このＣＴＢＡ量から試料中のアクリルアミドの量を求めることができる。
【００３３】
検出器は、間接競合ＥＬＩＳＡ法のためのイムノプレートであってもよい。この場合、ＣＴＢＡがイムノプレートに固定化されている。まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドを過剰量のＭＢＡと反応させて定量的にＣＴＢＡへと変換する。このＣＴＢＡ液体試料および一定量の抗ＣＴＢＡ抗体をイムノプレートへ添加すると、イムノプレートに固定化されたＣＴＢＡと液体試料中のＣＴＢＡが競争的に抗ＣＴＢＡ抗体を奪い合う。但し、抗体量≦ＣＴＢＡ量となるように測定系を設定しておく必要がある。液体試料に含まれるＣＴＢＡが少ないほどイムノプレートに固定化されたＣＴＢＡに結合する抗体が多く、試料に含まれるＣＴＢＡが多いほど固定化ＣＴＢＡに結合する抗体は少ない。イムノプレートを洗浄した後、標識二次抗体を加えて固定化ＣＴＢＡと複合体を形成している抗ＣＴＢＡ抗体に結合させる。次に、イムノプレートを洗浄した後、プレートに残存する標識物質の量を測定する。既知濃度のアクリルアミド溶液を用いて予め作成した、試料中のアクリルアミド量と残存標識物質量の関係を表す検量線から、試料中のアクリルアミド量を算出することが可能である。
【００３４】
また、別の一例としては、クロマトグラフ媒体を有した検出器（イムノクロマトグラフ）が挙げられる。その構造は、例えば、液体試料を滴下または液体試料に浸す第一の部分と、ＣＴＢＡがクロマトグラフ媒体に固定化された第二の部分と、免疫グロブリンが、第一、第二の部分を通過したことを確認できる物質、例えば、抗免疫グロブリン抗体やプロテインＡ等の抗ＣＴＢＡ抗体産生に用いた動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する物質、あるいは、ｐＨ指示薬等がクロマトグラフ媒体に固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、標識物質で標識された一定量の抗ＣＴＢＡ抗体を含むものが例示できる。また、用いるクロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の修飾セルロース等が挙げられる。
【００３５】
このような構造のイムノクロマトグラフの使用方法は、まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドに過剰量のＭＢＡを反応させ、アクリルアミドを定量的にＣＴＢＡへ変換する。この液体試料をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下、あるいは、この液体試料にクロマトグラフ媒体の第一の部分を浸すと、液体試料は毛細管現象によりクロマトグラフ媒体の第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を越えて移動する。この時、液体試料中にＣＴＢＡが含まれていれば、第一の部分に一定量含まれている標識抗ＣＴＢＡ抗体は液体試料に溶けた後ＣＴＢＡと反応してＣＴＢＡ−標識抗ＣＴＢＡ抗体の複合体を形成する。第一の部分に一定量含ませてある標識抗ＣＴＢＡ抗体のうち、液体試料中のＣＴＢＡと複合体を形成した標識抗ＣＴＢＡ抗体は、クロマトグラフ媒体中を移動して第二の部分へ到達してももはや第二の部分に固定化されたＣＴＢＡとは反応しない。第二の部分に固定化されたＣＴＢＡと複合体を形成できる標識抗ＣＴＢＡ抗体は、第一の部分で試料中のＣＴＢＡと複合体を形成せずに残存した標識抗ＣＴＢＡ抗体のみである。すなわち、液体試料中のＣＴＢＡ量が少ないほど第二の部分における標識の発色は強くなり、液体試料中のＣＴＢＡ量が多いほど標識の発色は弱くなる。この発色強度を、ＣＴＢＡ量がゼロの場合の発色強度と比較することにより液体試料中のＣＴＢＡの有無を判定することが可能となる。また、ＣＴＢＡ量と第二の部分における発色強度の関係を表す検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて試料中のＣＴＢＡ量を求めることもできる。液体試料が第一の部分へ添加された後、予定通り試料が第一、第二、第三の部分を通過すると、第三の部分に到達した標識抗ＣＴＢＡ抗体が抗ＣＴＢＡ抗体に結合性のある物質あるいはｐＨ指示薬等により発色する。
【００３６】
さらに、抗ＣＴＢＡ抗体やアクリルアミド検出試薬をはじめとする１種類あるいは複数種類の反応試薬を含有させて、アクリルアミド検出キットを製造することができる。抗ＣＴＢＡ抗体は、アクリルアミド検出器のように、媒体に固定化されていてもよい。反応試薬は、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、アジ化ナトリウム等の防腐剤、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等の非特異反応を抑制するためのブロッキング剤、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等の免疫学的手法によりＣＴＢＡを検出するために必要な物質、ＢＳＡ、ヤギ血清等の安定化剤等であってもよい。
【００３７】
以上に説明したアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、アクリルアミド検出キットにおいて、標識物質は、例えば蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を指すが、これらに制限されるものではなく、その他の公知の標識物質であってもよい。また、標識物質が酵素の場合、発色基質は特に制限されるものではなく、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、o-フェニレンジアミン(o-phenylenediamine)、ＢＣＩＰ／Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitrotetrazolium blue)、ｐＮＰＰ (para-nitorophenylphosphate)等が挙げられる。発色増強剤は、これらの基質の発色を増強させることができるものであれば特に制限されず、例えば、硫酸等が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
[実施例１]
本実施例では、アクリルアミドをメルカプト安息香酸（ＭＢＡ）と反応させることにより、ＣＴＢＡが得られることを示す。
【００３９】
アクリルアミド（Sigma-Aldrich 社）を０．５００ｇ（７．０３ｍｍｏｌ）量りとり、蒸留水２０ｍＬに溶かした。次に１ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウム水溶液３５．２ｍＬに３−ＭＢＡ（Sigma-Aldrich 社）０．５４３ ｇ（３．５２ｍｍｏｌ）を溶かして混合し、磁気撹拌した。室温で３時間反応させた後、ギ酸２００Ｌ（０．２４４ｇ、５．３００ｍｍｏｌ）を加えて３−ＣＢＴＡの結晶を析出させた。結晶を吸引ろ過して、少量の蒸留水で洗浄した。得られた結晶を少量（約５ｍＬ）のメタノールで加熱しながら溶解させ、蒸留水（約２．５ｍＬ）をゆっくり加えた後、放冷した。４℃で一日放置し、十分に結晶を析出させた後、結晶を吸引ろ過して、少量の蒸留水で洗浄し、真空乾燥し白色顆粒状の３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸を得た。収量は０．５２３ｇであった。また、同様の条件下でアクリルアミドに２−ＭＢＡ（和光純薬工業株式会社）あるいは４−ＭＢＡ（東京化成工業株式会社）を反応させることによって、２−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡを得た。
【００４０】
＝＝ＣＴＢＡの純度検定法＝＝
上記３−ＣＴＢＡについて、重水素化メタノール溶媒に溶解して核磁気共鳴スペクトルを測定した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定は磁場強度１００ＭＨｚで、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定は４００ＭＨｚで行った。その結果、得られた産物が３−ＣＴＢＡであることを確認できた。また、不純物が含まれていないことを確認できた（図１、２）。同様に、２−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡの純度も確認した。
【００４１】
[実施例２]
本実施例では、以下の（１）〜（３）に示すＣＴＢＡ−ＫＬＨを作製した。
（１）２−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
（２）３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
（３）４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
【００４２】
＝＝カルボジイミド−サクシニミド法によるＣＴＢＡ−ＫＬＨの調製＝＝
まず、２ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０〜７．５）に２０ｍｇのＫＬＨ(タンパク質濃度＝１０ｍｇ/ｍＬ)を溶解した。一方、３．４ｍｇ（１５μｍｏｌ）の２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡまたは４−ＣＴＢＡを１ｍＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０〜７．５）に溶解し、１５ｍＭのＣＴＢＡ溶液を調製した。ＣＴＢＡ溶液１ｍＬに４．３ｍｇ（３７．５μｍｏｌ）の粉末Ｎ−ヒドロキシサクシニミドを加えて溶解した後、ＣＴＢＡと等ｍｏｌ量（２．９ｍｇ）の粉末カルボジイミド（ＥＤＣ）を加えて溶解した。溶解後、直ちに、上記のＫＬＨ溶液と混合し、室温で２時間反応させた。反応後の溶液を全て回収して透析チューブに入れ、透析外液（ＰＢＳ）を激しく撹拌しながら透析した。この際、透析外液は透析チューブ内液の１００倍量用い、透析開始から３時間後および一晩後にそれぞれ新しい外液に交換した。
【００４３】
このようにして調製したＣＴＢＡ−ＫＬＨについて、１分子のＫＬＨ当たりに結合したＣＴＢＡの分子数を測定した。具体的には、ＣＴＢＡ結合前のＫＬＨと、結合後のＫＬＨについてＢｌａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定した。この濃度を基に、ＣＴＢＡ結合前後のＫＬＨ、およびＣＴＢＡ自体を１ｍｇ／ｍＬに調製し、これらの溶液の紫外吸収スペクトルを測定した。ＣＴＢＡ結合前後のスペクトルの差から、１分子のＫＬＨに結合したＣＴＢＡの分子数を算出した。
【００４４】
その結果、１分子のＫＬＨ(分子量＝７，０００，０００)に対し、２−ＣＴＢＡでは１１０分子、３−ＣＴＢＡでは６５０分子、４−ＣＴＢＡでは５４０分子が結合されていた。従って、３−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡは２−ＣＴＢＡよりも多くの分子がＫＬＨに結合できる。なお、この結果は、２−ＣＴＢＡは３−ＣＴＢＡや４−ＣＴＢＡに比べてベンゼン環上の−ＣＯＯＨ基と−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２の距離が近いため、結合の際の反応が立体障害により阻害されることに起因すると考えられる。
【００４５】
[実施例３]
本実施例では、実施例１で調製した３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨおよび４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨにより動物を免疫した。
【００４６】
＝＝ウサギに対する免疫方法＝＝
３羽のウサギ（日本白色種、オス、１３〜１５週齢）を実施例１の３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨまたは４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨで初回免疫した後、１４日後、２８日後、４２日後、および５６日後に追加免疫を行った。これらのウサギから、初回免疫後３５日後と４９日後に試採血し、さらに６３日後に全採血し、抗血清を得た。
【００４７】
＝＝モルモットに対する免疫方法＝＝
３匹のモルモット（ハートレイ、メス、１２週齢）を実施例１の３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨまたは４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨで免疫した後、１４日後、２８日後、４２日後、および５６日後に追加免疫を行った。これらのモルモットから、初回免疫後４９日後に試採血し、さらに、６３日後に全採血し、抗血清を得た。
【００４８】
＝＝ＥＬＩＳＡ法による抗体力価測定＝＝
（イムノプレートへのＣＴＢＡの固定化）
実施例１と同様の方法を用い、ＫＬＨをＢＳＡに置き換えることによりＣＴＢＡ−ＢＳＡ（表１参照）を調製した。９６ウェルイムノプレート（MaxiSorp、Nunc社）の各ウェルに５μｇ/ｍＬのＣＴＢＡ−ＢＳＡを１００μＬ加えた後、２時間放置してイムノプレートに結合させた。ＣＴＢＡ−ＢＳＡ溶液をウェルから取り除いて０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略す)で洗浄した。ウェルをＢＳＡでブロッキングした後、ブロッキング液を取り除き、一晩乾燥させた。なお、この工程はすべて室温（約２５℃）で行った。
【表１】
【００４９】
（抗体力価測定）
上記のようにしてＣＴＢＡ−ＢＳＡを固定化したイムノプレートのウェルに、ウサギあるいはモルモットから採取した抗血清の稀釈系列（１０００×２ｎ、ｎ＝０〜７）を添加し、室温で２時間放置した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでウェルを洗浄した。各ウェルに０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡを含有する０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）(以下、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡと略す)により２０００倍稀釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Bio-Rad社）あるいはペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧヤギ抗体（Jackson社）を１００μＬずつ加え、室温で２時間放置した後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次に、各ウェルにペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ（BioFX社）を１００μＬ加えて室温に３０分間放置した後、１Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。この測定値（ＯＤ４５０）を縦軸に、抗血清の稀釈倍率を横軸にとってグラフを作成し、吸光度の最大値（ＯＤ４５０＝３．０）の半値（ＯＤ４５０＝１．５）を与える抗血清稀釈倍率を以て抗体の力価とした。
【００５０】
表２に、ウサギおよびモルモット各３個体から得られた抗血清における抗体力価を示す。
【表２】
【００５１】
[実施例４]
本実施例では、間接競合ＥＬＩＳＡ法によるアクリルアミド測定系を構築した。
【００５２】
実施例２で得られた各抗血清を用いたアクリルアミド測定系を確立するため、まず、イムノプレートに固定化するＣＴＢＡ−ＢＳＡの濃度と抗血清稀釈倍率の最適な組み合わせをチェッカーボード・タイトレーション法によって決定した。
【００５３】
＝＝チェッカーボード・タイトレーション法＝＝
イムノプレートを用いる間接競合ＥＬＩＳＡ法によってＣＴＢＡを定量する場合には、イムノプレートに固定化されたＣＴＢＡ−ＢＳＡの量やウェル中へ添加する抗体量が多いほど抗原検出感度が低くなる。従って、ＣＴＢＡの検出感度を高くするためには、「抗体モル数≦抗原モル数」を満たす範囲で固定化するＣＴＢＡ−ＢＳＡの濃度をできるだけ低くし、かつ、ウェルに添加する抗体濃度をできるだけ低くすることが必要である。そこで、以下のようにＣＴＢＡ−ＢＳＡと抗体稀釈倍率の最適な組合せを設定した。
【００５４】
（チェッカーボード・タイトレーション用イムノプレートの調製）
表１に示した固定化用ＣＴＢＡ−ＢＳＡのタンパク質濃度を、炭酸緩衝液を用いて１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３μｇ／ｍｌに調製し、各１００μＬを９６ウェルイムノプレート（MaxiSorp、Nunc社）のウェルに加え、室温で２時間放置した。続いて、ウェル中のＣＴＢＡ−ＢＳＡを取り除き、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＢＳＡでブロッキングした後、ブロッキング液を取り除いて一晩乾燥させた。このようにして、異なる濃度のＣＴＢＡ−ＢＳＡが固定化されたチェッカーボード・タイトレーション用イムノプレートを調製した。
【００５５】
３−ＣＴＢＡをウサギ１に接種し、４９日目に得られた血清（３−ＣＴＢＡ抗血清）、および、４−ＣＴＢＡをウサギ２に接種し、４９日目に得られた血清（４−ＣＴＢＡ抗血清）（実施例２）の希釈系列を調製し、(１００，０００×３ｎ倍稀釈、ｎ＝０〜１０)、このイムノプレートのウェルに添加した。実施例２の「抗体力価測定」に記載の方法と同様にして、１．５ 付近のＯＤ４５０値を与えることのできる最も低い固定化ＣＴＢＡ−ＢＳＡ濃度と最も高い抗血清稀釈倍率の組み合わせを決定した（表３）。
【表３】
【００５６】
＝＝検量線の作成＝＝
上記３−ＣＴＢＡ抗血清を用いた測定系（３−ＣＴＢＡ測定系）と４−ＣＴＢＡ抗血清を用いた測定系（４−ＣＴＢＡ測定系）によって、ＣＴＢＡあるいはアクリルアミドを標準物質として測定し、検量線を作成した。
【００５７】
（ＣＴＢＡを標準物質として用いた検量線の作成）
実施例１で合成した３−ＣＴＢＡあるいは４−ＣＴＢＡをアクリルアミド換算濃度が０（ブランク）および０．１〜１００，０００ ｎｇ/ｍＬとなるようにＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ（０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ３ （ｐＨ ８．３））に溶解した。これを表３に示す最適濃度の固定化ＣＴＢＡ−ＢＳＡを有するイムノプレートの各ウェルに５０μＬ添加し、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより最適倍率に稀釈した抗血清（表３）を５０μＬ加えた後、室温に２時間放置して抗原抗体反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、各ウェルにＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより２０００倍稀釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体(Bio-Rad社)を加え、室温で１時間放置した。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した後、各ウェルにペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ(BioFX社)溶液を１００μＬ加え３０分間室温で反応させた後、１Ｎ硫酸を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。なお、この測定は三重測定で行った。
【００５８】
このようにして得られた吸光度（ＯＤ４５０）の測定値を用い、以下のようにして検量線を作成した。まず、アクリルアミド換算濃度がゼロの時(ブランク)のＯＤ４５０を１００％とし、各アクリルアミド換算濃度について得られたＯＤ４５０を％表示した値（Ｂ/Ｂ０）をＹ軸にとり、アクリルアミド標準液の濃度（ｎｇ/ｍＬ）をＸ軸にとって片対数プロットした。このプロットに対し、４−パラメータロジスティック関数Y(=B/B0)=[(a-d)/{1+(X/c)b}]+dによるカーブフィッティングを行って曲線式を得た。
ここで、
a: B/B0の最大値（アクリルアミド換算濃度がゼロの時のB/B0）
b: 変曲点（IC50）における曲線の傾き
c: 変曲点のアクリルアミド濃度（=IC50）
d: B/B0の最小値（アクリルアミド濃度が無限大の時のB/B0）
Y: B/B0
X: 濃度既知アクリアミド標準液の濃度
【００５９】
次に、得られた曲線式Y(=B/B0)=[(a-d)/{1+(X/c)b}]+dを標準化した曲線式Y’(=(B/B0)’) =1/{1+(X/c)b}に変換し、これを検量線（x軸：X，y軸：Y'）とした。ここで、B/B0と (B/B0)’ の関係は、<標準化したB/B0=(B/B0)’={(B/B0)-d}/(a-d)>である。
【００６０】
合成３−ＣＴＢＡおよび合成４−ＣＴＢＡを標準物質として、免疫に用いたウサギ個体別に３−ＣＴＢＡ測定系および４−ＣＴＢＡ測定系の検量線を作成した。一例として、それぞれ最も感度の高かった個体の検量線を対比して図３に示すが、３−ＣＴＢＡ測定系の検量線では４−ＣＴＢＡ測定系に比較して、標準物質濃度の増減に対するY'値の増減が大きかった。このように、３−ＣＴＢＡ測定系では４−ＣＴＢＡ測定系に比較して、ＣＴＢＡの濃度の変化をより高感度で検出できる。
【００６１】
（アクリルアミドを標準物質として用いた検量線の作成）
ＣＴＢＡを標準物質とした場合に検出感度がより高い３−ＣＴＢＡ測定系についてアクリルアミドを標準物質として用いてアクリルアミド検量線を作成した。抗血清は、合成３−ＣＴＢＡを標準物質として用いた場合に最も感度の良かったウサギ１のものを用い、三重測定で行った。
【００６２】
試験管に濃度が０および０．６９〜５００ｎｇ/ｍＬのアクリルアミド標準水溶液（１００μＬ）（関東化学株式会社）を入れておき、２０μＬの３−ＭＢＡ溶液（１Ｎ ＮａＯＨ中に３−ＭＢＡ（Toronto Research Chemicals社）を４８ｍｇ/ｍＬの濃度に溶解して調製）を添加した後、３７℃で２時間反応させ、アクリルアミドを３−ＣＴＢＡに変換した。次に、各試験管にＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌを８８０μＬ加えて測定用試料溶液を調製した。
【００６３】
チェッカーボード・タイトレーションにより決定した最適濃度の３−ＣＴＢＡ−ＢＳＡを固定化したイムノプレートの各ウェルへ上記の測定用サンプル溶液を５０μＬ加えた。ここに、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌにより最適組合せ稀釈倍率に稀釈した抗血清を５０μＬ加え、室温で１時間放置して抗原抗体反応させた。各ウェルをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ）で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより１０００倍希釈、Bio-Rad社）を加え、室温で３０分放置した。ウェルをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ (BioFX社)溶液を１００μＬ加え、室温で３０分間反応させた。続いて、各ウェルに１Ｎ硫酸を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
【００６４】
このようにして得た吸光度（ＯＤ４５０）の測定値を用い、ＣＴＢＡを標準物質とした時と同様にして検量線を作成した（図４）。
【００６５】
３−ＣＴＢＡを標準物質とした場合とアクリルアミドを標準物質とした場合の検量線について、横軸のアクリルアミド濃度をそろえて比較したグラフを図５に示す。どちらの標準物質を用いた場合でも同様の検量線が得られた。この結果により、３７℃で２時間反応させることにより、アクリルアミドが定量的にＣＴＢＡに変換されることが確認された。
【００６６】
なお、図３と図４を比較すると、見かけ上、アクリルアミドを標準物質として用いた検量線は３−ＣＴＢＡを標準物質として用いた検量線に比べて感度が約１/１０であるかのように見える。これは、アクリルアミドを標準物質とした場合に測定用試料調製の段階でアクリルアミド溶液が１０倍に希釈されているためである。
【００６７】
＝＝検出下限値の算出＝＝
アクリルアミドを標準物質として作成した検量線を用いて、アクリルアミドの検出下限値をISO 11843-5:2008(E)（Capability of detection; Part 5: Methodology in the linear and non-linear calibration cases）に記載の方法によって求めた。ISO 11843-5:2008(E)によれば、検量線作成に用いた測定値に関して、アクリルアミド濃度がゼロの時(ブランク)の(B/B0)’の相対標準偏差（ＲＳＤ; relative standard deviation）を、定数１３．２で除した値を勾配とする直線により検量線Y’(=(B/B0)’)=1/{1+(X/c)b}に対して接線を引き、接点のX座標を検出下限値とする。計算の結果、図４に示すように、検出下限値は０．４ｎｇ/ｍＬ付近であった。
【００６８】
＝＝アクリルアミド定量値の誤差プロファイル＝＝
３−ＣＴＢＡ測定系と４−ＣＴＢＡ測定系のうちでより検出感度の高い３−ＣＴＢＡ測定系について定量値のＲＳＤを算出し、アクリルアミド定量値の誤差プロファイルを求めた（図６）。定量値のＲＳＤは、アクリルアミド検量線の各濃度における(B/B0)’のＲＳＤ（ｎ＝３）をそのアクリルアミド濃度における検量線の勾配で割ることにより得られる。
【００６９】
図４に示すように、検出下限値（定義はＲＳＤ＝３０％）を与えるアクリルアミド濃度は０．６ｎｇ/ｍＬ付近であり、ISO 11843-5:2008(E)で算出された検出下限値とよく一致していた。一方、アクリルアミドの定量範囲（定義はＲＳＤ≦１０％の範囲）は、２〜５００ｎｇ/ｍＬの範囲である。
【００７０】
このように、実施例２で製造された抗体を用いたアクリルアミド測定系が構築できた。このアクリルアミド測定系は検出下限値が約０．４ｎｇ/ｍＬ、かつ、定量域が２〜５００ｎｇ/ｍＬの優れた測定系である。
【００７１】
[実施例５]
本実施例では、実施例３で構築したアクリルアミド測定系では、アクリルアミド構造類似体の交差反応性が低いことを示す。
【００７２】
実施例３で構築したアクリルアミド測定系によって、アクリルアミド（関東化学株式会社）、メタクリルアミド（MP Bio 社）、アクリロニトリル（AccuStandard Inc.）、アクリル酸(ナカライテスク社)、マレイン酸(ナカライテスク社)およびマレアミド酸（FRINTON LABORATORIES Inc.）を測定し、縦軸にＢ/Ｂ０、横軸に構造類似体のモル濃度をとったグラフを作成した。この結果を図７に示す。
【００７３】
各構造類似体についてＢ/Ｂ０＝５０％のモル濃度を読み取り、この濃度をＩＣ５０とした。ＩＣ５０の逆数はこの測定系における構造類似体の相対的な反応性を表すため、アクリルアミドの１/ＩＣ５０を１００％として構造類似体の交差反応率を計算することができる。このようにして求めた交差反応率を表４に示す。
【表４】
【００７４】
表４に示すように、最も交差反応率が高いアクリロニトリルでも交差反応率は１．４３％であった。この結果は、抗ＣＴＢＡ抗体を用いたアクリルアミド測定系により、アクリルアミドを特異的に検出または測定できることを示している。
【００７５】
[実施例６]
本実施例では、実施例３で構築したアクリルアミド測定系により食品試料中のアクリルアミドが測定できること、および、その信頼性が十分に高いことを示す。
【００７６】
種々の食品（ポテトチップス１〜６（１、２はアクリルアミドを添加した市販品、３〜６は市販品）、ビスケット、かりんとう、ほうじ茶）中に含まれるアクリルアミドを文献（Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi Vol.49,N0.12,822-825(2002)）に従って測定試料を調製した。具体的には、まず、粉砕した各食品試料２ｇを１００ｍＬの純水に加え、ホモジナイズした。これを遠心分離した後にろ過し、上清１ｍＬをＩＳＯＬＵＴＥ(Biotage 社)５００ｍｇに通して溶出してくる液を捨て、更に３ｍＬの水を通して溶出させた３ｍＬを取って３-ＣＴＢＡ調製用試料とした（コンディショニング：メタノール３ｍＬ通液、水３ｍＬ通液）。
【００７７】
＝＝３−ＣＴＢＡ測定系（ＥＬＩＳＡ法）による測定＝＝
固相抽出後の試料１００μＬに１００μＬの３−ＭＢＡ（１Ｎ ＮａＯＨ中に３−ＭＢＡ（Toronto Research Chemicals社）を４８ｍｇ/ｍＬの濃度に溶解して調製）を添加し、３７℃で２時間反応させて３−ＣＴＢＡに変換した後、８８０μＬのＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ加えて測定試料とした。３−ＣＴＢＡ試料を、実施例４の「検量線の作成」の記載に従い測定した。
【００７８】
＝＝ＬＣ／ＭＳ機器分析による測定＝＝
固相抽出後の試料を２０μＬに調製し、ＨＰ１１００ ＬＣ／ＭＳシステム（アジレントテクノロジー株式会社）による機器分析に供した。分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｃ１８カラム（Zorbax Eclipse XDB C18 4.6mm x 150mm）
溶媒：８％アセトニトリル−水
流速：０．４５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０ ℃
ＭＳＤ：
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍ／ｚ ７２
Ｄｒｙ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ：１１ Ｌ/ｍｉｎ
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ： ４０ ｐｓｉｇ
Ｄｒｙ Ｇａｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ３００ ℃
【００７９】
測定結果を表５に示す。
【表５】
【００８０】
３−ＣＴＢＡ測定系による測定値を縦軸にとり、ＬＣ/ＭＳ機器分析による測定値を横軸にとってプロットし、回帰直線を引いて両測定値の相関性を検討した結果、両者は決定係数Ｒ２＝０．９９のよい一致を示した。この結果を図８に示した。
【００８１】
図８に示すように、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を用いたアクリルアミド測定系による測定結果は従来の機器分析法による測定結果とよく一致し、十分に信頼性が高い。このように、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を用いる測定系により食品試料中のアクリルアミドを正確に測定することができる。機器分析法と比較しても、本アクリルアミド測定系は迅速、簡便、かつ安価に行えるため、食品中のアクリルアミド低減に向けた取り組みも容易となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸に対する特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、アクリルアミドの検出や測定は、ＬＣ/ＭＳあるいはＧＣ/ＭＳ等の質量分析法によって行われていた（例えば、特許文献１参照）。しかし、これらの方法には高価な機器と熟練が必要であると同時に時間がかかるため、安価かつ簡便・迅速なアクリルアミドの検出、測定方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１８４２１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸（[(2-carbamoylethyl)thio]benzonic acid、以下、ＣＴＢＡと称する）に特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明に係る複合体は、ＣＴＢＡとスカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）との複合体である。ここで、ＣＴＢＡは３−ＣＴＢＡ (３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)または４−ＣＴＢＡ (４−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)であることが好ましい。
【０００６】
本発明に係るＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法は、上記の複合体により非ヒト動物を免疫する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るアクリルアミド検出試薬の製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明に係るアクリルアミド検出器の製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るアクリルアミド検出キットの製造方法は、ＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、製造された抗体を含有させる工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法、並びに該抗体を含むアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、及びアクリルアミド検出キットの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態において、アクリルアミドに３−ＭＢＡを反応させることにより得られた３−ＣＴＢＡの１３Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。
【図２】本発明の一実施形態において、アクリルアミドに３−ＭＢＡを反応させることにより得られた３−ＣＴＢＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨおよび４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による３−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡの検量線を比較して示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による、アクリルアミドの検量線と検出下限値を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系による、３−ＣＴＢＡの検量線とアクリルアミドの検量線を比較して示すグラフである。
【図６】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いたアクリルアミド測定系によりアクリルアミドを測定した場合の、誤差プロファイルを示したグラフである。
【図７】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いた測定系によるアクリルアミド構造類似体（アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、アクリル酸、マレイン酸、マレアミド酸）の交差反応性を示したグラフである。
【図８】本発明の一実施形態において、３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨによりウサギを免疫して得られた抗血清を用いた測定系と従来のＬＣ/ＭＳ機器分析測定系により測定した、食品試料中のアクリルアミド含有量の相関を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法＝＝
本発明に係るＣＴＢＡに特異的な抗体（以下、抗ＣＴＢＡ抗体とも称する）は、周知の方法により、宿主となる非ヒト動物に対して免疫原となるＣＴＢＡを接種することにより製造することができる。
【００１６】
ＣＴＢＡを非ヒト動物に接種する際、抗体産生効率を向上させるために、周知の担体タンパク質と結合させてもよい。担体タンパク質は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の担体タンパク質であってもよいが、スカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）であることが好ましい。
【００１７】
免疫原のＣＴＢＡは、非ヒト動物において抗ＣＴＢＡ抗体の産生を誘起する範囲で制限されず、２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡ等の何れのＣＴＢＡであってもよいが、担体タンパク質、特にＫＬＨと結合させて免疫する場合には、３−ＣＴＢＡあるいは４−ＣＴＢＡであることが好ましい。以下に、３−ＣＴＢＡと４−ＣＴＢＡの構造式を示す。
【化１】
【００１８】
ＣＴＢＡと担体タンパク質との結合方法は特に制限されず、周知の方法から当業者が適宜選択できる。例えば、ＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide）などのカルボジイミドを用いる方法や縮合法（mixed carbonic anhydride法）等を用いてもよいが、カルボジイミド−サクシニミド法を用いることが好ましい。
【００１９】
また、抗体産生効率を向上させるために、免疫原を、１種類以上の免疫応答増強物質（アジュバント）と共に非ヒト動物に接種してもよい。アジュバントとしては、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどの鉱物塩、グラム陰性菌のリポ多糖類等を例示できるが、これらに制限されず、周知の物質から当業者が適宜選択できる。
【００２０】
非ヒト動物の種類は特に制限されず、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類、または、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類であってもよい。
【００２１】
免疫原の接種方法は特に制限されないが、抗体産生効率を考慮すると注射による接種が好ましく、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が例示できる。
【００２２】
非ヒト動物への免疫原の接種スケジュールは、製造する抗体の種類、動物の種類、コスト、設備等を考慮し、周知の方法に従って当業者が適宜決定することができるが、初回免疫後に１回、あるいは複数回の追加免疫を行うことが好ましい。
【００２３】
本発明に係る抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、使用目的、製造に係るコスト、設備等を考慮して当業者が適宜選択すればよい。ポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法に従って、非ヒト動物に免疫原を接種し、血清を回収することにより製造することができる。血清の回収後、周知の方法に従って、抗体を単離精製してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、マウスの脾臓細胞やリンパ球細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、ＣＴＢＡに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ・クローンを単離し、そのクローンの培養上清を回収することにより製造することができる。あるいは、培養上清を採取する代わりに、得られたハイブリドーマをマウス腹腔に注入し、腹水を回収してもよい。また、得られた培養上清や腹水から、周知の方法に従って、抗体を単離精製してもよい。
【００２４】
ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の精製方法は特に制限されず、例えば、塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、当業者に周知の方法から適宜選択することができる。
【００２５】
なお、本明細書において、抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体、及び部分抗体を含む。部分抗体とは、抗原結合部位を含み、抗原結合活性を有する抗体の断片であり、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ‘）２断片を例示できる。
【００２６】
＝＝ＣＴＢＡに特異的な抗体の使用方法＝＝
アクリルアミドをメルカプト安息香酸（以下、ＭＢＡと略す）と反応させることにより、ＣＴＢＡへと変換することができる。従って、合成されたＣＴＢＡを検出することにより、アクリルアミドを検出することができる。
【００２７】
ＭＢＡの一般試薬として２−メルカプト安息香酸（２−ＭＢＡ）、３−メルカプト安息香酸（３−ＭＢＡ）、４−メルカプト安息香酸（４−ＭＢＡ）が知られている。これらのＭＢＡと反応させることにより、アクリルアミドはそれぞれ２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡへと変換される。本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体は、２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡ、４−ＣＴＢＡ等のＣＴＢＡのうちいずれか一つを認識する抗体であっても、あるいは、複数のＣＴＢＡを認識することのできる抗体であってもよい。
【００２８】
また、過剰量のＭＢＡと反応させることにより、アクリルアミドを定量的にＣＴＢＡに変換することができる。このように変換されたＣＴＢＡの量はアクリルアミドの量を反映するため、ＣＴＢＡの量を測定することにより、アクリルアミドの量を測定することができる。従って、ＣＴＢＡに特異的な抗体を用いて、例えば、アクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、あるいはアクリルアミド検出キットを製造することができる。
【００２９】
アクリルアミド検出試薬は、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を１種類あるいは２種類以上含有させて製造することができる。アクリルアミド検出試薬は、抗ＣＴＢＡ抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、アジ化ナトリウム等の防腐剤、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等の非特異反応を抑制するための物質、標識物質等の免疫学的手法によりＣＴＢＡを検出するために必要な物質、ＢＳＡ、ヤギ血清等の安定剤をはじめとする、抗原の検出試薬に含ませる一般的な物質が１種類あるいは複数種類、抗体以外に含んでいてもよい。
【００３０】
また、抗ＣＴＢＡ抗体やＣＴＢＡを媒体に固定化することにより、アクリルアミド検出器を製造することができる。ここで、媒体に固定化するＣＴＢＡは、１種類あるいは２種類以上の抗ＣＴＢＡ抗体が結合性を有する物質であって、例えば、ＣＴＢＡ自体であってもよく、抗体との結合性を有するＣＴＢＡ断片等であってもよい。媒体としては、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロンやプラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ、ラテックス粒子等を例示することができる。
【００３１】
このような検出器の形状は特に限定されないが、一例として、抗ＣＴＢＡ抗体やＣＴＢＡが固定化されたイムノプレートやプラスチックチューブ等の、試料を受け入れることができる形状の検出器を挙げることができる。これらの検出器は、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法、およびＲＩＡ(radioimmunoassay)法等によるアクリルアミドの検出や測定に使用することが可能である。
【００３２】
例えば、検出器の一例として、直接競合ＥＬＩＳＡ法のためのイムノプレートが挙げられる。この場合、抗ＣＴＢＡ抗体がイムノプレートに固定化されている。使用方法としては、まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドに過剰量のＭＢＡを反応させてアクリルアミドを定量的にＣＴＢＡへ変換する。次に、このＣＴＢＡ液体試料と一定量の標識ＣＴＢＡとを検出器に添加する。この時、液体試料中のＣＴＢＡと標識ＣＴＢＡが検出器に固定化された抗ＣＴＢＡ抗体を競争的に奪い合うことになり、試料に含まれるＣＴＢＡが少ないほど抗体と標識ＣＴＢＡの複合体形成が多く、試料に含まれるＣＴＢＡが多いほど抗体と標識ＣＴＢＡの複合体形成は少ない。続いて、イムノプレートに固定化された抗体に結合しなかった、余剰の液体試料と標識ＣＴＢＡを洗浄除去した後、イムノプレートに残存する標識物質の量を測定する。予めイムノプレートに添加したＣＴＢＡ量と残存標識物質量の関係を表す検量線を作成しておき、この検量線を用いて試料中のＣＴＢＡ量を求める。このＣＴＢＡ量から試料中のアクリルアミドの量を求めることができる。
【００３３】
検出器は、間接競合ＥＬＩＳＡ法のためのイムノプレートであってもよい。この場合、ＣＴＢＡがイムノプレートに固定化されている。まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドを過剰量のＭＢＡと反応させて定量的にＣＴＢＡへと変換する。このＣＴＢＡ液体試料および一定量の抗ＣＴＢＡ抗体をイムノプレートへ添加すると、イムノプレートに固定化されたＣＴＢＡと液体試料中のＣＴＢＡが競争的に抗ＣＴＢＡ抗体を奪い合う。但し、抗体量≦ＣＴＢＡ量となるように測定系を設定しておく必要がある。液体試料に含まれるＣＴＢＡが少ないほどイムノプレートに固定化されたＣＴＢＡに結合する抗体が多く、試料に含まれるＣＴＢＡが多いほど固定化ＣＴＢＡに結合する抗体は少ない。イムノプレートを洗浄した後、標識二次抗体を加えて固定化ＣＴＢＡと複合体を形成している抗ＣＴＢＡ抗体に結合させる。次に、イムノプレートを洗浄した後、プレートに残存する標識物質の量を測定する。既知濃度のアクリルアミド溶液を用いて予め作成した、試料中のアクリルアミド量と残存標識物質量の関係を表す検量線から、試料中のアクリルアミド量を算出することが可能である。
【００３４】
また、別の一例としては、クロマトグラフ媒体を有した検出器（イムノクロマトグラフ）が挙げられる。その構造は、例えば、液体試料を滴下または液体試料に浸す第一の部分と、ＣＴＢＡがクロマトグラフ媒体に固定化された第二の部分と、免疫グロブリンが、第一、第二の部分を通過したことを確認できる物質、例えば、抗免疫グロブリン抗体やプロテインＡ等の抗ＣＴＢＡ抗体産生に用いた動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する物質、あるいは、ｐＨ指示薬等がクロマトグラフ媒体に固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、標識物質で標識された一定量の抗ＣＴＢＡ抗体を含むものが例示できる。また、用いるクロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の修飾セルロース等が挙げられる。
【００３５】
このような構造のイムノクロマトグラフの使用方法は、まず、液体試料中に含まれるアクリルアミドに過剰量のＭＢＡを反応させ、アクリルアミドを定量的にＣＴＢＡへ変換する。この液体試料をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下、あるいは、この液体試料にクロマトグラフ媒体の第一の部分を浸すと、液体試料は毛細管現象によりクロマトグラフ媒体の第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を越えて移動する。この時、液体試料中にＣＴＢＡが含まれていれば、第一の部分に一定量含まれている標識抗ＣＴＢＡ抗体は液体試料に溶けた後ＣＴＢＡと反応してＣＴＢＡ−標識抗ＣＴＢＡ抗体の複合体を形成する。第一の部分に一定量含ませてある標識抗ＣＴＢＡ抗体のうち、液体試料中のＣＴＢＡと複合体を形成した標識抗ＣＴＢＡ抗体は、クロマトグラフ媒体中を移動して第二の部分へ到達してももはや第二の部分に固定化されたＣＴＢＡとは反応しない。第二の部分に固定化されたＣＴＢＡと複合体を形成できる標識抗ＣＴＢＡ抗体は、第一の部分で試料中のＣＴＢＡと複合体を形成せずに残存した標識抗ＣＴＢＡ抗体のみである。すなわち、液体試料中のＣＴＢＡ量が少ないほど第二の部分における標識の発色は強くなり、液体試料中のＣＴＢＡ量が多いほど標識の発色は弱くなる。この発色強度を、ＣＴＢＡ量がゼロの場合の発色強度と比較することにより液体試料中のＣＴＢＡの有無を判定することが可能となる。また、ＣＴＢＡ量と第二の部分における発色強度の関係を表す検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて試料中のＣＴＢＡ量を求めることもできる。液体試料が第一の部分へ添加された後、予定通り試料が第一、第二、第三の部分を通過すると、第三の部分に到達した標識抗ＣＴＢＡ抗体が抗ＣＴＢＡ抗体に結合性のある物質あるいはｐＨ指示薬等により発色する。
【００３６】
さらに、抗ＣＴＢＡ抗体やアクリルアミド検出試薬をはじめとする１種類あるいは複数種類の反応試薬を含有させて、アクリルアミド検出キットを製造することができる。抗ＣＴＢＡ抗体は、アクリルアミド検出器のように、媒体に固定化されていてもよい。反応試薬は、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液、アジ化ナトリウム等の防腐剤、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等の非特異反応を抑制するためのブロッキング剤、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等の免疫学的手法によりＣＴＢＡを検出するために必要な物質、ＢＳＡ、ヤギ血清等の安定化剤等であってもよい。
【００３７】
以上に説明したアクリルアミド検出試薬、アクリルアミド検出器、アクリルアミド検出キットにおいて、標識物質は、例えば蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を指すが、これらに制限されるものではなく、その他の公知の標識物質であってもよい。また、標識物質が酵素の場合、発色基質は特に制限されるものではなく、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、o-フェニレンジアミン(o-phenylenediamine)、ＢＣＩＰ／Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitrotetrazolium blue)、ｐＮＰＰ (para-nitorophenylphosphate)等が挙げられる。発色増強剤は、これらの基質の発色を増強させることができるものであれば特に制限されず、例えば、硫酸等が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
[実施例１]
本実施例では、アクリルアミドをメルカプト安息香酸（ＭＢＡ）と反応させることにより、ＣＴＢＡが得られることを示す。
【００３９】
アクリルアミド（Sigma-Aldrich 社）を０．５００ｇ（７．０３ｍｍｏｌ）量りとり、蒸留水２０ｍＬに溶かした。次に１ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウム水溶液３５．２ｍＬに３−ＭＢＡ（Sigma-Aldrich 社）０．５４３ ｇ（３．５２ｍｍｏｌ）を溶かして混合し、磁気撹拌した。室温で３時間反応させた後、ギ酸２００Ｌ（０．２４４ｇ、５．３００ｍｍｏｌ）を加えて３−ＣＢＴＡの結晶を析出させた。結晶を吸引ろ過して、少量の蒸留水で洗浄した。得られた結晶を少量（約５ｍＬ）のメタノールで加熱しながら溶解させ、蒸留水（約２．５ｍＬ）をゆっくり加えた後、放冷した。４℃で一日放置し、十分に結晶を析出させた後、結晶を吸引ろ過して、少量の蒸留水で洗浄し、真空乾燥し白色顆粒状の３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸を得た。収量は０．５２３ｇであった。また、同様の条件下でアクリルアミドに２−ＭＢＡ（和光純薬工業株式会社）あるいは４−ＭＢＡ（東京化成工業株式会社）を反応させることによって、２−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡを得た。
【００４０】
＝＝ＣＴＢＡの純度検定法＝＝
上記３−ＣＴＢＡについて、重水素化メタノール溶媒に溶解して核磁気共鳴スペクトルを測定した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定は磁場強度１００ＭＨｚで、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定は４００ＭＨｚで行った。その結果、得られた産物が３−ＣＴＢＡであることを確認できた。また、不純物が含まれていないことを確認できた（図１、２）。同様に、２−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡの純度も確認した。
【００４１】
[実施例２]
本実施例では、以下の（１）〜（３）に示すＣＴＢＡ−ＫＬＨを作製した。
（１）２−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
（２）３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
（３）４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨ
【００４２】
＝＝カルボジイミド−サクシニミド法によるＣＴＢＡ−ＫＬＨの調製＝＝
まず、２ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０〜７．５）に２０ｍｇのＫＬＨ(タンパク質濃度＝１０ｍｇ/ｍＬ)を溶解した。一方、３．４ｍｇ（１５μｍｏｌ）の２−ＣＴＢＡ、３−ＣＴＢＡまたは４−ＣＴＢＡを１ｍＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０〜７．５）に溶解し、１５ｍＭのＣＴＢＡ溶液を調製した。ＣＴＢＡ溶液１ｍＬに４．３ｍｇ（３７．５μｍｏｌ）の粉末Ｎ−ヒドロキシサクシニミドを加えて溶解した後、ＣＴＢＡと等ｍｏｌ量（２．９ｍｇ）の粉末カルボジイミド（ＥＤＣ）を加えて溶解した。溶解後、直ちに、上記のＫＬＨ溶液と混合し、室温で２時間反応させた。反応後の溶液を全て回収して透析チューブに入れ、透析外液（ＰＢＳ）を激しく撹拌しながら透析した。この際、透析外液は透析チューブ内液の１００倍量用い、透析開始から３時間後および一晩後にそれぞれ新しい外液に交換した。
【００４３】
このようにして調製したＣＴＢＡ−ＫＬＨについて、１分子のＫＬＨ当たりに結合したＣＴＢＡの分子数を測定した。具体的には、ＣＴＢＡ結合前のＫＬＨと、結合後のＫＬＨについてＢｌａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定した。この濃度を基に、ＣＴＢＡ結合前後のＫＬＨ、およびＣＴＢＡ自体を１ｍｇ／ｍＬに調製し、これらの溶液の紫外吸収スペクトルを測定した。ＣＴＢＡ結合前後のスペクトルの差から、１分子のＫＬＨに結合したＣＴＢＡの分子数を算出した。
【００４４】
その結果、１分子のＫＬＨ(分子量＝７，０００，０００)に対し、２−ＣＴＢＡでは１１０分子、３−ＣＴＢＡでは６５０分子、４−ＣＴＢＡでは５４０分子が結合されていた。従って、３−ＣＴＢＡおよび４−ＣＴＢＡは２−ＣＴＢＡよりも多くの分子がＫＬＨに結合できる。なお、この結果は、２−ＣＴＢＡは３−ＣＴＢＡや４−ＣＴＢＡに比べてベンゼン環上の−ＣＯＯＨ基と−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２の距離が近いため、結合の際の反応が立体障害により阻害されることに起因すると考えられる。
【００４５】
[実施例３]
本実施例では、実施例１で調製した３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨおよび４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨにより動物を免疫した。
【００４６】
＝＝ウサギに対する免疫方法＝＝
３羽のウサギ（日本白色種、オス、１３〜１５週齢）を実施例１の３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨまたは４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨで初回免疫した後、１４日後、２８日後、４２日後、および５６日後に追加免疫を行った。これらのウサギから、初回免疫後３５日後と４９日後に試採血し、さらに６３日後に全採血し、抗血清を得た。
【００４７】
＝＝モルモットに対する免疫方法＝＝
３匹のモルモット（ハートレイ、メス、１２週齢）を実施例１の３−ＣＴＢＡ−ＫＬＨまたは４−ＣＴＢＡ−ＫＬＨで免疫した後、１４日後、２８日後、４２日後、および５６日後に追加免疫を行った。これらのモルモットから、初回免疫後４９日後に試採血し、さらに、６３日後に全採血し、抗血清を得た。
【００４８】
＝＝ＥＬＩＳＡ法による抗体力価測定＝＝
（イムノプレートへのＣＴＢＡの固定化）
実施例１と同様の方法を用い、ＫＬＨをＢＳＡに置き換えることによりＣＴＢＡ−ＢＳＡ（表１参照）を調製した。９６ウェルイムノプレート（MaxiSorp、Nunc社）の各ウェルに５μｇ/ｍＬのＣＴＢＡ−ＢＳＡを１００μＬ加えた後、２時間放置してイムノプレートに結合させた。ＣＴＢＡ−ＢＳＡ溶液をウェルから取り除いて０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略す)で洗浄した。ウェルをＢＳＡでブロッキングした後、ブロッキング液を取り除き、一晩乾燥させた。なお、この工程はすべて室温（約２５℃）で行った。
【表１】
【００４９】
（抗体力価測定）
上記のようにしてＣＴＢＡ−ＢＳＡを固定化したイムノプレートのウェルに、ウサギあるいはモルモットから採取した抗血清の稀釈系列（１０００×２ｎ、ｎ＝０〜７）を添加し、室温で２時間放置した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでウェルを洗浄した。各ウェルに０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡを含有する０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）(以下、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡと略す)により２０００倍稀釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Bio-Rad社）あるいはペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧヤギ抗体（Jackson社）を１００μＬずつ加え、室温で２時間放置した後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次に、各ウェルにペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ（BioFX社）を１００μＬ加えて室温に３０分間放置した後、１Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。この測定値（ＯＤ４５０）を縦軸に、抗血清の稀釈倍率を横軸にとってグラフを作成し、吸光度の最大値（ＯＤ４５０＝３．０）の半値（ＯＤ４５０＝１．５）を与える抗血清稀釈倍率を以て抗体の力価とした。
【００５０】
表２に、ウサギおよびモルモット各３個体から得られた抗血清における抗体力価を示す。
【表２】
【００５１】
[実施例４]
本実施例では、間接競合ＥＬＩＳＡ法によるアクリルアミド測定系を構築した。
【００５２】
実施例２で得られた各抗血清を用いたアクリルアミド測定系を確立するため、まず、イムノプレートに固定化するＣＴＢＡ−ＢＳＡの濃度と抗血清稀釈倍率の最適な組み合わせをチェッカーボード・タイトレーション法によって決定した。
【００５３】
＝＝チェッカーボード・タイトレーション法＝＝
イムノプレートを用いる間接競合ＥＬＩＳＡ法によってＣＴＢＡを定量する場合には、イムノプレートに固定化されたＣＴＢＡ−ＢＳＡの量やウェル中へ添加する抗体量が多いほど抗原検出感度が低くなる。従って、ＣＴＢＡの検出感度を高くするためには、「抗体モル数≦抗原モル数」を満たす範囲で固定化するＣＴＢＡ−ＢＳＡの濃度をできるだけ低くし、かつ、ウェルに添加する抗体濃度をできるだけ低くすることが必要である。そこで、以下のようにＣＴＢＡ−ＢＳＡと抗体稀釈倍率の最適な組合せを設定した。
【００５４】
（チェッカーボード・タイトレーション用イムノプレートの調製）
表１に示した固定化用ＣＴＢＡ−ＢＳＡのタンパク質濃度を、炭酸緩衝液を用いて１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３μｇ／ｍｌに調製し、各１００μＬを９６ウェルイムノプレート（MaxiSorp、Nunc社）のウェルに加え、室温で２時間放置した。続いて、ウェル中のＣＴＢＡ−ＢＳＡを取り除き、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＢＳＡでブロッキングした後、ブロッキング液を取り除いて一晩乾燥させた。このようにして、異なる濃度のＣＴＢＡ−ＢＳＡが固定化されたチェッカーボード・タイトレーション用イムノプレートを調製した。
【００５５】
３−ＣＴＢＡをウサギ１に接種し、４９日目に得られた血清（３−ＣＴＢＡ抗血清）、および、４−ＣＴＢＡをウサギ２に接種し、４９日目に得られた血清（４−ＣＴＢＡ抗血清）（実施例２）の希釈系列を調製し、(１００，０００×３ｎ倍稀釈、ｎ＝０〜１０)、このイムノプレートのウェルに添加した。実施例２の「抗体力価測定」に記載の方法と同様にして、１．５ 付近のＯＤ４５０値を与えることのできる最も低い固定化ＣＴＢＡ−ＢＳＡ濃度と最も高い抗血清稀釈倍率の組み合わせを決定した（表３）。
【表３】
【００５６】
＝＝検量線の作成＝＝
上記３−ＣＴＢＡ抗血清を用いた測定系（３−ＣＴＢＡ測定系）と４−ＣＴＢＡ抗血清を用いた測定系（４−ＣＴＢＡ測定系）によって、ＣＴＢＡあるいはアクリルアミドを標準物質として測定し、検量線を作成した。
【００５７】
（ＣＴＢＡを標準物質として用いた検量線の作成）
実施例１で合成した３−ＣＴＢＡあるいは４−ＣＴＢＡをアクリルアミド換算濃度が０（ブランク）および０．１〜１００，０００ ｎｇ/ｍＬとなるようにＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ（０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ３ （ｐＨ ８．３））に溶解した。これを表３に示す最適濃度の固定化ＣＴＢＡ−ＢＳＡを有するイムノプレートの各ウェルに５０μＬ添加し、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより最適倍率に稀釈した抗血清（表３）を５０μＬ加えた後、室温に２時間放置して抗原抗体反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、各ウェルにＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより２０００倍稀釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体(Bio-Rad社)を加え、室温で１時間放置した。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した後、各ウェルにペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ(BioFX社)溶液を１００μＬ加え３０分間室温で反応させた後、１Ｎ硫酸を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。なお、この測定は三重測定で行った。
【００５８】
このようにして得られた吸光度（ＯＤ４５０）の測定値を用い、以下のようにして検量線を作成した。まず、アクリルアミド換算濃度がゼロの時(ブランク)のＯＤ４５０を１００％とし、各アクリルアミド換算濃度について得られたＯＤ４５０を％表示した値（Ｂ/Ｂ０）をＹ軸にとり、アクリルアミド標準液の濃度（ｎｇ/ｍＬ）をＸ軸にとって片対数プロットした。このプロットに対し、４−パラメータロジスティック関数Y(=B/B0)=[(a-d)/{1+(X/c)b}]+dによるカーブフィッティングを行って曲線式を得た。
ここで、
a: B/B0の最大値（アクリルアミド換算濃度がゼロの時のB/B0）
b: 変曲点（IC50）における曲線の傾き
c: 変曲点のアクリルアミド濃度（=IC50）
d: B/B0の最小値（アクリルアミド濃度が無限大の時のB/B0）
Y: B/B0
X: 濃度既知アクリアミド標準液の濃度
【００５９】
次に、得られた曲線式Y(=B/B0)=[(a-d)/{1+(X/c)b}]+dを標準化した曲線式Y’(=(B/B0)’) =1/{1+(X/c)b}に変換し、これを検量線（x軸：X，y軸：Y'）とした。ここで、B/B0と (B/B0)’ の関係は、<標準化したB/B0=(B/B0)’={(B/B0)-d}/(a-d)>である。
【００６０】
合成３−ＣＴＢＡおよび合成４−ＣＴＢＡを標準物質として、免疫に用いたウサギ個体別に３−ＣＴＢＡ測定系および４−ＣＴＢＡ測定系の検量線を作成した。一例として、それぞれ最も感度の高かった個体の検量線を対比して図３に示すが、３−ＣＴＢＡ測定系の検量線では４−ＣＴＢＡ測定系に比較して、標準物質濃度の増減に対するY'値の増減が大きかった。このように、３−ＣＴＢＡ測定系では４−ＣＴＢＡ測定系に比較して、ＣＴＢＡの濃度の変化をより高感度で検出できる。
【００６１】
（アクリルアミドを標準物質として用いた検量線の作成）
ＣＴＢＡを標準物質とした場合に検出感度がより高い３−ＣＴＢＡ測定系についてアクリルアミドを標準物質として用いてアクリルアミド検量線を作成した。抗血清は、合成３−ＣＴＢＡを標準物質として用いた場合に最も感度の良かったウサギ１のものを用い、三重測定で行った。
【００６２】
試験管に濃度が０および０．６９〜５００ｎｇ/ｍＬのアクリルアミド標準水溶液（１００μＬ）（関東化学株式会社）を入れておき、２０μＬの３−ＭＢＡ溶液（１Ｎ ＮａＯＨ中に３−ＭＢＡ（Toronto Research Chemicals社）を４８ｍｇ/ｍＬの濃度に溶解して調製）を添加した後、３７℃で２時間反応させ、アクリルアミドを３−ＣＴＢＡに変換した。次に、各試験管にＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌを８８０μＬ加えて測定用試料溶液を調製した。
【００６３】
チェッカーボード・タイトレーションにより決定した最適濃度の３−ＣＴＢＡ−ＢＳＡを固定化したイムノプレートの各ウェルへ上記の測定用サンプル溶液を５０μＬ加えた。ここに、ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌにより最適組合せ稀釈倍率に稀釈した抗血清を５０μＬ加え、室温で１時間放置して抗原抗体反応させた。各ウェルをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ）で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ−ＢＳＡにより１０００倍希釈、Bio-Rad社）を加え、室温で３０分放置した。ウェルをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ (BioFX社)溶液を１００μＬ加え、室温で３０分間反応させた。続いて、各ウェルに１Ｎ硫酸を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
【００６４】
このようにして得た吸光度（ＯＤ４５０）の測定値を用い、ＣＴＢＡを標準物質とした時と同様にして検量線を作成した（図４）。
【００６５】
３−ＣＴＢＡを標準物質とした場合とアクリルアミドを標準物質とした場合の検量線について、横軸のアクリルアミド濃度をそろえて比較したグラフを図５に示す。どちらの標準物質を用いた場合でも同様の検量線が得られた。この結果により、３７℃で２時間反応させることにより、アクリルアミドが定量的にＣＴＢＡに変換されることが確認された。
【００６６】
なお、図３と図４を比較すると、見かけ上、アクリルアミドを標準物質として用いた検量線は３−ＣＴＢＡを標準物質として用いた検量線に比べて感度が約１/１０であるかのように見える。これは、アクリルアミドを標準物質とした場合に測定用試料調製の段階でアクリルアミド溶液が１０倍に希釈されているためである。
【００６７】
＝＝検出下限値の算出＝＝
アクリルアミドを標準物質として作成した検量線を用いて、アクリルアミドの検出下限値をISO 11843-5:2008(E)（Capability of detection; Part 5: Methodology in the linear and non-linear calibration cases）に記載の方法によって求めた。ISO 11843-5:2008(E)によれば、検量線作成に用いた測定値に関して、アクリルアミド濃度がゼロの時(ブランク)の(B/B0)’の相対標準偏差（ＲＳＤ; relative standard deviation）を、定数１３．２で除した値を勾配とする直線により検量線Y’(=(B/B0)’)=1/{1+(X/c)b}に対して接線を引き、接点のX座標を検出下限値とする。計算の結果、図４に示すように、検出下限値は０．４ｎｇ/ｍＬ付近であった。
【００６８】
＝＝アクリルアミド定量値の誤差プロファイル＝＝
３−ＣＴＢＡ測定系と４−ＣＴＢＡ測定系のうちでより検出感度の高い３−ＣＴＢＡ測定系について定量値のＲＳＤを算出し、アクリルアミド定量値の誤差プロファイルを求めた（図６）。定量値のＲＳＤは、アクリルアミド検量線の各濃度における(B/B0)’のＲＳＤ（ｎ＝３）をそのアクリルアミド濃度における検量線の勾配で割ることにより得られる。
【００６９】
図４に示すように、検出下限値（定義はＲＳＤ＝３０％）を与えるアクリルアミド濃度は０．６ｎｇ/ｍＬ付近であり、ISO 11843-5:2008(E)で算出された検出下限値とよく一致していた。一方、アクリルアミドの定量範囲（定義はＲＳＤ≦１０％の範囲）は、２〜５００ｎｇ/ｍＬの範囲である。
【００７０】
このように、実施例２で製造された抗体を用いたアクリルアミド測定系が構築できた。このアクリルアミド測定系は検出下限値が約０．４ｎｇ/ｍＬ、かつ、定量域が２〜５００ｎｇ/ｍＬの優れた測定系である。
【００７１】
[実施例５]
本実施例では、実施例３で構築したアクリルアミド測定系では、アクリルアミド構造類似体の交差反応性が低いことを示す。
【００７２】
実施例３で構築したアクリルアミド測定系によって、アクリルアミド（関東化学株式会社）、メタクリルアミド（MP Bio 社）、アクリロニトリル（AccuStandard Inc.）、アクリル酸(ナカライテスク社)、マレイン酸(ナカライテスク社)およびマレアミド酸（FRINTON LABORATORIES Inc.）を測定し、縦軸にＢ/Ｂ０、横軸に構造類似体のモル濃度をとったグラフを作成した。この結果を図７に示す。
【００７３】
各構造類似体についてＢ/Ｂ０＝５０％のモル濃度を読み取り、この濃度をＩＣ５０とした。ＩＣ５０の逆数はこの測定系における構造類似体の相対的な反応性を表すため、アクリルアミドの１/ＩＣ５０を１００％として構造類似体の交差反応率を計算することができる。このようにして求めた交差反応率を表４に示す。
【表４】
【００７４】
表４に示すように、最も交差反応率が高いアクリロニトリルでも交差反応率は１．４３％であった。この結果は、抗ＣＴＢＡ抗体を用いたアクリルアミド測定系により、アクリルアミドを特異的に検出または測定できることを示している。
【００７５】
[実施例６]
本実施例では、実施例３で構築したアクリルアミド測定系により食品試料中のアクリルアミドが測定できること、および、その信頼性が十分に高いことを示す。
【００７６】
種々の食品（ポテトチップス１〜６（１、２はアクリルアミドを添加した市販品、３〜６は市販品）、ビスケット、かりんとう、ほうじ茶）中に含まれるアクリルアミドを文献（Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi Vol.49,N0.12,822-825(2002)）に従って測定試料を調製した。具体的には、まず、粉砕した各食品試料２ｇを１００ｍＬの純水に加え、ホモジナイズした。これを遠心分離した後にろ過し、上清１ｍＬをＩＳＯＬＵＴＥ(Biotage 社)５００ｍｇに通して溶出してくる液を捨て、更に３ｍＬの水を通して溶出させた３ｍＬを取って３-ＣＴＢＡ調製用試料とした（コンディショニング：メタノール３ｍＬ通液、水３ｍＬ通液）。
【００７７】
＝＝３−ＣＴＢＡ測定系（ＥＬＩＳＡ法）による測定＝＝
固相抽出後の試料１００μＬに１００μＬの３−ＭＢＡ（１Ｎ ＮａＯＨ中に３−ＭＢＡ（Toronto Research Chemicals社）を４８ｍｇ/ｍＬの濃度に溶解して調製）を添加し、３７℃で２時間反応させて３−ＣＴＢＡに変換した後、８８０μＬのＮａＨＣＯ３−Ｔｗｅｅｎ−ＮａＣｌ加えて測定試料とした。３−ＣＴＢＡ試料を、実施例４の「検量線の作成」の記載に従い測定した。
【００７８】
＝＝ＬＣ／ＭＳ機器分析による測定＝＝
固相抽出後の試料を２０μＬに調製し、ＨＰ１１００ ＬＣ／ＭＳシステム（アジレントテクノロジー株式会社）による機器分析に供した。分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｃ１８カラム（Zorbax Eclipse XDB C18 4.6mm x 150mm）
溶媒：８％アセトニトリル−水
流速：０．４５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０ ℃
ＭＳＤ：
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍ／ｚ ７２
Ｄｒｙ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ：１１ Ｌ/ｍｉｎ
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ： ４０ ｐｓｉｇ
Ｄｒｙ Ｇａｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ３００ ℃
【００７９】
測定結果を表５に示す。
【表５】
【００８０】
３−ＣＴＢＡ測定系による測定値を縦軸にとり、ＬＣ/ＭＳ機器分析による測定値を横軸にとってプロットし、回帰直線を引いて両測定値の相関性を検討した結果、両者は決定係数Ｒ２＝０．９９のよい一致を示した。この結果を図８に示した。
【００８１】
図８に示すように、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を用いたアクリルアミド測定系による測定結果は従来の機器分析法による測定結果とよく一致し、十分に信頼性が高い。このように、本発明に係る抗ＣＴＢＡ抗体を用いる測定系により食品試料中のアクリルアミドを正確に測定することができる。機器分析法と比較しても、本アクリルアミド測定系は迅速、簡便、かつ安価に行えるため、食品中のアクリルアミド低減に向けた取り組みも容易となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸（ＣＴＢＡ）とスカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）との複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の複合体であって、
前記ＣＴＢＡが３−ＣＴＢＡ(３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)、または４−ＣＴＢＡ(４−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸) であることを特徴とする複合体。
【請求項３】
ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法であって、
請求項１または２に記載の複合体を非ヒト動物に免疫する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出試薬の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出器の製造方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出キットの製造方法。
【請求項１】
[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸（ＣＴＢＡ）とスカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）との複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の複合体であって、
前記ＣＴＢＡが３−ＣＴＢＡ(３−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸)、または４−ＣＴＢＡ(４−[(２−カルバモイルエチル)チオ]安息香酸) であることを特徴とする複合体。
【請求項３】
ＣＴＢＡに特異的な抗体の製造方法であって、
請求項１または２に記載の複合体を非ヒト動物に免疫する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出試薬の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と、
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出器の製造方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法でＣＴＢＡに特異的な抗体を製造する工程と
製造された前記抗体を含有させる工程と、を含む、アクリルアミド検出キットの製造方法。
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１９５４５３（Ｐ２０１１−１９５４５３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４５７５７（Ｐ２０１０−４５７５７）
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
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