所定の開示される本発明の実施形態は、免疫グロブリンへの合成、誘導体化、共役、および複数の対象分子と反応する複数の反応性官能基を有する離散的な比較的短いポリマーに基づく信号増幅に関する。ヒドラジド等の反応性官能基は、種々の検出可能な標識、特にハプテンで誘導体化される。残りの反応性官能基は、抗体のＦｃ領域の酸化糖質等の特異的結合分子に直接共役され得る。開示される共役体は、単一のハプテンで誘導体化される分子に基づくものと比較して、大きい信号増幅を示し、かつ分析方法、特に多重分析に有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子共役体を作製するための方法であって、ポリマー担体によって提供される反応性官能基を介して、特異的結合分子を検出可能な標識に連結するステップを含み、前記反応性官能基は、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、グアニジン、アミノグアニジン、ヒドロキシルアミン、またはそれらの組み合わせから選択される、方法。
【請求項２】
前記ポリマー担体は、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、多糖類、ポリエチレン−ａｌｔ−マレイン酸、ポリアミノ酸またはポリビニルピロリドンから選択されるポリマー部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー担体は、ポリアクリルアミドヒドラジドまたはポリビニルピロリドンヒドラジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー担体は、平均分子量１０，０００以下のポリアクリルアミドヒドラジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリアクリルアミドヒドラジドは、非チオール化される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記特異的結合分子は、アビジン、抗体、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはアプタマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記特異的結合分子は抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的結合分子を前記反応性官能基の少なくとも一部に連結することによって、第１の化合物を作製するステップと、
前記第１の化合物の残りの反応性官能基の少なくとも一部を前記検出可能な標識に連結するステップと、を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な標識を前記反応性官能基の少なくとも一部に連結することによって、第１の化合物を作製するステップと、
前記第１の化合物の残りの反応性官能基の少なくとも一部を前記特異的結合分子に連結するステップと、を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
反応性ヒドラジド官能基を介して、前記ポリマー担体を前記抗体のＦｃ部分に連結するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
反応性官能基との反応のために、前記抗体を活性化するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体のグリコシル化部分を化学的に修飾するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能な標識は、酵素、フルオロフォア、ルミノフォア、ハプテン、蛍光ナノ粒子、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハプテンは、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ジニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、またはベンゾジアゼピン、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハプテンは、ＮＨＳ−ＰＥＧリンカーを使用して、前記反応性官能基を介して、前記特異的結合分子に連結される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識はハプテンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
複数の異なるハプテンは、前記ポリマー担体に連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第３の分子を前記反応性官能基のうちの少なくとも１つと反応させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗体のＦｃ部分を酸化して、酸化Ｆｃ部分を作製するステップと、
少なくとも１つの反応性ヒドラジド官能基を介して、前記ポリマー担体を前記抗体の前記酸化Ｆｃ部分に連結して、第１の化合物を作製するステップと、
反応性ヒドラジド官能基を介して、前記第１の化合物を少なくとも１つのハプテンに連結して、第２の化合物を作製するステップと、を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハプテンは、ＮＨＳ−ＰＥＧリンカーを使用して、反応性ヒドラジド官能基を介して前記特異的結合分子に連結される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の化合物を複数のハプテンに連結するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の化合物を複数の異なるハプテンに連結するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記多糖類は、糖質、セルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、アミドデキストラン、ヒドラジドデキストラン、ヒドラジンデキストラン、グリコーゲン、ポリヒアルロン酸、およびデンプンから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリアミノ酸は、ポリ（アスパラギン）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（グアニジン）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の共役体。
【請求項２６】
前記分子共役体は、ポリハプテニル化共役体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法に従って産生される共役体。
【請求項２８】
ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、グアニジン、アミノグアニジン、ヒドロキシルアミン、またはそれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つの反応性官能基を含む、ポリマーリンカーによって提供される、反応性官能基を介して検出可能な標識に共有結合された特異的結合分子を含む、共役体。
【請求項２９】
前記ポリマーリンカーは、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、多糖類、ポリエチレン−ａｌｔ−マレイン酸、ポリアミノ酸またはポリビニルピロリドンから選択されるポリマー部分を含み、前記ポリマー部分は、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、グアニジン、アミノグアニジン、ヒドロキシルアミン、またはそれらの組み合わせから選択される複数の反応性官能基を含む、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３０】
前記ポリマーリンカーは、ポリアクリルアミドまたはポリビニルピロリドン部分を含む、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３１】
前記特異的結合分子は、アビジン、抗体、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはアプタマーである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３２】
前記特異的結合分子は抗体である、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３３】
前記ポリマーリンカーは、ＰＥＧベースのヒドラジドリンカーである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３４】
前記検出可能な標識は、酵素、フルオロフォア、ルミノホル、ハプテン、蛍光ナノ粒子、またはそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３５】
前記検出可能な標識は、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせから選択されるハプテンである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３６】
前記検出可能な標識は、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ジニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、またはそれらの組み合わせから選択されるハプテンである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３７】
前記ポリマーリンカーは、複数のヒドラジド官能基を有する、すなわち、ヒドラジド基を介して、抗体の酸化Ｆｃ部分および少なくとも１つの検出可能な標識に連結される、ポリアクリルアミドヒドラジドである、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３８】
ポリハプテニル化共役体を含む、請求項２８に記載の共役体。
【請求項３９】
前記多糖類は、糖質、セルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、アミドデキストラン、ヒドラジドデキストラン、ヒドラジンデキストラン、グリコーゲン、ポリヒアルロン酸およびデンプンから選択される、請求項２９に記載の共役体。
【請求項４０】
前記ポリアミノ酸は、ポリ（アスパラギン）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（グルタミン）、ポリ（リシン）、ポリ（グアニジン）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２９に記載の共役体。
【請求項４１】
前記分子共役体は、ポリハプテニル化共役体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
試料における標的に対して診断分析を行うための方法であって、
前記試料を、標的に特異的に結合する特異的結合分子と接触させるステップであって、前記特異的結合分子は、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、グアニジン、アミノグアニジン、ヒドロキシルアミン、またはそれらの組み合わせから選択される複数の反応性官能基を含むポリマーリンカーを介して、検出可能な標識に共役されるステップと、
前記検出可能な標識を使用する前記標識に結合される前記特異的結合分子を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項４３】
前記ポリマーリンカーは、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、多糖類、ポリエチレン−ａｌｔ−マレイン酸、ポリアミノ酸、またはポリビニルピロリドンから選択されるポリマー部分を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリマーリンカーは、ポリアクリルアミドヒドラジドまたはポリビニルピロリドンヒドラジドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記特異的結合分子は、アビジン、抗体、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはアプタマーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記特異的結合分子は抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能な標識は、酵素、フルオロフォア、ルミノホル、ハプテン、蛍光ナノ粒子、またはそれらの組み合わせである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記検出可能な標識はハプテンであり、前記方法は、前記試料を抗ハプテンと接触させるステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記ハプテンは、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ジニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記特異的結合分子は、分子量１０，０００以下であって、複数の反応性ヒドラジド官能基を含む非チオール化ポリアクリルアミドヒドラジド担体によって、検出可能な標識に共役される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記分析は、試料における２つ以上の異なる標的に対する多重診断分析であって、
前記試料を、２つ以上の異なる標的に特異的に結合する２つ以上の特異的結合分子と接触させるステップであって、前記２つ以上の特異的結合分子は、前記ポリマーリンカーの反応性官能基を介して、異なるハプテンに共役されるステップと、
前記試料を、個別に検出され得る２つ以上の異なる抗ハプテンと接触させるステップと、を含む、
請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料を抗抗体抗体と接触させるステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記多糖類は、糖質、セルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、アミドデキストラン、ヒドラジドデキストラン、ヒドラジンデキストラン、グリコーゲン、ポリヒアルロン酸およびデンプンから選択される、
請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリアミノ酸は、ポリ（アルギニン）、ポリ（アスパラギン）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（グルタミン）、およびポリ（リシン）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記特異的結合分子は、酸化Ｆｃ部分を含む抗体であり、前記ポリマーリンカーは、反応性官能基を介して、前記酸化Ｆｃ部分に連結される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記ハプテンは、ＮＨＳ−ＰＥＧリンカーを使用して、前記ポリマー担体の反応性官能基を介して、前記特異的結合分子に連結される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
複数の異なるハプテンは、前記ポリマーリンカーに連結される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５９】
前記特異的結合分子は抗体であり、前記方法は、
前記試料を、２つ以上の一次抗体と接触させるステップであって、前記一次抗体のそれぞれは、異なるハプテンに共役されるステップと、
前記試料を、２つ以上の二次抗ハプテン抗体と接触させるステップであって、前記二次抗ハプテン抗体のそれぞれは、異なる量子ドットに共役されるステップと、を含む、
請求項４２に記載の方法。

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図１】

【図２】

【図７】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２０１０−５２８２８５（Ｐ２０１０−５２８２８５Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９３９１（Ｐ２０１０−５０９３９１）
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６５９１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３７４４
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５９９０７５０７０）ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド (31)