免疫蛋白質の産生促進剤
【課題】免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質産生促進剤は、柑橘類の果皮抽出物を含有するものであり、当該果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲルカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する活性物質を含むものである。上記活性物質は、分子量が約３７８および約２８０の、二種類の物質を少なくとも含有する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質産生促進剤は、柑橘類の果皮抽出物を含有するものであり、当該果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲルカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する活性物質を含むものである。上記活性物質は、分子量が約３７８および約２８０の、二種類の物質を少なくとも含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類の果皮抽出物を含有する免疫蛋白質産生促進剤に関し、詳細には、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリンなどの免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、種々の技術を開示している。例えば特許文献１には、柑橘類果皮の抽出液中に多く含まれるβ−クリプトキサンチンおよびオーラプテンが、免疫蛋白質の産生促進剤として有用であることを開示している。
【０００３】
また、特許文献２には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を促進する活性を有することを開示している。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１１６７３５号公報
【特許文献２】特開平６−９８７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、柑橘類の果皮抽出物を含有する免疫蛋白質産生促進剤であって、前記抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル逆相カラム（ＯＤＳ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）により、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分にカラムから溶出する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有するところに要旨を有するものである。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、上記抽出物として、上記エタノール抽出液のうちヘキサンに溶解するものを主に含有する抽出物を用いるものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【０００９】
本発明に用いられる抽出物は、柑橘類の果皮を原材料として得られるため、安全であり、当該抽出物を用いた飼料組成物は、例えば養殖魚などの魚類に広範囲に感染する魚病原菌やウイルスから、魚類を安全且つ有効に、予防または治療し得る魚類の感染防止剤としての使用が大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その１）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図１（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図１（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図２】図２は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その２）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図２（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図２（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図３】図３は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その３）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図３（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図３（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図４】図４は、活性物質Ａの質量分析結果を示す図である。
【図５】図５は、活性物質Ｂの質量分析結果を示す図である。
【図６】図６は、参考実験におけるＨＰＬＣの結果を示す図であり、図６（ａ）は、果皮抽出液の結果を、図６（ｂ）は果皮抽出液＋β−クリプトキサンチン（β−ＣＲＰ）の結果を、それぞれ示す。
【図７】図７は、実施例２におけるヒラメ滑走細菌症に対する確認実験の結果を示す図であり、図７（ａ）は治療効果の結果を、図７（ｂ）は予防効果の結果を、それぞれ示す。
【図８】図８は、実施例３におけるブリ類結節症に対する確認実験の結果を示す図であり、図８（ａ）は低濃度感染群における治療効果の結果を、図８（ｂ）は低濃度感染群における予防効果の結果を、図８（ｃ）は高濃度感染菌群における予防効果の結果を、それぞれ示す。
【図９】図９（ａ）は、実施例１で用いたエタノール抽出液のＴＬＣによる分画結果を示す図であり、図９（ｂ）は、サンプル濃度を種々変化させたときのＩｇＭ産生量の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１で用いたエタノール抽出液、および柑橘類に含まれる種々の物質における、ＴＬＣによる分画結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例４における、マダイＲＳＩＶウイルスに対する予防効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、柑橘類の果皮抽出液には、前述した特許文献１に記載の成分（β−クリプトキサンチンおよびオーラプテン）とも異なる、新規な活性成分が含まれており、当該活性成分を含む抽出物（詳細には、エタノール抽出後、逆相ＨＰＬＣを行なったとき、所定の画分に出現する活性物質を含む抽出物；以下、単に「本発明に用いられる柑橘類の果皮抽出物」で代表させる場合がある。）が、優れた免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
詳細には、本発明に用いられる柑橘類の果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有するところに特徴がある。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【００１３】
上述した柑橘類の果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出したエタノール抽出液のうち、ヘキサンに溶解するものを主に含有するものである。この点で、ヘキサンに溶解しない、β−クリプトキサンチンおよびオーラプテンとは、明瞭に相違している。このことは、例えば、後記する図１、図６、図１０の結果などからも確認することができる。
【００１４】
以下、抽出工程を詳しく説明する。
【００１５】
まず、柑橘類の果皮に対し、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどの有機溶媒（低極性溶媒）を加え、約４〜３０℃の温度で、約１２〜４８時間抽出して抽出液を得る。
【００１６】
詳細には、柑橘類の果皮乾燥物１００質量部に対し、上記有機溶媒を、約２００〜６００質量部の割合で加えることが好ましい。後記する実施例では、温州ミカンの果皮乾燥物５ｇに１００％エタノール２５ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不溶物を除去して回収した抽出液を用いた。
【００１７】
本発明に用いられる柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。このうち好ましいのは、温州ミカン、夏みかん、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーであり、より好ましくは温州ミカンである。
【００１８】
本発明では、上記柑橘類の果皮を用いるが、本発明の作用を損なわない範囲で、果皮のほか果肉を用いることもできる。但し、本発明の作用を有効に発揮させるためには、果皮のみを用いることが好ましい。具体的には、上記柑橘類の果皮（本発明の作用を損なわない範囲で果肉を含む）を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、上記の抽出処理を行なうことが好ましい。
【００１９】
次に、上記のようにして得られた抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル逆相カラム（ＯＤＳ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、前述した条件で分画する。本発明の免疫蛋白質産生促進剤に用いられるのは、このようにして得られた各画分（フラクション）のうち、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分であり、本発明は、当該画分中に、所望とする作用効果を発揮し得る有効成分（活性物質本体を含む活性成分）が含まれることを突き止めたところに特徴がある。
【００２０】
詳細には、上記画分中には、少なくとも二種類の活性物質を含有しており、液体クロマトグラフ質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）により測定した分子量（数平均分子量）は、それぞれ、約２８０および約３７８である。
【００２１】
以下、説明の便宜上、分子量が約２８０の活性物質を活性物質Ａと呼び、分子量が約３７８の活性物質を活性物質Ｂと呼ぶ。これら活性物質ＡおよびＢの同定方法は、後記する実施例の欄で詳述する。
【００２２】
これらのうち活性物質Ａは、後記する図３（ａ）に示すＨＰＬＣチャートの「３」成分（＝図３（ｂ）のＰ３成分）に相当し、液体クロマトグラフ質量分析により分子量を算出すると、分子量は２８０．２２５７であった（図４を参照）。すなわち、図４に示すプロファイルにおいて、一番高いピーク上の数字（２７９．２２５７）に１を足した値が、活性物質Ａの分子量になる。活性物質Ａの詳細な構造は不明であるが、炭化水素の直鎖構造を有し、炭素の二重結合が２つ以上あり、酸素原子は含まない構造であることがわかる。
【００２３】
一方、活性物質Ｂは、後記する図３（ａ）に示すＨＰＬＣチャートの「６」成分（＝図３（ｂ）のＰ６成分）に相当し、液体クロマトグラフ質量分析により分子量を算出すると、分子量は３７８．２８４２であった(図５を参照)。すなわち、図５に示すプロファイルにおいて、一番高いピーク上の数字（３７９．２８４２）から１を引いた値が、活性物質Ｂの分子量になる。活性物質Ｂの詳細な構造は不明であるが、炭化水素の直鎖構造を有しており、炭素の二重結合も有しているが、ベンゼン環などの芳香環は含まない。酸素原子は有していても良い。
【００２４】
上記の構造解析結果より、上記活性物質ＡおよびＢは、少なくとも前述した特許文献１に記載のヘスペリジン（フラボノイドの一種）でないことが確認された。また、柑橘類果皮のエタノール抽出物中に多く含まれるノビレチン（フラボノイドの一種）、リコペン（フラボノイドの一種）、β−カロテン（カロテノイドの一種）、リモネン（単環式モノテルペノイドの一種）でないことが判明した。このことは、後記する図１０でも実証している（詳細は後述する）。
【００２５】
上記のほか、本発明者らの更なる実験結果によれば、以下のことが判明した。
【００２６】
（ア）後記する実施例で用いた、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの）に等量のヘキサンを加え、ヘキサン相を薄膜クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）で分画した（展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合溶媒を使用）ところ、図９（ｂ）に示すように、図９（ａ）の上方スポットに活性が認められた。よって、上記活性物質ＡおよびＢを含む本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、エタノール抽出後、ヘキサンで抽出されるものであることが判明した。
【００２７】
図９（ａ）の上方スポット部分に、活性物質ＡおよびＢを含む活性成分が存在することは、図９（ｂ）より確認している。すなわち、上記の上方スポット部分を採取し、その成分をエタノールに溶解した後、図９（ｂ）に示す様々な濃度となるようにエタノールで希釈して各サンプルを調製し、後記する実施例に記載の方法でＩｇＭ産生量を測定した。比較のため、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの、図９（ｂ）では「粗抽出物」と記載）についても、上記と同様にしてＩｇＭ量を測定すると共に、溶媒（エタノール、図９（ｂ）では「コントロール」と記載）中のＩｇＭ産生量も測定した。
【００２８】
これらの結果を図９（ｂ）に示す。図９（ｂ）に示すように、上方スポットの画分は、粗抽出物に比べ、高いＩｇＭ産生促進作用を有する傾向が見られた。
【００２９】
（イ）また、上述した実験結果（活性物質ＡおよびＢを含む本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、エタノール抽出後、ヘキサンに移行するものであること）は、上記活性成分ＡおよびＢが、柑橘類に代表的に含まれるβ−クリプトキサンチン（カロテノイド類の一種）や、オーラプテン（クマリン類の一種）とも異なることを間接的に意味するものである。β−クリプトキサンチンやオーラプテンは、或る程度の極性を有するため、エタノール抽出後、ヘキサン相には移行しないからである。
【００３０】
このことは、図１０の結果からも確認することができる。図１０は、上記図９（ａ）において、柑橘類果皮中に含まれることが知られている種々の物質（図１０中、２〜７に記載の各物質）について、同様のＴＬＣによる分画を行なったときの結果を示すものである。図１０より、本発明の活性物質は、ノビレチン、ヘスペリジン、リコペン、β−クリプトキサンチン、β−カロテン、リモネンとは全く異なる挙動を示すことが分かる。
【００３１】
以上の実験結果より、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物中に含まれ、本発明の作用効果を発揮し得る活性物質ＡおよびＢは、その詳細な構造は不明であるが、上述した種々の解析結果（質量分析、ＴＬＣによる移動度の比較、ＨＰＬＣなど）によれば、少なくとも、これまでに報告されている柑橘類果皮に含まれる成分（ヘスペリジン、ノビレチン、リコペン、β−カロテン、リモネン、β−クリプトキサンチン、オーラプテン）とは異なることが充分裏付けられる。
【００３２】
次に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物による作用効果について説明する。上記の活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有するものは、免疫蛋白質の産生促進剤として好適に用いることができる。
【００３３】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＴＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００３４】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００３５】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物（厳密には、上記活性物質ＡおよびＢを、活性成分として含む画分）のみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００３６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００３７】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３８】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良い。
【００３９】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、ブリ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメ、マハタなどの魚類・甲殻類などが代表的に例示される。
【００４０】
本発明によれば、上記免疫蛋白質の産生促進剤を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進することができる。具体的な方法は、例えば、前述した特許文献１に記載の方法を参照することができる。
【００４１】
すなわち、本発明では、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物の存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（後記する免疫蛋白質産生細胞）を培養すれば、当該抽出物を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００４２】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００４３】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００４４】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含有する培地中で培養する。
【００４５】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００４６】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００４７】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００４８】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含むもの）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０4〜５×１０5ｃｅｌｌｓである場合、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４９】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００５０】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００５１】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００５２】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００５３】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【００５４】
更に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含むものは、上述した免疫蛋白質の産生促進剤として好適に用いられる他、魚病の感染予防剤または感染治療剤（以下、これらをまとめて、感染防除剤と呼ぶ場合がある。）としても好適に用いられ得ることが大いに期待される。後記する実施例では、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの）における、魚病の感染予防効果および感染治療効果を確認したが、これらの実験結果は、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物が、魚病の感染予防効果および感染治療効果を発揮することを、充分示唆するものである。
【００５５】
このような作用効果を有効に発揮させるための魚類への投与量は、使用する柑橘類の種類や抽出条件、感染した魚類の種類、感染症の種類、感染症状の程度などによっても相違するが、おおむね、柑橘類果皮１００ｇを５００ｍＬのエタノールで抽出したエタノール抽出液を、魚類の体重１ｋｇ当たり、おおむね、５０〜５，０００ｍｇ／ｋｇ魚類体重／日となるように投与することが好ましい。
【００５６】
また、上記柑橘類果皮抽出物への魚類への投与手段（給餌方法）は特に限定されず、飼料に直接混入して飼料組成物の形態で投与しても良いし、飼育水中に直接混入して投与しても良い。
【００５７】
本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、細菌性魚病のほか、ウイルス性魚病の感染予防または感染治療に好適に用いられる。
【００５８】
細菌性魚病としては、例えば、滑走細菌症や類結節症などが挙げられる。これらは、養殖魚などに毎年大きな被害を出している代表的な感染症であり、死亡率も高く、現状では抗生物質による治療に頼っているのが実情である。
【００５９】
このうち滑走細菌症は、滑走細菌（Flexibacter maritimus)によって引き起こされる感染症であり、ヒラメ、タイ、ブリ、サケ科の魚類で被害が報告されている。症状としては、稚魚では口唇部や尾ひれに糜爛（びらん）、壊死、崩壊などがみられ、幼魚や成魚では頭部、躯幹、ひれ、えらなどに発赤や出血、ときには潰瘍がみられる。
【００６０】
また、類結節症は、類結節症原因菌（Photobacterium damuselae subsp. piscicida）によって引き起こされる感染症であり、ブリ、カンパチ、マダイ、ヒラメなどに発病する感染症である。近年の養殖魚種の拡大に伴い、類結節症原因菌による感染症は広がりつつあり、感染後の死亡率はほぼ１００％である。
【００６１】
また、ウイルス性魚病としては、例えば、イリドウイルスによる感染症が挙げられる。ウイルスによる感染は、細菌による感染に比べ、感染の伝播および病気の進行が格段に速く、大量死を招く恐れがあるなど深刻な被害をもたらすにもかかわらず、有効な防除手段がないのが現状であるが、特に、マダイイリドウイルスによる感染は、海産養殖魚に甚大な被害をもたらしたことが報告されており、大きな社会問題となっている。
【００６２】
後記する実施例では、代表的に上記３種類の魚病に対する予防作用および治療作用を確認したが、適用可能な感染症の種類は上記に限定されない。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６４】
実施例１：本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物の同定方法、および免疫蛋白質産生促進作用の検討
（エタノール抽出液の調製）
温州ミカンの果皮のみを乾燥させた果皮乾燥物５ｇに１００％エタノール２５ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不純物を除去し、エタノール抽出液を得た。
【００６５】
（ＨＰＬＣによる分画その１）
次いで上記のエタノール抽出液を、下記条件で逆相ＨＰＬＣに付した結果、図１（ａ）のチャートが得られた。
カラム：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬ Ｐａｃｋ Ｃ18 ５μｍ）ＯＤＳカラム（４．６ｍｍＩＤ（内径）×１５０ｍｍカラム長）
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度ＯＤ（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（ＡｃＮ、２０％→１００％）
溶出条件：図１（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％
（２）１０〜５０分：２０％→１００％
（３）５０〜９０分：１００％
【００６６】
次に、１０分ごとに得られる溶出液［図１（ａ）の横軸における、フラクションＦ１〜Ｆ９］を分画し、それらが、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を、以下の実験方法で検討した。
【００６７】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、上記の各画分を、それぞれ１％の濃度となるように添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６８】
比較のため、上記画分の代わりにエタノールを添加して上記と同様の培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した（対照群、図１（ｂ）では「Ｃｏｎｔ．」と記載）。
【００６９】
更に参考のため、ＨＰＬＣに付す前の、エタノール抽出液を添加して上記と同様の培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した（図１（ｂ）では「Ｅｘｔｒａｃｔ」と記載）。
【００７０】
これらの結果を図１（ｂ）に示す。
【００７１】
また、図１（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒１．８ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図１（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００７２】
図１（ｂ）に示すように、フラクションＦ４〜Ｆ６では、対照群の平均値を遥かに超える量のＩｇＭ産生量が認められた。これに対し、他のフラクションでは、対照群とほぼ同程度のＩｇＭ産生量しか見られなかった。
【００７３】
なお、保持時間の結果から、フラクションＦ８にはβ−クリプトキサンチン（β−ＣＲＰ）が溶出していると考えられるが、図１（ｂ）に示すように、対照群と同程度のＩｇＭ産生量しか認められなかった。これは、Ｆ８中に含まれるβ−クリプトキサンチンの量が極く少量であり、ＩｇＭ産生活性を示す程の濃度でなかったためと推察される。
【００７４】
以上の実験結果から、柑橘類果皮のエタノール抽出液中における、免疫蛋白質産生促進作用を示す活性物質本体（免疫促進物質の主体）は、上述したフラクションＦ４〜Ｆ６に含まれることが確認された。
【００７５】
（ＨＰＬＣによる分画その２）
上記のフラクションＦ４〜Ｆ６は、アセトニトリル濃度が６０〜１００％のときに溶出したため、これらのフラクションを用い、より時間をかけて溶出させてＨＰＬＣを行い、活性物質本体の更なる精製を行なった。
【００７６】
具体的には、上記のフラクションＦ４〜Ｆ６を集めて前述したＨＰＬＣに付すに当たり、アセトニトリル濃度が６０％→１００％に変化する部分を、前述したＨＰＬＣ条件よりも３倍の時間をかけて溶出させた。
溶出条件：図２（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％
（２）１０〜２０分：２０％→６０％
（３）２０〜８０分：６０％→１００％
（４）８０〜１３０分：１００％
【００７７】
次に、このようにして得られた各フラクション［１０分ごとに得られる溶出液であって、図２（ａ）の横軸における、フラクションＦ１〜Ｆ８］を分画し、前述した方法と同様にして、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を調べた。
【００７８】
これらの結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）において、「Ｅｘｔｒａｃｔ」および「Ｃｏｎｔ．」とは、前述した図１（ｂ）と同じ意味である。
【００７９】
また、図２（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒３．７ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図２（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００８０】
図２（ｂ）に示すように、フラクションＦ４〜Ｆ７（アセトニトリル濃度が８０〜１００％のときに溶出した画分）では、対照群の平均値に比べ、遥かに高いＩｇＭ産生促進活性が認められた。
【００８１】
（ＨＰＬＣによる分画その３）
次に、溶出ピークごとにカラム溶出液を回収し、前述した方法と同様にして、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を調べた。詳細には、上記図２（ａ）において、ＩｇＭ産生活性が認められたフラクションＦ４〜Ｆ７を集め、以下の条件で逆相ＨＰＬＣに付した。
溶出条件：図３（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％アセトニトリル
（２）１０〜２０分：２０％→６０％
（３）２０〜６０分：６０％→１００％
（４）６０〜９０分：１００％
【００８２】
その結果、図３（ａ）に示すように、１５本のピーク［図３（ａ）中、１〜１５のピーク］を示すチャートが得られた。次いで、前述した方法と同様にして、各ピークにおけるＩｇＭ産生活性を測定した。
【００８３】
これらの結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）において、「Ｅｘｔｒａｃｔ」および「Ｃｏｎｔ．」とは、前述した図１（ｂ）と同じ意味である。
【００８４】
また、図３（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒８．４ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図３（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００８５】
図３（ｂ）に示すように、ピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ６では、対照群（エタノール抽出液）に比べ、遥かに高いＩｇＭ産生促進活性が認められた。
【００８６】
次いで、上記のようにして得られたピーク３およびピーク６について、液体クロマトグラフ質量分析を行なった。これらの結果は、前述した図４（ピーク３）および図５（ピーク６）に示したとおりである。
【００８７】
（参考実験）
以下では、上記活性物質ＡおよびＢが、β−クリプトキサンチン（温州ミカン果皮中の代表的な成分であり、前述した特許文献２に記載の成分；β−ＣＲＰ）であるかどうかを、ＨＰＬＣにより検討した。
【００８８】
詳細には、上記のようにして調製した温州ミカン果皮のエタノール抽出液について、資生堂ＣＡＰＣＥＬＬ Ｐａｃｋ Ｃ18 ５μｍＯＤＳカラム（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍカラム長）を用いて吸光度を４５０ｎｍで検出したこと以外は前述した実施例１と同様にしてＨＰＬＣを行なった結果、図６（ａ）のチャートが得られた。
【００８９】
一方、上記のエタノール抽出液１ｍＬにβ−ＣＲＰを０．５ｍＬ添加し、上記と同様にしてＨＰＬＣを行なった。その結果を図６（ｂ）に示す。
【００９０】
図６（ａ）と図６（ｂ）を対比すると、アセトニトリル（ＡｃＮ）濃度が１００％に達してから２０分以上経過した後に認められるピーク（各図において、○で示した部分）が、図６（ａ）に比べて図６（ｂ）では大きくなったことから、当該ピーク部分にβ−ＣＲＰが溶出していることが分かる。また、これらの結果より、上記のエタノール抽出液には、β−ＣＲＰは殆ど含まれないことも確認された。
【００９１】
以下の実施例２、実施例３、および実施例４では、実施例１で用いた、温州ミカン果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣによる分画を行なう前のもの）を用い、ヒラメ滑走細菌症に対する防御効果（治療効果および予防効果、実施例２）、ブリ類結節症に対する防御効果（治療効果および予防効果、実施例３）、およびマダイイリドウイルスによる感染症に対する防除効果（予防効果、実施例４）を調べた。これらの実施例は、直接的に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物（活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有する抽出物）による効果を調べたものではないが、上記抽出物が、間接的にしろ、魚病の感染予防効果および感染治療効果を奏することを示すデータとして掲げたものである。
【００９２】
実施例２：ヒラメ滑走細菌症に対する感染防御効果
１．実験方法
（１）供試魚
治療効果の確認実験には、ヒラメ（平均体重９．１ｇ±標準偏差３．５５ｇ）を、一実験群（１区）当たり２９〜３０尾ずつ使用した。以下の実験に入る前に、ヒラメは、２００Ｌ水槽に収容し、３日間馴致した。実験中、ヒラメを入れた水槽には絶えず給水し、水を循環させた。
【００９３】
また、予防効果の確認実験には、ヒラメ（平均体重１４．６ｇ±標準偏差４．９３ｇ）を、一実験群（１区）当たり３４〜３５尾ずつ使用した。本実施例では、まず治療効果の確認実験を行なってから、予防効果の確認実験を行なったため、予防効果の確認実験に供したヒラメの体重は、治療効果の確認実験に用いたヒラメに比べて増加している。
【００９４】
（２）供試菌
本実施例では、滑走細菌（Flexibacter maritimus)050603株を使用した。詳細には、−８０℃に凍結保存しておいた上記菌株を融解し、その１００μＬを採取し、５０ｍＬ三角フラスコに入れた２０ｍＬのＺｏＢｅｌｌ培地（滑走細菌用培地）に接種して２４時間振とうしながら前培養を行った。このようにして得られた前培養菌液１００μＬを、新鮮な３００ｍＬのＺｏＢｅｌｌ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、４８時間振とうして本培養を行った。このようにして得られた培養物を、滑走細菌感染用菌液として使用した。
【００９５】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
本実施例では、前述した実施例１に用いたエタノール抽出液を実験に用いた。詳細には、温州ミカンの果皮のみを乾燥させた果皮乾燥物１００ｇに１００％エタノール５００ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不純物を除去し、回収した抽出液を用いた。
【００９６】
（４）魚への投与量
試験飼料として、市販の餌ペレット１ｋｇに対して、上記のようにして得られたエタノール抽出液を、１０ｍＬ［エタノールの比重（約０．８ｇ／ｍＬ）を掛けると、抽出物量換算で約８ｇ］、または１００ｍＬ［エタノールの比重（約０．８ｇ／ｍＬ）を掛けると、抽出物量換算で約８０ｇ］浸み込ませたものを用い、魚に自由摂取させた。いずれの場合も、１日の摂取量は魚体重の約３％であり、計算上、魚へのエタノール抽出液量はそれぞれ、約０．３ｍＬ／ｋｇ魚体重／日（１０ｍＬ浸み込ませた群）、または約３ｍＬ／ｋｇ魚体重／日（１００ｍＬ浸み込ませた群）であり、抽出物量換算で算出すると、約０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日、または約２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日である。
【００９７】
以下では、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレットを低濃度餌ペレット、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の投与群を低濃度投与群と呼び、一方、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレットを高濃度餌ペレット、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の投与群を高濃度投与群と呼ぶ。
【００９８】
（５）細菌感染実験
上記抽出液による滑走細菌症に対する治療効果を確認するため、ヒラメに、上記の各餌ペレットを給餌させると同時（給餌直後、投与開始１日目）に、以下の方法で供試菌（滑走細菌）に感染させ、治療効果を検討した。
【００９９】
また、上記抽出液による滑走細菌症に対する予防効果を確認するため、ヒラメに、上記の各餌ペレットを１週間連続して給餌させた後（投与開始１日目〜７日目）に、投与７日目に以下の方法で供試菌（滑走細菌）に感染させ、予防効果を検討した。
【０１００】
滑走細菌の感染方法は以下のとおりである。まず、水槽の水位を２００Ｌから５０Ｌまで下げた後、これに上記の滑走細菌感染用菌液３００ｍＬを入れ、水槽中への給水を一旦止め、止水状態で３０分間感染させた。３０分後、この水槽にヒラメを収容したまま、再び給水を開始し、水槽の水位を２００Ｌ（実験期間中、常に一定）とした。なお、飼育７日目の感染作業の翌日である投与開始８日目からは、通常の餌ペレット（上記抽出液の混入なし）を与えて飼育した後、感染後の生存数を毎日測定した。
【０１０１】
いずれの確認実験においても、比較のため、通常の餌ペレット（上記抽出液果の混入なし）を与えて、同様の実験を行なった（コントロール群）。
【０１０２】
２．実験結果
（１）抽出液含有餌ペレットの投与開始１日目に感染を行った場合（治療効果の検討）
図７（ａ）に、治療効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はヒラメの生存率（％）である。図７（ａ）において、感染後日数０日は、投与開始１日目を意味する。
【０１０３】
図７（ａ）に示すように、感染１０日後のヒラメの生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で６３％（１９尾／３０尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で７６％（２２尾／２９尾）であり、いずれも、コントロール群（５０％、１５尾／３０尾）に比べて上昇した。コントロール群と比較すると、高濃度投与群で有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
（２）抽出液含有餌ペレットを７日間投与後に感染を行った場合（予防効果の検討）
図７（ｂ）に、予防効果の確認実験の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はヒラメの生存率（％）である。図７（ｂ）において、感染後日数０日は、投与開始７日目を意味する。
【０１０５】
図７（ｂ）に示すように、感染１０日後の生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８９％（３１尾／３５尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で７６％（２６尾／３４尾）であり、いずれも、コントロール群（７１％、２４尾／３４尾）に比べて上昇した。コントロール群と比較すると、低濃度投与群で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
３．考察
上記のとおり、治療効果の確認実験では、高濃度投与群において有意な効果が認められたことから、上記のミカン果皮抽出物を２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の割合で投与すると、滑走細菌症からヒラメを効果的に治療できると考えられる。これに対し、予防効果の確認実験では、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）において有意な効果が認められた。これらの実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整することにより、所望とする治療効果および予防効果の両方が得られることが大いに期待される。
【０１０７】
実施例３：ブリ類結節症に対する感染防御効果
１．実験方法
（１）供試魚
治療効果の確認実験には、ブリ（平均体重１９．１ｇ）を、一実験群（１区）当たり４９〜５０尾ずつ使用した。以下の実験に入る前に、ブリは、２００Ｌ水槽に収容し、３日間馴致した。実験中、ブリを入れた水槽には絶えず給水し、水を循環させた。
【０１０８】
また、予防効果の確認実験には、ブリ（平均体重７８．０ｇ）を、一実験群（１区）当たり２０〜２１尾ずつ使用した。本実施例では、まず治療効果の確認実験を行なってから、予防効果の確認実験を行なったため、予防効果の確認実験に供したブリの体重は、治療効果の確認実験に用いたブリに比べて増加している。
【０１０９】
（２）供試菌
本実施例では、類結節症原因菌（Photobacterium damuselae subsp.piscicida)O-82352M株を使用した。詳細には、−８０℃に凍結保存しておいた上記菌株を融解し、その１００μＬを採取し、５０ｍＬ三角フラスコに入れた少量のブレインハートインヒュージョン培地（ＢＨＩ、ＮａＣｌを２％に調製）に接種して２４時間振とうしながら前培養を行った。このようにして得られた前培養菌液０．７５μＬを、３００ｍＬのＢＨＩ培地（類結節症原因菌用培地）が入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、２４時間振とうして本培養を行ったものを、類結節症原因菌感染用菌原液とした（菌濃度：約７．９×１０7ＣＦＵ／ｍＬ）。
【０１１０】
感染に当たっては、上記の菌原液を海水で希釈し、治療効果確認実験における感染実験には２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬの菌濃度とした液に、一方、予防効果確認実験における感染実験には２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬおよび１．９×１０6ＣＦＵ／ｍＬの菌濃度とした液に、ブリを１０分間浸漬して感染を行った。
【０１１１】
以下では、２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬの菌液濃度で感染させたものを低濃度感染群、１．９×１０6ＣＦＵ／ｍＬの菌液濃度で感染させたものを高濃度感染群と呼ぶ。
【０１１２】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
前述した実施例１と同様にして、エタノール抽出液を調製した。
【０１１３】
（４）魚への投与量
前述した実施例１と同様にして、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレット（低濃度餌ペレット）および２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレット（高濃度餌ペレット）を調製し、各餌ペレットを、ブリに自由摂取させた。
【０１１４】
（５）細菌感染実験
前述した実施例２において、治療効果の確認実験および予防効果の確認実験に用いた類結節症原因菌の菌液濃度（感染時の濃度）を上記のように変更したこと以外は前述した実施例２と同様にして、類結節症に対する治療効果および予防効果の確認実験を行なった。
【０１１５】
２．実験結果
（１）抽出液含有餌ペレットの投与開始１日目に感染を行った場合（治療効果の検討）
図８（ａ）に、低濃度感染群における治療効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はブリの生存率（％）である。
【０１１６】
図８（ａ）に示すように、感染１０日後のブリの生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で１６．０％（８尾／５０尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で３２．７％（１６尾／４９尾）であり、高濃度投与群ではコントロール群（２０．４％、１０尾／４９尾）に比べて生存率が上昇した。
【０１１７】
（２）抽出液含有餌ペレットを７日間投与後に感染を行った場合（予防効果の検討）
図８（ｂ）に、低濃度感染群における予防効果の結果を示し、図８（ｃ）に、高濃度感染群における予防効果の結果を示す。いずれの図も、横軸は感染後日数であり、縦軸はブリの生存率（％）である。
【０１１８】
低濃度感染群の場合、図８（ｂ）に示すように、感染１０日後の生存率は、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で９５％（１９尾／２０尾）、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８６％（１８尾／２１尾）であり、いずれも、コントロール群（６５％、１３尾／２０尾）に比べて顕著に上昇した。コントロール群と比較すると、低濃度投与群および高濃度投与群の両方において有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１１９】
一方、高濃度感染群の場合、図８（ｃ）に示すように、感染１０日後の生存率は、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で５０％（１０尾／２０尾）、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で１０％（２尾／２０尾）、コントロール群で２０％（４尾／２０尾）であり、高濃度投与群は、コントロール群に比べて生存率が著しく上昇し、有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
３．考察
上記のとおり、治療効果の確認実験では、低濃度投与群において生存率の上昇が認められた。一方、予防効果の確認実験では、低濃度感染群では高濃度投与群および低濃度投与群の両方に有意な効果が認められ、高濃度感染群では高濃度投与群で有意な効果が認められた。これらの実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整することにより、所望とする治療効果および予防効果の両方が得られることが大いに期待される。
【０１２１】
４．総合考察
以上の結果を総合的に勘案すると、本実施例に用いたミカン果皮抽出物を、おおむね、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（魚体重）程度の割合で魚に投与すると、ヒラメ滑走細菌症およびブリ類結節症の双方に対して治療効果および予防効果が発揮され得ることが確認された。この実験結果は、本実施例で用いた魚病以外の、他の細菌性感染症の予防または治療に、本発明の上記抽出物が効果的に用いられることを強く示唆するものである。
【０１２２】
実施例４：マダイイリドウイルスによる感染症に対する感染予防効果
１．実験方法
（１）供試魚
マダイイリドウイルス（red sea bream iridovirus、ＲＳＩＶ）に感染した経歴のないマダイ当歳魚（平均体重約２０ｇ）を、一実験群（１区）当たり４０尾ずつ使用した。マダイは、２００ＬのＦＲＰ製水槽４連付き循環水槽システムのうち３水槽を使用して飼育した。実験期間中の水温は、約２８〜３０℃の範囲に制御した。
【０１２３】
（２）供試菌
本実施例では、マダイイリドウイルスとしてＲＳＩＶ Ｕ−６株を使用した。詳細には、細胞培養用小フラスコに単層を形成させたＧＦ（Grow Factor、細胞成長因子）細胞に、上記のウイルス原液を２００μＬ接種して培養し、ウイルス増殖により細胞変性効果が全体に広がったことを確認した培養物を、使用時まで−８０℃で凍結保存した（ウイルス力価２．７×１０5ＴＣＩＤ50）。
【０１２４】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
前述した実施例１と同様にして、エタノール抽出液を調製した。
【０１２５】
（４）魚への投与量
試験飼料として、市販のＥＰ飼料１００ｇに対して、上記のようにして得られたエタノール抽出液を、１０ｍＬ（エタノール抽出物量換算で約８ｇ、高濃度投与群、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）、または１ｍＬ（エタノール抽出物量換算で約０．８ｇ、低濃度投与群、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）浸み込ませたものを用いた。比較のため、通常のＥＰ飼料（上記抽出液果の混入なし）も用いた（コントロール群）。いずれの群も、７日分で約１００ｇの飼料を毎日１回、自由摂食により投与した。
【０１２６】
（５）ウイルス感染実験
上記抽出液によるマダイイリドウイルス（ＲＳＩＶ）に対する予防効果を確認するため、マダイに、上記の各飼料を１週間（７日間）連続して給餌させた後（投与開始１日目〜７日目）、投与１０日目に、以下の浸漬感染法によりウイルスに感染させ、予防効果を検討した。本実施例では、前述した実施例２や実施例３と異なり、投与１０日目にウイルスの感染を行なったが、これは、台風接近の影響のため、投与７日目に感染実験を行なうことができなかったためである。
【０１２７】
詳細には、上記のようにして得られたＲＳＩＶウイルス液（ウイルス力価２．７×１０5ＴＣＩＤ50）を海水で１０万倍希釈したウイルス海水液５０Ｌを用意し、通気しながら、各実験群のマダイを３０分間浸漬処理して感染させた。次いで、感染後のマダイを、上記の各飼育水槽に戻し、通常の餌ペレット（上記抽出液果の混入なし）を毎日与えて飼育し、感染後の死亡数（２２日まで）を毎日測定し、各実験群の生存率を測定した。各実験群の生存率の結果は、Ｆ検定により有意差を検討した。
【０１２８】
なお、マダイは、飼育中に共食いによる死亡が良く見られるが、上記生存率（％）［＝｛（母数−死亡数）／母数｝×１００］の算出に当たっては、母数および死亡数ともに、共食いによる死亡または共食いによる死亡が疑われるが死亡原因が特定できないものは除いて計算した。
【０１２９】
２．実験結果
図１１に、ＲＳＩＶウイルスに対する予防効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はマダイの生存率（％）である。図１１において、感染後日数０日は、投与開始１０日目を意味する。
【０１３０】
図１１に示すように、マダイの死亡は感染後８日目から始まり、１０日後には、すべての実験群で生存率は５０％以下に減少したが、感染後１６日目には死亡が終息した。最終的な生存率（感染後２２日目の生存率）は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８．１％（３尾／３７尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で３０．６％（１１尾／３６尾）、コントロール群で１０．８％（４尾／３７尾）であったり、高濃度投与群では、コントロール群に比べて生存率が高くなる傾向が認められた。
【０１３１】
また、ウイルスにより死亡したマダイを解剖したところ、ＲＳＩＶ病に特徴的な脾臓の腫大が多くの個体で観察され、鰓の褪色斑および肝臓の出血を示す個体も認められた。
【０１３２】
３．考察
上記の実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整して投与することにより、細菌のみならずウイルスによる感染症に対しても所望とする予防効果が得られ、更には治療効果も得られることが大いに期待される。なお、上記の実験では、イリドウイルスによる感染症に対する防除効果を調べたが、それ以外の、他のウイルス性感染症の予防または治療に、本発明の上記抽出物が効果的に用いられることを強く示唆するものである。
【０１３３】
４．総合考察
上記の実施例では、柑橘類果皮のエタノール抽出液を用いたときにおける、魚病の感染予防効果および感染治療効果を調べたが、これらの実験結果は、上記の活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有する、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物においても、上記効果を奏することを強く示唆するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類の果皮抽出物を含有する免疫蛋白質産生促進剤に関し、詳細には、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリンなどの免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、種々の技術を開示している。例えば特許文献１には、柑橘類果皮の抽出液中に多く含まれるβ−クリプトキサンチンおよびオーラプテンが、免疫蛋白質の産生促進剤として有用であることを開示している。
【０００３】
また、特許文献２には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を促進する活性を有することを開示している。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１１６７３５号公報
【特許文献２】特開平６−９８７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、柑橘類の果皮抽出物を含有する免疫蛋白質産生促進剤であって、前記抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル逆相カラム（ＯＤＳ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）により、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分にカラムから溶出する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有するところに要旨を有するものである。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、上記抽出物として、上記エタノール抽出液のうちヘキサンに溶解するものを主に含有する抽出物を用いるものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【０００９】
本発明に用いられる抽出物は、柑橘類の果皮を原材料として得られるため、安全であり、当該抽出物を用いた飼料組成物は、例えば養殖魚などの魚類に広範囲に感染する魚病原菌やウイルスから、魚類を安全且つ有効に、予防または治療し得る魚類の感染防止剤としての使用が大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その１）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図１（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図１（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図２】図２は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その２）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図２（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図２（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図３】図３は、実施例１において、（ＨＰＬＣによる分画その３）で得られた画分を用いたときの分析結果を示す図であり、図３（ａ）はＨＰＬＣの結果を、図３（ｂ）はＩｇＭ産生量の結果を、それぞれ示す。
【図４】図４は、活性物質Ａの質量分析結果を示す図である。
【図５】図５は、活性物質Ｂの質量分析結果を示す図である。
【図６】図６は、参考実験におけるＨＰＬＣの結果を示す図であり、図６（ａ）は、果皮抽出液の結果を、図６（ｂ）は果皮抽出液＋β−クリプトキサンチン（β−ＣＲＰ）の結果を、それぞれ示す。
【図７】図７は、実施例２におけるヒラメ滑走細菌症に対する確認実験の結果を示す図であり、図７（ａ）は治療効果の結果を、図７（ｂ）は予防効果の結果を、それぞれ示す。
【図８】図８は、実施例３におけるブリ類結節症に対する確認実験の結果を示す図であり、図８（ａ）は低濃度感染群における治療効果の結果を、図８（ｂ）は低濃度感染群における予防効果の結果を、図８（ｃ）は高濃度感染菌群における予防効果の結果を、それぞれ示す。
【図９】図９（ａ）は、実施例１で用いたエタノール抽出液のＴＬＣによる分画結果を示す図であり、図９（ｂ）は、サンプル濃度を種々変化させたときのＩｇＭ産生量の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１で用いたエタノール抽出液、および柑橘類に含まれる種々の物質における、ＴＬＣによる分画結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例４における、マダイＲＳＩＶウイルスに対する予防効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、柑橘類の果皮抽出液には、前述した特許文献１に記載の成分（β−クリプトキサンチンおよびオーラプテン）とも異なる、新規な活性成分が含まれており、当該活性成分を含む抽出物（詳細には、エタノール抽出後、逆相ＨＰＬＣを行なったとき、所定の画分に出現する活性物質を含む抽出物；以下、単に「本発明に用いられる柑橘類の果皮抽出物」で代表させる場合がある。）が、優れた免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
詳細には、本発明に用いられる柑橘類の果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有するところに特徴がある。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【００１３】
上述した柑橘類の果皮抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出したエタノール抽出液のうち、ヘキサンに溶解するものを主に含有するものである。この点で、ヘキサンに溶解しない、β−クリプトキサンチンおよびオーラプテンとは、明瞭に相違している。このことは、例えば、後記する図１、図６、図１０の結果などからも確認することができる。
【００１４】
以下、抽出工程を詳しく説明する。
【００１５】
まず、柑橘類の果皮に対し、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどの有機溶媒（低極性溶媒）を加え、約４〜３０℃の温度で、約１２〜４８時間抽出して抽出液を得る。
【００１６】
詳細には、柑橘類の果皮乾燥物１００質量部に対し、上記有機溶媒を、約２００〜６００質量部の割合で加えることが好ましい。後記する実施例では、温州ミカンの果皮乾燥物５ｇに１００％エタノール２５ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不溶物を除去して回収した抽出液を用いた。
【００１７】
本発明に用いられる柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。このうち好ましいのは、温州ミカン、夏みかん、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーであり、より好ましくは温州ミカンである。
【００１８】
本発明では、上記柑橘類の果皮を用いるが、本発明の作用を損なわない範囲で、果皮のほか果肉を用いることもできる。但し、本発明の作用を有効に発揮させるためには、果皮のみを用いることが好ましい。具体的には、上記柑橘類の果皮（本発明の作用を損なわない範囲で果肉を含む）を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、上記の抽出処理を行なうことが好ましい。
【００１９】
次に、上記のようにして得られた抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲル逆相カラム（ＯＤＳ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、前述した条件で分画する。本発明の免疫蛋白質産生促進剤に用いられるのは、このようにして得られた各画分（フラクション）のうち、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分であり、本発明は、当該画分中に、所望とする作用効果を発揮し得る有効成分（活性物質本体を含む活性成分）が含まれることを突き止めたところに特徴がある。
【００２０】
詳細には、上記画分中には、少なくとも二種類の活性物質を含有しており、液体クロマトグラフ質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）により測定した分子量（数平均分子量）は、それぞれ、約２８０および約３７８である。
【００２１】
以下、説明の便宜上、分子量が約２８０の活性物質を活性物質Ａと呼び、分子量が約３７８の活性物質を活性物質Ｂと呼ぶ。これら活性物質ＡおよびＢの同定方法は、後記する実施例の欄で詳述する。
【００２２】
これらのうち活性物質Ａは、後記する図３（ａ）に示すＨＰＬＣチャートの「３」成分（＝図３（ｂ）のＰ３成分）に相当し、液体クロマトグラフ質量分析により分子量を算出すると、分子量は２８０．２２５７であった（図４を参照）。すなわち、図４に示すプロファイルにおいて、一番高いピーク上の数字（２７９．２２５７）に１を足した値が、活性物質Ａの分子量になる。活性物質Ａの詳細な構造は不明であるが、炭化水素の直鎖構造を有し、炭素の二重結合が２つ以上あり、酸素原子は含まない構造であることがわかる。
【００２３】
一方、活性物質Ｂは、後記する図３（ａ）に示すＨＰＬＣチャートの「６」成分（＝図３（ｂ）のＰ６成分）に相当し、液体クロマトグラフ質量分析により分子量を算出すると、分子量は３７８．２８４２であった(図５を参照)。すなわち、図５に示すプロファイルにおいて、一番高いピーク上の数字（３７９．２８４２）から１を引いた値が、活性物質Ｂの分子量になる。活性物質Ｂの詳細な構造は不明であるが、炭化水素の直鎖構造を有しており、炭素の二重結合も有しているが、ベンゼン環などの芳香環は含まない。酸素原子は有していても良い。
【００２４】
上記の構造解析結果より、上記活性物質ＡおよびＢは、少なくとも前述した特許文献１に記載のヘスペリジン（フラボノイドの一種）でないことが確認された。また、柑橘類果皮のエタノール抽出物中に多く含まれるノビレチン（フラボノイドの一種）、リコペン（フラボノイドの一種）、β−カロテン（カロテノイドの一種）、リモネン（単環式モノテルペノイドの一種）でないことが判明した。このことは、後記する図１０でも実証している（詳細は後述する）。
【００２５】
上記のほか、本発明者らの更なる実験結果によれば、以下のことが判明した。
【００２６】
（ア）後記する実施例で用いた、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの）に等量のヘキサンを加え、ヘキサン相を薄膜クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）で分画した（展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合溶媒を使用）ところ、図９（ｂ）に示すように、図９（ａ）の上方スポットに活性が認められた。よって、上記活性物質ＡおよびＢを含む本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、エタノール抽出後、ヘキサンで抽出されるものであることが判明した。
【００２７】
図９（ａ）の上方スポット部分に、活性物質ＡおよびＢを含む活性成分が存在することは、図９（ｂ）より確認している。すなわち、上記の上方スポット部分を採取し、その成分をエタノールに溶解した後、図９（ｂ）に示す様々な濃度となるようにエタノールで希釈して各サンプルを調製し、後記する実施例に記載の方法でＩｇＭ産生量を測定した。比較のため、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの、図９（ｂ）では「粗抽出物」と記載）についても、上記と同様にしてＩｇＭ量を測定すると共に、溶媒（エタノール、図９（ｂ）では「コントロール」と記載）中のＩｇＭ産生量も測定した。
【００２８】
これらの結果を図９（ｂ）に示す。図９（ｂ）に示すように、上方スポットの画分は、粗抽出物に比べ、高いＩｇＭ産生促進作用を有する傾向が見られた。
【００２９】
（イ）また、上述した実験結果（活性物質ＡおよびＢを含む本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、エタノール抽出後、ヘキサンに移行するものであること）は、上記活性成分ＡおよびＢが、柑橘類に代表的に含まれるβ−クリプトキサンチン（カロテノイド類の一種）や、オーラプテン（クマリン類の一種）とも異なることを間接的に意味するものである。β−クリプトキサンチンやオーラプテンは、或る程度の極性を有するため、エタノール抽出後、ヘキサン相には移行しないからである。
【００３０】
このことは、図１０の結果からも確認することができる。図１０は、上記図９（ａ）において、柑橘類果皮中に含まれることが知られている種々の物質（図１０中、２〜７に記載の各物質）について、同様のＴＬＣによる分画を行なったときの結果を示すものである。図１０より、本発明の活性物質は、ノビレチン、ヘスペリジン、リコペン、β−クリプトキサンチン、β−カロテン、リモネンとは全く異なる挙動を示すことが分かる。
【００３１】
以上の実験結果より、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物中に含まれ、本発明の作用効果を発揮し得る活性物質ＡおよびＢは、その詳細な構造は不明であるが、上述した種々の解析結果（質量分析、ＴＬＣによる移動度の比較、ＨＰＬＣなど）によれば、少なくとも、これまでに報告されている柑橘類果皮に含まれる成分（ヘスペリジン、ノビレチン、リコペン、β−カロテン、リモネン、β−クリプトキサンチン、オーラプテン）とは異なることが充分裏付けられる。
【００３２】
次に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物による作用効果について説明する。上記の活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有するものは、免疫蛋白質の産生促進剤として好適に用いることができる。
【００３３】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，ＴＮＦαなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００３４】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００３５】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物（厳密には、上記活性物質ＡおよびＢを、活性成分として含む画分）のみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００３６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００３７】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３８】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良い。
【００３９】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、ブリ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメ、マハタなどの魚類・甲殻類などが代表的に例示される。
【００４０】
本発明によれば、上記免疫蛋白質の産生促進剤を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進することができる。具体的な方法は、例えば、前述した特許文献１に記載の方法を参照することができる。
【００４１】
すなわち、本発明では、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物の存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（後記する免疫蛋白質産生細胞）を培養すれば、当該抽出物を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００４２】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００４３】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００４４】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含有する培地中で培養する。
【００４５】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００４６】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００４７】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００４８】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含むもの）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０4〜５×１０5ｃｅｌｌｓである場合、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４９】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００５０】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００５１】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００５２】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００５３】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【００５４】
更に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物を含むものは、上述した免疫蛋白質の産生促進剤として好適に用いられる他、魚病の感染予防剤または感染治療剤（以下、これらをまとめて、感染防除剤と呼ぶ場合がある。）としても好適に用いられ得ることが大いに期待される。後記する実施例では、柑橘類果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣに付す前のもの）における、魚病の感染予防効果および感染治療効果を確認したが、これらの実験結果は、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物が、魚病の感染予防効果および感染治療効果を発揮することを、充分示唆するものである。
【００５５】
このような作用効果を有効に発揮させるための魚類への投与量は、使用する柑橘類の種類や抽出条件、感染した魚類の種類、感染症の種類、感染症状の程度などによっても相違するが、おおむね、柑橘類果皮１００ｇを５００ｍＬのエタノールで抽出したエタノール抽出液を、魚類の体重１ｋｇ当たり、おおむね、５０〜５，０００ｍｇ／ｋｇ魚類体重／日となるように投与することが好ましい。
【００５６】
また、上記柑橘類果皮抽出物への魚類への投与手段（給餌方法）は特に限定されず、飼料に直接混入して飼料組成物の形態で投与しても良いし、飼育水中に直接混入して投与しても良い。
【００５７】
本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物は、細菌性魚病のほか、ウイルス性魚病の感染予防または感染治療に好適に用いられる。
【００５８】
細菌性魚病としては、例えば、滑走細菌症や類結節症などが挙げられる。これらは、養殖魚などに毎年大きな被害を出している代表的な感染症であり、死亡率も高く、現状では抗生物質による治療に頼っているのが実情である。
【００５９】
このうち滑走細菌症は、滑走細菌（Flexibacter maritimus)によって引き起こされる感染症であり、ヒラメ、タイ、ブリ、サケ科の魚類で被害が報告されている。症状としては、稚魚では口唇部や尾ひれに糜爛（びらん）、壊死、崩壊などがみられ、幼魚や成魚では頭部、躯幹、ひれ、えらなどに発赤や出血、ときには潰瘍がみられる。
【００６０】
また、類結節症は、類結節症原因菌（Photobacterium damuselae subsp. piscicida）によって引き起こされる感染症であり、ブリ、カンパチ、マダイ、ヒラメなどに発病する感染症である。近年の養殖魚種の拡大に伴い、類結節症原因菌による感染症は広がりつつあり、感染後の死亡率はほぼ１００％である。
【００６１】
また、ウイルス性魚病としては、例えば、イリドウイルスによる感染症が挙げられる。ウイルスによる感染は、細菌による感染に比べ、感染の伝播および病気の進行が格段に速く、大量死を招く恐れがあるなど深刻な被害をもたらすにもかかわらず、有効な防除手段がないのが現状であるが、特に、マダイイリドウイルスによる感染は、海産養殖魚に甚大な被害をもたらしたことが報告されており、大きな社会問題となっている。
【００６２】
後記する実施例では、代表的に上記３種類の魚病に対する予防作用および治療作用を確認したが、適用可能な感染症の種類は上記に限定されない。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６４】
実施例１：本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物の同定方法、および免疫蛋白質産生促進作用の検討
（エタノール抽出液の調製）
温州ミカンの果皮のみを乾燥させた果皮乾燥物５ｇに１００％エタノール２５ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不純物を除去し、エタノール抽出液を得た。
【００６５】
（ＨＰＬＣによる分画その１）
次いで上記のエタノール抽出液を、下記条件で逆相ＨＰＬＣに付した結果、図１（ａ）のチャートが得られた。
カラム：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬ Ｐａｃｋ Ｃ18 ５μｍ）ＯＤＳカラム（４．６ｍｍＩＤ（内径）×１５０ｍｍカラム長）
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度ＯＤ（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（ＡｃＮ、２０％→１００％）
溶出条件：図１（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％
（２）１０〜５０分：２０％→１００％
（３）５０〜９０分：１００％
【００６６】
次に、１０分ごとに得られる溶出液［図１（ａ）の横軸における、フラクションＦ１〜Ｆ９］を分画し、それらが、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を、以下の実験方法で検討した。
【００６７】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、上記の各画分を、それぞれ１％の濃度となるように添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６８】
比較のため、上記画分の代わりにエタノールを添加して上記と同様の培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した（対照群、図１（ｂ）では「Ｃｏｎｔ．」と記載）。
【００６９】
更に参考のため、ＨＰＬＣに付す前の、エタノール抽出液を添加して上記と同様の培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した（図１（ｂ）では「Ｅｘｔｒａｃｔ」と記載）。
【００７０】
これらの結果を図１（ｂ）に示す。
【００７１】
また、図１（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒１．８ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図１（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００７２】
図１（ｂ）に示すように、フラクションＦ４〜Ｆ６では、対照群の平均値を遥かに超える量のＩｇＭ産生量が認められた。これに対し、他のフラクションでは、対照群とほぼ同程度のＩｇＭ産生量しか見られなかった。
【００７３】
なお、保持時間の結果から、フラクションＦ８にはβ−クリプトキサンチン（β−ＣＲＰ）が溶出していると考えられるが、図１（ｂ）に示すように、対照群と同程度のＩｇＭ産生量しか認められなかった。これは、Ｆ８中に含まれるβ−クリプトキサンチンの量が極く少量であり、ＩｇＭ産生活性を示す程の濃度でなかったためと推察される。
【００７４】
以上の実験結果から、柑橘類果皮のエタノール抽出液中における、免疫蛋白質産生促進作用を示す活性物質本体（免疫促進物質の主体）は、上述したフラクションＦ４〜Ｆ６に含まれることが確認された。
【００７５】
（ＨＰＬＣによる分画その２）
上記のフラクションＦ４〜Ｆ６は、アセトニトリル濃度が６０〜１００％のときに溶出したため、これらのフラクションを用い、より時間をかけて溶出させてＨＰＬＣを行い、活性物質本体の更なる精製を行なった。
【００７６】
具体的には、上記のフラクションＦ４〜Ｆ６を集めて前述したＨＰＬＣに付すに当たり、アセトニトリル濃度が６０％→１００％に変化する部分を、前述したＨＰＬＣ条件よりも３倍の時間をかけて溶出させた。
溶出条件：図２（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％
（２）１０〜２０分：２０％→６０％
（３）２０〜８０分：６０％→１００％
（４）８０〜１３０分：１００％
【００７７】
次に、このようにして得られた各フラクション［１０分ごとに得られる溶出液であって、図２（ａ）の横軸における、フラクションＦ１〜Ｆ８］を分画し、前述した方法と同様にして、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を調べた。
【００７８】
これらの結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）において、「Ｅｘｔｒａｃｔ」および「Ｃｏｎｔ．」とは、前述した図１（ｂ）と同じ意味である。
【００７９】
また、図２（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒３．７ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図２（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００８０】
図２（ｂ）に示すように、フラクションＦ４〜Ｆ７（アセトニトリル濃度が８０〜１００％のときに溶出した画分）では、対照群の平均値に比べ、遥かに高いＩｇＭ産生促進活性が認められた。
【００８１】
（ＨＰＬＣによる分画その３）
次に、溶出ピークごとにカラム溶出液を回収し、前述した方法と同様にして、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を調べた。詳細には、上記図２（ａ）において、ＩｇＭ産生活性が認められたフラクションＦ４〜Ｆ７を集め、以下の条件で逆相ＨＰＬＣに付した。
溶出条件：図３（ａ）に示すとおり
（１）０〜１０分：２０％アセトニトリル
（２）１０〜２０分：２０％→６０％
（３）２０〜６０分：６０％→１００％
（４）６０〜９０分：１００％
【００８２】
その結果、図３（ａ）に示すように、１５本のピーク［図３（ａ）中、１〜１５のピーク］を示すチャートが得られた。次いで、前述した方法と同様にして、各ピークにおけるＩｇＭ産生活性を測定した。
【００８３】
これらの結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）において、「Ｅｘｔｒａｃｔ」および「Ｃｏｎｔ．」とは、前述した図１（ｂ）と同じ意味である。
【００８４】
また、図３（ｂ）において、ＩｇＭ産生量≒８．４ｎｇ／ｍＬの横線ラインは、対照群（図３（ｂ）中、Ｃｏｎｔ．）の平均値を示している。
【００８５】
図３（ｂ）に示すように、ピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ６では、対照群（エタノール抽出液）に比べ、遥かに高いＩｇＭ産生促進活性が認められた。
【００８６】
次いで、上記のようにして得られたピーク３およびピーク６について、液体クロマトグラフ質量分析を行なった。これらの結果は、前述した図４（ピーク３）および図５（ピーク６）に示したとおりである。
【００８７】
（参考実験）
以下では、上記活性物質ＡおよびＢが、β−クリプトキサンチン（温州ミカン果皮中の代表的な成分であり、前述した特許文献２に記載の成分；β−ＣＲＰ）であるかどうかを、ＨＰＬＣにより検討した。
【００８８】
詳細には、上記のようにして調製した温州ミカン果皮のエタノール抽出液について、資生堂ＣＡＰＣＥＬＬ Ｐａｃｋ Ｃ18 ５μｍＯＤＳカラム（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍカラム長）を用いて吸光度を４５０ｎｍで検出したこと以外は前述した実施例１と同様にしてＨＰＬＣを行なった結果、図６（ａ）のチャートが得られた。
【００８９】
一方、上記のエタノール抽出液１ｍＬにβ−ＣＲＰを０．５ｍＬ添加し、上記と同様にしてＨＰＬＣを行なった。その結果を図６（ｂ）に示す。
【００９０】
図６（ａ）と図６（ｂ）を対比すると、アセトニトリル（ＡｃＮ）濃度が１００％に達してから２０分以上経過した後に認められるピーク（各図において、○で示した部分）が、図６（ａ）に比べて図６（ｂ）では大きくなったことから、当該ピーク部分にβ−ＣＲＰが溶出していることが分かる。また、これらの結果より、上記のエタノール抽出液には、β−ＣＲＰは殆ど含まれないことも確認された。
【００９１】
以下の実施例２、実施例３、および実施例４では、実施例１で用いた、温州ミカン果皮のエタノール抽出液（ＨＰＬＣによる分画を行なう前のもの）を用い、ヒラメ滑走細菌症に対する防御効果（治療効果および予防効果、実施例２）、ブリ類結節症に対する防御効果（治療効果および予防効果、実施例３）、およびマダイイリドウイルスによる感染症に対する防除効果（予防効果、実施例４）を調べた。これらの実施例は、直接的に、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物（活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有する抽出物）による効果を調べたものではないが、上記抽出物が、間接的にしろ、魚病の感染予防効果および感染治療効果を奏することを示すデータとして掲げたものである。
【００９２】
実施例２：ヒラメ滑走細菌症に対する感染防御効果
１．実験方法
（１）供試魚
治療効果の確認実験には、ヒラメ（平均体重９．１ｇ±標準偏差３．５５ｇ）を、一実験群（１区）当たり２９〜３０尾ずつ使用した。以下の実験に入る前に、ヒラメは、２００Ｌ水槽に収容し、３日間馴致した。実験中、ヒラメを入れた水槽には絶えず給水し、水を循環させた。
【００９３】
また、予防効果の確認実験には、ヒラメ（平均体重１４．６ｇ±標準偏差４．９３ｇ）を、一実験群（１区）当たり３４〜３５尾ずつ使用した。本実施例では、まず治療効果の確認実験を行なってから、予防効果の確認実験を行なったため、予防効果の確認実験に供したヒラメの体重は、治療効果の確認実験に用いたヒラメに比べて増加している。
【００９４】
（２）供試菌
本実施例では、滑走細菌（Flexibacter maritimus)050603株を使用した。詳細には、−８０℃に凍結保存しておいた上記菌株を融解し、その１００μＬを採取し、５０ｍＬ三角フラスコに入れた２０ｍＬのＺｏＢｅｌｌ培地（滑走細菌用培地）に接種して２４時間振とうしながら前培養を行った。このようにして得られた前培養菌液１００μＬを、新鮮な３００ｍＬのＺｏＢｅｌｌ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、４８時間振とうして本培養を行った。このようにして得られた培養物を、滑走細菌感染用菌液として使用した。
【００９５】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
本実施例では、前述した実施例１に用いたエタノール抽出液を実験に用いた。詳細には、温州ミカンの果皮のみを乾燥させた果皮乾燥物１００ｇに１００％エタノール５００ｍＬを加え、室温で１２時間振とうした後、遠心（７０００ｇ×２０分）することにより不純物を除去し、回収した抽出液を用いた。
【００９６】
（４）魚への投与量
試験飼料として、市販の餌ペレット１ｋｇに対して、上記のようにして得られたエタノール抽出液を、１０ｍＬ［エタノールの比重（約０．８ｇ／ｍＬ）を掛けると、抽出物量換算で約８ｇ］、または１００ｍＬ［エタノールの比重（約０．８ｇ／ｍＬ）を掛けると、抽出物量換算で約８０ｇ］浸み込ませたものを用い、魚に自由摂取させた。いずれの場合も、１日の摂取量は魚体重の約３％であり、計算上、魚へのエタノール抽出液量はそれぞれ、約０．３ｍＬ／ｋｇ魚体重／日（１０ｍＬ浸み込ませた群）、または約３ｍＬ／ｋｇ魚体重／日（１００ｍＬ浸み込ませた群）であり、抽出物量換算で算出すると、約０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日、または約２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日である。
【００９７】
以下では、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレットを低濃度餌ペレット、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の投与群を低濃度投与群と呼び、一方、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレットを高濃度餌ペレット、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の投与群を高濃度投与群と呼ぶ。
【００９８】
（５）細菌感染実験
上記抽出液による滑走細菌症に対する治療効果を確認するため、ヒラメに、上記の各餌ペレットを給餌させると同時（給餌直後、投与開始１日目）に、以下の方法で供試菌（滑走細菌）に感染させ、治療効果を検討した。
【００９９】
また、上記抽出液による滑走細菌症に対する予防効果を確認するため、ヒラメに、上記の各餌ペレットを１週間連続して給餌させた後（投与開始１日目〜７日目）に、投与７日目に以下の方法で供試菌（滑走細菌）に感染させ、予防効果を検討した。
【０１００】
滑走細菌の感染方法は以下のとおりである。まず、水槽の水位を２００Ｌから５０Ｌまで下げた後、これに上記の滑走細菌感染用菌液３００ｍＬを入れ、水槽中への給水を一旦止め、止水状態で３０分間感染させた。３０分後、この水槽にヒラメを収容したまま、再び給水を開始し、水槽の水位を２００Ｌ（実験期間中、常に一定）とした。なお、飼育７日目の感染作業の翌日である投与開始８日目からは、通常の餌ペレット（上記抽出液の混入なし）を与えて飼育した後、感染後の生存数を毎日測定した。
【０１０１】
いずれの確認実験においても、比較のため、通常の餌ペレット（上記抽出液果の混入なし）を与えて、同様の実験を行なった（コントロール群）。
【０１０２】
２．実験結果
（１）抽出液含有餌ペレットの投与開始１日目に感染を行った場合（治療効果の検討）
図７（ａ）に、治療効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はヒラメの生存率（％）である。図７（ａ）において、感染後日数０日は、投与開始１日目を意味する。
【０１０３】
図７（ａ）に示すように、感染１０日後のヒラメの生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で６３％（１９尾／３０尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で７６％（２２尾／２９尾）であり、いずれも、コントロール群（５０％、１５尾／３０尾）に比べて上昇した。コントロール群と比較すると、高濃度投与群で有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
（２）抽出液含有餌ペレットを７日間投与後に感染を行った場合（予防効果の検討）
図７（ｂ）に、予防効果の確認実験の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はヒラメの生存率（％）である。図７（ｂ）において、感染後日数０日は、投与開始７日目を意味する。
【０１０５】
図７（ｂ）に示すように、感染１０日後の生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８９％（３１尾／３５尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で７６％（２６尾／３４尾）であり、いずれも、コントロール群（７１％、２４尾／３４尾）に比べて上昇した。コントロール群と比較すると、低濃度投与群で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
３．考察
上記のとおり、治療効果の確認実験では、高濃度投与群において有意な効果が認められたことから、上記のミカン果皮抽出物を２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の割合で投与すると、滑走細菌症からヒラメを効果的に治療できると考えられる。これに対し、予防効果の確認実験では、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）において有意な効果が認められた。これらの実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整することにより、所望とする治療効果および予防効果の両方が得られることが大いに期待される。
【０１０７】
実施例３：ブリ類結節症に対する感染防御効果
１．実験方法
（１）供試魚
治療効果の確認実験には、ブリ（平均体重１９．１ｇ）を、一実験群（１区）当たり４９〜５０尾ずつ使用した。以下の実験に入る前に、ブリは、２００Ｌ水槽に収容し、３日間馴致した。実験中、ブリを入れた水槽には絶えず給水し、水を循環させた。
【０１０８】
また、予防効果の確認実験には、ブリ（平均体重７８．０ｇ）を、一実験群（１区）当たり２０〜２１尾ずつ使用した。本実施例では、まず治療効果の確認実験を行なってから、予防効果の確認実験を行なったため、予防効果の確認実験に供したブリの体重は、治療効果の確認実験に用いたブリに比べて増加している。
【０１０９】
（２）供試菌
本実施例では、類結節症原因菌（Photobacterium damuselae subsp.piscicida)O-82352M株を使用した。詳細には、−８０℃に凍結保存しておいた上記菌株を融解し、その１００μＬを採取し、５０ｍＬ三角フラスコに入れた少量のブレインハートインヒュージョン培地（ＢＨＩ、ＮａＣｌを２％に調製）に接種して２４時間振とうしながら前培養を行った。このようにして得られた前培養菌液０．７５μＬを、３００ｍＬのＢＨＩ培地（類結節症原因菌用培地）が入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、２４時間振とうして本培養を行ったものを、類結節症原因菌感染用菌原液とした（菌濃度：約７．９×１０7ＣＦＵ／ｍＬ）。
【０１１０】
感染に当たっては、上記の菌原液を海水で希釈し、治療効果確認実験における感染実験には２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬの菌濃度とした液に、一方、予防効果確認実験における感染実験には２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬおよび１．９×１０6ＣＦＵ／ｍＬの菌濃度とした液に、ブリを１０分間浸漬して感染を行った。
【０１１１】
以下では、２．４×１０5ＣＦＵ／ｍＬの菌液濃度で感染させたものを低濃度感染群、１．９×１０6ＣＦＵ／ｍＬの菌液濃度で感染させたものを高濃度感染群と呼ぶ。
【０１１２】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
前述した実施例１と同様にして、エタノール抽出液を調製した。
【０１１３】
（４）魚への投与量
前述した実施例１と同様にして、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレット（低濃度餌ペレット）および２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日の抽出物含有餌ペレット（高濃度餌ペレット）を調製し、各餌ペレットを、ブリに自由摂取させた。
【０１１４】
（５）細菌感染実験
前述した実施例２において、治療効果の確認実験および予防効果の確認実験に用いた類結節症原因菌の菌液濃度（感染時の濃度）を上記のように変更したこと以外は前述した実施例２と同様にして、類結節症に対する治療効果および予防効果の確認実験を行なった。
【０１１５】
２．実験結果
（１）抽出液含有餌ペレットの投与開始１日目に感染を行った場合（治療効果の検討）
図８（ａ）に、低濃度感染群における治療効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はブリの生存率（％）である。
【０１１６】
図８（ａ）に示すように、感染１０日後のブリの生存率は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で１６．０％（８尾／５０尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で３２．７％（１６尾／４９尾）であり、高濃度投与群ではコントロール群（２０．４％、１０尾／４９尾）に比べて生存率が上昇した。
【０１１７】
（２）抽出液含有餌ペレットを７日間投与後に感染を行った場合（予防効果の検討）
図８（ｂ）に、低濃度感染群における予防効果の結果を示し、図８（ｃ）に、高濃度感染群における予防効果の結果を示す。いずれの図も、横軸は感染後日数であり、縦軸はブリの生存率（％）である。
【０１１８】
低濃度感染群の場合、図８（ｂ）に示すように、感染１０日後の生存率は、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で９５％（１９尾／２０尾）、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８６％（１８尾／２１尾）であり、いずれも、コントロール群（６５％、１３尾／２０尾）に比べて顕著に上昇した。コントロール群と比較すると、低濃度投与群および高濃度投与群の両方において有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１１９】
一方、高濃度感染群の場合、図８（ｃ）に示すように、感染１０日後の生存率は、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で５０％（１０尾／２０尾）、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で１０％（２尾／２０尾）、コントロール群で２０％（４尾／２０尾）であり、高濃度投与群は、コントロール群に比べて生存率が著しく上昇し、有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
３．考察
上記のとおり、治療効果の確認実験では、低濃度投与群において生存率の上昇が認められた。一方、予防効果の確認実験では、低濃度感染群では高濃度投与群および低濃度投与群の両方に有意な効果が認められ、高濃度感染群では高濃度投与群で有意な効果が認められた。これらの実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整することにより、所望とする治療効果および予防効果の両方が得られることが大いに期待される。
【０１２１】
４．総合考察
以上の結果を総合的に勘案すると、本実施例に用いたミカン果皮抽出物を、おおむね、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（魚体重）程度の割合で魚に投与すると、ヒラメ滑走細菌症およびブリ類結節症の双方に対して治療効果および予防効果が発揮され得ることが確認された。この実験結果は、本実施例で用いた魚病以外の、他の細菌性感染症の予防または治療に、本発明の上記抽出物が効果的に用いられることを強く示唆するものである。
【０１２２】
実施例４：マダイイリドウイルスによる感染症に対する感染予防効果
１．実験方法
（１）供試魚
マダイイリドウイルス（red sea bream iridovirus、ＲＳＩＶ）に感染した経歴のないマダイ当歳魚（平均体重約２０ｇ）を、一実験群（１区）当たり４０尾ずつ使用した。マダイは、２００ＬのＦＲＰ製水槽４連付き循環水槽システムのうち３水槽を使用して飼育した。実験期間中の水温は、約２８〜３０℃の範囲に制御した。
【０１２３】
（２）供試菌
本実施例では、マダイイリドウイルスとしてＲＳＩＶ Ｕ−６株を使用した。詳細には、細胞培養用小フラスコに単層を形成させたＧＦ（Grow Factor、細胞成長因子）細胞に、上記のウイルス原液を２００μＬ接種して培養し、ウイルス増殖により細胞変性効果が全体に広がったことを確認した培養物を、使用時まで−８０℃で凍結保存した（ウイルス力価２．７×１０5ＴＣＩＤ50）。
【０１２４】
（３）使用した柑橘類の果皮抽出物
前述した実施例１と同様にして、エタノール抽出液を調製した。
【０１２５】
（４）魚への投与量
試験飼料として、市販のＥＰ飼料１００ｇに対して、上記のようにして得られたエタノール抽出液を、１０ｍＬ（エタノール抽出物量換算で約８ｇ、高濃度投与群、２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）、または１ｍＬ（エタノール抽出物量換算で約０．８ｇ、低濃度投与群、０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）浸み込ませたものを用いた。比較のため、通常のＥＰ飼料（上記抽出液果の混入なし）も用いた（コントロール群）。いずれの群も、７日分で約１００ｇの飼料を毎日１回、自由摂食により投与した。
【０１２６】
（５）ウイルス感染実験
上記抽出液によるマダイイリドウイルス（ＲＳＩＶ）に対する予防効果を確認するため、マダイに、上記の各飼料を１週間（７日間）連続して給餌させた後（投与開始１日目〜７日目）、投与１０日目に、以下の浸漬感染法によりウイルスに感染させ、予防効果を検討した。本実施例では、前述した実施例２や実施例３と異なり、投与１０日目にウイルスの感染を行なったが、これは、台風接近の影響のため、投与７日目に感染実験を行なうことができなかったためである。
【０１２７】
詳細には、上記のようにして得られたＲＳＩＶウイルス液（ウイルス力価２．７×１０5ＴＣＩＤ50）を海水で１０万倍希釈したウイルス海水液５０Ｌを用意し、通気しながら、各実験群のマダイを３０分間浸漬処理して感染させた。次いで、感染後のマダイを、上記の各飼育水槽に戻し、通常の餌ペレット（上記抽出液果の混入なし）を毎日与えて飼育し、感染後の死亡数（２２日まで）を毎日測定し、各実験群の生存率を測定した。各実験群の生存率の結果は、Ｆ検定により有意差を検討した。
【０１２８】
なお、マダイは、飼育中に共食いによる死亡が良く見られるが、上記生存率（％）［＝｛（母数−死亡数）／母数｝×１００］の算出に当たっては、母数および死亡数ともに、共食いによる死亡または共食いによる死亡が疑われるが死亡原因が特定できないものは除いて計算した。
【０１２９】
２．実験結果
図１１に、ＲＳＩＶウイルスに対する予防効果の結果を示す。横軸は感染後日数であり、縦軸はマダイの生存率（％）である。図１１において、感染後日数０日は、投与開始１０日目を意味する。
【０１３０】
図１１に示すように、マダイの死亡は感染後８日目から始まり、１０日後には、すべての実験群で生存率は５０％以下に減少したが、感染後１６日目には死亡が終息した。最終的な生存率（感染後２２日目の生存率）は、低濃度投与群（０．２４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で８．１％（３尾／３７尾）、高濃度投与群（２．４ｇ／ｋｇ魚体重／日）で３０．６％（１１尾／３６尾）、コントロール群で１０．８％（４尾／３７尾）であったり、高濃度投与群では、コントロール群に比べて生存率が高くなる傾向が認められた。
【０１３１】
また、ウイルスにより死亡したマダイを解剖したところ、ＲＳＩＶ病に特徴的な脾臓の腫大が多くの個体で観察され、鰓の褪色斑および肝臓の出血を示す個体も認められた。
【０１３２】
３．考察
上記の実験結果から、本発明の感染防除剤の投与量を適切に調整して投与することにより、細菌のみならずウイルスによる感染症に対しても所望とする予防効果が得られ、更には治療効果も得られることが大いに期待される。なお、上記の実験では、イリドウイルスによる感染症に対する防除効果を調べたが、それ以外の、他のウイルス性感染症の予防または治療に、本発明の上記抽出物が効果的に用いられることを強く示唆するものである。
【０１３３】
４．総合考察
上記の実施例では、柑橘類果皮のエタノール抽出液を用いたときにおける、魚病の感染予防効果および感染治療効果を調べたが、これらの実験結果は、上記の活性物質ＡおよびＢを少なくとも活性成分として含有する、本発明に用いられる柑橘類果皮の抽出物においても、上記効果を奏することを強く示唆するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類の果皮抽出物を含有する、免疫蛋白質の産生促進剤であって、
前記抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲルカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する物質であって、
液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【請求項２】
前記抽出物として、前記エタノール抽出液のうちヘキサンに溶解するものを主に含有する抽出物を用いる請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項１】
柑橘類の果皮抽出物を含有する、免疫蛋白質の産生促進剤であって、
前記抽出物は、柑橘類の果皮をエタノールで抽出し、得られたエタノール抽出液を、オクタデシルシリル化シリカゲルカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件で分画したとき、アセトニトリル濃度７０％から９０％の画分に出現する物質であって、
液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が約３７８および約２８０である、二種類の活性物質を少なくとも含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：吸光度（２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル（２０％→１００％）
溶出条件：
（１）０〜５分：２０％
（２）５〜２０分：２０％→７０％
（３）２０〜６０分：７０％→１００％
【請求項２】
前記抽出物として、前記エタノール抽出液のうちヘキサンに溶解するものを主に含有する抽出物を用いる請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１３−６３９１７（Ｐ２０１３−６３９１７Ａ）
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０２２１６（Ｐ２０１１−２０２２１６）
【出願日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【出願人】（５１１２２５５７２）
【出願人】（５１１２２５１２５）
【出願人】（５１１２２５５８３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【出願人】（５１１２２５５７２）
【出願人】（５１１２２５１２５）
【出願人】（５１１２２５５８３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
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