免疫誘導剤及びその用途
【課題】癌の治療及び／又は予防剤として有用なペプチドを見出し、該ペプチドの免疫誘導剤としての用途を提供すること。
【解決手段】カルモジュリン２がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることが見出された。カルモジュリン２タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有し、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用である。
【解決手段】カルモジュリン２がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることが見出された。カルモジュリン２タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有し、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの癌に特異的なタンパク質又はその部分ペプチドを含む免疫誘導剤に関する。さらに本発明は、上記ペプチドによって刺激され誘導された活性化Ｔ細胞、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞、上記活性化Ｔ細胞又は上記抗原提示細胞を有効成分として含む医薬、前記タンパク質の遺伝子発現量を指標とした癌の検出方法、及び該タンパク質に対する抗体を含む癌の診断剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。
【０００３】
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。１９９１年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２を参照）。Boonの報告後ＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識する抗原としてtyrosinase（非特許文献３を参照）、MART1/MelanA（非特許文献４を参照）、ｇｐ１００（非特許文献５を参照）などの単離が行われた。
【０００４】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるタンパク質は、正常細胞には少なく、癌細胞に過剰に存在していることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Robbins P.F. et al., Cancer Res., 54:3124-3126(1994)
【非特許文献４】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9):3515-3519(1994)
【非特許文献５】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6458-6462(1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤として有用なペプチドを見出し、該ペプチドの免疫誘導剤としての用途を提供することである。また、本発明の目的は、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞、及びペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞並びにそれらの癌の治療及び／又は予防剤の用途を提供することである。さらに、本発明の目的は、前記ペプチドの発現量を指標とした癌の検出方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、前記ペプチドに対する抗体又はその抗原結合性断片の、癌の診断剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、カルモジュリン２（以下ＣＡＬＭ２と略記することがある）がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを見出した（実施例１を参照）。そして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する上記ＣＡＬＭ２タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク若しくは免疫誘導活性を有し、連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片、又は前記カルモジュリン２タンパク若しくはその前記断片と８０％以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド、又は前記カルモジュリン２タンパク、その前記断片若しくは前記ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤を提供する。また、本発明は、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を提供する。さらに、本発明は、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号１に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン２遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、癌の治療及び／又は予防や、そのための抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用なペプチドが新規に同定され、医学分野における該ペプチドの各種用途が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、前記ペプチドにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して優れた細胞障害活性を示す。従って、本発明で用いられるペプチドは、これをヒトに投与することにより、又はこれを用いてインビトロで活性化Ｔ細胞をヒトに投与することにより、癌の治療及び／又は予防に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。参照番号１；配列番号３のペプチドについての結果、参照番号７；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号８；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号９；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号２；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号３；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【図２】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。
【図３】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。参照番号４；配列番号３のペプチドについての結果、参照番号１０；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号１１；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号１２；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号５；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号６；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【図４】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。参照番号１３；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号１４；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号１５；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号１６；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号１７；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、「ペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）のみならず、アミノ酸数が多いポリペプチドやタンパク質も包含され、本発明ではカルモジュリン２の全長タンパク質も包含される。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク（以下ＣＡＬＭ２タンパクと略記することがある）。
(b) (a)の断片であって、連続する７個以上のアミノ酸配列からなり、免疫誘導活性を有する断片（以下、便宜的に「免疫誘導性断片」と言うことがある）。
(c) (a)のカルモジュリン２タンパク又は(b)の断片と、８０％以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある）。
(d) (a)のカルモジュリン２タンパク、(b)の断片または(c)のペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある）。
【００１２】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」とは、Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr Metのアミノ酸配列を持つ１０アミノ酸残基のサイズのペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」を「配列番号３のペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。
【００１３】
ここで、「免疫誘導活性」は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させる能力を意味し、具体的には、下記実施例に詳述する方法により測定される、ペプチドで刺激されたＴ細胞のIFN-γ産生能力及び／又はＣＡＬＭ２発現癌細胞に対する細胞障害活性が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりも高く、かつ、ペプチドで刺激されたＴ細胞が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりもよく増殖することを意味する。増殖は、目視観察、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。なお、下記実施例で採用したIFN-γ産生能力の測定は、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載されており、また、細胞障害活性の測定は、Int.J.Cancer,58:p317,1994に記載された51Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法に準拠している。
【００１４】
上記(a)のカルモジュリン２タンパクをコードするＣＡＬＭ２遺伝子は、本願発明者らが、ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを初めて見出したものである（実施例１を参照）。
【００１５】
上記(b)の免疫誘導性断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクの断片であって、免疫誘導活性を有するものである。該断片は、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、好ましくは連続する９個以上のアミノ酸からなる。
【００１６】
上記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの少数のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入され、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するペプチドである。ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には短い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトを用いて容易に算出することができる。また、該免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの１ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたペプチドであることも好ましい。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記本発明の免疫誘導性部分ペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。
【００１７】
上記(d)の免疫誘導性付加ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク、前記(b)の免疫誘導性断片又は前記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドである。すなわち、(a)のタンパク質、(b)の断片又は(c)のペプチドの一端又は両端に他のペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するペプチドである。これらのペプチドも、本発明の免疫誘導剤等の調製に用いることができる。
【００１８】
本発明で用いられる上記ペプチドの好ましい例として、配列番号２中の(1)aa9〜17の９アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の１０アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の９アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の９アミノ酸の領域を含む、９アミノ酸以上のペプチドを挙げることができる。なお、(1)ないし(4)の領域のアミノ酸配列は、配列表中にそれぞれ配列番号５、配列番号３、配列番号７、配列番号６として示されている。
【００１９】
本発明で用いられる上記ペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、カルモジュリン２遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、カルモジュリン２遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするペプチドを得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
【００２０】
下記実施例に具体的に記載されるように、上記ペプチドは、免疫誘導活性を示す。すなわち、該ペプチドで刺激したＴ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示し、増殖する。従って、該ペプチドを有効成分として含む免疫誘導剤を生体に投与することにより、癌を治療及び／又は予防することができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。なお、下記実施例では、免疫誘導活性が高い領域を選択して用いているが、例えばカルモジュリン２タンパクの全長を用いた場合であっても、生体内で分解され、結果として免疫誘導活性の高い領域を含む断片を生じることになるので、本発明では該タンパク質全長や、アミノ酸数が３０を超えるその断片、特に全長の半分以上のサイズを有する大きな断片を用いることもできる。
【００２１】
本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防剤として用いる場合、対象となる癌としては、ＣＡＬＭ２を発現している癌を挙げることができ、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができる。また、投与対象は、哺乳動物であり、特にヒトが好ましい。
【００２２】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。また、投与量は、免疫誘導するのに有効な量、すなわち、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させるのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。投与量は、症状、使用目的等に応じて適宜選択されるが、通常、0.0001μｇ〜1000μｇ、好ましくは0.001μｇ〜1000μｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００２３】
本発明の免疫誘導剤は、ペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することができる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００２４】
また、上記ペプチドを生体内に投与することにより、該ペプチドを生体内で抗原として認識させ、生体にあらかじめ該ペプチドに対する免疫を誘導することができる。従って、上記ペプチドを有効成分として含有する本発明の免疫誘導剤は、ワクチンとして用いることができる。この場合には、免疫誘導剤は、有効成分として含む上記ペプチドに加えてアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ；ポリＩＣＬＣ；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。
【００２５】
ワクチンとして免疫誘導剤を用いる場合、有効成分として含有されるペプチドは、好ましくはＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００２６】
対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターフェロン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦｌｔ３リガンドが挙げられる。投与される場合、本発明の治療用組成物は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。
【００２７】
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ペプチドと、抗原提示細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞の処理剤として用いることができる。ここで、抗原提示細胞としては、ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＨＬＡクラスI分子が同定されており、周知である。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。
【００２８】
ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００２９】
本発明で用いられる上記ペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。すなわち、抗原提示細胞を、上記ペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とペプチドをインビトロで接触させる場合、該ペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００３０】
上記したペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞をも提供する。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ペプチドを提示し、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させる。
【００３１】
上記のようにして調製される、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。なお、本明細書において、上記のように、ペプチドを抗原提示細胞の表面に提示させるためにペプチドを抗原提示細胞の培養液に加えることを、「ペプチドで細胞をパルスする」と呼ぶことがある。また、上記ペプチドを提示する抗原提示細胞とＴ細胞を接触させることを、「ペプチドでＴ細胞を刺激する」と呼ぶことがある。
【００３２】
上記の共存培養により、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞をも提供する。
【００３３】
上記ペプチドを提示する上記抗原提示細胞は、生体内においても該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、これを生体に投与することにより癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。また、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すので、該Ｔ細胞を生体に投与することによっても癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。従って、本発明は、上記本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤、並びに上記本発明のＴ細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤をも提供する。治療対象となる癌の例としては、当然ながら、上記ペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の対象として上記した癌を挙げることができる。
【００３４】
生体に投与する抗原提示細胞又はＴ細胞は、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように本発明で用いられる上記ペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００３５】
抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００３６】
本発明が開示する、癌の治療及び／又は予防に用いることができるＣＡＬＭ２タンパクのアミノ酸配列自体は、配列番号２に示すとおり公知であり、ＣＡＬＭ２遺伝子のコード領域の塩基配列も配列番号１に示すとおり公知である。従って、ＣＡＬＭ２タンパクをコードするポリヌクレオチドを含み、哺乳動物細胞中で該ポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターを調製することができ、該組換えベクターを癌の治療及び／又は予防のための遺伝子ワクチンとして利用することができる。
【００３７】
ベクターに挿入するポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、また、上記した免疫誘導性断片をコードする領域の塩基配列を有するものであってもよい。あるいは、その保存的置換塩基配列（コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの）を用いることができる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した免疫誘導性修飾ペプチド及び免疫誘導性付加ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができる。これらのポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により合成することができる。これらのポリヌクレオチドをベクターに挿入してもよい。また、ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
【００３８】
哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、これら自体は周知であり、種々のものが市販されているので、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターのマルチクローニング部位に上記したポリヌクレオチドを挿入することにより、前記組換えベクターを得ることができる。
【００３９】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。
【００４０】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡ ウイルスまたはＤＮＡ ウイルスに本発明のＤＮＡ を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００４１】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４２】
本発明で用いられる上記ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００４３】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明で用いられる上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４４】
一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。微生物用のベクターに上記ポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、本発明で用いられる上記ペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。微生物への組換えベクターの組み込みは周知の方法により行なうことができる。
【００４５】
下記実施例１に記載される通り、カルモジュリン２遺伝子（そのコード領域の塩基配列を配列番号１に示す）は、癌組織において正常組織よりも有意に高発現している。従って、癌の疑いのある患者から得た試料における、該カルモジュリン２遺伝子の発現量を、健常者から得た試料における発現量と比較することにより、該患者が癌であるか否かを調べることができる。発現量の比較は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、癌を罹患していることが分かっている複数の患者と、複数の健常者とから試料を得て、カルモジュリン２遺伝子の発現量を調べ、癌患者集団と健常者集団それぞれについてカルモジュリン２遺伝子発現量の基準値を定める。そして、癌であるか否かを診断すべき患者から試料を得て、該試料中のカルモジュリン２遺伝子発現量を調べ、前記基準値と比較する。発現量が健常者基準値よりも有意に高く、癌患者基準値に近ければ、その患者は癌である可能性が高いと考えられる。健常者基準値との比較のみでも癌の検出は可能であるが、癌患者基準値とも比較することにより、さらに検出精度を高めることができる。なお、前記基準値は、例えば、各試料における発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、遺伝子の発現量は、該遺伝子から生産されるmRNA又はタンパク質の量を測定することにより調べることができる。試料としては、例えばヒト由来の体組織等を用いることができる。mRNA又はタンパク質の量は常法により測定することができる。例えば、カルモジュリン２のmRNAは、該mRNAを鋳型とするリアルタイム検出RT-PCRのような常法により定量することができ、常法であるノーザンブロットにおける染色強度等によっても概ね定量することができる。また、タンパク質の量は、常法である免疫測定により定量することができる。
【００４６】
カルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中のカルモジュリン２タンパクの検出又は定量を行うことができる。癌組織中では正常組織よりも有意にカルモジュリン２遺伝子の発現量が高いので、該遺伝子にコードされるカルモジュリン２タンパクの蓄積量も有意に高いと考えられる。従って、そのような抗体又はその抗原結合性断片を用いることによっても、上記の通り癌の検出を行うことができる。すなわち、本発明は、カルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤をも提供する。本発明の癌の診断剤を用いた癌の検出は、上記したカルモジュリン２遺伝子の発現量を指標とする癌の検出方法と同様に、癌の疑いのある患者由来の試料と健常者由来の試料との間でのタンパク質蓄積量の比較に基づいて行うことができる。
【００４７】
ここで、抗原結合性断片とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab')2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行なうことができる。例えば、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより該ペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、本発明のペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から本発明のペプチドを対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。
【００４８】
免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、フローサイトメトリーも免疫測定の１種と考えることができる。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、上記抗体又はその抗原結合性断片はこれらのいずれにも用いることができる。癌の診断剤として用いる場合は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないサンドイッチELISAや凝集法を適用することが好ましい。なお、本発明で用いられる上記ペプチドは、該ペプチドを発現する細胞を競合法で検出又は測定する場合の免疫測定用試薬として用いることもできる。
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【実施例】
【００５０】
実施例１：癌組織のDNAマイクロアレイ解析
（１）実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た１１９名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び／又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
【００５１】
（２）全ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食道組織における非ガン組織（正常組織）を用いた。おのおのの組織から、Trizol reagent（Invitrogen社）を用いて、同社推奨のプロトコールにより全ＲＮＡを調製した。
【００５２】
上述の方法で得られた全ＲＮＡ １μｇについて、oligo(dT)プライマー及びランダムノナマーを併用し、CyScribe First-Strand CDNA Labeling Kit（ＧＥヘルスケア社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。正常組織由来又は食道ガン組織由来の全ＲＮＡにはCy3-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンス全ＲＮＡ（Stratagene社）にはCy5-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはQIA quick PCR purification Kit（QIAGEN社）で精製してからハイブリダイズに用いた。
【００５３】
（３）オリゴＤＮＡマイクロアレイの作製
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChip（登録商標）(Human Genome U133 A)及び本明細書中で述べる方法に従って作製したＤＮＡチップを使用した。
【００５４】
ＤＮＡチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴＤＮＡの種類を決定するために、Affymetrix社GeneChip（登録商標）を用いて遺伝子の絞込みを行った。GeneChip（登録商標）の操作については、Complete GeneChip（登録商標） Instrument System及び添付の指示書に基づいて実施した。Complete GeneChip（登録商標）を用いた解析の結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりうる遺伝子を計８９６１種抽出した。
【００５５】
抽出した８９６１種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０−７０ｍｅｒをそれぞれ選択して合成した。４倍に希釈したSolution I（タカラバイオ社）に３０μＭとなるように溶解した、８９６１種の６０又は７０ｍｅｒからなる合成オリゴＤＮＡを、MATSUNAMI ＤＮＡマイクロアレイ用コートグラスＤＭＳＯ対応TypeIアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定コート（松浪硝子工業株式会社）上にスポッター（GMS417arrayer，Affymetrix社）を用いて湿度環境５０−６０％でスポットした。
【００５６】
（４）ハイブリダイゼーション
標識したｃＤＮＡ 1μgをアンチセンスオリゴカクテル（QIAGEN）に溶解し、Ｇａｐカバーグラス（松浪硝子工業）を載せたＤＮＡチップにアプライし、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄した。
【００５７】
（５）遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをAgilentマイクロアレイスキャナー（Agilent社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC，及びCauston H.C.ら著「A beginner's guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationとLOWESS（locally weighted scatterplot smoother）による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、食道ガン病変部における発現量が、非ガン組織部よりも多い遺伝子として、ＣＡＬＭ２を見出すことができた。
【００５８】
実施例２：ＣＡＬＭ２由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスI分子に結合可能と予想されるペプチド２４種類を選択した。
【００５９】
（２）HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., 米国ニューヨーク州Grand Island）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。
【００６０】
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。
【００６１】
（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。
【００６２】
実施例３：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するＣＡＬＭ２由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、配列番号３、５、６又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、パルスに用いた各ペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号３、５、６又は７のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図１）。中でも、配列番号３のペプチドでパルスした場合におけるＩＦＮ−γ産生量が顕著に高かった。従って、配列番号３、５、６及び７のペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。
【００６３】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。参照番号７、８及び９はそれぞれ配列番号５、６及び７のペプチドについての結果を示す。参照番号２はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドＡＥＬＲＨＶＭＴＮＬ（配列番号４）についての結果を示す（比較例１）。参照番号３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例２）。
【００６４】
（２）次に、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドが、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。ＣＡＬＭ２の発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Stein GH et al.,J. Cell Physiol., 99:43-54(1979)、ＡＴＣＣより購入）を１０５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４および１．２５ｘ１０４個の配列番号３のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号３のペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した（図２）。従って、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドは、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。
【００６５】
同様にして、配列番号５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｔ９８Ｇに対して細胞障害活性を示した（図４）。なお、図４中、横軸の参照番号１３、１４および１５は、それぞれ配列番号５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号１６はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例５）、横軸の参照番号１７はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例６）。
【００６６】
さらに、配列番号３，５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２の発現が確認されている別の悪性脳腫瘍細胞株、Ｕ８７ ＭＧ（Beckman G et al.,Hum.Hered., 21:238-241(1971)、ＡＴＣＣより購入）に対して細胞障害活性を示した（図３）。
【００６７】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたCD8陽性T細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したCD8陽性T細胞のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧに対する細胞障害活性を示した結果である。＊式：細胞障害活性（％）＝CD8陽性T細胞を加えた際のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００
【００６８】
なお、図３中、横軸の参照番号４、１０，１１および１２は、それぞれ配列番号３、５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号５はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例３）、横軸の参照番号６はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例４）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明で用いられるペプチドは、免疫誘導剤、特に癌の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用であり、また、癌の治療及び／又は予防剤として利用できる抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの癌に特異的なタンパク質又はその部分ペプチドを含む免疫誘導剤に関する。さらに本発明は、上記ペプチドによって刺激され誘導された活性化Ｔ細胞、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞、上記活性化Ｔ細胞又は上記抗原提示細胞を有効成分として含む医薬、前記タンパク質の遺伝子発現量を指標とした癌の検出方法、及び該タンパク質に対する抗体を含む癌の診断剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。
【０００３】
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。１９９１年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２を参照）。Boonの報告後ＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識する抗原としてtyrosinase（非特許文献３を参照）、MART1/MelanA（非特許文献４を参照）、ｇｐ１００（非特許文献５を参照）などの単離が行われた。
【０００４】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるタンパク質は、正常細胞には少なく、癌細胞に過剰に存在していることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Robbins P.F. et al., Cancer Res., 54:3124-3126(1994)
【非特許文献４】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9):3515-3519(1994)
【非特許文献５】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6458-6462(1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤として有用なペプチドを見出し、該ペプチドの免疫誘導剤としての用途を提供することである。また、本発明の目的は、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞、及びペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞並びにそれらの癌の治療及び／又は予防剤の用途を提供することである。さらに、本発明の目的は、前記ペプチドの発現量を指標とした癌の検出方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、前記ペプチドに対する抗体又はその抗原結合性断片の、癌の診断剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、カルモジュリン２（以下ＣＡＬＭ２と略記することがある）がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを見出した（実施例１を参照）。そして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する上記ＣＡＬＭ２タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク若しくは免疫誘導活性を有し、連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片、又は前記カルモジュリン２タンパク若しくはその前記断片と８０％以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド、又は前記カルモジュリン２タンパク、その前記断片若しくは前記ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤を提供する。また、本発明は、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を提供する。さらに、本発明は、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号１に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン２遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、癌の治療及び／又は予防や、そのための抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用なペプチドが新規に同定され、医学分野における該ペプチドの各種用途が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、前記ペプチドにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して優れた細胞障害活性を示す。従って、本発明で用いられるペプチドは、これをヒトに投与することにより、又はこれを用いてインビトロで活性化Ｔ細胞をヒトに投与することにより、癌の治療及び／又は予防に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。参照番号１；配列番号３のペプチドについての結果、参照番号７；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号８；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号９；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号２；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号３；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【図２】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。
【図３】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。参照番号４；配列番号３のペプチドについての結果、参照番号１０；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号１１；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号１２；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号５；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号６；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【図４】ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。参照番号１３；配列番号５のペプチドについての結果、参照番号１４；配列番号６のペプチドについての結果、参照番号１５；配列番号７のペプチドについての結果、参照番号１６；配列番号４のペプチドについての結果、参照番号１７；ペプチドを添加せずに処理を行なった場合についての結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、「ペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）のみならず、アミノ酸数が多いポリペプチドやタンパク質も包含され、本発明ではカルモジュリン２の全長タンパク質も包含される。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク（以下ＣＡＬＭ２タンパクと略記することがある）。
(b) (a)の断片であって、連続する７個以上のアミノ酸配列からなり、免疫誘導活性を有する断片（以下、便宜的に「免疫誘導性断片」と言うことがある）。
(c) (a)のカルモジュリン２タンパク又は(b)の断片と、８０％以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある）。
(d) (a)のカルモジュリン２タンパク、(b)の断片または(c)のペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある）。
【００１２】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」とは、Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr Metのアミノ酸配列を持つ１０アミノ酸残基のサイズのペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」を「配列番号３のペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。
【００１３】
ここで、「免疫誘導活性」は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させる能力を意味し、具体的には、下記実施例に詳述する方法により測定される、ペプチドで刺激されたＴ細胞のIFN-γ産生能力及び／又はＣＡＬＭ２発現癌細胞に対する細胞障害活性が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりも高く、かつ、ペプチドで刺激されたＴ細胞が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりもよく増殖することを意味する。増殖は、目視観察、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。なお、下記実施例で採用したIFN-γ産生能力の測定は、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載されており、また、細胞障害活性の測定は、Int.J.Cancer,58:p317,1994に記載された51Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法に準拠している。
【００１４】
上記(a)のカルモジュリン２タンパクをコードするＣＡＬＭ２遺伝子は、本願発明者らが、ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを初めて見出したものである（実施例１を参照）。
【００１５】
上記(b)の免疫誘導性断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクの断片であって、免疫誘導活性を有するものである。該断片は、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、好ましくは連続する９個以上のアミノ酸からなる。
【００１６】
上記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの少数のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入され、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するペプチドである。ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には短い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトを用いて容易に算出することができる。また、該免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの１ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたペプチドであることも好ましい。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記本発明の免疫誘導性部分ペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。
【００１７】
上記(d)の免疫誘導性付加ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク、前記(b)の免疫誘導性断片又は前記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドである。すなわち、(a)のタンパク質、(b)の断片又は(c)のペプチドの一端又は両端に他のペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するペプチドである。これらのペプチドも、本発明の免疫誘導剤等の調製に用いることができる。
【００１８】
本発明で用いられる上記ペプチドの好ましい例として、配列番号２中の(1)aa9〜17の９アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の１０アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の９アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の９アミノ酸の領域を含む、９アミノ酸以上のペプチドを挙げることができる。なお、(1)ないし(4)の領域のアミノ酸配列は、配列表中にそれぞれ配列番号５、配列番号３、配列番号７、配列番号６として示されている。
【００１９】
本発明で用いられる上記ペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、カルモジュリン２遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、カルモジュリン２遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするペプチドを得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
【００２０】
下記実施例に具体的に記載されるように、上記ペプチドは、免疫誘導活性を示す。すなわち、該ペプチドで刺激したＴ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示し、増殖する。従って、該ペプチドを有効成分として含む免疫誘導剤を生体に投与することにより、癌を治療及び／又は予防することができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。なお、下記実施例では、免疫誘導活性が高い領域を選択して用いているが、例えばカルモジュリン２タンパクの全長を用いた場合であっても、生体内で分解され、結果として免疫誘導活性の高い領域を含む断片を生じることになるので、本発明では該タンパク質全長や、アミノ酸数が３０を超えるその断片、特に全長の半分以上のサイズを有する大きな断片を用いることもできる。
【００２１】
本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防剤として用いる場合、対象となる癌としては、ＣＡＬＭ２を発現している癌を挙げることができ、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができる。また、投与対象は、哺乳動物であり、特にヒトが好ましい。
【００２２】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。また、投与量は、免疫誘導するのに有効な量、すなわち、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させるのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。投与量は、症状、使用目的等に応じて適宜選択されるが、通常、0.0001μｇ〜1000μｇ、好ましくは0.001μｇ〜1000μｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００２３】
本発明の免疫誘導剤は、ペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することができる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００２４】
また、上記ペプチドを生体内に投与することにより、該ペプチドを生体内で抗原として認識させ、生体にあらかじめ該ペプチドに対する免疫を誘導することができる。従って、上記ペプチドを有効成分として含有する本発明の免疫誘導剤は、ワクチンとして用いることができる。この場合には、免疫誘導剤は、有効成分として含む上記ペプチドに加えてアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ；ポリＩＣＬＣ；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。
【００２５】
ワクチンとして免疫誘導剤を用いる場合、有効成分として含有されるペプチドは、好ましくはＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００２６】
対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターフェロン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦｌｔ３リガンドが挙げられる。投与される場合、本発明の治療用組成物は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。
【００２７】
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ペプチドと、抗原提示細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞の処理剤として用いることができる。ここで、抗原提示細胞としては、ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＨＬＡクラスI分子が同定されており、周知である。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。
【００２８】
ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００２９】
本発明で用いられる上記ペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。すなわち、抗原提示細胞を、上記ペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とペプチドをインビトロで接触させる場合、該ペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００３０】
上記したペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞をも提供する。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ペプチドを提示し、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させる。
【００３１】
上記のようにして調製される、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。なお、本明細書において、上記のように、ペプチドを抗原提示細胞の表面に提示させるためにペプチドを抗原提示細胞の培養液に加えることを、「ペプチドで細胞をパルスする」と呼ぶことがある。また、上記ペプチドを提示する抗原提示細胞とＴ細胞を接触させることを、「ペプチドでＴ細胞を刺激する」と呼ぶことがある。
【００３２】
上記の共存培養により、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞をも提供する。
【００３３】
上記ペプチドを提示する上記抗原提示細胞は、生体内においても該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、これを生体に投与することにより癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。また、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すので、該Ｔ細胞を生体に投与することによっても癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。従って、本発明は、上記本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤、並びに上記本発明のＴ細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤をも提供する。治療対象となる癌の例としては、当然ながら、上記ペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の対象として上記した癌を挙げることができる。
【００３４】
生体に投与する抗原提示細胞又はＴ細胞は、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように本発明で用いられる上記ペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００３５】
抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００３６】
本発明が開示する、癌の治療及び／又は予防に用いることができるＣＡＬＭ２タンパクのアミノ酸配列自体は、配列番号２に示すとおり公知であり、ＣＡＬＭ２遺伝子のコード領域の塩基配列も配列番号１に示すとおり公知である。従って、ＣＡＬＭ２タンパクをコードするポリヌクレオチドを含み、哺乳動物細胞中で該ポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターを調製することができ、該組換えベクターを癌の治療及び／又は予防のための遺伝子ワクチンとして利用することができる。
【００３７】
ベクターに挿入するポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、また、上記した免疫誘導性断片をコードする領域の塩基配列を有するものであってもよい。あるいは、その保存的置換塩基配列（コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの）を用いることができる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した免疫誘導性修飾ペプチド及び免疫誘導性付加ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができる。これらのポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により合成することができる。これらのポリヌクレオチドをベクターに挿入してもよい。また、ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
【００３８】
哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、これら自体は周知であり、種々のものが市販されているので、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターのマルチクローニング部位に上記したポリヌクレオチドを挿入することにより、前記組換えベクターを得ることができる。
【００３９】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。
【００４０】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡ ウイルスまたはＤＮＡ ウイルスに本発明のＤＮＡ を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００４１】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４２】
本発明で用いられる上記ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００４３】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明で用いられる上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４４】
一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。微生物用のベクターに上記ポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、本発明で用いられる上記ペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。微生物への組換えベクターの組み込みは周知の方法により行なうことができる。
【００４５】
下記実施例１に記載される通り、カルモジュリン２遺伝子（そのコード領域の塩基配列を配列番号１に示す）は、癌組織において正常組織よりも有意に高発現している。従って、癌の疑いのある患者から得た試料における、該カルモジュリン２遺伝子の発現量を、健常者から得た試料における発現量と比較することにより、該患者が癌であるか否かを調べることができる。発現量の比較は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、癌を罹患していることが分かっている複数の患者と、複数の健常者とから試料を得て、カルモジュリン２遺伝子の発現量を調べ、癌患者集団と健常者集団それぞれについてカルモジュリン２遺伝子発現量の基準値を定める。そして、癌であるか否かを診断すべき患者から試料を得て、該試料中のカルモジュリン２遺伝子発現量を調べ、前記基準値と比較する。発現量が健常者基準値よりも有意に高く、癌患者基準値に近ければ、その患者は癌である可能性が高いと考えられる。健常者基準値との比較のみでも癌の検出は可能であるが、癌患者基準値とも比較することにより、さらに検出精度を高めることができる。なお、前記基準値は、例えば、各試料における発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、遺伝子の発現量は、該遺伝子から生産されるmRNA又はタンパク質の量を測定することにより調べることができる。試料としては、例えばヒト由来の体組織等を用いることができる。mRNA又はタンパク質の量は常法により測定することができる。例えば、カルモジュリン２のmRNAは、該mRNAを鋳型とするリアルタイム検出RT-PCRのような常法により定量することができ、常法であるノーザンブロットにおける染色強度等によっても概ね定量することができる。また、タンパク質の量は、常法である免疫測定により定量することができる。
【００４６】
カルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中のカルモジュリン２タンパクの検出又は定量を行うことができる。癌組織中では正常組織よりも有意にカルモジュリン２遺伝子の発現量が高いので、該遺伝子にコードされるカルモジュリン２タンパクの蓄積量も有意に高いと考えられる。従って、そのような抗体又はその抗原結合性断片を用いることによっても、上記の通り癌の検出を行うことができる。すなわち、本発明は、カルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤をも提供する。本発明の癌の診断剤を用いた癌の検出は、上記したカルモジュリン２遺伝子の発現量を指標とする癌の検出方法と同様に、癌の疑いのある患者由来の試料と健常者由来の試料との間でのタンパク質蓄積量の比較に基づいて行うことができる。
【００４７】
ここで、抗原結合性断片とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab')2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行なうことができる。例えば、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより該ペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、本発明のペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から本発明のペプチドを対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。
【００４８】
免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、フローサイトメトリーも免疫測定の１種と考えることができる。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、上記抗体又はその抗原結合性断片はこれらのいずれにも用いることができる。癌の診断剤として用いる場合は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないサンドイッチELISAや凝集法を適用することが好ましい。なお、本発明で用いられる上記ペプチドは、該ペプチドを発現する細胞を競合法で検出又は測定する場合の免疫測定用試薬として用いることもできる。
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【実施例】
【００５０】
実施例１：癌組織のDNAマイクロアレイ解析
（１）実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た１１９名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び／又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
【００５１】
（２）全ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食道組織における非ガン組織（正常組織）を用いた。おのおのの組織から、Trizol reagent（Invitrogen社）を用いて、同社推奨のプロトコールにより全ＲＮＡを調製した。
【００５２】
上述の方法で得られた全ＲＮＡ １μｇについて、oligo(dT)プライマー及びランダムノナマーを併用し、CyScribe First-Strand CDNA Labeling Kit（ＧＥヘルスケア社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。正常組織由来又は食道ガン組織由来の全ＲＮＡにはCy3-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンス全ＲＮＡ（Stratagene社）にはCy5-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはQIA quick PCR purification Kit（QIAGEN社）で精製してからハイブリダイズに用いた。
【００５３】
（３）オリゴＤＮＡマイクロアレイの作製
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChip（登録商標）(Human Genome U133 A)及び本明細書中で述べる方法に従って作製したＤＮＡチップを使用した。
【００５４】
ＤＮＡチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴＤＮＡの種類を決定するために、Affymetrix社GeneChip（登録商標）を用いて遺伝子の絞込みを行った。GeneChip（登録商標）の操作については、Complete GeneChip（登録商標） Instrument System及び添付の指示書に基づいて実施した。Complete GeneChip（登録商標）を用いた解析の結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりうる遺伝子を計８９６１種抽出した。
【００５５】
抽出した８９６１種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０−７０ｍｅｒをそれぞれ選択して合成した。４倍に希釈したSolution I（タカラバイオ社）に３０μＭとなるように溶解した、８９６１種の６０又は７０ｍｅｒからなる合成オリゴＤＮＡを、MATSUNAMI ＤＮＡマイクロアレイ用コートグラスＤＭＳＯ対応TypeIアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定コート（松浪硝子工業株式会社）上にスポッター（GMS417arrayer，Affymetrix社）を用いて湿度環境５０−６０％でスポットした。
【００５６】
（４）ハイブリダイゼーション
標識したｃＤＮＡ 1μgをアンチセンスオリゴカクテル（QIAGEN）に溶解し、Ｇａｐカバーグラス（松浪硝子工業）を載せたＤＮＡチップにアプライし、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄した。
【００５７】
（５）遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをAgilentマイクロアレイスキャナー（Agilent社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC，及びCauston H.C.ら著「A beginner's guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationとLOWESS（locally weighted scatterplot smoother）による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、食道ガン病変部における発現量が、非ガン組織部よりも多い遺伝子として、ＣＡＬＭ２を見出すことができた。
【００５８】
実施例２：ＣＡＬＭ２由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスI分子に結合可能と予想されるペプチド２４種類を選択した。
【００５９】
（２）HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., 米国ニューヨーク州Grand Island）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。
【００６０】
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。
【００６１】
（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。
【００６２】
実施例３：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するＣＡＬＭ２由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、配列番号３、５、６又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、パルスに用いた各ペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号３、５、６又は７のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図１）。中でも、配列番号３のペプチドでパルスした場合におけるＩＦＮ−γ産生量が顕著に高かった。従って、配列番号３、５、６及び７のペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。
【００６３】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。参照番号７、８及び９はそれぞれ配列番号５、６及び７のペプチドについての結果を示す。参照番号２はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドＡＥＬＲＨＶＭＴＮＬ（配列番号４）についての結果を示す（比較例１）。参照番号３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例２）。
【００６４】
（２）次に、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドが、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。ＣＡＬＭ２の発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Stein GH et al.,J. Cell Physiol., 99:43-54(1979)、ＡＴＣＣより購入）を１０５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４および１．２５ｘ１０４個の配列番号３のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号３のペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した（図２）。従って、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドは、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。
【００６５】
同様にして、配列番号５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｔ９８Ｇに対して細胞障害活性を示した（図４）。なお、図４中、横軸の参照番号１３、１４および１５は、それぞれ配列番号５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号１６はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例５）、横軸の参照番号１７はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例６）。
【００６６】
さらに、配列番号３，５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２の発現が確認されている別の悪性脳腫瘍細胞株、Ｕ８７ ＭＧ（Beckman G et al.,Hum.Hered., 21:238-241(1971)、ＡＴＣＣより購入）に対して細胞障害活性を示した（図３）。
【００６７】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたCD8陽性T細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したCD8陽性T細胞のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧに対する細胞障害活性を示した結果である。＊式：細胞障害活性（％）＝CD8陽性T細胞を加えた際のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００
【００６８】
なお、図３中、横軸の参照番号４、１０，１１および１２は、それぞれ配列番号３、５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号５はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例３）、横軸の参照番号６はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例４）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明で用いられるペプチドは、免疫誘導剤、特に癌の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用であり、また、癌の治療及び／又は予防剤として利用できる抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク若しくは免疫誘導活性を有し、連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片、又は前記カルモジュリン２タンパク若しくはその前記断片と８０％以上の同一性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド、又は前記カルモジュリン２タンパク、その前記断片若しくは前記ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤。
【請求項２】
前記カルモジュリン２タンパク又は免疫誘導活性を有する連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片を有効成分として含有する請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記断片は、配列番号２中の(1)aa9〜17の９アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の１０アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の９アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の９アミノ酸の領域を含む、９アミノ酸以上のペプチドである請求項１又は２記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
癌の治療及び／又は予防剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
ワクチン又は抗原提示細胞の処理剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
有効成分であるペプチドのアミノ酸数が７〜３０であり、抗原提示細胞の処理剤である請求項５記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
【請求項８】
請求項６記載のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
【請求項９】
請求項７記載の単離抗原提示細胞又は請求項８記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
請求項７記載の単離抗原提示細胞又は請求項８記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項１１】
癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号１に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン２遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
【請求項１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤。
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク若しくは免疫誘導活性を有し、連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片、又は前記カルモジュリン２タンパク若しくはその前記断片と８０％以上の同一性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド、又は前記カルモジュリン２タンパク、その前記断片若しくは前記ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤。
【請求項２】
前記カルモジュリン２タンパク又は免疫誘導活性を有する連続する７個以上のアミノ酸から成るその断片を有効成分として含有する請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記断片は、配列番号２中の(1)aa9〜17の９アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の１０アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の９アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の９アミノ酸の領域を含む、９アミノ酸以上のペプチドである請求項１又は２記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
癌の治療及び／又は予防剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
ワクチン又は抗原提示細胞の処理剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
有効成分であるペプチドのアミノ酸数が７〜３０であり、抗原提示細胞の処理剤である請求項５記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
請求項６記載のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
【請求項８】
請求項６記載のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
【請求項９】
請求項７記載の単離抗原提示細胞又は請求項８記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
請求項７記載の単離抗原提示細胞又は請求項８記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項１１】
癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号１に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン２遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
【請求項１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−２８６３９（Ｐ２０１３−２８６３９Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２４１８０（Ｐ２０１２−２２４１８０）
【出願日】平成２４年１０月９日（２０１２．１０．９）
【分割の表示】特願２００７−２４７０３１（Ｐ２００７−２４７０３１）の分割
【原出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月９日（２０１２．１０．９）
【分割の表示】特願２００７−２４７０３１（Ｐ２００７−２４７０３１）の分割
【原出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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