免疫調節物質の同定方法及びシステム
抗炎症能力に関して、細菌、細菌により精製若しくは生成された産生物及び／又は他の細菌物質をスクリーニングするための方法並びにシステムが提示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２００９年４月２３日に出願され、“抗炎症性特性を有する細菌のためのハイスループットスクリーン”と題名を付された米国仮出願第６１／１７２，１０１号（事件整理番号ＣＩＴ−５３５４−Ｐ）の優先権を主張するものであり、その開示の全てを参照して本明細書に組み込む。
【０００２】
政府機関の助成金の記述
国立衛生研究所から与えられた助成金第ＤＫ０７８９３８号に従って、アメリカ合衆国政府はこの発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、免疫調節物質、特に免疫調節微生物及び化合物の同定方法並びにシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
免疫調節微生物及び化合物の同定は、特に興味が持たれている。ヒト消化管は、免疫システムの発達と機能とに大きな影響を有する非常に多くの微生物（腸内細菌叢として知られる）を宿している。哺乳類の消化管に生息する細菌の無数の種のうち、バクテロイデス門は最も豊富なグラム陰性菌の門である。
【０００５】
特に、バクテロイデス・フラジリスは、免疫調節特性を有することが示されているヒト共生微生物である。特に、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節特性は、該細菌による多糖類Ａ（ＰＳＡ）の産生に関連している。
【０００６】
しかし、バクテロイデス・フラジリス（又は任意の共生細菌）が有益な微生物分子を免疫システムへ伝え、そして免疫調節特性を発揮するメカニズム及び／又は分子トリガーの同定は困難とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫調節性、特に抗炎症性特性を有する微生物及び関連する物質をスクリーニングする方法並びにシステムがここに提供される。特に、本明細書に提供されるのは、いくつかの実施形態において、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節応答に匹敵する免疫調節応答を個体中に引き起こすことができる細菌物質の同定を可能にする方法及びシステムである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の態様によれば、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、候補細菌物質を、単独で、或いは、抗原提示細胞の存在下でＴ細胞と接触させることと、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することとを含む。前記方法は、前記接触の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含む。
【０００９】
第二の態様によれば、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、前記接触の後に前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。前記方法は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することを更に含む。また、前記方法は、前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含む。
【００１０】
他の態様によれば、動物において、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補細菌物質で処理することを含み、前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物は、遺伝子的に修飾されて、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の標識化抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７又はＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つを発現する。前記方法は、前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカー、或いは、少なくとも一つの前記炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの、トランスジェニックマーカー非ヒト動物における発現を検出することと、前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することとを更に含む。
【００１１】
別の態様によれば、細菌物質をスクリーニングするためのシステムが記載される。システムは、本明細書に記載された抗炎症性細菌物質を同定する方法における同時、組み合わせまたは連続使用のために、Ｔ細胞と、抗原提示細胞と、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性マーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７又はＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの検出するための試薬と、の少なくとも二つを備える。
【００１２】
本明細書に記載された方法及びシステムは、本開示の解釈に応じて当業者により特定可能な、医学的、薬学的、獣医学的な用途、並びに、基礎生物学研究及び様々な用途に関連して使用されることができ、ここで、物質の免疫調節能、特に抗炎症性能を調査することが望ましい。
【００１３】
開示についての一つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において明らかにされている。他の特徴、目的、および利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【００１４】
本明細書に取り込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示についての一つ以上の実施形態を示し、発明の詳細な説明及び実施例の部分と共に、本開示の原理および実装を説明するために役に立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１は、バクテロイデス・フラジリス由来の外膜小胞が、ＰＳＡを含むことを示している。図１Ａは、ＥＤＬ（高電子密度層）富化バクテロイデス・フラジリスについて透過型電子顕微鏡法により検出された、野生型バクテロイデス・フラジリスから産生されたＯＭＶ（ＷＴ−ＯＭＶ）及びバクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから産生されたＯＭＶ（ΔＰＳＡ−ＯＭＶ）を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、野生型細菌及びＰＳＡ−変異細菌からの全細胞（ＷＣ）及び外膜小胞（ＯＭＶ）抽出物のイムノブロット分析を示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、抗ＰＳＡ及び抗ＩｇＧ−金コロイド複合体（５ｎｍ）で染色し、電子顕微鏡法により分析した精製ＯＭＶの免疫金法標識を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、全細胞及びＯＭＶからの莢膜多糖製剤の糖タンパク質染色を示す。
【図２Ａ】図２は、ＯＭＶが、ＰＳＡ依存的方法で、実験的大腸炎及び小腸炎から動物を保護していることを表す代表的な結果を示す。図２Ａは、初期重量から屠殺した日（４日）までの減量として測定された、ＴＮＢＳ大腸炎の誘発（０日）後の動物グループにおける重量減を報告する図表を示す。全てのグループが少なくとも４頭の動物を含み、誤差棒は標準誤差（ＳＥＭ）を示している。結果は三つの独立した試行を代表する。一元配置分散分析法によりｐ値は決定されている。*ｐ＜０．０５；***ｐ＜０．００１。
【図２Ｂ】図２Ｂは、切除直後の、媒体（ＥｔＯＨ）処理及びＴＮＢＳのグループ（ｎ＝４頭／グループ）からの未操作の大腸の画像と、長さの定量化（グラフ）を示す。誤差棒はＳＥＭを示す。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。ｐ値は一元配置分散分析法により決定された。***ｐ＜０．００１。ＮＳ（有意でない）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した、各処理グループの代表的な大腸の断面の画像を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、標準得点システム（ＯＮＬＩＮＥ ＭＥＴＨＯＤＳ）に従って盲検化病理学者（Ｇ．Ｗ．Ｌ）により指定された動物からの大腸炎スコアを示す（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ． （２００１） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １．１９．１−１５．１９．１４）。各記号は個々の動物を表す。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。***ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意でない。
【図２Ｅ】図２Ｅは、全大腸から回収したＲＮＡからのｑＲＴ−ＰＣＲによるサイトカイン転写分析を説明する図表を示す。誤差棒は、４頭／グループからのＳＥＭを示している。結果は三つの独立した試行の代表である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、精製した腸間膜リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞から回収したＲＮＡからのｑＲＴ−ＰＣＲによるサイトカイン転写分析を説明する図表を示す。誤差棒は、４頭／グループからのＳＥＭを示している。結果は三つの独立した試行の代表である。
【図３Ａ】図３は、ＰＳＡを含むＯＭＶが、処理されたＤＣと共培養したＴ細胞からのＩＬ−１０産生及びＦｏｘｐ３発現を誘導することを明らかにする結果を示す。図３Ａは、ＤＣによるＯＭＶ内部移行のフローサイトメトリー（ＦＣ）分析を示す。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識され、培養されたＤＣと共に様々な時間（図示のように）インキュベートされた。また、細胞は抗ＣＤ１１ｃで染色された。百分率は、ＣＤ１１Ｃ＋ＯＭＶ＋集団を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶと共に様々な時間（図示のように）インキュベートされ、且つ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＭＨＣＩＩで染色されたＤＣのＦＣプロットを示す。百分率は、ＣＤ１１Ｃ＋細胞中のＭＨＣＩＩ＋集団を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＣ又はＤＣ−Ｔ細胞共培養からの培養液上澄みのＩＬ−１０のＥＬＩＳＡ分析を示しており、ここで、ＤＣは、ＯＭＶと１８時間振動され、洗浄され、そして原発性ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートされ、或いは、されなかった。上澄みは培養４日目に採取された。培養液試料は、ＯＭＶと振動されていないが、他の点では全く同じように処理されたＤＣを示す。抗ＣＤ３は、Ｔ細胞応答を増幅するためにいくつかの試料に加えられた。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、五つ以上の独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１。
【図３Ｄ】図３Ｄの左図は、ＩＬ−１０−／−動物から分化したＤＣを含む以外は、図３Ｃと同様なＥＬＩＳＡ分析を示す。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。図３Ｄの右図は、ＴＬＲ２−／−動物から分化したＤＣを含む以外は、図３Ｃと同様なＥＬＩＳＡ分析を示す。ＳＥＡ：ブドウ球菌エンテロトキシンＡ。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＤＣとの生体外での培養の後に精製したＴ細胞亜集団から得られたＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された、ＩＬ−１０（左図）及びＦｏｘｐ３（右図）の転写濃度を示す。共培養は(ｃ−ｅ)のように作られ、４日目に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は磁器ビーズ分離で精製され（＞９５％純度）、そしてＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキットを用いて抽出された。相対値はβ−アクチンに標準化した。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。***ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意でない。
【図３Ｆ】図３Ｆは、共培養が(ｃ−ｅ)のように作られたが、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したことを示す。ＯＭＶで振動したＤＣとの４日間の培養の後に、細胞は抗ＣＤ４及びＦＣを用いたＧＦＰ発現により検出されたＦｏｘｐ３で染色された。結果は、二つの独立した試行を代表する。
【図４Ａ】図４は、ＰＳＡ含有ＯＭＶによる、Ｔｒｅｇの抑制機能の生体外発生を示す例示的な結果を表している。図４Ａは、ＯＭＶで処理されたＤＣと４日間共培養した後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団によるＩＬ−１０発現のＦＣヒストグラムを示す。脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１０−ＧＦＰマウスから精製され、共培養の後に抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５で染色され、そして、ＧＦＰ発現によりＩＬ−１０発現が測定された。百分率は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−亜集合のＩＬ−１０＋集団を示す。結果は、三つの独立した試行を代表する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、媒体（コントロール）、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶで処理したＤＣで共培養した後の、精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞による単純な応答細胞の生体外抑制を示す。細胞増殖は、ＣＦＳＲ希釈のＦＣにより測定された。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆの比は示されており、百分率は全増殖細胞を示す。Ｎｏ ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞のみである。結果は、二つの独立した試行を代表する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の、それぞれの増殖の最大時における百分率の定量化を示す（図４Ｂ中の１、２、３、４、５と同様に標識されている）。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。
【図５】図５は、野生型バクテロイデス・フラジリス及びＰＳＡ欠損変異バクテロイデス・フラジリスが、生体外培養中に同等のＯＭＶを産出することを示す。各ＯＭＶ製剤から回収された総タンパク質量は、収集時の培養液のＯＤ６００により標準化された。誤差棒はＳＥＭを示している。結果は、独立して実施された十以上の混合実験から示される。ｐ値はステューデントのｔ検定で決定された。ＮＳ：有意でない。
【図６】図６は、野生型バクテロイデス・フラジリスから精製した多数ＯＭＶがＰＳＡを含むことを示している。精製されたＯＭＶ上のＰＳＡの免疫金法標識は、試料の１０領域（１μｍ×１μｍ）のランダム標本抽出で観測されたＷＴ−ＯＭＶの６０％以下がＰＳＡに関連するが、観測されたΔＰＳＡ−ＯＭＶがＰＳＡについて陽性に染色されていないことを示す（抗ＩｇＧ−金を用いたＷＴ−ＯＭＶの免疫金法標識は、標識の特異性のみを確認する）。
【図７】図７は、野生型バクテロイデス・フラジリス又はＰＳＡ欠損変異バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶが、タンパク質構成に有意差がないことを示す。プロテオーム質量分析法は、ＷＴ−ＯＭＶとΔＰＳＡ−ＯＭＶとの間で同定されたタンパク質の１００％重複（各タンパク質について同定された一つ以上の特徴的なペプチド）を示す。全ての同定されたタンパク質の間で、我々は、それぞれのタンパク質について同定された特徴的なペプチドの番号に従い、相対的に大量のタンパク質の量を準定量的に比較した。それらの大部分は、独立して機能するような差異を示さない。誤差棒はＳＥＭを示している。ｐ値はステューデントのｔ検定で決定された。**ｐ＜０．０１；*ｐ＜０．０５；ＮＳ：有意でない。
【図８】図８は、アクチン重合が、ＤＣによるＯＭＶの取り込みに必要とされることを示している。サイトカラシンＤで予め処理されたＤＣによるＯＭＶ内部移行のフローサイトメトリー分析である。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識され、培養されたＤＣと共に様々な時間で（図に示されている）インキュベートされる。細胞は抗ＣＤ１１ｃで染色された。百分率はＣＤ１１Ｃ＋ＯＭＶ＋集合を示す。
【図９】図９は、ＷＴ−ＯＭＶ又はΔＰＳＡ−ＯＭＶが内部に取り込まれ、ＤＣの細胞質に局在化されていることを示す。ＤＣによるＯＭＶ（ＷＴ又はΔＰＳＡ）内部移行の蛍光顕微鏡写真である。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（灰色矢印）で標識され、培養されたＤＣと二時間インキュベートされた。細胞は固定化され、細胞膜はコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）−テトラメチルローダミン（黒色矢印）を用いて染色された。スケールバー：７．５μｍ。
【図１０】図１０は、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶが、ＤＣ活性化のための共刺激分子を増加させることを示している。ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶを用いて様々な時間で（図に示す）インキュベートされ、且つ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ８６で染色された、ＤＣのＦＣプロットである。百分率はＣＤ１１ｃ＋の中のＣＤ８６＋集合を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記載された実施形態における、バイオマーカーのＰＳＡ誘発発現を示す。各図表で示したデータは、各々の三つの独立した実験を代表する。色が薄い棒は、ＰＢＳ処理されたマウスから誘導した細胞を示し、色が濃い棒は、ＰＳＡ処理されたマウスから誘導した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
方法およびシステムは、免疫調節細菌物質を同定するために適していることが記載されている。
【００１７】
本明細書で使用される用語“免疫調節”は、炎症性応答のないことに関連付けられた状態を促進する能力を意味する。具体的な免疫調節特性は抗炎症性特性を含み、ここで、用語“抗炎症性”は、炎症を防ぐ若しくは低減する物質又は処理の特性を指す。
【００１８】
本明細書で使用される用語“炎症”、“炎症性状態”又は“炎症性応答”は、病原菌、損傷細胞、又は刺激物質などの有害な刺激に対する、個体の維管束組織の複雑な生物学的応答を意味し、またサイトカイン、より具体的には炎症誘発性サイトカイン（すなわち、ミクログリアなどの活性化免疫細胞によって主に産生され、炎症性応答の増幅に伴われるサイトカイン）の分泌を含む。例示的な炎症誘発性サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２３を含む。例示的な炎症は、急性炎症及び慢性炎症を含む。本明細書で使用される単語“急性炎症”は、血漿及び白血球による組織の浸潤に起因する、炎症の典型的兆候（腫れ、発赤、痛み、熱、および機能の喪失）を特徴とする短期的過程を意味する。急性炎症は、一般的に傷害性刺激が存在するかぎり発生し、そして刺激が、瘢痕化（線維症）によって除去され、壊滅され、又は遮断されると急性炎症が止む。本明細書で使用される単語“慢性炎症”は、同時発生性活動性炎症、組織破壊、及び修復の試みを特徴とする状態を意味する。慢性炎症は、上記の急性炎症の典型的兆候によって特徴付けられない。代わりに、慢性的に炎症を起こした組織は、単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞）の浸潤、組織破壊、並びに血管新生及び線維症を含む治療の試みにより特徴付けられる。
【００１９】
本明細書で使用される用語“物質”とは、特定の又は明確な化学構造の物体を意味する。用語“細菌物質”とは、生きた細菌、死んだ細菌、及び特に加熱死菌、細菌抽出物、細菌由来の精製分子、細菌から精製された分子の組み合わせ、又は細菌から若しくは細菌由来の精製小胞から精製された一つの分子を若しくは分子の組み合わせを含む小胞などの細菌由来の物質を意味する。特に、細菌物質は、細菌の表面から放出される小胞であって、遠隔の標的細胞へ一連の積み荷分子を運ぶ膜外小胞により形成され得る。細菌物質は、同じ細菌から誘導した物質及び二つ以上の異なる細菌から誘導した物質を含む。
【００２０】
本明細書で使用される用語“細菌”は、通常、長さ数マイクロメートルで、種々の形状を有している単細胞、原核細胞、微生物の大きなグループを意味する。特に、本開示の意味における細菌は、ヒトフローラの細菌、すなわち、ヒト組織の表面上並びに内部及び体液中、例えば、皮膚の深層、唾液中、口腔又は膣粘膜中及び消化管中に宿る微生物の集合を含む。細菌フローラは、腸フローラ（ヒト消化管において検出可能な細菌）、膣内フローラ（女性ヒトにおいて子宮から身体外側へつながる線維筋管路中において検出可能な細菌）及び皮膚フローラ（ヒト皮膚において検出可能な細菌）を含む。さらに、特に、本開示の意味における細菌とは、腸フローラの一つ以上のバクテロイデス門、特に、一つ以上のバクテロイデス属（ヒトと共生し、当業者によって識別可能である、グラム陰性の非芽胞形成嫌気性桿菌の属）により形成され得る。代表的なバクテロイデス属の細菌は、バクテロイデス・フラジリスである。
【００２１】
本明細書に記載の方法及びシステムにおいて、細菌物質の免疫調節能は、炎症性バイオマーカーおよび／または抗炎症性バイオマーカーの検出により決定され得る。本明細書で使用される用語“バイオマーカー”は、細胞周期の段階、生物学的プロセス、並びに健康状態及び疾患状態のような、生物学的状態の指標として使用される物質または特徴を意味する。バイオマーカーの存在、欠如、減少、発現上昇は、特定の状態に関連しており、また特定の状態を表示している。特に、本明細書に使用される用語“炎症性バイオマーカー”は、炎症状態の存在を表示しており、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ-２１、ＩＬ-２２、ＩＬ−２３、ＩＬ-１７、ＴＮＦα、並びに当業者により同定可能な追加の細胞マーカー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。本明細書に使用される用語“抗炎症性バイオマーカー”は、炎症状態がないことを表示し、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢ並びに当業者により同定可能な追加の細胞マーカー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される用語“トランスジェニックマーカー非ヒト動物”とは、自然に又は多くの遺伝子工学的操作のうちの任意の操作により移植された非天然の遺伝子材料を有する動物を指す。そのような非天然の遺伝子材料（又は導入遺伝子）は、“バイオマーカー”（本明細書で定義される）として作用し得、及び／又は非ヒト動物においてＲＮＡ若しくはタンパク質を産生する能力を保持し得る。
【００２３】
一実施形態において、免疫調節細菌物質の同定は、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞により、炎症性又は抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することにより実行される。
【００２４】
本明細書で使用される用語“Ｔ細胞”は、当業者により同定可能な異なる細胞種を含む、リンパ球（白血球の一種）の亜群を意味する。本開示によるヘルパーＴ細胞は、エフェクターＴｈ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７など）とサプレッサーＴ細胞（Ｔｒｅｇなど）とを含み、エフェクターＴｈ細胞は即ち、ヘルパーＴ細胞を含む、他の白血球と刺激し又は相互作用するサイトカイン、タンパク質又はペプチドを分泌するヘルパー細胞であり、サプレッサーＴ細胞は即ち、免疫システムの活性を抑制し、それにより免疫システムの恒常性と自己抗原への耐性とを維持するＴ細胞である。
【００２５】
本明細書で使用される用語“抗原提示細胞”とは、細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を用いて外来抗原複合体を提示する細胞を意味する。特に、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞及び当業者により同定可能な追加の細胞を含む。
【００２６】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、候補細菌物質を、単独で又は又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と、接触することを含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法は、候補細菌物質が抗原提示細胞と接触し、該接触の後の、前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。
【００２７】
本明細書で使用される用語“接触”又は“インキュベート”は、二つの項目の間の少なくとも一つの相互関係のある動作若しくは影響、又は相互関係のない動作若しくは影響が発揮されうるような状況の下に、一時的に与えられた二つの項目間で空間的関係の創造へ指向される動作を意味する。特に、インキュベートすることは、細菌物質と細胞との間で実行されることができ、細菌物質と細胞との間で直接的接触及び／若しくは直接的相互作用という結果になり、又は細菌物質の間接的作用の後に（例えば、細胞と直接的相互作用する他の物質の活性化又は修飾の後に）細胞の修飾という結果になる。
【００２８】
インキュベートはまた、細菌物質の第１の細胞との接触の後に、第１の細胞と第２の細胞との間で実行され得、その結果、第１の細胞と第２の細胞との間の直接的接触及び／又は直接的相互作用の結果になり得、又は第１の細胞の間接的作用の後に（例えば、第２の細胞と直接的な相互作用するサイトカイン又は他の分子の分泌の後に）第２の細胞の修飾の結果になり得る。
【００２９】
例示的な、細菌物質をＴ細胞又は抗原提示細胞と接触させることは、特異的な細胞及び特異的な細菌物質に依存し、本開示を読む当業者により同定可能である適当な条件下で、細菌物質を含有する溶液内において、一つ以上の細胞種を含む全試料を溶液槽により、生体外で実行され得る。さらなる例示的な、細菌物質と、Ｔ細胞又は抗原提示細胞との接触は、適した条件下で精製細胞の細胞培養液へ細菌物質を生体外で誘導することによって、及び個体（標識化炎症性バイオマーカー又は抗炎症性バイオマーカーを発現するために遺伝子的に修飾されているヒト以外の遺伝子移植の動物）を細菌物質を用いて生体内処理することによって、実行され得る。処理は、細菌物質を、局所投与又は全身投与することによって実行され得る。全身投与は、腸内投与（例えば、経口投与、胃栄養管による投与、十二指腸栄養管による投与、胃瘻造設、経腸栄養、および直腸投与）および非経口投与（例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、膀胱内注入）を含む。局所投与は、限定されないが、経皮投与、吸入投与（例えば、喘息治療薬内に）、浣腸、点眼（例えば、結膜上に）、点耳、鼻腔内経路（例えば、うっ血除去点鼻薬）、及び膣内投与を含む。
【００３０】
例示的な、抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることは、Ｔ細胞を含む細胞培養液と抗原提示細胞を含む細胞培養液とを生体外混合することにより、Ｔ細胞の培養液に精製抗原提示細胞を生体外で添加することにより、又は抗原提示細胞の培養液に精製Ｔ細胞を生体外で添加することにより実行され得る。さらなる例示的な、生体内でのＴ細胞と抗原提示細胞とのさらなるインキュベートすることは、個体組織への抗原提示細胞の移植、Ｔ細胞を含む組織、又は抗原提示細胞を含む個体組織の組織へのＴ細胞の移植を含む。一実施形態において、個体は、標識化炎症性バイオマーカーまたは抗炎症性バイオマーカーを発現するように遺伝子的に修飾されたヒト以外のトランスジェニック動物である。
【００３１】
物質と、抗原提示細胞又はＴ細胞との接触、及び抗原提示細胞とＴ細胞とのインキュベートを実行するための適切なさらなる手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によって生体外又は生体内で同定することができる。
【００３２】
接触またはインキュベートを実行するための適した条件は、当業者により同定可能であり、例えば、適した生育環境を細胞に与えるために、温度、また任意に大気のＣＯ２、Ｎ２及び／又はＯ２の濃度、相対湿度、栄養量並びにその他の適した条件を調整し、監視するロボットの細胞培養器を使用することによって、生体外又は適当な環境下での細胞培養に適した環境の提供を含む。また、生体外又は生体内での、物質及び細胞の接触を行うためのさらなる適当な手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によって同定され得る。
【００３３】
生体外培養液に又は動物生体内に与えられた物質量だけでなく、インキュベートの時間フレームは、特定の細菌物質、特定のＴ細胞、抗原提示細胞、処理される動物、関連する適当な条件及び実験計画の実験的な観点において、当業者によって決定され得る。
【００３４】
本明細書に記載の方法及びシステムにおいて、炎症性バイオマーカー又は抗炎症性バイオマーカーの発現の検出は、標識化バイオマーカー若しくはバイオマーカーに対し特異的な標識化分子又はそれらに関連した分子を含む、標識化分子の使用を含む、当業者にとって同定可能な手法により、生体外又は生体内で実行され得る。
【００３５】
本明細書で用いられる用語“検出する”又は“検出”は、限定されないが、試料、反応混合物、分子複合体及び物質を含む、空間の限られた部分において分析又は関連する信号の実在、存在又は事実の決定を示す。検出は、分析物の数量若しくは量又は関連する信号の測定を参照し、測定に関連し、測定を含むとき（定量において同様に参照される）、“定量的”であり、限定されないが、分析物若しくは関連する信号の量又は比率を決めるために計画された任意の分析を含む。検出は、他の分析物又は関連する信号の相対的存在量に関して、分析物若しくは関連する信号の質又は種類の同定を、参照し、関連し、又は含むとき、“定性的”であり、定量化されない。
【００３６】
用語“標識”及び“標識化分子”又は検出可能な分子を指す複合体若しくは分子の成分として本明細書で使用される用語は、限定されないが、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光染料、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はハプテンなど）などを含む。用語“蛍光物質”は、検出可能な画像中に蛍光を示すことができる物質又はその部分を指す。結果として、本明細書で使用する言葉“信号”又は“標識信号”は、標識検出を可能にする標識から放出される信号を意味し、限定されないが、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果物中の化合物の生産などを含む。
【００３７】
検出は、バイオマーカー、前駆体若しくはその類似体、及び／又はそれに関連する分析物の発現のレベルを検出することにより実行され得る。二つの項目に参照して本明細書で使用される言葉“に関連する”は、第一の項目の出現が、第二の項目の出現によって同時に伴われるような二つの項目間の関係を示し、限定されないが、因果関係及び兆候／症状−病気の関係を含む。特に、検出は、定性的又は定量的に実行され、ＲＮＡ、タンパク質、その前駆体、異なる種類（すなわちｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡ）及び／若しくは分解生成物などの分子の検出、並びに／又はそれらに関連する検出若しくは測定可能な特性を含み得る。検出を実行するための技術および手順は、本開示を読む当業者により同定可能である。
【００３８】
例示的な、バイオマーカー発現の検出のための方法は、限定されないが、ＥＬＩＳＡと、Ｑ−ＰＣＲと、ＦＡＣＳによって検出される細胞内サイトカイン染色とを含む、当業者に周知の方法を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの発現は、蛍光物質で標識された、バイオマーカーに又はそれに関連する分子に特異な抗体を使用して実施される細胞培養液上の蛍光に基づく読み出しによって検出され、蛍光物質としては、網羅的でないが、低分子色素、タンパク質の発色団、量子ドット、及び金ナノ粒子を含む。一実施形態において、バイオマーカーの発現は、生体内で（例えば、動物組織内で）又は生体外で（例えば、細胞培養液中で）、バイオマーカープロモーターの転写制御下で標識の発現の検出により、検出され得る。それらのいくつかの実施形態において、バイオマーカーは、具体的にはＩＬ−１０又はＦｏｘｐ３であり得る。さらなる手法は、本開示を読むことで当業者により同定可能であり、またさらなる詳細について説明されないだろう。
【００３９】
本明細書に記載した方法及びシステムにおいて、候補細菌物質の抗炎症性能は、接触及び／又はインキュベートに続く、一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加又は一つ以上の炎症性バイオマーカーの発現の減少の検出を通じて決定され得る。バイオマーカー発現の増加及び／又は減少を決定することは、接触及び／又はインキュベートの後のバイオマーカーの検出発現と、接触及び／又はインキュベートがない状態で、同じバイオマーカーの予め決定された検出発現とを比較することにより実行される。バイオマーカーの発現の増加及び／又は減少を決定することは、検出された発現マーカーと、接触及び／又はインキュベートがない状態においてコントロール細胞で同じバイオマーカーの検出された発現とを、比較することにより実行されることができる。
【００４０】
引用文献は、実施例の部分に記載されており、抗炎症性バイオマーカーのＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢの発現の増加並びに炎症性バイオマーカーのＴＮＦ−αまたはＩＬ−１７Ａの発現の減少が、上記発現様式とバクテロイデス・フラジリスの生物学的活性との関連性を支持する、バクテロイデス・フラジリスの作用の機構に関連する。バクテロイデス・フラジリスの抗炎症性能は、当業者により同定可能であり、限定されないが、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５を含む、様々な出版物や特許に説明されており、各々のその全体が本明細書において参照され援用される。当業者は、候補細菌物質の特定の抗炎症性能が、産生されたサイトカインと、本明細書に記載の方法によって同定された候補細菌物質によって活性化された細胞との特定のセットのさらなる決定に基づいて、決定される可能性があることを理解するであろう。
【００４１】
一実施形態において、抗炎症性バイオマーカーの発現の増加又は炎症性バイオマーカーの発現の低下の検出は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢ又はそれらの組み合わせなどの抗炎症性分子を誘導する物質の能力、または、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦα又はそれらの組み合わせなどの炎症性サイトカインを抑制する物質の能力を示す。
【００４２】
一実施形態において、方法は、生体外で及び／又は生体内で、候補細菌物質を、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と接触させることとし、またＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及び／又はグランザイムＢの発現は、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特にＦｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４３】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、接触の後に抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。この方法は、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することをさらに含み、ここで、インキュベートの後のバイオマーカー発現の増加の検出が候補物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ−１０、パーフォリン及び／又はグランザイムＢはＦｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４４】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と接触させることと、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも一つの炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後に炎症性バイオマーカーの発現の減少は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ１７及びＴＮＦαの発現は、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４５】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、接触の後に抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。該方法は、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することをさらに含み、ここで、接触の後の炎症性バイオマーカー発現の減少が候補物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ１７及びＴＮＦαは、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４６】
一実施形態において、候補細菌物質は純粋なプール内の細菌を含む。他の実施形態において、候補細菌物質は混成のプール内の細菌を含む。細菌は生きた菌、死んだ菌、細菌から分離された抽出物若しくは産生物、又はそれぞれの組み合わせとすることができる。細菌はまた、実験室株、ＡＴＣＣなどのリポジトリからの分離株、動物からの分離株、ヒトからの分離株、またはそれぞれの組み合わせであってもよい。
【００４７】
一実施形態において、動物から分離株は排泄物から分離される。分離株はまた、腸内容物又は排泄物及び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。一実施形態において、ヒトからの分離株は排泄物から分離される。分離株はまた、腸内容物又は排泄物及び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。
【００４８】
一実施形態において、方法は、トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、特に、マウス又はラットのようなトランスジェニックマーカー非ヒト哺乳類を、候補物質で処理することを含み、トランスジェニックマーカー非ヒト動物は一般的に、ＩＬ−１０及びＦｏｘｐ３だけでなくパーフォリン及びグランザイムＢ、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群から選択される標識化抗炎症性バイオマーカー又は炎症性バイオマーカーを発現するように遺伝子的に修飾されており、処理後にトランスジェニックマーカー非ヒト動物におけるバイオマーカー発現を検出する。
【００４９】
特に、一実施形態において、前述のトランスジェニック非ヒト動物のモデルは、物質を経口に若しくは静脈内に処理され得、又は強制経口により生きた菌を恒久的にコロニー化され得、バイオマーカー発現のＦｏｘｐ３又はＩＬ１０発現の量が、物質の免疫調節能の測定として、脾臓、腸間膜リンパ節、小腸及び大腸、肺、膵臓、および骨髄を含むマウスの様々なコンパートメントにおいて観察されるだろう。
【００５０】
一実施形態において、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞又はマクロファージは、ＩＬ−１０（若しくは、Ｔ細胞の分析の場合にはＦｏｘｐ３）の発現が蛍光体である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でマークされているマウスから精製され又は分化される。これらの実施形態において、候補細菌物質は、前記細胞種のいずれかと接触させられ、ＧＦＰの発現量が、試験される物質の免疫調節能を意味することを決定される。また、樹状細胞または他の抗原提示細胞は物質とインキュベートすることができ、物質が洗浄されることができ、その後、樹状細胞は、Ｔ細胞から免疫調節活性を誘発するために樹状細胞の免疫調節能を決定するためにＴ細胞とインキュベートすることができる。ＧＦＰの発現は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）またはマイクロプレートリーダーを用いて決定されることができる。
【００５１】
一実施形態において、Ｔ細胞と、抗原提示細胞と、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びにＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの検出をするための試薬とは、本明細書に記載の方法にしたがって免疫調節能を有する細菌物質を同定するためのシステムを含み得る。
【００５２】
一実施形態において、システムは、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はマクロファージを含み、いくつかの実施形態において、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はマクロファージがＩＬ−１０（若しくは、Ｔ細胞の分析の場合にはＦｏｘｐ３）の発現が蛍光体である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でマークされているマウスから精製され又は分化されることができる。
【００５３】
システムは、部品のキットの形態で提供され得る。部品のキットにおいて、方法を実行するためのマルチリガンド捕捉剤および他の試薬は、キット内で独立的に含まれ得る。抗原提示細胞、Ｔ細胞及び試薬は、一つ以上の構成物中に含められ得、また各々の細胞及び試薬は、適当な媒体と共に構成物にし得る。
【００５４】
さらなる構成部分は、標識化分子及び特に、抗炎症性バイオマーカー若しくは炎症性バイオマーカーに特異的な標識化捕捉剤、又はその発現に関連する分子、マイクロ流体チップ、標準試料、並びに本開示を読むことで当業者により同定可能なさらなる格子得部分を含むことができる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語“捕捉剤”は、目標物に対し特異的に結合し得る化合物を示す。第一の分子に対する第二の分子への結合を参照するときの本明細書で使用される単語“特異的な”“特異的に”又は“特異性”は、第一の分子と第二の分子との安定した複合体の認識、接触及び形成とともに、第一の分子と第二の分子とのそれぞれが、存在し得る他の分子と一緒に安定な複合体の認識をせず、接触をせず及び形成をしないことが実質的に少ないことを指す。例示的な特異な結合としては、抗体−抗原相互作用、分子レセプター−リガンド相互作用、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、酵素基質の相互作用などである。“安定な複合体”は、検出可能であり、安定性の任意のレベルを必要とせず、しかしより大きな安定が通常好ましい。いくつかの実施形態において、キットは標識化ポリヌクレオチド又は標識化抗体を含みうる。
【００５６】
キットの構成部分は、本明細書中に記載する方法を実行するために、適当な指示及び他の必要な試薬を与え得る。キットは通常、別々の容器に構成物を含むだろう。指示（例えば、解析するにために、書面上に又はテープ若しくはＣＤ−ＲＯＭのように電子的に対応されているもの上に、記載された指示又は音声指示）は、キット内に通常含まれるだろう。キットはまた、特定の使用の方法、他のパッケージ化試薬及び材料（すなわち洗浄用バッファーなど）に応じて含めることができる。
【００５７】
好適な担体剤または構成物の助剤の同定に関するさらなる詳細、およびキットの一般的な製造及び包装は、本開示を読む当業者により同定され得る。
【実施例】
【００５８】
本明細書に記載する方法及びシステム並びに関連する構成物は、さらに後の実施例においてさらに示され、実施例は、例示のために提供され、制限されることを意図されていない。
【００５９】
特に、次の実施例は、例示的な細胞培養、並びにＰＳＡを細胞と接触させ及びＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン、グランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＬ１７Ａの発現を検出するための方法を示している。当業者は、本開示に従うことにより、ＰＳＡ及びバクテロイデス・フラジリスの追加物質に対する免疫調節活性を検出するために適した、ＰＳＡ及びバクテロイデス・フラジリス並びに細胞／培養液／動物のシステムのために、詳細において述べられている特徴の適応性を理解するだろう。同様に、当業者は、本明細書に記載された他のバイオマーカーへの、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン、グランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＬ１７Ａのようなバイオマーカーの検出の適応性を理解するだろう。
【００６０】
材料及び方法
以下の材料および方法は、本明細書に例示した免疫調節物質の検出を目的に全ての方法及びシステムのために使用された。
【００６１】
菌種、培養条件及びマウス
バクテロイデス・フラジリス株 ＮＣＴＣ ９３４３は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得、その同質遺伝子的ＰＳＡ欠損変異株及びｍｐｉ４４変異株（ＰＳＡのみを産生し、他の多糖類を産生しない）は、「ＭＪ．Ｃｏｙｎｅ，Ａ．Ｏ．Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，Ｂ．Ｃ．Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｖ．Ｊ．Ｃａｒｅｙ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｓｐｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｅ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，（２００１）Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌｏｃｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４３４２−４３５０」に記載されている。細菌は、１ＬのｄｄＨ２Ｏ中に３７ｇＢＨＩ（ＢＤ社＃２３７２００）、０．５μｇ／ｍｌヘミン（Ｓｉｇｍａ社 Ｈ５５３３）、及び０．５μｇ／ｍｌビタミンＫ（Ｓｉｇｍａ社 Ｖ３５０１）を含む富栄養培地、又は１ＬのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＳＫＵ＃１１８３５−０３０）中に８ｇグルコース、１％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌヘミン、及び０．５μｇ／ｍｌビタミンＫを含むカスタマイズした最小培地（ＭＭ）のいずれかで生育された。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃ株のＳＰＦマウスはＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入された。ＴＬＲ２−／−及びＩＬ−１０ノックアウトマウスは、Ｊａｃｋｓｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入された。ＩＬ−１０ＧＦＰマウスはｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｋａｒｐ ｆｒｏｍ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ ｍｅｄｉｃａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌから調達し、また、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスはｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔａｌａｌ Ｃｈａｔｉｌａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓから得られた。
【００６２】
ＥＤＬ富化細菌集団の分離
パーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社＃１７−０８９１−０１）不連続密度勾配遠心分離は、野生型バクテロイデス・フラジリス及びバクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡの両方におけるＥＤＬ分離のために用いられた（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， Ｒｅｉｄ ＪＨ．（１９８３）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｕｌａｔｅ ａｎｄ ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｔｅ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｏｎ ａ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）：２３９−４１）。簡単に言えば、２０％、４０％、６０％、８０％のパーコール勾配（ＰＢＳで希釈）は１４ｍｌ試験管に作製された（各層２ｍｌ）。その後、ＰＢＳに再懸濁されたバクテロイデス・フラジリス培養液は２０％パーコール層の上部に慎重に加えられた。続いて、勾配は、室温、８００ｇ、２０分間の条件で遠心分離された。ＥＤＬ富化細菌は、分離後勾配の４０％−６０％の境界面から回収され得る。
【００６３】
ＯＭＶの精製と標識
この方法は、Ｅ．ｃｏｌｉからＯＭＶを調製するために、以前記載された手順（Ａｍａｎｄａ Ｌ． Ｈｏｒｓｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｕｅｈｎ．（２０００）Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ａｃｔｉｖｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｖｉａ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１２４８９−１２４９６）に適応された。簡単に言えば、ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスは、カスタマイズ化されたＭＭの中で生育された。ＯＭＶは、４０００ｇ、２時間、４℃の条件で遠心により培養液中の細菌が取り除かれた上澄みから回収され、ＰＢＳで二回洗浄され、０．４５μｍスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 ＃２０−２１８）によりろ過された。精製されたＯＭＶの総タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析（Ｂｉｏｒａｄ社 ＃５００−０２０５）により測定した。ＦＩＴＣ標識化ＯＭＶは、以前記載されたように調製された（Ｎｉｃｏｌｅ Ｃ． Ｋｅｓｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｅｕｈｎ．（２００４）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：２０６９−２０７６）。簡単に言えば、ＯＭＶは、室温で１時間、染色緩衝液（ｌｍｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 ＃４６４２４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ９．２）中でインキュベートされた。標識化ＯＭＶは、４℃、３０分、４０，０００ｇの条件で遠心分離により収集され、ＰＢＳ＋２００ｍＭ ＮａＣｌで２回洗浄された。
【００６４】
細菌超薄切片の電子顕微鏡
ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、以前記載されたように調製された（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ， Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ， Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２）。簡単に言えば、試料は、２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社 Ｇ５８８２）のカコジル酸緩衝液中で、４℃で、一晩かけて固定化され、そして、四酸化オスミウム（１％、ｗ／ｖ）中で、３時間、室温、暗所でさらに固定化された。ルテニウムレッド（ｌｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社 Ｒ２７５１）は、固定化手順の両方に含有された。その後、固定化試料は、アルコールによる一連の段階的脱水後、エポキシ樹脂に包埋された。ＴＥＭにより可視化する前に、超薄切片（１００−２００ｎｍ）は切断され、ホルムバール／炭素被膜銅格子上で２％の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛でネガティブ染色された。
【００６５】
精製ＯＭＶの免疫金標識
この方法は、以前記載された手順（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ，Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ，Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２）に適応された。簡単に言えば、ごく少量の精製ＯＭＶは、ホルムバール／炭素被膜金格子（ＥＭＳ社 ＃ＦＦ２００−Ａｕ）に塗られ、空気で乾燥された。免疫金標識は、“ＯＭＶ”が付された格子の側面が下になるように浮かした状態にされ、一連の抗体及び洗浄溶液の滴下により、室温で実行された。具体的には、試料は、０．１２％グリシン中で５分間のインキュベートの後、１０％ＦＢＳ中で１０分間ブロックされ、続いて、ＰＢＳで３分間の洗浄が５回実施された。その後、５ｎｍ 金粒子を有する第二の抗体−ＩｇＧ結合体（Ｄｒ．Ｐａｕｌ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｈｏｕｓｅ Ｅａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓからの親切な寄贈品）は２０分間試料に適用され、続いて、再度、ＰＢＳを用いて４分間の洗浄を５回実施された。標識後、試料は１％グルタルアルデヒド中で５分間固定化され、ＰＢＳの１分間×４回の滴下へ、またＨ２Ｏ１分間×４回の滴下へ格子が移されることで十分に洗浄された。対比染色は、氷上で１０分間、３−５％酢酸ウラニルが２％メチルセルロースに溶解した溶液の滴下に格子が配置されることにより実施された。最後に、格子は、ワイヤーループにより染色液から取り除かれ、空気乾燥された。メチルセルロースの薄膜で覆われた試料は、ループから取り除かれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって可視化するために使用された。
【００６６】
糖タンパク質分析
全細胞抽出物またはＯＭＶ（バクテロイデス・フラジリス変異株ｍｐｉ４４由来）から精製したＰＳＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、続いて、ゲルは、ＰＳＡの存在を示すための糖タンパク質染色キット（Ｇ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 ＃７８６−２５４）により染色された。
【００６７】
化学的（ＴＮＢＳ）誘発性の実験的大腸炎
この手順は、以前記載された方法（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５．１９．１−１５．１９．１４）に適応された。簡単に述べると、野生型（Ｂａｌｂ／ｃ）雄マウスは、ＴＮＢＳ投与される前に、ＰＢＳ、ＷＴ−ＯＭＶ（５μｇ）又はΔＰＳＡ−ＯＭＶ（５μｇ）を一日おきに一週間、経口処理された。処理されたマウスは、イソフルランで麻酔され、２％ＴＮＢＳ（５０％ＥｔＯＨ中、Ｓｉｇｍ社 Ｐ２２９７）の直腸投与が３．５Ｆカテーテル（Ｉｎｓｔｅｃｈ Ｓｏｌｏｍｏｎ社 ＳＩＬ−Ｃ３５）を通じて適用された。ＴＮＢＳ投与の後、経口処理はさらに二回続けられ、最後の処置後１−２日にマウスは分析された。
【００６８】
組織病理学的解析
マウスの大腸は、１０％中性緩衝ホルマリン液（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社 ＣＡＳ＃５０−００−０）に固定され、Ｈ＆Ｅ染色のためにＰａｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ社により処理された。各大腸断片の大腸炎スコアは、病理学者（Ｄｒ． Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｌａｗｓｏｎ， Ｄａｖｉｄ Ｇｅｆｆｅｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＵＣＬＡ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ）によって盲検方式で評価された。組織学的画像は光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して２０倍率で撮影された。
【００６９】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、ＴＲｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＃１５５９６−０１８）を用いてマウス組織から、又はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社 ＃７４１０４）を用いて精製細胞から、いずれかにより収集された。ｉＳＣＲＩＰＴ ｃＤＮＡ合成キット（バイオラッド社 ＃１７０−８８９０）はｃＤＮＡの変換に使用され、ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社 ＃１７２−８８８２）は、リアルタイムＰＣＲに使用された。本研究で使用されたプライマーは、ＴＮＦα（Ｆ−５’ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＣ ３’（配列番号：１）、Ｒ−５’ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＧＴ ３’）（配列番号：２）、ＩＬ−１７（Ｆ−５’ＴＴＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＡＡ ３’（配列番号：３）、Ｒ−５’ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＡ ＴＣＣ ＡＡ ３’）（配列番号：４）ＩＬ−１０（Ｆ−５’ＧＧＴ ＴＧＣ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＣＧ ＧＡ ３’（配列番号５）、Ｒ−５’ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ Ｔ ３’）（配列番号６）、Ｆｏｘｐ３（Ｆ−５’ＧＣＡ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ３’（配列番号７）、Ｒ−５’ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＧＧＡ ＴＡＡ Ｇ ３’（配列番号：８））である。
【００７０】
蛍光顕微鏡検査法
生体外で分化されたＢＭＤＣは、５０，０００細胞／ウェルでＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ ８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社 ＃１５４５３４）に蒔かれた。ＦＩＴＣ標識化ＯＭＶは１０μｇ／ｍｌで細胞培養液に添加された。２時間のインキュベートの後、細胞は室温で２０分間、４％ＰＦＡで固定された。５分間のＰＢＳ洗浄が３回された後に、細胞膜は、１μｇ／ｍｌのＷＧＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 Ｗ８４９）結合テトラメチルローダミンで、４℃で１時間染色された。プロロングゴールド褪色防止剤（Ｐ３６９３０）は、細胞膜の染色を、膜染色に続く広範な洗浄後に、試料に対し適用された。蛍光画像は、ＬＳＭ ５１０顕微鏡とＰｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ６３ｘ／１．２５油浸対物レンズとを用いて撮影した。
【００７１】
フローサイトメトリー及び染色
ＯＭＶ取込み解析またはＯＭＶ活性化解析の結果のＢＭＤＣは採取され、氷上で３０分間、５％のマウス血清でブロックされた。ブロックした後、細胞は、氷上で３０分間抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、抗ＭＨＣＩＩ−ＦＩＴＣ又は抗ＣＤ８６−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色され、フローサイトメトリー分析の前にＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含有）、１％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を用いて４℃で２回洗浄された。同様に、生体外でのＢＭＤＣ−Ｔ細胞の共培養由来の細胞は、ブロックされ、採取される前に４−４．５時間ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて細胞を再刺激したことを除いて同じ方法で、抗ＣＤ４−ＡＰＣ／抗ＣＤ２５−ＰＥを用いて染色された。全てのフローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて行われ、結果はＦｌｏｗＪｏを用いて分析された。
【００７２】
ＢＭＤＣ−Ｔ細胞の生体外共培養
骨髄は、マウスの異なる株から採取され、従来の記載のように（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８）２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社＃９５１７５７１）存在下で生体外で８日間分化された。（細胞の純度＞９０％）。ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞は、磁気マイクロビーズ精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社＃１３０−０９０−８６０）（細胞の純度＞９５％）により単離された。ＯＭＶが振動されたＢＭＤＣ（１０μｌ／ｍｌ ＯＭＶ、１００，０００細胞／ｍｌ、１２時間から２４時間）は、ＨＢＳＳで洗浄され、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１，０００，０００細胞／ｍｌ）が、０．０１μｌ／ｍｌ抗ＣＤ３（０日目、図３Ｄ、Ｅ、Ｆ、図４Ａに示されるように図３Ｃ）と、２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ（０日目、図３Ｃ、Ｄ及びＦ、図４Ａ）の追加と、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２（１日目とで３日目、生体外で全てのＤＣ−Ｔ細胞共培養分析）丸底９６ウェルプレート内でインキュベートした。合計４日の培養後、上清をＥＬＩＳＡ（＃８８−７１０４−７７ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）又は細胞は、染色及びフローサイトメトリーの解析のために採取された。
【００７３】
生体外での抑制分析
ＢＭＤＣ（ＷＴ−ＯＭＶ又はΔＰＳＡ−ＯＭＶと振動されている）−Ｔ細胞の共培養から精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社， ＃１３０−０９１−０４１）の供給源として使用された。マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社 Ｍ４２７８）で処理し、ＣＤ４除去マウスの脾細胞は、ＡＰＣ（１００，０００細胞／ｍｌ）として使用された。マウスの脾臓から直接精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、１０分間、３７℃でＣＦＳＥと振動され、続いて、まずＰＢＳで次に培養液で洗浄され、レスポンダー細胞（エフェクターＴ細胞）として（５００，０００細胞／ｍｌ）をすぐに使用された。この分析は、２００μｌ体積の５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 ＃１６−００３１−８６）追加により、丸底９６ウェルプレートで行われた。エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞との比を滴定により測定され、細胞はＦＡＣＳ分析のための培養２−３日後に採取された。
【００７４】
統計的分析
ステューデントのｔ検定及び一元配置分散分析法は、一対比較及び二つを超えるグループ間の比較にそれぞれ適用された。分散分析により検出されたグループ間の有意差は、統計学的有意差を示すグループを識別するために、事後テストとしてニューマン−クールズの検定を用いて分析した。すべての誤差棒はＳＥＭを示す。ＮＳ：有意でない。*ｐ＜０．０５。***ｐ＜０．０１。***ｐ＜０．００１。
【００７５】
実施例１：免疫調節莢膜多糖体ＰＳＡは、バクテロイデス・フラジリスのＯＭＶの中へ活発に局在化される。
ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、材料及び方法に記載されたように調製され、透過型電子顕微鏡により画像化された。
【００７６】
図１Ａに示される結果は、ＯＭＶが豊富に細菌によって産生され、細菌の外被（図１Ａ、より高倍率）からの出芽を観測されることができたことを示す。出願人らこれまでの研究では、ＰＳＡ欠損が、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節能を抑制することを示している（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８．）（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｒｏｕｎｄ， ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００８）Ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ． ４５３（７１９５）６２０−６２５）。ＰＳＡ変異株（バクテロイデス・フラジリス ΔＰＳＡ）の電子顕微鏡写真は、ＯＭＶ合成において欠陥のないことを示し、そして、産生されたＯＭＶの大きさ、形状及び豊富さは、野生型細菌（図１Ａ及び図５）と識別不能であった。特に、図１Ａに示される結果は、小胞が細菌の表面から活発に出芽していることを明らかにした。
【００７７】
ＰＳＡが、バクテロイデス・フラジリスのＯＭＶに関連するかを判断するために、野生型細菌及びΔＰＳＡ細菌から精製した小胞は、材料及び方法の部分で記載したように分析され免疫ブロットが行われた。
【００７８】
図１Ｂに示される結果は、野生型由来の小胞が、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡ由来のＯＭＶとは異なり、ＰＳＡへの免疫反応性を表示することを示す。バクテロイデス・フラジリスは、細菌細胞の表面を覆っている、ＰＳＡ〜ＰＳＨという名称の、少なくとも８つの異なる莢膜多糖を産生する。ＰＳＢも小胞の標本内で検出されたが、ＰＳＧは存在せず、ＯＭＶで包まれるために特定の多糖類に対する選択性を示す（図１Ｂ）。したがって、図１Ｂの結果は、ＰＳＧのみが細菌表面上で検出される一方で、ＰＳＡ及びＰＳＢは、小胞に関連することを示している。莢膜多糖体に対する欠損変異株は、各抗血清の特異性を確認する。
【００７９】
免疫ブロット分析の結果は、材料及び方法の部分に記載されたように実行され、免疫金標識の実験により確認された。精製小胞の免疫ブロット標識の結果は図１Ｃに示され、ＰＳＡが物理的にＯＭＶに関連していること、及び野生型バクテロイデス・フラジリス株からのＯＭＶの大半が、ＰＳＡに対し陽性に染色していることを確認する（図６）。ＰＳＡの不存在がＯＭＶの分子構成物を変化しなかったかったことを確かめるため、プロテオーム分析は、野生型細菌からの又はＰＳＡ変異細菌からの小胞間のタンパク質構成物において、質的または量的な違いはないことを明らかにした質量分析法により、実行された（図７）。
【００８０】
ＰＳＡは、繰り返されるサブユニットの異種ポリマーである。クロマトグラフィーにより全細胞抽出物から回収されたＰＳＡのサイズ分離は、材料及び方法において示されているような、全細胞由来の、及び精製ＯＭＶ由来の莢膜多糖標本の抗ＰＳＡを用いた免疫ブロット分析と同様に実行された。
【００８１】
図１Ｄに示される関連性の高い結果は、驚くほどに、低分子量種のみがＯＭＶに関連していることを示し、小胞へのＰＳＡ包み込みの特異性を表している。特に、図１Ｄの結果は、低分子量ＰＳＡ（Ｌ−ＰＳＡ）は、細菌細胞外被に関連し維持している高分子量（Ｈ−ＰＳＡ）種とは異なり、小胞に包み込まれることを示している。
【００８２】
併せて上記の結果は、免疫調節莢膜多糖体ＰＳＡがバクテロイデス・フラジリスのＯＭＶへ活発に局在化されていることを明らかにしている。
【００８３】
実施例２：ＯＭＶは、ＰＳＡ−依存的方法で実験的大腸炎及び腸炎から動物を保護する。
ＯＭＶが疾患の臨床症状を改善できるか調査するために、マウスは、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）誘発性大腸炎の期間中にＯＭＶ強制経口投与によって処理された。
【００８４】
図２Ａに示された結果は、コントロール動物がＴＮＢＳ（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ）の直腸投与後に体重が急速に減少しており、媒体処理されたマウス（図２Ａ；ＥＴＯＨ＋ＰＢＳ）と比較し、コントロール動物の体重が回復しなかったことを示している。驚くべきことに、ＴＮＢＳ動物にＯＭＶ経口投与すると、体重減少（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ＷＴ−ＯＭＶ）から大きく保護された。最も重要なことは、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡ由来のＯＭＶを投与した場合、体重減少がＴＮＢＳ動物（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ΔＰＳＡ−ＯＭＶ）と区別できなく、ＰＳＡが、消耗性疾患を抑えることに完全に関連することを実証した。
【００８５】
胃内経管栄養の後に大腸内の損傷を受けていない小胞を検出する努力は、以前の報告のように無菌マウスでさえ（データは示されず）、宿主由来の小胞の観測によって混乱された。
【００８６】
大腸の長さの減少がＴＮＢＳ大腸炎の顕著な特徴であるので、盲腸から直腸までの切除し、長さの定量化（グラフ）した後、直ちに、媒体（ＥｔＯＨ）処理されたグループ及びＴＮＢＳグループ（ｎ＝４匹／グループ）からの大腸の長さの検出は、未操作の大腸において、実行された。具体的に、測定は屠殺の時（疾患誘導から４日目）に実行された。
【００８７】
図２Ｂに示される結果は、ＰＳＡ含有小胞を処理した動物において、通常の腸の長さであることを示し、しかしＰＳＡ欠乏ＯＭＶで処理した動物においては通常の腸の長さでないことを示している（図２Ｂ）。
【００８８】
実験的大腸炎は、腸構造内で重篤な病理学的変化の結果になる。したがって、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した、各処理グループの大腸断片の代表物を挙げ、図２Ｃに示す。大腸組織の組織学的分析により、重篤な疾患がＴＮＢＳ処理動物において観測され、ＴＮＢＳ処理動物がＰＳＡ含有小胞の経口投与によって改善されたことを、図２Ｃの画像は示している。
【００８９】
図２Ｃの結果は、盲検化病理学者により指定された動物からの大腸炎スコアによって確認された。ＴＮＢＳ大腸炎は、クローン病で観察される病状を模倣した、大腸全域の限局性病巣においてそれ自体を明らかにする。定量的に疾患を評価するために、臨床症状が標準得点システムを用いて盲検化病理学者によって評価された（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５．１９．１−１５．１９．１４）。図２Ｄに示される結果は、ＴＮＢＳ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶを投与されたすべての動物が深刻な影響を受けた一方で、ＷＴ−ＯＭＶがほとんどの動物において疾病を劇的に減少させることを示している。野生型細菌由来のＯＭＶで処理された動物は、遥かに少ない病状の限局的サイトを有していたが、病巣が観察された時、ΔＰＳＡ−ＯＭＶを与えられた動物と比べて、病巣が小さく、相当正常な組織構造を保持していた。
【００９０】
上記の結果は、ＰＳＡがＯＭＶの疾患防御活性に必要とされることを立証する。
【００９１】
実施例３：ＰＳＡ含有ＯＭＶは、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１７を阻害し、ＩＬ−１０の発現を高める。
大腸炎に関連し標準的な炎症促進性及び抗炎症性サイトカインの産生は、実施例２に例示されるように処理されたマウスにおいて測定された。具体的には、サイトカインの転写産物の分析は、大腸全体より回収され又は腸間膜リンパ節由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞より回収されたＲＮＡについて、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施された。
【００９２】
３つの独立した試験の代表的な関連性の高い結果は、図２Ｅ（大腸全体）及び図２Ｆ（腸間膜リンパ節から精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞）で報告されている。これらの結果は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ）の転写レベルがＴＮＢＳ処理動物において高められ、しかし、ＯＭＶ投与によりＰＳＡ−依存的方法（図２Ｅ）で減少させられたことを示す。病状からの保護と矛盾しないで、ΔＰＳＡ−ＯＭＶ経口投与動物と比較して、ＯＭＶは増加したＩＬ−１０濃度の産生を誘発する（図２Ｆ）。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されたサイトカインの分析は、ＩＬ−１０が、Ｔ細胞のＰＳＡへの応答により実際に産生されていることを確認した（図２Ｆ）。強力な炎症誘発性マーカーＴＮＦ−α濃度のように、Ｔｈｌ７細胞の浸潤は、疾患のために必要であるが、ＯＭＶにより劇的に減少した（図２Ｆ）。我々は、バクテロイデス・フラジリスＯＭＶ中へのＰＳＡの包み込みが、実験的大腸炎の病理学的および免疫学的症状発現から動物を保護すると結論付ける。
【００９３】
実施例４：バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶを含むＰＳＡは、樹状細胞応答を誘導する。
樹状細胞（ＤＣ）は、腸管内腔へ突起を伸ばし、腸の粒子を採取し、続いてＴ細胞の反応を開始するためにＭＬＮに移行する。確かに、動物へＰＳＡの経口投与は、ＭＬＮにおけるＣＤ１１ｃ＋ＤＣに関連している。したがって、出願人は、ＰＳＡを含むＯＭＶが同様に樹状細胞に取り込まれ得るかどうかの研究に努めた。
【００９４】
図３Ａに示される結果は、サイトカラシンＤを用いた細胞の処理が、大幅に小胞への取り込みを阻害したため、骨髄由来のＤＣが急速にアクチン依存的方法でＯＭＶを内部移行したことを示す（図３Ａ及び図８）。細胞間の局在は共焦点顕微鏡により確認された（図９）。
【００９５】
Ｔ細胞活性化マーカーのＰＳＡを介したＤＣでの誘導は、同様に調査された。図３Ｂに示される結果は、Ｔ細胞活性化マーカー（ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６）の発現が、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶの両方の内部移行に続いて、同等に上昇させられたことを示した（図３Ｂ及び図１０）。
【００９６】
ＭＨＣ及び共刺激分子の発現増加は、バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶを含むＰＳＡが、Ｔ細胞応答に影響を与え得ることを示している。
【００９７】
実施例５：ＰＳＡは、ＤＣのＩＬ−１０発現を通じてＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１０発現を誘導する。
実施例１〜３に例示した実験に示すように、大腸炎におけるＰＳＡ保護の役割に照らして、抑制性Ｔ細胞応答の誘導にＯＭＶの生物学的効果は試験された。特に、様々な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団が大腸炎を抑制することが知られているので、Ｔｒｅｇの発達を促進するＯＭＶの能力は検討された。
【００９８】
図３Ｃに示される結果は、ＤＣ−Ｔ細胞の生体外共培養の条件下でＷＴ−ＯＭＶがＩＬ−１０の発現を誘導し、一方、同条件下でＩＬ−１０がＤＣのみからでは産生されないことを示している。増加が媒体コントロールを超えて検出されているが、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから精製された小胞は、ＷＴ−ＯＭＶよりＩＬ−１０を有意に低く誘導していた。ＤＣからのＩＬ−１０の産生は、生体内及び生体外におけるＣＤ４＋ＩＬ−１０＋Ｔ細胞の発達を支援することが知られている。したがって、ＩＬ−１０−／−の動物から分化されたＤＣを含み、図３Ｃに示されている結果と同様のＥＬＩＳＡ分析は実行された。
【００９９】
図３Ｄ（左パネル）に示される結果は、ＩＬ−１０−／−ＤＣがＯＭＶで処理された場合、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養において大幅に減少したＩＬ−１０を示しており、ＤＣによるＩＬ−１０発現が、パラクリン的方法でＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＬ−１０を誘導するために必要とされることを示している。
【０１００】
実施例６：ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇの発達及び／又は増殖を指示するようにＤＣをプログラムする。
微生物のリガンドは、パターン認識受容体のいくつかのクラスによって感知され、Ｔｈ１サイトカイン産生を惹起するために、ＰＳＡがＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）を通じた信号へ示されている。一連の実験は、したがって、最近の報告が、Ｔｒｅｇの機能及びＩＬ−１０発現がＴＬＲ２の影響を受けていることを示しているように、ＴＬＲ２が、ＰＳＡによるＩＬ−１０の誘導に必要であるかどうかを試験するために実行された。
【０１０１】
図３Ｄ（右パネル）に示される結果は、野生型ＤＣと比較して、ＴＬＲ２の欠如（ＴＬＲ２−／−動物由来のＤＣ）が、完全にＯＭＶに応答してＩＬ−１０産生を阻害することを示している。両方のＤＣはスーパー抗原（ＳＥＡ）刺激に同様に応答し、ＰＳＡセンシングにおける特異的な欠陥ではなく、ＴＬＲ２−／−ＤＣによるＴ細胞活性化の一般的な欠如を実証している（図３Ｄ）。転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、重要なＴｒｅｇの亜集団である。最近の研究では、示されているＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇはＩＬ−１０を発現することができ、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０の産生は腸の炎症を抑制するために必要とされる。
【０１０２】
ＯＭＶ上のＰＳＡにより誘導されるＩＬ−１０の起源を決定するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＤＣとの共培養に続いて精製され、そしてＩＬ−１０及びＦｏｘｐ３の発現は定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定された。
【０１０３】
図３Ｅに示される結果は、注目に値し、ＰＳＡがＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞由来ではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ集合内でＩＬ−１０発現を大幅に誘導することを示している。バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから精製したＯＭＶは、媒体コントロールと同じ濃度で、どちらのＴ細胞集団からであってもＩＬ−１０産生を促進することができなかった。Ｆｏｘｐ３の発現はまた、ＯＭＶによって、ＰＳＡ依存的方法でもっぱらＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞において有意に増加した（図３Ｅ）。
【０１０４】
共培養液は、図３Ｃ〜Ｅに示される実験用として作成され、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。ＯＭＶを振動されたＤＣで４日培養した後、細胞は、抗ＣＤ４で染色され、ＦＣを使用してＧＦＰの発現によりＦｏｘｐ３が検出された。
【０１０５】
二つの独立した試験の代表的な結果は、図３Ｆに示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞の間で増加したＦｏｘｐ３転写と一致し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合は、ΔＰＳＡ−ＯＭＶ処理でなく、ＷＴ−ＯＭＶ処理への応答において増加した（図３Ｆ）。まとめると、完全なる生体外培養システムにおいてＰＳＡ含有ＯＭＶは、Ｔｒｅｇの発達および／または増殖をする方向へＤＣをプログラムする。
【０１０６】
実施例７：ＰＳＡ含有ＯＭＶは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇの抑制機能の媒介によりＩＬ−１０を誘発する。
細胞治療としてのＴｒｅｇの使用は、ＩＢＤ、自己免疫及びアレルギーのために提案されている。ＯＭＶで処理されたＤＣとの４日間共存培養後のＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団によるＩＬ−１０の発現は調査された。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１０−ＧＦＰマウスから精製され、共培養後に抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５で染色され、ＩＬ−１０の発現がＧＦＰにより測定された。
【０１０７】
図４Ａに示す、精製ＤＣ及びＴ細胞の関連するＯＭＶ処置の結果は、ＰＳＡが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇからの特異的なＩＬ−１０産生を促進することを明らかにしていることを示す。
【０１０８】
この知見に基づいて、ＰＳＡの能力は、媒体（コントロール）、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶで処理したＤＣとの共培養に続いて、精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞により、単純な応答細胞の生体外でのＴｅｇの抑制能を促進するために調査された。ＣＤ４＋ＣＤ２５−応答細胞（エフェクター細胞; Ｔｅｆｆ）は、野生型マウスの脾臓から精製され、細胞内の色素のＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で振動され、Ｔｒｅｇとインキュベートされ、３日間抗ＣＤ３で刺激を与えられた。細胞増殖はＣＦＳＥ希釈のＦＣにより測定された。
【０１０９】
図４Ｂ及び４Ｃに示される結果は、ＷＴ−ＯＭＶで処理されたＤＣを用いた条件から回収されたＴｒｅｇが、ΔＰＳＡ−ＯＭＶに対応したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と比較して、大幅に強化された抑制能力を表示することを示す。
【０１１０】
したがって、他の多数の微生物性リガンド（ＬＰＳ、リポタンパク質、ペプチドグリカンなど）を含むＯＭＶからのＰＳＡの特異的欠落は、機能的なＴｒｅｇを誘導するための、バクテロイデス・フラジリスの小胞の能力を抑制する。
【０１１１】
実施例８：ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇにおいて、様々なバイオマーカーの組み合わせを誘導する。
Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスは、一日おきに６日間精製ＰＳＡで経口処理された。ＭＬＮは抽出され、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞は、±ＧＦＰの発現に基づいたＦＡＣＳにより精製された（純度＞９９％）。ＲＮＡは抽出され、定量−ＰＣＲに使用された。
【０１１２】
図１１に示される結果は、ＰＳＡが、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、パーフォリン、及びグランザイムＡを含む複数の抗炎症性遺伝子の誘導と、ＴＮＦαおよびＩＬ１７（特にＩＬ１７Ａ）の阻害とを調整することを実証する。
【０１１３】
上記の結果は、バクテロイデス・フラジリスの生菌活性の分子機構を提供し、制御性Ｔ細胞の発達へシグナル伝達する自然免疫受容体を結合する微生物リガンドのための独創的な例を明らかにする。特に上記の結果は、ＰＳＡが、外膜小胞（ＯＭＶ）によって、及び細菌分子を宿主細胞へ標的とする分泌構造によって、宿主に運ばれることを示している。ＰＳＡを含むＯＭＶは、宿主免疫システムの樹状細胞によって内部移行される。ＯＭＶの取り込みに続いて、ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３及び抗炎症性サイトカインのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化を誘導するために樹状細胞をプログラムする。ＯＭＶによるＴｒｅｇの発達は、樹状細胞によるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の発現及びＩＬ−１０の産生を必要とする。驚くべきことに、精製ＯＭＶは、ＰＳＡ依存的方法で強力な抑制活性を持つ、機能的なＴｒｅｇの生体外分化を指示する。ＰＳＡ含有ＯＭＶを用いた動物の処理は、実験的大腸炎を防ぎ、腸内の炎症誘発性サイトカイン応答を抑制する。これらの知見は、ＩＢＤのための生菌治療が運ぶという新しいアプローチに設計され得るプロセスである小胞の分泌を通じて、共生細菌が有益な微生物の因子を提供することが明らかにする。
【０１１４】
特に、上記の結果は、ＰＳＡ含有ＯＭＶによって誘導されるＴｒｅｇが、機能的に抑制し、培養中のＴ細胞の活性化を阻害することを示している。これは、微生物のリガンドによる生体外Ｔｒｅｇの発達についての最初の実証であり、自然免疫受容体シグナル伝達がＴｒｅｇの機能を調節することが広く推測される観念に対する原理証明を提供する。ＩＢＤのための現在の治療は、効果がない又は重篤な副作用を持っているかのどちらかであるので、活性免疫調節のためのよく進化したメカニズムを利用することによる、有望な新しい治療の選択肢を生菌が表している。Ｔｒｅｇが複数の組織において免疫応答を抑制することを考えると、ＰＳＡによる生体外Ｔｒｅｇの発達の私たちの独創性に富んだ実証は、自己免疫、喘息及びアレルギーを含む多数の炎症性疾患のための新規細胞治療の心躍る可能性を示唆している。
【０１１５】
免疫調節を媒介する微生物によって生産された分子を識別するために、細菌産生物の一部が精製され得、全細菌が使用されるとき、純粋な化合物がどのその成果を模倣するのかを発見されるまで、同じ解析が上記のように実施される。また、上記のアプローチは、この活性を有する菌株のそれぞれのクローンにおいて欠損されている免疫調節分子を識別するために、関心のある微生物の変異体ライブラリーをスクリーンするために使用されるだろう。
【０１１６】
要約すると、いくつかの実施形態において、抗炎症能力に関して、細菌、細菌により精製若しくは生成された産生物及び／又は他の細菌物質をスクリーニングするための方法並びにシステムが提示される。
【０１１７】
上記に明らかにした例は、当業者に、開示による小胞と、システムと方法との実施形態を生成する方法および使用方法の完全な開示並びに説明を与えるために提供されており、本発明者らがそれらの開示としてみなすことの範囲を制限するために意図されていない。当業者に明白な開示を行うための上記の様式の変更は、以下の特許請求の範囲内であることを意図している。明細書に記載されている全ての特許および刊行物は、開示が属する当業者の技術の水準を示している。それぞれの参照が個々にその全体が参照として援用されたかのように、この開示における引用のすべての参照は、同じ程度に参照として援用される。
【０１１８】
背景技術、要約、詳細な説明、および実施例で引用されている各文書（特許、特許出願、雑誌論文、抄録、実験マニュアル、書籍、またはその他の開示を含む）の開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、配列表のハードコピーは、これに提出し、対応するコンピュータ読み取り可能な書式は、その全体が参照により本明細書に両方とも組み込まれている。
【０１１９】
開示が、当然に変化し得る特定の構成物または生物学的システムに限定されないことを理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することに意図されないことを理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、内容が別途明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。内容が別途明確に指示しない限り、用語“複数”は、二つ以上の参照対象を含む。他に定義しない限り、本明細書に使用されているすべての技術用語および科学用語は、開示の属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を持っている。
【０１２０】
しかし、本明細書に記載されたものと類似または等価の任意の方法および材料は、本明細書に記載されている適当な材料および方法の特定の実施例を試験するために実際に使用されることができる。
【０１２１】
多数の開示の実施形態は記載されている。それにもかかわらず、種々の変更が、本開示の精神および範囲から逸脱することなく行われることができることは理解されるであろう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１２２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０６７９６５４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／００８３７７７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００９２４３３号明細書
【特許文献４】国際公開第０７／０９２４５１号
【特許文献５】国際公開第２００７／０６２１３２号
【非特許文献】
【０１２３】
【非特許文献１】Ｘａｖｉｅｒ，ＲＪ．＆ Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８，４２７−４３４（２００７）．
【非特許文献２】Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｒｏｕｎｄ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｋａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，６２０−６２５（２００８）．
【非特許文献３】Ｂｒａｕｎ，Ｊ．＆ Ｗｅｉ，Ｂ．Ｂｏｄｙ ｔｒａｆｆｉｃ：ｅｃｏｌｏｇｙ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２，４０１−４２９（２００７）．
【非特許文献４】Ｒｏｕｎｄ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．Ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｓｈａｐｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）．
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５．１９．１−１５．１９．１４．
【非特許文献６】Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８．
【非特許文献７】Ｍ．Ｊ．Ｃｏｙｎｅ，Ａ．Ｏ．Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，Ｂ．Ｃ．Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｖ．Ｊ．Ｃａｒｅｙ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｓｐｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｅ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，（２００１）Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌｏｃｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４３４２−４３５０．
【非特許文献８】Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，Ｒｅｉｄ ＪＨ．（１９８３）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｕｌａｔｅ ａｎｄ ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｏｎ ａ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）：２３９−２４１．
【非特許文献９】Ａｍａｎｄａ Ｌ．Ｈｏｒｓｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｕｅｈｎ．（２０００）Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ａｃｔｉｖｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｖｉａ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１２４８９−１２４９６．
【非特許文献１０】Ｎｉｃｏｌｅ Ｃ．Ｋｅｓｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｅｕｈｎ．（２００４）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：２０６９−２０７６．
【非特許文献１１】Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ，Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ，Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２．
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２００９年４月２３日に出願され、“抗炎症性特性を有する細菌のためのハイスループットスクリーン”と題名を付された米国仮出願第６１／１７２，１０１号（事件整理番号ＣＩＴ−５３５４−Ｐ）の優先権を主張するものであり、その開示の全てを参照して本明細書に組み込む。
【０００２】
政府機関の助成金の記述
国立衛生研究所から与えられた助成金第ＤＫ０７８９３８号に従って、アメリカ合衆国政府はこの発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、免疫調節物質、特に免疫調節微生物及び化合物の同定方法並びにシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
免疫調節微生物及び化合物の同定は、特に興味が持たれている。ヒト消化管は、免疫システムの発達と機能とに大きな影響を有する非常に多くの微生物（腸内細菌叢として知られる）を宿している。哺乳類の消化管に生息する細菌の無数の種のうち、バクテロイデス門は最も豊富なグラム陰性菌の門である。
【０００５】
特に、バクテロイデス・フラジリスは、免疫調節特性を有することが示されているヒト共生微生物である。特に、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節特性は、該細菌による多糖類Ａ（ＰＳＡ）の産生に関連している。
【０００６】
しかし、バクテロイデス・フラジリス（又は任意の共生細菌）が有益な微生物分子を免疫システムへ伝え、そして免疫調節特性を発揮するメカニズム及び／又は分子トリガーの同定は困難とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫調節性、特に抗炎症性特性を有する微生物及び関連する物質をスクリーニングする方法並びにシステムがここに提供される。特に、本明細書に提供されるのは、いくつかの実施形態において、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節応答に匹敵する免疫調節応答を個体中に引き起こすことができる細菌物質の同定を可能にする方法及びシステムである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の態様によれば、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、候補細菌物質を、単独で、或いは、抗原提示細胞の存在下でＴ細胞と接触させることと、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することとを含む。前記方法は、前記接触の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含む。
【０００９】
第二の態様によれば、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、前記接触の後に前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。前記方法は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することを更に含む。また、前記方法は、前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含む。
【００１０】
他の態様によれば、動物において、免疫調節能を有する細菌物質を同定することを目的として方法が記載される。前記方法は、トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補細菌物質で処理することを含み、前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物は、遺伝子的に修飾されて、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の標識化抗炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７又はＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つを発現する。前記方法は、前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカー、或いは、少なくとも一つの前記炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの、トランスジェニックマーカー非ヒト動物における発現を検出することと、前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することとを更に含む。
【００１１】
別の態様によれば、細菌物質をスクリーニングするためのシステムが記載される。システムは、本明細書に記載された抗炎症性細菌物質を同定する方法における同時、組み合わせまたは連続使用のために、Ｔ細胞と、抗原提示細胞と、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性マーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７又はＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの検出するための試薬と、の少なくとも二つを備える。
【００１２】
本明細書に記載された方法及びシステムは、本開示の解釈に応じて当業者により特定可能な、医学的、薬学的、獣医学的な用途、並びに、基礎生物学研究及び様々な用途に関連して使用されることができ、ここで、物質の免疫調節能、特に抗炎症性能を調査することが望ましい。
【００１３】
開示についての一つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において明らかにされている。他の特徴、目的、および利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【００１４】
本明細書に取り込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示についての一つ以上の実施形態を示し、発明の詳細な説明及び実施例の部分と共に、本開示の原理および実装を説明するために役に立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１は、バクテロイデス・フラジリス由来の外膜小胞が、ＰＳＡを含むことを示している。図１Ａは、ＥＤＬ（高電子密度層）富化バクテロイデス・フラジリスについて透過型電子顕微鏡法により検出された、野生型バクテロイデス・フラジリスから産生されたＯＭＶ（ＷＴ−ＯＭＶ）及びバクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから産生されたＯＭＶ（ΔＰＳＡ−ＯＭＶ）を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、野生型細菌及びＰＳＡ−変異細菌からの全細胞（ＷＣ）及び外膜小胞（ＯＭＶ）抽出物のイムノブロット分析を示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、抗ＰＳＡ及び抗ＩｇＧ−金コロイド複合体（５ｎｍ）で染色し、電子顕微鏡法により分析した精製ＯＭＶの免疫金法標識を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、全細胞及びＯＭＶからの莢膜多糖製剤の糖タンパク質染色を示す。
【図２Ａ】図２は、ＯＭＶが、ＰＳＡ依存的方法で、実験的大腸炎及び小腸炎から動物を保護していることを表す代表的な結果を示す。図２Ａは、初期重量から屠殺した日（４日）までの減量として測定された、ＴＮＢＳ大腸炎の誘発（０日）後の動物グループにおける重量減を報告する図表を示す。全てのグループが少なくとも４頭の動物を含み、誤差棒は標準誤差（ＳＥＭ）を示している。結果は三つの独立した試行を代表する。一元配置分散分析法によりｐ値は決定されている。*ｐ＜０．０５；***ｐ＜０．００１。
【図２Ｂ】図２Ｂは、切除直後の、媒体（ＥｔＯＨ）処理及びＴＮＢＳのグループ（ｎ＝４頭／グループ）からの未操作の大腸の画像と、長さの定量化（グラフ）を示す。誤差棒はＳＥＭを示す。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。ｐ値は一元配置分散分析法により決定された。***ｐ＜０．００１。ＮＳ（有意でない）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した、各処理グループの代表的な大腸の断面の画像を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、標準得点システム（ＯＮＬＩＮＥ ＭＥＴＨＯＤＳ）に従って盲検化病理学者（Ｇ．Ｗ．Ｌ）により指定された動物からの大腸炎スコアを示す（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ． （２００１） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １．１９．１−１５．１９．１４）。各記号は個々の動物を表す。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。***ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意でない。
【図２Ｅ】図２Ｅは、全大腸から回収したＲＮＡからのｑＲＴ−ＰＣＲによるサイトカイン転写分析を説明する図表を示す。誤差棒は、４頭／グループからのＳＥＭを示している。結果は三つの独立した試行の代表である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、精製した腸間膜リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞から回収したＲＮＡからのｑＲＴ−ＰＣＲによるサイトカイン転写分析を説明する図表を示す。誤差棒は、４頭／グループからのＳＥＭを示している。結果は三つの独立した試行の代表である。
【図３Ａ】図３は、ＰＳＡを含むＯＭＶが、処理されたＤＣと共培養したＴ細胞からのＩＬ−１０産生及びＦｏｘｐ３発現を誘導することを明らかにする結果を示す。図３Ａは、ＤＣによるＯＭＶ内部移行のフローサイトメトリー（ＦＣ）分析を示す。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識され、培養されたＤＣと共に様々な時間（図示のように）インキュベートされた。また、細胞は抗ＣＤ１１ｃで染色された。百分率は、ＣＤ１１Ｃ＋ＯＭＶ＋集団を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶと共に様々な時間（図示のように）インキュベートされ、且つ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＭＨＣＩＩで染色されたＤＣのＦＣプロットを示す。百分率は、ＣＤ１１Ｃ＋細胞中のＭＨＣＩＩ＋集団を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＣ又はＤＣ−Ｔ細胞共培養からの培養液上澄みのＩＬ−１０のＥＬＩＳＡ分析を示しており、ここで、ＤＣは、ＯＭＶと１８時間振動され、洗浄され、そして原発性ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートされ、或いは、されなかった。上澄みは培養４日目に採取された。培養液試料は、ＯＭＶと振動されていないが、他の点では全く同じように処理されたＤＣを示す。抗ＣＤ３は、Ｔ細胞応答を増幅するためにいくつかの試料に加えられた。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、五つ以上の独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１。
【図３Ｄ】図３Ｄの左図は、ＩＬ−１０−／−動物から分化したＤＣを含む以外は、図３Ｃと同様なＥＬＩＳＡ分析を示す。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。図３Ｄの右図は、ＴＬＲ２−／−動物から分化したＤＣを含む以外は、図３Ｃと同様なＥＬＩＳＡ分析を示す。ＳＥＡ：ブドウ球菌エンテロトキシンＡ。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＤＣとの生体外での培養の後に精製したＴ細胞亜集団から得られたＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された、ＩＬ−１０（左図）及びＦｏｘｐ３（右図）の転写濃度を示す。共培養は(ｃ−ｅ)のように作られ、４日目に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は磁器ビーズ分離で精製され（＞９５％純度）、そしてＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキットを用いて抽出された。相対値はβ−アクチンに標準化した。誤差棒は、三つの試料からのＳＥＭを示している。結果は、三つの独立した試行を代表する。*ｐ＜０．０５。***ｐ＜０．００１。ＮＳ：有意でない。
【図３Ｆ】図３Ｆは、共培養が(ｃ−ｅ)のように作られたが、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を使用したことを示す。ＯＭＶで振動したＤＣとの４日間の培養の後に、細胞は抗ＣＤ４及びＦＣを用いたＧＦＰ発現により検出されたＦｏｘｐ３で染色された。結果は、二つの独立した試行を代表する。
【図４Ａ】図４は、ＰＳＡ含有ＯＭＶによる、Ｔｒｅｇの抑制機能の生体外発生を示す例示的な結果を表している。図４Ａは、ＯＭＶで処理されたＤＣと４日間共培養した後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団によるＩＬ−１０発現のＦＣヒストグラムを示す。脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１０−ＧＦＰマウスから精製され、共培養の後に抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５で染色され、そして、ＧＦＰ発現によりＩＬ−１０発現が測定された。百分率は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−亜集合のＩＬ−１０＋集団を示す。結果は、三つの独立した試行を代表する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、媒体（コントロール）、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶで処理したＤＣで共培養した後の、精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞による単純な応答細胞の生体外抑制を示す。細胞増殖は、ＣＦＳＲ希釈のＦＣにより測定された。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆの比は示されており、百分率は全増殖細胞を示す。Ｎｏ ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞のみである。結果は、二つの独立した試行を代表する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の、それぞれの増殖の最大時における百分率の定量化を示す（図４Ｂ中の１、２、３、４、５と同様に標識されている）。結果は、独立して実施された三つの混合実験から示される。*ｐ＜０．０５。ＮＳ：有意でない。
【図５】図５は、野生型バクテロイデス・フラジリス及びＰＳＡ欠損変異バクテロイデス・フラジリスが、生体外培養中に同等のＯＭＶを産出することを示す。各ＯＭＶ製剤から回収された総タンパク質量は、収集時の培養液のＯＤ６００により標準化された。誤差棒はＳＥＭを示している。結果は、独立して実施された十以上の混合実験から示される。ｐ値はステューデントのｔ検定で決定された。ＮＳ：有意でない。
【図６】図６は、野生型バクテロイデス・フラジリスから精製した多数ＯＭＶがＰＳＡを含むことを示している。精製されたＯＭＶ上のＰＳＡの免疫金法標識は、試料の１０領域（１μｍ×１μｍ）のランダム標本抽出で観測されたＷＴ−ＯＭＶの６０％以下がＰＳＡに関連するが、観測されたΔＰＳＡ−ＯＭＶがＰＳＡについて陽性に染色されていないことを示す（抗ＩｇＧ−金を用いたＷＴ−ＯＭＶの免疫金法標識は、標識の特異性のみを確認する）。
【図７】図７は、野生型バクテロイデス・フラジリス又はＰＳＡ欠損変異バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶが、タンパク質構成に有意差がないことを示す。プロテオーム質量分析法は、ＷＴ−ＯＭＶとΔＰＳＡ−ＯＭＶとの間で同定されたタンパク質の１００％重複（各タンパク質について同定された一つ以上の特徴的なペプチド）を示す。全ての同定されたタンパク質の間で、我々は、それぞれのタンパク質について同定された特徴的なペプチドの番号に従い、相対的に大量のタンパク質の量を準定量的に比較した。それらの大部分は、独立して機能するような差異を示さない。誤差棒はＳＥＭを示している。ｐ値はステューデントのｔ検定で決定された。**ｐ＜０．０１；*ｐ＜０．０５；ＮＳ：有意でない。
【図８】図８は、アクチン重合が、ＤＣによるＯＭＶの取り込みに必要とされることを示している。サイトカラシンＤで予め処理されたＤＣによるＯＭＶ内部移行のフローサイトメトリー分析である。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識され、培養されたＤＣと共に様々な時間で（図に示されている）インキュベートされる。細胞は抗ＣＤ１１ｃで染色された。百分率はＣＤ１１Ｃ＋ＯＭＶ＋集合を示す。
【図９】図９は、ＷＴ−ＯＭＶ又はΔＰＳＡ−ＯＭＶが内部に取り込まれ、ＤＣの細胞質に局在化されていることを示す。ＤＣによるＯＭＶ（ＷＴ又はΔＰＳＡ）内部移行の蛍光顕微鏡写真である。ＯＭＶは、ＦＩＴＣ（灰色矢印）で標識され、培養されたＤＣと二時間インキュベートされた。細胞は固定化され、細胞膜はコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）−テトラメチルローダミン（黒色矢印）を用いて染色された。スケールバー：７．５μｍ。
【図１０】図１０は、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶが、ＤＣ活性化のための共刺激分子を増加させることを示している。ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶを用いて様々な時間で（図に示す）インキュベートされ、且つ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ８６で染色された、ＤＣのＦＣプロットである。百分率はＣＤ１１ｃ＋の中のＣＤ８６＋集合を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記載された実施形態における、バイオマーカーのＰＳＡ誘発発現を示す。各図表で示したデータは、各々の三つの独立した実験を代表する。色が薄い棒は、ＰＢＳ処理されたマウスから誘導した細胞を示し、色が濃い棒は、ＰＳＡ処理されたマウスから誘導した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
方法およびシステムは、免疫調節細菌物質を同定するために適していることが記載されている。
【００１７】
本明細書で使用される用語“免疫調節”は、炎症性応答のないことに関連付けられた状態を促進する能力を意味する。具体的な免疫調節特性は抗炎症性特性を含み、ここで、用語“抗炎症性”は、炎症を防ぐ若しくは低減する物質又は処理の特性を指す。
【００１８】
本明細書で使用される用語“炎症”、“炎症性状態”又は“炎症性応答”は、病原菌、損傷細胞、又は刺激物質などの有害な刺激に対する、個体の維管束組織の複雑な生物学的応答を意味し、またサイトカイン、より具体的には炎症誘発性サイトカイン（すなわち、ミクログリアなどの活性化免疫細胞によって主に産生され、炎症性応答の増幅に伴われるサイトカイン）の分泌を含む。例示的な炎症誘発性サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２３を含む。例示的な炎症は、急性炎症及び慢性炎症を含む。本明細書で使用される単語“急性炎症”は、血漿及び白血球による組織の浸潤に起因する、炎症の典型的兆候（腫れ、発赤、痛み、熱、および機能の喪失）を特徴とする短期的過程を意味する。急性炎症は、一般的に傷害性刺激が存在するかぎり発生し、そして刺激が、瘢痕化（線維症）によって除去され、壊滅され、又は遮断されると急性炎症が止む。本明細書で使用される単語“慢性炎症”は、同時発生性活動性炎症、組織破壊、及び修復の試みを特徴とする状態を意味する。慢性炎症は、上記の急性炎症の典型的兆候によって特徴付けられない。代わりに、慢性的に炎症を起こした組織は、単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞）の浸潤、組織破壊、並びに血管新生及び線維症を含む治療の試みにより特徴付けられる。
【００１９】
本明細書で使用される用語“物質”とは、特定の又は明確な化学構造の物体を意味する。用語“細菌物質”とは、生きた細菌、死んだ細菌、及び特に加熱死菌、細菌抽出物、細菌由来の精製分子、細菌から精製された分子の組み合わせ、又は細菌から若しくは細菌由来の精製小胞から精製された一つの分子を若しくは分子の組み合わせを含む小胞などの細菌由来の物質を意味する。特に、細菌物質は、細菌の表面から放出される小胞であって、遠隔の標的細胞へ一連の積み荷分子を運ぶ膜外小胞により形成され得る。細菌物質は、同じ細菌から誘導した物質及び二つ以上の異なる細菌から誘導した物質を含む。
【００２０】
本明細書で使用される用語“細菌”は、通常、長さ数マイクロメートルで、種々の形状を有している単細胞、原核細胞、微生物の大きなグループを意味する。特に、本開示の意味における細菌は、ヒトフローラの細菌、すなわち、ヒト組織の表面上並びに内部及び体液中、例えば、皮膚の深層、唾液中、口腔又は膣粘膜中及び消化管中に宿る微生物の集合を含む。細菌フローラは、腸フローラ（ヒト消化管において検出可能な細菌）、膣内フローラ（女性ヒトにおいて子宮から身体外側へつながる線維筋管路中において検出可能な細菌）及び皮膚フローラ（ヒト皮膚において検出可能な細菌）を含む。さらに、特に、本開示の意味における細菌とは、腸フローラの一つ以上のバクテロイデス門、特に、一つ以上のバクテロイデス属（ヒトと共生し、当業者によって識別可能である、グラム陰性の非芽胞形成嫌気性桿菌の属）により形成され得る。代表的なバクテロイデス属の細菌は、バクテロイデス・フラジリスである。
【００２１】
本明細書に記載の方法及びシステムにおいて、細菌物質の免疫調節能は、炎症性バイオマーカーおよび／または抗炎症性バイオマーカーの検出により決定され得る。本明細書で使用される用語“バイオマーカー”は、細胞周期の段階、生物学的プロセス、並びに健康状態及び疾患状態のような、生物学的状態の指標として使用される物質または特徴を意味する。バイオマーカーの存在、欠如、減少、発現上昇は、特定の状態に関連しており、また特定の状態を表示している。特に、本明細書に使用される用語“炎症性バイオマーカー”は、炎症状態の存在を表示しており、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ-２１、ＩＬ-２２、ＩＬ−２３、ＩＬ-１７、ＴＮＦα、並びに当業者により同定可能な追加の細胞マーカー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。本明細書に使用される用語“抗炎症性バイオマーカー”は、炎症状態がないことを表示し、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢ並びに当業者により同定可能な追加の細胞マーカー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される用語“トランスジェニックマーカー非ヒト動物”とは、自然に又は多くの遺伝子工学的操作のうちの任意の操作により移植された非天然の遺伝子材料を有する動物を指す。そのような非天然の遺伝子材料（又は導入遺伝子）は、“バイオマーカー”（本明細書で定義される）として作用し得、及び／又は非ヒト動物においてＲＮＡ若しくはタンパク質を産生する能力を保持し得る。
【００２３】
一実施形態において、免疫調節細菌物質の同定は、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞により、炎症性又は抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することにより実行される。
【００２４】
本明細書で使用される用語“Ｔ細胞”は、当業者により同定可能な異なる細胞種を含む、リンパ球（白血球の一種）の亜群を意味する。本開示によるヘルパーＴ細胞は、エフェクターＴｈ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７など）とサプレッサーＴ細胞（Ｔｒｅｇなど）とを含み、エフェクターＴｈ細胞は即ち、ヘルパーＴ細胞を含む、他の白血球と刺激し又は相互作用するサイトカイン、タンパク質又はペプチドを分泌するヘルパー細胞であり、サプレッサーＴ細胞は即ち、免疫システムの活性を抑制し、それにより免疫システムの恒常性と自己抗原への耐性とを維持するＴ細胞である。
【００２５】
本明細書で使用される用語“抗原提示細胞”とは、細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を用いて外来抗原複合体を提示する細胞を意味する。特に、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞及び当業者により同定可能な追加の細胞を含む。
【００２６】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、候補細菌物質を、単独で又は又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と、接触することを含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法は、候補細菌物質が抗原提示細胞と接触し、該接触の後の、前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。
【００２７】
本明細書で使用される用語“接触”又は“インキュベート”は、二つの項目の間の少なくとも一つの相互関係のある動作若しくは影響、又は相互関係のない動作若しくは影響が発揮されうるような状況の下に、一時的に与えられた二つの項目間で空間的関係の創造へ指向される動作を意味する。特に、インキュベートすることは、細菌物質と細胞との間で実行されることができ、細菌物質と細胞との間で直接的接触及び／若しくは直接的相互作用という結果になり、又は細菌物質の間接的作用の後に（例えば、細胞と直接的相互作用する他の物質の活性化又は修飾の後に）細胞の修飾という結果になる。
【００２８】
インキュベートはまた、細菌物質の第１の細胞との接触の後に、第１の細胞と第２の細胞との間で実行され得、その結果、第１の細胞と第２の細胞との間の直接的接触及び／又は直接的相互作用の結果になり得、又は第１の細胞の間接的作用の後に（例えば、第２の細胞と直接的な相互作用するサイトカイン又は他の分子の分泌の後に）第２の細胞の修飾の結果になり得る。
【００２９】
例示的な、細菌物質をＴ細胞又は抗原提示細胞と接触させることは、特異的な細胞及び特異的な細菌物質に依存し、本開示を読む当業者により同定可能である適当な条件下で、細菌物質を含有する溶液内において、一つ以上の細胞種を含む全試料を溶液槽により、生体外で実行され得る。さらなる例示的な、細菌物質と、Ｔ細胞又は抗原提示細胞との接触は、適した条件下で精製細胞の細胞培養液へ細菌物質を生体外で誘導することによって、及び個体（標識化炎症性バイオマーカー又は抗炎症性バイオマーカーを発現するために遺伝子的に修飾されているヒト以外の遺伝子移植の動物）を細菌物質を用いて生体内処理することによって、実行され得る。処理は、細菌物質を、局所投与又は全身投与することによって実行され得る。全身投与は、腸内投与（例えば、経口投与、胃栄養管による投与、十二指腸栄養管による投与、胃瘻造設、経腸栄養、および直腸投与）および非経口投与（例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、膀胱内注入）を含む。局所投与は、限定されないが、経皮投与、吸入投与（例えば、喘息治療薬内に）、浣腸、点眼（例えば、結膜上に）、点耳、鼻腔内経路（例えば、うっ血除去点鼻薬）、及び膣内投与を含む。
【００３０】
例示的な、抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることは、Ｔ細胞を含む細胞培養液と抗原提示細胞を含む細胞培養液とを生体外混合することにより、Ｔ細胞の培養液に精製抗原提示細胞を生体外で添加することにより、又は抗原提示細胞の培養液に精製Ｔ細胞を生体外で添加することにより実行され得る。さらなる例示的な、生体内でのＴ細胞と抗原提示細胞とのさらなるインキュベートすることは、個体組織への抗原提示細胞の移植、Ｔ細胞を含む組織、又は抗原提示細胞を含む個体組織の組織へのＴ細胞の移植を含む。一実施形態において、個体は、標識化炎症性バイオマーカーまたは抗炎症性バイオマーカーを発現するように遺伝子的に修飾されたヒト以外のトランスジェニック動物である。
【００３１】
物質と、抗原提示細胞又はＴ細胞との接触、及び抗原提示細胞とＴ細胞とのインキュベートを実行するための適切なさらなる手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によって生体外又は生体内で同定することができる。
【００３２】
接触またはインキュベートを実行するための適した条件は、当業者により同定可能であり、例えば、適した生育環境を細胞に与えるために、温度、また任意に大気のＣＯ２、Ｎ２及び／又はＯ２の濃度、相対湿度、栄養量並びにその他の適した条件を調整し、監視するロボットの細胞培養器を使用することによって、生体外又は適当な環境下での細胞培養に適した環境の提供を含む。また、生体外又は生体内での、物質及び細胞の接触を行うためのさらなる適当な手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によって同定され得る。
【００３３】
生体外培養液に又は動物生体内に与えられた物質量だけでなく、インキュベートの時間フレームは、特定の細菌物質、特定のＴ細胞、抗原提示細胞、処理される動物、関連する適当な条件及び実験計画の実験的な観点において、当業者によって決定され得る。
【００３４】
本明細書に記載の方法及びシステムにおいて、炎症性バイオマーカー又は抗炎症性バイオマーカーの発現の検出は、標識化バイオマーカー若しくはバイオマーカーに対し特異的な標識化分子又はそれらに関連した分子を含む、標識化分子の使用を含む、当業者にとって同定可能な手法により、生体外又は生体内で実行され得る。
【００３５】
本明細書で用いられる用語“検出する”又は“検出”は、限定されないが、試料、反応混合物、分子複合体及び物質を含む、空間の限られた部分において分析又は関連する信号の実在、存在又は事実の決定を示す。検出は、分析物の数量若しくは量又は関連する信号の測定を参照し、測定に関連し、測定を含むとき（定量において同様に参照される）、“定量的”であり、限定されないが、分析物若しくは関連する信号の量又は比率を決めるために計画された任意の分析を含む。検出は、他の分析物又は関連する信号の相対的存在量に関して、分析物若しくは関連する信号の質又は種類の同定を、参照し、関連し、又は含むとき、“定性的”であり、定量化されない。
【００３６】
用語“標識”及び“標識化分子”又は検出可能な分子を指す複合体若しくは分子の成分として本明細書で使用される用語は、限定されないが、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光染料、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はハプテンなど）などを含む。用語“蛍光物質”は、検出可能な画像中に蛍光を示すことができる物質又はその部分を指す。結果として、本明細書で使用する言葉“信号”又は“標識信号”は、標識検出を可能にする標識から放出される信号を意味し、限定されないが、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果物中の化合物の生産などを含む。
【００３７】
検出は、バイオマーカー、前駆体若しくはその類似体、及び／又はそれに関連する分析物の発現のレベルを検出することにより実行され得る。二つの項目に参照して本明細書で使用される言葉“に関連する”は、第一の項目の出現が、第二の項目の出現によって同時に伴われるような二つの項目間の関係を示し、限定されないが、因果関係及び兆候／症状−病気の関係を含む。特に、検出は、定性的又は定量的に実行され、ＲＮＡ、タンパク質、その前駆体、異なる種類（すなわちｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡ）及び／若しくは分解生成物などの分子の検出、並びに／又はそれらに関連する検出若しくは測定可能な特性を含み得る。検出を実行するための技術および手順は、本開示を読む当業者により同定可能である。
【００３８】
例示的な、バイオマーカー発現の検出のための方法は、限定されないが、ＥＬＩＳＡと、Ｑ−ＰＣＲと、ＦＡＣＳによって検出される細胞内サイトカイン染色とを含む、当業者に周知の方法を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの発現は、蛍光物質で標識された、バイオマーカーに又はそれに関連する分子に特異な抗体を使用して実施される細胞培養液上の蛍光に基づく読み出しによって検出され、蛍光物質としては、網羅的でないが、低分子色素、タンパク質の発色団、量子ドット、及び金ナノ粒子を含む。一実施形態において、バイオマーカーの発現は、生体内で（例えば、動物組織内で）又は生体外で（例えば、細胞培養液中で）、バイオマーカープロモーターの転写制御下で標識の発現の検出により、検出され得る。それらのいくつかの実施形態において、バイオマーカーは、具体的にはＩＬ−１０又はＦｏｘｐ３であり得る。さらなる手法は、本開示を読むことで当業者により同定可能であり、またさらなる詳細について説明されないだろう。
【００３９】
本明細書に記載した方法及びシステムにおいて、候補細菌物質の抗炎症性能は、接触及び／又はインキュベートに続く、一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加又は一つ以上の炎症性バイオマーカーの発現の減少の検出を通じて決定され得る。バイオマーカー発現の増加及び／又は減少を決定することは、接触及び／又はインキュベートの後のバイオマーカーの検出発現と、接触及び／又はインキュベートがない状態で、同じバイオマーカーの予め決定された検出発現とを比較することにより実行される。バイオマーカーの発現の増加及び／又は減少を決定することは、検出された発現マーカーと、接触及び／又はインキュベートがない状態においてコントロール細胞で同じバイオマーカーの検出された発現とを、比較することにより実行されることができる。
【００４０】
引用文献は、実施例の部分に記載されており、抗炎症性バイオマーカーのＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢの発現の増加並びに炎症性バイオマーカーのＴＮＦ−αまたはＩＬ−１７Ａの発現の減少が、上記発現様式とバクテロイデス・フラジリスの生物学的活性との関連性を支持する、バクテロイデス・フラジリスの作用の機構に関連する。バクテロイデス・フラジリスの抗炎症性能は、当業者により同定可能であり、限定されないが、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５を含む、様々な出版物や特許に説明されており、各々のその全体が本明細書において参照され援用される。当業者は、候補細菌物質の特定の抗炎症性能が、産生されたサイトカインと、本明細書に記載の方法によって同定された候補細菌物質によって活性化された細胞との特定のセットのさらなる決定に基づいて、決定される可能性があることを理解するであろう。
【００４１】
一実施形態において、抗炎症性バイオマーカーの発現の増加又は炎症性バイオマーカーの発現の低下の検出は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢ又はそれらの組み合わせなどの抗炎症性分子を誘導する物質の能力、または、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７若しくはＴＮＦα又はそれらの組み合わせなどの炎症性サイトカインを抑制する物質の能力を示す。
【００４２】
一実施形態において、方法は、生体外で及び／又は生体内で、候補細菌物質を、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と接触させることとし、またＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及び／又はグランザイムＢの発現は、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特にＦｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４３】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、接触の後に抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。この方法は、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することをさらに含み、ここで、インキュベートの後のバイオマーカー発現の増加の検出が候補物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ−１０、パーフォリン及び／又はグランザイムＢはＦｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４４】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を、単独で又は抗原提示細胞存在下でＴ細胞と接触させることと、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも一つの炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後に炎症性バイオマーカーの発現の減少は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ１７及びＴＮＦαの発現は、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４５】
一実施形態において、方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、接触の後に抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることを含む。該方法は、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することをさらに含み、ここで、接触の後の炎症性バイオマーカー発現の減少が候補物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、ＩＬ１７及びＴＮＦαは、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞上で、また特に、Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞上で実行される。
【００４６】
一実施形態において、候補細菌物質は純粋なプール内の細菌を含む。他の実施形態において、候補細菌物質は混成のプール内の細菌を含む。細菌は生きた菌、死んだ菌、細菌から分離された抽出物若しくは産生物、又はそれぞれの組み合わせとすることができる。細菌はまた、実験室株、ＡＴＣＣなどのリポジトリからの分離株、動物からの分離株、ヒトからの分離株、またはそれぞれの組み合わせであってもよい。
【００４７】
一実施形態において、動物から分離株は排泄物から分離される。分離株はまた、腸内容物又は排泄物及び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。一実施形態において、ヒトからの分離株は排泄物から分離される。分離株はまた、腸内容物又は排泄物及び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。
【００４８】
一実施形態において、方法は、トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、特に、マウス又はラットのようなトランスジェニックマーカー非ヒト哺乳類を、候補物質で処理することを含み、トランスジェニックマーカー非ヒト動物は一般的に、ＩＬ−１０及びＦｏｘｐ３だけでなくパーフォリン及びグランザイムＢ、ＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群から選択される標識化抗炎症性バイオマーカー又は炎症性バイオマーカーを発現するように遺伝子的に修飾されており、処理後にトランスジェニックマーカー非ヒト動物におけるバイオマーカー発現を検出する。
【００４９】
特に、一実施形態において、前述のトランスジェニック非ヒト動物のモデルは、物質を経口に若しくは静脈内に処理され得、又は強制経口により生きた菌を恒久的にコロニー化され得、バイオマーカー発現のＦｏｘｐ３又はＩＬ１０発現の量が、物質の免疫調節能の測定として、脾臓、腸間膜リンパ節、小腸及び大腸、肺、膵臓、および骨髄を含むマウスの様々なコンパートメントにおいて観察されるだろう。
【００５０】
一実施形態において、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞又はマクロファージは、ＩＬ−１０（若しくは、Ｔ細胞の分析の場合にはＦｏｘｐ３）の発現が蛍光体である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でマークされているマウスから精製され又は分化される。これらの実施形態において、候補細菌物質は、前記細胞種のいずれかと接触させられ、ＧＦＰの発現量が、試験される物質の免疫調節能を意味することを決定される。また、樹状細胞または他の抗原提示細胞は物質とインキュベートすることができ、物質が洗浄されることができ、その後、樹状細胞は、Ｔ細胞から免疫調節活性を誘発するために樹状細胞の免疫調節能を決定するためにＴ細胞とインキュベートすることができる。ＧＦＰの発現は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）またはマイクロプレートリーダーを用いて決定されることができる。
【００５１】
一実施形態において、Ｔ細胞と、抗原提示細胞と、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びにＩＬ１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの検出をするための試薬とは、本明細書に記載の方法にしたがって免疫調節能を有する細菌物質を同定するためのシステムを含み得る。
【００５２】
一実施形態において、システムは、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はマクロファージを含み、いくつかの実施形態において、樹状細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はマクロファージがＩＬ−１０（若しくは、Ｔ細胞の分析の場合にはＦｏｘｐ３）の発現が蛍光体である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でマークされているマウスから精製され又は分化されることができる。
【００５３】
システムは、部品のキットの形態で提供され得る。部品のキットにおいて、方法を実行するためのマルチリガンド捕捉剤および他の試薬は、キット内で独立的に含まれ得る。抗原提示細胞、Ｔ細胞及び試薬は、一つ以上の構成物中に含められ得、また各々の細胞及び試薬は、適当な媒体と共に構成物にし得る。
【００５４】
さらなる構成部分は、標識化分子及び特に、抗炎症性バイオマーカー若しくは炎症性バイオマーカーに特異的な標識化捕捉剤、又はその発現に関連する分子、マイクロ流体チップ、標準試料、並びに本開示を読むことで当業者により同定可能なさらなる格子得部分を含むことができる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語“捕捉剤”は、目標物に対し特異的に結合し得る化合物を示す。第一の分子に対する第二の分子への結合を参照するときの本明細書で使用される単語“特異的な”“特異的に”又は“特異性”は、第一の分子と第二の分子との安定した複合体の認識、接触及び形成とともに、第一の分子と第二の分子とのそれぞれが、存在し得る他の分子と一緒に安定な複合体の認識をせず、接触をせず及び形成をしないことが実質的に少ないことを指す。例示的な特異な結合としては、抗体−抗原相互作用、分子レセプター−リガンド相互作用、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、酵素基質の相互作用などである。“安定な複合体”は、検出可能であり、安定性の任意のレベルを必要とせず、しかしより大きな安定が通常好ましい。いくつかの実施形態において、キットは標識化ポリヌクレオチド又は標識化抗体を含みうる。
【００５６】
キットの構成部分は、本明細書中に記載する方法を実行するために、適当な指示及び他の必要な試薬を与え得る。キットは通常、別々の容器に構成物を含むだろう。指示（例えば、解析するにために、書面上に又はテープ若しくはＣＤ−ＲＯＭのように電子的に対応されているもの上に、記載された指示又は音声指示）は、キット内に通常含まれるだろう。キットはまた、特定の使用の方法、他のパッケージ化試薬及び材料（すなわち洗浄用バッファーなど）に応じて含めることができる。
【００５７】
好適な担体剤または構成物の助剤の同定に関するさらなる詳細、およびキットの一般的な製造及び包装は、本開示を読む当業者により同定され得る。
【実施例】
【００５８】
本明細書に記載する方法及びシステム並びに関連する構成物は、さらに後の実施例においてさらに示され、実施例は、例示のために提供され、制限されることを意図されていない。
【００５９】
特に、次の実施例は、例示的な細胞培養、並びにＰＳＡを細胞と接触させ及びＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン、グランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＬ１７Ａの発現を検出するための方法を示している。当業者は、本開示に従うことにより、ＰＳＡ及びバクテロイデス・フラジリスの追加物質に対する免疫調節活性を検出するために適した、ＰＳＡ及びバクテロイデス・フラジリス並びに細胞／培養液／動物のシステムのために、詳細において述べられている特徴の適応性を理解するだろう。同様に、当業者は、本明細書に記載された他のバイオマーカーへの、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、パーフォリン、グランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＬ１７Ａのようなバイオマーカーの検出の適応性を理解するだろう。
【００６０】
材料及び方法
以下の材料および方法は、本明細書に例示した免疫調節物質の検出を目的に全ての方法及びシステムのために使用された。
【００６１】
菌種、培養条件及びマウス
バクテロイデス・フラジリス株 ＮＣＴＣ ９３４３は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得、その同質遺伝子的ＰＳＡ欠損変異株及びｍｐｉ４４変異株（ＰＳＡのみを産生し、他の多糖類を産生しない）は、「ＭＪ．Ｃｏｙｎｅ，Ａ．Ｏ．Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，Ｂ．Ｃ．Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｖ．Ｊ．Ｃａｒｅｙ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｓｐｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｅ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，（２００１）Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌｏｃｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４３４２−４３５０」に記載されている。細菌は、１ＬのｄｄＨ２Ｏ中に３７ｇＢＨＩ（ＢＤ社＃２３７２００）、０．５μｇ／ｍｌヘミン（Ｓｉｇｍａ社 Ｈ５５３３）、及び０．５μｇ／ｍｌビタミンＫ（Ｓｉｇｍａ社 Ｖ３５０１）を含む富栄養培地、又は１ＬのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＳＫＵ＃１１８３５−０３０）中に８ｇグルコース、１％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌヘミン、及び０．５μｇ／ｍｌビタミンＫを含むカスタマイズした最小培地（ＭＭ）のいずれかで生育された。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃ株のＳＰＦマウスはＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入された。ＴＬＲ２−／−及びＩＬ−１０ノックアウトマウスは、Ｊａｃｋｓｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入された。ＩＬ−１０ＧＦＰマウスはｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｋａｒｐ ｆｒｏｍ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ ｍｅｄｉｃａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌから調達し、また、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスはｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔａｌａｌ Ｃｈａｔｉｌａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓから得られた。
【００６２】
ＥＤＬ富化細菌集団の分離
パーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社＃１７−０８９１−０１）不連続密度勾配遠心分離は、野生型バクテロイデス・フラジリス及びバクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡの両方におけるＥＤＬ分離のために用いられた（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， Ｒｅｉｄ ＪＨ．（１９８３）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｕｌａｔｅ ａｎｄ ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｔｅ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｏｎ ａ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）：２３９−４１）。簡単に言えば、２０％、４０％、６０％、８０％のパーコール勾配（ＰＢＳで希釈）は１４ｍｌ試験管に作製された（各層２ｍｌ）。その後、ＰＢＳに再懸濁されたバクテロイデス・フラジリス培養液は２０％パーコール層の上部に慎重に加えられた。続いて、勾配は、室温、８００ｇ、２０分間の条件で遠心分離された。ＥＤＬ富化細菌は、分離後勾配の４０％−６０％の境界面から回収され得る。
【００６３】
ＯＭＶの精製と標識
この方法は、Ｅ．ｃｏｌｉからＯＭＶを調製するために、以前記載された手順（Ａｍａｎｄａ Ｌ． Ｈｏｒｓｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｕｅｈｎ．（２０００）Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ａｃｔｉｖｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｖｉａ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１２４８９−１２４９６）に適応された。簡単に言えば、ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスは、カスタマイズ化されたＭＭの中で生育された。ＯＭＶは、４０００ｇ、２時間、４℃の条件で遠心により培養液中の細菌が取り除かれた上澄みから回収され、ＰＢＳで二回洗浄され、０．４５μｍスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 ＃２０−２１８）によりろ過された。精製されたＯＭＶの総タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析（Ｂｉｏｒａｄ社 ＃５００−０２０５）により測定した。ＦＩＴＣ標識化ＯＭＶは、以前記載されたように調製された（Ｎｉｃｏｌｅ Ｃ． Ｋｅｓｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｅｕｈｎ．（２００４）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：２０６９−２０７６）。簡単に言えば、ＯＭＶは、室温で１時間、染色緩衝液（ｌｍｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 ＃４６４２４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ９．２）中でインキュベートされた。標識化ＯＭＶは、４℃、３０分、４０，０００ｇの条件で遠心分離により収集され、ＰＢＳ＋２００ｍＭ ＮａＣｌで２回洗浄された。
【００６４】
細菌超薄切片の電子顕微鏡
ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、以前記載されたように調製された（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ， ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ， Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ， Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２）。簡単に言えば、試料は、２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社 Ｇ５８８２）のカコジル酸緩衝液中で、４℃で、一晩かけて固定化され、そして、四酸化オスミウム（１％、ｗ／ｖ）中で、３時間、室温、暗所でさらに固定化された。ルテニウムレッド（ｌｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社 Ｒ２７５１）は、固定化手順の両方に含有された。その後、固定化試料は、アルコールによる一連の段階的脱水後、エポキシ樹脂に包埋された。ＴＥＭにより可視化する前に、超薄切片（１００−２００ｎｍ）は切断され、ホルムバール／炭素被膜銅格子上で２％の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛でネガティブ染色された。
【００６５】
精製ＯＭＶの免疫金標識
この方法は、以前記載された手順（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ，Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ，Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２）に適応された。簡単に言えば、ごく少量の精製ＯＭＶは、ホルムバール／炭素被膜金格子（ＥＭＳ社 ＃ＦＦ２００−Ａｕ）に塗られ、空気で乾燥された。免疫金標識は、“ＯＭＶ”が付された格子の側面が下になるように浮かした状態にされ、一連の抗体及び洗浄溶液の滴下により、室温で実行された。具体的には、試料は、０．１２％グリシン中で５分間のインキュベートの後、１０％ＦＢＳ中で１０分間ブロックされ、続いて、ＰＢＳで３分間の洗浄が５回実施された。その後、５ｎｍ 金粒子を有する第二の抗体−ＩｇＧ結合体（Ｄｒ．Ｐａｕｌ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｈｏｕｓｅ Ｅａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓからの親切な寄贈品）は２０分間試料に適用され、続いて、再度、ＰＢＳを用いて４分間の洗浄を５回実施された。標識後、試料は１％グルタルアルデヒド中で５分間固定化され、ＰＢＳの１分間×４回の滴下へ、またＨ２Ｏ１分間×４回の滴下へ格子が移されることで十分に洗浄された。対比染色は、氷上で１０分間、３−５％酢酸ウラニルが２％メチルセルロースに溶解した溶液の滴下に格子が配置されることにより実施された。最後に、格子は、ワイヤーループにより染色液から取り除かれ、空気乾燥された。メチルセルロースの薄膜で覆われた試料は、ループから取り除かれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって可視化するために使用された。
【００６６】
糖タンパク質分析
全細胞抽出物またはＯＭＶ（バクテロイデス・フラジリス変異株ｍｐｉ４４由来）から精製したＰＳＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、続いて、ゲルは、ＰＳＡの存在を示すための糖タンパク質染色キット（Ｇ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 ＃７８６−２５４）により染色された。
【００６７】
化学的（ＴＮＢＳ）誘発性の実験的大腸炎
この手順は、以前記載された方法（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５．１９．１−１５．１９．１４）に適応された。簡単に述べると、野生型（Ｂａｌｂ／ｃ）雄マウスは、ＴＮＢＳ投与される前に、ＰＢＳ、ＷＴ−ＯＭＶ（５μｇ）又はΔＰＳＡ−ＯＭＶ（５μｇ）を一日おきに一週間、経口処理された。処理されたマウスは、イソフルランで麻酔され、２％ＴＮＢＳ（５０％ＥｔＯＨ中、Ｓｉｇｍ社 Ｐ２２９７）の直腸投与が３．５Ｆカテーテル（Ｉｎｓｔｅｃｈ Ｓｏｌｏｍｏｎ社 ＳＩＬ−Ｃ３５）を通じて適用された。ＴＮＢＳ投与の後、経口処理はさらに二回続けられ、最後の処置後１−２日にマウスは分析された。
【００６８】
組織病理学的解析
マウスの大腸は、１０％中性緩衝ホルマリン液（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社 ＣＡＳ＃５０−００−０）に固定され、Ｈ＆Ｅ染色のためにＰａｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ社により処理された。各大腸断片の大腸炎スコアは、病理学者（Ｄｒ． Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｌａｗｓｏｎ， Ｄａｖｉｄ Ｇｅｆｆｅｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＵＣＬＡ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ）によって盲検方式で評価された。組織学的画像は光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して２０倍率で撮影された。
【００６９】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、ＴＲｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＃１５５９６−０１８）を用いてマウス組織から、又はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社 ＃７４１０４）を用いて精製細胞から、いずれかにより収集された。ｉＳＣＲＩＰＴ ｃＤＮＡ合成キット（バイオラッド社 ＃１７０−８８９０）はｃＤＮＡの変換に使用され、ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社 ＃１７２−８８８２）は、リアルタイムＰＣＲに使用された。本研究で使用されたプライマーは、ＴＮＦα（Ｆ−５’ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＣ ３’（配列番号：１）、Ｒ−５’ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＧＴ ３’）（配列番号：２）、ＩＬ−１７（Ｆ−５’ＴＴＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＡＡ ３’（配列番号：３）、Ｒ−５’ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＡ ＴＣＣ ＡＡ ３’）（配列番号：４）ＩＬ−１０（Ｆ−５’ＧＧＴ ＴＧＣ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＣＧ ＧＡ ３’（配列番号５）、Ｒ−５’ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ Ｔ ３’）（配列番号６）、Ｆｏｘｐ３（Ｆ−５’ＧＣＡ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ３’（配列番号７）、Ｒ−５’ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＧＧＡ ＴＡＡ Ｇ ３’（配列番号：８））である。
【００７０】
蛍光顕微鏡検査法
生体外で分化されたＢＭＤＣは、５０，０００細胞／ウェルでＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ ８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社 ＃１５４５３４）に蒔かれた。ＦＩＴＣ標識化ＯＭＶは１０μｇ／ｍｌで細胞培養液に添加された。２時間のインキュベートの後、細胞は室温で２０分間、４％ＰＦＡで固定された。５分間のＰＢＳ洗浄が３回された後に、細胞膜は、１μｇ／ｍｌのＷＧＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 Ｗ８４９）結合テトラメチルローダミンで、４℃で１時間染色された。プロロングゴールド褪色防止剤（Ｐ３６９３０）は、細胞膜の染色を、膜染色に続く広範な洗浄後に、試料に対し適用された。蛍光画像は、ＬＳＭ ５１０顕微鏡とＰｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ６３ｘ／１．２５油浸対物レンズとを用いて撮影した。
【００７１】
フローサイトメトリー及び染色
ＯＭＶ取込み解析またはＯＭＶ活性化解析の結果のＢＭＤＣは採取され、氷上で３０分間、５％のマウス血清でブロックされた。ブロックした後、細胞は、氷上で３０分間抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、抗ＭＨＣＩＩ−ＦＩＴＣ又は抗ＣＤ８６−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色され、フローサイトメトリー分析の前にＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含有）、１％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を用いて４℃で２回洗浄された。同様に、生体外でのＢＭＤＣ−Ｔ細胞の共培養由来の細胞は、ブロックされ、採取される前に４−４．５時間ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて細胞を再刺激したことを除いて同じ方法で、抗ＣＤ４−ＡＰＣ／抗ＣＤ２５−ＰＥを用いて染色された。全てのフローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて行われ、結果はＦｌｏｗＪｏを用いて分析された。
【００７２】
ＢＭＤＣ−Ｔ細胞の生体外共培養
骨髄は、マウスの異なる株から採取され、従来の記載のように（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８）２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社＃９５１７５７１）存在下で生体外で８日間分化された。（細胞の純度＞９０％）。ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞は、磁気マイクロビーズ精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社＃１３０−０９０−８６０）（細胞の純度＞９５％）により単離された。ＯＭＶが振動されたＢＭＤＣ（１０μｌ／ｍｌ ＯＭＶ、１００，０００細胞／ｍｌ、１２時間から２４時間）は、ＨＢＳＳで洗浄され、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１，０００，０００細胞／ｍｌ）が、０．０１μｌ／ｍｌ抗ＣＤ３（０日目、図３Ｄ、Ｅ、Ｆ、図４Ａに示されるように図３Ｃ）と、２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ（０日目、図３Ｃ、Ｄ及びＦ、図４Ａ）の追加と、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２（１日目とで３日目、生体外で全てのＤＣ−Ｔ細胞共培養分析）丸底９６ウェルプレート内でインキュベートした。合計４日の培養後、上清をＥＬＩＳＡ（＃８８−７１０４−７７ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）又は細胞は、染色及びフローサイトメトリーの解析のために採取された。
【００７３】
生体外での抑制分析
ＢＭＤＣ（ＷＴ−ＯＭＶ又はΔＰＳＡ−ＯＭＶと振動されている）−Ｔ細胞の共培養から精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社， ＃１３０−０９１−０４１）の供給源として使用された。マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社 Ｍ４２７８）で処理し、ＣＤ４除去マウスの脾細胞は、ＡＰＣ（１００，０００細胞／ｍｌ）として使用された。マウスの脾臓から直接精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、１０分間、３７℃でＣＦＳＥと振動され、続いて、まずＰＢＳで次に培養液で洗浄され、レスポンダー細胞（エフェクターＴ細胞）として（５００，０００細胞／ｍｌ）をすぐに使用された。この分析は、２００μｌ体積の５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 ＃１６−００３１−８６）追加により、丸底９６ウェルプレートで行われた。エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞との比を滴定により測定され、細胞はＦＡＣＳ分析のための培養２−３日後に採取された。
【００７４】
統計的分析
ステューデントのｔ検定及び一元配置分散分析法は、一対比較及び二つを超えるグループ間の比較にそれぞれ適用された。分散分析により検出されたグループ間の有意差は、統計学的有意差を示すグループを識別するために、事後テストとしてニューマン−クールズの検定を用いて分析した。すべての誤差棒はＳＥＭを示す。ＮＳ：有意でない。*ｐ＜０．０５。***ｐ＜０．０１。***ｐ＜０．００１。
【００７５】
実施例１：免疫調節莢膜多糖体ＰＳＡは、バクテロイデス・フラジリスのＯＭＶの中へ活発に局在化される。
ＥＤＬ富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、材料及び方法に記載されたように調製され、透過型電子顕微鏡により画像化された。
【００７６】
図１Ａに示される結果は、ＯＭＶが豊富に細菌によって産生され、細菌の外被（図１Ａ、より高倍率）からの出芽を観測されることができたことを示す。出願人らこれまでの研究では、ＰＳＡ欠損が、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節能を抑制することを示している（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８．）（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｒｏｕｎｄ， ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００８）Ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ． ４５３（７１９５）６２０−６２５）。ＰＳＡ変異株（バクテロイデス・フラジリス ΔＰＳＡ）の電子顕微鏡写真は、ＯＭＶ合成において欠陥のないことを示し、そして、産生されたＯＭＶの大きさ、形状及び豊富さは、野生型細菌（図１Ａ及び図５）と識別不能であった。特に、図１Ａに示される結果は、小胞が細菌の表面から活発に出芽していることを明らかにした。
【００７７】
ＰＳＡが、バクテロイデス・フラジリスのＯＭＶに関連するかを判断するために、野生型細菌及びΔＰＳＡ細菌から精製した小胞は、材料及び方法の部分で記載したように分析され免疫ブロットが行われた。
【００７８】
図１Ｂに示される結果は、野生型由来の小胞が、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡ由来のＯＭＶとは異なり、ＰＳＡへの免疫反応性を表示することを示す。バクテロイデス・フラジリスは、細菌細胞の表面を覆っている、ＰＳＡ〜ＰＳＨという名称の、少なくとも８つの異なる莢膜多糖を産生する。ＰＳＢも小胞の標本内で検出されたが、ＰＳＧは存在せず、ＯＭＶで包まれるために特定の多糖類に対する選択性を示す（図１Ｂ）。したがって、図１Ｂの結果は、ＰＳＧのみが細菌表面上で検出される一方で、ＰＳＡ及びＰＳＢは、小胞に関連することを示している。莢膜多糖体に対する欠損変異株は、各抗血清の特異性を確認する。
【００７９】
免疫ブロット分析の結果は、材料及び方法の部分に記載されたように実行され、免疫金標識の実験により確認された。精製小胞の免疫ブロット標識の結果は図１Ｃに示され、ＰＳＡが物理的にＯＭＶに関連していること、及び野生型バクテロイデス・フラジリス株からのＯＭＶの大半が、ＰＳＡに対し陽性に染色していることを確認する（図６）。ＰＳＡの不存在がＯＭＶの分子構成物を変化しなかったかったことを確かめるため、プロテオーム分析は、野生型細菌からの又はＰＳＡ変異細菌からの小胞間のタンパク質構成物において、質的または量的な違いはないことを明らかにした質量分析法により、実行された（図７）。
【００８０】
ＰＳＡは、繰り返されるサブユニットの異種ポリマーである。クロマトグラフィーにより全細胞抽出物から回収されたＰＳＡのサイズ分離は、材料及び方法において示されているような、全細胞由来の、及び精製ＯＭＶ由来の莢膜多糖標本の抗ＰＳＡを用いた免疫ブロット分析と同様に実行された。
【００８１】
図１Ｄに示される関連性の高い結果は、驚くほどに、低分子量種のみがＯＭＶに関連していることを示し、小胞へのＰＳＡ包み込みの特異性を表している。特に、図１Ｄの結果は、低分子量ＰＳＡ（Ｌ−ＰＳＡ）は、細菌細胞外被に関連し維持している高分子量（Ｈ−ＰＳＡ）種とは異なり、小胞に包み込まれることを示している。
【００８２】
併せて上記の結果は、免疫調節莢膜多糖体ＰＳＡがバクテロイデス・フラジリスのＯＭＶへ活発に局在化されていることを明らかにしている。
【００８３】
実施例２：ＯＭＶは、ＰＳＡ−依存的方法で実験的大腸炎及び腸炎から動物を保護する。
ＯＭＶが疾患の臨床症状を改善できるか調査するために、マウスは、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）誘発性大腸炎の期間中にＯＭＶ強制経口投与によって処理された。
【００８４】
図２Ａに示された結果は、コントロール動物がＴＮＢＳ（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ）の直腸投与後に体重が急速に減少しており、媒体処理されたマウス（図２Ａ；ＥＴＯＨ＋ＰＢＳ）と比較し、コントロール動物の体重が回復しなかったことを示している。驚くべきことに、ＴＮＢＳ動物にＯＭＶ経口投与すると、体重減少（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ＷＴ−ＯＭＶ）から大きく保護された。最も重要なことは、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡ由来のＯＭＶを投与した場合、体重減少がＴＮＢＳ動物（図２Ａ；ＴＮＢＳ＋ΔＰＳＡ−ＯＭＶ）と区別できなく、ＰＳＡが、消耗性疾患を抑えることに完全に関連することを実証した。
【００８５】
胃内経管栄養の後に大腸内の損傷を受けていない小胞を検出する努力は、以前の報告のように無菌マウスでさえ（データは示されず）、宿主由来の小胞の観測によって混乱された。
【００８６】
大腸の長さの減少がＴＮＢＳ大腸炎の顕著な特徴であるので、盲腸から直腸までの切除し、長さの定量化（グラフ）した後、直ちに、媒体（ＥｔＯＨ）処理されたグループ及びＴＮＢＳグループ（ｎ＝４匹／グループ）からの大腸の長さの検出は、未操作の大腸において、実行された。具体的に、測定は屠殺の時（疾患誘導から４日目）に実行された。
【００８７】
図２Ｂに示される結果は、ＰＳＡ含有小胞を処理した動物において、通常の腸の長さであることを示し、しかしＰＳＡ欠乏ＯＭＶで処理した動物においては通常の腸の長さでないことを示している（図２Ｂ）。
【００８８】
実験的大腸炎は、腸構造内で重篤な病理学的変化の結果になる。したがって、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した、各処理グループの大腸断片の代表物を挙げ、図２Ｃに示す。大腸組織の組織学的分析により、重篤な疾患がＴＮＢＳ処理動物において観測され、ＴＮＢＳ処理動物がＰＳＡ含有小胞の経口投与によって改善されたことを、図２Ｃの画像は示している。
【００８９】
図２Ｃの結果は、盲検化病理学者により指定された動物からの大腸炎スコアによって確認された。ＴＮＢＳ大腸炎は、クローン病で観察される病状を模倣した、大腸全域の限局性病巣においてそれ自体を明らかにする。定量的に疾患を評価するために、臨床症状が標準得点システムを用いて盲検化病理学者によって評価された（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５．１９．１−１５．１９．１４）。図２Ｄに示される結果は、ＴＮＢＳ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶを投与されたすべての動物が深刻な影響を受けた一方で、ＷＴ−ＯＭＶがほとんどの動物において疾病を劇的に減少させることを示している。野生型細菌由来のＯＭＶで処理された動物は、遥かに少ない病状の限局的サイトを有していたが、病巣が観察された時、ΔＰＳＡ−ＯＭＶを与えられた動物と比べて、病巣が小さく、相当正常な組織構造を保持していた。
【００９０】
上記の結果は、ＰＳＡがＯＭＶの疾患防御活性に必要とされることを立証する。
【００９１】
実施例３：ＰＳＡ含有ＯＭＶは、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１７を阻害し、ＩＬ−１０の発現を高める。
大腸炎に関連し標準的な炎症促進性及び抗炎症性サイトカインの産生は、実施例２に例示されるように処理されたマウスにおいて測定された。具体的には、サイトカインの転写産物の分析は、大腸全体より回収され又は腸間膜リンパ節由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞より回収されたＲＮＡについて、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施された。
【００９２】
３つの独立した試験の代表的な関連性の高い結果は、図２Ｅ（大腸全体）及び図２Ｆ（腸間膜リンパ節から精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞）で報告されている。これらの結果は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ）の転写レベルがＴＮＢＳ処理動物において高められ、しかし、ＯＭＶ投与によりＰＳＡ−依存的方法（図２Ｅ）で減少させられたことを示す。病状からの保護と矛盾しないで、ΔＰＳＡ−ＯＭＶ経口投与動物と比較して、ＯＭＶは増加したＩＬ−１０濃度の産生を誘発する（図２Ｆ）。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されたサイトカインの分析は、ＩＬ−１０が、Ｔ細胞のＰＳＡへの応答により実際に産生されていることを確認した（図２Ｆ）。強力な炎症誘発性マーカーＴＮＦ−α濃度のように、Ｔｈｌ７細胞の浸潤は、疾患のために必要であるが、ＯＭＶにより劇的に減少した（図２Ｆ）。我々は、バクテロイデス・フラジリスＯＭＶ中へのＰＳＡの包み込みが、実験的大腸炎の病理学的および免疫学的症状発現から動物を保護すると結論付ける。
【００９３】
実施例４：バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶを含むＰＳＡは、樹状細胞応答を誘導する。
樹状細胞（ＤＣ）は、腸管内腔へ突起を伸ばし、腸の粒子を採取し、続いてＴ細胞の反応を開始するためにＭＬＮに移行する。確かに、動物へＰＳＡの経口投与は、ＭＬＮにおけるＣＤ１１ｃ＋ＤＣに関連している。したがって、出願人は、ＰＳＡを含むＯＭＶが同様に樹状細胞に取り込まれ得るかどうかの研究に努めた。
【００９４】
図３Ａに示される結果は、サイトカラシンＤを用いた細胞の処理が、大幅に小胞への取り込みを阻害したため、骨髄由来のＤＣが急速にアクチン依存的方法でＯＭＶを内部移行したことを示す（図３Ａ及び図８）。細胞間の局在は共焦点顕微鏡により確認された（図９）。
【００９５】
Ｔ細胞活性化マーカーのＰＳＡを介したＤＣでの誘導は、同様に調査された。図３Ｂに示される結果は、Ｔ細胞活性化マーカー（ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６）の発現が、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶの両方の内部移行に続いて、同等に上昇させられたことを示した（図３Ｂ及び図１０）。
【００９６】
ＭＨＣ及び共刺激分子の発現増加は、バクテロイデス・フラジリス由来のＯＭＶを含むＰＳＡが、Ｔ細胞応答に影響を与え得ることを示している。
【００９７】
実施例５：ＰＳＡは、ＤＣのＩＬ−１０発現を通じてＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１０発現を誘導する。
実施例１〜３に例示した実験に示すように、大腸炎におけるＰＳＡ保護の役割に照らして、抑制性Ｔ細胞応答の誘導にＯＭＶの生物学的効果は試験された。特に、様々な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団が大腸炎を抑制することが知られているので、Ｔｒｅｇの発達を促進するＯＭＶの能力は検討された。
【００９８】
図３Ｃに示される結果は、ＤＣ−Ｔ細胞の生体外共培養の条件下でＷＴ−ＯＭＶがＩＬ−１０の発現を誘導し、一方、同条件下でＩＬ−１０がＤＣのみからでは産生されないことを示している。増加が媒体コントロールを超えて検出されているが、バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから精製された小胞は、ＷＴ−ＯＭＶよりＩＬ−１０を有意に低く誘導していた。ＤＣからのＩＬ−１０の産生は、生体内及び生体外におけるＣＤ４＋ＩＬ−１０＋Ｔ細胞の発達を支援することが知られている。したがって、ＩＬ−１０−／−の動物から分化されたＤＣを含み、図３Ｃに示されている結果と同様のＥＬＩＳＡ分析は実行された。
【００９９】
図３Ｄ（左パネル）に示される結果は、ＩＬ−１０−／−ＤＣがＯＭＶで処理された場合、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養において大幅に減少したＩＬ−１０を示しており、ＤＣによるＩＬ−１０発現が、パラクリン的方法でＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＬ−１０を誘導するために必要とされることを示している。
【０１００】
実施例６：ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇの発達及び／又は増殖を指示するようにＤＣをプログラムする。
微生物のリガンドは、パターン認識受容体のいくつかのクラスによって感知され、Ｔｈ１サイトカイン産生を惹起するために、ＰＳＡがＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）を通じた信号へ示されている。一連の実験は、したがって、最近の報告が、Ｔｒｅｇの機能及びＩＬ−１０発現がＴＬＲ２の影響を受けていることを示しているように、ＴＬＲ２が、ＰＳＡによるＩＬ−１０の誘導に必要であるかどうかを試験するために実行された。
【０１０１】
図３Ｄ（右パネル）に示される結果は、野生型ＤＣと比較して、ＴＬＲ２の欠如（ＴＬＲ２−／−動物由来のＤＣ）が、完全にＯＭＶに応答してＩＬ−１０産生を阻害することを示している。両方のＤＣはスーパー抗原（ＳＥＡ）刺激に同様に応答し、ＰＳＡセンシングにおける特異的な欠陥ではなく、ＴＬＲ２−／−ＤＣによるＴ細胞活性化の一般的な欠如を実証している（図３Ｄ）。転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、重要なＴｒｅｇの亜集団である。最近の研究では、示されているＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇはＩＬ−１０を発現することができ、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０の産生は腸の炎症を抑制するために必要とされる。
【０１０２】
ＯＭＶ上のＰＳＡにより誘導されるＩＬ−１０の起源を決定するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＤＣとの共培養に続いて精製され、そしてＩＬ−１０及びＦｏｘｐ３の発現は定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定された。
【０１０３】
図３Ｅに示される結果は、注目に値し、ＰＳＡがＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞由来ではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ集合内でＩＬ−１０発現を大幅に誘導することを示している。バクテロイデス・フラジリスΔＰＳＡから精製したＯＭＶは、媒体コントロールと同じ濃度で、どちらのＴ細胞集団からであってもＩＬ−１０産生を促進することができなかった。Ｆｏｘｐ３の発現はまた、ＯＭＶによって、ＰＳＡ依存的方法でもっぱらＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞において有意に増加した（図３Ｅ）。
【０１０４】
共培養液は、図３Ｃ〜Ｅに示される実験用として作成され、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。ＯＭＶを振動されたＤＣで４日培養した後、細胞は、抗ＣＤ４で染色され、ＦＣを使用してＧＦＰの発現によりＦｏｘｐ３が検出された。
【０１０５】
二つの独立した試験の代表的な結果は、図３Ｆに示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞の間で増加したＦｏｘｐ３転写と一致し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合は、ΔＰＳＡ−ＯＭＶ処理でなく、ＷＴ−ＯＭＶ処理への応答において増加した（図３Ｆ）。まとめると、完全なる生体外培養システムにおいてＰＳＡ含有ＯＭＶは、Ｔｒｅｇの発達および／または増殖をする方向へＤＣをプログラムする。
【０１０６】
実施例７：ＰＳＡ含有ＯＭＶは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇの抑制機能の媒介によりＩＬ−１０を誘発する。
細胞治療としてのＴｒｅｇの使用は、ＩＢＤ、自己免疫及びアレルギーのために提案されている。ＯＭＶで処理されたＤＣとの４日間共存培養後のＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団によるＩＬ−１０の発現は調査された。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１０−ＧＦＰマウスから精製され、共培養後に抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５で染色され、ＩＬ−１０の発現がＧＦＰにより測定された。
【０１０７】
図４Ａに示す、精製ＤＣ及びＴ細胞の関連するＯＭＶ処置の結果は、ＰＳＡが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇからの特異的なＩＬ−１０産生を促進することを明らかにしていることを示す。
【０１０８】
この知見に基づいて、ＰＳＡの能力は、媒体（コントロール）、ＷＴ−ＯＭＶ及びΔＰＳＡ−ＯＭＶで処理したＤＣとの共培養に続いて、精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞により、単純な応答細胞の生体外でのＴｅｇの抑制能を促進するために調査された。ＣＤ４＋ＣＤ２５−応答細胞（エフェクター細胞; Ｔｅｆｆ）は、野生型マウスの脾臓から精製され、細胞内の色素のＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で振動され、Ｔｒｅｇとインキュベートされ、３日間抗ＣＤ３で刺激を与えられた。細胞増殖はＣＦＳＥ希釈のＦＣにより測定された。
【０１０９】
図４Ｂ及び４Ｃに示される結果は、ＷＴ−ＯＭＶで処理されたＤＣを用いた条件から回収されたＴｒｅｇが、ΔＰＳＡ−ＯＭＶに対応したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と比較して、大幅に強化された抑制能力を表示することを示す。
【０１１０】
したがって、他の多数の微生物性リガンド（ＬＰＳ、リポタンパク質、ペプチドグリカンなど）を含むＯＭＶからのＰＳＡの特異的欠落は、機能的なＴｒｅｇを誘導するための、バクテロイデス・フラジリスの小胞の能力を抑制する。
【０１１１】
実施例８：ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒｅｇにおいて、様々なバイオマーカーの組み合わせを誘導する。
Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスは、一日おきに６日間精製ＰＳＡで経口処理された。ＭＬＮは抽出され、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞は、±ＧＦＰの発現に基づいたＦＡＣＳにより精製された（純度＞９９％）。ＲＮＡは抽出され、定量−ＰＣＲに使用された。
【０１１２】
図１１に示される結果は、ＰＳＡが、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、パーフォリン、及びグランザイムＡを含む複数の抗炎症性遺伝子の誘導と、ＴＮＦαおよびＩＬ１７（特にＩＬ１７Ａ）の阻害とを調整することを実証する。
【０１１３】
上記の結果は、バクテロイデス・フラジリスの生菌活性の分子機構を提供し、制御性Ｔ細胞の発達へシグナル伝達する自然免疫受容体を結合する微生物リガンドのための独創的な例を明らかにする。特に上記の結果は、ＰＳＡが、外膜小胞（ＯＭＶ）によって、及び細菌分子を宿主細胞へ標的とする分泌構造によって、宿主に運ばれることを示している。ＰＳＡを含むＯＭＶは、宿主免疫システムの樹状細胞によって内部移行される。ＯＭＶの取り込みに続いて、ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３及び抗炎症性サイトカインのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化を誘導するために樹状細胞をプログラムする。ＯＭＶによるＴｒｅｇの発達は、樹状細胞によるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の発現及びＩＬ−１０の産生を必要とする。驚くべきことに、精製ＯＭＶは、ＰＳＡ依存的方法で強力な抑制活性を持つ、機能的なＴｒｅｇの生体外分化を指示する。ＰＳＡ含有ＯＭＶを用いた動物の処理は、実験的大腸炎を防ぎ、腸内の炎症誘発性サイトカイン応答を抑制する。これらの知見は、ＩＢＤのための生菌治療が運ぶという新しいアプローチに設計され得るプロセスである小胞の分泌を通じて、共生細菌が有益な微生物の因子を提供することが明らかにする。
【０１１４】
特に、上記の結果は、ＰＳＡ含有ＯＭＶによって誘導されるＴｒｅｇが、機能的に抑制し、培養中のＴ細胞の活性化を阻害することを示している。これは、微生物のリガンドによる生体外Ｔｒｅｇの発達についての最初の実証であり、自然免疫受容体シグナル伝達がＴｒｅｇの機能を調節することが広く推測される観念に対する原理証明を提供する。ＩＢＤのための現在の治療は、効果がない又は重篤な副作用を持っているかのどちらかであるので、活性免疫調節のためのよく進化したメカニズムを利用することによる、有望な新しい治療の選択肢を生菌が表している。Ｔｒｅｇが複数の組織において免疫応答を抑制することを考えると、ＰＳＡによる生体外Ｔｒｅｇの発達の私たちの独創性に富んだ実証は、自己免疫、喘息及びアレルギーを含む多数の炎症性疾患のための新規細胞治療の心躍る可能性を示唆している。
【０１１５】
免疫調節を媒介する微生物によって生産された分子を識別するために、細菌産生物の一部が精製され得、全細菌が使用されるとき、純粋な化合物がどのその成果を模倣するのかを発見されるまで、同じ解析が上記のように実施される。また、上記のアプローチは、この活性を有する菌株のそれぞれのクローンにおいて欠損されている免疫調節分子を識別するために、関心のある微生物の変異体ライブラリーをスクリーンするために使用されるだろう。
【０１１６】
要約すると、いくつかの実施形態において、抗炎症能力に関して、細菌、細菌により精製若しくは生成された産生物及び／又は他の細菌物質をスクリーニングするための方法並びにシステムが提示される。
【０１１７】
上記に明らかにした例は、当業者に、開示による小胞と、システムと方法との実施形態を生成する方法および使用方法の完全な開示並びに説明を与えるために提供されており、本発明者らがそれらの開示としてみなすことの範囲を制限するために意図されていない。当業者に明白な開示を行うための上記の様式の変更は、以下の特許請求の範囲内であることを意図している。明細書に記載されている全ての特許および刊行物は、開示が属する当業者の技術の水準を示している。それぞれの参照が個々にその全体が参照として援用されたかのように、この開示における引用のすべての参照は、同じ程度に参照として援用される。
【０１１８】
背景技術、要約、詳細な説明、および実施例で引用されている各文書（特許、特許出願、雑誌論文、抄録、実験マニュアル、書籍、またはその他の開示を含む）の開示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、配列表のハードコピーは、これに提出し、対応するコンピュータ読み取り可能な書式は、その全体が参照により本明細書に両方とも組み込まれている。
【０１１９】
開示が、当然に変化し得る特定の構成物または生物学的システムに限定されないことを理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することに意図されないことを理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、内容が別途明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。内容が別途明確に指示しない限り、用語“複数”は、二つ以上の参照対象を含む。他に定義しない限り、本明細書に使用されているすべての技術用語および科学用語は、開示の属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を持っている。
【０１２０】
しかし、本明細書に記載されたものと類似または等価の任意の方法および材料は、本明細書に記載されている適当な材料および方法の特定の実施例を試験するために実際に使用されることができる。
【０１２１】
多数の開示の実施形態は記載されている。それにもかかわらず、種々の変更が、本開示の精神および範囲から逸脱することなく行われることができることは理解されるであろう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１２２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０６７９６５４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／００８３７７７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００９２４３３号明細書
【特許文献４】国際公開第０７／０９２４５１号
【特許文献５】国際公開第２００７／０６２１３２号
【非特許文献】
【０１２３】
【非特許文献１】Ｘａｖｉｅｒ，ＲＪ．＆ Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８，４２７−４３４（２００７）．
【非特許文献２】Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｒｏｕｎｄ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｋａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，６２０−６２５（２００８）．
【非特許文献３】Ｂｒａｕｎ，Ｊ．＆ Ｗｅｉ，Ｂ．Ｂｏｄｙ ｔｒａｆｆｉｃ：ｅｃｏｌｏｇｙ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２，４０１−４２９（２００７）．
【非特許文献４】Ｒｏｕｎｄ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．Ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｓｈａｐｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）．
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓ．（２００１）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＢＳ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５．１９．１−１５．１９．１４．
【非特許文献６】Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｌｉｕ，Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ（２００５）Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １２２：１ １０７−１１８．
【非特許文献７】Ｍ．Ｊ．Ｃｏｙｎｅ，Ａ．Ｏ．Ｔｚｉａｎａｂｏｓ，Ｂ．Ｃ．Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｖ．Ｊ．Ｃａｒｅｙ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｓｐｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｅ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，（２００１）Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌｏｃｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４３４２−４３５０．
【非特許文献８】Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，Ｒｅｉｄ ＪＨ．（１９８３）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｕｌａｔｅ ａｎｄ ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｏｎ ａ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（２）：２３９−２４１．
【非特許文献９】Ａｍａｎｄａ Ｌ．Ｈｏｒｓｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｕｅｈｎ．（２０００）Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｃｒｅｔｅｓ ａｃｔｉｖｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｖｉａ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１２４８９−１２４９６．
【非特許文献１０】Ｎｉｃｏｌｅ Ｃ．Ｋｅｓｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａ Ｊ．Ｋｅｕｈｎ．（２００４）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：２０６９−２０７６．
【非特許文献１１】Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ ＪＰ，Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｓ，Ｄｅｒｍｏｔｔ Ｅ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２０（４）：１９１−２０２．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を、単独で又は抗原を示す細胞の存在下でＴ細胞と接触させることと、
ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現、或いは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの減少濃度若しくは発現の、少なくとも一つの発現を検出することと、
前記接触の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項２】
免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、
前記接触の後、前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることと、
ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、及び、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することと、
前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項３】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３の発現を、単独で、或いは、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及び／又はグランザイムＢとの組み合わせで検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３の発現を、単独で、或いは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及び／又はＴＮＦαとの組み合わせで検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３及びＩＬ−１０の発現を検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞が、原発性又は細胞培養由来のいずれかである請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記候補細菌物質が、生きた細菌、死んだ細菌、細菌抽出物、細菌由来の精製分子、細菌から精製された分子、及び分子を内包する小胞からなる群より選択され、或いは、それらの組み合わせである請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記候補細菌物質が外膜小胞を備える請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
動物において、免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補細菌物質で処理し、ここで、当該トランスジェニックマーカー非ヒト動物は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つを発現するために遺伝子的に修飾されており、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカー又は少なくとも一つの前記炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物における発現を検出することと、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加又は一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物が、マウスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスが、ＩＬ−１０−ＧＦＰマウス及びＦｏｘｐ３−ＧＦＰマウスからなる群より選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記処理が、前記候補細菌物質を経口又は静脈内投与することにより実施される請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記候補細菌物質が生きた細菌を含み、
前記処理が、強制経口により前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物を前記生きた細菌で恒久的にコロニー化することにより実施される請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を、単独で又は抗原を示す細胞の存在下でＴ細胞と接触させることと、
ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現、或いは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの減少濃度若しくは発現の、少なくとも一つの発現を検出することと、
前記接触の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項２】
免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、
前記接触の後、前記抗原提示細胞をＴ細胞とインキュベートすることと、
ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、及び、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することと、
前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項３】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３の発現を、単独で、或いは、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及び／又はグランザイムＢとの組み合わせで検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３の発現を、単独で、或いは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及び／又はＴＮＦαとの組み合わせで検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、Ｆｏｘｐ３及びＩＬ−１０の発現を検出することにより実行される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞が、原発性又は細胞培養由来のいずれかである請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記候補細菌物質が、生きた細菌、死んだ細菌、細菌抽出物、細菌由来の精製分子、細菌から精製された分子、及び分子を内包する小胞からなる群より選択され、或いは、それらの組み合わせである請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記候補細菌物質が外膜小胞を備える請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
動物において、免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補細菌物質で処理し、ここで、当該トランスジェニックマーカー非ヒト動物は、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、パーフォリン及びグランザイムＢからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカー、並びに、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びＴＮＦαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの、少なくとも一つを発現するために遺伝子的に修飾されており、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカー又は少なくとも一つの前記炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物における発現を検出することと、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加又は一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物が、マウスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスが、ＩＬ−１０−ＧＦＰマウス及びＦｏｘｐ３−ＧＦＰマウスからなる群より選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記処理が、前記候補細菌物質を経口又は静脈内投与することにより実施される請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記候補細菌物質が生きた細菌を含み、
前記処理が、強制経口により前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物を前記生きた細菌で恒久的にコロニー化することにより実施される請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５２４９１０（Ｐ２０１２−５２４９１０Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７４５１（Ｐ２０１２−５０７４５１）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２３００
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２４２５６
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（３０１０５９５７０）カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２３００
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２４２５６
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（３０１０５９５７０）カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー (14)
【Ｆターム（参考）】
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