免疫賦活用組成物及びその製造方法
【課題】 米糠から収率よく調製することができ、かつ高い免疫賦活能を有する免疫賦活用組成物を提供する。
【解決手段】 免疫賦活用組成物の有効成分として、１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程を経て得られる水溶性画分を含有させる。前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましい。また、前記酵母がピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）であることが好ましい。
【解決手段】 免疫賦活用組成物の有効成分として、１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程を経て得られる水溶性画分を含有させる。前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましい。また、前記酵母がピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠由来の免疫賦活用組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糠は、米や麦などの穀物を精白した際に出る果皮や種皮、胚芽などの部分であり、米を主食とする我が国においては多量の米糠が生じている。米糠には油分、タンパク質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類などの栄養素が豊富に含まれている。米糠の主な用途としては、米油原料３３％、飼料原料１２％、キノコ菌床１１％、漬物５％で、残りの３９％は廃棄されているといわれている。また、米油製造の副産物である脱脂米糠には、タンパク質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類などの栄養素の多くが残存しているが、その一部が飼料原料や肥料などに利用されているだけである。
【０００３】
上記のように米糠の食品への利用が進んでいない原因としては、米糠特有の好ましくない風味やざらざらとした舌触りなどが挙げられる。そのため、風味や舌触りを改善した米糠製品の開発や、米糠を利用した機能性素材の開発が数多くなされている。
【０００４】
例えば、米糠を利用した機能性素材として、特許文献１には、米糠の水抽出物を含有することを特徴とする免疫賦活用組成物について開示されている。
【０００５】
特許文献２には、米糠の発酵物を極性溶媒で抽出してなる生理活性組成物について開示されており、該生理活性組成物が、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用、免疫賦活作用、ラジカル捕捉作用、及び抗酸化作用（ＳＯＤ様活性）などを有することが記載されている。
【０００６】
特許文献３には、米糠やふすまなどの植物組織原料を糸状菌の培養液中で資化することを特徴とする生理活性ヘミセルロースの製造方法について開示されており、該生理活性ヘミセルロースは、免疫賦活作用、マクロファージ活性化作用、抗ウイルス作用、脂質代謝改善作用などを有していることが記載されている。
【０００７】
特許文献４には、植物組織原料の熱水抽出物をグルコアミラーゼで処理した後、アスペルギルス属のAsp. oryzae及びバシディオミセテス属のLentinus edodesのいずれかの培養濾液から得られた酵素の複合体で処理して得られる免疫力増強物質について開示されている。
【０００８】
特許文献５には、乳酸菌発酵代謝物と米糠抽出物の加水分解物を配合した免疫調整剤について開示されており、該米糠抽出物の加水分解物は、米糠を水、アルコールなどの溶媒で抽出して得られる抽出物を、酸、アルカリ、酵素などで加水分解して得られることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２５５８４３号公報
【特許文献２】特開２００２−２６５３７７号公報
【特許文献３】特開平１−１５３７０１号公報
【特許文献４】特開平９−２３８９５号公報
【特許文献５】特開２００２−３７７３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上述したような従来の米糠由来の機能性素材の多くは、米糠からの収率が低いという問題を有しており、また、生理活性の点についても充分満足できるとは言いがたかった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、米糠から収率よく調製することができ、かつ高い免疫賦活能を有する免疫賦活用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明の一つは、米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、この発酵物を多糖類分解酵素で処理して得られる処理物の水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の組成物においては、前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましい。
【００１４】
また、前記酵母がピキア
sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM
P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）であることが好ましい。
【００１５】
本発明のもう一つは、１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程、を含むことを特徴とする免疫賦活用組成物の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の製造方法においては、前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましく、前記酵母としてピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を用い、前記乳酸菌としてエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、多糖類分解酵素で処理することにより、従来に比べて米糠からの収率が高く、かつ高い生理活性を有する免疫賦活用組成物を得ることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の免疫賦活用組成物は、米糠由来であるため、継続的に摂取しても副作用の心配がなく、安全に免疫能（特に初期免疫能）を高めることができる。また、米糠の高度利用の一つの方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各サンプルを添加した場合の好中球・単球の貪食活性相対値を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の免疫賦活用組成物の原料として用いられる米糠は、食用に適したものであればよく、好ましくは米油を抽出した後の脱脂米糠が用いられる。
【００２１】
本発明において米糠の発酵に用いられる酵母及び乳酸菌は、米糠から分離された菌が用いられる。米糠からの菌の分離は、常法に従って行うことができ、例えば以下のようにして行うことができる。
【００２２】
・酵母の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収する。この上清を生理食塩水で段階希釈した液をポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２〜３日間培養する。
【００２３】
出現したコロニーをピックしてポテトデキストロース液体培地に接種し、３０℃で１〜３日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、ポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２〜３日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とする。
【００２４】
単離した酵母のうち、米糠の発酵速度、ペプチド化、風味等を指標に使用する酵母を選択する。
【００２５】
本発明においては、上記のようにして米糠から分離された酵母であるピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）が好ましく用いられる。
【００２６】
・乳酸菌の単離
培地として炭酸カルシウム含有ＧＹＰ培地を用いた以外は、上記と同様にして米糠から乳酸菌を単離することができる。
【００２７】
本発明においては、上記のようにして米糠から分離された乳酸菌であるエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）が好ましく用いられる。
【００２８】
上記のようにして米糠から分離された酵母及び乳酸菌を用いることにより、米糠を効率よく発酵させることができる。
【００２９】
以下、本発明の免疫賦活用組成物の製造方法について説明する。
１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程
米糠１質量部に対し、水を０．２〜５０質量部添加し、９０〜１００℃で１〜３時間加熱殺菌を行う。本発明においては、オートクレーブ処理を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、発酵処理工程における腐敗を防止できる。
【００３０】
２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程
殺菌処理を行った米糠を充分に冷ました後、酵母の前培養液と乳酸菌の前培養液をそれぞれ添加し、２０〜４０℃で４８〜１２０時間発酵させる。発酵処理中は、発酵物のｐＨをモニタリングし、発酵物のｐＨが４．０〜５．５になるまで発酵を行うことが好ましい。
【００３１】
なお、酵母の前培養液は、例えば、ポテトデキストロース培地に酵母を接種し、常法に従って１〜２日間培養し、この培養液を米糠1質量部に対し、０．０００１〜０．１質量部添加すればよい。
【００３２】
乳酸菌の前培養液は、例えば、ＧＹＰ培地に乳酸菌を接種し、常法に従って１〜２日間培養し、この培養液を米糠１質量部に対し、０．０００１〜０．１質量部添加すればよい。
【００３３】
３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程
上記工程で得られた米糠発酵物に、多糖類分解酵素を添加し、３０〜５５℃で０．５〜２４時間酵素反応を行う。多糖類分解酵素の添加量は、原料米糠１質量部に対して０．０００１〜０．１質量部が好ましい。酵素処理後は、加熱処理を行い、殺菌と酵素失活を行うことが好ましい。
【００３４】
上記多糖類分解酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上が好ましく用いられ、特にヘミセルラーゼが好ましく用いられる。
【００３５】
多糖類分解酵素で処理することにより、収率も大幅に向上させることができるだけでなく、組成物の免疫賦活活性を向上させることができる。
【００３６】
４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程
多糖類分解酵素で処理した処理物を、常法により濾過して濾液を回収し、必要に応じて乾燥・粉末化する。
【００３７】
本発明の免疫賦活用組成物は、上記の水溶性画分をそのまま用いることもできるが、その他の成分として、賦形剤、乳化剤、安定剤、甘味料、ｐＨ調整剤、増粘剤、香料、酸味料等の食品添加剤や、ビタミン類、ミネラル類等を含むこともできる。
【００３８】
本発明の免疫賦活用組成物の形態は、特に制限されず、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、液剤など使用形態に応じて適宜選択すればよい。また、本発明の免疫賦活用組成物を飲料、ゼリー飲料、ヨーグルト、菓子、パン類などといった各種飲食品に配合することもできる。
【００３９】
本発明の免疫賦活用組成物の有効摂取量は１００〜１０００ｍｇであり、好ましくは２５０〜７５０ｍｇである。なお、各種飲食品における配合量は、該有効摂取量を基準にすればよい。
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれによって特に限定されるものではない。また、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を表す。
【実施例１】
【００４１】
（１）米糠由来の酵母・乳酸菌の単離
・酵母の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収し、この上清を生理食塩水で段階希釈した液をポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養した。
【００４２】
出現したコロニーをピックしてポテトデキストロース液体培地に接種し、３０℃で３日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、ポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とした。そして、米糠の発酵速度、ペプチド化、風味を指標に酵母を選択し、ピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を単離した。
【００４３】
・乳酸菌の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収し、この上清を生理食塩水で段階希釈した液を炭酸カルシウム含有GYP寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養した。
【００４４】
出現したコロニーをピックしてＧＹＰ液体培地に接種し、３０℃で１日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、炭酸カルシウム含有GYP寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とした。そして、米糠の発酵速度、ｐＨ、風味を指標に乳酸菌を選択し、エンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を単離した。
【００４５】
（２）米糠の発酵処理
ピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）をポテトデキストロース液体培地１００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養し、前培養液とした。
【００４６】
また、エンテロコッカス
sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM
P-21703）をＧＹＰ液体培地１００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養し、前培養液とした。
【００４７】
脱脂米糠１．５ｋｇに水を８Ｌ加え、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行った後、充分に冷ましてから、酵母の前培養液８ｍｌと乳酸菌の前培養液８ｍｌを加えて均一に撹拌した後、３０℃で９６時間発酵処理を行った。
【００４８】
発酵処理終了後、ヘミセルラーゼ（商品名「ヘミセルラーゼ「アマノ」９０」、天野エンザイム（株）製）を１．５ｇ添加・混合し、６０℃で１時間酵素反応を行った。
【００４９】
酵素反応終了後、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行い、酵素失活及び殺菌処理を行った後、濾過して濾液を回収した。
【００５０】
この濾液をスプレードライヤーを用いて噴霧乾燥し、本免疫賦活用組成物（サンプル１）を０．６ｋｇ得た（収率４０％）。
【００５１】
ヘミセルラーゼ処理を行わなかった以外は、上記と同様にして米糠発酵エキス（サンプル２）を得た（収率２０％）。
【００５２】
一方、脱脂米糠１．５ｋｇに水を８Ｌ加え、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行った後、濾過して濾液を回収し、噴霧乾燥して米糠熱水抽出物（サンプル３）を得た（収率１０％）。
【００５３】
（３）免疫賦活活性の測定
上記で得られた各サンプルを用いて、好中球・単球の貪食能、及び食胞融合能に与える影響を調べた。
【００５４】
・好中球及び単球の調製
ヘパリン加採血した健常ヒト末梢血２０ｍｌをMono-Poly Resolving Medium（商品名、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）５ｍｌの入った滅菌済み丸底スピッツ管４本に５ｍｌずつ分注し、２０℃、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。遠心分離により４層（下から赤血球層、好中球層、単球層及び血漿を含んだ層）に分離し、このうち好中球層と単球層をそれぞれ取り出した。
【００５５】
取り出した好中球層に０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液を加え、４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上清を捨て洗浄した。同様の操作を計3回繰り返した後、細胞にトリス−塩化アンモニウム緩衝液を２０ｍｌ加えて撹拌し、室温で１５分間放置し、混在している赤血球を溶血させた後、４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て細胞を洗浄した。
【００５６】
その後、ＲＰＭＩ １６４０培地を20ml加えて撹拌した後、細胞数をカウントし、細胞数が５．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように溶液（含１０％容量の非働化Fetal bovine serum）を調製した。
【００５７】
単球層についても上記と同様にして洗浄操作を行い、細胞数が５．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように溶液（含１０％容量の非働化Fetal bovine serum）を調製した。
【００５８】
・貪食能の測定
サンプル１〜３をそれぞれ０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液に溶解した後、黄色ブドウ球菌の死菌体を１×１０８個／ｍｌとなるように添加して均一に懸濁し、各濃度のサンプル溶液を調製した。
【００５９】
上記で調製した好中球（又は単球）懸濁液（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）２００μｌをcover slip上で培養（３７℃、９０分間、ＣＯ２インキュベーター）し、吸着させた。その後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、cover slip上に吸着しなかった細胞を除去した。その後、cover slip上に各サンプル溶液２００μｌを加え、培養（３７℃、６０分間、ＣＯ２インキュベーター）した。
【００６０】
インキュベート後、ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄し、メタノールに約１０秒間つけて固定し、スライドグラスにのせて自然乾燥させた。乾燥後、レフレルメチレンブルー液２００μｌを滴下して２０秒間染色し、純水で洗浄して乾燥させた。これを顕微鏡観察（１０００倍）し、各サンプル溶液について無作為に１２０個（３０個×４ヶ所）の好中球（又は単球）を選び、その細胞内に貧食された菌数を数え、その平均値を求めた。そして、サンプル濃度０μｇ／ｍＬの時の平均値を１００とし、各サンプル濃度における貧食活性の相対値を求めた。その結果を図１に示す。
【００６１】
図１（ａ）、（ｂ）から、サンプル１（本免疫賦活用組成物）は、サンプル２（米糠発酵エキス）及びサンプル３（米糠熱水抽出物）に比べてより低濃度で好中球及び単球の貧食能を促進していることが分かる。そして、サンプル１（本免疫賦活用組成物）は、特に好中球の貧食能を強く促進していることが分かる（図１（ｂ）参照）。
【００６２】
・殺菌能
サンプル１を０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液に溶解した後、黄色ブドウ球菌の死菌体を１×１０８個／ｍｌとなるように添加して均一に懸濁し、各濃度のサンプル溶液を調製した。
【００６３】
上記と同様にして調製した好中球懸濁液（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）２００μｌをcover slip上で培養（３７℃、９０分間、ＣＯ２インキュベーター）し、吸着させた。その後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、cover slip上に吸着しなかった細胞を除去した後、細胞をアクリジンオレンジ（５ｍｇ／ｍｌ）で染色し、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄した。
【００６４】
cover slip上に各サンプル溶液２００μｌを加え、培養（３７℃、６０分間、ＣＯ２インキュベーター）した後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、メタノールに約１０秒間つけて固定し、スライドグラスにのせて自然乾燥させた。乾燥後、レフレルメチレンブルー液２００μｌを滴下して２０秒間染色し、純水で洗浄して乾燥させた。これを蛍光顕微鏡観察し、各サンプル溶液について無作為に１２０個（３０個×４ヶ所）の好中球を選び、アクリジン染色された黄色ブドウ球菌の数をカウントした。
【００６５】
そして、１個あたりの細胞内で融合を起こしていた細菌の平均数に、融合が見られた細胞の割合を乗じて食胞融合能〔fusion index（FI）〕を算出し、１個あたりの細胞内に貪食された細菌の平均数に、貧食が見られた細胞の割合を乗じて貪食能〔phagocytosis index（PI）〕を算出し、殺菌能（FI/PI）を求めた。その結果を表１に示す。なお、FI（Fusion Index）は、１個あたりの細胞内で融合を起こしていた細菌の平均数に、融合が見られた細胞の割合を乗じた値であり、PI（Phagocytic Index）は、１個あたりの細胞内に貧食された細菌の平均数に、貧食が見られた細胞の割合を乗じた値である。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１から、サンプル１（本免疫賦活用組成物）の添加により、濃度依存的に殺菌能（FI/PI）が増大していることが分かる。
【００６８】
以上の結果から、本免疫賦活用組成物は、自然免疫の初期段階を活性化していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の免疫賦活用組成物は、米糠由来であるため、継続的に摂取しても副作用の心配がないので、日常的に摂取するサプリメントなどとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠由来の免疫賦活用組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糠は、米や麦などの穀物を精白した際に出る果皮や種皮、胚芽などの部分であり、米を主食とする我が国においては多量の米糠が生じている。米糠には油分、タンパク質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類などの栄養素が豊富に含まれている。米糠の主な用途としては、米油原料３３％、飼料原料１２％、キノコ菌床１１％、漬物５％で、残りの３９％は廃棄されているといわれている。また、米油製造の副産物である脱脂米糠には、タンパク質、食物繊維、ビタミン類、ミネラル類などの栄養素の多くが残存しているが、その一部が飼料原料や肥料などに利用されているだけである。
【０００３】
上記のように米糠の食品への利用が進んでいない原因としては、米糠特有の好ましくない風味やざらざらとした舌触りなどが挙げられる。そのため、風味や舌触りを改善した米糠製品の開発や、米糠を利用した機能性素材の開発が数多くなされている。
【０００４】
例えば、米糠を利用した機能性素材として、特許文献１には、米糠の水抽出物を含有することを特徴とする免疫賦活用組成物について開示されている。
【０００５】
特許文献２には、米糠の発酵物を極性溶媒で抽出してなる生理活性組成物について開示されており、該生理活性組成物が、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用、免疫賦活作用、ラジカル捕捉作用、及び抗酸化作用（ＳＯＤ様活性）などを有することが記載されている。
【０００６】
特許文献３には、米糠やふすまなどの植物組織原料を糸状菌の培養液中で資化することを特徴とする生理活性ヘミセルロースの製造方法について開示されており、該生理活性ヘミセルロースは、免疫賦活作用、マクロファージ活性化作用、抗ウイルス作用、脂質代謝改善作用などを有していることが記載されている。
【０００７】
特許文献４には、植物組織原料の熱水抽出物をグルコアミラーゼで処理した後、アスペルギルス属のAsp. oryzae及びバシディオミセテス属のLentinus edodesのいずれかの培養濾液から得られた酵素の複合体で処理して得られる免疫力増強物質について開示されている。
【０００８】
特許文献５には、乳酸菌発酵代謝物と米糠抽出物の加水分解物を配合した免疫調整剤について開示されており、該米糠抽出物の加水分解物は、米糠を水、アルコールなどの溶媒で抽出して得られる抽出物を、酸、アルカリ、酵素などで加水分解して得られることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２５５８４３号公報
【特許文献２】特開２００２−２６５３７７号公報
【特許文献３】特開平１−１５３７０１号公報
【特許文献４】特開平９−２３８９５号公報
【特許文献５】特開２００２−３７７３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上述したような従来の米糠由来の機能性素材の多くは、米糠からの収率が低いという問題を有しており、また、生理活性の点についても充分満足できるとは言いがたかった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、米糠から収率よく調製することができ、かつ高い免疫賦活能を有する免疫賦活用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明の一つは、米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、この発酵物を多糖類分解酵素で処理して得られる処理物の水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の組成物においては、前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましい。
【００１４】
また、前記酵母がピキア
sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM
P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）であることが好ましい。
【００１５】
本発明のもう一つは、１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程、を含むことを特徴とする免疫賦活用組成物の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の製造方法においては、前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上であることが好ましく、前記酵母としてピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を用い、前記乳酸菌としてエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、多糖類分解酵素で処理することにより、従来に比べて米糠からの収率が高く、かつ高い生理活性を有する免疫賦活用組成物を得ることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の免疫賦活用組成物は、米糠由来であるため、継続的に摂取しても副作用の心配がなく、安全に免疫能（特に初期免疫能）を高めることができる。また、米糠の高度利用の一つの方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各サンプルを添加した場合の好中球・単球の貪食活性相対値を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の免疫賦活用組成物の原料として用いられる米糠は、食用に適したものであればよく、好ましくは米油を抽出した後の脱脂米糠が用いられる。
【００２１】
本発明において米糠の発酵に用いられる酵母及び乳酸菌は、米糠から分離された菌が用いられる。米糠からの菌の分離は、常法に従って行うことができ、例えば以下のようにして行うことができる。
【００２２】
・酵母の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収する。この上清を生理食塩水で段階希釈した液をポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２〜３日間培養する。
【００２３】
出現したコロニーをピックしてポテトデキストロース液体培地に接種し、３０℃で１〜３日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、ポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２〜３日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とする。
【００２４】
単離した酵母のうち、米糠の発酵速度、ペプチド化、風味等を指標に使用する酵母を選択する。
【００２５】
本発明においては、上記のようにして米糠から分離された酵母であるピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）が好ましく用いられる。
【００２６】
・乳酸菌の単離
培地として炭酸カルシウム含有ＧＹＰ培地を用いた以外は、上記と同様にして米糠から乳酸菌を単離することができる。
【００２７】
本発明においては、上記のようにして米糠から分離された乳酸菌であるエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）が好ましく用いられる。
【００２８】
上記のようにして米糠から分離された酵母及び乳酸菌を用いることにより、米糠を効率よく発酵させることができる。
【００２９】
以下、本発明の免疫賦活用組成物の製造方法について説明する。
１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程
米糠１質量部に対し、水を０．２〜５０質量部添加し、９０〜１００℃で１〜３時間加熱殺菌を行う。本発明においては、オートクレーブ処理を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、発酵処理工程における腐敗を防止できる。
【００３０】
２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程
殺菌処理を行った米糠を充分に冷ました後、酵母の前培養液と乳酸菌の前培養液をそれぞれ添加し、２０〜４０℃で４８〜１２０時間発酵させる。発酵処理中は、発酵物のｐＨをモニタリングし、発酵物のｐＨが４．０〜５．５になるまで発酵を行うことが好ましい。
【００３１】
なお、酵母の前培養液は、例えば、ポテトデキストロース培地に酵母を接種し、常法に従って１〜２日間培養し、この培養液を米糠1質量部に対し、０．０００１〜０．１質量部添加すればよい。
【００３２】
乳酸菌の前培養液は、例えば、ＧＹＰ培地に乳酸菌を接種し、常法に従って１〜２日間培養し、この培養液を米糠１質量部に対し、０．０００１〜０．１質量部添加すればよい。
【００３３】
３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程
上記工程で得られた米糠発酵物に、多糖類分解酵素を添加し、３０〜５５℃で０．５〜２４時間酵素反応を行う。多糖類分解酵素の添加量は、原料米糠１質量部に対して０．０００１〜０．１質量部が好ましい。酵素処理後は、加熱処理を行い、殺菌と酵素失活を行うことが好ましい。
【００３４】
上記多糖類分解酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上が好ましく用いられ、特にヘミセルラーゼが好ましく用いられる。
【００３５】
多糖類分解酵素で処理することにより、収率も大幅に向上させることができるだけでなく、組成物の免疫賦活活性を向上させることができる。
【００３６】
４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程
多糖類分解酵素で処理した処理物を、常法により濾過して濾液を回収し、必要に応じて乾燥・粉末化する。
【００３７】
本発明の免疫賦活用組成物は、上記の水溶性画分をそのまま用いることもできるが、その他の成分として、賦形剤、乳化剤、安定剤、甘味料、ｐＨ調整剤、増粘剤、香料、酸味料等の食品添加剤や、ビタミン類、ミネラル類等を含むこともできる。
【００３８】
本発明の免疫賦活用組成物の形態は、特に制限されず、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、液剤など使用形態に応じて適宜選択すればよい。また、本発明の免疫賦活用組成物を飲料、ゼリー飲料、ヨーグルト、菓子、パン類などといった各種飲食品に配合することもできる。
【００３９】
本発明の免疫賦活用組成物の有効摂取量は１００〜１０００ｍｇであり、好ましくは２５０〜７５０ｍｇである。なお、各種飲食品における配合量は、該有効摂取量を基準にすればよい。
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれによって特に限定されるものではない。また、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を表す。
【実施例１】
【００４１】
（１）米糠由来の酵母・乳酸菌の単離
・酵母の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収し、この上清を生理食塩水で段階希釈した液をポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養した。
【００４２】
出現したコロニーをピックしてポテトデキストロース液体培地に接種し、３０℃で３日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、ポテトデキストロース寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とした。そして、米糠の発酵速度、ペプチド化、風味を指標に酵母を選択し、ピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を単離した。
【００４３】
・乳酸菌の単離
新鮮な脱脂米糠１０ｇに生理食塩水１０ｍｌ添加してよく撹拌した後、遠心して上清を回収し、この上清を生理食塩水で段階希釈した液を炭酸カルシウム含有GYP寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養した。
【００４４】
出現したコロニーをピックしてＧＹＰ液体培地に接種し、３０℃で１日間培養し、この培養液を生理食塩水で段階希釈して、炭酸カルシウム含有GYP寒天培地に播種し、３０℃で２日間培養し、出現したコロニーをピックして単離株とした。そして、米糠の発酵速度、ｐＨ、風味を指標に乳酸菌を選択し、エンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を単離した。
【００４５】
（２）米糠の発酵処理
ピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）をポテトデキストロース液体培地１００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養し、前培養液とした。
【００４６】
また、エンテロコッカス
sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM
P-21703）をＧＹＰ液体培地１００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養し、前培養液とした。
【００４７】
脱脂米糠１．５ｋｇに水を８Ｌ加え、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行った後、充分に冷ましてから、酵母の前培養液８ｍｌと乳酸菌の前培養液８ｍｌを加えて均一に撹拌した後、３０℃で９６時間発酵処理を行った。
【００４８】
発酵処理終了後、ヘミセルラーゼ（商品名「ヘミセルラーゼ「アマノ」９０」、天野エンザイム（株）製）を１．５ｇ添加・混合し、６０℃で１時間酵素反応を行った。
【００４９】
酵素反応終了後、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行い、酵素失活及び殺菌処理を行った後、濾過して濾液を回収した。
【００５０】
この濾液をスプレードライヤーを用いて噴霧乾燥し、本免疫賦活用組成物（サンプル１）を０．６ｋｇ得た（収率４０％）。
【００５１】
ヘミセルラーゼ処理を行わなかった以外は、上記と同様にして米糠発酵エキス（サンプル２）を得た（収率２０％）。
【００５２】
一方、脱脂米糠１．５ｋｇに水を８Ｌ加え、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）を行った後、濾過して濾液を回収し、噴霧乾燥して米糠熱水抽出物（サンプル３）を得た（収率１０％）。
【００５３】
（３）免疫賦活活性の測定
上記で得られた各サンプルを用いて、好中球・単球の貪食能、及び食胞融合能に与える影響を調べた。
【００５４】
・好中球及び単球の調製
ヘパリン加採血した健常ヒト末梢血２０ｍｌをMono-Poly Resolving Medium（商品名、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）５ｍｌの入った滅菌済み丸底スピッツ管４本に５ｍｌずつ分注し、２０℃、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。遠心分離により４層（下から赤血球層、好中球層、単球層及び血漿を含んだ層）に分離し、このうち好中球層と単球層をそれぞれ取り出した。
【００５５】
取り出した好中球層に０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液を加え、４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上清を捨て洗浄した。同様の操作を計3回繰り返した後、細胞にトリス−塩化アンモニウム緩衝液を２０ｍｌ加えて撹拌し、室温で１５分間放置し、混在している赤血球を溶血させた後、４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て細胞を洗浄した。
【００５６】
その後、ＲＰＭＩ １６４０培地を20ml加えて撹拌した後、細胞数をカウントし、細胞数が５．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように溶液（含１０％容量の非働化Fetal bovine serum）を調製した。
【００５７】
単球層についても上記と同様にして洗浄操作を行い、細胞数が５．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように溶液（含１０％容量の非働化Fetal bovine serum）を調製した。
【００５８】
・貪食能の測定
サンプル１〜３をそれぞれ０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液に溶解した後、黄色ブドウ球菌の死菌体を１×１０８個／ｍｌとなるように添加して均一に懸濁し、各濃度のサンプル溶液を調製した。
【００５９】
上記で調製した好中球（又は単球）懸濁液（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）２００μｌをcover slip上で培養（３７℃、９０分間、ＣＯ２インキュベーター）し、吸着させた。その後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、cover slip上に吸着しなかった細胞を除去した。その後、cover slip上に各サンプル溶液２００μｌを加え、培養（３７℃、６０分間、ＣＯ２インキュベーター）した。
【００６０】
インキュベート後、ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄し、メタノールに約１０秒間つけて固定し、スライドグラスにのせて自然乾燥させた。乾燥後、レフレルメチレンブルー液２００μｌを滴下して２０秒間染色し、純水で洗浄して乾燥させた。これを顕微鏡観察（１０００倍）し、各サンプル溶液について無作為に１２０個（３０個×４ヶ所）の好中球（又は単球）を選び、その細胞内に貧食された菌数を数え、その平均値を求めた。そして、サンプル濃度０μｇ／ｍＬの時の平均値を１００とし、各サンプル濃度における貧食活性の相対値を求めた。その結果を図１に示す。
【００６１】
図１（ａ）、（ｂ）から、サンプル１（本免疫賦活用組成物）は、サンプル２（米糠発酵エキス）及びサンプル３（米糠熱水抽出物）に比べてより低濃度で好中球及び単球の貧食能を促進していることが分かる。そして、サンプル１（本免疫賦活用組成物）は、特に好中球の貧食能を強く促進していることが分かる（図１（ｂ）参照）。
【００６２】
・殺菌能
サンプル１を０．１％ゼラチン−ハンクス緩衝液に溶解した後、黄色ブドウ球菌の死菌体を１×１０８個／ｍｌとなるように添加して均一に懸濁し、各濃度のサンプル溶液を調製した。
【００６３】
上記と同様にして調製した好中球懸濁液（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）２００μｌをcover slip上で培養（３７℃、９０分間、ＣＯ２インキュベーター）し、吸着させた。その後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、cover slip上に吸着しなかった細胞を除去した後、細胞をアクリジンオレンジ（５ｍｇ／ｍｌ）で染色し、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄した。
【００６４】
cover slip上に各サンプル溶液２００μｌを加え、培養（３７℃、６０分間、ＣＯ２インキュベーター）した後、ＲＰＭＩ
１６４０培地で３回洗浄し、メタノールに約１０秒間つけて固定し、スライドグラスにのせて自然乾燥させた。乾燥後、レフレルメチレンブルー液２００μｌを滴下して２０秒間染色し、純水で洗浄して乾燥させた。これを蛍光顕微鏡観察し、各サンプル溶液について無作為に１２０個（３０個×４ヶ所）の好中球を選び、アクリジン染色された黄色ブドウ球菌の数をカウントした。
【００６５】
そして、１個あたりの細胞内で融合を起こしていた細菌の平均数に、融合が見られた細胞の割合を乗じて食胞融合能〔fusion index（FI）〕を算出し、１個あたりの細胞内に貪食された細菌の平均数に、貧食が見られた細胞の割合を乗じて貪食能〔phagocytosis index（PI）〕を算出し、殺菌能（FI/PI）を求めた。その結果を表１に示す。なお、FI（Fusion Index）は、１個あたりの細胞内で融合を起こしていた細菌の平均数に、融合が見られた細胞の割合を乗じた値であり、PI（Phagocytic Index）は、１個あたりの細胞内に貧食された細菌の平均数に、貧食が見られた細胞の割合を乗じた値である。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１から、サンプル１（本免疫賦活用組成物）の添加により、濃度依存的に殺菌能（FI/PI）が増大していることが分かる。
【００６８】
以上の結果から、本免疫賦活用組成物は、自然免疫の初期段階を活性化していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の免疫賦活用組成物は、米糠由来であるため、継続的に摂取しても副作用の心配がないので、日常的に摂取するサプリメントなどとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、この発酵物を多糖類分解酵素で処理して得られる処理物の水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活用組成物。
【請求項２】
前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上である請求項１記載の免疫賦活用組成物。
【請求項３】
前記酵母がピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）である請求項１又は２記載の免疫賦活用組成物。
【請求項４】
１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程、を含むことを特徴とする免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項５】
前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上である請求項４記載の免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記酵母としてピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を用い、前記乳酸菌としてエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を用いる請求項４又は５記載の免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項１】
米糠由来の酵母及び乳酸菌を用いて米糠を発酵させた後、この発酵物を多糖類分解酵素で処理して得られる処理物の水溶性画分を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活用組成物。
【請求項２】
前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上である請求項１記載の免疫賦活用組成物。
【請求項３】
前記酵母がピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）であり、前記乳酸菌がエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）である請求項１又は２記載の免疫賦活用組成物。
【請求項４】
１）米糠に水を加えた後、殺菌処理を行う工程、２）殺菌処理した米糠に、米糠由来の酵母と乳酸菌を接種して発酵処理を行う工程、３）発酵処理した米糠を多糖類分解酵素で処理する工程、４）前記工程で得られた処理物から水溶性画分を抽出、回収する工程、を含むことを特徴とする免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項５】
前記多糖類分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群から選ばれた１種以上である請求項４記載の免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記酵母としてピキア sp-01（Pichia sp-01、寄託番号FERM P-21702）を用い、前記乳酸菌としてエンテロコッカス sp-L3（Enterococcus sp-L3、寄託番号FERM P-21703）を用いる請求項４又は５記載の免疫賦活用組成物の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１０６０１３（Ｐ２０１０−１０６０１３Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２３２６７（Ｐ２００９−２２３２６７）
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月１日 第６２回日本栄養・食糧学会大会会頭発行の「第６２回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５００１０１２４３）株式会社ファーマフーズ (30)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月１日 第６２回日本栄養・食糧学会大会会頭発行の「第６２回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５００１０１２４３）株式会社ファーマフーズ (30)
【Ｆターム（参考）】
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