免疫関連疾患を予防および治療するための組成物および方法
本発明はペプチドを含む免疫調節剤、重症敗血症または急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）などの免疫関連疾患を予防または治療するための薬剤学的組成物および方法、および抗炎症剤、抗菌剤、または免疫細胞自滅死の阻害剤に対するペプチドの用途に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを含む免疫調節剤、および重症敗血症、急性呼吸不全症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＲＤＳ）などの免疫関連疾患を予防または治療するための薬学組成物および方法、そして抗炎症剤、抗菌剤または免疫細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤に関するペプチド用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＰＲは好中球、単球、マクロファージおよび樹枝状細胞などの食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌ）で発見される伝統的な化学走性物質の受容体として、Ｇ−蛋白質と結合する。３種類のＦＰＲ（ＦＰＲ、ＦＰＲ−類似（ＦＰＲＬ）１、およびＦＰＲＬ２）と２種類のＦＰＲ（ヒトのＦＰＲに対応するＦＰＲ１、およびヒトのＦＰＲＬ１に対応するＦＰＲ２）がヒトおよびマウスでそれぞれ同定された。ＦＰＲファミリーの一員の活性化は白血球の化学走性による移動を誘導し、好中球および単球でスーパーオキサイド陰イオンの生成を通して殺菌活性を誘導する。食細胞で化学走性による移動を促進することができる合成ペプチドであるＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー（マウスでＦＰＲ１およびＦＰＲ２、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２）の一員に試験管内で結合し、スーパーオキサイド陰イオンの生成を通して単球および好中球の殺菌活性を増加させる。ＷＫＹＭＶｍはまた、自滅死を防止することによって単球の生存率を向上させると報告された（非特許文献１）。したがって、かかる実験は微生物感染後、重症敗血症への進行でＦＰＲ作動剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であるＷＫＹＭＶｍの治療効果および機能的メカニズムを研究し、かかる根拠は敗血症−誘導致死率の主要原因は制御されていない細菌感染であり、ＦＰＲ活性化が免疫細胞および炎症細胞の殺菌活性を増加させるという考えに基づいたものである。
【０００３】
最近の研究によれば、敗血症−誘導致死は初期敗血症（つまり、最初６時間）の間に先天的免疫システムの実質的な損傷により炎症反応の調節能がないのが伴われる。また、敗血症の間に過度なリンパ球の自滅死の結果で多くの器官破壊の臨床的兆候が現れる。さらに、最近の研究によれば、サイトカインの水準が敗血症の間に急激に変化し、特にＴＮＦ−α ａｎｄ ＩＬ−１βなどの前炎症性サイトカインの水準が急激に増加する。かかる考察は、重症敗血症または敗血症ショックによる致死を効果的に防止するためには、食細胞の殺菌活性を増加させ、前炎症性調節者の生成を阻害し、抗原−特異的後天性免疫反応を延長させる薬品が必要である。
【０００４】
重症敗血症または敗血症ショックを有する多くの患者は積極的な治療にもかかわらず死ぬ。重症敗血症を予防する一つの方法は、エンドトキシンの中和であるが、かかる治療的介入の目標は逆説的である（非特許文献２）。プラセボ対照臨床試験で、エンドトキシンに対する単クローン抗体は重症グラム−陰性バクテリア敗血症を病む患者の死を止めることができなかった（非特許文献３）。微生物磁極源に関係なく炎症を治療するための他の付属治療法、例えば、直間接的に炎症調節者（血小板活性化因子の拮抗筋（非特許文献４）、再結合ＩＬ−１β受容体の拮抗筋（非特許文献５）、ＴＮＦ−αに対する遺伝的に製造された水溶性受容体、およびＴＮＦ−αに対する単クローン抗体）の活性を遮断する治療法は、重症敗血症または敗血症ショックを有する患者の死を止めることができなかった（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ７１：３２９〜３３８， ２００２
【非特許文献２】Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ， Ｎ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：５１７〜５２４
【非特許文献３】Ｃｏｈｅｎ， Ｊ． Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５５：２１２〜２２５， １９９９
【非特許文献４】Ｄｈａｉｎａｕｔ， Ｊ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：１９６３〜１９７１， １９９８
【非特許文献５】Ｆｉｓｈｅｒ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ． ２７１：１８３６〜１８４３， １９９４
【非特許文献６】Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ， Ｎ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：５１７〜５２４， ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＬＰで敗血症を誘導した後に、ＷＫＹＭＶｍでＦＰＲを活性化させ、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、ＩＬ−１７生産の増加（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によって部分的に調節される前炎症性調節者の生産を減少させた（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）抗炎症活性効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通してマウスで効果的にＣＬＰ−誘導致死を防止する。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染後、重症敗血症への進行を効果的に防止する。したがって、ＦＰＲ活性化は、敗血症治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。
【０００７】
本発明の発明者らは、トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）によるホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）の活性化が死から保護し、肺炎症を阻害し、免疫細胞自滅死を防止し、殺菌活性を増加させることを糾明して本発明を完成した。
本発明の目的は、配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を含有する薬学組成物であって、急性呼吸不全症（ＡＲＤＳ）または重症敗血症を予防または治療するための薬学組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害する、前記免疫調節剤を含有する薬学組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を対象に治療学的有効量で投与することを含む対象の免疫反応を調節する方法を提供することにある。かかる方法における免疫反応の調節は、抗炎症反応、抗菌反応、免疫細胞自滅死阻害、または重症敗血症またはＡＲＤＳの予防または治療に関連する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
後述する詳細な説明で本明細書の一部分である図面を参照して説明する。図面において、類似する符号は文脈上異なって指示しない限り、通常類似する構成要素を意味する。詳細な説明で記述された実施例、図面、および請求の範囲は制限されるのを意味しない。本明細書で提示された主題の範囲または精神を逸脱しない他の具現例が活用されることができ、他の変形が可能である。
【００１２】
本発明の一例は、配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を提供するものである。本発明のさらに他の一例は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を対象に治療学的有効量で投与することを含む対象の免疫反応を調節する方法に関するものである。
【００１３】
ＷＫＹＭＶｍペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）およびホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）、およびヒトではＦＰＲ、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２に結合して活性化させることによって、対象で免疫反応を調節する。ＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー受容体に結合すると報告されたため、他のＦＰＲリガンドに対する治療効果を評価したが、ＷＫＹＭＶｍペプチドは治療効果がなかった（図１Ｇ）。
【００１４】
また、前記ペプチドは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子ＴＮＦ−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインの発現を減少させ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのＴｈ１サイトカインの発現を増加させる。前記ペプチドは、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の発現を増加させ、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはＩＬ−１０などの抗炎症サイトカインの発現を増加させる。
【００１５】
ＷＫＹＭＶｍペプチドは、前炎症性サイトカインの生産が減少するように調節し、ＦＰＲ活性化は、前炎症性サイトカインの生産の直接的阻害を通して急性炎症を防止することによって治療効果を現わすため、ＷＫＹＭＶｍは抗炎症剤として使用される。
【００１６】
本発明によれば、免疫反応の調節はまた、免疫細胞の自滅死を阻害することを含む。
【００１７】
ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、腹膜液から細菌の除去に影響を与え、向上された細菌除去と関連のあるＨ２Ｏ２の生産を向上させる。したがって、ＷＫＹＭＶｍペプチドは抗菌剤として使用される。ＣＬＰで敗血症を誘導した後ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、ＩＬ−１７生産の増加（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によって部分的に調節される前炎症性調節者の生産を減少させた（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）抗炎症活性効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通して、マウスでＣＬＰ−誘導致死を効果的に防止する。ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）によるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染以降に重症敗血症へ進行されることを効果的に防止する。したがって、ＦＰＲ活性化は重症敗血症および急性呼吸不全症の治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。ＷＫＹＭＶｍペプチドの抗炎症剤、抗菌剤、または免疫細胞自滅死の阻害剤は、炎症性サイトカインの発現減少およびＴｈ１サイトカインの増加による、重症敗血症の予防および治療効果と主に関連する。また、ＩＬ−１０、およびＴＦＧ−βおよびＩＬ−１０抗炎症サイトカインなどの抗炎症サイトカインのＷＫＹＭＶｍペプチドによる発現増加のような免疫調節活性は主にＡＲＤＳ予防および治療と関連する。
【００１８】
ＷＫＹＭＶｍペプチドとは異なり、ＷＫＹＭＶｍ類似体であるＷＲＹＭＶｍ（配列番号２）、ＷＫＷＭＶｍ（配列番号３）、ＷＫＲＭＶｍ（配列番号４）、ＷＫＦＭＶｍ（配列番号５）、ＷＨＹＭＶｍ（配列番号６）、ＷＫＹＭＹｍ（配列番号７）、ＷＫＹＭＦｍ（配列番号８）、ＷＫＹＭＷｍ（配列番号９）、ＷＫＹＭＶＶ（配列番号１０）、またはＷＫＥＭＶｍ（配列番号１１）は、実験的敗血症に対して治療効果がない（図１Ｈ）。
【００１９】
好ましくは、ＷＫＹＭＶｍペプチドはヒトで０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ、より好ましくは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙを投与することができる。前記投与量の範囲で、ＷＫＹＭＶｍペプチドはＷＫＹＭＶｍ類似体よりＣＬＰのマウスのモデルでより優秀な治療効果を現わす。
【００２０】
前記ＷＫＹＭＶｍペプチドを活性成分として含む組成物は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロールおよびエタノールからなる群より選択された１種以上の薬学的担体を含むことができ、前記担体は前記例示した担体に限定されない。
【００２１】
前記活性成分は多様な関連因子を考慮して投与量を決定することができ、前記関連因子は治療状態、患者の症状の深刻性、他の薬品との併用投与（例えば、化学療法剤）、年齢、性別、個々の患者別体重、食べ物、投与時間、選択された投与経路、および組成物の含量などを含む。前記組成物は１日に１回または１〜３回で分割投与することができ、疾患の種類および重症度を考慮して投与経路および投与量を決定することができるが、好ましくは、１２時間の間隔で１日２回投与することができる。
【００２２】
本発明によるペプチドを含む前記組成物は、経口または非経口投与することができる。非経口投与は口以外の経路を通して薬品を投与することで、直腸、静脈、腹膜内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入、目および皮下で投与することができる。
前記ペプチドを含む薬学製剤は、経口投与形態、注射液、または局所製剤などのような如何なる形態にも製造することができる。前記製剤は、好ましくは、経口および注射投与形態（真溶液、懸濁液またはエマルジョン）に製造されることができ、最も好ましくは、タブレット（ｔａｂｌｅｔ）、カプセル、軟質カプセル、受容製剤、ピル（ｐｉｌｌ）、顆粒などのような経口製剤であってもよい。
【００２３】
前記製剤を製造することにおいて、前記ペプチドは賦形剤なく軟質カプセルに充填されたり、担体と混合または希釈された後に適切な製剤形態に製造されることができる。前記適切な担体の例としては、デンプン、水、食塩水、リンゲル液、デキストロースなどがある。
【００２４】
ＣＬＰ敗血症誘導後、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、前炎症性調節者の生産を減少させること（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を通した抗炎症効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通して、マウスでＣＬＰ−誘導致死を効果的に防止することができる。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染後、重症敗血症への進行を効果的に防止することができる。したがって、ＦＰＲ活性化は、敗血症の治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。
【００２５】
集中治療室で死亡の主要原因である重症敗血症は宿主の免疫反応が侵入した微生物との戦いに失敗する時に起きる。ＷＫＹＭＶｍペプチドによるホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）活性化は、盲腸結紮および穿孔（ＣＬＰ）敗血症のマウスのモデルで死から保護し、肺炎症を防止し、免疫細胞自滅死を遮断し、殺菌活性を増加させる。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でマウスの好中球によるＨ２Ｏ２生成および殺菌活性を増加させる。ＦＰＲ活性化はまた、ＣＬＰのマウスでＩＦＮ−γの生産を増加させる。ＦＰＲ活性化の治療および殺菌効果（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔ）はＩＦＮ−γ欠乏のマウスで部分的に逆転される反面、標的器官の炎症がない。これと対照的に、ＦＰＲ活性化は、ＣＬＰのマウスでＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの生産を阻害する。さらに、ＦＰＲ活性化はグラム−陰性バクテリアで主な病原体−関連分子パターンであるＬＰＳに誘導された前炎症性調節者の生産を阻害する。最後に、ＦＰＲ活性化は、ＣＬＰ−誘導免疫細胞自滅死を阻害し、かかる活性はＣＬＰ−誘導ＩＦＮ−γ欠乏のマウスでは発生しない。かかる実験結果によれば、ＦＰＲ活性化が多重経路を通して、微生物の感染後、重症敗血症へ進行されることを効果的に防止することを提示する。
【００２６】
敗血症に伴う免疫性の減少調節（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）はリンパ球自滅死の進行と関連する。したがって、敗血症−誘導リンパ球自滅死の阻害は良い治療標的になり得る。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は優れた治療接近法になり得る。試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験によれば、ＦＰＲ活性化はＬＰＳ−誘導前炎症性サイトカインの生産を阻害する。かかる発見は、ＦＰＲ活性化が前炎症性サイトカインの生産の直接的な阻害を通して急性炎症反応を防止することによってその治療的効果を現わすということを提示する。したがって、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は敗血症治療において個別の前炎症性調節者を効果的に遮断することができる。
【発明の効果】
【００２７】
前記で詳細に記述した通り、本発明によるＷＫＹＭＶｍまたはその類似体は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）およびＩＬ−６の発現減少、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、ＩＬ−２およびＩＬ−１２の発現増加および反応性酸素の生成増加、敗血症によって誘発される脾臓リンパ球（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）または胸腺細胞（ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ）の減少抑制などの効果を現わすため、敗血症の治療剤として作用することができて敗血症の予防または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｂ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｃ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｄ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｅ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｆ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｇ】他のＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果を示したものである。
【図１Ｈ】他のＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果を示したものである。
【図２Ａ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｂ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｃ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｄ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図３Ａ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｂ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｃ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｄ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｅ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図４Ａ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｂ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｃ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｄ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｅ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｆ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図５Ａ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｂ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｃ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｄ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｅ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｆ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｇ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図６Ａ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｂ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｃ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｄ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図７Ａ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｂ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｃ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｄ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｅ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、実施例を通して本発明をより詳しく説明する。しかしながら、これら実施例は如何なる方式でも本発明の範囲を制限するものと解釈されてはいけない。
【００３０】
〔実施例１〕
〔１−１．ＣＬＰのマウスのモデルにおけるＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
前記論文に記述した通り（Ｙａｎ， Ｊ．Ｊ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０：１６１−１６７，２００４）、雄性のＷＴ ＩＣＲのマウスおよびＩＬ−１２Ｒ ２−、ＩＦＮ−γ−欠乏およびＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６のマウス（大韓民国、浦項工科大学教 Ｙ．Ｃ． Ｓｕｎｇから寄贈を受ける）を敗血症のモデルの動物として使用した。動物関連のすべての実験は東亜大学校の動物管理及び利用に関する臨床審議委員会のガイドラインに従い、その承認を受けた。ＣＬＰのために、マウスをペントタールナトリウム（腹膜内注入、５０ｍｇ／Ｋｇ）で麻酔させ、腹部正中線を若干切除して盲腸を露出させた。前記盲腸を回盲弁（ｉｌｅｏｃｅｃａｌ ｖａｌｖｅ）の下部を結紮した後、盲腸に２２ゲージの針で両面にわたって２度穿孔し（またはサイトカインの生産量の測定のために１度）腹部を縫合した。シャム（Ｓｈａｍ）ＣＬＰのマウスも前記方法と同様に行ったが、盲腸の結紮および穿孔を行わなかった。１０日間、１日１回生存率を観察した。
【００３１】
実験的敗血症に対するＷＫＹＭＶｍの治療効果を調査するために、アルビノＩＣＲ（癌研究センター、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスに対してもＣＬＰを行い、生存率を１０日まで観察した。ＣＬＰ後２日目、マウスの致死率が急激に増加した（図１Ａ）。ＣＬＰ手術後、２、１４、２６、および３８時間経過時に多様な濃度でＷＫＹＭＶｍをＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。
【００３２】
ＷＫＹＭＶｍの治療効果を調査するために、陰性対照群として多様な濃度のペプチドまたはＰＢＳをＣＬＰ後２時間から始めて皮下に注射した。ＰＢＳ投与群に比べて４または８ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍ投与群で顕著にマウスの生存率が増加した（図１Ａ）。ＣＬＰ遂行後１０時間目にＷＫＹＭＶｍを投与した場合、治療効果はＣＬＰ遂行後２時間目にペプチドを投与した場合と類似していた（図１Ｂ）。多様な濃度のＷＫＹＭＶｍを皮下に４回、ＣＬＰのマウスにＣＬＰ遂行後１０、２２、３４および４８時間目に投与した。
【００３３】
注射の頻度面において、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ遂行後２時間目に投与し、１２時間の間隔で３または４回追加投与した場合に生存率が大きく増加した（図１Ｃ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）を０、１、２、３、４、または５回ＣＬＰのマウスに注入した。前記結果から、以降の実験は、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ遂行後２時間目に投与し、１２時間の間隔で３回追加投与したＣＬＰのマウスを使用して行った。
【００３４】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の機能を評価するために、ＦＰＲ１拮抗剤［Ｎ−ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ）（配列番号１２）］（Ｌａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １５：２２４７〜２２５６）、およびＦＰＲ２拮抗剤［Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ；ＷＲＷＷＷＷ（ＷＲＷ４）（配列番号１３）］（Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：６０７〜６１４．）をＣＬＰのマウスにＷＫＹＭＶｍ投与前に投与した。ＷＲＷ４を先に投与した場合、ＷＫＹＭＶｍの治療効果は完全に逆転され、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰを先に投与した場合には部分的にのみ逆転された（図１Ｄ）。ＣＬＰを行う２時間前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）、ＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）＋ＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下で投与した。ＣＬＰを行った後に、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）をＷＫＹＭＶｍ処理する（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）２時間前に１２時間の間隔で４回皮下投与した。
【００３５】
統計分析：生存データをｌｏｇ−ｒａｎｋテスト法で分析した。すべての他のデータはＡＮＯＶＡを使用して分析した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを使用して事後比較を行い、統計的有意性はＰ＜０．０５で先験的設定した。
【００３６】
〔１−２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接種のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
マウスに大腸菌（１×１０９細胞／マウス）を腹膜内投与した後、２、１４、２６、および３８時間にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。本実施例はまた、他の敗血症のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果を評価した。ＰＢＳを投与した大腸菌接種のマウスに比べて、大腸菌（１×１０９）を接種し接種後２時間目から始めて１２時間の間隔で４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍを４回皮下投与したマウスで致死率が減少した（図１Ｅ）。
【００３７】
〔１−３：ＬＰＳを注射したマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
さらに、ＷＫＹＭＶｍはまた、６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹膜内に注射したマウスの致死率を減少させた（図１Ｆ）。６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹膜内投与した後、２、１４、２６および３８時間目にＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下で４回注射した。実験結果は平均±標準誤差で示した。溶媒対照群（ａ〜ｇ）に比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、サンプルの大きさｎ＝１６〜２４（ａ〜ｅ）またはｎ＝８（ｆ、ｇ）マウス／グループである。
【００３８】
〔比較例１〕
〔１−１：ＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
ＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー受容体に結合するため、他のＦＰＲリガンドの治療効果も評価した。Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（ＷＫＹＭＶＭ）（配列番号１４）（Ｂａｅｋ， Ｓ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：８１７０〜８１７５）、Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＦ）（配列番号１５）、およびＭＭＫ−１ペプチド（ＬＥＳＩＦＲＳＬＬＦＲＶＭ）（配列番号１６）（Ｋｌｅｉｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１３３４〜１３３７）の治療効果はＷＫＹＭＶｍより低かった（図１Ｇ）。
【００３９】
また、不活性スクランブルペプチドであるＶａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（ＶＷＭＹｍＫ）（配列番号１７）は治療効果がなかった（図１Ｇ）。ＦＰＲ−ファミリー作用剤（ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）、ＷＫＹＭＶＭ（配列番号１４）、ｆＭＬＦ（配列番号１５）、およびＭＭＫ−１（配列番号１６））またはスクランブルペプチド（ＶＷＭＹｍＫ：配列番号１７）（それぞれ４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ遂行後２、１４、２６、および３８時間に４回皮下注射した。
【００４０】
〔１−２．ＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果〕
ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）の類似体、ＷＲＹＭＶｍ（配列番号２）、ＷＫＷＭＶｍ（配列番号３）、ＷＫＲＭＶｍ（配列番号４）、ＷＫＦＭＶｍ（配列番号５）、ＷＨＹＭＶｍ（配列番号６）、ＷＫＹＭＹｍ（配列番号７）、ＷＫＹＭＦｍ（配列番号８）、ＷＫＹＭＷｍ（配列番号９）、ＷＫＹＭＶＶ（配列番号１０）、およびＷＫＥＭＶｍ（配列番号１１）が実験的敗血症に対して治療効果があるかを検査するために、アルビノＩＣＲマウスにＣＬＰを行い、１０日まで生存率を観察した。ＣＬＰ遂行後２日目に、マウスの致死率を急激に増加した（図１Ｈ）。ＷＫＹＭＶｍまたはＷＫＹＭＶｍの各類似体４ｍｇ／ｋｇをＣＬＰ遂行後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した（図１Ｈ）。
【００４１】
〔実施例２〕
〔ＷＫＹＭＶｍによる生存増加はバクテリアコロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症の減少と関連する〕
〔２−１．殺菌活性〕
ＣＬＰ−誘導致死率が腹膜液内バクテリアコロニー数と相当に関連しているため、実験はＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が腹膜液から細菌の除去に影響を与えたかを調査した。ＷＫＹＭＶｍ投与はＣＬＰ後２４時間目に腹膜内バクテリアコロニー数を９９．８％まで急激に減少させた（図２Ａ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ後２および１４時間目に４回皮下注射した。シャム（Ｓｈａｍ）、ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後２４時間目に収集した腹膜洗浄液を血液寒天培地平板（ｂｌｏｏｄ−ａｇａｒ ｂａｓｅ ｐｌａｔｅｓ）上に３７℃で一晩中培養してコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）の数を測定した。
【００４２】
〔２−２．リンパ球自滅死の阻害〕
敗血症が広範囲なリンパ球自滅死を誘導するという観測から（Ａｙａｌａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２６１〜４２７５）、実験はまたＷＫＹＭＶｍが脾臓リンパ球死滅を予防することができるかを評価した。ＣＬＰ遂行後２４時間目に脾臓リンパ球死滅はＷＫＹＭＶｍ投与によって顕著に阻害された（図２Ｂ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）がＣＬＰ後２および１４時間目に投与され、脾臓リンパ球数をＩＣＲマウス内にＣＬＰ遂行後２４時間目に測定した。
【００４３】
〔２−３．抗炎症活性〕
敗血症後致死率は生命器官炎症と関連したと知られている。本発明者らはＰＢＳを投与したＣＬＰ−誘導マウス内に急性肺炎症の標識である、湿／乾（ｗｅｔ／ｄｒｙ、Ｗ／Ｄ）重量比が顕著に増加したことを発見し、またこの標識がＷＫＹＭＶｍ投与によって完全に逆転されたことを発見した（図２Ｃ）。肺浮腫の大きさは、従来記載された通り、肺のＷ／Ｄ重量比を測定して定量化した（Ｌｉｕ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ５４：４６４〜４７０）。獲得した全体湿潤肺（ｗｅｔ ｌｕｎｇｓ）の重量を測定し、オーブンに６０℃で４８時間置いた。その後、乾燥重量を測定し、Ｗ／Ｄ重量比を計算した。
【００４４】
ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）をＣＬＰ後２および１４時間後に投与し、ＩＣＲマウス内のＣＬＰ後２４時間目の肺のＷ／Ｄ重量比を測定した。実験結果は平均±標準誤差（ａ、ｂでｎ＝１６、ｃでｎ＝５）で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）をＣＬＰ後２時間および１４時間後に投与した。前記マウスは手術後２４時間目に死んだ。
【００４５】
また、組織学的分析はＣＬＰ−誘導肺炎症がＷＫＹＭＶｍによって完全に逆転されたことを示した（図２Ｄ）。前記肺はヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）（倍率、×１００）で染色した。実験結果はグループ当り８匹のマウスの見本である。マウスにＣＬＰ手術を行い、ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍを２時間後に４ｍｇ／ｋｇの量で投与した。マウスは手術後２４時間目に安楽死させ、肺を固定して切断し、形態学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００４６】
〔実施例３〕
〔ＷＫＹＭＶｍは食細胞内の細菌の除去および過酸化水素の生産を向上させる〕
ＷＫＹＭＶｍ投与が試験管内殺菌活性を増加させるかを測定するために、マウスの好中球が１時間の間に大腸菌を摂取するようにし、その後２０分間、０．１〜１０００ｎＭのＷＫＹＭＶｍで刺激した。これは投与量に依存して好中球の殺菌活性を顕著に向上させた（図３Ａ）。付着された好中球はオプソニン化された（ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ）大腸菌１０６と１時間培養し、溶媒（ＰＢＳ）またはＷＫＹＭＶｍ（０．１、１、１０、１００、および１０００ｎＭ）で１時間刺激した。
【００４７】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２が好中球内に現れたため（データに現れない）、この実験はＷＫＹＭＶｍ−誘導殺菌活性において、ＦＰＲ１−１およびＦＰＲ２−媒介された経路の役割を調査した。ＷＫＹＭＶｍ投与前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰまたはＷＲＷ４で前処理された好中球は殺菌活性を顕著に阻害した（図３Ｂ）。マウスの好中球を従来記載されたヒストペイク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）−１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ）で末梢血から分離した（Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１：６８０７〜６８１３， ２００３）。ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を添加する３０分前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）＋ＷＲＷ４（１０μＭ）を添加した。その後、好中球内生菌の数を測定した。
【００４８】
食細胞の殺菌効果がＨ２Ｏ２の生産と関連しているため、（Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｍ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ９２：３００７〜３０１７）、マウスの好中球内Ｈ２Ｏ２の生成に対するＷＫＹＭＶｍの影響を測定した。ＷＫＹＭＶｍは１００〜１０００ｎＭで最大反応で好中球内Ｈ２Ｏ２の生産を向上させた（図３Ｃ）。マウスの好中球を１５分間溶媒（ＰＢＳ）またはＷＫＹＭＶｍ（１〜１０００ｎＭ）で刺激した。シャム、ＣＬＰ−、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ−投与されたマウスから分離した好中球を１００ｎＭのＰＭＡに１時間の間、刺激した。正常のマウスから新たに分離した好中球をサイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｂ（５μＭ）の存在下で多様な濃度のＷＫＹＭＶｍで１０分間刺激した。
【００４９】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の役割を調査するために、ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を１０分間添加する前に好中球をＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、または溶媒（ＤＭＳＯ）と３０分間前培養を行った。上澄み液内のＨ２Ｏ２はＨ２Ｏ２分析キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で測定した。
【００５０】
さらに、前記効果はＢｏｃ−ＰＬＰＬＰまたはＷＲＷ４で前処理することによって部分的に逆転された（図３Ｄ）。しかしながら、ＷＫＹＭＶｍ−誘導Ｈ２Ｏ２の生成はＦＰＲ１＋ＦＰＲ２拮抗剤に前処理することによって完全に逆転された（図３Ｄ）。ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を添加する５分前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）＋ＷＲＷ４（１０μＭ）を添加した。
【００５１】
前記テストはＣＬＰ−誘導マウスから由来した好中球がＰＭＡに応じて Ｈ２Ｏ２を生産することに失敗したことを発見した（図３Ｅ）。しかしながら、ＷＫＹＭＶｍが投与されたＣＬＰ−誘導のマウスから由来した好中球内ではそれが投与されないものに比べてＨ２Ｏ２の生産が顕著に向上された（図３Ｅ）。ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰ後２時間および１４時間目にＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。ＣＬＰ後２４時間目に腹膜内好中球を分離した。シャム、ＣＬＰ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍマウスから分離した好中球をＰＭＡ（１００ｎＭ）で３０分間刺激した。実験結果は平均±標準誤差（ａ、ｂでｎ＝８；ｃ〜ｅでｎ＝１６）で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５２】
好中球の殺菌活性は、Ｙａｎ、 Ｊ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０：１６１〜１６７， ２００４．の方法により測定した。好中球は６０−ｍｍプラスチック培養ディッシュ（１×１０６好中球／カバースリップ）内の１３−ｍｍプラスチックカバースリップ上で１時間の間、３７℃で培養した。付着されない細胞はＰＢＳで隔離した。付着された好中球はオプソニン化された大腸菌１０６と１時間の培養した。貪食されない大腸菌を洗浄した後、いくつかの濃度のＷＫＹＭＶｍまたは溶媒との１時間の培養前および後に好中球内生菌数を測定した。死菌の比率は１００×（１−ＷＫＹＭＶｍの刺激後のＣＦＵ数／ＷＫＹＭＶｍの刺激前のＣＦＵ数）で計算した。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の役割を調査するために、ＷＫＹＭＶｍ（１μＭ）を１時間の間、添加する前に好中球をＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、または溶媒（ＤＭＳＯ）と３０分間の前培養した。
【００５３】
初期宿主−細菌の相互作用によって、先天的免疫体系の広範囲な活性化が行われ、これは宿主防御反応を調整する。食細胞を含む核心防御機作の一つは反応性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）および酸化窒素などの細胞内毒性調節者（ｔｏｘｉｃ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）の合成である。実験的結果はＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が、向上された細菌の除去と関連したＨ２Ｏ２の生産を向上させたことを明確に示す。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２はＷＫＹＭＶｍに対する受容体として知られている。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２に対する拮抗剤は好中球内ＷＫＹＭＶｍ−誘導Ｈ２Ｏ２の生産を顕著に阻害した。かかる結果はＷＫＹＭＶｍで向上された生存は食細胞の殺菌効果と関連し、これはＦＰＲ１およびＦＰＲ２によって媒介されることを提示する。かかる実験的結果はまた、ＷＫＹＭＶｍで向上された生存は完全にＦＰＲ２経路に依存し、ＦＰＲ１経路には単に部分的にのみ依存するということを示す。したがって、ＷＫＹＭＶｍは食細胞の直接的な殺菌活性での役割以外に付加的な効果を有し、これは恐らくＦＰＲ２によって媒介される。
【００５４】
〔実施例４〕
〔ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死を阻害し、不活性抗原に反応してＴｈ１細胞の増殖を向上させる〕
〔４−１．Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスで脾臓リンパ球の増殖の分析〕
Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデル（図４Ｂ）を作るために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスを７５μｇのＯＶＡ＋１０μｇのＬＰＳまたは２ｍｇの明礬（ａｌｕｍ）で０および７日目に腹膜内２回免疫させ、その後５０μｇのＯＶＡで１４、１５、および１６日目に腹膜内免疫性検査を行った。分離された脾臓リンパ球をＯＶＡと培養または培養せずに細胞増殖分析を行った。要約すれば、脾臓リンパ球はＲＰＭＩ １６４０培地で収穫し、９６ウェルのフラットボトムプレート（９６−ｗｅｌｌ ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅｓ）で３７℃で９６時間、培地のみ、あるいは５、５０または５００μｇのＯＶＡ／ｍｌと培養した（２×１０５細胞／ウェル）。前記実施例は１μＣｉ［３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅと７２時間培養期間後に細胞のチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）挿入を測定した。
【００５５】
ＣＬＰ−誘導敗血症は脾臓リンパ球自滅死を起こした；しかしながら、かかる作用はＷＫＹＭＶｍによって非常に効果的に阻害された（図４Ａ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ後２および１４時間目に４回皮下注射した。シャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍの投与後２４時間目に収集した脾臓をＴＵＮＥＬ分析（上部）（倍率、×４００）に使用した。ＴＵＮＥＬ−陽性細胞を計数した（下部）。ＴＵＮＥＬ分析は標準組織学的プロトコルを使用して最初に脱パラフィン化されたパラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ）組織切片をもって行った。その後、前記切片を４℃で２分間のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で透過し、ＴｄＴ酵素およびジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）−ｄＵＴＰ反応バッファー（ＴＵＮＥＬ）試薬で３７℃で６０分間満たした。死滅細胞（ＴＵＮＥＬ−陽性細胞）の比率を光学顕微鏡下で脾臓リンパ球５００個を計数して測定した。
【００５６】
従来の文献はリンパ球自滅死がカスパーゼ−３（ｃａｓｐａｓｅ−３）を含むいくつかの重要なカースパー剤によって媒介されるということを明らかにした（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ， Ｒ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２７：１２３０〜１２５１， １９９９）。これと類似して、ＣＬＰ−誘導敗血症はカスパーゼ−３の活性化を増進させた反面、ＷＫＹＭＶｍは非常に効果的にそれを阻害した（図４Ｂ）。（ａ）に表示されたマウスから由来した脾臓は分離されたカスパーゼ−３（ｃｌｅａｖｅｄ−ｃａｓｐａｓｅ−３）抗体と免疫組織化学に使用した（倍率、×１００）。実験結果はグループ当り８匹のマウスの見本である（ａ、ｂ）。本実施例は標準組織学的プロトコルを使用して最初に脱パラフィン化されたパラフィン包埋組織切片で免疫組織化学を行った。
【００５７】
分離されたカスパーゼ−３に対する１次抗体と培養した後に（細胞信号（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））、蛍光色素と結合された２次抗体を有するすべての切片を染色した。
【００５８】
ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ後２４時間目に腹膜液内ＩＬ−２の量を増加させた（図４Ｃ）。ＩＬ−２がＴ−細胞増殖を促進するため（Ｂｅｎｃｚｉｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｎｖｅｓｔ． ３３：１０９〜１４２）、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化のＴｈ１およびＴｈ２細胞増殖に対する効果を不活性抗原を使用して測定した。
【００５９】
ＣＬＰ後２、１４、２６および３８時間目にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。実験結果は平均±標準誤差で示した（ｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスは脾臓内にＴｈ１およびＴｈ２細胞らを作り出すためにそれぞれＬＰＳまたは明礬にＯＶＡを添加して腹膜内を免疫化させた（図４Ｄ）。
【００６０】
以下、Ｔｈ１およびＴｈ２マウス（図４Ｄ）のためのプロトコルを記載した。ＯＶＡ＋ＬＰＳ（ｅ）またはＯＶＡ＋明礬（ｆ）で免疫化されたマウス内ＯＶＡで培養後７２時間目に脾臓リンパ球増殖した。実験結果は平均±標準誤差で示し（ｅ、ｆでｎ＝５）、＊はＯＶＡ＋ＰＢＳグループに比べて、Ｐ＜０．０５であることを示し；＊＊は他のグループに比べて、Ｐ＜０．０５であることを示す。Ｔｈ１のマウスのモデルで、脾臓リンパ球増殖は７２時間後にシャム−投与マウスに比べて、ＷＫＹＭＶｍ−投与マウスでは増進されたが、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ−またはＷＲＷ４−投与マウスでは阻害された（図４Ｅ）。これと対照的に、Ｔｈ２のモデルでは、脾臓リンパ球の増殖が７２時間後にシャム−投与マウスに比べて、ＷＫＹＭＶｍ−投与マウスでは阻害され、拮抗剤−投与マウスでは増進された（図４Ｆ）。
【００６１】
〔実施例５〕
〔ＷＫＹＭＶｍの効果はＩＦＮ−γ−媒介経路に部分的に依存する〕
本発明者らはＷＫＹＭＶｍがＣＬＰ後２４時間目に腹膜液内ＩＬ−１２の水準を増加させたことを確認した（図５Ａ）。反面、腹膜液内ＩＦＮ−γの水準はＣＬＰ後８および２４時間目に増加した（図５Ｂ）。ＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。その後、腹膜液内に存在するサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した。
【００６２】
分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。ａ，ＩＬ−１２；ｂ，ＩＦＮ−γ；実験結果は平均±標準誤差で示す（ａ、ｂでｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった。腹膜洗浄液内ＣＬＰ−誘導サイトカインを測定するために、マウスにＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ後２、１４、２６および３８時間目に投与した。腹膜洗浄液をＣＬＰ後４時間から７２時間の間の多様な時間帯に収集し、腹膜液内存在するサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した。
【００６３】
敗血症以降ＷＫＹＭＶｍ−誘導生存に対するＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ）の役割を調査するために、ＣＬＰのモデルをＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景）に適用させた。ＣＬＰ−誘導致死率はＷＫＹＭＶｍを投与したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスで顕著に減少したが（図５Ｃ）、その効果はＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏マウスで部分的に逆転された（図５Ｃおよび図５Ｄ）。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏のマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。図５Ｄで、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＦＮ−γ−欠乏のマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。実験結果は平均±標準誤差で示す。溶媒に比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった（ｃ、ｄ）。ｎ＝グループ当り１０〜１６マウス（ｃ、ｄ）
【００６４】
本実験はＷＫＹＭＶｍ−誘導生存がＴｈ１サイトカイン−媒介経路に部分的に依存したという発見に基づいて、殺菌活性、標的器官炎症および脾臓リンパ球自滅死もＴｈ１サイトカイン−依存的であるかを測定した。腹膜液内細菌コロニー数はＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴのマウスに比べてＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＩＦＮ−γ−欠乏のマウスでより高かった（図５Ｅ）。ＣＬＰ後２および１４時間目にＣＬＰのマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後２４時間目に収集した腹膜洗浄液を３７℃で血液寒天培地平板上に一晩中培養してＣＦＵの数を測定した。
【００６５】
これと対照的に、Ｗ／Ｄ重量比はＰＢＳを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴ、ＩＬ−１２Ｒ ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウスでより高かったが、この効果はＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴ、ＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウスで完全に逆転された（図５Ｆ）。Ｃ５７ＢＬ／６、ＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内ＣＬＰ後２４時間目にＷ／Ｄ重量比を測定するために肺を使用した。面白いことに、ＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏のマウス内ＣＬＰで誘導され、ＷＫＹＭＶｍで逆転されたにもかかわらず、ＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死はＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内で観測されなかった（図５Ｇ）。ＣＬＰ後２および１４時間目にＣＬＰのマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。シャム、ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後、２４時間目に収集された脾臓をＴＵＮＥＬ分析（左側）（倍率、×４００）に使用した。ＴＵＮＥＬ−陽性細胞を計数した（右側）。実験結果は平均±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１であった（ｅ〜ｇでｎ＝８）。
【００６６】
重症敗血症以降に、Ｔｈ２サイトカインの水準が増加し、Ｔｈ１サイトカインの水準が減少し、これが損傷された細胞免疫力をもたらすだろう（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：Ｓ１２４〜Ｓ１２８， ２０００）。したがって、Ｔｈ１サイトカインの生産を増加させるためにデザインされた治療は腹膜炎以降重症敗血症の治療に有益であろう。自然殺害細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）および大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などの、先天性免疫細胞およびＴｈ１細胞がＩＦＮ−γを分泌する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｇ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：１７〜２３， １９９７）。微生物に対する防御のためのＩＦＮ−γの特性は食細胞殺菌活性の刺激、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子を通した抗原提示の刺激、および白血球−内皮相互作用の結合を含む（Ｄｉｇｈｅ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ３：６５７〜６６６， １９９５）。重症敗血症はＩＦＮ−γ生産を低くめる調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）をする（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：Ｓ１２４〜Ｓ１２８， ２０００）。ある臨床研究は再結合ＩＦＮ−γを投与した敗血症患者が向上した臨床経過を示したことを立証した（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １５７：３８９〜３９３， １９９７）。実験結果は敗血症のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍとＦＰＲ活性化に起因した増加されたＩＦＮ−γ生産を示す。さらに、ＦＰＲ活性化は抗原を不活性化させるためにＴｈ１細胞の増殖を増進させたが、Ｔｈ２細胞増殖を阻害した。これと対照的に、ＦＰＲ活性化の効果はＩＦＮ−γ欠乏のマウスで部分的に逆転された。生存効果はＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内細菌コロニー数と陽の連関を示した。これはＦＰＲ活性化の生存および殺菌効果はＦＰＲ活性化以降ＩＦＮ−γ生産に部分的に依存するということを提示する。
【００６７】
〔実施例６〕
〔ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果は前炎症性サイトカインの下降調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に直接的に関連する〕
マウスの好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）（３×１０６細胞／０．３ｍｌ）を２４−ウェルのプレート内５％のＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ １６４０培地に置き、５％のＣＯ２培養機内で３７℃で維持した。その後、前記好中球をＷＫＹＭＶｍ（０．１および１μＭ）の存在または不存在下で、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）とそれぞれ３時間および６時間培養した。
【００６８】
３０分後に前記細胞にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を追加し、無細胞上澄み液（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収集し、遠心分離した後、製造会社の方法によりＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αを測定した。
【００６９】
前炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦ−γの水準はＷＫＹＭＶｍ投与されたＣＬＰ−誘導ＷＴマウスの腹膜液内で顕著に減少した。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。ａ，ＩＬ−１β；ｂ，ＴＮＦ−α。実験結果は平均±標準誤差で示す（ｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５であった（ａ、ｂ）。
【００７０】
かかる下降調節が前炎症性サイトカインの生産に対するＷＫＹＭＶｍの直接的な阻害効果によって発生されたかを測定するために、腹膜内に６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを投与した後、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）前炎症性サイトカインの生産を測定した。ＬＰＳの投与後４時間目にＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのプラズマ水準（ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌ）はＰＢＳを投与したマウスに比べて、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍを投与したマウスで顕著に減少した。ＬＰＳの６０ｍｇ／ｋｇを腹膜内に注射した後２時間目であるマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した；４時間後にプラズマを収集した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのプラズマ水準を測定した。
【００７１】
また、マウスの好中球からＬＰＳ−誘導ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの試験管内放出はＷＫＹＭＶｍの投与量に依存して阻害された（図６Ｄ）。マウスの好中球は３０分間のＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（０．１および１μＭ）と前培養し、その後３時間の間、ＰＢＳまたはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの水準をＥＬＩＳＡで測定した（ｄ）。実験結果は平均±標準誤差で示す（ｃ、ｄでｎ＝１６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００７２】
敗血症に伴う免疫力の下降調節はリンパ球自滅死の進行と関連する；したがって、敗血症−誘導リンパ球自滅死の阻害は良い治療標的である。実際に、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は脾臓内免疫細胞の自滅死を阻害した。最近の証拠はＩＦＮ−γが脾臓内抗原特異的Ｔｈ１細胞で自滅死を誘導すると報告する（Ｂｅｒｎｅｒ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：３５４〜３６０， ２００７）。実験的結果はまた、脾臓内免疫細胞自滅死はＩＦＮ−γに依存的であるということを示す。かかる発見は再結合ＩＦＮ−γで敗血症を治療することは、ＩＦＮ−γの治療効果を落とす副作用を誘発するということと、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化がより優れた治療的な接近法であるかもしれないということを提示する。
【００７３】
如何なる環境下で、感染に対する多くの先天性免疫反応は複合的な器官不全（重症敗血症の臨床的な特徴）をもたらす細胞および組織損傷を誘発することができる。組織食細胞による微生物分子の認知は感染された組織へ血流を増加させ、局所血管（ｌｏｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ）の透過性を向上させ、感染部位へ炎症性細胞を集める伝染症因子の生産または放出を触発する。その結果は、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が急性炎症に起因した生命器官障害と関連した、ＣＬＰで誘導されたＩＬ−１βおよびＴＮＦ−γを含むいくつかの前炎症性サイトカインの生産を阻害することを示す。また、試験管内および生体内実験はＦＰＲ活性化がＬＰＳ−誘導前炎症性サイトカインの生産を阻害することを示す。かかる発見はＦＰＲ活性化が前炎症性サイトカインの生産の直接的な阻害を通して急性炎症を予防した上で、治療効果を発揮することを提示する。これは敗血症治療においてＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化がそれぞれの前炎症性因子を防ぐよりはるかに優れていることを示す。
【００７４】
〔実施例７〕
〔ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果はＩＬ−１７−媒介経路に依存的である〕
ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ後４時間目にすでに腹膜液内ＩＬ−１７の水準を増加させた（図７Ａ）。ＷＫＹＭＶｍの投与はまた、ＣＬＰ後８および１２時間目からＩＬ−１０およびＴＧＦ−をそれぞれ増加させた（図７Ｂおよび図７Ｃ）。ＦＰＲ活性化による向上した生存効果におけるＩＬ−１７の役割を調査するために、ＣＬＰのモデルをＩＬ−１７欠乏およびＷＴ統制のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景）に適用した。本研究はＷＫＹＭＶｍ投与で向上された生存はＩＬ−１７−欠乏のマウスで部分的に逆転されたことを示した（図７Ｄ）。ＦＰＲ活性化の抗炎症効果におけるＩＬ−１７の役割側面から、ＷＴのマウスでＷＫＹＭＶｍによって阻害された肺のＷ／Ｄ重量比はＩＬ−１７欠乏のマウスでは観測されなかった（図７Ｅ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを含む免疫調節剤、および重症敗血症、急性呼吸不全症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＲＤＳ）などの免疫関連疾患を予防または治療するための薬学組成物および方法、そして抗炎症剤、抗菌剤または免疫細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤に関するペプチド用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＰＲは好中球、単球、マクロファージおよび樹枝状細胞などの食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌ）で発見される伝統的な化学走性物質の受容体として、Ｇ−蛋白質と結合する。３種類のＦＰＲ（ＦＰＲ、ＦＰＲ−類似（ＦＰＲＬ）１、およびＦＰＲＬ２）と２種類のＦＰＲ（ヒトのＦＰＲに対応するＦＰＲ１、およびヒトのＦＰＲＬ１に対応するＦＰＲ２）がヒトおよびマウスでそれぞれ同定された。ＦＰＲファミリーの一員の活性化は白血球の化学走性による移動を誘導し、好中球および単球でスーパーオキサイド陰イオンの生成を通して殺菌活性を誘導する。食細胞で化学走性による移動を促進することができる合成ペプチドであるＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー（マウスでＦＰＲ１およびＦＰＲ２、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２）の一員に試験管内で結合し、スーパーオキサイド陰イオンの生成を通して単球および好中球の殺菌活性を増加させる。ＷＫＹＭＶｍはまた、自滅死を防止することによって単球の生存率を向上させると報告された（非特許文献１）。したがって、かかる実験は微生物感染後、重症敗血症への進行でＦＰＲ作動剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であるＷＫＹＭＶｍの治療効果および機能的メカニズムを研究し、かかる根拠は敗血症−誘導致死率の主要原因は制御されていない細菌感染であり、ＦＰＲ活性化が免疫細胞および炎症細胞の殺菌活性を増加させるという考えに基づいたものである。
【０００３】
最近の研究によれば、敗血症−誘導致死は初期敗血症（つまり、最初６時間）の間に先天的免疫システムの実質的な損傷により炎症反応の調節能がないのが伴われる。また、敗血症の間に過度なリンパ球の自滅死の結果で多くの器官破壊の臨床的兆候が現れる。さらに、最近の研究によれば、サイトカインの水準が敗血症の間に急激に変化し、特にＴＮＦ−α ａｎｄ ＩＬ−１βなどの前炎症性サイトカインの水準が急激に増加する。かかる考察は、重症敗血症または敗血症ショックによる致死を効果的に防止するためには、食細胞の殺菌活性を増加させ、前炎症性調節者の生成を阻害し、抗原−特異的後天性免疫反応を延長させる薬品が必要である。
【０００４】
重症敗血症または敗血症ショックを有する多くの患者は積極的な治療にもかかわらず死ぬ。重症敗血症を予防する一つの方法は、エンドトキシンの中和であるが、かかる治療的介入の目標は逆説的である（非特許文献２）。プラセボ対照臨床試験で、エンドトキシンに対する単クローン抗体は重症グラム−陰性バクテリア敗血症を病む患者の死を止めることができなかった（非特許文献３）。微生物磁極源に関係なく炎症を治療するための他の付属治療法、例えば、直間接的に炎症調節者（血小板活性化因子の拮抗筋（非特許文献４）、再結合ＩＬ−１β受容体の拮抗筋（非特許文献５）、ＴＮＦ−αに対する遺伝的に製造された水溶性受容体、およびＴＮＦ−αに対する単クローン抗体）の活性を遮断する治療法は、重症敗血症または敗血症ショックを有する患者の死を止めることができなかった（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ７１：３２９〜３３８， ２００２
【非特許文献２】Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ， Ｎ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：５１７〜５２４
【非特許文献３】Ｃｏｈｅｎ， Ｊ． Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５５：２１２〜２２５， １９９９
【非特許文献４】Ｄｈａｉｎａｕｔ， Ｊ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：１９６３〜１９７１， １９９８
【非特許文献５】Ｆｉｓｈｅｒ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ． ２７１：１８３６〜１８４３， １９９４
【非特許文献６】Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ， Ｎ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：５１７〜５２４， ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＬＰで敗血症を誘導した後に、ＷＫＹＭＶｍでＦＰＲを活性化させ、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、ＩＬ−１７生産の増加（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によって部分的に調節される前炎症性調節者の生産を減少させた（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）抗炎症活性効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通してマウスで効果的にＣＬＰ−誘導致死を防止する。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染後、重症敗血症への進行を効果的に防止する。したがって、ＦＰＲ活性化は、敗血症治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。
【０００７】
本発明の発明者らは、トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）によるホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）の活性化が死から保護し、肺炎症を阻害し、免疫細胞自滅死を防止し、殺菌活性を増加させることを糾明して本発明を完成した。
本発明の目的は、配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を含有する薬学組成物であって、急性呼吸不全症（ＡＲＤＳ）または重症敗血症を予防または治療するための薬学組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害する、前記免疫調節剤を含有する薬学組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を対象に治療学的有効量で投与することを含む対象の免疫反応を調節する方法を提供することにある。かかる方法における免疫反応の調節は、抗炎症反応、抗菌反応、免疫細胞自滅死阻害、または重症敗血症またはＡＲＤＳの予防または治療に関連する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
後述する詳細な説明で本明細書の一部分である図面を参照して説明する。図面において、類似する符号は文脈上異なって指示しない限り、通常類似する構成要素を意味する。詳細な説明で記述された実施例、図面、および請求の範囲は制限されるのを意味しない。本明細書で提示された主題の範囲または精神を逸脱しない他の具現例が活用されることができ、他の変形が可能である。
【００１２】
本発明の一例は、配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を提供するものである。本発明のさらに他の一例は、ＷＫＹＭＶｍのアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を対象に治療学的有効量で投与することを含む対象の免疫反応を調節する方法に関するものである。
【００１３】
ＷＫＹＭＶｍペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）およびホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）、およびヒトではＦＰＲ、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２に結合して活性化させることによって、対象で免疫反応を調節する。ＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー受容体に結合すると報告されたため、他のＦＰＲリガンドに対する治療効果を評価したが、ＷＫＹＭＶｍペプチドは治療効果がなかった（図１Ｇ）。
【００１４】
また、前記ペプチドは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子ＴＮＦ−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインの発現を減少させ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのＴｈ１サイトカインの発現を増加させる。前記ペプチドは、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の発現を増加させ、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはＩＬ−１０などの抗炎症サイトカインの発現を増加させる。
【００１５】
ＷＫＹＭＶｍペプチドは、前炎症性サイトカインの生産が減少するように調節し、ＦＰＲ活性化は、前炎症性サイトカインの生産の直接的阻害を通して急性炎症を防止することによって治療効果を現わすため、ＷＫＹＭＶｍは抗炎症剤として使用される。
【００１６】
本発明によれば、免疫反応の調節はまた、免疫細胞の自滅死を阻害することを含む。
【００１７】
ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、腹膜液から細菌の除去に影響を与え、向上された細菌除去と関連のあるＨ２Ｏ２の生産を向上させる。したがって、ＷＫＹＭＶｍペプチドは抗菌剤として使用される。ＣＬＰで敗血症を誘導した後ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、ＩＬ−１７生産の増加（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によって部分的に調節される前炎症性調節者の生産を減少させた（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）抗炎症活性効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通して、マウスでＣＬＰ−誘導致死を効果的に防止する。ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）によるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染以降に重症敗血症へ進行されることを効果的に防止する。したがって、ＦＰＲ活性化は重症敗血症および急性呼吸不全症の治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。ＷＫＹＭＶｍペプチドの抗炎症剤、抗菌剤、または免疫細胞自滅死の阻害剤は、炎症性サイトカインの発現減少およびＴｈ１サイトカインの増加による、重症敗血症の予防および治療効果と主に関連する。また、ＩＬ−１０、およびＴＦＧ−βおよびＩＬ−１０抗炎症サイトカインなどの抗炎症サイトカインのＷＫＹＭＶｍペプチドによる発現増加のような免疫調節活性は主にＡＲＤＳ予防および治療と関連する。
【００１８】
ＷＫＹＭＶｍペプチドとは異なり、ＷＫＹＭＶｍ類似体であるＷＲＹＭＶｍ（配列番号２）、ＷＫＷＭＶｍ（配列番号３）、ＷＫＲＭＶｍ（配列番号４）、ＷＫＦＭＶｍ（配列番号５）、ＷＨＹＭＶｍ（配列番号６）、ＷＫＹＭＹｍ（配列番号７）、ＷＫＹＭＦｍ（配列番号８）、ＷＫＹＭＷｍ（配列番号９）、ＷＫＹＭＶＶ（配列番号１０）、またはＷＫＥＭＶｍ（配列番号１１）は、実験的敗血症に対して治療効果がない（図１Ｈ）。
【００１９】
好ましくは、ＷＫＹＭＶｍペプチドはヒトで０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ、より好ましくは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙを投与することができる。前記投与量の範囲で、ＷＫＹＭＶｍペプチドはＷＫＹＭＶｍ類似体よりＣＬＰのマウスのモデルでより優秀な治療効果を現わす。
【００２０】
前記ＷＫＹＭＶｍペプチドを活性成分として含む組成物は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロールおよびエタノールからなる群より選択された１種以上の薬学的担体を含むことができ、前記担体は前記例示した担体に限定されない。
【００２１】
前記活性成分は多様な関連因子を考慮して投与量を決定することができ、前記関連因子は治療状態、患者の症状の深刻性、他の薬品との併用投与（例えば、化学療法剤）、年齢、性別、個々の患者別体重、食べ物、投与時間、選択された投与経路、および組成物の含量などを含む。前記組成物は１日に１回または１〜３回で分割投与することができ、疾患の種類および重症度を考慮して投与経路および投与量を決定することができるが、好ましくは、１２時間の間隔で１日２回投与することができる。
【００２２】
本発明によるペプチドを含む前記組成物は、経口または非経口投与することができる。非経口投与は口以外の経路を通して薬品を投与することで、直腸、静脈、腹膜内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入、目および皮下で投与することができる。
前記ペプチドを含む薬学製剤は、経口投与形態、注射液、または局所製剤などのような如何なる形態にも製造することができる。前記製剤は、好ましくは、経口および注射投与形態（真溶液、懸濁液またはエマルジョン）に製造されることができ、最も好ましくは、タブレット（ｔａｂｌｅｔ）、カプセル、軟質カプセル、受容製剤、ピル（ｐｉｌｌ）、顆粒などのような経口製剤であってもよい。
【００２３】
前記製剤を製造することにおいて、前記ペプチドは賦形剤なく軟質カプセルに充填されたり、担体と混合または希釈された後に適切な製剤形態に製造されることができる。前記適切な担体の例としては、デンプン、水、食塩水、リンゲル液、デキストロースなどがある。
【００２４】
ＣＬＰ敗血症誘導後、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、食細胞の直接的および／またはＩＦＮ−γ−媒介殺菌活性化経路、前炎症性調節者の生産を減少させること（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を通した抗炎症効果、および免疫細胞における抗−自滅死効果などの多重治療経路を通して、マウスでＣＬＰ−誘導致死を効果的に防止することができる。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、多重経路を通して微生物感染後、重症敗血症への進行を効果的に防止することができる。したがって、ＦＰＲ活性化は、敗血症の治療のための新たな且つ効果的な治療標的になり得る。
【００２５】
集中治療室で死亡の主要原因である重症敗血症は宿主の免疫反応が侵入した微生物との戦いに失敗する時に起きる。ＷＫＹＭＶｍペプチドによるホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）活性化は、盲腸結紮および穿孔（ＣＬＰ）敗血症のマウスのモデルで死から保護し、肺炎症を防止し、免疫細胞自滅死を遮断し、殺菌活性を増加させる。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でマウスの好中球によるＨ２Ｏ２生成および殺菌活性を増加させる。ＦＰＲ活性化はまた、ＣＬＰのマウスでＩＦＮ−γの生産を増加させる。ＦＰＲ活性化の治療および殺菌効果（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔ）はＩＦＮ−γ欠乏のマウスで部分的に逆転される反面、標的器官の炎症がない。これと対照的に、ＦＰＲ活性化は、ＣＬＰのマウスでＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの生産を阻害する。さらに、ＦＰＲ活性化はグラム−陰性バクテリアで主な病原体−関連分子パターンであるＬＰＳに誘導された前炎症性調節者の生産を阻害する。最後に、ＦＰＲ活性化は、ＣＬＰ−誘導免疫細胞自滅死を阻害し、かかる活性はＣＬＰ−誘導ＩＦＮ−γ欠乏のマウスでは発生しない。かかる実験結果によれば、ＦＰＲ活性化が多重経路を通して、微生物の感染後、重症敗血症へ進行されることを効果的に防止することを提示する。
【００２６】
敗血症に伴う免疫性の減少調節（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）はリンパ球自滅死の進行と関連する。したがって、敗血症−誘導リンパ球自滅死の阻害は良い治療標的になり得る。ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は優れた治療接近法になり得る。試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験によれば、ＦＰＲ活性化はＬＰＳ−誘導前炎症性サイトカインの生産を阻害する。かかる発見は、ＦＰＲ活性化が前炎症性サイトカインの生産の直接的な阻害を通して急性炎症反応を防止することによってその治療的効果を現わすということを提示する。したがって、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は敗血症治療において個別の前炎症性調節者を効果的に遮断することができる。
【発明の効果】
【００２７】
前記で詳細に記述した通り、本発明によるＷＫＹＭＶｍまたはその類似体は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）およびＩＬ−６の発現減少、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、ＩＬ−２およびＩＬ−１２の発現増加および反応性酸素の生成増加、敗血症によって誘発される脾臓リンパ球（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）または胸腺細胞（ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ）の減少抑制などの効果を現わすため、敗血症の治療剤として作用することができて敗血症の予防または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｂ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｃ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｄ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｅ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｆ】動物のモデルで敗血症−誘導致死に対するＷＫＹＭＶｍの保護効果を示したものである。
【図１Ｇ】他のＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果を示したものである。
【図１Ｈ】他のＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍおよびＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果を示したものである。
【図２Ａ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｂ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｃ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図２Ｄ】ＣＬＰ−誘導細菌コロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図３Ａ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｂ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｃ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｄ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図３Ｅ】ＷＫＹＭＶｍがＨ２Ｏ２の生成を通して試験管内で殺菌活性を増加させることを示したものである。
【図４Ａ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｂ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｃ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｄ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｅ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図４Ｆ】Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデルで不活性抗原に対する反応としてＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および脾臓リンパ球の増殖に対するＷＫＹＭＶｍの効果を示したものである。
【図５Ａ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｂ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｃ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｄ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｅ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｆ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図５Ｇ】重症敗血症に対するＷＫＹＭＶｍ−誘導保護において、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの役割を示したものである。
【図６Ａ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｂ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｃ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図６Ｄ】炎症性サイトカインの生成の変化に与えるＷＫＹＭＶｍの役割を示したものである。
【図７Ａ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｂ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｃ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｄ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【図７Ｅ】ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果がＩＬ−１７媒介経路に依存的であることを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、実施例を通して本発明をより詳しく説明する。しかしながら、これら実施例は如何なる方式でも本発明の範囲を制限するものと解釈されてはいけない。
【００３０】
〔実施例１〕
〔１−１．ＣＬＰのマウスのモデルにおけるＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
前記論文に記述した通り（Ｙａｎ， Ｊ．Ｊ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０：１６１−１６７，２００４）、雄性のＷＴ ＩＣＲのマウスおよびＩＬ−１２Ｒ ２−、ＩＦＮ−γ−欠乏およびＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６のマウス（大韓民国、浦項工科大学教 Ｙ．Ｃ． Ｓｕｎｇから寄贈を受ける）を敗血症のモデルの動物として使用した。動物関連のすべての実験は東亜大学校の動物管理及び利用に関する臨床審議委員会のガイドラインに従い、その承認を受けた。ＣＬＰのために、マウスをペントタールナトリウム（腹膜内注入、５０ｍｇ／Ｋｇ）で麻酔させ、腹部正中線を若干切除して盲腸を露出させた。前記盲腸を回盲弁（ｉｌｅｏｃｅｃａｌ ｖａｌｖｅ）の下部を結紮した後、盲腸に２２ゲージの針で両面にわたって２度穿孔し（またはサイトカインの生産量の測定のために１度）腹部を縫合した。シャム（Ｓｈａｍ）ＣＬＰのマウスも前記方法と同様に行ったが、盲腸の結紮および穿孔を行わなかった。１０日間、１日１回生存率を観察した。
【００３１】
実験的敗血症に対するＷＫＹＭＶｍの治療効果を調査するために、アルビノＩＣＲ（癌研究センター、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスに対してもＣＬＰを行い、生存率を１０日まで観察した。ＣＬＰ後２日目、マウスの致死率が急激に増加した（図１Ａ）。ＣＬＰ手術後、２、１４、２６、および３８時間経過時に多様な濃度でＷＫＹＭＶｍをＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。
【００３２】
ＷＫＹＭＶｍの治療効果を調査するために、陰性対照群として多様な濃度のペプチドまたはＰＢＳをＣＬＰ後２時間から始めて皮下に注射した。ＰＢＳ投与群に比べて４または８ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍ投与群で顕著にマウスの生存率が増加した（図１Ａ）。ＣＬＰ遂行後１０時間目にＷＫＹＭＶｍを投与した場合、治療効果はＣＬＰ遂行後２時間目にペプチドを投与した場合と類似していた（図１Ｂ）。多様な濃度のＷＫＹＭＶｍを皮下に４回、ＣＬＰのマウスにＣＬＰ遂行後１０、２２、３４および４８時間目に投与した。
【００３３】
注射の頻度面において、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ遂行後２時間目に投与し、１２時間の間隔で３または４回追加投与した場合に生存率が大きく増加した（図１Ｃ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）を０、１、２、３、４、または５回ＣＬＰのマウスに注入した。前記結果から、以降の実験は、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ遂行後２時間目に投与し、１２時間の間隔で３回追加投与したＣＬＰのマウスを使用して行った。
【００３４】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の機能を評価するために、ＦＰＲ１拮抗剤［Ｎ−ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ）（配列番号１２）］（Ｌａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １５：２２４７〜２２５６）、およびＦＰＲ２拮抗剤［Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ；ＷＲＷＷＷＷ（ＷＲＷ４）（配列番号１３）］（Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：６０７〜６１４．）をＣＬＰのマウスにＷＫＹＭＶｍ投与前に投与した。ＷＲＷ４を先に投与した場合、ＷＫＹＭＶｍの治療効果は完全に逆転され、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰを先に投与した場合には部分的にのみ逆転された（図１Ｄ）。ＣＬＰを行う２時間前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）、ＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）＋ＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下で投与した。ＣＬＰを行った後に、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＷＲＷ４（４ｍｇ／ｋｇ）をＷＫＹＭＶｍ処理する（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）２時間前に１２時間の間隔で４回皮下投与した。
【００３５】
統計分析：生存データをｌｏｇ−ｒａｎｋテスト法で分析した。すべての他のデータはＡＮＯＶＡを使用して分析した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを使用して事後比較を行い、統計的有意性はＰ＜０．０５で先験的設定した。
【００３６】
〔１−２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接種のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
マウスに大腸菌（１×１０９細胞／マウス）を腹膜内投与した後、２、１４、２６、および３８時間にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。本実施例はまた、他の敗血症のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果を評価した。ＰＢＳを投与した大腸菌接種のマウスに比べて、大腸菌（１×１０９）を接種し接種後２時間目から始めて１２時間の間隔で４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍを４回皮下投与したマウスで致死率が減少した（図１Ｅ）。
【００３７】
〔１−３：ＬＰＳを注射したマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
さらに、ＷＫＹＭＶｍはまた、６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹膜内に注射したマウスの致死率を減少させた（図１Ｆ）。６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹膜内投与した後、２、１４、２６および３８時間目にＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下で４回注射した。実験結果は平均±標準誤差で示した。溶媒対照群（ａ〜ｇ）に比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、サンプルの大きさｎ＝１６〜２４（ａ〜ｅ）またはｎ＝８（ｆ、ｇ）マウス／グループである。
【００３８】
〔比較例１〕
〔１−１：ＦＰＲリガンドに対するＷＫＹＭＶｍの治療効果〕
ＷＫＹＭＶｍはＦＰＲファミリー受容体に結合するため、他のＦＰＲリガンドの治療効果も評価した。Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（ＷＫＹＭＶＭ）（配列番号１４）（Ｂａｅｋ， Ｓ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：８１７０〜８１７５）、Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＦ）（配列番号１５）、およびＭＭＫ−１ペプチド（ＬＥＳＩＦＲＳＬＬＦＲＶＭ）（配列番号１６）（Ｋｌｅｉｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１３３４〜１３３７）の治療効果はＷＫＹＭＶｍより低かった（図１Ｇ）。
【００３９】
また、不活性スクランブルペプチドであるＶａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（ＶＷＭＹｍＫ）（配列番号１７）は治療効果がなかった（図１Ｇ）。ＦＰＲ−ファミリー作用剤（ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）、ＷＫＹＭＶＭ（配列番号１４）、ｆＭＬＦ（配列番号１５）、およびＭＭＫ−１（配列番号１６））またはスクランブルペプチド（ＶＷＭＹｍＫ：配列番号１７）（それぞれ４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ遂行後２、１４、２６、および３８時間に４回皮下注射した。
【００４０】
〔１−２．ＷＫＹＭＶｍ類似体の治療効果〕
ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）の類似体、ＷＲＹＭＶｍ（配列番号２）、ＷＫＷＭＶｍ（配列番号３）、ＷＫＲＭＶｍ（配列番号４）、ＷＫＦＭＶｍ（配列番号５）、ＷＨＹＭＶｍ（配列番号６）、ＷＫＹＭＹｍ（配列番号７）、ＷＫＹＭＦｍ（配列番号８）、ＷＫＹＭＷｍ（配列番号９）、ＷＫＹＭＶＶ（配列番号１０）、およびＷＫＥＭＶｍ（配列番号１１）が実験的敗血症に対して治療効果があるかを検査するために、アルビノＩＣＲマウスにＣＬＰを行い、１０日まで生存率を観察した。ＣＬＰ遂行後２日目に、マウスの致死率を急激に増加した（図１Ｈ）。ＷＫＹＭＶｍまたはＷＫＹＭＶｍの各類似体４ｍｇ／ｋｇをＣＬＰ遂行後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した（図１Ｈ）。
【００４１】
〔実施例２〕
〔ＷＫＹＭＶｍによる生存増加はバクテリアコロニー数、脾臓リンパ球死滅および肺炎症の減少と関連する〕
〔２−１．殺菌活性〕
ＣＬＰ−誘導致死率が腹膜液内バクテリアコロニー数と相当に関連しているため、実験はＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が腹膜液から細菌の除去に影響を与えたかを調査した。ＷＫＹＭＶｍ投与はＣＬＰ後２４時間目に腹膜内バクテリアコロニー数を９９．８％まで急激に減少させた（図２Ａ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ後２および１４時間目に４回皮下注射した。シャム（Ｓｈａｍ）、ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後２４時間目に収集した腹膜洗浄液を血液寒天培地平板（ｂｌｏｏｄ−ａｇａｒ ｂａｓｅ ｐｌａｔｅｓ）上に３７℃で一晩中培養してコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）の数を測定した。
【００４２】
〔２−２．リンパ球自滅死の阻害〕
敗血症が広範囲なリンパ球自滅死を誘導するという観測から（Ａｙａｌａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２６１〜４２７５）、実験はまたＷＫＹＭＶｍが脾臓リンパ球死滅を予防することができるかを評価した。ＣＬＰ遂行後２４時間目に脾臓リンパ球死滅はＷＫＹＭＶｍ投与によって顕著に阻害された（図２Ｂ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）がＣＬＰ後２および１４時間目に投与され、脾臓リンパ球数をＩＣＲマウス内にＣＬＰ遂行後２４時間目に測定した。
【００４３】
〔２−３．抗炎症活性〕
敗血症後致死率は生命器官炎症と関連したと知られている。本発明者らはＰＢＳを投与したＣＬＰ−誘導マウス内に急性肺炎症の標識である、湿／乾（ｗｅｔ／ｄｒｙ、Ｗ／Ｄ）重量比が顕著に増加したことを発見し、またこの標識がＷＫＹＭＶｍ投与によって完全に逆転されたことを発見した（図２Ｃ）。肺浮腫の大きさは、従来記載された通り、肺のＷ／Ｄ重量比を測定して定量化した（Ｌｉｕ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ５４：４６４〜４７０）。獲得した全体湿潤肺（ｗｅｔ ｌｕｎｇｓ）の重量を測定し、オーブンに６０℃で４８時間置いた。その後、乾燥重量を測定し、Ｗ／Ｄ重量比を計算した。
【００４４】
ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）をＣＬＰ後２および１４時間後に投与し、ＩＣＲマウス内のＣＬＰ後２４時間目の肺のＷ／Ｄ重量比を測定した。実験結果は平均±標準誤差（ａ、ｂでｎ＝１６、ｃでｎ＝５）で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）をＣＬＰ後２時間および１４時間後に投与した。前記マウスは手術後２４時間目に死んだ。
【００４５】
また、組織学的分析はＣＬＰ−誘導肺炎症がＷＫＹＭＶｍによって完全に逆転されたことを示した（図２Ｄ）。前記肺はヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）（倍率、×１００）で染色した。実験結果はグループ当り８匹のマウスの見本である。マウスにＣＬＰ手術を行い、ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍを２時間後に４ｍｇ／ｋｇの量で投与した。マウスは手術後２４時間目に安楽死させ、肺を固定して切断し、形態学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００４６】
〔実施例３〕
〔ＷＫＹＭＶｍは食細胞内の細菌の除去および過酸化水素の生産を向上させる〕
ＷＫＹＭＶｍ投与が試験管内殺菌活性を増加させるかを測定するために、マウスの好中球が１時間の間に大腸菌を摂取するようにし、その後２０分間、０．１〜１０００ｎＭのＷＫＹＭＶｍで刺激した。これは投与量に依存して好中球の殺菌活性を顕著に向上させた（図３Ａ）。付着された好中球はオプソニン化された（ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ）大腸菌１０６と１時間培養し、溶媒（ＰＢＳ）またはＷＫＹＭＶｍ（０．１、１、１０、１００、および１０００ｎＭ）で１時間刺激した。
【００４７】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２が好中球内に現れたため（データに現れない）、この実験はＷＫＹＭＶｍ−誘導殺菌活性において、ＦＰＲ１−１およびＦＰＲ２−媒介された経路の役割を調査した。ＷＫＹＭＶｍ投与前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰまたはＷＲＷ４で前処理された好中球は殺菌活性を顕著に阻害した（図３Ｂ）。マウスの好中球を従来記載されたヒストペイク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）−１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ）で末梢血から分離した（Ｂａｅ， Ｙ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１：６８０７〜６８１３， ２００３）。ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を添加する３０分前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）＋ＷＲＷ４（１０μＭ）を添加した。その後、好中球内生菌の数を測定した。
【００４８】
食細胞の殺菌効果がＨ２Ｏ２の生産と関連しているため、（Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｍ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ９２：３００７〜３０１７）、マウスの好中球内Ｈ２Ｏ２の生成に対するＷＫＹＭＶｍの影響を測定した。ＷＫＹＭＶｍは１００〜１０００ｎＭで最大反応で好中球内Ｈ２Ｏ２の生産を向上させた（図３Ｃ）。マウスの好中球を１５分間溶媒（ＰＢＳ）またはＷＫＹＭＶｍ（１〜１０００ｎＭ）で刺激した。シャム、ＣＬＰ−、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ−投与されたマウスから分離した好中球を１００ｎＭのＰＭＡに１時間の間、刺激した。正常のマウスから新たに分離した好中球をサイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｂ（５μＭ）の存在下で多様な濃度のＷＫＹＭＶｍで１０分間刺激した。
【００４９】
ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の役割を調査するために、ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を１０分間添加する前に好中球をＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、または溶媒（ＤＭＳＯ）と３０分間前培養を行った。上澄み液内のＨ２Ｏ２はＨ２Ｏ２分析キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で測定した。
【００５０】
さらに、前記効果はＢｏｃ−ＰＬＰＬＰまたはＷＲＷ４で前処理することによって部分的に逆転された（図３Ｄ）。しかしながら、ＷＫＹＭＶｍ−誘導Ｈ２Ｏ２の生成はＦＰＲ１＋ＦＰＲ２拮抗剤に前処理することによって完全に逆転された（図３Ｄ）。ＷＫＹＭＶｍ（１００ｎＭ）を添加する５分前にＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、またはＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）＋ＷＲＷ４（１０μＭ）を添加した。
【００５１】
前記テストはＣＬＰ−誘導マウスから由来した好中球がＰＭＡに応じて Ｈ２Ｏ２を生産することに失敗したことを発見した（図３Ｅ）。しかしながら、ＷＫＹＭＶｍが投与されたＣＬＰ−誘導のマウスから由来した好中球内ではそれが投与されないものに比べてＨ２Ｏ２の生産が顕著に向上された（図３Ｅ）。ＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰ後２時間および１４時間目にＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。ＣＬＰ後２４時間目に腹膜内好中球を分離した。シャム、ＣＬＰ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍマウスから分離した好中球をＰＭＡ（１００ｎＭ）で３０分間刺激した。実験結果は平均±標準誤差（ａ、ｂでｎ＝８；ｃ〜ｅでｎ＝１６）で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５２】
好中球の殺菌活性は、Ｙａｎ、 Ｊ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０：１６１〜１６７， ２００４．の方法により測定した。好中球は６０−ｍｍプラスチック培養ディッシュ（１×１０６好中球／カバースリップ）内の１３−ｍｍプラスチックカバースリップ上で１時間の間、３７℃で培養した。付着されない細胞はＰＢＳで隔離した。付着された好中球はオプソニン化された大腸菌１０６と１時間の培養した。貪食されない大腸菌を洗浄した後、いくつかの濃度のＷＫＹＭＶｍまたは溶媒との１時間の培養前および後に好中球内生菌数を測定した。死菌の比率は１００×（１−ＷＫＹＭＶｍの刺激後のＣＦＵ数／ＷＫＹＭＶｍの刺激前のＣＦＵ数）で計算した。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２の役割を調査するために、ＷＫＹＭＶｍ（１μＭ）を１時間の間、添加する前に好中球をＢｏｃ−ＰＬＰＬＰ（１０μＭ）、ＷＲＷ４（１０μＭ）、または溶媒（ＤＭＳＯ）と３０分間の前培養した。
【００５３】
初期宿主−細菌の相互作用によって、先天的免疫体系の広範囲な活性化が行われ、これは宿主防御反応を調整する。食細胞を含む核心防御機作の一つは反応性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）および酸化窒素などの細胞内毒性調節者（ｔｏｘｉｃ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）の合成である。実験的結果はＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が、向上された細菌の除去と関連したＨ２Ｏ２の生産を向上させたことを明確に示す。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２はＷＫＹＭＶｍに対する受容体として知られている。ＦＰＲ１およびＦＰＲ２に対する拮抗剤は好中球内ＷＫＹＭＶｍ−誘導Ｈ２Ｏ２の生産を顕著に阻害した。かかる結果はＷＫＹＭＶｍで向上された生存は食細胞の殺菌効果と関連し、これはＦＰＲ１およびＦＰＲ２によって媒介されることを提示する。かかる実験的結果はまた、ＷＫＹＭＶｍで向上された生存は完全にＦＰＲ２経路に依存し、ＦＰＲ１経路には単に部分的にのみ依存するということを示す。したがって、ＷＫＹＭＶｍは食細胞の直接的な殺菌活性での役割以外に付加的な効果を有し、これは恐らくＦＰＲ２によって媒介される。
【００５４】
〔実施例４〕
〔ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死を阻害し、不活性抗原に反応してＴｈ１細胞の増殖を向上させる〕
〔４−１．Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスで脾臓リンパ球の増殖の分析〕
Ｔｈ１およびＴｈ２のマウスのモデル（図４Ｂ）を作るために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスを７５μｇのＯＶＡ＋１０μｇのＬＰＳまたは２ｍｇの明礬（ａｌｕｍ）で０および７日目に腹膜内２回免疫させ、その後５０μｇのＯＶＡで１４、１５、および１６日目に腹膜内免疫性検査を行った。分離された脾臓リンパ球をＯＶＡと培養または培養せずに細胞増殖分析を行った。要約すれば、脾臓リンパ球はＲＰＭＩ １６４０培地で収穫し、９６ウェルのフラットボトムプレート（９６−ｗｅｌｌ ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅｓ）で３７℃で９６時間、培地のみ、あるいは５、５０または５００μｇのＯＶＡ／ｍｌと培養した（２×１０５細胞／ウェル）。前記実施例は１μＣｉ［３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅと７２時間培養期間後に細胞のチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）挿入を測定した。
【００５５】
ＣＬＰ−誘導敗血症は脾臓リンパ球自滅死を起こした；しかしながら、かかる作用はＷＫＹＭＶｍによって非常に効果的に阻害された（図４Ａ）。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウスにＣＬＰ後２および１４時間目に４回皮下注射した。シャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍの投与後２４時間目に収集した脾臓をＴＵＮＥＬ分析（上部）（倍率、×４００）に使用した。ＴＵＮＥＬ−陽性細胞を計数した（下部）。ＴＵＮＥＬ分析は標準組織学的プロトコルを使用して最初に脱パラフィン化されたパラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ）組織切片をもって行った。その後、前記切片を４℃で２分間のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で透過し、ＴｄＴ酵素およびジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）−ｄＵＴＰ反応バッファー（ＴＵＮＥＬ）試薬で３７℃で６０分間満たした。死滅細胞（ＴＵＮＥＬ−陽性細胞）の比率を光学顕微鏡下で脾臓リンパ球５００個を計数して測定した。
【００５６】
従来の文献はリンパ球自滅死がカスパーゼ−３（ｃａｓｐａｓｅ−３）を含むいくつかの重要なカースパー剤によって媒介されるということを明らかにした（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ， Ｒ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２７：１２３０〜１２５１， １９９９）。これと類似して、ＣＬＰ−誘導敗血症はカスパーゼ−３の活性化を増進させた反面、ＷＫＹＭＶｍは非常に効果的にそれを阻害した（図４Ｂ）。（ａ）に表示されたマウスから由来した脾臓は分離されたカスパーゼ−３（ｃｌｅａｖｅｄ−ｃａｓｐａｓｅ−３）抗体と免疫組織化学に使用した（倍率、×１００）。実験結果はグループ当り８匹のマウスの見本である（ａ、ｂ）。本実施例は標準組織学的プロトコルを使用して最初に脱パラフィン化されたパラフィン包埋組織切片で免疫組織化学を行った。
【００５７】
分離されたカスパーゼ−３に対する１次抗体と培養した後に（細胞信号（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））、蛍光色素と結合された２次抗体を有するすべての切片を染色した。
【００５８】
ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ後２４時間目に腹膜液内ＩＬ−２の量を増加させた（図４Ｃ）。ＩＬ−２がＴ−細胞増殖を促進するため（Ｂｅｎｃｚｉｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｎｖｅｓｔ． ３３：１０９〜１４２）、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化のＴｈ１およびＴｈ２細胞増殖に対する効果を不活性抗原を使用して測定した。
【００５９】
ＣＬＰ後２、１４、２６および３８時間目にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。実験結果は平均±標準誤差で示した（ｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった。Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスは脾臓内にＴｈ１およびＴｈ２細胞らを作り出すためにそれぞれＬＰＳまたは明礬にＯＶＡを添加して腹膜内を免疫化させた（図４Ｄ）。
【００６０】
以下、Ｔｈ１およびＴｈ２マウス（図４Ｄ）のためのプロトコルを記載した。ＯＶＡ＋ＬＰＳ（ｅ）またはＯＶＡ＋明礬（ｆ）で免疫化されたマウス内ＯＶＡで培養後７２時間目に脾臓リンパ球増殖した。実験結果は平均±標準誤差で示し（ｅ、ｆでｎ＝５）、＊はＯＶＡ＋ＰＢＳグループに比べて、Ｐ＜０．０５であることを示し；＊＊は他のグループに比べて、Ｐ＜０．０５であることを示す。Ｔｈ１のマウスのモデルで、脾臓リンパ球増殖は７２時間後にシャム−投与マウスに比べて、ＷＫＹＭＶｍ−投与マウスでは増進されたが、Ｂｏｃ−ＰＬＰＬＰ−またはＷＲＷ４−投与マウスでは阻害された（図４Ｅ）。これと対照的に、Ｔｈ２のモデルでは、脾臓リンパ球の増殖が７２時間後にシャム−投与マウスに比べて、ＷＫＹＭＶｍ−投与マウスでは阻害され、拮抗剤−投与マウスでは増進された（図４Ｆ）。
【００６１】
〔実施例５〕
〔ＷＫＹＭＶｍの効果はＩＦＮ−γ−媒介経路に部分的に依存する〕
本発明者らはＷＫＹＭＶｍがＣＬＰ後２４時間目に腹膜液内ＩＬ−１２の水準を増加させたことを確認した（図５Ａ）。反面、腹膜液内ＩＦＮ−γの水準はＣＬＰ後８および２４時間目に増加した（図５Ｂ）。ＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。その後、腹膜液内に存在するサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した。
【００６２】
分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。ａ，ＩＬ−１２；ｂ，ＩＦＮ−γ；実験結果は平均±標準誤差で示す（ａ、ｂでｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった。腹膜洗浄液内ＣＬＰ−誘導サイトカインを測定するために、マウスにＷＫＹＭＶｍをＣＬＰ後２、１４、２６および３８時間目に投与した。腹膜洗浄液をＣＬＰ後４時間から７２時間の間の多様な時間帯に収集し、腹膜液内存在するサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した。
【００６３】
敗血症以降ＷＫＹＭＶｍ−誘導生存に対するＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ）の役割を調査するために、ＣＬＰのモデルをＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景）に適用させた。ＣＬＰ−誘導致死率はＷＫＹＭＶｍを投与したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスで顕著に減少したが（図５Ｃ）、その効果はＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏マウスで部分的に逆転された（図５Ｃおよび図５Ｄ）。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏のマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。図５Ｄで、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＦＮ−γ−欠乏のマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウスに４回皮下注射した。実験結果は平均±標準誤差で示す。溶媒に比べて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１であった（ｃ、ｄ）。ｎ＝グループ当り１０〜１６マウス（ｃ、ｄ）
【００６４】
本実験はＷＫＹＭＶｍ−誘導生存がＴｈ１サイトカイン−媒介経路に部分的に依存したという発見に基づいて、殺菌活性、標的器官炎症および脾臓リンパ球自滅死もＴｈ１サイトカイン−依存的であるかを測定した。腹膜液内細菌コロニー数はＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴのマウスに比べてＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＩＦＮ−γ−欠乏のマウスでより高かった（図５Ｅ）。ＣＬＰ後２および１４時間目にＣＬＰのマウスにＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後２４時間目に収集した腹膜洗浄液を３７℃で血液寒天培地平板上に一晩中培養してＣＦＵの数を測定した。
【００６５】
これと対照的に、Ｗ／Ｄ重量比はＰＢＳを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴ、ＩＬ−１２Ｒ ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウスでより高かったが、この効果はＷＫＹＭＶｍを投与したＣＬＰ−誘導ＷＴ、ＩＬ−１２Ｒβ２−およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウスで完全に逆転された（図５Ｆ）。Ｃ５７ＢＬ／６、ＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏およびＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内ＣＬＰ後２４時間目にＷ／Ｄ重量比を測定するために肺を使用した。面白いことに、ＩＬ−１２Ｒβ２−欠乏のマウス内ＣＬＰで誘導され、ＷＫＹＭＶｍで逆転されたにもかかわらず、ＣＬＰ−誘導脾臓リンパ球自滅死はＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内で観測されなかった（図５Ｇ）。ＣＬＰ後２および１４時間目にＣＬＰのマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を４回皮下注射した。シャム、ＣＬＰまたはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍ投与後、２４時間目に収集された脾臓をＴＵＮＥＬ分析（左側）（倍率、×４００）に使用した。ＴＵＮＥＬ−陽性細胞を計数した（右側）。実験結果は平均±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１であった（ｅ〜ｇでｎ＝８）。
【００６６】
重症敗血症以降に、Ｔｈ２サイトカインの水準が増加し、Ｔｈ１サイトカインの水準が減少し、これが損傷された細胞免疫力をもたらすだろう（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：Ｓ１２４〜Ｓ１２８， ２０００）。したがって、Ｔｈ１サイトカインの生産を増加させるためにデザインされた治療は腹膜炎以降重症敗血症の治療に有益であろう。自然殺害細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）および大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などの、先天性免疫細胞およびＴｈ１細胞がＩＦＮ−γを分泌する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｇ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：１７〜２３， １９９７）。微生物に対する防御のためのＩＦＮ−γの特性は食細胞殺菌活性の刺激、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子を通した抗原提示の刺激、および白血球−内皮相互作用の結合を含む（Ｄｉｇｈｅ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ３：６５７〜６６６， １９９５）。重症敗血症はＩＦＮ−γ生産を低くめる調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）をする（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２６：Ｓ１２４〜Ｓ１２８， ２０００）。ある臨床研究は再結合ＩＦＮ−γを投与した敗血症患者が向上した臨床経過を示したことを立証した（Ｋｏｘ， Ｗ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １５７：３８９〜３９３， １９９７）。実験結果は敗血症のマウスのモデルでＷＫＹＭＶｍとＦＰＲ活性化に起因した増加されたＩＦＮ−γ生産を示す。さらに、ＦＰＲ活性化は抗原を不活性化させるためにＴｈ１細胞の増殖を増進させたが、Ｔｈ２細胞増殖を阻害した。これと対照的に、ＦＰＲ活性化の効果はＩＦＮ−γ欠乏のマウスで部分的に逆転された。生存効果はＩＦＮ−γ−欠乏のマウス内細菌コロニー数と陽の連関を示した。これはＦＰＲ活性化の生存および殺菌効果はＦＰＲ活性化以降ＩＦＮ−γ生産に部分的に依存するということを提示する。
【００６７】
〔実施例６〕
〔ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果は前炎症性サイトカインの下降調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に直接的に関連する〕
マウスの好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）（３×１０６細胞／０．３ｍｌ）を２４−ウェルのプレート内５％のＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ １６４０培地に置き、５％のＣＯ２培養機内で３７℃で維持した。その後、前記好中球をＷＫＹＭＶｍ（０．１および１μＭ）の存在または不存在下で、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）とそれぞれ３時間および６時間培養した。
【００６８】
３０分後に前記細胞にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を追加し、無細胞上澄み液（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収集し、遠心分離した後、製造会社の方法によりＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αを測定した。
【００６９】
前炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦ−γの水準はＷＫＹＭＶｍ投与されたＣＬＰ−誘導ＷＴマウスの腹膜液内で顕著に減少した。ＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）をＣＬＰ後２、１４、２６、および３８時間目にＣＬＰのマウス内に４回皮下注射した。分離された動物グループにシャム、ＣＬＰ＋ＰＢＳ、またはＣＬＰ＋ＷＫＹＭＶｍを投与した。ａ，ＩＬ−１β；ｂ，ＴＮＦ−α。実験結果は平均±標準誤差で示す（ｎ＝８）。ＣＬＰ＋ＰＢＳに比べて、＊Ｐ＜０．０５であった（ａ、ｂ）。
【００７０】
かかる下降調節が前炎症性サイトカインの生産に対するＷＫＹＭＶｍの直接的な阻害効果によって発生されたかを測定するために、腹膜内に６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを投与した後、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）前炎症性サイトカインの生産を測定した。ＬＰＳの投与後４時間目にＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのプラズマ水準（ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌ）はＰＢＳを投与したマウスに比べて、４ｍｇ／ｋｇのＷＫＹＭＶｍを投与したマウスで顕著に減少した。ＬＰＳの６０ｍｇ／ｋｇを腹膜内に注射した後２時間目であるマウス内にＷＫＹＭＶｍ（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した；４時間後にプラズマを収集した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのプラズマ水準を測定した。
【００７１】
また、マウスの好中球からＬＰＳ−誘導ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの試験管内放出はＷＫＹＭＶｍの投与量に依存して阻害された（図６Ｄ）。マウスの好中球は３０分間のＰＢＳまたはＷＫＹＭＶｍ（０．１および１μＭ）と前培養し、その後３時間の間、ＰＢＳまたはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの水準をＥＬＩＳＡで測定した（ｄ）。実験結果は平均±標準誤差で示す（ｃ、ｄでｎ＝１６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００７２】
敗血症に伴う免疫力の下降調節はリンパ球自滅死の進行と関連する；したがって、敗血症−誘導リンパ球自滅死の阻害は良い治療標的である。実際に、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化は脾臓内免疫細胞の自滅死を阻害した。最近の証拠はＩＦＮ−γが脾臓内抗原特異的Ｔｈ１細胞で自滅死を誘導すると報告する（Ｂｅｒｎｅｒ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３：３５４〜３６０， ２００７）。実験的結果はまた、脾臓内免疫細胞自滅死はＩＦＮ−γに依存的であるということを示す。かかる発見は再結合ＩＦＮ−γで敗血症を治療することは、ＩＦＮ−γの治療効果を落とす副作用を誘発するということと、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化がより優れた治療的な接近法であるかもしれないということを提示する。
【００７３】
如何なる環境下で、感染に対する多くの先天性免疫反応は複合的な器官不全（重症敗血症の臨床的な特徴）をもたらす細胞および組織損傷を誘発することができる。組織食細胞による微生物分子の認知は感染された組織へ血流を増加させ、局所血管（ｌｏｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ）の透過性を向上させ、感染部位へ炎症性細胞を集める伝染症因子の生産または放出を触発する。その結果は、ＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化が急性炎症に起因した生命器官障害と関連した、ＣＬＰで誘導されたＩＬ−１βおよびＴＮＦ−γを含むいくつかの前炎症性サイトカインの生産を阻害することを示す。また、試験管内および生体内実験はＦＰＲ活性化がＬＰＳ−誘導前炎症性サイトカインの生産を阻害することを示す。かかる発見はＦＰＲ活性化が前炎症性サイトカインの生産の直接的な阻害を通して急性炎症を予防した上で、治療効果を発揮することを提示する。これは敗血症治療においてＷＫＹＭＶｍによるＦＰＲ活性化がそれぞれの前炎症性因子を防ぐよりはるかに優れていることを示す。
【００７４】
〔実施例７〕
〔ＷＫＹＭＶｍの抗炎症効果はＩＬ−１７−媒介経路に依存的である〕
ＷＫＹＭＶｍはＣＬＰ後４時間目にすでに腹膜液内ＩＬ−１７の水準を増加させた（図７Ａ）。ＷＫＹＭＶｍの投与はまた、ＣＬＰ後８および１２時間目からＩＬ−１０およびＴＧＦ−をそれぞれ増加させた（図７Ｂおよび図７Ｃ）。ＦＰＲ活性化による向上した生存効果におけるＩＬ−１７の役割を調査するために、ＣＬＰのモデルをＩＬ−１７欠乏およびＷＴ統制のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景）に適用した。本研究はＷＫＹＭＶｍ投与で向上された生存はＩＬ−１７−欠乏のマウスで部分的に逆転されたことを示した（図７Ｄ）。ＦＰＲ活性化の抗炎症効果におけるＩＬ−１７の役割側面から、ＷＴのマウスでＷＫＹＭＶｍによって阻害された肺のＷ／Ｄ重量比はＩＬ−１７欠乏のマウスでは観測されなかった（図７Ｅ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）またはホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）と結合してこれらを活性化させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と結合する、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項４】
前記免疫調節剤は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）である炎症性サイトカインの発現を減少させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項５】
前記免疫調節剤はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）であるＴｈ１サイトカインの発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項６】
前記免疫調節剤は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤
【請求項７】
前記免疫調節剤は、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である抗炎症性サイトカインの発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項８】
抗炎症剤、抗菌剤または免疫細胞自滅死の阻害剤として使用される、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項９】
トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−ジ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の免疫調節剤を含む、重症敗血症または急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記免疫調節剤は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害する、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記重症敗血症は、炎症反応を伴う、請求項９に記載の薬剤学的組成物
【請求項１２】
前記ペプチドは、０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項１２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、経口または非経口投与される、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、薬剤学的に受容可能な担体または賦形剤をさらに含む、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を治療学的有効量で対象に投与することを含む、対象内免疫反応調節方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）またはホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）と結合してこれらを活性化させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項１８】
前記ペプチドは、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と結合および活性化させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項１９】
前記ペプチドは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）である炎症性サイトカインの発現を減少させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２０】
前記ペプチドは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）であるＴｈ１サイトカインの発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２１】
前記ペプチドは、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である抗炎症性サイトカインの発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２３】
前記免疫反応調節は、抗炎症反応、抗菌反応、または免疫細胞自滅死の阻害を含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２４】
前記免疫反応調節は、重症敗血症または急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）の予防または治療を含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２５】
前記免疫反応調節は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害することを含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２６】
前記ペプチドは、０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２７】
前記ペプチドは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項２６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２８】
前記ペプチドは、経口または非経口投与される、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項１】
配列番号１で示されるトリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）またはホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）と結合してこれらを活性化させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と結合する、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項４】
前記免疫調節剤は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）である炎症性サイトカインの発現を減少させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項５】
前記免疫調節剤はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）であるＴｈ１サイトカインの発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項６】
前記免疫調節剤は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤
【請求項７】
前記免疫調節剤は、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である抗炎症性サイトカインの発現を増加させる、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項８】
抗炎症剤、抗菌剤または免疫細胞自滅死の阻害剤として使用される、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項９】
トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−ジ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の免疫調節剤を含む、重症敗血症または急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記免疫調節剤は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害する、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記重症敗血症は、炎症反応を伴う、請求項９に記載の薬剤学的組成物
【請求項１２】
前記ペプチドは、０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項１２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、経口または非経口投与される、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、薬剤学的に受容可能な担体または賦形剤をさらに含む、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
トリプトファン−リシン−チロシン−メチオニン−バリン−Ｄ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、ＷＫＹＭＶｍ）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫調節剤を治療学的有効量で対象に投与することを含む、対象内免疫反応調節方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは、マウスでホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）またはホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）と結合してこれらを活性化させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項１８】
前記ペプチドは、ヒトでＦＰＲ、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と結合および活性化させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項１９】
前記ペプチドは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫よう死滅因子−α（ＴＮＦ−α）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）である炎症性サイトカインの発現を減少させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２０】
前記ペプチドは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）であるＴｈ１サイトカインの発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２１】
前記ペプチドは、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）またはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である抗炎症性サイトカインの発現を増加させる、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２３】
前記免疫反応調節は、抗炎症反応、抗菌反応、または免疫細胞自滅死の阻害を含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２４】
前記免疫反応調節は、重症敗血症または急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）の予防または治療を含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２５】
前記免疫反応調節は、重症敗血症によって誘導される脾臓リンパ球または胸腺細胞の減少を阻害することを含む、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２６】
前記ペプチドは、０．００６４乃至６．４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２７】
前記ペプチドは、０．０６４乃至０．６４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの量で投与される、請求項２６に記載の免疫反応調節方法。
【請求項２８】
前記ペプチドは、経口または非経口投与される、請求項１６に記載の免疫反応調節方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【公表番号】特表２０１１−５０３０５４（Ｐ２０１１−５０３０５４Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３００３（Ｐ２０１０−５３３００３）
【出願日】平成２０年１１月３日（２００８．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６４６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７９８２
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０６３７６４５８）ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーション (28)
【出願人】（５０９０９９２０２）トンア ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション フォー インダストリー−アカデミー コーポレイション (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｎｇ−Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ａｃａｄｅｍｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】８４０， Ｈａｄａｎ−２ｄｏｎｇ， Ｓａｈａ−ｇｕ， Ｂｕｓａｎ， ６０４−７１４， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月３日（２００８．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６４６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７９８２
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０６３７６４５８）ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーション (28)
【出願人】（５０９０９９２０２）トンア ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション フォー インダストリー−アカデミー コーポレイション (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｎｇ−Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ａｃａｄｅｍｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】８４０， Ｈａｄａｎ−２ｄｏｎｇ， Ｓａｈａ−ｇｕ， Ｂｕｓａｎ， ６０４−７１４， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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