免疫障害により誘起される疾患の治療のための医薬組成物およびポリア抽出物
本発明は、免疫障害により誘起される疾患の治療における、下記化学式（Ｉ）で示されるラノスタンまたはそれらの製薬上許容されうる塩の新規な使用に関する。
式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯまたはＯＨであり；Ｒ３はＨまたはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨまたはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。
式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯまたはＯＨであり；Ｒ３はＨまたはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨまたはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アレルギーなどの免疫障害により誘起される疾患の治療におけるラノスタン化合物の新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の記載
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、免疫グロブリン（または「抗体」）分子の１種である。ＩｇＥは、ヒト血清中で他の免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤよりも低濃度で存在する。ＩｇＥは、寄生虫に対する保護の役割を有すると考えられるが、少なくとも寄生虫感染が重大な問題ではない先進国では、必要な役割を、または有用な役割でさえも担うものとして明確に確立されていない。ＩｇＥはアレルギー性鼻炎（「花粉症」）、喘息、じんましん、ならびに食物および薬物のアレルギーを含む即時型過敏症アレルギー反応のメディエータとして知られている。
【０００３】
ＩｇＥ−媒介性アレルギー反応において、ＩｇＥはＢ細胞によって分泌された後、Ｆｃ部分を通して、好塩基球、肥満細胞およびランゲルハンス細胞の表面に存在するＦｃεＲＩ受容体に結合する。これらの細胞の表面に結合したＩｇＥが今アレルゲンに接触および結合した場合、これは結合したＩｇＥ分子および下部の受容体の架橋を引き起こし、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンなどの薬理的メディエータおよびアナフィラキシーなどの遅反応性物質の放出のトリガとなる。これらのメディエータは、アレルギー反応の病理的発現を引き起こす。
【０００４】
いくつかの、または全てのＩｇＥ−媒介性アレルギー状態の罹患歴を有する患者の一部は、アトピー性皮膚炎と呼ばれる痛みのある皮膚症状をも患う。
【０００５】
アレルギー性疾患の中で喘息を例にとると、免疫反応時間は即時型喘息反応と遅発型喘息反応とに分けられうる。即時型喘息反応は、アレルゲンとの接触後１５〜３０分以内に起こる、肥満細胞から放出された炎症性メディエータによって引き起こされる反応である。患者が同じアレルゲンに再びさらされたとき、アレルゲンは肥満細胞に結合したＩｇＥを識別してこれに結合し、肥満細胞を活性化し、細胞中の顆粒はより多くのヒスタミン、ロイコトリエン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、ならびに走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ）などを含む炎症性物質が放出されるように脱顆粒され、これによって血管の透過性が上昇し、気道の平滑筋が収縮する。これらの炎症性物質、サイトカインおよび走化性因子は即時型喘息反応だけでなく遅発型反応にも影響を与える。
【０００６】
好酸球および好中球によって引き起こされる反応は遅発型反応に関連する。即時型反応から４〜６時間後、肥満細胞から放出されたサイトカインおよび走化性因子は好酸球および好中球などの炎症細胞をひきつけ、浸潤をもたらすであろう。さらに、上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞から分泌されるエオタキシンなどのサイトカインは走化性因子の主要な部分であり、これはさらに好酸球またはＴｈ２免疫細胞を肺の気管支での炎症部位に移動させる。ＭＢＰ（主要塩基性タンパク質）、ＥＣＰ（好酸球カチオン性タンパク質）、好酸球由来神経毒、ＥＰＯ（好酸球ペルオキシダーゼ）およびロイコトリエンなどの多くの炎症性タンパク質が、活性化されたときに好酸球から分泌されるであろう。これらの炎症性タンパク質は気道の平滑筋を刺激して収縮させ、血管の透過性を上昇させ、気道の上皮組織が直接傷つけられるように気道浮腫を引き起こし、したがって上皮細胞はその完全性を失う。気道は過剰の粘液を分泌し、これは気道を閉塞させたり狭くしたりするだけではなく、好中球の浸潤および肥満細胞の脱顆粒を引き起こし、これによって好酸球の浸潤が増加する。その結果、喘息の程度がより深刻になる。
【０００７】
本出願の出願人は、台湾特許出願第９２１１３３９３号（台湾特許公開第２００４２５９００号、２００４年１２月１日公開）において、人体の免疫力の増強において有用な医薬組成物を開示した。当該組成物は有効な成分のラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）化合物を含む。人体の免疫力増強のためのポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物も開示され、当該抽出物は、５〜６０重量％のラノスタン化合物を含み、セコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まない。抽出物はマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）の代謝産物、菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）または発酵産物から調製される。
【０００８】
アレルギーが治療できる物質または方法は研究者ばかりでなく一般の人々にとっても重要な問題である。これまでにラノスタン化合物がアレルギーの治療に有効であることの報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明の第一の目的はアレルギーなどの免疫障害により誘起される疾患の治療におけるラノスタン化合物の新規な用途を提供することである。
【００１０】
本発明の他の一の目的は有効な成分としてラノスタン化合物を含む免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）の治療のための医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の一の目的はラノスタン化合物を用いて免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）を治療する方法を提供することである。
【００１２】
哺乳類（例えばヒト）における免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）を治療しうる医薬組成物であって、活性成分として下記化学式（Ｉ）で表されるラノスタン：
【００１３】
【化１】
【００１４】
式中、Ｒ１はＨもしくはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯもしくはＯＨであり；Ｒ３はＨもしくはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）、もしくは−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨもしくはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨである；またはそれらの製薬上許容されうる塩を前記疾患の治療に有効な量で含む、医薬組成物である。
【００１５】
本発明はまた、哺乳類における免疫障害により誘起される疾患の治療のための薬剤の作製における上記化学式（Ｉ）で示されるラノスタンの使用を提供する。
【００１６】
好ましくは、前記アレルギーはアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、咽喉（ｇｕｌｌｅｔ）アレルギー、アトピー性湿疹、またはリウマチ性関節炎である。より好ましくは、前記アレルギーはアレルギー性喘息である。
【００１７】
好ましくは、化学式（Ｉ）を有するラノスタンは、
【００１８】
【化２】
【００１９】
【化３】
【００２０】
または
【００２１】
【化４】
【００２２】
である。
【００２３】
好ましくは、前記医薬組成物はラノスタン（Ｉ）またはそれらの製薬上許容されうる塩を組成物の０．１〜６０重量％で含む。
【００２４】
本発明のアレルギーの治療のための医薬組成物は一般に、例えば錠剤、丸薬、ソフトカプセル、ハードカプセル、微細顆粒、粉末またはペレットなどの形態で経口で患者に投与されうる。本発明の医薬組成物は、水溶液として経口または非経口で投与されうる液体の形態でありうる。本発明の医薬組成物は、エタノール、水などの混和性溶媒に分散され、スプレー、ローション、軟膏、チンキ剤、エマルションまたはアンプルの形態で非経口で投与されうる。
【００２５】
好ましくは、前記医薬組成物は経口投与される。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、前記ラノスタン（Ｉ）の原料としてのポリア抽出物の使用である。前記ポリア抽出物は１〜６０重量％のラノスタン（Ｉ）を含み、およびセコラノスタンを実質的に含まない。
【００２７】
好ましくは、前記ポリア抽出物は以下の工程を含む方法で調製される：
ａ）水、メタノール、エタノールまたはそれらの混合溶媒により、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を抽出し；
ｂ）前記ａ）工程で得られた液体抽出物を濃縮し；
ｃ）前記ｂ）工程で得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；
ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、得られた溶出液を集め；および
ｅ）前記溶出液を濃縮して濃縮溶出液を生成する。
【００２８】
好ましくは、ｅ）工程で得られた濃縮溶出液の有する、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒で展開され、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気で検出される、薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上である。
【００２９】
好ましくは、ａ）工程における抽出は９５％エタノールを用いて行われる。
【００３０】
好ましくは、ａ）工程における抽出は、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を沸騰水で抽出し；得られた抽出水溶液にｐＨ値が９〜１１になるまで塩基を添加し；塩基性水溶液を回収し；塩基性水溶液にｐＨ値が４〜６になるまで酸を添加し、沈殿を形成し；沈殿を回収し；沈殿をエタノールで抽出し；および液体抽出物を回収することを含む。
【００３１】
好ましくは、工程ｂ）で得られた濃縮物が、さらに体積比１：１の９５％ｖ／ｖメタノール水溶液およびｎ−ヘキサンを含む二相溶媒で抽出され、メタノール層が二相溶媒抽出混合物から分離され、および前記メタノール層が濃縮され、工程ｃ）でシリカゲルカラムに供給されて用いられる濃縮物を形成する。
【００３２】
好ましくは、工程ｄ）における前記極性の低い溶離液がジクロロメタンおよびメタノールを９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である。
【００３３】
好ましくは、前記ポリア抽出物が５〜３５重量％の前記ラノスタン（Ｉ）を含む。
【００３４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明を実施するための最良の形態
ここで行なった以下の実験では、オボアルブミン（ＯＶＡ）をアレルゲンとして用いることによってマウスをアレルギー性になるように誘導し、マウスのＯＶＥ−特異的ＩｇＥ抗体の出現から誘起された喘息にマウスが罹患していることを確認した。実験期間の間、異なる群のマウスにポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を与えて飼育し、１か月の飼育後各マウスに気道過敏性試験を行い、これによってマウスの喘息の深刻さの程度を反映する重要な指数を決定した。本発明者らはまた、マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の異なる免疫細胞を、これらが、特に好酸球および好中球が影響されているかについて観察した。さらに、走化性因子であるエオタキシンは、本発明においてサイトカインの分泌が劇的に変化したかを観察するための重要な観察因子であった。上記の３つの薬理的または炎症性物質、気道過敏性、炎症細胞および走化性因子（エオタキシン）の観察から、ポリア抽出物およびラノスタン化合物は喘息の予防および治療のための優れた薬剤であることがわかる。
【００３６】
本発明で開示された、哺乳類（例えば、ヒト）による栄養素の摂取を促進させるポリア抽出物は台湾特許公開第２００４２５９００号に開示されているのと同様の方法で調製することができ、それはマツホドを通常の抽出方法で抽出して粗抽出物を入手し、その粗抽出物をクロマトグラフィーによりラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）の低極性留分（ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の溶離液を使用）およびセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）の高極性留分（ジクロロメタン：メタノールが９０：１０および０：１００の溶離液を使用）に分離し、ここでジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒によって薄層クロマトグラフィーで展開したときに、ラノスタン留分はクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上のところで検出され、また、セコラノスタン留分はＲｆが０．１未満のところで検出される。いくつかのラノスタンは前記ラノスタン留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより溶出することで分離される。ここで使用される溶離液はジクロロメタン：メタノール＝９７：３〜９５：５である。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するために提示されるものであり、本発明の範囲を限定するために使用されてはならない。
【００３８】
本明細書中に記載される百分率および他の量は、特にことわりのないかぎり質量基準である。百分率は合計１００％となるような任意の範囲で選択される。
【００３９】
実施例１：
ポリア粉末を中国で成長したマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）３０ｋｇから製造した。このポリア粉末を、９５％エタノール１２０Ｌを用いて２４時間かけて抽出した。この混合物をろ過し、ろ液を得た。さらに３回残渣を抽出してろ過した。ろ液を合わせて濃縮し、２６５．２ｇの量の乾燥抽出物を得た。乾燥抽出物を、二相抽出剤（ｎ−ヘキサン：９５％メタノール＝１：１）を用いて分配抽出し、そこからメタノール層を除き、その後、濃縮して２４６．９ｇの量の乾燥固形物を得た。乾燥固形物の分離を、乾燥固形物の１０〜４０倍の重量のシリカゲルを充填したシリカゲルカラムを用いて行った。７０〜２３０メッシュの直径を有する前記シリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ社製のＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０である。前記カラムを次の溶離液を順に用いて溶出した：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０の混合溶媒；および純粋メタノール。溶出液を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって試験し、ここでは検出に紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用い、ジクロロメタン：メタン＝９６：４の混合溶媒を展開液として使用した。ＴＬＣにおいて類似の組成を有する溶出液を混合した。
【００４０】
ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒を用いて行なった溶出からは、７８ｇの量のＰＣＭ部分を得た。前記ＰＣＭは薄層クロマトグラフィーにおいて６つのスポット跡を示した。ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０および純粋メタノールの溶離液を用いた溶出により得られた溶出液を混合し、１６８ｇの量のＰＣＷ部分を得た。
【００４１】
前記ＰＣＭ部分を、ジクロロメタン：メタノール＝９６．５：３．５の溶離液および同様のシリカゲルカラムを使用してさらに分離し、Ｋ１（Ｋ１−１およびＫ１−２）、Ｋ２（Ｋ２−１およびＫ２−２）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａおよびＫ６ｂの精製ラノスタン成分を得た。なお、前記分離工程および同定分析データの詳細については、上述の台湾特許公開第２００４２５９００号に記載されている。
【００４２】
前記Ｋ１〜Ｋ６ｂ化合物は下記の構造を有する：
【００４３】
【化５】
【００４４】
ＰＣＭ部分から分離されたラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂの量を下記表に列記する。ＰＣＭ部分は、ラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂを約１５重量％含む。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例２：
ポリア１００ｋｇを水８００ｋｇ中で３時間煮沸し、その後放置して５０℃になるまで冷却し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ値を１１になるように調整し、次いでその溶液を３時間攪拌した。遠心分離機を使用して、固形物から液体を分離し、分離した固形物にさらに水８００ｋｇを加えた。ｐＨ値をＮａＯＨで１１に調整し、攪拌し、遠心分離により固形物を除くことを含む、上記の手順を繰り返した。得られた２つの液体を合わせて、５０℃で真空濃縮して１００ｋｇの溶液とし、次いで、３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ値を６．５になるように調整して、沈殿を生成した。前記沈殿を溶液から分離し、続いて４０ＬのＨ２Ｏで洗浄し、沈殿を回収するために遠心分離し；沈殿を水８Ｌを用いて噴霧乾燥し、３８０ｇの粉末を得た。その後、前記粉末を４Ｌのエタノールを用いて３回抽出し、抽出溶液を合わせて濃縮し、エタノール抽出物２３８．９ｇを得た。このエタノール抽出物２３８．９ｇは、実施例１のＴＬＣ分析からセコラノスタン化合物を含まないことがわかり、次いでＨＰＬＣで分離され、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を１８５．９３ｍｇ、Ｋ３を２０．３４ｍｇ、Ｋ４を１５．８２ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇを与えた。言い換えれば、抽出物１グラムは約２２６．０７ｍｇのラノスタン化合物を含む。
【００４７】
実施例３：
ポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を用いた喘息のマウスの治療の実験
この実施例では、オボアルブミン（ＯＶＡ）をアレルゲンとして用いることによってマウスをアレルギー性になるように誘導し、マウスのＯＶＥ−特異的ＩｇＥ抗体の出現からマウスが誘起された喘息に罹患していることを確認した。実験期間の間、異なる群のマウスにポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を与えて飼育し、１か月の飼育後各マウスに気道過敏性試験を行い、これによってマウスの喘息の深刻さの程度を反映する重要な指数を決定した。この実施例においては、マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の異なる免疫細胞を、これらが、特に好酸球および好中球が影響されているかについても観察した。さらに、走化性因子であるエオタキシンは、この実施例においてサイトカインの分泌が劇的に変化したかを観察するための重要な観察因子であった。
【００４８】
実験方法：
（１）実験動物：Ｉｎｂｒｅｄ ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを標準的な研究用えさを適宜用いて飼育した。室温を１９〜２４℃に維持し、相対湿度を５０〜７０％とした。動物実験は台湾輔仁大学の実験動物の保護と使用のガイドラインにしたがって行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスを８匹ずつの１０の群に分けた。
【００４９】
（２）実験的な喘息動物モデルの確立：免疫化プロトコルは過去に記載したもの（Ｓｙ，Ｌ．Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ａｎ ｏｖａ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ ６：１０５３−１０６０．（２００６））と同様であり修正して実施した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２ｍｇのアジュバント水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３，７７１６１，Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌのＯＶＡ（アルブミン、鶏卵、Ａ−５５０３、Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射を用いて、８週齢および１０週齢でそれぞれ免疫化した。２回目の腹腔内注射を受けた後のマウスをチャンバに入れ、超音波ネプライザ（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ Ｐｕｌｍｏ−Ａｉｄｅ，５６５０Ｄ，ＵＳＡ）を用いて、全てのマウスを８ｍｌの２％ＯＶＡエアロゾルに２０分間露出して吸入させた。
【００５０】
（３）実験動物のグループ化：１０群のＯＶＡ−感作喘息マウスを、治療していない喘息群（Ａｓ）；実施例２で調製されたポリア抽出物および純粋な化合物Ｋ１、Ｋ２およびＫ３での治療群（１ＰＣＥ、１Ｋ１、１Ｋ２、１Ｋ３、２ＰＣＥ、２Ｋ１、２Ｋ２および２Ｋ３）；ならびにコントロール薬物群（Ｐｒｅｄ）に分けた。１ＰＣＥ群の治療群の各マウスは、毎日０．０３７２ｍｇの実施例２で調製されたＰＣＥエタノール抽出物を摂取した（１ＰＣＥ）。２ＰＣＥは、１ＰＣＥ群の２倍のＰＣＥの投与量（０．０７４４ｍｇ）を与えたマウスを意味する。１Ｋ１、１Ｋ２および１Ｋ３の治療群の各マウスは、毎日０．００８７ｍｇのＫ１、Ｋ２およびＫ３をそれぞれ摂取した。２Ｋ１、２Ｋ２および２Ｋ３は、１Ｋ１、１Ｋ２および１Ｋ３群と比較してＫ１、Ｋ２およびＫ３の２倍の投与量（０．０１７４ｍｇ）を与えたマウスを意味する。Ｐｒｅｄ群の各マウスには、致死させる前に連続５日間１日あたり０．１ｍｇのプレドニゾロンを投与した。上記ＰＣＥ、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびプレドニゾロン化合物ははじめにエタノールに溶解させ、最終的にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解させた。各マウスに各回合計体積０．４ｍＬを強制投与した。
【００５１】
（４）気道過敏性試験：
気道過敏性（ＡＨＲ）値は喘息の程度の深刻さに比例して上昇し、このためＡＨＲ値の減少は喘息が緩和したかどうかを決定するための重要な指標である。すべての群の各マウスについて、最後の露出（吸入）を行なった、治療群における投与の２９日目の次の日にＡＨＲ試験を行なった。ＡＨＲはＢｕｘｃｏシステム（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＸＡ；Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｓｈａｒｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて試験し、ここでマウスをチャンバに入れ、異なる濃度（２５ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳまたはメタコリンのエアロゾルを超音波ネプライザを用いてチャンバに導入した。導入から３分後、１分あたりのＡＨＲの平均値を記録した。メタコリンによって誘起される気道の収縮は、メタコリン濃度が上昇した場合により顕著であった。Ｐｅｎｈ（増大の中断（ｐａｕｓｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅ））値はシステムの変換器（差圧変換器、Ｂｕｘｃｏ）およびプリアンプ（ＭＡＸ ＩＩ，Ｂｕｘｃｏ）から導いたデータを集めることによって計算した。Ｐｅｎｈの相対増加率はＰｅｎｈ％＝Ｐｅｎｈメタコリン／ＰｅｎｈＰＢＳとして計算した；ここでＰｅｎｈメタコリンはマウスがメタコリンエアロゾルを３分間吸入した後のＰｅｎｈの平均値であり、ＰｅｎｈＰＢＳはマウスがＰＢＳエアロゾルを３分間吸入した後のＰｅｎｈの平均値である。
【００５２】
（５）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および肺組織構造：
ＡＨＲ分析を終えた全ての群のマウスを、次の日に致死させた。すぐに肺を気管カニューレ（１８ ＧＡ，ａｎｇｉｏｃａｔｈ，Ｂ．Ｄ．）を介して２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ ２Ｎａ−ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，ＳＨ３００１６．０１，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）１ｍｌを用いて３回洗浄した。約３ｍｌのＢＡＬＦを集めた。１回目に集めたＢＡＬＦを１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。集めたＢＡＬＦの上澄みを、サイトカイン濃度を決定するために−２０℃で保管した。２回目および３回目に集めたＢＡＬＦを合わせて１回目に集めたＢＡＬＦと同一の条件下で遠心分離した。上澄みをデカンテーションして得られた細胞を少したたいてこれらを分離し、これに１回目の遠心分離から得られた細胞を添加した。全細胞数は０．５ｍｌのＣＭ−１０を用いて決定し、この際、細胞の密度を３×１０５細胞／ｍｌに調整した。この後行なう実験ではセルの固定化にＣｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４ Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。マウス一匹当り２００μｌの細胞懸濁液を５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、スライドガラスを準備してこの上で細胞懸濁液を空気中で乾燥させた。この細胞をＬｉｕの染色溶液（Ｌｉｕ Ａ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｂ，Ｄｅｌｔａ，２３２，Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。油浸レンズを備えた顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＢＸ４１ＴＦ，Ｊａｐａｎ）を用いて１０００倍の倍率下で細胞を観察した。各スライド上で好酸球、好中球、リンパ球および単球の４つの異なる細胞を含む２００の白血球が計測された。実験結果は全ＢＡＬＦ細胞に対するリンパ球の特定の亜集団の百分率として表した。
【００５３】
（６）エオタキシン濃度測定：
気管支肺胞洗浄液中のエオタキシン濃度は、商品名Ｒ＆Ｄで市販されているキットを用いてサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、はじめにＥＬＩＳＡプレートを特定のＡｂｓで被覆し、４℃で一晩放置した。実験を行なう前に、このプレートを１％ＰＢＳ−ＢＳＡで処理し、洗浄した。次いで上澄みをＥＬＩＳＡプレートに添加し、これを室温で２時間維持し、その後ビオチン結合Ａｂｓを添加した。さらに室温で２時間維持した後、次いでアビジン結合ＨＲＰを添加してさらに２時間放置した。次いで基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を着色のために添加し、吸収波長をＯＤ４５０波長で測定した。濃度は標準値に基づく補間によって計算した。
【００５４】
（７）生物学的統計的解析：
全てのデータは平均±ＳＤとして表した。統計的に有意な差のために全ての解析はＡｓ群の治療と比較してステューデントのｔ検定を用いて行なった。ｐ値＜０．０５であれば有意であると考えた。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
結果：
１．表１から、メタコリン濃度が上昇するにつれてＡＨＲの値も群の中で上昇することがわかる。２Ｋ２群はＡｓ群に比べて最も低いＡＨＲ値を示し、より強いメタコリン（５０ｍｇ／ｍＬ）の刺激を受けたとき、１Ｋ１、２Ｋ２、および１Ｋ３群もまたＡｓ群に比べて有意に低いＡＨＲ値を示す。ＡＨＲ値が高いほどマウスがより深刻な気道過敏性反応に苦しむことを示す。得られた結果から本発明のマツホドの抽出物および成分が喘息の予防／治療効果を有することが示された。Ｐｒｅｄ群はより低いＡＨＲ値を示したが、Ａｓ群に対して統計的に有意ではない。したがって、本発明のマツホドの抽出物および成分は喘息治療のための一般的な医療用ステロイドに比べて、喘息によって引き起こされる気道の収縮の観点から喘息の予防／治療効果においてより有利である。
【００５９】
２．表２に示した結果から、Ａｓ群はＯＶＡ−感作マウスのＢＡＬＦ中の好酸球の百分率が最も高く、Ｐｒｅｄ群は百分率が最も低いが統計的優位性はないことがわかる。しかしながら、Ｐｒｅｄ群におけるリンパ球の百分率はＡｓ群のものに比べて有意に高い。それにもかかわらず、１ＰＣＥ、２ＰＣＥ、１Ｋ１および２Ｋ１を投与されたマウスはＡｓ群に比べてＢＡＬＦ中の好中球の百分率が有意に低い。この結果は、マツホドの成分が肺組織において受ける炎症細胞の浸潤を弱めうることを示す。
【００６０】
３．喘息の開始段階の活動期においては、多くの種類の炎症性タンパク質が局所炎症に含まれる。この実施例においては、ＢＡＬＦ中のエオタキシン濃度を分析し、その結果を表３に示す。気道気管支上の上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞など、多くの種類の細胞がエオタキシンを分泌しうる。分泌されたエオタキシンは好酸球またはＴｈ２細胞を気道気管支に誘導しうる（Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｏｔａｘｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６：２０−２７．（２０００））。表３のデータから、１ＰＣＥ、１Ｋ１、２Ｋ１および１Ｋ３を投与されたマウスはＡｓ群に比べてＢＡＬＦ中のエオタキシン濃度が有意に低いことがわかる。Ｐｒｅｄ群のマウスについてはＡｓ群に比べてエオタキシン濃度の有意な差はみられなかった。この結果は、本発明に開示されたマツホドの成分が炎症性タンパク質エオタキシンの分泌を阻害することによって気道の炎症細胞による浸潤を防ぎうることを支持する。したがって、本発明のマツホドの成分は喘息治療のための一般的な医療用ステロイド（Ｐｒｅｄ）に比べて、肺組織において受ける炎症細胞（好酸球またはＴｈ２リンパ球）の浸潤を弱める点で喘息の予防／治療効果においてより有利である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アレルギーなどの免疫障害により誘起される疾患の治療におけるラノスタン化合物の新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の記載
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、免疫グロブリン（または「抗体」）分子の１種である。ＩｇＥは、ヒト血清中で他の免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤよりも低濃度で存在する。ＩｇＥは、寄生虫に対する保護の役割を有すると考えられるが、少なくとも寄生虫感染が重大な問題ではない先進国では、必要な役割を、または有用な役割でさえも担うものとして明確に確立されていない。ＩｇＥはアレルギー性鼻炎（「花粉症」）、喘息、じんましん、ならびに食物および薬物のアレルギーを含む即時型過敏症アレルギー反応のメディエータとして知られている。
【０００３】
ＩｇＥ−媒介性アレルギー反応において、ＩｇＥはＢ細胞によって分泌された後、Ｆｃ部分を通して、好塩基球、肥満細胞およびランゲルハンス細胞の表面に存在するＦｃεＲＩ受容体に結合する。これらの細胞の表面に結合したＩｇＥが今アレルゲンに接触および結合した場合、これは結合したＩｇＥ分子および下部の受容体の架橋を引き起こし、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンなどの薬理的メディエータおよびアナフィラキシーなどの遅反応性物質の放出のトリガとなる。これらのメディエータは、アレルギー反応の病理的発現を引き起こす。
【０００４】
いくつかの、または全てのＩｇＥ−媒介性アレルギー状態の罹患歴を有する患者の一部は、アトピー性皮膚炎と呼ばれる痛みのある皮膚症状をも患う。
【０００５】
アレルギー性疾患の中で喘息を例にとると、免疫反応時間は即時型喘息反応と遅発型喘息反応とに分けられうる。即時型喘息反応は、アレルゲンとの接触後１５〜３０分以内に起こる、肥満細胞から放出された炎症性メディエータによって引き起こされる反応である。患者が同じアレルゲンに再びさらされたとき、アレルゲンは肥満細胞に結合したＩｇＥを識別してこれに結合し、肥満細胞を活性化し、細胞中の顆粒はより多くのヒスタミン、ロイコトリエン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、ならびに走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ）などを含む炎症性物質が放出されるように脱顆粒され、これによって血管の透過性が上昇し、気道の平滑筋が収縮する。これらの炎症性物質、サイトカインおよび走化性因子は即時型喘息反応だけでなく遅発型反応にも影響を与える。
【０００６】
好酸球および好中球によって引き起こされる反応は遅発型反応に関連する。即時型反応から４〜６時間後、肥満細胞から放出されたサイトカインおよび走化性因子は好酸球および好中球などの炎症細胞をひきつけ、浸潤をもたらすであろう。さらに、上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞から分泌されるエオタキシンなどのサイトカインは走化性因子の主要な部分であり、これはさらに好酸球またはＴｈ２免疫細胞を肺の気管支での炎症部位に移動させる。ＭＢＰ（主要塩基性タンパク質）、ＥＣＰ（好酸球カチオン性タンパク質）、好酸球由来神経毒、ＥＰＯ（好酸球ペルオキシダーゼ）およびロイコトリエンなどの多くの炎症性タンパク質が、活性化されたときに好酸球から分泌されるであろう。これらの炎症性タンパク質は気道の平滑筋を刺激して収縮させ、血管の透過性を上昇させ、気道の上皮組織が直接傷つけられるように気道浮腫を引き起こし、したがって上皮細胞はその完全性を失う。気道は過剰の粘液を分泌し、これは気道を閉塞させたり狭くしたりするだけではなく、好中球の浸潤および肥満細胞の脱顆粒を引き起こし、これによって好酸球の浸潤が増加する。その結果、喘息の程度がより深刻になる。
【０００７】
本出願の出願人は、台湾特許出願第９２１１３３９３号（台湾特許公開第２００４２５９００号、２００４年１２月１日公開）において、人体の免疫力の増強において有用な医薬組成物を開示した。当該組成物は有効な成分のラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）化合物を含む。人体の免疫力増強のためのポリア（Ｐｏｒｉａ）抽出物も開示され、当該抽出物は、５〜６０重量％のラノスタン化合物を含み、セコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）を含まない。抽出物はマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ （Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）の代謝産物、菌核粒子（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）または発酵産物から調製される。
【０００８】
アレルギーが治療できる物質または方法は研究者ばかりでなく一般の人々にとっても重要な問題である。これまでにラノスタン化合物がアレルギーの治療に有効であることの報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明の第一の目的はアレルギーなどの免疫障害により誘起される疾患の治療におけるラノスタン化合物の新規な用途を提供することである。
【００１０】
本発明の他の一の目的は有効な成分としてラノスタン化合物を含む免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）の治療のための医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の一の目的はラノスタン化合物を用いて免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）を治療する方法を提供することである。
【００１２】
哺乳類（例えばヒト）における免疫障害により誘起される疾患（例えばアレルギー）を治療しうる医薬組成物であって、活性成分として下記化学式（Ｉ）で表されるラノスタン：
【００１３】
【化１】
【００１４】
式中、Ｒ１はＨもしくはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯもしくはＯＨであり；Ｒ３はＨもしくはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）、もしくは−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨもしくはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３もしくはＣＨ２ＯＨである；またはそれらの製薬上許容されうる塩を前記疾患の治療に有効な量で含む、医薬組成物である。
【００１５】
本発明はまた、哺乳類における免疫障害により誘起される疾患の治療のための薬剤の作製における上記化学式（Ｉ）で示されるラノスタンの使用を提供する。
【００１６】
好ましくは、前記アレルギーはアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、咽喉（ｇｕｌｌｅｔ）アレルギー、アトピー性湿疹、またはリウマチ性関節炎である。より好ましくは、前記アレルギーはアレルギー性喘息である。
【００１７】
好ましくは、化学式（Ｉ）を有するラノスタンは、
【００１８】
【化２】
【００１９】
【化３】
【００２０】
または
【００２１】
【化４】
【００２２】
である。
【００２３】
好ましくは、前記医薬組成物はラノスタン（Ｉ）またはそれらの製薬上許容されうる塩を組成物の０．１〜６０重量％で含む。
【００２４】
本発明のアレルギーの治療のための医薬組成物は一般に、例えば錠剤、丸薬、ソフトカプセル、ハードカプセル、微細顆粒、粉末またはペレットなどの形態で経口で患者に投与されうる。本発明の医薬組成物は、水溶液として経口または非経口で投与されうる液体の形態でありうる。本発明の医薬組成物は、エタノール、水などの混和性溶媒に分散され、スプレー、ローション、軟膏、チンキ剤、エマルションまたはアンプルの形態で非経口で投与されうる。
【００２５】
好ましくは、前記医薬組成物は経口投与される。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、前記ラノスタン（Ｉ）の原料としてのポリア抽出物の使用である。前記ポリア抽出物は１〜６０重量％のラノスタン（Ｉ）を含み、およびセコラノスタンを実質的に含まない。
【００２７】
好ましくは、前記ポリア抽出物は以下の工程を含む方法で調製される：
ａ）水、メタノール、エタノールまたはそれらの混合溶媒により、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を抽出し；
ｂ）前記ａ）工程で得られた液体抽出物を濃縮し；
ｃ）前記ｂ）工程で得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；
ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、得られた溶出液を集め；および
ｅ）前記溶出液を濃縮して濃縮溶出液を生成する。
【００２８】
好ましくは、ｅ）工程で得られた濃縮溶出液の有する、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒で展開され、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気で検出される、薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上である。
【００２９】
好ましくは、ａ）工程における抽出は９５％エタノールを用いて行われる。
【００３０】
好ましくは、ａ）工程における抽出は、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を沸騰水で抽出し；得られた抽出水溶液にｐＨ値が９〜１１になるまで塩基を添加し；塩基性水溶液を回収し；塩基性水溶液にｐＨ値が４〜６になるまで酸を添加し、沈殿を形成し；沈殿を回収し；沈殿をエタノールで抽出し；および液体抽出物を回収することを含む。
【００３１】
好ましくは、工程ｂ）で得られた濃縮物が、さらに体積比１：１の９５％ｖ／ｖメタノール水溶液およびｎ−ヘキサンを含む二相溶媒で抽出され、メタノール層が二相溶媒抽出混合物から分離され、および前記メタノール層が濃縮され、工程ｃ）でシリカゲルカラムに供給されて用いられる濃縮物を形成する。
【００３２】
好ましくは、工程ｄ）における前記極性の低い溶離液がジクロロメタンおよびメタノールを９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である。
【００３３】
好ましくは、前記ポリア抽出物が５〜３５重量％の前記ラノスタン（Ｉ）を含む。
【００３４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明を実施するための最良の形態
ここで行なった以下の実験では、オボアルブミン（ＯＶＡ）をアレルゲンとして用いることによってマウスをアレルギー性になるように誘導し、マウスのＯＶＥ−特異的ＩｇＥ抗体の出現から誘起された喘息にマウスが罹患していることを確認した。実験期間の間、異なる群のマウスにポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を与えて飼育し、１か月の飼育後各マウスに気道過敏性試験を行い、これによってマウスの喘息の深刻さの程度を反映する重要な指数を決定した。本発明者らはまた、マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の異なる免疫細胞を、これらが、特に好酸球および好中球が影響されているかについて観察した。さらに、走化性因子であるエオタキシンは、本発明においてサイトカインの分泌が劇的に変化したかを観察するための重要な観察因子であった。上記の３つの薬理的または炎症性物質、気道過敏性、炎症細胞および走化性因子（エオタキシン）の観察から、ポリア抽出物およびラノスタン化合物は喘息の予防および治療のための優れた薬剤であることがわかる。
【００３６】
本発明で開示された、哺乳類（例えば、ヒト）による栄養素の摂取を促進させるポリア抽出物は台湾特許公開第２００４２５９００号に開示されているのと同様の方法で調製することができ、それはマツホドを通常の抽出方法で抽出して粗抽出物を入手し、その粗抽出物をクロマトグラフィーによりラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）の低極性留分（ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の溶離液を使用）およびセコラノスタン（ｓｅｃｏｌａｎｏｓｔａｎｅ）の高極性留分（ジクロロメタン：メタノールが９０：１０および０：１００の溶離液を使用）に分離し、ここでジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒によって薄層クロマトグラフィーで展開したときに、ラノスタン留分はクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上のところで検出され、また、セコラノスタン留分はＲｆが０．１未満のところで検出される。いくつかのラノスタンは前記ラノスタン留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより溶出することで分離される。ここで使用される溶離液はジクロロメタン：メタノール＝９７：３〜９５：５である。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するために提示されるものであり、本発明の範囲を限定するために使用されてはならない。
【００３８】
本明細書中に記載される百分率および他の量は、特にことわりのないかぎり質量基準である。百分率は合計１００％となるような任意の範囲で選択される。
【００３９】
実施例１：
ポリア粉末を中国で成長したマツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ） Ｗｏｌｆ）３０ｋｇから製造した。このポリア粉末を、９５％エタノール１２０Ｌを用いて２４時間かけて抽出した。この混合物をろ過し、ろ液を得た。さらに３回残渣を抽出してろ過した。ろ液を合わせて濃縮し、２６５．２ｇの量の乾燥抽出物を得た。乾燥抽出物を、二相抽出剤（ｎ−ヘキサン：９５％メタノール＝１：１）を用いて分配抽出し、そこからメタノール層を除き、その後、濃縮して２４６．９ｇの量の乾燥固形物を得た。乾燥固形物の分離を、乾燥固形物の１０〜４０倍の重量のシリカゲルを充填したシリカゲルカラムを用いて行った。７０〜２３０メッシュの直径を有する前記シリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ社製のＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０である。前記カラムを次の溶離液を順に用いて溶出した：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０の混合溶媒；および純粋メタノール。溶出液を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって試験し、ここでは検出に紫外線ランプおよびヨウ素蒸気を用い、ジクロロメタン：メタン＝９６：４の混合溶媒を展開液として使用した。ＴＬＣにおいて類似の組成を有する溶出液を混合した。
【００４０】
ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒を用いて行なった溶出からは、７８ｇの量のＰＣＭ部分を得た。前記ＰＣＭは薄層クロマトグラフィーにおいて６つのスポット跡を示した。ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０および純粋メタノールの溶離液を用いた溶出により得られた溶出液を混合し、１６８ｇの量のＰＣＷ部分を得た。
【００４１】
前記ＰＣＭ部分を、ジクロロメタン：メタノール＝９６．５：３．５の溶離液および同様のシリカゲルカラムを使用してさらに分離し、Ｋ１（Ｋ１−１およびＫ１−２）、Ｋ２（Ｋ２−１およびＫ２−２）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ４ａ、Ｋ４ｂ、Ｋ５、Ｋ６ａおよびＫ６ｂの精製ラノスタン成分を得た。なお、前記分離工程および同定分析データの詳細については、上述の台湾特許公開第２００４２５９００号に記載されている。
【００４２】
前記Ｋ１〜Ｋ６ｂ化合物は下記の構造を有する：
【００４３】
【化５】
【００４４】
ＰＣＭ部分から分離されたラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂの量を下記表に列記する。ＰＣＭ部分は、ラノスタン化合物Ｋ１〜Ｋ６ｂを約１５重量％含む。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例２：
ポリア１００ｋｇを水８００ｋｇ中で３時間煮沸し、その後放置して５０℃になるまで冷却し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ値を１１になるように調整し、次いでその溶液を３時間攪拌した。遠心分離機を使用して、固形物から液体を分離し、分離した固形物にさらに水８００ｋｇを加えた。ｐＨ値をＮａＯＨで１１に調整し、攪拌し、遠心分離により固形物を除くことを含む、上記の手順を繰り返した。得られた２つの液体を合わせて、５０℃で真空濃縮して１００ｋｇの溶液とし、次いで、３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ値を６．５になるように調整して、沈殿を生成した。前記沈殿を溶液から分離し、続いて４０ＬのＨ２Ｏで洗浄し、沈殿を回収するために遠心分離し；沈殿を水８Ｌを用いて噴霧乾燥し、３８０ｇの粉末を得た。その後、前記粉末を４Ｌのエタノールを用いて３回抽出し、抽出溶液を合わせて濃縮し、エタノール抽出物２３８．９ｇを得た。このエタノール抽出物２３８．９ｇは、実施例１のＴＬＣ分析からセコラノスタン化合物を含まないことがわかり、次いでＨＰＬＣで分離され、抽出物１グラムにつき、Ｋ２を１８５．９３ｍｇ、Ｋ３を２０．３４ｍｇ、Ｋ４を１５．８２ｍｇおよびＫ１を４．５２ｍｇを与えた。言い換えれば、抽出物１グラムは約２２６．０７ｍｇのラノスタン化合物を含む。
【００４７】
実施例３：
ポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を用いた喘息のマウスの治療の実験
この実施例では、オボアルブミン（ＯＶＡ）をアレルゲンとして用いることによってマウスをアレルギー性になるように誘導し、マウスのＯＶＥ−特異的ＩｇＥ抗体の出現からマウスが誘起された喘息に罹患していることを確認した。実験期間の間、異なる群のマウスにポリア抽出物または純粋なラノスタン化合物を与えて飼育し、１か月の飼育後各マウスに気道過敏性試験を行い、これによってマウスの喘息の深刻さの程度を反映する重要な指数を決定した。この実施例においては、マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の異なる免疫細胞を、これらが、特に好酸球および好中球が影響されているかについても観察した。さらに、走化性因子であるエオタキシンは、この実施例においてサイトカインの分泌が劇的に変化したかを観察するための重要な観察因子であった。
【００４８】
実験方法：
（１）実験動物：Ｉｎｂｒｅｄ ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを標準的な研究用えさを適宜用いて飼育した。室温を１９〜２４℃に維持し、相対湿度を５０〜７０％とした。動物実験は台湾輔仁大学の実験動物の保護と使用のガイドラインにしたがって行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスを８匹ずつの１０の群に分けた。
【００４９】
（２）実験的な喘息動物モデルの確立：免疫化プロトコルは過去に記載したもの（Ｓｙ，Ｌ．Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ａｎ ｏｖａ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ ６：１０５３−１０６０．（２００６））と同様であり修正して実施した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２ｍｇのアジュバント水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３，７７１６１，Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌのＯＶＡ（アルブミン、鶏卵、Ａ−５５０３、Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射を用いて、８週齢および１０週齢でそれぞれ免疫化した。２回目の腹腔内注射を受けた後のマウスをチャンバに入れ、超音波ネプライザ（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ Ｐｕｌｍｏ−Ａｉｄｅ，５６５０Ｄ，ＵＳＡ）を用いて、全てのマウスを８ｍｌの２％ＯＶＡエアロゾルに２０分間露出して吸入させた。
【００５０】
（３）実験動物のグループ化：１０群のＯＶＡ−感作喘息マウスを、治療していない喘息群（Ａｓ）；実施例２で調製されたポリア抽出物および純粋な化合物Ｋ１、Ｋ２およびＫ３での治療群（１ＰＣＥ、１Ｋ１、１Ｋ２、１Ｋ３、２ＰＣＥ、２Ｋ１、２Ｋ２および２Ｋ３）；ならびにコントロール薬物群（Ｐｒｅｄ）に分けた。１ＰＣＥ群の治療群の各マウスは、毎日０．０３７２ｍｇの実施例２で調製されたＰＣＥエタノール抽出物を摂取した（１ＰＣＥ）。２ＰＣＥは、１ＰＣＥ群の２倍のＰＣＥの投与量（０．０７４４ｍｇ）を与えたマウスを意味する。１Ｋ１、１Ｋ２および１Ｋ３の治療群の各マウスは、毎日０．００８７ｍｇのＫ１、Ｋ２およびＫ３をそれぞれ摂取した。２Ｋ１、２Ｋ２および２Ｋ３は、１Ｋ１、１Ｋ２および１Ｋ３群と比較してＫ１、Ｋ２およびＫ３の２倍の投与量（０．０１７４ｍｇ）を与えたマウスを意味する。Ｐｒｅｄ群の各マウスには、致死させる前に連続５日間１日あたり０．１ｍｇのプレドニゾロンを投与した。上記ＰＣＥ、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびプレドニゾロン化合物ははじめにエタノールに溶解させ、最終的にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解させた。各マウスに各回合計体積０．４ｍＬを強制投与した。
【００５１】
（４）気道過敏性試験：
気道過敏性（ＡＨＲ）値は喘息の程度の深刻さに比例して上昇し、このためＡＨＲ値の減少は喘息が緩和したかどうかを決定するための重要な指標である。すべての群の各マウスについて、最後の露出（吸入）を行なった、治療群における投与の２９日目の次の日にＡＨＲ試験を行なった。ＡＨＲはＢｕｘｃｏシステム（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＸＡ；Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｓｈａｒｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて試験し、ここでマウスをチャンバに入れ、異なる濃度（２５ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳまたはメタコリンのエアロゾルを超音波ネプライザを用いてチャンバに導入した。導入から３分後、１分あたりのＡＨＲの平均値を記録した。メタコリンによって誘起される気道の収縮は、メタコリン濃度が上昇した場合により顕著であった。Ｐｅｎｈ（増大の中断（ｐａｕｓｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅ））値はシステムの変換器（差圧変換器、Ｂｕｘｃｏ）およびプリアンプ（ＭＡＸ ＩＩ，Ｂｕｘｃｏ）から導いたデータを集めることによって計算した。Ｐｅｎｈの相対増加率はＰｅｎｈ％＝Ｐｅｎｈメタコリン／ＰｅｎｈＰＢＳとして計算した；ここでＰｅｎｈメタコリンはマウスがメタコリンエアロゾルを３分間吸入した後のＰｅｎｈの平均値であり、ＰｅｎｈＰＢＳはマウスがＰＢＳエアロゾルを３分間吸入した後のＰｅｎｈの平均値である。
【００５２】
（５）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および肺組織構造：
ＡＨＲ分析を終えた全ての群のマウスを、次の日に致死させた。すぐに肺を気管カニューレ（１８ ＧＡ，ａｎｇｉｏｃａｔｈ，Ｂ．Ｄ．）を介して２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ ２Ｎａ−ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，ＳＨ３００１６．０１，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）１ｍｌを用いて３回洗浄した。約３ｍｌのＢＡＬＦを集めた。１回目に集めたＢＡＬＦを１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。集めたＢＡＬＦの上澄みを、サイトカイン濃度を決定するために−２０℃で保管した。２回目および３回目に集めたＢＡＬＦを合わせて１回目に集めたＢＡＬＦと同一の条件下で遠心分離した。上澄みをデカンテーションして得られた細胞を少したたいてこれらを分離し、これに１回目の遠心分離から得られた細胞を添加した。全細胞数は０．５ｍｌのＣＭ−１０を用いて決定し、この際、細胞の密度を３×１０５細胞／ｍｌに調整した。この後行なう実験ではセルの固定化にＣｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４ Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。マウス一匹当り２００μｌの細胞懸濁液を５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、スライドガラスを準備してこの上で細胞懸濁液を空気中で乾燥させた。この細胞をＬｉｕの染色溶液（Ｌｉｕ Ａ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｂ，Ｄｅｌｔａ，２３２，Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。油浸レンズを備えた顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＢＸ４１ＴＦ，Ｊａｐａｎ）を用いて１０００倍の倍率下で細胞を観察した。各スライド上で好酸球、好中球、リンパ球および単球の４つの異なる細胞を含む２００の白血球が計測された。実験結果は全ＢＡＬＦ細胞に対するリンパ球の特定の亜集団の百分率として表した。
【００５３】
（６）エオタキシン濃度測定：
気管支肺胞洗浄液中のエオタキシン濃度は、商品名Ｒ＆Ｄで市販されているキットを用いてサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、はじめにＥＬＩＳＡプレートを特定のＡｂｓで被覆し、４℃で一晩放置した。実験を行なう前に、このプレートを１％ＰＢＳ−ＢＳＡで処理し、洗浄した。次いで上澄みをＥＬＩＳＡプレートに添加し、これを室温で２時間維持し、その後ビオチン結合Ａｂｓを添加した。さらに室温で２時間維持した後、次いでアビジン結合ＨＲＰを添加してさらに２時間放置した。次いで基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を着色のために添加し、吸収波長をＯＤ４５０波長で測定した。濃度は標準値に基づく補間によって計算した。
【００５４】
（７）生物学的統計的解析：
全てのデータは平均±ＳＤとして表した。統計的に有意な差のために全ての解析はＡｓ群の治療と比較してステューデントのｔ検定を用いて行なった。ｐ値＜０．０５であれば有意であると考えた。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
結果：
１．表１から、メタコリン濃度が上昇するにつれてＡＨＲの値も群の中で上昇することがわかる。２Ｋ２群はＡｓ群に比べて最も低いＡＨＲ値を示し、より強いメタコリン（５０ｍｇ／ｍＬ）の刺激を受けたとき、１Ｋ１、２Ｋ２、および１Ｋ３群もまたＡｓ群に比べて有意に低いＡＨＲ値を示す。ＡＨＲ値が高いほどマウスがより深刻な気道過敏性反応に苦しむことを示す。得られた結果から本発明のマツホドの抽出物および成分が喘息の予防／治療効果を有することが示された。Ｐｒｅｄ群はより低いＡＨＲ値を示したが、Ａｓ群に対して統計的に有意ではない。したがって、本発明のマツホドの抽出物および成分は喘息治療のための一般的な医療用ステロイドに比べて、喘息によって引き起こされる気道の収縮の観点から喘息の予防／治療効果においてより有利である。
【００５９】
２．表２に示した結果から、Ａｓ群はＯＶＡ−感作マウスのＢＡＬＦ中の好酸球の百分率が最も高く、Ｐｒｅｄ群は百分率が最も低いが統計的優位性はないことがわかる。しかしながら、Ｐｒｅｄ群におけるリンパ球の百分率はＡｓ群のものに比べて有意に高い。それにもかかわらず、１ＰＣＥ、２ＰＣＥ、１Ｋ１および２Ｋ１を投与されたマウスはＡｓ群に比べてＢＡＬＦ中の好中球の百分率が有意に低い。この結果は、マツホドの成分が肺組織において受ける炎症細胞の浸潤を弱めうることを示す。
【００６０】
３．喘息の開始段階の活動期においては、多くの種類の炎症性タンパク質が局所炎症に含まれる。この実施例においては、ＢＡＬＦ中のエオタキシン濃度を分析し、その結果を表３に示す。気道気管支上の上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞など、多くの種類の細胞がエオタキシンを分泌しうる。分泌されたエオタキシンは好酸球またはＴｈ２細胞を気道気管支に誘導しうる（Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｏｔａｘｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６：２０−２７．（２０００））。表３のデータから、１ＰＣＥ、１Ｋ１、２Ｋ１および１Ｋ３を投与されたマウスはＡｓ群に比べてＢＡＬＦ中のエオタキシン濃度が有意に低いことがわかる。Ｐｒｅｄ群のマウスについてはＡｓ群に比べてエオタキシン濃度の有意な差はみられなかった。この結果は、本発明に開示されたマツホドの成分が炎症性タンパク質エオタキシンの分泌を阻害することによって気道の炎症細胞による浸潤を防ぎうることを支持する。したがって、本発明のマツホドの成分は喘息治療のための一般的な医療用ステロイド（Ｐｒｅｄ）に比べて、肺組織において受ける炎症細胞（好酸球またはＴｈ２リンパ球）の浸潤を弱める点で喘息の予防／治療効果においてより有利である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における免疫障害により誘起される疾患の治療のための薬剤の作製における、活性成分としての下記化学式（Ｉ）で示されるラノスタンまたはそれらの製薬上許容されうる塩の使用：
【化１】
式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯまたはＯＨであり；Ｒ３はＨまたはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨまたはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。
【請求項２】
前記免疫障害により誘起される疾患がアレルギーである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アレルギーが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、咽喉アレルギー、アトピー性湿疹、またはリウマチ性関節炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記アレルギーが、アレルギー性喘息である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ラノスタン（Ｉ）が、
【化２】
【化３】
または
【化４】
である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が前記ラノスタン（Ｉ）またはそれらの製薬上許容されうる塩を０．１〜６０重量％で含む、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が経口投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ポリア抽出物が前記活性成分として使用され、前記ポリア抽出物はラノスタン（Ｉ）を１〜６０重量％含み、セコラノスタンを実質的に含まない、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリア抽出物が以下の工程を含む方法で調製される、請求項９に記載の使用：
ａ）水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒によって、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を抽出し；
ｂ）前記ａ）工程から得られた液体抽出物を濃縮し；
ｃ）前記ｂ）工程から得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；
ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、得られた溶出液を集め；
ｅ）前記溶出液を濃縮して濃縮溶出液を生成する。
【請求項１１】
前記ｅ）工程から得られた濃縮溶出液の有する、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒で展開され、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気で検出される、薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ａ）工程における抽出が、９５％エタノールを用いて行われる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記ａ）工程における抽出が、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を沸騰水により抽出し；得られた抽出水溶液にｐＨ値が９〜１１になるまで塩基を添加し；塩基性水溶液を回収し；塩基性水溶液にｐＨ値が４〜６になるまで酸を添加し、沈殿を形成し；沈殿を回収し；沈殿をエタノールで抽出し；および液体抽出物を回収することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記ｂ）工程から得られた濃縮物が、体積比が１：１である９５％ｖ／ｖメタノール水溶液およびｎ−ヘキサンを含む二相溶媒でさらに抽出され、メタノール層が二相溶媒抽出混合物から分離され、および前記メタノール層が濃縮され、前記ｃ）工程でシリカゲルカラムに供給される濃縮物を形成する、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ｄ）工程における前記極性の低い溶離液がジクロロメタンおよびメタノールを９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
前記ポリア抽出物が５〜３５重量％の前記ラノスタン（Ｉ）を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１７】
前記ラノスタン（Ｉ）が、
【化５】
【化６】
【化７】
または
【化８】
である、請求項９に記載の使用。
【請求項１】
哺乳類における免疫障害により誘起される疾患の治療のための薬剤の作製における、活性成分としての下記化学式（Ｉ）で示されるラノスタンまたはそれらの製薬上許容されうる塩の使用：
【化１】
式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２はＯＣＯＣＨ３、＝ＯまたはＯＨであり；Ｒ３はＨまたはＯＨであり；Ｒ４は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＣＨ３）２Ｒａ（ここでＲａはＨまたはＯＨである）または−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｒｂ（ここでＲｂはＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである）であり；Ｒ５はＨまたはＯＨであり；およびＲ６はＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。
【請求項２】
前記免疫障害により誘起される疾患がアレルギーである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アレルギーが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、咽喉アレルギー、アトピー性湿疹、またはリウマチ性関節炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記アレルギーが、アレルギー性喘息である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ラノスタン（Ｉ）が、
【化２】
【化３】
または
【化４】
である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が前記ラノスタン（Ｉ）またはそれらの製薬上許容されうる塩を０．１〜６０重量％で含む、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が経口投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ポリア抽出物が前記活性成分として使用され、前記ポリア抽出物はラノスタン（Ｉ）を１〜６０重量％含み、セコラノスタンを実質的に含まない、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリア抽出物が以下の工程を含む方法で調製される、請求項９に記載の使用：
ａ）水、メタノール、エタノールまたはこれらの混合溶媒によって、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を抽出し；
ｂ）前記ａ）工程から得られた液体抽出物を濃縮し；
ｃ）前記ｂ）工程から得られた濃縮物をシリカゲルカラムに導入し；
ｄ）極性の低い溶離液で前記シリカゲルカラムを溶出し、得られた溶出液を集め；
ｅ）前記溶出液を濃縮して濃縮溶出液を生成する。
【請求項１１】
前記ｅ）工程から得られた濃縮溶出液の有する、ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の混合溶媒で展開され、紫外線ランプおよびヨウ素蒸気で検出される、薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー値（Ｒｆ）が０．１以上である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ａ）工程における抽出が、９５％エタノールを用いて行われる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記ａ）工程における抽出が、マツホドの代謝産物、発酵産物または菌核粒子を沸騰水により抽出し；得られた抽出水溶液にｐＨ値が９〜１１になるまで塩基を添加し；塩基性水溶液を回収し；塩基性水溶液にｐＨ値が４〜６になるまで酸を添加し、沈殿を形成し；沈殿を回収し；沈殿をエタノールで抽出し；および液体抽出物を回収することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記ｂ）工程から得られた濃縮物が、体積比が１：１である９５％ｖ／ｖメタノール水溶液およびｎ−ヘキサンを含む二相溶媒でさらに抽出され、メタノール層が二相溶媒抽出混合物から分離され、および前記メタノール層が濃縮され、前記ｃ）工程でシリカゲルカラムに供給される濃縮物を形成する、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ｄ）工程における前記極性の低い溶離液がジクロロメタンおよびメタノールを９６．５：３．５の体積比で含む混合溶媒である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
前記ポリア抽出物が５〜３５重量％の前記ラノスタン（Ｉ）を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１７】
前記ラノスタン（Ｉ）が、
【化５】
【化６】
【化７】
または
【化８】
である、請求項９に記載の使用。
【公表番号】特表２０１１−５２５４８１（Ｐ２０１１−５２５４８１Ａ）
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３８４１（Ｐ２０１１−５１３８４１）
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５７３０
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５１０１１８１４５）杏輝天力（杭州）藥業有限公司 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５７３０
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５１０１１８１４５）杏輝天力（杭州）藥業有限公司 (4)
【Ｆターム（参考）】
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