全反射顕微鏡
【課題】単一の光ファイバーを用いて多波長のレーザ光を照明光とした場合の照明光学系の色収差による全反射照明ずれを補正可能な全反射蛍光観察を提供すること。
【解決手段】対物レンズ２３を介して標本４１に全反射照明を行う全反射顕微鏡１であって、異なる波長の複数の光源１１、１２からの照明光を導く導光光学系５と、前記導光光学系５から射出した前記照明光を、前記対物レンズ２３の瞳面２５の全反射照明範囲に集光させる照明光学系７と、前記照明光学系７の色収差による前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段４３、４５とを有する全反射顕微鏡１。
【解決手段】対物レンズ２３を介して標本４１に全反射照明を行う全反射顕微鏡１であって、異なる波長の複数の光源１１、１２からの照明光を導く導光光学系５と、前記導光光学系５から射出した前記照明光を、前記対物レンズ２３の瞳面２５の全反射照明範囲に集光させる照明光学系７と、前記照明光学系７の色収差による前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段４３、４５とを有する全反射顕微鏡１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の波長の光を照明光として用いる全反射顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ分野において蛍光観察や蛍光解析に全反射顕微鏡が多く用いられるようになっている。さらに、多波長の励起光を用いた全反射蛍光観察も行われるようになり、これに対応した全反射顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−２７２６０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の多波長を用いる全反射顕微鏡において、単一の光ファイバーに複数の波長のレーザ光を導入して照明光学系に導いた場合、照明光学系が有する色収差のために一部の波長のレーザ光が全反射可能な範囲から逸脱してしまい、全反射照明観察が行えなくなるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、対物レンズを介して標本に全反射照明を行う全反射顕微鏡であって、異なる波長の複数の光源からの照明光を導く導光光学系と、前記導光光学系から射出した前記照明光を、前記対物レンズの瞳面の全反射照明範囲に集光させる照明光学系と、前記照明光学系の色収差による前記前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段と、を有することを特徴とする全反射顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、単一の光ファイバーを用いて多波長のレーザ光を照明光とした場合の照明光学系の色収差による照明光の集光ずれを補正可能な全反射蛍光観察を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の実施の形態にかかる全反射顕微鏡に関し図面を参照しつつ説明する。
【０００７】
図１は、実施の形態にかかる全反射顕微鏡の概略構成図を示す。図２は、対物レンズの瞳面における全反射照明範囲と複数の光源スポットの例を示す。
【０００８】
図１、図２において、全反射顕微鏡１は、光源３と、光ファイバー５と、照明光学系７と、結像光学系９とから構成されている。
【０００９】
光源３は、波長の異なる複数のレーザ光源１１、１２と光ファイバー５の入射端面５ａにレーザ光を集光するためのレンズ１３、１４及びミラー１５、１６からなる光学系から構成されている。
【００１０】
光ファイバー５の入射端面５ａに集光された複数の波長のレーザ光は、光ファイバー５の射出端面５ｂから出射され照明光学系７に導入される。なお、光ファイバー５は、各波長で共用し小さな光源像と均一照明を得るため単一シングルファイバーを用いることが好ましい。
【００１１】
照明光学系７は、光ファイバー５の射出端面５ｂを焦点位置とするレンズＬ１で略平行な光にされレンズＬ２を介してダイクロイックミラー２１に入射し、ダイクロイックミラー２１で選択された光が対物レンズ２３方向に反射される。また、ダイクロイックミラー２１は、照明光の各波長に対応するダイクロイックミラー２１を光軸に挿脱あるいは交換可能に構成されている。
【００１２】
レンズＬ２は、略平行にされた光を対物レンズ２３の瞳面２５上に集光する作用を有する。このレンズＬ２は、レンズＬ２を光軸方向に沿って移動させる移動手段４３を有し、瞳面２５に集光する光の合焦位置を光軸方向に移動することが可能である。
【００１３】
ダイクロイックミラー２１は、ダイクロイックミラー２１を光軸と照明光の中心位置とを結ぶ軸に対して遥動させる遥動手段４５有し、瞳面２５上での照明光の中心位置を半径方向に交差する方向に移動することが可能である。
【００１４】
上記移動手段４３、および遥動手段４５は、顕微鏡の制御装置４６により駆動の制御が行われる。なお、制御装置４６は、前もって測定された照明光学系７の各波長に対する色収差情報と移動手段４３の移動量と方向、遥動手段４５の遥動量をテーブルに記憶しておき、選択された照明光の各波長に対応してテーブルを参照し移動手段４３、遥動手段４５を駆動するように構成することも可能である。このように構成することで、照明光の各波長に対応した最適な全反射照明状態を達成することができる。
【００１５】
光ファイバー５の射出端面５ｂは、対物レンズ２３の瞳面２５上の全反射照明範囲３１内に光が集光される位置に光軸に垂直な面内で移動調整後固定されている。
【００１６】
対物レンズ２３から射出した光は、標本４１にカバーガラス４２側から全反射角度で入射し、カバーガラス４２と標本４１との界面でエバネッセント波を発生し、このエバネッセント波で励起された蛍光が標本４１から発生する。なお、蛍光は励起光に対し全方向に発光するため、励起光の入射角を同じにすれば方位角によらず同じ条件の照明を達成することができる。
【００１７】
標本４１で発生した蛍光は、対物レンズ２３で集光され、ダイクロイックミラー２１を透過して結像レンズ２６を介して不図示の光検出器で検出され、不図示の画像処理部で画像処理を施され不図示のモニタに表示される。このようにして、光源３からのレーザ光で励起された蛍光が観察可能な全反射顕微鏡１が構成されている。
【００１８】
全反射顕微鏡１では高い解像度を得るために高ＮＡの対物レンズ２３が使用されている。例えば、ＮＡ１．４０以上で倍率１００程度の対物レンズ２３が使用される。このような対物レンズ２３の瞳面２５において、全反射照明範囲３１を見積もると、例えば倍率１００倍（ＮＡ＝１．４５、ｆ＝２ｍｍ）の場合、瞳面２５における全反射照明範囲３１は、約０．１４ｍｍの幅となり狭い輪帯領域となる（図２参照）。標本４１に対して全反射照明を行うためには、この狭い輪帯状の全反射照明範囲３１内にレーザ光を集光させる必要がある。
【００１９】
一方、照明光学系７には、色収差が存在し多波長光を照明光として使用する場合に、一部の波長の光が全反射照明範囲３１からずれて集光される。例えば、対物レンズ２３で、基準波長λ１の光の縦方向色収差（光軸に沿った方向でピントずれとなる）がほぼゼロで、波長λ２の光の縦方向色収差が光軸方向に１ｍｍ存在する場合、ｆ＝２ｍｍ、実視野０．２５ｍｍφの倍率１００倍の対物レンズ２３の場合、瞳面２５位置では半径約０．０６ｍｍのボケが生じ、上記の輪帯幅０．１４ｍｍに対して無視できない量となる。
【００２０】
また、照明光学系７は、横方向色収差（瞳面２５で半径方向のずれとなる）を有し、これは基準波長λ１の光の集光中心に対して波長λ２の光の集光中心が半径方向にずれてしまう。図２は、上記集光状態を破線の円λ１、λ２で示している。
【００２１】
このように、縦方向色収差と横方向色収差のために、波長λ２の光は全反射照明範囲３１から一部が非全反射照明範囲３２にはみ出てしまい、結果として多波長の全反射照明観察を不可能にしてしまう。
【００２２】
本実施の形態にかかる全反射顕微鏡１では、瞳面２５上における、縦方向色収差による焦点ボケを補正するためのレンズＬ２の移動手段４３と、横方向色収差による集光中心のずれを補正するためのダイクロイックミラー２１の遥動手段４５が配置されている。
【００２３】
縦方向色収差による焦点ボケは、図２の破線に示すように基準波長λ１の集光サイズに比べ波長λ２の集光サイズが大きくなり、一部が全反射照明範囲３１から非全反射照明範囲３２にはみ出してしまう。この際、波長λ２の光の集光サイズを小さくする方向（波長λ２の光が合焦する方向）にレンズＬ１を移動手段４３で光軸に沿って移動させ、集光サイズが全反射照明範囲３１内に全て入るようにする。このとき基準波長λ１の光は僅かに焦点ボケ状態となり集光サイズは僅かに大きくなるが、全反射照明範囲３１から非全反射照明範囲３２に一部がはみ出すことがない状態にする。
【００２４】
さらに、横方向色収差による半径方向の集光中心のずれを補正するために、ダイクロイックミラー２１を遥動手段４５により遥動する。この遥動により、集光中心は、図２の破線に示す位置から実線で示す位置に、光軸と集光中心とを結ぶ半径方向に対してほぼ直交する周方向に集光中心を移動する。なお、図２において全反射照明範囲３１のＬとＬ１の長さを比較すると、それぞれの位置の動径のなす角度がθの場合、Ｌ１＝Ｌ／ｓｉｎθとなり、Ｌ１の方が僅かながら長くなるため、照明光の集光位置に対して余裕を持たせることができるという利点がある。
【００２５】
この結果、照明光の集光位置は、図２の破線λ１、λ２で示す位置から実線λ１、λ２で示す位置に移動され、全反射照明範囲３１に余裕を持って波長λ１、λ２の照明光を位置付けすることが可能になる。
【００２６】
以上述べたように、本実施の形態にかかる全反射顕微鏡１は、全反射顕微鏡１の照明光学系７に存在する各波長に対する色収差を良好に補正し、各波長の集光位置を全反射照明範囲３１内に正確に位置付けすることができ、多波長の照明光を用いた全反射照明観察が可能になる。
【００２７】
なお、上記実施の形態の説明では、縦方向色収差と横方向色収差の両方の色収差の補正を行った場合について説明したが、どちらか一方の色収差補正で照明光の状態を補正できる場合は、一方の補正のみを行うことで上記効果を奏することは言うまでもない。また、上記説明では、波長を二波長（λ１、λ２）の場合について説明したが、三波長以上の場合にも適用できることは言うまでもない。
【００２８】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施の形態にかかる全反射顕微鏡の概略構成図を示す。
【図２】対物レンズの瞳面における全反射照明範囲と複数の光源スポットの例を示す。
【符号の説明】
【００３０】
１ 全反射顕微鏡
３ 光源
５ 光ファイバー
７ 照明光学系
９ 結像光学系
１１、１２ レーザ光源
２１ ダイクロイックミラー
２３ 対物レンズ
２５ 対物レンズの瞳面
４３ 移動手段
４５ 遥動手段
Ｌ１ レンズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の波長の光を照明光として用いる全反射顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ分野において蛍光観察や蛍光解析に全反射顕微鏡が多く用いられるようになっている。さらに、多波長の励起光を用いた全反射蛍光観察も行われるようになり、これに対応した全反射顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−２７２６０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の多波長を用いる全反射顕微鏡において、単一の光ファイバーに複数の波長のレーザ光を導入して照明光学系に導いた場合、照明光学系が有する色収差のために一部の波長のレーザ光が全反射可能な範囲から逸脱してしまい、全反射照明観察が行えなくなるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、対物レンズを介して標本に全反射照明を行う全反射顕微鏡であって、異なる波長の複数の光源からの照明光を導く導光光学系と、前記導光光学系から射出した前記照明光を、前記対物レンズの瞳面の全反射照明範囲に集光させる照明光学系と、前記照明光学系の色収差による前記前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段と、を有することを特徴とする全反射顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、単一の光ファイバーを用いて多波長のレーザ光を照明光とした場合の照明光学系の色収差による照明光の集光ずれを補正可能な全反射蛍光観察を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の実施の形態にかかる全反射顕微鏡に関し図面を参照しつつ説明する。
【０００７】
図１は、実施の形態にかかる全反射顕微鏡の概略構成図を示す。図２は、対物レンズの瞳面における全反射照明範囲と複数の光源スポットの例を示す。
【０００８】
図１、図２において、全反射顕微鏡１は、光源３と、光ファイバー５と、照明光学系７と、結像光学系９とから構成されている。
【０００９】
光源３は、波長の異なる複数のレーザ光源１１、１２と光ファイバー５の入射端面５ａにレーザ光を集光するためのレンズ１３、１４及びミラー１５、１６からなる光学系から構成されている。
【００１０】
光ファイバー５の入射端面５ａに集光された複数の波長のレーザ光は、光ファイバー５の射出端面５ｂから出射され照明光学系７に導入される。なお、光ファイバー５は、各波長で共用し小さな光源像と均一照明を得るため単一シングルファイバーを用いることが好ましい。
【００１１】
照明光学系７は、光ファイバー５の射出端面５ｂを焦点位置とするレンズＬ１で略平行な光にされレンズＬ２を介してダイクロイックミラー２１に入射し、ダイクロイックミラー２１で選択された光が対物レンズ２３方向に反射される。また、ダイクロイックミラー２１は、照明光の各波長に対応するダイクロイックミラー２１を光軸に挿脱あるいは交換可能に構成されている。
【００１２】
レンズＬ２は、略平行にされた光を対物レンズ２３の瞳面２５上に集光する作用を有する。このレンズＬ２は、レンズＬ２を光軸方向に沿って移動させる移動手段４３を有し、瞳面２５に集光する光の合焦位置を光軸方向に移動することが可能である。
【００１３】
ダイクロイックミラー２１は、ダイクロイックミラー２１を光軸と照明光の中心位置とを結ぶ軸に対して遥動させる遥動手段４５有し、瞳面２５上での照明光の中心位置を半径方向に交差する方向に移動することが可能である。
【００１４】
上記移動手段４３、および遥動手段４５は、顕微鏡の制御装置４６により駆動の制御が行われる。なお、制御装置４６は、前もって測定された照明光学系７の各波長に対する色収差情報と移動手段４３の移動量と方向、遥動手段４５の遥動量をテーブルに記憶しておき、選択された照明光の各波長に対応してテーブルを参照し移動手段４３、遥動手段４５を駆動するように構成することも可能である。このように構成することで、照明光の各波長に対応した最適な全反射照明状態を達成することができる。
【００１５】
光ファイバー５の射出端面５ｂは、対物レンズ２３の瞳面２５上の全反射照明範囲３１内に光が集光される位置に光軸に垂直な面内で移動調整後固定されている。
【００１６】
対物レンズ２３から射出した光は、標本４１にカバーガラス４２側から全反射角度で入射し、カバーガラス４２と標本４１との界面でエバネッセント波を発生し、このエバネッセント波で励起された蛍光が標本４１から発生する。なお、蛍光は励起光に対し全方向に発光するため、励起光の入射角を同じにすれば方位角によらず同じ条件の照明を達成することができる。
【００１７】
標本４１で発生した蛍光は、対物レンズ２３で集光され、ダイクロイックミラー２１を透過して結像レンズ２６を介して不図示の光検出器で検出され、不図示の画像処理部で画像処理を施され不図示のモニタに表示される。このようにして、光源３からのレーザ光で励起された蛍光が観察可能な全反射顕微鏡１が構成されている。
【００１８】
全反射顕微鏡１では高い解像度を得るために高ＮＡの対物レンズ２３が使用されている。例えば、ＮＡ１．４０以上で倍率１００程度の対物レンズ２３が使用される。このような対物レンズ２３の瞳面２５において、全反射照明範囲３１を見積もると、例えば倍率１００倍（ＮＡ＝１．４５、ｆ＝２ｍｍ）の場合、瞳面２５における全反射照明範囲３１は、約０．１４ｍｍの幅となり狭い輪帯領域となる（図２参照）。標本４１に対して全反射照明を行うためには、この狭い輪帯状の全反射照明範囲３１内にレーザ光を集光させる必要がある。
【００１９】
一方、照明光学系７には、色収差が存在し多波長光を照明光として使用する場合に、一部の波長の光が全反射照明範囲３１からずれて集光される。例えば、対物レンズ２３で、基準波長λ１の光の縦方向色収差（光軸に沿った方向でピントずれとなる）がほぼゼロで、波長λ２の光の縦方向色収差が光軸方向に１ｍｍ存在する場合、ｆ＝２ｍｍ、実視野０．２５ｍｍφの倍率１００倍の対物レンズ２３の場合、瞳面２５位置では半径約０．０６ｍｍのボケが生じ、上記の輪帯幅０．１４ｍｍに対して無視できない量となる。
【００２０】
また、照明光学系７は、横方向色収差（瞳面２５で半径方向のずれとなる）を有し、これは基準波長λ１の光の集光中心に対して波長λ２の光の集光中心が半径方向にずれてしまう。図２は、上記集光状態を破線の円λ１、λ２で示している。
【００２１】
このように、縦方向色収差と横方向色収差のために、波長λ２の光は全反射照明範囲３１から一部が非全反射照明範囲３２にはみ出てしまい、結果として多波長の全反射照明観察を不可能にしてしまう。
【００２２】
本実施の形態にかかる全反射顕微鏡１では、瞳面２５上における、縦方向色収差による焦点ボケを補正するためのレンズＬ２の移動手段４３と、横方向色収差による集光中心のずれを補正するためのダイクロイックミラー２１の遥動手段４５が配置されている。
【００２３】
縦方向色収差による焦点ボケは、図２の破線に示すように基準波長λ１の集光サイズに比べ波長λ２の集光サイズが大きくなり、一部が全反射照明範囲３１から非全反射照明範囲３２にはみ出してしまう。この際、波長λ２の光の集光サイズを小さくする方向（波長λ２の光が合焦する方向）にレンズＬ１を移動手段４３で光軸に沿って移動させ、集光サイズが全反射照明範囲３１内に全て入るようにする。このとき基準波長λ１の光は僅かに焦点ボケ状態となり集光サイズは僅かに大きくなるが、全反射照明範囲３１から非全反射照明範囲３２に一部がはみ出すことがない状態にする。
【００２４】
さらに、横方向色収差による半径方向の集光中心のずれを補正するために、ダイクロイックミラー２１を遥動手段４５により遥動する。この遥動により、集光中心は、図２の破線に示す位置から実線で示す位置に、光軸と集光中心とを結ぶ半径方向に対してほぼ直交する周方向に集光中心を移動する。なお、図２において全反射照明範囲３１のＬとＬ１の長さを比較すると、それぞれの位置の動径のなす角度がθの場合、Ｌ１＝Ｌ／ｓｉｎθとなり、Ｌ１の方が僅かながら長くなるため、照明光の集光位置に対して余裕を持たせることができるという利点がある。
【００２５】
この結果、照明光の集光位置は、図２の破線λ１、λ２で示す位置から実線λ１、λ２で示す位置に移動され、全反射照明範囲３１に余裕を持って波長λ１、λ２の照明光を位置付けすることが可能になる。
【００２６】
以上述べたように、本実施の形態にかかる全反射顕微鏡１は、全反射顕微鏡１の照明光学系７に存在する各波長に対する色収差を良好に補正し、各波長の集光位置を全反射照明範囲３１内に正確に位置付けすることができ、多波長の照明光を用いた全反射照明観察が可能になる。
【００２７】
なお、上記実施の形態の説明では、縦方向色収差と横方向色収差の両方の色収差の補正を行った場合について説明したが、どちらか一方の色収差補正で照明光の状態を補正できる場合は、一方の補正のみを行うことで上記効果を奏することは言うまでもない。また、上記説明では、波長を二波長（λ１、λ２）の場合について説明したが、三波長以上の場合にも適用できることは言うまでもない。
【００２８】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施の形態にかかる全反射顕微鏡の概略構成図を示す。
【図２】対物レンズの瞳面における全反射照明範囲と複数の光源スポットの例を示す。
【符号の説明】
【００３０】
１ 全反射顕微鏡
３ 光源
５ 光ファイバー
７ 照明光学系
９ 結像光学系
１１、１２ レーザ光源
２１ ダイクロイックミラー
２３ 対物レンズ
２５ 対物レンズの瞳面
４３ 移動手段
４５ 遥動手段
Ｌ１ レンズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを介して標本に全反射照明を行う全反射顕微鏡であって、
異なる波長の複数の光源からの照明光を導く導光光学系と、
前記導光光学系から射出した前記照明光を、前記対物レンズの瞳面の全反射照明範囲に集光させる照明光学系と、
前記照明光学系の色収差による前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段と、
を有することを特徴とする全反射顕微鏡。
【請求項２】
前記補正手段は、前記照明光学系に配置された少なくとも一つのレンズを当該照明光学系の光軸に沿って移動させる移動手段を有することを特徴とする請求項１に記載の全反射顕微鏡。
【請求項３】
前記補正手段は、前記照明光学系に配置されたダイクロイックミラーを、前記ダイクロイックミラーのミラー面における当該照明光学系の光軸と前記照明光の中心位置を結ぶ軸を中心軸として遥動させる遥動手段を有することを特徴とする請求項１に記載の全反射顕微鏡。
【請求項４】
前記導光光学系は光ファイバーからなり、
前記光源はレーザ光源を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の全反射顕微鏡。
【請求項１】
対物レンズを介して標本に全反射照明を行う全反射顕微鏡であって、
異なる波長の複数の光源からの照明光を導く導光光学系と、
前記導光光学系から射出した前記照明光を、前記対物レンズの瞳面の全反射照明範囲に集光させる照明光学系と、
前記照明光学系の色収差による前記全反射照明範囲からの集光ずれを補正する補正手段と、
を有することを特徴とする全反射顕微鏡。
【請求項２】
前記補正手段は、前記照明光学系に配置された少なくとも一つのレンズを当該照明光学系の光軸に沿って移動させる移動手段を有することを特徴とする請求項１に記載の全反射顕微鏡。
【請求項３】
前記補正手段は、前記照明光学系に配置されたダイクロイックミラーを、前記ダイクロイックミラーのミラー面における当該照明光学系の光軸と前記照明光の中心位置を結ぶ軸を中心軸として遥動させる遥動手段を有することを特徴とする請求項１に記載の全反射顕微鏡。
【請求項４】
前記導光光学系は光ファイバーからなり、
前記光源はレーザ光源を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の全反射顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１８５６３６（Ｐ２００８−１８５６３６Ａ）
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６７９８（Ｐ２００７−１６７９８）
【出願日】平成１９年１月２６日（２００７．１．２６）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２６日（２００７．１．２６）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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