全身性エリテマトーデスを治療するペプチドおよび全身性エリテマトーデスの治療方法
被験哺乳類に対し、有効量の少なくとも１つのラミニンペプチド、アナログ、またはそれらの誘導体の経口投与を含む、全身性エリテマトーデスを治療するための方法を開示する。１つの典型的な実施形態では、ラミニンペプチドは、Ｒ３８（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）と５２００（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）、５１０４（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５）、５１０５（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）、５１０６（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７）、５１０７（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８）、５１０８（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９）、５１０９（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０）、５１１０（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１）など主張されるＲ３８アナログとその誘導体からなる群から選択される。本発明のラミニンペプチドは、既知の化学合成法またはバイオ技術を用いて作製できる。本発明は、全身性エリテマトーデス患者における本疾患の診断および病理的活動性の経過を追跡調査するのに有用な測定法も提供する。さらに、本発明は、被験者の血漿からループス抗体を限外濾過法を用いて除去することと、血漿を被験者へ戻すこととを含む、被験者の全身性エリテマトーデスを治療する方法に関する。さらなる態様では、本発明は患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデスを治療および検出するためのペプチドＲ３８および関連アナログなど、ラミニンペプチドおよびラミニン誘導体の使用に関する。本発明は、全身性エリテマトーデスの治療法も提供する。本発明は、患者の血漿中抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法もさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、多臓器に関連する自己免疫疾患である。自己免疫性炎症過程に腎臓が関与することで生じるループス糸球体腎炎が、ＳＬＥの罹患および死亡の主因である（非特許文献１）。
【０００３】
血清学上のＳＬＥの特徴は、血清中に種々の自己抗体が生じることであり、なかでも最も顕著にみられるのは抗ＤＮＡ自己抗体である（非特許文献２）。種々の炎症性および自己免疫性の疾患で生じる抗ＤＮＡ抗体価は低いが、主にＳＬＥでは高値であり、ＳＬＥの実際の診断は抗体価の高い抗ＤＮＡ抗体と低補体価を組み合わせて行う（非特許文献３）。
【０００４】
ループス患者由来腎の染色またはマウス由来ループスの染色により、免疫グロブリンと糸球体基底膜（ＧＢＭ）の結合が示されている（非特許文献４）。ループス患者の腎臓および硫酸化グリコサミノグリカンと交差反応を示したＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｒマウスから抗ＤＮＡ抗体が溶出されることも示されたが、血清中の抗ＤＮＡ抗体はこの交差反応を示さなかった（非特許文献５）。これらの結果は、細胞外基質（ＥＣＭ）が、腎炎原性自己抗体の標的であるループスの病因に関与していることを示唆している。
【０００５】
Ｔｅｒｍｍａｔ Ｒ．Ｍ．らは、ラミニンとヘパリンのように、ＥＣＭの成分がマウスのモノクローナル抗体抗ＤＮＡ抗体と交差反応を示すことを開示している（非特許文献６）。特許文献１は、活性ループスを有する患者の尿に抗ＥＣＭ抗体が存在することを開示している。さらに、これらの抗体とＥＣＭの２００ ｋＤａのラミニン成分との交差反応と、これらの抗ＥＣＭ／ラミニン抗体の尿中検出に基づくＳＬＥ検査についても開示している。
【０００６】
Ｒ３８は、マウスのラミニン∝鎖のＣ末端領域から単離したペプチド配列である（非特許文献７では残基２８９０ないし２９１０、非特許文献８では残基２８５１ないし２８７１）。Ｒ３８の位置は、第４および第５ループの球状領域の接合部である（上の非特許文献７のペプチドＧＤ−２であり、
ＫＥＧＹＫＶＲＬＤＬＮＩＴＬＥＦＲＴＴＳＫ (ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）
のアミノ酸配列からなる）。
【０００７】
現在のＳＬＥ療法は、過剰反応する免疫系を抑制するコルチコステロイドに限定されている。この療法は特異的ではなく、避けられない副作用自体が致死性であると考えられる。さらに、免疫抑制療法は複雑で、臨床症状、血清学的血液検査、および腎臓生検を組み合わせた結果で開始が決まる。したがって、ＳＬＥに特異性が高く、免疫抑制剤の副作用がない療法および疾患の活動性を評価する特異性の高い、侵襲性の低い測定法が必要である。実際に、最近のレビュー（非特許文献９）によると、血液検査はＳＬＥの確定診断に有用であるが、「疾患の活動性をモニタリングするにはあまり有用ではない」とされている。
【０００８】
上述のいずれの参考文献も、ペプチドＲ３８またはそのアナログの投与を用いたＳＬＥの治療法について開示していない。さらに、上述のいずれの参考文献も、ＳＬＥの診断検査またはＳＬＥの活動性のモニタリングにおけるＲ３８のペプチドの使用について開示していない。上述のすべての特許および参考文献の内容を参照により本明細書に組み込む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第６７０，４９５号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｌａｒｃｏｎ−Ｓｅｇｏｖｉａ Ｄ． ｉｎ：Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｅｄ．Ｓｃｈｕｍａｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｒ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ａｔｌａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ （１９８８） ｐｐ．９６−１００
【非特許文献２】Ｎａｐａｒｓｔｅｋ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９３）， １１，７９−１０４
【非特許文献３】Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｉｎ：Ｄｕｂｏｉｓ‘ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ， Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９３）
【非特許文献４】Ｎａｐａｒｓｔｅｋ， Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．（１９９０），３３，１５５４−１５５９
【非特許文献５】Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．（１９９０），３，５３１−５４５
【非特許文献６】Ｓｋｕｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９１），１１５，１１３７−１１４８
【非特許文献７】Ｓａｓａｋｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８）， ２６３， １６， ５３６−１６，５４４
【非特許文献８】Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ （１９９５），３１０，１２５７−１２６１
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ラミニンペプチドの投与を含む全身性エリテマトーデスの治療法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、被験者の血漿から抗Ｒ３８（およびその誘導体）抗体を除去し、被験者の血漿へ戻す限外濾過法を含むＳＬＥ治療法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、Ｒ３８’およびペプチドＲ３８のその他の新規のアナログと誘導体を開示することであり、これらの投与法はＳＬＥの治療法を含む。
【００１４】
本発明の別の目的は、ペプチドＲ３８、Ｒ３８’、およびその他の構造的に関連のあるアナログとそれらの誘導体を用いたＳＬＥの診断法を提供することである。
【００１５】
本発明は、ＳＬＥ治療に使用されるペプチドＲ３８、ペプチドＲ３８’、Ｒ３８のその他の新規アナログおよび誘導体を含む医薬組成物または薬剤的に許容可能なその塩類とも関連している。
【００１６】
本明細書で使用される用語「ペプチドＲ３８」は、ペプチドＲ３８それ自体と、完全ペプチドの活性を保持するそのアナログ、誘導体、断片にも使用する。「アナログ」という用語は、例えば個々または複数のアミノ酸残基の相同置換により生じるペプチド変異体を含むことを意図している。「誘導体」という用語は、Ｒ３８の生物学的活性を同様に保有するＲ３８それ自体またはそのアナログに可能な軽微な化学変化に使用し、「断片」という用語は短いＲ３８分子に使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｃ７２マウスの抗ＤＮＡ抗体とラミニンペプチドとの直接結合を示す。
【図２】Ｒ３８、５２００、ＤＮＡ、ＤＮａｓｅ、およびヘパリンによるＣ７２とＲ３８アナログ５２００（本明細書では時にＲ３８’と記載する）との結合の阻害を示す。
【図３】ヒトループスモノクローナル抗ＤＮＡ抗体（ＤＩＬ６およびＢ３）とラミニンペプチドおよびその誘導体との結合を示す。
【図４】ヒトループスモノクローナル抗ＤＮＡ抗体（ＤＩＬ６およびＢ３）とラミニンペプチドおよびその誘導体との結合を示す。
【図５】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図６】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図７】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図８】ループスマウスの生存期間延長に対する５２００（Ｒ３８’）の効果を示す。
【図９】ループスマウスの生存期間延長に対するＲ３８（本明細書では５１００と記載することもある）投与の効果を示す。
【図１０】ＤＮＡおよびＲ３８アナログによるＣ７２とＲ３８との結合の阻害を示す。
【図１１】血清中の抗体濃度とＯＤ値の関係を示すグラフ。
【図１２】ある患者の投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体量の変化を示すグラフ。
【図１３】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１４】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１５】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１６】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１７】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１８】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１９】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２０】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２１】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２２】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２３】本発明の免疫吸着カラムの使用を示す本発明の実施形態の模式図。矢印「Ａ」はカラムの方向を示す。
【図２４】本発明の吸着カラム図。
【図２５】Ｃ７２抗Ｒ３８抗体の本発明の吸着カラムへの結合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施例で使用されるなど、本明細書および請求項で使用されるとおり、特に具体的に記載していない限り、表記していなくてもすべての数値の前に「約」があると考える。また、本明細書に記載の数値の範囲は、そのすべての下位の範囲を含む。
【００１９】
本用途は、「治験薬概要書」２００６年７月２５日付第００１版に添付されている付録のすべての材料を参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。したがって、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するためのラミニンペプチドの使用に関するものである。
【００２０】
本発明は、マウスのラミニン∝鎖のＣ末端領域由来のペプチドであるＲ３８を、病原性のループス抗体を用いて確認する観察結果を基礎としているため、ループス抗体との結合を競合することでＳＬＥを治療できる可能性があると考えられる。
【００２１】
さらに、本発明は全身性エリテマトーデス治療におけるラミニン由来の２種類以上のペプチドの混合物の使用に関する。好適な実施形態では、少なくとも１つのペプチドはＲ３８またはそのアナログである。
【００２２】
本発明は、被験者の血漿からループス抗体（抗Ｒ３８およびその誘導体）を除去し、被験者の血漿へ戻す限外濾過法を用いて、ＳＬＥを有する被験者を治療する方法も提供する。１つの実施形態では、少なくとも１種類のペプチドがカラムに吸着するカラムクロマトグラフィーを用いて抗体を除去する。さらなる実施形態では、２種類以上のペプチドがカラムに吸着する。別の実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１ないし２２からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１を有する。別の実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０を有する。１つの実施形態では、カラムはＮＨＳ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラムである。
【００２３】
本発明は、尿中の抗体のラミニンのＲ３８成分との結合能を検出することを含む、ＳＬＥ患者の疾患の活動性をモニタリングする方法にも関する。この結合は、種々の検査パラメータを組み合わせることで評価される疾患の活動性と直接相関する。
【００２４】
Ｒ３８と結合する抗体量の増加は、ＳＬＥの活動期へ近づいていることを示し、抗体量の減少は寛解に近づいていることを示すと考えられる。したがって、本法は、ラミニンに特異的な抗体量の変化を検出する測定法を提供し、本症が活動期に入る前に治療を開始できるようにする。
【００２５】
本法は、尿を用いて実施可能であり、静脈穿刺が不要である、患者自身が使用できる簡易測定法も提供する。これは診断測定法、つまりＳＬＥの活動性を評価するルーチンの測定法として使用可能であり、疾患増悪の早期発見およびループス腎炎に対する早期治療的介入を可能にする。
【００２６】
特許文献１に記載の方法を用いて、Ｒ３８またはアナログ、断片または誘導体をそのような測定に使用できる。したがって、ペプチドＲ３８を固相に結合させ、患者の尿を用いてインキュベートできる。患者にＳＬＥ罹患が疑われる場合、ＳＬＥに罹患している場合、または本症の活動期に近づいている場合に、尿中のＲ３８結合抗体量が増加する。
【００２７】
Ｒ３８結合抗体は、当業者には既知の方法を用いて検出できる。そのような検出法の例は、ＥＬＩＳＡおよびその変形形態、化学発光等である。検出の実際の方法は、本測定の成功にとって重要ではない。次に、観察されたＲ３８結合抗体量を対照群で観察された数値と比較する。対照群は健康被験者または内部標準等の役割を果たす患者（観察された数値を同一患者の早期の数値と比較する等）からなる。このような方法で、患者の疾患の状態の特徴をまとめ、さらなる活動期または寛解状態の指標として使用する。薬剤的に許容可能なＲ３８ペプチドの塩類は、ペプチド分子のカルボキシ基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を含む。カルボキシ基の塩は当業者には既知の方法で生成されており、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄、または亜鉛等の無機塩と、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカイン等のアミンにより生成される塩等の有機塩基を有する塩とを含む。酸付加塩は、塩酸およびスルホンサン等の鉱酸を有する塩と、酢酸およびシュウ酸等の有機酸の塩とを含む。
【００２８】
医薬組成物は、唯一のペプチドまたは高分子キャリアあるいはポリマーと結合させた重合体あるいは複合体であるペプチドＲ３８等のラミニンペプチドを含む。本組成物は、薬剤的に許容可能な賦形剤を任意選択的に含む。代替の実施形態では、本組成物はペプチドＲ３８のみを含む。
【００２９】
投与経路は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、関節内、鼻腔内、くも膜下内、皮内、経皮、または吸入などがある。
【００３０】
ＳＬＥを治療する際のペプチドＲ３８または誘導体の有効量は、１回約１μｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇ（体重）と考えられる。これは当業者には容易に計算できる。投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、体重、併用療法の種類（あれば）、および投与頻度によって異なる。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明は患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法、すなわち１）患者の血漿を除去し、その血漿をＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、２）その血漿を患者の体内へ戻すステップとを含む方法を提供する。患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体量は、投与前より約６０％以上低く、投与前より約８０％以上低い症例もあれば、投与前より９０％以上低い症例もあり、血漿中抗３８抗体量が投与前より約９５％以上または９９％も低くなる症例もある。本発明の方法では、カラムに通した血漿すべてを患者に戻すため、血漿置換は不要である。
【００３２】
本発明のこれらの実施形態の長所は、
・ループス専用の第一治療法が得られる。ループス自己抗体と結合する特異的な抗原を標的とする。
・高効率の方法である。血漿からループスを引き起こす抗原のみを除去し、その他すべての重要な血漿成分を保持する。
・使用されているその他すべての既存の治療法（例；免疫抑制薬、非特異的な血漿アフェレーシス、全血漿交換）と比べて副作用が少ない。
・吸着カラムの操作が単純かつ容易である。
・治療の効率および効果が高いため費用対効果が高く、重症患者にかかる医療コスト全体が削減される。
【００３３】
実施例１３および図１２で示されるとおり、ＯＤ（光学密度４０５ｎｍ）を用いて測定したところ、患者の投与前の血漿中抗Ｒ３８（ＶＲＴ１０１）抗体量は約０．８であり、投与直後は約０．６であった。投与約２週間後の抗Ｒ３８抗体もさらに低下し、ＯＤ測定値は約０．２であった。図１１（ＯＤ値と血清中ＶＲＴ１０１濃度の関係）に記載の情報から、ＯＤ値の約７０％の低下（０．６から０．２）は、血漿中抗体濃度の９７％低下に相当する。
【００３４】
抗Ｒ３８抗体量は約１〜５週間低下し続け、投与直後の濃度を下回り、７〜８週間かけて投与前の濃度に緩徐に戻った。したがって、さらなる実施形態では、本発明はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性のある吸着カラムを用いて患者の血漿を限外濾過的に治療することにより、血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法を提供し、このとき抗体量は約１〜５週間にわたり低く、投与直後の濃度を下回り、その後投与前の濃度まで徐々に上昇する。投与直後から投与２週間後までの抗体量の変化の割合は８０％を超え、９０％を超える症例もあり、９５％または９７％を超える症例もある。さらに、抗体量が投与前の濃度に戻るのに少なくとも３週間、４週間、症例によっては５または６週間かかることもある。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は本発明の限外濾過療法に使用する抗原特異的な免疫吸着カラムを提供する。カラムは１）ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するリガンドペプチドまたはその変異体あるいは誘導体と、２）リガンドペプチドが共有結合する基質を含むカラムとを備える。１つの実施形態では、本発明の免疫吸着カラムはＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムである。
【００３６】
ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムはリガンドペプチドであるＲ３８が共有結合してＤＶ２吸着装置タイプの使い捨て医療用デバイスを形成するＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズマトリックスを含むプラスチックケーシングを備え、血漿アフェレーシス施行時にヒト血漿中の抗Ｒ３８抗体を可逆的に結合させる。
【００３７】
ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムは、標準的な血漿アフェレーシス施行時に使用するようにデザインされている。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムの上側出口と下側出口は、対応する血漿アフェレーシス装置の入口または出口ラインに適合する標準的なコネクタである。血液除去、血漿からの血球分離、これらの血球の体内循環への返還からなる通常の血漿アフェレーシスでは、新鮮血漿または代用物で希釈する。本法を用いて血流から抗体を取り除き、それにより抗体が標的を攻撃できないようにする。
【００３８】
本発明は、ループス自己抗体に特異的な初めての血漿アフェレーシスを提供する。本法では、ループス患者の血漿をＶＲＴ１０１（Ｒ３８）免疫吸着カラムに通す（図２４）。本発明の方法では、患者の血漿を患者に戻すため、新鮮血漿および血漿代替物を用いて希釈する必要はない。
【００３９】
病原性のループス自己抗体をカラムに結合させることで除去し、残りの血漿成分を患者に再度輸血するため、重要な血漿成分が失われることはない。Ｒ３８はＣＮＢｒ活性化セファロースと共有結合させ、５２ｍｌ吸着装置タイプの使い捨て医療用デバイスを形成するセファロースビーズマトリックスを含むプラスチックケーシングを備えるＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムを形成し、血漿アフェレーシス施行時にヒト血漿中の各病原体を可逆的に結合させる。
【００４０】
ケーシングは規定のポリカーボネートから作られ、ＰＴＦＥおよびＰＥＴ膜を含む。ケーシング材料に必ず必要であったのは、
・ＶＩクラスのプラスチックについてＵＳＰの要件を満たす、
・意図した使用に対してＥＮ ＩＳＯ １０９９３の要件を満たす、
・エチレンオキシドによる減菌に適する、
・再生時に使用されるｐＨ値に抵抗性を示すなどである。
カラムのケーシングは上部、中央部、底部の３種類の部品からなる（図２５）。３種類とも最終的には接着剤を用いない方法で結合される。
ケーシングのサイズ仕様
【００４１】
上部は中央の雌ルアーコネクタに取り付けられ、対応するルアーキャップ（外側の切り取りラベルおよび内側にある殺菌バリアとして疎水性の膜で密閉された換気穴を有する円形部）で密閉され、単一膜層（ＰＥＴ、１１μｍ）が上部の内径を完全に被覆する。
【００４２】
中央の雌ルアーコネクタには、アフェレーシス時に血漿輸送（流入ライン）に使用される雄ルアーロックを有する吸着材用のチューブシステムのための安定した特徴的な取り付け具が必要である。このような標準的なコネクタの形状により、接続失敗、血漿喪失、および汚染のリスクは低くなる。使用時まで蓋で密閉する。
【００４３】
治療および再生時に基質の圧増大とその後エアポケットが生じるのを避けるため、ケーシングは蓋に円形に配列される穴から自己換気する。吸着材を充填した後、ラベルでこれらの穴を密閉し、生理食塩水の蒸発およびその後のセファロース懸濁液の劣化を防ぐ。治療時および貯蔵時も吸着材含有物が汚染されるのを防ぐため、換気穴を内側から疎水性殺菌バリアで密閉する。吸着材の全内径上の膜層は、貯蔵、輸送、および取り扱い時にセファロースが吸着材の流入コネクタへ入るのを阻止できる。さらに、入ってくる血漿がセファロース表面に分布するのも助ける。
【００４４】
中央部は吸着材の実際の容積を補填する、雌ルアーコネクタを有する側部の単一のポリカーボネート製シリンダーであり、製造時にセファロースが充填される。コネクタは対応する蓋で密閉される。流出チューブはこのコネクタには適合していないため、セファロースが戻りラインに入って患者の体内に入る危険はない。
【００４５】
底部には中央の雄ルアーコネクタおよびＰＥＴ膜層（孔サイズ１１μｍ）が取り付けられている。
【００４６】
標準的な中央の雄ルアーコネクタはチューブセットの流出ライン上で対応する部品のみ取り付けられるように規定されており、流入ラインと流出ラインの組み合わせの不適合性を防止する。このコネクタも使用時まで蓋で密閉される。
【００４７】
１１ μｍの膜の孔サイズは十分小さいため、選択したアガロースゲル基質のビーズを保持することが可能である。このアガロースゲルはＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ等で、サイズの分布は４５ないし１６５μｍである。さらに、第２の独立した安全システムとして、流出コネクタと流出チューブの間に孔サイズが５μｍの減菌粒子フィルタを使用する必要がある。
【００４８】
クロマトグラフィの基質は、十分量のペプチドまたは抗体の結合に適するアガロースを基剤とするビーズ形成アガロースゲル基質と規定される。このペプチドまたは抗体は物理的・化学的安定性が高く、吸着率は低く、血漿流速は医学的に安全かつ技術的に実現可能な流速に基づいている。
【００４９】
１つの実施形態では、Ｌｕｐｕｓｏｒｂ吸着材として市販のＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ＦＦを選択した。この４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは減菌仕様であり、生物汚染度が低く、ヒト血漿や再生溶液のｐＨの範囲に耐え得ることが可能である。リガンド結合に使用される化学物質に耐性があり、結合に適する部位を提供する。吸着はごくわずかで、流速はヒト血漿分離に適しており、ビーズは保持可能なサイズで品質保持期間が長い。
【００５０】
４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは、活性化、リガンドの結合、および阻害後のアフィニティー・クロマトグラフィーのベース基質として用いられる仕様になっている。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４ＦＦは架橋アガロース（４％）を含む球形のビーズを含み、ビーズのサイズは９５％超が４５ないし１６５μｍの範囲（平均９０μｍ）となるように規定されている。このセファロースで得られる流速は血漿アフェレーシスにとって技術的に実現可能かつ医学的に安全である流速と一致している（部位によらず、１５ないし２５ ｍｌ／分）。ビーズはｐＨの範囲を２ないし１２、圧は最高２．０バールという特徴を維持している。
【００５１】
４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは、広範囲の物質（吸着材の製造および使用時に使用される有機溶媒および水溶液など）に対し高い化学的安定性を示している。また、セファロース上に荷電基がないため、実質的に分解物（アガロース由来の炭水化物）の漏出がなく、非特異的な結合もない。
【００５２】
架橋が高度なため、４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは高圧減菌で容易に減菌可能であり、出荷規格の一環として極めて低い生物汚染度から開始される。さらに、セファロースは２０％エタノールに溶解した状態で供給され、微生物汚染はさらに低減される。このような条件下でのＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭの品質保持期間は５年である。
【実施例】
【００５３】
（ペプチド）
【００５４】
マウスラミニン∝鎖のＣ末端由来のペプチドＲ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３５、Ｒ３７、およびＲ３８（本明細書では「５１００」および「ＴＶ
５１００」とも呼ぶ）およびマウスラミニン∝鎖のＮ末端由来のペプチドＲ１８を用いて試験を行った。ペプチドは１７ないし２２ ｍｅｒの合成ペプチドであり、Ｆ‐ｍｏｃ法で調製される（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｌ．Ａ． ＆ Ｈａｎ、Ｇ．Ｙ.（１９７２），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，２７、３４０４）。これらのペプチドは、バイオテクノロジー分野の当業者に既知の方法でも製造できた。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡの群から選択される核酸を用いて、任意のペプチドを生体細胞培養で生産し、採取できる。ペプチドの配列を表１に示す。表１：ラミニン由来ペプチド
（＊）残基名は上のＳｋｕｂｉｔｚに従う
【００５５】
本実施例で対照として使用するその他のラミニンペプチドは、ＡＳ３１（残基ＹＩＧＳＲを含む）、ＡＣ１５、Ｆ９（その他のラミニンペプチド）、ラミニン∝鎖の球形部の第４ループのペプチドＲ２７などである。
【００５６】
厳密にはＲ３８由来の断片またはアナログであるその他のペプチドを作製し、下の表２に示す。表２に開示しているペプチド５２００および５１０１ないし５１１１は、上の表１のペプチドと同じ方法で作製した。表２のペプチドは、ヒトＲ３８（５３００）、Ｒ３８の断片、５３００由来の断片５１１１、またはＲ３８のアナログを含み、当業者に既知の技術に従って、１つまたは複数の点置換を行った。これらのペプチドを作製し、特にペプチドＲ３８の実効電荷を変えることで生じる抗ＤＮＡ抗体の結合作用に対する効果について検討した。
表２：マウスＲ３８ペプチドの合成ペプチドアナログ
ａ．ａ．＝アミノ酸
（モノクローナル抗体）
【００５７】
Ｃ７２マウス抗ＤＮＡ抗体は（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１ループスマウス由来であり、Ｅｉｌａｔ Ｄ． ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７ ３６１−３６８に記載されたハイブリドーマ技術を用いて得られた。モノクローナル抗ＤＮＡ抗体ＤＩＬ６およびＢ３はループス患者由来であり、Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９３ １７８７−１７９９およびＥｈｒｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒ．（１９９５）４８ ７０５−７１１に記載されたハイブリドーマ技術を用いて得られた。
【００５８】
以下の説明はラミニンおよび本明細書で開示されるペプチドに特異的な抗体の使用を意図していることを理解する必要がある。ラミニンおよびＲ３８とそのアナログならびに誘導体に特異的なペプチドを製造する方法は、当業者には既知である。これに関して本文に既定の参照文（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９８８）を含め、参照しながらその内容を本明細書に組み込む。本参照文は、ラミニンペプチドに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体等、単一特異性の抗体を得るため使用される方法を開示する。
（抗ペプチド（直接結合）ＥＬＩＳＡ）
【００５９】
ウェルをペプチド１０μｇ／ｍｌで被覆し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶解１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックし、適切に希釈した血漿またはモノクローナル抗体を用いて反応させ、アルカリホスファターゼと結合させた抗ヒトまたは抗マウス免疫グロブリン酵素を用いてインキュベートした。基質（Ｓｉｇｍａ １００ホスファターゼ基質タブレット）を添加し、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ分光器を波長４０５ｎｍで用いて着色することでこれを検出した。
（競合的阻害試験）
【００６０】
競合的阻害試験において、種々の濃度の阻害物質（例えばペプチド、ＤＮＡ、ヘパリン）またはＤＮａｓｅを用いて４５分間室温でインキュベートし、前述のとおり残存する結合物をＥＬＩＳＡにより評価した。阻害率（％）の計算は以下の通り。
Ｏ．Ｄ．結合（阻害物質なし）−Ｏ．Ｄ.結合物（阻害物質あり）ｘ１００／Ｏ．Ｄ．結合物（阻害物質なし）＝阻害率（％）
【実施例１】
【００６１】
ラミニンペプチドとＳＬＥ抗体の結合
Ａ：ラミニン∝鎖のＣ末端ペプチドとマウスＳＬＥ抗体との結合。
上述の通り、Ｃ７２マウス抗ＤＮＡ抗体とラミニンペプチドの相互作用を、ＥＬＩＳＡを用いて解析した。Ｃ７２条件培地を種々の希釈を用いてＰＢＳで希釈した。結果を図１に要約し、Ｃ７２抗ＤＮＡ抗体がラミニン∝鎖のペプチドＲ２８およびＲ１８とではなく、５２００、Ｒ３７、およびＲ３０などのペプチドと結合することを示す。対照マウス抗体である抗ＨＥＬ Ｈｙ５はペプチド５２００と結合しなかった（データなし）。
【００６２】
Ｂ：ＤＮＡおよびヘパリンによるＣ７２と５２００との結合阻害の阻害
Ｃ７２と５２００の結合について、５２００、Ｒ３８、Ｒ１８、ヘパリン、ＤＮＡ、およびＤＮａｓｅを用いたインキュベーションの前と後に試験を行った。結果を図２に要約し、本発明のペプチドであるＲ３８または５２００によるＣ７２と５２００との結合阻害がＤＮＡおよびヘパリンにより阻害されることを示す。阻害率は、阻害剤を用いてインキュベーションした後のＯ．Ｄ．の低下率である。
【実施例２】
【００６３】
ポリクローナルマウス抗体とペプチド５２００との結合
直接結合ＥＬＩＳＡ法によりＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ尿中抗体とペプチド５２００の相互作用を解析したところ、特異的な結合が認められた。そのため、少なくともマウス５匹（ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒまたは対照マウス（例；ＢＡＬＢ／ｃ））の蓄尿を、上述の通りＲ３８’（５２００）、Ｒ１８、またはＤＮＡで被覆したウェルに添加し、結合した５２００についてＥＬＩＳＡを用いて試験した。
【００６４】
マウス尿中免疫グロブリンと５２００との結合
各群は蓄尿からなる。
Ｕ．Ｄ．‐未検出
（＊）４０５ ｎｍでのＯ．Ｄ．
【実施例３】
【００６５】
ヒトモノクローナルループス抗体とペプチド５２００との結合
ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体ＤＩＬ６およびＢ３はループス患者由来であり、ハイブリドーマ法を用いて得られた。図３および４に示されるとおり、これらの抗体は試験対象のその他のラミニンペプチドではなく、ペプチド５２００と結合することが確認された。図３および４では、ペプチドは上または以下を意味する。ＡＳ３０はＲ２７、ＡＳ１９はＲ３５、ＡＳ３５はＲ２６、ＡＳ１７はＲ２８、ＡＳ６はＲ１８。
【実施例４】
【００６６】
マウスＳＬＥの臨床経過に対するＲ３８（５１００）およびＲ３８’の効果
ペプチドＲ３８がＳＬＥの経過に影響を及ぼすかどうか調べるため、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの疾患に対する効果について試験を行った。ＰＢＳ ０．１ ｍｌ中に溶解した５２００ ６０μｇ（Ｒ３８’単独または各３０μｇでペプチドと混合）を週齢６週の雌ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに週１回、１６週間腹腔内投与し、マウスの生存率（図８）および腎組織を評価した。
【００６７】
ＰＢＳ ０．１ ｍｌ中に溶解した５１００（Ｒ３８）または５３００（ヒトＲ３８）５０μｇを週齢６週の雌ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに週３回腹腔内投与し、マウスの生存率（図９）および腎組織を評価した。対照マウスには、リン酸緩衝液０．１ ｍｌを投与した。試験群および対照群にはマウス１２ないし１５匹を含めた。
【００６８】
５１００、５２００、または５３００を投与したＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存率をＰＢＳ投与マウスと比較した。図８および９に示されるとおり、５１００または５２００を投与したマウスの生存率は対照マウスより有意に高かった。図８および９では、ｘ軸に示した時間（日数）はマウスの週齢である。５ヵ月後に各群２匹を屠殺し、光学顕微鏡を用いて腎臓を評価した。対照マウスの腎臓には半月体および硬化を有する重度のびまん性の増殖性糸球体腎炎が認められ、５１００または５２００投与マウスでは軽度の増殖性変化が認められたものの半月体および硬化は認められなかった。
【実施例５】
【００６９】
抗Ｒ３８抗体と疾患の活動性の相関性の分析
活動正および非活動性の腎疾患の有無によらず、ループス患者由来の尿を繰り返し採取し、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８抗体の有無について試験を行った。疾患の活性度についても承認された臨床パラメータおよび血清学的パラメータ（Ｌｏｃｋｓｈｉｎ Ｍ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ（１９８４）７７ ８９３−８９８）を用いて評価し、抗Ｒ３８抗体量との相関性を比較した。上述のとおり、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８抗体について、ＳＬＥ患者３７例の尿検体１０３件を用いて試験を行った。非腎疾患患者由来の検体が２３件、腎疾患患者由来の検体が８０件であった。さらにＳＬＥと無関係の腎疾患患者由来の検体１２も試験対象とした。
【００７０】
以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．０１￥０１
【００７１】
１９種類の臨床パラメータおよび検査パラメータ（上のＬｏｃｋｓｈｉｎ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）を含む活動性スコアによると、腎疾患患者の検体の陽性度は通常活動している疾患と相関していた。これらのパラメータには、脱毛症、発疹、発熱、漿膜炎、関節痛／関節炎、粘膜潰瘍、神経性事象、倦怠感、眼底の変化、結節、脾臓などの臨床基準の有無または状態の評価ならびにＥＳＲ（赤血球沈降速度）、抗ＤＮＡ抗体、補体（Ｕ／ｍｌ）、クレアチニン、ヘモグロビン（ｇ／ｄｌ）、ＰＬＴ血小板（／ｍｍ２）または検尿などの血液検査を含めた。これらのパラメータの評価は、上のＬｏｃｋｓｈｉｎの記載どおりに測定する。得られた全割合は、評価したパラメータのみを反映している。
【００７２】
尿検体を１回以上試験した患者もあり、臨床活動性と抗Ｒ３８結合量の間に良好な相関が認められた。異なる３例のループス患者由来の代表的な３つの例を図５、６、および７に示す。この場合、ｘ軸は病院訪問回数を、ｙ軸は観察された結合（ＯＤ ４０５ｎｍ）または蒸気の活動性スコアの割合を示す。これらの図からわかるとおり、ペプチドＲ３８を用いた測定法により、疾患の活動性について信頼性の高いモニタリング法が得られた。
【実施例６】
【００７３】
抗５２００Ｒ（３８’）抗体と疾患の活動性の相関性の分析 さらに実験において、ループス患者由来の尿検体１７８件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体２４件、ない検体２２件）を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５２００抗体の有無について試験を行った。以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．００１
【実施例７】
【００７４】
抗５１００（Ｒ３８）抗体と疾患の活動性の相関性の分析
ループス患者２１例由来の尿検体４５件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体若干とない検体若干）を採取し、上述のとおり直接ＥＬＩＳＡにより抗５１００抗体の有無について試験を行った。
【００７５】
以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．０３
【実施例８】
【００７６】
抗５２００（Ｒ３８’）抗体と疾患の活動性の相関性の分析
ループス患者２１例（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体とない検体）由来の尿検体５２件を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５２００抗体の有無について試験を行った。
【００７７】
以下の結果が得られた。
【実施例９】
【００７８】
抗５１０８、５１０１、５１０９、および５１１０抗体と疾患の活動性の相関性の分析
実施例７および８のループス患者の一部から尿検体２４件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体２件、ない検体２２件）を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５１０８との結合について試験を行った。
【００７９】
以下の結果が得られた。
【００８０】
ペプチド５１０１、５１０９、および５１１０との結合でも同様の結果が確認された。
【実施例１０】
【００８１】
Ｃ７２およびＢ３のＲ３８およびペプチドアナログとの直接結合
本明細書で記載した方法に従い、本発明のペプチドのＣ７２マウス抗ＤＮＡ抗体およびＢ３ヒト抗ＤＮＡ抗体との直接結合能について試験を行った。直接結合試験の結果を表３で報告する。
表３：Ｃ７２およびＢ３のＲ３８およびアナログペプチドとの直接結合
＊ＮＴ：未試験
＋：１時間後の直接結合ＥＬＩＳＡ試験のＯ．Ｄ．
‡：２時間後の直接結合ＥＬＩＳＡ試験のＯ．Ｄ．
【実施例１１】
【００８２】
ペプチドアナログによるＣ７２とＲ３８との結合の競合的阻害
競合的阻害試験では、Ｃ７２抗ＤＮＡ抗体との結合について、各ペプチドがＲ３８（５１００）とどのように競合するのかを比較した。本明細書で記載した方法に従って実施した試験結果を下の表４に開示し、図１０を参照しながらさらに説明する。
表４：Ｃ７２のＲ３８との結合阻害
＊ＥＬＩＳＡ試験においてＣ７２抗ＤＮＡ抗体のペプチド５１００（Ｒ３８）への結合が５０％阻害される競合阻害物質の濃度。
＊ＮＩ＊阻害されず
【実施例１２】
【００８３】
本実施例は、被験者の血液から病原性ループス抗体である抗Ｒ３８（ＴＶ‐５１００）（およびその誘導体）を限外濾過法を用いて除去するためのカラムの使用を示す。
【００８４】
カラムの作製
ペプチドＲ３８を結合緩衝液５ ｍｌ中１ ｍｇ／ｍｌの濃度で結合緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解した。Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラム（ファーマシア社、１７‐０７１７‐０１）５ ｍｌを使用する。カラム中のイソプロパノールを冷たい（４℃）ＨＣｌ １ ｍＭ ３０ ｍｌでカラムから洗い出し、次にシリンジ（２．５ ｍｌ／分）を用いてペプチド溶液５ ｍｌをカラムに注入した。カラムを密閉し、室温で３０分間直立させた。次に緩衝液Ａ（０．５ Ｍエタノールアミン、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）３０ ｍｌおよび緩衝液Ｂ（０．５Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４）でカラムを連続３回洗浄し、次にｐＨが中性の緩衝液（０．０５ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．１％ ＮａＮ３）で洗浄した。
【００８５】
抗Ｒ３８（ＴＶ‐５１００）抗体の親和性吸着 ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１５ ｍｌ後、溶出緩衝液（０．１ Ｍ塩酸グリシン）１５ ｍｌ、次にＰＢＳ ５０ ｍｌでカラムを洗浄した。Ｃ７２抗体または患者の血漿検体を０．４５ミクロンフィルタで濾過した。適合したシリンジを用いて、２．５ ｍｌ／分の速度で検体をカラムに入れた。次にＰＢＳ ５ｍｌでカラムを洗浄し、流液形を再度カラムに入れた。検体（原形および流液形）とＲ３８の結合について、抗Ｒ３８ＥＬＩＳＡにより試験を行った。
【００８６】
即時例では、マウスＣ７２とＳＬＥ患者の血漿をＲ３８カラムに入れた。原形検体およびカラムの流液形において、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８結合を評価した。
【００８７】
表５に示されるとおり、カラムに対する親和性吸着により、マウスモノクローナルＣ７２の抗Ｒ３８活性の９９％が、ヒトＳＬＥ患者の血漿中の抗体の３０ないし６０％が除去された。したがって、ＳＬＥ患者の血漿の親和性吸着によりＳＬＥを処理し、患者の静脈内に血漿を戻した。
表５：親和性吸着
【実施例１３】
【００８８】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）患者を対象とするＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムを用いた第Ｉ／ＩＩ相試験
ルーチンの血漿アフェレーシス時に、ＳＬＥ患者１０例に対しＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムを単回実施して処理した。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムは、Ｒ３８（ＶＲＴ１０１）ペプチドを含む親和性吸着カラムである。本試験組入れ前の患者スクリーニングは、血漿アフェレーシス予定日の３ヵ月前から５日前までである。血漿アフェレーシス実施日に患者を本試験に組み入れ、ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムを用いて１．５ないし２．２５時間にわたって処理する。次にＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラム処置後８週間にわたってフォローアップを行う。
【００８９】
最初の患者に処理を行い、２ヵ月間のフォローアップ期間を完了した。有害事象は報告されず、本処置の忍容性は良好であった。予備的有効性に関して、図１２は施行前、施行後、フォローアップ期間中の患者のＶＲＴ１０１抗体量の変化を示す。図１２に示されるとおり、抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量はＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ血漿アフェレーシス後に減少し、５週間以上経過して元の抗体量に戻った。
【００９０】
同じ方法に従って得られた追加の患者情報を図１３ないし２２に示す。０１３および０２７の患者では、抗ＶＲＴ１０１抗体量に対する効果は認められなかった。残りの患者はいずれもフォローアップ来院２または３からフォローアップ来院４または５まででわかるように抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量が正常値まで減少した。ただし、ＶＲＴ１０１値が減少したものの正常値を上回った００３の患者を除く。患者１０例に有意なリバウンド効果は認められなかった。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭの処置と関連のある重篤な有害事象は報告されなかった。
【実施例１４】
【００９１】
ＳＬＥ患者の血漿中抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量の評価
【００９２】
ループス患者（ＬＭ）の血漿１０ｍｌをカラムに入れた。ＰＢＳ（少なくとも５カラム容量）でカラムをすすぎ、ＨＣＬ １０ｍ／Ｍ（ｐＨ３．０）に溶解した０．０５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、画分１ ｍｌを採取した。画分ピーク（ＥＬＩＳＡにより抗ＶＲＴ１０１結合を用いて同定）は７ないし９で、免疫拡散法（ＲＩＤ）またはＥＬＩＳＡによりＩｇＧ含量について試験を行った。元の血漿中免疫グロブリン量は１６４ ｍｇ（１６４０ ｍｇ／ｄＬの濃度より）であり、ピーク画分は２００μｇ（ＲＩＤにより濃度は６．９ ｍｇ／ｄＬ未満）となった。
【００９３】
これらの結果は、特異的抗体の量が免疫グロブリン含量中でごくわずかである、つまり免疫グロブリン全体の約０．１２％であることを示している。
【実施例１５】
【００９４】
Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムの容量
小規模な実験において、Ｃ７２抗体を用いたＬｕｐｕｓｏｒｂカラムの飽和により、Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムの結合能について以下のとおり試験を行った。：免疫グロブリン約１２μｇ／ｍｌを含有するＣ７２の上清３５０ ｍｌを５ ｍｌ Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムに入れた。流液形の画分を採取し、ＥＬＩＳＡによりＶＲＴ１０１結合について試験を行った。
【００９５】
最初の画分は６０ ｍｌ、以降の画分は各３０ｍｌとした。図２６からわかるとおり、最初の画分とＶＲＴ１０１との結合はごくわずかである。カラムのＣ７２抗体除去能は上清（ＩｇＧ １．８ｍｇ）１５０ｍｌ後に飽和状態となり、カラムが樹脂処理した免疫グロブリン／ｍｌ少なくとも３６０μｇと結合し得ることを示している。
【実施例１６】
【００９６】
血漿アフェレーシスを実施し、血漿容量および流速などの技術パラメータを規定するＬｕｐｕｓｏｒｂの性能を測るため、ヒツジ３匹を用いて、１ヵ月に２ないし３回血漿アフェレーシス実験を実施した。ヒツジに麻酔をかけ、挿管し、血漿３リットルをアフェレーシスした。流速は１６ないし２０ ｍｌ／分に設定した。
【００９７】
血漿はカラムを問題なく持続的かつ均一に通過した。挿管時の麻酔が原因で２回目実施後にヒツジ１匹が死亡した。残りのヒツジはアフェレーシスに対し即時または遅延性の反応を示さず、血液学的および生化学的血液パラメータは元の結果から有意な変化を示さなかった。
【００９８】
前記の記述および実施例は単なる例示であることと、多くの変更形態および変形形態は下で主張されるとおり、本発明の目的と精神から逸脱することなく１人の当業者によってなされたものであることを理解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデスを治療および検出するためのペプチドＲ３８および関連アナログなど、ラミニンペプチドおよびラミニン誘導体の使用に関する。本発明は、全身性エリテマトーデスの治療法も提供する。本発明は、患者の血漿中抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法もさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、多臓器に関連する自己免疫疾患である。自己免疫性炎症過程に腎臓が関与することで生じるループス糸球体腎炎が、ＳＬＥの罹患および死亡の主因である（非特許文献１）。
【０００３】
血清学上のＳＬＥの特徴は、血清中に種々の自己抗体が生じることであり、なかでも最も顕著にみられるのは抗ＤＮＡ自己抗体である（非特許文献２）。種々の炎症性および自己免疫性の疾患で生じる抗ＤＮＡ抗体価は低いが、主にＳＬＥでは高値であり、ＳＬＥの実際の診断は抗体価の高い抗ＤＮＡ抗体と低補体価を組み合わせて行う（非特許文献３）。
【０００４】
ループス患者由来腎の染色またはマウス由来ループスの染色により、免疫グロブリンと糸球体基底膜（ＧＢＭ）の結合が示されている（非特許文献４）。ループス患者の腎臓および硫酸化グリコサミノグリカンと交差反応を示したＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｒマウスから抗ＤＮＡ抗体が溶出されることも示されたが、血清中の抗ＤＮＡ抗体はこの交差反応を示さなかった（非特許文献５）。これらの結果は、細胞外基質（ＥＣＭ）が、腎炎原性自己抗体の標的であるループスの病因に関与していることを示唆している。
【０００５】
Ｔｅｒｍｍａｔ Ｒ．Ｍ．らは、ラミニンとヘパリンのように、ＥＣＭの成分がマウスのモノクローナル抗体抗ＤＮＡ抗体と交差反応を示すことを開示している（非特許文献６）。特許文献１は、活性ループスを有する患者の尿に抗ＥＣＭ抗体が存在することを開示している。さらに、これらの抗体とＥＣＭの２００ ｋＤａのラミニン成分との交差反応と、これらの抗ＥＣＭ／ラミニン抗体の尿中検出に基づくＳＬＥ検査についても開示している。
【０００６】
Ｒ３８は、マウスのラミニン∝鎖のＣ末端領域から単離したペプチド配列である（非特許文献７では残基２８９０ないし２９１０、非特許文献８では残基２８５１ないし２８７１）。Ｒ３８の位置は、第４および第５ループの球状領域の接合部である（上の非特許文献７のペプチドＧＤ−２であり、
ＫＥＧＹＫＶＲＬＤＬＮＩＴＬＥＦＲＴＴＳＫ (ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）
のアミノ酸配列からなる）。
【０００７】
現在のＳＬＥ療法は、過剰反応する免疫系を抑制するコルチコステロイドに限定されている。この療法は特異的ではなく、避けられない副作用自体が致死性であると考えられる。さらに、免疫抑制療法は複雑で、臨床症状、血清学的血液検査、および腎臓生検を組み合わせた結果で開始が決まる。したがって、ＳＬＥに特異性が高く、免疫抑制剤の副作用がない療法および疾患の活動性を評価する特異性の高い、侵襲性の低い測定法が必要である。実際に、最近のレビュー（非特許文献９）によると、血液検査はＳＬＥの確定診断に有用であるが、「疾患の活動性をモニタリングするにはあまり有用ではない」とされている。
【０００８】
上述のいずれの参考文献も、ペプチドＲ３８またはそのアナログの投与を用いたＳＬＥの治療法について開示していない。さらに、上述のいずれの参考文献も、ＳＬＥの診断検査またはＳＬＥの活動性のモニタリングにおけるＲ３８のペプチドの使用について開示していない。上述のすべての特許および参考文献の内容を参照により本明細書に組み込む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第６７０，４９５号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｌａｒｃｏｎ−Ｓｅｇｏｖｉａ Ｄ． ｉｎ：Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｅｄ．Ｓｃｈｕｍａｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｒ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ａｔｌａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ （１９８８） ｐｐ．９６−１００
【非特許文献２】Ｎａｐａｒｓｔｅｋ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９３）， １１，７９−１０４
【非特許文献３】Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｉｎ：Ｄｕｂｏｉｓ‘ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ， Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９３）
【非特許文献４】Ｎａｐａｒｓｔｅｋ， Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．（１９９０），３３，１５５４−１５５９
【非特許文献５】Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．（１９９０），３，５３１−５４５
【非特許文献６】Ｓｋｕｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９１），１１５，１１３７−１１４８
【非特許文献７】Ｓａｓａｋｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８）， ２６３， １６， ５３６−１６，５４４
【非特許文献８】Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ （１９９５），３１０，１２５７−１２６１
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ラミニンペプチドの投与を含む全身性エリテマトーデスの治療法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、被験者の血漿から抗Ｒ３８（およびその誘導体）抗体を除去し、被験者の血漿へ戻す限外濾過法を含むＳＬＥ治療法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、Ｒ３８’およびペプチドＲ３８のその他の新規のアナログと誘導体を開示することであり、これらの投与法はＳＬＥの治療法を含む。
【００１４】
本発明の別の目的は、ペプチドＲ３８、Ｒ３８’、およびその他の構造的に関連のあるアナログとそれらの誘導体を用いたＳＬＥの診断法を提供することである。
【００１５】
本発明は、ＳＬＥ治療に使用されるペプチドＲ３８、ペプチドＲ３８’、Ｒ３８のその他の新規アナログおよび誘導体を含む医薬組成物または薬剤的に許容可能なその塩類とも関連している。
【００１６】
本明細書で使用される用語「ペプチドＲ３８」は、ペプチドＲ３８それ自体と、完全ペプチドの活性を保持するそのアナログ、誘導体、断片にも使用する。「アナログ」という用語は、例えば個々または複数のアミノ酸残基の相同置換により生じるペプチド変異体を含むことを意図している。「誘導体」という用語は、Ｒ３８の生物学的活性を同様に保有するＲ３８それ自体またはそのアナログに可能な軽微な化学変化に使用し、「断片」という用語は短いＲ３８分子に使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｃ７２マウスの抗ＤＮＡ抗体とラミニンペプチドとの直接結合を示す。
【図２】Ｒ３８、５２００、ＤＮＡ、ＤＮａｓｅ、およびヘパリンによるＣ７２とＲ３８アナログ５２００（本明細書では時にＲ３８’と記載する）との結合の阻害を示す。
【図３】ヒトループスモノクローナル抗ＤＮＡ抗体（ＤＩＬ６およびＢ３）とラミニンペプチドおよびその誘導体との結合を示す。
【図４】ヒトループスモノクローナル抗ＤＮＡ抗体（ＤＩＬ６およびＢ３）とラミニンペプチドおよびその誘導体との結合を示す。
【図５】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図６】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図７】ループス患者３例におけるループスの活動性スコアと尿中抗Ｒ３８抗体量との相関を示す。
【図８】ループスマウスの生存期間延長に対する５２００（Ｒ３８’）の効果を示す。
【図９】ループスマウスの生存期間延長に対するＲ３８（本明細書では５１００と記載することもある）投与の効果を示す。
【図１０】ＤＮＡおよびＲ３８アナログによるＣ７２とＲ３８との結合の阻害を示す。
【図１１】血清中の抗体濃度とＯＤ値の関係を示すグラフ。
【図１２】ある患者の投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体量の変化を示すグラフ。
【図１３】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１４】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１５】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１６】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１７】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１８】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図１９】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２０】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２１】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２２】本発明の方法およびデバイスを用いた投与前および投与後の血清中の抗Ｒ３８抗体に関する患者の個別データを示すグラフ。
【図２３】本発明の免疫吸着カラムの使用を示す本発明の実施形態の模式図。矢印「Ａ」はカラムの方向を示す。
【図２４】本発明の吸着カラム図。
【図２５】Ｃ７２抗Ｒ３８抗体の本発明の吸着カラムへの結合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施例で使用されるなど、本明細書および請求項で使用されるとおり、特に具体的に記載していない限り、表記していなくてもすべての数値の前に「約」があると考える。また、本明細書に記載の数値の範囲は、そのすべての下位の範囲を含む。
【００１９】
本用途は、「治験薬概要書」２００６年７月２５日付第００１版に添付されている付録のすべての材料を参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。したがって、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するためのラミニンペプチドの使用に関するものである。
【００２０】
本発明は、マウスのラミニン∝鎖のＣ末端領域由来のペプチドであるＲ３８を、病原性のループス抗体を用いて確認する観察結果を基礎としているため、ループス抗体との結合を競合することでＳＬＥを治療できる可能性があると考えられる。
【００２１】
さらに、本発明は全身性エリテマトーデス治療におけるラミニン由来の２種類以上のペプチドの混合物の使用に関する。好適な実施形態では、少なくとも１つのペプチドはＲ３８またはそのアナログである。
【００２２】
本発明は、被験者の血漿からループス抗体（抗Ｒ３８およびその誘導体）を除去し、被験者の血漿へ戻す限外濾過法を用いて、ＳＬＥを有する被験者を治療する方法も提供する。１つの実施形態では、少なくとも１種類のペプチドがカラムに吸着するカラムクロマトグラフィーを用いて抗体を除去する。さらなる実施形態では、２種類以上のペプチドがカラムに吸着する。別の実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１ないし２２からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１を有する。別の実施形態では、ペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０を有する。１つの実施形態では、カラムはＮＨＳ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラムである。
【００２３】
本発明は、尿中の抗体のラミニンのＲ３８成分との結合能を検出することを含む、ＳＬＥ患者の疾患の活動性をモニタリングする方法にも関する。この結合は、種々の検査パラメータを組み合わせることで評価される疾患の活動性と直接相関する。
【００２４】
Ｒ３８と結合する抗体量の増加は、ＳＬＥの活動期へ近づいていることを示し、抗体量の減少は寛解に近づいていることを示すと考えられる。したがって、本法は、ラミニンに特異的な抗体量の変化を検出する測定法を提供し、本症が活動期に入る前に治療を開始できるようにする。
【００２５】
本法は、尿を用いて実施可能であり、静脈穿刺が不要である、患者自身が使用できる簡易測定法も提供する。これは診断測定法、つまりＳＬＥの活動性を評価するルーチンの測定法として使用可能であり、疾患増悪の早期発見およびループス腎炎に対する早期治療的介入を可能にする。
【００２６】
特許文献１に記載の方法を用いて、Ｒ３８またはアナログ、断片または誘導体をそのような測定に使用できる。したがって、ペプチドＲ３８を固相に結合させ、患者の尿を用いてインキュベートできる。患者にＳＬＥ罹患が疑われる場合、ＳＬＥに罹患している場合、または本症の活動期に近づいている場合に、尿中のＲ３８結合抗体量が増加する。
【００２７】
Ｒ３８結合抗体は、当業者には既知の方法を用いて検出できる。そのような検出法の例は、ＥＬＩＳＡおよびその変形形態、化学発光等である。検出の実際の方法は、本測定の成功にとって重要ではない。次に、観察されたＲ３８結合抗体量を対照群で観察された数値と比較する。対照群は健康被験者または内部標準等の役割を果たす患者（観察された数値を同一患者の早期の数値と比較する等）からなる。このような方法で、患者の疾患の状態の特徴をまとめ、さらなる活動期または寛解状態の指標として使用する。薬剤的に許容可能なＲ３８ペプチドの塩類は、ペプチド分子のカルボキシ基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を含む。カルボキシ基の塩は当業者には既知の方法で生成されており、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄、または亜鉛等の無機塩と、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカイン等のアミンにより生成される塩等の有機塩基を有する塩とを含む。酸付加塩は、塩酸およびスルホンサン等の鉱酸を有する塩と、酢酸およびシュウ酸等の有機酸の塩とを含む。
【００２８】
医薬組成物は、唯一のペプチドまたは高分子キャリアあるいはポリマーと結合させた重合体あるいは複合体であるペプチドＲ３８等のラミニンペプチドを含む。本組成物は、薬剤的に許容可能な賦形剤を任意選択的に含む。代替の実施形態では、本組成物はペプチドＲ３８のみを含む。
【００２９】
投与経路は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、関節内、鼻腔内、くも膜下内、皮内、経皮、または吸入などがある。
【００３０】
ＳＬＥを治療する際のペプチドＲ３８または誘導体の有効量は、１回約１μｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇ（体重）と考えられる。これは当業者には容易に計算できる。投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、体重、併用療法の種類（あれば）、および投与頻度によって異なる。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明は患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法、すなわち１）患者の血漿を除去し、その血漿をＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、２）その血漿を患者の体内へ戻すステップとを含む方法を提供する。患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体量は、投与前より約６０％以上低く、投与前より約８０％以上低い症例もあれば、投与前より９０％以上低い症例もあり、血漿中抗３８抗体量が投与前より約９５％以上または９９％も低くなる症例もある。本発明の方法では、カラムに通した血漿すべてを患者に戻すため、血漿置換は不要である。
【００３２】
本発明のこれらの実施形態の長所は、
・ループス専用の第一治療法が得られる。ループス自己抗体と結合する特異的な抗原を標的とする。
・高効率の方法である。血漿からループスを引き起こす抗原のみを除去し、その他すべての重要な血漿成分を保持する。
・使用されているその他すべての既存の治療法（例；免疫抑制薬、非特異的な血漿アフェレーシス、全血漿交換）と比べて副作用が少ない。
・吸着カラムの操作が単純かつ容易である。
・治療の効率および効果が高いため費用対効果が高く、重症患者にかかる医療コスト全体が削減される。
【００３３】
実施例１３および図１２で示されるとおり、ＯＤ（光学密度４０５ｎｍ）を用いて測定したところ、患者の投与前の血漿中抗Ｒ３８（ＶＲＴ１０１）抗体量は約０．８であり、投与直後は約０．６であった。投与約２週間後の抗Ｒ３８抗体もさらに低下し、ＯＤ測定値は約０．２であった。図１１（ＯＤ値と血清中ＶＲＴ１０１濃度の関係）に記載の情報から、ＯＤ値の約７０％の低下（０．６から０．２）は、血漿中抗体濃度の９７％低下に相当する。
【００３４】
抗Ｒ３８抗体量は約１〜５週間低下し続け、投与直後の濃度を下回り、７〜８週間かけて投与前の濃度に緩徐に戻った。したがって、さらなる実施形態では、本発明はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性のある吸着カラムを用いて患者の血漿を限外濾過的に治療することにより、血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させる方法を提供し、このとき抗体量は約１〜５週間にわたり低く、投与直後の濃度を下回り、その後投与前の濃度まで徐々に上昇する。投与直後から投与２週間後までの抗体量の変化の割合は８０％を超え、９０％を超える症例もあり、９５％または９７％を超える症例もある。さらに、抗体量が投与前の濃度に戻るのに少なくとも３週間、４週間、症例によっては５または６週間かかることもある。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は本発明の限外濾過療法に使用する抗原特異的な免疫吸着カラムを提供する。カラムは１）ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するリガンドペプチドまたはその変異体あるいは誘導体と、２）リガンドペプチドが共有結合する基質を含むカラムとを備える。１つの実施形態では、本発明の免疫吸着カラムはＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムである。
【００３６】
ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムはリガンドペプチドであるＲ３８が共有結合してＤＶ２吸着装置タイプの使い捨て医療用デバイスを形成するＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズマトリックスを含むプラスチックケーシングを備え、血漿アフェレーシス施行時にヒト血漿中の抗Ｒ３８抗体を可逆的に結合させる。
【００３７】
ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムは、標準的な血漿アフェレーシス施行時に使用するようにデザインされている。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムの上側出口と下側出口は、対応する血漿アフェレーシス装置の入口または出口ラインに適合する標準的なコネクタである。血液除去、血漿からの血球分離、これらの血球の体内循環への返還からなる通常の血漿アフェレーシスでは、新鮮血漿または代用物で希釈する。本法を用いて血流から抗体を取り除き、それにより抗体が標的を攻撃できないようにする。
【００３８】
本発明は、ループス自己抗体に特異的な初めての血漿アフェレーシスを提供する。本法では、ループス患者の血漿をＶＲＴ１０１（Ｒ３８）免疫吸着カラムに通す（図２４）。本発明の方法では、患者の血漿を患者に戻すため、新鮮血漿および血漿代替物を用いて希釈する必要はない。
【００３９】
病原性のループス自己抗体をカラムに結合させることで除去し、残りの血漿成分を患者に再度輸血するため、重要な血漿成分が失われることはない。Ｒ３８はＣＮＢｒ活性化セファロースと共有結合させ、５２ｍｌ吸着装置タイプの使い捨て医療用デバイスを形成するセファロースビーズマトリックスを含むプラスチックケーシングを備えるＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムを形成し、血漿アフェレーシス施行時にヒト血漿中の各病原体を可逆的に結合させる。
【００４０】
ケーシングは規定のポリカーボネートから作られ、ＰＴＦＥおよびＰＥＴ膜を含む。ケーシング材料に必ず必要であったのは、
・ＶＩクラスのプラスチックについてＵＳＰの要件を満たす、
・意図した使用に対してＥＮ ＩＳＯ １０９９３の要件を満たす、
・エチレンオキシドによる減菌に適する、
・再生時に使用されるｐＨ値に抵抗性を示すなどである。
カラムのケーシングは上部、中央部、底部の３種類の部品からなる（図２５）。３種類とも最終的には接着剤を用いない方法で結合される。
ケーシングのサイズ仕様
【００４１】
上部は中央の雌ルアーコネクタに取り付けられ、対応するルアーキャップ（外側の切り取りラベルおよび内側にある殺菌バリアとして疎水性の膜で密閉された換気穴を有する円形部）で密閉され、単一膜層（ＰＥＴ、１１μｍ）が上部の内径を完全に被覆する。
【００４２】
中央の雌ルアーコネクタには、アフェレーシス時に血漿輸送（流入ライン）に使用される雄ルアーロックを有する吸着材用のチューブシステムのための安定した特徴的な取り付け具が必要である。このような標準的なコネクタの形状により、接続失敗、血漿喪失、および汚染のリスクは低くなる。使用時まで蓋で密閉する。
【００４３】
治療および再生時に基質の圧増大とその後エアポケットが生じるのを避けるため、ケーシングは蓋に円形に配列される穴から自己換気する。吸着材を充填した後、ラベルでこれらの穴を密閉し、生理食塩水の蒸発およびその後のセファロース懸濁液の劣化を防ぐ。治療時および貯蔵時も吸着材含有物が汚染されるのを防ぐため、換気穴を内側から疎水性殺菌バリアで密閉する。吸着材の全内径上の膜層は、貯蔵、輸送、および取り扱い時にセファロースが吸着材の流入コネクタへ入るのを阻止できる。さらに、入ってくる血漿がセファロース表面に分布するのも助ける。
【００４４】
中央部は吸着材の実際の容積を補填する、雌ルアーコネクタを有する側部の単一のポリカーボネート製シリンダーであり、製造時にセファロースが充填される。コネクタは対応する蓋で密閉される。流出チューブはこのコネクタには適合していないため、セファロースが戻りラインに入って患者の体内に入る危険はない。
【００４５】
底部には中央の雄ルアーコネクタおよびＰＥＴ膜層（孔サイズ１１μｍ）が取り付けられている。
【００４６】
標準的な中央の雄ルアーコネクタはチューブセットの流出ライン上で対応する部品のみ取り付けられるように規定されており、流入ラインと流出ラインの組み合わせの不適合性を防止する。このコネクタも使用時まで蓋で密閉される。
【００４７】
１１ μｍの膜の孔サイズは十分小さいため、選択したアガロースゲル基質のビーズを保持することが可能である。このアガロースゲルはＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ等で、サイズの分布は４５ないし１６５μｍである。さらに、第２の独立した安全システムとして、流出コネクタと流出チューブの間に孔サイズが５μｍの減菌粒子フィルタを使用する必要がある。
【００４８】
クロマトグラフィの基質は、十分量のペプチドまたは抗体の結合に適するアガロースを基剤とするビーズ形成アガロースゲル基質と規定される。このペプチドまたは抗体は物理的・化学的安定性が高く、吸着率は低く、血漿流速は医学的に安全かつ技術的に実現可能な流速に基づいている。
【００４９】
１つの実施形態では、Ｌｕｐｕｓｏｒｂ吸着材として市販のＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ＦＦを選択した。この４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは減菌仕様であり、生物汚染度が低く、ヒト血漿や再生溶液のｐＨの範囲に耐え得ることが可能である。リガンド結合に使用される化学物質に耐性があり、結合に適する部位を提供する。吸着はごくわずかで、流速はヒト血漿分離に適しており、ビーズは保持可能なサイズで品質保持期間が長い。
【００５０】
４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは、活性化、リガンドの結合、および阻害後のアフィニティー・クロマトグラフィーのベース基質として用いられる仕様になっている。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４ＦＦは架橋アガロース（４％）を含む球形のビーズを含み、ビーズのサイズは９５％超が４５ないし１６５μｍの範囲（平均９０μｍ）となるように規定されている。このセファロースで得られる流速は血漿アフェレーシスにとって技術的に実現可能かつ医学的に安全である流速と一致している（部位によらず、１５ないし２５ ｍｌ／分）。ビーズはｐＨの範囲を２ないし１２、圧は最高２．０バールという特徴を維持している。
【００５１】
４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは、広範囲の物質（吸着材の製造および使用時に使用される有機溶媒および水溶液など）に対し高い化学的安定性を示している。また、セファロース上に荷電基がないため、実質的に分解物（アガロース由来の炭水化物）の漏出がなく、非特異的な結合もない。
【００５２】
架橋が高度なため、４ＦＦ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭは高圧減菌で容易に減菌可能であり、出荷規格の一環として極めて低い生物汚染度から開始される。さらに、セファロースは２０％エタノールに溶解した状態で供給され、微生物汚染はさらに低減される。このような条件下でのＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭの品質保持期間は５年である。
【実施例】
【００５３】
（ペプチド）
【００５４】
マウスラミニン∝鎖のＣ末端由来のペプチドＲ２６、Ｒ２８、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３５、Ｒ３７、およびＲ３８（本明細書では「５１００」および「ＴＶ
５１００」とも呼ぶ）およびマウスラミニン∝鎖のＮ末端由来のペプチドＲ１８を用いて試験を行った。ペプチドは１７ないし２２ ｍｅｒの合成ペプチドであり、Ｆ‐ｍｏｃ法で調製される（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｌ．Ａ． ＆ Ｈａｎ、Ｇ．Ｙ.（１９７２），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，２７、３４０４）。これらのペプチドは、バイオテクノロジー分野の当業者に既知の方法でも製造できた。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡの群から選択される核酸を用いて、任意のペプチドを生体細胞培養で生産し、採取できる。ペプチドの配列を表１に示す。表１：ラミニン由来ペプチド
（＊）残基名は上のＳｋｕｂｉｔｚに従う
【００５５】
本実施例で対照として使用するその他のラミニンペプチドは、ＡＳ３１（残基ＹＩＧＳＲを含む）、ＡＣ１５、Ｆ９（その他のラミニンペプチド）、ラミニン∝鎖の球形部の第４ループのペプチドＲ２７などである。
【００５６】
厳密にはＲ３８由来の断片またはアナログであるその他のペプチドを作製し、下の表２に示す。表２に開示しているペプチド５２００および５１０１ないし５１１１は、上の表１のペプチドと同じ方法で作製した。表２のペプチドは、ヒトＲ３８（５３００）、Ｒ３８の断片、５３００由来の断片５１１１、またはＲ３８のアナログを含み、当業者に既知の技術に従って、１つまたは複数の点置換を行った。これらのペプチドを作製し、特にペプチドＲ３８の実効電荷を変えることで生じる抗ＤＮＡ抗体の結合作用に対する効果について検討した。
表２：マウスＲ３８ペプチドの合成ペプチドアナログ
ａ．ａ．＝アミノ酸
（モノクローナル抗体）
【００５７】
Ｃ７２マウス抗ＤＮＡ抗体は（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１ループスマウス由来であり、Ｅｉｌａｔ Ｄ． ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７ ３６１−３６８に記載されたハイブリドーマ技術を用いて得られた。モノクローナル抗ＤＮＡ抗体ＤＩＬ６およびＢ３はループス患者由来であり、Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９３ １７８７−１７９９およびＥｈｒｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒ．（１９９５）４８ ７０５−７１１に記載されたハイブリドーマ技術を用いて得られた。
【００５８】
以下の説明はラミニンおよび本明細書で開示されるペプチドに特異的な抗体の使用を意図していることを理解する必要がある。ラミニンおよびＲ３８とそのアナログならびに誘導体に特異的なペプチドを製造する方法は、当業者には既知である。これに関して本文に既定の参照文（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９８８）を含め、参照しながらその内容を本明細書に組み込む。本参照文は、ラミニンペプチドに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体等、単一特異性の抗体を得るため使用される方法を開示する。
（抗ペプチド（直接結合）ＥＬＩＳＡ）
【００５９】
ウェルをペプチド１０μｇ／ｍｌで被覆し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶解１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックし、適切に希釈した血漿またはモノクローナル抗体を用いて反応させ、アルカリホスファターゼと結合させた抗ヒトまたは抗マウス免疫グロブリン酵素を用いてインキュベートした。基質（Ｓｉｇｍａ １００ホスファターゼ基質タブレット）を添加し、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ分光器を波長４０５ｎｍで用いて着色することでこれを検出した。
（競合的阻害試験）
【００６０】
競合的阻害試験において、種々の濃度の阻害物質（例えばペプチド、ＤＮＡ、ヘパリン）またはＤＮａｓｅを用いて４５分間室温でインキュベートし、前述のとおり残存する結合物をＥＬＩＳＡにより評価した。阻害率（％）の計算は以下の通り。
Ｏ．Ｄ．結合（阻害物質なし）−Ｏ．Ｄ.結合物（阻害物質あり）ｘ１００／Ｏ．Ｄ．結合物（阻害物質なし）＝阻害率（％）
【実施例１】
【００６１】
ラミニンペプチドとＳＬＥ抗体の結合
Ａ：ラミニン∝鎖のＣ末端ペプチドとマウスＳＬＥ抗体との結合。
上述の通り、Ｃ７２マウス抗ＤＮＡ抗体とラミニンペプチドの相互作用を、ＥＬＩＳＡを用いて解析した。Ｃ７２条件培地を種々の希釈を用いてＰＢＳで希釈した。結果を図１に要約し、Ｃ７２抗ＤＮＡ抗体がラミニン∝鎖のペプチドＲ２８およびＲ１８とではなく、５２００、Ｒ３７、およびＲ３０などのペプチドと結合することを示す。対照マウス抗体である抗ＨＥＬ Ｈｙ５はペプチド５２００と結合しなかった（データなし）。
【００６２】
Ｂ：ＤＮＡおよびヘパリンによるＣ７２と５２００との結合阻害の阻害
Ｃ７２と５２００の結合について、５２００、Ｒ３８、Ｒ１８、ヘパリン、ＤＮＡ、およびＤＮａｓｅを用いたインキュベーションの前と後に試験を行った。結果を図２に要約し、本発明のペプチドであるＲ３８または５２００によるＣ７２と５２００との結合阻害がＤＮＡおよびヘパリンにより阻害されることを示す。阻害率は、阻害剤を用いてインキュベーションした後のＯ．Ｄ．の低下率である。
【実施例２】
【００６３】
ポリクローナルマウス抗体とペプチド５２００との結合
直接結合ＥＬＩＳＡ法によりＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ尿中抗体とペプチド５２００の相互作用を解析したところ、特異的な結合が認められた。そのため、少なくともマウス５匹（ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒまたは対照マウス（例；ＢＡＬＢ／ｃ））の蓄尿を、上述の通りＲ３８’（５２００）、Ｒ１８、またはＤＮＡで被覆したウェルに添加し、結合した５２００についてＥＬＩＳＡを用いて試験した。
【００６４】
マウス尿中免疫グロブリンと５２００との結合
各群は蓄尿からなる。
Ｕ．Ｄ．‐未検出
（＊）４０５ ｎｍでのＯ．Ｄ．
【実施例３】
【００６５】
ヒトモノクローナルループス抗体とペプチド５２００との結合
ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体ＤＩＬ６およびＢ３はループス患者由来であり、ハイブリドーマ法を用いて得られた。図３および４に示されるとおり、これらの抗体は試験対象のその他のラミニンペプチドではなく、ペプチド５２００と結合することが確認された。図３および４では、ペプチドは上または以下を意味する。ＡＳ３０はＲ２７、ＡＳ１９はＲ３５、ＡＳ３５はＲ２６、ＡＳ１７はＲ２８、ＡＳ６はＲ１８。
【実施例４】
【００６６】
マウスＳＬＥの臨床経過に対するＲ３８（５１００）およびＲ３８’の効果
ペプチドＲ３８がＳＬＥの経過に影響を及ぼすかどうか調べるため、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの疾患に対する効果について試験を行った。ＰＢＳ ０．１ ｍｌ中に溶解した５２００ ６０μｇ（Ｒ３８’単独または各３０μｇでペプチドと混合）を週齢６週の雌ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに週１回、１６週間腹腔内投与し、マウスの生存率（図８）および腎組織を評価した。
【００６７】
ＰＢＳ ０．１ ｍｌ中に溶解した５１００（Ｒ３８）または５３００（ヒトＲ３８）５０μｇを週齢６週の雌ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに週３回腹腔内投与し、マウスの生存率（図９）および腎組織を評価した。対照マウスには、リン酸緩衝液０．１ ｍｌを投与した。試験群および対照群にはマウス１２ないし１５匹を含めた。
【００６８】
５１００、５２００、または５３００を投与したＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存率をＰＢＳ投与マウスと比較した。図８および９に示されるとおり、５１００または５２００を投与したマウスの生存率は対照マウスより有意に高かった。図８および９では、ｘ軸に示した時間（日数）はマウスの週齢である。５ヵ月後に各群２匹を屠殺し、光学顕微鏡を用いて腎臓を評価した。対照マウスの腎臓には半月体および硬化を有する重度のびまん性の増殖性糸球体腎炎が認められ、５１００または５２００投与マウスでは軽度の増殖性変化が認められたものの半月体および硬化は認められなかった。
【実施例５】
【００６９】
抗Ｒ３８抗体と疾患の活動性の相関性の分析
活動正および非活動性の腎疾患の有無によらず、ループス患者由来の尿を繰り返し採取し、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８抗体の有無について試験を行った。疾患の活性度についても承認された臨床パラメータおよび血清学的パラメータ（Ｌｏｃｋｓｈｉｎ Ｍ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ（１９８４）７７ ８９３−８９８）を用いて評価し、抗Ｒ３８抗体量との相関性を比較した。上述のとおり、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８抗体について、ＳＬＥ患者３７例の尿検体１０３件を用いて試験を行った。非腎疾患患者由来の検体が２３件、腎疾患患者由来の検体が８０件であった。さらにＳＬＥと無関係の腎疾患患者由来の検体１２も試験対象とした。
【００７０】
以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．０１￥０１
【００７１】
１９種類の臨床パラメータおよび検査パラメータ（上のＬｏｃｋｓｈｉｎ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）を含む活動性スコアによると、腎疾患患者の検体の陽性度は通常活動している疾患と相関していた。これらのパラメータには、脱毛症、発疹、発熱、漿膜炎、関節痛／関節炎、粘膜潰瘍、神経性事象、倦怠感、眼底の変化、結節、脾臓などの臨床基準の有無または状態の評価ならびにＥＳＲ（赤血球沈降速度）、抗ＤＮＡ抗体、補体（Ｕ／ｍｌ）、クレアチニン、ヘモグロビン（ｇ／ｄｌ）、ＰＬＴ血小板（／ｍｍ２）または検尿などの血液検査を含めた。これらのパラメータの評価は、上のＬｏｃｋｓｈｉｎの記載どおりに測定する。得られた全割合は、評価したパラメータのみを反映している。
【００７２】
尿検体を１回以上試験した患者もあり、臨床活動性と抗Ｒ３８結合量の間に良好な相関が認められた。異なる３例のループス患者由来の代表的な３つの例を図５、６、および７に示す。この場合、ｘ軸は病院訪問回数を、ｙ軸は観察された結合（ＯＤ ４０５ｎｍ）または蒸気の活動性スコアの割合を示す。これらの図からわかるとおり、ペプチドＲ３８を用いた測定法により、疾患の活動性について信頼性の高いモニタリング法が得られた。
【実施例６】
【００７３】
抗５２００Ｒ（３８’）抗体と疾患の活動性の相関性の分析 さらに実験において、ループス患者由来の尿検体１７８件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体２４件、ない検体２２件）を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５２００抗体の有無について試験を行った。以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．００１
【実施例７】
【００７４】
抗５１００（Ｒ３８）抗体と疾患の活動性の相関性の分析
ループス患者２１例由来の尿検体４５件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体若干とない検体若干）を採取し、上述のとおり直接ＥＬＩＳＡにより抗５１００抗体の有無について試験を行った。
【００７５】
以下の結果が得られた。
＊ｐ＜０．０３
【実施例８】
【００７６】
抗５２００（Ｒ３８’）抗体と疾患の活動性の相関性の分析
ループス患者２１例（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体とない検体）由来の尿検体５２件を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５２００抗体の有無について試験を行った。
【００７７】
以下の結果が得られた。
【実施例９】
【００７８】
抗５１０８、５１０１、５１０９、および５１１０抗体と疾患の活動性の相関性の分析
実施例７および８のループス患者の一部から尿検体２４件（活動性および非活動性状態の腎疾患のある検体２件、ない検体２２件）を採取し、上述のとおりＥＬＩＳＡにより抗５１０８との結合について試験を行った。
【００７９】
以下の結果が得られた。
【００８０】
ペプチド５１０１、５１０９、および５１１０との結合でも同様の結果が確認された。
【実施例１０】
【００８１】
Ｃ７２およびＢ３のＲ３８およびペプチドアナログとの直接結合
本明細書で記載した方法に従い、本発明のペプチドのＣ７２マウス抗ＤＮＡ抗体およびＢ３ヒト抗ＤＮＡ抗体との直接結合能について試験を行った。直接結合試験の結果を表３で報告する。
表３：Ｃ７２およびＢ３のＲ３８およびアナログペプチドとの直接結合
＊ＮＴ：未試験
＋：１時間後の直接結合ＥＬＩＳＡ試験のＯ．Ｄ．
‡：２時間後の直接結合ＥＬＩＳＡ試験のＯ．Ｄ．
【実施例１１】
【００８２】
ペプチドアナログによるＣ７２とＲ３８との結合の競合的阻害
競合的阻害試験では、Ｃ７２抗ＤＮＡ抗体との結合について、各ペプチドがＲ３８（５１００）とどのように競合するのかを比較した。本明細書で記載した方法に従って実施した試験結果を下の表４に開示し、図１０を参照しながらさらに説明する。
表４：Ｃ７２のＲ３８との結合阻害
＊ＥＬＩＳＡ試験においてＣ７２抗ＤＮＡ抗体のペプチド５１００（Ｒ３８）への結合が５０％阻害される競合阻害物質の濃度。
＊ＮＩ＊阻害されず
【実施例１２】
【００８３】
本実施例は、被験者の血液から病原性ループス抗体である抗Ｒ３８（ＴＶ‐５１００）（およびその誘導体）を限外濾過法を用いて除去するためのカラムの使用を示す。
【００８４】
カラムの作製
ペプチドＲ３８を結合緩衝液５ ｍｌ中１ ｍｇ／ｍｌの濃度で結合緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解した。Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラム（ファーマシア社、１７‐０７１７‐０１）５ ｍｌを使用する。カラム中のイソプロパノールを冷たい（４℃）ＨＣｌ １ ｍＭ ３０ ｍｌでカラムから洗い出し、次にシリンジ（２．５ ｍｌ／分）を用いてペプチド溶液５ ｍｌをカラムに注入した。カラムを密閉し、室温で３０分間直立させた。次に緩衝液Ａ（０．５ Ｍエタノールアミン、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）３０ ｍｌおよび緩衝液Ｂ（０．５Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４）でカラムを連続３回洗浄し、次にｐＨが中性の緩衝液（０．０５ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．１％ ＮａＮ３）で洗浄した。
【００８５】
抗Ｒ３８（ＴＶ‐５１００）抗体の親和性吸着 ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１５ ｍｌ後、溶出緩衝液（０．１ Ｍ塩酸グリシン）１５ ｍｌ、次にＰＢＳ ５０ ｍｌでカラムを洗浄した。Ｃ７２抗体または患者の血漿検体を０．４５ミクロンフィルタで濾過した。適合したシリンジを用いて、２．５ ｍｌ／分の速度で検体をカラムに入れた。次にＰＢＳ ５ｍｌでカラムを洗浄し、流液形を再度カラムに入れた。検体（原形および流液形）とＲ３８の結合について、抗Ｒ３８ＥＬＩＳＡにより試験を行った。
【００８６】
即時例では、マウスＣ７２とＳＬＥ患者の血漿をＲ３８カラムに入れた。原形検体およびカラムの流液形において、ＥＬＩＳＡにより抗Ｒ３８結合を評価した。
【００８７】
表５に示されるとおり、カラムに対する親和性吸着により、マウスモノクローナルＣ７２の抗Ｒ３８活性の９９％が、ヒトＳＬＥ患者の血漿中の抗体の３０ないし６０％が除去された。したがって、ＳＬＥ患者の血漿の親和性吸着によりＳＬＥを処理し、患者の静脈内に血漿を戻した。
表５：親和性吸着
【実施例１３】
【００８８】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）患者を対象とするＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムを用いた第Ｉ／ＩＩ相試験
ルーチンの血漿アフェレーシス時に、ＳＬＥ患者１０例に対しＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムを単回実施して処理した。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ免疫吸着カラムは、Ｒ３８（ＶＲＴ１０１）ペプチドを含む親和性吸着カラムである。本試験組入れ前の患者スクリーニングは、血漿アフェレーシス予定日の３ヵ月前から５日前までである。血漿アフェレーシス実施日に患者を本試験に組み入れ、ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラムを用いて１．５ないし２．２５時間にわたって処理する。次にＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭカラム処置後８週間にわたってフォローアップを行う。
【００８９】
最初の患者に処理を行い、２ヵ月間のフォローアップ期間を完了した。有害事象は報告されず、本処置の忍容性は良好であった。予備的有効性に関して、図１２は施行前、施行後、フォローアップ期間中の患者のＶＲＴ１０１抗体量の変化を示す。図１２に示されるとおり、抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量はＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭ血漿アフェレーシス後に減少し、５週間以上経過して元の抗体量に戻った。
【００９０】
同じ方法に従って得られた追加の患者情報を図１３ないし２２に示す。０１３および０２７の患者では、抗ＶＲＴ１０１抗体量に対する効果は認められなかった。残りの患者はいずれもフォローアップ来院２または３からフォローアップ来院４または５まででわかるように抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量が正常値まで減少した。ただし、ＶＲＴ１０１値が減少したものの正常値を上回った００３の患者を除く。患者１０例に有意なリバウンド効果は認められなかった。ＬｕｐｕｓｏｒｂＴＭの処置と関連のある重篤な有害事象は報告されなかった。
【実施例１４】
【００９１】
ＳＬＥ患者の血漿中抗ＶＲＴ（Ｒ３８）抗体量の評価
【００９２】
ループス患者（ＬＭ）の血漿１０ｍｌをカラムに入れた。ＰＢＳ（少なくとも５カラム容量）でカラムをすすぎ、ＨＣＬ １０ｍ／Ｍ（ｐＨ３．０）に溶解した０．０５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、画分１ ｍｌを採取した。画分ピーク（ＥＬＩＳＡにより抗ＶＲＴ１０１結合を用いて同定）は７ないし９で、免疫拡散法（ＲＩＤ）またはＥＬＩＳＡによりＩｇＧ含量について試験を行った。元の血漿中免疫グロブリン量は１６４ ｍｇ（１６４０ ｍｇ／ｄＬの濃度より）であり、ピーク画分は２００μｇ（ＲＩＤにより濃度は６．９ ｍｇ／ｄＬ未満）となった。
【００９３】
これらの結果は、特異的抗体の量が免疫グロブリン含量中でごくわずかである、つまり免疫グロブリン全体の約０．１２％であることを示している。
【実施例１５】
【００９４】
Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムの容量
小規模な実験において、Ｃ７２抗体を用いたＬｕｐｕｓｏｒｂカラムの飽和により、Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムの結合能について以下のとおり試験を行った。：免疫グロブリン約１２μｇ／ｍｌを含有するＣ７２の上清３５０ ｍｌを５ ｍｌ Ｌｕｐｕｓｏｒｂカラムに入れた。流液形の画分を採取し、ＥＬＩＳＡによりＶＲＴ１０１結合について試験を行った。
【００９５】
最初の画分は６０ ｍｌ、以降の画分は各３０ｍｌとした。図２６からわかるとおり、最初の画分とＶＲＴ１０１との結合はごくわずかである。カラムのＣ７２抗体除去能は上清（ＩｇＧ １．８ｍｇ）１５０ｍｌ後に飽和状態となり、カラムが樹脂処理した免疫グロブリン／ｍｌ少なくとも３６０μｇと結合し得ることを示している。
【実施例１６】
【００９６】
血漿アフェレーシスを実施し、血漿容量および流速などの技術パラメータを規定するＬｕｐｕｓｏｒｂの性能を測るため、ヒツジ３匹を用いて、１ヵ月に２ないし３回血漿アフェレーシス実験を実施した。ヒツジに麻酔をかけ、挿管し、血漿３リットルをアフェレーシスした。流速は１６ないし２０ ｍｌ／分に設定した。
【００９７】
血漿はカラムを問題なく持続的かつ均一に通過した。挿管時の麻酔が原因で２回目実施後にヒツジ１匹が死亡した。残りのヒツジはアフェレーシスに対し即時または遅延性の反応を示さず、血液学的および生化学的血液パラメータは元の結果から有意な変化を示さなかった。
【００９８】
前記の記述および実施例は単なる例示であることと、多くの変更形態および変形形態は下で主張されるとおり、本発明の目的と精神から逸脱することなく１人の当業者によってなされたものであることを理解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血漿からループス抗体を、限外濾過法を用いて除去することと、血漿を患者へ戻すこととを含み、さらなる血漿交換の必要性がない全身性エリテマトーデスを有する被験者の、治療法。
【請求項２】
少なくとも１種類のペプチドを吸着させたカラムにおいて、カラムクロマトグラフィーを用いてループス抗体を前記除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２からなる前記群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２種類以上のペプチドが前記カラムに吸着する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１からなる前記群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドがＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドがＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記カラムがＮ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラムである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
１）前記患者の血漿を除去し、前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、
２）前記血漿を前記患者の身体へ戻すステップとを含み、患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体の血漿中濃度が前記患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体の処置前の約９５％以上低減される、患者の抗Ｒ３８抗体量を低減する、方法。
【請求項１０】
前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムを用いて前記患者の血漿を限外濾過法を用いて処理することにより患者の前記血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させ、これが
前記患者の血漿を除去し、前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、
前記血漿を前記患者の身体へ戻すステップとを含み、
約１ないし約５週間、前記抗Ｒ３８抗体量を処置直後の量を下回るまで低減させる、方法。
【請求項１１】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその変異体あるいは誘導体を含む、親和性吸着カラム。
【請求項１２】
前記カラムがアガロースを基剤とするゲル濾過基質で充填される、請求項１１に記載の吸着カラム。
【請求項１３】
前記アガロースを基剤とするゲルの粒子サイズが約４５ないし１６５ μｍである、請求項１２に記載の吸着カラム。
【請求項１４】
前記アガロースゲルがＮ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）-ａｃｔｉｖａｔｅｄである、請求項１２に記載の吸着カラム。
【請求項１５】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２からなる前記群から選択されるペプチドを含む、親和性吸着カラム。
【請求項１６】
前記カラムに２種類以上のペプチドが吸着する、請求項１５に記載の吸着カラム。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１からなる前記群から選択される、請求項１５に記載の吸着カラム。
【請求項１】
被験者の血漿からループス抗体を、限外濾過法を用いて除去することと、血漿を患者へ戻すこととを含み、さらなる血漿交換の必要性がない全身性エリテマトーデスを有する被験者の、治療法。
【請求項２】
少なくとも１種類のペプチドを吸着させたカラムにおいて、カラムクロマトグラフィーを用いてループス抗体を前記除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２からなる前記群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２種類以上のペプチドが前記カラムに吸着する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１からなる前記群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドがＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドがＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記カラムがＮ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ高性能カラムである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
１）前記患者の血漿を除去し、前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、
２）前記血漿を前記患者の身体へ戻すステップとを含み、患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体の血漿中濃度が前記患者の血漿中の抗Ｒ３８抗体の処置前の約９５％以上低減される、患者の抗Ｒ３８抗体量を低減する、方法。
【請求項１０】
前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムを用いて前記患者の血漿を限外濾過法を用いて処理することにより患者の前記血漿中の抗Ｒ３８抗体量を低減させ、これが
前記患者の血漿を除去し、前記血漿をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む親和性吸着カラムに通すステップと、
前記血漿を前記患者の身体へ戻すステップとを含み、
約１ないし約５週間、前記抗Ｒ３８抗体量を処置直後の量を下回るまで低減させる、方法。
【請求項１１】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその変異体あるいは誘導体を含む、親和性吸着カラム。
【請求項１２】
前記カラムがアガロースを基剤とするゲル濾過基質で充填される、請求項１１に記載の吸着カラム。
【請求項１３】
前記アガロースを基剤とするゲルの粒子サイズが約４５ないし１６５ μｍである、請求項１２に記載の吸着カラム。
【請求項１４】
前記アガロースゲルがＮ‐ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）-ａｃｔｉｖａｔｅｄである、請求項１２に記載の吸着カラム。
【請求項１５】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２からなる前記群から選択されるペプチドを含む、親和性吸着カラム。
【請求項１６】
前記カラムに２種類以上のペプチドが吸着する、請求項１５に記載の吸着カラム。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１からなる前記群から選択される、請求項１５に記載の吸着カラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２０１０−５３０３６０（Ｐ２０１０−５３０３６０Ａ）
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８９６７（Ｐ２０１０−５０８９６７）
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４２６９４
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０９３０９４７７）ハダシット リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／０００６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４２６９４
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０９３０９４７７）ハダシット リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]