共役リノール酸組成物
【課題】共役リノール酸を含む新規の組成物を提供すること
【解決手段】共役リノール酸を含む新規の組成物は、動物の飼料添加物およびヒトの栄養補助食品として効果的である。リノール酸は、その共役形態に転換される。この共役形態において、生じる組成物は、従来の共役リノール生成物と比較して、特定の通常でない異性体が低い。さらに、本発明は、揮発性有機化合物へのＣＬＡの酸化を制御する新規方法に従って調製され、かつ貯蔵の間に酸化を制御するための金属酸化剤キレート剤を含む組成物を提供する。
【解決手段】共役リノール酸を含む新規の組成物は、動物の飼料添加物およびヒトの栄養補助食品として効果的である。リノール酸は、その共役形態に転換される。この共役形態において、生じる組成物は、従来の共役リノール生成物と比較して、特定の通常でない異性体が低い。さらに、本発明は、揮発性有機化合物へのＣＬＡの酸化を制御する新規方法に従って調製され、かつ貯蔵の間に酸化を制御するための金属酸化剤キレート剤を含む組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願番号０９／１３２，５９３（１９９８年８月１１日出願）および米国特許出願番号０９／２７０，９４０（１９９９年３月１７日出願）の一部継続出願であり、これらの出願は、米国特許出願番号０９／０４２，７６７（１９９８年３月１７日出願：現在米国特許第６，０１５，８３３号）および米国特許出願番号０９／０４２，５３８（１９９８年３月１７日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒトおよび動物の栄養の分野に関し、そして特に共役リノール酸（ＣＬＡ）の特定の新規組成物に関する。これらの組成物は、揮発性有機化合物へのＣＬＡの酸化を制御して、そしていくつかの場合、酸化を調節する抗酸化剤を含む、新規方法に従って調製される。本発明はまた、共役リノール酸の製造、特に、共役リノール酸を含む飼料および食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
１９７８年に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの研究者らは、調理された牛肉中に含まれる物質の同定を得た。これは、突然変異誘発を阻害するようである。この物質は、共役した二重結合を有するリノール酸（Ｃ１８：２）の位置的異性体の混合物であることが見出された。ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体は、非常に多量存在するが、どの異性体が観察された生物学的活性の原因であるかは不確定である。９，１１異性体が動物組織のリン脂質画分に好ましくはいくらか取り込まれかつ組み込まれ、そして１０，１２異性体はその程度が低いようであることが、標識された取り込み研究より記述されてきた（Ｈａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０））。
【０００４】
共役リノール酸（ＣＬＡと称する）に関する生物学的活性は、多様でありかつ複雑である。現在、作用の機構についてほとんど知られていないが、進行中のいくつかの前臨床研究および臨床研究は、作用の生理学的様式および生化学的様式に新たな光を与えるようである。ＣＬＡの抗発癌性特性は、十分実証されてきた。ＣＬＡの投与は、Ｂｉｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２０３５ｓ（１９９２）によって実証されるようにラット乳房腫瘍形成を阻害する。同様に報告されたＨａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０）は、マウス噴門洞新生物形成様式を生じた。ＣＬＡはまた、インビトロで標的ヒト黒色腫、結腸直腸癌細胞および乳癌細胞に対する強力な細胞傷害性剤として同定された。最近の主要な総説論文は、個々の研究より得られる結論を確認する（Ｉｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６（６補遺）：１５２３ｓ（１９９７））。
【０００５】
ＣＬＡ作用の機構は未だ不明であるが、免疫系のいくつかの成分が、少なくともインビボで関与され得るという証拠が存在する。米国特許第５，５８５，４００号（Ｃｏｏｋら、本明細書中に参照として援用される）は、ＣＬＡを含有する食餌を投与することによって、Ｉ型またはＴｇＥ高感受性によって媒介される、動物でのアレルギー性反応を減弱するための方法を開示する。約０．１〜１．０％の濃度でのＣＬＡはまた、白血球を保存するに効果的なアジュバントであることが示された。本明細書中に参照として援用される米国特許第５，６７４，９０１号（Ｃｏｏｋら、）は、細胞性免疫に関与するＣＤ−４およびＣＤ−８のリンパ球亜集団における上昇をもたらした、遊離酸または遊離塩のいずれかの形態でのＣＬＡの経口または非経口の投与を開示した。外因性腫瘍壊死因子での前処置により生じる不利な効果は、ＣＬＡが投与された動物中のＣＤ−４細胞およびＣＤ−８細胞のレベルの上昇または維持により間接的に緩和され得る。最終的には、米国特許第５，４３０，０６６号（参考として本明細書中に援用される）は、免疫刺激による体重減少および食欲不振を予防する際のＣＬＡの効果を記載する。
【０００６】
上記のＣＬＡの有力な治療的適用および薬理的適用とは別に、栄養補助食品として栄養的なＣＬＡの使用に関して、非常に興奮させられている。ＣＬＡは、身体構成に対して非常に一般化された効果を発揮することが見出されている。特に、脂肪組織塊と脂肪のない組織塊との区画を再指向する。参考として本明細書中に援用される、米国特許第５，５５４，６４６号（Ｃｏｏｋら）は、栄養補助食品としてＣＬＡを利用する方法を開示し、ここで、ブタ、マウスおよびヒトは、０．５％ ＣＬＡを含有する食品を給餌された。各種において、脂肪含量における顕著な減少が、タンパク質質量において付随する増加とともに観察された。これらの動物において、ＣＬＡの添加による食餌の脂肪酸含量の増加は、体重の増加をもたらさないが、身体内の脂肪および無脂肪（ｌｅａｎ）の再分布に関連した。目的の別の食餌現象は、食餌転換に対するＣＬＡ補填の効果である。米国特許第５，４２８，０７２号（Ｃｏｏｋら、本明細書中に参考として援用される）は、動物食餌（トリおよび哺乳動物）へのＣＬＡの組み込みがＣＬＡ補填動物におけるかなりの体重増加を導く食餌変換の効果を増加することを示すデータを提供した。食品動物飼育者にとってＣＬＡ補填の有利な効果は、明白である。
【０００７】
ＣＬＡに目的の別の重要な供給源、およびその初期の商業的潜在性を強調するものは、それがヒトおよび動物などによって消費される食品および食餌の中に天然に存在することである。特に、ＣＬＡは、反芻動物からの産物中に豊富である。例えば、いくつかの研究が実施されてきた。ここで、ＣＬＡは、種々の乳製品において調査された。Ａｎｅｊａら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，４３：２３１（１９９０）は、牛乳からヨーグルトへの処理がＣＬＡの濃縮を生じることを観察した。（Ｓｈａｎｔａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７：２５７（１９９３））は、処理する温度および乳清の添加における組合わせた増加が処理されたチーズの調製の間ＣＬＡ濃度を増加したことを示した。別の研究において、Ｓｈａｎｔａら、Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．６０：６９５（１９９５）は、処理および貯蔵の条件は明らかにはＣＬＡ濃度を減少しないがいずれの増加も観察されなかったことを報告した。実際、いくつかの研究は、季節的変動および動物間の変動は牛乳のＣＬＡ含量における３倍もの差異の原因であり得ることを示した。（例えば、Ｐａｒｏｄｉら、Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６０：１５５０（１９９７）を参照のこと。）また、Ｃｈｉｎら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃａｍｐ．Ａｎａｌ．，５：１８５（１９９２）に記されるように、食物因子は、ＣＬＡ含量の変動において関係している。天然の供給源におけるＣＬＡ含量の変動のために、規定された量の種々の食品の摂取は、ヒト（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）または動物が最適用量を受けて所望の栄養効果を達成することを確保することを保障しない。
【０００８】
リノール酸は、重要な生物脂質の成分であり、顕著な割合のトリグリセリドおよびリン脂質を含む。リノール酸は、「必須」脂肪酸として公知であり、自己合成され得ないので、動物は、外因性食餌供給源からそれを得なければならないことを意味する。リノール酸のＣＬＡ型の組み込みは、脂質位置へのＣＬＡの直接置換を生じ得、ここで、非共役リノール酸が移動した。しかし、このことは証明されておらず、そしてかなり有利だが説明できない観察された効果のいくつかが、非共役リノール酸がさもなければ移動しない部位での脂質構造内のＣＬＡの再位置付けから生じ得る。現在、動物ＣＬＡのある供給源（特に、乳製品において）がネイティブなリノール酸への特定のルーメン細菌の生化学的作用から生じ、まず、リノール酸をＣＬＡに異性化し、次いで、ルーメンキャビティー内にそれを分泌することが、明白である。Ｋｅｐｌｅｒら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，５６：１１９１（１９６６）は、ルーメン細菌であるＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓを単離した。この細菌は、リノール酸の生物水素化における中間体として９，１１−ＣＬＡの形成を触媒する。Ｃｈｉｎら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１２４：６９４（１９９４）はさらに、対応する無菌ラットがＣＬＡを産生しないので、げっ歯類の組織中に見出されたＣＬＡは細菌と関連することを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，４００号
【特許文献２】米国特許第５，４３０，０６６号
【特許文献３】米国特許第５，６７４，９０１号
【特許文献４】米国特許第５，５５４，６４６号
【特許文献５】米国特許第５，４２８，０７２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０）
【非特許文献２】Ｂｉｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２０３５ｓ（１９９２）
【非特許文献３】Ｉｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６（６補遺）：１５２３ｓ（１９９７）
【非特許文献４】Ａｎｅｊａら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，４３：２３１（１９９０）
【非特許文献５】Ｓｈａｎｔａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７：２５７（１９９３）
【非特許文献６】Ｐａｒｏｄｉら、Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６０：１５５０（１９９７）
【非特許文献７】Ｃｈｉｎら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃａｍｐ．Ａｎａｌ．，５：１８５（１９９２）
【非特許文献８】Ｋｅｐｌｅｒら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，５６：１１９１（１９６６）
【非特許文献９】Ｃｈｉｎら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１２４：６９４（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
治療的適用および栄養的適用の両方のための、ＣＬＡの規定された商業的供給源の開発において、大量の規定された材料を生成するためのプロセスが必要である。慣用的な手段によって作製されたほとんどのＣＬＡ産物の問題は、その異質性であり、そしてバッチ間で実質的なアイソフォームの変動である。獣脂の代わりに多量の硬化油およびショートニングを摂取することは、トランス脂肪酸量の高い食餌を生じるという事実に、多くの注意が払われてきた。例えば、Ｈｏｌｍａｎら、ＰＮＡＳ，８８：４８３０（１９９１）は、硬化油を給餌されたラットは異常なポリ不飽和脂肪酸異性体のラット肝における蓄積を生じることを示した。これは、天然に存在するポリ不飽和脂肪酸の正常な代謝を妨害するようである。これらの関係は、初期の論説（Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８４：７２２（１９７４））に要約された。従って、規定された組成物の生物学的に活性なＣＬＡ産物に対して強い要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、後述する手段により、上記課題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のアルカリ異性化プロセスのフロー図である。
【図２】図２は、抗酸化剤の存在下でのＣＬＡ組成物についてのＯＳＩ値のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトおよび動物の栄養の分野に関し、特に、共役リノール酸（ＣＬＡ）の特定の新規組成物に関する。これらの組成物は、新規方法に従って調製され、これは、ＣＬＡの揮発性有機化合物への酸化を調節して、そしていくつかの実施形態は、酸化を調節する抗酸化剤を含む。
【００１５】
本発明は、異性化された（すなわち、共役した）高純度のリノール酸部分を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、これらの組成物は、異性化され共役したリノール酸部分を含み、ある程度の低分子量の揮発性有機化合物を有するが、不活性な貯蔵条件下で少なくとも３０日間の貯蔵期間の間、合計１００ｐｐｍを超えない。他の好ましい実施形態において、本発明は、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供し、この組成物は、合計１００ｐｐｍ以下の低分子量揮発性有機化合物を含みかつ６０℃で約２０〜１００時間の油安定性指数を有する。特定の好ましい実施形態において、油安定性指数は、６０℃で約４０時間より大きい。よりさらなる実施形態において、本発明は、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供し、この組成物は、合計１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含み、この組成物は、以下の工程を包含するプロセスを通じて入手可能である：ａ）異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供する工程；ｂ）吸収剤を提供する工程；およびｃ）上記共役リノール酸部分を上記吸収剤で処理する工程。いくつかの好ましい実施形態において、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物は、合計約１〜約１０ｐｐｍの金属イオン濃度を含み、これは、安定性を増加するために減少されなければならない。
【００１６】
上記の組成物のＣＬＡ部分は、特定のＣＬＡ部分のいずれか１つに限定されない。いくつかの異なる部分は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、ＣＬＡ部分は、遊離脂肪酸である。他の実施形態において、ＣＬＡ部分は、アルキルエステルである。なおさらなる実施形態において、ＣＬＡ部分は、トリアシルグリセリドである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態において、上記の組成物はさらに、金属酸化剤キレート剤を含む。本発明は、金属酸化剤キレート剤のいずれか１つに限定されない。種々の金属酸化剤キレート剤は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、金属酸化剤キレート剤は、クエン酸エステルを含む。他の実施形態において、金属酸化剤キレート剤はレシチンを含む。
【００１８】
上記の異性化されたリノール酸組成物の純度は、特定のレベルのいずれかに限定されない。いくつかのレベルの純度は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、組成物は、合計１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。他の実施形態において、組成物は、合計５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。なお他の実施形態において、組成物は、合計１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。なおさらなる実施形態において、組成物は、合計５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記の組成物を含有する食品または食物添加物を提供する。
【００２０】
本発明はまた、共役リノール酸の製造、特に、共役リノール酸を含有する食餌および食品に関する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、共役リノール酸エステルを含む食品を産生するための方法を提供する：ａ）以下を提供する工程：ｉ）共役リノール酸エステル（ここで、このエステルは、アルコラート触媒でリノール酸エステルを処理することによって産生される）；および食材；ならびにｂ）この食材を共役リノール酸エステルと組み合わされる工程。
【００２１】
本発明は、特定の供給源由来のリノール酸エステルに限定されない。実際、種々のリノール酸の供給源は、紅花、ヒマワリおよびトウモロコシ油を含むがこれらに限定されないことが意図される。
【００２２】
本発明は、共役リノール酸の特定の誘導体に限定されない。実際、種々の共役リノール酸部分は、アルコラート触媒によって産生された共役リノール酸エステル由来の遊離脂肪酸、アルコラート触媒によって産生されるアルキルエステルおよびアルコラート触媒によって産生されたＣＬＡ部分を含むトリグリセリドを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２３】
本発明は、特定のアルコラート触媒の使用を介して産生されるＣＬＡ部分に限定されない。実際、種々のアルコラート触媒は、ナトリウムメチラートおよびカリウムメチラートを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態において、抗酸化剤は、食品に含まれる。本発明は、特定の抗酸化剤に限定されない。実際、種々の抗酸化剤は、α−トコフェノール、β−トコフェノール、レシチン、アスコルビルパルミテートおよびＢＨＴを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２５】
本発明のなおさらなる実施形態において、共役リノール酸部分およびアルコールを含む食品が提供される。本発明は、特定のアルコールに限定されない。実際、種々のアルコールは、エチルアルコールを含むが、これらに限定されないことが意図される。本発明は、特定の濃度のアルコールに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、アルコールの濃度は、約１０ｐｐｍ未満である。
【００２６】
他の実施形態において、以下の工程を包含する、安定化され共役リノール酸産物を提供するための方法が提供される：ａ）共役リノール酸部分および吸収剤を含む組成物を提供する工程；ならびにｂ）得られた共役リノール酸化合物が不活性な貯蔵条件下で１０ｐｐｍ未満の量の低分子量揮発性有機化合物を維持するような条件下で、この共役リノール酸部分を吸収剤で処理する工程。いくつかの実施形態において、共役リノール酸部分は、工程（ｂ）の前に脱臭される。他の実施形態において、方法はさらに、上記共役リノール酸部分を抗酸化剤で処理する工程を包含する。
【００２７】
なお他の実施形態において、方法は、以下の工程を包含する安定化され共役したリノール酸産物を提供する：ａ）共役リノール酸部分、吸収剤および少なくとも１つの抗酸化剤組成物を含む組成物を提供する工程；ｂ）共役リノール酸部分を含む組成物を脱臭する工程；ｃ）共役リノール酸部分を含む組成物を少なくとも１つの抗酸化剤組成物で処理する工程；およびｄ）得られた共役リノール酸化合物が不活性な貯蔵条件下で１０ｐｐｍ未満の量の低分子量揮発性有機化合物を維持するような条件下で、共役リノール酸部分を吸収剤で処理する工程。いくつかの実施形態において、共役リノール酸化合物は、遊離脂肪酸として提供される。他の実施形態において、共役リノール酸部分は、アルキルエステルとして提供される。いくつかの実施形態において、共役リノール酸部分は、トリグリセリドとして提供される。なおさらなるの実施形態において、吸収剤は、漂白土類、活性炭ゼオライトおよびシリカからなる群より選択される。
【００２８】
（定義）
本明細書において用いる場合、「共役リノール酸」または「ＣＬＡ」とは、任意の、共役リノール酸、またはオクタデカジエン遊離脂肪酸をいう。この用語は、リノール酸の分子の任意の位置で２つの共役炭素間二重結合を有する、リノール酸の全ての位置的および幾何的な異性体（アイソマー）を包含し、そして示すことが意図される。ＣＬＡは、普通のリノール酸とは、普通のリノール酸は、炭素原子９および１２で二重結合を有するという点で異なる。ＣＬＡの例としては、以下：２，４−オクタデカジエン、４，６−オクタデカジエン、６，８−オクタデカジエン、７，９−オクタデカジエン、８，１０−オクタデカジエン、９，１１−オクタデカジエン、および１０，１２−オクタデカジエン、１１，１３−オクタデカジエン、の位置異性体のシス異性体およびトランス異性体（「Ｅ／Ｚ異性体」）が挙げられる。本明細書において用いる場合、「ＣＬＡ」は、単一の異性体、２つ以上の異性体の選択された混合物、および天然の供給源から得られた異性体の非選択的混合物、ならびに合成および半合成のＣＬＡを包含する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「異性体化された共役リノール酸」は、化学的方法（例えば、アルカリ水溶液異性体化、非アルカリ水溶液異性体化、またはアルカリアルコレート異性体化）によって合成されたＣＬＡをいう。
【００３０】
本明細書において用いる場合、用語「共役リノール酸部分」とは、共役リノール酸または誘導体を含む任意の化合物または複数の化合物をいう。例としては、脂肪酸、アルキルエステル、および共役リノール酸のトリグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書において用いる場合、ＣＬＡの「トリグリセリド」は、トリグリセリド骨格の上の任意の位置または３つ全ての位置（例えば、ＳＮ−１、ＳＮ−２、またはＳＮ−３の位置）においてＣＬＡを含むことが意図される。従って、ＣＬＡを含有するトリグリセリドは、ＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のうちいずれかを含み得る。
【００３２】
本明細書において用いる場合、ＣＬＡの「エステル」は、アルコールまたは任意の他の化学基（生理学的に受容可能な、天然に存在するアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール）が挙げられるがこれらに限定されない）に対してエステル結合を通じて結合したＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のいずれかおよび全てを含むことが意図される。従って、ＣＬＡのエステルまたはエステル化されたＣＬＡは、ＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のいずれかを含み得る。
【００３３】
ＣＬＡの「天然に存在しない異性体」としては、ｃ１１，ｔ１３；ｔ１１，ｃ１３；ｔ１１，ｔ１３；ｃ１１，ｃ１３；ｃ８，ｔ１０；ｔ８，ｃ１０；ｔ８，ｔ１０；ｃ８，ｃ１０；ならびにオクタデカジエンのトランス−トランス異性体が挙げられるがこれらに限定されない。そしてオクタデカジエンのｔ１０、ｃ１２、およびｃ９，ｔ１１の異性体を含まない。「天然に存在しない異性体」はまた、ＣＬＡがアルカリ異性体化によって合成されるとき、これらの異性体が一般に低量で生成されるので、ＣＬＡの「マイナー異性体」とも呼ばれ得る。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「低不純物」ＣＬＡとは、遊離脂肪酸、アルキルエステル、およびトリグリセリドを含んでいるが、１％未満の８，１０−オクタデカジエン、１１，１３−オクタデカジエン、およびトランス−トランスオクタデカジエンの総量、含む、ＣＬＡ組成物をいう。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「ｃ」は、シス配向における化学結合を包含し、そして「ｔ」は、トランス配向における化学結合をいう。ＣＬＡの位置異性体が「ｃ」も「ｔ」もなしに命名されるならば、その命名は、４つ全ての可能性のある異性体を含む。例えば、１０，１２−オクタデカジエンは，ｃ１０，ｔ１２；ｔ１０，ｃ１２；ｔ１０，ｔ１２；およびｃ１０，ｃ１２オクタデカジエンを包含するが、ｔ１０，ｃ１２−オクタデカジエンすなわちＣＬＡは、単一の異性体をのみをいう。
【００３６】
本明細書において用いる場合、用語「オイル（油脂）」とは、長鎖脂肪酸（例えば，ｃＬＡ）、トリグリセリド、または他の長鎖炭化水素基を含む、流動性の流体をいう。長鎖脂肪酸としては、ＣＬＡの種々の異性体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
本明細書において用いる場合、用語「生理学的に受容可能なキャリア」とは、油状の薬学的組成物（医薬品）とともに通常用いられる任意のキャリアまたは賦形剤をいう。このようなキャリアまたは賦形剤としては、オイル、デンプン、ショ糖（スクロース）、およびラクトースが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において用いる場合、用語「経口送達ビヒクル」とは、薬学的組成物を経口的に送達する任意の手段をいい、カプセル、丸剤、錠剤、およびシロップが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
本明細書において用いる場合、用語「食品（ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、ヒト、非反芻動物、または反芻動物による消費に適切な任意の食物または飼料（餌）をいう。「食品」とは、調製され包装された食物（例えば、マヨネーズ、サラダドレッシング、パン、またはチーズ）、または動物用飼料（例えば、押し出されたおよびペレット化された動物用飼料または粗混合飼料）であり得る。「調製された食品」とは、ヒトの消費について承認された任意の予め包装された食物を意味する。
【００４０】
本明細書において用いる場合、用語「フードスタッフ（食材、栄養素）」とは、ヒトまたは動物の消費に適した任意の物質をいう。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「揮発性有機化合物」とは、所定の温度で部分的に、または完全にガス状態で存在する、任意の炭素含有化合物をいう。揮発性有機化合物は、有機化合物（例えば、ＣＬＡ）の酸化から形成され得る。本発明において特に目的であるのは、炭素を１０以下含む、低分子量揮発性有機化合物である。これらの低分子量揮発性有機化合物の例としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２−ブテナール、エタノール、３−メチルブタナール、４−メチルペンタノン、ヘキサナール、ヘプタナール、２−ペンチルフラン、オクタナールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
本明細書において用いる場合、用語「金属酸化剤キレート剤（メタルオキシダントキレーター）」とは、金属をキレート化する任意の抗酸化剤をいう。例としては、レシチンおよびクエン酸エステルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
本明細書において用いる場合、用語「アルコレート触媒」とは、カリウムメチレートおよびカリウムエチレートが挙げられるがこれらに限定されない、任意の一価アルコールのアルカリ金属化合物をいう。
【００４４】
本明細書において言及する場合、用語「不活性貯蔵状態（ｉｎｅｒｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、貯蔵されている組成物が、本質的に、反応性ガス、貯蔵容器から溶出する化合物などのような任意の外因性の影響なしに維持されている貯蔵状態をいう。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明の組成物は、高度に制御された異性体化プロセスから、そして好ましくはヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油の出発物質を用いて生じる。この組成物は、工業的規模に対する適用については、これまで得られなかった。なぜなら、この従来のプロセスは、歴史的に、全く異なる目的のために（すなわち、ペイント工業における乾燥オイルとして）共役リノール酸を生成しているからである。また、最終製品の異性体含量の意味の認識がなかった。なぜなら、この脂肪酸を特徴付けるための分析方法は広く利用可能ではなかったからである。さらに、本発明は、貯蔵の間のＣＬＡの酸化を防止して揮発性有機化合物を形成するための方法を提供する。
【００４６】
（Ｉ．リノール酸を共役させるための方法）
さらに古い異性体化プロセス（そのいくつかは、さらに現代的な様式でなお使用中である）において、共役させた脂肪酸の生成をアルカリ水溶液（一般にはＮａＯＨ）中で、２００℃を超える高温で、そして通常大気圧を超える圧力で実行した。例えば、米国特許第２，３５０，５８３号（Ｂｒａｄｌｅｙ）は、処理済みの石鹸を利用するアルカリ水溶液プロセスを開示している。このプロセスでは、共役および重合の両方が、２００〜２５０℃で、数時間にわたる、かなり過酷な条件下で生じた。リンシードオイル（アマニ油）で開始する乾燥オイルの画分を、蒸留によって得た（非常に類似のプロセスについては、英国特許番号５５８，８８１号も参照のこと）。このプロセスのバリエーションにおいて、米国特許出願第４，３８１，２６４号は、低水含量反応ゾーン（０．５％水）が、ＳＯ２の存在下で化学量論塩基を含み、種々の多飽和脂肪酸の二重結合の共役を得るプロセスを教示している。アルカリ水溶液プロセスは、米国特許第４，１６４，５０５号において連続的フロープロセス適応された。ここでアルカリ金属水酸化物および水は、２００℃〜３７０℃で維持されているフローゾーンに連続的に充填される。これらの温度では、反応時間は、一般に短縮されなければならないが、この異性体化に対する制御は比較的小さい。温度範囲のさらに高い端で、当業者は二重トランス種へのほぼ完全な変換を予測する。
【００４７】
種々の非水性溶媒および触媒を用いるＣＬＡの生成の方法は、文献中に記載されている。Ｂｕｒｒ（米国特許第２，２４２，２３０号）は、種々の触媒と組み合わせた、メタノール、ブタノール、エタノールおよびグリコールのような溶媒の使用を開示している。これらの反応パラメーターは、表１にまとめられている。グリコールを除いて、この反応は、還流条件下または密閉したチューブのいずれかにおいて実行された。この反応条件によって、重要な反応パラメーターのうちの２つである、温度および圧力の不正確な制御が生じる。これらの反応パラメーターの不正確な制御によって、完全でない共役および所望されない異性体の形成が導かれる可能性が高い。
【００４８】
【表１】
同様に、Ｂａｌｔｅｓら（米国特許第３，１６２，６５８号）は、脂肪酸の共役のための触媒としての非水性溶媒および種々の金属塩素の使用を開示している。Ｂａｌｔｅｓらによって記載された方法の種々の反応パラメーターを表２にまとめる。Ｂａｌｔｅｓらはまた、種々の低沸点溶媒の使用を開示している。これらの反応のほとんどが、使用される溶媒の沸点を超える温度で行われた。この反応は圧力下で行われたことが明らかである。この圧力は、オクタデカジエン異性体の形成に影響する独立した因子である。従って、これらの反応に由来する生成物は所望されない異性体を含む。
【００４９】
【表２】
（ＩＩ．制御された異性体化反応）
本発明のＣＬＡは、８，１０異性体、１１，１３異性体、および種々のトランス−トランス異性体のような大量の異性体を欠く。これらの組成物は、図１におけるフローチャートに示される密接に制御された非水性のアルカリ異性体化プロセスによって、およびアルカリアルコレート触媒での異性体化によって、生成された。いくつかの実施形態において、ヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油を、過剰のアルカリと、不活性ガス雰囲気下で大気圧において、高沸点溶媒（すなわち、ポリエチレングリコール）中で、この溶媒の沸点未満の温度で、反応させる。他の実施形態では、ヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油を、アルカリアルコレート触媒および少量の適切な溶媒の存在下で、反応させる。
【００５０】
（Ａ．リノール酸の供給源）
共役について好ましい油は、ヒマワリ油、サフラワー油、およびコーン油である。ダイズ油と比べた場合、これらの油は、低濃度の、ホスファチドおよびステロールのような所望されない成分を有する。これらの所望されない成分は、共役設備および他の所望されないポリマーを汚染する、ガム（粘性物質）の形成に寄与し得る。これらの油の種々の特性を表３、４、および５にまとめる。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
（Ｂ．溶媒としてプロピレングリコールを用いた異性体化）
本発明のいくつかの実施形態において、共役リノール酸は、非水性アルカリ異性体化によって生成される。制御された異性体化プロセスの反応条件によって、共役プロセスの温度（および一定の環境圧力）の正確な制御が可能になる。好ましくは、アルカリは、水酸化カリウム、水酸化セシウム、炭酸セシウムのような無機アルカリ、または水酸化テトラエチルアンモニウムのような有機アルカリである。触媒は、好ましくは、油の脂肪酸含量に比較してモル過剰で提供される。溶媒は、プロピレングリコールである。好ましくは、この反応を１３０〜１６５℃の温度範囲内、最も好ましくは約１５０℃で行う。反応の時間は、変化し得るが、反応が長時間行われるとき、所望されない異性体の形成の確率が増大する。優れた収率には、比較的短い反応時間である２．０〜６．５時間で十分であることが証明されている。
【００５４】
所望の組成物を生成するためには、上記の反応条件は、共役されるべき油（オイル）、アルカリの供給源、および設備によって変化し得ることが当業者には理解される。特定の油の事前分析によって、この条件が所望の組成物を得るために変化されなければならないことが示され得る。従って、温度範囲、圧力、および他の反応パラメーターは、個々のプロセスの設計のための開始点を表し、そしてガイドとしてのみ意図される。例えば、所望の温度範囲が、用いられ得る唯一の範囲であるとは意図されない。本質的な局面は、正確な温度制御を提供することである。しかし、注意を払わなければならない。なぜなら、圧力の増大は、不完全な異性体化および所望されない異性体の形成をもたらし得るからである。結局、共役化反応の長さは変化され得る。一般に、反応時間の延長に伴って、漸増量の所望されない異性体が形成される。従って、至適反応時間によって反応をほぼ、または本質的に完了するまで進行することが可能になるが、所望されない異性体の形成は生じない。
【００５５】
共役反応後、得られたＣＬＡ含有組成物は、図１に従ってさらに精製され得る。共役反応混合物から脂肪酸を分離するため、この反応混合物を約９５℃に冷却し、過剰の水を５０℃で添加し、そして温度を約５０〜６０℃に低下したまま、この混合物を緩徐に攪拌する。水の添加の際に、脂肪酸の石鹸を形成し、そしてグリセロールを副産物として形成する。次に、モル過剰の濃ＨＣｌを、攪拌しながら添加する。次いで、水性および非水性の層を約８０〜９０℃で分離させる。次いで、水およびポリエチレングリコールを含有する底部層を流し出す。残ったポリエチレングリコールを、６０〜８０℃の減圧脱水によって除去する。
【００５６】
次いで、乾燥したＣＬＡ組成物を、好ましくは、コールドトラップを有する脱気ユニット中で、脱気し、残りのプロピレングリコールを除去し得る。次に、ＣＬＡを、１０−１〜１０−２ミリバールの減圧下で分子蒸留プラントにおいて、１９０℃で蒸留する。この精製システムの利点は、短時間（１分未満）であることである。ここでＣＬＡが、高温で保持される。従来のバッチ蒸留手順は、厳密に回避されるべきである。なぜなら、その手順は、数時間まで、約１８０〜２００℃の高温を含むからである。これらの高温で、所望されないトランス−トランス異性体の形成が生じる。供給物質の約９０％が、わずかに黄色の蒸留物として回収される。次いで、ＣＬＡを、約１２０℃〜１７０℃への、好ましくは約１５０℃への２時間の加熱によって脱臭し、匂いと風味を改善し得る。過剰の熱が、トランス−トランス異性体の形成を生じ得る。これらの手順は、約５ｐｐｍ未満、好ましくは約１ｐｐｍ未満の溶媒レベルでＣＬＡ組成物を生成する。このプロセスは、得られた組成物が本質的に毒性溶媒残留分を本質的に含まないように、有毒なわずかなレベルの溶媒を排除する。
【００５７】
上記のプロセスは、パイロット規模および商業的規模の両方に容易に適応可能である。例えば、４００ｋｇのヒマワリ油は、触媒として添加された２００ｋｇ ＫＯＨとともに４００ｋｇのプロピレングリコール中で、１５０℃で５時間、共役され得る。次いで、得られたＣＬＡは、上記のように精製され得る。さらに、商業的規模のバッチシステムは、所望のＣＬＡ組成物を生成するために容易に改変され得る。例えば、ステンレス鋼反応器（リアクター）は、好ましくはガラスで裏打ちされて、３．０未満のｐＨレベルに起因する腐食を防止するべきである。しかし、非水性溶媒を利用する共役プロセスは、水で行われたプロセスよりも一般に腐食が少ないことに注意すべきである。
【００５８】
次善の条件下かまたは先行技術の水性アルカリ方法に従ってかのいずれかでなされたものと対照的に、本発明のＣＬＡ組成物の重要な特性を強調するために、いくつかの比較実験を実行した。実施例１において、ＣＬＡを本発明の方法によって調製した。ＣＬＡを、実施例２において、従来の水性アルカリ方法によって生成した。実施例３において、実施例１の反応を、高い温度でのみ実質的に繰り返す。最後に、実施例４において、実施例２のものに実質的に同一である水性アルカリ反応を、低い温度で実行している。各実験の正確な条件および詳細が、実施例に示される。ＣＬＡ異性体含有量の分析のプロフィールが、表６〜１１に示される。
【００５９】
表６のデータを参照して、相対的な面積のパーセンテージが、４つの実験の各々について、個々の異性体に対応する各同定されたピークについて提供される。ＧＣプロットは、試験した各サンプルについて多数のピークを与えた。これらのピークの各々の下の面積は、総計の値を得るために積分された。ピークの同一性は、標準溶出プロフィールの公開されたアトラスからのその相対的な位置、および科学文献によって決定した。最上列は、共役していない出発材料（９，１２−リノール酸）についての残基の値を表す。プロピレングリコールにおける低温度の反応および高温度の反応の両方が、総出発材料の９９％を超える極めて高い転換を生じた。
【００６０】
カラム１を参照して、実施例１において、コントロール組成物のいずれとも異なり、異性体の１１，１３混合物に対応するピーク、詳細にはｃ１１，ｃ１３に対応するピーク、８，１０異性体のいずれかについてのピーク、および同定されていない異性体についてのピークがすべて完全に失われていることは、明らかである。ｃ９，ｔ１１異性体の異性体の場合、８，１０異性体および９，１１異性体の両方についてのＧＣにおけるピークが、重ね合わされ、そして、ＮＭＲ研究によって８，１０として同定されたピークのその部分を差し引きすることによって、実施例１の材料に関してのみここで分離される。これは、他の実験において実行されず、故に、列３は、実施例２〜４について、組み合わされた８，１０および９，１１についての値を与える。一般的に、８，１０異性体、１１，１３異性体および同定されていない異性体に関して、１％未満から検出不能までの値は、治療的および栄養学的な価値がある。なぜならこの値は、潜在的に有害な夾雑物（特に、脂質生成において疑わしい吸収経路を有することが公知であるもの）を微量レベルに低下するからである。例えば、非反芻動物において、０．２５〜２．５％のＣＬＡの食品への添加は、組織におけるＣＬＡの発生率を増加して、反芻動物における発生率に近づへ得、その結果、他の動物は、純度を落とす異性体が存在しない場合、ＣＬＡの供給源であり得る。
【００６１】
実施例２は、慣用的に製造されたＣＬＡを代表する、典型的な水性アルカリ生成物を提供する。変換は、全体的ならびにｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体を生成する場合の両方においてあまり効果的ではない。疑わしい１１，１３異性体の高い割合、および同定されていない材料の有意な割合にもまた、注意すること。
【００６２】
実施例３は、温度パラメーターの臨界を示す。プロピレングリコール媒体における温度の上方へのシフトは、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体を犠牲にして夾雑している異性体の量を急に増加する。トランス，トランス種において急激な増加がより高い温度において存在する（なぜなら、増加したエネルギーストレスのレベルにおいてより安定な電子配置を生じる二重結合転移が好まれるからである）こともまた興味深い。
【００６３】
実施例４は、水性アルカリ系における温度の低下が、実際に、夾雑している異性体のうちのいくつかのの量を減少することを示す。しかし、収量における劇的な低下が存在し、１１，１３群の異性体のレベルは非常に高いままである。このことは、この電子配置の形成が、この系における全体的な運動エネルギーによって説明されるよりも、水性媒体中の塩基の作用によって影響を受けることを示唆する。２２．５時間というの極度に長い反応時間（効率的な産業スケールのバッチプロセスにとって長すぎる）にもまた注意すること。
【００６４】
表６は、ピーク面積の関数として種々の反応における相対的な異性体の割合を、それらの対応するピーク比に変換する。本プロセスは、おおよそ等しい量の２つの所望のＣＬＡ異性体の各々への、９，１２−リノール酸の実質的に完全な変換を生じる。ましてより高い温度において、プロピレングリコールにおいてさえ、１１，１３異性体の発生は、低い温度の水性アルカリプロセスの発生の３分の１である。
【００６５】
（Ｃ．アルコラート触媒を用いた異性化）
いくつかの実施形態において、本発明はまた、ＣＬＡのアルキルエステルを生成するための方法を提供する。脂肪の分割および脱水後、遊離の脂肪酸を、メタノールまたは他の一価低分子量アルコールと合わせ、そしてアルコールが沸騰する温度まで加熱した。エステル化は、反応水を凝縮器を介して除去する、再還流条件下で進行する。さらなる量の同じかまたは異なる一価アルコールの添加後、アルコラート触媒を、このエステル混合物にブレンドする（例えば、米国特許第３，１６２，６５８号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。代表的なアルコラート触媒は、ナトリウムエトキシドもしくはカリウムエトキシド、またはこれらのメチル対応物、ブチル対応物もしくはプロピル対応物である。
【００６６】
エステル化において、メタノールまたはエタノールが好ましいが、他の分枝鎖一価アルコールまたは直鎖一価アルコールが、使用され得る。アルキル基の脂肪族鎖が長くなるにつれ、この材料はより脂質適合性になる。粘性もまた、増加する傾向がある。異なる型の食餌または食物（その粘稠度は変化する）に関して、種々の粘性の生成物が、ＣＬＡ部分から生じる治療特性または栄養学的特性に影響を与えることなく所望の流動特徴または混合特徴を得るために使用され得る。エステル化の理論および実際は、慣用的である。最も一般的な方法の基本的な説明は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．：１９９６（第５版）に示される。動物およびヒトの身体は、多様なエステラーゼを有し、故に、ＣＬＡ−エステルは、切断されて、遊離の脂肪酸を容易に放出する。組織取り込みは、関与する組織および要求される利点に依存して、異なる動態を有し得る。
【００６７】
異性化工程において、アルコラート触媒が、水性アルカリに媒介される異性化よりも、はるかに優れた生成物を生成したことが見出された。後者のプロセスは、温和な反応条件下であっても所望されない異性体を、常に生成する。温和な条件は、実施例に示されるように、より低い量の所望されない異性体を与えるが、収率を大きく犠牲にする。ほとんどの系において、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体の発生が優勢であり、そしてこれらは、おおよそ等モル量で形成される。一方の異性体の、他方を除外した異性化を制御することは、これまで可能ではなかった。一方または他方の異性体の割合を増加することは（達成される生理学的効果に依存して）望ましいが、現在のところこれは、所望の異性体が富化された供給源を添加することによって、大規模に実行されなければならない。
【００６８】
アルコラート触媒を用いた共役のための好ましい出発材料は、ヒマワリ油、サフラワー油、およびトウモロコシ油である。これらの油の各々は、高レベルのリノール酸および低レベルのリノレン酸を含む。実施例１８に示されるように、リノレン酸の共役は、いくつかの特徴付けられていない脂肪酸部分の形成を引き起こし、これらの生物学的な特性は、未知である。以前の共役プロセスは、未知化合物の生成と関連しなかった。なぜなら、これらの生成物は、乾性油、塗料およびワニスにおいて使用され、ヒトまたは動物による消費が予定された製品においては使用されなかったからである。従って、高レベルのリノレン酸を含む油を用いたこれらのプロセスによって生成されたＣＬＡは、栄養学的使用に適していなかった。
【００６９】
いくつかの実施形態において、グリセロールまたはグリセロールのエステルは、脂肪酸のモノエステルを作製する前に除去されるべきであることが、さらに意図される。共役の間に存在する微量のグリセロールは、トリメトキシプロパンおよびトリエトキシプロパンの生成に寄与する。従って、共役の前に、アルコール分解によって得られたモノエステルを蒸留することが好ましい。
【００７０】
（Ｄ．ＣＬＡのトリアシルグリセリド誘導体）
本発明は、ＣＬＡの誘導体の使用を意図する。例えば、ＣＬＡは、実施例５、６、および１４に記載されるように、遊離であり得るかもしくは上記のようにエステル結合を介して結合され得るか、またはＣＬＡトリグリセリドを含む油の形態で提供され得る。これらの実施形態において、このトリグリセリドは、グリセロール骨格に結合したＣＬＡから部分的または完全に構成され得る。ＣＬＡはまた、好ましくは、実施例８および９に記載されるように、メチルエステルまたはエチルエステルとして提供され得る。さらに、ＣＬＡは、非毒性塩の形態（例えば、カリウム塩またはナトリウム塩（例えば、化学的に等価な量の遊離酸をアルカリ水酸化物と約ｐＨ８〜９において反応させることによって形成される塩））であり得る。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、ヒマワリ油および／またはサフラワー油由来のリノール酸の非水性異性化に関して本明細書中の以後に開示される新規ＣＬＡ異性体混合物を含む、新規トリアシルグリセロールが合成される。ＣＬＡに関して高度に富化された（９０〜９６％）純粋なトリアシルグリセロールが、Ｈ ＮＭＲによって確認され得る。エステル化は、固定されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼを用いて進行させる。好ましくは、ＣＬＡは、少なくとも４０％、および４５〜４８％以上のｃ９，ｔ１１−オクタデカジエン酸およびｔ１０，ｃ１２−オクタデカジエン酸、ならびにこれらの混合物を含む。１％未満のエステル８，１０；１１，１３；およびトランス，トランス異性体が存在するか、またはこれらは、総計５％未満で存在する。いくつかの実施形態において、生じるトリアシルグリセロールは、全レベルのホスファチジル残基およびステロール残基を除去するためにさらに精製されない。しかし、ヒマワリ油およびサフラワー油の異性化からの残存するレベルは、食餌および食物における安全で可食の製品を含む商業的適用に対して十分である。他の実施形態において、トリアシルグリセロールは、分子蒸留によってさらに精製される。
【００７２】
固定されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼは、Ｈａｒｒａｌｄｓｏｎらにおいて、ｎ−３型の多価不飽和脂肪酸について記載されたものと類似の様式で使用される。エステル化反応は、５０°〜７５℃、好ましくは６５℃で、そして形成の際に同時生成される水またはアルコールを（エステルから）除去するために使用されるいかなる溶媒も減圧も存在させずに、実行される。これは、トリアシルグリセロール生成を完了にシフトさせ、そして本質的に定量的な収率での、いかなるモノアシルグリセロールおよびジアシルグリセロールも実質的に含まない高度に純粋な生成物を確実にする。化学量論量の遊離の脂肪酸（すなわち、グリセロールに基づく場合、３モル当量、またはグルセロール部分に存在するヒドロキシル基のモル当量の数に基づく場合、１モル当量）が使用され得る。基質の総重量に基づく場合、１０％投与量のリパーゼのみしか、必要でなく、これは多数回使用され得る。これは、生産性の観点から非常に重要である。これらの全ては、溶媒が必要とされないという事実とともに、このプロセスを、スケールアップおよび工業化の観点から非常に実現可能性のあるものにする。なぜなら、容積およびかさ高さの削減が、莫大であるからである。また、わずかに過剰な（＜５／５）遊離の脂肪酸は、終了へと反応を加速するため、および反応の完結を確実にするために、使用され得る。
【００７３】
反応の開始において、１−モノ−アシルグリセリドまたは３−モノ−アシルグリセリドが最初に形成され、続いて１，３ジアシルグリセリドが形成され、そして最終的に、より長い反応時間においてトリグリセリドが形成される。モノアシルグリセリドおよびジアシルグリセリドは、これらが生物学的活性を表すが、水性細胞環境においてより大きな可溶性を有し、かつ代替的な分子合成経路（例えば、リン脂質または他の機能的脂質の合成）に関与し得るという点で、有用な中間体である。対照的に、トリグリセリドは、しばしば細胞膜または貯蔵小胞中にインタクトで沈積される。従って、遊離の脂肪酸またはエステルよりもモノグリセロール、ジグリセロールまたはトリグリセロール形態のＣＬＡの投与は、ＣＬＡ成分の取り込みの様式および分布、代謝速度ならびに構造的役割または生理学的役割に影響を与え得る。
【００７４】
（ＩＩＩ．ＣＬＡ化合物の安定化）
本発明者らは、不活性でない容器または不活性でない条件下でのＣＬＡ組成物の貯蔵が、長期の安定性に有害であり得ることを最初に理解した。これは詳細には、金属イオン（例えば、鉄イオンおよび銅イオン）が、容器から溶解され得、そしてこの組成物の望ましくない酸化および揮発性有機化合物（特に、低分子量揮発性有機化合物）の形成を引き起こし得るという事実に起因する。これらの所望されない化合物は、ＣＬＡ製品の味および香りの両方に影響を与える。本発明者らはまた、これらの化合物の形成を回避するためにＣＬＡの加工の各工程において金属イオンを制限する（例えば、分子蒸留および他の蒸留工程の組合わせを介した金属の除去、貯蔵に適した製品を生成するためのこの蒸留した生成物に対する吸着剤の使用、および貯蔵製品における抗酸化剤およびキレート剤の使用による）ことが好ましいことを発見した。
【００７５】
従って、本発明は、ＣＬＡ（ＣＬＡ、ＣＬＡのエステル、およびＣＬＡのトリグリセリドを含むがこれらに限定されない化合物を含む）の、これらの化合物の酸化を回避することによる安定化を意図する。好ましい実施形態において、これらの組成物は、少なくとも３０日間安定であり、そして好ましくは最大２年間安定である。安定性は、貯蔵されるＣＬＡ製品における低分子量揮発性有機化合物のレベルによって、慣用的に記載され得る。従って、約３０日〜約２年間貯蔵されるこれらのＣＬＡ製品は、約１００ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物、好ましくは約１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物、および最も好ましくは約５ｐｐｍまたは１ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物を含む。
【００７６】
本発明は、いかなる１つの機構にも限定されない。実際、本発明の機構の理解は、本発明の組成物を生成するためにも本発明の方法を実行するためにも、必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、共役されていない脂肪酸と異なり、ＣＬＡは、過酸化物分解生成物を形成しないようである。これは、比色定量的チオシアン酸鉄方法（ｃｈｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｆｅｒｒｉｃ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって過酸化物値（ＰＶ）を分光光度的に測定することによって、実験的に実証された。開放したガラスにおける貯蔵後、ＣＬＡのＰＶは３２であった；比較において、リノール酸の値は３７０であった。
【００７７】
ＣＬＡは、分解の間に、ヘキサンを含む揮発性有機化合物を形成する。スチールドラム中に数週間貯蔵された製品は、最大２５ｐｐｍのヘキサンを含むことが見出された。ヘキサンは、食物製品において所望されない特徴的な味および香りを有する。ＣＬＡの酸化は、金属夾雑物の存在によって引き起こされるようである。従って、精製の間に酸化を促進するこのような化合物の除去のためのシステムが、有利である。
【００７８】
さらに、化合物をＣＬＡ調製物に添加して保存中の酸化を減少することもまた有利である。酸化を防止する化合物（酸化防止剤）は、２つの一般的な作用機構を有する。第１は、脂質過酸化物のラジカルの除去による酸化の防止である。例としては、トコフェロールおよびアスコルビルパルミテートが挙げられるが、これらに限定されない。酸化を防止するための第２の機構は、金属イオンのキレート化による。金属酸化剤キレート剤の例としては、クエン酸エステルおよびレシチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの市販の化合物（例えば、Ｃｏｎｔｒｏｘ、Ｇｒｕｍａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ、ＤＥ）は、過酸化物除去剤および金属キレート剤の両方（例えば、レシチン、トコフェロール、アスコルビルパルミテートおよびクエン酸エステル）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、金属酸化剤キレート剤が、ＣＬＡ含有化合物に添加され、酸化を防止する。他の実施形態において、金属酸化剤キレート剤および過酸化物除去剤の組み合わせが、ＣＬＡ組成物に含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ガスクロマトグラフィー／質量分析法が、ＣＬＡの揮発性の有機分解生成物の存在の検出において使用される。他の実施形態において、油安定性指数（ＯＳＩ）測定が、ＣＬＡの揮発性の有機分解生成物の存在を検出するために使用される。好ましい実施形態において、本発明の安定化された組成物は、６０℃で少なくとも約２０〜１００時間のＯＳＩを有する。特に好ましい実施形態において、６０℃で約４０時間のＯＳＩを有する。これらの値は、金属イオンの除去ならびに抗酸化剤およびキレート剤の添加に起因して、ＯＳＩ測定ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（公定方法） Ｃｄ １２ｂ−９２の推奨範囲を超えることに留意する。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＬＡサンプルからの酸化促進剤（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｎｔ）（例えば、鉄）の除去のための方法が、提供される。方法としては、蒸留または吸着によるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、異性化されたＣＬＡの金属イオン濃度は、約１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍである。好ましくは、金属イオン濃度は、約１ｐｐｍ未満であり、そして最も好ましくは、蒸留および／または吸着後に、約０．５ｐｐｍ未満である。本発明のいくつかの実施形態において、以下に記載のように、化合物が、ＣＬＡの酸化を防止するために添加される。
【００８１】
実施例１２は、ガスクロマトグラフィー、その後の質量分析法による、揮発性有機化合物の測定を示す。ＣＬＡは、実施例１１の方法によって調製される。ＧＣ／ＭＳを行い、そしてピークを、参照物質（例えば、Ｗｉｌｅｙ参照検索）を使用して同定される。表２８は、同定された化合物およびそれらの相対量を列挙する。同定された揮発性の有機化合物としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２−ブテナール、エタノール、３−メチルブタナール、４−メチルペンタノン、ヘキサナール、ヘプタナール、２−ペンチルフラン、およびオクタナールが挙げられる。実施例１２は、ＣＬＡのサンプルが、所望でない揮発性の有機化合物を含むことを示す。サンプルが、出発物質および正確な反応条件に依存して、さらなる揮発性の有機化合物を含み得ることが、当業者に理解される。
【００８２】
１つの例示的な実施例において、揮発性の有機酸の生成が経時的に増加することが示される。実施例１３は、６０℃で２１日間の外気中での保存の前後のＣＬＡ溶液中のペンタンおよびヘキサンの相対量を示す。結果を表２８に示す。ペンタンおよびヘキサンの両方の量が、２１日後に約２倍に増加した。この実施例は、ＣＬＡの酸化生成物として存在する揮発性の有機化合物のレベルが、経時的に増加することを示す。
【００８３】
好ましい実施形態において、保存中の酸化を防止するために、精製中に予防措置を講じる。これらの予防措置としては、酸化促進剤として作用する化合物（鉄または他の金属を含むが、これらに限定されない）の除去が挙げられる。いくつかの実施形態において、金属は、吸着剤（漂白土類（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｅａｒｔｈ）、活性炭ゼオライト、およびシリカが挙げられるが、これらに限定されない）での処理によって除去される。他の実施形態において、酸化促進剤は、蒸留によって除去される。
【００８４】
実施例１６は、金属を吸着するための１つの方法の例示的な実施例を提供する。この実施例において、シリカを、吸着剤として使用する。実施例１４の方法によって調製されたトリアシルグリセリドを、最初に、上昇した温度および圧力にて脱臭した。次いで、このサンプルをシリカと混合し、減圧下で加熱した。本発明は、実施例１６に記載の吸着条件に限定されることを意図されず；当業者に公知の他の吸着方法が意図される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、酸化促進剤は、蒸留プロセスにおいて除去される。例示的な実施例を、実施例１４に与える。この実施例において、ＣＬＡのトリアシルグリセリドの蒸留を、分子蒸留装置で行う。蒸留を、１５０℃および１０−２ｍｂａｒの圧力にて行う。本発明は、この蒸留について記載した条件に限定されることを意図されない。他の温度および圧力は、本発明の範囲内にある。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣＬＡの酸化は、最終生成物への金属酸化剤キレート剤または過酸化物除去剤の添加によって防止される。好ましい金属イオンキレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ペニシラミン、デフェロキサミン、および他の安全であると一般に認識されている（ＧＲＡＳ）キレート剤、ならびにそれらの生理学的に受容可能な塩が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態おいて、酸化の量は、油安定性指数（ＯＳＩ）によって測定される。ＯＳＩ（例えば、ＡＯＣＳ公定方法Ｃｄ １２ｂ−９２を参照のこと）は、酸化に対する油の耐性の尺度である。これは、酸化速度の最大変化の時間として数学的に規定される。この速度は、数学的に決定され得る。実験的に、ＯＳＩは、揮発性の有機酸（酸化生成物）が溶解される脱イオン水の伝導性における変化を測定することによって計算される。ＯＳＩ測定を行う場合、酸化プロセスを促進し得る微量の金属の混入を回避することが重要である。これは、一般に、クロメートまたは界面活性剤を欠く洗浄溶液と共に用いる、全てのガラス製品の注意深い洗浄によって達成され得る。水は脱イオン化されなければならず、そして全ての溶媒は高度に精製された品質のものでなければならない。
【００８８】
抗酸化剤の存在下または非存在下でのＣＬＡのＯＳＩ測定を例示する実施例を、実施例１５に与える。実施例１５において、ＣＬＡのトリアシルグリセリドを、実施例１４の方法によって調製する。サンプルを、種々の量（０〜０．１％）の４つの抗酸化剤（Ｃｏｎｔｒｏｘ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、Ｈｅｒｂａｌｏｘ（ローズマリーの抽出物；Ｋａｌｓｅｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）、Ｃｏｖｉ−ＯＸ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、およびα−トコフェロール）を含む開口皿に配置する。ＯＳＩを、上記のように計算する。結果を、表２９および図２に示す。α−トコフェロールの添加は、ＯＳＩ値を有意に増加しなかった。Ｈｅｒｂａｌｏｘは、この値を約２〜３倍増加した。Ｃｏｖｉ−ＯＸおよびＣｏｎｔｒｏｘは、ＯＳＩ値をより高い量（それぞれ、約４倍および６倍）に増加した。この実験は、抗酸化剤の添加が、保存中のＣＬＡ含有化合物の酸化を遅らせ得ることを実証した。
【００８９】
（ＩＶ．ＣＬＡ含有化合物の投与）
本発明の共役リノール酸部分は、種々の形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、投与は、経口である。ＣＬＡ部分は、適切なキャリア（例えば、デンプン、スクロースまたはラクトース）と共に、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、溶液、液体、スラリー、懸濁液およびエマルジョンに処方され得る。好ましくは、ＣＬＡ処方物は、抗酸化剤（Ｃｏｎｔｒｏｘ、Ｃｏｖｉ−ＯＸ、レシチン、およびビタミンＣ（アスコルビルパルミテート）の油溶性形態が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。ＣＬＡは、水溶液、油性溶液、または上記の他の形態のいずれかで提供され得る。本発明の錠剤またはカプセル剤は、腸溶性コーティングでコートされ得、このコーティングは、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する。小腸で溶解するが胃で溶解しない適切な腸溶性コーティングは、酢酸フタル酸セルロースである。いくつかの実施形態において、ＣＬＡは、７５０ｍｇの８０％ＣＬＡを含む軟性ゼラチンカプセル剤（ＴｏｎａｌｉｎＴＭ）として提供される。ＣＬＡはまた、多くの他の経路のいずれかによって提供され得る。これらの経路としては、静脈内、筋内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所的、舌下または直腸手段が挙げられるが、これらに限定されない。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出され得る。
【００９０】
有効量のＣＬＡ部分が、種々の食品（動物飼料、および飲料を含む）における補助剤として提供され得る。この適用の目的のために、ＣＬＡを含む食品は、外来性のＣＬＡが添加された、任意の天然の食品、加工食品、ダイエット食品または非ダイエット食品を意金属酸化剤キレート剤する。ＣＬＡは、遊離脂肪酸、共役リノール酸のエステルの形態で、または油含有のＣＬＡの部分トリグリセリドまたは全トリグリセリドとして添加され得る。従って、ＣＬＡは、種々の調製された食品（ダイエット飲料、ダイエットバー、補助剤、加工凍結食、キャンディー、スナック製品（例えば、チップス）、加工肉製品、牛乳、チーズ、ヨーグルトおよび任意の他の脂肪または油含有食品が挙げられるが、これらに限定されない）に直接含まれ得る。アルキルエステルまたはアルカリアルコラート触媒によって生成された共役リノール酸成分を処方された食品は、使用する溶媒および触媒に依存して、アルコール（例えば、メチルアルコールまたはエチルアルコール）を含む。一般に、これらのアルコールは、約１〜１０ｐｐｍで存在する。
【００９１】
さらに、上記および実施例に示されるように、ＣＬＡ組成物は、ＣＬＡを含有する食品の味および香りに悪影響をもたらさないレベルの揮発性有機化合物を含み得る。１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物、そして好ましくは、５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を有するＣＬＡ組成物を含む本発明の食品が、より高いレベルの揮発性有機化合物を含む食品に比べて味および香りが優れており、そして味および香りの盲検において好まれることが意図される。従って、本発明のいくつかの実施形態は、共役リノール酸部分を含む食品を提供し、ここで、この共役リノール酸部分は、その食品の味および香りが影響されないように十分に低い揮発性有機酸化合物濃度を有する。
【実施例】
【００９２】
（実験）
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を実証およびさらに例示するために提供され、そして本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
【００９３】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｋｇ（キログラム）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；Ｌまたはｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ＫＯＨ（水酸化カリウム）；ＨＣＬ（塩酸）；Ｈｇ（水銀）。
【００９４】
（実施例１）
（低温でプロピレングリコールを使用するサフラワー油の異性化）
サフラワー油を、触媒としてＫＯＨを使用して、低温にてプロピレングリコール中で異性化した。この異性化装置は、温度計を備えた２首フラスコからなり、温度計は、一方の首に配置され、過剰の圧力を放出するために小さい開口を残す。窒素供給源を、このフラスコのもう一方の首に取り付けた。フラスコに添加した溶液を、磁気棒および磁気スターラーの使用によって攪拌した。フラスコの温度を、磁気スターラー上に配置したサーモスタット制御油浴中にフラスコを配置することによって制御した。
【００９５】
フラスコを、６０．２７ｇのプロピレングリコールおよび２８．２０ｇのＫＯＨで満たし、そして油浴中に漬けた。温度を１３０℃に上昇させ、ＫＯＨを溶解させた。ＫＯＨが溶解した後、６０．０９ｇのサフラワー油をフラスコに導入した。多量の窒素を、２首フラスコを通して５分間循環させ、次いで、より少量に減少させた。この混合物を１５０℃に加熱した（約４０分を要した）。次いで、この混合物を、３．５時間１５０℃で反応させた。間隔を開けながら、３ｍｌのサンプルを分析用に採取した。
【００９６】
これらのサンプルを、６ｍｌの熱水中に直接配置し、そしてクエン酸を、遊離脂肪酸が上層として分離されるまで過剰に添加した。加熱は、クエン酸を添加する間の凝固を防止するために必要であった。ガスクロマトグラフィーによる分析のために遊離脂肪酸をメチルエステルに変換するために、０．０２５ｇの遊離脂肪酸、５ｍｌの４％ ＨＣｌ溶液およびエタノールを試験管に添加した。窒素を試験管に添加し、次いで、試験管を密閉し、そして２０分間６０℃の水浴中に置いた。次いで、試験管を冷却し、１ｍｌの精製水および５ｍｌのイソオクタンを添加した。窒素を試験管に添加し、そして試験管を３０秒間振盪した。得られた上層を、新しい試験管中の１μｌの精製水に添加し、そして再度窒素下で振盪した。次いで、得られた上層をイソオクタンで洗浄し、第３の試験管にデカントした。少量の硫酸ナトリウムを、水分吸収のために添加した。次いで、１μｌのサンプルを、ガスクロマトグラフに直接注入した。
【００９７】
ガスクロマトグラフィー条件は、以下のとおりである：
システム：Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ自動システム
注入器：２４０℃でのスプリットなし（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）
検出器：２８０℃での水素炎イオン化検出器
キャリア：ヘリウム
カラム：ＷＣＯＴ融合シリカ０．２５ｍｍ×１００Ｍ、ＣＰ−ＳＬ ８８ ＦＡＭＥ用、ＤＦ０．２
オーブンプログラム：８０℃（０分）から、１０℃／分で２２０℃まで上昇し、２２０℃で１０分間維持
全ての結果を、相対的なピーク面積％として表す。標準は一般的に利用可能でなく、そのため、溶出したピークを他のシステムで確かめた。ＧＣ−ＭＳは、シス結合およびトランス結合の数を決定するが、これらの位置を決定しない。従って、ＮＭＲ分析を使用して、結合の位置を確認した。大きいピークは、ｃ９，ｔ１１およびｔ１０，ｃ１２であった。ＣＬＡ異性体のＮＭＲ分析については、Ｍａｒｃｅｌ Ｓ．Ｆ．Ｌｉｅ Ｋｅｎ ＪｉｅおよびＪ．Ｍｕｓｔａｆａ，Ｌｉｐｉｄｓ，３２（１０）１０１９−３４（１９９７）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９８】
このデータ（表６に示されそして表１０に要約される）は、プロピレングリコール（溶媒として）、ＫＯＨ（触媒として）および低い温度を使用するサフラワー油の異性化が、８，１０異性体および１１，１３異性体を欠く共役リノール酸の生成を生じることを実証する。この実験において使用した高度に極性のカラムは、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体から８，１０異性体および１１，１３異性体を分離するために首尾よく使用され得る。８，１０異性体は、ｃ９，ｔ１１異性体と同時に溶出されるかまたはｃ９，ｔ１１異性体の直後に溶出される傾向がある。１１，１３異性体は、カラム条件に依存して、ｔ１０，ｃ１１異性体の前に溶出するか、またはｔ１０，ｃ１２異性体と共に溶出する。
【００９９】
この方法に従って生成された共役リノール酸を、生成される種々の異性体を比較することによって特徴付けた。第１に、この異性化反応は、実質的に完了するまで進行した。この反応の完全性は、リノール酸異性体−残留するｃ９，ｔ１２リノール酸についての総ピーク面積を、総ピーク面積によって除算することによって得られる。この値は、０．９９４である。第２に、総ピーク面積に対するｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．９５３である。第３に、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体に対するｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．０１０である。第４に、総ピーク面積に対するｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．００９である。第５に、ｃ９，ｔ１１異性体に対するｔ１０，ｃ１２異性体の比が決定され得る。この値は、１．０１８である。これらの比を、表１１に要約する。
【０１００】
（実施例２）
（高温および高圧での水性異性化）
５０ｇの水および２５．３２ｇのＮａＯＨを、高圧リアクタ（Ｐａｒｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ ＭＬ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｌｏｙ ４００（圧力ゲージおよびスターラーを備える））に添加した。ＮａＯＨを溶解させ、そして９４．０ｇのサフラワー油をリアクタに添加した。リアクタを閉じ、そして２分間窒素をフラッシュし、次いで、全ての弁を閉じた。リアクタを電気ガスケット中で２１０℃に加熱し、この温度で６時間維持した。次いで、温度を６０℃に減少し、その後圧力を放出し、そしてリアクタを開けた。２ｇの生じた凝固セッケンをリアクタから採取し、そして約４０℃の水に溶解した。次いで、クエン酸を添加して溶液中のｐＨを６未満に低下させた。サンプルを、脂肪酸の上層から採取し、そして実施例１のようにガスクロマトグラフィー用に調製した。
【０１０１】
ガスクロマトグラフィーの結果を表７に表し、そして表１０に要約する。これらのデータは、この異性化方法が、比較的多い量の８，１０異性体および１１，１３異性体の形成を生じることを示す。比を表１１に示す。
【０１０２】
（実施例３）
（高温高圧でのサフラワー油の非水性アルカリ異性化）
１００．４８ｇのプロピレングリコールおよび４６．７５ｇのＫＯＨを、実施例２に記載されるような高圧反応器に添加した。次いで、この反応器を、ＫＯＨを溶解するために１３０℃まで加熱した。次いで、１００．１２ｇのサフラワー油を、ＫＯＨ−プロピレングリコール混合物に添加した。この反応器を閉じ、窒素で１分間フラッシュし、そして全てのバルブを閉じた。次いで、この反応器を２１０℃まで加熱し、そしてこの温度で１時間維持した。この反応器を冷却し、そして内容物を１２０ｇの熱水にデカントした。攪拌しながら、３５．３ｇの３７％ＨＣｌおよび２７．５９ｇのクエン酸を、この脂肪酸に連続して添加した。最上層からサンプルを採取し、そして減圧フラスコ中６０℃で乾燥させた。得られた脂肪酸のサンプルを、実施例１に記載のようにガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１０３】
この結果を表８に表し、そして表１０に要約する。この実験は、高温でＫＯＨおよび非水性溶媒を用いるサフラワー油の異性化が、有意な量の８，１０異性体および１１，１３異性体、ならびにｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の形成を生じることを実証する。比を表１１に示す。
【０１０４】
（実施例４）
（低温での水性アルカリ反応）
４９．９４ｇの水および３９．９６ｇのＮａＯＨを、実施例３に記載される高圧反応器に添加した。この混合物を、ＮａＯＨが溶解するまで加熱した。次に、１００．５４ｇのサフラワー油をこの高圧反応器に添加し、この反応器を窒素でフラッシュし、そして全てのバルブを閉じた。この高圧反応器を、１７９℃まで２２．５時間加熱した。実施例３のように、ガスクロマトグラフィーのためのサンプルを調製した。このデータを表９に示し、そして表１０に要約する。この実験は、水性アルカリ異性化について低温が用いられる場合、共役反応は完了しないことを実証する。さらに、有意な量の８，１０異性体および１１，１３異性体が生成される。比を表１１に示す。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
【表１１】
（実施例５）
（直接エステル化によるＣＬＡのトリアシルグリセロールの調製）
概要。溶媒としての重水素化クロロホルム中で、Ｈ核磁気共鳴スペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０ ＮＭＲ分光器で記録した。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＰｒｅｐＰａｋ（登録商標）５００／Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅカラムを使用し、石油エーテル中の１０％ジエチルエーテルで溶出する、ＷａｔｅｒｓからのＰｒｅｐＬＣＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ ５００Ａ機器によってＨＰＣＬ分離を行った。分析ＧＬＣを、Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎら，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ Ｓｃａｎｎｅｄ ４５：７２３（１９９１）に記載されるような、以前に記載された手順に従って、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ８１４０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈで行った。
【０１１１】
固定したＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼを、ＤｅｎｍａｒｋのＮｏｖｏ ＮｏｒｄｉｓｋからＮｏｖｏｚｙｍｅＴＭとして得た。これを、エステル化実験において提供する場合、直接使用した。Ｍｅｒｃｋから購入した分析等級のジエチルエーテルは、いずれの精製もなく使用したが、Ｍｅｒｃｋからの合成等級のｎ−ヘキサンは、抽出およびＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて使用する前に、新たに蒸留した。グリセロール（９９％）を、ＳｉｇｍａおよびＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、そしてさらなる精製なしで使用した。ＣＬＡ濃縮物を、ＮｏｒｗａｙのＮａｔｕｒａｌ Ｌｉｐｉｄｓから、遊離脂肪酸としてＴｏｎａｌｉｎＴＭとして得た。この純度を、分析用ＧＬＣおよび高磁場ＮＭＲ分光法によって確認し、これによってある程度のグリセリド不純物が明らかになった。Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでのＧＬＣによって、ＣＬＡ濃縮物は、４３．３％の９−ｃｉｓ，１１−ｔｒａｎｓ−リノール酸、４４．５％の１０−ｔｒａｎｓ，ｌ２−ｃｉｓ−リノール酸、５．４％の他のＣＬＡ異性体、５．６％のオレイン酸、および各々０．６％のパルミチン酸およびステアリン酸を含むことがわかった。
【０１１２】
（実施例６）
（直接エステル化によるＣＬＡのトリアシルグリセロールの調製）
固定したＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ（１．２５ｇ）を、グリセロール（１．２２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）および遊離脂肪酸としてのＣＬＡ（Ｍ．ｗｔ．２８０．３ｇ／ｍｏｌ；１１．６ｇ，４１．５ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。この混合物をマグネチックスターラーホットプレート上、６５℃、０．０１〜０．５Ｔｏｒｒの持続減圧下で、緩やかに攪拌した。この反応の進行の間に精製した揮発性の水を、液体窒素冷却トラップ中に持続的に濃縮した。４８時間後、この反応を中断し、ｎ−ヘキサンを添加し、そして酵素を濾過によって濾別した。この有機相を、炭酸ナトリウムのアルカリ性水溶液で処理して、過剰の遊離脂肪酸を除去した（必要な場合）。この有機溶媒（適切な場合、無水硫酸マグネシウムで乾燥後）を、ロータリーエバポレーターで減圧下で除去し、続いて、高減圧処理によって実質的に純粋な生成物を、わずかに黄色がかった油状物として得た（１０．９ｇ；平均Ｍ．ｗｔ．８７８．６ｇ／ｍｏｌ；収率９３％）。化学量論量の遊離脂肪酸が使用される場合、標準化水酸化ナトリウムによる滴定を適用して、粗反応生成物の遊離脂肪酸含有量を決定した（エステル基のモル数に基づく場合の１％未満の遊離脂肪酸含有量は、少なくとも９９％の取り込みに対応し、これは、最低９７％のトリグリセリド含有量と等価である）。この粗生成物を、ＨＰＬＣに直接導入し、ｎ−ヘキサン中の１０％ジエチルエーテルで溶出して、１００％純度のトリグリセリドを無色の油状物として得た。２５０ＭＨｚ １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）８（ｐｐｍ）６．３５−６．２３（３Ｈ，ｄｄｔ，Ｊｔｒａｎｓ＝１５．０Ｈｚ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｊアリール＝１．３，＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ），５．９８−５．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｉｃｉｓ＝１０．９，Ｊ＝１０．９，−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝），５．７１−５．５９（３Ｈ，ｄｔｄ，Ｊｔｒａｎｓ＝１５．０Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，＝ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−），５．３５−５．２６（４Ｈ，ｍ，＝ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−および−ＣＨ２Ｃ−ＩＣＨ２−），４．３３−４．２６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊｇｅｍ＝１１．９Ｈｚ，Ｊ＝４．３，−ＣＨ２ＣＨＣＨ２−），４．１８−４．１０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊｇｅｍ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝６．０，−ＣＨ２ＣＨＣＨ２−），２．３７−２．３１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４ Ｈ２，−ＣＨ２ＣＯＯＲ），２．１９−２．０５（１２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−），１．６６−１．６０（６Ｈ，ｑｕ．，Ｊ＝Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＲ），１．４３−１．３０ １８Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−），０．９１−０．８６（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，−ＣＨ３）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８（ｐｐｍ）１７３．２，１７２．８，１３４．６，１３０．０，１２８．６，１２５．５，６８．８，６２．０，３４．０，３２．９，３１．６，２９．６−２８．９（６Ｃ），２７．６，２４．８，２２．５，１４．１。
【０１１３】
この反応の進行をモニターするため、およびこの反応の間の個々のグリセリドの組成についてのより詳細を提供するために、サンプルを、この反応の進行に伴なって規則正しく収集した。これらをＨＮＭＲ分光法によって分析し、そしてこの反応の進行の間のモノ−、ジ−およびトリアシルグリセロールの組成における良好な洞察を提供した。この結果を、以下の表１２に示す。この表から認識され得るように、１，３−ジアシルグリセロールは、この反応の最初の２時間の間、この反応混合物の優位を占める。４時間後、トリアシルグリセロールが優勢になり、そして２２時間後に９８％の組成に達し、そして４８時間後に１００％に達した。予想され得るように、１，２−ジアシルグリセロールは、１，３−ジアシルグリセロールよりも相当低いレベルに達した。１−モノアシルグリセロールは、この反応の最初の時間の間に最大に達したが、２−モノアシルグリセロールは、この反応を通して検出されなかった。
【０１１４】
【表１２】
（実施例７）
（ＣＬＡの収率および組成に対する、種々の温度および反応持続時間の影響） サフラワー油の共役に対する温度および反応持続時間の影響を決定した。水およびＮａＯＨを、表１、欄１および２に示されるように、高圧反応器（圧力ゲージおよびスターラーを備えたＰａｒｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ＭＬ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｌｏｙ ４００）に添加した。ＮａＯＨを溶解し、そしてサフラワー油（欄３）をこの反応器に添加した。この反応器を閉じ、そして２分間窒素でフラッシュし、次いで全てのバルブを閉じた。この反応器を、電気的ガスケットで所望の温度まで加熱し（欄４）、そして所望の時間（欄５）この温度を維持した。ついで、圧力を開放する前に、この温度を６０℃まで低下し、そして反応器を開けた。各反応について、反応器から、得られた２グラムの凝固した石鹸を取り出し、そして約４０℃の水に溶解した。ついで、クエン酸を添加して、この溶液のｐＨを６未満まで下げた。サンプルを、この脂肪酸最上層から取り出し、そしてガスクロマトグラフィーのために調製した。
【０１１５】
このガスクロマトグラフィーの結果を、欄６（９，１１異性体および１０，１２異性体の全パーセンテージ）、欄７（１１，１３異性体の全パーセンテージ）、ならびに欄８（全てのＣＬＡ異性体の全パーセンテージまたは収率）に示す。これらのデータは、反応の持続時間および温度が増加するにつれて、共役体の総量および１１，１３異性体のパーセンテージが増加することを示す。１１，１３異性体の形成が少ない条件下では、共役体の総量もまた少ない。
【０１１６】
【表１３】
（実施例８）
（サフラワー脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の結合）
この反応を、閉鎖容器中で行った。以下の成分を一緒に混合した：１００ｇのサフラワーＦＡＭＥ、および約２．８ｇのＫＯＣＨ３および２．８ｇのメタノールの混合物。２種の成分の混合の間のメタノールの蒸発に起因して、メタノールより多くのＫＯＭｅがおそらく存在する。この混合物を、この閉鎖反応容器中、窒素雰囲気下で、１１１〜１１５℃で５時間攪拌した。異性体の分布を、ガスクロマトグラフィーによって分析した。この結果を、表２に要約する。未処理のＧＣデータを、表３に示す。これらのデータは、結合サフラワーＦＡＭＥが、穏やかな条件下で達成され得、かなりの量の所望でない８，１０異性体および１１，１３異性体を含まない生成物を生じることを示す。
【０１１７】
表１４：異性体の分布
パルミチン酸 ６．６％
ステアリン酸 ２．７％
オレイン酸 １２．９％
リノール酸 ５．７％（未結合）
ＣＬＡ ｃ９，ｔ１１ ３４．１％
ＣＬＡ ｔ１０，ｃ１２ ３３．３％
ＣＬＡ ｃ，ｃ １．８％
ＣＬＡ ｔ，ｔ １．０％
ＣＬＡ 合計 ７０．２％。
【０１１８】
（実施例９）
（共役サフラワーＦＡＭＥの大規模バッチ生成物）
サフラワー結合ＦＡＭＥの生成を、２つの段階に分け得る：メタノール分解および結合。メタノール分解のために、６，０００ｋｇのサフラワー油を、閉鎖反応器に入れた。この反応器を、大気圧の窒素でパージし、そして１１５０リットルのメタノールおよび１６０ｋｇのＮａＯＣＨ３（３０％溶液）を添加した。この混合物を、攪拌しながら６５℃まで加熱し、そして６５℃で２時間反応させた。得られた底部層を、反応器を窒素ガスでパージしながらデカントした。次いで、１０００リットルの水（４０〜５０℃、これに５０ｋｇのクエン酸一水和物が溶解される）を、攪拌しながら添加した。この層を分離させ（約６０分）、そして底部層を、この反応器を窒素ガスでパージしながらデカントした。得られたサフラワーＦＡＭＥ生成物を、８０℃、減圧下で１時間乾燥させた。
【０１１９】
サフラワーＦＡＭＥを結合するために、メタノールに溶解してぺーストを形成した２５０ｋｇのＫＯＣＨ３を、この反応器に添加した。次いで、この混合物を攪拌しながら１２０℃まで加熱し、そして反応を３時間続けた。この混合物を１００℃まで冷却し、そして１０００リットルの水（４０〜５０℃、これに５０ｋｇのクエン酸一水和物が溶解される）を、攪拌しながら添加した。この混合物を１５分間攪拌し、次いでこの層を２０分かけて分離した。底部層をデカントし、そして生成物を８０℃で１時間乾燥させ、次いで窒素下で保存した。
【０１２０】
得られたＣＬＡを、以下の条件下で、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ＸＬ ＧＣを用いて分析した：
カラム： ＷＣＯＴ融合シリカ １００ｍ×０．２５ｍｍ，Ｃｏａｔｉｎｇ ＣＰ ＳＩＬ ８８
キャリア： Ｈｅガス，３０．０ＰＳＩ
温度： ２２０℃
作動時間： ３５〜９０分
注入： Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ，２４０℃
検出： ＦＩＤ，２８０℃。
【０１２１】
このＧＣの結果を、表１５および１６に要約する。
【０１２２】
【表１４】
（実施例１０）
以下は、本発明のＣＬＡ遊離脂肪酸、トリグリセリド、およびエステルを含む代表的な動物の食料の例である。
【０１２３】
Ａ．ブタの開始食料
【０１２４】
【表１５】
Ｂ．ブタのための成長停止食料（４０−２４０ＬＢＳ［１８−１０９ＫＧＳ］）
【０１２５】
【表１６】
Ｃ．ブタの成長停止食料（ブタ１２１−２４０ＬＢＳ［５５−１０９ＫＧＳ］）
【０１２６】
【表１７】
ブタの微量鉱物再混合物の組成および分析
【０１２７】
【表１８】
（ブタビタミンプレ混合物の組成）
（表２０）
【０１２８】
【表１９】
（Ｄ．雌鶏についての１８％タンパク質層食料）
（表２１）
【０１２９】
【表２０】
（Ｅ．ブロイラーについての開始期食料および仕上げ期食料）
（表２２）
【０１３０】
【表２１】
（Ｆ．飼育期／仕上げ期シチメンチョウ食料）
（表２３）
【０１３１】
【表２２】
（Ｇ．乾燥ドッグフード処方）
（表２４）
【０１３２】
【表２３】
（Ｈ．やや湿気のあるドッグフードの処方）
（表２５）
【０１３３】
【表２４】
（実施例１１）
（ＣＬＡの大スケール調製）
本実施例は、サフラワー油の異性化によるパイロットスケールでのＣＬＡの遊離脂肪酸の方法を示す。１０００ｋｇのＫＯＨを、２０７０Ｌのプロピレングリコールに溶解した。その後、この混合物を、攪拌しながら１００℃まで加熱した。ついで、２３４０Ｌのサフラワー油を添加し、そしてその温度を、１５０℃まで３時間上昇させた。その後、この混合物を、冷却し、そして１０００Ｌの水および１３５０ＬのＨＣＬを添加した。この時点で、その溶液が、遊離脂肪酸を上層として、二層に分離した。これらの層を分離し、そして下の水層を廃棄した。上層を、５０ｋｇのクエン酸を含む１０００Ｌの水を用いて洗浄した。この水層を廃棄し、そして油（ＣＬＡ）含有層を、減圧下で乾燥した。
【０１３４】
（実施例１２）
（揮発性化合物の検出）
本実施例は、ヘッドスペースキャピラリーガスクロマトグラフィーおよび質量分析計を使用する、揮発性有機化合物の検出を示す。実施例１１の方法により調製した３ｇのＣＬＡを、スリフ（ｓｌｉｆｆ）管において７０℃、１００ｍｌ／分の窒素を用いてパージした。放出された揮発性化合物を、パージおよび捕捉技術によって、Ｔｅｎｅｘ ＧＲ上に吸収した。その後、吸収された化合物を、ロウエーテルカラム（Ｊ＆Ｗ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０／５９７０ ＧＣ／ＭＳＤガスクロマトグラフィーシステムに、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＴＤ注入器によって注入した。ピークを、Ｗｉｌｅｙ参照サーチを使用して同定した。
【０１３５】
表２７は、最も優勢なピークおよびその相対的存在度（面積％）を示す。１１個の揮発性化合物を、サンプル（ペンタンおよびヘキサンを含む）中で同定した。これらの化合物の多く（ヘキサンを含む）は、動物またはヒトによる消費のための製品中では望ましくない。これらの結果は、油の化学的共役により調製されたＣＬＡサンプルは、望ましくない揮発性有機化合物を含むことを示す。
【０１３６】
（実施例１３）
（ＣＬＡの酸化）
本実施例は、経時的なＣＬＡの酸化を示す。ＣＬＡを、実施例１１に記載されるように調製した。１つのサンプルを、試験管中にて室温で２１日間放置した。第２の参照サンプルを、−３０℃で貯蔵した。両方のサンプルにおけるペンタンおよびヘキサンの増加を、実施例１２に記載される方法によって測定した。結果を、表２８に示す。サンプル中に存在するペンタンおよびヘキサンの両方の量が、室温で２１日間の貯蔵の後、約２倍増加した。本実施例は、油の化学的共役により調製されたＣＬＡサンプルが、経時的に酸化して、望ましくない揮発性有機化合物を形成することを示した。
【０１３７】
（実施例１４）
（トリアシルグリセリドの生成）
ＣＬＡを、実施例１１の方法に従って調製した。その後、この製品を、１５０℃および圧力１０−２ｍｂａｒで分子蒸留プラントにて蒸留した。次いで、１０００ｋｇのこの蒸留産物を、９７ｋｇの純粋なグリセロールおよび８０ｋｇリパーゼと混合した。この反応を、減圧下で攪拌しながら、５５℃で１２時間進行させた。そのトリアシルグリセリド産物を、分子蒸留装置にて希釈して、未反応脂肪酸を除去した。
【０１３８】
（実施例１５）
（ＣＬＡトリアシルグリセリドの酸化）
実施例１４の産物のアリコートを、フタをしない皿に配置し、制御した条件下で６０℃にて貯蔵した。抗酸化剤を、種々の量で、これらのサンプルのうちのいくつかに添加した。使用した抗酸化剤は、Ｃｏｎｔｒｏｘ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ），Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、Ｈｅｒｂａｌｏｘ（Ｋａｌｓｅｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）、Ｃｏｖｉ−ＯＸ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ），Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、およびα−トコフェロールであった。抗酸化剤を、０重量％、０．０２重量％、０．０５重量％、および０．１０重量％で添加した。
【０１３９】
油安定性指数（ＯＳＩ）を、当該分野で公知の方法（Ｏｍｎｉｏｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＯＳＩ装置を使用する、ＡＯＣＳ公式方法Ｃｄ １２ｂ−９２）を使用して測定した。サンプル（５ｇ）を、耐熱浴中で保持し、そして精製空気流を、このサンプルに通した。このサンプルからの流出空気を、脱イオン水を含む容器を通してバブリングした。この水の伝導性を、経時的に継続モニタリングする。そのＯＳＩ（酸化率の最大変化の点）を、数学的に決定する。このＯＳＩ測定の結果を、表２９および図２に示す。α−トコフェノールの添加は、このＯＳＩ地を有意には増加しなかった。Ｈｅｒｂａｌｏｘは、その値を約２〜３倍増加した。Ｃｏｖｉ−ＯＸおよびＣｏｎｔｒｏｘは、より大量に、それぞれ、約４倍および６倍、このＯＳＩ値を増加した。本実験は、特定の抗酸化剤（金属酸化剤キレート剤を含む）の添加は、貯蔵の間のＣＬＡ含有化合物の酸化を遅らせ得ること示す。
【０１４０】
（実施例１６）
（吸収剤での処理）
ＣＬＡのトリグリセリドを、実施例１４に記載されるように調製した。このサンプルを、１５０℃および１ｍｍＨｇで３時間脱臭した。次いで、このサンプル５００ｍｌを、粉末シリカで処理した。シリカを２％まで添加し、減圧下で３０分間、９０〜１００℃まで加熱した。次いで、このサンプルを冷却し、そして濾過した。
【０１４１】
（表２６）
【０１４２】
【表２５】
（表２７）
【０１４３】
【表２６】
（表２８）
（抗酸化剤の存在下でのＯＳＩ値（標準偏差）
【０１４４】
【表２７】
（実施例１７）
（アルコラート触媒を用いたＣＬＡの生成）
本実施例は、カリウムメチレートを触媒として使用して、サフラワー油からＣＬＡを生成することを記載する。サフラワー油（４１．５ｇ）の蒸留メチルエステルを、０．２０７ｇメタノールおよび０．６２ｇカリウムメチレートを含むリアクター中に配置し、そしてそのリアクターを、閉める前に窒素でパージした。このリアクターの内容物を、攪拌しながら１２０℃にした。その後、その反応を、１２０℃で４時間進行させた。その後、そのリアクターを８０℃まで冷却し、そしてその内容物を、分離漏斗に移し、そして熱い蒸留水で洗浄し、その後、クエン酸を含む熱湯で洗浄した。その後、メチルエステルを、穏やかに加熱しながら、減圧下で乾燥させた。その乾燥メチルエステルを、イソオクタン中で溶解し、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒオートサンプラーを用いてＧＬＣにより分析した。そのカラムは、高極性の溶融シリカ型であった。以下のプログラムを使用した：
注入：２５０℃のスプリットレス（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）
検出：２８０℃でフレームイオン化検出器
キャリア：ｐｓｉｇでヘリウム
オーブンプログラム：８０℃〜１３０℃（４５℃／分）、その後１℃／分で２２０℃まで、そして２２０℃で１０分間
カラム：ＷＣＯＴ ＦＵＳＥＤ ＳＩＬＩＣＡ ０．２５ｍｍ １００ｍ、ＣＰ−ＳＩＬ ８８ ｆｏｒ ＦＡＭＥ、ｄｆ＋０．２。
【０１４５】
得られたＣＬＡは、ほぼ、表３０に示されるようなＣＬＡのｃ９、ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体のみからなった。
【０１４６】
【表２８】
（実施例１８）
（リノレン酸の共役により形成された産物）
本実施例は、リノレン酸の共役により形成された産物を記載する。純粋なリノレン酸（Ｎｕ Ｃｈｅｃｋ Ｐｒｅｐ．）をエステル化し、そしてリノレン酸の脂肪酸メチルエステル１．０８ｇを、４３．０ｍｇのカリウムメチレートおよび１０．８ｍｇメタノールとともに、試験管中で混合した。試験管を、窒素でパージして閉じた。その混合物を攪拌するために磁性バーを使用した。この反応を１２０℃で３時間進行させた。このサンプルを水で２回洗浄し、そしてクエン酸で１回洗浄し、そしてＧＬＣ分析のためにイソオクタン中に希釈した。その条件は、実施例１７と同じであり、ただし、オーブンプログラムおよびカラムが以下であった：
オーブンプログラム：８０〜１６０℃（２５℃／分）、その後、５℃／分で２２０℃まで、そして２２０℃で１０分間
カラム：ＷＣＯＴ ＦＵＳＥＤ ＳＩＬＩＣＡ ０．２５ｍｍ １００ｍ、ＣＰ−ＳＩＬ ５ＣＢ ｆｏｒ ＦＡＭＥ、ｄｆ＋０．２。
【０１４７】
その結果（表３１）は、１％以上の７つのピークの存在を示す。これらのピーク各々が、共役した位置で２つまたは３つの結合を有する酸を示す。これらのピークに対応する脂肪酸が天然で見出されるか否かは公知でなく、そしてその可能な効果は、公知ではない。
【０１４８】
【表２９】
（実施例１９）
（ＣＬＡ酸化産物）
本実施例は、解放空気に曝したＣＬＡの酸化を記載する。メチルエステルの小さいサンプルを調製し、そしてフタをしない試験管中にて室温で１１５日間貯蔵し、空気に自由に接近させた。そのサンプル中に最初に存在するＣＬＡは、完全に分解され、そしてフラン脂肪酸および他の未同定の誘導体へと変換された。酸化前後のＣＬＡサンプルの相対含量を、表３に示す。このクロマトグラムは、比較的非極性である成分のみを示す。同じサンプルのクロマトグラムもまた、極性カラム上で流した。その結果は、大量の短鎖の極性成分（すなわち、分解産物）の存在を示した。
【０１４９】
【表３０】
上記から明らかであるべきことは、本発明が、動物の餌の処方において、およびヒトによる消費のために適切な食品において、使用され得る高純度の共役リノール酸組成物を提供することである。
【０１５０】
上記明細書に言及されたすべての刊行物および特許が、本明細書中に参考として援用される。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変化形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求された本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが、理解されるべきである。実際、医学分野、生化学分野、または関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の改変が、上記の特許請求の範囲内にあることが意図される。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、該組成物は、不活性貯蔵条件下における少なくとも３０日間の貯蔵期間の間に総１００ｐｐｍを超えない、低分子量揮発性有機化合物の含有量を有する、組成物。
（項２） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離脂肪酸である、上記項１に記載の組成物。
（項３） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項１に記載の組成物。
（項４） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項１に記載の組成物。
（項５） 前記組成物が金属酸化体キレート剤をさらに含む、上記項１〜４に記載の組成物。
（項６） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項５に記載の組成物。
（項７） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項８） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項９） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項１０） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項１〜９に記載の組成物。
（項１１） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項１０に記載の組成物。
（項１２） 抗酸化剤をさらに含む、上記項１〜１１に記載の組成物。
（項１３） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項１２に記載の組成物。
（項１４） 上記項１〜１３に記載の組成物を含む、食品。
（項１５） 上記項１〜１３に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項１６） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該組成物は、総１００ｐｐｍ以下の低分子量揮発性有機化合物を含み、そして６０℃において約２０〜１００時間の油安定性指標を有する、組成物。
（項１７） 上記項１６に記載の組成物であって、ここで、前記油安定性指標がおおよそ、６０℃において約２０〜１００時間より大きい、組成物。
（項１８） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離の脂肪酸である、上記項１６に記載の組成物。
（項１９） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項１６に記載の組成物。
（項２０） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項１６に記載の組成物。
（項２１） 前記組成物がさらに金属酸化剤キレート剤を含む、上記項１６〜２０に記載の組成物。
（項２２） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項２１に記載の組成物。
（項２３） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２２に記載の組成物。
（項２４） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２２に記載の組成物。
（項２５） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２４に記載の組成物。
（項２６） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項１６〜２５に記載の組成物。
（項２７） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項２６に記載の組成物。
（項２８） 抗酸化剤をさらに含む、上記項１６〜２７に記載の組成物。
（項２９） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項２８に記載の組成物。
（項３０） 上記項１６〜２９に記載の組成物を含む、食品。
（項３１） 上記項１６〜２９に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項３２） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該組成物は、総１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含み、該組成物は、以下の工程：
ａ）異性化された共役リノール酸部分を含む組成物を提供する工程；
ｂ）吸着剤を提供する工程；
ｃ）該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含するプロセスを介して入手可能である、
組成物。
（項３３） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離脂肪酸である、上記項３２に記載の組成物。
（項３４） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項３２に記載の組成物。
（項３５） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項３２に記載の組成物。
（項３６） 前記組成物が金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項３２〜３５に記載の組成物。
（項３７） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項３６に記載の組成物。
（項３８） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項３９） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項４０） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項４１） 上記項３２〜４０に記載の組成物であって、ここで、該組成物は、約１〜１０ｐｐｍの金属イオンを含む異性化された共役リノール酸部分を含む、組成物。
（項４２） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項３２〜４１に記載の組成物。
（項４３） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項４２に記載の組成物。
（項４４） 抗酸化剤をさらに含む、上記項３２〜４３に記載の組成物。
（項４５） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項４４に記載の組成物。
（項４６） 上記項３２〜４５に記載の組成物を含む、食品。
（項４７） 上記項３２〜４５に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項４８） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該共役リノール酸部分は、該組成物の味および香りに影響を与えないように、十分に低い揮発性有機化合物の濃度を有する、組成物。
（項４９） 前記共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項４８に記載の組成物。
（項５０） 前記共役リノール酸部分が遊離の脂肪酸である、上記項４８に記載の組成物。
（項５１） 前記共役リノール酸部分がトリグリセリドである、上記項４８に記載の組成物。
（項５２） 安定化された共役リノール酸生成物を提供する方法であって、該方法は、以下：
ａ）共役リノール酸部分を含む組成物および吸着剤を提供する工程；ならびに
ｂ）生じる共役リノール酸化合物が、不活性貯蔵条件下において１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物の含有量を維持するような条件下で、該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含する、方法。
（項５３） 前記共役リノール酸部分が工程（ｂ）の前に脱臭される、上記項５２に記載の方法。
（項５４） 前記共役リノール酸部分を抗酸化剤を用いて処理する工程をさらに包含する、上記項５２に記載の方法。
（項５５） 安定化された共役リノール酸生成物を提供する方法であって、該方法は、以下：
ａ）共役リノール酸部分を含む組成物、吸着剤、および少なくとも１つの抗酸化組成物をを提供する工程；
ｂ）該共役リノール酸部分を含む組成物を脱臭する工程；
ｃ）該共役リノール酸部分を含む組成物を少なくとも１つの該抗酸化組成物を用いて処理する工程；ならびに
ｄ）生じる共役リノール酸化合物が、不活性貯蔵条件下において１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物の含有量を維持するような条件下で、該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含する、方法。
（項５６） 前記共役リノール酸部分が遊離脂肪酸として提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５７） 前記共役リノール酸部分がアルキルエステルとして提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５８） 前記共役リノール酸部分がトリグリセリドとして提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５９） 上記項５５に記載の方法であって、該吸着剤が、漂白土類、活性な活性炭ゼオライト、およびシリカからなる群より選択される、方法。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願番号０９／１３２，５９３（１９９８年８月１１日出願）および米国特許出願番号０９／２７０，９４０（１９９９年３月１７日出願）の一部継続出願であり、これらの出願は、米国特許出願番号０９／０４２，７６７（１９９８年３月１７日出願：現在米国特許第６，０１５，８３３号）および米国特許出願番号０９／０４２，５３８（１９９８年３月１７日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒトおよび動物の栄養の分野に関し、そして特に共役リノール酸（ＣＬＡ）の特定の新規組成物に関する。これらの組成物は、揮発性有機化合物へのＣＬＡの酸化を制御して、そしていくつかの場合、酸化を調節する抗酸化剤を含む、新規方法に従って調製される。本発明はまた、共役リノール酸の製造、特に、共役リノール酸を含む飼料および食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
１９７８年に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの研究者らは、調理された牛肉中に含まれる物質の同定を得た。これは、突然変異誘発を阻害するようである。この物質は、共役した二重結合を有するリノール酸（Ｃ１８：２）の位置的異性体の混合物であることが見出された。ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体は、非常に多量存在するが、どの異性体が観察された生物学的活性の原因であるかは不確定である。９，１１異性体が動物組織のリン脂質画分に好ましくはいくらか取り込まれかつ組み込まれ、そして１０，１２異性体はその程度が低いようであることが、標識された取り込み研究より記述されてきた（Ｈａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０））。
【０００４】
共役リノール酸（ＣＬＡと称する）に関する生物学的活性は、多様でありかつ複雑である。現在、作用の機構についてほとんど知られていないが、進行中のいくつかの前臨床研究および臨床研究は、作用の生理学的様式および生化学的様式に新たな光を与えるようである。ＣＬＡの抗発癌性特性は、十分実証されてきた。ＣＬＡの投与は、Ｂｉｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２０３５ｓ（１９９２）によって実証されるようにラット乳房腫瘍形成を阻害する。同様に報告されたＨａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０）は、マウス噴門洞新生物形成様式を生じた。ＣＬＡはまた、インビトロで標的ヒト黒色腫、結腸直腸癌細胞および乳癌細胞に対する強力な細胞傷害性剤として同定された。最近の主要な総説論文は、個々の研究より得られる結論を確認する（Ｉｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６（６補遺）：１５２３ｓ（１９９７））。
【０００５】
ＣＬＡ作用の機構は未だ不明であるが、免疫系のいくつかの成分が、少なくともインビボで関与され得るという証拠が存在する。米国特許第５，５８５，４００号（Ｃｏｏｋら、本明細書中に参照として援用される）は、ＣＬＡを含有する食餌を投与することによって、Ｉ型またはＴｇＥ高感受性によって媒介される、動物でのアレルギー性反応を減弱するための方法を開示する。約０．１〜１．０％の濃度でのＣＬＡはまた、白血球を保存するに効果的なアジュバントであることが示された。本明細書中に参照として援用される米国特許第５，６７４，９０１号（Ｃｏｏｋら、）は、細胞性免疫に関与するＣＤ−４およびＣＤ−８のリンパ球亜集団における上昇をもたらした、遊離酸または遊離塩のいずれかの形態でのＣＬＡの経口または非経口の投与を開示した。外因性腫瘍壊死因子での前処置により生じる不利な効果は、ＣＬＡが投与された動物中のＣＤ−４細胞およびＣＤ−８細胞のレベルの上昇または維持により間接的に緩和され得る。最終的には、米国特許第５，４３０，０６６号（参考として本明細書中に援用される）は、免疫刺激による体重減少および食欲不振を予防する際のＣＬＡの効果を記載する。
【０００６】
上記のＣＬＡの有力な治療的適用および薬理的適用とは別に、栄養補助食品として栄養的なＣＬＡの使用に関して、非常に興奮させられている。ＣＬＡは、身体構成に対して非常に一般化された効果を発揮することが見出されている。特に、脂肪組織塊と脂肪のない組織塊との区画を再指向する。参考として本明細書中に援用される、米国特許第５，５５４，６４６号（Ｃｏｏｋら）は、栄養補助食品としてＣＬＡを利用する方法を開示し、ここで、ブタ、マウスおよびヒトは、０．５％ ＣＬＡを含有する食品を給餌された。各種において、脂肪含量における顕著な減少が、タンパク質質量において付随する増加とともに観察された。これらの動物において、ＣＬＡの添加による食餌の脂肪酸含量の増加は、体重の増加をもたらさないが、身体内の脂肪および無脂肪（ｌｅａｎ）の再分布に関連した。目的の別の食餌現象は、食餌転換に対するＣＬＡ補填の効果である。米国特許第５，４２８，０７２号（Ｃｏｏｋら、本明細書中に参考として援用される）は、動物食餌（トリおよび哺乳動物）へのＣＬＡの組み込みがＣＬＡ補填動物におけるかなりの体重増加を導く食餌変換の効果を増加することを示すデータを提供した。食品動物飼育者にとってＣＬＡ補填の有利な効果は、明白である。
【０００７】
ＣＬＡに目的の別の重要な供給源、およびその初期の商業的潜在性を強調するものは、それがヒトおよび動物などによって消費される食品および食餌の中に天然に存在することである。特に、ＣＬＡは、反芻動物からの産物中に豊富である。例えば、いくつかの研究が実施されてきた。ここで、ＣＬＡは、種々の乳製品において調査された。Ａｎｅｊａら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，４３：２３１（１９９０）は、牛乳からヨーグルトへの処理がＣＬＡの濃縮を生じることを観察した。（Ｓｈａｎｔａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７：２５７（１９９３））は、処理する温度および乳清の添加における組合わせた増加が処理されたチーズの調製の間ＣＬＡ濃度を増加したことを示した。別の研究において、Ｓｈａｎｔａら、Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．６０：６９５（１９９５）は、処理および貯蔵の条件は明らかにはＣＬＡ濃度を減少しないがいずれの増加も観察されなかったことを報告した。実際、いくつかの研究は、季節的変動および動物間の変動は牛乳のＣＬＡ含量における３倍もの差異の原因であり得ることを示した。（例えば、Ｐａｒｏｄｉら、Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６０：１５５０（１９９７）を参照のこと。）また、Ｃｈｉｎら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃａｍｐ．Ａｎａｌ．，５：１８５（１９９２）に記されるように、食物因子は、ＣＬＡ含量の変動において関係している。天然の供給源におけるＣＬＡ含量の変動のために、規定された量の種々の食品の摂取は、ヒト（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）または動物が最適用量を受けて所望の栄養効果を達成することを確保することを保障しない。
【０００８】
リノール酸は、重要な生物脂質の成分であり、顕著な割合のトリグリセリドおよびリン脂質を含む。リノール酸は、「必須」脂肪酸として公知であり、自己合成され得ないので、動物は、外因性食餌供給源からそれを得なければならないことを意味する。リノール酸のＣＬＡ型の組み込みは、脂質位置へのＣＬＡの直接置換を生じ得、ここで、非共役リノール酸が移動した。しかし、このことは証明されておらず、そしてかなり有利だが説明できない観察された効果のいくつかが、非共役リノール酸がさもなければ移動しない部位での脂質構造内のＣＬＡの再位置付けから生じ得る。現在、動物ＣＬＡのある供給源（特に、乳製品において）がネイティブなリノール酸への特定のルーメン細菌の生化学的作用から生じ、まず、リノール酸をＣＬＡに異性化し、次いで、ルーメンキャビティー内にそれを分泌することが、明白である。Ｋｅｐｌｅｒら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，５６：１１９１（１９６６）は、ルーメン細菌であるＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓを単離した。この細菌は、リノール酸の生物水素化における中間体として９，１１−ＣＬＡの形成を触媒する。Ｃｈｉｎら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１２４：６９４（１９９４）はさらに、対応する無菌ラットがＣＬＡを産生しないので、げっ歯類の組織中に見出されたＣＬＡは細菌と関連することを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，４００号
【特許文献２】米国特許第５，４３０，０６６号
【特許文献３】米国特許第５，６７４，９０１号
【特許文献４】米国特許第５，５５４，６４６号
【特許文献５】米国特許第５，４２８，０７２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０）
【非特許文献２】Ｂｉｒｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２０３５ｓ（１９９２）
【非特許文献３】Ｉｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６（６補遺）：１５２３ｓ（１９９７）
【非特許文献４】Ａｎｅｊａら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，４３：２３１（１９９０）
【非特許文献５】Ｓｈａｎｔａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７：２５７（１９９３）
【非特許文献６】Ｐａｒｏｄｉら、Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６０：１５５０（１９９７）
【非特許文献７】Ｃｈｉｎら、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃａｍｐ．Ａｎａｌ．，５：１８５（１９９２）
【非特許文献８】Ｋｅｐｌｅｒら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，５６：１１９１（１９６６）
【非特許文献９】Ｃｈｉｎら、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１２４：６９４（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
治療的適用および栄養的適用の両方のための、ＣＬＡの規定された商業的供給源の開発において、大量の規定された材料を生成するためのプロセスが必要である。慣用的な手段によって作製されたほとんどのＣＬＡ産物の問題は、その異質性であり、そしてバッチ間で実質的なアイソフォームの変動である。獣脂の代わりに多量の硬化油およびショートニングを摂取することは、トランス脂肪酸量の高い食餌を生じるという事実に、多くの注意が払われてきた。例えば、Ｈｏｌｍａｎら、ＰＮＡＳ，８８：４８３０（１９９１）は、硬化油を給餌されたラットは異常なポリ不飽和脂肪酸異性体のラット肝における蓄積を生じることを示した。これは、天然に存在するポリ不飽和脂肪酸の正常な代謝を妨害するようである。これらの関係は、初期の論説（Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８４：７２２（１９７４））に要約された。従って、規定された組成物の生物学的に活性なＣＬＡ産物に対して強い要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、後述する手段により、上記課題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のアルカリ異性化プロセスのフロー図である。
【図２】図２は、抗酸化剤の存在下でのＣＬＡ組成物についてのＯＳＩ値のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトおよび動物の栄養の分野に関し、特に、共役リノール酸（ＣＬＡ）の特定の新規組成物に関する。これらの組成物は、新規方法に従って調製され、これは、ＣＬＡの揮発性有機化合物への酸化を調節して、そしていくつかの実施形態は、酸化を調節する抗酸化剤を含む。
【００１５】
本発明は、異性化された（すなわち、共役した）高純度のリノール酸部分を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、これらの組成物は、異性化され共役したリノール酸部分を含み、ある程度の低分子量の揮発性有機化合物を有するが、不活性な貯蔵条件下で少なくとも３０日間の貯蔵期間の間、合計１００ｐｐｍを超えない。他の好ましい実施形態において、本発明は、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供し、この組成物は、合計１００ｐｐｍ以下の低分子量揮発性有機化合物を含みかつ６０℃で約２０〜１００時間の油安定性指数を有する。特定の好ましい実施形態において、油安定性指数は、６０℃で約４０時間より大きい。よりさらなる実施形態において、本発明は、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供し、この組成物は、合計１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含み、この組成物は、以下の工程を包含するプロセスを通じて入手可能である：ａ）異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物を提供する工程；ｂ）吸収剤を提供する工程；およびｃ）上記共役リノール酸部分を上記吸収剤で処理する工程。いくつかの好ましい実施形態において、異性化され共役したリノール酸部分を含む組成物は、合計約１〜約１０ｐｐｍの金属イオン濃度を含み、これは、安定性を増加するために減少されなければならない。
【００１６】
上記の組成物のＣＬＡ部分は、特定のＣＬＡ部分のいずれか１つに限定されない。いくつかの異なる部分は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、ＣＬＡ部分は、遊離脂肪酸である。他の実施形態において、ＣＬＡ部分は、アルキルエステルである。なおさらなる実施形態において、ＣＬＡ部分は、トリアシルグリセリドである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態において、上記の組成物はさらに、金属酸化剤キレート剤を含む。本発明は、金属酸化剤キレート剤のいずれか１つに限定されない。種々の金属酸化剤キレート剤は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、金属酸化剤キレート剤は、クエン酸エステルを含む。他の実施形態において、金属酸化剤キレート剤はレシチンを含む。
【００１８】
上記の異性化されたリノール酸組成物の純度は、特定のレベルのいずれかに限定されない。いくつかのレベルの純度は、本発明によって意図される。いくつかの実施形態において、組成物は、合計１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。他の実施形態において、組成物は、合計５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。なお他の実施形態において、組成物は、合計１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。なおさらなる実施形態において、組成物は、合計５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記の組成物を含有する食品または食物添加物を提供する。
【００２０】
本発明はまた、共役リノール酸の製造、特に、共役リノール酸を含有する食餌および食品に関する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、共役リノール酸エステルを含む食品を産生するための方法を提供する：ａ）以下を提供する工程：ｉ）共役リノール酸エステル（ここで、このエステルは、アルコラート触媒でリノール酸エステルを処理することによって産生される）；および食材；ならびにｂ）この食材を共役リノール酸エステルと組み合わされる工程。
【００２１】
本発明は、特定の供給源由来のリノール酸エステルに限定されない。実際、種々のリノール酸の供給源は、紅花、ヒマワリおよびトウモロコシ油を含むがこれらに限定されないことが意図される。
【００２２】
本発明は、共役リノール酸の特定の誘導体に限定されない。実際、種々の共役リノール酸部分は、アルコラート触媒によって産生された共役リノール酸エステル由来の遊離脂肪酸、アルコラート触媒によって産生されるアルキルエステルおよびアルコラート触媒によって産生されたＣＬＡ部分を含むトリグリセリドを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２３】
本発明は、特定のアルコラート触媒の使用を介して産生されるＣＬＡ部分に限定されない。実際、種々のアルコラート触媒は、ナトリウムメチラートおよびカリウムメチラートを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態において、抗酸化剤は、食品に含まれる。本発明は、特定の抗酸化剤に限定されない。実際、種々の抗酸化剤は、α−トコフェノール、β−トコフェノール、レシチン、アスコルビルパルミテートおよびＢＨＴを含むが、これらに限定されないことが意図される。
【００２５】
本発明のなおさらなる実施形態において、共役リノール酸部分およびアルコールを含む食品が提供される。本発明は、特定のアルコールに限定されない。実際、種々のアルコールは、エチルアルコールを含むが、これらに限定されないことが意図される。本発明は、特定の濃度のアルコールに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、アルコールの濃度は、約１０ｐｐｍ未満である。
【００２６】
他の実施形態において、以下の工程を包含する、安定化され共役リノール酸産物を提供するための方法が提供される：ａ）共役リノール酸部分および吸収剤を含む組成物を提供する工程；ならびにｂ）得られた共役リノール酸化合物が不活性な貯蔵条件下で１０ｐｐｍ未満の量の低分子量揮発性有機化合物を維持するような条件下で、この共役リノール酸部分を吸収剤で処理する工程。いくつかの実施形態において、共役リノール酸部分は、工程（ｂ）の前に脱臭される。他の実施形態において、方法はさらに、上記共役リノール酸部分を抗酸化剤で処理する工程を包含する。
【００２７】
なお他の実施形態において、方法は、以下の工程を包含する安定化され共役したリノール酸産物を提供する：ａ）共役リノール酸部分、吸収剤および少なくとも１つの抗酸化剤組成物を含む組成物を提供する工程；ｂ）共役リノール酸部分を含む組成物を脱臭する工程；ｃ）共役リノール酸部分を含む組成物を少なくとも１つの抗酸化剤組成物で処理する工程；およびｄ）得られた共役リノール酸化合物が不活性な貯蔵条件下で１０ｐｐｍ未満の量の低分子量揮発性有機化合物を維持するような条件下で、共役リノール酸部分を吸収剤で処理する工程。いくつかの実施形態において、共役リノール酸化合物は、遊離脂肪酸として提供される。他の実施形態において、共役リノール酸部分は、アルキルエステルとして提供される。いくつかの実施形態において、共役リノール酸部分は、トリグリセリドとして提供される。なおさらなるの実施形態において、吸収剤は、漂白土類、活性炭ゼオライトおよびシリカからなる群より選択される。
【００２８】
（定義）
本明細書において用いる場合、「共役リノール酸」または「ＣＬＡ」とは、任意の、共役リノール酸、またはオクタデカジエン遊離脂肪酸をいう。この用語は、リノール酸の分子の任意の位置で２つの共役炭素間二重結合を有する、リノール酸の全ての位置的および幾何的な異性体（アイソマー）を包含し、そして示すことが意図される。ＣＬＡは、普通のリノール酸とは、普通のリノール酸は、炭素原子９および１２で二重結合を有するという点で異なる。ＣＬＡの例としては、以下：２，４−オクタデカジエン、４，６−オクタデカジエン、６，８−オクタデカジエン、７，９−オクタデカジエン、８，１０−オクタデカジエン、９，１１−オクタデカジエン、および１０，１２−オクタデカジエン、１１，１３−オクタデカジエン、の位置異性体のシス異性体およびトランス異性体（「Ｅ／Ｚ異性体」）が挙げられる。本明細書において用いる場合、「ＣＬＡ」は、単一の異性体、２つ以上の異性体の選択された混合物、および天然の供給源から得られた異性体の非選択的混合物、ならびに合成および半合成のＣＬＡを包含する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「異性体化された共役リノール酸」は、化学的方法（例えば、アルカリ水溶液異性体化、非アルカリ水溶液異性体化、またはアルカリアルコレート異性体化）によって合成されたＣＬＡをいう。
【００３０】
本明細書において用いる場合、用語「共役リノール酸部分」とは、共役リノール酸または誘導体を含む任意の化合物または複数の化合物をいう。例としては、脂肪酸、アルキルエステル、および共役リノール酸のトリグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書において用いる場合、ＣＬＡの「トリグリセリド」は、トリグリセリド骨格の上の任意の位置または３つ全ての位置（例えば、ＳＮ−１、ＳＮ−２、またはＳＮ−３の位置）においてＣＬＡを含むことが意図される。従って、ＣＬＡを含有するトリグリセリドは、ＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のうちいずれかを含み得る。
【００３２】
本明細書において用いる場合、ＣＬＡの「エステル」は、アルコールまたは任意の他の化学基（生理学的に受容可能な、天然に存在するアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール）が挙げられるがこれらに限定されない）に対してエステル結合を通じて結合したＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のいずれかおよび全てを含むことが意図される。従って、ＣＬＡのエステルまたはエステル化されたＣＬＡは、ＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のいずれかを含み得る。
【００３３】
ＣＬＡの「天然に存在しない異性体」としては、ｃ１１，ｔ１３；ｔ１１，ｃ１３；ｔ１１，ｔ１３；ｃ１１，ｃ１３；ｃ８，ｔ１０；ｔ８，ｃ１０；ｔ８，ｔ１０；ｃ８，ｃ１０；ならびにオクタデカジエンのトランス−トランス異性体が挙げられるがこれらに限定されない。そしてオクタデカジエンのｔ１０、ｃ１２、およびｃ９，ｔ１１の異性体を含まない。「天然に存在しない異性体」はまた、ＣＬＡがアルカリ異性体化によって合成されるとき、これらの異性体が一般に低量で生成されるので、ＣＬＡの「マイナー異性体」とも呼ばれ得る。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「低不純物」ＣＬＡとは、遊離脂肪酸、アルキルエステル、およびトリグリセリドを含んでいるが、１％未満の８，１０−オクタデカジエン、１１，１３−オクタデカジエン、およびトランス−トランスオクタデカジエンの総量、含む、ＣＬＡ組成物をいう。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「ｃ」は、シス配向における化学結合を包含し、そして「ｔ」は、トランス配向における化学結合をいう。ＣＬＡの位置異性体が「ｃ」も「ｔ」もなしに命名されるならば、その命名は、４つ全ての可能性のある異性体を含む。例えば、１０，１２−オクタデカジエンは，ｃ１０，ｔ１２；ｔ１０，ｃ１２；ｔ１０，ｔ１２；およびｃ１０，ｃ１２オクタデカジエンを包含するが、ｔ１０，ｃ１２−オクタデカジエンすなわちＣＬＡは、単一の異性体をのみをいう。
【００３６】
本明細書において用いる場合、用語「オイル（油脂）」とは、長鎖脂肪酸（例えば，ｃＬＡ）、トリグリセリド、または他の長鎖炭化水素基を含む、流動性の流体をいう。長鎖脂肪酸としては、ＣＬＡの種々の異性体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
本明細書において用いる場合、用語「生理学的に受容可能なキャリア」とは、油状の薬学的組成物（医薬品）とともに通常用いられる任意のキャリアまたは賦形剤をいう。このようなキャリアまたは賦形剤としては、オイル、デンプン、ショ糖（スクロース）、およびラクトースが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において用いる場合、用語「経口送達ビヒクル」とは、薬学的組成物を経口的に送達する任意の手段をいい、カプセル、丸剤、錠剤、およびシロップが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
本明細書において用いる場合、用語「食品（ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、ヒト、非反芻動物、または反芻動物による消費に適切な任意の食物または飼料（餌）をいう。「食品」とは、調製され包装された食物（例えば、マヨネーズ、サラダドレッシング、パン、またはチーズ）、または動物用飼料（例えば、押し出されたおよびペレット化された動物用飼料または粗混合飼料）であり得る。「調製された食品」とは、ヒトの消費について承認された任意の予め包装された食物を意味する。
【００４０】
本明細書において用いる場合、用語「フードスタッフ（食材、栄養素）」とは、ヒトまたは動物の消費に適した任意の物質をいう。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「揮発性有機化合物」とは、所定の温度で部分的に、または完全にガス状態で存在する、任意の炭素含有化合物をいう。揮発性有機化合物は、有機化合物（例えば、ＣＬＡ）の酸化から形成され得る。本発明において特に目的であるのは、炭素を１０以下含む、低分子量揮発性有機化合物である。これらの低分子量揮発性有機化合物の例としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２−ブテナール、エタノール、３−メチルブタナール、４−メチルペンタノン、ヘキサナール、ヘプタナール、２−ペンチルフラン、オクタナールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
本明細書において用いる場合、用語「金属酸化剤キレート剤（メタルオキシダントキレーター）」とは、金属をキレート化する任意の抗酸化剤をいう。例としては、レシチンおよびクエン酸エステルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
本明細書において用いる場合、用語「アルコレート触媒」とは、カリウムメチレートおよびカリウムエチレートが挙げられるがこれらに限定されない、任意の一価アルコールのアルカリ金属化合物をいう。
【００４４】
本明細書において言及する場合、用語「不活性貯蔵状態（ｉｎｅｒｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、貯蔵されている組成物が、本質的に、反応性ガス、貯蔵容器から溶出する化合物などのような任意の外因性の影響なしに維持されている貯蔵状態をいう。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明の組成物は、高度に制御された異性体化プロセスから、そして好ましくはヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油の出発物質を用いて生じる。この組成物は、工業的規模に対する適用については、これまで得られなかった。なぜなら、この従来のプロセスは、歴史的に、全く異なる目的のために（すなわち、ペイント工業における乾燥オイルとして）共役リノール酸を生成しているからである。また、最終製品の異性体含量の意味の認識がなかった。なぜなら、この脂肪酸を特徴付けるための分析方法は広く利用可能ではなかったからである。さらに、本発明は、貯蔵の間のＣＬＡの酸化を防止して揮発性有機化合物を形成するための方法を提供する。
【００４６】
（Ｉ．リノール酸を共役させるための方法）
さらに古い異性体化プロセス（そのいくつかは、さらに現代的な様式でなお使用中である）において、共役させた脂肪酸の生成をアルカリ水溶液（一般にはＮａＯＨ）中で、２００℃を超える高温で、そして通常大気圧を超える圧力で実行した。例えば、米国特許第２，３５０，５８３号（Ｂｒａｄｌｅｙ）は、処理済みの石鹸を利用するアルカリ水溶液プロセスを開示している。このプロセスでは、共役および重合の両方が、２００〜２５０℃で、数時間にわたる、かなり過酷な条件下で生じた。リンシードオイル（アマニ油）で開始する乾燥オイルの画分を、蒸留によって得た（非常に類似のプロセスについては、英国特許番号５５８，８８１号も参照のこと）。このプロセスのバリエーションにおいて、米国特許出願第４，３８１，２６４号は、低水含量反応ゾーン（０．５％水）が、ＳＯ２の存在下で化学量論塩基を含み、種々の多飽和脂肪酸の二重結合の共役を得るプロセスを教示している。アルカリ水溶液プロセスは、米国特許第４，１６４，５０５号において連続的フロープロセス適応された。ここでアルカリ金属水酸化物および水は、２００℃〜３７０℃で維持されているフローゾーンに連続的に充填される。これらの温度では、反応時間は、一般に短縮されなければならないが、この異性体化に対する制御は比較的小さい。温度範囲のさらに高い端で、当業者は二重トランス種へのほぼ完全な変換を予測する。
【００４７】
種々の非水性溶媒および触媒を用いるＣＬＡの生成の方法は、文献中に記載されている。Ｂｕｒｒ（米国特許第２，２４２，２３０号）は、種々の触媒と組み合わせた、メタノール、ブタノール、エタノールおよびグリコールのような溶媒の使用を開示している。これらの反応パラメーターは、表１にまとめられている。グリコールを除いて、この反応は、還流条件下または密閉したチューブのいずれかにおいて実行された。この反応条件によって、重要な反応パラメーターのうちの２つである、温度および圧力の不正確な制御が生じる。これらの反応パラメーターの不正確な制御によって、完全でない共役および所望されない異性体の形成が導かれる可能性が高い。
【００４８】
【表１】
同様に、Ｂａｌｔｅｓら（米国特許第３，１６２，６５８号）は、脂肪酸の共役のための触媒としての非水性溶媒および種々の金属塩素の使用を開示している。Ｂａｌｔｅｓらによって記載された方法の種々の反応パラメーターを表２にまとめる。Ｂａｌｔｅｓらはまた、種々の低沸点溶媒の使用を開示している。これらの反応のほとんどが、使用される溶媒の沸点を超える温度で行われた。この反応は圧力下で行われたことが明らかである。この圧力は、オクタデカジエン異性体の形成に影響する独立した因子である。従って、これらの反応に由来する生成物は所望されない異性体を含む。
【００４９】
【表２】
（ＩＩ．制御された異性体化反応）
本発明のＣＬＡは、８，１０異性体、１１，１３異性体、および種々のトランス−トランス異性体のような大量の異性体を欠く。これらの組成物は、図１におけるフローチャートに示される密接に制御された非水性のアルカリ異性体化プロセスによって、およびアルカリアルコレート触媒での異性体化によって、生成された。いくつかの実施形態において、ヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油を、過剰のアルカリと、不活性ガス雰囲気下で大気圧において、高沸点溶媒（すなわち、ポリエチレングリコール）中で、この溶媒の沸点未満の温度で、反応させる。他の実施形態では、ヒマワリ油、サフラワー油、またはコーン油を、アルカリアルコレート触媒および少量の適切な溶媒の存在下で、反応させる。
【００５０】
（Ａ．リノール酸の供給源）
共役について好ましい油は、ヒマワリ油、サフラワー油、およびコーン油である。ダイズ油と比べた場合、これらの油は、低濃度の、ホスファチドおよびステロールのような所望されない成分を有する。これらの所望されない成分は、共役設備および他の所望されないポリマーを汚染する、ガム（粘性物質）の形成に寄与し得る。これらの油の種々の特性を表３、４、および５にまとめる。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
（Ｂ．溶媒としてプロピレングリコールを用いた異性体化）
本発明のいくつかの実施形態において、共役リノール酸は、非水性アルカリ異性体化によって生成される。制御された異性体化プロセスの反応条件によって、共役プロセスの温度（および一定の環境圧力）の正確な制御が可能になる。好ましくは、アルカリは、水酸化カリウム、水酸化セシウム、炭酸セシウムのような無機アルカリ、または水酸化テトラエチルアンモニウムのような有機アルカリである。触媒は、好ましくは、油の脂肪酸含量に比較してモル過剰で提供される。溶媒は、プロピレングリコールである。好ましくは、この反応を１３０〜１６５℃の温度範囲内、最も好ましくは約１５０℃で行う。反応の時間は、変化し得るが、反応が長時間行われるとき、所望されない異性体の形成の確率が増大する。優れた収率には、比較的短い反応時間である２．０〜６．５時間で十分であることが証明されている。
【００５４】
所望の組成物を生成するためには、上記の反応条件は、共役されるべき油（オイル）、アルカリの供給源、および設備によって変化し得ることが当業者には理解される。特定の油の事前分析によって、この条件が所望の組成物を得るために変化されなければならないことが示され得る。従って、温度範囲、圧力、および他の反応パラメーターは、個々のプロセスの設計のための開始点を表し、そしてガイドとしてのみ意図される。例えば、所望の温度範囲が、用いられ得る唯一の範囲であるとは意図されない。本質的な局面は、正確な温度制御を提供することである。しかし、注意を払わなければならない。なぜなら、圧力の増大は、不完全な異性体化および所望されない異性体の形成をもたらし得るからである。結局、共役化反応の長さは変化され得る。一般に、反応時間の延長に伴って、漸増量の所望されない異性体が形成される。従って、至適反応時間によって反応をほぼ、または本質的に完了するまで進行することが可能になるが、所望されない異性体の形成は生じない。
【００５５】
共役反応後、得られたＣＬＡ含有組成物は、図１に従ってさらに精製され得る。共役反応混合物から脂肪酸を分離するため、この反応混合物を約９５℃に冷却し、過剰の水を５０℃で添加し、そして温度を約５０〜６０℃に低下したまま、この混合物を緩徐に攪拌する。水の添加の際に、脂肪酸の石鹸を形成し、そしてグリセロールを副産物として形成する。次に、モル過剰の濃ＨＣｌを、攪拌しながら添加する。次いで、水性および非水性の層を約８０〜９０℃で分離させる。次いで、水およびポリエチレングリコールを含有する底部層を流し出す。残ったポリエチレングリコールを、６０〜８０℃の減圧脱水によって除去する。
【００５６】
次いで、乾燥したＣＬＡ組成物を、好ましくは、コールドトラップを有する脱気ユニット中で、脱気し、残りのプロピレングリコールを除去し得る。次に、ＣＬＡを、１０−１〜１０−２ミリバールの減圧下で分子蒸留プラントにおいて、１９０℃で蒸留する。この精製システムの利点は、短時間（１分未満）であることである。ここでＣＬＡが、高温で保持される。従来のバッチ蒸留手順は、厳密に回避されるべきである。なぜなら、その手順は、数時間まで、約１８０〜２００℃の高温を含むからである。これらの高温で、所望されないトランス−トランス異性体の形成が生じる。供給物質の約９０％が、わずかに黄色の蒸留物として回収される。次いで、ＣＬＡを、約１２０℃〜１７０℃への、好ましくは約１５０℃への２時間の加熱によって脱臭し、匂いと風味を改善し得る。過剰の熱が、トランス−トランス異性体の形成を生じ得る。これらの手順は、約５ｐｐｍ未満、好ましくは約１ｐｐｍ未満の溶媒レベルでＣＬＡ組成物を生成する。このプロセスは、得られた組成物が本質的に毒性溶媒残留分を本質的に含まないように、有毒なわずかなレベルの溶媒を排除する。
【００５７】
上記のプロセスは、パイロット規模および商業的規模の両方に容易に適応可能である。例えば、４００ｋｇのヒマワリ油は、触媒として添加された２００ｋｇ ＫＯＨとともに４００ｋｇのプロピレングリコール中で、１５０℃で５時間、共役され得る。次いで、得られたＣＬＡは、上記のように精製され得る。さらに、商業的規模のバッチシステムは、所望のＣＬＡ組成物を生成するために容易に改変され得る。例えば、ステンレス鋼反応器（リアクター）は、好ましくはガラスで裏打ちされて、３．０未満のｐＨレベルに起因する腐食を防止するべきである。しかし、非水性溶媒を利用する共役プロセスは、水で行われたプロセスよりも一般に腐食が少ないことに注意すべきである。
【００５８】
次善の条件下かまたは先行技術の水性アルカリ方法に従ってかのいずれかでなされたものと対照的に、本発明のＣＬＡ組成物の重要な特性を強調するために、いくつかの比較実験を実行した。実施例１において、ＣＬＡを本発明の方法によって調製した。ＣＬＡを、実施例２において、従来の水性アルカリ方法によって生成した。実施例３において、実施例１の反応を、高い温度でのみ実質的に繰り返す。最後に、実施例４において、実施例２のものに実質的に同一である水性アルカリ反応を、低い温度で実行している。各実験の正確な条件および詳細が、実施例に示される。ＣＬＡ異性体含有量の分析のプロフィールが、表６〜１１に示される。
【００５９】
表６のデータを参照して、相対的な面積のパーセンテージが、４つの実験の各々について、個々の異性体に対応する各同定されたピークについて提供される。ＧＣプロットは、試験した各サンプルについて多数のピークを与えた。これらのピークの各々の下の面積は、総計の値を得るために積分された。ピークの同一性は、標準溶出プロフィールの公開されたアトラスからのその相対的な位置、および科学文献によって決定した。最上列は、共役していない出発材料（９，１２−リノール酸）についての残基の値を表す。プロピレングリコールにおける低温度の反応および高温度の反応の両方が、総出発材料の９９％を超える極めて高い転換を生じた。
【００６０】
カラム１を参照して、実施例１において、コントロール組成物のいずれとも異なり、異性体の１１，１３混合物に対応するピーク、詳細にはｃ１１，ｃ１３に対応するピーク、８，１０異性体のいずれかについてのピーク、および同定されていない異性体についてのピークがすべて完全に失われていることは、明らかである。ｃ９，ｔ１１異性体の異性体の場合、８，１０異性体および９，１１異性体の両方についてのＧＣにおけるピークが、重ね合わされ、そして、ＮＭＲ研究によって８，１０として同定されたピークのその部分を差し引きすることによって、実施例１の材料に関してのみここで分離される。これは、他の実験において実行されず、故に、列３は、実施例２〜４について、組み合わされた８，１０および９，１１についての値を与える。一般的に、８，１０異性体、１１，１３異性体および同定されていない異性体に関して、１％未満から検出不能までの値は、治療的および栄養学的な価値がある。なぜならこの値は、潜在的に有害な夾雑物（特に、脂質生成において疑わしい吸収経路を有することが公知であるもの）を微量レベルに低下するからである。例えば、非反芻動物において、０．２５〜２．５％のＣＬＡの食品への添加は、組織におけるＣＬＡの発生率を増加して、反芻動物における発生率に近づへ得、その結果、他の動物は、純度を落とす異性体が存在しない場合、ＣＬＡの供給源であり得る。
【００６１】
実施例２は、慣用的に製造されたＣＬＡを代表する、典型的な水性アルカリ生成物を提供する。変換は、全体的ならびにｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体を生成する場合の両方においてあまり効果的ではない。疑わしい１１，１３異性体の高い割合、および同定されていない材料の有意な割合にもまた、注意すること。
【００６２】
実施例３は、温度パラメーターの臨界を示す。プロピレングリコール媒体における温度の上方へのシフトは、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体を犠牲にして夾雑している異性体の量を急に増加する。トランス，トランス種において急激な増加がより高い温度において存在する（なぜなら、増加したエネルギーストレスのレベルにおいてより安定な電子配置を生じる二重結合転移が好まれるからである）こともまた興味深い。
【００６３】
実施例４は、水性アルカリ系における温度の低下が、実際に、夾雑している異性体のうちのいくつかのの量を減少することを示す。しかし、収量における劇的な低下が存在し、１１，１３群の異性体のレベルは非常に高いままである。このことは、この電子配置の形成が、この系における全体的な運動エネルギーによって説明されるよりも、水性媒体中の塩基の作用によって影響を受けることを示唆する。２２．５時間というの極度に長い反応時間（効率的な産業スケールのバッチプロセスにとって長すぎる）にもまた注意すること。
【００６４】
表６は、ピーク面積の関数として種々の反応における相対的な異性体の割合を、それらの対応するピーク比に変換する。本プロセスは、おおよそ等しい量の２つの所望のＣＬＡ異性体の各々への、９，１２−リノール酸の実質的に完全な変換を生じる。ましてより高い温度において、プロピレングリコールにおいてさえ、１１，１３異性体の発生は、低い温度の水性アルカリプロセスの発生の３分の１である。
【００６５】
（Ｃ．アルコラート触媒を用いた異性化）
いくつかの実施形態において、本発明はまた、ＣＬＡのアルキルエステルを生成するための方法を提供する。脂肪の分割および脱水後、遊離の脂肪酸を、メタノールまたは他の一価低分子量アルコールと合わせ、そしてアルコールが沸騰する温度まで加熱した。エステル化は、反応水を凝縮器を介して除去する、再還流条件下で進行する。さらなる量の同じかまたは異なる一価アルコールの添加後、アルコラート触媒を、このエステル混合物にブレンドする（例えば、米国特許第３，１６２，６５８号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。代表的なアルコラート触媒は、ナトリウムエトキシドもしくはカリウムエトキシド、またはこれらのメチル対応物、ブチル対応物もしくはプロピル対応物である。
【００６６】
エステル化において、メタノールまたはエタノールが好ましいが、他の分枝鎖一価アルコールまたは直鎖一価アルコールが、使用され得る。アルキル基の脂肪族鎖が長くなるにつれ、この材料はより脂質適合性になる。粘性もまた、増加する傾向がある。異なる型の食餌または食物（その粘稠度は変化する）に関して、種々の粘性の生成物が、ＣＬＡ部分から生じる治療特性または栄養学的特性に影響を与えることなく所望の流動特徴または混合特徴を得るために使用され得る。エステル化の理論および実際は、慣用的である。最も一般的な方法の基本的な説明は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．：１９９６（第５版）に示される。動物およびヒトの身体は、多様なエステラーゼを有し、故に、ＣＬＡ−エステルは、切断されて、遊離の脂肪酸を容易に放出する。組織取り込みは、関与する組織および要求される利点に依存して、異なる動態を有し得る。
【００６７】
異性化工程において、アルコラート触媒が、水性アルカリに媒介される異性化よりも、はるかに優れた生成物を生成したことが見出された。後者のプロセスは、温和な反応条件下であっても所望されない異性体を、常に生成する。温和な条件は、実施例に示されるように、より低い量の所望されない異性体を与えるが、収率を大きく犠牲にする。ほとんどの系において、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体の発生が優勢であり、そしてこれらは、おおよそ等モル量で形成される。一方の異性体の、他方を除外した異性化を制御することは、これまで可能ではなかった。一方または他方の異性体の割合を増加することは（達成される生理学的効果に依存して）望ましいが、現在のところこれは、所望の異性体が富化された供給源を添加することによって、大規模に実行されなければならない。
【００６８】
アルコラート触媒を用いた共役のための好ましい出発材料は、ヒマワリ油、サフラワー油、およびトウモロコシ油である。これらの油の各々は、高レベルのリノール酸および低レベルのリノレン酸を含む。実施例１８に示されるように、リノレン酸の共役は、いくつかの特徴付けられていない脂肪酸部分の形成を引き起こし、これらの生物学的な特性は、未知である。以前の共役プロセスは、未知化合物の生成と関連しなかった。なぜなら、これらの生成物は、乾性油、塗料およびワニスにおいて使用され、ヒトまたは動物による消費が予定された製品においては使用されなかったからである。従って、高レベルのリノレン酸を含む油を用いたこれらのプロセスによって生成されたＣＬＡは、栄養学的使用に適していなかった。
【００６９】
いくつかの実施形態において、グリセロールまたはグリセロールのエステルは、脂肪酸のモノエステルを作製する前に除去されるべきであることが、さらに意図される。共役の間に存在する微量のグリセロールは、トリメトキシプロパンおよびトリエトキシプロパンの生成に寄与する。従って、共役の前に、アルコール分解によって得られたモノエステルを蒸留することが好ましい。
【００７０】
（Ｄ．ＣＬＡのトリアシルグリセリド誘導体）
本発明は、ＣＬＡの誘導体の使用を意図する。例えば、ＣＬＡは、実施例５、６、および１４に記載されるように、遊離であり得るかもしくは上記のようにエステル結合を介して結合され得るか、またはＣＬＡトリグリセリドを含む油の形態で提供され得る。これらの実施形態において、このトリグリセリドは、グリセロール骨格に結合したＣＬＡから部分的または完全に構成され得る。ＣＬＡはまた、好ましくは、実施例８および９に記載されるように、メチルエステルまたはエチルエステルとして提供され得る。さらに、ＣＬＡは、非毒性塩の形態（例えば、カリウム塩またはナトリウム塩（例えば、化学的に等価な量の遊離酸をアルカリ水酸化物と約ｐＨ８〜９において反応させることによって形成される塩））であり得る。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、ヒマワリ油および／またはサフラワー油由来のリノール酸の非水性異性化に関して本明細書中の以後に開示される新規ＣＬＡ異性体混合物を含む、新規トリアシルグリセロールが合成される。ＣＬＡに関して高度に富化された（９０〜９６％）純粋なトリアシルグリセロールが、Ｈ ＮＭＲによって確認され得る。エステル化は、固定されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼを用いて進行させる。好ましくは、ＣＬＡは、少なくとも４０％、および４５〜４８％以上のｃ９，ｔ１１−オクタデカジエン酸およびｔ１０，ｃ１２−オクタデカジエン酸、ならびにこれらの混合物を含む。１％未満のエステル８，１０；１１，１３；およびトランス，トランス異性体が存在するか、またはこれらは、総計５％未満で存在する。いくつかの実施形態において、生じるトリアシルグリセロールは、全レベルのホスファチジル残基およびステロール残基を除去するためにさらに精製されない。しかし、ヒマワリ油およびサフラワー油の異性化からの残存するレベルは、食餌および食物における安全で可食の製品を含む商業的適用に対して十分である。他の実施形態において、トリアシルグリセロールは、分子蒸留によってさらに精製される。
【００７２】
固定されたＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼは、Ｈａｒｒａｌｄｓｏｎらにおいて、ｎ−３型の多価不飽和脂肪酸について記載されたものと類似の様式で使用される。エステル化反応は、５０°〜７５℃、好ましくは６５℃で、そして形成の際に同時生成される水またはアルコールを（エステルから）除去するために使用されるいかなる溶媒も減圧も存在させずに、実行される。これは、トリアシルグリセロール生成を完了にシフトさせ、そして本質的に定量的な収率での、いかなるモノアシルグリセロールおよびジアシルグリセロールも実質的に含まない高度に純粋な生成物を確実にする。化学量論量の遊離の脂肪酸（すなわち、グリセロールに基づく場合、３モル当量、またはグルセロール部分に存在するヒドロキシル基のモル当量の数に基づく場合、１モル当量）が使用され得る。基質の総重量に基づく場合、１０％投与量のリパーゼのみしか、必要でなく、これは多数回使用され得る。これは、生産性の観点から非常に重要である。これらの全ては、溶媒が必要とされないという事実とともに、このプロセスを、スケールアップおよび工業化の観点から非常に実現可能性のあるものにする。なぜなら、容積およびかさ高さの削減が、莫大であるからである。また、わずかに過剰な（＜５／５）遊離の脂肪酸は、終了へと反応を加速するため、および反応の完結を確実にするために、使用され得る。
【００７３】
反応の開始において、１−モノ−アシルグリセリドまたは３−モノ−アシルグリセリドが最初に形成され、続いて１，３ジアシルグリセリドが形成され、そして最終的に、より長い反応時間においてトリグリセリドが形成される。モノアシルグリセリドおよびジアシルグリセリドは、これらが生物学的活性を表すが、水性細胞環境においてより大きな可溶性を有し、かつ代替的な分子合成経路（例えば、リン脂質または他の機能的脂質の合成）に関与し得るという点で、有用な中間体である。対照的に、トリグリセリドは、しばしば細胞膜または貯蔵小胞中にインタクトで沈積される。従って、遊離の脂肪酸またはエステルよりもモノグリセロール、ジグリセロールまたはトリグリセロール形態のＣＬＡの投与は、ＣＬＡ成分の取り込みの様式および分布、代謝速度ならびに構造的役割または生理学的役割に影響を与え得る。
【００７４】
（ＩＩＩ．ＣＬＡ化合物の安定化）
本発明者らは、不活性でない容器または不活性でない条件下でのＣＬＡ組成物の貯蔵が、長期の安定性に有害であり得ることを最初に理解した。これは詳細には、金属イオン（例えば、鉄イオンおよび銅イオン）が、容器から溶解され得、そしてこの組成物の望ましくない酸化および揮発性有機化合物（特に、低分子量揮発性有機化合物）の形成を引き起こし得るという事実に起因する。これらの所望されない化合物は、ＣＬＡ製品の味および香りの両方に影響を与える。本発明者らはまた、これらの化合物の形成を回避するためにＣＬＡの加工の各工程において金属イオンを制限する（例えば、分子蒸留および他の蒸留工程の組合わせを介した金属の除去、貯蔵に適した製品を生成するためのこの蒸留した生成物に対する吸着剤の使用、および貯蔵製品における抗酸化剤およびキレート剤の使用による）ことが好ましいことを発見した。
【００７５】
従って、本発明は、ＣＬＡ（ＣＬＡ、ＣＬＡのエステル、およびＣＬＡのトリグリセリドを含むがこれらに限定されない化合物を含む）の、これらの化合物の酸化を回避することによる安定化を意図する。好ましい実施形態において、これらの組成物は、少なくとも３０日間安定であり、そして好ましくは最大２年間安定である。安定性は、貯蔵されるＣＬＡ製品における低分子量揮発性有機化合物のレベルによって、慣用的に記載され得る。従って、約３０日〜約２年間貯蔵されるこれらのＣＬＡ製品は、約１００ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物、好ましくは約１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物、および最も好ましくは約５ｐｐｍまたは１ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物を含む。
【００７６】
本発明は、いかなる１つの機構にも限定されない。実際、本発明の機構の理解は、本発明の組成物を生成するためにも本発明の方法を実行するためにも、必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、共役されていない脂肪酸と異なり、ＣＬＡは、過酸化物分解生成物を形成しないようである。これは、比色定量的チオシアン酸鉄方法（ｃｈｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｆｅｒｒｉｃ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって過酸化物値（ＰＶ）を分光光度的に測定することによって、実験的に実証された。開放したガラスにおける貯蔵後、ＣＬＡのＰＶは３２であった；比較において、リノール酸の値は３７０であった。
【００７７】
ＣＬＡは、分解の間に、ヘキサンを含む揮発性有機化合物を形成する。スチールドラム中に数週間貯蔵された製品は、最大２５ｐｐｍのヘキサンを含むことが見出された。ヘキサンは、食物製品において所望されない特徴的な味および香りを有する。ＣＬＡの酸化は、金属夾雑物の存在によって引き起こされるようである。従って、精製の間に酸化を促進するこのような化合物の除去のためのシステムが、有利である。
【００７８】
さらに、化合物をＣＬＡ調製物に添加して保存中の酸化を減少することもまた有利である。酸化を防止する化合物（酸化防止剤）は、２つの一般的な作用機構を有する。第１は、脂質過酸化物のラジカルの除去による酸化の防止である。例としては、トコフェロールおよびアスコルビルパルミテートが挙げられるが、これらに限定されない。酸化を防止するための第２の機構は、金属イオンのキレート化による。金属酸化剤キレート剤の例としては、クエン酸エステルおよびレシチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの市販の化合物（例えば、Ｃｏｎｔｒｏｘ、Ｇｒｕｍａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ、ＤＥ）は、過酸化物除去剤および金属キレート剤の両方（例えば、レシチン、トコフェロール、アスコルビルパルミテートおよびクエン酸エステル）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、金属酸化剤キレート剤が、ＣＬＡ含有化合物に添加され、酸化を防止する。他の実施形態において、金属酸化剤キレート剤および過酸化物除去剤の組み合わせが、ＣＬＡ組成物に含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ガスクロマトグラフィー／質量分析法が、ＣＬＡの揮発性の有機分解生成物の存在の検出において使用される。他の実施形態において、油安定性指数（ＯＳＩ）測定が、ＣＬＡの揮発性の有機分解生成物の存在を検出するために使用される。好ましい実施形態において、本発明の安定化された組成物は、６０℃で少なくとも約２０〜１００時間のＯＳＩを有する。特に好ましい実施形態において、６０℃で約４０時間のＯＳＩを有する。これらの値は、金属イオンの除去ならびに抗酸化剤およびキレート剤の添加に起因して、ＯＳＩ測定ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（公定方法） Ｃｄ １２ｂ−９２の推奨範囲を超えることに留意する。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＬＡサンプルからの酸化促進剤（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｎｔ）（例えば、鉄）の除去のための方法が、提供される。方法としては、蒸留または吸着によるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、異性化されたＣＬＡの金属イオン濃度は、約１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍである。好ましくは、金属イオン濃度は、約１ｐｐｍ未満であり、そして最も好ましくは、蒸留および／または吸着後に、約０．５ｐｐｍ未満である。本発明のいくつかの実施形態において、以下に記載のように、化合物が、ＣＬＡの酸化を防止するために添加される。
【００８１】
実施例１２は、ガスクロマトグラフィー、その後の質量分析法による、揮発性有機化合物の測定を示す。ＣＬＡは、実施例１１の方法によって調製される。ＧＣ／ＭＳを行い、そしてピークを、参照物質（例えば、Ｗｉｌｅｙ参照検索）を使用して同定される。表２８は、同定された化合物およびそれらの相対量を列挙する。同定された揮発性の有機化合物としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２−ブテナール、エタノール、３−メチルブタナール、４−メチルペンタノン、ヘキサナール、ヘプタナール、２−ペンチルフラン、およびオクタナールが挙げられる。実施例１２は、ＣＬＡのサンプルが、所望でない揮発性の有機化合物を含むことを示す。サンプルが、出発物質および正確な反応条件に依存して、さらなる揮発性の有機化合物を含み得ることが、当業者に理解される。
【００８２】
１つの例示的な実施例において、揮発性の有機酸の生成が経時的に増加することが示される。実施例１３は、６０℃で２１日間の外気中での保存の前後のＣＬＡ溶液中のペンタンおよびヘキサンの相対量を示す。結果を表２８に示す。ペンタンおよびヘキサンの両方の量が、２１日後に約２倍に増加した。この実施例は、ＣＬＡの酸化生成物として存在する揮発性の有機化合物のレベルが、経時的に増加することを示す。
【００８３】
好ましい実施形態において、保存中の酸化を防止するために、精製中に予防措置を講じる。これらの予防措置としては、酸化促進剤として作用する化合物（鉄または他の金属を含むが、これらに限定されない）の除去が挙げられる。いくつかの実施形態において、金属は、吸着剤（漂白土類（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｅａｒｔｈ）、活性炭ゼオライト、およびシリカが挙げられるが、これらに限定されない）での処理によって除去される。他の実施形態において、酸化促進剤は、蒸留によって除去される。
【００８４】
実施例１６は、金属を吸着するための１つの方法の例示的な実施例を提供する。この実施例において、シリカを、吸着剤として使用する。実施例１４の方法によって調製されたトリアシルグリセリドを、最初に、上昇した温度および圧力にて脱臭した。次いで、このサンプルをシリカと混合し、減圧下で加熱した。本発明は、実施例１６に記載の吸着条件に限定されることを意図されず；当業者に公知の他の吸着方法が意図される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、酸化促進剤は、蒸留プロセスにおいて除去される。例示的な実施例を、実施例１４に与える。この実施例において、ＣＬＡのトリアシルグリセリドの蒸留を、分子蒸留装置で行う。蒸留を、１５０℃および１０−２ｍｂａｒの圧力にて行う。本発明は、この蒸留について記載した条件に限定されることを意図されない。他の温度および圧力は、本発明の範囲内にある。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣＬＡの酸化は、最終生成物への金属酸化剤キレート剤または過酸化物除去剤の添加によって防止される。好ましい金属イオンキレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ペニシラミン、デフェロキサミン、および他の安全であると一般に認識されている（ＧＲＡＳ）キレート剤、ならびにそれらの生理学的に受容可能な塩が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態おいて、酸化の量は、油安定性指数（ＯＳＩ）によって測定される。ＯＳＩ（例えば、ＡＯＣＳ公定方法Ｃｄ １２ｂ−９２を参照のこと）は、酸化に対する油の耐性の尺度である。これは、酸化速度の最大変化の時間として数学的に規定される。この速度は、数学的に決定され得る。実験的に、ＯＳＩは、揮発性の有機酸（酸化生成物）が溶解される脱イオン水の伝導性における変化を測定することによって計算される。ＯＳＩ測定を行う場合、酸化プロセスを促進し得る微量の金属の混入を回避することが重要である。これは、一般に、クロメートまたは界面活性剤を欠く洗浄溶液と共に用いる、全てのガラス製品の注意深い洗浄によって達成され得る。水は脱イオン化されなければならず、そして全ての溶媒は高度に精製された品質のものでなければならない。
【００８８】
抗酸化剤の存在下または非存在下でのＣＬＡのＯＳＩ測定を例示する実施例を、実施例１５に与える。実施例１５において、ＣＬＡのトリアシルグリセリドを、実施例１４の方法によって調製する。サンプルを、種々の量（０〜０．１％）の４つの抗酸化剤（Ｃｏｎｔｒｏｘ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、Ｈｅｒｂａｌｏｘ（ローズマリーの抽出物；Ｋａｌｓｅｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）、Ｃｏｖｉ−ＯＸ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ）、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、およびα−トコフェロール）を含む開口皿に配置する。ＯＳＩを、上記のように計算する。結果を、表２９および図２に示す。α−トコフェロールの添加は、ＯＳＩ値を有意に増加しなかった。Ｈｅｒｂａｌｏｘは、この値を約２〜３倍増加した。Ｃｏｖｉ−ＯＸおよびＣｏｎｔｒｏｘは、ＯＳＩ値をより高い量（それぞれ、約４倍および６倍）に増加した。この実験は、抗酸化剤の添加が、保存中のＣＬＡ含有化合物の酸化を遅らせ得ることを実証した。
【００８９】
（ＩＶ．ＣＬＡ含有化合物の投与）
本発明の共役リノール酸部分は、種々の形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、投与は、経口である。ＣＬＡ部分は、適切なキャリア（例えば、デンプン、スクロースまたはラクトース）と共に、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、溶液、液体、スラリー、懸濁液およびエマルジョンに処方され得る。好ましくは、ＣＬＡ処方物は、抗酸化剤（Ｃｏｎｔｒｏｘ、Ｃｏｖｉ−ＯＸ、レシチン、およびビタミンＣ（アスコルビルパルミテート）の油溶性形態が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。ＣＬＡは、水溶液、油性溶液、または上記の他の形態のいずれかで提供され得る。本発明の錠剤またはカプセル剤は、腸溶性コーティングでコートされ得、このコーティングは、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する。小腸で溶解するが胃で溶解しない適切な腸溶性コーティングは、酢酸フタル酸セルロースである。いくつかの実施形態において、ＣＬＡは、７５０ｍｇの８０％ＣＬＡを含む軟性ゼラチンカプセル剤（ＴｏｎａｌｉｎＴＭ）として提供される。ＣＬＡはまた、多くの他の経路のいずれかによって提供され得る。これらの経路としては、静脈内、筋内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所的、舌下または直腸手段が挙げられるが、これらに限定されない。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出され得る。
【００９０】
有効量のＣＬＡ部分が、種々の食品（動物飼料、および飲料を含む）における補助剤として提供され得る。この適用の目的のために、ＣＬＡを含む食品は、外来性のＣＬＡが添加された、任意の天然の食品、加工食品、ダイエット食品または非ダイエット食品を意金属酸化剤キレート剤する。ＣＬＡは、遊離脂肪酸、共役リノール酸のエステルの形態で、または油含有のＣＬＡの部分トリグリセリドまたは全トリグリセリドとして添加され得る。従って、ＣＬＡは、種々の調製された食品（ダイエット飲料、ダイエットバー、補助剤、加工凍結食、キャンディー、スナック製品（例えば、チップス）、加工肉製品、牛乳、チーズ、ヨーグルトおよび任意の他の脂肪または油含有食品が挙げられるが、これらに限定されない）に直接含まれ得る。アルキルエステルまたはアルカリアルコラート触媒によって生成された共役リノール酸成分を処方された食品は、使用する溶媒および触媒に依存して、アルコール（例えば、メチルアルコールまたはエチルアルコール）を含む。一般に、これらのアルコールは、約１〜１０ｐｐｍで存在する。
【００９１】
さらに、上記および実施例に示されるように、ＣＬＡ組成物は、ＣＬＡを含有する食品の味および香りに悪影響をもたらさないレベルの揮発性有機化合物を含み得る。１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物、そして好ましくは、５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を有するＣＬＡ組成物を含む本発明の食品が、より高いレベルの揮発性有機化合物を含む食品に比べて味および香りが優れており、そして味および香りの盲検において好まれることが意図される。従って、本発明のいくつかの実施形態は、共役リノール酸部分を含む食品を提供し、ここで、この共役リノール酸部分は、その食品の味および香りが影響されないように十分に低い揮発性有機酸化合物濃度を有する。
【実施例】
【００９２】
（実験）
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を実証およびさらに例示するために提供され、そして本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
【００９３】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｋｇ（キログラム）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；Ｌまたはｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ＫＯＨ（水酸化カリウム）；ＨＣＬ（塩酸）；Ｈｇ（水銀）。
【００９４】
（実施例１）
（低温でプロピレングリコールを使用するサフラワー油の異性化）
サフラワー油を、触媒としてＫＯＨを使用して、低温にてプロピレングリコール中で異性化した。この異性化装置は、温度計を備えた２首フラスコからなり、温度計は、一方の首に配置され、過剰の圧力を放出するために小さい開口を残す。窒素供給源を、このフラスコのもう一方の首に取り付けた。フラスコに添加した溶液を、磁気棒および磁気スターラーの使用によって攪拌した。フラスコの温度を、磁気スターラー上に配置したサーモスタット制御油浴中にフラスコを配置することによって制御した。
【００９５】
フラスコを、６０．２７ｇのプロピレングリコールおよび２８．２０ｇのＫＯＨで満たし、そして油浴中に漬けた。温度を１３０℃に上昇させ、ＫＯＨを溶解させた。ＫＯＨが溶解した後、６０．０９ｇのサフラワー油をフラスコに導入した。多量の窒素を、２首フラスコを通して５分間循環させ、次いで、より少量に減少させた。この混合物を１５０℃に加熱した（約４０分を要した）。次いで、この混合物を、３．５時間１５０℃で反応させた。間隔を開けながら、３ｍｌのサンプルを分析用に採取した。
【００９６】
これらのサンプルを、６ｍｌの熱水中に直接配置し、そしてクエン酸を、遊離脂肪酸が上層として分離されるまで過剰に添加した。加熱は、クエン酸を添加する間の凝固を防止するために必要であった。ガスクロマトグラフィーによる分析のために遊離脂肪酸をメチルエステルに変換するために、０．０２５ｇの遊離脂肪酸、５ｍｌの４％ ＨＣｌ溶液およびエタノールを試験管に添加した。窒素を試験管に添加し、次いで、試験管を密閉し、そして２０分間６０℃の水浴中に置いた。次いで、試験管を冷却し、１ｍｌの精製水および５ｍｌのイソオクタンを添加した。窒素を試験管に添加し、そして試験管を３０秒間振盪した。得られた上層を、新しい試験管中の１μｌの精製水に添加し、そして再度窒素下で振盪した。次いで、得られた上層をイソオクタンで洗浄し、第３の試験管にデカントした。少量の硫酸ナトリウムを、水分吸収のために添加した。次いで、１μｌのサンプルを、ガスクロマトグラフに直接注入した。
【００９７】
ガスクロマトグラフィー条件は、以下のとおりである：
システム：Ｐｅｒｋｉｎｓ−Ｅｌｍｅｒ自動システム
注入器：２４０℃でのスプリットなし（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）
検出器：２８０℃での水素炎イオン化検出器
キャリア：ヘリウム
カラム：ＷＣＯＴ融合シリカ０．２５ｍｍ×１００Ｍ、ＣＰ−ＳＬ ８８ ＦＡＭＥ用、ＤＦ０．２
オーブンプログラム：８０℃（０分）から、１０℃／分で２２０℃まで上昇し、２２０℃で１０分間維持
全ての結果を、相対的なピーク面積％として表す。標準は一般的に利用可能でなく、そのため、溶出したピークを他のシステムで確かめた。ＧＣ−ＭＳは、シス結合およびトランス結合の数を決定するが、これらの位置を決定しない。従って、ＮＭＲ分析を使用して、結合の位置を確認した。大きいピークは、ｃ９，ｔ１１およびｔ１０，ｃ１２であった。ＣＬＡ異性体のＮＭＲ分析については、Ｍａｒｃｅｌ Ｓ．Ｆ．Ｌｉｅ Ｋｅｎ ＪｉｅおよびＪ．Ｍｕｓｔａｆａ，Ｌｉｐｉｄｓ，３２（１０）１０１９−３４（１９９７）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９８】
このデータ（表６に示されそして表１０に要約される）は、プロピレングリコール（溶媒として）、ＫＯＨ（触媒として）および低い温度を使用するサフラワー油の異性化が、８，１０異性体および１１，１３異性体を欠く共役リノール酸の生成を生じることを実証する。この実験において使用した高度に極性のカラムは、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体から８，１０異性体および１１，１３異性体を分離するために首尾よく使用され得る。８，１０異性体は、ｃ９，ｔ１１異性体と同時に溶出されるかまたはｃ９，ｔ１１異性体の直後に溶出される傾向がある。１１，１３異性体は、カラム条件に依存して、ｔ１０，ｃ１１異性体の前に溶出するか、またはｔ１０，ｃ１２異性体と共に溶出する。
【００９９】
この方法に従って生成された共役リノール酸を、生成される種々の異性体を比較することによって特徴付けた。第１に、この異性化反応は、実質的に完了するまで進行した。この反応の完全性は、リノール酸異性体−残留するｃ９，ｔ１２リノール酸についての総ピーク面積を、総ピーク面積によって除算することによって得られる。この値は、０．９９４である。第２に、総ピーク面積に対するｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．９５３である。第３に、ｃ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体に対するｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．０１０である。第４に、総ピーク面積に対するｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の比が決定され得る。この値は、０．００９である。第５に、ｃ９，ｔ１１異性体に対するｔ１０，ｃ１２異性体の比が決定され得る。この値は、１．０１８である。これらの比を、表１１に要約する。
【０１００】
（実施例２）
（高温および高圧での水性異性化）
５０ｇの水および２５．３２ｇのＮａＯＨを、高圧リアクタ（Ｐａｒｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ ＭＬ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｌｏｙ ４００（圧力ゲージおよびスターラーを備える））に添加した。ＮａＯＨを溶解させ、そして９４．０ｇのサフラワー油をリアクタに添加した。リアクタを閉じ、そして２分間窒素をフラッシュし、次いで、全ての弁を閉じた。リアクタを電気ガスケット中で２１０℃に加熱し、この温度で６時間維持した。次いで、温度を６０℃に減少し、その後圧力を放出し、そしてリアクタを開けた。２ｇの生じた凝固セッケンをリアクタから採取し、そして約４０℃の水に溶解した。次いで、クエン酸を添加して溶液中のｐＨを６未満に低下させた。サンプルを、脂肪酸の上層から採取し、そして実施例１のようにガスクロマトグラフィー用に調製した。
【０１０１】
ガスクロマトグラフィーの結果を表７に表し、そして表１０に要約する。これらのデータは、この異性化方法が、比較的多い量の８，１０異性体および１１，１３異性体の形成を生じることを示す。比を表１１に示す。
【０１０２】
（実施例３）
（高温高圧でのサフラワー油の非水性アルカリ異性化）
１００．４８ｇのプロピレングリコールおよび４６．７５ｇのＫＯＨを、実施例２に記載されるような高圧反応器に添加した。次いで、この反応器を、ＫＯＨを溶解するために１３０℃まで加熱した。次いで、１００．１２ｇのサフラワー油を、ＫＯＨ−プロピレングリコール混合物に添加した。この反応器を閉じ、窒素で１分間フラッシュし、そして全てのバルブを閉じた。次いで、この反応器を２１０℃まで加熱し、そしてこの温度で１時間維持した。この反応器を冷却し、そして内容物を１２０ｇの熱水にデカントした。攪拌しながら、３５．３ｇの３７％ＨＣｌおよび２７．５９ｇのクエン酸を、この脂肪酸に連続して添加した。最上層からサンプルを採取し、そして減圧フラスコ中６０℃で乾燥させた。得られた脂肪酸のサンプルを、実施例１に記載のようにガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１０３】
この結果を表８に表し、そして表１０に要約する。この実験は、高温でＫＯＨおよび非水性溶媒を用いるサフラワー油の異性化が、有意な量の８，１０異性体および１１，１３異性体、ならびにｔ９，ｔ１１異性体およびｔ１０，ｔ１２異性体の形成を生じることを実証する。比を表１１に示す。
【０１０４】
（実施例４）
（低温での水性アルカリ反応）
４９．９４ｇの水および３９．９６ｇのＮａＯＨを、実施例３に記載される高圧反応器に添加した。この混合物を、ＮａＯＨが溶解するまで加熱した。次に、１００．５４ｇのサフラワー油をこの高圧反応器に添加し、この反応器を窒素でフラッシュし、そして全てのバルブを閉じた。この高圧反応器を、１７９℃まで２２．５時間加熱した。実施例３のように、ガスクロマトグラフィーのためのサンプルを調製した。このデータを表９に示し、そして表１０に要約する。この実験は、水性アルカリ異性化について低温が用いられる場合、共役反応は完了しないことを実証する。さらに、有意な量の８，１０異性体および１１，１３異性体が生成される。比を表１１に示す。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
【表１１】
（実施例５）
（直接エステル化によるＣＬＡのトリアシルグリセロールの調製）
概要。溶媒としての重水素化クロロホルム中で、Ｈ核磁気共鳴スペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０ ＮＭＲ分光器で記録した。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＰｒｅｐＰａｋ（登録商標）５００／Ｓｉｌｉｃａ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅカラムを使用し、石油エーテル中の１０％ジエチルエーテルで溶出する、ＷａｔｅｒｓからのＰｒｅｐＬＣＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ ５００Ａ機器によってＨＰＣＬ分離を行った。分析ＧＬＣを、Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎら，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ Ｓｃａｎｎｅｄ ４５：７２３（１９９１）に記載されるような、以前に記載された手順に従って、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ８１４０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈで行った。
【０１１１】
固定したＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼを、ＤｅｎｍａｒｋのＮｏｖｏ ＮｏｒｄｉｓｋからＮｏｖｏｚｙｍｅＴＭとして得た。これを、エステル化実験において提供する場合、直接使用した。Ｍｅｒｃｋから購入した分析等級のジエチルエーテルは、いずれの精製もなく使用したが、Ｍｅｒｃｋからの合成等級のｎ−ヘキサンは、抽出およびＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて使用する前に、新たに蒸留した。グリセロール（９９％）を、ＳｉｇｍａおよびＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、そしてさらなる精製なしで使用した。ＣＬＡ濃縮物を、ＮｏｒｗａｙのＮａｔｕｒａｌ Ｌｉｐｉｄｓから、遊離脂肪酸としてＴｏｎａｌｉｎＴＭとして得た。この純度を、分析用ＧＬＣおよび高磁場ＮＭＲ分光法によって確認し、これによってある程度のグリセリド不純物が明らかになった。Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでのＧＬＣによって、ＣＬＡ濃縮物は、４３．３％の９−ｃｉｓ，１１−ｔｒａｎｓ−リノール酸、４４．５％の１０−ｔｒａｎｓ，ｌ２−ｃｉｓ−リノール酸、５．４％の他のＣＬＡ異性体、５．６％のオレイン酸、および各々０．６％のパルミチン酸およびステアリン酸を含むことがわかった。
【０１１２】
（実施例６）
（直接エステル化によるＣＬＡのトリアシルグリセロールの調製）
固定したＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ（１．２５ｇ）を、グリセロール（１．２２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）および遊離脂肪酸としてのＣＬＡ（Ｍ．ｗｔ．２８０．３ｇ／ｍｏｌ；１１．６ｇ，４１．５ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。この混合物をマグネチックスターラーホットプレート上、６５℃、０．０１〜０．５Ｔｏｒｒの持続減圧下で、緩やかに攪拌した。この反応の進行の間に精製した揮発性の水を、液体窒素冷却トラップ中に持続的に濃縮した。４８時間後、この反応を中断し、ｎ−ヘキサンを添加し、そして酵素を濾過によって濾別した。この有機相を、炭酸ナトリウムのアルカリ性水溶液で処理して、過剰の遊離脂肪酸を除去した（必要な場合）。この有機溶媒（適切な場合、無水硫酸マグネシウムで乾燥後）を、ロータリーエバポレーターで減圧下で除去し、続いて、高減圧処理によって実質的に純粋な生成物を、わずかに黄色がかった油状物として得た（１０．９ｇ；平均Ｍ．ｗｔ．８７８．６ｇ／ｍｏｌ；収率９３％）。化学量論量の遊離脂肪酸が使用される場合、標準化水酸化ナトリウムによる滴定を適用して、粗反応生成物の遊離脂肪酸含有量を決定した（エステル基のモル数に基づく場合の１％未満の遊離脂肪酸含有量は、少なくとも９９％の取り込みに対応し、これは、最低９７％のトリグリセリド含有量と等価である）。この粗生成物を、ＨＰＬＣに直接導入し、ｎ−ヘキサン中の１０％ジエチルエーテルで溶出して、１００％純度のトリグリセリドを無色の油状物として得た。２５０ＭＨｚ １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）８（ｐｐｍ）６．３５−６．２３（３Ｈ，ｄｄｔ，Ｊｔｒａｎｓ＝１５．０Ｈｚ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｊアリール＝１．３，＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ），５．９８−５．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｉｃｉｓ＝１０．９，Ｊ＝１０．９，−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝），５．７１−５．５９（３Ｈ，ｄｔｄ，Ｊｔｒａｎｓ＝１５．０Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，＝ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−），５．３５−５．２６（４Ｈ，ｍ，＝ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−および−ＣＨ２Ｃ−ＩＣＨ２−），４．３３−４．２６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊｇｅｍ＝１１．９Ｈｚ，Ｊ＝４．３，−ＣＨ２ＣＨＣＨ２−），４．１８−４．１０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊｇｅｍ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝６．０，−ＣＨ２ＣＨＣＨ２−），２．３７−２．３１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４ Ｈ２，−ＣＨ２ＣＯＯＲ），２．１９−２．０５（１２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−），１．６６−１．６０（６Ｈ，ｑｕ．，Ｊ＝Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＲ），１．４３−１．３０ １８Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−），０．９１−０．８６（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，−ＣＨ３）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８（ｐｐｍ）１７３．２，１７２．８，１３４．６，１３０．０，１２８．６，１２５．５，６８．８，６２．０，３４．０，３２．９，３１．６，２９．６−２８．９（６Ｃ），２７．６，２４．８，２２．５，１４．１。
【０１１３】
この反応の進行をモニターするため、およびこの反応の間の個々のグリセリドの組成についてのより詳細を提供するために、サンプルを、この反応の進行に伴なって規則正しく収集した。これらをＨＮＭＲ分光法によって分析し、そしてこの反応の進行の間のモノ−、ジ−およびトリアシルグリセロールの組成における良好な洞察を提供した。この結果を、以下の表１２に示す。この表から認識され得るように、１，３−ジアシルグリセロールは、この反応の最初の２時間の間、この反応混合物の優位を占める。４時間後、トリアシルグリセロールが優勢になり、そして２２時間後に９８％の組成に達し、そして４８時間後に１００％に達した。予想され得るように、１，２−ジアシルグリセロールは、１，３−ジアシルグリセロールよりも相当低いレベルに達した。１−モノアシルグリセロールは、この反応の最初の時間の間に最大に達したが、２−モノアシルグリセロールは、この反応を通して検出されなかった。
【０１１４】
【表１２】
（実施例７）
（ＣＬＡの収率および組成に対する、種々の温度および反応持続時間の影響） サフラワー油の共役に対する温度および反応持続時間の影響を決定した。水およびＮａＯＨを、表１、欄１および２に示されるように、高圧反応器（圧力ゲージおよびスターラーを備えたＰａｒｒ Ｍｏｄｅｌ ４５０ＭＬ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ａｌｌｏｙ ４００）に添加した。ＮａＯＨを溶解し、そしてサフラワー油（欄３）をこの反応器に添加した。この反応器を閉じ、そして２分間窒素でフラッシュし、次いで全てのバルブを閉じた。この反応器を、電気的ガスケットで所望の温度まで加熱し（欄４）、そして所望の時間（欄５）この温度を維持した。ついで、圧力を開放する前に、この温度を６０℃まで低下し、そして反応器を開けた。各反応について、反応器から、得られた２グラムの凝固した石鹸を取り出し、そして約４０℃の水に溶解した。ついで、クエン酸を添加して、この溶液のｐＨを６未満まで下げた。サンプルを、この脂肪酸最上層から取り出し、そしてガスクロマトグラフィーのために調製した。
【０１１５】
このガスクロマトグラフィーの結果を、欄６（９，１１異性体および１０，１２異性体の全パーセンテージ）、欄７（１１，１３異性体の全パーセンテージ）、ならびに欄８（全てのＣＬＡ異性体の全パーセンテージまたは収率）に示す。これらのデータは、反応の持続時間および温度が増加するにつれて、共役体の総量および１１，１３異性体のパーセンテージが増加することを示す。１１，１３異性体の形成が少ない条件下では、共役体の総量もまた少ない。
【０１１６】
【表１３】
（実施例８）
（サフラワー脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の結合）
この反応を、閉鎖容器中で行った。以下の成分を一緒に混合した：１００ｇのサフラワーＦＡＭＥ、および約２．８ｇのＫＯＣＨ３および２．８ｇのメタノールの混合物。２種の成分の混合の間のメタノールの蒸発に起因して、メタノールより多くのＫＯＭｅがおそらく存在する。この混合物を、この閉鎖反応容器中、窒素雰囲気下で、１１１〜１１５℃で５時間攪拌した。異性体の分布を、ガスクロマトグラフィーによって分析した。この結果を、表２に要約する。未処理のＧＣデータを、表３に示す。これらのデータは、結合サフラワーＦＡＭＥが、穏やかな条件下で達成され得、かなりの量の所望でない８，１０異性体および１１，１３異性体を含まない生成物を生じることを示す。
【０１１７】
表１４：異性体の分布
パルミチン酸 ６．６％
ステアリン酸 ２．７％
オレイン酸 １２．９％
リノール酸 ５．７％（未結合）
ＣＬＡ ｃ９，ｔ１１ ３４．１％
ＣＬＡ ｔ１０，ｃ１２ ３３．３％
ＣＬＡ ｃ，ｃ １．８％
ＣＬＡ ｔ，ｔ １．０％
ＣＬＡ 合計 ７０．２％。
【０１１８】
（実施例９）
（共役サフラワーＦＡＭＥの大規模バッチ生成物）
サフラワー結合ＦＡＭＥの生成を、２つの段階に分け得る：メタノール分解および結合。メタノール分解のために、６，０００ｋｇのサフラワー油を、閉鎖反応器に入れた。この反応器を、大気圧の窒素でパージし、そして１１５０リットルのメタノールおよび１６０ｋｇのＮａＯＣＨ３（３０％溶液）を添加した。この混合物を、攪拌しながら６５℃まで加熱し、そして６５℃で２時間反応させた。得られた底部層を、反応器を窒素ガスでパージしながらデカントした。次いで、１０００リットルの水（４０〜５０℃、これに５０ｋｇのクエン酸一水和物が溶解される）を、攪拌しながら添加した。この層を分離させ（約６０分）、そして底部層を、この反応器を窒素ガスでパージしながらデカントした。得られたサフラワーＦＡＭＥ生成物を、８０℃、減圧下で１時間乾燥させた。
【０１１９】
サフラワーＦＡＭＥを結合するために、メタノールに溶解してぺーストを形成した２５０ｋｇのＫＯＣＨ３を、この反応器に添加した。次いで、この混合物を攪拌しながら１２０℃まで加熱し、そして反応を３時間続けた。この混合物を１００℃まで冷却し、そして１０００リットルの水（４０〜５０℃、これに５０ｋｇのクエン酸一水和物が溶解される）を、攪拌しながら添加した。この混合物を１５分間攪拌し、次いでこの層を２０分かけて分離した。底部層をデカントし、そして生成物を８０℃で１時間乾燥させ、次いで窒素下で保存した。
【０１２０】
得られたＣＬＡを、以下の条件下で、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ＸＬ ＧＣを用いて分析した：
カラム： ＷＣＯＴ融合シリカ １００ｍ×０．２５ｍｍ，Ｃｏａｔｉｎｇ ＣＰ ＳＩＬ ８８
キャリア： Ｈｅガス，３０．０ＰＳＩ
温度： ２２０℃
作動時間： ３５〜９０分
注入： Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ，２４０℃
検出： ＦＩＤ，２８０℃。
【０１２１】
このＧＣの結果を、表１５および１６に要約する。
【０１２２】
【表１４】
（実施例１０）
以下は、本発明のＣＬＡ遊離脂肪酸、トリグリセリド、およびエステルを含む代表的な動物の食料の例である。
【０１２３】
Ａ．ブタの開始食料
【０１２４】
【表１５】
Ｂ．ブタのための成長停止食料（４０−２４０ＬＢＳ［１８−１０９ＫＧＳ］）
【０１２５】
【表１６】
Ｃ．ブタの成長停止食料（ブタ１２１−２４０ＬＢＳ［５５−１０９ＫＧＳ］）
【０１２６】
【表１７】
ブタの微量鉱物再混合物の組成および分析
【０１２７】
【表１８】
（ブタビタミンプレ混合物の組成）
（表２０）
【０１２８】
【表１９】
（Ｄ．雌鶏についての１８％タンパク質層食料）
（表２１）
【０１２９】
【表２０】
（Ｅ．ブロイラーについての開始期食料および仕上げ期食料）
（表２２）
【０１３０】
【表２１】
（Ｆ．飼育期／仕上げ期シチメンチョウ食料）
（表２３）
【０１３１】
【表２２】
（Ｇ．乾燥ドッグフード処方）
（表２４）
【０１３２】
【表２３】
（Ｈ．やや湿気のあるドッグフードの処方）
（表２５）
【０１３３】
【表２４】
（実施例１１）
（ＣＬＡの大スケール調製）
本実施例は、サフラワー油の異性化によるパイロットスケールでのＣＬＡの遊離脂肪酸の方法を示す。１０００ｋｇのＫＯＨを、２０７０Ｌのプロピレングリコールに溶解した。その後、この混合物を、攪拌しながら１００℃まで加熱した。ついで、２３４０Ｌのサフラワー油を添加し、そしてその温度を、１５０℃まで３時間上昇させた。その後、この混合物を、冷却し、そして１０００Ｌの水および１３５０ＬのＨＣＬを添加した。この時点で、その溶液が、遊離脂肪酸を上層として、二層に分離した。これらの層を分離し、そして下の水層を廃棄した。上層を、５０ｋｇのクエン酸を含む１０００Ｌの水を用いて洗浄した。この水層を廃棄し、そして油（ＣＬＡ）含有層を、減圧下で乾燥した。
【０１３４】
（実施例１２）
（揮発性化合物の検出）
本実施例は、ヘッドスペースキャピラリーガスクロマトグラフィーおよび質量分析計を使用する、揮発性有機化合物の検出を示す。実施例１１の方法により調製した３ｇのＣＬＡを、スリフ（ｓｌｉｆｆ）管において７０℃、１００ｍｌ／分の窒素を用いてパージした。放出された揮発性化合物を、パージおよび捕捉技術によって、Ｔｅｎｅｘ ＧＲ上に吸収した。その後、吸収された化合物を、ロウエーテルカラム（Ｊ＆Ｗ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０／５９７０ ＧＣ／ＭＳＤガスクロマトグラフィーシステムに、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＴＤ注入器によって注入した。ピークを、Ｗｉｌｅｙ参照サーチを使用して同定した。
【０１３５】
表２７は、最も優勢なピークおよびその相対的存在度（面積％）を示す。１１個の揮発性化合物を、サンプル（ペンタンおよびヘキサンを含む）中で同定した。これらの化合物の多く（ヘキサンを含む）は、動物またはヒトによる消費のための製品中では望ましくない。これらの結果は、油の化学的共役により調製されたＣＬＡサンプルは、望ましくない揮発性有機化合物を含むことを示す。
【０１３６】
（実施例１３）
（ＣＬＡの酸化）
本実施例は、経時的なＣＬＡの酸化を示す。ＣＬＡを、実施例１１に記載されるように調製した。１つのサンプルを、試験管中にて室温で２１日間放置した。第２の参照サンプルを、−３０℃で貯蔵した。両方のサンプルにおけるペンタンおよびヘキサンの増加を、実施例１２に記載される方法によって測定した。結果を、表２８に示す。サンプル中に存在するペンタンおよびヘキサンの両方の量が、室温で２１日間の貯蔵の後、約２倍増加した。本実施例は、油の化学的共役により調製されたＣＬＡサンプルが、経時的に酸化して、望ましくない揮発性有機化合物を形成することを示した。
【０１３７】
（実施例１４）
（トリアシルグリセリドの生成）
ＣＬＡを、実施例１１の方法に従って調製した。その後、この製品を、１５０℃および圧力１０−２ｍｂａｒで分子蒸留プラントにて蒸留した。次いで、１０００ｋｇのこの蒸留産物を、９７ｋｇの純粋なグリセロールおよび８０ｋｇリパーゼと混合した。この反応を、減圧下で攪拌しながら、５５℃で１２時間進行させた。そのトリアシルグリセリド産物を、分子蒸留装置にて希釈して、未反応脂肪酸を除去した。
【０１３８】
（実施例１５）
（ＣＬＡトリアシルグリセリドの酸化）
実施例１４の産物のアリコートを、フタをしない皿に配置し、制御した条件下で６０℃にて貯蔵した。抗酸化剤を、種々の量で、これらのサンプルのうちのいくつかに添加した。使用した抗酸化剤は、Ｃｏｎｔｒｏｘ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ），Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、Ｈｅｒｂａｌｏｘ（Ｋａｌｓｅｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）、Ｃｏｖｉ−ＯＸ（Ｇｒｕｎａｕ（Ｈｅｎｋｅｌ），Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ，ＤＥ）、およびα−トコフェロールであった。抗酸化剤を、０重量％、０．０２重量％、０．０５重量％、および０．１０重量％で添加した。
【０１３９】
油安定性指数（ＯＳＩ）を、当該分野で公知の方法（Ｏｍｎｉｏｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＯＳＩ装置を使用する、ＡＯＣＳ公式方法Ｃｄ １２ｂ−９２）を使用して測定した。サンプル（５ｇ）を、耐熱浴中で保持し、そして精製空気流を、このサンプルに通した。このサンプルからの流出空気を、脱イオン水を含む容器を通してバブリングした。この水の伝導性を、経時的に継続モニタリングする。そのＯＳＩ（酸化率の最大変化の点）を、数学的に決定する。このＯＳＩ測定の結果を、表２９および図２に示す。α−トコフェノールの添加は、このＯＳＩ地を有意には増加しなかった。Ｈｅｒｂａｌｏｘは、その値を約２〜３倍増加した。Ｃｏｖｉ−ＯＸおよびＣｏｎｔｒｏｘは、より大量に、それぞれ、約４倍および６倍、このＯＳＩ値を増加した。本実験は、特定の抗酸化剤（金属酸化剤キレート剤を含む）の添加は、貯蔵の間のＣＬＡ含有化合物の酸化を遅らせ得ること示す。
【０１４０】
（実施例１６）
（吸収剤での処理）
ＣＬＡのトリグリセリドを、実施例１４に記載されるように調製した。このサンプルを、１５０℃および１ｍｍＨｇで３時間脱臭した。次いで、このサンプル５００ｍｌを、粉末シリカで処理した。シリカを２％まで添加し、減圧下で３０分間、９０〜１００℃まで加熱した。次いで、このサンプルを冷却し、そして濾過した。
【０１４１】
（表２６）
【０１４２】
【表２５】
（表２７）
【０１４３】
【表２６】
（表２８）
（抗酸化剤の存在下でのＯＳＩ値（標準偏差）
【０１４４】
【表２７】
（実施例１７）
（アルコラート触媒を用いたＣＬＡの生成）
本実施例は、カリウムメチレートを触媒として使用して、サフラワー油からＣＬＡを生成することを記載する。サフラワー油（４１．５ｇ）の蒸留メチルエステルを、０．２０７ｇメタノールおよび０．６２ｇカリウムメチレートを含むリアクター中に配置し、そしてそのリアクターを、閉める前に窒素でパージした。このリアクターの内容物を、攪拌しながら１２０℃にした。その後、その反応を、１２０℃で４時間進行させた。その後、そのリアクターを８０℃まで冷却し、そしてその内容物を、分離漏斗に移し、そして熱い蒸留水で洗浄し、その後、クエン酸を含む熱湯で洗浄した。その後、メチルエステルを、穏やかに加熱しながら、減圧下で乾燥させた。その乾燥メチルエステルを、イソオクタン中で溶解し、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒオートサンプラーを用いてＧＬＣにより分析した。そのカラムは、高極性の溶融シリカ型であった。以下のプログラムを使用した：
注入：２５０℃のスプリットレス（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）
検出：２８０℃でフレームイオン化検出器
キャリア：ｐｓｉｇでヘリウム
オーブンプログラム：８０℃〜１３０℃（４５℃／分）、その後１℃／分で２２０℃まで、そして２２０℃で１０分間
カラム：ＷＣＯＴ ＦＵＳＥＤ ＳＩＬＩＣＡ ０．２５ｍｍ １００ｍ、ＣＰ−ＳＩＬ ８８ ｆｏｒ ＦＡＭＥ、ｄｆ＋０．２。
【０１４５】
得られたＣＬＡは、ほぼ、表３０に示されるようなＣＬＡのｃ９、ｔ１１異性体およびｔ１０，ｃ１２異性体のみからなった。
【０１４６】
【表２８】
（実施例１８）
（リノレン酸の共役により形成された産物）
本実施例は、リノレン酸の共役により形成された産物を記載する。純粋なリノレン酸（Ｎｕ Ｃｈｅｃｋ Ｐｒｅｐ．）をエステル化し、そしてリノレン酸の脂肪酸メチルエステル１．０８ｇを、４３．０ｍｇのカリウムメチレートおよび１０．８ｍｇメタノールとともに、試験管中で混合した。試験管を、窒素でパージして閉じた。その混合物を攪拌するために磁性バーを使用した。この反応を１２０℃で３時間進行させた。このサンプルを水で２回洗浄し、そしてクエン酸で１回洗浄し、そしてＧＬＣ分析のためにイソオクタン中に希釈した。その条件は、実施例１７と同じであり、ただし、オーブンプログラムおよびカラムが以下であった：
オーブンプログラム：８０〜１６０℃（２５℃／分）、その後、５℃／分で２２０℃まで、そして２２０℃で１０分間
カラム：ＷＣＯＴ ＦＵＳＥＤ ＳＩＬＩＣＡ ０．２５ｍｍ １００ｍ、ＣＰ−ＳＩＬ ５ＣＢ ｆｏｒ ＦＡＭＥ、ｄｆ＋０．２。
【０１４７】
その結果（表３１）は、１％以上の７つのピークの存在を示す。これらのピーク各々が、共役した位置で２つまたは３つの結合を有する酸を示す。これらのピークに対応する脂肪酸が天然で見出されるか否かは公知でなく、そしてその可能な効果は、公知ではない。
【０１４８】
【表２９】
（実施例１９）
（ＣＬＡ酸化産物）
本実施例は、解放空気に曝したＣＬＡの酸化を記載する。メチルエステルの小さいサンプルを調製し、そしてフタをしない試験管中にて室温で１１５日間貯蔵し、空気に自由に接近させた。そのサンプル中に最初に存在するＣＬＡは、完全に分解され、そしてフラン脂肪酸および他の未同定の誘導体へと変換された。酸化前後のＣＬＡサンプルの相対含量を、表３に示す。このクロマトグラムは、比較的非極性である成分のみを示す。同じサンプルのクロマトグラムもまた、極性カラム上で流した。その結果は、大量の短鎖の極性成分（すなわち、分解産物）の存在を示した。
【０１４９】
【表３０】
上記から明らかであるべきことは、本発明が、動物の餌の処方において、およびヒトによる消費のために適切な食品において、使用され得る高純度の共役リノール酸組成物を提供することである。
【０１５０】
上記明細書に言及されたすべての刊行物および特許が、本明細書中に参考として援用される。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変化形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求された本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが、理解されるべきである。実際、医学分野、生化学分野、または関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の改変が、上記の特許請求の範囲内にあることが意図される。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、該組成物は、不活性貯蔵条件下における少なくとも３０日間の貯蔵期間の間に総１００ｐｐｍを超えない、低分子量揮発性有機化合物の含有量を有する、組成物。
（項２） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離脂肪酸である、上記項１に記載の組成物。
（項３） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項１に記載の組成物。
（項４） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項１に記載の組成物。
（項５） 前記組成物が金属酸化体キレート剤をさらに含む、上記項１〜４に記載の組成物。
（項６） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項５に記載の組成物。
（項７） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項８） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項９） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１〜６に記載の組成物。
（項１０） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項１〜９に記載の組成物。
（項１１） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項１０に記載の組成物。
（項１２） 抗酸化剤をさらに含む、上記項１〜１１に記載の組成物。
（項１３） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項１２に記載の組成物。
（項１４） 上記項１〜１３に記載の組成物を含む、食品。
（項１５） 上記項１〜１３に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項１６） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該組成物は、総１００ｐｐｍ以下の低分子量揮発性有機化合物を含み、そして６０℃において約２０〜１００時間の油安定性指標を有する、組成物。
（項１７） 上記項１６に記載の組成物であって、ここで、前記油安定性指標がおおよそ、６０℃において約２０〜１００時間より大きい、組成物。
（項１８） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離の脂肪酸である、上記項１６に記載の組成物。
（項１９） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項１６に記載の組成物。
（項２０） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項１６に記載の組成物。
（項２１） 前記組成物がさらに金属酸化剤キレート剤を含む、上記項１６〜２０に記載の組成物。
（項２２） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項２１に記載の組成物。
（項２３） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２２に記載の組成物。
（項２４） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２２に記載の組成物。
（項２５） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項１６〜２４に記載の組成物。
（項２６） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項１６〜２５に記載の組成物。
（項２７） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項２６に記載の組成物。
（項２８） 抗酸化剤をさらに含む、上記項１６〜２７に記載の組成物。
（項２９） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項２８に記載の組成物。
（項３０） 上記項１６〜２９に記載の組成物を含む、食品。
（項３１） 上記項１６〜２９に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項３２） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該組成物は、総１００ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含み、該組成物は、以下の工程：
ａ）異性化された共役リノール酸部分を含む組成物を提供する工程；
ｂ）吸着剤を提供する工程；
ｃ）該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含するプロセスを介して入手可能である、
組成物。
（項３３） 前記異性化された共役リノール酸部分が遊離脂肪酸である、上記項３２に記載の組成物。
（項３４） 前記異性化された共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項３２に記載の組成物。
（項３５） 前記異性化された共役リノール酸部分がトリアシルグリセリドである、上記項３２に記載の組成物。
（項３６） 前記組成物が金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項３２〜３５に記載の組成物。
（項３７） 前記金属酸化剤キレート剤が、クエン酸エステルおよびレシチンからなる群より選択される、上記項３６に記載の組成物。
（項３８） 前記組成物が、総５０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項３９） 前記組成物が、総１０ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項４０） 前記組成物が、総５ｐｐｍ未満の揮発性有機化合物を含む、上記項３２〜３７に記載の組成物。
（項４１） 上記項３２〜４０に記載の組成物であって、ここで、該組成物は、約１〜１０ｐｐｍの金属イオンを含む異性化された共役リノール酸部分を含む、組成物。
（項４２） 金属酸化剤キレート剤をさらに含む、上記項３２〜４１に記載の組成物。
（項４３） 前記金属酸化剤キレート剤が、レシチンおよびアスコルビン酸から選択される、上記項４２に記載の組成物。
（項４４） 抗酸化剤をさらに含む、上記項３２〜４３に記載の組成物。
（項４５） 前記抗酸化剤が、α−トコフェロール、β−トコフェロール、レシチン、アスコルビルパルミテート、およびＢＨＴからなる群より選択される、上記項４４に記載の組成物。
（項４６） 上記項３２〜４５に記載の組成物を含む、食品。
（項４７） 上記項３２〜４５に記載の組成物を含む、食物補助食品。
（項４８） 異性化された共役リノール酸部分を含む組成物であって、
該共役リノール酸部分は、該組成物の味および香りに影響を与えないように、十分に低い揮発性有機化合物の濃度を有する、組成物。
（項４９） 前記共役リノール酸部分がアルキルエステルである、上記項４８に記載の組成物。
（項５０） 前記共役リノール酸部分が遊離の脂肪酸である、上記項４８に記載の組成物。
（項５１） 前記共役リノール酸部分がトリグリセリドである、上記項４８に記載の組成物。
（項５２） 安定化された共役リノール酸生成物を提供する方法であって、該方法は、以下：
ａ）共役リノール酸部分を含む組成物および吸着剤を提供する工程；ならびに
ｂ）生じる共役リノール酸化合物が、不活性貯蔵条件下において１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物の含有量を維持するような条件下で、該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含する、方法。
（項５３） 前記共役リノール酸部分が工程（ｂ）の前に脱臭される、上記項５２に記載の方法。
（項５４） 前記共役リノール酸部分を抗酸化剤を用いて処理する工程をさらに包含する、上記項５２に記載の方法。
（項５５） 安定化された共役リノール酸生成物を提供する方法であって、該方法は、以下：
ａ）共役リノール酸部分を含む組成物、吸着剤、および少なくとも１つの抗酸化組成物をを提供する工程；
ｂ）該共役リノール酸部分を含む組成物を脱臭する工程；
ｃ）該共役リノール酸部分を含む組成物を少なくとも１つの該抗酸化組成物を用いて処理する工程；ならびに
ｄ）生じる共役リノール酸化合物が、不活性貯蔵条件下において１０ｐｐｍ未満の低分子量揮発性有機化合物の含有量を維持するような条件下で、該共役リノール酸部分を該吸着剤を用いて処理する工程、
を包含する、方法。
（項５６） 前記共役リノール酸部分が遊離脂肪酸として提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５７） 前記共役リノール酸部分がアルキルエステルとして提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５８） 前記共役リノール酸部分がトリグリセリドとして提供される、上記項５５に記載の方法。
（項５９） 上記項５５に記載の方法であって、該吸着剤が、漂白土類、活性な活性炭ゼオライト、およびシリカからなる群より選択される、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載の発明。
【請求項１】
本願明細書または図面に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１７６９８６（Ｐ２０１２−１７６９８６Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１３５８９４（Ｐ２０１２−１３５８９４）
【出願日】平成２４年６月１５日（２０１２．６．１５）
【分割の表示】特願２００１−５７５１２５（Ｐ２００１−５７５１２５）の分割
【原出願日】平成１３年４月６日（２００１．４．６）
【出願人】（５０２２０８２４９）コンリンコ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３５８９４（Ｐ２０１２−１３５８９４）
【出願日】平成２４年６月１５日（２０１２．６．１５）
【分割の表示】特願２００１−５７５１２５（Ｐ２００１−５７５１２５）の分割
【原出願日】平成１３年４月６日（２００１．４．６）
【出願人】（５０２２０８２４９）コンリンコ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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