内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の処置及び可能性を防止／減少させる方法
本発明は、被験者が内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を誘発することが既知の発作を患った後に、ＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与することにより、被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症を防止し、又は被験者における側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の重症度を軽減する処置方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
２００９年７月２４日出願の表題「内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の処置及び可能性を防止／減少させる方法」の特許文献１、及び２００９年１１月１２日出願の同一表題の特許文献２の優先の恩恵を主張し、それらは参照により個々にその全体がここに採り入れられる。
（連邦助成による研究）
本発明はＮＩＨ／ＮＲＳＡによる助成金番号ＲＲ１５６３６，ＦＦ０１５６１４，ＡＡ０１４１２７及びＡＡ０１６８８０の政府の助成により完成された。従って米国政府は本発明に対し権利を有する。
（技術分野）
本発明は、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の処置及び防止に関する新規の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全ての参照に対する引用文献は実施例の後に記載されている。
内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は成人において最も一般的なタイプのてんかんであり（Ｅｎｇｅｌ，１９８９）、しばしば薬物処置に対し耐性を示し、最終的には発作を抑えるために神経手術の選択肢しか残されない。ＴＬＥは脳損傷及びてんかん重積（ＳＥ）を含む種々の発作の後に発症する。突然の発作の後に、特徴的な無発作の「潜伏期」がヒトでは典型的に２−３カ月、例外的に数年続く（Ａｎｎｅｇｅｒｓ氏他、１９８０；Ｗｅｉｓｓ氏他，１９８６）。リチウム−ピロカルピン誘導てんかん重積（ＳＥ）後数週間後に発症するラットのＴＬＥは、ヒトＴＬＥの臨床及び神経病理学的特徴を再現し、そしてその病気の非常に有益な動物モデルを提供する（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他，１９８９；Ｔｕｒｓｋｉ氏他，１９９１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ氏，１９９５；Ｄｕｂｅ氏他，２００；Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。当初の原因が異なっても、ＴＬＥの行動性及び組織病理学的特徴は全ての病因で驚くほど類似している。このことが多くの研究者に初期の原因の下流に主な共通する経路、恐らくは発作の識別特性である激しい同期活性があると仮定するように誘導した（Ｄｕ氏他，１９９５；Ｗｕ氏及びＳｃｈｗａｒｃｚ氏，１９９８；Ｓｃｈｗａｒｃｚ氏他，２０００）。通常この同期活性は嗅内皮質（ＥＣ）を含む海馬及び海馬傍回皮質に見られる（Ｓｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎ氏及びＫｎｏｗｌｅｓ氏，１９８４；Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ氏他，２００４）。長い間、特定の内側側頭葉萎縮が発作病巣に対して同側性であることが示されて来た（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ氏他，２００５）。外科的に切除された標本の検査により、嗅内皮質（ＥＣ）で細胞消失とアストログリオーシスが確認された（Ｙｉｌｍａｚｅｒ−Ｈａｎｋｅ氏他，２０００）。
【０００３】
神経生理学において、てんかん重積（ＳＥ）の後、どこの場所において重要な初期変化が起こるのかが不明確である；しかしながら、海馬アンモン角領域に対する海馬傍回の神経保護実験は、てんかん発生の初期段階において海馬傍回皮質の重要な役割を示唆した（Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。さらに我々は以前の研究において、深部嗅内皮質（ＥＣ）が、第２層及び第３層と著しく対照的に、異常に高い網状組織の興奮を発現することを観察した（Ｇｌｏｖｅｌｉ氏他，１９９９；Ｅｇｏｒｏｖ氏他，２００３）。このことは、深部嗅内皮質（ＥＣ）が、てんかん重積（ＳＥ）にトリガーされた過剰興奮性の発現に対して特に疑わしいことを示唆する。
【０００４】
自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する重要な機構は、興奮性ニューロンのＣｌ−依存シナプス抑制である。この抑制の有効性は細胞外Ｃｌ−濃度に対する細胞内Ｃｌ−の増加と共に低下する。細胞内Ｃｌ−濃度はＫ＋Ｃｌ−共輸送体、特にＫＣＣ２により、Ｋ＋外向き勾配により駆動されて減少し、Ｎａ＋Ｋ＋２Ｃｌ−共輸送体、特にＮＫＣＣ１により、Ｎａ＋内向き勾配に駆動されて増加する。従って周辺及び中心ニューロンに対しては、両方のＣｌ−輸送体がシナプス抑制の効率性に対して重要な役割を果たしていることが確認されている（Ａｉｃｋｉｎ氏他，１９８４；Ｍｉｓｇｅｌｄ氏他，１９８６）。
【０００５】
特許文献３は種々の疾病、特に、塩化ナトリウムカリウム共輸送体媒介疾病、及びガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の損なわれた抑制により激化する脳内の興奮毒性に伴う疾病、の処置に利尿剤を使用することを記載している。
【０００６】
ＴＬＥを防止又は処置する努力に拘わらず、上記のＴＬＥ関連発作を防止又は寛解させる処置方法に対する要求は依然として存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国暫定特許出願ＵＳ６１／２７１，７１４
【特許文献２】米国暫定特許出願ＵＳ６１／２８１，０９５
【特許文献３】米国特許出願 ２００７００４３０３４
【発明の概要】
【０００８】
出願人は、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後にＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与することにより、被験者に内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）が発症するのを防止する、或いはＴＬＥの重症度を低減する処置法を発見した。
【０００９】
従って本発明のある側面では、被験者が、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、緊張性―クローヌス性（間代性）発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、脳腫瘍の診断又は発見後、などの発作を患った後に、被験者にＮＫＣＣ１抑制剤が投与される。
【００１０】
ある側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積（ＳＥ）発症後の潜伏期に被験者に投与される。
また他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が原因が未知の最初の発作を患った後に被験者に投与される。
【００１１】
さらに他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＴＬＥ誘発発作（一般的に、ＳＥ発作を含む）を患った後約８週間から約２４週間以内（或いは約１２週間から約１６週間以内）に被験者に投与される、又は約１週間から約４週間以内、又は約２−３週間から４週間以内に被験者に投与される。ブメタニド及びＧＡＢＡＡ作動性伝達賦活薬との組合せによる、ＴＬＥ又はＴＬＥ発症の効果的処置のためのＳＥ又は他のＴＬＥ誘発発作後の時間は、ＳＥ又は発作の継続期間と重症度、及び種、特にヒトに依存し、それよりずっと長い。
【００１２】
本発明の他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤とガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後又は原因が未知の発作の最初の発作後に、前記被験者に同時投与される。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、ＮＫＣＣ１抑制剤が,トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、それらの塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である。
【００１４】
本発明の他の側面では、１つ以上のＮＫＣＣ１抑制剤、及び選択肢として１つ以上のガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の反復性発作を患った後に、慢性的に被験者に投与される。
【００１５】
本発明のさらに他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が第２の処置薬と組合わされ、そして被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者に同時投与され、
ここにおいて第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物（例えば、ＧＡＢＡＡ受容体依存信号伝達の調節剤）、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである。
【００１６】
発明者らは、ＴＬＥを誘発することが既知の発作に続く期間（例えば、てんかん重積（ＳＥ）後の潜伏期）において、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内の増加する比率のニューロンが単一のシナプス刺激に多シナプス性バースト脱分極／てんかん型活性で応答することを発見した。この変化はＣｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の発現量の増大及び同時発生のＣｌ−外向き輸送体ＫＣＣ２の発現量の減少に明白に起因する、第５層ニューロンにおけるＩＰＳＰ逆転電位の進行性脱分極シフトと平行して起こり、両方の変化は細胞内Ｃｌ−蓄積を助ける。潜伏期におけるＣｌ−取り込みの抑制は、よりネガティブなＧＡＢＡ作動性逆転電位を回復し、そして多シナプス性バーストを消滅させた。Ｃｌ−輸送体における変化は、深部嗅内皮質に高度に特異的であった。変化はこの期間、第１−３層、嗅周囲皮質、海馬台、ＣＡ１,ＣＡ２又は歯状回では起こらない。いかなる理論にも縛られないことを希望するが、我々は、Ｃｌ−のホメオスタシスの変化が深部嗅内皮質において過剰興奮性を促進し、そこでのてんかん放電につながり、それは結果的に下流の皮質領域に影響を与えることを提案する。
【００１７】
本発明の処置方法は従って、潜伏期及び初期慢性型てんかん期における異常性細胞活性及び発作形成の根底をなす特定の基礎的病理を標的とする。ＴＬＥを誘発することが既知の発作の後、又は未知の原因の初期発作の後、のＮＫＣＣ１の慢性的抑制は、ＴＬＥの予防的防止、又は発現の減弱に有用であることを証明する。
本発明のこれら及び他の側面は、発明の詳細においてさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の実験により画定される、てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの増大した多シナプス性バースト興奮を示す図である。
【図２】「材料及び方法」の項、及び実施例２で説明される、てんかん重積（ＳＥ）後２週間後と３週間後のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位のポジティブ変移を示す図である。
【図３】実施例３で画定される、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ、Ｃｌ−内側方向輸送体が、てんかん重積（ＳＥ）後嗅内皮質（ＥＣ）第５層内において進行的に増大することを示す図である。
【図４】実施例４の実験において、ＮＫＣＣ１タンパク質も増加したことを示す図である。
【図５】実施例４の実験において測定されるように、ＳＥ後、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンがＮＫＣＣ１タンパク質の発現を増加させたことを示す図である。
【図６】実施例５の実験において測定されたように、ＫＣＣ２に対するｍＲＮＡ，ニューロンのＣｌ−の外向き輸送体は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後進行的に減少することを示す図である。
【図７】実施例６の実験において測定されたように、ＳＥ後ＫＣＣ２タンパク質も減少することを示す図である。
【図８】実施例７の実験において測定されたように、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは他の皮質領域では増加しないことを示す図である。
【図９】実施例７の実験において測定されたように、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは深層嗅内皮質（ＥＣ）でのみ減少することを示す図である。
【図１０】実施例８の実験において測定されたように、ＮＫＣＣ１抑制剤ブメタニドは部分的にＥ（ＰＳＰ）を回復し、そして多シナプス性興奮を抑制することを示す図である。
【図１１】実施例９の実験において測定されたように、ピクロトキシンは多シナプス性バーストに軽度の影響をあたえることを示す図である。
【図１２】リチウム−ピロカルピンＳＥ後１２−１７週間後における、ブメタニドによる発作の抑制（０．２ｍｇ／Ｋｇ体重、腹腔内）を示す（ｎ＝５ラット）図である。５体のリチウム−ピロカルピンＳＥラットが連続するブメタニド又は媒体注射（生理食塩水内の５％エタノール、腹腔内、下部に日付を記載）を受け、そしてその後８時間以内に発現する発作がビデオ録画により分析された。１体の同一のラットは、ブメタニドがＣｌ及びＩＰＳＰ逆転電位を概して基準化した場合でも、２度目及び３度目のブメタニド投与後に発作を発現したが、それは恐らく自発的発作を可能にするこのラット内の２次的な下流の変化によるものである。
【図１３】ＮＫＣＣ１タンパク質が正常な成人レベルに向かって回復することを示す図である。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＮＫＣＣ１タンパク質の免疫蛍光信号を、抗体を持たない対照ラット（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）、抗体を持つ対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ 週間後」と表示）のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１信号は、ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）では、ＳＥ後３週間後のラットのレベルの５０％未満まで回復し、そしてブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）では９５％超に回復した。
【図１４】ＫＣＣ２タンパク質が正常な成体レベルに向かって回復することを示す図である。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＫＣＣ２タンパク質の免疫蛍光信号を対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ後 週間」と表示）のラット、及びＳＥ後１７週間後のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＫＣＣ２信号は、正常レベルに向かって回復した（ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示、そして、ブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）。
【図１５】海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは変化がないことを示す図である。
【図１６】海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは変化がないことを示す図である。
【図１７】嗅内皮質（ＥＣ）第２層、第３層、又は第５層においても、ＳＥ後３週間後にニューロンの損失がないことを示す図である。
【図１８】ブメタニド処置が有る場合と無い場合の発作発現を示す図である。
【図１９】慢性ブメタニド処置が、処置期間中および処置終了後少なくとも６週間、自発的発作の発現を抑制することを示す図である。
【図２０】ブメタニド処置終了後６週間後も誘発発作の発現を抑制することを示す図である。
【図２１】ブメタニド処置がラットの挙動を回復させることを示す図である。
【図２２】内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）発症の我々の原理、及び本発明による防止を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の用語が本発明の記述に使用される。ここで特別に定義されない言葉は、本発明の記述に使用される言葉と一貫性を持つ、当業者に使用される共通の意味を有する。
特に特定されない限り、「１つの」、および「少なくとも１つ」は交換可能に使用され、１つ又はそれ以上を意味する。
用語「効果的」は、本発明において意図された効果を生むための本発明の薬剤の量を記述するために使用される。
用語「ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物」は、限定されないが、バルビツール酸化合物（例えばフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン系化合物（例えば、ジアゼパム）、又はＧＡＢＡの放出を増加させ又はＧＡＢＡの再摂取を抑制する薬剤、例えば、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、及び、３−アミノプロピルスルフィン酸、を含む。
【００２０】
ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物として有用な本発明の他の組成物は：
拮抗薬：ガボクサドール、イソグバシン、イソニペコチン酸、ムシモール（ベニテングタケ）、プロガビド、ＳＬ７５１０２、チオムシモール（Ｔｈｉｏｍｕｓｃｉｍｏｌ）。
ＧＡＢＡＡ受容体ポジティブアロステリック調節剤：
バルビツール酸化合物；
アロバルビタール、アルフェナール（Ａｌｐｈｅｎａｌ）、アモバルビタール、アプロバルビタール、バルベキサクロン、バルビタール、バルビツール酸ベンジルブチル、ブラロバルビタール（Ｂｒａｌｌｏｂａｒｂｉｔａｌ），ブロフェバルビタール（Ｂｒｏｐｈｅｂａｒｂｉｔａｌ）、ブコローム、ブタバービタル、ブタルビタール、ブトバルビタール、ブタリロナール、クロチルバルビタール（Ｃｒｏｔｙｌｂａｒｂｉｔａｌ），シクロバルビタール、シクロパール（Ｃｙｃｌｏｐａｌ），エナリルプロピマール（Ｅｎａｌｌｙｌｐｒｏｐｙｍａｌ）、エサロバルビタール（Ｅｔｈａｌｌｏｂａｒｂｉｔａｌ），フェバルバメート、ヘプタバルビタール、ヘキセタール、ヘキソバルビタール、メホバルビタール、メタルビタール、メトヘキシタール、メチルフェノバルビタール、ナルコバルビタール、ニールバルビタール（Ｎｅａｌｂａｒｂｉｔａｌ），ペントバルビタール、フェノバルビタール、フェタアルビタール（Ｐｈｅｔｈａｒｂｉｔａｌ）、プリミドン、プラジトン（Ｐｒａｚｉｔｏｎ）、プロバルビタール、プロパリロナール（Ｐｒｏｐａｌｌｙｌｏｎａｌ）、プロキシバルバール、プロキシバルビタール、レポサール、セクブタバルビタール、セコバルビタール、シグモダール（Ｓｉｇｍｏｄａｌ）、スピロバルビタール（Ｓｐｉｒｏｂａｒｂｉｔａｌ）、タルブタール、チアルバルビタール、チアミラール、チオバルビタール、チオブタバルビタール、チオペンタール、バロフェイン（Ｖａｌｏｆａｎｅ）、ビンバルビタール（Ｖｉｎｂａｒｂｉｔａｌ），ビニルビタール。
【００２１】
ベンゾジアゼピン系薬；
アジナゾラム、アルプラゾラム、アルフェンダザム（Ａｒｆｅｎｄａｚａｍ），アビザホン（Ａｖｉｚａｆｏｎｅ），ベンタゼパム，ブレタゼニル，ブロマゼパム，ブロチゾラム，カマゼパム，クロルジアゼポキシド，シクロチゾラム（Ｃｉｃｌｏｔｉｚｏｌａｍ），シノラゼパム，クリマゾラム（Ｃｌｉｍａｚｏｌａｍ），クロバザム，クロナゼパム，クロラゼペート，クロチアゼパム，クロキサゾラム，シプラゼパム（Ｃｙｐｒａｚｅｐａｍ），デロラゼパム，ジアゼパム，ドキセファゼパム，エルファゼパム（Ｅｌｆａｚｅｐａｍ）、エスタゾラム，エチルカルフルゼペート（Ｅｔｈｙｌ ｃａｒｆｌｕｚｅｐａｔｅ），エチルジラゼペート（Ｅｔｈｙｌ Ｄｉｒａｚｅｐａｔｅ），ロフラゼプ酸エチル，エチゾラム，フレタゼパム（Ｆｌｅｔａｚｅｐａｍ），フルジアゼパム，フルニトラゼパム，フルラゼパム，フルタゾラム，フルテマゼパム（Ｆｌｕｔｅｍａｚｅｐａｍ），フルトプラゼパム、ホサゼパム（Ｆｏｓａｚｅｐａｍ）、ギダゼパム（Ｇｉｄａｚｅｐａｍ）、ギリソパム（Ｇｉｒｉｓｏｐａｍ）, ハラゼパム, ハロキサゾラム, イクラゼパム(Ｉｃｌａｚｅｐａｍ)，イミダゼニル（Ｉｍｉｄａｚｅｎｉｌ），ケタゾラム，ロフェンダザム（Ｌｏｆｅｎｄａｚａｍ），ロピラゼパム（Ｌｏｐｉｒａｚｅｐａｍ），ロピラゼパム（Ｌｏｐｉｒａｚｅｐａｍ），ロプラゾラム，ロラゼパム，ロルメタゼパム，メクロナゼパム（Ｍｅｃｌｏｎａｚｅｐａｍ），メダゼパム，メニトラゼパム（Ｍｅｎｉｔｒａｚｅｐａｍ），メタクラゼパム，メキサゾラム，ミダゾラム，ネリソパム（Ｎｅｒｉｓｏｐａｍ），ニメタゼパム，ニトラゼパム，ニトラゼペート（Ｎｉｔｒａｚｅｐａｔｅ），ノルダゼパム，オキサゼパム，オキサゾラム，フェナゼパム、ピナゼパム、ピボザゼパム（Ｐｉｖｏｘａｚｅｐａｍ），プラゼパム，プレマゼパム，プロフラゼパム（Ｐｒｏｆｌａｚｅｐａｍ），ＱＨ−ＩＩ−６６，クアゼパム，レクラゼパム（Ｒｅｃｌａｚｅｐａｍ），リルマザホン，リパゼパム，Ｒｏ４８−６７９１，ＳＨ−０５３−Ｒ−ＣＨ３−２’Ｆ，スラゼパム（Ｓｕｌａｚｅｐａｍ），テマゼパム，テトラゼパム，トフィソパム，トリアゾラム，トリフルバザム（Ｔｒｉｆｌｕｂａｚａｍ），ウルダゼパム（Ｕｌｄａｚｅｐａｍ）、ザピゾラム（Ｚａｐｉｚｏｌａｍ），ゾラゼパム，ゾメバザム（Ｚｏｍｅｂａｚａｍ）。
【００２２】
カルバミン酸化合物；
カリスバメート、カリソプロドール、エミルカメート、フェルバメート、メブタメート、メプロバメート、メトカルバモール、フェンプロバメート、プロシメート（Ｐｒｏｃｙｍａｔｅ）、チバメート。
抗神経活性ステロイド；
アセブロコール（Ａｃｅｂｒｏｃｈｏｌ）、アロプレグナノロン、アルファドロン、アルファキサロン、ゲドカルニル、ガナクソロン（Ｇａｎａｘｏｌｏｎｅ）、ヒドロキシジオン、ミナキソロン、Ｏｒｇ２０５９９、ＴＨＤＯＣ。
非ベンゾジアゼピン系薬；
アベカーニル、アジピプロン（Ａｄｉｐｉｐｌｏｎ）、アルピデム、ＣＧＳ−２０６２５、ＣＧＳ−９８９６、ＣＬ−２１８，８７２、ＥＬＢ−１３９、エスゾピクロン、エチホキシン、インジプロン（Ｉｎｄｉｐｌｏｎ）、Ｌ−８３８，４１７、ネコピデム（Ｎｅｃｏｐｉｄｅｍ）、ＮＳ−２６６４、ＮＳ−２７１０、オシナプロン、パゴクロン（Ｐａｇｏｃｌｏｎｅ）、パナジプロン（Ｐａｎａｄｉｐｌｏｎ）、パジナクロン（Ｐａｚｉｎａｃｌｏｎｅ）、ピペクアリン（Ｐｉｐｅｑｕａｌｉｎｅ）、ＲＯＤ−１８８、ＲＷＪ−５１２０４、サリピデム（Ｓａｒｉｐｉｄｅｍ）、ＳＢ−２０５，３８４、ＳＬ−６５１，４９８、スプロクロン（Ｓｕｐｒｏｃｌｏｎｅ）、スリクロン、ＳＸ−３２２８、ＴＰ−００３、ＴＰＡ−０２３，ＴＰ−１３，トラカゾレート、Ｕ−８９８４３Ａ，Ｕ−９００４２、Ｙ−２３６８４、ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロン。
フェノール；
フォスプロポフォール、プロポフォール、チモール。
ピペリジンジオン；
グルテチミド、メチプリロン、ピペリジオン、ピリチルジオン。
キナゾリノン；
アフロクアロン、クロロカロン（Ｃｌｏｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、ジプロカロン（Ｄｉｐｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、エタカロン（Ｅｔａｑｕａｌｏｎｅ）、メブロカロン（Ｍｅｂｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、メクロカロン、メタカロン、メチルメタカロン。
その他；
クロルメザノン、クロメチアゾール、エタゾレート、エタノール（アルコール）、エトミデート、キャバラクトン（Ｋａｖａｌａｃｔｏｎｅ）（カバカバ）、ロレクレゾール、プロガビド、プロパニジド、ＲＯＤ−１８８、タツナミソウ、スチリペントール、ワレレン酸（Ｖａｌｅｒｅｎｉｃ Ａｃｉｄ）（カノコソウ）。
【００２３】
Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−２Ｃｌ（−）の共輸送体（ブメタニド又はエタクリン酸）の抑制剤。Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ。２００９年２月号；２９６（２）：Ｆ４４６−５７
セレンスレオニンキナーゼＷＮＫ４は、Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−２Ｃｌ（−）の共輸送体（ＮＫＣＣ１）及びＣｌ（−）／塩基交換輸送体ＳＬＣ２６Ａ６（ＣＦＥＸ）の両方に対し強い薬効のある抑制剤であることが証明されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４年２月１７；１０１（７）：２０６４−９．Ｅｐｕｂ ２００４年２月９日）。
ｍＲＮＡからのＮＫＣＣ１タンパク質の発現は再発現期間の間、嗅内皮質を標的とする核酸のアンチセンス鎖により抑制される。
炎症は典型的にＮＫＣＣ特にＮＫＣＣ１の増加につながる。炎症の典型的なサインはてんかん誘発性皮質に現れ、そして炎症媒介物質は従ってＮＫＣＣ１再発現に寄与する可能性がある。従って、遷延性のインターフェロン−ガンマ暴露はイオン輸送及びＮＫＣＣ１発現を他の組織において減少させ（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００４年１月；２８６（１）：Ｇ１５７-６５．Ｅｐｕｂ ２００３ ９月４）、従って側頭葉てんかん（ＴＬＥ）誘発発作の後に、嗅内皮質（ＥＣ）におけるＮＫＣＣ１再発現を抑制するのに有用である可能性がある。
【００２４】
ＧＡＢＡＢ受容体遮断薬は、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストの活性化による放出の負のフィードバックを遮断することにより、ＧＡＢＡ放出を増大させるのに有用でありうる：
主要サイト：ファクロフェン、サクロフェン、ＳＣＨ−５０９１１。
ＧＡＢＡ異化反応の遮断もまた有用でありうる：ＧＡＢＡ−Ｔ抑制薬、例えば、３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン。
【００２５】
ＮＫＣＣ１抑制薬の利尿効果の抑制は水及びナトリウムのホメオタシスに対する副作用を最小化するのに有用であり得る。１）プロベネシドでの前処置はブメタニド又は他のＮＫＣＣ１抑制薬により発症したナトリウム利尿及び高レニン血症の両方を減少させる。プロベネシドのＮＫＣＣ抑制媒介ナトリウム利尿に対するこのような拮抗作用は明らかにナトリウム排出に対する直接作用に起因せず、おそらくブメタニドの腎尿細管分泌に対する抑制作用の２次性である。インドメタシンはブメタニド処置の間、尿量およびナトリウム排出の増加を鈍化させ、そして、ブメタニド−誘発の血漿レニン活性の増加を抑制する。３）バソプレシン、アルギプレシン又は抗利尿ホルモンとして知られるアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）及びその変異体、例えば、リジンバソプレシン（ＬＶＰ）又はリプレシンは、腎臓内の遠位尿細管及び集合尿細管における水の再吸収を増大させることにより、腎臓内のＮＫＣＣの抑制に起因する水利尿の増加を鈍化させる。
【００２６】
抗けいれん薬は、神経性発作活性の蓄積と拡散を抑制するためにてんかん発作の処置に使用される、イオンチャネル不活性剤を含む広範な薬剤グループである。それらは、てんかん様活性及び興奮性を増大させる下流の変化をさらに抑制するのに有用でありうる。このことは慢性期間において疾病が進行する間、てんかん様活性のＮＫＣＣ１活性への依存性が低下する場合に、特に重要である。カルバマゼピン及びフェニトインは共に現在での第１選択肢の抗けいれん薬である。これらの薬は共にナトリウムチャネルの非活性化状態を安定させ、ニューロンを発火がより起り難い電位にし、そして他の作用も持ちうる。
【００２７】
ガバペンチンの作用の明確なメカニズムは未知であるが、その抗けいれん性作用は電圧ゲートのＮ型カルシウムイオンチャネルを含んでいると考えられている。バルプロ酸もまた電圧ゲートのナトリウムチャネル及びＴ型カルシウムチャネルを遮断する。このメカニズムがバルプロ酸を広範囲の抗けいれん剤にする。他の臨床的に使用される抗けいれん薬はレベチラセタム、ラモトリギン、プリミドン、及びフェルバメートであり、それらはカルバマゼピン及びフェニトインが効かなかった場合とくに有益である。有用でありうる他の抗けいれん薬は、臭化物（臭化カリウム）、カルバメート（フェルバメート）、カルボキサミド（カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、エスリカルバゼピンアセテート）、脂肪酸（バルプロエート−バルプロン酸、バルプロン酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム）、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、果糖誘導体（トピラマート）、ＧＡＢＡ誘導体（ガバペンチン、プレガパリン）、ヒダントイン（エトトイン、フェニトイン、メフェニトイン、ホスフェニトイン）、オキサゾリジンジオン（パラメタジオン、トリメタジオン、エタジオン）、プロピオネート（ベクラミド）、ピリミジンジオン（プリミドン）、ピロリジン（ブリバラセタム、レベチラセタム、セレトラセタム（ｓｅｌｅｔｒａｃｅｔａｍ））、コハク酸イミド（エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド）、スルホンアミド（アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド）、トリアジン（ラモトリギン）、尿素（フェネトライド、フェナセミド）、バルプロイルアミド（ｖａｌｐｒｏｙａｍｉｄｅｓ；バルプロエートのアミド誘導体），アミド（バルプロミド、バルノクタミド）である。
【００２８】
「ＴＬＥを誘発することが既知の発作」には、限定されないが、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、脳腫瘍、感染症、脊髄膜炎、血管形成異常を含む。
【００２９】
「ＮＫＣＣ１抑制剤」は限定されないが、ループ利尿薬（即ち、ヘンレループの厚い上行脚の中のＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−担体を抑制し、それによりナトリウム、カリウム及び塩素イオンの再吸収を抑制する利尿薬）を含む。有用なループ利尿薬は、トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、例えばそれらの塩及びエステルである。）他のＮＫＣＣ１抑制剤はＧＡＢＡ−Ｔ抑制薬を含む：３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン。
【００３０】
本明細書で使用される「患者」又は「被験者」とは、本発明に基づく組成物によるてんかん処置を含む処置が行われる動物、一般的には哺乳類、好適にはヒトを示す。これらのヒト患者のような特定の動物に特異的な感染症、容態、または疾病の状態の処置において、「患者」とはその特定の動物を示す。
本明細書で使用されているように、「処置」とは症状の進行の防止、速度の低減、遅延、抑止又は留保することを意味する。
ここで使用される「処置上効果的な量」とは、ＴＬＥを患い、又は発症するリスクのある患者の処置に十分なＮＫＣＣ１抑制剤（選択肢として、１つ以上のＧＡＢＡ調節組成物と組み合わせて）の量を意味する。例えば、効果的な量はＴＬＥ又は関連症候の発症又は進行を遅延させ、速度を遅くさせ、又は防止するのに十分な量を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「抑制的効果的濃度」又は「抑制的効果的量」とは、実質的に又は有意にＴＬＥ又は関連する症候を処置または防止する本発明に基づく組成物の濃度又は量を意味する。
本明細書で使用される「防止的効果的濃度」とは、ＴＬＥ又は関連する症候の発症を防止し可能性を低減するのに予防的に効果的な本発明に基づく組成物の濃度又は量を意味する。「抑制的効果的濃度」及び「防止的効果的濃度」は一般的に「効果的な量」の範疇に含まれる。
【００３２】
「被験者におけるＴＬＥの重症度を減ずる」とは、ある有益な程度までＴＬＥに付随する多くの症候のいくつかを抑制又は寛解することを意味する。例示の目的だけのために言えば、本発明の処置法は側頭葉の小さな領域に影響を及ぼし、そして意識には影響を与えない単純部分発作（ＳＰＳ）の悪影響を寛解又は低減する。これらは初期に感覚を引き起こす発作である。これらの感覚は記憶に関し、例えば、既視感（精通感）、未視感（未精通感）、特定の単一又は１組の記憶、又は記憶喪失である。感覚は実際には存在しない音、又は旋律のような聴覚性、或いは味のような味覚性、又は匂いのような嗅覚性でありうる。感覚はまた視覚的でありえ又は皮膚の感覚又は内臓の感覚でありうる。後者の感覚は体中を移動するようである。不快性又は多幸性感覚、恐怖、怒り、及び他の感情もまた単純部分発作（ＳＰＳ）の間起こり得る。多くの場合、ＴＬＥのＳＰＳを患う人は、感覚を記述するのが困難である。ＳＰＳは多くの場合「発作の前兆」と呼ばれ、更に激しい発作の前触れと考えられることもある。このような感覚は、本発明の方法を適用することにより軽減する。
【００３３】
他の事例では、複雑部分発作（ＣＰＳ）の重症度が本発明の方法を適用することにより軽減する。このような発作は意識をある程度障害し、通常はＳＰＳと共に発症し、その後側頭葉の大部分に拡がる。徴候は無動凝視、手及び口の自動的運動、他人への応答不能、異常発言、又は異常行動を含む。
更に他の事例では、本発明の方法は続発性全汎強直間代発作（ＳＧＴＣＳ）に付随する徴候の重症性を軽減する。これらは初期にはＳＰＳ又はＣＰＳで発症し、その後、腕、体幹、及び脚が曲がった位置又は伸ばした位置で硬化する。この後、脚と体幹の突然の粗いけいれんが起こる。
【００３４】
「同時投与」という言葉は２つ以上の活性化合物を、ＴＬＥ又はそれに関連する徴候を処置又は防止するのに有効な量だけ投与することを意味する。同時投与という言葉は、好適には２つ以上の活性化合物を患者に同時に投与することを意味するが、その化合物が正確に同時刻に投与される必要はなく、効果的な濃度が血液、血清、血漿又は肺組織内で同時に発見されるように化合物の量が患者又は被験者に投与されればよい。
「慢性的に投与される」又は「慢性投与」とは、一連の処置の中で、ＮＫＣＣ１抑制剤及び、選択肢として、ＧＡＢＡ調節組成物を、被験者の状態又は被験者から提示される徴候により変化するある期間内に、１回より多い回数投与することを意味する。
【００３５】
本発明の方法は、ＮＫＣＣ１抑制剤とＧＡＢＡ調節組成物が担体材料で組合わされる剤形を使用してもよい。剤形と投与経路は処置される被験者及びＴＬＥ又は関連徴候の状態により異なる。同じ観点から、本願の方法は、０．２５ミリグラム−１グラム、より好適には約１ミリグラム−約７５０ミリグラム、更に好適には、約１０ミリグラム−約５００から６００ミリグラムの間のＮＫＣＣ１抑制剤とＧＡＢＡ調節組成物を含む剤形の投与を必要とする。
特定の患者に対する特定の投薬及び投与計画は種々の要素により異なることを理解しなければならない。それら要素は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的健康、性別、食事制限、投薬の時間、排泄速度、薬の組合せ、及び処置担当医の判断、及び処置中の特定の疾病又は症状の重症度を含む。
【００３６】
活性化合物の投与は、連続性（静脈内持続点滴）から日に数回の経口投与（例えば、１日４回（Ｑ．Ｉ．Ｄ．））までの範囲が有り、また、投与の他の経路の中で、経口、外用、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（これには浸透促進剤を含んでもよい）、バッカル、及び座薬を含んでよい。腸溶性経口錠も化合物の経口投与経路からの生物学的利用能を高めるため使用可能である。最も効果的な剤様は、選択された特定の薬剤の薬物動態および患者の疾病の重症度に依存する。経口剤様は投与の容易性及び予期される患者の応諾から特に好適である。
本発明はさらに以下の実験的セクションで記述されるが、それは説明目的のためだけであり、限定するものではない。
【００３７】
（実験の部）
（材料及び方法）
（ＴＬＥ誘発）
全てのプロセスはニューメキシコ大学健康科学センターに所在の動物介護及び使用委員会により承認され、また全米健康局の実験動物のケア及び使用に関するガイドに従っている。本実験のプロトコルはアンドレ氏他による刊行物のプロトコル（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）を僅かに変更したものである。発作誘発の２４時間前に生後２−３カ月の雄のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットが皮下注射で等浸透圧のＮａＣｌ生理食塩水に溶解した３ｍｍｏｌ／ｋｇの塩化リチウムを投与された。
その後ピロカルピンが皮下注射（等浸透圧のＮａＣｌ内２５ｍｇ／Ｋｇ）で投与された。一度大脳辺縁系のけいれんが始まると、てんかん重積（ＳＥ）の発症を確認するため皮下針ＥＥＧ電極が配置される。てんかん重積は連続高振幅脳波（ＥＥＧ）スパイキングの発生として定義される（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他、１９８９）。このような針は２５ゲージの皮下注射針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から、ハブを切り取り、そして６０度曲げて形成され、それにより針は定位置に留まる。１本の針が頭皮に皮下挿入により頭頂皮質に挿入され、そして対照電極として機能する他の１本の針が肩甲骨に挿入された。グラスモデル８脳波計（アストロ−メド（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ）社、ウエストワーウィック、イリノイ州）を使用した脳波（ＥＥＧ）記録は、連続高振幅スパイキングをてんかん重積（ＳＥ）発症後１時間に亘って示し、それは頭蓋内に埋め込まれた電極での従前の研究で記録された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ氏他、２００５）正常な脳波に対し明確なコントラストを示した。その後記録は全体的に停止された。硫酸アトロピン（１０ｍｇ／Ｋｇ皮下注射）及びジアゼパム（４ｍｇ／Ｋｇ筋肉内注射）が生存率を上げ、不安を軽減させ、そして筋肉弛緩を誘発するため投与された。ジアゼパムの投与は、発作を停止出来なかったが、１時間以内に筋肉弛緩を誘発し、ラットは脚を使わず腹側面を下にして横になった。アトロピンも発作を停止出来なかった。てんかん重積（ＳＥ）発症後１２時間後に脳波が再び５−１０分間記録され、全てのラットは断続的又は全体に形成される、即ち脳波スパイキングのバーストを有した。この時点でスパイキングのバーストや連続するスパイキングの列のような全体的な脳波スパイキングを示したこれらのラット（ケースの約２０％）は、追加の２ｍｇ／Ｋｇのジアゼパム筋肉内注射を投与された。てんかん重積（ＳＥ）の発症後１２時間後にリンゲル溶液内の５％ブドウ糖が皮下注射で投与された。
【００３８】
このプロトコルはてんかん重積（ＳＥ）の発症後１時間後にジアゼパムを投与した点で、２時間後に投与したアンドレ（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）のプロトコルとは異なる。更に我々は末梢性ピロカルピンの影響（Ｄｕ氏他、１９９５）を軽減するため、アトロピンを投与した。従って我々のプロトコルはよりマイルドな発作を動物に提供すると信ずる。
【００３９】
アンドレ（Ａｎｄｒｅ）氏他のプロトコルは、信頼性を持って成体ラットの１００％にてんかんを誘発したと記載されている（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ｂ，Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。これは、僅かに高いピロカルピン投与量とリチウムを使用したこの研究所のそれより早期のプロトコルからも真実である（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ｂ，Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。我々のラボでアンドレ（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）のプロトコルを使用した研究では、全てのラットが２８．６±２．４３（標準誤差）日（ｎ＝１４；２４時間／１日の連続ビデオ録画、Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ氏、非公開結果）の潜伏期の後、ランク３，４又は５の自発性発作を発症した。１体のラットだけが１５日目に発作を起こした。２１日までには４体のラットが発作を起こした。
これらの潜伏期データを正規分布に適合させることにより、平均約２５％のラットがピロカルピン／２時間後ジアゼパム処置の３週間以内に最初の発作を起こすことが予期された。
しかし屠殺する前の観察及び取り扱い中にはラットに発作は見られなかった。
我々のマイルドなプロトコルのてんかんの転帰がてんかん重積（ＳＥ）後８−１６週間、１ラット当り合計３６時間までのビデオ録画をしながらテストされた。そして、この期間に１３体全てのラットに自発的発作が観察された。てんかん重積（ＳＥ）のラットの新しい２グループ（合計１２体）によって、我々は潜伏期期間が１２．７±１．７（平均±標準誤差）週間であると量定した。全体で２０３体のラットが使用された、リチウム対照ラット５６体、てんかん重積（ＳＥ）後２週間のラット４２体、ＳＥ後３週間のラット４７体、ビデオ録画用ＳＥ後ラット５８体。
【００４０】
（スライス準備）
全ての実験は、側頭葉新皮質、嗅内皮質、海馬台及び腹側海馬を含む鋭い形状の水平大脳スライス上で行われた。対照又は発作後２又は３週間のラットは深くケタミンとキシラジン（それぞれ８５と１５ｍｇ／ｍｌ）麻酔をかけられそして断頭された。大脳は迅速に移動され酸素負荷された（９５％酸素、５％炭酸ガス）氷冷の３ ＫＣＬ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ４、６ ＭｇＳＯ４、２６ ＮａＨＣＯ３、０．２ ＣａＣｌ２、１０ グルコース、２２０ ショ糖及び０．４３ ケタミンを含む（ｍＭで）切断溶液中に置いた。スライス（３５０ミクロン）は氷冷の切断溶液内でビブラトーム（Ｄｏｓａｋａ ＤＴＫ−１０００）を使用して薄切りにされ，そこからリカバリー用に９５％酸素／５％炭酸ガスで３４°Ｃで平衡化された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、ｍＭで：１２６ ＮａＣｌ，３ ＫＣｌ，１．２５ ＮａＨＰＯ４，１ ＭｇＳＯ４，２６ ＮａＨＣＯ３，２ ＣａＣｌ２及びグルコース）内に移された。１時間後ＡＣＳＦが取り替えられ、そして記録に使用されるまで室温で保管された。
【００４１】
（電気生理）
個々のスライスは固定台顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ社、ジュネーブ、ドイツ）に搭載された記録用チャンバに移され、そして暖められ（３４°Ｃ）、酸素負荷された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で２ｍｌ／分で灌流された。細胞内記録は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンから、低めの電極抵抗に対しては１Ｍ ＣｓＳＯ４又は０．５Ｍ酢酸カリウム／０．５Ｍ塩化カリウム、又は改良空間クランプ用には２Ｍ ＣｓＳＯ４／１Ｍ塩化カリウムを充填された、ホウケイ酸ガラスの鋭い微小電極（８０−１５０ＭΩ）を使用してなされた。Ｃｌ−輸送遮断剤がない場合は、全ての細胞内液はＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位に対して同一の結果を示し、逆転電位は従って蓄積された（Ｍｉｓｇｅｌｄ氏他、１９８６参照）。ブメタニドによるＣｌ−輸送遮断の間、０．５Ｍ酢酸カリウム／０．５Ｍ塩化カリウムを充填された微小電極がＥＩＰＳＰを脱分極方向に約２０ｍＶだけ変移させるのが確認された。従ってＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位に対するブメタニドの影響に関する全ての最終的な記録／データは、１Ｍ Ｋ２ＳＯ４又は２Ｍ ＣｓＳＯ４／１Ｍ塩化カリウムで充填された微小電極で得られた。
【００４２】
ニューロンは、皮質の厚さの１／４まで、ナノステッパー微小位置決め装置（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、オッペンハイム、ドイツ）を使用して、内側嗅内皮質内のアンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）のすぐ上に刺入された。記録はＡｘｏｃｌａｍｐ２Ｂアンプを使用して記録され、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ユニオンシティ、カリフォルニア）を使用してデジタル化し記録された。マイナス６８ｍＶまでの静止膜電位（ＲＭＰ）が負のニューロンが、マイナス８５ｍＶまでの過分極パルスを使用して、錐体ニューロンを示唆するＩｈの存在をテストされた（Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００２；Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００３）。この基準では記録されたニューロンの７５％は錐体であり、残りは多極ニューロンと推定された。Ｈａｍａｍ氏他の研究では鋭い電極を第５層に刺入されたニューロンの８５％が錐体ニューロンに典型的な顕著な長い先端樹状突起を示した（Ｈａｍａｍ氏他、２０００）。我々の研究と対照的にこの研究は非錐体ニューロンにもＩｈの存在を報告した（Ｈａｍａｍ氏他、２０００）。同心性２極刺激電極（直径２００ミクロン、ＨＦＣ Ｉｎｃ．社製、メイン州、米国）が嗅内皮質（ＥＣ）の第５層に、記録用電極から約１５０−２５０ミクロンの距離に配置された。刺激（７０−１００μ秒、１００−８００ｎＡ）は刺激分離ユニット（Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｉ、エルサレム、イスラエル）に接続されたマスター８プログラム可能パルス発生機により制御された。興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）及び抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）に対する全入力−出力関係が記録され、そして７０−９０％の最大応答を与える刺激強度が使用された。そこでは計測された刺激強度が最大応答の５−１０％を誘発するまで減少した。
【００４３】
図２ＡはＧＡＢＡＡ受容体−媒介シナプス後電位の逆転電位を測定するのに使用されるプロトコルを示す。単シナプス性のシナプス後電位（ＰＳＰ）がグルタミン酸受容体遮断剤ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）の存在下で誘発された。刺激強度は最大誘起シナプス後電位（ＰＳＰ）振幅の約８０％となるように調整された。電場刺激に先だって、膜電位（Ｖｍ）は正又は負の直流（ＤＣ）パルス（５００ｍｓ、４００ｐＡ以上）で変化された。膜電位が安定に達した後、シナプス後電位（ＰＳＰ）が誘起された（図中＊印）。安定膜電位（図２Ｂ、○印）とシナプス後電位（ＰＳＰ）のピーク電圧（図２Ｂ、×印）の両方の電流−電圧関係がプロットされ、そして線形回帰がシグマプロットを使用して計算され、直接、膜電気伝導度の値を与えた。直線的な膜動作の可能性領域内で電流−電圧関係を測定することにより、遅延整流の電圧依存活性化又は他の整流電流に起因する接線コンダクタンスの誤りを避けることができる。逆転電位は回帰直線の交点により決定された。典型的なシナプス後電位（ＰＳＰ）トレースが対照と３週目の実験動物で示される。ＣＮＱＸ、ＤＬ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸、ピクロトキシン、ブメタニド、ピロカルピン及びアトロピンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社（セントルイス、ミズーリ州）より入手した。ジアゼパムはＨｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．（レイクフォーレスト、イリノイ州）から入手した。１０００倍に濃縮された原液はフリーザーに保管され、ＡＣＳＦで使用する前に希釈された。原液に関しては、ＣＮＱＸとピクロトキシンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解され、ブメタニドはエタノールに溶解された。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１：１０００）もエタノール（１：１０００）もシナプス後電位（ＰＳＰ）、電流−電圧関係、又はバースト応答に影響を与えなかった。
【００４４】
（免疫ブロッティング）
免疫ブロッティング研究のため、内側嗅内皮質（ＥＣ）の第５−６層が３５０ミクロンの厚さの切片から切り裂かれ、ドライアイス上でスナップ冷凍され、そしてマイナス８０℃で処理まで保管された。膜断片の準備のため、組織は２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ抑制剤（ｐＨ７．２）を含む緩衝液内で均質化され、その後、前記のように（Ｐａｙｎｅ氏他、１９９６）分画遠心分離された。精製された膜断片（５０μｇ）はその後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７％）及び抗ＫＣＣ２（１：１０００；ニューロマブ（ＮｅｕｒｏＭａｂ）クローン Ｎ１／１２、ＵＣデービス）と抗アクチン（１：５００；シグマ（Ｓｉｇｍａ））をそれぞれ使用した免疫ブロッティング用に処理された。
抗原−抗体複合体が、増大した化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、アーリントンハイツ、イリノイ州からのＥＣＬ−プラス）から検知され、Ｘ線フィルムはＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。
【００４５】
（蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ））
ＦＩＳＨ用に大脳スライスを準備する場合、１つの大脳の半球がドライアイス／エタノールスラリー内で平衡化されたイソペンタンのビーカー内で急速冷凍され、そしてマイナス８０℃で保存された。水平脳部位（１６ミクロン）がクリオスタットを使用して準備され、スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，ＶＷＲ）上に配置され，空気乾燥され、処理までマイナス８０℃で冷凍保存された。
【００４６】
ＮＫＣＣ１（クローンＩＤ４８２４５５６、アクセス番号ＢＣ０３３００３）及びＫＣＣ２（クローンＩＤ６８３８８８０、アクセス番号ＢＣ０５４８０８）プラスミドはオープンバイオシステム（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社（ハンツビル、アラバマ州）から入手した。ＮＫＣＣ１ｃＤＮＡシークエンスは、Ｓａｌｌ／ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位間のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲベクターに挿入された。ＫＣＣ２ｃＤＮＡシークエンスは、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位間のｐＹＸ−Ａｓｃベクターに挿入された。プラスミドはその後ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２シークエンスを確認するため配列決定された（ＤＮＡリサーチサービス、ニューメキシコ大学、健康科学センター）。ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩは共に異なる長さのアンチセンス鎖を生成するのに使用され、ＫｐｎＩはセンス鎖を生成するのに使用された（ニューイングランド バイオラボ社、Ｉｐｓｗｉｃｈ，マサチューセッツ州）。ＫＣＣ２のアンチセンス鎖はＡｓｃＩを使用し、センス鎖はＰａｃＩを使用して生成された。制限消化反応は３７℃で２時間インキュベートされた。
【００４７】
ＮＫＣＣ１ａ，ｂ及びＫＣＣ２ａ，ｂに対する単一標識化ＦＩＳＨが前述（Ｇｕｚｏｗｓｋｉ氏他、１９９９）のように実行された。概要は、ジゴキシゲニン標識化ＫＣＣ２及びＮＫＣＣ１全長アンチセンスリボプローブが、直線化されたｃＤＮＡから商業的に入手可能な転写キット（Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔ，アンビオン、オースチン、テキサス州）を使用して生成され、そして事前混合されたＲＮＡジゴキシゲニンがＴ３重合酵素（ロシェ分子生化学、パルアルト、カリフォルニア州）を使用してヌクレオチドを標識化した。ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２のジゴキシゲニン標識化リボプローブのハイブリダイゼーションは共に５６℃で一晩かけて異なるスライド（１ｎｇ／μｌ）上で行われた。その後、抗ジゴキシゲニン セイヨウワサビ過酸化酵素複合体（ＨＲＰ；１：２００；ロシェ分子生化学、パルアルト、カリフォルニア州）が４℃で一晩インキュベートされた。ＴＳＡ−シアニン−３（Ｃｙ３）（１：５０；パーキンエルマー、Ｗａｌｔｈａｍ， マサチューセッツ州）がＨＲＰ複合体を検知するのに使用された。核は、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）によって対比染色された。画像は、スピンニングディスク共焦点システム（スピンニングディスク共焦点画像化装置ＣＡＲＶ、Ａｔｔｏ生科学、ロックビル、メリーランド州）及びＣｏｏlＳＮＡＰ−Ｈｑ ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ科学、ツーソン、アリゾナ州）を備えるニコンＴＥ２０００Ｕ落射蛍光顕微鏡（２０倍対物）により獲得された。画像はＭｅｔａＭｏｒｐｈソストウェア（ユニバーサル画像）を使用して更に分析され、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。信号は背景（画像内の明確にネガティブな領域をカバーする注目画像領域（ＲＯＩ）で得られた）に対して補正され、核染色に対する比率が計算された。ここにおいてこれらのデータは対照ラットに関して正規化されていた。
【００４８】
（免疫組織化学的検査）
スライスは１００ｍＭリン酸緩衝食塩水内の４％パラホルムアルデヒドで一晩固定化され、ＰＢＳ内の１５％及び３０％ショ糖で凍結保護され、その後最適切断温度（ＯＣＴ）化合物（サクラファインテック、トーランス、カリフォルニア州）内で凍結された。
免疫組織化学的検査が室温で２４時間かけて３００ミクロン浮遊部位上で、抗ＫＣＣ２（ニューロマブ（ＮｅｕｒｏＭａｂ）クローン Ｎ１／１２、ＵＣデービス））又はＮＫＣＣ１抗体（ラビットポリクローナル、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州；結果はカリフォルニア大学リバーサイド校のＣ．Ｌｙｔｌｅ博士から提供されたマウスＮＫＣＣモノクローナル抗体ＭＡｂＴ４で得られた結果と合致した）で実施された。スライスはガラススライド上に搭載され、画像がＢｉｏｒａｄ二光子顕微鏡とスライス表面下７５ミクロンに配置された４０倍対物レンズにより撮像された。ニューロトレース蛍光染色（モレキュラープローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）がクリトスタットを使用して調製された６０ミクロン区画内のニューロンを対抗染色するのに使用され、そして画像はＣＣＤカメラと４０倍対物レンズを備える落射蛍光顕微鏡で撮像された。ＮＫＣＣ１抗体での免疫染色のため、組織区画は遮断前に１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び８％２−メルカプトエタノールで５分間前処理された（Ｓｕｎｇ氏他、２０００）。この前処理を伴わない多くの試みにおいて、ＭＡｂＴ４抗体で明確なＮＫＣＣ信号を獲得するのに失敗した。全ての区画はＰＢＳ−Ｔ（０．２％トリトン−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））内の１０％正常ヤギ血清で遮断され、一晩４℃でそれぞれの１次抗体（１：２００）と共にインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔで広範に洗浄した後、組織区画はＣｙ３接合ヤギ抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ（１：２００、ジャクソン免疫研究所、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）内でインキュベートされた。対照は１次抗体の無い同一の処理を受け、そして常にネガティブであった。区画は広範にＰＢＳ−Ｔ内で洗浄され、観察のためカバーグラスを付けられた。細胞核の対抗染色にはヘキスト３３３４２ＤＮＡ染色（１０ミクロン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）が使用された。
【００４９】
（統計）
平均±標準誤差が別途指定されない限り示される。データのグループ間の統計的比較はシグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）ソフトウェアで、必要に応じ独立又は対応のある両側スチューデントのt−検定が帰無仮説を検証するため実行された。０．０５未満の確率値Ｐは統計的に有意であると見做された。
【００５０】
（実施例１）
（てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンにおける多シナプス性バースト応答の発生）
対照ラットからの切片において、嗅内皮質（ＥＣ）第５層に対する単一のシナプス前性の刺激が静止膜電位−７０ｍＶにおいて振幅２０ｍＶまでの単シナプス性の急速な興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を第５層ニューロンに誘発し（図１Ａ）、その後、膜保持電位により振幅が異なる急速な抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）を誘発する。対照的に、てんかん重積（ＳＥ）後３週間後の記録では、刺激強度を対照調製より大きく減少させた場合でも単一シナプス性刺激に応答して多シナプス性てんかん活性を示した。（図１Ｂ）多シナプス性バースト応答は、より高い脱分極電位への活動電位の発火の場合を除いて、ＤＣ注入による−９５ｍＶから−６０ｍＶまでの範囲のシナプス後性膜電位の変化によっては殆ど変化を示さなかった。示された実施例では、弱い刺激での多シナプス性脱分極の僅かな遅れが、初期興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を明白に顕在化させ；そして振幅で僅か１−２ｍＶとして見える。（挿入図、細胞は負のＤＣにより発火を防ぐため過分極されている。これらの弱い刺激は、高信頼度で多シナプス性バースト応答を、２週目でテストされた１０．８％のニューロン（ｎ＝３７）で，そして３週目でテストされた６１．８％のニューロン（ｎ＝３４）で誘発した（図１Ｃ）。この量定のため、多シナプス性バーストは、−７５ｍＶ<ＲＭＰ<−６８ｍＶから誘発され、半振幅で１５０ｍｓ以上継続するシナプス後性応答として定義された。対照切片では、このような応答は４２の記録されたニューロンの内で１つにおいてのみ観察された。
【００５１】
図１およびその図に反映されているデータを獲得した実験のさらなる詳細は以下の通りである。
（図１：てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの増大した多シナプス性バースト興奮）
Ａ：無処置ラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの単一シナプス前性刺激（＊，５００ｎＡ，７０μＳ）に対するシナプス後性応答。
Ｂ：てんかん重積（ＳＥ）３週間後の第５層ニューロンのはるかに小さい刺激（＊，１００ｎＡ，７０μＳ、図１０及び１１も参照）に対する多シナプス性バースト応答。初期に誘起されたシナプス後電位（ボックス内に示す）は、拡大挿入図（３０ｍｓＸ５ｍＶ）に示される。この記録に対しては、細胞は発火を防ぐため負のＤＣにより過分極されている。
Ｃ：単一の刺激に多シナプス性脱分極で応答する嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの比率を示す棒グラフである。単一の刺激は対照ラットから（ｎ＝４２）の嗅内皮質（ＥＣ）第５層細胞の内の僅か２．４％でしか多シナプス性応答を誘起しないが、てんかん重積（ＳＥ）後２週間後（ｎ＝３７）及び３週間後（ｎ＝３４）のラットではそれぞれ１０．８％と６１．８％の細胞が多シナプス性応答を誘起した。
【００５２】
（実施例２）
（てんかん重積（ＳＥ）後、ＧＡＢＡＡ作動性のシナプス後電位（ＰＳＰ）が脱分極化する）
長期に渡って確立されたＴＬＥを有する海馬台ニューロン亜集団におけるＥＩＰＳＰ及びＣｌ−輸送体システムの重要な変化の現存する観察（Ｃｏｈｅｎ氏他、２００２；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６；Ｐａｌｍａ氏他，２００６；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄ氏他，２００７；Ｍｕｎｏｚ氏他，２００７；Ｓｅｎ氏他、２００７）に依存して、我々は、バースト活性を促進する可能性のある、極めて初期の対象段階におけるＧＡＢＡ作動性伝達の継続的変化を探した。図２Ａは、ＣＮＱＸ（１０μＭ）とＡＰＶ（５０μＭ）によるグルタミン酸塩受容体の遮断の間の単シナプス性ＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）を示し、そのＰＳＰは電場刺激により嗅内皮質（ＥＣ）第５層に誘発され、一方細胞は異なる安定膜電位に保持された（前記（材料及び方法）参照）。ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））は、安定膜電位（図２Ｂの○）及びＰＳＰのピーク電圧（図２Ｂの×）の両方の電流−電圧関係をプロットし、線形回帰を計算することにより決定された。膜電位とＰＳＰ線形回帰との交点が逆転電位である（図２Ｂ、矢印）。対照ラットとＳＥ後２週目と３週目のラットからの代表的ニューロンの電流−電圧プロットは、ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））の進行性変移を示し、それらはそれぞれ、対照の−６８．３±２．１ｍＶから、ＳＥ後２週目の−５２．６±１．８ｍＶ、ＳＥ後３週目の−３４．８±１．４ｍＶであった（図２Ｂ１−Ｂ３）。データがヒストグラムで示された場合、ＳＥ後２週目と３週目の両方で、処置ラットからのスライス内に２つの細胞クラスが観察された（図２Ｃ、ｎ＝８４）。１つのクラスでは平均ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））は対照と類似していた、即ち静止膜電位（ＲＭＰ）に対し５ｍＶ未満ポジティブであった（２週目と３週目に分析した細胞全体のそれぞれ２３．５％及び１９．２％）。もう１つのクラスは強い変移を示した（２週目と３週目に分析した細胞全体のそれぞれ７６．５％及び８０．８％）。両方の細胞クラスは同一のラットからの複数のスライス内だけでなく、単一のスライス内にも観察された。ＳＥ後３週間で約２５％と推定された（前記（方法）参照）屠殺前自発発作は、これらのラットからのニューロンのＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））をさらに変移させ、これによりさらに強く変位したＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））を有する亜集団を確立する可能性が有った。ヒストグラムは、このような顕著なニューロン亜集団のサインを全く示さず、そのことは、自発的発作が全く起らなかったか、あるいはそれがＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））の更なる変移を引き起こさなかったかを示唆した。
【００５３】
集団データの棒グラフ（図２Ｄ）は、変化が起こらなかった集団の部分を除外した、ＰＳＰ逆転電位の平均値の時間経過変移をまとめたものである（Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７１．９±１．４６ｍＶに対し３．６±０．５ｍＶポジティブ、ｎ＝２４；ＳＥ後２週目Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７０．９±２．８ｍＶに対し１８．０±３．６ｍＶポジティブ、ｔ５６＝８．３、Ｐ＝０．００６、ｎ＝２６；ＳＥ後３週目Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７２．９±２．８ｍＶに対し４５．１±６．２ｍＶポジティブ、ｔ４８＝９．８１、Ｐ＝０．０００８、ｎ＝２１）。３週目の測定点において、変移集団及び非変移集団のそれぞれ８１％と７５％が錐体ニューロンであり、それぞれ１９％と２５％が多極性ニューロンであった。これらの分布は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層のこれら２つの細胞タイプの全体分布から有意に差異がなかった（Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００２；Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００３）。３週目のポジティブな変移がＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））をスパイク開始のレベルにごく近い値に持ってゆくことは注目すべきである。従って、てんかん重積（ＳＥ）後のＧＡＢＡ放出は反復性発火を効果的に制限しない可能性が有り、逆にニューロンを興奮させる可能性がある。
【００５４】
対照ニューロン内の僅かに脱分極した静止膜電位に対する抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）は、明らかにＣｌ−の外向き輸送だけが発現する状態に対して不可解に見えるかもしれない（以下参照）。Ｃｌ−の逆転電位は静止膜電位にたいしネガティブ（又はＣｌ−の外向き輸送がＣｌ−の流入の後にのみ活性になった場合、静止膜電位と等しい）でなければならない。しかし、ＧＡＢＡＡチャネルは炭酸水素イオンをある程度、陰イオンの約１／６、伝導し、ＧＡＢＡ−ＰＳＰ逆転電位をＥＣｌ−とＥＨＣＯ３−との間に置く（Ｂｏｒｍａｎｎ氏他，１９８７）。細胞内エネルギー代謝は２酸化炭素を生成し、それは炭酸脱水酵素により触媒されて水と逆反応し、炭酸水素イオンを生成する。このプロセスは強い外向きの傾斜をＨＣＯ３−に与え、逆転電位を−１０ｍＶにまでポジティブ側にする（Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他，２００７）。このことは正常な動物ではシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位をＥＣｌ−よりポジティブな値に変移させる（Ｓｔａｌｅｙ氏他，１９９５）。また，Ｃｌ−の内側輸送の限定的出現は、僅かに脱分極したシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位を生成可能である（以下参照）。
【００５５】
逆転電位の変移に加えて、膜接線コンダクタンス、およびコンダクタンスが、シナプス後電位（ＰＳＰ）がてんかん重積（ＳＥ）後に進行的に減少する間、増加する（図２Ｂ１−Ｂ３参照）。静止コンダクタンスは、対照での５．９±０．７ｎＳから、てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間でそれぞれ４．８±０．７（ｔ１２＝３．６６、Ｐ＝０．０３２）と３．６±０．４ｎＳ（ｔ１３＝３．７９、Ｐ＝０．０２６）に減少した。これは恐らく漏出イオンチャネルの劣化による（Ｂｅｒｎａｒｄ氏他，２００４；Ｂｏｒｔｅｒ氏他，２００６）。同様に、ＧＡＢＡ活性化ピークコンダクタンスは、対照での８．５±０．６９ｎＳから、てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間でそれぞれ２．１±０．４３（ｔ１２＝１３．１２、Ｐ＝０．００１８）と０．２４±０．０７ｎＳ（ｔ１３＝６．１６、Ｐ＝０．０００５）に減少した。この減少は、１００Ｈｚで３度繰り返された、入出力関係の最大値に近い刺激強度により誘発された、大きなＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）により確認され、それは、３度目の刺激後、３グループ全てに大きな非撹乱ＰＳＰを与えた。
【００５６】
図２、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図２．てんかん重積（ＳＥ）後２週間後と３週間後のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位のポジティブ変移）
図２Ａ：対照（上側の軌跡）とてんかん重積（ＳＥ）後３週間後のラット（下側の軌跡）からの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のニューロンの、鋭い微小電極により記録された、５つの異なる膜電位において誘起された、単一シナプス性ＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位。膜電位は微小電極からの電流の印加（５００ｍ秒パルス）により変化した。＊（アスタリスク）はシナプス前性刺激の時点を示す。記録は、ＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸受容体拮抗薬ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＮメチルＤアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗薬ＡＰＶ（５０μＭ）の存在下で行なわれた。
図２Ｂ１−２Ｂ３：刺激前性膜電位（図内の○印）及び刺激後１５ｍ秒後に測定されたＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）の絶対値（図中×印）と電極電流との電流―電圧関係。データは図２Ａのプロトコルを使用して獲得され、線形回帰で適合された。膜電位とＰＳＰプロットとの交叉はＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ，矢印）で起こる。
図２Ｃ：測定３時点で２ｍＶ未満のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位を示す嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のニューロンの数のヒストグラム。包絡線（点線の曲線）は５つの明白な集団のガウス適合である。対照ラットからのニューロンでは、ＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ）ガウス適合は中央値約−６９ｍＶを有した。てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間後のラットからのニューロンは、非変移と有意の変移の２つのクラスに分かれた。２週間目には７７％のニューロンが約−５４ｍＶ、３週間目には８１％のニューロンが約−２８ｍＶの変移した平均値を示した。非変移ニューロンは集団のそれぞれ２３％と１９％を占めた。それらのＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ）分布は対照グループから識別可能であった。対照、ＳＥ後２週間後、３週間後の記録された細胞数Ｎはそれぞれ、２４，３４及び２６であった。
図２Ｄ：ＳＥ後２週間後（ｎ＝２６）、３週間後（ｎ＝２１）の変移集団の静止膜電位（ＲＭＰ）に対するＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位（ＥＰＳＰ）の平均値±標準誤差は、対照と比較して逆転電位の進行性脱分極変移を示す（ｎ＝２４，ＳＥ後２週間後（＊＊）ｐ０．０１未満、ＳＥ後３週間後（＊＊＊）ｐ０．００１未満）。
【００５７】
（実施例３）
（てんかん重積（ＳＥ）後ＮＫＣＣ１ｍＲＮＡの増加）
てんかん重積（ＳＥ）後強く脱分極するＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）は、活性Ｃｌ−内側方向輸送を必要とする。しかし成体ニューロンには殆どＮＫＣＣ１の発現がないことが知られている（Ｄｅｌｐｉｒｅ，２０００；Ｗａｎｇ氏他，２００２）。我々は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内の成人ニューロンで、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ発現が、初期の発症段階を再現して、てんかん重積（ＳＥ）後の潜伏期に再確立されるか否かを検証した（山田氏他、２００４；Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他，２００７）。我々は、従前の研究と適合して、対照ラットの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ蛍光発光が非常に低いか存在しないことを発見した。対照的に、リチウム−ピロカルピン誘発てんかん重積（ＳＥ）後、２週間後、特に３週間後では、明瞭なＮＫＣＣ１染色を確認した（図３Ｂ）。てんかん重積（ＳＥ）後、２週間後では、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ蛍光発光が対照の２３７±３３．４％に増大し、３週間後では４５２±３３．５％に増大した（図３Ｂ、Ｅ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、前記（方法）参照、各グループ４ラット、それぞれｔ３８＝２．１５、Ｐ＝０．０３７及びｔ４９＝３．５４、Ｐ＝０．０００９）。これらのパーセントは、対照における発現が低いことを前提にすると、幾分任意であるが、発現の非常に大きな増加を示している。ＤＡＰＩによる核の対抗染色は、分析期間中には細胞数に変化を与えなかった（対照、ＳＥ後２週間後及び３週間後のそれぞれにおいて、１２．２±２．７，１２．８±３．４及び１２．５±３．１細胞核数／５００平方ミクロン、それぞれｔ６８＝−０．４９，Ｐ＝０．６２及びｔ６８＝−２．３８，Ｐ＝０．２４、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット；図３Ａ２、Ｂ２）。ＤＡＰI及びＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡの画像の重なりは標識化ｍＲＮＡの初期の核周囲の位置を示す（図３Ｂ２）。ＮＫＣＣ１ポジティブ細胞と場内の全細胞との比較分析では、対照組織では細胞の５．１±２．１％の標識化に対して、ＳＥ後２週間後及び３週間後のそれぞれにおいては２８．５±６．７％及び５６．７±４．３％を示した（図３Ｄ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ３８＝３．２７，Ｐ＝０．０４２及びｔ４９＝２．７１，Ｐ＝０．００９６）。
【００５８】
図３、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図３．てんかん重積（ＳＥ）後嗅内皮質（ＥＣ）第５層内において進行的に増大する、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ、Ｃｌ−内側方向輸送）
図３Ａ、Ｂ：蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）は、ピロカルピン誘発発作の３週間後にＮＫＣＣ１のｍＲＮＡが対照（赤い信号、Ａ１，Ｂ１）に比較して発現量の増大を示した。ＤＡＰＩ核染色は細胞数に変化の無いことを示した（青の信号、図３Ａ２、図３Ｂ２）。下方パネルＡ３、Ｂ３は図３Ａ１，２及び図３Ｂ１，２で概観された領域の拡大統合図であり、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの核周辺配置を示す。
図３Ｃ：てんかん重積（ＳＥ）後のＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの増加を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）内の全ＮＫＣＣ１信号に対する核染色の蛍光の比率を生成することにより定量化された。これらの比率はその後、対照ラットからの値に対して正規化された（平均値±標準誤差、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、ＳＥ後２週間後（＊）ｐ０．０１未満、ＳＥ後３週間後（＊＊＊）ｐ０．００１未満）。
図３Ｄ：ＤＡＰＩ染色により決定される、核の数に対する％として表現される、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ−ポジティブの細胞数の平均値（平均値±標準誤差、ｎ＝約３００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、ＳＥ後２週間後（＊）ｐ０．０５未満、ＳＥ後３週間後（＊＊）ｐ０．０１未満）。
【００５９】
（実施例４）
（ＮＫＣＣ１タンパク質の増加）
潜伏期間中に起こったＮＫＣＣ１のタンパク質レベルの変化を分析するため、蛍光免疫組織化学的検査を実施した。これらのデータはケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社ＮＫＣＣ１抗体によって得られ、そして図４に示すように、ＳＥ後２−３週間において、ＮＫＣＣ１タンパク質の進行的増加を示した。一方対照ラットからのスライスでは、特定の信号はほとんど得られなかった（図４Ａ−４Ｃ）。同様の結果がＭａｂＴ４ ＮＫＣＣ抗体で得られた。ＮＫＣＣ１画像の上に染色核画像（ヘキスト３３３４２）を重ね合わせることにより、特にＳＥ後３週間後において、ＮＫＣＣ１の優先的な核周囲の、そして細胞体性の位置が明らかにされ、ニューロン性タンパク質合成の有意の増加を示唆した（図４Ｂ３、４Ｃ３及び拡大された図４Ｂ４,４Ｃ４）。繰り返すが、ヘキストで染色された核の数は３つのラットグループの間で有意の差異を示さなかった（対照８５．３±５．３に対し、発作後２週間後は９７．７±３．４、発作後３週間後は８６．０±４．９、４ラット、それぞれｔ２０＝−１．３３，Ｐ＝０．２０及びｔ１８＝−２．３５，Ｐ＝０．８１、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット）。図４Ｄは細胞体からのＮＫＣＣ１の蛍光強度の平均値は、発作後２週間後及び３週間後に対照の背景蛍光の約３５０％及び８６０％であったことを示す（ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ６４＝５．３２，Ｐ＝０．０００６及びｔ５１＝４．５６，Ｐ＝０．０００８）。神経線維網ではＮＫＣＣ１の平均蛍光強度は、発作後２週間後及び３週間後に対照の背景蛍光のそれぞれ１２３±２１％及び２２２±４５％であった、その結果は樹状突起内においてＮＫＣＣ１タンパク質が遅延して増加することを示唆した（ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ３２＝４．２５，Ｐ＝０．０２５及びｔ３６＝５．３１，Ｐ＝０．００８）。個々の細胞に関しては、ＳＥ後２週間後と３週間後で、それぞれ細胞体の３１．２±６．９％及び５６．３±１１．２％が明確にＮＫＣＣ１に対しポジティブであったが、対照では明確なものは無かった（図４Ｅ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ４２＝１１．２４，Ｐ＝０．０００９及びｔ３７＝７．１２，Ｐ＝０．０００７）。
【００６０】
図５ではニューロン特異ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）対抗染色が使用され、発作後３週間後には７７．１±８．１％のニューロンがＮＫＣＣ１ポジティブになったことを示した（対照組織：３．０±１．３％、各グループｎ＝３ラット、それぞれｔ２１＝３．７８，Ｐ＝０．００８及びｔ３３＝４．２３，Ｐ＝０．００１）。ＮＫＣＣ１ポジティブのニューロンの比率がＮＫＣＣ１ポジティブの細胞の比率より高いことが、ＮＫＣＣ１がニューロンにおいて増大していることを示した。ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）ポジティブな細胞数は実験期間中安定し、（対照の３５．４±７．２に対し、発作後２週間後は３７．１±６．４及び３週間後は３６．６±６．７、各グループ３ラット、それぞれｔ１２＝−０．５１，Ｐ＝０．６及びｔ１６＝−０．３０，Ｐ＝０．８）、それは安定的なＨ３３３４２細胞数がニューロン損出とグリア細胞の増大との相殺の結果ではないことを示唆した。ＮＫＣＣ１発現及びポジティブニューロン比率の漸増は、ＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の同時発生的進行性脱分極変移を説明するのによく適合した。
【００６１】
図４，５、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図４．ＮＫＣＣ１タンパク質も増加した。）
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ：蛍光免疫組織化学的検査は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後２−３週間に、ＮＫＣＣ１タンパク質の発現の進行的増加を示した（赤色信号、Ａ１，Ｂ１，Ｃ１）。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２核対抗染色は安定的細胞数を示した（Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，緑色信号）。上記パネルセットの統合図（Ａ３,Ｂ３，Ｃ３）は発現の拡散的増加を示す。これらパネルのボックスに囲まれた領域は、ＮＫＣＣ１の核周辺及び細胞体系の位置をより明示するため、拡大されて下の図に示される（Ａ４，Ｂ４，Ｃ４）。
図４Ｄ：ＳＥ後のＮＫＣＣ１タンパク質の増加を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）におけるＮＫＣＣ１信号合計に対する核染色の蛍光合計の比率を形成して定量化された。その後これらの比率は対照ラットからの値で正規化された（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
図４Ｅ：核数の％で表示されるＮＫＣＣ１ポジティブ細胞の平均数（Ｈ３３３４２、平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後及び３週間後（＊＊＊）ではｐは０．０１未満）。
【００６２】
（図５．ＳＥ後、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンがＮＫＣＣ１タンパク質の発現を増加）
図５Ａ、Ｂ：蛍光免疫組織化学的検査は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後３週間に、ＮＫＣＣ１タンパク質の強い発現を示した（赤色信号、Ａ１，Ｂ１）。ニューロン特異ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）対抗染色は安定的細胞数を示した（Ａ２，Ｂ２，緑色信号）。統合図はＮＫＣＣ１の核周辺及び細胞体系の位置を示す（Ａ３,Ｂ３）。ここでは厚さ６０ミクロンの組織ブロック中のニューロンが示される。
図５Ｃ：ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）に対する％で示されるＮＫＣＣ１ポジティブニューロンの平均値であり、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてピロカルピン誘発ＳＥ後２週間後及び３週間後に進行的に増加している（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．０１未満）。
【００６３】
（ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの進行的減少）
示されたＮＫＣＣ１の増加は活性Ｃｌ−の摂取を示唆する。ニューロンのＫＣｌ共輸送体ＫＣＣ２による正常型のＣｌ−の放出（Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他、２００７）は、このＣｌ−の摂取と対抗し、そして大なり小なりＣｌ−の摂取を妨げる。もしＫＣＣ２出現が維持されれば、それはＣｌ−の摂取の効率を限定し、そして代謝エネルギーを浪費する。これが事実であることを検証するため、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現を研究した。
【００６４】
上記のように、我々は嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを蛍光遺伝子プローブ法により評価した。図６はＫＣＣ２ ｍＲＮＡが対照動物（Ａ１）において多量に発現し、一方ＳＥ３週間後（Ｂ１）には減少することを示す。核のＤＡＰＩによる染色は３時点の間に有意の差異を示さなかった。（１１．９±２．９，１±２．３３．８及び１２．１±３．２核数／５００μｍ２、それぞれｔ２４＝−０．３６，Ｐ＝０．１７及びｔ２４＝−０．４１，Ｐ＝０．２４、図６Ａ２、６Ｂ２）。統合蛍光画像（図６Ａ３、６Ｂ３）は、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡが核内及び核周辺領域内に配置されることを示した。
【００６５】
対照に対し正規化されたＫＣＣ２ ｍＲＮＡの蛍光は、ＳＥ後２週間後及び３週間後においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡ発現がそれぞれ対照の８１±８．３及び４４±７．８％に進行的に減少することを示した（図６Ｃ、ｎは約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、（方法）参照、各グループ４ラット、それぞれｔ６２＝１．９５，Ｐ＝０．００８及びｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）。同様に、核数に対する嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のＫＣＣ２ ｍＲＮＡを発現する（図６Ａ３、６Ｂ３に示すように核の周りの少なくとも２つの赤色の点）細胞数の比率は、対照動物の嗅内皮質（ＥＣ）第５層内における全細胞数の６３．９±８．５％から、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ４７．３±６．７及び３６．３±４．３％に減少した（図６Ｄ、平均値±標準誤差、ｎは約３００細胞、各グループ４ラット、それぞれｔ３４＝３．１４，Ｐ＝０．０４５及びｔ２８＝４．２１，Ｐ＝０．００７）。
【００６６】
図６、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図６．ＫＣＣ２に対するｍＲＮＡ，ニューロンのＣｌ−の外向き輸送体は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後進行的に減少する、Ａ、Ｂ）
蛍光遺伝子プローブ法で検知されたＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現は、対照と比較してピロカルピン誘発ＳＥ後３週間後においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの減少を示した（Ａ１、Ｂ１、赤信号）。ＤＡＰＩ核染色は細胞数が変わらないことを示唆した（Ａ２,Ｂ２，青色信号）。図Ａ１，Ａ２，及びＢ１、Ｂ２で囲った領域の拡大統合図は、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの核周囲の配置を示す（Ａ３、Ｂ３）。
図６Ｃ：ＳＥ後のＫＣＣ２ ｍＲＮＡの減少を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）におけるＫＣＣ２信号合計に対する核染色の蛍光合計の比率を形成して定量化された。その後これらの比率は対照ラットからの値で正規化された（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
図６Ｄ：核数の％で表示されるＫＣＣ２ポジティブ細胞の平均数（ＤＡＰＩ、平均値±標準誤差、ｎは約３００細胞、各グループ４ラット、ＳＥ２週間後（＊）及びＳＥ３週間後（＊＊）では、ｐはそれぞれ０．０５未満及び０．０１未満）。
【００６７】
我々はまた、対照ラットとＳＥ後ラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内におけるＫＣＣ２タンパク質レベルを、ウェスタンブロット法と単一細胞分析を使用して調査した。図７Ａ，７Ｂに示すように結果は、ＫＣＣ２タンパク質レベルが、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ対照レベルの７８．８±７．５及び３８．１±４．３％へと、有意な減少を示した（平均値±標準誤差、ｎ＝５ラット、それぞれｔ１２＝２．１７，Ｐ＝０．０１及びｔ１８＝４．６，Ｐ＝０．０００６）。蛍光免疫組織化学的検査を使用して、ＫＣＣ２タンパク質の分布及び処置後のその消失について研究した（図７Ｃ）。対照ラットでは、ＫＣＣ２の免疫活性は、散在する神経線維網信号の上の密集した細胞体系の蛍光として検知された（図７Ｃ、一番上のパネル、及び挿入図）。ＳＥ後２週間及び３週間後では免疫蛍光はニューロンの細胞体内で漸減し（図７Ｃ、７Ｄ）、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンの細胞体系領域に弱い離散した蛍光が残った（図７Ｃ、真中及び一番下のパネル、及び挿入図）。ＫＣＣ２に対する細胞体性の蛍光は、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ対照レベルの６６±３．５及び３４±１．９％に減少した（図７Ｄ、平均値±標準誤差、ｎは４ラットに対して約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、それぞれｔ３４＝７．８５，Ｐ＝０．００７及びｔ４１＝６．３９，Ｐ＝０．００００６）。
【００６８】
神経線維網において、ＫＣＣ２信号減衰はさらに遅延する。ここではＫＣＣ２信号は２週間及び３週間後にそれぞれ９６±４．１％及び６０±４．４％に減少した。神経細胞体と神経線維網の体積を概略１：１と推定すると、ＫＣＣ２免疫蛍光の合計の変化はウェスタンブロットのデータとよく一致する。ニューロンが死滅せず、かつグリアに置き換わることを証明するため、ニューロン特異性の蛍光ニューロトレース染色が対抗染色に使用された。これら染色はニューロンの安定的な数（対照が１５７．６±６．５に対して、発作後３週間後で１５４．６±２１．３、３ラット、ｔ２６＝２．３４，Ｐ＝０．４４）を示し、そしてＫＣＣ２信号がニューロンに高度に特異的（ＫＣＣ２ポジティブ細胞の９５％超がニューロトレースポジティブ）であることを示した。興味深いことに、ピロカルピン多量投与モデルでは、嗅内皮質（ＥＣ）からのてんかん様活性の海馬への拡散に対するこの構造のゲートキーパー機能を損なう、下流歯状回におけるＫＣＣ２の早期、機能的減少の証拠もある（Ｐａｔｈａｋ氏他、２００７）。このゲートキーパー機能の損傷と同時に、生体内てんかん様脳波（ＥＥＧ）活性の証拠もある（Ｅｌ−Ｈａｓｓａｒ氏他、２００７）。
【００６９】
図７、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図７．ＳＥ後ＫＣＣ２タンパク質も減少する）
図７Ａ：ウェスタンブロットＫＣＣ２バンド（約１５０ｋＤａ）は、ピロカブリン誘発ＳＥ後２週間及び３週間後のラットの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ＫＣＣ２が対照と比較して有意に漸減することを示す。βアクチン（約４０ｋＤａ）は負荷制御として機能した。
図７Ｂ：図７Ａのブロットからの、対照の％で表示される平均光学密度（平均値±標準誤差、ｎ＝５、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。これらのデータはｍＲＮＡ及び抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）逆転電位データと非常によく一致する。
図７Ｃ：免疫組織化学的検査はピロカブリン誘発ＳＥ後２週間及び３週間後のＫＣＣ２タンパク質の漸減を示し、それは細胞体で最も顕著であった。各パネルの白抜きのボックスは、白矢印で識別される細胞の拡大図である。
図７Ｄ：ＳＥ後のＫＣＣ２免疫組織化学的検査の平均信号で、対照に対して正規化されている（平均値±標準誤差、ｎは４ラットに対して約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
【００７０】
（実施例７）
（ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２における初期の変化は嗅内皮質（ＥＣ）第５層に特異である）
てんかん重積（ＳＥ）中に発生する高振幅脳波（ＥＥＧ）スパイキングは、海馬及び海馬台を含む他の皮質層の嗅内皮質（ＥＣ）第５層で見られるＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２出現における進行性変化をトリガーするのに十分でありうる。従って我々は、分析を海馬台、歯状回、嗅周囲皮質だけでなく、嗅内皮質（ＥＣ）の浅葉も含むように拡げた。 図８Ａ，Ｂは拡大率の低い概観で、ＳＥ後３週間の嗅内皮質（ＥＣ）深層のＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ発現を示し、一方、浅葉、海馬台、歯状回、嗅周囲皮質では発現しなかった。
これらの領域からの蛍光の平均値のプロット（図８Ｃ、倍率のより大きい画像から、対照に対し正規化）は、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡの深層内側嗅内皮質（ＥＣ）にこの高度に特異的な出現を示し、それよりずっと弱い程度に深層外側嗅内皮質（ＥＣ）に出現し、一方他のテスト領域ではネガティブであった（図８Ｃ、コラム３−１０）。
【００７１】
同様の特異性が関連するＫＣＣ２出現の研究において観察された。図９Ａ，Ｂの概観は、ＳＥ後３週間において、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡが特異的に深層嗅内皮質（ＥＣ）、特に内側部分で発現するのがわかる。平均蛍光の定量的分析では、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの深層内側嗅内皮質（ｍＥＣ）における進行的減少が５６±７．８％（ＳＥ後３週間、ｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）深層外側嗅内皮質において１４±４．５％（ＳＥ後３週間、ｔ６２＝２．４１，Ｐ＝０．０３９）であり、一方海馬台、歯状回、嗅周囲皮質及び嗅内皮質（ＥＣ）浅葉では有意の変化を示さなかった（図９Ｃ）。
【００７２】
拡張的実験のさらなる重要な結果は、「ＳＥ発症２時間超後のジアゼパム投与」プロトコル（Ｄｕ氏他，１９９５；小林氏他、２００３）に対抗してここで使用されるプロトコル「ＳＥ発症１時間後ピロカプリンの低量投与−ジアゼパム」後の初期のニューロンの有意の減少が第３層に存在しないことである。第１に嗅内皮質（ＥＣ）第３層においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの有意の変化の不存在は、我々のラットでは第３層の錐体ニューロンがＳＥ後３週間後も死滅していないことを示唆する。第２に、ニューロンの生存が、第３層の安定的ニューロン数を示した（対照、ＳＥ後２週間後及び３週間後においてそれぞれ、ニューロン数１１４±１４．２，１１２±１８．１及び１１６±１５、それぞれｔ１０＝−０．１８，Ｐ＝０．８６及びｔ１０＝−０．７７，Ｐ＝０．４６、３ラット）ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）染色で確認された。
【００７３】
図８，９、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図８．ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは他の皮質領域では増加しない）
図８Ａ，Ｂ：内側嗅内皮質（ｍＥＣ）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）、アンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）（ａｂ）,海馬台（Ｓｕｂ）、歯状回（ＤＧ）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）に亘る脳領域を示すＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡに対する蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）研究：
Ａ、対照スライス；Ｂ、ＳＥ後３週間後に採取されたスライス。左のパネルは、ＤＡＰＩ染色された領域を示し、それは構成要素領域のアウトラインが重ねて表示されている（Ａ１，Ｂ１）。中央のパネルはＮＫＣＣ１信号を示す。対照では殆ど見られないか皆無であるが、ＳＥ後３週間後では信号は中央の嗅内皮質（ＥＣ）第５−６層に明白に存在するが、他の場所では存在しない（Ａ２、Ｂ２）。これらの画像は右パネルで統合される（Ａ３，Ｂ３，高出力画像は図３参照）。
図８Ｃ：ＳＥ後にＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡが、深層嗅内皮質（ＥＣ）、（内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第５層、それぞれｔ５４＝２．１５，Ｐ＝０．０３７及びｔ５４＝３．５４，Ｐ＝０．０００９）及び＃２とラベル付けされた外側嗅内皮質第５層（それぞれｔ５４＝１．０２，Ｐ＝０．１２及びｔ５４＝１．２８，Ｐ＝０．０４７）においてのみ増加するが、内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第３層（＃３、それぞれｔ５４＝０．９３，Ｐ＝０．２４及びｔ４９＝０．４２，Ｐ＝０．３４）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）（＃４、それぞれｔ５４＝０．２７，Ｐ＝０．８６及びｔ５４＝０．２４，Ｐ＝０．０９４）内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第１−２層（＃５、それぞれｔ５４＝−１．２５，Ｐ＝０．３２及びｔ５４＝０．３４，Ｐ＝０．２３）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）第１−２層（＃６、それぞれｔ５４＝１．２４，Ｐ＝０．０７８及びｔ５４＝０．５２，Ｐ＝０．２７）、海馬台（＃７、それぞれｔ５４＝１．５４，Ｐ＝０．４９及びｔ５４＝１．６７，Ｐ＝０．０６３）、歯状回（＃８、それぞれｔ５４＝０．４５，Ｐ＝０．０９８及びｔ５４＝−１．３５，Ｐ＝０．２６）、深層嗅周囲皮質（＃９、それぞれｔ５４＝０．５３，Ｐ＝０．４７及びｔ５４＝２．０１，Ｐ＝０．４８）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）第１−３層（＃１０、それぞれｔ５４＝−１．３６，Ｐ＝０．８１及びｔ５４＝０．２８，Ｐ＝０．８１；データは高倍率画像より抽出）では、有意の変化が起こらなかったことを示す。
【００７４】
（図９．ＫＣＣ２のｍＲＮＡは深層嗅内皮質（ＥＣ）でのみ減少する）
図９Ａ、Ｂ：内側嗅内皮質（ｍＥＣ）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）、アンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）（ａｂ）,海馬台（Ｓｕｂ）、歯状回（ＤＧ）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）に亘る脳領域を示すＫＣＣ２ ｍＲＮＡに対する蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）研究：
Ａ、対照スライス；Ｂ、ＳＥ後３週間後に採取されたスライス。左のパネルは、ＫＣＣ２染色された領域を示し、それは構成要素領域のアウトラインが重ねて表示されている（Ａ１，Ａ２）。対照では全体に発現が見られるが、ＳＥ後３週間後では嗅内皮質（ＥＣ）第５層でのみ信号が消滅した。中央のパネルはＤＡＰＩ染色を示す（Ａ２、Ｂ２）。これらの画像は右パネルで統合される（Ａ３，Ｂ３，高出力画像は図６参照）。
図９Ｃ：ＳＥ後にＫＣＣ２ ｍＲＮＡが、深層嗅内皮質（ＥＣ）、（内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第５層、それぞれｔ６２＝１．９５，Ｐ＝０．０８２及びｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）及び＃２とラベル付けされた外側嗅内皮質第５層（それぞれｔ６２＝１．８６，Ｐ＝０．０９３及びｔ６２＝２．４１，Ｐ＝０．０３９）においてのみ増加するが、内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第３層（＃３、それぞれｔ６２＝０．３４，Ｐ＝０．３２及びｔ６２＝−１．２２，Ｐ＝０．５１）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）（＃４、それぞれｔ６２＝−０．２５，Ｐ＝０．１７及びｔ６２＝０．２４，Ｐ＝０．３６）内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第１−２層（＃５、それぞれｔ６２＝１．０６，Ｐ＝０．８５及びｔ６２＝０．４３，Ｐ＝０．６２）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）第１−２層（＃６、それぞれｔ６２＝−０．４５，Ｐ＝０．６８及びｔ６２＝０．１５，Ｐ＝０．３９）、海馬台（＃７、それぞれｔ６２＝−１．０１，Ｐ＝０．０９８及びｔ６２＝１．８４，Ｐ＝０．０６５）、歯状回（＃８、それぞれｔ６２＝１．０５，Ｐ＝０．７７及びｔ６２＝−２．０３，Ｐ＝０．４９）、深層嗅周囲皮質（＃９、それぞれｔ６２＝１．３３，Ｐ＝０．２８及びｔ６２＝−１．５２，Ｐ＝０．５３）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）第１−３層（＃１０、それぞれｔ６２＝１．１２，Ｐ＝０．０８５及びｔ６２＝０．３６，Ｐ＝０．１４；データは高倍率画像より抽出）では、有意の変化が起こらなかったことを示す。
【００７５】
（実施例８）
（Ｃｌ−輸送遮断抑制バースト活性）
抑制性シナプス後電位（ＥＩＰＳＰ）の変移及び発作後の多シナプス性バースト応答の増加に対するＮＫＣＣ１増加の機能的役割を調査するため、我々はＣｌ−輸送体遮断を通して作用し、ＮＫＣＣ対ＫＣＣ輸送体の遮断により効果のある利尿剤ブメタニドを採用した（Ｒｕｓｓｅｌ，２０００；Ｓｕｎｇ氏他，２０００；Ｈａｎｎａｅｒｔ氏他，２００２；Ｂｅｃｋ氏他，２００３）。ここで絶対的特異性の欠如は１）示されたＫＣＣ２の強い減少、２）Ｃｌ−内向き輸送のみがＥＣｌをポジティブに静止膜電位（ＲＭＰ）に変移させるという事実、により補償される。残存ＫＣＣ２活性の遮断は、ＮＫＣＣ１の遮断の間、ＥＣｌの強い過分極変移を阻止しない。図１０ＡはＳＥ後３週間後の膜電圧に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）振幅のプロットであり、Ｅ（ＰＳＰ）の脱分極変移がブメタニド（１０μＭ）での２０分灌流の後、消滅したことを示す。これは、Ｃｌ−の膜を通過する受動的再分布に対応する。図１０ＢはＳＥ後３週間後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層の正常記録状態における静止膜電位（ＲＭＰ）（約−７２ｍＶ）に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の平均値が＋４０ＭＶ超であり、ブメタニド存在下では＋１０ｍＶに低下した（Ｅ（ＰＳＰ）絶対平均電圧は、対照状態で−２９．７±２．３ｍＶ、ブメタニド存在下で−６０．９±４．１ｍＶであり（ｔ２４＝２．２６，Ｐ＝０．００００９）、ブメタニドの洗い流し中は−３４．２３．４ｍＶ、ｎ＝５，ｔ２４＝１．５２，Ｐ＝０．００５７対ブメタニド）。
【００７６】
シナプス後電位Ｅ（ＰＳＰ）の脱分極に対して２次性の脱抑制又は興奮が、ＳＥ後の潜伏期における多シナプス性バースト応答の発現に決定的な場合、ブメタニドによる逆転電位の蓄積もまた、多シナプス性バースト応答を遮断することになる。図１０Ｃは、確かに、ブメタニドでの灌流（１０μＭ）は単一ショック刺激に対する多シナプス性応答を効果的に抑制した。図１０Ｃの上段パネルに示すような強い多シナプス性バースト応答を記録した後、ブメタニドでの灌流が始まり、２０分後までには、バースト放電は強く減衰した（中段の軌跡）。３０分間のブメタニドの洗い出しにより、強い多シナプス性応答が回復した（下段の軌跡）。平均すると、ブメタニドは、ピロカルピン発作後３週間後のラットからの細胞の多シナプス性応答を持つニューロンの数を、６４．８％（合計１４ニューロンの内９ニューロン）から１１．６％（２／１４）に減じた。３０分間のブメタニドの洗い出しは応答ニューロンの数を３５．１％（５／１４、図１０Ｄ）に回復した。半最大振幅における応答期間はブメタニドで対照応答（ｔ１３＝１３．８，Ｐ＝０．０００００００００４）の３６±９％に減少し、そして洗い出し中に７５±１１％（ｔ１３＝−５．０７，Ｐ＝０．０００２対ブメタニド）に回復した。
【００７７】
図１０、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図１０．ＮＫＣＣ１抑制剤ブメタニドは部分的にＥ（ＰＳＰ）を回復し、そして多シナプス性興奮を抑制する）
図１０Ａ：ＳＥ後３週間後のラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの膜電位に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）振幅をブメタニドへの２０分暴露前（上段パネル、白丸）と後（下段パネル、×印）でプロットしたものであり、ＰＳＰ逆転電位の過分極変移を示す。データは図２Ａのプロトコルから得られた。Ｅ（ＰＳＰ）は−２９．７ｍＶから−６０．９ｍＶへ変移した。
測定はＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）による興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）遮断中に行われた。
図１０Ｂ：集団データで、ポジティブ変移したＧＡＢＡＡ−ＰＳＰ逆転電位が、ブメタニドにより強く、かつ可逆的に再分極した（平均値±標準誤差、ｎ＝３、ブメタニドへの暴露（＊＊＊）ｐは０．００１未満）ことを示す。
図１０Ｃ：最上段の記録は、ＳＥ後３週間後に観察された単一刺激（１００ｎＡ）に対する多シナプス性応答を示し、それがブメタニドにより遮断されるが（中段の記録）、３０分間の薬物の洗い出しにより回復する（下段の記録）ことを示す。
図１０Ｄ：ブメタニドは、単一刺激に応答して多シナプス性脱分極を発現するＳＥ後３週間後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの数を、６４．８％から１１．６％（ｎ＝１４）に減少させることを示す集団データである。この数値は３０分間のブメタニド洗い出しにより３５．１％に回復した。
【００７８】
（実施例９）
（ＧＡＢＡＡ誘発興奮はバーストに軽度の影響をあたえる）
シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の脱分極変移は、第５層ニューロンの脱抑制及び直接的ＧＡＢＡ誘発興奮の両方に繋がる。我々はピクロトキシンでＧＡＢＡＡ誘発興奮を遮断してバースト応答における直接的興奮の役割を調べた。ブメタニドと異なり、ピクロトキシン（１００μＭ）はＳＥ３週間後の多シナプス性バースト放電に対し僅かな効果しか示さなかった（図１１Ａ１，Ａ２；ピクロトキシンでは、自発的バーストも観察した；自発的バースト後５秒より長く記録された誘発バーストのみ分析した；これらのバーストは明白に従前の自発的バーストに影響されない）。研究された細胞集団において、ピクロトキシンは、ＳＥ３週間後に多シナプス性バースト応答におけるスパイクの数を９．８±０．８から７．９±０．７へ減少させた（図１１Ｃ、ｎ＝８，ｔ２４＝２．２６，Ｐ＝０．００００８９）。このような同一細胞からの１０個の応答の平均をとると、図１１Ｂ１，Ｂ２に示すように、ピクロトキシンが平均バースト応答において活動電位振幅を１０．５±３．４％減少させ、それは刺激後の活動電位のタイミングの可変性が増大したことを示唆する（ｎ＝８，ｐ＝０．０９４）ことが判った。このように、ＧＡＢＡ誘発興奮の存在は、明白にネットワークの発火のタイミング精度を増大させ、それは、ＧＡＢＡ誘発伝達がニューロン間興奮の下流であるため遅延するので、恐らく直接的興奮よりは全体的な興奮性の増大に起因している。
ピクロトキシン単独での僅かな効果と対照的に、ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）のＡＣＳＦ／ピクロトキシン生理食塩水への追加は、ほぼ完全にシナプス応答を遮断し（９５．９±０．２６％、ｔ７＝−１０．０５，Ｐ＝０．００００２）、それはバーストが主として多シナプス性グルタミン酸作動性伝達により媒介されることを示した（図１１Ａ３，Ｂ３；図２Ａで示すように、ピクロトキシンが無いＣＮＱＸ及びＡＰＶ内で、単一シナプス性ＰＳＰが誘起された）。ピクロトキシンでは統計的有意性に達しないが、バースト期間の短縮傾向が存在した（図１１Ｄ）。
）。
【００７９】
図１１、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図１１．ピクロトキシンは多シナプス性バーストに軽度の影響をあたえる）
図１１Ａ：ピクロトキシン（１００μＭ）によるＧＡＢＡＡ受容体の遮断が多シナプス性バースト応答における活動電位発火を、小さいが有意な量だけ減少させた（図Ａ１，Ａ２；刺激１００ｎＡ、７０μ秒が＊印時点で印加された）。その後のＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）によるイオンチャネル型グルタミン酸受容体の遮断は、全てのシナプス後性応答を殆ど除去した（図１１Ａ３）。
図１１Ｂ：同一の細胞からの１０個のバーストの平均がピクロトキシンでのバースト期間の短縮化を示した。これら平均におけるスパイク振幅の減少は、ピクロトキシンでのバーストにおいて発火パターンの精度が低下することを示唆する。
図１１Ｃ：ピクロトキシンが、多シナプス性バースト応答における平均スパイク数を、１応答当り９．８±０．８から７．９±０．７へ減少させる（平均値±標準誤差、ｎ＝８細胞、５ラット、ピクロトキシン付加（＊）ｐは０．０５未満）ことを示す数量データである。
図１１Ｄ：ピクロトキシンでは多シナプス性バースト期間の１０．５％短縮傾向が見られた（平均値±標準誤差、ｎ＝８、ｐ＝０．０９４）。
【００８０】
図１２−１４、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
図１２は、リチウム−ピロカルピンＳＥ後１２−１７週間後における、ブメタニドによる発作の抑制（０．２ｍｇ／Ｋｇ体重、腹腔内）を示す（ｎ＝５ラット）。５体のリチウム−ピロカルピンＳＥラットが連続するブメタニド又は媒体注射（生理食塩水内の５％エタノール、腹腔内、下部に日付を記載）を受け、そしてその後８時間以内に発現する発作がビデオ録画により分析された。１体の同一のラットは、ブメタニドがＣｌ及びＩＰＳＰ逆転電位を概して基準化した場合でも、２度目及び３度目のブメタニド投与後に発作を発現したが、それは恐らく自発的発作を可能にするこのラット内の２次的な下流の変化によるものである。
【００８１】
図１３は、ＮＫＣＣ１タンパク質が正常な成体レベルに向かって回復することを示す。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＮＫＣＣ１タンパク質の免疫蛍光信号を、抗体を持たない対照ラット（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）、抗体を持つ対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ 週間後」と表示）のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１信号は、ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）では、ＳＥ後３週間後のラットのレベルの５０％未満まで回復し、そしてブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）では９５％超に回復した。
【００８２】
図１４は、ＫＣＣ２タンパク質が正常な成人レベルに向かって回復することを示す。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＫＣＣ２タンパク質の免疫蛍光信号を対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ後 週間」と表示）のラット、及びＳＥ後１７週間後のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＫＣＣ２信号は、正常レベルに向かって回復した（ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示、そして、ブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）。
【００８３】
ブメタニド又は媒体が投与された後の発作活性が図１２で定量化された、ラットの新規のＮＫＣＣ１データが図１３に示され、図１３は従前のＮＫＣＣ１データを比較のために含む。抗体を持たない対照の測定（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）はさらに、対照ラットにおけるＮＫＣＣ１タンパク質レベルがゼロに近く非常に低いことを示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１タンパク質レベルは、ブメタニド投与が完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止したラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）において正常レベルに向かって有意に回復した。２度目及び３度目のブメタニド投与（約４週間離れて０９年６月８日と０９年７月１日に）後に発作を発現した１体のラットでは、ＮＫＣＣ１はほぼ完全に基準化された。
【００８４】
図１４はＫＣＣ２タンパク質レベルも、ＳＥ後１７週間後に正常な成体レベルに回復したことを示す。これらのデータは、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２のＣｌ−輸送体の発現は共に長い時間の中で基準化され、従ってＣｌ−分布の基準化およびＣｌ−依存性ＩＰＳＰ逆転電位に関するシナプス性抑制につながるという、我々の仮説を確認した。
【００８５】
図１５は、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後に有意の変化がない（「ＳＥ後２週間」、「ＳＥ後３週間」と表示）ことを示す。棒グラフは、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後に変化しないことを示す。ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）データは、図８に使用されたものと同一の組織の高倍率画像から抽出された。
【００８６】
図１６は、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは変化がないことを示す。棒グラフは、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後（「ＳＥ後２週間」、「ＳＥ後３週間」と表示）に変化しないことを示す。ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）データは、図９に使用されたものと同一の組織の高倍率画像から抽出された。
【００８７】
図１７：ニューロン−特異染色「ニューロトレース（ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ）」で染色されたニューロンの数に、嗅内皮質（ＥＣ）第２層（「ＥＣ第２層」と表示）、又は第３層、又は第５層においても、ＳＥ後３週間後に有意の変化が無いことを示す（ニューロンの数／１００ミクロンｘ１００ミクロン領域）。
【００８８】
図１８は慢性ブメタニド処置が慢性期において強く発作の発現を抑制することを示す。ＳＥ後の週単位時間経過に対する発作発現／８時間ビデオ録画のプロットであり、無処置ラット（黒塗りの棒、水消費 平均±標準誤差＝水２９±６．３ｍｌ／日）及び飲料水によりブメタニド（ｂｕｍｅｔ．）を処置されたラット（平均±標準誤差＝０．６５±０．１３ｍｇブメタニド／日；水３２±６．４ｍｌ／日；点線及び斜線）。４体のラットではブメタニドは完全に発作を防止した（中空の棒）が、他の２体のラットでは、発作の発現及びＳＥ後時間経過に伴う発作の進行は共に減少した（斜線の棒）。
【００８９】
図１９：ＳＥ後２週間後に開始され２０週間継続する慢性ブメタニド処置が、処置期間中および処置終了後少なくとも６週間、発作の発現を強く抑制する。棒グラフは、ＳＥ後第１１−２１週における８時間ビデオ録画セッション中のラット当りの平均発作発現回数を示し（一番左の棒のペア）、無処置ラット（黒）又はＳＥ後２週間目から２０週間に亘って慢性的に飲料水経由でブメタニド処置されたラット（斜線）である。その後ブメタニド処置を終了し、その後３週間後と６週間後の発作発現回数を示す、無処置ラットは約３回の発作／８時間録画のレベルに到達した（黒の棒、ラット当り３回の録画セッション）が、一方事前にブメタニド処置されたラットでは発作の発現はずっと少なかった（斜線の棒）、即ち、ＳＥ後時間適合対照ＳＥラットが発現する発作回数の１５−２２％であった（各グループｎ＝６ラット）。
【００９０】
図２０は、ＳＥ後１週間後に開始する慢性ブメタニド処置が、ブメタニド処置終了後少なくとも６週間のオープンフィールド暴露に誘発される発作の発現を強く抑制することを示す。棒グラフは、ＳＥ発作後２７週後のピロカプリンＳＥラットをオープンフィールド（１．４ｘ１．４ｍ）の中央に置き、その後１分後から始まる１５分間に発現する発作の回数を示す。ラットは無処置（黒の棒）、又はＳＥ後第２週目から２１週間に亘り慢性的に飲料水経由でブメタニド処置された（斜線の棒）である。このテストでは、ブメタニド処置終了後６週間後でも処置済みラットは、ＳＥ後時間適合対照ＳＥラットが発現する発作回数の１５％未満の発作発現回数を示した（各グループｎ＝６ラット）。
【００９１】
図２１はＳＥ後１６日目から１２週間に亘る慢性ブメタニド処置がオープンフィールドの暗箱に入るラットの挙動を回復させることを示す。ラットは箱を含むオープンフィールド（１．４ｘ１．４ｍ）の中央に置かれ、箱は内部が暗く、０．２（長さ）ｘ０．３（幅）ｘ０．１５（高さ）ｍの寸法であり、０．３ｍの幅側が開口しており、オープンフィールドの中央と囲み壁の間の中間点に置かれる。挙動は１分間ビデオ録画される（３回の試技／ラット、各グループ６ラット）。対照ラットは殆ど箱に入り、箱内に留まった（試技の７８％）。対照的に、ＳＥ後のラット（ＳＥは後１４−１５週）は殆ど箱を無視して入らなかった（試技の１５％、７ラット）。同じＳＥグループからのブメタニド処置ラットは、対照ラットと類似の挙動を示し、殆ど箱に入った（試技の６７％、８ラット）。
【００９２】
図２２は内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）発症の我々の原理、及び我々の新規の予防的及び抗てんかん慢性ブメタニド処置を示す。ＴＬＥ誘発の発作、例えば、てんかん重積（ＳＥ）、外傷性脳障害（ＴＢＩ）、脳卒中他は、潜伏期（ＳＥ後２及び３週間）に進行するＮＫＣＣ１の病理学的再発現を誘発する。ＧＡＢＡＡ受容体依存シナプス性抑制の進行性消失は嗅内皮質（ＥＣ）第５層のてんかん様活性／無症候性発作をもたらす。このてんかん様活性は嗅内皮質（ＥＣ）及び下流脳領域において下流可塑性変化をトリガーし、それは易興奮性を増大させる２次的変化につながる。易興奮性を増大させる変化の進行に伴って、顕性発作の可能性も増大する。顕性発作もまた下流可塑性変化をトリガーし、それは更に大脳易興奮性を増大させ、発作発現の進行につながる（図１８及び１９に示す）。最終的に発作はＮＫＣＣ１活性に依存性でなくなり、そしてＮＫＣＣ１が基準化した時でも継続する（図１２、１３に示す）。ブメタニド処置は低い細胞内Ｃｌ−レベル及びより効率的な抑制（図１０Ａ、Ｂ）を回復し、潜伏期においててんかん様活性（図１０Ｃ、Ｄ）及び慢性期の発作（図１２，１８，１９，２０）を抑制する。無症候性及び顕性発作のブメタニド処置は、下流病理学的変化を防止し、処置後少なくとも６週間継続する（図１９、２０）発作出現率及びテストされた挙動（図２１）の基準化につながる。
【００９３】
（実験結果の議論）
発作中のてんかん様ニューロン活性は多くの大脳領域で観察されるが、しかしそのてんかん重積（ＳＥ）状態に後続する発生源は明確ではない。我々は深層嗅内皮質（ＥＣ）におけるてんかん様活性の初期発現を検証するため、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のリチウム−低投与量ピロカプリンラットモデルを使用した。我々はＳＥ後３週間の潜在期間内に増加する比率の嗅内皮質（ＥＣ）第５層のニューロンが単一シナプス刺激に多シナプス性バースト脱分極で応答することを示した。この変化は並行して第５層ニューロンのＩＰＳＰ逆転電位の進行性脱分極変移を伴い、これは明らかにＣｌ−内側輸送体ＮＫＣＣ１の増加及び同時にＣｌ−外側輸送体ＫＣＣ２の減少に起因し、この両方の変化は、細胞内Ｃｌ−蓄積に役立っている。潜伏期におけるＣｌ−摂取の抑制はよりネガティブなＧＡＢＡ作動性逆転電位を回復し、そして多シナプス性バーストを終了させた。Ｃｌ−輸送体の変化は深層嗅内皮質（ＥＣ）に強く特異的であった。それらはこの時期に第１−３層、嗅周囲皮質、海馬台又は歯状回では発現しなかった。我々はＣｌ−ホメオスタシスの変化が深層嗅内皮質における過剰興奮性を促進し、それがそこでのてんかん様放電に繋がり、それは結果的に下流皮質領域に影響を及ぼすと提案する。
【００９４】
従って、我々はＳＥ後の潜伏期に深層嗅内皮質における大幅に増加した興奮性の発現を示した。第５層のニューロンは通常は閾値以下のシナプス性刺激に対し多シナプス性バースト放電で応答を始める。さらに、我々はこの潜伏期にＣｌ−輸送体ＮＫＣＣ１（内向き）およびＫＣＣ２（外向き）の変化した発現に起因するＧＡＢＡＡ受容体逆転電位の大きな脱分極変移が起こることを示した。このてんかん発生の初期段階では、これらの輸送体発現の変化は深層嗅内皮質においてのみ発現し、隣接する海馬領域及び皮質領域では発現しなかった。Ｃｌ−輸送活性の変化と増加する多シナプス性バーストとの間の直接的な関係は、ブメタニドによるＮＫＣＣ１の遮断がＩＰＳＰ逆転電位を大きく回復し、多シナプス性バースト放電を大幅に減少させた、という発見よって支持された。我々の結果は、嗅内皮質第５層が内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症において重要な部位であることを意味している。
【００９５】
従って、上記の実験結果は、ＳＥ後の潜伏期において、行動性発作の発現前に、深層内側嗅内皮質においてニューロ興奮性の強い増加、即ち弱いシナプス刺激に対し多シナプス性バースト放電で応答する嗅内皮質第５層ニューロンの比率の進行性増加があることを示唆している。従って嗅内皮質における自然活性パターンは、ますます自発的発作をトリガーする可能性が高くなり、自発的発作は定義により潜伏期を終了させる。我々の発見は、ＳＥ後、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は初期において嗅内皮質深層に発現することを示唆している。我々の知る限りでは、潜伏期に他の脳領域においてシナプス刺激に応答するてんかん活性を示す他の研究は無かった。この領域の特異性は、嗅内皮質深層に対する脱抑制に繋がるＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２発現の変化の特異性により実証された。内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のピロカプリン高投与モデルでＣＡ１に対し潜伏期発作間活性が生体内で示されたが（Ｅｌ−Ｈａｓｓａｒ氏他，２００７）、検査した幾つかの他の皮質領域及び海馬領域は変化を示さなかった。我々のレポートした第５層ニューロンの易興奮性の変化が、嗅内皮質第３層の錐体ニューロンの明確に認識可能な消失がなく発現した、ことは非常に重要である。嗅内皮質第３層の錐体ニューロンの高度の消失は後期ＬＴＥの症状に典型的であることが示されて来たし（Ｄｕ氏他，１９９３；Ｄｕ氏他，１９９５）、そしてそれは遷延性ＳＥの２４時間以内に発現可能であった（Ｄｕ氏他，１９９５）が、明確に認識可能な消失が発現しないため、これらの発見は本論とは無関係である。
【００９６】
ジアゼパムがＳＥ発症後２時間後でなく１時間後に投与され、かつアトロピンが投与される、我々のＳＥ発現プロトコルはアンドレ氏他（Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）のプロトコルよりも幾分弱く見えるかもしれない。ジアゼパムもアトロピンもいずれかの時点で即座にＳＥを停止させないが、この変更がラットの回復を促進し、より良い生存率の脳スライスを生成したことを我々は発見した。良かれ悪しかれ我々はまた、弱い初期の発作はより徐々に進行する細胞又は神経網の変化を生成し、従って分析が容易であるかも知れないと理由づけた。ビデオモニタリングで検査した場合、我々のプロトコルは、１８週までの潜伏期を持つ全てのラットにおいて実証可能な発作活性を生成した（平均＝１２．７週、材料と方法の項参照）。重要なことに、これらの潜伏期間は非常によく患者に対し報告された潜伏期間と適合した（Ａｎｎｅｇｅｒｓ氏他，１９８０）。これは、潜伏期が平均して１−４週間しか継続せず、殆どは２週間未満である公開されたげっ歯類ＴＬＥモデル（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ａ；Ａｒｚｉｍａｎｏｇｌｏｕ氏他，２００２；Ｃｕｒｉａ氏他，２００８；Ｌｉ氏他，２００８）に対する重要な改良である。はるかに短い潜伏期は、恐らく追加又は全体的な発作を促進する他のメカニズムを活性化させるより激しい発作を示唆するが、それは殆どの場合明らかに患者に関係が無い。このようにＬｉ氏他（Ｌｉ氏他，２００８）はマウスに対するピロカプリン高投与と組み合わせた異常なリチウム侵襲を使用して（確立されたＴＬＥモデルではない）、海馬領域ＣＡ１に本願で研究される期間まで継続するＮＫＣＣ１の急性再発現を示した。この発見は、我々のラットにおいてはＣＡ１ではＮＫＣＣ１の変化が無いことと対照的である。我々の示した嗅内皮質第５層における細胞性変化は、より強いリチウム−ピロカプリンＳＥ及び他のプロトコルによっても殆どの場合トリガーされる。
【００９７】
嗅内皮質第５層における易興奮性の変化は、嗅内皮質第５層のニューロンの約８０％で発現する、ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰ逆転電位における強いそして進行性の脱分極変移、と同時性を有し、そして我々はそれにより補助されるものと提案する。この比率はＣｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の増加と非常によく適合する。殆どの嗅内皮質第５層のニューロンで同時に発現するＣｌ−外向き輸送体ＫＣＣ２の減少は、ＮＫＣＣ１によるネットのＣｌ−蓄積を促進するが、それ自身では静止膜電位に対するＥＣｌポジティブをもたらさない。ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２の進行性変化は、ＳＥ後３週間後の強く変位したＥ（ＰＳＰ）と非常によく適合した、ただし後者の量定は、ＰＳＰ振幅の外挿及び傾斜の差異の減少に起因して精度が劣り、従って測定可変性を追加した。
【００９８】
ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰ逆転電位の弱い変移はＴＬＥ疾病進行のずっと後の期、即ち、後期慢性てんかんにおいて海馬台ニューロンで観察され、それは明らかにＮＫＣＣ１発現のずっと弱い変移に起因した（Ｃｏｈｅｎ氏他，２００２；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６；Ｐａｌｍａ氏他，２００６；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄ氏他，２００７；Ｍｕｎｏｚ氏他，２００７；Ｓｅｎ氏他，２００７）。領域、疾病進行期、発作間及び発作活性のレベル、及び発現レベルの差異は、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２の変移した発現レベルを開始しそして更に制御する信号ネットワークにおける、潜伏期と後期慢性ＴＬＥにおける基本的差異を示唆する。
【００９９】
最近になって、大規模な発作が、海馬において急性の４５日以上に渡るＮＫＣＣ１の部分回復性再発現、及び発作後２週間以内の自発性再発性発作（ＳＲＳ）の発現に繋がることが示された（Ｋａｎｇ氏他，２００２；Ｌｉ氏他，２００８）。しかしこれらのマウスにおいて、１）ＮＫＣＣ１がニューロンにより再発現したか、グリア細胞により再発現したか、２）ＧＡＢＡＡ−ＰＳＰ逆転電位が変位したか、３）潜伏期間中にてんかん様活性があったか、４）発作がＮＫＣＣ１活性に依存するか、が示されておらず、従って不明確である。対照的に、これらの研究（Ｌｉ氏他）に基づく最も最近の研究は、高投与量の注入によってもブメタニド処置はＳＲＳの抑制に完全に失敗したことを示した（Ｂｒａｎｄｔ氏他，２０１０）。Ｂｒａｎｄｔ氏他はこの結果の原因について議論している：「最近の研究の成体ラットＴＬＥモデルにおいて、ブメタニドを使用した予防的処置において有意な抗てんかん活性が見られなかったことは、下記を含む幾つかの原因が考えられる：（１）ブメタニドの全身性投与が脳に到達しそしてこの薬剤が脳で十分な高濃度を保つことができないことに伴う、薬物動態的問題点（速い排出、脳浸透が乏しい）、（２）ＮＫＣＣ１の変化がピロカプリン誘発てんかん発作に決定的には関与していない、又は、（３）このモデルにおいて予防的処置に使用される時間窓、即ち、ＳＥ後２週間後が適切でなかった。」。我々のデータにおける低投与量ブメタニドでの発作抑制は、薬物動態的問題点がＢｒａｄｔ氏他の発作処置の失敗の理由となりえないことを示している（Ｂｒａｎｄｔ氏他，２０１０）。我々のデータは、ＳＥ後最初の２週間以内ではＮＫＣＣ１の変化はてんかん発作に決定的には関与していないことを示唆している。従って時間窓も間違っている。さらに、回復ＮＫＣＣ１レベルは潜伏期の最後の発作発現の開始の理由にはなりえない（Ｌｉ氏他，２００８）。このマウスモデルは患者に見られた（上記参照）潜伏期より遥かに短い潜伏期を示す（Ｌｉ氏他，２００８）のみならず、示されたＣＡ１におけるＮＫＣＣ１発現は、我々のデータと矛盾する（Ｋａｎｇ氏他、２００２；Ｌｉ氏他，２００８）。これら事実の両方は、使用されたＳＥモデルが現実的なＴＬＥモデルではないことを示唆している（上記参照）。本発明の新規性は、１）我々の改良ラットＴＬＥモデルによる潜伏期の現実的適合、２）潜伏期ニューロンにおけるＮＫＣＣ１の進行性再出現とＩＰＳＰ逆転電位の変移の両方、３）潜伏期及び慢性期（ＳＥ後３−１８週）におけるブメタニドによるてんかん様活性及び発作の効果的抑制、そして、４）遷延性ブメタニド処置終了後少なくとも６週間を超えること、に反映されている。
【０１００】
嗅内皮質第５層ニューロンにおけるＧＡＢＡ−ＰＳＰの通常の逆転電位、即ちほぼＶｒｅｓｔは２つの別個の慢性てんかん中のＳＥ−ＴＬＥモデル（Ｆｏｕｎｔａｉｎ氏他，１９９８；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６）で発見され，我々の報告する非常に大きなＧＡＢＡＡＥ（ＰＳＰ）は、一度慢性てんかんが確立されると大部分回復することを支持した。他の説明も可能である：第１に、記録は外側嗅内皮質から得られ、そこではＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２に小さな変化しか見られないことを我々は発見した。更に、異なるＴＬＥモデルが使用された。ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他（２００６）は、ＴＬＥのピロカルピン高投与量ラットモデルを研究し、それは，リチウム−ピロカルピンラットモデルとは基礎となるＳＥ中活性化される信号伝達経路が有意に異なり（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他，１９８９）、はるかに短い潜伏期（２週間未満）、及び第３層ニューロン消失の差異（上記）において異なることが示された。後者２者の差異はより激しい発作を示唆する（上記）。これはＥ（ＰＳＰ）変移、及び慢性てんかんから回復するか否かにおいて、差異を生成可能である。我々はこれら重要な問題について将来研究する予定である。
【０１０１】
ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰの強い脱分極変移が、深層嗅内皮質の易興奮性の観察された変化の主たる原因であるという推論は、Ｃｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の遮断剤ブメタニドの効果により支持された。ブメタニドはより過分極されたＰＳＰ逆転電位を回復し、そして刺激に対するてんかん様バースト応答をほぼ消滅させた。これらの発見は、ＳＥ後のこの病期におけるてんかん様バースト応答の発現に対し、強く脱分極したＥ（ＰＳＰ）の必要性を意味するが、しかし、他の同時性変化、例えば、第５層ニューロンの観察された入力コンダクタンスの減少が追加的に必要となる可能性を除外しない。ブメタニドの効果はさらに、ＧＡＢＡＡＲ遺伝子の減少、又は抑制性シナプス及び介在ニューロンの消失に起因すると思われる、観察された入力コンダクタンスの減少にも拘わらず、ＳＥ後３週間後に抑制が依然非常に効果的でありうることを意味する（Ｂｅｒｎａｒｄ氏他，２００４；Ｇｏｒｔｅｒ氏他，２００６；Ｋｕｍａｒ氏とＢｕｃｋｍａｓｔｅｒ氏，２００６）。対照ニューロンではＧＡＢＡ−ＰＳＰは既にわずかに脱分極しており、そして、ＳＥ後３週間後、ブメタニドはそれを完全にはそのレベルに回復させなかった。従って、抑制は「過分極している」のではなく、常に「短絡している」と言える。しかし、ＡＰ発火のトリガーを興奮電流により防止するための最も重要な要素は、発火閾値に近い膜電位での抑止性電流の振幅であるように思われることを忘れないようにする必要がある。この電流振幅は、発火閾値（約４５ｍＶ）に近いＥ（ＰＳＰ）の変移と共にＣｌ−駆動力に従って徐々に変化する。その結果ＳＥ３週間後かつブメタニドの存在下で（Ｅ（ＰＳＰ）は約−６０ｍＶ）−４５ｍＶでの駆動力は、対照ラットの約２６ｍＶに対し約１５ｍＶであり、従って約４２％減少する。結果としてこの臨界膜電位領域でのＣｌ−電流は、駆動力の減少及びＧＡＢＡ−ＰＳＰコンダクタンスの減少の両方によって減衰されるが、ブメタニドの存在下では、てんかん様活性の抑制に依然として全く効果的である。このことは、全体的にＣｌ−勾配を回復することが生体内で処置的利益をもたらすという希望を与える。てんかん発生、及びＮＫＣＣ１活性の抑制に対する処置的及び予防的干渉に関する我々の原理は、図２２に要約されている。そこに示された、潜伏期に始まるブメタニド処置中及び以降の発作の非常に効果的な抑制は、原理の実証を提供する。
さらに、初期のそして高度に特異的な病理的ＮＫＣＣ１活性の基準化、及びこの処置による変化した挙動の基準化は、ブメタニドでの提案された抗てんかん処置が、少なくとも幾つかの現在の抗てんかん剤による知性と脳の能力に対する副作用を回避する、という重要な追加的利益を有することを示唆する。
【０１０２】
我々は、我々の発見がＴＬＥの初期の発現において作用する主要な要素を開示するものと信じ、また、疾患につながる変化の起点及び進行中の深層嗅内皮質の重要性を強調する。
【０１０３】
（略語）
ＡＣＳＦ、人工脳脊髄液；ＣＡ、アンモン角；ＤＡＰＩ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＥＣ，嗅内皮質；Ｅ（ＰＳＰ）、ＰＳＰ逆転電位；ＦＩＳＨ，蛍光遺伝子プローブ法；ＩＰＳＰ，抑制性シナプス後電位；ＰＢＳ，リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ−Ｔ，０．２％のトリトン−Ｘ−１００を含むＰＢＳ；ＰＳＰ, シナプス後電位；ＲＭＰ，静止膜電位；ＳＥ、てんかん重積；ＴＬＥ、内側側頭葉てんかん。
【０１０４】
（参照）
【表１】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
２００９年７月２４日出願の表題「内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の処置及び可能性を防止／減少させる方法」の特許文献１、及び２００９年１１月１２日出願の同一表題の特許文献２の優先の恩恵を主張し、それらは参照により個々にその全体がここに採り入れられる。
（連邦助成による研究）
本発明はＮＩＨ／ＮＲＳＡによる助成金番号ＲＲ１５６３６，ＦＦ０１５６１４，ＡＡ０１４１２７及びＡＡ０１６８８０の政府の助成により完成された。従って米国政府は本発明に対し権利を有する。
（技術分野）
本発明は、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の処置及び防止に関する新規の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全ての参照に対する引用文献は実施例の後に記載されている。
内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は成人において最も一般的なタイプのてんかんであり（Ｅｎｇｅｌ，１９８９）、しばしば薬物処置に対し耐性を示し、最終的には発作を抑えるために神経手術の選択肢しか残されない。ＴＬＥは脳損傷及びてんかん重積（ＳＥ）を含む種々の発作の後に発症する。突然の発作の後に、特徴的な無発作の「潜伏期」がヒトでは典型的に２−３カ月、例外的に数年続く（Ａｎｎｅｇｅｒｓ氏他、１９８０；Ｗｅｉｓｓ氏他，１９８６）。リチウム−ピロカルピン誘導てんかん重積（ＳＥ）後数週間後に発症するラットのＴＬＥは、ヒトＴＬＥの臨床及び神経病理学的特徴を再現し、そしてその病気の非常に有益な動物モデルを提供する（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他，１９８９；Ｔｕｒｓｋｉ氏他，１９９１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ氏，１９９５；Ｄｕｂｅ氏他，２００；Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。当初の原因が異なっても、ＴＬＥの行動性及び組織病理学的特徴は全ての病因で驚くほど類似している。このことが多くの研究者に初期の原因の下流に主な共通する経路、恐らくは発作の識別特性である激しい同期活性があると仮定するように誘導した（Ｄｕ氏他，１９９５；Ｗｕ氏及びＳｃｈｗａｒｃｚ氏，１９９８；Ｓｃｈｗａｒｃｚ氏他，２０００）。通常この同期活性は嗅内皮質（ＥＣ）を含む海馬及び海馬傍回皮質に見られる（Ｓｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎ氏及びＫｎｏｗｌｅｓ氏，１９８４；Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ氏他，２００４）。長い間、特定の内側側頭葉萎縮が発作病巣に対して同側性であることが示されて来た（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ氏他，２００５）。外科的に切除された標本の検査により、嗅内皮質（ＥＣ）で細胞消失とアストログリオーシスが確認された（Ｙｉｌｍａｚｅｒ−Ｈａｎｋｅ氏他，２０００）。
【０００３】
神経生理学において、てんかん重積（ＳＥ）の後、どこの場所において重要な初期変化が起こるのかが不明確である；しかしながら、海馬アンモン角領域に対する海馬傍回の神経保護実験は、てんかん発生の初期段階において海馬傍回皮質の重要な役割を示唆した（Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。さらに我々は以前の研究において、深部嗅内皮質（ＥＣ）が、第２層及び第３層と著しく対照的に、異常に高い網状組織の興奮を発現することを観察した（Ｇｌｏｖｅｌｉ氏他，１９９９；Ｅｇｏｒｏｖ氏他，２００３）。このことは、深部嗅内皮質（ＥＣ）が、てんかん重積（ＳＥ）にトリガーされた過剰興奮性の発現に対して特に疑わしいことを示唆する。
【０００４】
自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する重要な機構は、興奮性ニューロンのＣｌ−依存シナプス抑制である。この抑制の有効性は細胞外Ｃｌ−濃度に対する細胞内Ｃｌ−の増加と共に低下する。細胞内Ｃｌ−濃度はＫ＋Ｃｌ−共輸送体、特にＫＣＣ２により、Ｋ＋外向き勾配により駆動されて減少し、Ｎａ＋Ｋ＋２Ｃｌ−共輸送体、特にＮＫＣＣ１により、Ｎａ＋内向き勾配に駆動されて増加する。従って周辺及び中心ニューロンに対しては、両方のＣｌ−輸送体がシナプス抑制の効率性に対して重要な役割を果たしていることが確認されている（Ａｉｃｋｉｎ氏他，１９８４；Ｍｉｓｇｅｌｄ氏他，１９８６）。
【０００５】
特許文献３は種々の疾病、特に、塩化ナトリウムカリウム共輸送体媒介疾病、及びガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の損なわれた抑制により激化する脳内の興奮毒性に伴う疾病、の処置に利尿剤を使用することを記載している。
【０００６】
ＴＬＥを防止又は処置する努力に拘わらず、上記のＴＬＥ関連発作を防止又は寛解させる処置方法に対する要求は依然として存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国暫定特許出願ＵＳ６１／２７１，７１４
【特許文献２】米国暫定特許出願ＵＳ６１／２８１，０９５
【特許文献３】米国特許出願 ２００７００４３０３４
【発明の概要】
【０００８】
出願人は、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後にＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与することにより、被験者に内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）が発症するのを防止する、或いはＴＬＥの重症度を低減する処置法を発見した。
【０００９】
従って本発明のある側面では、被験者が、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、緊張性―クローヌス性（間代性）発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、脳腫瘍の診断又は発見後、などの発作を患った後に、被験者にＮＫＣＣ１抑制剤が投与される。
【００１０】
ある側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積（ＳＥ）発症後の潜伏期に被験者に投与される。
また他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が原因が未知の最初の発作を患った後に被験者に投与される。
【００１１】
さらに他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＴＬＥ誘発発作（一般的に、ＳＥ発作を含む）を患った後約８週間から約２４週間以内（或いは約１２週間から約１６週間以内）に被験者に投与される、又は約１週間から約４週間以内、又は約２−３週間から４週間以内に被験者に投与される。ブメタニド及びＧＡＢＡＡ作動性伝達賦活薬との組合せによる、ＴＬＥ又はＴＬＥ発症の効果的処置のためのＳＥ又は他のＴＬＥ誘発発作後の時間は、ＳＥ又は発作の継続期間と重症度、及び種、特にヒトに依存し、それよりずっと長い。
【００１２】
本発明の他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤とガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後又は原因が未知の発作の最初の発作後に、前記被験者に同時投与される。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、ＮＫＣＣ１抑制剤が,トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、それらの塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である。
【００１４】
本発明の他の側面では、１つ以上のＮＫＣＣ１抑制剤、及び選択肢として１つ以上のガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の反復性発作を患った後に、慢性的に被験者に投与される。
【００１５】
本発明のさらに他の側面では、ＮＫＣＣ１抑制剤が第２の処置薬と組合わされ、そして被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者に同時投与され、
ここにおいて第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物（例えば、ＧＡＢＡＡ受容体依存信号伝達の調節剤）、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである。
【００１６】
発明者らは、ＴＬＥを誘発することが既知の発作に続く期間（例えば、てんかん重積（ＳＥ）後の潜伏期）において、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内の増加する比率のニューロンが単一のシナプス刺激に多シナプス性バースト脱分極／てんかん型活性で応答することを発見した。この変化はＣｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の発現量の増大及び同時発生のＣｌ−外向き輸送体ＫＣＣ２の発現量の減少に明白に起因する、第５層ニューロンにおけるＩＰＳＰ逆転電位の進行性脱分極シフトと平行して起こり、両方の変化は細胞内Ｃｌ−蓄積を助ける。潜伏期におけるＣｌ−取り込みの抑制は、よりネガティブなＧＡＢＡ作動性逆転電位を回復し、そして多シナプス性バーストを消滅させた。Ｃｌ−輸送体における変化は、深部嗅内皮質に高度に特異的であった。変化はこの期間、第１−３層、嗅周囲皮質、海馬台、ＣＡ１,ＣＡ２又は歯状回では起こらない。いかなる理論にも縛られないことを希望するが、我々は、Ｃｌ−のホメオスタシスの変化が深部嗅内皮質において過剰興奮性を促進し、そこでのてんかん放電につながり、それは結果的に下流の皮質領域に影響を与えることを提案する。
【００１７】
本発明の処置方法は従って、潜伏期及び初期慢性型てんかん期における異常性細胞活性及び発作形成の根底をなす特定の基礎的病理を標的とする。ＴＬＥを誘発することが既知の発作の後、又は未知の原因の初期発作の後、のＮＫＣＣ１の慢性的抑制は、ＴＬＥの予防的防止、又は発現の減弱に有用であることを証明する。
本発明のこれら及び他の側面は、発明の詳細においてさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の実験により画定される、てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの増大した多シナプス性バースト興奮を示す図である。
【図２】「材料及び方法」の項、及び実施例２で説明される、てんかん重積（ＳＥ）後２週間後と３週間後のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位のポジティブ変移を示す図である。
【図３】実施例３で画定される、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ、Ｃｌ−内側方向輸送体が、てんかん重積（ＳＥ）後嗅内皮質（ＥＣ）第５層内において進行的に増大することを示す図である。
【図４】実施例４の実験において、ＮＫＣＣ１タンパク質も増加したことを示す図である。
【図５】実施例４の実験において測定されるように、ＳＥ後、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンがＮＫＣＣ１タンパク質の発現を増加させたことを示す図である。
【図６】実施例５の実験において測定されたように、ＫＣＣ２に対するｍＲＮＡ，ニューロンのＣｌ−の外向き輸送体は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後進行的に減少することを示す図である。
【図７】実施例６の実験において測定されたように、ＳＥ後ＫＣＣ２タンパク質も減少することを示す図である。
【図８】実施例７の実験において測定されたように、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは他の皮質領域では増加しないことを示す図である。
【図９】実施例７の実験において測定されたように、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは深層嗅内皮質（ＥＣ）でのみ減少することを示す図である。
【図１０】実施例８の実験において測定されたように、ＮＫＣＣ１抑制剤ブメタニドは部分的にＥ（ＰＳＰ）を回復し、そして多シナプス性興奮を抑制することを示す図である。
【図１１】実施例９の実験において測定されたように、ピクロトキシンは多シナプス性バーストに軽度の影響をあたえることを示す図である。
【図１２】リチウム−ピロカルピンＳＥ後１２−１７週間後における、ブメタニドによる発作の抑制（０．２ｍｇ／Ｋｇ体重、腹腔内）を示す（ｎ＝５ラット）図である。５体のリチウム−ピロカルピンＳＥラットが連続するブメタニド又は媒体注射（生理食塩水内の５％エタノール、腹腔内、下部に日付を記載）を受け、そしてその後８時間以内に発現する発作がビデオ録画により分析された。１体の同一のラットは、ブメタニドがＣｌ及びＩＰＳＰ逆転電位を概して基準化した場合でも、２度目及び３度目のブメタニド投与後に発作を発現したが、それは恐らく自発的発作を可能にするこのラット内の２次的な下流の変化によるものである。
【図１３】ＮＫＣＣ１タンパク質が正常な成人レベルに向かって回復することを示す図である。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＮＫＣＣ１タンパク質の免疫蛍光信号を、抗体を持たない対照ラット（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）、抗体を持つ対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ 週間後」と表示）のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１信号は、ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）では、ＳＥ後３週間後のラットのレベルの５０％未満まで回復し、そしてブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）では９５％超に回復した。
【図１４】ＫＣＣ２タンパク質が正常な成体レベルに向かって回復することを示す図である。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＫＣＣ２タンパク質の免疫蛍光信号を対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ後 週間」と表示）のラット、及びＳＥ後１７週間後のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＫＣＣ２信号は、正常レベルに向かって回復した（ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示、そして、ブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）。
【図１５】海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは変化がないことを示す図である。
【図１６】海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは変化がないことを示す図である。
【図１７】嗅内皮質（ＥＣ）第２層、第３層、又は第５層においても、ＳＥ後３週間後にニューロンの損失がないことを示す図である。
【図１８】ブメタニド処置が有る場合と無い場合の発作発現を示す図である。
【図１９】慢性ブメタニド処置が、処置期間中および処置終了後少なくとも６週間、自発的発作の発現を抑制することを示す図である。
【図２０】ブメタニド処置終了後６週間後も誘発発作の発現を抑制することを示す図である。
【図２１】ブメタニド処置がラットの挙動を回復させることを示す図である。
【図２２】内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）発症の我々の原理、及び本発明による防止を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の用語が本発明の記述に使用される。ここで特別に定義されない言葉は、本発明の記述に使用される言葉と一貫性を持つ、当業者に使用される共通の意味を有する。
特に特定されない限り、「１つの」、および「少なくとも１つ」は交換可能に使用され、１つ又はそれ以上を意味する。
用語「効果的」は、本発明において意図された効果を生むための本発明の薬剤の量を記述するために使用される。
用語「ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物」は、限定されないが、バルビツール酸化合物（例えばフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン系化合物（例えば、ジアゼパム）、又はＧＡＢＡの放出を増加させ又はＧＡＢＡの再摂取を抑制する薬剤、例えば、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、及び、３−アミノプロピルスルフィン酸、を含む。
【００２０】
ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物として有用な本発明の他の組成物は：
拮抗薬：ガボクサドール、イソグバシン、イソニペコチン酸、ムシモール（ベニテングタケ）、プロガビド、ＳＬ７５１０２、チオムシモール（Ｔｈｉｏｍｕｓｃｉｍｏｌ）。
ＧＡＢＡＡ受容体ポジティブアロステリック調節剤：
バルビツール酸化合物；
アロバルビタール、アルフェナール（Ａｌｐｈｅｎａｌ）、アモバルビタール、アプロバルビタール、バルベキサクロン、バルビタール、バルビツール酸ベンジルブチル、ブラロバルビタール（Ｂｒａｌｌｏｂａｒｂｉｔａｌ），ブロフェバルビタール（Ｂｒｏｐｈｅｂａｒｂｉｔａｌ）、ブコローム、ブタバービタル、ブタルビタール、ブトバルビタール、ブタリロナール、クロチルバルビタール（Ｃｒｏｔｙｌｂａｒｂｉｔａｌ），シクロバルビタール、シクロパール（Ｃｙｃｌｏｐａｌ），エナリルプロピマール（Ｅｎａｌｌｙｌｐｒｏｐｙｍａｌ）、エサロバルビタール（Ｅｔｈａｌｌｏｂａｒｂｉｔａｌ），フェバルバメート、ヘプタバルビタール、ヘキセタール、ヘキソバルビタール、メホバルビタール、メタルビタール、メトヘキシタール、メチルフェノバルビタール、ナルコバルビタール、ニールバルビタール（Ｎｅａｌｂａｒｂｉｔａｌ），ペントバルビタール、フェノバルビタール、フェタアルビタール（Ｐｈｅｔｈａｒｂｉｔａｌ）、プリミドン、プラジトン（Ｐｒａｚｉｔｏｎ）、プロバルビタール、プロパリロナール（Ｐｒｏｐａｌｌｙｌｏｎａｌ）、プロキシバルバール、プロキシバルビタール、レポサール、セクブタバルビタール、セコバルビタール、シグモダール（Ｓｉｇｍｏｄａｌ）、スピロバルビタール（Ｓｐｉｒｏｂａｒｂｉｔａｌ）、タルブタール、チアルバルビタール、チアミラール、チオバルビタール、チオブタバルビタール、チオペンタール、バロフェイン（Ｖａｌｏｆａｎｅ）、ビンバルビタール（Ｖｉｎｂａｒｂｉｔａｌ），ビニルビタール。
【００２１】
ベンゾジアゼピン系薬；
アジナゾラム、アルプラゾラム、アルフェンダザム（Ａｒｆｅｎｄａｚａｍ），アビザホン（Ａｖｉｚａｆｏｎｅ），ベンタゼパム，ブレタゼニル，ブロマゼパム，ブロチゾラム，カマゼパム，クロルジアゼポキシド，シクロチゾラム（Ｃｉｃｌｏｔｉｚｏｌａｍ），シノラゼパム，クリマゾラム（Ｃｌｉｍａｚｏｌａｍ），クロバザム，クロナゼパム，クロラゼペート，クロチアゼパム，クロキサゾラム，シプラゼパム（Ｃｙｐｒａｚｅｐａｍ），デロラゼパム，ジアゼパム，ドキセファゼパム，エルファゼパム（Ｅｌｆａｚｅｐａｍ）、エスタゾラム，エチルカルフルゼペート（Ｅｔｈｙｌ ｃａｒｆｌｕｚｅｐａｔｅ），エチルジラゼペート（Ｅｔｈｙｌ Ｄｉｒａｚｅｐａｔｅ），ロフラゼプ酸エチル，エチゾラム，フレタゼパム（Ｆｌｅｔａｚｅｐａｍ），フルジアゼパム，フルニトラゼパム，フルラゼパム，フルタゾラム，フルテマゼパム（Ｆｌｕｔｅｍａｚｅｐａｍ），フルトプラゼパム、ホサゼパム（Ｆｏｓａｚｅｐａｍ）、ギダゼパム（Ｇｉｄａｚｅｐａｍ）、ギリソパム（Ｇｉｒｉｓｏｐａｍ）, ハラゼパム, ハロキサゾラム, イクラゼパム(Ｉｃｌａｚｅｐａｍ)，イミダゼニル（Ｉｍｉｄａｚｅｎｉｌ），ケタゾラム，ロフェンダザム（Ｌｏｆｅｎｄａｚａｍ），ロピラゼパム（Ｌｏｐｉｒａｚｅｐａｍ），ロピラゼパム（Ｌｏｐｉｒａｚｅｐａｍ），ロプラゾラム，ロラゼパム，ロルメタゼパム，メクロナゼパム（Ｍｅｃｌｏｎａｚｅｐａｍ），メダゼパム，メニトラゼパム（Ｍｅｎｉｔｒａｚｅｐａｍ），メタクラゼパム，メキサゾラム，ミダゾラム，ネリソパム（Ｎｅｒｉｓｏｐａｍ），ニメタゼパム，ニトラゼパム，ニトラゼペート（Ｎｉｔｒａｚｅｐａｔｅ），ノルダゼパム，オキサゼパム，オキサゾラム，フェナゼパム、ピナゼパム、ピボザゼパム（Ｐｉｖｏｘａｚｅｐａｍ），プラゼパム，プレマゼパム，プロフラゼパム（Ｐｒｏｆｌａｚｅｐａｍ），ＱＨ−ＩＩ−６６，クアゼパム，レクラゼパム（Ｒｅｃｌａｚｅｐａｍ），リルマザホン，リパゼパム，Ｒｏ４８−６７９１，ＳＨ−０５３−Ｒ−ＣＨ３−２’Ｆ，スラゼパム（Ｓｕｌａｚｅｐａｍ），テマゼパム，テトラゼパム，トフィソパム，トリアゾラム，トリフルバザム（Ｔｒｉｆｌｕｂａｚａｍ），ウルダゼパム（Ｕｌｄａｚｅｐａｍ）、ザピゾラム（Ｚａｐｉｚｏｌａｍ），ゾラゼパム，ゾメバザム（Ｚｏｍｅｂａｚａｍ）。
【００２２】
カルバミン酸化合物；
カリスバメート、カリソプロドール、エミルカメート、フェルバメート、メブタメート、メプロバメート、メトカルバモール、フェンプロバメート、プロシメート（Ｐｒｏｃｙｍａｔｅ）、チバメート。
抗神経活性ステロイド；
アセブロコール（Ａｃｅｂｒｏｃｈｏｌ）、アロプレグナノロン、アルファドロン、アルファキサロン、ゲドカルニル、ガナクソロン（Ｇａｎａｘｏｌｏｎｅ）、ヒドロキシジオン、ミナキソロン、Ｏｒｇ２０５９９、ＴＨＤＯＣ。
非ベンゾジアゼピン系薬；
アベカーニル、アジピプロン（Ａｄｉｐｉｐｌｏｎ）、アルピデム、ＣＧＳ−２０６２５、ＣＧＳ−９８９６、ＣＬ−２１８，８７２、ＥＬＢ−１３９、エスゾピクロン、エチホキシン、インジプロン（Ｉｎｄｉｐｌｏｎ）、Ｌ−８３８，４１７、ネコピデム（Ｎｅｃｏｐｉｄｅｍ）、ＮＳ−２６６４、ＮＳ−２７１０、オシナプロン、パゴクロン（Ｐａｇｏｃｌｏｎｅ）、パナジプロン（Ｐａｎａｄｉｐｌｏｎ）、パジナクロン（Ｐａｚｉｎａｃｌｏｎｅ）、ピペクアリン（Ｐｉｐｅｑｕａｌｉｎｅ）、ＲＯＤ−１８８、ＲＷＪ−５１２０４、サリピデム（Ｓａｒｉｐｉｄｅｍ）、ＳＢ−２０５，３８４、ＳＬ−６５１，４９８、スプロクロン（Ｓｕｐｒｏｃｌｏｎｅ）、スリクロン、ＳＸ−３２２８、ＴＰ−００３、ＴＰＡ−０２３，ＴＰ−１３，トラカゾレート、Ｕ−８９８４３Ａ，Ｕ−９００４２、Ｙ−２３６８４、ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロン。
フェノール；
フォスプロポフォール、プロポフォール、チモール。
ピペリジンジオン；
グルテチミド、メチプリロン、ピペリジオン、ピリチルジオン。
キナゾリノン；
アフロクアロン、クロロカロン（Ｃｌｏｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、ジプロカロン（Ｄｉｐｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、エタカロン（Ｅｔａｑｕａｌｏｎｅ）、メブロカロン（Ｍｅｂｒｏｑｕａｌｏｎｅ）、メクロカロン、メタカロン、メチルメタカロン。
その他；
クロルメザノン、クロメチアゾール、エタゾレート、エタノール（アルコール）、エトミデート、キャバラクトン（Ｋａｖａｌａｃｔｏｎｅ）（カバカバ）、ロレクレゾール、プロガビド、プロパニジド、ＲＯＤ−１８８、タツナミソウ、スチリペントール、ワレレン酸（Ｖａｌｅｒｅｎｉｃ Ａｃｉｄ）（カノコソウ）。
【００２３】
Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−２Ｃｌ（−）の共輸送体（ブメタニド又はエタクリン酸）の抑制剤。Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ。２００９年２月号；２９６（２）：Ｆ４４６−５７
セレンスレオニンキナーゼＷＮＫ４は、Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−２Ｃｌ（−）の共輸送体（ＮＫＣＣ１）及びＣｌ（−）／塩基交換輸送体ＳＬＣ２６Ａ６（ＣＦＥＸ）の両方に対し強い薬効のある抑制剤であることが証明されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４年２月１７；１０１（７）：２０６４−９．Ｅｐｕｂ ２００４年２月９日）。
ｍＲＮＡからのＮＫＣＣ１タンパク質の発現は再発現期間の間、嗅内皮質を標的とする核酸のアンチセンス鎖により抑制される。
炎症は典型的にＮＫＣＣ特にＮＫＣＣ１の増加につながる。炎症の典型的なサインはてんかん誘発性皮質に現れ、そして炎症媒介物質は従ってＮＫＣＣ１再発現に寄与する可能性がある。従って、遷延性のインターフェロン−ガンマ暴露はイオン輸送及びＮＫＣＣ１発現を他の組織において減少させ（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００４年１月；２８６（１）：Ｇ１５７-６５．Ｅｐｕｂ ２００３ ９月４）、従って側頭葉てんかん（ＴＬＥ）誘発発作の後に、嗅内皮質（ＥＣ）におけるＮＫＣＣ１再発現を抑制するのに有用である可能性がある。
【００２４】
ＧＡＢＡＢ受容体遮断薬は、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストの活性化による放出の負のフィードバックを遮断することにより、ＧＡＢＡ放出を増大させるのに有用でありうる：
主要サイト：ファクロフェン、サクロフェン、ＳＣＨ−５０９１１。
ＧＡＢＡ異化反応の遮断もまた有用でありうる：ＧＡＢＡ−Ｔ抑制薬、例えば、３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン。
【００２５】
ＮＫＣＣ１抑制薬の利尿効果の抑制は水及びナトリウムのホメオタシスに対する副作用を最小化するのに有用であり得る。１）プロベネシドでの前処置はブメタニド又は他のＮＫＣＣ１抑制薬により発症したナトリウム利尿及び高レニン血症の両方を減少させる。プロベネシドのＮＫＣＣ抑制媒介ナトリウム利尿に対するこのような拮抗作用は明らかにナトリウム排出に対する直接作用に起因せず、おそらくブメタニドの腎尿細管分泌に対する抑制作用の２次性である。インドメタシンはブメタニド処置の間、尿量およびナトリウム排出の増加を鈍化させ、そして、ブメタニド−誘発の血漿レニン活性の増加を抑制する。３）バソプレシン、アルギプレシン又は抗利尿ホルモンとして知られるアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）及びその変異体、例えば、リジンバソプレシン（ＬＶＰ）又はリプレシンは、腎臓内の遠位尿細管及び集合尿細管における水の再吸収を増大させることにより、腎臓内のＮＫＣＣの抑制に起因する水利尿の増加を鈍化させる。
【００２６】
抗けいれん薬は、神経性発作活性の蓄積と拡散を抑制するためにてんかん発作の処置に使用される、イオンチャネル不活性剤を含む広範な薬剤グループである。それらは、てんかん様活性及び興奮性を増大させる下流の変化をさらに抑制するのに有用でありうる。このことは慢性期間において疾病が進行する間、てんかん様活性のＮＫＣＣ１活性への依存性が低下する場合に、特に重要である。カルバマゼピン及びフェニトインは共に現在での第１選択肢の抗けいれん薬である。これらの薬は共にナトリウムチャネルの非活性化状態を安定させ、ニューロンを発火がより起り難い電位にし、そして他の作用も持ちうる。
【００２７】
ガバペンチンの作用の明確なメカニズムは未知であるが、その抗けいれん性作用は電圧ゲートのＮ型カルシウムイオンチャネルを含んでいると考えられている。バルプロ酸もまた電圧ゲートのナトリウムチャネル及びＴ型カルシウムチャネルを遮断する。このメカニズムがバルプロ酸を広範囲の抗けいれん剤にする。他の臨床的に使用される抗けいれん薬はレベチラセタム、ラモトリギン、プリミドン、及びフェルバメートであり、それらはカルバマゼピン及びフェニトインが効かなかった場合とくに有益である。有用でありうる他の抗けいれん薬は、臭化物（臭化カリウム）、カルバメート（フェルバメート）、カルボキサミド（カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、エスリカルバゼピンアセテート）、脂肪酸（バルプロエート−バルプロン酸、バルプロン酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム）、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、果糖誘導体（トピラマート）、ＧＡＢＡ誘導体（ガバペンチン、プレガパリン）、ヒダントイン（エトトイン、フェニトイン、メフェニトイン、ホスフェニトイン）、オキサゾリジンジオン（パラメタジオン、トリメタジオン、エタジオン）、プロピオネート（ベクラミド）、ピリミジンジオン（プリミドン）、ピロリジン（ブリバラセタム、レベチラセタム、セレトラセタム（ｓｅｌｅｔｒａｃｅｔａｍ））、コハク酸イミド（エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド）、スルホンアミド（アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド）、トリアジン（ラモトリギン）、尿素（フェネトライド、フェナセミド）、バルプロイルアミド（ｖａｌｐｒｏｙａｍｉｄｅｓ；バルプロエートのアミド誘導体），アミド（バルプロミド、バルノクタミド）である。
【００２８】
「ＴＬＥを誘発することが既知の発作」には、限定されないが、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、脳腫瘍、感染症、脊髄膜炎、血管形成異常を含む。
【００２９】
「ＮＫＣＣ１抑制剤」は限定されないが、ループ利尿薬（即ち、ヘンレループの厚い上行脚の中のＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−担体を抑制し、それによりナトリウム、カリウム及び塩素イオンの再吸収を抑制する利尿薬）を含む。有用なループ利尿薬は、トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、例えばそれらの塩及びエステルである。）他のＮＫＣＣ１抑制剤はＧＡＢＡ−Ｔ抑制薬を含む：３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン。
【００３０】
本明細書で使用される「患者」又は「被験者」とは、本発明に基づく組成物によるてんかん処置を含む処置が行われる動物、一般的には哺乳類、好適にはヒトを示す。これらのヒト患者のような特定の動物に特異的な感染症、容態、または疾病の状態の処置において、「患者」とはその特定の動物を示す。
本明細書で使用されているように、「処置」とは症状の進行の防止、速度の低減、遅延、抑止又は留保することを意味する。
ここで使用される「処置上効果的な量」とは、ＴＬＥを患い、又は発症するリスクのある患者の処置に十分なＮＫＣＣ１抑制剤（選択肢として、１つ以上のＧＡＢＡ調節組成物と組み合わせて）の量を意味する。例えば、効果的な量はＴＬＥ又は関連症候の発症又は進行を遅延させ、速度を遅くさせ、又は防止するのに十分な量を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「抑制的効果的濃度」又は「抑制的効果的量」とは、実質的に又は有意にＴＬＥ又は関連する症候を処置または防止する本発明に基づく組成物の濃度又は量を意味する。
本明細書で使用される「防止的効果的濃度」とは、ＴＬＥ又は関連する症候の発症を防止し可能性を低減するのに予防的に効果的な本発明に基づく組成物の濃度又は量を意味する。「抑制的効果的濃度」及び「防止的効果的濃度」は一般的に「効果的な量」の範疇に含まれる。
【００３２】
「被験者におけるＴＬＥの重症度を減ずる」とは、ある有益な程度までＴＬＥに付随する多くの症候のいくつかを抑制又は寛解することを意味する。例示の目的だけのために言えば、本発明の処置法は側頭葉の小さな領域に影響を及ぼし、そして意識には影響を与えない単純部分発作（ＳＰＳ）の悪影響を寛解又は低減する。これらは初期に感覚を引き起こす発作である。これらの感覚は記憶に関し、例えば、既視感（精通感）、未視感（未精通感）、特定の単一又は１組の記憶、又は記憶喪失である。感覚は実際には存在しない音、又は旋律のような聴覚性、或いは味のような味覚性、又は匂いのような嗅覚性でありうる。感覚はまた視覚的でありえ又は皮膚の感覚又は内臓の感覚でありうる。後者の感覚は体中を移動するようである。不快性又は多幸性感覚、恐怖、怒り、及び他の感情もまた単純部分発作（ＳＰＳ）の間起こり得る。多くの場合、ＴＬＥのＳＰＳを患う人は、感覚を記述するのが困難である。ＳＰＳは多くの場合「発作の前兆」と呼ばれ、更に激しい発作の前触れと考えられることもある。このような感覚は、本発明の方法を適用することにより軽減する。
【００３３】
他の事例では、複雑部分発作（ＣＰＳ）の重症度が本発明の方法を適用することにより軽減する。このような発作は意識をある程度障害し、通常はＳＰＳと共に発症し、その後側頭葉の大部分に拡がる。徴候は無動凝視、手及び口の自動的運動、他人への応答不能、異常発言、又は異常行動を含む。
更に他の事例では、本発明の方法は続発性全汎強直間代発作（ＳＧＴＣＳ）に付随する徴候の重症性を軽減する。これらは初期にはＳＰＳ又はＣＰＳで発症し、その後、腕、体幹、及び脚が曲がった位置又は伸ばした位置で硬化する。この後、脚と体幹の突然の粗いけいれんが起こる。
【００３４】
「同時投与」という言葉は２つ以上の活性化合物を、ＴＬＥ又はそれに関連する徴候を処置又は防止するのに有効な量だけ投与することを意味する。同時投与という言葉は、好適には２つ以上の活性化合物を患者に同時に投与することを意味するが、その化合物が正確に同時刻に投与される必要はなく、効果的な濃度が血液、血清、血漿又は肺組織内で同時に発見されるように化合物の量が患者又は被験者に投与されればよい。
「慢性的に投与される」又は「慢性投与」とは、一連の処置の中で、ＮＫＣＣ１抑制剤及び、選択肢として、ＧＡＢＡ調節組成物を、被験者の状態又は被験者から提示される徴候により変化するある期間内に、１回より多い回数投与することを意味する。
【００３５】
本発明の方法は、ＮＫＣＣ１抑制剤とＧＡＢＡ調節組成物が担体材料で組合わされる剤形を使用してもよい。剤形と投与経路は処置される被験者及びＴＬＥ又は関連徴候の状態により異なる。同じ観点から、本願の方法は、０．２５ミリグラム−１グラム、より好適には約１ミリグラム−約７５０ミリグラム、更に好適には、約１０ミリグラム−約５００から６００ミリグラムの間のＮＫＣＣ１抑制剤とＧＡＢＡ調節組成物を含む剤形の投与を必要とする。
特定の患者に対する特定の投薬及び投与計画は種々の要素により異なることを理解しなければならない。それら要素は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的健康、性別、食事制限、投薬の時間、排泄速度、薬の組合せ、及び処置担当医の判断、及び処置中の特定の疾病又は症状の重症度を含む。
【００３６】
活性化合物の投与は、連続性（静脈内持続点滴）から日に数回の経口投与（例えば、１日４回（Ｑ．Ｉ．Ｄ．））までの範囲が有り、また、投与の他の経路の中で、経口、外用、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（これには浸透促進剤を含んでもよい）、バッカル、及び座薬を含んでよい。腸溶性経口錠も化合物の経口投与経路からの生物学的利用能を高めるため使用可能である。最も効果的な剤様は、選択された特定の薬剤の薬物動態および患者の疾病の重症度に依存する。経口剤様は投与の容易性及び予期される患者の応諾から特に好適である。
本発明はさらに以下の実験的セクションで記述されるが、それは説明目的のためだけであり、限定するものではない。
【００３７】
（実験の部）
（材料及び方法）
（ＴＬＥ誘発）
全てのプロセスはニューメキシコ大学健康科学センターに所在の動物介護及び使用委員会により承認され、また全米健康局の実験動物のケア及び使用に関するガイドに従っている。本実験のプロトコルはアンドレ氏他による刊行物のプロトコル（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）を僅かに変更したものである。発作誘発の２４時間前に生後２−３カ月の雄のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットが皮下注射で等浸透圧のＮａＣｌ生理食塩水に溶解した３ｍｍｏｌ／ｋｇの塩化リチウムを投与された。
その後ピロカルピンが皮下注射（等浸透圧のＮａＣｌ内２５ｍｇ／Ｋｇ）で投与された。一度大脳辺縁系のけいれんが始まると、てんかん重積（ＳＥ）の発症を確認するため皮下針ＥＥＧ電極が配置される。てんかん重積は連続高振幅脳波（ＥＥＧ）スパイキングの発生として定義される（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他、１９８９）。このような針は２５ゲージの皮下注射針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から、ハブを切り取り、そして６０度曲げて形成され、それにより針は定位置に留まる。１本の針が頭皮に皮下挿入により頭頂皮質に挿入され、そして対照電極として機能する他の１本の針が肩甲骨に挿入された。グラスモデル８脳波計（アストロ−メド（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ）社、ウエストワーウィック、イリノイ州）を使用した脳波（ＥＥＧ）記録は、連続高振幅スパイキングをてんかん重積（ＳＥ）発症後１時間に亘って示し、それは頭蓋内に埋め込まれた電極での従前の研究で記録された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ氏他、２００５）正常な脳波に対し明確なコントラストを示した。その後記録は全体的に停止された。硫酸アトロピン（１０ｍｇ／Ｋｇ皮下注射）及びジアゼパム（４ｍｇ／Ｋｇ筋肉内注射）が生存率を上げ、不安を軽減させ、そして筋肉弛緩を誘発するため投与された。ジアゼパムの投与は、発作を停止出来なかったが、１時間以内に筋肉弛緩を誘発し、ラットは脚を使わず腹側面を下にして横になった。アトロピンも発作を停止出来なかった。てんかん重積（ＳＥ）発症後１２時間後に脳波が再び５−１０分間記録され、全てのラットは断続的又は全体に形成される、即ち脳波スパイキングのバーストを有した。この時点でスパイキングのバーストや連続するスパイキングの列のような全体的な脳波スパイキングを示したこれらのラット（ケースの約２０％）は、追加の２ｍｇ／Ｋｇのジアゼパム筋肉内注射を投与された。てんかん重積（ＳＥ）の発症後１２時間後にリンゲル溶液内の５％ブドウ糖が皮下注射で投与された。
【００３８】
このプロトコルはてんかん重積（ＳＥ）の発症後１時間後にジアゼパムを投与した点で、２時間後に投与したアンドレ（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）のプロトコルとは異なる。更に我々は末梢性ピロカルピンの影響（Ｄｕ氏他、１９９５）を軽減するため、アトロピンを投与した。従って我々のプロトコルはよりマイルドな発作を動物に提供すると信ずる。
【００３９】
アンドレ（Ａｎｄｒｅ）氏他のプロトコルは、信頼性を持って成体ラットの１００％にてんかんを誘発したと記載されている（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ｂ，Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。これは、僅かに高いピロカルピン投与量とリチウムを使用したこの研究所のそれより早期のプロトコルからも真実である（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ｂ，Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）。我々のラボでアンドレ（Ａｎｄｒｅ氏他、２００７）のプロトコルを使用した研究では、全てのラットが２８．６±２．４３（標準誤差）日（ｎ＝１４；２４時間／１日の連続ビデオ録画、Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ氏、非公開結果）の潜伏期の後、ランク３，４又は５の自発性発作を発症した。１体のラットだけが１５日目に発作を起こした。２１日までには４体のラットが発作を起こした。
これらの潜伏期データを正規分布に適合させることにより、平均約２５％のラットがピロカルピン／２時間後ジアゼパム処置の３週間以内に最初の発作を起こすことが予期された。
しかし屠殺する前の観察及び取り扱い中にはラットに発作は見られなかった。
我々のマイルドなプロトコルのてんかんの転帰がてんかん重積（ＳＥ）後８−１６週間、１ラット当り合計３６時間までのビデオ録画をしながらテストされた。そして、この期間に１３体全てのラットに自発的発作が観察された。てんかん重積（ＳＥ）のラットの新しい２グループ（合計１２体）によって、我々は潜伏期期間が１２．７±１．７（平均±標準誤差）週間であると量定した。全体で２０３体のラットが使用された、リチウム対照ラット５６体、てんかん重積（ＳＥ）後２週間のラット４２体、ＳＥ後３週間のラット４７体、ビデオ録画用ＳＥ後ラット５８体。
【００４０】
（スライス準備）
全ての実験は、側頭葉新皮質、嗅内皮質、海馬台及び腹側海馬を含む鋭い形状の水平大脳スライス上で行われた。対照又は発作後２又は３週間のラットは深くケタミンとキシラジン（それぞれ８５と１５ｍｇ／ｍｌ）麻酔をかけられそして断頭された。大脳は迅速に移動され酸素負荷された（９５％酸素、５％炭酸ガス）氷冷の３ ＫＣＬ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ４、６ ＭｇＳＯ４、２６ ＮａＨＣＯ３、０．２ ＣａＣｌ２、１０ グルコース、２２０ ショ糖及び０．４３ ケタミンを含む（ｍＭで）切断溶液中に置いた。スライス（３５０ミクロン）は氷冷の切断溶液内でビブラトーム（Ｄｏｓａｋａ ＤＴＫ−１０００）を使用して薄切りにされ，そこからリカバリー用に９５％酸素／５％炭酸ガスで３４°Ｃで平衡化された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、ｍＭで：１２６ ＮａＣｌ，３ ＫＣｌ，１．２５ ＮａＨＰＯ４，１ ＭｇＳＯ４，２６ ＮａＨＣＯ３，２ ＣａＣｌ２及びグルコース）内に移された。１時間後ＡＣＳＦが取り替えられ、そして記録に使用されるまで室温で保管された。
【００４１】
（電気生理）
個々のスライスは固定台顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ社、ジュネーブ、ドイツ）に搭載された記録用チャンバに移され、そして暖められ（３４°Ｃ）、酸素負荷された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で２ｍｌ／分で灌流された。細胞内記録は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンから、低めの電極抵抗に対しては１Ｍ ＣｓＳＯ４又は０．５Ｍ酢酸カリウム／０．５Ｍ塩化カリウム、又は改良空間クランプ用には２Ｍ ＣｓＳＯ４／１Ｍ塩化カリウムを充填された、ホウケイ酸ガラスの鋭い微小電極（８０−１５０ＭΩ）を使用してなされた。Ｃｌ−輸送遮断剤がない場合は、全ての細胞内液はＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位に対して同一の結果を示し、逆転電位は従って蓄積された（Ｍｉｓｇｅｌｄ氏他、１９８６参照）。ブメタニドによるＣｌ−輸送遮断の間、０．５Ｍ酢酸カリウム／０．５Ｍ塩化カリウムを充填された微小電極がＥＩＰＳＰを脱分極方向に約２０ｍＶだけ変移させるのが確認された。従ってＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位に対するブメタニドの影響に関する全ての最終的な記録／データは、１Ｍ Ｋ２ＳＯ４又は２Ｍ ＣｓＳＯ４／１Ｍ塩化カリウムで充填された微小電極で得られた。
【００４２】
ニューロンは、皮質の厚さの１／４まで、ナノステッパー微小位置決め装置（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、オッペンハイム、ドイツ）を使用して、内側嗅内皮質内のアンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）のすぐ上に刺入された。記録はＡｘｏｃｌａｍｐ２Ｂアンプを使用して記録され、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ユニオンシティ、カリフォルニア）を使用してデジタル化し記録された。マイナス６８ｍＶまでの静止膜電位（ＲＭＰ）が負のニューロンが、マイナス８５ｍＶまでの過分極パルスを使用して、錐体ニューロンを示唆するＩｈの存在をテストされた（Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００２；Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００３）。この基準では記録されたニューロンの７５％は錐体であり、残りは多極ニューロンと推定された。Ｈａｍａｍ氏他の研究では鋭い電極を第５層に刺入されたニューロンの８５％が錐体ニューロンに典型的な顕著な長い先端樹状突起を示した（Ｈａｍａｍ氏他、２０００）。我々の研究と対照的にこの研究は非錐体ニューロンにもＩｈの存在を報告した（Ｈａｍａｍ氏他、２０００）。同心性２極刺激電極（直径２００ミクロン、ＨＦＣ Ｉｎｃ．社製、メイン州、米国）が嗅内皮質（ＥＣ）の第５層に、記録用電極から約１５０−２５０ミクロンの距離に配置された。刺激（７０−１００μ秒、１００−８００ｎＡ）は刺激分離ユニット（Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｉ、エルサレム、イスラエル）に接続されたマスター８プログラム可能パルス発生機により制御された。興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）及び抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）に対する全入力−出力関係が記録され、そして７０−９０％の最大応答を与える刺激強度が使用された。そこでは計測された刺激強度が最大応答の５−１０％を誘発するまで減少した。
【００４３】
図２ＡはＧＡＢＡＡ受容体−媒介シナプス後電位の逆転電位を測定するのに使用されるプロトコルを示す。単シナプス性のシナプス後電位（ＰＳＰ）がグルタミン酸受容体遮断剤ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）の存在下で誘発された。刺激強度は最大誘起シナプス後電位（ＰＳＰ）振幅の約８０％となるように調整された。電場刺激に先だって、膜電位（Ｖｍ）は正又は負の直流（ＤＣ）パルス（５００ｍｓ、４００ｐＡ以上）で変化された。膜電位が安定に達した後、シナプス後電位（ＰＳＰ）が誘起された（図中＊印）。安定膜電位（図２Ｂ、○印）とシナプス後電位（ＰＳＰ）のピーク電圧（図２Ｂ、×印）の両方の電流−電圧関係がプロットされ、そして線形回帰がシグマプロットを使用して計算され、直接、膜電気伝導度の値を与えた。直線的な膜動作の可能性領域内で電流−電圧関係を測定することにより、遅延整流の電圧依存活性化又は他の整流電流に起因する接線コンダクタンスの誤りを避けることができる。逆転電位は回帰直線の交点により決定された。典型的なシナプス後電位（ＰＳＰ）トレースが対照と３週目の実験動物で示される。ＣＮＱＸ、ＤＬ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸、ピクロトキシン、ブメタニド、ピロカルピン及びアトロピンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社（セントルイス、ミズーリ州）より入手した。ジアゼパムはＨｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．（レイクフォーレスト、イリノイ州）から入手した。１０００倍に濃縮された原液はフリーザーに保管され、ＡＣＳＦで使用する前に希釈された。原液に関しては、ＣＮＱＸとピクロトキシンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解され、ブメタニドはエタノールに溶解された。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１：１０００）もエタノール（１：１０００）もシナプス後電位（ＰＳＰ）、電流−電圧関係、又はバースト応答に影響を与えなかった。
【００４４】
（免疫ブロッティング）
免疫ブロッティング研究のため、内側嗅内皮質（ＥＣ）の第５−６層が３５０ミクロンの厚さの切片から切り裂かれ、ドライアイス上でスナップ冷凍され、そしてマイナス８０℃で処理まで保管された。膜断片の準備のため、組織は２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ抑制剤（ｐＨ７．２）を含む緩衝液内で均質化され、その後、前記のように（Ｐａｙｎｅ氏他、１９９６）分画遠心分離された。精製された膜断片（５０μｇ）はその後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７％）及び抗ＫＣＣ２（１：１０００；ニューロマブ（ＮｅｕｒｏＭａｂ）クローン Ｎ１／１２、ＵＣデービス）と抗アクチン（１：５００；シグマ（Ｓｉｇｍａ））をそれぞれ使用した免疫ブロッティング用に処理された。
抗原−抗体複合体が、増大した化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、アーリントンハイツ、イリノイ州からのＥＣＬ−プラス）から検知され、Ｘ線フィルムはＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。
【００４５】
（蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ））
ＦＩＳＨ用に大脳スライスを準備する場合、１つの大脳の半球がドライアイス／エタノールスラリー内で平衡化されたイソペンタンのビーカー内で急速冷凍され、そしてマイナス８０℃で保存された。水平脳部位（１６ミクロン）がクリオスタットを使用して準備され、スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，ＶＷＲ）上に配置され，空気乾燥され、処理までマイナス８０℃で冷凍保存された。
【００４６】
ＮＫＣＣ１（クローンＩＤ４８２４５５６、アクセス番号ＢＣ０３３００３）及びＫＣＣ２（クローンＩＤ６８３８８８０、アクセス番号ＢＣ０５４８０８）プラスミドはオープンバイオシステム（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社（ハンツビル、アラバマ州）から入手した。ＮＫＣＣ１ｃＤＮＡシークエンスは、Ｓａｌｌ／ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位間のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲベクターに挿入された。ＫＣＣ２ｃＤＮＡシークエンスは、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位間のｐＹＸ−Ａｓｃベクターに挿入された。プラスミドはその後ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２シークエンスを確認するため配列決定された（ＤＮＡリサーチサービス、ニューメキシコ大学、健康科学センター）。ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩは共に異なる長さのアンチセンス鎖を生成するのに使用され、ＫｐｎＩはセンス鎖を生成するのに使用された（ニューイングランド バイオラボ社、Ｉｐｓｗｉｃｈ，マサチューセッツ州）。ＫＣＣ２のアンチセンス鎖はＡｓｃＩを使用し、センス鎖はＰａｃＩを使用して生成された。制限消化反応は３７℃で２時間インキュベートされた。
【００４７】
ＮＫＣＣ１ａ，ｂ及びＫＣＣ２ａ，ｂに対する単一標識化ＦＩＳＨが前述（Ｇｕｚｏｗｓｋｉ氏他、１９９９）のように実行された。概要は、ジゴキシゲニン標識化ＫＣＣ２及びＮＫＣＣ１全長アンチセンスリボプローブが、直線化されたｃＤＮＡから商業的に入手可能な転写キット（Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔ，アンビオン、オースチン、テキサス州）を使用して生成され、そして事前混合されたＲＮＡジゴキシゲニンがＴ３重合酵素（ロシェ分子生化学、パルアルト、カリフォルニア州）を使用してヌクレオチドを標識化した。ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２のジゴキシゲニン標識化リボプローブのハイブリダイゼーションは共に５６℃で一晩かけて異なるスライド（１ｎｇ／μｌ）上で行われた。その後、抗ジゴキシゲニン セイヨウワサビ過酸化酵素複合体（ＨＲＰ；１：２００；ロシェ分子生化学、パルアルト、カリフォルニア州）が４℃で一晩インキュベートされた。ＴＳＡ−シアニン−３（Ｃｙ３）（１：５０；パーキンエルマー、Ｗａｌｔｈａｍ， マサチューセッツ州）がＨＲＰ複合体を検知するのに使用された。核は、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）によって対比染色された。画像は、スピンニングディスク共焦点システム（スピンニングディスク共焦点画像化装置ＣＡＲＶ、Ａｔｔｏ生科学、ロックビル、メリーランド州）及びＣｏｏlＳＮＡＰ−Ｈｑ ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ科学、ツーソン、アリゾナ州）を備えるニコンＴＥ２０００Ｕ落射蛍光顕微鏡（２０倍対物）により獲得された。画像はＭｅｔａＭｏｒｐｈソストウェア（ユニバーサル画像）を使用して更に分析され、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。信号は背景（画像内の明確にネガティブな領域をカバーする注目画像領域（ＲＯＩ）で得られた）に対して補正され、核染色に対する比率が計算された。ここにおいてこれらのデータは対照ラットに関して正規化されていた。
【００４８】
（免疫組織化学的検査）
スライスは１００ｍＭリン酸緩衝食塩水内の４％パラホルムアルデヒドで一晩固定化され、ＰＢＳ内の１５％及び３０％ショ糖で凍結保護され、その後最適切断温度（ＯＣＴ）化合物（サクラファインテック、トーランス、カリフォルニア州）内で凍結された。
免疫組織化学的検査が室温で２４時間かけて３００ミクロン浮遊部位上で、抗ＫＣＣ２（ニューロマブ（ＮｅｕｒｏＭａｂ）クローン Ｎ１／１２、ＵＣデービス））又はＮＫＣＣ１抗体（ラビットポリクローナル、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州；結果はカリフォルニア大学リバーサイド校のＣ．Ｌｙｔｌｅ博士から提供されたマウスＮＫＣＣモノクローナル抗体ＭＡｂＴ４で得られた結果と合致した）で実施された。スライスはガラススライド上に搭載され、画像がＢｉｏｒａｄ二光子顕微鏡とスライス表面下７５ミクロンに配置された４０倍対物レンズにより撮像された。ニューロトレース蛍光染色（モレキュラープローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）がクリトスタットを使用して調製された６０ミクロン区画内のニューロンを対抗染色するのに使用され、そして画像はＣＣＤカメラと４０倍対物レンズを備える落射蛍光顕微鏡で撮像された。ＮＫＣＣ１抗体での免疫染色のため、組織区画は遮断前に１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び８％２−メルカプトエタノールで５分間前処理された（Ｓｕｎｇ氏他、２０００）。この前処理を伴わない多くの試みにおいて、ＭＡｂＴ４抗体で明確なＮＫＣＣ信号を獲得するのに失敗した。全ての区画はＰＢＳ−Ｔ（０．２％トリトン−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））内の１０％正常ヤギ血清で遮断され、一晩４℃でそれぞれの１次抗体（１：２００）と共にインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔで広範に洗浄した後、組織区画はＣｙ３接合ヤギ抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ（１：２００、ジャクソン免疫研究所、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）内でインキュベートされた。対照は１次抗体の無い同一の処理を受け、そして常にネガティブであった。区画は広範にＰＢＳ−Ｔ内で洗浄され、観察のためカバーグラスを付けられた。細胞核の対抗染色にはヘキスト３３３４２ＤＮＡ染色（１０ミクロン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）が使用された。
【００４９】
（統計）
平均±標準誤差が別途指定されない限り示される。データのグループ間の統計的比較はシグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）ソフトウェアで、必要に応じ独立又は対応のある両側スチューデントのt−検定が帰無仮説を検証するため実行された。０．０５未満の確率値Ｐは統計的に有意であると見做された。
【００５０】
（実施例１）
（てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンにおける多シナプス性バースト応答の発生）
対照ラットからの切片において、嗅内皮質（ＥＣ）第５層に対する単一のシナプス前性の刺激が静止膜電位−７０ｍＶにおいて振幅２０ｍＶまでの単シナプス性の急速な興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を第５層ニューロンに誘発し（図１Ａ）、その後、膜保持電位により振幅が異なる急速な抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）を誘発する。対照的に、てんかん重積（ＳＥ）後３週間後の記録では、刺激強度を対照調製より大きく減少させた場合でも単一シナプス性刺激に応答して多シナプス性てんかん活性を示した。（図１Ｂ）多シナプス性バースト応答は、より高い脱分極電位への活動電位の発火の場合を除いて、ＤＣ注入による−９５ｍＶから−６０ｍＶまでの範囲のシナプス後性膜電位の変化によっては殆ど変化を示さなかった。示された実施例では、弱い刺激での多シナプス性脱分極の僅かな遅れが、初期興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を明白に顕在化させ；そして振幅で僅か１−２ｍＶとして見える。（挿入図、細胞は負のＤＣにより発火を防ぐため過分極されている。これらの弱い刺激は、高信頼度で多シナプス性バースト応答を、２週目でテストされた１０．８％のニューロン（ｎ＝３７）で，そして３週目でテストされた６１．８％のニューロン（ｎ＝３４）で誘発した（図１Ｃ）。この量定のため、多シナプス性バーストは、−７５ｍＶ<ＲＭＰ<−６８ｍＶから誘発され、半振幅で１５０ｍｓ以上継続するシナプス後性応答として定義された。対照切片では、このような応答は４２の記録されたニューロンの内で１つにおいてのみ観察された。
【００５１】
図１およびその図に反映されているデータを獲得した実験のさらなる詳細は以下の通りである。
（図１：てんかん重積（ＳＥ）後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの増大した多シナプス性バースト興奮）
Ａ：無処置ラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの単一シナプス前性刺激（＊，５００ｎＡ，７０μＳ）に対するシナプス後性応答。
Ｂ：てんかん重積（ＳＥ）３週間後の第５層ニューロンのはるかに小さい刺激（＊，１００ｎＡ，７０μＳ、図１０及び１１も参照）に対する多シナプス性バースト応答。初期に誘起されたシナプス後電位（ボックス内に示す）は、拡大挿入図（３０ｍｓＸ５ｍＶ）に示される。この記録に対しては、細胞は発火を防ぐため負のＤＣにより過分極されている。
Ｃ：単一の刺激に多シナプス性脱分極で応答する嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの比率を示す棒グラフである。単一の刺激は対照ラットから（ｎ＝４２）の嗅内皮質（ＥＣ）第５層細胞の内の僅か２．４％でしか多シナプス性応答を誘起しないが、てんかん重積（ＳＥ）後２週間後（ｎ＝３７）及び３週間後（ｎ＝３４）のラットではそれぞれ１０．８％と６１．８％の細胞が多シナプス性応答を誘起した。
【００５２】
（実施例２）
（てんかん重積（ＳＥ）後、ＧＡＢＡＡ作動性のシナプス後電位（ＰＳＰ）が脱分極化する）
長期に渡って確立されたＴＬＥを有する海馬台ニューロン亜集団におけるＥＩＰＳＰ及びＣｌ−輸送体システムの重要な変化の現存する観察（Ｃｏｈｅｎ氏他、２００２；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６；Ｐａｌｍａ氏他，２００６；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄ氏他，２００７；Ｍｕｎｏｚ氏他，２００７；Ｓｅｎ氏他、２００７）に依存して、我々は、バースト活性を促進する可能性のある、極めて初期の対象段階におけるＧＡＢＡ作動性伝達の継続的変化を探した。図２Ａは、ＣＮＱＸ（１０μＭ）とＡＰＶ（５０μＭ）によるグルタミン酸塩受容体の遮断の間の単シナプス性ＧＡＢＡＡ作動性シナプス後電位（ＰＳＰ）を示し、そのＰＳＰは電場刺激により嗅内皮質（ＥＣ）第５層に誘発され、一方細胞は異なる安定膜電位に保持された（前記（材料及び方法）参照）。ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））は、安定膜電位（図２Ｂの○）及びＰＳＰのピーク電圧（図２Ｂの×）の両方の電流−電圧関係をプロットし、線形回帰を計算することにより決定された。膜電位とＰＳＰ線形回帰との交点が逆転電位である（図２Ｂ、矢印）。対照ラットとＳＥ後２週目と３週目のラットからの代表的ニューロンの電流−電圧プロットは、ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））の進行性変移を示し、それらはそれぞれ、対照の−６８．３±２．１ｍＶから、ＳＥ後２週目の−５２．６±１．８ｍＶ、ＳＥ後３週目の−３４．８±１．４ｍＶであった（図２Ｂ１−Ｂ３）。データがヒストグラムで示された場合、ＳＥ後２週目と３週目の両方で、処置ラットからのスライス内に２つの細胞クラスが観察された（図２Ｃ、ｎ＝８４）。１つのクラスでは平均ＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））は対照と類似していた、即ち静止膜電位（ＲＭＰ）に対し５ｍＶ未満ポジティブであった（２週目と３週目に分析した細胞全体のそれぞれ２３．５％及び１９．２％）。もう１つのクラスは強い変移を示した（２週目と３週目に分析した細胞全体のそれぞれ７６．５％及び８０．８％）。両方の細胞クラスは同一のラットからの複数のスライス内だけでなく、単一のスライス内にも観察された。ＳＥ後３週間で約２５％と推定された（前記（方法）参照）屠殺前自発発作は、これらのラットからのニューロンのＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））をさらに変移させ、これによりさらに強く変位したＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））を有する亜集団を確立する可能性が有った。ヒストグラムは、このような顕著なニューロン亜集団のサインを全く示さず、そのことは、自発的発作が全く起らなかったか、あるいはそれがＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））の更なる変移を引き起こさなかったかを示唆した。
【００５３】
集団データの棒グラフ（図２Ｄ）は、変化が起こらなかった集団の部分を除外した、ＰＳＰ逆転電位の平均値の時間経過変移をまとめたものである（Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７１．９±１．４６ｍＶに対し３．６±０．５ｍＶポジティブ、ｎ＝２４；ＳＥ後２週目Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７０．９±２．８ｍＶに対し１８．０±３．６ｍＶポジティブ、ｔ５６＝８．３、Ｐ＝０．００６、ｎ＝２６；ＳＥ後３週目Ｅ（ＰＳＰ）＝静止膜電位（ＲＭＰ）−７２．９±２．８ｍＶに対し４５．１±６．２ｍＶポジティブ、ｔ４８＝９．８１、Ｐ＝０．０００８、ｎ＝２１）。３週目の測定点において、変移集団及び非変移集団のそれぞれ８１％と７５％が錐体ニューロンであり、それぞれ１９％と２５％が多極性ニューロンであった。これらの分布は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層のこれら２つの細胞タイプの全体分布から有意に差異がなかった（Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００２；Ｅｇｏｒｏｖ氏他、２００３）。３週目のポジティブな変移がＰＳＰ逆転電位（Ｅ（ＰＳＰ））をスパイク開始のレベルにごく近い値に持ってゆくことは注目すべきである。従って、てんかん重積（ＳＥ）後のＧＡＢＡ放出は反復性発火を効果的に制限しない可能性が有り、逆にニューロンを興奮させる可能性がある。
【００５４】
対照ニューロン内の僅かに脱分極した静止膜電位に対する抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）は、明らかにＣｌ−の外向き輸送だけが発現する状態に対して不可解に見えるかもしれない（以下参照）。Ｃｌ−の逆転電位は静止膜電位にたいしネガティブ（又はＣｌ−の外向き輸送がＣｌ−の流入の後にのみ活性になった場合、静止膜電位と等しい）でなければならない。しかし、ＧＡＢＡＡチャネルは炭酸水素イオンをある程度、陰イオンの約１／６、伝導し、ＧＡＢＡ−ＰＳＰ逆転電位をＥＣｌ−とＥＨＣＯ３−との間に置く（Ｂｏｒｍａｎｎ氏他，１９８７）。細胞内エネルギー代謝は２酸化炭素を生成し、それは炭酸脱水酵素により触媒されて水と逆反応し、炭酸水素イオンを生成する。このプロセスは強い外向きの傾斜をＨＣＯ３−に与え、逆転電位を−１０ｍＶにまでポジティブ側にする（Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他，２００７）。このことは正常な動物ではシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位をＥＣｌ−よりポジティブな値に変移させる（Ｓｔａｌｅｙ氏他，１９９５）。また，Ｃｌ−の内側輸送の限定的出現は、僅かに脱分極したシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位を生成可能である（以下参照）。
【００５５】
逆転電位の変移に加えて、膜接線コンダクタンス、およびコンダクタンスが、シナプス後電位（ＰＳＰ）がてんかん重積（ＳＥ）後に進行的に減少する間、増加する（図２Ｂ１−Ｂ３参照）。静止コンダクタンスは、対照での５．９±０．７ｎＳから、てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間でそれぞれ４．８±０．７（ｔ１２＝３．６６、Ｐ＝０．０３２）と３．６±０．４ｎＳ（ｔ１３＝３．７９、Ｐ＝０．０２６）に減少した。これは恐らく漏出イオンチャネルの劣化による（Ｂｅｒｎａｒｄ氏他，２００４；Ｂｏｒｔｅｒ氏他，２００６）。同様に、ＧＡＢＡ活性化ピークコンダクタンスは、対照での８．５±０．６９ｎＳから、てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間でそれぞれ２．１±０．４３（ｔ１２＝１３．１２、Ｐ＝０．００１８）と０．２４±０．０７ｎＳ（ｔ１３＝６．１６、Ｐ＝０．０００５）に減少した。この減少は、１００Ｈｚで３度繰り返された、入出力関係の最大値に近い刺激強度により誘発された、大きなＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）により確認され、それは、３度目の刺激後、３グループ全てに大きな非撹乱ＰＳＰを与えた。
【００５６】
図２、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図２．てんかん重積（ＳＥ）後２週間後と３週間後のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位のポジティブ変移）
図２Ａ：対照（上側の軌跡）とてんかん重積（ＳＥ）後３週間後のラット（下側の軌跡）からの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のニューロンの、鋭い微小電極により記録された、５つの異なる膜電位において誘起された、単一シナプス性ＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位。膜電位は微小電極からの電流の印加（５００ｍ秒パルス）により変化した。＊（アスタリスク）はシナプス前性刺激の時点を示す。記録は、ＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸受容体拮抗薬ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＮメチルＤアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗薬ＡＰＶ（５０μＭ）の存在下で行なわれた。
図２Ｂ１−２Ｂ３：刺激前性膜電位（図内の○印）及び刺激後１５ｍ秒後に測定されたＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）の絶対値（図中×印）と電極電流との電流―電圧関係。データは図２Ａのプロトコルを使用して獲得され、線形回帰で適合された。膜電位とＰＳＰプロットとの交叉はＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ，矢印）で起こる。
図２Ｃ：測定３時点で２ｍＶ未満のＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位を示す嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のニューロンの数のヒストグラム。包絡線（点線の曲線）は５つの明白な集団のガウス適合である。対照ラットからのニューロンでは、ＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ）ガウス適合は中央値約−６９ｍＶを有した。てんかん重積（ＳＥ）後２週間及び３週間後のラットからのニューロンは、非変移と有意の変移の２つのクラスに分かれた。２週間目には７７％のニューロンが約−５４ｍＶ、３週間目には８１％のニューロンが約−２８ｍＶの変移した平均値を示した。非変移ニューロンは集団のそれぞれ２３％と１９％を占めた。それらのＰＳＰ逆転電位（ＥＰＳＰ）分布は対照グループから識別可能であった。対照、ＳＥ後２週間後、３週間後の記録された細胞数Ｎはそれぞれ、２４，３４及び２６であった。
図２Ｄ：ＳＥ後２週間後（ｎ＝２６）、３週間後（ｎ＝２１）の変移集団の静止膜電位（ＲＭＰ）に対するＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位（ＥＰＳＰ）の平均値±標準誤差は、対照と比較して逆転電位の進行性脱分極変移を示す（ｎ＝２４，ＳＥ後２週間後（＊＊）ｐ０．０１未満、ＳＥ後３週間後（＊＊＊）ｐ０．００１未満）。
【００５７】
（実施例３）
（てんかん重積（ＳＥ）後ＮＫＣＣ１ｍＲＮＡの増加）
てんかん重積（ＳＥ）後強く脱分極するＧＡＢＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）は、活性Ｃｌ−内側方向輸送を必要とする。しかし成体ニューロンには殆どＮＫＣＣ１の発現がないことが知られている（Ｄｅｌｐｉｒｅ，２０００；Ｗａｎｇ氏他，２００２）。我々は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内の成人ニューロンで、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ発現が、初期の発症段階を再現して、てんかん重積（ＳＥ）後の潜伏期に再確立されるか否かを検証した（山田氏他、２００４；Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他，２００７）。我々は、従前の研究と適合して、対照ラットの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ蛍光発光が非常に低いか存在しないことを発見した。対照的に、リチウム−ピロカルピン誘発てんかん重積（ＳＥ）後、２週間後、特に３週間後では、明瞭なＮＫＣＣ１染色を確認した（図３Ｂ）。てんかん重積（ＳＥ）後、２週間後では、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ蛍光発光が対照の２３７±３３．４％に増大し、３週間後では４５２±３３．５％に増大した（図３Ｂ、Ｅ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、前記（方法）参照、各グループ４ラット、それぞれｔ３８＝２．１５、Ｐ＝０．０３７及びｔ４９＝３．５４、Ｐ＝０．０００９）。これらのパーセントは、対照における発現が低いことを前提にすると、幾分任意であるが、発現の非常に大きな増加を示している。ＤＡＰＩによる核の対抗染色は、分析期間中には細胞数に変化を与えなかった（対照、ＳＥ後２週間後及び３週間後のそれぞれにおいて、１２．２±２．７，１２．８±３．４及び１２．５±３．１細胞核数／５００平方ミクロン、それぞれｔ６８＝−０．４９，Ｐ＝０．６２及びｔ６８＝−２．３８，Ｐ＝０．２４、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット；図３Ａ２、Ｂ２）。ＤＡＰI及びＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡの画像の重なりは標識化ｍＲＮＡの初期の核周囲の位置を示す（図３Ｂ２）。ＮＫＣＣ１ポジティブ細胞と場内の全細胞との比較分析では、対照組織では細胞の５．１±２．１％の標識化に対して、ＳＥ後２週間後及び３週間後のそれぞれにおいては２８．５±６．７％及び５６．７±４．３％を示した（図３Ｄ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ３８＝３．２７，Ｐ＝０．０４２及びｔ４９＝２．７１，Ｐ＝０．００９６）。
【００５８】
図３、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図３．てんかん重積（ＳＥ）後嗅内皮質（ＥＣ）第５層内において進行的に増大する、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ、Ｃｌ−内側方向輸送）
図３Ａ、Ｂ：蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）は、ピロカルピン誘発発作の３週間後にＮＫＣＣ１のｍＲＮＡが対照（赤い信号、Ａ１，Ｂ１）に比較して発現量の増大を示した。ＤＡＰＩ核染色は細胞数に変化の無いことを示した（青の信号、図３Ａ２、図３Ｂ２）。下方パネルＡ３、Ｂ３は図３Ａ１，２及び図３Ｂ１，２で概観された領域の拡大統合図であり、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの核周辺配置を示す。
図３Ｃ：てんかん重積（ＳＥ）後のＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの増加を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）内の全ＮＫＣＣ１信号に対する核染色の蛍光の比率を生成することにより定量化された。これらの比率はその後、対照ラットからの値に対して正規化された（平均値±標準誤差、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、ＳＥ後２週間後（＊）ｐ０．０１未満、ＳＥ後３週間後（＊＊＊）ｐ０．００１未満）。
図３Ｄ：ＤＡＰＩ染色により決定される、核の数に対する％として表現される、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡ−ポジティブの細胞数の平均値（平均値±標準誤差、ｎ＝約３００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、ＳＥ後２週間後（＊）ｐ０．０５未満、ＳＥ後３週間後（＊＊）ｐ０．０１未満）。
【００５９】
（実施例４）
（ＮＫＣＣ１タンパク質の増加）
潜伏期間中に起こったＮＫＣＣ１のタンパク質レベルの変化を分析するため、蛍光免疫組織化学的検査を実施した。これらのデータはケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社ＮＫＣＣ１抗体によって得られ、そして図４に示すように、ＳＥ後２−３週間において、ＮＫＣＣ１タンパク質の進行的増加を示した。一方対照ラットからのスライスでは、特定の信号はほとんど得られなかった（図４Ａ−４Ｃ）。同様の結果がＭａｂＴ４ ＮＫＣＣ抗体で得られた。ＮＫＣＣ１画像の上に染色核画像（ヘキスト３３３４２）を重ね合わせることにより、特にＳＥ後３週間後において、ＮＫＣＣ１の優先的な核周囲の、そして細胞体性の位置が明らかにされ、ニューロン性タンパク質合成の有意の増加を示唆した（図４Ｂ３、４Ｃ３及び拡大された図４Ｂ４,４Ｃ４）。繰り返すが、ヘキストで染色された核の数は３つのラットグループの間で有意の差異を示さなかった（対照８５．３±５．３に対し、発作後２週間後は９７．７±３．４、発作後３週間後は８６．０±４．９、４ラット、それぞれｔ２０＝−１．３３，Ｐ＝０．２０及びｔ１８＝−２．３５，Ｐ＝０．８１、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット）。図４Ｄは細胞体からのＮＫＣＣ１の蛍光強度の平均値は、発作後２週間後及び３週間後に対照の背景蛍光の約３５０％及び８６０％であったことを示す（ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ６４＝５．３２，Ｐ＝０．０００６及びｔ５１＝４．５６，Ｐ＝０．０００８）。神経線維網ではＮＫＣＣ１の平均蛍光強度は、発作後２週間後及び３週間後に対照の背景蛍光のそれぞれ１２３±２１％及び２２２±４５％であった、その結果は樹状突起内においてＮＫＣＣ１タンパク質が遅延して増加することを示唆した（ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ３２＝４．２５，Ｐ＝０．０２５及びｔ３６＝５．３１，Ｐ＝０．００８）。個々の細胞に関しては、ＳＥ後２週間後と３週間後で、それぞれ細胞体の３１．２±６．９％及び５６．３±１１．２％が明確にＮＫＣＣ１に対しポジティブであったが、対照では明確なものは無かった（図４Ｅ、ｎ＝１００注目画像領域（ＲＯＩ）、各グループ４ラット、それぞれｔ４２＝１１．２４，Ｐ＝０．０００９及びｔ３７＝７．１２，Ｐ＝０．０００７）。
【００６０】
図５ではニューロン特異ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）対抗染色が使用され、発作後３週間後には７７．１±８．１％のニューロンがＮＫＣＣ１ポジティブになったことを示した（対照組織：３．０±１．３％、各グループｎ＝３ラット、それぞれｔ２１＝３．７８，Ｐ＝０．００８及びｔ３３＝４．２３，Ｐ＝０．００１）。ＮＫＣＣ１ポジティブのニューロンの比率がＮＫＣＣ１ポジティブの細胞の比率より高いことが、ＮＫＣＣ１がニューロンにおいて増大していることを示した。ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）ポジティブな細胞数は実験期間中安定し、（対照の３５．４±７．２に対し、発作後２週間後は３７．１±６．４及び３週間後は３６．６±６．７、各グループ３ラット、それぞれｔ１２＝−０．５１，Ｐ＝０．６及びｔ１６＝−０．３０，Ｐ＝０．８）、それは安定的なＨ３３３４２細胞数がニューロン損出とグリア細胞の増大との相殺の結果ではないことを示唆した。ＮＫＣＣ１発現及びポジティブニューロン比率の漸増は、ＧＡＢＡＡ誘発シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の同時発生的進行性脱分極変移を説明するのによく適合した。
【００６１】
図４，５、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図４．ＮＫＣＣ１タンパク質も増加した。）
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ：蛍光免疫組織化学的検査は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後２−３週間に、ＮＫＣＣ１タンパク質の発現の進行的増加を示した（赤色信号、Ａ１，Ｂ１，Ｃ１）。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２核対抗染色は安定的細胞数を示した（Ａ２，Ｂ２，Ｃ２，緑色信号）。上記パネルセットの統合図（Ａ３,Ｂ３，Ｃ３）は発現の拡散的増加を示す。これらパネルのボックスに囲まれた領域は、ＮＫＣＣ１の核周辺及び細胞体系の位置をより明示するため、拡大されて下の図に示される（Ａ４，Ｂ４，Ｃ４）。
図４Ｄ：ＳＥ後のＮＫＣＣ１タンパク質の増加を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）におけるＮＫＣＣ１信号合計に対する核染色の蛍光合計の比率を形成して定量化された。その後これらの比率は対照ラットからの値で正規化された（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
図４Ｅ：核数の％で表示されるＮＫＣＣ１ポジティブ細胞の平均数（Ｈ３３３４２、平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後及び３週間後（＊＊＊）ではｐは０．０１未満）。
【００６２】
（図５．ＳＥ後、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンがＮＫＣＣ１タンパク質の発現を増加）
図５Ａ、Ｂ：蛍光免疫組織化学的検査は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後３週間に、ＮＫＣＣ１タンパク質の強い発現を示した（赤色信号、Ａ１，Ｂ１）。ニューロン特異ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）対抗染色は安定的細胞数を示した（Ａ２，Ｂ２，緑色信号）。統合図はＮＫＣＣ１の核周辺及び細胞体系の位置を示す（Ａ３,Ｂ３）。ここでは厚さ６０ミクロンの組織ブロック中のニューロンが示される。
図５Ｃ：ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）に対する％で示されるＮＫＣＣ１ポジティブニューロンの平均値であり、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてピロカルピン誘発ＳＥ後２週間後及び３週間後に進行的に増加している（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．０１未満）。
【００６３】
（ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの進行的減少）
示されたＮＫＣＣ１の増加は活性Ｃｌ−の摂取を示唆する。ニューロンのＫＣｌ共輸送体ＫＣＣ２による正常型のＣｌ−の放出（Ｂｅｎ−Ａｒｉ氏他、２００７）は、このＣｌ−の摂取と対抗し、そして大なり小なりＣｌ−の摂取を妨げる。もしＫＣＣ２出現が維持されれば、それはＣｌ−の摂取の効率を限定し、そして代謝エネルギーを浪費する。これが事実であることを検証するため、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現を研究した。
【００６４】
上記のように、我々は嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを蛍光遺伝子プローブ法により評価した。図６はＫＣＣ２ ｍＲＮＡが対照動物（Ａ１）において多量に発現し、一方ＳＥ３週間後（Ｂ１）には減少することを示す。核のＤＡＰＩによる染色は３時点の間に有意の差異を示さなかった。（１１．９±２．９，１±２．３３．８及び１２．１±３．２核数／５００μｍ２、それぞれｔ２４＝−０．３６，Ｐ＝０．１７及びｔ２４＝−０．４１，Ｐ＝０．２４、図６Ａ２、６Ｂ２）。統合蛍光画像（図６Ａ３、６Ｂ３）は、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡが核内及び核周辺領域内に配置されることを示した。
【００６５】
対照に対し正規化されたＫＣＣ２ ｍＲＮＡの蛍光は、ＳＥ後２週間後及び３週間後においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡ発現がそれぞれ対照の８１±８．３及び４４±７．８％に進行的に減少することを示した（図６Ｃ、ｎは約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、（方法）参照、各グループ４ラット、それぞれｔ６２＝１．９５，Ｐ＝０．００８及びｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）。同様に、核数に対する嗅内皮質（ＥＣ）第５層内のＫＣＣ２ ｍＲＮＡを発現する（図６Ａ３、６Ｂ３に示すように核の周りの少なくとも２つの赤色の点）細胞数の比率は、対照動物の嗅内皮質（ＥＣ）第５層内における全細胞数の６３．９±８．５％から、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ４７．３±６．７及び３６．３±４．３％に減少した（図６Ｄ、平均値±標準誤差、ｎは約３００細胞、各グループ４ラット、それぞれｔ３４＝３．１４，Ｐ＝０．０４５及びｔ２８＝４．２１，Ｐ＝０．００７）。
【００６６】
図６、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図６．ＫＣＣ２に対するｍＲＮＡ，ニューロンのＣｌ−の外向き輸送体は、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内においてＳＥ後進行的に減少する、Ａ、Ｂ）
蛍光遺伝子プローブ法で検知されたＫＣＣ２ ｍＲＮＡの発現は、対照と比較してピロカルピン誘発ＳＥ後３週間後においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの減少を示した（Ａ１、Ｂ１、赤信号）。ＤＡＰＩ核染色は細胞数が変わらないことを示唆した（Ａ２,Ｂ２，青色信号）。図Ａ１，Ａ２，及びＢ１、Ｂ２で囲った領域の拡大統合図は、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの核周囲の配置を示す（Ａ３、Ｂ３）。
図６Ｃ：ＳＥ後のＫＣＣ２ ｍＲＮＡの減少を示す棒グラフである。データは、所定の注目画像領域（ＲＯＩ）におけるＫＣＣ２信号合計に対する核染色の蛍光合計の比率を形成して定量化された。その後これらの比率は対照ラットからの値で正規化された（平均値±標準誤差、３ラット、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
図６Ｄ：核数の％で表示されるＫＣＣ２ポジティブ細胞の平均数（ＤＡＰＩ、平均値±標準誤差、ｎは約３００細胞、各グループ４ラット、ＳＥ２週間後（＊）及びＳＥ３週間後（＊＊）では、ｐはそれぞれ０．０５未満及び０．０１未満）。
【００６７】
我々はまた、対照ラットとＳＥ後ラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内におけるＫＣＣ２タンパク質レベルを、ウェスタンブロット法と単一細胞分析を使用して調査した。図７Ａ，７Ｂに示すように結果は、ＫＣＣ２タンパク質レベルが、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ対照レベルの７８．８±７．５及び３８．１±４．３％へと、有意な減少を示した（平均値±標準誤差、ｎ＝５ラット、それぞれｔ１２＝２．１７，Ｐ＝０．０１及びｔ１８＝４．６，Ｐ＝０．０００６）。蛍光免疫組織化学的検査を使用して、ＫＣＣ２タンパク質の分布及び処置後のその消失について研究した（図７Ｃ）。対照ラットでは、ＫＣＣ２の免疫活性は、散在する神経線維網信号の上の密集した細胞体系の蛍光として検知された（図７Ｃ、一番上のパネル、及び挿入図）。ＳＥ後２週間及び３週間後では免疫蛍光はニューロンの細胞体内で漸減し（図７Ｃ、７Ｄ）、嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ニューロンの細胞体系領域に弱い離散した蛍光が残った（図７Ｃ、真中及び一番下のパネル、及び挿入図）。ＫＣＣ２に対する細胞体性の蛍光は、ＳＥ２週間後及び３週間後にそれぞれ対照レベルの６６±３．５及び３４±１．９％に減少した（図７Ｄ、平均値±標準誤差、ｎは４ラットに対して約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、それぞれｔ３４＝７．８５，Ｐ＝０．００７及びｔ４１＝６．３９，Ｐ＝０．００００６）。
【００６８】
神経線維網において、ＫＣＣ２信号減衰はさらに遅延する。ここではＫＣＣ２信号は２週間及び３週間後にそれぞれ９６±４．１％及び６０±４．４％に減少した。神経細胞体と神経線維網の体積を概略１：１と推定すると、ＫＣＣ２免疫蛍光の合計の変化はウェスタンブロットのデータとよく一致する。ニューロンが死滅せず、かつグリアに置き換わることを証明するため、ニューロン特異性の蛍光ニューロトレース染色が対抗染色に使用された。これら染色はニューロンの安定的な数（対照が１５７．６±６．５に対して、発作後３週間後で１５４．６±２１．３、３ラット、ｔ２６＝２．３４，Ｐ＝０．４４）を示し、そしてＫＣＣ２信号がニューロンに高度に特異的（ＫＣＣ２ポジティブ細胞の９５％超がニューロトレースポジティブ）であることを示した。興味深いことに、ピロカルピン多量投与モデルでは、嗅内皮質（ＥＣ）からのてんかん様活性の海馬への拡散に対するこの構造のゲートキーパー機能を損なう、下流歯状回におけるＫＣＣ２の早期、機能的減少の証拠もある（Ｐａｔｈａｋ氏他、２００７）。このゲートキーパー機能の損傷と同時に、生体内てんかん様脳波（ＥＥＧ）活性の証拠もある（Ｅｌ−Ｈａｓｓａｒ氏他、２００７）。
【００６９】
図７、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図７．ＳＥ後ＫＣＣ２タンパク質も減少する）
図７Ａ：ウェスタンブロットＫＣＣ２バンド（約１５０ｋＤａ）は、ピロカブリン誘発ＳＥ後２週間及び３週間後のラットの嗅内皮質（ＥＣ）第５層内ＫＣＣ２が対照と比較して有意に漸減することを示す。βアクチン（約４０ｋＤａ）は負荷制御として機能した。
図７Ｂ：図７Ａのブロットからの、対照の％で表示される平均光学密度（平均値±標準誤差、ｎ＝５、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。これらのデータはｍＲＮＡ及び抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）逆転電位データと非常によく一致する。
図７Ｃ：免疫組織化学的検査はピロカブリン誘発ＳＥ後２週間及び３週間後のＫＣＣ２タンパク質の漸減を示し、それは細胞体で最も顕著であった。各パネルの白抜きのボックスは、白矢印で識別される細胞の拡大図である。
図７Ｄ：ＳＥ後のＫＣＣ２免疫組織化学的検査の平均信号で、対照に対して正規化されている（平均値±標準誤差、ｎは４ラットに対して約１００注目画像領域（ＲＯＩ）、ＳＥ２週間後（＊＊）ではｐは０．０１未満、ＳＥ３週間後（＊＊＊）ではｐは０．００１未満）。
【００７０】
（実施例７）
（ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２における初期の変化は嗅内皮質（ＥＣ）第５層に特異である）
てんかん重積（ＳＥ）中に発生する高振幅脳波（ＥＥＧ）スパイキングは、海馬及び海馬台を含む他の皮質層の嗅内皮質（ＥＣ）第５層で見られるＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２出現における進行性変化をトリガーするのに十分でありうる。従って我々は、分析を海馬台、歯状回、嗅周囲皮質だけでなく、嗅内皮質（ＥＣ）の浅葉も含むように拡げた。 図８Ａ，Ｂは拡大率の低い概観で、ＳＥ後３週間の嗅内皮質（ＥＣ）深層のＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡ発現を示し、一方、浅葉、海馬台、歯状回、嗅周囲皮質では発現しなかった。
これらの領域からの蛍光の平均値のプロット（図８Ｃ、倍率のより大きい画像から、対照に対し正規化）は、ＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡの深層内側嗅内皮質（ＥＣ）にこの高度に特異的な出現を示し、それよりずっと弱い程度に深層外側嗅内皮質（ＥＣ）に出現し、一方他のテスト領域ではネガティブであった（図８Ｃ、コラム３−１０）。
【００７１】
同様の特異性が関連するＫＣＣ２出現の研究において観察された。図９Ａ，Ｂの概観は、ＳＥ後３週間において、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡが特異的に深層嗅内皮質（ＥＣ）、特に内側部分で発現するのがわかる。平均蛍光の定量的分析では、ＫＣＣ２ ｍＲＮＡの深層内側嗅内皮質（ｍＥＣ）における進行的減少が５６±７．８％（ＳＥ後３週間、ｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）深層外側嗅内皮質において１４±４．５％（ＳＥ後３週間、ｔ６２＝２．４１，Ｐ＝０．０３９）であり、一方海馬台、歯状回、嗅周囲皮質及び嗅内皮質（ＥＣ）浅葉では有意の変化を示さなかった（図９Ｃ）。
【００７２】
拡張的実験のさらなる重要な結果は、「ＳＥ発症２時間超後のジアゼパム投与」プロトコル（Ｄｕ氏他，１９９５；小林氏他、２００３）に対抗してここで使用されるプロトコル「ＳＥ発症１時間後ピロカプリンの低量投与−ジアゼパム」後の初期のニューロンの有意の減少が第３層に存在しないことである。第１に嗅内皮質（ＥＣ）第３層においてＫＣＣ２ ｍＲＮＡの有意の変化の不存在は、我々のラットでは第３層の錐体ニューロンがＳＥ後３週間後も死滅していないことを示唆する。第２に、ニューロンの生存が、第３層の安定的ニューロン数を示した（対照、ＳＥ後２週間後及び３週間後においてそれぞれ、ニューロン数１１４±１４．２，１１２±１８．１及び１１６±１５、それぞれｔ１０＝−０．１８，Ｐ＝０．８６及びｔ１０＝−０．７７，Ｐ＝０．４６、３ラット）ニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）染色で確認された。
【００７３】
図８，９、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図８．ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡは他の皮質領域では増加しない）
図８Ａ，Ｂ：内側嗅内皮質（ｍＥＣ）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）、アンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）（ａｂ）,海馬台（Ｓｕｂ）、歯状回（ＤＧ）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）に亘る脳領域を示すＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡに対する蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）研究：
Ａ、対照スライス；Ｂ、ＳＥ後３週間後に採取されたスライス。左のパネルは、ＤＡＰＩ染色された領域を示し、それは構成要素領域のアウトラインが重ねて表示されている（Ａ１，Ｂ１）。中央のパネルはＮＫＣＣ１信号を示す。対照では殆ど見られないか皆無であるが、ＳＥ後３週間後では信号は中央の嗅内皮質（ＥＣ）第５−６層に明白に存在するが、他の場所では存在しない（Ａ２、Ｂ２）。これらの画像は右パネルで統合される（Ａ３，Ｂ３，高出力画像は図３参照）。
図８Ｃ：ＳＥ後にＮＫＣＣ１ ｍＲＮＡが、深層嗅内皮質（ＥＣ）、（内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第５層、それぞれｔ５４＝２．１５，Ｐ＝０．０３７及びｔ５４＝３．５４，Ｐ＝０．０００９）及び＃２とラベル付けされた外側嗅内皮質第５層（それぞれｔ５４＝１．０２，Ｐ＝０．１２及びｔ５４＝１．２８，Ｐ＝０．０４７）においてのみ増加するが、内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第３層（＃３、それぞれｔ５４＝０．９３，Ｐ＝０．２４及びｔ４９＝０．４２，Ｐ＝０．３４）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）（＃４、それぞれｔ５４＝０．２７，Ｐ＝０．８６及びｔ５４＝０．２４，Ｐ＝０．０９４）内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第１−２層（＃５、それぞれｔ５４＝−１．２５，Ｐ＝０．３２及びｔ５４＝０．３４，Ｐ＝０．２３）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）第１−２層（＃６、それぞれｔ５４＝１．２４，Ｐ＝０．０７８及びｔ５４＝０．５２，Ｐ＝０．２７）、海馬台（＃７、それぞれｔ５４＝１．５４，Ｐ＝０．４９及びｔ５４＝１．６７，Ｐ＝０．０６３）、歯状回（＃８、それぞれｔ５４＝０．４５，Ｐ＝０．０９８及びｔ５４＝−１．３５，Ｐ＝０．２６）、深層嗅周囲皮質（＃９、それぞれｔ５４＝０．５３，Ｐ＝０．４７及びｔ５４＝２．０１，Ｐ＝０．４８）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）第１−３層（＃１０、それぞれｔ５４＝−１．３６，Ｐ＝０．８１及びｔ５４＝０．２８，Ｐ＝０．８１；データは高倍率画像より抽出）では、有意の変化が起こらなかったことを示す。
【００７４】
（図９．ＫＣＣ２のｍＲＮＡは深層嗅内皮質（ＥＣ）でのみ減少する）
図９Ａ、Ｂ：内側嗅内皮質（ｍＥＣ）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）、アンギュラーバンドル（Ａｎｇｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）（ａｂ）,海馬台（Ｓｕｂ）、歯状回（ＤＧ）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）に亘る脳領域を示すＫＣＣ２ ｍＲＮＡに対する蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）研究：
Ａ、対照スライス；Ｂ、ＳＥ後３週間後に採取されたスライス。左のパネルは、ＫＣＣ２染色された領域を示し、それは構成要素領域のアウトラインが重ねて表示されている（Ａ１，Ａ２）。対照では全体に発現が見られるが、ＳＥ後３週間後では嗅内皮質（ＥＣ）第５層でのみ信号が消滅した。中央のパネルはＤＡＰＩ染色を示す（Ａ２、Ｂ２）。これらの画像は右パネルで統合される（Ａ３，Ｂ３，高出力画像は図６参照）。
図９Ｃ：ＳＥ後にＫＣＣ２ ｍＲＮＡが、深層嗅内皮質（ＥＣ）、（内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第５層、それぞれｔ６２＝１．９５，Ｐ＝０．０８２及びｔ６２＝２．３４，Ｐ＝０．００９５）及び＃２とラベル付けされた外側嗅内皮質第５層（それぞれｔ６２＝１．８６，Ｐ＝０．０９３及びｔ６２＝２．４１，Ｐ＝０．０３９）においてのみ増加するが、内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第３層（＃３、それぞれｔ６２＝０．３４，Ｐ＝０．３２及びｔ６２＝−１．２２，Ｐ＝０．５１）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）（＃４、それぞれｔ６２＝−０．２５，Ｐ＝０．１７及びｔ６２＝０．２４，Ｐ＝０．３６）内側嗅内皮質（ｍＥＣ）第１−２層（＃５、それぞれｔ６２＝１．０６，Ｐ＝０．８５及びｔ６２＝０．４３，Ｐ＝０．６２）、外側嗅内皮質（ｌＥＣ）第１−２層（＃６、それぞれｔ６２＝−０．４５，Ｐ＝０．６８及びｔ６２＝０．１５，Ｐ＝０．３９）、海馬台（＃７、それぞれｔ６２＝−１．０１，Ｐ＝０．０９８及びｔ６２＝１．８４，Ｐ＝０．０６５）、歯状回（＃８、それぞれｔ６２＝１．０５，Ｐ＝０．７７及びｔ６２＝−２．０３，Ｐ＝０．４９）、深層嗅周囲皮質（＃９、それぞれｔ６２＝１．３３，Ｐ＝０．２８及びｔ６２＝−１．５２，Ｐ＝０．５３）及び嗅周囲皮質（ＰＲＣ）第１−３層（＃１０、それぞれｔ６２＝１．１２，Ｐ＝０．０８５及びｔ６２＝０．３６，Ｐ＝０．１４；データは高倍率画像より抽出）では、有意の変化が起こらなかったことを示す。
【００７５】
（実施例８）
（Ｃｌ−輸送遮断抑制バースト活性）
抑制性シナプス後電位（ＥＩＰＳＰ）の変移及び発作後の多シナプス性バースト応答の増加に対するＮＫＣＣ１増加の機能的役割を調査するため、我々はＣｌ−輸送体遮断を通して作用し、ＮＫＣＣ対ＫＣＣ輸送体の遮断により効果のある利尿剤ブメタニドを採用した（Ｒｕｓｓｅｌ，２０００；Ｓｕｎｇ氏他，２０００；Ｈａｎｎａｅｒｔ氏他，２００２；Ｂｅｃｋ氏他，２００３）。ここで絶対的特異性の欠如は１）示されたＫＣＣ２の強い減少、２）Ｃｌ−内向き輸送のみがＥＣｌをポジティブに静止膜電位（ＲＭＰ）に変移させるという事実、により補償される。残存ＫＣＣ２活性の遮断は、ＮＫＣＣ１の遮断の間、ＥＣｌの強い過分極変移を阻止しない。図１０ＡはＳＥ後３週間後の膜電圧に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）振幅のプロットであり、Ｅ（ＰＳＰ）の脱分極変移がブメタニド（１０μＭ）での２０分灌流の後、消滅したことを示す。これは、Ｃｌ−の膜を通過する受動的再分布に対応する。図１０ＢはＳＥ後３週間後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層の正常記録状態における静止膜電位（ＲＭＰ）（約−７２ｍＶ）に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の平均値が＋４０ＭＶ超であり、ブメタニド存在下では＋１０ｍＶに低下した（Ｅ（ＰＳＰ）絶対平均電圧は、対照状態で−２９．７±２．３ｍＶ、ブメタニド存在下で−６０．９±４．１ｍＶであり（ｔ２４＝２．２６，Ｐ＝０．００００９）、ブメタニドの洗い流し中は−３４．２３．４ｍＶ、ｎ＝５，ｔ２４＝１．５２，Ｐ＝０．００５７対ブメタニド）。
【００７６】
シナプス後電位Ｅ（ＰＳＰ）の脱分極に対して２次性の脱抑制又は興奮が、ＳＥ後の潜伏期における多シナプス性バースト応答の発現に決定的な場合、ブメタニドによる逆転電位の蓄積もまた、多シナプス性バースト応答を遮断することになる。図１０Ｃは、確かに、ブメタニドでの灌流（１０μＭ）は単一ショック刺激に対する多シナプス性応答を効果的に抑制した。図１０Ｃの上段パネルに示すような強い多シナプス性バースト応答を記録した後、ブメタニドでの灌流が始まり、２０分後までには、バースト放電は強く減衰した（中段の軌跡）。３０分間のブメタニドの洗い出しにより、強い多シナプス性応答が回復した（下段の軌跡）。平均すると、ブメタニドは、ピロカルピン発作後３週間後のラットからの細胞の多シナプス性応答を持つニューロンの数を、６４．８％（合計１４ニューロンの内９ニューロン）から１１．６％（２／１４）に減じた。３０分間のブメタニドの洗い出しは応答ニューロンの数を３５．１％（５／１４、図１０Ｄ）に回復した。半最大振幅における応答期間はブメタニドで対照応答（ｔ１３＝１３．８，Ｐ＝０．０００００００００４）の３６±９％に減少し、そして洗い出し中に７５±１１％（ｔ１３＝−５．０７，Ｐ＝０．０００２対ブメタニド）に回復した。
【００７７】
図１０、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図１０．ＮＫＣＣ１抑制剤ブメタニドは部分的にＥ（ＰＳＰ）を回復し、そして多シナプス性興奮を抑制する）
図１０Ａ：ＳＥ後３週間後のラットからの嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの膜電位に対するシナプス後電位（ＰＳＰ）振幅をブメタニドへの２０分暴露前（上段パネル、白丸）と後（下段パネル、×印）でプロットしたものであり、ＰＳＰ逆転電位の過分極変移を示す。データは図２Ａのプロトコルから得られた。Ｅ（ＰＳＰ）は−２９．７ｍＶから−６０．９ｍＶへ変移した。
測定はＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）による興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）遮断中に行われた。
図１０Ｂ：集団データで、ポジティブ変移したＧＡＢＡＡ−ＰＳＰ逆転電位が、ブメタニドにより強く、かつ可逆的に再分極した（平均値±標準誤差、ｎ＝３、ブメタニドへの暴露（＊＊＊）ｐは０．００１未満）ことを示す。
図１０Ｃ：最上段の記録は、ＳＥ後３週間後に観察された単一刺激（１００ｎＡ）に対する多シナプス性応答を示し、それがブメタニドにより遮断されるが（中段の記録）、３０分間の薬物の洗い出しにより回復する（下段の記録）ことを示す。
図１０Ｄ：ブメタニドは、単一刺激に応答して多シナプス性脱分極を発現するＳＥ後３週間後の嗅内皮質（ＥＣ）第５層ニューロンの数を、６４．８％から１１．６％（ｎ＝１４）に減少させることを示す集団データである。この数値は３０分間のブメタニド洗い出しにより３５．１％に回復した。
【００７８】
（実施例９）
（ＧＡＢＡＡ誘発興奮はバーストに軽度の影響をあたえる）
シナプス後電位（ＰＳＰ）逆転電位の脱分極変移は、第５層ニューロンの脱抑制及び直接的ＧＡＢＡ誘発興奮の両方に繋がる。我々はピクロトキシンでＧＡＢＡＡ誘発興奮を遮断してバースト応答における直接的興奮の役割を調べた。ブメタニドと異なり、ピクロトキシン（１００μＭ）はＳＥ３週間後の多シナプス性バースト放電に対し僅かな効果しか示さなかった（図１１Ａ１，Ａ２；ピクロトキシンでは、自発的バーストも観察した；自発的バースト後５秒より長く記録された誘発バーストのみ分析した；これらのバーストは明白に従前の自発的バーストに影響されない）。研究された細胞集団において、ピクロトキシンは、ＳＥ３週間後に多シナプス性バースト応答におけるスパイクの数を９．８±０．８から７．９±０．７へ減少させた（図１１Ｃ、ｎ＝８，ｔ２４＝２．２６，Ｐ＝０．００００８９）。このような同一細胞からの１０個の応答の平均をとると、図１１Ｂ１，Ｂ２に示すように、ピクロトキシンが平均バースト応答において活動電位振幅を１０．５±３．４％減少させ、それは刺激後の活動電位のタイミングの可変性が増大したことを示唆する（ｎ＝８，ｐ＝０．０９４）ことが判った。このように、ＧＡＢＡ誘発興奮の存在は、明白にネットワークの発火のタイミング精度を増大させ、それは、ＧＡＢＡ誘発伝達がニューロン間興奮の下流であるため遅延するので、恐らく直接的興奮よりは全体的な興奮性の増大に起因している。
ピクロトキシン単独での僅かな効果と対照的に、ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）のＡＣＳＦ／ピクロトキシン生理食塩水への追加は、ほぼ完全にシナプス応答を遮断し（９５．９±０．２６％、ｔ７＝−１０．０５，Ｐ＝０．００００２）、それはバーストが主として多シナプス性グルタミン酸作動性伝達により媒介されることを示した（図１１Ａ３，Ｂ３；図２Ａで示すように、ピクロトキシンが無いＣＮＱＸ及びＡＰＶ内で、単一シナプス性ＰＳＰが誘起された）。ピクロトキシンでは統計的有意性に達しないが、バースト期間の短縮傾向が存在した（図１１Ｄ）。
）。
【００７９】
図１１、及びその図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
（図１１．ピクロトキシンは多シナプス性バーストに軽度の影響をあたえる）
図１１Ａ：ピクロトキシン（１００μＭ）によるＧＡＢＡＡ受容体の遮断が多シナプス性バースト応答における活動電位発火を、小さいが有意な量だけ減少させた（図Ａ１，Ａ２；刺激１００ｎＡ、７０μ秒が＊印時点で印加された）。その後のＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）によるイオンチャネル型グルタミン酸受容体の遮断は、全てのシナプス後性応答を殆ど除去した（図１１Ａ３）。
図１１Ｂ：同一の細胞からの１０個のバーストの平均がピクロトキシンでのバースト期間の短縮化を示した。これら平均におけるスパイク振幅の減少は、ピクロトキシンでのバーストにおいて発火パターンの精度が低下することを示唆する。
図１１Ｃ：ピクロトキシンが、多シナプス性バースト応答における平均スパイク数を、１応答当り９．８±０．８から７．９±０．７へ減少させる（平均値±標準誤差、ｎ＝８細胞、５ラット、ピクロトキシン付加（＊）ｐは０．０５未満）ことを示す数量データである。
図１１Ｄ：ピクロトキシンでは多シナプス性バースト期間の１０．５％短縮傾向が見られた（平均値±標準誤差、ｎ＝８、ｐ＝０．０９４）。
【００８０】
図１２−１４、及びそれらの図に反映されたデータを与えた実験のさらなる詳細は以下の通り。
図１２は、リチウム−ピロカルピンＳＥ後１２−１７週間後における、ブメタニドによる発作の抑制（０．２ｍｇ／Ｋｇ体重、腹腔内）を示す（ｎ＝５ラット）。５体のリチウム−ピロカルピンＳＥラットが連続するブメタニド又は媒体注射（生理食塩水内の５％エタノール、腹腔内、下部に日付を記載）を受け、そしてその後８時間以内に発現する発作がビデオ録画により分析された。１体の同一のラットは、ブメタニドがＣｌ及びＩＰＳＰ逆転電位を概して基準化した場合でも、２度目及び３度目のブメタニド投与後に発作を発現したが、それは恐らく自発的発作を可能にするこのラット内の２次的な下流の変化によるものである。
【００８１】
図１３は、ＮＫＣＣ１タンパク質が正常な成体レベルに向かって回復することを示す。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＮＫＣＣ１タンパク質の免疫蛍光信号を、抗体を持たない対照ラット（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）、抗体を持つ対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ 週間後」と表示）のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１信号は、ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）では、ＳＥ後３週間後のラットのレベルの５０％未満まで回復し、そしてブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）では９５％超に回復した。
【００８２】
図１４は、ＫＣＣ２タンパク質が正常な成人レベルに向かって回復することを示す。プロットは、深層内側嗅内皮質（ＥＣ）のＫＣＣ２タンパク質の免疫蛍光信号を対照ラット（「対照」と表示）、ＳＥ後２週間後及び３週間後（「ＳＥ後 週間」と表示）のラット、及びＳＥ後１７週間後のラットにおいて示す。ＳＥ後１７週間でＫＣＣ２信号は、正常レベルに向かって回復した（ブメタニドが完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止するラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示、そして、ブメタニドが自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止する効果が無くなったラットは「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ネガティブ」と表示）。
【００８３】
ブメタニド又は媒体が投与された後の発作活性が図１２で定量化された、ラットの新規のＮＫＣＣ１データが図１３に示され、図１３は従前のＮＫＣＣ１データを比較のために含む。抗体を持たない対照の測定（「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）無し」と表示）はさらに、対照ラットにおけるＮＫＣＣ１タンパク質レベルがゼロに近く非常に低いことを示す。ＳＥ後１７週間でＮＫＣＣ１タンパク質レベルは、ブメタニド投与が完全に自発的再発性発作（ＳＲＳ）を防止したラット（「ブメット（Ｂｕｍｅｔ）ポジティブ」と表示）において正常レベルに向かって有意に回復した。２度目及び３度目のブメタニド投与（約４週間離れて０９年６月８日と０９年７月１日に）後に発作を発現した１体のラットでは、ＮＫＣＣ１はほぼ完全に基準化された。
【００８４】
図１４はＫＣＣ２タンパク質レベルも、ＳＥ後１７週間後に正常な成体レベルに回復したことを示す。これらのデータは、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２のＣｌ−輸送体の発現は共に長い時間の中で基準化され、従ってＣｌ−分布の基準化およびＣｌ−依存性ＩＰＳＰ逆転電位に関するシナプス性抑制につながるという、我々の仮説を確認した。
【００８５】
図１５は、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後に有意の変化がない（「ＳＥ後２週間」、「ＳＥ後３週間」と表示）ことを示す。棒グラフは、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後に変化しないことを示す。ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）データは、図８に使用されたものと同一の組織の高倍率画像から抽出された。
【００８６】
図１６は、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＫＣＣ２のｍＲＮＡは変化がないことを示す。棒グラフは、海馬の錐体細胞ＣＡ１層又はＣＡ３層では、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡはＳＥ２週間後及び３週間後（「ＳＥ後２週間」、「ＳＥ後３週間」と表示）に変化しないことを示す。ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの蛍光遺伝子プローブ法（ＦＩＳＨ）データは、図９に使用されたものと同一の組織の高倍率画像から抽出された。
【００８７】
図１７：ニューロン−特異染色「ニューロトレース（ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ）」で染色されたニューロンの数に、嗅内皮質（ＥＣ）第２層（「ＥＣ第２層」と表示）、又は第３層、又は第５層においても、ＳＥ後３週間後に有意の変化が無いことを示す（ニューロンの数／１００ミクロンｘ１００ミクロン領域）。
【００８８】
図１８は慢性ブメタニド処置が慢性期において強く発作の発現を抑制することを示す。ＳＥ後の週単位時間経過に対する発作発現／８時間ビデオ録画のプロットであり、無処置ラット（黒塗りの棒、水消費 平均±標準誤差＝水２９±６．３ｍｌ／日）及び飲料水によりブメタニド（ｂｕｍｅｔ．）を処置されたラット（平均±標準誤差＝０．６５±０．１３ｍｇブメタニド／日；水３２±６．４ｍｌ／日；点線及び斜線）。４体のラットではブメタニドは完全に発作を防止した（中空の棒）が、他の２体のラットでは、発作の発現及びＳＥ後時間経過に伴う発作の進行は共に減少した（斜線の棒）。
【００８９】
図１９：ＳＥ後２週間後に開始され２０週間継続する慢性ブメタニド処置が、処置期間中および処置終了後少なくとも６週間、発作の発現を強く抑制する。棒グラフは、ＳＥ後第１１−２１週における８時間ビデオ録画セッション中のラット当りの平均発作発現回数を示し（一番左の棒のペア）、無処置ラット（黒）又はＳＥ後２週間目から２０週間に亘って慢性的に飲料水経由でブメタニド処置されたラット（斜線）である。その後ブメタニド処置を終了し、その後３週間後と６週間後の発作発現回数を示す、無処置ラットは約３回の発作／８時間録画のレベルに到達した（黒の棒、ラット当り３回の録画セッション）が、一方事前にブメタニド処置されたラットでは発作の発現はずっと少なかった（斜線の棒）、即ち、ＳＥ後時間適合対照ＳＥラットが発現する発作回数の１５−２２％であった（各グループｎ＝６ラット）。
【００９０】
図２０は、ＳＥ後１週間後に開始する慢性ブメタニド処置が、ブメタニド処置終了後少なくとも６週間のオープンフィールド暴露に誘発される発作の発現を強く抑制することを示す。棒グラフは、ＳＥ発作後２７週後のピロカプリンＳＥラットをオープンフィールド（１．４ｘ１．４ｍ）の中央に置き、その後１分後から始まる１５分間に発現する発作の回数を示す。ラットは無処置（黒の棒）、又はＳＥ後第２週目から２１週間に亘り慢性的に飲料水経由でブメタニド処置された（斜線の棒）である。このテストでは、ブメタニド処置終了後６週間後でも処置済みラットは、ＳＥ後時間適合対照ＳＥラットが発現する発作回数の１５％未満の発作発現回数を示した（各グループｎ＝６ラット）。
【００９１】
図２１はＳＥ後１６日目から１２週間に亘る慢性ブメタニド処置がオープンフィールドの暗箱に入るラットの挙動を回復させることを示す。ラットは箱を含むオープンフィールド（１．４ｘ１．４ｍ）の中央に置かれ、箱は内部が暗く、０．２（長さ）ｘ０．３（幅）ｘ０．１５（高さ）ｍの寸法であり、０．３ｍの幅側が開口しており、オープンフィールドの中央と囲み壁の間の中間点に置かれる。挙動は１分間ビデオ録画される（３回の試技／ラット、各グループ６ラット）。対照ラットは殆ど箱に入り、箱内に留まった（試技の７８％）。対照的に、ＳＥ後のラット（ＳＥは後１４−１５週）は殆ど箱を無視して入らなかった（試技の１５％、７ラット）。同じＳＥグループからのブメタニド処置ラットは、対照ラットと類似の挙動を示し、殆ど箱に入った（試技の６７％、８ラット）。
【００９２】
図２２は内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）発症の我々の原理、及び我々の新規の予防的及び抗てんかん慢性ブメタニド処置を示す。ＴＬＥ誘発の発作、例えば、てんかん重積（ＳＥ）、外傷性脳障害（ＴＢＩ）、脳卒中他は、潜伏期（ＳＥ後２及び３週間）に進行するＮＫＣＣ１の病理学的再発現を誘発する。ＧＡＢＡＡ受容体依存シナプス性抑制の進行性消失は嗅内皮質（ＥＣ）第５層のてんかん様活性／無症候性発作をもたらす。このてんかん様活性は嗅内皮質（ＥＣ）及び下流脳領域において下流可塑性変化をトリガーし、それは易興奮性を増大させる２次的変化につながる。易興奮性を増大させる変化の進行に伴って、顕性発作の可能性も増大する。顕性発作もまた下流可塑性変化をトリガーし、それは更に大脳易興奮性を増大させ、発作発現の進行につながる（図１８及び１９に示す）。最終的に発作はＮＫＣＣ１活性に依存性でなくなり、そしてＮＫＣＣ１が基準化した時でも継続する（図１２、１３に示す）。ブメタニド処置は低い細胞内Ｃｌ−レベル及びより効率的な抑制（図１０Ａ、Ｂ）を回復し、潜伏期においててんかん様活性（図１０Ｃ、Ｄ）及び慢性期の発作（図１２，１８，１９，２０）を抑制する。無症候性及び顕性発作のブメタニド処置は、下流病理学的変化を防止し、処置後少なくとも６週間継続する（図１９、２０）発作出現率及びテストされた挙動（図２１）の基準化につながる。
【００９３】
（実験結果の議論）
発作中のてんかん様ニューロン活性は多くの大脳領域で観察されるが、しかしそのてんかん重積（ＳＥ）状態に後続する発生源は明確ではない。我々は深層嗅内皮質（ＥＣ）におけるてんかん様活性の初期発現を検証するため、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のリチウム−低投与量ピロカプリンラットモデルを使用した。我々はＳＥ後３週間の潜在期間内に増加する比率の嗅内皮質（ＥＣ）第５層のニューロンが単一シナプス刺激に多シナプス性バースト脱分極で応答することを示した。この変化は並行して第５層ニューロンのＩＰＳＰ逆転電位の進行性脱分極変移を伴い、これは明らかにＣｌ−内側輸送体ＮＫＣＣ１の増加及び同時にＣｌ−外側輸送体ＫＣＣ２の減少に起因し、この両方の変化は、細胞内Ｃｌ−蓄積に役立っている。潜伏期におけるＣｌ−摂取の抑制はよりネガティブなＧＡＢＡ作動性逆転電位を回復し、そして多シナプス性バーストを終了させた。Ｃｌ−輸送体の変化は深層嗅内皮質（ＥＣ）に強く特異的であった。それらはこの時期に第１−３層、嗅周囲皮質、海馬台又は歯状回では発現しなかった。我々はＣｌ−ホメオスタシスの変化が深層嗅内皮質における過剰興奮性を促進し、それがそこでのてんかん様放電に繋がり、それは結果的に下流皮質領域に影響を及ぼすと提案する。
【００９４】
従って、我々はＳＥ後の潜伏期に深層嗅内皮質における大幅に増加した興奮性の発現を示した。第５層のニューロンは通常は閾値以下のシナプス性刺激に対し多シナプス性バースト放電で応答を始める。さらに、我々はこの潜伏期にＣｌ−輸送体ＮＫＣＣ１（内向き）およびＫＣＣ２（外向き）の変化した発現に起因するＧＡＢＡＡ受容体逆転電位の大きな脱分極変移が起こることを示した。このてんかん発生の初期段階では、これらの輸送体発現の変化は深層嗅内皮質においてのみ発現し、隣接する海馬領域及び皮質領域では発現しなかった。Ｃｌ−輸送活性の変化と増加する多シナプス性バーストとの間の直接的な関係は、ブメタニドによるＮＫＣＣ１の遮断がＩＰＳＰ逆転電位を大きく回復し、多シナプス性バースト放電を大幅に減少させた、という発見よって支持された。我々の結果は、嗅内皮質第５層が内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症において重要な部位であることを意味している。
【００９５】
従って、上記の実験結果は、ＳＥ後の潜伏期において、行動性発作の発現前に、深層内側嗅内皮質においてニューロ興奮性の強い増加、即ち弱いシナプス刺激に対し多シナプス性バースト放電で応答する嗅内皮質第５層ニューロンの比率の進行性増加があることを示唆している。従って嗅内皮質における自然活性パターンは、ますます自発的発作をトリガーする可能性が高くなり、自発的発作は定義により潜伏期を終了させる。我々の発見は、ＳＥ後、内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は初期において嗅内皮質深層に発現することを示唆している。我々の知る限りでは、潜伏期に他の脳領域においてシナプス刺激に応答するてんかん活性を示す他の研究は無かった。この領域の特異性は、嗅内皮質深層に対する脱抑制に繋がるＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２発現の変化の特異性により実証された。内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のピロカプリン高投与モデルでＣＡ１に対し潜伏期発作間活性が生体内で示されたが（Ｅｌ−Ｈａｓｓａｒ氏他，２００７）、検査した幾つかの他の皮質領域及び海馬領域は変化を示さなかった。我々のレポートした第５層ニューロンの易興奮性の変化が、嗅内皮質第３層の錐体ニューロンの明確に認識可能な消失がなく発現した、ことは非常に重要である。嗅内皮質第３層の錐体ニューロンの高度の消失は後期ＬＴＥの症状に典型的であることが示されて来たし（Ｄｕ氏他，１９９３；Ｄｕ氏他，１９９５）、そしてそれは遷延性ＳＥの２４時間以内に発現可能であった（Ｄｕ氏他，１９９５）が、明確に認識可能な消失が発現しないため、これらの発見は本論とは無関係である。
【００９６】
ジアゼパムがＳＥ発症後２時間後でなく１時間後に投与され、かつアトロピンが投与される、我々のＳＥ発現プロトコルはアンドレ氏他（Ａｎｄｒｅ氏他，２００７）のプロトコルよりも幾分弱く見えるかもしれない。ジアゼパムもアトロピンもいずれかの時点で即座にＳＥを停止させないが、この変更がラットの回復を促進し、より良い生存率の脳スライスを生成したことを我々は発見した。良かれ悪しかれ我々はまた、弱い初期の発作はより徐々に進行する細胞又は神経網の変化を生成し、従って分析が容易であるかも知れないと理由づけた。ビデオモニタリングで検査した場合、我々のプロトコルは、１８週までの潜伏期を持つ全てのラットにおいて実証可能な発作活性を生成した（平均＝１２．７週、材料と方法の項参照）。重要なことに、これらの潜伏期間は非常によく患者に対し報告された潜伏期間と適合した（Ａｎｎｅｇｅｒｓ氏他，１９８０）。これは、潜伏期が平均して１−４週間しか継続せず、殆どは２週間未満である公開されたげっ歯類ＴＬＥモデル（Ｄｕｂｅ氏他，２０００ａ；Ａｒｚｉｍａｎｏｇｌｏｕ氏他，２００２；Ｃｕｒｉａ氏他，２００８；Ｌｉ氏他，２００８）に対する重要な改良である。はるかに短い潜伏期は、恐らく追加又は全体的な発作を促進する他のメカニズムを活性化させるより激しい発作を示唆するが、それは殆どの場合明らかに患者に関係が無い。このようにＬｉ氏他（Ｌｉ氏他，２００８）はマウスに対するピロカプリン高投与と組み合わせた異常なリチウム侵襲を使用して（確立されたＴＬＥモデルではない）、海馬領域ＣＡ１に本願で研究される期間まで継続するＮＫＣＣ１の急性再発現を示した。この発見は、我々のラットにおいてはＣＡ１ではＮＫＣＣ１の変化が無いことと対照的である。我々の示した嗅内皮質第５層における細胞性変化は、より強いリチウム−ピロカプリンＳＥ及び他のプロトコルによっても殆どの場合トリガーされる。
【００９７】
嗅内皮質第５層における易興奮性の変化は、嗅内皮質第５層のニューロンの約８０％で発現する、ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰ逆転電位における強いそして進行性の脱分極変移、と同時性を有し、そして我々はそれにより補助されるものと提案する。この比率はＣｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の増加と非常によく適合する。殆どの嗅内皮質第５層のニューロンで同時に発現するＣｌ−外向き輸送体ＫＣＣ２の減少は、ＮＫＣＣ１によるネットのＣｌ−蓄積を促進するが、それ自身では静止膜電位に対するＥＣｌポジティブをもたらさない。ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２の進行性変化は、ＳＥ後３週間後の強く変位したＥ（ＰＳＰ）と非常によく適合した、ただし後者の量定は、ＰＳＰ振幅の外挿及び傾斜の差異の減少に起因して精度が劣り、従って測定可変性を追加した。
【００９８】
ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰ逆転電位の弱い変移はＴＬＥ疾病進行のずっと後の期、即ち、後期慢性てんかんにおいて海馬台ニューロンで観察され、それは明らかにＮＫＣＣ１発現のずっと弱い変移に起因した（Ｃｏｈｅｎ氏他，２００２；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６；Ｐａｌｍａ氏他，２００６；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄ氏他，２００７；Ｍｕｎｏｚ氏他，２００７；Ｓｅｎ氏他，２００７）。領域、疾病進行期、発作間及び発作活性のレベル、及び発現レベルの差異は、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２の変移した発現レベルを開始しそして更に制御する信号ネットワークにおける、潜伏期と後期慢性ＴＬＥにおける基本的差異を示唆する。
【００９９】
最近になって、大規模な発作が、海馬において急性の４５日以上に渡るＮＫＣＣ１の部分回復性再発現、及び発作後２週間以内の自発性再発性発作（ＳＲＳ）の発現に繋がることが示された（Ｋａｎｇ氏他，２００２；Ｌｉ氏他，２００８）。しかしこれらのマウスにおいて、１）ＮＫＣＣ１がニューロンにより再発現したか、グリア細胞により再発現したか、２）ＧＡＢＡＡ−ＰＳＰ逆転電位が変位したか、３）潜伏期間中にてんかん様活性があったか、４）発作がＮＫＣＣ１活性に依存するか、が示されておらず、従って不明確である。対照的に、これらの研究（Ｌｉ氏他）に基づく最も最近の研究は、高投与量の注入によってもブメタニド処置はＳＲＳの抑制に完全に失敗したことを示した（Ｂｒａｎｄｔ氏他，２０１０）。Ｂｒａｎｄｔ氏他はこの結果の原因について議論している：「最近の研究の成体ラットＴＬＥモデルにおいて、ブメタニドを使用した予防的処置において有意な抗てんかん活性が見られなかったことは、下記を含む幾つかの原因が考えられる：（１）ブメタニドの全身性投与が脳に到達しそしてこの薬剤が脳で十分な高濃度を保つことができないことに伴う、薬物動態的問題点（速い排出、脳浸透が乏しい）、（２）ＮＫＣＣ１の変化がピロカプリン誘発てんかん発作に決定的には関与していない、又は、（３）このモデルにおいて予防的処置に使用される時間窓、即ち、ＳＥ後２週間後が適切でなかった。」。我々のデータにおける低投与量ブメタニドでの発作抑制は、薬物動態的問題点がＢｒａｄｔ氏他の発作処置の失敗の理由となりえないことを示している（Ｂｒａｎｄｔ氏他，２０１０）。我々のデータは、ＳＥ後最初の２週間以内ではＮＫＣＣ１の変化はてんかん発作に決定的には関与していないことを示唆している。従って時間窓も間違っている。さらに、回復ＮＫＣＣ１レベルは潜伏期の最後の発作発現の開始の理由にはなりえない（Ｌｉ氏他，２００８）。このマウスモデルは患者に見られた（上記参照）潜伏期より遥かに短い潜伏期を示す（Ｌｉ氏他，２００８）のみならず、示されたＣＡ１におけるＮＫＣＣ１発現は、我々のデータと矛盾する（Ｋａｎｇ氏他、２００２；Ｌｉ氏他，２００８）。これら事実の両方は、使用されたＳＥモデルが現実的なＴＬＥモデルではないことを示唆している（上記参照）。本発明の新規性は、１）我々の改良ラットＴＬＥモデルによる潜伏期の現実的適合、２）潜伏期ニューロンにおけるＮＫＣＣ１の進行性再出現とＩＰＳＰ逆転電位の変移の両方、３）潜伏期及び慢性期（ＳＥ後３−１８週）におけるブメタニドによるてんかん様活性及び発作の効果的抑制、そして、４）遷延性ブメタニド処置終了後少なくとも６週間を超えること、に反映されている。
【０１００】
嗅内皮質第５層ニューロンにおけるＧＡＢＡ−ＰＳＰの通常の逆転電位、即ちほぼＶｒｅｓｔは２つの別個の慢性てんかん中のＳＥ−ＴＬＥモデル（Ｆｏｕｎｔａｉｎ氏他，１９９８；ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他，２００６）で発見され，我々の報告する非常に大きなＧＡＢＡＡＥ（ＰＳＰ）は、一度慢性てんかんが確立されると大部分回復することを支持した。他の説明も可能である：第１に、記録は外側嗅内皮質から得られ、そこではＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２に小さな変化しか見られないことを我々は発見した。更に、異なるＴＬＥモデルが使用された。ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ氏他（２００６）は、ＴＬＥのピロカルピン高投与量ラットモデルを研究し、それは，リチウム−ピロカルピンラットモデルとは基礎となるＳＥ中活性化される信号伝達経路が有意に異なり（Ｏｒｍａｎｄｙ氏他，１９８９）、はるかに短い潜伏期（２週間未満）、及び第３層ニューロン消失の差異（上記）において異なることが示された。後者２者の差異はより激しい発作を示唆する（上記）。これはＥ（ＰＳＰ）変移、及び慢性てんかんから回復するか否かにおいて、差異を生成可能である。我々はこれら重要な問題について将来研究する予定である。
【０１０１】
ＧＡＢＡ作動性ＰＳＰの強い脱分極変移が、深層嗅内皮質の易興奮性の観察された変化の主たる原因であるという推論は、Ｃｌ−内向き輸送体ＮＫＣＣ１の遮断剤ブメタニドの効果により支持された。ブメタニドはより過分極されたＰＳＰ逆転電位を回復し、そして刺激に対するてんかん様バースト応答をほぼ消滅させた。これらの発見は、ＳＥ後のこの病期におけるてんかん様バースト応答の発現に対し、強く脱分極したＥ（ＰＳＰ）の必要性を意味するが、しかし、他の同時性変化、例えば、第５層ニューロンの観察された入力コンダクタンスの減少が追加的に必要となる可能性を除外しない。ブメタニドの効果はさらに、ＧＡＢＡＡＲ遺伝子の減少、又は抑制性シナプス及び介在ニューロンの消失に起因すると思われる、観察された入力コンダクタンスの減少にも拘わらず、ＳＥ後３週間後に抑制が依然非常に効果的でありうることを意味する（Ｂｅｒｎａｒｄ氏他，２００４；Ｇｏｒｔｅｒ氏他，２００６；Ｋｕｍａｒ氏とＢｕｃｋｍａｓｔｅｒ氏，２００６）。対照ニューロンではＧＡＢＡ−ＰＳＰは既にわずかに脱分極しており、そして、ＳＥ後３週間後、ブメタニドはそれを完全にはそのレベルに回復させなかった。従って、抑制は「過分極している」のではなく、常に「短絡している」と言える。しかし、ＡＰ発火のトリガーを興奮電流により防止するための最も重要な要素は、発火閾値に近い膜電位での抑止性電流の振幅であるように思われることを忘れないようにする必要がある。この電流振幅は、発火閾値（約４５ｍＶ）に近いＥ（ＰＳＰ）の変移と共にＣｌ−駆動力に従って徐々に変化する。その結果ＳＥ３週間後かつブメタニドの存在下で（Ｅ（ＰＳＰ）は約−６０ｍＶ）−４５ｍＶでの駆動力は、対照ラットの約２６ｍＶに対し約１５ｍＶであり、従って約４２％減少する。結果としてこの臨界膜電位領域でのＣｌ−電流は、駆動力の減少及びＧＡＢＡ−ＰＳＰコンダクタンスの減少の両方によって減衰されるが、ブメタニドの存在下では、てんかん様活性の抑制に依然として全く効果的である。このことは、全体的にＣｌ−勾配を回復することが生体内で処置的利益をもたらすという希望を与える。てんかん発生、及びＮＫＣＣ１活性の抑制に対する処置的及び予防的干渉に関する我々の原理は、図２２に要約されている。そこに示された、潜伏期に始まるブメタニド処置中及び以降の発作の非常に効果的な抑制は、原理の実証を提供する。
さらに、初期のそして高度に特異的な病理的ＮＫＣＣ１活性の基準化、及びこの処置による変化した挙動の基準化は、ブメタニドでの提案された抗てんかん処置が、少なくとも幾つかの現在の抗てんかん剤による知性と脳の能力に対する副作用を回避する、という重要な追加的利益を有することを示唆する。
【０１０２】
我々は、我々の発見がＴＬＥの初期の発現において作用する主要な要素を開示するものと信じ、また、疾患につながる変化の起点及び進行中の深層嗅内皮質の重要性を強調する。
【０１０３】
（略語）
ＡＣＳＦ、人工脳脊髄液；ＣＡ、アンモン角；ＤＡＰＩ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＥＣ，嗅内皮質；Ｅ（ＰＳＰ）、ＰＳＰ逆転電位；ＦＩＳＨ，蛍光遺伝子プローブ法；ＩＰＳＰ，抑制性シナプス後電位；ＰＢＳ，リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ−Ｔ，０．２％のトリトン−Ｘ−１００を含むＰＢＳ；ＰＳＰ, シナプス後電位；ＲＭＰ，静止膜電位；ＳＥ、てんかん重積；ＴＬＥ、内側側頭葉てんかん。
【０１０４】
（参照）
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症の可能性を抑制又は減少させる方法であって、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、治療的に有効な量のＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積（ＳＥ）発症後の潜伏期に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、原因が未知の最初の発作を被験者が患った後に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が請求項２に記載の発作の１つを患った後約８週間から約２４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が請求項２に記載の発作の１つを患った後約１週間から約４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が第２の処置薬と組合わされ、そして前記被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、前記被験者に同時投与され、
ここにおいて前記第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が,トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, ３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン、及びそれらの混合物からなるグループから選択される化合物である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、バルビツール酸化合物、ベンゾジアゼピン系化合物、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、３−アミノプロピルスルフィン酸、及びここに記載される他の組成物からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の重症度を抑制又は減少させる方法であって、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、治療的に有効な量のＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積発症後の潜伏期に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、原因が未知の最初の発作を被験者が患った後に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＳＥ発作を発症後約８週間から約２４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＳＥ発作を発症後約２週間から約４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、前記被験者に前記ＮＫＣＣ１抑制剤と第２の処置薬が同時投与され、
ここにおいて前記第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, ３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン、及びそれらの混合物からなるグループから選択される化合物である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、バルビツール酸化合物、ベンゾジアゼピン系化合物、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、３−アミノプロピルスルフィン酸、及びここに記載される他の組成物からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の反復性発作を患った後に、慢性的に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者が反復性てんかん重積（ＳＥ）を患う、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、発作後２−４週間以内のＮＫＣＣ１活性の抑制、又はＮＫＣＣ１の再発現の抑制を通じて作用する、ことを特徴とする請求項２又は１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗利尿剤が末梢作用性抗利尿剤である、ことを特徴とする請求項７又は１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗利尿剤が、ＮＫＣＣ１抑制剤の利尿作用を抑制することにより作用することを特徴とする請求項７又は１７に記載の方法。
【請求項２６】
被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症の可能性を抑制又は減少させるための薬剤の生産において、ＮＫＣＣ１抑制剤を使用する方法。
【請求項２７】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤は、ガンマアミノ酪酸Ａ（ＧＡＢＡＡ）受容体依存信号伝達の調節剤、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せからなるグループから選択される第２の処置剤と組合わされる、ことを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の重症度を抑制又は減少させるための薬剤の生産において、ＮＫＣＣ１抑制剤を使用する方法。
【請求項３０】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記発作がてんかん重積（ＳＥ）である、ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
原因が未知の最初の発作を前記被験者が患う、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症の可能性を抑制又は減少させる方法であって、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、治療的に有効な量のＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積（ＳＥ）発症後の潜伏期に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、原因が未知の最初の発作を被験者が患った後に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が請求項２に記載の発作の１つを患った後約８週間から約２４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者が請求項２に記載の発作の１つを患った後約１週間から約４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が第２の処置薬と組合わされ、そして前記被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、前記被験者に同時投与され、
ここにおいて前記第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が,トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, ３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン、及びそれらの混合物からなるグループから選択される化合物である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、バルビツール酸化合物、ベンゾジアゼピン系化合物、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、３−アミノプロピルスルフィン酸、及びここに記載される他の組成物からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の重症度を抑制又は減少させる方法であって、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、治療的に有効な量のＮＫＣＣ１抑制剤を被験者に投与するステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者のてんかん重積発症後の潜伏期に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、原因が未知の最初の発作を被験者が患った後に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＳＥ発作を発症後約８週間から約２４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＳＥ発作を発症後約２週間から約４週間以内に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、前記被験者に前記ＮＫＣＣ１抑制剤と第２の処置薬が同時投与され、
ここにおいて前記第２の処置薬は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せである、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, トラセミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、ピレタニド、トリパミド、エトゾリン（ｅｔｏｚｏｌｉｎｅ）及びその代謝体、オゾリノン（Ｏｚｏｌｉｎｏｎｅ）、シクレタニン、およびそれらの医薬的に許容可能な派生物、塩及びエステルからなるグループから選択されるループ利尿薬である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が, ３−ヒドラジノプロピオン酸、アミノオキシ酢酸、ガバクリン、ガバペンチン、イソニアジド、フェネルジン、フェニルエチリデンヒドラジン、プレガバリン、バルノクタミド、バルプロ酸、バルプロミド、ビガバトリン、及びそれらの混合物からなるグループから選択される化合物である、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）調節組成物が、バルビツール酸化合物、ベンゾジアゼピン系化合物、ガバペンチン、プレガバリン、４アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸（バクロフェン）、４−アミノ−３−フェニルブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシフェニルブタン酸、４−アミノ−３−（チエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−クロロチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−ブロモチエン−２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（５−メチルチエンー２−イル）ブタン酸、４−アミノ−３−（２−イミダゾリル）ブタン酸、４−グアニジノー３−（４−クロロフェニル）ブタン酸、（３−アミノプロピル）亜ホスホン酸、（４−アミノブチ−２−イル）亜ホスホン酸、酪酸ナトリウム、（３−アミノ−２−メチルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノブチル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−（４−フルオロフェニル）プロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−フェニルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）亜ホスホン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−シクロヘキシルプロピル）亜ホスホン酸、（３−アミノ−２−ベンジルプロピル）亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−メトキシフェニル）プロピル]亜ホスホン酸、[３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロピル]亜ホスホン酸、（３−アミノプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（４−アミノブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）（ジフルオロメチル）ホスフィン酸、（Ｅ）−（３−アミノプロペン−１−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−オキソ−プロピル）メチルホスフィン酸、（３−アミノプロピル）ヒドロキシメチルホスフィン酸、（５−アミノペンチ−３−イル）メチルホスフィン酸、（４−アミノ−１，１，１−トリフルオロブチ−２−イル）メチルホスフィン酸、（３−アミノ−２−（４−クロロフェニル）プロピル）スルフィン酸、３−アミノプロピルスルフィン酸、及びここに記載される他の組成物からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、被験者がＴＬＥを誘発することが既知の反復性発作を患った後に、慢性的に被験者に投与される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者が反復性てんかん重積（ＳＥ）を患う、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤が、発作後２−４週間以内のＮＫＣＣ１活性の抑制、又はＮＫＣＣ１の再発現の抑制を通じて作用する、ことを特徴とする請求項２又は１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗利尿剤が末梢作用性抗利尿剤である、ことを特徴とする請求項７又は１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗利尿剤が、ＮＫＣＣ１抑制剤の利尿作用を抑制することにより作用することを特徴とする請求項７又は１７に記載の方法。
【請求項２６】
被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の発症の可能性を抑制又は減少させるための薬剤の生産において、ＮＫＣＣ１抑制剤を使用する方法。
【請求項２７】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＫＣＣ１抑制剤は、ガンマアミノ酪酸Ａ（ＧＡＢＡＡ）受容体依存信号伝達の調節剤、抗けいれん薬、イオンチャネル不活性化剤、抗利尿剤、又はそれらの組合せからなるグループから選択される第２の処置剤と組合わされる、ことを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験者がＴＬＥを誘発することが既知の発作を患った後に、被験者における内側側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の重症度を抑制又は減少させるための薬剤の生産において、ＮＫＣＣ１抑制剤を使用する方法。
【請求項３０】
前記ＴＬＥを誘発することが既知の発作は、てんかん重積（ＳＥ）、小発作性てんかん、欠神、筋クローヌス性発作、クローヌス性（間代性）発作、緊張性発作、強直間代発作、無緊張性発作、後天性失語、てんかんを伴う後天性失語症（ランドウ・クレフナー症候群）、後天性てんかん性失語症、大脳皮質異形成−焦点性てんかん（ＣＤＦＥ）、新生児てんかん、海馬硬化症（ＨＳ）、海馬萎縮症、大脳萎縮症、小脳萎縮症、複雑熱性けいれん（ＣＦＣ）を含む熱性発作、外傷性脳障害、脳卒中、低酸素性虚血性症状、代謝不全、脳腫瘍、からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記発作がてんかん重積（ＳＥ）である、ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
原因が未知の最初の発作を前記被験者が患う、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１３−５００２６２（Ｐ２０１３−５００２６２Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１８３１（Ｐ２０１２−５２１８３１）
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３０６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１６９２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０８２６６６５０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３０６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１６９２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０８２６６６５０）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]