内因性カイロミクロンを利用した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸のデリバリーシステム
本発明は、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、より安全かつより効率的に、インビボにおいて細胞内へデリバリーし得るシステムを提供することや、該システムを利用する発現抑制剤や医薬組成物を提供することを目的とする。カイロミクロン導入物質、特にα−トコフェロールが結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、体内においてカイロミクロンの生産が誘導されている条件下で投与することにより、上記核酸をより安全かつ効率的にインビボにおいて肝細胞内へデリバリーすることができる。あるいは、α−トコフェロールが結合した核酸を、抽出したカイロミクロンと混合し、それを投与する。その結果、標的遺伝子の発現を抑制し、その発現の亢進に起因する疾患の治療をより安全かつ効率的に行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、インビボで細胞内へデリバリーするシステムに関し、また、該システムを利用する発現抑制剤や医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的な遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡは、リサーチツールとして広く用いられており、また、腫瘍、感染性疾患、遺伝性疾患を含む広範囲の疾患のための治療剤への応用も注目を集めている。ｓｉＲＮＡの臨床への応用において最も重要な問題は、インビボにおいて、ｓｉＲＮＡを目的細胞に特異的に効率よくデリバリーを行う点にある。例えば、ウイルスベクターを利用して合成ｓｉＲＮＡを高圧、高容量で静脈注射することにより、インビボで該ｓｉＲＮＡのデリバリーを行う方法が知られている。しかし、ウイルスベクターを用いたこの方法は、安全性等の観点から、臨床での利用が制限されている。そのため、ｓｉＲＮＡを肝臓、腫瘍や他の組織にインビボでデリバリーすることのできる非ウイルス性の様々なシステムが開発されている。
【０００３】
非ウイルス性のデリバリーシステムとして、例えば、コレステロールとｓｉＲＮＡの複合体を用いるものや（非特許文献１）、安定な核酸脂質粒子（stable nucleic acid lipid particles；ＳＮＡＬＰ）を用いるものや（非特許文献２）、干渉ナノ粒子（interfering nanoparticles；ｉＮＯＰ）を用いるもの（非特許文献３）などが近年開発されている。これらの非ウイルス性のデリバリーシステムのうち、ＳＮＡＬＰは、これを用いて臨床上適当な量のｓｉＲＮＡを注射投与することにより、肝臓におけるターゲットｍＲＮＡのノックダウンが可能となった点で、大きな進歩をもたらした。しかし、治療量（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＳＮＡＬＰは、カニクイザルにおいて、投与から４８時間後にトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が１０００Ｕ／Ｌを超えるという顕著な肝臓障害を引き起こした。また、ＳＮＡＬＰ及びｉＮＯＰの重大な欠点は、それらのデリバリーシステムでは、毒性の一因となり得る親油性を利用することによって、ｓｉＲＮＡ複合体を受動的にしか肝臓へ移送することができないということである。
【０００４】
近年、非ウイルス性の新たなタイプのデリバリーシステムとして、受容体を介してｓｉＲＮＡを移送し得るｓｉＲＮＡベクター（ＲＶＧ−９Ｒ）（非特許文献４）や、「Dynamic PolyConjugate（登録商標）」（Mirus社製）（非特許文献５）が報告されている。前述のＲＶＧ−９Ｒは、狂犬病ウイルスのグリコプロテイン由来の短ペプチドに９つのアルギニン残基が付加されたものであり、このＲＶＧ−９Ｒを利用して、アセチルコリン受容体を介して神経細胞へｓｉＲＮＡを移送することができる。一方、Dynamic PolyConjugateは、肝細胞を標的とするリガンドとしてＮ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）が結合した膜活性型のポリマーを含んでいる。これらＲＶＧ−９ＲやDynamic PolyConjugateのような受容体介在型デリバリーシステムによれば、インビボでのターゲット細胞へのｓｉＲＮＡのデリバリーの効率と特異性を向上させることができるが、これらのシステムに用いるベクターの人工的な合成分子は、特に投与量が増加した場合に、深刻な副作用を生じる危険性を依然として有している。
【０００５】
ごく最近、内因性lipoproteinを抽出して、lipoptotein内のcholesterol分子を結合させたｓｉＲＮＡでex vivoでＬＤＬ、ＨＤＬ内にとりこませ、リポプロテイン受容体を介して肝臓に導入させるというデリバリー方法が報告された（非特許文献６）。この複合体はフリーのcholesterol−ｓｉＲＮＡより５−８倍有効に肝臓に取り込まれるが、その有効性は１３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの静脈投与で肝臓の標的遺伝子を約５５％抑制できる程度で、はなはだ不十分である。
【０００６】
以上のような状況下において、インビボにおいて効率的かつ特異的にｓｉＲＮＡのデリバリーを行うことができ、かつ、副作用の危険性がより少ないｓｉＲＮＡのデリバリーシステムが求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】Nature 432:173-178, 2004
【非特許文献２】Nature 441:111-114, 2006
【非特許文献３】ACS Chem Biol. 2:237-241, 2007
【非特許文献４】Nature 448:39-43, 2007
【非特許文献５】Proc Natl Acad Sci U S A. 104:12982-12987, 2007
【非特許文献６】Nature Biotechnology 25:1149-1157, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、より安全かつより効率的に、インビボにおいてデリバリーし得るシステムを提供することや、該システムを利用する発現抑制剤や医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ビタミンＥが結合したｓｉＲＮＡを、生体内において内因性カイロミクロンの生産が誘導される条件下で投与したところ、ｓｉＲＮＡをより安全かつ効率的にインビボにおいて細胞内へデリバリーすることができ、その結果、標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制剤や、（２）条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、上記（１）に記載の剤や、（３）脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、上記（２）に記載の剤や、（４）脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（５）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（６）脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（７）カイロミクロン導入物質が結合した核酸が、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合されて脊椎動物に投与される、上記（１）に記載の剤や、（８）物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする上記（１）に記載の剤や、（９）脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、上記（８）に記載の剤や、（１０）核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（１１）核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、上記（１０）に記載の剤や、（１２）核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（１３）抗ＲＮＡｓｅ処理が、２’Ｏメチル化処理及び／又はチオリン酸化処理であることを特徴とする、上記（１２）に記載の剤に関する。
【００１１】
また本発明は、（１４）上記（１）に記載の剤を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（１５）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、前記核酸をインビボでデリバリーする方法に関する。
【００１３】
またさらに本発明は、（１６）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、標的遺伝子の発現抑制によって改善される疾患を治療する方法や、（１７）条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（１８）脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、上記（１７）に記載の方法や、（１９）脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２０）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２１）脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２２）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合して脊椎動物に投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２３）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、上記（２２）に記載の方法や、（２４）物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２５）脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、上記（２４）に記載の方法や、（２６）核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２７）核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、上記（２６）に記載の方法や、（２８）核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】α−トコフェロール（ビタミンＥ）結合ｓｉＲＮＡ（Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）のインビボデリバリーの一般的な概要を示す図である。
【図２】異なる組織間におけるα−トコフェロールの輸送を示す図である。
【図３】ヌクレオチドにおける骨格の結合のチオリン酸化及びそのリボース２’−Ｏ−メチル化による化学的に修飾されたｓｉＲＮＡの安定性及び発現抑制活性を示す図である。Ａ：マウスａｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの配列及び化学的な修飾を示す図である。Ｂ：修飾ｓｉＲＮＡの血清中における安定性を示す図である。Ｃ：修飾ｓｉＲＮＡのインビトロにおける発現抑制効率を示す図である。
【図４】α−トコフェロール（ビタミンＥ）結合ｓｉＲＮＡの化学的構造を示す図である。
【図５】ｓｉＲＮＡとリポプロテインの相互作用を示す図である。
【図６】マウスに静脈注射したＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの肝臓への取り込みを示す図である。Ａ：Ｃｙ３標識Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後の肝臓組織切片を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す図である。Ｂ：肝臓に取り込まれた２７／２９ｍｅｒのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡがＤｉｃｅｒによって切断され、２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡが生じることを示す図である。
【図７】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡを介したマウス肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡの発現抑制効果が、遺伝子特異的であり、かつ、用量依存的であることを示す図である。なお、図７のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。Ａ：ａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、ａｐｏＢ遺伝子特異的にそのｍＲＮＡ発現量を低減させることを示す図である。Ｂ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与による、ａｐｏＢ遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。Ｃ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、用量依存的に発現抑制活性を有することを示す図である。
【図８】Hepa 1-6細胞株に取り込まれた２７／２９ｍｅｒのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰがＤｉｃｅｒによって切断され、２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡが生じることを示す図である。
【図９】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを介したマウス肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡの発現抑制効果が、遺伝子特異的であり、かつ、用量依存的であることを示す図である。なお、図９のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。Ａ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与による、肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡ発現量の低下を示す図である。Ｂ：ａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、ａｐｏＢ遺伝子特異的にそのｍＲＮＡ発現量を低下させることを示す図である。Ｃ：ａｐｏＢ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、用量依存的に発現抑制活性を有することを示す図である。
【図１０】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与する前に、給餌することの効果を示す図である。なお、図１０のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。
【図１１】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与後の肝臓の病理学的解析の結果を示す図である。
【図１２】肝臓ａｐｏＢｍＲＮＡに対するＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの発現抑制活性、及び、他の公知の非ウイルスベクターとの比較を示す図である（但し、ＨＤＬベクター（Ｓｗｉｓｓ）の数値は肝臓のａｐｏＢのタンパク量のデータである）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の標的遺伝子の発現抑制剤は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸（以下、「カイロミクロン導入物質結合核酸」ともいう。）を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする。
リポプロテインにはその比重によりカイロミクロン、ＶＬＤＬ，ＬＤＬ，ＨＤＬがあり、肝細胞にはその受容体として、カイロミクロンの代謝物であるカイロミクロンレムナントが結合するＬＲＰ−１受容体、ＬＤＬが結合するＬＤＬ受容体、ＨＤＬが結合するＳＲ−Ｂ１受容体があり、受容体介在エンドサイトーシス（receptor-mediated endocytosis）により各リポプロテインを細胞内に取り込んでいる。
ＬＤＬ−ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ−ＳＲ−Ｂ１受容体は内因性脂質を恒常的に取り込んでいる。一方、食後に短時間にかつ大量に吸収されたビタミンＥを含む外因性脂質は、主としてカイロミクロンに取り込まれ、ＬＰＬ（lipoprotein lipase）でカイロミクロンレムナントに代謝された後にカイロミクロンレムナント受容体（LDL receptor-related protein-1; ＬＲＰ−１受容体）を介して肝細胞に取り込まれる。肝細胞上のＬＲＰ−１受容体は食後に細胞表面に移動して活性化状態になる。
この外因性脂質の吸収に際して食後に活性化するカイロミクロンレムナント−ＬＲＰ−１受容体を介した肝細胞内への取り込み系をｓｉＲＮＡの導入に用いることにした。
カイロミクロン導入物質結合核酸を、脂質摂取後の内因性カイロミクロンの生産が誘導されている状況で投与すると、カイロミクロン導入物質結合核酸におけるカイロミクロン導入物質とカイロミクロンなどが相互作用して、カイロミクロン導入物質結合核酸とカイロミクロンとの複合体が形成される。このカイロミクロン導入物質結合核酸−カイロミクロン複合体がＬＲＰ−１受容体を介して細胞内に取り込まれるため、標的遺伝子の発現を抑制する核酸が、インビボにおいても、細胞内、特に肝細胞に非常に効率的に取り込まれる。また、生理学的な系を用いているため、従来よりもかなり安全性の高い発現抑制剤を得ることができる。なお、カイロミクロン導入物質としてビタミンＥを、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としてマウスのａｐｏＢ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いた場合における本発明のデリバリーの概要を図１に示す。
【００１６】
上記標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、標的遺伝子の発現を抑制する活性（以下、「発現抑制活性」ともいう。）を有する核酸であれば、天然型、天然修飾型、合成型ヌクレオチドのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはそれらのキメラ体であってもよいが、具体的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム、デコイ（おとり分子）を例示することができ、中でもｓｉＲＮＡを好適に例示することができる。マウスａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡとして具体的には、配列番号１（GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA）からなるセンス鎖（２７ｍｅｒ）と、配列番号２（UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC）からなるアンチセンス鎖（２９ｍｅｒ）からなるｓｉＲＮＡを例示することができる。
【００１７】
また、上記核酸としては、生体内で分解されにくいように修飾した核酸であることが好ましく、特に、核酸がＲＮＡの場合は、細胞内のＲＮａｓｅに対して分解されにくいように、メチル化処理やチオリン酸化処理などの抗ＲＮａｓｅ処理されていることが好ましく、核酸のリボースの２’位のメチル化処理や、核酸の骨格の結合のチオリン酸化処理がさらに好ましい。メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置は、核酸が有する発現抑制活性に若干影響を与える場合があるため、メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置等の態様には、好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の配列によっても異なるため一概いうことはできないが、修飾後の核酸の発現抑制活性を確認するによって、好ましい態様を容易に調べることができる。例えば、前述の配列番号１及び２からなるｓｉＲＮＡにおける好ましい抗ＲＮａｓｅ処理の態様としては、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２、５、１１、１５、２１、２４及び２５のヌクレオチド、並びに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号１、２、５、１２、１４、２１、２４、２５及び２６のヌクレオチドにおけるリボースの２’をメチル化し、また、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２６のヌクレオチドにおける骨格の結合をチオリン酸化し、さらに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号３、４、６、２７、２８のヌクレオチドについては、そのリボースの２’をメチル化し、かつ、その骨格の結合をチオリン酸化することを例示することができる。
【００１８】
上記核酸が有する「標的遺伝子の発現を抑制する活性」とは、上記核酸を細胞内に導入した場合に、導入しない場合に比べて、その標的遺伝子の細胞内の発現を低下させる活性を意味する。標的遺伝子の細胞内の発現の低下は、該標的遺伝子のｍＲＮＡを定量したり、該標的遺伝子にコードされるタンパク質を定量するなどして調べることができる。本発明に用いる核酸が標的遺伝子の発現を抑制する程度としては、この核酸を所定の細胞内に２ｍｇ／ｋｇ導入した場合に、導入しない場合と比較して、細胞内の標的遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパクレベルでの発現が８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、さらにより好ましくは２０％以下を例示することができる。
【００１９】
上記核酸が、ｓｉＲＮＡである場合、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のヌクレオチド数は２１でもよいが、２１より多くすると、細胞内のＤｉｃｅｒによって上記カイロミクロン導入物質及びｓｉＲＮＡの一部と、ｓｉＲＮＡ（ヌクレオチド数２１のもの）との間が切断され、ヌクレオチド数２１のｓｉＲＮＡが効率的に発現抑制効果を発揮しうるため、好ましい。
【００２０】
上記標的遺伝子の発現を抑制する核酸は、標的遺伝子の配列やその転写因子が結合し得る部分の配列などの情報に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、ｓｉＲＮＡであれば、特開２００５−１６８４８５号記載の方法を、核酸アプタマーであれば、Nature, 1990, 346(6287):818-22記載の方法を、リボザイムであれば、FEBS Lett, 1988, 239, 285.； タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.； Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.記載の方法などを用いて、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を設計することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒやデコイは、それぞれ標的遺伝子の配列、及び、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて容易に設計することができる。
【００２１】
上記核酸は、公知の方法等を用いて調製することができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムは標的遺伝子のｃＤＮＡ配列又はゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができ、また、デコイやｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせること等により調製することができる。また、核酸アプタマーは、特開２００７−０１４２９２号記載の方法等により調製することができる。
【００２２】
上記カイロミクロン導入物質としては、カイロミクロンなどのリポプロテインに取り込まれる物質であれば特に制限されないが、炭化水素類、高級アルコール類、高級アルコールエステル類、高級脂肪酸類、高級脂肪酸エステル類、ステロール類（特にコレステロール）、ステロールエステル類などの脂溶性物質、細胞透過性ペプチド（Cell permeable peptide）などのペプチドとアポリポタンパク質とのコンジュゲートや、第１級アミン又は第２級アミンにアルキルアクリルアテソール（alkylacrylatesor）アルキル−アクリルアミドの付加等の脂質様分子などの物質であることが好ましく、中でも生体内で合成のできない外因性脂質である脂溶性ビタミン、安全性がより高い点で、特にビタミンＥであることがより好ましい。
【００２３】
上記ビタミンＥとしては、下記一般式（１）で示されるトコフェノール類もしくは一般式（２）で示されるトコトリエノール類
【００２４】
【化１】
【００２５】
【化２】
【００２６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ3は水素原子またはカルボン酸残基を表わす。）、またはこれら化合物を２種以上含有する混合物を好適に例示することができる。これらのうちα−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝メチル基，Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、β−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、γ−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、δ−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、α−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝メチル基，Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、β−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、γ−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、δ−トコトリエール（一般式（２）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、及び、これらの酢酸エステル、コハク酸エステルが好ましい。特に、α−トコフェロール、γ−トコフェロールが好ましい。また、ビタミンＥとして、ｄ体、ｌ体、ｄｌ体の区別は特に問わない。
【００２７】
なお、上記カイロミクロン導入物質は、２種類以上を組み合わせて使用してもよく、また、上記カイロミクロン導入物質は、天然物質であってもよいし、合成物質であってもよい。
【００２８】
上記カイロミクロン導入物質と上記核酸との結合は、直接的な結合であってもよいし、他の物質を間に介した間接的な結合であってもよいが、共有結合、イオン結合、水素結合等の化学結合で直接的に結合していることが好ましく、中でもより安定した結合が得られることから共有結合を特に好ましく例示することができる。
【００２９】
カイロミクロン導入物質と核酸とを結合させる方法としては、特に制限はないが、例えば共有結合させる場合は、カイロミクロン導入物質と核酸とを、Tetrahedron Letters 33; 2729-2732. 1992.記載の方法にしたがって共有結合させることが好ましく、イオン結合やさせる水素結合を利用する場合は、正電荷を有するアルギニン残基をカイロミクロン導入物質に結合させ、アルギニン残基のこの正電荷と、ｓｉＲＮＡ等の核酸が有する負電荷とのイオン結合や水素結合を利用して結合させることが好ましい。なお、カイロミクロン導入物質に結合させるアルギニン残基の数は、核酸とのより安定的な結合を得る観点から、２以上とすることが好ましく、３以上とすることがより好ましく、４以上とすることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の発現抑制剤は、上記必須成分の他に、必要に応じて本発明の効果に影響しない質的、量的範囲内で、リポプロテイン、水、油剤、ワックス、シリコーン、界面活性剤、アルコール、多価アルコール、水溶性高分子増粘剤、ｐＨ調節剤、香料、酸化防止剤、キレート剤、色素、防腐剤、他の薬効成分等、医薬品に用いられる成分の他、無機又は有機成分も配合することができる。
【００３１】
本発明の発現抑制剤は、上記必須成分及び必要に応じて任意成分を用い、常法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤、シロップ剤、乳剤、注射剤（皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、点滴法を含む）等の液剤、舌下錠、バッカル、トローチ剤、マイクロカプセル等の徐放性製剤、口腔内速崩壊剤、坐剤などの様々な剤型とすることができ、中でも注射剤を好ましく例示することができる。
【００３２】
本発明の発現抑制剤は、カイロミクロン導入物質結合核酸の細胞内への取り込み効率を向上させ、標的遺伝子の発現抑制効率を上昇させる観点から、体内において内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与される。内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件としては、当該目的を達成できる限り特に制限はないが、脊椎動物に脂質を経口投与してから１２時間以内（例えば、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内）の条件が好ましい。脂質の経口投与は、脂質そのものの投与でも良いし、脂質を含む食事の形態での投与でも良い。内因性カイロミクロンの生産を誘導する前に投与対象を飢餓状態にすることがより好ましい。脂質の投与や、さらには、その前に投与対象を飢餓状態することによって、カイロミクロン導入物質結合核酸の細胞内への取り込み効率が向上する詳細な作用機作は明らかではない。しかしながら、リポプロテインの取り込みに関与する肝細胞のＬＲＰ−１受容体は脂質の経口摂取やインスリンによって細胞膜での発現量が増加し、かつ、活性化されることが知られている（Mol Pharmacol. 2007 Jul 3；17609417）ことを考慮すると、脂質を摂取させること等によって、リポプロテインの取り込みに関与する受容体の発現量が増加したり活性化され、その結果、肝細胞のカイロミクロン導入が増加して、その結果カイロミクロン導入物質結合核酸の肝細胞内への取り込み効率が向上するものと考えられる。
なお、上記飢餓状態とは、一定期間飲食物（ただし、カロリーのない水等の飲食物を除く）を摂取していない状態をいい、例えば６時間以上、好ましくは８時間以上、より好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、投与対象に食物を与えない状態が含まれる。
【００３３】
投与されたカイロミクロンが、肝細胞内に迅速に取り込まれるカイロミクロンレムナントに代謝されるためには、十分なＬＰＬが必要である。そのために、脂質（又は脂質含有物）を投与する前にトリトン等のＬＰＬ阻害剤を投与（例えば、静脈注射）し、カイロミクロンの濃度を高めることが好ましい。また、ＬＰＬはビタミンＥを肝細胞に取り込ませる作用がある。ヘパリンを投与することによって、血管内皮細胞表面のヘパラン硫酸に結合したＬＰＬが血中に遊離させることができる。したがって、核酸を投与する前に、脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することが好ましい。
【００３４】
また、本発明の発現抑制剤は、生体外でカイロミクロンを多く含むリポプロテインと混合して投与することができる。上記リポプロテインとしては、脂質とアポタンパク質を含んでおり、いずれかのリポプロテイン受容体から細胞内部に取り込まれ得るリポプロテインである限り特に制限されないが、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質及びアポタンパク質を含むリポプロテインが好ましい。上記リポプロテインとしては、生体から採取したものであっても、レコンビナントであっても、化学合成して得られたものであってもよいが、より高い安全性を得る観点から、生体由来のものが好ましく、免疫アレルギー反応による副作用をより低減させる観点から、発現抑制剤の投与対象の個体自身または同種の個体から採取されたリポプロテインであることがより好ましい。
【００３５】
上記の生体由来のリポプロテインとして、具体的には、生体に吸収された脂質が腸管粘膜上でアポタンパク質と共に形成するカイロミクロン（chylomicron）や、該カイロミクロンが血管内皮のリポプロテインリパーゼによって分解生成するカイロミクロンレムナントを好ましく例示することができ、カイロミクロンをより好ましく例示することができる。上記アポタンパク質としては、特に制限はされないが、アポＢタンパク質（ＡｐｏＢ）やアポＥタンパク質（ＡｐｏＥ）を好ましく例示することができる。
【００３６】
本発明に用いるカイロミクロンを含むリポプロテインとしては、生体から採取したものであってもよいし、合成して得られたものから調製したものであってもよいし、それらの混合物であってもよい。上記リポプロテインの生体からの採取方法としては、脂肪分を摂取してから数時間後の採血で良いが、生体に０．０８−０．４ｇ／ｋｇのトライトンを静脈注射の後に、５−２５ｍｌ／ｋｇの高たんぱく／脂質溶液（アルブミン１０ｍｇ、トリオレイン４０ｍｇ、タウロコール酸ナトリウム４０ｍｇ／ｍｌ）を経口投与後、３−６時間の採血を好ましく例示することができる。さらに、上記のカイロミクロンを多く含むリポプロテインの生体からの調製方法としては、例えば、脂肪分を摂取してから数時間後の生体から採取した血清に、同容量の溶液（水１リットルにつき、１１．４ｇＮａＣｌ、０．１ｇＥＤＴＡ、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む溶液；比重１．００６）を添加し、該溶液を遠心して得られた懸濁液の上相を採取する方法を好適に例示することができる。
【００３７】
また、本発明の発現抑制剤は、前述の剤型に応じて、経口的又は非経口的に投与することができるが、より迅速かつ効率的に発現抑制効果を得る観点から、非経口的に投与することが好ましく、注射投与することがより好ましく、静脈内へ注射投与することがさらに好ましい。
【００３８】
本発明の発現抑制剤の投与量は、投与対象の年齢、体重、症状や、投与対象が罹患している疾患の種類、該発現抑制剤中に含まれるｓｉＲＮＡの配列等によって異なるが、通常は０．１〜３０ｍｇ/ｋｇ（ｓｉＲＮＡ重量換算）を、一日あたり１〜３回に分けて投与することができる。
【００３９】
本発明の発現抑制剤の対象疾患としては、特定の遺伝子を抑制することにより治療に結びつく疾患である限り特に制限されないが、特定の病的標的遺伝子の発現に起因する疾患で肝炎ウイルス遺伝子の発現の亢進に起因するウイルス肝炎や、変異トランスサイレチン遺伝子の発現に起因する家族性アミロイドニューロパチーを特に好ましく例示することができる。
【００４０】
本発明における投与対象としては、動物である限り特に制限されないが、脊椎動物を好ましく例示することができ、哺乳類又は鳥類に属する動物をより好ましく例示することができ、中でも、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジをさらに好ましく例示することができ、ヒトを特に好ましく例示することができる。
【００４１】
また、本発明の発現抑制剤は、本発明の医薬組成物の有効成分として用いることもできる。本発明の医薬組成物は、本発明の発現抑制剤を有効成分として含有することを特徴とする。
【００４２】
本発明における核酸を細胞内へデリバリーする方法（以下、「本発明のデリバリー方法」ともいう。）は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する工程（Ｃ）を有することを特徴とする。カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与すると、カイロミクロン導入物質結合核酸におけるカイロミクロン導入物質とリポプロテインが相互作用して、カイロミクロン導入物質結合核酸とリポプロテインとの複合体が形成され、このカイロミクロン導入物質結合核酸−リポプロテイン複合体がリポプロテイン受容体を介して細胞内に取り込まれるため、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、インビボにおいても、細胞内に非常に効率的にデリバリーすることが可能となった。また、本発明のデリバリー方法を用いることによって、インビボにおいても、従来法と比較してかなり安全に、核酸をデリバリーすることが可能となった。本発明のデリバリー方法における「カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸」や「リポプロテイン」は、上記のとおりである。
【００４３】
本発明のデリバリー方法における、カイロミクロン導入物質結合核酸を内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する方法としては、特に制限されず、上記本発明の発現抑制剤と同様の方法により投与することができる。
【００４４】
本発明のデリバリー方法によってカイロミクロン導入物質結合核酸をデリバリーし得る組織としては特に制限されず、インビボにおいても、肝臓、脳、末梢神経、肺、腸管、すい臓、腎臓、心筋、骨格筋などのいずれの組織へも上記カイロミクロン導入物質結合核酸をデリバリーすることができる。
本発明のデリバリー方法によって、インビボにおいて各組織に脂溶性結合核酸をデリバリーし得ることを示すために、α−トコフェロールの体内での輸送を表す図を図２に示す。
図２に示されているように、飲食物に含まれるα−トコフェロールは、小腸で吸収され、さらに主としてリポプロテインの１種であるカイロミクロンに取り込まれ、このカイロミクロンは、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）によってカイロミクロンレムナント（chylomicron remnant）に代謝され、このカイロミクロンレムナントによって肝臓に輸送される。肝細胞の細胞質において、α−トコフェロールはαＴＴＰ（α-Tocopherol Transfer Protein）によってＶＬＤＬ（very low-density lipoprotein）に取り込まれ、その後、α−トコフェロールを含むＶＬＤＬは血液中に分泌され、該ＶＬＤＬはＬＤＬ（low-density lipoprotein）やＨＤＬ（high-density lipoprotein cholesterol）に代謝されて、α−トコフェロールを含むＬＤＬやＨＤＬとなり、これらは血液によって各組織へと輸送され、各組織に存在するリポプロテイン受容体（例えばＬＲＰ−１受容体、ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体等）を介した受容体介在性エンドサイトーシスによって、α−トコフェロールはさまざまな組織に効率的に取り込まれる。なお、本発明におけるカイロミクロン導入物質がα−トコフェロール以外のカイロミクロン導入物質であっても、本発明におけるカイロミクロン導入物質結合核酸は、リポプロテインと共に各組織の細胞内にリポプロテイン受容体を介したエンドサイトーシスによって効率的に取り込まれる。
【００４５】
本発明のデリバリー方法としては、上記工程（Ｃ）を有している限り特に制限はないが、上記核酸のデリバリー効率を向上させ、標的遺伝子の発現抑制効率を上昇させる観点から、上記内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に核酸を投与する前に、投与対象にヘパリン及び／又はＬＰＬを投与すること（工程（Ｂ））、工程（Ｃ）より前に、飢餓状態にさせる工程（Ａ）をさらに有していることが好ましい。上記飢餓状態とは、一定期間飲食物（ただし、カロリーのない水等の飲食物を除く）を摂取していない状態をいい、例えば６時間以上、好ましくは８時間以上、より好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、投与対象に食物を与えない状態が含まれる。
【００４６】
本発明における疾患を治療する方法（以下、「本発明の治療方法」ともいう。）は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する工程（Ｃ）を有することを特徴とする。カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与すると、前述のように、使用物質結合核酸がインビボにおいても細胞内に非常に効率的に取り込まれるため、従来法と比較してかなり安全に標的遺伝子の発現抑制効果が十分発揮され、その結果、疾患に対する優れた治療効果が得られる。本発明の治療方法における「カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸」や「カイロミクロンを多く含むリポプロテイン」は、上記のとおりである。
【００４７】
本発明の治療方法における、カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する方法としては、特に制限されず、上記本発明の発現抑制剤と同様の方法により投与することができる。また、本発明の治療方法の対象疾患としては、所定の遺伝子の発現の亢進に起因する限り特に制限されず、具体的には、上記の本発明の発現抑制剤の対象疾患と同様の疾患を例示することができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
[細胞培養]
後述の実験に用いるマウス肝がん細胞株（Hepa 1-6細胞株）として、以下の方法で維持した細胞株を用いた。
マウス肝がん細胞株（Hepa 1-6細胞株）を、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＤＭＥＭ：シグマ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。
【実施例２】
【００５０】
[カイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清の分離]
後述の実験に用いるカイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清は、以下の方法にて分離、及び、調整を行った。
生後１２〜１４週のＩＣＲマウス（チャールズ リバー研究所：米国）に、０．４ｇ／ｋｇのトライトンＷＲ−１３３９（ナカライテスク株式会社：京都：日本）を尾静脈から注射した。注射から１０分後に、５ｍｇのウシ血清アルブミン（シグマ社）、２０ｍｇのトリオレイン（和光純薬工業株式会社：東京：日本）及び２０ｍｇのタウロコール酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を含む０．５ｍｌのプロテインリッチ液体食物を上記マウスに経口投与した。このプロテインリッチ液体食物の経口投与から３〜１２時間後にマウスから採取した血清に、同容量の溶液（水１リットルにつき、１１．４ｇＮａＣｌ、０．１ｇＥＤＴＡ、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む溶液；比重１．００６）を添加し、１６℃条件下、２６，０００ｇで３０分間遠心した。得られた懸濁液の上から６分の１を、リポプロテインリッチ血清として採取した。このリポプロテインリッチ血清中のトリグリセリドを、Triglyceride E-TST kit（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を用いて測定し、適宜、使用量を調整した。
【実施例３】
【００５１】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等投与マウスの肝臓の単離]
後述の実験に用いるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ等を投与したマウスの肝臓は、以下の方法にて用意した。
まず、生後４週のＩＣＲマウス（チャールズ リバー研究所：米国）を用意し、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等の投与前に、上記マウスを２４時間断食させた。その後、０．０８〜０．２ｇ／ｋｇのトリトンを尾静脈内から投与し、次いで、２５０μｇのウシ血清アルブミン（シグマ社）及び１ｍｇのトリオレイン（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を含む０．５ｍｌのプロテインリッチ液体食物を上記マウスに経口投与した。プロテインリッチ液体食物の投与から１０分間〜１０時間後、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等を含む０．２５ｍｌの１０質量％マルトース溶液をマウスの尾静脈内に単回投与した。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与の１０分前に、８〜１０Ｕのヘパリンを尾静脈内からマウスに注入し、その後、適宜、６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールをマウスの腹腔内に投与して麻酔をかけ、経心臓的にＰＢＳ溶液を灌流させることによって屠殺し、肝臓を摘出した。
【実施例４】
【００５２】
[定量ＲＴ−ＰＣＲ]
後述の実験で行った定量ＲＴ−ＰＣＲは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。
Isogen（株式会社ニッポンジーン：東京）を用いて、培養細胞又はマウス組織からトータルＲＮＡを抽出した。superscript III及びrandom hexamers (インビトロジェン社)を用い、添付のプロトコールにしたがって、上記ＲＮＡについて逆転写を行い、それに相補的なＤＮＡを得た。定量ＲＴ−ＰＣＲは、前述の相補的なＤＮＡ ０．５μｌと、所定のプライマーと、TaqMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社)とを用いて、添付のプロトコールにしたがって行った。上記定量ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、ABI PRISM 7700 Sequence Detector（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、９５℃１５秒間変性及び６０℃６０秒間アニーリングからなるサイクルを４０サイクル繰り返した。なお、上記所定のプライマーとして用いたマウスのａｐｏＢ遺伝子用のプライマー、ＧＡＰＤＨ遺伝子用のプライマー、ＴＴＲ（transthyretin）遺伝子用のプライマーは、アプライドバイオシステムズ社が設計したものを用いた。
【実施例５】
【００５３】
[ノーザンブロット解析]
後述の実験で行ったノーザンブロット解析は、特に断りのない限り、以下の方法で行った。
MirVana (アンビオン社：オースチン：米国テキサス州)を用いて、Hepa 1-6細胞株、又は、マウス肝臓からトータルＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを、エタチンメイト (株式会社ニッポンジーン：東京：日本) を用いて濃縮した。得られたＲＮＡのうち２μｇを１４質量％のポリアクリルアミドゲル（尿素含有）にて電気泳動して分離し、次いでHybond-N+ メンブレン(アマシャムバイオサイエンス社：ピスカタウエイ：米国ニュージャージー州)にトランスファーした。
一方、ノーザンブロット用のプローブとして、Gene Images 3’-オリゴラべリング キット(アマシャムバイオサイエンス社)にて蛍光標識したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を用意した。
前述のトランスファーメンブレン及びプローブ等を用い、常法にしたがってノーザンブロット解析を行った。上記蛍光標識によるシグナルは、Gene Images CDP-star detection Kit (アマシャムバイオサイエンス社)を用いて画像化した。
【実施例６】
【００５４】
[ｓｉＲＮＡの合成]
マウスのａｐｏＢ遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを設計した。このｓｉＲＮＡのセンス鎖ヌクレオチドの配列（２７ｍｅｒ）を、配列番号１（GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA）に示し、アンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（２９ｍｅｒ）を配列番号２（UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC）に示す。これらのセンス鎖ヌクレオチド配列とアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を、常法にしたがって合成した。
【００５５】
次いで、生体内のＲＮａｓｅに対する安定性を向上させるために、これらのヌクレオチド配列について修飾処理を行った。すなわち、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２、５、１１、１５、２１、２４及び２５のヌクレオチド、並びに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号１、２、５、１２、１４、２１、２４、２５及び２６のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−リボースをメチル化し、また、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２６のヌクレオチドにおける骨格の結合をチオリン酸化し、さらに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号３、４、６、２７、２８のヌクレオチドについては、そのリボースの２’をメチル化し、かつ、その骨格の結合をチオリン酸化した。
【００５６】
その後、文献（Tetrahedron Letters 33; 2729-2732. 1992）記載の方法にしたがって、上記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端にα−トコフェロール（東京化成工業株式会社：東京：日本）を結合した（図４）。
α−トコフェロールを結合した上記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列と、上記センス鎖ヌクレオチド配列とを、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの蒸留水（ＤＷ）中、９５℃１分間アニールさせ、次いで、３７℃で１時間インキュベーションを行った。これにより、本研究に用いる、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ（以下、「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ」ともいう。）を得た。なお、このｓｉＲＮＡは、前述のように、センス鎖ヌクレオチド配列の長さとアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の長さが異なっているため、アンチセンス鎖の３’末端に２ｍｅｒのヌクレオチドのオーバーハングが生じている（図３Ａ）。
【実施例７】
【００５７】
［ｓｉＲＮＡの安定性試験］
上記実施例６における化学的な修飾処理による、ｓｉＲＮＡの安定性への影響を調べるために、以下の実験を行った。
まず、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とし、上記実施例６において化学的に修飾したｓｉＲＮＡ（以下、「修飾ｓｉＲＮＡ」ともいう。）（２μｇ）を用意した。このｓｉＲＮＡを、蒸留水（ＤＷ）又は上記実施例２記載の方法に従って調整したリポプロテインリッチ血清中において、３７℃で２４時間インキュベートした。得られた溶液のそれぞれから、一定量をとってそれぞれプロテイナーゼＫで１時間処理したのち、２質量％のアガロースゲルにて電気泳動を行った。
また、上記の修飾ｓｉＲＮＡに代えて、修飾していないこと以外はそれと同じｓｉＲＮＡ（以下、「非修飾ｓｉＲＮＡ」ともいう。）（２μｇ）を用いて、同様に電気泳動を行った。
上記の電気泳動の結果を図３Ｂに示す。図３Ｂから分かるように、修飾ｓｉＲＮＡ（Modified siRNA）は、非修飾ｓｉＲＮＡ（Naked siRNA）に比べて、血清中での安定性が著しく向上している。これは、修飾ｓｉＲＮＡが、非修飾ｓｉＲＮＡに比べて、血清中に含まれるＲＮＡａｓｅに対してより高い安定性を有していることを示す。
【実施例８】
【００５８】
［ｓｉＲＮＡのインビトロ活性試験］
ｓｉＲＮＡの化学的な修飾は、ｓｉＲＮＡが有する発現抑制活性（silencing activity）を損なう場合もある。上記の修飾ｓｉＲＮＡのインビトロにおける発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。
まず、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とする上記の修飾ｓｉＲＮＡ（２μｇ）を用意した。次いで、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）を用いて、Hepa 1-6細胞株に１０ｎＭの上記修飾ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、得られた細胞株からトータルＲＮＡを抽出し、内因性のａｐｏＢ ｍＲＮＡの量を上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
また、上記の修飾ｓｉＲＮＡに代えて、非修飾ｓｉＲＮＡや非標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）を用いて、同様の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果を図３Ｃに示す。図３Ｃから分かるように、修飾ｓｉＲＮＡ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ）は、非修飾ｓｉＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ ｓｉＲＮＡ）と遜色ない発現抑制活性を示した。
【実施例９】
【００５９】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡとリポプロテインの相互作用]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、カイロミクロンを多く含むリポプロテイン（ＬＰ）リッチ血清に取り込まれるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
まず、０．４μｇ／ｍｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの水溶液４５μｌを、上述の実施例２に記載の方法に従って調製した２．７ｍｇのトリグリセリドを含むリポプロテインリッチ血清１３５μｌと共に１時間インキュベートして、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテイン（Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ）溶液を調製した。このＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液を、分子量１００，０００以上の物質を遮断する遠心フィルターユニット Microcon YM-100（Millipore社)でろ過した。ろ過して得られた溶液について、２質量％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドでＲＮＡを染色した。
また、上記「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液」に代えて、そのα−トコフェロールの結合がない「ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液」や、そのリポプロテインがない「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ溶液」や、そのα−トコフェロールの結合がなく、かつ、そのリポプロテインがない「ｓｉＲＮＡ溶液」について同様の操作を行った。
さらに、上記のそれぞれの場合ついて、ろ過して得られた溶液に代えて、ろ過した際にフィルターに残った画分を溶出して得られた溶液を用いて、同様の操作を行った。
これらの実験の結果を図５に示す。図５の上段は、フィルターに残った画分を溶出して得られた溶液（In centrifugal device）の泳動結果を示し、下段は、ろ過して得られた溶液（Filtered un-conjugated siRNA）の泳動結果を示す。図５の結果から分かるように、α−トコフェロールとの結合があり（Tocopherol-conjugation ＋）、かつ、リポプロテインリッチ血清とのインキュベートがある（Lipoproteins ＋）場合にのみ、ｓｉＲＮＡが上記フィルターにトラップされている。このことは、α−トコフェロールとの結合があり（Tocopherol-conjugation ＋）、かつ、リポプロテインリッチ血清とのインキュベートあって（Lipoproteins ＋）初めて、ｓｉＲＮＡとリポプロテインとの相互作用が生じることを示しており、ひいては、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが生体内において、カイロミクロン等に取り込まれ、ＬＲＰ−１受容体等の受容体を介し、各組織に運搬・吸収される可能性を示唆するものである。
【実施例１０】
【００６０】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡのインビボにおけるｓｉＲＮＡデリバリー]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの、インビボにおいてそのｓｉＲＮＡを運搬するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｃｙ３蛍光色素で標識したＴｏｃ−ｓｉＲＮＡをマウスに投与し、１時間経過後屠殺し、肝臓を摘出した。
次に、この肝臓の一部を４質量％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で６時間固定した後、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に一晩４℃にて浸漬させた。固定した肝臓をＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社：東京：日本）に包埋し、液体窒素にて凍結し、次いで、ライカＣＭ３０５０クライオスタット（ライカ社：ドイツ）にて厚さ４μｍの切片にした。この凍結切片を、スーパーフロストプラス顕微鏡用スライドグラス（フィッシャーサイエンティフィック：ピッツバーグ：米国ペンシルバニア州）に移し、１３ｎＭアレクサ−４８８ファロイジン（インビトロジェン社）／ＰＢＳ溶液と４０ｎＭ ＴｏＰｒｏ−３（インビトロジェン社）／ＰＢＳ溶液を用い、対比染色を２０分間行った後、ベクターシールド（ベクター社：バーリンゲーム：米国カルフォニア州）に封入し、ＬＳＭ５１０共焦点レーザー顕微鏡（ツアイス社：ドイツ）にて観察を行った（図６Ａ）。
図６Ａは肝臓の洞様毛細血管周辺部位を観察した図である。Ｃｙ３蛍光色素のシグナルは、血管を囲んだ部分（図６Ａ中破線を引いた右部分）において全体的に強く検出され、肝細胞（一例として、図６Ａ中三角で示される細胞）、及び、非実質細胞（一例として、図６Ａ中矢印で示される細胞）にｓｉＲＮＡが導入されていたことが確認された。このことから、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、そのｓｉＲＮＡを肝臓に運搬する能力を有する事が示された。
【実施例１１】
【００６１】
[インビボにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの効果的なプロセシング]
肝臓の細胞内に取り込まれたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、成熟形態のｓｉＲＮＡへとプロセシングされるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３記載の方法と同様に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後1時間経過したマウスの肝臓を用意し、上述の実施例５に記載の方法に従って、ｓｉＲＮＡの検出を行った（図６Ｂ）。図６Ｂの結果から分かるように、元々の２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡに加えて、プロセシングされた２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡの存在が確認された。このことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが肝臓の細胞内に取り込まれた後、細胞質に存在するＤｉｃｅｒによって、２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡから２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡへと切断されたことを示している。
【実施例１２】
【００６２】
［Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによるジーンサイレンシングに関する動物試験］
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの、インビボにおいて標的遺伝子の発現を低減させる能力を調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法と同様に、マウスにＴｏｃ−ｓｉＲＮＡを投与し、２４時間経過後に屠殺し、肝臓を摘出した。次に、上述の実施例４に記載の方法にしたがって、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ａｐｏＢ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子のそれぞれについてｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図７Ａに示す。図７Ａから分かるように、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）は、ａｐｏＢとは無関係なｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）や、溶媒のみ（ｍａｌｔｏｓｅ）の場合に比べて、ａｐｏＢのｍＲＮＡ発現量が有意に低減した（ｎ＝３，Ｐ＜０．００１）。また、肝臓で発現する他の内因性遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子）のｍＲＮＡ発現量は、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡや、ｍａｌｔｏｓｅのみを投与した場合と同程度の相対発現量（トータルＲＮＡに対する相対発現量）であった。以上のことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）は、肝臓において標的遺伝子の発現のみを特異的に低減させること、及び、非特異的な遺伝子の発現に影響を与えない、即ち、オフターゲット効果を有さないということを示している。
【００６３】
次に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与マウスのサンプリングを行う時間をずらし、経時的変化を計測した結果を図７Ｂに示す。図７Ｂから分かるように、ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによるａｐｏＢ遺伝子による発現抑制活性の継続性は、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後２日まで確認され、４日目には他（ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ、ｍａｌｔｏｓｅ）と同程度に発現量は回復していた。
【００６４】
また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの投与量を段階的に変化させて同様の実験を行った結果を図７Ｃに示す。ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡのａｐｏＢ遺伝子に対する発現抑制活性は、その投与量に依存的であり、投与量が３２．０ｍｇ／ｋｇの場合、８０％以上の発現抑制活性が得られた。
【実施例１３】
【００６５】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡに関する副作用確認試験]
上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスについて、副作用がないか調べた。
具体的には、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与から３日間経過後のマウスの血液を採取し、その血中の白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（Ｐｌｔ）の測定、及び、総タンパク質量（ＴＰ）、アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）の生化学的解析を行った。
また、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与から３時間経過後のマウスにおけるインターフェロン（ＩＦＮ）の誘導を調べた。まず、血清中のインターフェロンα（ＩＦＮα）濃度を、検出限界が１２．５ｐｇ／ｍｌであるＥＬＩＳＡキット (PBL Biomedical Laboratories社, Biosource社)で測定したが、ＩＦＮαは検出されなかった。更に、ＲＴ−ＰＣＲにて、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与マウスの肝臓におけるインターフェロンβの発現確認を試みたが、検出されなかった。
以上の結果を表１に示す。これらのことから、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡにはほとんど副作用がないこと、また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによる遺伝子抑制がインターフェロン応答によるものではないことが示された。
【００６６】
【表１】
【実施例１４】
【００６７】
[α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテインの調製]
上述の実施例２に記載の方法にしたがって用意したカイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清を、１０質量％のマルトース溶液にて、トリグリセリド濃度が、２０ｇ／Ｌになるように調整した。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ量換算で１μｇ／μｌ）を、同容量のリポプロテインリッチ血清（トリグリセリド濃度２０ｇ／Ｌ）と混合した後、３７℃で１時間インキュベートし、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテイン（以下、「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ」ともいう。）を得た。
【実施例１５】
【００６８】
[インビトロにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの効果的なプロセシング]
細胞内に取り込まれたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、成熟形態のｓｉＲＮＡへとプロセシングされるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、トランスフェクション試薬を含まない培地で培養しているHepa 1-6細胞株の培地に１００ｎＭのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを添加した後、さらに６時間培養した。
このHepa 1-6細胞株を用いて、上述の実施例５に記載の方法にしたがって、ノーザンブロット解析を行った。その結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、元々の２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡに加えて、プロセシングされた２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡの存在が確認された。このことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰがHepa 1-6細胞株の細胞内に取り込まれることができ、また、細胞質に存在するＤｉｃｅｒによって、２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡから２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡへと切断されたことを示している。
【実施例１６】
【００６９】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのｓｉＲＮＡデリバリー及びジーンサイレンシングに関する動物試験]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、インビボにおいてそのｓｉＲＮＡをデリバリーする能力や、インビボにおいて標的遺伝子の発現を低減させる能力を調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰをマウスに投与し、２日経過後に屠殺し、肝臓を摘出した。この肝臓を用い、上述の実施例４に記載の方法にしたがって、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ａｐｏＢ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子のそれぞれについてｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図９に示す。図９Ａから分かるように、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（ＡｐｏＢ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ ｖｅｃｔｏｒ）は、ａｐｏＢとは無関係なｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ／ＬＰ）や、ＬＰのみ（ｃｏｎｔｒｏｌ（ＬＰ ｏｎｌｙ））の場合に比べて、ａｐｏＢのｍＲＮＡ発現量が有意に低減した（ｎ＝３, Ｐ＜０．００１）。また、この発現量の低減効果が、ａｐｏＢ遺伝子に特異的であることは、図９Ｂの結果に示されている。すなわち、ａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与しても、肝臓で発現する他の内因性遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子）のｍＲＮＡ発現量は、ＬＰのみを投与した場合と同程度の相対発現量（トータルＲＮＡに対する相対発現量）であった。
【００７０】
次に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与量を段階的に変化させて同様の実験を行った結果を図９Ｃに示す。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのａｐｏＢ遺伝子に対する発現抑制活性（knockdown effect）は、その投与量に依存的であり、投与量が１．０ｍｇ／ｋｇの場合であっても、８０％以上の発現抑制活性が得られた。
【００７１】
また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの発現抑制活性に対する、断食後における給餌（プロテインリッチ液体食物の投与）の影響を調べるため、上記実験において、プロテインリッチ液体食物の投与を行わなかった場合の、発現抑制活性を測定した。その結果を図１０に示す。図１０から分かるように、給餌を行わなかった場合（Feeding(-)）の発現抑制活性は、給餌を行った場合（Feeding(+)）に比べて３１％低下した。このことは、給餌によってカイロミクロンレムナントの取り込みが活性化される、肝臓で発現しているＬＲＰ１受容体等を介して、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが取り込まれることを示唆している。
【実施例１７】
【００７２】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰに関する副作用確認試験]
上述の実施例１３同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスの血液についても、生化学的解析等を行った（表２）。
加えて、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスの肝臓を、上述の実施例３に記載の方法で摘出し、肝臓の一部を４質量％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、４μｍの厚さの切片を作製し、その切片をヘマトキシリン・エオジン染色して病理学的解析を行った。また、コントロールとして、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰに代えて、ＬＰのみを投与したマウスの肝臓切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果も示す（図１１）。
以上のように、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与したマウスでは、血液の生化学的解析、肝臓組織の病理学的解析のいずれにおいても、特に異常は認められなかった。
また、上述の実施例１３同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスにおけるインターフェロンの誘導を調べたが、検出できなかった。
以上のことから、上述のＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰについてもほとんど副作用がないことが示された。
【００７３】
【表２】
【実施例１８】
【００７４】
[他の非ウイルス性ベクターとの比較]
すでに報告されている他の非ウイルスベクター（Nature 432:173-178, 2004； Nature 441;111-114, 2006； ACS Chem Biol 2;237-241, 2007； Proc Natl Acad Sci USA 104;12982-12987, 2007, Nature Biotechnology 25:1149-1157,2007）との間で、マウス肝臓におけるａｐｏＢｍＲＮＡのインビボの発現抑制効率を比較した。その結果を図１２に示す。公知の他の非ウイルスベクターにおいて用いられているｓｉＲＮＡは、本発明のＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ、又は、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰで用いられているｓｉＲＮＡと同じであり、マウスａｐｏＢｍＲＮＡの同じ部位（Nature 432:173-178, 2004）を標的としている。また、本発明のデータとしては、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡについては上記実施例１２の図７ＢにおけるａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（２．０ｍｇ／ｋｇ投与１日経過後）を、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのデータについては、上記実施例１６の図９ＣにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ投与２日経過後）を用いた。
図１２の結果により、本発明、特にＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰは、他のｓｉＲＮＡデリバリーシステムに比べ、そのｓｉＲＮＡ必要量、並びに、その発現抑制活性の点において非常に優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の核酸のデリバリー方法によれば、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、より安全かつより効率的に、インビボにおいてデリバリーすることができる。本発明のデリバリー方法を利用する本発明の発現抑制剤や医薬組成物によれば、疾患の要因となる特定遺伝子の発現をインビボにおいてより安全かつより効率的に抑制することができる。また、本発明のデリバリー方法を利用する本発明の治療方法によれば、疾患の要因となる特定遺伝子の発現をインビボにおいてより安全かつより効率的に抑制することができ、その結果、前記疾患をより安全かつより効果的に治療することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、インビボで細胞内へデリバリーするシステムに関し、また、該システムを利用する発現抑制剤や医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的な遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡは、リサーチツールとして広く用いられており、また、腫瘍、感染性疾患、遺伝性疾患を含む広範囲の疾患のための治療剤への応用も注目を集めている。ｓｉＲＮＡの臨床への応用において最も重要な問題は、インビボにおいて、ｓｉＲＮＡを目的細胞に特異的に効率よくデリバリーを行う点にある。例えば、ウイルスベクターを利用して合成ｓｉＲＮＡを高圧、高容量で静脈注射することにより、インビボで該ｓｉＲＮＡのデリバリーを行う方法が知られている。しかし、ウイルスベクターを用いたこの方法は、安全性等の観点から、臨床での利用が制限されている。そのため、ｓｉＲＮＡを肝臓、腫瘍や他の組織にインビボでデリバリーすることのできる非ウイルス性の様々なシステムが開発されている。
【０００３】
非ウイルス性のデリバリーシステムとして、例えば、コレステロールとｓｉＲＮＡの複合体を用いるものや（非特許文献１）、安定な核酸脂質粒子（stable nucleic acid lipid particles；ＳＮＡＬＰ）を用いるものや（非特許文献２）、干渉ナノ粒子（interfering nanoparticles；ｉＮＯＰ）を用いるもの（非特許文献３）などが近年開発されている。これらの非ウイルス性のデリバリーシステムのうち、ＳＮＡＬＰは、これを用いて臨床上適当な量のｓｉＲＮＡを注射投与することにより、肝臓におけるターゲットｍＲＮＡのノックダウンが可能となった点で、大きな進歩をもたらした。しかし、治療量（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＳＮＡＬＰは、カニクイザルにおいて、投与から４８時間後にトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が１０００Ｕ／Ｌを超えるという顕著な肝臓障害を引き起こした。また、ＳＮＡＬＰ及びｉＮＯＰの重大な欠点は、それらのデリバリーシステムでは、毒性の一因となり得る親油性を利用することによって、ｓｉＲＮＡ複合体を受動的にしか肝臓へ移送することができないということである。
【０００４】
近年、非ウイルス性の新たなタイプのデリバリーシステムとして、受容体を介してｓｉＲＮＡを移送し得るｓｉＲＮＡベクター（ＲＶＧ−９Ｒ）（非特許文献４）や、「Dynamic PolyConjugate（登録商標）」（Mirus社製）（非特許文献５）が報告されている。前述のＲＶＧ−９Ｒは、狂犬病ウイルスのグリコプロテイン由来の短ペプチドに９つのアルギニン残基が付加されたものであり、このＲＶＧ−９Ｒを利用して、アセチルコリン受容体を介して神経細胞へｓｉＲＮＡを移送することができる。一方、Dynamic PolyConjugateは、肝細胞を標的とするリガンドとしてＮ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）が結合した膜活性型のポリマーを含んでいる。これらＲＶＧ−９ＲやDynamic PolyConjugateのような受容体介在型デリバリーシステムによれば、インビボでのターゲット細胞へのｓｉＲＮＡのデリバリーの効率と特異性を向上させることができるが、これらのシステムに用いるベクターの人工的な合成分子は、特に投与量が増加した場合に、深刻な副作用を生じる危険性を依然として有している。
【０００５】
ごく最近、内因性lipoproteinを抽出して、lipoptotein内のcholesterol分子を結合させたｓｉＲＮＡでex vivoでＬＤＬ、ＨＤＬ内にとりこませ、リポプロテイン受容体を介して肝臓に導入させるというデリバリー方法が報告された（非特許文献６）。この複合体はフリーのcholesterol−ｓｉＲＮＡより５−８倍有効に肝臓に取り込まれるが、その有効性は１３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの静脈投与で肝臓の標的遺伝子を約５５％抑制できる程度で、はなはだ不十分である。
【０００６】
以上のような状況下において、インビボにおいて効率的かつ特異的にｓｉＲＮＡのデリバリーを行うことができ、かつ、副作用の危険性がより少ないｓｉＲＮＡのデリバリーシステムが求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】Nature 432:173-178, 2004
【非特許文献２】Nature 441:111-114, 2006
【非特許文献３】ACS Chem Biol. 2:237-241, 2007
【非特許文献４】Nature 448:39-43, 2007
【非特許文献５】Proc Natl Acad Sci U S A. 104:12982-12987, 2007
【非特許文献６】Nature Biotechnology 25:1149-1157, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、より安全かつより効率的に、インビボにおいてデリバリーし得るシステムを提供することや、該システムを利用する発現抑制剤や医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ビタミンＥが結合したｓｉＲＮＡを、生体内において内因性カイロミクロンの生産が誘導される条件下で投与したところ、ｓｉＲＮＡをより安全かつ効率的にインビボにおいて細胞内へデリバリーすることができ、その結果、標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制剤や、（２）条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、上記（１）に記載の剤や、（３）脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、上記（２）に記載の剤や、（４）脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（５）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（６）脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（７）カイロミクロン導入物質が結合した核酸が、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合されて脊椎動物に投与される、上記（１）に記載の剤や、（８）物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする上記（１）に記載の剤や、（９）脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、上記（８）に記載の剤や、（１０）核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（１１）核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、上記（１０）に記載の剤や、（１２）核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、上記（１）に記載の剤や、（１３）抗ＲＮＡｓｅ処理が、２’Ｏメチル化処理及び／又はチオリン酸化処理であることを特徴とする、上記（１２）に記載の剤に関する。
【００１１】
また本発明は、（１４）上記（１）に記載の剤を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（１５）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、前記核酸をインビボでデリバリーする方法に関する。
【００１３】
またさらに本発明は、（１６）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、標的遺伝子の発現抑制によって改善される疾患を治療する方法や、（１７）条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（１８）脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、上記（１７）に記載の方法や、（１９）脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２０）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２１）脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２２）カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合して脊椎動物に投与することを含む、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２３）脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、上記（２２）に記載の方法や、（２４）物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２５）脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、上記（２４）に記載の方法や、（２６）核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法や、（２７）核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、上記（２６）に記載の方法や、（２８）核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、上記（１５）又は（１６）に記載の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】α−トコフェロール（ビタミンＥ）結合ｓｉＲＮＡ（Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）のインビボデリバリーの一般的な概要を示す図である。
【図２】異なる組織間におけるα−トコフェロールの輸送を示す図である。
【図３】ヌクレオチドにおける骨格の結合のチオリン酸化及びそのリボース２’−Ｏ−メチル化による化学的に修飾されたｓｉＲＮＡの安定性及び発現抑制活性を示す図である。Ａ：マウスａｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの配列及び化学的な修飾を示す図である。Ｂ：修飾ｓｉＲＮＡの血清中における安定性を示す図である。Ｃ：修飾ｓｉＲＮＡのインビトロにおける発現抑制効率を示す図である。
【図４】α−トコフェロール（ビタミンＥ）結合ｓｉＲＮＡの化学的構造を示す図である。
【図５】ｓｉＲＮＡとリポプロテインの相互作用を示す図である。
【図６】マウスに静脈注射したＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの肝臓への取り込みを示す図である。Ａ：Ｃｙ３標識Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後の肝臓組織切片を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す図である。Ｂ：肝臓に取り込まれた２７／２９ｍｅｒのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡがＤｉｃｅｒによって切断され、２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡが生じることを示す図である。
【図７】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡを介したマウス肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡの発現抑制効果が、遺伝子特異的であり、かつ、用量依存的であることを示す図である。なお、図７のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。Ａ：ａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、ａｐｏＢ遺伝子特異的にそのｍＲＮＡ発現量を低減させることを示す図である。Ｂ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与による、ａｐｏＢ遺伝子発現量の経時的変化を示す図である。Ｃ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、用量依存的に発現抑制活性を有することを示す図である。
【図８】Hepa 1-6細胞株に取り込まれた２７／２９ｍｅｒのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰがＤｉｃｅｒによって切断され、２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡが生じることを示す図である。
【図９】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを介したマウス肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡの発現抑制効果が、遺伝子特異的であり、かつ、用量依存的であることを示す図である。なお、図９のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。Ａ：Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与による、肝臓におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡ発現量の低下を示す図である。Ｂ：ａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、ａｐｏＢ遺伝子特異的にそのｍＲＮＡ発現量を低下させることを示す図である。Ｃ：ａｐｏＢ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、用量依存的に発現抑制活性を有することを示す図である。
【図１０】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与する前に、給餌することの効果を示す図である。なお、図１０のすべてのデータは、ｎ＝３, 平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。
【図１１】Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与後の肝臓の病理学的解析の結果を示す図である。
【図１２】肝臓ａｐｏＢｍＲＮＡに対するＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの発現抑制活性、及び、他の公知の非ウイルスベクターとの比較を示す図である（但し、ＨＤＬベクター（Ｓｗｉｓｓ）の数値は肝臓のａｐｏＢのタンパク量のデータである）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の標的遺伝子の発現抑制剤は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸（以下、「カイロミクロン導入物質結合核酸」ともいう。）を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする。
リポプロテインにはその比重によりカイロミクロン、ＶＬＤＬ，ＬＤＬ，ＨＤＬがあり、肝細胞にはその受容体として、カイロミクロンの代謝物であるカイロミクロンレムナントが結合するＬＲＰ−１受容体、ＬＤＬが結合するＬＤＬ受容体、ＨＤＬが結合するＳＲ−Ｂ１受容体があり、受容体介在エンドサイトーシス（receptor-mediated endocytosis）により各リポプロテインを細胞内に取り込んでいる。
ＬＤＬ−ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ−ＳＲ−Ｂ１受容体は内因性脂質を恒常的に取り込んでいる。一方、食後に短時間にかつ大量に吸収されたビタミンＥを含む外因性脂質は、主としてカイロミクロンに取り込まれ、ＬＰＬ（lipoprotein lipase）でカイロミクロンレムナントに代謝された後にカイロミクロンレムナント受容体（LDL receptor-related protein-1; ＬＲＰ−１受容体）を介して肝細胞に取り込まれる。肝細胞上のＬＲＰ−１受容体は食後に細胞表面に移動して活性化状態になる。
この外因性脂質の吸収に際して食後に活性化するカイロミクロンレムナント−ＬＲＰ−１受容体を介した肝細胞内への取り込み系をｓｉＲＮＡの導入に用いることにした。
カイロミクロン導入物質結合核酸を、脂質摂取後の内因性カイロミクロンの生産が誘導されている状況で投与すると、カイロミクロン導入物質結合核酸におけるカイロミクロン導入物質とカイロミクロンなどが相互作用して、カイロミクロン導入物質結合核酸とカイロミクロンとの複合体が形成される。このカイロミクロン導入物質結合核酸−カイロミクロン複合体がＬＲＰ−１受容体を介して細胞内に取り込まれるため、標的遺伝子の発現を抑制する核酸が、インビボにおいても、細胞内、特に肝細胞に非常に効率的に取り込まれる。また、生理学的な系を用いているため、従来よりもかなり安全性の高い発現抑制剤を得ることができる。なお、カイロミクロン導入物質としてビタミンＥを、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としてマウスのａｐｏＢ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いた場合における本発明のデリバリーの概要を図１に示す。
【００１６】
上記標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、標的遺伝子の発現を抑制する活性（以下、「発現抑制活性」ともいう。）を有する核酸であれば、天然型、天然修飾型、合成型ヌクレオチドのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはそれらのキメラ体であってもよいが、具体的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム、デコイ（おとり分子）を例示することができ、中でもｓｉＲＮＡを好適に例示することができる。マウスａｐｏＢ遺伝子を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡとして具体的には、配列番号１（GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA）からなるセンス鎖（２７ｍｅｒ）と、配列番号２（UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC）からなるアンチセンス鎖（２９ｍｅｒ）からなるｓｉＲＮＡを例示することができる。
【００１７】
また、上記核酸としては、生体内で分解されにくいように修飾した核酸であることが好ましく、特に、核酸がＲＮＡの場合は、細胞内のＲＮａｓｅに対して分解されにくいように、メチル化処理やチオリン酸化処理などの抗ＲＮａｓｅ処理されていることが好ましく、核酸のリボースの２’位のメチル化処理や、核酸の骨格の結合のチオリン酸化処理がさらに好ましい。メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置は、核酸が有する発現抑制活性に若干影響を与える場合があるため、メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置等の態様には、好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の配列によっても異なるため一概いうことはできないが、修飾後の核酸の発現抑制活性を確認するによって、好ましい態様を容易に調べることができる。例えば、前述の配列番号１及び２からなるｓｉＲＮＡにおける好ましい抗ＲＮａｓｅ処理の態様としては、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２、５、１１、１５、２１、２４及び２５のヌクレオチド、並びに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号１、２、５、１２、１４、２１、２４、２５及び２６のヌクレオチドにおけるリボースの２’をメチル化し、また、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２６のヌクレオチドにおける骨格の結合をチオリン酸化し、さらに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号３、４、６、２７、２８のヌクレオチドについては、そのリボースの２’をメチル化し、かつ、その骨格の結合をチオリン酸化することを例示することができる。
【００１８】
上記核酸が有する「標的遺伝子の発現を抑制する活性」とは、上記核酸を細胞内に導入した場合に、導入しない場合に比べて、その標的遺伝子の細胞内の発現を低下させる活性を意味する。標的遺伝子の細胞内の発現の低下は、該標的遺伝子のｍＲＮＡを定量したり、該標的遺伝子にコードされるタンパク質を定量するなどして調べることができる。本発明に用いる核酸が標的遺伝子の発現を抑制する程度としては、この核酸を所定の細胞内に２ｍｇ／ｋｇ導入した場合に、導入しない場合と比較して、細胞内の標的遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパクレベルでの発現が８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、さらにより好ましくは２０％以下を例示することができる。
【００１９】
上記核酸が、ｓｉＲＮＡである場合、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のヌクレオチド数は２１でもよいが、２１より多くすると、細胞内のＤｉｃｅｒによって上記カイロミクロン導入物質及びｓｉＲＮＡの一部と、ｓｉＲＮＡ（ヌクレオチド数２１のもの）との間が切断され、ヌクレオチド数２１のｓｉＲＮＡが効率的に発現抑制効果を発揮しうるため、好ましい。
【００２０】
上記標的遺伝子の発現を抑制する核酸は、標的遺伝子の配列やその転写因子が結合し得る部分の配列などの情報に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、ｓｉＲＮＡであれば、特開２００５−１６８４８５号記載の方法を、核酸アプタマーであれば、Nature, 1990, 346(6287):818-22記載の方法を、リボザイムであれば、FEBS Lett, 1988, 239, 285.； タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.； Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.記載の方法などを用いて、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を設計することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒやデコイは、それぞれ標的遺伝子の配列、及び、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて容易に設計することができる。
【００２１】
上記核酸は、公知の方法等を用いて調製することができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムは標的遺伝子のｃＤＮＡ配列又はゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができ、また、デコイやｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせること等により調製することができる。また、核酸アプタマーは、特開２００７−０１４２９２号記載の方法等により調製することができる。
【００２２】
上記カイロミクロン導入物質としては、カイロミクロンなどのリポプロテインに取り込まれる物質であれば特に制限されないが、炭化水素類、高級アルコール類、高級アルコールエステル類、高級脂肪酸類、高級脂肪酸エステル類、ステロール類（特にコレステロール）、ステロールエステル類などの脂溶性物質、細胞透過性ペプチド（Cell permeable peptide）などのペプチドとアポリポタンパク質とのコンジュゲートや、第１級アミン又は第２級アミンにアルキルアクリルアテソール（alkylacrylatesor）アルキル−アクリルアミドの付加等の脂質様分子などの物質であることが好ましく、中でも生体内で合成のできない外因性脂質である脂溶性ビタミン、安全性がより高い点で、特にビタミンＥであることがより好ましい。
【００２３】
上記ビタミンＥとしては、下記一般式（１）で示されるトコフェノール類もしくは一般式（２）で示されるトコトリエノール類
【００２４】
【化１】
【００２５】
【化２】
【００２６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ3は水素原子またはカルボン酸残基を表わす。）、またはこれら化合物を２種以上含有する混合物を好適に例示することができる。これらのうちα−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝メチル基，Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、β−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、γ−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、δ−トコフェロール（一般式（１）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、α−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝メチル基，Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、β−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、γ−トコトリエノール（一般式（２）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝メチル基，Ｒ3＝水素原子）、δ−トコトリエール（一般式（２）において、Ｒ1＝水素原子、Ｒ2＝水素原子，Ｒ3＝水素原子）、及び、これらの酢酸エステル、コハク酸エステルが好ましい。特に、α−トコフェロール、γ−トコフェロールが好ましい。また、ビタミンＥとして、ｄ体、ｌ体、ｄｌ体の区別は特に問わない。
【００２７】
なお、上記カイロミクロン導入物質は、２種類以上を組み合わせて使用してもよく、また、上記カイロミクロン導入物質は、天然物質であってもよいし、合成物質であってもよい。
【００２８】
上記カイロミクロン導入物質と上記核酸との結合は、直接的な結合であってもよいし、他の物質を間に介した間接的な結合であってもよいが、共有結合、イオン結合、水素結合等の化学結合で直接的に結合していることが好ましく、中でもより安定した結合が得られることから共有結合を特に好ましく例示することができる。
【００２９】
カイロミクロン導入物質と核酸とを結合させる方法としては、特に制限はないが、例えば共有結合させる場合は、カイロミクロン導入物質と核酸とを、Tetrahedron Letters 33; 2729-2732. 1992.記載の方法にしたがって共有結合させることが好ましく、イオン結合やさせる水素結合を利用する場合は、正電荷を有するアルギニン残基をカイロミクロン導入物質に結合させ、アルギニン残基のこの正電荷と、ｓｉＲＮＡ等の核酸が有する負電荷とのイオン結合や水素結合を利用して結合させることが好ましい。なお、カイロミクロン導入物質に結合させるアルギニン残基の数は、核酸とのより安定的な結合を得る観点から、２以上とすることが好ましく、３以上とすることがより好ましく、４以上とすることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の発現抑制剤は、上記必須成分の他に、必要に応じて本発明の効果に影響しない質的、量的範囲内で、リポプロテイン、水、油剤、ワックス、シリコーン、界面活性剤、アルコール、多価アルコール、水溶性高分子増粘剤、ｐＨ調節剤、香料、酸化防止剤、キレート剤、色素、防腐剤、他の薬効成分等、医薬品に用いられる成分の他、無機又は有機成分も配合することができる。
【００３１】
本発明の発現抑制剤は、上記必須成分及び必要に応じて任意成分を用い、常法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤、シロップ剤、乳剤、注射剤（皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、点滴法を含む）等の液剤、舌下錠、バッカル、トローチ剤、マイクロカプセル等の徐放性製剤、口腔内速崩壊剤、坐剤などの様々な剤型とすることができ、中でも注射剤を好ましく例示することができる。
【００３２】
本発明の発現抑制剤は、カイロミクロン導入物質結合核酸の細胞内への取り込み効率を向上させ、標的遺伝子の発現抑制効率を上昇させる観点から、体内において内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与される。内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件としては、当該目的を達成できる限り特に制限はないが、脊椎動物に脂質を経口投与してから１２時間以内（例えば、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内）の条件が好ましい。脂質の経口投与は、脂質そのものの投与でも良いし、脂質を含む食事の形態での投与でも良い。内因性カイロミクロンの生産を誘導する前に投与対象を飢餓状態にすることがより好ましい。脂質の投与や、さらには、その前に投与対象を飢餓状態することによって、カイロミクロン導入物質結合核酸の細胞内への取り込み効率が向上する詳細な作用機作は明らかではない。しかしながら、リポプロテインの取り込みに関与する肝細胞のＬＲＰ−１受容体は脂質の経口摂取やインスリンによって細胞膜での発現量が増加し、かつ、活性化されることが知られている（Mol Pharmacol. 2007 Jul 3；17609417）ことを考慮すると、脂質を摂取させること等によって、リポプロテインの取り込みに関与する受容体の発現量が増加したり活性化され、その結果、肝細胞のカイロミクロン導入が増加して、その結果カイロミクロン導入物質結合核酸の肝細胞内への取り込み効率が向上するものと考えられる。
なお、上記飢餓状態とは、一定期間飲食物（ただし、カロリーのない水等の飲食物を除く）を摂取していない状態をいい、例えば６時間以上、好ましくは８時間以上、より好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、投与対象に食物を与えない状態が含まれる。
【００３３】
投与されたカイロミクロンが、肝細胞内に迅速に取り込まれるカイロミクロンレムナントに代謝されるためには、十分なＬＰＬが必要である。そのために、脂質（又は脂質含有物）を投与する前にトリトン等のＬＰＬ阻害剤を投与（例えば、静脈注射）し、カイロミクロンの濃度を高めることが好ましい。また、ＬＰＬはビタミンＥを肝細胞に取り込ませる作用がある。ヘパリンを投与することによって、血管内皮細胞表面のヘパラン硫酸に結合したＬＰＬが血中に遊離させることができる。したがって、核酸を投与する前に、脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することが好ましい。
【００３４】
また、本発明の発現抑制剤は、生体外でカイロミクロンを多く含むリポプロテインと混合して投与することができる。上記リポプロテインとしては、脂質とアポタンパク質を含んでおり、いずれかのリポプロテイン受容体から細胞内部に取り込まれ得るリポプロテインである限り特に制限されないが、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質及びアポタンパク質を含むリポプロテインが好ましい。上記リポプロテインとしては、生体から採取したものであっても、レコンビナントであっても、化学合成して得られたものであってもよいが、より高い安全性を得る観点から、生体由来のものが好ましく、免疫アレルギー反応による副作用をより低減させる観点から、発現抑制剤の投与対象の個体自身または同種の個体から採取されたリポプロテインであることがより好ましい。
【００３５】
上記の生体由来のリポプロテインとして、具体的には、生体に吸収された脂質が腸管粘膜上でアポタンパク質と共に形成するカイロミクロン（chylomicron）や、該カイロミクロンが血管内皮のリポプロテインリパーゼによって分解生成するカイロミクロンレムナントを好ましく例示することができ、カイロミクロンをより好ましく例示することができる。上記アポタンパク質としては、特に制限はされないが、アポＢタンパク質（ＡｐｏＢ）やアポＥタンパク質（ＡｐｏＥ）を好ましく例示することができる。
【００３６】
本発明に用いるカイロミクロンを含むリポプロテインとしては、生体から採取したものであってもよいし、合成して得られたものから調製したものであってもよいし、それらの混合物であってもよい。上記リポプロテインの生体からの採取方法としては、脂肪分を摂取してから数時間後の採血で良いが、生体に０．０８−０．４ｇ／ｋｇのトライトンを静脈注射の後に、５−２５ｍｌ／ｋｇの高たんぱく／脂質溶液（アルブミン１０ｍｇ、トリオレイン４０ｍｇ、タウロコール酸ナトリウム４０ｍｇ／ｍｌ）を経口投与後、３−６時間の採血を好ましく例示することができる。さらに、上記のカイロミクロンを多く含むリポプロテインの生体からの調製方法としては、例えば、脂肪分を摂取してから数時間後の生体から採取した血清に、同容量の溶液（水１リットルにつき、１１．４ｇＮａＣｌ、０．１ｇＥＤＴＡ、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む溶液；比重１．００６）を添加し、該溶液を遠心して得られた懸濁液の上相を採取する方法を好適に例示することができる。
【００３７】
また、本発明の発現抑制剤は、前述の剤型に応じて、経口的又は非経口的に投与することができるが、より迅速かつ効率的に発現抑制効果を得る観点から、非経口的に投与することが好ましく、注射投与することがより好ましく、静脈内へ注射投与することがさらに好ましい。
【００３８】
本発明の発現抑制剤の投与量は、投与対象の年齢、体重、症状や、投与対象が罹患している疾患の種類、該発現抑制剤中に含まれるｓｉＲＮＡの配列等によって異なるが、通常は０．１〜３０ｍｇ/ｋｇ（ｓｉＲＮＡ重量換算）を、一日あたり１〜３回に分けて投与することができる。
【００３９】
本発明の発現抑制剤の対象疾患としては、特定の遺伝子を抑制することにより治療に結びつく疾患である限り特に制限されないが、特定の病的標的遺伝子の発現に起因する疾患で肝炎ウイルス遺伝子の発現の亢進に起因するウイルス肝炎や、変異トランスサイレチン遺伝子の発現に起因する家族性アミロイドニューロパチーを特に好ましく例示することができる。
【００４０】
本発明における投与対象としては、動物である限り特に制限されないが、脊椎動物を好ましく例示することができ、哺乳類又は鳥類に属する動物をより好ましく例示することができ、中でも、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジをさらに好ましく例示することができ、ヒトを特に好ましく例示することができる。
【００４１】
また、本発明の発現抑制剤は、本発明の医薬組成物の有効成分として用いることもできる。本発明の医薬組成物は、本発明の発現抑制剤を有効成分として含有することを特徴とする。
【００４２】
本発明における核酸を細胞内へデリバリーする方法（以下、「本発明のデリバリー方法」ともいう。）は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する工程（Ｃ）を有することを特徴とする。カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与すると、カイロミクロン導入物質結合核酸におけるカイロミクロン導入物質とリポプロテインが相互作用して、カイロミクロン導入物質結合核酸とリポプロテインとの複合体が形成され、このカイロミクロン導入物質結合核酸−リポプロテイン複合体がリポプロテイン受容体を介して細胞内に取り込まれるため、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、インビボにおいても、細胞内に非常に効率的にデリバリーすることが可能となった。また、本発明のデリバリー方法を用いることによって、インビボにおいても、従来法と比較してかなり安全に、核酸をデリバリーすることが可能となった。本発明のデリバリー方法における「カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸」や「リポプロテイン」は、上記のとおりである。
【００４３】
本発明のデリバリー方法における、カイロミクロン導入物質結合核酸を内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する方法としては、特に制限されず、上記本発明の発現抑制剤と同様の方法により投与することができる。
【００４４】
本発明のデリバリー方法によってカイロミクロン導入物質結合核酸をデリバリーし得る組織としては特に制限されず、インビボにおいても、肝臓、脳、末梢神経、肺、腸管、すい臓、腎臓、心筋、骨格筋などのいずれの組織へも上記カイロミクロン導入物質結合核酸をデリバリーすることができる。
本発明のデリバリー方法によって、インビボにおいて各組織に脂溶性結合核酸をデリバリーし得ることを示すために、α−トコフェロールの体内での輸送を表す図を図２に示す。
図２に示されているように、飲食物に含まれるα−トコフェロールは、小腸で吸収され、さらに主としてリポプロテインの１種であるカイロミクロンに取り込まれ、このカイロミクロンは、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）によってカイロミクロンレムナント（chylomicron remnant）に代謝され、このカイロミクロンレムナントによって肝臓に輸送される。肝細胞の細胞質において、α−トコフェロールはαＴＴＰ（α-Tocopherol Transfer Protein）によってＶＬＤＬ（very low-density lipoprotein）に取り込まれ、その後、α−トコフェロールを含むＶＬＤＬは血液中に分泌され、該ＶＬＤＬはＬＤＬ（low-density lipoprotein）やＨＤＬ（high-density lipoprotein cholesterol）に代謝されて、α−トコフェロールを含むＬＤＬやＨＤＬとなり、これらは血液によって各組織へと輸送され、各組織に存在するリポプロテイン受容体（例えばＬＲＰ−１受容体、ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体等）を介した受容体介在性エンドサイトーシスによって、α−トコフェロールはさまざまな組織に効率的に取り込まれる。なお、本発明におけるカイロミクロン導入物質がα−トコフェロール以外のカイロミクロン導入物質であっても、本発明におけるカイロミクロン導入物質結合核酸は、リポプロテインと共に各組織の細胞内にリポプロテイン受容体を介したエンドサイトーシスによって効率的に取り込まれる。
【００４５】
本発明のデリバリー方法としては、上記工程（Ｃ）を有している限り特に制限はないが、上記核酸のデリバリー効率を向上させ、標的遺伝子の発現抑制効率を上昇させる観点から、上記内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に核酸を投与する前に、投与対象にヘパリン及び／又はＬＰＬを投与すること（工程（Ｂ））、工程（Ｃ）より前に、飢餓状態にさせる工程（Ａ）をさらに有していることが好ましい。上記飢餓状態とは、一定期間飲食物（ただし、カロリーのない水等の飲食物を除く）を摂取していない状態をいい、例えば６時間以上、好ましくは８時間以上、より好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、投与対象に食物を与えない状態が含まれる。
【００４６】
本発明における疾患を治療する方法（以下、「本発明の治療方法」ともいう。）は、カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する工程（Ｃ）を有することを特徴とする。カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与すると、前述のように、使用物質結合核酸がインビボにおいても細胞内に非常に効率的に取り込まれるため、従来法と比較してかなり安全に標的遺伝子の発現抑制効果が十分発揮され、その結果、疾患に対する優れた治療効果が得られる。本発明の治療方法における「カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸」や「カイロミクロンを多く含むリポプロテイン」は、上記のとおりである。
【００４７】
本発明の治療方法における、カイロミクロン導入物質結合核酸を、内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与する方法としては、特に制限されず、上記本発明の発現抑制剤と同様の方法により投与することができる。また、本発明の治療方法の対象疾患としては、所定の遺伝子の発現の亢進に起因する限り特に制限されず、具体的には、上記の本発明の発現抑制剤の対象疾患と同様の疾患を例示することができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
[細胞培養]
後述の実験に用いるマウス肝がん細胞株（Hepa 1-6細胞株）として、以下の方法で維持した細胞株を用いた。
マウス肝がん細胞株（Hepa 1-6細胞株）を、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＤＭＥＭ：シグマ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。
【実施例２】
【００５０】
[カイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清の分離]
後述の実験に用いるカイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清は、以下の方法にて分離、及び、調整を行った。
生後１２〜１４週のＩＣＲマウス（チャールズ リバー研究所：米国）に、０．４ｇ／ｋｇのトライトンＷＲ−１３３９（ナカライテスク株式会社：京都：日本）を尾静脈から注射した。注射から１０分後に、５ｍｇのウシ血清アルブミン（シグマ社）、２０ｍｇのトリオレイン（和光純薬工業株式会社：東京：日本）及び２０ｍｇのタウロコール酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を含む０．５ｍｌのプロテインリッチ液体食物を上記マウスに経口投与した。このプロテインリッチ液体食物の経口投与から３〜１２時間後にマウスから採取した血清に、同容量の溶液（水１リットルにつき、１１．４ｇＮａＣｌ、０．１ｇＥＤＴＡ、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを含む溶液；比重１．００６）を添加し、１６℃条件下、２６，０００ｇで３０分間遠心した。得られた懸濁液の上から６分の１を、リポプロテインリッチ血清として採取した。このリポプロテインリッチ血清中のトリグリセリドを、Triglyceride E-TST kit（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を用いて測定し、適宜、使用量を調整した。
【実施例３】
【００５１】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等投与マウスの肝臓の単離]
後述の実験に用いるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ等を投与したマウスの肝臓は、以下の方法にて用意した。
まず、生後４週のＩＣＲマウス（チャールズ リバー研究所：米国）を用意し、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等の投与前に、上記マウスを２４時間断食させた。その後、０．０８〜０．２ｇ／ｋｇのトリトンを尾静脈内から投与し、次いで、２５０μｇのウシ血清アルブミン（シグマ社）及び１ｍｇのトリオレイン（和光純薬工業株式会社：東京：日本）を含む０．５ｍｌのプロテインリッチ液体食物を上記マウスに経口投与した。プロテインリッチ液体食物の投与から１０分間〜１０時間後、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ等を含む０．２５ｍｌの１０質量％マルトース溶液をマウスの尾静脈内に単回投与した。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与の１０分前に、８〜１０Ｕのヘパリンを尾静脈内からマウスに注入し、その後、適宜、６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールをマウスの腹腔内に投与して麻酔をかけ、経心臓的にＰＢＳ溶液を灌流させることによって屠殺し、肝臓を摘出した。
【実施例４】
【００５２】
[定量ＲＴ−ＰＣＲ]
後述の実験で行った定量ＲＴ−ＰＣＲは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。
Isogen（株式会社ニッポンジーン：東京）を用いて、培養細胞又はマウス組織からトータルＲＮＡを抽出した。superscript III及びrandom hexamers (インビトロジェン社)を用い、添付のプロトコールにしたがって、上記ＲＮＡについて逆転写を行い、それに相補的なＤＮＡを得た。定量ＲＴ−ＰＣＲは、前述の相補的なＤＮＡ ０．５μｌと、所定のプライマーと、TaqMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社)とを用いて、添付のプロトコールにしたがって行った。上記定量ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、ABI PRISM 7700 Sequence Detector（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、９５℃１５秒間変性及び６０℃６０秒間アニーリングからなるサイクルを４０サイクル繰り返した。なお、上記所定のプライマーとして用いたマウスのａｐｏＢ遺伝子用のプライマー、ＧＡＰＤＨ遺伝子用のプライマー、ＴＴＲ（transthyretin）遺伝子用のプライマーは、アプライドバイオシステムズ社が設計したものを用いた。
【実施例５】
【００５３】
[ノーザンブロット解析]
後述の実験で行ったノーザンブロット解析は、特に断りのない限り、以下の方法で行った。
MirVana (アンビオン社：オースチン：米国テキサス州)を用いて、Hepa 1-6細胞株、又は、マウス肝臓からトータルＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを、エタチンメイト (株式会社ニッポンジーン：東京：日本) を用いて濃縮した。得られたＲＮＡのうち２μｇを１４質量％のポリアクリルアミドゲル（尿素含有）にて電気泳動して分離し、次いでHybond-N+ メンブレン(アマシャムバイオサイエンス社：ピスカタウエイ：米国ニュージャージー州)にトランスファーした。
一方、ノーザンブロット用のプローブとして、Gene Images 3’-オリゴラべリング キット(アマシャムバイオサイエンス社)にて蛍光標識したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を用意した。
前述のトランスファーメンブレン及びプローブ等を用い、常法にしたがってノーザンブロット解析を行った。上記蛍光標識によるシグナルは、Gene Images CDP-star detection Kit (アマシャムバイオサイエンス社)を用いて画像化した。
【実施例６】
【００５４】
[ｓｉＲＮＡの合成]
マウスのａｐｏＢ遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを設計した。このｓｉＲＮＡのセンス鎖ヌクレオチドの配列（２７ｍｅｒ）を、配列番号１（GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA）に示し、アンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（２９ｍｅｒ）を配列番号２（UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC）に示す。これらのセンス鎖ヌクレオチド配列とアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を、常法にしたがって合成した。
【００５５】
次いで、生体内のＲＮａｓｅに対する安定性を向上させるために、これらのヌクレオチド配列について修飾処理を行った。すなわち、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２、５、１１、１５、２１、２４及び２５のヌクレオチド、並びに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号１、２、５、１２、１４、２１、２４、２５及び２６のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−リボースをメチル化し、また、センス鎖（配列番号１）のヌクレオチド番号２６のヌクレオチドにおける骨格の結合をチオリン酸化し、さらに、アンチセンス鎖（配列番号２）のヌクレオチド番号３、４、６、２７、２８のヌクレオチドについては、そのリボースの２’をメチル化し、かつ、その骨格の結合をチオリン酸化した。
【００５６】
その後、文献（Tetrahedron Letters 33; 2729-2732. 1992）記載の方法にしたがって、上記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端にα−トコフェロール（東京化成工業株式会社：東京：日本）を結合した（図４）。
α−トコフェロールを結合した上記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列と、上記センス鎖ヌクレオチド配列とを、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの蒸留水（ＤＷ）中、９５℃１分間アニールさせ、次いで、３７℃で１時間インキュベーションを行った。これにより、本研究に用いる、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ（以下、「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ」ともいう。）を得た。なお、このｓｉＲＮＡは、前述のように、センス鎖ヌクレオチド配列の長さとアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の長さが異なっているため、アンチセンス鎖の３’末端に２ｍｅｒのヌクレオチドのオーバーハングが生じている（図３Ａ）。
【実施例７】
【００５７】
［ｓｉＲＮＡの安定性試験］
上記実施例６における化学的な修飾処理による、ｓｉＲＮＡの安定性への影響を調べるために、以下の実験を行った。
まず、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とし、上記実施例６において化学的に修飾したｓｉＲＮＡ（以下、「修飾ｓｉＲＮＡ」ともいう。）（２μｇ）を用意した。このｓｉＲＮＡを、蒸留水（ＤＷ）又は上記実施例２記載の方法に従って調整したリポプロテインリッチ血清中において、３７℃で２４時間インキュベートした。得られた溶液のそれぞれから、一定量をとってそれぞれプロテイナーゼＫで１時間処理したのち、２質量％のアガロースゲルにて電気泳動を行った。
また、上記の修飾ｓｉＲＮＡに代えて、修飾していないこと以外はそれと同じｓｉＲＮＡ（以下、「非修飾ｓｉＲＮＡ」ともいう。）（２μｇ）を用いて、同様に電気泳動を行った。
上記の電気泳動の結果を図３Ｂに示す。図３Ｂから分かるように、修飾ｓｉＲＮＡ（Modified siRNA）は、非修飾ｓｉＲＮＡ（Naked siRNA）に比べて、血清中での安定性が著しく向上している。これは、修飾ｓｉＲＮＡが、非修飾ｓｉＲＮＡに比べて、血清中に含まれるＲＮＡａｓｅに対してより高い安定性を有していることを示す。
【実施例８】
【００５８】
［ｓｉＲＮＡのインビトロ活性試験］
ｓｉＲＮＡの化学的な修飾は、ｓｉＲＮＡが有する発現抑制活性（silencing activity）を損なう場合もある。上記の修飾ｓｉＲＮＡのインビトロにおける発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。
まず、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とする上記の修飾ｓｉＲＮＡ（２μｇ）を用意した。次いで、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）を用いて、Hepa 1-6細胞株に１０ｎＭの上記修飾ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、得られた細胞株からトータルＲＮＡを抽出し、内因性のａｐｏＢ ｍＲＮＡの量を上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
また、上記の修飾ｓｉＲＮＡに代えて、非修飾ｓｉＲＮＡや非標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）を用いて、同様の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果を図３Ｃに示す。図３Ｃから分かるように、修飾ｓｉＲＮＡ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ）は、非修飾ｓｉＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ ｓｉＲＮＡ）と遜色ない発現抑制活性を示した。
【実施例９】
【００５９】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡとリポプロテインの相互作用]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、カイロミクロンを多く含むリポプロテイン（ＬＰ）リッチ血清に取り込まれるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
まず、０．４μｇ／ｍｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの水溶液４５μｌを、上述の実施例２に記載の方法に従って調製した２．７ｍｇのトリグリセリドを含むリポプロテインリッチ血清１３５μｌと共に１時間インキュベートして、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテイン（Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ）溶液を調製した。このＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液を、分子量１００，０００以上の物質を遮断する遠心フィルターユニット Microcon YM-100（Millipore社)でろ過した。ろ過して得られた溶液について、２質量％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドでＲＮＡを染色した。
また、上記「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液」に代えて、そのα−トコフェロールの結合がない「ｓｉＲＮＡ／ＬＰ溶液」や、そのリポプロテインがない「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ溶液」や、そのα−トコフェロールの結合がなく、かつ、そのリポプロテインがない「ｓｉＲＮＡ溶液」について同様の操作を行った。
さらに、上記のそれぞれの場合ついて、ろ過して得られた溶液に代えて、ろ過した際にフィルターに残った画分を溶出して得られた溶液を用いて、同様の操作を行った。
これらの実験の結果を図５に示す。図５の上段は、フィルターに残った画分を溶出して得られた溶液（In centrifugal device）の泳動結果を示し、下段は、ろ過して得られた溶液（Filtered un-conjugated siRNA）の泳動結果を示す。図５の結果から分かるように、α−トコフェロールとの結合があり（Tocopherol-conjugation ＋）、かつ、リポプロテインリッチ血清とのインキュベートがある（Lipoproteins ＋）場合にのみ、ｓｉＲＮＡが上記フィルターにトラップされている。このことは、α−トコフェロールとの結合があり（Tocopherol-conjugation ＋）、かつ、リポプロテインリッチ血清とのインキュベートあって（Lipoproteins ＋）初めて、ｓｉＲＮＡとリポプロテインとの相互作用が生じることを示しており、ひいては、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが生体内において、カイロミクロン等に取り込まれ、ＬＲＰ−１受容体等の受容体を介し、各組織に運搬・吸収される可能性を示唆するものである。
【実施例１０】
【００６０】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡのインビボにおけるｓｉＲＮＡデリバリー]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの、インビボにおいてそのｓｉＲＮＡを運搬するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｃｙ３蛍光色素で標識したＴｏｃ−ｓｉＲＮＡをマウスに投与し、１時間経過後屠殺し、肝臓を摘出した。
次に、この肝臓の一部を４質量％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で６時間固定した後、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に一晩４℃にて浸漬させた。固定した肝臓をＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社：東京：日本）に包埋し、液体窒素にて凍結し、次いで、ライカＣＭ３０５０クライオスタット（ライカ社：ドイツ）にて厚さ４μｍの切片にした。この凍結切片を、スーパーフロストプラス顕微鏡用スライドグラス（フィッシャーサイエンティフィック：ピッツバーグ：米国ペンシルバニア州）に移し、１３ｎＭアレクサ−４８８ファロイジン（インビトロジェン社）／ＰＢＳ溶液と４０ｎＭ ＴｏＰｒｏ−３（インビトロジェン社）／ＰＢＳ溶液を用い、対比染色を２０分間行った後、ベクターシールド（ベクター社：バーリンゲーム：米国カルフォニア州）に封入し、ＬＳＭ５１０共焦点レーザー顕微鏡（ツアイス社：ドイツ）にて観察を行った（図６Ａ）。
図６Ａは肝臓の洞様毛細血管周辺部位を観察した図である。Ｃｙ３蛍光色素のシグナルは、血管を囲んだ部分（図６Ａ中破線を引いた右部分）において全体的に強く検出され、肝細胞（一例として、図６Ａ中三角で示される細胞）、及び、非実質細胞（一例として、図６Ａ中矢印で示される細胞）にｓｉＲＮＡが導入されていたことが確認された。このことから、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが、そのｓｉＲＮＡを肝臓に運搬する能力を有する事が示された。
【実施例１１】
【００６１】
[インビボにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡの効果的なプロセシング]
肝臓の細胞内に取り込まれたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、成熟形態のｓｉＲＮＡへとプロセシングされるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３記載の方法と同様に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後1時間経過したマウスの肝臓を用意し、上述の実施例５に記載の方法に従って、ｓｉＲＮＡの検出を行った（図６Ｂ）。図６Ｂの結果から分かるように、元々の２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡに加えて、プロセシングされた２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡの存在が確認された。このことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡが肝臓の細胞内に取り込まれた後、細胞質に存在するＤｉｃｅｒによって、２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡから２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡへと切断されたことを示している。
【実施例１２】
【００６２】
［Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによるジーンサイレンシングに関する動物試験］
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの、インビボにおいて標的遺伝子の発現を低減させる能力を調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法と同様に、マウスにＴｏｃ−ｓｉＲＮＡを投与し、２４時間経過後に屠殺し、肝臓を摘出した。次に、上述の実施例４に記載の方法にしたがって、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ａｐｏＢ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子のそれぞれについてｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図７Ａに示す。図７Ａから分かるように、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）は、ａｐｏＢとは無関係なｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）や、溶媒のみ（ｍａｌｔｏｓｅ）の場合に比べて、ａｐｏＢのｍＲＮＡ発現量が有意に低減した（ｎ＝３，Ｐ＜０．００１）。また、肝臓で発現する他の内因性遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子）のｍＲＮＡ発現量は、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡや、ｍａｌｔｏｓｅのみを投与した場合と同程度の相対発現量（トータルＲＮＡに対する相対発現量）であった。以上のことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ）は、肝臓において標的遺伝子の発現のみを特異的に低減させること、及び、非特異的な遺伝子の発現に影響を与えない、即ち、オフターゲット効果を有さないということを示している。
【００６３】
次に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与マウスのサンプリングを行う時間をずらし、経時的変化を計測した結果を図７Ｂに示す。図７Ｂから分かるように、ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによるａｐｏＢ遺伝子による発現抑制活性の継続性は、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与後２日まで確認され、４日目には他（ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ、ｍａｌｔｏｓｅ）と同程度に発現量は回復していた。
【００６４】
また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡの投与量を段階的に変化させて同様の実験を行った結果を図７Ｃに示す。ａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡのａｐｏＢ遺伝子に対する発現抑制活性は、その投与量に依存的であり、投与量が３２．０ｍｇ／ｋｇの場合、８０％以上の発現抑制活性が得られた。
【実施例１３】
【００６５】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡに関する副作用確認試験]
上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスについて、副作用がないか調べた。
具体的には、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与から３日間経過後のマウスの血液を採取し、その血中の白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（Ｐｌｔ）の測定、及び、総タンパク質量（ＴＰ）、アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）の生化学的解析を行った。
また、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与から３時間経過後のマウスにおけるインターフェロン（ＩＦＮ）の誘導を調べた。まず、血清中のインターフェロンα（ＩＦＮα）濃度を、検出限界が１２．５ｐｇ／ｍｌであるＥＬＩＳＡキット (PBL Biomedical Laboratories社, Biosource社)で測定したが、ＩＦＮαは検出されなかった。更に、ＲＴ−ＰＣＲにて、２ｍｇ／ｋｇのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ投与マウスの肝臓におけるインターフェロンβの発現確認を試みたが、検出されなかった。
以上の結果を表１に示す。これらのことから、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡにはほとんど副作用がないこと、また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡによる遺伝子抑制がインターフェロン応答によるものではないことが示された。
【００６６】
【表１】
【実施例１４】
【００６７】
[α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテインの調製]
上述の実施例２に記載の方法にしたがって用意したカイロミクロンを多く含むリポプロテインリッチ血清を、１０質量％のマルトース溶液にて、トリグリセリド濃度が、２０ｇ／Ｌになるように調整した。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ量換算で１μｇ／μｌ）を、同容量のリポプロテインリッチ血清（トリグリセリド濃度２０ｇ／Ｌ）と混合した後、３７℃で１時間インキュベートし、α−トコフェロール結合ｓｉＲＮＡ含有リポプロテイン（以下、「Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ」ともいう。）を得た。
【実施例１５】
【００６８】
[インビトロにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの効果的なプロセシング]
細胞内に取り込まれたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、成熟形態のｓｉＲＮＡへとプロセシングされるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、トランスフェクション試薬を含まない培地で培養しているHepa 1-6細胞株の培地に１００ｎＭのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを添加した後、さらに６時間培養した。
このHepa 1-6細胞株を用いて、上述の実施例５に記載の方法にしたがって、ノーザンブロット解析を行った。その結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、元々の２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡに加えて、プロセシングされた２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡの存在が確認された。このことは、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰがHepa 1-6細胞株の細胞内に取り込まれることができ、また、細胞質に存在するＤｉｃｅｒによって、２７／２９ｍｅｒのｓｉＲＮＡから２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡへと切断されたことを示している。
【実施例１６】
【００６９】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのｓｉＲＮＡデリバリー及びジーンサイレンシングに関する動物試験]
Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが、インビボにおいてそのｓｉＲＮＡをデリバリーする能力や、インビボにおいて標的遺伝子の発現を低減させる能力を調べるため、以下の実験を行った。
まず、上述の実施例３に記載の方法にしたがって、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰをマウスに投与し、２日経過後に屠殺し、肝臓を摘出した。この肝臓を用い、上述の実施例４に記載の方法にしたがって、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ａｐｏＢ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子のそれぞれについてｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図９に示す。図９Ａから分かるように、マウスのａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（ＡｐｏＢ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ ｖｅｃｔｏｒ）は、ａｐｏＢとは無関係なｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ／ＬＰ）や、ＬＰのみ（ｃｏｎｔｒｏｌ（ＬＰ ｏｎｌｙ））の場合に比べて、ａｐｏＢのｍＲＮＡ発現量が有意に低減した（ｎ＝３, Ｐ＜０．００１）。また、この発現量の低減効果が、ａｐｏＢ遺伝子に特異的であることは、図９Ｂの結果に示されている。すなわち、ａｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いたＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与しても、肝臓で発現する他の内因性遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＴＴＲ遺伝子）のｍＲＮＡ発現量は、ＬＰのみを投与した場合と同程度の相対発現量（トータルＲＮＡに対する相対発現量）であった。
【００７０】
次に、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの投与量を段階的に変化させて同様の実験を行った結果を図９Ｃに示す。Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのａｐｏＢ遺伝子に対する発現抑制活性（knockdown effect）は、その投与量に依存的であり、投与量が１．０ｍｇ／ｋｇの場合であっても、８０％以上の発現抑制活性が得られた。
【００７１】
また、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰの発現抑制活性に対する、断食後における給餌（プロテインリッチ液体食物の投与）の影響を調べるため、上記実験において、プロテインリッチ液体食物の投与を行わなかった場合の、発現抑制活性を測定した。その結果を図１０に示す。図１０から分かるように、給餌を行わなかった場合（Feeding(-)）の発現抑制活性は、給餌を行った場合（Feeding(+)）に比べて３１％低下した。このことは、給餌によってカイロミクロンレムナントの取り込みが活性化される、肝臓で発現しているＬＲＰ１受容体等を介して、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰが取り込まれることを示唆している。
【実施例１７】
【００７２】
[Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰに関する副作用確認試験]
上述の実施例１３同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスの血液についても、生化学的解析等を行った（表２）。
加えて、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスの肝臓を、上述の実施例３に記載の方法で摘出し、肝臓の一部を４質量％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、４μｍの厚さの切片を作製し、その切片をヘマトキシリン・エオジン染色して病理学的解析を行った。また、コントロールとして、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰに代えて、ＬＰのみを投与したマウスの肝臓切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果も示す（図１１）。
以上のように、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰを投与したマウスでは、血液の生化学的解析、肝臓組織の病理学的解析のいずれにおいても、特に異常は認められなかった。
また、上述の実施例１３同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ投与マウスにおけるインターフェロンの誘導を調べたが、検出できなかった。
以上のことから、上述のＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ同様、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰについてもほとんど副作用がないことが示された。
【００７３】
【表２】
【実施例１８】
【００７４】
[他の非ウイルス性ベクターとの比較]
すでに報告されている他の非ウイルスベクター（Nature 432:173-178, 2004； Nature 441;111-114, 2006； ACS Chem Biol 2;237-241, 2007； Proc Natl Acad Sci USA 104;12982-12987, 2007, Nature Biotechnology 25:1149-1157,2007）との間で、マウス肝臓におけるａｐｏＢｍＲＮＡのインビボの発現抑制効率を比較した。その結果を図１２に示す。公知の他の非ウイルスベクターにおいて用いられているｓｉＲＮＡは、本発明のＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ、又は、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰで用いられているｓｉＲＮＡと同じであり、マウスａｐｏＢｍＲＮＡの同じ部位（Nature 432:173-178, 2004）を標的としている。また、本発明のデータとしては、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡについては上記実施例１２の図７ＢにおけるａｐｏＢ−１ Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ（２．０ｍｇ／ｋｇ投与１日経過後）を、Ｔｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰのデータについては、上記実施例１６の図９ＣにおけるＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ投与２日経過後）を用いた。
図１２の結果により、本発明、特にＴｏｃ−ｓｉＲＮＡ／ＬＰは、他のｓｉＲＮＡデリバリーシステムに比べ、そのｓｉＲＮＡ必要量、並びに、その発現抑制活性の点において非常に優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の核酸のデリバリー方法によれば、ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、より安全かつより効率的に、インビボにおいてデリバリーすることができる。本発明のデリバリー方法を利用する本発明の発現抑制剤や医薬組成物によれば、疾患の要因となる特定遺伝子の発現をインビボにおいてより安全かつより効率的に抑制することができる。また、本発明のデリバリー方法を利用する本発明の治療方法によれば、疾患の要因となる特定遺伝子の発現をインビボにおいてより安全かつより効率的に抑制することができ、その結果、前記疾患をより安全かつより効果的に治療することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制剤。
【請求項２】
条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項６】
脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項７】
カイロミクロン導入物質が結合した核酸が、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合されて脊椎動物に投与される、請求項１に記載の剤。
【請求項８】
物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項９】
脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、請求項８に記載の剤。
【請求項１０】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項１１】
核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項１３】
抗ＲＮＡｓｅ処理が、２’Ｏメチル化処理及び／又はチオリン酸化処理であることを特徴とする、請求項１２に記載の剤。
【請求項１４】
請求項１に記載の剤を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、前記核酸をインビボでデリバリーする方法。
【請求項１６】
カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、標的遺伝子の発現抑制によって改善される疾患を治療する方法。
【請求項１７】
条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２１】
脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２２】
カイロミクロン導入物質が結合した核酸を、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合して脊椎動物に投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２５】
脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２７】
核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法に関する。
【請求項１】
カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を含有し、かつ、これを内因性カイロミクロンの生産が誘導されている条件下で脊椎動物に投与することを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制剤。
【請求項２】
条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項６】
脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項７】
カイロミクロン導入物質が結合した核酸が、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合されて脊椎動物に投与される、請求項１に記載の剤。
【請求項８】
物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項９】
脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、請求項８に記載の剤。
【請求項１０】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項１１】
核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項１３】
抗ＲＮＡｓｅ処理が、２’Ｏメチル化処理及び／又はチオリン酸化処理であることを特徴とする、請求項１２に記載の剤。
【請求項１４】
請求項１に記載の剤を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、前記核酸をインビボでデリバリーする方法。
【請求項１６】
カイロミクロン導入物質が結合した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸を、内因性カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントの生産が脊椎動物において誘導されている条件下で、前記脊椎動物に投与することを含む、標的遺伝子の発現抑制によって改善される疾患を治療する方法。
【請求項１７】
条件が、脊椎動物に脂質が投与されてから１２時間以内の条件である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
脂質の投与が経口摂取の形態で行なわれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脊椎動物において内因性カイロミクロンの生産が誘導される前に、前記脊椎動物にＬＰＬ阻害剤を投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２１】
脂質を投与する前に、脊椎動物を飢餓状態にすることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２２】
カイロミクロン導入物質が結合した核酸を、脊椎動物から採取した高濃度カイロミクロンと混合して脊椎動物に投与することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物に核酸を投与する前に、前記脊椎動物にＬＰＬ及び／又はヘパリンを投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２５】
脂溶性ビタミンがビタミンＥであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される１種又は２種以上の核酸であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２７】
核酸が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸が、抗ＲＮａｓｅ処理されたＲＮＡであることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法に関する。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０４８７４（Ｐ２０１１−５０４８７４Ａ）
【公表日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０３５６（Ｐ２０１０−５２０３５６）
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００８／００３５２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９３１３
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００８／００３５２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９３１３
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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