内視鏡蛍光観察装置
【課題】 安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察を行うことを可能とする内視鏡蛍光観察装置を提供する。
【解決手段】 十分な光量の蛍光を発する種類の蛋白質を発現させる遺伝子を含むベクタを処置具７により観察対象組織へ注入し、励起光透過フィルタ３３を透過した励起光を観察対象組織へ照射し、観察像の蛍光成分を観察光透過フィルタ４１を介して観察する。これにより、高感度の撮像装置等を導入することなく安価な構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行える。
【解決手段】 十分な光量の蛍光を発する種類の蛋白質を発現させる遺伝子を含むベクタを処置具７により観察対象組織へ注入し、励起光透過フィルタ３３を透過した励起光を観察対象組織へ照射し、観察像の蛍光成分を観察光透過フィルタ４１を介して観察する。これにより、高感度の撮像装置等を導入することなく安価な構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行える。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入して蛍光観察を行う内視鏡蛍光観察装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば腫瘍や癌細胞等の病変部を観察するには、腫瘍や癌細胞等の病変部に集まり易く且つ励起光を照射することで蛍光を発する性質の薬剤を生体へ注入して蛍光観察を行う手法が用いられている。このような蛍光観察を行う蛍光観察装置として、例えば特願平９−１０９６６８号では、励起光を透過するフィルタを介して得られる励起光を内視鏡へ供給し、蛍光を発する薬剤が注入された生体の対象部位へ向けて内視鏡により励起光を照射して薬剤の蛍光による光学像を取得し、この蛍光を透過するフィルタを介して被写体像を観察することで、観察対象部位における病変部を特定する診断を行うための手段が示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の技術で述べた蛍光を発する薬剤は、腫瘍や癌細胞等の種類や生体の固体差により蛍光の強さにバラツキがあり、蛍光が弱く腫瘍や癌細胞等の特定を確実に行えないことがあった。従来、この問題を改善するために、励起光を強くしても、確実な観察を行うための効果は得られなかった。また、微弱な蛍光を観察するために高感度の撮像装置を導入すると、装置が高価になるという問題があった。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察を行うことを可能とする内視鏡蛍光観察装置を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため、本発明は、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴としている。
【０００５】
【発明の実施の形態】（第１の実施の形態）以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１ないし図５は本発明の第１の実施の形態に係り、図１は内視鏡蛍光観察装置の構成を示す説明図、図２はｐＥＧＦＰベクタの構成及び作用を示す説明図、図３はＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの蛍光機能に関わるアミノ酸配列を示す説明図、図４はＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの励起光及び蛍光の波長帯域の特性を示す説明図、図５は励起光透過フィルタ及び観察光透過フィルタのそれぞれの透過波長帯域の特性を示す説明図である。
【０００６】図１に示すように、本実施の形態の内視鏡蛍光観察装置１は、体腔内等に挿入して観察対象組織の観察像を得る内視鏡２と、この内視鏡２に照明光を供給する光源装置３と、前記内視鏡２で得られる観察像を撮像して撮像信号を得る撮像装置４と、この撮像装置４で得られる撮像信号をモニタ表示可能な映像信号に変換するビデオプロセッサ５と、このビデオプロセッサ５で得られる映像信号を映し出すモニタ装置６と、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を含む微生物であるｐＥＧＦＰベクタを含む水溶液を観察対象部位へ注入する処置具７を有して構成されている。
【０００７】前記内視鏡２は、体腔内等に挿入する細長の挿入部１１と、この挿入部１１の基端側に連設され、内視鏡２を把持し操作するための操作部１２と、この操作部１２の基端側に連設され、内視鏡２で得られる観察対象像を射出する接眼部１３と、前記操作部１２の例えば側部から延出し、前記光源装置３から照明光の供給を受けるためのライトガイドケーブル１４と、このライトガイドケーブル１４の端部に設けられ、前記光源装置３と着脱自在に接続するためのライトガイドコネクタ１５と、前記ライトガイドケーブル１４及び前記操作部１２及び前記挿入部１１内を挿通し、前記ライトガイドコネクタ１５を介して光源装置３から得られる照明光を前記挿入部１１の先端部１１ａまで導光するライトガイド１６と、前記先端部１１ａに設けられ、前記ライトガイド１６で導光された照明光を観察対象部位へ向けて配光する配光光学系１７と、前記先端部１１ａに設けられ、観察対象部位の光学像を内視鏡２内へ導く対物光学系１８と、前記挿入部１１及び操作部１２内を挿通し、前記対物光学系１８で導かれた光学像を前記接眼部１３まで導くイメージガイド１９と、前記接眼部１３に設けられ、前記イメージガイド１９で導かれた光学像を射出する接眼光学系２０と、前記操作部１２に設けられ、前記処置具７を導入する処置具導入口２１と、前記先端部１１ａに設けられ、前記処置具導入口２１から導入される処置具７を導出する処置具導出口２２と、前記操作部１２及び前記挿入部１１内を挿通し、前記処置具導入口２１から導入される処置具７を前記処置具導出口２２まで導く処置具挿通管路２３を有して構成されている。
【０００８】前記光源装置３は、照明光を発する光源ランプ３１と、この光源ランプ３１へ電力を供給する電源回路３２と、照明光路上に設けられ、ｐＥＧＦＰベクタにより観察対象部位に発現する蛋白質を励起する波長を透過する励起光透過フィルタ３３と、照明光を前記ライトガイド１６の光入射端面へ集光する集光光学系３４と、前記励起光透過フィルタ３３を照明光路上に挿脱自在に挿入すべく前記励起光透過フィルタ３３を移動させるモータ３５と、光源装置３に対する操作指示を入力するための操作パネル３６と、この操作パネル３６の操作に応じて、少なくとも前記モータ３５を駆動制御する制御回路３７を有して構成されている。
【０００９】前記撮像装置４は、前記内視鏡２の接眼部１３から射出される観察光の前記蛋白質による蛍光の波長成分を透過する観察光透過フィルタ４１と、観察光を結像する結像光学系４２と、この結像光学系４２で結像された観察像を撮像して撮像信号を得る撮像手段としてのＣＣＤ４３を有して構成されている。
【００１０】前記処置具７は、この処置具７の先端部に設けられた注射針５１と、この処置具７の基端側に取り付けられ前記注射針５１を介してｐＥＧＦＰベクタを観察対象組織へ注入するためのシリンジ５２を有して構成されている。
【００１１】図２に示すように、ｐＥＧＦＰベクタは、蛍光を発するＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる蛋白質を観察対象組織のホスト細胞に発現させるＥＧＦＰ遺伝子と呼ばれる遺伝子を含んでいる。このｐＥＧＦＰベクタは、安定して遺伝子をホスト細胞へ導入することが可能であり、米国クローンテック社より製品として供給されている。
【００１２】前記ＥＧＦＰは、野生に存在するオワンクラゲに含まれる蛍光を発するＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる２３８アミノ酸で構成される蛋白質の蛍光を発する強度を増加させるべく遺伝子操作により生成したものである。図３R>３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、それぞれ前記ＧＦＰ及び前記ＥＧＦＰの蛍光機能に関わるアミノ酸配列の抜粋であり、ＥＧＦＰは、（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とＧＦＰに含まれるＳｅｒ（セリン）をＴｈｒ（スレオニン）に組み替えることで、蛍光の強度が増加されている。
【００１３】図４に示すように、前記ＥＧＦＰは、天然のＧＦＰに比して、強い蛍光を発する特性を有している。このＥＧＦＰは、ピークの波長が４８８ｎｍの励起光に励起され、ピークの波長が５１０ｎｍの蛍光を発する特性を有している。
【００１４】図５に示すように、前記励起光透過フィルタ３３は、４５０〜５００ｎｍ付近の波長の光を透過させるように構成されており、前記ＥＧＦＰの励起感度がピークとなる４８８ｎｍ付近の波長帯域を透過するようになっている。なお、この励起光透過フィルタ３３により前記ＥＧＦＰの励起光の波長帯域以外の波長が減衰することで、生体細胞が別の波長により励起されることが防止される。観察光透過フィルタ４１は、励起光の波長帯域及びそれ以下の波長の光を減衰するように構成されている。これにより、観察対象組織からの反射光や散乱光が観察光から取り除かれ、蛍光のみを抽出できるようになっている。
【００１５】次に、本実施の形態の作用を説明する。先ず、経内視鏡的に遺伝子導入を行う組織を特定し、処置具７を処置具挿通管路２３へ挿入し、シリンジ５２により、ｐＥＧＦＰベクタを含む水溶液を観察対象組織へ注入する。すると、観察対象組織のホスト細胞にＥＧＦＰ遺伝子が導入され、このホスト細胞は、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列に従って、ＥＧＦＰの生成を開始する。
【００１６】そして、ＥＧＦＰが発現する時期になったら、操作パネル３６によりモータ３５を操作して、励起光透過フィルタ３３を照明光路に挿入する。すると、内視鏡２から観察対象組織へ向けて励起光が照射され、励起光が照射されたＥＧＦＰが酸化されて発色団が形成され、このＥＧＦＰの発色団が励起され、ＥＧＦＰから蛍光が発せられる。このとき、ＥＧＦＰは、細胞内の局在性を示さないので、細胞全体からＥＧＦＰによる蛍光が発せられる。この蛍光による観察像は、対物光学系１８と、イメージガイド１９と、接眼光学系２０を介して、内視鏡２から射出する。この内視鏡２から射出された観察像は、観察光透過フィルタ４１により、蛍光成分が抽出され、結像光学系４２により、ＣＣＤ４３の撮像面に結像する。これにより、蛍光による被写体像が、モニタ装置６に表示される。
【００１７】このとき、蛍光を発している部位は、内視鏡２による観察部位全体内の小さい領域である場合が多く、蛍光を発している部位が観察部位全体の何処に位置するのか分からないことがある。このような場合には、励起光透過フィルタ３３を照明光路中から退避させ、観察光透過フィルタ４１の透過波長を含む可視光を観察対象組織へ向けて照射することにより、観察部位全体を観察することができる。
【００１８】なお、観察対象組織は、ヒトや動物の組織や細胞に限らず、他の生物の組織や細胞であってもよい。
【００１９】以上説明したように、本実施の形態によれば、内視鏡的操作により観察対象組織にＥＧＦＰ遺伝子を導入し、ＥＧＦＰを発現させることで、ＥＧＦＰから発せられる十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察を行うことができる。また、高感度の撮像装置等を導入することなく、安価な構成の内視鏡蛍光観察装置１により、確実な蛍光観察を行うことができる。従って、本実施の形態によれば、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行えるという効果を得ることができる。
（第１の実施の形態の変形例）次に、前記第１の実施の形態の変形例を説明する。なお、本変形例では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。本変形例では、前記第１の実施の形態で用いたｐＥＧＦＰベクタの代わりに、以下に説明するベクタを用いる。本変形例で用いるベクタは、変性低密度リポ蛋白質受容体を発現させるベクタに、前記第１の実施の形態で述べたＥＧＦＰ遺伝子を組み入れて構成したものである。この変性低密度リポ蛋白質受容体を発現させるベクタは、哺乳類や、微生物や、酵母や、バクテリオファージ或いはウイルス遺伝子由来の調節要素に使用可能な状態に連結された哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体或いは生物学的にこれと等価な類似物をコードする合成ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いはｃＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を介して生成されたＤＮＡ断片で構成される。
【００２０】次に、本変形例の作用を説明する。なお、本変形例では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。本変形例のベクタは、適当な細胞系列への形質転換、形質導入或いは感染によって、変性低密度リポ蛋白質受容体及びＥＧＦＰの発現を誘導する。すると、例えば哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体及びＥＧＦＰが、適当なプロモーターの調節の下、哺乳類細胞や、酵母や、細菌或いはその他の細胞中で発現する。これにより、変性低密度リポ蛋白質受容体が生産される組織を蛍光観察することができる。
【００２１】なお、特開平９−９８７８７号によれば、細菌や、真菌や、酵母及び哺乳類細胞宿主に用いるための適当なクローニング及び発現ベクタは、ポウエル（Pouwl）ら（Cloning Vectors：A Laboratory Manual，エルスビュー社、ニューヨーク州、（1985））によって述べられている。
【００２２】（第２の実施の形態）次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。なお、本実施の形態では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する◎本実施の形態では、前記第１の実施の形態のｐＥＧＦＰベクタを用いる代わりに、後述する抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を用いる。文献１「抗体の生物分子学」（愛知医科大学 吉川和宏他、脳神経外科１９９８年９月号）によれば、アイソトープや、細胞毒素や、或いは治療用遺伝子の運搬手段として使用可能で、直接腫瘍内で発現させることで増殖因子受容体分子の発現を抑止する抗腫瘍抗体について記述されている。この抗腫瘍抗体は、腫瘍のミサイル療法への臨床応用の可能性が検討されており、腫瘍単鎖抗体の組替え抗体により一層現実的となってきつつある。この抗腫瘍抗体は、腫瘍に集積性がある抗体であることが確認されている。
【００２３】また、文献１によれば、遺伝子操作技術により、異なる機能を持つ蛋白質を１つの分子として作り出すことが可能であり、抗体に様々な機能を持たせることができる。そこで、本実施の形態では、ＥＧＦＰを細胞或いは生体組織に発現させるべく、遺伝子組替え技術により抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を生成し、この融合抗体を使用する。
【００２４】次に、本実施の形態の作用を説明する。なお、本実施の形態では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。例えば、切除した腫瘍を経内視鏡的に経過観察する際、腫瘍切除後にその近傍組織に、ＥＧＦＰ遺伝子が導入された抗腫瘍抗体を注入或いは散布する。抗腫瘍抗体が注入或いは散布された組織に腫瘍があると、抗腫瘍抗体はその腫瘍に対して抗体として作用し、腫瘍のある部位に蓄積される。そして、抗腫瘍抗体の蓄積された部位において、ＥＧＦＰ遺伝子が細胞に組み込まれ、細胞分裂により新しい細胞が生成されると、その部位にＥＧＦＰが発現する。これにより、腫瘍細胞から蛍光が発せられるので、腫瘍細胞を蛍光観察することができ、内視鏡下で腫瘍細胞の経過観察を行うことができる。なお、観察対象部位は、内視鏡下で観察可能な生体の胃や、腸や、膀胱等の体腔であれば、いずれの部位であってもよい。また、使用する抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体を含む。また、使用する抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体に限らず、ＥＧＦＰ遺伝子を腫瘍細胞へ導入してＥＧＦＰを発現できるベクタとなるものであれば何でもよい。
【００２５】以上説明した本実施の形態によれば、第１の実施の形態で述べた効果以外に次の効果を得ることができる。本実施の形態によれば、腫瘍に集積性のあるモノクロナール抗体等の抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を観察対象組織に注入或いは散布して使用することで、蛍光観察により腫瘍や癌細胞を発見したり、経過観察し易くなる。
【００２６】なお、本発明は、上述の実施の形態のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能である。
【００２７】［付記］
（付記項１）蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴とする内視鏡蛍光観察装置。
【００２８】（付記項２）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛋白質は、オワンクラゲに含まれる蛍光を発する蛋白質のアミノ酸配列を蛍光を強めるべく組み替えた蛋白質を含む。
【００２９】（付記項３）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記遺伝子は、オワンクラゲに含まれる遺伝子を遺伝子操作により組み替えた遺伝子を含む。
【００３０】（付記項４）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛋白質は、励起光によって酸化されることで蛍光する。
【００３１】（付記項５）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子が組み込まれた微生物を含む。
【００３２】（付記項６）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子を前記観察対象組織の細胞に導入させることで前記細胞に前記蛋白質を発現させるベクタである。
【００３３】（付記項７）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記遺伝子は、遺伝子組み替えにより生成される。
【００３４】（付記項８）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、抗腫瘍抗体と前記遺伝子を結合させた融合抗体を含む。
【００３５】（付記項９）付記項８に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体を含む。
【００３６】（付記項１０）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記励起する波長は、略４８８ｎｍを含む。
【００３７】（付記項１１）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛍光の波長は、略５１０ｎｍを含む。
【００３８】（付記項１２）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第１の透過波長制限手段は、波長が略４８８ｎｍの光を少なくとも透過する。
【００３９】（付記項１３）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、波長が略５１０ｎｍの光を少なくとも透過する。
【００４０】（付記項１４）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、前記第１の透過波長制限手段が透過する波長の光を少なくとも減衰する。
【００４１】（付記項１５）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、略５００ｎｍ以下の波長の光を減衰する。
【００４２】（付記項１６）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、前記蛍光の波長より短い波長の光を減衰する。
【００４３】（付記項１７）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子を前記観察対象組織へ導く処置具を含む。
【００４４】（付記項１８）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段を前記観察対象組織へ導く処置具を備えた。
【００４５】（付記項１９）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第１の透過波長制限手段を前記照明光の光路上に自在に挿入する手段を備えた。
【００４６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行えるという効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ないし図５は本発明の第１の実施の形態に係り、図１は内視鏡蛍光観察装置の構成を示す説明図
【図２】ｐＥＧＦＰベクタの構成及び作用を示す説明図
【図３】ＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの蛍光機能に関わるアミノ酸配列を示す説明図
【図４】ＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの励起光及び蛍光の波長帯域の特性を示す説明図
【図５】励起光透過フィルタ及び観察光透過フィルタのそれぞれの透過波長帯域の特性を示す説明図
【符号の説明】
１…内視鏡蛍光観察装置
２…内視鏡
３…光源装置
４…撮像装置
７…処置具
３３…励起光透過フィルタ
４１…観察光透過フィルタ
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入して蛍光観察を行う内視鏡蛍光観察装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば腫瘍や癌細胞等の病変部を観察するには、腫瘍や癌細胞等の病変部に集まり易く且つ励起光を照射することで蛍光を発する性質の薬剤を生体へ注入して蛍光観察を行う手法が用いられている。このような蛍光観察を行う蛍光観察装置として、例えば特願平９−１０９６６８号では、励起光を透過するフィルタを介して得られる励起光を内視鏡へ供給し、蛍光を発する薬剤が注入された生体の対象部位へ向けて内視鏡により励起光を照射して薬剤の蛍光による光学像を取得し、この蛍光を透過するフィルタを介して被写体像を観察することで、観察対象部位における病変部を特定する診断を行うための手段が示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の技術で述べた蛍光を発する薬剤は、腫瘍や癌細胞等の種類や生体の固体差により蛍光の強さにバラツキがあり、蛍光が弱く腫瘍や癌細胞等の特定を確実に行えないことがあった。従来、この問題を改善するために、励起光を強くしても、確実な観察を行うための効果は得られなかった。また、微弱な蛍光を観察するために高感度の撮像装置を導入すると、装置が高価になるという問題があった。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察を行うことを可能とする内視鏡蛍光観察装置を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため、本発明は、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴としている。
【０００５】
【発明の実施の形態】（第１の実施の形態）以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１ないし図５は本発明の第１の実施の形態に係り、図１は内視鏡蛍光観察装置の構成を示す説明図、図２はｐＥＧＦＰベクタの構成及び作用を示す説明図、図３はＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの蛍光機能に関わるアミノ酸配列を示す説明図、図４はＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの励起光及び蛍光の波長帯域の特性を示す説明図、図５は励起光透過フィルタ及び観察光透過フィルタのそれぞれの透過波長帯域の特性を示す説明図である。
【０００６】図１に示すように、本実施の形態の内視鏡蛍光観察装置１は、体腔内等に挿入して観察対象組織の観察像を得る内視鏡２と、この内視鏡２に照明光を供給する光源装置３と、前記内視鏡２で得られる観察像を撮像して撮像信号を得る撮像装置４と、この撮像装置４で得られる撮像信号をモニタ表示可能な映像信号に変換するビデオプロセッサ５と、このビデオプロセッサ５で得られる映像信号を映し出すモニタ装置６と、蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を含む微生物であるｐＥＧＦＰベクタを含む水溶液を観察対象部位へ注入する処置具７を有して構成されている。
【０００７】前記内視鏡２は、体腔内等に挿入する細長の挿入部１１と、この挿入部１１の基端側に連設され、内視鏡２を把持し操作するための操作部１２と、この操作部１２の基端側に連設され、内視鏡２で得られる観察対象像を射出する接眼部１３と、前記操作部１２の例えば側部から延出し、前記光源装置３から照明光の供給を受けるためのライトガイドケーブル１４と、このライトガイドケーブル１４の端部に設けられ、前記光源装置３と着脱自在に接続するためのライトガイドコネクタ１５と、前記ライトガイドケーブル１４及び前記操作部１２及び前記挿入部１１内を挿通し、前記ライトガイドコネクタ１５を介して光源装置３から得られる照明光を前記挿入部１１の先端部１１ａまで導光するライトガイド１６と、前記先端部１１ａに設けられ、前記ライトガイド１６で導光された照明光を観察対象部位へ向けて配光する配光光学系１７と、前記先端部１１ａに設けられ、観察対象部位の光学像を内視鏡２内へ導く対物光学系１８と、前記挿入部１１及び操作部１２内を挿通し、前記対物光学系１８で導かれた光学像を前記接眼部１３まで導くイメージガイド１９と、前記接眼部１３に設けられ、前記イメージガイド１９で導かれた光学像を射出する接眼光学系２０と、前記操作部１２に設けられ、前記処置具７を導入する処置具導入口２１と、前記先端部１１ａに設けられ、前記処置具導入口２１から導入される処置具７を導出する処置具導出口２２と、前記操作部１２及び前記挿入部１１内を挿通し、前記処置具導入口２１から導入される処置具７を前記処置具導出口２２まで導く処置具挿通管路２３を有して構成されている。
【０００８】前記光源装置３は、照明光を発する光源ランプ３１と、この光源ランプ３１へ電力を供給する電源回路３２と、照明光路上に設けられ、ｐＥＧＦＰベクタにより観察対象部位に発現する蛋白質を励起する波長を透過する励起光透過フィルタ３３と、照明光を前記ライトガイド１６の光入射端面へ集光する集光光学系３４と、前記励起光透過フィルタ３３を照明光路上に挿脱自在に挿入すべく前記励起光透過フィルタ３３を移動させるモータ３５と、光源装置３に対する操作指示を入力するための操作パネル３６と、この操作パネル３６の操作に応じて、少なくとも前記モータ３５を駆動制御する制御回路３７を有して構成されている。
【０００９】前記撮像装置４は、前記内視鏡２の接眼部１３から射出される観察光の前記蛋白質による蛍光の波長成分を透過する観察光透過フィルタ４１と、観察光を結像する結像光学系４２と、この結像光学系４２で結像された観察像を撮像して撮像信号を得る撮像手段としてのＣＣＤ４３を有して構成されている。
【００１０】前記処置具７は、この処置具７の先端部に設けられた注射針５１と、この処置具７の基端側に取り付けられ前記注射針５１を介してｐＥＧＦＰベクタを観察対象組織へ注入するためのシリンジ５２を有して構成されている。
【００１１】図２に示すように、ｐＥＧＦＰベクタは、蛍光を発するＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる蛋白質を観察対象組織のホスト細胞に発現させるＥＧＦＰ遺伝子と呼ばれる遺伝子を含んでいる。このｐＥＧＦＰベクタは、安定して遺伝子をホスト細胞へ導入することが可能であり、米国クローンテック社より製品として供給されている。
【００１２】前記ＥＧＦＰは、野生に存在するオワンクラゲに含まれる蛍光を発するＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる２３８アミノ酸で構成される蛋白質の蛍光を発する強度を増加させるべく遺伝子操作により生成したものである。図３R>３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、それぞれ前記ＧＦＰ及び前記ＥＧＦＰの蛍光機能に関わるアミノ酸配列の抜粋であり、ＥＧＦＰは、（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とＧＦＰに含まれるＳｅｒ（セリン）をＴｈｒ（スレオニン）に組み替えることで、蛍光の強度が増加されている。
【００１３】図４に示すように、前記ＥＧＦＰは、天然のＧＦＰに比して、強い蛍光を発する特性を有している。このＥＧＦＰは、ピークの波長が４８８ｎｍの励起光に励起され、ピークの波長が５１０ｎｍの蛍光を発する特性を有している。
【００１４】図５に示すように、前記励起光透過フィルタ３３は、４５０〜５００ｎｍ付近の波長の光を透過させるように構成されており、前記ＥＧＦＰの励起感度がピークとなる４８８ｎｍ付近の波長帯域を透過するようになっている。なお、この励起光透過フィルタ３３により前記ＥＧＦＰの励起光の波長帯域以外の波長が減衰することで、生体細胞が別の波長により励起されることが防止される。観察光透過フィルタ４１は、励起光の波長帯域及びそれ以下の波長の光を減衰するように構成されている。これにより、観察対象組織からの反射光や散乱光が観察光から取り除かれ、蛍光のみを抽出できるようになっている。
【００１５】次に、本実施の形態の作用を説明する。先ず、経内視鏡的に遺伝子導入を行う組織を特定し、処置具７を処置具挿通管路２３へ挿入し、シリンジ５２により、ｐＥＧＦＰベクタを含む水溶液を観察対象組織へ注入する。すると、観察対象組織のホスト細胞にＥＧＦＰ遺伝子が導入され、このホスト細胞は、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列に従って、ＥＧＦＰの生成を開始する。
【００１６】そして、ＥＧＦＰが発現する時期になったら、操作パネル３６によりモータ３５を操作して、励起光透過フィルタ３３を照明光路に挿入する。すると、内視鏡２から観察対象組織へ向けて励起光が照射され、励起光が照射されたＥＧＦＰが酸化されて発色団が形成され、このＥＧＦＰの発色団が励起され、ＥＧＦＰから蛍光が発せられる。このとき、ＥＧＦＰは、細胞内の局在性を示さないので、細胞全体からＥＧＦＰによる蛍光が発せられる。この蛍光による観察像は、対物光学系１８と、イメージガイド１９と、接眼光学系２０を介して、内視鏡２から射出する。この内視鏡２から射出された観察像は、観察光透過フィルタ４１により、蛍光成分が抽出され、結像光学系４２により、ＣＣＤ４３の撮像面に結像する。これにより、蛍光による被写体像が、モニタ装置６に表示される。
【００１７】このとき、蛍光を発している部位は、内視鏡２による観察部位全体内の小さい領域である場合が多く、蛍光を発している部位が観察部位全体の何処に位置するのか分からないことがある。このような場合には、励起光透過フィルタ３３を照明光路中から退避させ、観察光透過フィルタ４１の透過波長を含む可視光を観察対象組織へ向けて照射することにより、観察部位全体を観察することができる。
【００１８】なお、観察対象組織は、ヒトや動物の組織や細胞に限らず、他の生物の組織や細胞であってもよい。
【００１９】以上説明したように、本実施の形態によれば、内視鏡的操作により観察対象組織にＥＧＦＰ遺伝子を導入し、ＥＧＦＰを発現させることで、ＥＧＦＰから発せられる十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察を行うことができる。また、高感度の撮像装置等を導入することなく、安価な構成の内視鏡蛍光観察装置１により、確実な蛍光観察を行うことができる。従って、本実施の形態によれば、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行えるという効果を得ることができる。
（第１の実施の形態の変形例）次に、前記第１の実施の形態の変形例を説明する。なお、本変形例では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。本変形例では、前記第１の実施の形態で用いたｐＥＧＦＰベクタの代わりに、以下に説明するベクタを用いる。本変形例で用いるベクタは、変性低密度リポ蛋白質受容体を発現させるベクタに、前記第１の実施の形態で述べたＥＧＦＰ遺伝子を組み入れて構成したものである。この変性低密度リポ蛋白質受容体を発現させるベクタは、哺乳類や、微生物や、酵母や、バクテリオファージ或いはウイルス遺伝子由来の調節要素に使用可能な状態に連結された哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体或いは生物学的にこれと等価な類似物をコードする合成ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いはｃＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を介して生成されたＤＮＡ断片で構成される。
【００２０】次に、本変形例の作用を説明する。なお、本変形例では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。本変形例のベクタは、適当な細胞系列への形質転換、形質導入或いは感染によって、変性低密度リポ蛋白質受容体及びＥＧＦＰの発現を誘導する。すると、例えば哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体及びＥＧＦＰが、適当なプロモーターの調節の下、哺乳類細胞や、酵母や、細菌或いはその他の細胞中で発現する。これにより、変性低密度リポ蛋白質受容体が生産される組織を蛍光観察することができる。
【００２１】なお、特開平９−９８７８７号によれば、細菌や、真菌や、酵母及び哺乳類細胞宿主に用いるための適当なクローニング及び発現ベクタは、ポウエル（Pouwl）ら（Cloning Vectors：A Laboratory Manual，エルスビュー社、ニューヨーク州、（1985））によって述べられている。
【００２２】（第２の実施の形態）次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。なお、本実施の形態では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する◎本実施の形態では、前記第１の実施の形態のｐＥＧＦＰベクタを用いる代わりに、後述する抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を用いる。文献１「抗体の生物分子学」（愛知医科大学 吉川和宏他、脳神経外科１９９８年９月号）によれば、アイソトープや、細胞毒素や、或いは治療用遺伝子の運搬手段として使用可能で、直接腫瘍内で発現させることで増殖因子受容体分子の発現を抑止する抗腫瘍抗体について記述されている。この抗腫瘍抗体は、腫瘍のミサイル療法への臨床応用の可能性が検討されており、腫瘍単鎖抗体の組替え抗体により一層現実的となってきつつある。この抗腫瘍抗体は、腫瘍に集積性がある抗体であることが確認されている。
【００２３】また、文献１によれば、遺伝子操作技術により、異なる機能を持つ蛋白質を１つの分子として作り出すことが可能であり、抗体に様々な機能を持たせることができる。そこで、本実施の形態では、ＥＧＦＰを細胞或いは生体組織に発現させるべく、遺伝子組替え技術により抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を生成し、この融合抗体を使用する。
【００２４】次に、本実施の形態の作用を説明する。なお、本実施の形態では、前記第１の実施の形態と異なる点を説明する。例えば、切除した腫瘍を経内視鏡的に経過観察する際、腫瘍切除後にその近傍組織に、ＥＧＦＰ遺伝子が導入された抗腫瘍抗体を注入或いは散布する。抗腫瘍抗体が注入或いは散布された組織に腫瘍があると、抗腫瘍抗体はその腫瘍に対して抗体として作用し、腫瘍のある部位に蓄積される。そして、抗腫瘍抗体の蓄積された部位において、ＥＧＦＰ遺伝子が細胞に組み込まれ、細胞分裂により新しい細胞が生成されると、その部位にＥＧＦＰが発現する。これにより、腫瘍細胞から蛍光が発せられるので、腫瘍細胞を蛍光観察することができ、内視鏡下で腫瘍細胞の経過観察を行うことができる。なお、観察対象部位は、内視鏡下で観察可能な生体の胃や、腸や、膀胱等の体腔であれば、いずれの部位であってもよい。また、使用する抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体を含む。また、使用する抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体に限らず、ＥＧＦＰ遺伝子を腫瘍細胞へ導入してＥＧＦＰを発現できるベクタとなるものであれば何でもよい。
【００２５】以上説明した本実施の形態によれば、第１の実施の形態で述べた効果以外に次の効果を得ることができる。本実施の形態によれば、腫瘍に集積性のあるモノクロナール抗体等の抗腫瘍抗体にＥＧＦＰ遺伝子を導入した融合抗体を観察対象組織に注入或いは散布して使用することで、蛍光観察により腫瘍や癌細胞を発見したり、経過観察し易くなる。
【００２６】なお、本発明は、上述の実施の形態のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能である。
【００２７】［付記］
（付記項１）蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴とする内視鏡蛍光観察装置。
【００２８】（付記項２）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛋白質は、オワンクラゲに含まれる蛍光を発する蛋白質のアミノ酸配列を蛍光を強めるべく組み替えた蛋白質を含む。
【００２９】（付記項３）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記遺伝子は、オワンクラゲに含まれる遺伝子を遺伝子操作により組み替えた遺伝子を含む。
【００３０】（付記項４）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛋白質は、励起光によって酸化されることで蛍光する。
【００３１】（付記項５）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子が組み込まれた微生物を含む。
【００３２】（付記項６）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子を前記観察対象組織の細胞に導入させることで前記細胞に前記蛋白質を発現させるベクタである。
【００３３】（付記項７）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記遺伝子は、遺伝子組み替えにより生成される。
【００３４】（付記項８）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、抗腫瘍抗体と前記遺伝子を結合させた融合抗体を含む。
【００３５】（付記項９）付記項８に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記抗腫瘍抗体は、モノクロナール抗体を含む。
【００３６】（付記項１０）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記励起する波長は、略４８８ｎｍを含む。
【００３７】（付記項１１）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記蛍光の波長は、略５１０ｎｍを含む。
【００３８】（付記項１２）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第１の透過波長制限手段は、波長が略４８８ｎｍの光を少なくとも透過する。
【００３９】（付記項１３）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、波長が略５１０ｎｍの光を少なくとも透過する。
【００４０】（付記項１４）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、前記第１の透過波長制限手段が透過する波長の光を少なくとも減衰する。
【００４１】（付記項１５）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、略５００ｎｍ以下の波長の光を減衰する。
【００４２】（付記項１６）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第２の透過波長制限手段は、前記蛍光の波長より短い波長の光を減衰する。
【００４３】（付記項１７）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段は、前記遺伝子を前記観察対象組織へ導く処置具を含む。
【００４４】（付記項１８）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記導入手段を前記観察対象組織へ導く処置具を備えた。
【００４５】（付記項１９）付記項１に記載の内視鏡蛍光観察装置であって、前記第１の透過波長制限手段を前記照明光の光路上に自在に挿入する手段を備えた。
【００４６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、安価な装置構成で、十分な光量の蛍光による確実な蛍光観察が行えるという効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ないし図５は本発明の第１の実施の形態に係り、図１は内視鏡蛍光観察装置の構成を示す説明図
【図２】ｐＥＧＦＰベクタの構成及び作用を示す説明図
【図３】ＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの蛍光機能に関わるアミノ酸配列を示す説明図
【図４】ＧＦＰ及びＥＧＦＰのそれぞれの励起光及び蛍光の波長帯域の特性を示す説明図
【図５】励起光透過フィルタ及び観察光透過フィルタのそれぞれの透過波長帯域の特性を示す説明図
【符号の説明】
１…内視鏡蛍光観察装置
２…内視鏡
３…光源装置
４…撮像装置
７…処置具
３３…励起光透過フィルタ
４１…観察光透過フィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴とする内視鏡蛍光観察装置。
【請求項１】蛍光を発する蛋白質を発現させる遺伝子を観察対象組織へ導入する導入手段と、光源から発せられる照明光を前記観察対象組織へ照射し前記観察対象組織の観察像を得る内視鏡と、前記照明光の光路上に設けられ前記蛋白質を励起する波長を透過する第１の透過波長制限手段と、前記観察像の光路上に設けられ前記蛋白質から発せられる蛍光の波長を透過する第２の透過波長制限手段とを備えたことを特徴とする内視鏡蛍光観察装置。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０００−３００５０９（Ｐ２０００−３００５０９Ａ）
【公開日】平成１２年１０月３１日（２０００．１０．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−１１１２３５
【出願日】平成１１年４月１９日（１９９９．４．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス光学工業株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１２年１０月３１日（２０００．１０．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年４月１９日（１９９９．４．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス光学工業株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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