再ミエリン化および脊髄損傷の治療のためのヒト胚性幹細胞に由来するオリゴデンドロサイト
【課題】オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞等の、グリア細胞のマーカーを有する神経系細胞の集団を提供する。
【解決手段】細胞集団は、所望の表現型または機能的能力を有する細胞の濃縮を促進する条件下で、ヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞を分化させることによって作製される。様々な組み合わせの分化因子およびマイトジェンを用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーを有する細胞集団を産生することができる。さらなる分化において、成熟オリゴデンドロサイトに特有の複雑な突起が形成される。細胞は、ミエリン鞘を形成する能力があり、中枢神経系の機能を改善するために治療に用いることができる。
【解決手段】細胞集団は、所望の表現型または機能的能力を有する細胞の濃縮を促進する条件下で、ヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞を分化させることによって作製される。様々な組み合わせの分化因子およびマイトジェンを用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーを有する細胞集団を産生することができる。さらなる分化において、成熟オリゴデンドロサイトに特有の複雑な突起が形成される。細胞は、ミエリン鞘を形成する能力があり、中枢神経系の機能を改善するために治療に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、胚細胞および神経系前駆細胞の細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、生物学的研究、薬剤スクリーニング、およびヒトの治療に使用するのに適した、オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞の濃縮された集団を提供する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００２年７月１１日に出願された米国仮出願第６０／３９５，３８２号、および２００３年４月４日に出願された米国実用出願第１０／４０６，８１７号の利益を主張する。優先権出願は、本明細書によって完全に参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の支持において重要な生理的役割を担う。ヒトの治療にオリゴデンドロサイトが利用できれば、神経細胞を絶縁するミエリン鞘の欠陥によって生じる障害状態の治癒が促進され得る。
【０００４】
多発性硬化症は、脳および脊髄の神経細胞を囲むミエリン鞘のゆっくりとした破壊を伴う、進行性かつ障害性の脱髄疾患である。症状は、しびれ感、視覚障害、および認知変化から麻痺に及ぶ。この疾患は免疫学的および遺伝学的要素を有すると考えられており、２０歳から４０歳の間で臨床型に現れる場合が多い。米国だけでも約３００，０００人がこの疾患に冒されている。治療法は、現在のところβインターフェロンまたは副腎皮質ステロイドの過程を伴う。これらの薬剤により発病の間の症状を伴う期間が短縮され得るが、一般に長期の障害は妨げられない。
【０００５】
脊髄の外傷により外傷部位の近傍で無傷の軸索の脱髄が起こり、それによって軸索の神経伝達能力が奪われる。米国では、毎年約１１，０００件の脊髄損傷の新たな症例がある。ＳＣＩ情報ネットワークでは、任意のレベルでの不完全な運動機能に苦しむ患者にかかる生涯直接費は、減給分および生活の質への影響を含めずに、＄４００，０００〜＄２，２００，０００に及ぶと推定している。
【０００６】
中枢神経系の細胞上のミエリンは、軸索をその近傍で覆いミエリン鞘を形成するオリゴデンドロサイトによって正しい位置に整えられている。疾患状態におけるオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞の役割は、ＫｅｉｒｓｔｅａｄおよびＢｌａｋｅｍｏｒｅ（Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４６８：１８３、１９９９）によって概説されている。Ｏ−２Ａ細胞として知られているオリゴデンドロサイト前駆細胞は、健常成人のＣＮＳおよび多発性硬化症の病変に存在し、再ミエリン化に関与する（Ｓｃｏｌｄｉｎｇら、Ｂｒａｉｎ １２１：２２２１、１９９８；およびＳｃｏｌｄｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８９：１、１９９９）。オリゴデンドロサイトが均整をとって増殖し、損傷が大きい箇所では蓄積された前駆細胞を使い果たしてしまうため、適切な再ミエリン化ができないということが起こり得る。
【０００７】
神経機能を回復するための再生医療で用い得る細胞集団を作製することを目的として、かなりの研究が行われてきた（Ｐａｒｋら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １６：６７５、１９９９によって概説されている）。Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９：７５２９、１９９９）は、出生後のラット脳から、移植後にオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を生じるＣＮＳ前駆細胞を単離した。Ｓｖｅｎｄｓｅｎら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． ８５：１４１、１９９８）は、発達過程のヒト皮質から前駆細胞を単離した。Ｍｕｊｔａｂａら（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１４：１１３、１９９９）は、胚性幹細胞からの神経系前駆細胞の単離について報告している。
【０００８】
国際公開公報第９７／０７２００号（スタンフォード大学）は、成体ラット脳から単離したオリゴデンドロサイトの培養を示している。国際公開公報第０１／２８３４２号（ワシントン大学）は、あらかじめ馴化したオリゴデンドロサイト培地中で神経細胞を培養する特定の方法を提案している。米国特許第５，７５３，５０６号（Ｊｏｈｅ、ＣＮＳ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する能力を有する、神経組織から単離した幹細胞を維持する培養系に関する。米国特許第６，２３８，９２２号（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｃ．）は、神経組織の、ニューロンおよびグリアに分化する能力を有する細胞への解離を提案している。米国特許第６，２３５，５２７号（Ｒａｏら、ユタ大学）は、哺乳動物神経管組織から解離し、Ａ２Ｂ５細胞表面マーカーに基づいて選択した、哺乳動物ＣＮＳグリア限定前駆細胞の集団に関する。
【０００９】
米国特許第５，９６８，８２９号（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを産生する能力を有するＣＮＳ神経幹細胞を含む培養液を請求している。国際公開公報第９７／３２６０８号は、移植を介してＣＮＳに送達するための、遺伝子操作した初代オリゴデンドロサイトに関する。米国特許第５，８３０，６２１号（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、アクセッション番号ＣＲＬ １１８８１でＡＴＣＣに寄託したヒトオリゴデンドロサイト細胞株について記載している。この株は、特徴的なマーカーＧＦＡＰ、ＧａｌＣ、Ｏ４、およびＡ２Ｂ５を本質的に含まない。
【００１０】
残念なことに、神経組織から単離した前駆細胞がヒトの臨床治療に必要な細胞数を産生するのに十分な複製能力を有するのかどうかは、いまだ明らかではない。
【００１１】
別の供給源は、初期の胚組織から単離される多能性細胞である。胚性幹（ＥＳ）細胞は、２５年以上前に初めてマウス胚から単離された（Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：７６３４、１９８１）。ＥＳ細胞は、同じ種の実質的に任意の組織種の子孫を生じ得ると考えられている。
【００１２】
Ｆｒａｉｃｈａｒｄら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０８：３１８１、１９９５）は、マウスＥＳ細胞のグリア細胞および機能的なニューロンへのインビトロ分化について報告している。Ｍｕｊｔａｂａら（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１４：１１３、１９９９）は、マウスＥＳ細胞からの神経前駆細胞の単離について報告している。Ｌｉ、Ｓｍｉｔｈら（Ｃｕｒ． Ｂｉｏｌ． ８：９７１、 １９９８）は、細胞系譜選択によるマウスＥＳ細胞からのニューロン前駆細胞の産生について報告している。Ｂｒｕｓｔｌｅ、Ｍｃｋａｙら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１４８０９、１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：７５４、１９９９）は、有髄化移植片の潜在的な供給源として、マウスＥＳ細胞に由来するグリア前駆細胞について報告している。ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ． Ｍｅｄ ５：１４１０、１９９９；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：６１２６、２０００）は、培養においておよび脊髄移植後に、マウスＥＳ細胞がオリゴデンドロサイトを形成し、有髄化することを報告している。
【００１３】
ヒトＥＳ細胞は、ごく最近になって初めて単離された（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８）。ヒトＥＳ細胞は、未分化状態で維持するためまたは特定の分化経路に沿って導くために、非常に異なる条件を必要とする（米国特許第６，０９０，６２２号および第６，２００，８０６号；国際公開公報第９９／２０７４１号および国際公開公報第０１／５１６１６号）。このため、ヒトＥＳ細胞から分化細胞の比較的均一な集団をいかにして調製するかについては、ほとんどわかっていない。
【００１４】
国際公開公報第０１／８８１０４号（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることによって得られる神経系前駆細胞集団について記載している。９０％ ＮＣＡＭ陽性、３５％βチューブリン陽性、および７５％ Ａ２Ｂ５陽性を超える集団が得られた。Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９：１１２９、２００１）は、ヒトＥＳ細胞からの移植可能な神経系前駆細胞の分化について報告している。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９４７７（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、生じた集団内の少なくとも１０％のＭＡＰ−２陽性細胞がドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシン水酸化酵素を発現する、ＥＳ細胞由来の神経系細胞集団について記載している。
【００１５】
最近になって、Ｂｉｌｌｏｎら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１５：３６５７、２００２）は、遺伝子操作したマウスＥＳ細胞からのオリゴデンドロサイト発生のタイミングについて記載している。Ｋｕｏら（Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｃ １１／０２）は、２８％ ＧＦＡＰ陽性であるサルＥＳ由来細胞の集団について記載しており；Ｘｉａｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：４１、２００３）は、細胞系譜特異的転写因子Ｏｌｉｇ２を用いた、マウスＥＳ細胞からのオリゴデンドロサイトの作製について報告している。
【００１６】
ヒトの健康および疾患の管理におけるｐＰＳ細胞の全般的な可能性を理解するため、脱髄状態の治療に有用な細胞の濃縮された集団を作製する新しいパラダイムを開発することが必要である。
【発明の概要】
【００１７】
概要
本発明は、研究および薬学的組成物の調製に用いるための、グリア系譜の霊長動物細胞を効率的に産生する系を提供する。
【００１８】
本発明の分化細胞集団は単離されまたはインビトロで培養され、グリア細胞または神経組織を有髄化し得る細胞の特徴に関して高度に濃縮されている。この細胞は、オリゴデンドロサイトの形態的特徴、本開示で後に記載する特定の抗体で検出可能なもしくは増幅可能なマーカーの発現、またはさらなる分化においてオリゴデンドロサイトを形成する能力を有し得る。この細胞はまた、同時培養アッセイにおいて神経節を有髄化する能力、インビボにおいて脱髄した軸索に対してミエリンを回復する能力、またはヒトもしくは非ヒト動物において神経機能を改善する能力等の、オリゴデンドロサイトの特定の機能的特徴を有し得る。これらの特徴の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上が任意の組み合わせで存在し得る。
【００１９】
この細胞集団は、あまり分化していない様々な種類の幹細胞から調製することができる。起源となり得る細胞には、胚盤胞由来の霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞（胚性幹細胞に例証される）または初期胚の胚組織が含まれる。したがって、細胞はその起源の元となった組織の子孫であるという特徴を有することになり、このことは起源細胞と分化細胞が同じゲノムを有することを示すことによって確認され得る。
【００２０】
本発明の他の態様は、すでに記載した分化細胞を作製または維持する方法に関する。この方法は、本開示において後に説明するような１つまたは複数の成長因子または分化因子の存在下で、多分化能幹細胞または多分化能性幹細胞を培養する段階を含む。
【００２１】
例証として、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）等のマイトジェンと共にまたはそれなしで、トリヨードチロニン（Ｔ３）、セレン、またはレチノイン酸等の１つまたは複数の分化因子を含む培地中で幹細胞を培養することができる。分化細胞の最初の形成は、オリゴデンドロサイト系譜細胞が比較的均一な球体を形成し得る懸濁培養において起こり得る。他の細胞型は、所望の細胞型に選択的に付着する表面上に培養物をプレーティングする等の適切な分離手段によって、除去することができる。任意で、多くは細胞の最初の誘導に用いたような１つまたは複数の分化因子の存在下で、ＦＧＦまたは上皮成長因子等のマイトジェンと共に培養することによる、選択の前または後に分化細胞をさらに増殖させることができる。次に、任意でマイトジェンの非存在下で、または後期分化を亢進するポリ−Ｌ−リジン等の表面の存在下で培養することにより、細胞をさらに成熟させることができる。
【００２２】
本発明の細胞は、多くの商業上重要な用途に用いることができる。例えば、この細胞は、その存在が細胞の維持、毒性、さらなる分化、またはグリア細胞として機能する能力に関連する化合物を、グリア細胞に及ぼす影響についてスクリーニングするのに適している。この細胞はまた、インビトロおよびインビボにおいて隣接する神経組織の髄鞘形成をもたらすのにも適している。
【００２３】
ヒトまたは動物治療用の薬学的組成物の調製において、本発明の細胞を用いることも可能である。次にこの組成物を用いて、軸索の髄鞘形成障害に関連するような病態または脊髄損傷を治療することができる。
本発明のさらなる局面は、以下の記載により明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】塩基性ＦＧＦおよびオリゴデンドロサイト分化因子を含む培地中、懸濁状態で２日間培養したヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を示す、倒立顕微鏡を用いて撮影した位相差像である。
【図２】レチノイン酸と共に７日間培養した後の細胞を示す。培養物中の８０〜９０％を示す、細胞の大きな透明な球体が存在した。
【図３】レチノイン酸を除去し、細胞を低濃度のＦＧＦの存在下で維持した後に何が起こるかを示す。
【図４】ｂＦＧＦを除去した後に現れる変化を示す。大きな凝集塊が解離し、培養液全体が単一細胞および小さな細胞塊でいっぱいになった。同時に、新たに鮮黄色の球体が観察された（矢印）。
【図５】細胞をＦＧＦの非存在下で上皮成長因子と共に培養した場合に成長する鮮黄色の球体（矢印）を示す。
【図６】マトリゲル（登録商標）上にプレーティングしてから２日または３日後の、球体からのグリアに拘束された神経前駆細胞の遊走および分枝を示す。
【図７】１０〜２０時間だけ細胞をマトリゲル（登録商標）に接着させることにより、オリゴデンドロサイト系譜細胞が選択されたという結果を示す。非接着細胞を除去したが、これによりオリゴデンドロサイトマーカーをもたない細胞は実質的にすべて除去される。次に接着細胞を再懸濁して、ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびグリア前駆細胞培地の存在下で７日間拡大した。これは、治療的投与および他の目的に対してより適したより分散した細胞集団を産生する利点を有する。この顕微鏡写真は、ヘマトキシンを用いて細胞核を対比染色した（黒矢印）、ガラクトセレブロシドに対する染色（ＧａｌＣ；白矢印）を示す。この条件下でＧａｌＣに染色された細胞の割合は、少なくとも約９５％であった。
【図８】より高い倍率のＥＳ由来オリゴデンドロサイトを示す。細胞は、成熟オリゴデンドロサイトに特有の形態的特徴（間にミエリン皮膜を有するように見える多数の複雑な突起）を有する。
【図９】分化過程における細胞形態の進行を示す。（Ａ）： 未分化ｈＥＳ細胞。（Ｂ）： レチノイン酸を含む懸濁培養において胚様体から成長する透明な球体。（Ｃ）： ＥＧＦの存在下における、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む黄色球体の拡大。 （Ｄ）： マトリゲル（登録商標）上にプレーティングすることによりポジティブ選択されたオリゴデンドロサイト系譜細胞。（Ｅ、Ｆ）： 培養におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞の隆起の増加。（Ｇ、Ｈ）： 次に続くプレーティングによって、成熟オリゴデンドロサイトへのさらなる分化が起こる。
【図１０】成熟オリゴデンドロサイトの免疫細胞化学的解析を示す。プレーティングしてから１週間後、細胞は初期グリア細胞のマーカーＮＧ２に関して陽性である（Ａ）。プレーティングしてから８週間後、細胞は、ＧａｌＣ（Ｃ）、Ｏ４（Ｄ）、およびＲＩＰ（Ｅ）に関して陽性である。パネルＢは、示したマーカーで染色された細胞の数を示す。
【図１１】ヒト核タンパク質に特異的な抗体で染色した、ラットの脊髄に投与したオリゴデンドロサイト前駆細胞の組織切片を示す
【図１２】移植してから９週間後、細胞が白質に向けて遊走または増殖したことを示す。
【図１３】移植したオリゴデンドロサイトが、脊髄の断面積として測定される、挫傷後の二次拡大に起因する損傷を悪化させないことを示す。
【図１４】ｈＥＳ細胞が軸索分枝を誘導することを示す。オリゴデンドロサイトを移植した動物の像では（上のパネル）、ＢＤＡ染色の濃い細い線として新たな軸索が示される。未処置の動物では、分枝は認められなかった。移植した細胞は、再生可塑性を誘導する
【図１５】損傷部位（中心点）からのニューロン分枝の定量を示す（ブロック当たり３切片の平均値±ＳＥＭ）。処置した動物は、有意に高いレベルで、中心点の損傷のすぐ頭側にまで標識軸索を有した。
【図１６】ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物における、実質的な再ミエリン化の証拠を示す。上段の電子顕微鏡写真における厚い環は、正常にミエリン化した繊維である。視野内の残りの軸索は、薄い層のミエリンを示す。右上のパネルの軸索は、約５層または６層の外被、および進行中の再ミエリン化の証拠を示す。移植した動物のみが、オリゴデンドロサイト活性に起因する新たなミエリンを示した。これにより、移植動物における動作の改善を説明する手段が提供される。
【図１７】未分化ｈＥＳ細胞コロニーで検出されたマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列は、多能性細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に標識されたコロニーを示す。下列は、中胚葉マーカーＢＭＰ４に標識されたコロニーを囲む間質細胞を示す。
【図１８】分化過程における転写因子Ｐａｘ６の一過性の出現を示す。上列は、１０日目の細胞塊の中心に向かった染色、周辺に向かってより分化した細胞でのすでにダウンレギュレートされた染色を示す。下列は、分化３５日目では実質的に染色されないことを示す。
【図１９】分化１０日目に存在する初期のオリゴデンドロサイト系譜細胞で検出されるマーカーを示す。上列：転写因子Ｏｌｉｇ１。中列：転写因子ＳＯＸ１０。下列：オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーＡ２Ｂ５。
【図２０Ａ】３５日目の移植に適したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。実質的にすべての細胞がオリゴデンドログリアマーカーを有したが、神経細胞、間葉細胞、または未分化ｈＥＳ細胞のマーカーは有さない（２０Ｂ、下のグラフ）。
【図２０Ｂ】３５日目の移植に適したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。実質的にすべての細胞がオリゴデンドログリアマーカーを有したが、神経細胞、間葉細胞、または未分化ｈＥＳ細胞のマーカーは有さない（２０Ｂ、下のグラフ）。
【図２１】ミエリン塩基性タンパク質を作り出す能力が遺伝的に欠損しているシバラーマウスにオリゴデンドロサイトを投与した結果を示す。超微細構造的に、シバラーマウスの軸索はミエリンを欠いているか、または１もしくは２層の緻密でないミエリンによって囲まれている（上のパネル）。細胞を移植してから６週間後、電子顕微鏡解析により多層の緻密なミエリンが示され、このことから移植集団のミエリン形成能が示唆された（下のパネル）。緻密なミエリンは、投与したオリゴデンドロサイトによって直接産生されている。
【図２２】衝撃装置を用いてラットの脊髄を挫傷させ、ＢＢＢ尺度での定量によりその後の期間の脊髄機能について評価する実験の結果を示す。上のグラフ：２００キロダイン挫傷；下のグラフ：２５０キロダイン挫傷。 （■）損傷から１週間後にＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物（ｎ＝５）；（▲）同じ挫傷を被るが細胞を投与していない対照動物（ｎ＝３）。盲検で評価した平均値±ＳＥＭ。ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物は、治療後５週間を超えて持続する有意に優れた地上歩行を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞を効率的に産生することにより、それらの細胞の大きな集団を作製する問題を解決する。
【００２６】
分化細胞集団は著しく均一である。図７は、オリゴデンドロサイトに特有である形態学的特徴を有するヒト細胞の例示的な調製を示す。集団を、オリゴデンドロサイト系譜の細胞のマーカーであるＧａｌＣについて染色した。図８はより高い倍率の視野であり、近傍の任意のニューロンを有髄化しようとしているミエリンのシートの生成を示している。これらの細胞の機能的特徴から、これらの細胞はオリゴデンドロサイトの性質のさらなる特徴付けおよびヒトの治療での使用によく適している。
【００２７】
本発明の細胞の理想的な供給源は、様々な種類の霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞である。以下に記載する戦略に従っていくつもの適切な培養条件および補因子の中から選択することにより、ｐＰＳ細胞をオリゴデンドロサイト経路に導出することができる。未分化ｐＰＳ細胞のオリゴデンドロサイトへの変換は、最適条件下で２５％程度の効率で起こり得ることが明らかになった。
【００２８】
本発明の組成物および方法により、これまでに利用可能であった技術を超える重要な利点が提供される。所望のアロタイプのｐＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを分化させることにより、任意の組織適合性を有するオリゴデンドロサイトを産生することができる。必要に応じて、移植を亢進する任意の方法で、分化の前または後に細胞を遺伝子改変することができる。細胞は天然細胞株に由来するが継続的な組織解剖を必要としないため、規制認可の品質管理要求事項を満たすのに最適である。
【００２９】
重要なことには、各出発幹細胞集団から産生され得る細胞の供給量はほぼ無限である。実施例１に説明するように、ひとたびオリゴデンドロサイト系譜細胞を産生かつ選択すれば、成長因子の存在下で培養することによりその細胞を大幅に拡大することができる。さらに、起源ｐＰＳ細胞をほぼ無期限に増殖させて、それによってより分化した細胞の供給源を連続的に提供することができる。
【００３０】
以下の開示により、本発明の分化細胞をいかにして作製および使用するかのさらなる説明を提供する。集団は著しく均一であり、したがって多くの商業的に重要な用途における使用に適している。
【００３１】
本発明の１つの局面により、少なくとも約８０％の細胞が、霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞の子孫であり；ＮＧ２プロテオグリカン（または他のオリゴデンドロサイトマーカー）に特異的な抗体で染色され；かつＮｅｕＮ（または神経細胞および他の潜在的混入物の他のマーカー）に関して陰性である、分化細胞集団を提供する。分化細胞集団は、オリゴデンドロサイト系譜細胞を産生するのに適した成分のシステムの一部であってよい。このシステムは、分化細胞が産生される元ととなったｐＰＳ細胞（ヒト胚性幹細胞等）の系統をさらに含み得る。任意で、分化細胞集団の少なくとも８０％の細胞が、Ａ２Ｂ５またはＰＤＧＦＲαも発現する。細胞の少なくとも２０％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞に特有である双極性形態を示す可能性がある。
【００３２】
ある状況下では、シバラー変異（ｓｈｉｖｅｒｅｒ ｍｕｔａｎｔ）マウスの脊髄に分化細胞集団を移植した後、その集団により神経軸索の周りに緻密なミエリンの沈着が起こる；または挫傷ラットの脊髄内もしくは脊髄の周りに集団を移植した後、地上歩行が改善される。あるいは、本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞集団を（例えば、マイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上で３日間培養することにより）インビトロでさらに分化させてもよい。これにより、少なくとも１０％の細胞が成熟オリゴデンドロサイトに特有である複雑な突起を有し；かつ約８０％、９０％、９５％、またはそれ以上がＧａｌＣ等の成熟オリゴデンドロサイトマーカーを有する、より成熟した集団が産生され得る。増殖段階中に産生されたオリゴデンドロサイト系譜細胞は、前駆細胞段階で発現しているマーカーばかりでなく、成熟細胞の濃縮された集団を産生する能力またはインビボで所望の機能を遂行する能力によっても特徴付けることができる。
【００３３】
以下に説明するように、本発明のいくつかの分化細胞集団は、マイトジェンおよび少なくとも２つのオリゴデンドロサイト分化因子を含む培地中で未分化ｐＰＳ細胞を培養する過程により得ることができる。例えば、細胞凝集体を形成させるために、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、レチノイン酸、およびおそらくセレンの存在下で、未分化ｐＰＳ細胞を懸濁状態で培養してもよい。
【００３４】
本発明のさらなる説明および例証を以下の項で提供する。
【００３５】
定義
オリゴデンドロサイトとは、中枢神経系の外膜構造（神経膠）の一部を形成する外胚葉起源の神経系細胞である。この細胞は、個々の軸索の周りを覆いＣＮＳのミエリン鞘を形成する、不定数のベール様またはシート様突起を有する。この細胞は、本開示で後に説明する形態学的基準、表現型基準、または機能的基準によって同定することができる。
【００３６】
「神経系前駆細胞」または「神経上皮幹細胞」とは、神経細胞（ニューロン前駆細胞もしくは成熟ニューロン等）またはグリア細胞のいずれかである子孫を産生し得る細胞である。「グリア細胞」という用語は、成熟オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびこれらの細胞のいずれかまたは両方に拘束された前駆細胞を包含する。
【００３７】
「オリゴデンドロサイト前駆細胞」は、ニューロンまたは非神経組織に優先して、成熟オリゴデンドロサイトおよび／またはさらなる前駆細胞を含む子孫を形成するように拘束された神経系細胞である。特記しない限りこの細胞は、必ずしも必要ではないが、アストロサイト等の他の種類のグリア細胞を産生する能力を有してもよい。特記しない限り、本開示での「オリゴデンドロサイト」または「オリゴデンドロサイト系譜細胞」への言及は、オリゴデンドロサイト前駆細胞および成熟細胞の両方を指す。
【００３８】
細胞の個体発生との関連では、形容詞「分化した」とは相対語である。「分化細胞」とは、比較する細胞よりも発生経路をさらに下方に進行した細胞のことである。したがって、多能性胚性幹細胞は、上記の様々な種類の前駆細胞等の系譜を限定した前駆細胞に分化することが可能である。これらの細胞は、次に経路のさらに下流にある細胞、または成熟オリゴデンドロサイト等の最終段階の分化細胞にさらに分化することが可能である。
【００３９】
本開示で用いる「分化剤」とは、オリゴデンドロサイト系譜の分化細胞（前駆細胞および最終分化細胞を含む）を産生するために、本発明の培養系で用いる一群の化合物の１つを指す。化合物の作用形態に関しては限定しない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導もしくは補助することにより、特定の表現型を有する細胞の成長を促進することによりもしくは他の細胞の成長を遅らせることにより、または他の薬剤と合わせて未知の機構で作用することにより、分化過程を補助する可能性がある。
【００４０】
特記しない限り、本開示における「セレン」への言及は、溶液中で任意の対イオンを伴う亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）、セレン酸（ＳｅＯ４２−）、またはセレン化物（Ｓｅ２−）を含む、Ｓｅの任意の酸化型を指す。
【００４１】
原型の「霊長動物多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）とは、前胚組織、胚組織、または受精後の任意の時期の胎児組織に由来する多能性細胞であり、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスで奇形腫を形成する能力等の標準技術として公認の試験によると、適切な条件下で３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物である様々な異なった細胞型の子孫を産生し得る特徴を有する。ｐＰＳ細胞の定義には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞に例証される様々な種類の胚細胞が含まれる。ｐＰＳ細胞は、悪性供給源に由来しないことが好ましい。細胞は正倍数体であることが望ましい（が必ずしも必要ではない）。その供給源および培養法に依存して、ｐＰＳ細胞は、人体のすべての異なる細胞型に発達する能力を有するという意味で、全能性であってもなくてもよい。
【００４２】
ｐＰＳ細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその派生物の実質的な割合が、胚起源または成体起源の分化細胞と区別できる未分化細胞の形態学的特徴を示す場合に、「未分化である」と記載される。集団内の未分化細胞のコロニーは、分化した隣接細胞に囲まれていることが多いと理解されている。
【００４３】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、別の種類の細胞と共培養され、第２の種類の細胞が成長できる環境を提供する１つの種類の細胞を表すのに用いられる用語である。ｐＰＳ細胞集団は、分割後にｐＰＳの成長を支持するために新鮮なフィーダー細胞を添加せずに少なくとも１回成長した場合、フィーダー細胞を「本質的に含まない」と称される。
【００４４】
「胚様体」という用語は、ｐＰＳ細胞が単層培養において過剰成長する場合、または懸濁培養で維持される場合に現れる、分化および未分化細胞の凝集体を指す。胚様体は、形態学的基準および免疫細胞化学法により検出可能な細胞マーカーによって識別可能ないくつかの胚葉に典型的に由来する、様々な細胞型の混合物である。
【００４５】
「成長環境」とは、関心対象の細胞がインビトロにおいて増殖、分化、または成熟する環境のことである。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在し得る任意の成長因子または分化誘導因子、および存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基層）が含まれる。
【００４６】
特記しない限り、個々の細胞および細胞集団における表現型マーカーの判定では、細胞は、アイソタイプ対照と比較して、二次免疫細胞化学染色において特異的抗体を用いて実質的により高い染色を示した場合にマーカーに関して「陽性」であると称される。特記しない限り細胞は、この種の免疫細胞化学的解析によりマーカーが抗体で検出不可能である場合に、「陰性」であると称される。
【００４７】
任意の適切な人工的操作手段によりポリヌクレオチドが細胞に導入された場合、または細胞がそのポリヌクレオチドを受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合、その細胞は「遺伝子改変された」、「トランスフェクションされた」、または「 遺伝的に形質転換された」と称される。ポリヌクレオチドは関心対象のタンパク質をコードする転写可能な配列を含む場合が多く、これにより細胞はこのタンパク質を高いレベルで発現することが可能になる。改変した細胞の子孫が同じ改変を有する場合、遺伝的改変は「遺伝性である」と称される。
【００４８】
一般的技術
分子遺伝学および遺伝子工学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ） の現行版に記載されている。分子生物学、タンパク質化学、および抗体技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に見出すことができる。本開示で引用する遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．等の市販業者から入手可能である。
【００４９】
細胞培養法は、一般に、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ． ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＩ．Ｆ． Ｒａｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）、およびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ． Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）の現行版に記載されている。組織培養用の供給品および試薬は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、およびＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ等の市販業者から入手可能である。
【００５０】
本開示に関連する専門的な参考文献には、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第４版、Ｋａｎｄｅｌら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ２０００；ＣＮＳ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ、Ｍ．Ｈ． ＴｕｓｚｙｎｓｋｉおよびＪ．Ｈ． Ｋｏｒｄｏｗｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｎ： Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｉ．Ｂ． ＬｅｖｉｔａｎおよびＬ．Ｋ． Ｋａｃｚｍａｒｅｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ、Ｐ．Ｒ． Ｌａｍｉｎｇら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ、１９９８；Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＭａｔｓａｓおよびＴｓａｃｏｐｏｕｌｏｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ． Ｃｏｒｐ、１９９９；Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＪｗｅｓｓｅｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ ２００１；およびＭａｎ ｏｆ Ｓｔｅｅｌ、Ａｄｒｉａｎ Ｈａｖｉｌｌ、１９９６が含まれる。
【００５１】
幹細胞の供給源
本発明は、様々な種類の幹細胞を用いて実施することができる。本発明の使用に特に適しているのは、胚盤胞等の妊娠後に形成される組織または妊娠期間の任意の時期に採取した胎児組織もしくは胚組織等に由来する霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞である。限定されない例は、以下に記載するような胚性幹細胞もしくは胚性生殖細胞の初代培養または樹立株である。本発明の技法を初代胚組織または胎児組織に直接実行し、最初に未分化細胞株を樹立することなく初代胚性細胞から神経系細胞を直接導出することも可能である。
【００５２】
実施例の項に提供する例証は、ヒト胚性幹細胞を用いて行った研究の結果である。しかし、特記しない限り、本発明は任意の脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することが可能である。これには、ヒト、ならびに非ヒト霊長動物および他の非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞が含まれる。
【００５３】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長動物組織から単離することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第６，２００，８０６号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ページ以降、１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：３９９、２０００の記載する技法により、ヒト割球から調製することが可能である。ｈＥＳ細胞に相当する細胞型には、国際公開公報第０１／５１６１０号（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説されるような、原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞等のその多能性派生物が含まれる。
【００５４】
１つの方法では、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から透明帯を除去する。１：５０希釈したウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に胚盤胞を３０分間曝露し、次にＤＭＥＭで５分間３回洗浄し、１：５希釈したモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する免疫手術により、内部細胞塊を単離する（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：５０９９、１９７５）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、穏やかにピペッティングして無傷の内部細胞塊（ＩＣＭ）から溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【００５５】
９〜１５日後、１ ｍＭ ＥＤＴＡを添加したカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に曝露することにより、ディスパーゼもしくはトリプシンに曝露することにより、またはマイクロピペットで機械的に解離することにより、内部細胞塊に由来する増殖物を凝集塊に解離し；次に新鮮な培地中でｍＥＦ上に再度プレーティングする。未分化の形態を有して増殖するコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に凝集塊に解離し、再度プレーティングする。ＥＳ様の形態は、細胞質に対して核の比率が明らかに高くかつ顕著な核小体を有する小型のコロニーとして特徴付けられる。次に、得られたＥＳ細胞を短時間トリプシン処理してダルベッコＰＢＳ（２ ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に曝露し、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００ Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）に曝露することにより、またはマイクロピペットで個別にコロニーを選択することにより、１〜２週間ごとに日常的に分割する。凝集塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【００５６】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されているように、始原生殖細胞から調製することができる。
【００５７】
簡潔に説明すると、約８〜１１週間後に採取した生殖隆起を等張緩衝液ですすぎ、０．０５％トリプシン／０．５３ ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム溶液（ＢＲＬ）０．１ ｍＬ中に入れ、＜１ ｍｍ３の塊に切断する。脱凝集した後、細胞をＥＧ増殖培地（Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３；１５％ ＥＳ認定ウシ胎仔血清；２ ｍＭグルタミン；１ ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０００〜２０００ Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子；１〜２ ｎｇ／ｍＬ ヒト組換えｂＦＧＦ；および１０μＭフォルスコリン（１０％ ＤＭＳＯ中）を含むＤＭＥＭ）約３．５ ｍＬ中、３７℃で１時間または一晩インキュベートする。
【００５８】
次に細胞をＥＧ増殖培地１〜３ ｍＬに再懸濁し、フィーダー層上にプレーティングする（例えば、５０００ｒａｄのγ−照射で不活性化したＳＴＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５０３）。７〜１０日後に１回目の継代を行い、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、毎日培地を交換して培養するが、典型的にこれは７〜３０日後または１〜４継代後である。
【００５９】
他の幹細胞
オリゴデンドロサイトを作製するための出発材料として有用なｐＰＳまたは胚性幹細胞を産生するために、本発明の実施はヒト胚または胚盤胞を脱凝集することを決して必要としない。ｈＥＳ細胞は、公共の受託所（例えば、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国、ウィスコンシン州、マディソン、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、バージニア州、マナッサス）から入手可能な樹立株から得ることができる。米国特許公報第２００３−０１１３９１０Ａ１号は、胚または胎児組織を用いずに導出された多能性幹細胞について報告している。多能性表現型を誘導する因子を使用することにより、臍帯血または他の前駆細胞をｐＰＳ細胞に再プログラミングすることも可能であると考えられる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ １１３：６４３、２００３；Ｍｉｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ １１３：６３１、２００３）。適切な条件下において、別の方法でｐＰＳまたはｈＥＳ細胞の定義に見合う任意の細胞を、本発明によりオリゴデンドロサイト系譜細胞の導出に用いることができる。
【００６０】
本開示で提供する技法のいくつかを用いて、外胚葉細胞、および胎児組織もしくは成体組織から得られた神経系細胞、または神系前駆細胞等のより拘束された細胞型の分化を維持または促進することも可能である。そのような細胞を得る方法は、例えば、米国特許第５，８５２，８３２号；第５，６５４，１８３号；第５，８４９，５５３号；および第５，９６８，８２９号；ならびに国際公開公報第９８／５０５２６号および国際公開公報第９９／０１１５９号に記載されている。
【００６１】
未分化状態でのｐＰＳ細胞の増殖
ｐＰＳ細胞は、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を用いて培養し、連続して増殖させることが可能である。血清を含む例示的なＥＳ培地は、８０％ ＤＭＥＭ（ノックアウトＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ等）、２０％の既知組成ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替品（国際公開公報第９８／３０６７９号）のいずれか、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１ ｍＭβ−メルカプトエタノールから作製する。使用する直前に、ヒトｂＦＧＦを４ ｎｇ／ｍＬになるように添加する（国際公開公報第９９／２０７４１号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）
【００６２】
分化を阻害する環境において培養することによってのみ、ｐＰＳ細胞を未分化状態で拡大することができる。慣例的に、ｐＰＳ細胞は、マウスの胚組織または胎児組織に由来するフィーダー細胞層上で培養する。増殖を阻害するがｐＰＳ細胞を支持する因子の合成はできるように照射した照射ｍＥＦを、培養プレートにウェル当たり３７５，０００個プレーティングし、プレーティングしてから５時間〜４日後に使用する（米国特許第６，２００，８０６号）。最近になって、ヒト胚性幹細胞の増殖を分化させることなく支持するヒトフィーダー細胞が開発された（国際公開公報第０１／５１６１６号：米国特許出願第０９／８８８，３０９号；Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。ｈＥＳ細胞を分化させ、所望の活性を有する細胞を選択し、次にテロメラーゼ逆転写酵素を発現するようにトランスフェクションして不死化することにより、細胞が得られる。
【００６３】
ｐＰＳ細胞は、フィーダー細胞なしでも未分化状態で維持することができる。無フィーダー培養の環境には、適切な培養基層、特にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）またはラミニン等の細胞外マトリックスが含まれる。ｐＰＳ細胞は、＞１５，０００細胞ｃｍ−２（最適には９０，０００ ｃｍ−２〜１７０，０００ ｃｍ−２）でプレーティングする。無フィーダー培養物は、分化させることなく細胞の増殖を支持する因子を含む栄養培地により支持される。そのような因子は、照射した（約４，０００ｒａｄ）初代マウス胚線維芽細胞、テロメル化（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）したマウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞由来のヒトフィーダー細胞等のそのような因子を分泌する細胞と共に培地を培養することにより、培地中に導入され得る。フィーダーを、２０％ 血清代替品および４〜８ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＫＯ ＤＭＥＭ等の無血清培地で約５〜６ ｘ １０４ ｃｍ−２の密度でプレーティングすることにより、培地を馴化することができる。１〜２日間馴化した培地にさらにｂＦＧＦを添加し、これを用いてｐＰＳ細胞培養物を１〜２日間支持する。無フィーダー培養法の特徴は、国際公開公報第９９／２０７４１号および国際公開公報第０１／５１６１６号；ならびにＸｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：９７１、２００１においてさらに考察されている。
【００６４】
ＥＳ細胞は顕微鏡下で、高い核／細胞質比、顕著な核小体、および細胞の接合部が識別困難な小型のコロニー形成を伴って見える。霊長動物ＥＳ細胞は典型的に、時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３および４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称する抗体を用いて検出できるマーカー（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８）、ならびにテロメラーゼ活性を発現する。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化により、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現が消失し、未分化ｈＥＧ細胞においても認められるＳＳＥＡ−１の発現が増加する。
【００６５】
幹細胞からのオリゴデンドロサイトの作製
本発明のオリゴデンドロサイト系譜細胞は、所望の表現型を有する細胞を濃縮および拡大する特殊な成長環境において幹細胞を培養することによって得られる。成長環境によって、オリゴデンドロサイト系譜への分化が特異的に方向づけられ得る、所望の細胞の成長が促進され得る、他の細胞型の成長が阻害され得る、またはこれらの活性の任意の組み合わせが起こり得る。
【００６６】
本項は、本発明のオリゴデンドロサイトを得るためにとり得るいくつかのアプローチを当業者に説明する指針である。別に規定する場合を除き、過程の根本的な機構に関する説明は、さらなる詳細を支援するための作業仮説としてのみ提供する。使用者が仮説を理解する必要はなく、また本発明を実施するためにこれを仮説に合わせる必要もない。多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトを作製することができ、手順のさらなる適合化を行うことができ、本開示に記載する新規産物を得るために別法を見出すことが可能であることを、本出願者らがこれから実証する。
【００６７】
ｐＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを産生する段階には、ａ） オリゴデンドロサイトを産生するように拘束された細胞の集団を得る段階；ｂ） オリゴデンドロサイト系譜細胞の拡大；およびｃ） 細胞の後期オリゴデンドロサイトへのさらなる成熟が含まれ得る。
【００６８】
幹細胞のオリゴデンドロサイト系譜への方向付け
オリゴデンドロサイトを産生する過程は、典型的に２つの局面、起源幹細胞集団に分化を引き起こす段階；およびオリゴデンドロサイト系譜細胞を主要細胞型にする段階を含む。これらの事象は、経時的にまたは同時に起こり得る。
【００６９】
例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過剰成長により、または胚様体の形成を可能にする低接着性特性を備えた基層を有する培養容器中でｐＰＳ細胞を懸濁状態で培養することにより、ｐＰＳ細胞に胚様体または凝集体の形成を引き起こすことによって分化の過程を誘導することができる。例示的な方法では、ｈＥＳ細胞のコンフルエントな単層培養物を回収し、非接着性細胞培養プレートにプレーティングし、細胞を懸濁状態に保ち、定期的に栄養培地でフィードする。
【００７０】
別法としてまたはさらに加えて、細胞が未分化表現型を維持するのを妨げる特定の因子と共に培養することによって、分化過程を開始することができる。最初の分化因子は分化をオリゴデンドロサイト系譜に限定する必要はないが、分化集団内の細胞型の範囲内にオリゴデンドロサイトまたはその前駆細胞を含めるべきである。この種の例示的な成長因子は、レチノイド受容体に結合する、または細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路を活性化するリガンドである。典型的に線維芽細胞成長因子（または次項に記載するマイトジェン）等のマイトジェンを培地に含めて、分化過程の進行中に増殖を促進する。
【００７１】
ある段階で、培養物をより特異的にオリゴデンドロサイト系譜に方向づけることができる。これは、オリゴデンドロサイトの成長をより特異的に促進する因子を培養物に含めることによって行うことができる。例示的なオリゴデンドロサイト分化因子は、約４０ ｎｇ／ｍｌのＴ３（３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン）およびＴ４（Ｌ−チロキシン）によって例証される、細胞表面上または核内の甲状腺ホルモン受容体に結合するリガンドおよび抗体である。甲状腺ホルモンは、レチノイン酸受容体の発現を増加させる、さもなければオリゴデンドロサイト系譜の細胞への分化を促進すると考えられている。
【００７２】
別のオリゴデンドロサイト分化因子は、分化しているオリゴデンドロサイトにおいてミエリン遺伝子の上方制御に関与すると考えられている抗酸化剤であるセレンである。他の候補分化因子は、ビタミンＥのような他の抗酸化剤、ならびにチオレドキシン還元酵素およびヨードチロニン脱ヨウ素酵素のファミリー等のセレンが補因子である酵素の活性を増加させる因子である。セレンは、亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）の形で少なくとも２０ ｎｇ／ｍＬまたは１００ ｎｇ／ｍＬの比較的高い濃度で培地に含めた場合に、特に効果的である。他の候補分化因子または補因子には、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれる。神経組織によって産生されるオリゴデンドロサイト分化因子の組み合わせも意図するが、これは、胚性ＣＤ−１マウス脳および組織または細胞株から得られる因子含有抽出物によって例証される、選択された解離した神経組織または細胞株と共培養することによって産生され得る。
【００７３】
これらの技法をすべて組み合わせることにより：マイトジェン、レチノイン酸等の一般的な分化因子、ならびに甲状腺ホルモンおよび亜セレン酸ナトリウムのような特異的分化因子の存在下で胚様体を形成させることによって分化を開始することにより、驚くほど効率的にオリゴデンドロサイトを産生できることを見出した。実施例の項に提供する限定されない例証には、これらの因子、ならびに栄養補充物、インスリン等の成長因子、および抗生物質等の他の標準的な培養成分が含まれる。分化の開始時に適切な組み合わせの分化因子を含めることによって、培養物はオリゴデンドロサイト系譜により拘束された細胞を迅速に産生することになる。
【００７４】
オリゴデンドロサイト系譜細胞の拡大
所望の目的のために細胞を用いる以前の任意の段階として、本発明の使用者は、オリゴデンドロサイト系譜細胞を培養において増殖させることによりこの細胞の数を増やしてもよい。
【００７５】
これは、１つまたは複数のマイトジェンの存在下で、細胞を栄養培地中で培養することによって達成できる。ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）およびＦＧＦ−４等の線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーが例示的である。上皮成長因子（ＥＧＦ）、機能的相同体、およびＥＧＦ受容体に結合する他の因子も例示的である。他の候補成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、およびフォルスコリン等のサイクリックＡＭＰレベルを上昇させる因子である。
【００７６】
そのようなマイトジェンの存在下では、レチノイン酸等の分化因子イニシエーターを取り除くことができる。マイトジェンによって細胞は非特異的に成長することから、オリゴデンドロサイト系譜細胞の優先的な成長を維持するために、培地中にオリゴデンドロサイト特異的分化因子を含め続けることが有利な場合が多い。培養液中のマイトジェンのバランスを調整することによって、オリゴデンドロサイトの優先的な成長を支持することも可能である。例えば、ＥＧＦは外胚葉を維持するが線維芽細胞を維持せず、線維芽細胞はＦＧＦが存在しなくなれば死滅し得る。ＦＧＦに厳密に依存する細胞が除去されたならば、培養液にＦＧＦを再度添加して所望の細胞型の成長を促進できる。
【００７７】
細胞の調製における別の任意の段階として、本発明の使用者は、培養物中に存在し得る他の細胞型からオリゴデンドロサイト系譜細胞を分離してもよい。抗体もしくはレクチンを介した接着または細胞表面マーカーについてのソーティング等の、様々な分離手順を意図する。ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方に関する適切な表現型マーカーを以下に記載する。ＵＤＰ−ガラクトース・セラミド・ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＧ２プロテオグリカン、ＮＣＡＭ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、または様々なミエリン関連タンパク質のプロモーター等の組織特異的プロモーターを、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子に連結して構築したプロモーター−レポータープラスミドを用いた、オリゴデンドロサイト系譜細胞のソーティングも意図する。
【００７８】
細胞を適切な基層に接着させることによる単純な様式で、オリゴデンドロサイト分化因子の存在下で増殖する他の細胞からオリゴデンドロサイト系譜細胞を分離することができることを見出した。オリゴデンドロサイトは細胞特異的糖質および細胞表面受容体を有し、複合リガンドに優先的に接着することになる。詳細には、ラミニン、ゼラチン、または室温でゲル化し再構成された基底膜を形成するエンゲルブレス・ホルム・スワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）腫瘍細胞に由来する市販の細胞外マトリックス調製品マトリゲル（登録商標）等の、ある種の基底膜成分への接着によって、オリゴデンドロサイトを分離することができる（実施例１）。オリゴデンドロサイトがマトリックスに接着したら（数時間〜数日）、他の細胞型を洗浄除去し、例えば短時間トリプシン消化することによって接着細胞を回収することができる。この手順は、所望の細胞型の濃縮に加えて、さらなる操作を容易にするために細胞の大きな凝集塊を解離する利点を有する。
【００７９】
分離手順の効果は、以下に記載するマーカーに関して濃縮を測定することによって判定することができる。このような方法でオリゴデンドロサイトを精製したならば、すでに記載したようにマイトジェンの存在下でこの細胞をさらに拡大する、以下の項に記載するように成熟させる、または最終用途に適した方法で調製することができる。
【００８０】
さらなる成熟
必要に応じて、本発明の細胞を、複製段階を超えて機能的表現型にさらに成熟させることができる。これを行うことで、前駆細胞の可能性を特徴付ける、または治療目的もしくは薬剤スクリーニング目的のために最終段階の細胞を得ることができる。
【００８１】
成熟は、前駆細胞表現型のさらなる増殖を阻害する様式で成長条件を変化させることによって達成される。例えば、成熟表現型の出現を促進するポリ−Ｌ−リジン等の基層上に細胞をプレーティングすることができる。別法としてまたはさらに加えて、細胞の拡大に用いた１つまたは複数の成長因子を除去する。繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）およびＣＮＴＦ受容体の他のアゴニスト等の成熟を亢進する因子を、成熟培地中に含めることができる。細胞が所望の成熟度に達したならば、培養液から細胞を回収し（例えば、トリプシンまたはコラーゲンを用いて）、解析または最終的な使用のために調製することができる。
【００８２】
分化細胞の特徴
多くの表現型基準に従って、細胞を特徴付けることができる。基準には、形態学的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出または定量、インビトロで測定可能な機能的基準、および宿主動物に注入した際の反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
表現型マーカー
オリゴデンドロサイトに特有の表現型マーカーを発現するかどうかに従って、本発明の分化細胞を特徴付けることができる。細胞集団の成熟度に従って存在し得るオリゴデンドロサイト細胞の古典的な免疫細胞化学的マーカーは、以下の通りである：
・ＮＧ２、マクロファージおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞によって発現されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン
・ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、拘束されたオリゴデンドロサイトのマーカー
・ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、成熟ミエリンおよびミエリン産生細胞のマーカー。
【００８４】
オリゴデンドロサイト系譜細胞によって発現される他の有用なマーカーには、以下が含まれる：
・ＰＤＧＦＲα、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、および他の細胞型によって発現されるＰＤＧＦの膜受容体
・ＴＲα１、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン、および他の細胞型によって発現される甲状腺ホルモンの核受容体
・ミエリンプロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトおよびグリア前駆細胞で発現されるミエリンの成分
・Ｏ４抗体によって規定されるエピトープ、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびそれらの前駆細胞のマーカー
・ビメンチン、アストロサイト前駆細胞を特徴付ける線維芽細胞型フィラメントタンパク質（オリゴデンドロサイトでは陰性である場合が多い）
・神経膠繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、アストロサイトのマーカー（オリゴデンドロサイトでは陰性）
・Ａ２Ｂ５、ＩＩ型アストロサイト、グリア前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、および膵臓β細胞で発現されるエピトープ
・オリゴデンドロサイトおよびその突起を染色し、脊髄および小脳両方の有髄化軸索と一致する、ＲＩＰ抗体によって認識されるエピトープ。
【００８５】
オリゴデンドロサイト分化の経路における様々な時点で発現される転写因子には、以下が含まれる：
・Ｏｌｉｇ１、オリゴ前駆細胞、運動ニューロン前駆細胞、および腎細胞によって発現されるヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）ファミリー転写因子
・Ｏｌｉｇ２、オリゴ前駆細胞、運動ニューロン前駆細胞、および松果体によって発現される別のＨＬＨファミリー転写因子
・Ｓｏｘ１０、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、神経堤、蝸牛、前立腺、およびメラノサイトによって発現されるＳｏｘファミリー転写因子
・Ｎｋｘ２．２、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン前駆細胞、膵臓α細胞および膵臓β細胞によって発現されるＨｏｘファミリー転写因子
・Ｐａｘ６、オリゴ前駆細胞、ニューロン前駆細胞、膵αおよびβ細胞、水晶体網膜、下垂体、肝臓、および脾臓によって発現されるＨＬＨファミリー転写因子。
【００８６】
他の細胞型の有用なマーカーには以下が含まれる：
・ニューロン核抗原（ＮｅｕＮ）、ニューロン成熟のマーカー（通常、オリゴデンドロサイト系譜細胞では陰性）
・クラスＩＩＩβチューブリン（ＴｕＪ１）、神経細胞の別のマーカー
・微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ＣＮＳ細胞のマーカー（おそらく陽性）
・ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、未分化ｐＰＳ細胞のマーカー（オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞では陰性）。
【００８７】
組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフロー免疫細胞化学法、または細胞内もしくは細胞表面マーカーについての免疫組織化学法（例えば、固定化細胞または組織切片）等の、任意の適切な免疫学的技法を用いて検出することができる。フローサイトメトリー解析の詳細な方法は、Ｇａｌｌａｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１７４０、２０００に記載されている。細胞表面抗原の発現は、標準的な免疫細胞化学法またはフローサイトメトリーアッセイ法において、選択的に細胞を固定化した後、および選択的に標識二次抗体または標識を増幅する他のコンジュゲートを用いて、有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合した場合に陽性と定義される。
【００８８】
組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット解析法、ドットブロットハイブリダイゼーション解析法により、または標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により、ｍＲＮＡレベルで検出することもできる。さらなる詳細については、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。特定マーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベースから入手可能である。例えば、ミエリンガラクトリピド生合成酵素ＵＤＰ−ガラクトース・セラミド・ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００６６５１）は、ＧａｌＣの合成の最終段階を触媒する酵素である。
【００８９】
研究または治療における使用を容易にするために、集団内のオリゴデンドロサイトまたはその前駆細胞の特徴を有する細胞の割合を最大にすることが有利である場合が多い。以下の実施例の項で説明するように、上記のようなオリゴデンドロサイトまたは成熟細胞に特有の表現型マーカーのいずれかの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上に関して陽性であると同定されるそのような細胞（または両方の混合物）が少なくとも約２０％から約６０％、８０％、９０％、９５％、さらに９８％を超えるまでのいずれかの細胞集団を得ることが可能である。
【００９０】
神経機能の再構成に関連する治療的応用では、細胞集団が他の細胞型 − 詳細には未分化ｐＰＳ細胞および非外胚葉系譜の細胞を形成する能力を最小限に抑えることが望ましい場合が多い。用途に応じて、ニューロン系譜およびその拘束前駆細胞、アストロサイト系譜およびその拘束前駆細胞、ならびにグリア細胞またはすべての種類の神経系細胞の共通の前駆細胞の割合を最小限に抑えることが有利である可能性もある。特定の態様では、本発明によるオリゴデンドロサイト集団は、これらの他の細胞型による混入を約１％、０．２％、または０．０５％未満しか有さない。
【００９１】
当業者は、オリゴデンドロサイト系譜細胞に特有の形態学的特徴をすでに理解していると考えられる。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、中心体から反対極に２つの突起を伸長した双極の形状をとる場合がある。この細胞はまた、同様のマーカーおよびオリゴデンドロサイトの他の特徴の多くを有する、比較的扁平な細胞の形態をとる場合もある。この細胞は、比較的遅い成長速度ならびに細胞外マトリックスおよび可溶性因子への依存によって、他の細胞（線維芽細胞のような）から識別することができる。双極細胞と扁平細胞は、扁平細胞の優位性を促進する成長因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等）の有無により、相互変換が可能である。本発明の前駆細胞集団は、少なくとも約２０％、４０％。６０％、８０％、またはそれ以上の双極細胞または扁平細胞表現型を含み得る。
【００９２】
より成熟したオリゴデンドロサイトへの分化に際して、突起の数および複雑度は典型的に増加する。突起はそれらの間にミエリン皮膜を有するようであり、個々の軸索の周りを覆って軸索に沿った神経伝達を促進するミエリン鞘を形成する。
【００９３】
遺伝子型特性
単離したｐＰＳ細胞またはｐＰＳ細胞の樹立株に由来する場合、本発明のオリゴデンドロサイトは起源細胞または細胞株の子孫であると特徴付けられ得る。したがって、オリゴデンドロサイトはその由来の元となった細胞と同じゲノムを有することになる。このことは、任意の核型変化のほかに、ｐＰＳ細胞とオリゴデンドロサイトとの間で染色体ＤＮＡが９０％を超えて同一であることを意味する。導入遺伝子を導入する、または内因性遺伝子をノックアウトするために組換え法により処理したオリゴデンドロサイトは、未操作の遺伝子要素はすべて保存されているため、依然として由来の元となった株と同じゲノムを有すると見なされる。
【００９４】
オリゴデンドロサイトおよびｐＰＳ細胞は、標準的な遺伝子フィンガープリント技法により同じゲノムを有することが同定され得る。オリゴデンドロサイトが、未分化株から正常な有糸分裂の過程を経て得られる場合にも、同じゲノムを所有することが示され得る。
【００９５】
特定の産業用途において、この特徴は本発明のオリゴデンドロサイトの貴重な特性である。詳細には、ｐＰＳ細胞に増殖を引き起こし、細分し、要求に応じてさらなるオリゴデンドロサイトに分化させることができるため、起源ｐＰＳ細胞が利用できることによって遺伝的に一致したオリゴデンドロサイトがさらにまた供給される。さらに、ｐＰＳ細胞を他の治療的に重要な系譜に分化させることもできる。例えば、ｐＰＳ細胞を免疫寛容細胞集団に分化させることが可能であり、この細胞集団は対象とするレシピエントを対応するオリゴデンドロサイトを用いた移植に対して寛容にするのに役立ち得る（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４３４３４、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）
【００９６】
本明細書に記載する技法により、分化の前または後に細胞を拡大することによって、同じゲノムを共有するオリゴデンドロサイト系譜細胞の大きな集団の産生が可能となる。理論的に、１０８、１０１０、または１０１２個の細胞の集団が可能である。そのような大きな集団は、通常、さらなる培養、薬剤スクリーニング、または治療投与に適した個々の容器に分割する。
【００９７】
本発明の特定の態様は、グリア細胞またはオリゴデンドロサイトの特徴を有する分化細胞と組み合わせた起源細胞（未分化ｐＰＳ細胞株または中間の集団等）を含む。２つの集団は同じ容器中に存在しても、同じ施設内の別の容器に存在しても、または２つの別の場所に存在してもよい。すでに記載したように未分化細胞の培養物にオリゴデンドロサイト系譜細胞への分化を全体として引き起こす場合のように、未分化細胞および分化細胞は同時に存在しても別の時点で存在してもよい。
【００９８】
機能特性
品質管理の目的で、本発明の分化細胞の特性を機能的基準によって特徴付けることが望ましい場合が多い。目的とする最終的な用途により、異なる機能が異なる相対的関心となり得る。例えば、組織培養において神経組織を再ミエリン化する能力、インビボで脱髄が誘導された部位を修復する能力、または損傷した対象において神経機能を回復する能力について、細胞を評価することができる。これらの特性を判定するための、以下の限定されない例証を含む多くの実験モデルが存在する。
【００９９】
１． 共培養におけるインビトロ髄鞘形成
２〜３ヶ月齢雌ラットから腰椎および頚椎後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを回収することにより、成体ＤＲＧ培養物を調製する。細胞を粉砕し、遠心分離し、ｍＬ当たり約１００，０００個の生存ニューロンでＤＭＥＭ Ｆ１２培地に再懸濁し、ラミニンコーティングした皿にプレーティングして４週間培養する。約２．５ ｘ １０４個のオリゴデンドロサイト系譜細胞を添加し、毎日フィードしながらさらに４週間培養することにより、インビトロ髄鞘形成を行う。ヒトオリゴデンドロサイトによるげっ歯類軸索の髄鞘形成は、ＴａｒｇｅｔおよびＢｌａｋｅｍｏｒｅ、Ｅｙｅ ８（ｐａｒｔ２）：２３８、１９９４に例証されている。
【０１００】
オリゴデンドロサイト系譜細胞がミエリンを形成する能力を判定するため、共培養物を４％パラフォルムアルデヒドで一晩固定し、ＧａｌＣについて染色する。神経節に隣接した視野を選択し、視野当たりのミエリン部分の数をスコアリングする。ネスチン、βチューブリンＩＩＩ、ＧＦＡＰ、ＣＮＰ、ＧａｌＣ、Ｋｉ−６７抗原、ＮｅｕＮ、または神経フィラメント７０等のマーカーについて低密度培養物を染色することによって、分化の潜在能力を判定する。
【０１０１】
培養におけるＤＲＧの髄鞘形成の証拠は、一般的にオリゴデンドロサイトの生物学的有効性と関連がある。細胞がインビボで生存し髄鞘形成または軸索の再成長を亢進する能力は、適切な動物モデルを用いてより一層得られる。これに反して、共培養における髄鞘形成は培養の条件に依存することになり、否定的な結果によってインビボにおける有効性は排除されない。インビトロ試験の予測値は、例えばＩＧＦまたはＮＴ−３のようなニューロトロフィン等の髄鞘形成を亢進すると考えられている因子を添加することにより、培養条件を調製することによって、改善することができる。
【０１０２】
２． 慢性脱髄モデル
成体ラット脊柱において、慢性脱髄の領域を誘導することができる（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：７５２９、１９９９）。鉛遮蔽を用いてＴ９を中心に、２ ｃｍを超える距離で脊髄を４０ ＧのＸ線照射に曝露するが、これにより曝露細胞のＤＮＡにニックが導入され、細胞分裂している細胞が死滅する。２日後に、Ｔ９においてエチジウムブロマイドを脊髄内に直接注入する。エチジウムブロマイドはこれに曝露した細胞を死滅させるインターカレート剤であり、これによって慢性脱髄の無細胞領域ならびに脊柱領域の約６０％を通して生存オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトがない状態が提供される。
【０１０３】
３日後、ラットの脱髄部位にオリゴデンドロサイト系譜細胞の移植を行う。任意で、４８時間前に培地にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加して細胞を予め標識することができる。第一に、細胞を前駆細胞約３０個の凝集塊として調製し、μＬ当たり約６０，０００個の細胞密度に濃縮することができる。外径約８０ ｕｍのガラスマイクロピペットを用いて、約１０分を上回る時間をかけて細胞１μＬを損傷部位に投与する。約２〜４週間後、組織試料を調製し、１ ｍｍの横軸ブロックになるように樹脂またはクリオスタット切片を作製する。
【０１０４】
冠状面の切片をトルイジンブルーで染色し、一般病理、再ミエリン化の証拠、および細胞形態について解析する。誘導した部位は無細胞であるため、移植後に存在する細胞は投与した細胞に由来する。クリオスタット切片を、ＧＦＡＰ（アストロサイト）、ＣＮＰ（オリゴデンドロサイト）、ＲＩＰ（オリゴデンドロサイト）、またはＮｅｕＮ（ニューロン）等の関連する細胞型のマーカーについて染色することができる。超薄切片を、ミエリン層板の数および細胞の超微細構造について電子顕微鏡により解析することもできる。脱髄部位にわたる移植細胞の再分布、および成熟有髄化細胞への分化を判定することができる。約２５％、５０％、または７５％のレベルでの脱髄した軸索に占める再ミエリン化が、生物学的有効性の増加の証拠である。
【０１０５】
オリゴデンドロサイト系譜細胞の治療能力は、脱髄の先天性モデルにおいて試験することも可能である。ミエリン塩基性タンパク質における変異または欠陥を含む樹立モデルには、シバラー変異マウス（Ｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ ４２：１４９、１９８５）およびロングエバンス・シェーカー（Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ ｓｈａｋｅｒ）ラット（Ｋｗｉｅｃｉｅｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２７：５８１、１９８９；Ｄｅｌａｎｅｙら、Ｌａｂ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ４５：５４７、１９９５）が含まれる。脳室内または大槽移植により（Ｍｉｔｏｍｅら、Ｂｒａｉｎ １３４：２１４７、２００１）、または脊髄への直接投与により（Ｌｉｕ、ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：６１２６、２０００）、再構築を試験することができる。ＭＢＰにおける変異または欠陥を伴うモデルは通常は適切な髄鞘形成の能力がなく、結果として神経欠損を被るため、これらのモデルでの緻密なミエリンの形成は投与細胞に直接起因する。
【０１０６】
３． 脊髄損傷モデル
ＳＣＩモデルは、挫傷および背側片側切断を含む。挫傷では、適切な脊髄損傷装置を用いて、脊髄層を２３ミリ秒を上回る時間をかけて約０．９ ｍｍ除去する（中程度の損傷）。片側切断損傷では、定位的なマニピュレーターを用いて先のとがった手術用メスで脊髄の背側の半分を切断する。どちらの手順とも、その後適切な術後処置を行う。
【０１０７】
移植した細胞の遊走を促進しかつミエリン関連成長抑制物質を除去するため、任意で脊髄もまた脱髄する（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． １５１：３０３、１９９８）。脊柱管の中央かつ軸索損傷部位の後方に２ ｍｍの孔を作製する。露出した脊髄に、リン酸緩衝食塩水に溶解した３３％モルモット補体（Ｈａｒｌａｎ ＳｅｒａＬａｂ）で１：２に希釈したポリクローナル抗ＧａｌＣ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）約４μＬを注入する。
【０１０８】
損傷から約２４時間後に、ガラスマイクロピペットを通して動物にオリゴデンドロサイト系譜細胞を移植する。あるいは、１〜３ヶ月間治療を保留することにより、慢性損傷モデルを作製することができる。細胞を用いて処置した後、ビデオテープに機能的反応を記録し、臨床的改善の証拠を得るために定期的にモニターすることができる。例えば、ＢＢＢ尺度、関節運動に基づいた２１ポイント尺度、体重支持、四肢の協調、および他の特性を用いて、地上歩行を定量化することができる（実施例２）。
【０１０９】
組織学的精密検査をするため、ビオチン標識コレラ毒素βサブユニット（ＣＴＢ、坐骨神経の両側に０．１％を４μＬ注入）またはビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ、感覚運動皮質に１０％を１０μＬ注入）等のトレーサーを動物に予め注射することができる。約２週間後、脱髄モデルでのように組織切片を調製し、移植した細胞の位置および再ミエリン化の証拠について検討するが、再ミエリン化は形態学的基準によって正常な髄鞘形成または部分的脱髄と識別可能である。特徴的な神経突起の成長円錐の証拠を得るために、注射したトレーサーで標識した軸索についても切片を解析する。軸索再生の免疫化学的証拠は、ＲＴ９７抗原（神経フィラメントのマーカー）、セロトニン（５ＨＴ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）等のニューロンマーカーについて染色することによって評価することができる。
【０１１０】
オリゴデンドロサイトの遺伝子改変
本発明の特定のオリゴデンドロサイト前駆細胞集団は、実質的な増殖能を有する。必要に応じて、内因性遺伝子からの転写を増加させることによって、または導入遺伝子を導入することによって、細胞内ののテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることにより複製能をさらに亢進することができる。特に適切なのは、国際公開公報第９８／１４５９２号に提供されているヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）の触媒成分である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３４９、１９９８、およびＪｉａｎｇら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２１：１１１、１９９９に記載されている。
【０１１１】
未分化ｐＰＳ細胞においてテロメラーゼ発現を増加させることができ、その後本発明に従ってオリゴデンドロサイトに分化させることができる。あるいは、ｐＰＳ細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させ、その後トランスフェクションしてＴＥＲＴ発現を増加させることもできる。遺伝子改変細胞は、標準的な方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法、テロメラーゼ活性（ＴＲＡＰアッセイ法）、ＴＥＲＴの免疫細胞化学染色、または複製能により、ＴＥＲＴの発現について評価することができる。用途によっては、ｍｙｃ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、またはＭＯＴ−２をコードするＤＮＡで細胞を形質転換する等の、細胞を不死化する他の方法もまた意図している（米国特許第５，８６９，２４３号、国際公開公報第９７／３２９７２号、および国際公開公報第０１／２３５５５号）。
【０１１２】
必要に応じて、本発明の細胞を調製もしくはさらに処理し、インビトロで未分化細胞を除去すること、またはインビボで復帰細胞を防ぐことができる。集団から未分化幹細胞を減少させる１つの方法は、エフェクター遺伝子が、ＴＥＲＴプロモーターまたはＯＣＴ−４プロモーター等の未分化細胞において優先的な発現を引き起こすプロモーターの制御下にあるベクターを、集団にトランスフェクションすることである。エフェクター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質等のセルソーティング導くレポーターであってよい。エフェクターは、例えば毒素またはカスパーゼ等のアポトーシスの介在物質をコードし、細胞に対して直接溶解性であってもよい（Ｓｈｉｎｏｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：７３９， ２０００）。エフェクター遺伝子は、抗体またはプロドラッグ等の外部薬剤の毒素効果に対して細胞を感受性にする効果を有してもよい。発現する細胞をガンシクロビルに対して感受性にする単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が例示的である（米国特許第６，５７６，４６４ Ｂ１号）。あるいは、エフェクターは、未分化表現型に復帰する任意の細胞をインビボで天然抗体に感受性にする外来決定因子を、細胞表面に発現させてもよい（Ｕ．Ｓ． ２００３−００３２１８７ Ａ１）。
【０１１３】
本発明の細胞はまた、組織再生に関与する能力、または治療する対象に治療遺伝子を送達する能力を増強するために、遺伝子改変することも可能である。所望の遺伝子をコードする既知の配列を用いてベクターを設計し、構成的（ＣＭＶプロモーター等）またはオリゴデンドロサイト系譜細胞の細胞において特異的（ミエリン塩基性タンパク質のプロモーター等）に活性のあるプロモーターに機能的に連結する。この戦略に従って、オリゴデンドロサイトの成長を亢進する、再ミエリン化を活性化する、または軸索の再生を促進するような、様々な導入遺伝子を発現させることができる。神経成長因子をコードする遺伝子が例示的である（米国特許第５，８８５，５８４号および第６，２６８，３４０号）。
【０１１４】
研究および臨床治療におけるオリゴデンドロサイトの使用
本発明は、様々な重要な研究、開発、および商業目的のために、多数のオリゴデンドロサイトを産生する方法を提供する。
【０１１５】
本発明の細胞を用いて、他の系譜の細胞で優先的に発現されるｃＤＮＡが比較的混入していないｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。本発明の分化細胞を用いて、標準的な方法に従い、オリゴデンドロサイトおよびその派生物のマーカーに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製することも可能である。
【０１１６】
特に関心が持たれるのは、薬剤開発および臨床治療を目的とした本発明の組成物の使用である。
【０１１７】
薬剤スクリーニング
本発明の細胞を用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞および成熟オリゴデンドロサイト両方の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）または環境条件（培養環境または操作等）をスクリーニングすることができる。
【０１１８】
一例では、ｐＰＳ細胞（未分化または分化パラダイムに向けて起動した）を用いて、オリゴデンドロサイトへの成熟を促進する因子、または長期培養におけるオリゴデンドロサイトの増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、別のウェル内の細胞に候補成熟因子または成長因子を添加し、さらなる培養および細胞用途の所望の基準に従って生じる任意の表現型変化を判断することにより、それら因子を試験する。これにより、ｐＰＳ由来オリゴデンドロサイトばかりでなく初代神経組織から単離したオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞に関しても、導出および培養法の改良がもたらされ得る。
【０１１９】
本発明の他のスクリーニング法は、オリゴデンドロサイトの成長、発達、または毒性に及ぼす潜在的副作用についての薬学的化合物の試験に関する。この種のスクリーニングは、化合物がオリゴデンドロサイト自体への薬学的効果を有するように設計される場合ばかりでなく、他所での主要な薬学的効果のために設計された化合物のオリゴデンドロサイトに関連する副作用を試験するためにも適している。
【０１２０】
他のスクリーニング法は、軸索を有髄化する役割におけるオリゴデンドロサイト活性に影響を及ぼす可能性を有する小分子薬剤の効果を測定するための、オリゴデンドロサイトの使用に関する。この目的のため、細胞をインビトロで試験化合物と混合することができ、ミエリンに関連する活性に及ぼす化合物の効果を判定する − 例えば、ミエリン塩基性タンパク質等のミエリン関連成分の発現；組織学的に検出可能なミエリン鞘の形成；および神経細胞との共培養において隣接する軸索を有髄化する能力。
【０１２１】
薬剤スクリーニングの一般原理に関しては、当業者には、米国特許第５，０３０，０１５号および教科書Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般に本発明の分化細胞を、単独または他の薬剤との組み合わせのどちらかで、候補化合物と混合することを伴う。研究者は、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または機能的活性の任意の変化を判断し（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、化合物の効果を観察した変化と関連づける。
【０１２２】
臨床治療におけるオリゴデンドロサイト
本発明は、治療を必要とする患者において神経機能を保持または回復するための、オリゴデンドロサイト前駆細胞およびその派生物の使用を提供する。特に、神経組織を再ミエリン化するため、またはさもなければ神経ネットワークの維持もしくは再生を支持するために、本発明の細胞を投与することができる。いかなる限定も意味することなく、投与した細胞は、すでに所定の位置にあるニューロンの機能を安定化するもしくは改善する効果を有する、またはニューロンが相互にもしくはそれが制御する組織と新たな連結を形成するのを支持する可能性がある。
【０１２３】
薬学的組成物の性質は、部分的には治療する病態に依存する。ある症例では、優れた複製能および操作に必要な回復力を有する前駆細胞（ＮＰ２またはＧａｌＣに関して陽性）で組成物を製剤化することが適切である場合がある。別の症例では、より迅速に髄鞘形成能を提供するために、より成熟した細胞（ＧａｌＣまたはＭＢＰに関して陽性）で組成物を製剤化することが適切である場合がある。
【０１２４】
懸濁培養において形成される大きな凝集体をマトリゲル（登録商標）等の適切なマトリックスに接着させることにより、ｐＰＳ由来細胞からオリゴデンドロサイト系譜細胞の比較的分散した集団が容易に得られること見出した。培養した細胞を基層上にプレーティングして数時間〜数日間培養し、非接着細胞を除去する。次に、短時間酵素消化した後に粉砕する等の適切な化学的または機械的手段によって、オリゴデンドロサイト系譜細胞を回収する。細胞操作、保存特性、および投与に際して有利な効果を提供する能力の点から見て、単分散集団または約３０個以下の細胞の凝集塊は利点を有すると考えられる。細胞は典型的に洗浄し、その後疾患部位に細胞を保持するために効果的な用量を投与するのに適した濃度で（例えば、μＬ当たり細胞２０，０００個〜１００，０００個、治療領域の量によって調整する）、薬学的に適合する培地中に懸濁する。
【０１２５】
神経に適応した治療（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の通常の手順に従って、患者の準備をする。拒絶を防ぐために、シクロスポリンＡ等の標準的な免疫抑制療法により患者を処置してもよい。別法としてまたはさらに加えて、同じｐＰＳ細胞株から調製した造血細胞または未分化細胞を用いて、患者をオリゴデンドロサイトのアロタイプに対して特異的に寛容化してもよい（国際公開公報第０２／４４３４３号；国際公開公報第０３／０５０２５１号）。症例によっては、損傷部位においてニューロンを一次的に脱髄すること、投与細胞の接近を促進すること、または再ミエリン化を阻害し得る因子を除去することが有利である場合がある。これを達成する１つの手段は、ＧａｌＣ、Ｏ４、またはエリン関連糖タンパク質等の、ミエリン鞘上の１つまたは複数のエピトープに対する補体結合抗体を局所環境に投与することである。Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌ． ４４：７２７、１９９７；およびカナダ特許第２，２５３，０７８号を参照されたい。次に、本発明の分化細胞を、髄鞘形成もしくは神経機能の再生を所望する部位またはその周りに、１回または複数回投与する。
【０１２６】
その後対象に支持的な術後処置を施し、移植片の許容または神経機能の再生についてモニターする。適切であれば、患者をファムプリジン（Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）−ＳＲ（４−アミノピリジン）等の、オリゴデンドロサイト機能を回復すると考えられる他の手段を用いて同時に治療してもよい。組織試料を、すでに記載した関連マーカーに関して免疫細胞化学法によって解析し、軸索の再ミエリン化、投与細胞の存在に起因する神経突起の発芽等の機能的事象に関して評価することができる。それらの疾患の典型的な病理学的特性により病態の維持または改善に関して、および例えば障害状態尺度（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｔｕｓ ｓｃａｌｅ； ＥＤＳＳ）での機能の評価に関して、患者をモニターすることができる。
【０１２７】
本発明の組成物を用いた治療に適切な病態には、ミエリンを維持するまたは産生する能力が、治癒またはさらなる悪化の防止に役立つ進行性脱髄および中枢神経系の外傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
多発性硬化症は、脳および脊髄における脱髄部分の散在を特徴とする緩徐進行性疾患である。オリゴデンドログリアの破壊および血管周囲の炎症を伴う脱髄プラークは、ＣＮＳを通じて、主として白質（特に、頚部および背部）、視神経、および周室部に起こる。中脳、脳橋、および小脳の路、ならびに大脳および脊髄の灰白質もまた影響を受ける。
【０１２９】
急性散在性脳脊髄炎（感染後脳脊髄炎）は血管周囲のＣＮＳ脱髄を特徴とし、これは自発的に起こり得るが、通常はウイルス感染またはウイルスワクチン接種の後に起こる。慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）は、炎症性Ｔ細胞およびマクロファージを伴う神経内膜の間質および血管周囲浸潤を特徴とし、末梢神経の分節性脱髄を引き起こす。ＨＴＬＶ関連ミエロパシーは、両脚の痙性衰弱を特徴とする緩徐進行性脊髄疾患である。ギランバレー症候群等のいくつかの末梢神経障害も、脱髄を特徴とする。
【０１３０】
先天性代謝病（フェニルケトン尿症および他のアミノ酸尿症；テイ・サックス病、ニ−マン・ピック病、およびゴーシェ病；フルラー症候群；クラッベ病および他の白質萎縮症等）は、ＣＮＳにおけるミエリン鞘の発達に影響を及ぼし、永久的な広汎性神経欠損を起こす可能性がある。副腎白質萎縮症および副腎脊髄神経障害は、副腎機能不全および神経系の広範な脱髄を特徴とする伴性劣性代謝病である。ペリツェウス・メルツバッハー病は、プロテオリピドタンパク質遺伝子の点突然変異のために患者がミエリンを形成しない病態である。レーバー遺伝性視神経萎縮および関連するミトコンドリア障害は、主に両側の中心視力の喪失を特徴とする。
【０１３１】
ＣＮＳの外傷によって起こる任意の急性または長期異常も、無酸素症および虚血によるミエリンの喪失に関連する病態と同様に、治療が検討され得る。この分類には、脳卒中および外傷性脳損傷に関連する病態が含まれる。
【０１３２】
対麻痺または任意のレベルの不完全な運動機能を起こす様々な種類の脊髄損傷が、本発明の細胞を用いた治療の第一候補である。性質および到達性次第で、頚椎、腰椎、胸椎、および仙椎の損傷は、すべてその病態の改善または安定化を得る可能性がある。ＳＣ機能の完全なまたは不完全な喪失を起こす急性損傷は、減圧手術と同時にまたはその直後に治療することができる。慢性病態は、必要に応じていつでも治療または再治療することができる。針、カニューレ、または他の適切な装置を使用して、手術、内視鏡、または経皮注射により、細胞を損傷部位にまたはその近傍に投与することができる。保証されている場合、誘発電位試験により電気生理学的効果を測定することができる。米国脊髄損傷学会（ＡＳＩＡ）の運動スコアならびにフェランズおよびパワーズの生活の質指標（ＱＬＩ）等の基準により、患者を運動経路および感覚経路の臨床的改善について評価することもできる。
【０１３３】
いつもと同様、患者の選択、投与形態、およびリハビリテーションのモニタリングの最終責任は、管理する臨床医の責任である。
【０１３４】
商品流通できるように、本発明のオリゴデンドロサイトは典型的に等張賦形剤を含む薬学的組成物の形態で提供し、ヒト投与に十分に無菌的な条件下で調製する。本発明はまた、生産、流通、または使用の任意の時点で存在する細胞のセットまたは組み合わせを含む試薬系を含む。細胞セットは、同じゲノムを共有する場合がある未分化ｐＰＳ細胞または他の分化細胞型と組み合わせた、分化したｐＰＳ由来細胞の種類（グリア細胞、オリゴデンドロサイト、それらの前駆細胞およびサブタイプ等）に例証されるがこれらに限定されない、本開示に記載する２つまたはそれ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット中の各細胞型は、同じ事業体もしくは事業関係を共有する別の事業体の管理下で、同時にもしくは別の時点で、一緒にもしくは同じ施設内の別の容器に包装しても、または別の場所で包装してもよい。
【０１３５】
細胞組成物の医薬品製剤化における一般原則については、当業者には、Ｇ． ＭｏｒｓｔｙｎおよびＷ． Ｓｈｅｒｉｄａｎ編によるＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６、およびＣｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔ．Ｂ． Ｆｒｅｅｍａｎら編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９８を参照されたい。細胞は、任意で細胞の保存または上記の病態を治療するための医薬品としての使用に関する情報を添付して、流通もしくは臨床用途に適した装置もしくは容器に、または他の価値ある目的に適した装置もしくは容器に包装する。
【０１３６】
本発明の特定の態様の限定されないさらなる例証として、以下の実施例を提供する。
【０１３７】
実施例
実施例１：ｈＥＳ細胞のオリゴデンドロサイトへの分化
Ｈ７株およびＨ１株のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、初代マウスフィーダー細胞により馴化しｂＦＧＦを添加したノックアウト（無血清）培地中、マトリゲル（登録商標）基層上で無フィーダー条件において未分化状態で増殖させた（国際公開公報第９９／２０７４１号； 国際公開公報第０１／５１６１６号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。
【０１３８】
以下の計画に従って、ｈＥＳ細胞をオリゴデンドロサイト系譜の細胞に分化させた：
【０１３９】
（表１）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の産生
【表１】
ＧＲＭはグリア制限培地である（表２を参照のこと）。
移行培地（ＴＲ）は、ＧＲＭおよびｈＥＳ細胞を作製するための馴化培地の１：１混合物として作製する。
【０１４０】
（表２）グリア制限培地（ＧＲＭ）の成分
【表２】
【０１４１】
分化手順は以下の通りに行った：
・１日目：コラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ １７１０１−０１５）を用いて接着基層からＥＳコロニーを解離し、コロニーを４ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ １３２５６−０２９）を有するＴＲ中で低接着性６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３４７１）に入れた。分化手順の最初の３日間のみ、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １０３７８−０１６）を用いた。
・２〜１０日目：細胞をレチノイン酸（ＲＡ；オールトランス−レチノイン酸、Ｓｉｇｍａ ２２３０１８）、１０μＭと共に培養し、合計８日間毎日フィードした。ＲＡ保存液は、６ ｍｇ／ｍＬの濃度で（約０．０２ Ｍ）ＤＭＳＯに溶解して調製した。
・３日目から：培地をＧＲＭに置換し、それ以上はｂＦＧＦを添加しなかった。培地は毎日交換した。ＲＡは光感受性であるため、フィード中は照明を最小限に落とした。ＥＳ細胞凝集体を含むウェルの培地を、１５ ｍＬチューブに回収した。低速で短時間遠心分離した後（８００ ｒｐｍ、１分間）、上清を吸引除去し、新鮮培地を添加した。穏やかに上下にピペッティングし（２〜３回）、６ウェルプレートの各ウェルに４ ｍＬずつ確実に均一に分配した。
・１０〜１５日目：１０日目以後は、毎日フィードする際に、２０ ｎｇ／ｍＬ濃度のＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ｅ９６４４）および２ ｎｇ／ｍＬ濃度のｂＦＧＦを添加した。
・１５〜２１日目：ＥＧＦは２０ ｎｇ／ｍＬ濃度で添加し続けたが、ｂＦＧＦは培地から除去した。
・２１日目以後：２０ ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦを有するＧＲＭ培地を維持することにより、４２日目以降でも神経の特徴を有する新たな凝集体／凝集塊が産生され得た。
・これらの神経球を選択するため、分化手順の２８日目に、マトリゲル（登録商標）をコーティングした６ウェルプレート（マトリゲル（登録商標）１：３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ３５６２３１）に、培養物全体を解離手順を行うことなく、１２〜２０時間（一晩）移した。翌日、培養物を穏やかに振盪すると、神経球のみが接着したままであるので、培養物の残りを新鮮なＧＲＭ培地で置換した。
・３５日目：ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ Ｐ２６３６）およびラミニンでコーティングした４チャンバー・イメージングスライド（Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １５４９１７）に、神経凝集体をプレーティングした。トリプシン−ＥＤＴＡで短時間（５分）処理し、細胞の凝集を解離させた。ＰＬＬ−ラミニン上で細胞を７日間培養し、その間一日おきに培養物にフィードした。
・４２日目：培養物をパラフォルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学法により細胞を特徴付けした。使用したマーカー：ＮｅｕＮ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、Ｍａｐ２、Ｏ４、ビメンチン、ＧＦＡＰ。
【０１４２】
結果を添付の位相倒立顕微鏡写真（ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）に示す。
【０１４３】
図１は、移行培地（５０％グリア前駆細胞培地）中、懸濁状態で２日間培養した胚様体を示す。
【０１４４】
図２は、レチノイン酸中での培養の最終時点における、分化７日目の球体を示す。３日目から、透明な球体が懸濁培養物中に現れ始めた。７日目までに、これらの球体が培養物中の細胞の８０〜９０％を構成した。
【０１４５】
図３は、ＲＡ処理の抑制後の球体の崩壊を示す。いくつかの小胞は、細胞を球体の内部および外部に添加することにより成長し続けた。細胞集塊は濃い陰影の球状の形をとっていた。球体は、２０ ｎｇ ＥＧＦのみの存在下では崩壊した。しかし、低濃度のｂＦＧＦを添加することにより、球体は維持され得た。いくつかの球体は新たな細胞を添加することによって成長し続け、球状の濃い陰影の細胞集塊を生じた。厚い壁を有するいくつかの小さな球体は成長し続けたが、数日後に完全に消失した。従って、ｂＦＧＦを低濃度（２ ｎｇ／ｍＬ）で培養物中に５日間保持し続け、それにより球体は層の添加で成長し続けた。
【０１４６】
図４は、ｂＦＧＦを除去した後に現れる変化を示す。細胞集塊のほとんどが解離し始め、培養液全体が単一細胞および小さな細胞塊でいっぱいになった。同時に、新たな鮮黄色の球体が観察された（矢印）。
【０１４７】
図５は、鮮黄色の球体（矢印）が培養を続けながら選択的に維持されたことを示す。あるものは他の球体から、あるものは単離した細胞集団から、あるものは濃い細胞集塊から発芽し、新たな球体が毎日出現した。
【０１４８】
２８日目に、培養物全体をマトリゲル（登録商標）基層上に一晩接着させた。神経に拘束された球体のみが基質に接着し、その他の培養物は浮遊したままであった。
【０１４９】
図６は、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングしてから２、３日後の、球体からのグリアに拘束された神経前駆細胞の遊走および分枝を示す。より小さいコロニーは個々の細胞の縦裂により環を形成したのに対し、大きなコロニーは長い突起を有する星型の遊走を示した。マトリゲル（登録商標）で培養してから数日後に、より多くの遊走細胞が出現した。
【０１５０】
一週間後、トリプシンを用いてマトリゲル（登録商標）から培養物を解離し、さらなる特徴付けを行うために、ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン（Ｇｉｂｃｏ １２１６３−０１０）でコーティングしたＮｕｎｃイメージングチャンバーに低密度でプレーティングした。プレーティングした細胞は、ラミニン基層上で成長してから３〜４日後に、特徴としてオリゴデンドロサイト形状をとった。
【０１５１】
次に、マトリゲル（登録商標）選択段階が１０〜２０時間に短縮できることを見出した。非接着細胞を除去し、次に接着細胞を再懸濁して、ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびグリア前駆細胞培地の存在下で拡大した。これは、治療投与および他の目的に対してより適した、より分散した細胞集団を産生する利点を有する。
【０１５２】
図７はこの技法の結果を示す。細胞をマトリゲル（登録商標）に接着させた後、７日間拡大し、ポリ−Ｌ−リジン・ラミニン上にプレーティングし、マイトジェンの非存在下で培養した。４％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、３％ヤギ血清および０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（登録商標）界面活性剤中でブロッキングした。ガラクトセレブロシドに対する抗体（ＧａｌＣ、Ｃｈｅｍｉｃｏｍ）、次にペルオキシダーゼ標識した抗免疫グロブリンを用いて、免疫細胞化学法を行った。ヘマトキシンにより核を対比染色した。（第１パネル倍率２０ Ｘ；第２パネル倍率４０ Ｘ）。
【０１５３】
視野内の少なくとも約９５％の細胞が、成熟オリゴデンドロサイト系譜細胞のマーカーであるＧａｌＣの染色を示す。
【０１５４】
図８は、ＧａｌＣに関して染色された、高倍率のＥＳ由来オリゴデンドロサイトを示す（倍率６０ Ｘ）。少なくとも約１０％〜２０％の細胞がオリゴデンドロサイトに特有の形態（具体的には、ミエリンシートを示唆する、間に皮膜を有する多数の突起）を示す。
【０１５５】
実施例２：ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトはインビボにおいて再ミエリン化および神経発芽を起こす
本実施例では、実施例１と同様の戦略にいくつかの改良点を加え、Ｈ７株由来のｈＥＳ細胞を移植用のオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させた。ＧＲＭの処方は、プロゲステロン濃度を６５ ｎｇ／ｍＬに再検討する点以外は同様とした。ＥＧＦを初めから添加し、２日後にｂＦＧＦを除いた。
【０１５６】
（表３）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体の産生
【表３】
【０１５７】
最初の週は、低速で４〜５分間遠心分離してからフィードした。球体が成長を開始した後は、１５〜５０ ｍＬ円錐管内に入れインキュベーター中で５〜１０分間培養物を沈降させてフィードした。接着因子を発現する細胞は凝集体（球体）を形成し、単一細胞懸濁液中では非接着細胞よりも早く沈降する。これにより、細胞間接着特性を有する培養物の精度が増す。
【０１５８】
図９は、分化計画過程における細胞形態の進行を示す。（Ａ）： ｍＥＦ馴化培地中、マトリゲル（登録商標）上で無フィーダー培養にて成長する未分化ｈＥＳ細胞。（Ｂ）： ３日目までに、レチノイン酸を含む培地での懸濁培養で胚様体から透明な球体が成長し、迅速な細胞の分散を示す。（Ｃ）： 黄色い球体が大きな塊状で蓄積することから、レチノイン酸による神経系譜細胞の誘導（段階３）、その後のＥＧＦの存在下でのオリゴデンドロサイト前駆細胞の拘束および拡大（段階４）が明白であった。（Ｄ）： 次に、所望の細胞型のポジティブセレクションのため細胞をマトリゲル（登録商標）上にプレーティングした。（Ｅ、Ｆ）： 拡大段階が進行するにつれて、球体の大きさおよび培養物の割合が増加した。優先的に選択した後、最大で８週までグリア拘束前駆細胞を維持し増幅することができた。（Ｇ、Ｈ）： 次にマイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上にオリゴデンドロサイト前駆細胞をプレーティングすると、細胞は１週間以内に成熟オリゴデンドロサイトの形態をとった。
【０１５９】
図１０は、成熟オリゴデンドロサイトの免疫細胞化学的解析を示す。プレーティングしてから１週間後、９４％を超える細胞が初期グリア細胞のマーカーであるＮＧ２に対する抗体で標識された（Ａ）。プレーティングしてから８週間後、９５％を超える細胞がＧａｌＣ（Ｃ）、Ｏ４（Ｄ）、およびＲＩＰ（Ｅ）について陽性に染色された。細胞を抗ＧＦＡＰで染色し、かつＤＡＰＩで対比染色したところ、オリゴデンドログリアマーカーで標識されなかった細胞の実質的にすべてが、ＧＦＡＰ陽性であった（Ｂ）。
【０１６０】
次に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）衝撃装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ＬＬＣ）を用いて中程度の脊椎挫傷を誘導した成体スプラーグ・ド−リー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを麻酔し、低位胸髄にオリゴデンドロサイト前駆細胞を投与した。
【０１６１】
図１１は、細胞を投与した後に得られた、ヒト核タンパク質に特異的な抗体で染色した組織切片を示す。濃く染色されたことから、移植後にヒト細胞が生存していることが確認される。
【０１６２】
図１２は、移植してから９週間後の、ヒト核タンパク質について染色した脊髄の周囲領域の横断切片を示す。拒絶を防ぐために、シクロスポリンＡで動物を処置しておいた。細胞は白質に向けて遊走または増殖した。
【０１６３】
図１３は、移植細胞が投与部位に副作用をもたらすかどうかを判定する詳細な解析の結果を示す。未処置のラットおよび移植したラットの損傷部位にわたり、脊髄の長さに沿って連続切片を得た。各棒グラフは、５枚の切片で測定した平均断面積を示す（平均値±ＳＥＭ）。挫傷近傍の小さな断面積は、損傷後の二次拡大の結果である。オリゴデンドロサイトは救済（ｓｐａｒｉｎｇ）を誘導しないが、損傷を悪化させることもない。このことから、ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトは脊髄損傷の１ ｍｍ以内に投与しても安全であることが示される。
【０１６４】
図１４は、ニューロン分枝を測定する実験から得られたものである。損傷から８週間後、運動皮質の順行性トレーサーとして、動物の皮質脊髄路にＢＤＡを注射した。これらの切片は２週間後に採取したものである。ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物においてのみ、軸索分枝の証拠が存在した（上の２枚のパネルにおいて、濃く染色された細い線として示される）。分枝は、損傷部位の真上の脊髄の領域で観察された。
【０１６５】
図１５は、損傷および細胞投与部位（中心点）から１ ｍｍの間隔で測定したニューロン分枝の定量を示す（ブロック当たり３切片の平均値±ＳＥＭ）。処置を受けなかった損傷動物では、部位の３ ｍｍ上で標識軸索を計測した。処置した動物は、有意に高いレベルで、中心点の損傷のすぐ頭側にまで標識軸索を有した。このことから、移植細胞が再生可塑性を誘導することが確認される。
【０１６６】
図１６は、移植した動物から採取した、実質的な再ミエリン化の証拠を示す切片の一連の電子顕微鏡写真である。左上のパネルの厚い環は、正常にミエリン化した繊維である。視野内の残りの軸索は、薄い層のミエリンを示す。軸索直径に対する鞘の比率から、これらの軸索が新たにミエリン化されたことが示唆される。右上のパネルは、新たにミエリン化した軸索のより解像度の高い像である。約５または６層の外被、および上部にはオリゴデンドロサイトの先端を示す軸索の舌状の縁が存在する。これは、この軸索のミエリン化が進行中であることを示す。下のパネルは、シュワン細胞によって沈着した厚いミエリン鞘を示す。これは移植にかかわらず生じ、未処置動物において限られた程度の回復が提供される。しかし、ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物のみが、オリゴデンドロサイトに特有の、上のパネルで観察される性質のミエリン化の証拠を示した。
【０１６７】
実施例３：オリゴデンドロサイト系譜細胞の表現型特徴付け
本実施例では、表４に示す手順に従ったｈＥＳ株Ｈ７からのオリゴデンドロサイトの産生過程におけるマーカー発現を追跡する。
【０１６８】
（表４）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体の産生
【表４】
【０１６９】
本手順の一般的な適用では、固相選択段階後（約２３日目以後の任意の時点）に移植に適したオリゴデンドロサイト前駆細胞が得られる。トリプシンを用いて週に一度継代することにより、最終段階の培養を行い必要に応じて細胞を拡大することができる（少なくとも８週間）。
【０１７０】
本実施例での表現型解析のために、５％ノックアウト血清代替物を含むＧＲＭを用いて細胞を低密度培養に適合化した。２１日目に５％ ＫＯ−ＳＲを存在させ始めることによって、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングした際に双極細胞の増殖が改善された。細胞を低密度でラミニン（ポリ−Ｌ−リジン上で１５μｇ／ｍＬ）上にプレーティングした場合には、ＫＯ−ＳＲにより細胞の生存度および成長が改善された。手順の早い時期にＫＯ−ＳＲを使用しても、成長速度および黄色球体の比率から見て分化の過程に影響を及ぼさなかった。
【０１７１】
図１７は、未分化ｈＥＳ細胞コロニーで検出されたマーカーを示す。左側のパネルは、視野内のすべての細胞核の位置を表すＤＡＰＩ染色の青蛍光の上に重ね合わせた、各マーカーに特異的な抗体による赤蛍光を白黒で示す。右側のパネルは、マーカー染色のみを示す。２つの像を比較することにより、問題のマーカーを発現する、視野内の全細胞の比率の推定が可能となる。
【０１７２】
上列は、多能性細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に陽性標識されたコロニーを示す。下列は、中胚葉マーカーＢＭＰ４に陽性標識されたコロニーを囲む間質細胞を示す。各コロニー内の未分化細胞はＢＭＰ４陰性である。
【０１７３】
図１８は、分化過程における転写因子Ｐａｘ６の一過性の出現を示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列は、１０日目の細胞塊の中心に向かった染色、周辺に向かってより分化した細胞でのすでにダウンレギュレートされた染色を示す。下列は、３５日目に採取した細胞では実質的に染色されないことを示す。
【０１７４】
図１９は、１０日目にレチノイン酸を除去した直後に存在する、初期のオリゴデンドロサイト系譜細胞で検出されるマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列：転写因子Ｏｌｉｇ１（８３％±７％）。中列：転写因子ＳＯＸ１０（７２％±１２％）。下列：非特異的オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーＡ２Ｂ５（９７％±３％）。
【０１７５】
図２０Ａ〜２０Ｂは、３５日目の完全に分化したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。
【０１７６】
結果から、少なくとも約８０％の細胞がオリゴデンドログリアマーカーＮＧ２、ＧａｌＣ、およびＯ４に陽性であることが示される。オリゴデンドログリアマーカーで標識されなかった細胞は、主にニューロンマーカーＧＦＡＰまたはＴｕｊ１（２０Ｂ、下列）に陽性であった。二重免疫細胞化学法により、ＧＦＡＰまたはＴｕｊ１陽性細胞はオリゴデンドログリアマーカーを同時に発現しないことが示される。さらに、ＢＭＰ４またはＳＳＥＡ−４は検出されず、このことからこれらの培養物が未分化細胞または中胚葉系譜細胞を欠いていることが示唆される。この細胞集団は、少なくとも８回の連続した継代を通して増殖させることが可能であると考えられる。
【０１７７】
実施例４：ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトは、ミエリン欠損動物において軸索
を再ミエリン化する
これらの細胞によってインビボで起こった髄鞘形成が（内因性オリゴデンドロサイトの誘導によるのではなく）直接的な効果であることを実証するため、分化手順の２８日目の細胞を脱髄のシバラーマウスモデルに移植した。シバラーマウスは、染色体１８に位置するミエリン塩基性タンパク質遺伝子の変異に関してホモ接合性である（Ｍｂｐｓｈｉ／Ｍｂｐｓｈｉ）。この遺伝子は重複しており、重複遺伝子の大部分が反転し、アンチセンスＲＮＡの形成を引き起こす。これにより、ＣＮＳを通じて重篤なミエリン欠損が生じる。
【０１７８】
培養物からオリゴデンドロサイト前駆細胞を回収し、ＤＭＥＭで洗浄し、濃縮し、シリコンコーティングしたハミルトンシリンジに装填する。すべての実験と同様に、ここでも１０ ｍｇ／ｋｇ シクロスポリンＡにより動物を免疫抑制した。６週間後、動物を屠殺しＥＭ解析のために切片を作製した。
【０１７９】
図２１はその結果を示す。超微細構造的に、シバラーマウスの軸索はミエリンを欠いているか、または１もしくは２層の緻密でないミエリンによって囲まれている（上のパネル）。細胞を移植してから６週間後、電子顕微鏡解析により多層の緻密なミエリンが示され、このことから移植集団のミエリン形成能が示唆された（下のパネル）。
【０１８０】
マウスはミエリン塩基性タンパク質を産生する能力を欠いているため、緻密なミエリンは栄養作用ではなく、投与したオリゴデンドロサイトによって直接産生されるに違いない。
【０１８１】
実施例５：ＥＳ由来オリゴデンドロサイトによる脊髄機能の回復
ＥＳ由来オリゴデンドロサイト系譜細胞が神経活性を回復する能力を、脊髄損傷のラット挫傷モデルで判定した。
【０１８２】
衝撃装置を用いて、麻酔した成体スプラーグ・ド−リーラットの低位胸髄に中程度の挫傷を誘導した。損傷から１週間後、４μＬ培地中の細胞２．５ ｘ １０５個を挫傷部位に移植した。分化計画（実施例１）の３５日目の細胞を、トリプシンおよびＥＤＴＡに３分間曝露して細胞を非接着性にすることにより、移植細胞集団を調製した。次に細胞を基礎培地ですすぎ、μｌ当たり細胞６ ｘ １０４個に濃縮した。
【０１８３】
損傷から６週間後、順行性トレーサーＢＤＡ（ビオチン化デキストランアミン）を動物の運動皮質に注射した。腰椎にエメラルドグリーンを注射し、腰椎路を標識した。８週目に実験を終了した時点で、これらのマーカーの位置を判定した。
【０１８４】
図２２は、本実験の２群それぞれについての地上歩行スコアを示す。上のグラフは、２００キロダイン挫傷を受けた動物の結果を示す。下のグラフは、２５０キロダイン挫傷の結果を示す。ＢＢＢ尺度は、関節運動、体重支持、四肢の協調、足の配置、および歩行安定性に基づく正常な地上歩行を評価する２１ポイント尺度である（Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１２：１、１９９５）。（■）損傷から１週間後にＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物（ｎ＝５）；（▲）同じ挫傷を被るが細胞を投与していない対照動物（ｎ＝３）。盲検で評価した平均値±ＳＥＭ。
【０１８５】
ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物は、処置後５週間を超えて持続する有意に優れた機能を示した（＊≡ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
これらの結果から、ＥＳ由来オリゴデンドロサイトが脊髄損傷の動物モデルにおいて機能の回復を助けることが実証される。先の実施例から、移植したオリゴデンドロサイトにより神経発芽およびミエリン欠損軸索の再ミエリン化が起こることが示される。これらの効果のいずれかまたは両方が、ここで認められた動作の改善に寄与する可能性がある。
【０１８７】
本発明のある種の適応は日常的な最適化の問題であり、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく実施可能であることは自明である。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、胚細胞および神経系前駆細胞の細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、生物学的研究、薬剤スクリーニング、およびヒトの治療に使用するのに適した、オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞の濃縮された集団を提供する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００２年７月１１日に出願された米国仮出願第６０／３９５，３８２号、および２００３年４月４日に出願された米国実用出願第１０／４０６，８１７号の利益を主張する。優先権出願は、本明細書によって完全に参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の支持において重要な生理的役割を担う。ヒトの治療にオリゴデンドロサイトが利用できれば、神経細胞を絶縁するミエリン鞘の欠陥によって生じる障害状態の治癒が促進され得る。
【０００４】
多発性硬化症は、脳および脊髄の神経細胞を囲むミエリン鞘のゆっくりとした破壊を伴う、進行性かつ障害性の脱髄疾患である。症状は、しびれ感、視覚障害、および認知変化から麻痺に及ぶ。この疾患は免疫学的および遺伝学的要素を有すると考えられており、２０歳から４０歳の間で臨床型に現れる場合が多い。米国だけでも約３００，０００人がこの疾患に冒されている。治療法は、現在のところβインターフェロンまたは副腎皮質ステロイドの過程を伴う。これらの薬剤により発病の間の症状を伴う期間が短縮され得るが、一般に長期の障害は妨げられない。
【０００５】
脊髄の外傷により外傷部位の近傍で無傷の軸索の脱髄が起こり、それによって軸索の神経伝達能力が奪われる。米国では、毎年約１１，０００件の脊髄損傷の新たな症例がある。ＳＣＩ情報ネットワークでは、任意のレベルでの不完全な運動機能に苦しむ患者にかかる生涯直接費は、減給分および生活の質への影響を含めずに、＄４００，０００〜＄２，２００，０００に及ぶと推定している。
【０００６】
中枢神経系の細胞上のミエリンは、軸索をその近傍で覆いミエリン鞘を形成するオリゴデンドロサイトによって正しい位置に整えられている。疾患状態におけるオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞の役割は、ＫｅｉｒｓｔｅａｄおよびＢｌａｋｅｍｏｒｅ（Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４６８：１８３、１９９９）によって概説されている。Ｏ−２Ａ細胞として知られているオリゴデンドロサイト前駆細胞は、健常成人のＣＮＳおよび多発性硬化症の病変に存在し、再ミエリン化に関与する（Ｓｃｏｌｄｉｎｇら、Ｂｒａｉｎ １２１：２２２１、１９９８；およびＳｃｏｌｄｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８９：１、１９９９）。オリゴデンドロサイトが均整をとって増殖し、損傷が大きい箇所では蓄積された前駆細胞を使い果たしてしまうため、適切な再ミエリン化ができないということが起こり得る。
【０００７】
神経機能を回復するための再生医療で用い得る細胞集団を作製することを目的として、かなりの研究が行われてきた（Ｐａｒｋら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １６：６７５、１９９９によって概説されている）。Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９：７５２９、１９９９）は、出生後のラット脳から、移植後にオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を生じるＣＮＳ前駆細胞を単離した。Ｓｖｅｎｄｓｅｎら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． ８５：１４１、１９９８）は、発達過程のヒト皮質から前駆細胞を単離した。Ｍｕｊｔａｂａら（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１４：１１３、１９９９）は、胚性幹細胞からの神経系前駆細胞の単離について報告している。
【０００８】
国際公開公報第９７／０７２００号（スタンフォード大学）は、成体ラット脳から単離したオリゴデンドロサイトの培養を示している。国際公開公報第０１／２８３４２号（ワシントン大学）は、あらかじめ馴化したオリゴデンドロサイト培地中で神経細胞を培養する特定の方法を提案している。米国特許第５，７５３，５０６号（Ｊｏｈｅ、ＣＮＳ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する能力を有する、神経組織から単離した幹細胞を維持する培養系に関する。米国特許第６，２３８，９２２号（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｃ．）は、神経組織の、ニューロンおよびグリアに分化する能力を有する細胞への解離を提案している。米国特許第６，２３５，５２７号（Ｒａｏら、ユタ大学）は、哺乳動物神経管組織から解離し、Ａ２Ｂ５細胞表面マーカーに基づいて選択した、哺乳動物ＣＮＳグリア限定前駆細胞の集団に関する。
【０００９】
米国特許第５，９６８，８２９号（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを産生する能力を有するＣＮＳ神経幹細胞を含む培養液を請求している。国際公開公報第９７／３２６０８号は、移植を介してＣＮＳに送達するための、遺伝子操作した初代オリゴデンドロサイトに関する。米国特許第５，８３０，６２１号（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、アクセッション番号ＣＲＬ １１８８１でＡＴＣＣに寄託したヒトオリゴデンドロサイト細胞株について記載している。この株は、特徴的なマーカーＧＦＡＰ、ＧａｌＣ、Ｏ４、およびＡ２Ｂ５を本質的に含まない。
【００１０】
残念なことに、神経組織から単離した前駆細胞がヒトの臨床治療に必要な細胞数を産生するのに十分な複製能力を有するのかどうかは、いまだ明らかではない。
【００１１】
別の供給源は、初期の胚組織から単離される多能性細胞である。胚性幹（ＥＳ）細胞は、２５年以上前に初めてマウス胚から単離された（Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：７６３４、１９８１）。ＥＳ細胞は、同じ種の実質的に任意の組織種の子孫を生じ得ると考えられている。
【００１２】
Ｆｒａｉｃｈａｒｄら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０８：３１８１、１９９５）は、マウスＥＳ細胞のグリア細胞および機能的なニューロンへのインビトロ分化について報告している。Ｍｕｊｔａｂａら（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１４：１１３、１９９９）は、マウスＥＳ細胞からの神経前駆細胞の単離について報告している。Ｌｉ、Ｓｍｉｔｈら（Ｃｕｒ． Ｂｉｏｌ． ８：９７１、 １９９８）は、細胞系譜選択によるマウスＥＳ細胞からのニューロン前駆細胞の産生について報告している。Ｂｒｕｓｔｌｅ、Ｍｃｋａｙら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１４８０９、１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：７５４、１９９９）は、有髄化移植片の潜在的な供給源として、マウスＥＳ細胞に由来するグリア前駆細胞について報告している。ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ． Ｍｅｄ ５：１４１０、１９９９；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：６１２６、２０００）は、培養においておよび脊髄移植後に、マウスＥＳ細胞がオリゴデンドロサイトを形成し、有髄化することを報告している。
【００１３】
ヒトＥＳ細胞は、ごく最近になって初めて単離された（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８）。ヒトＥＳ細胞は、未分化状態で維持するためまたは特定の分化経路に沿って導くために、非常に異なる条件を必要とする（米国特許第６，０９０，６２２号および第６，２００，８０６号；国際公開公報第９９／２０７４１号および国際公開公報第０１／５１６１６号）。このため、ヒトＥＳ細胞から分化細胞の比較的均一な集団をいかにして調製するかについては、ほとんどわかっていない。
【００１４】
国際公開公報第０１／８８１０４号（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることによって得られる神経系前駆細胞集団について記載している。９０％ ＮＣＡＭ陽性、３５％βチューブリン陽性、および７５％ Ａ２Ｂ５陽性を超える集団が得られた。Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９：１１２９、２００１）は、ヒトＥＳ細胞からの移植可能な神経系前駆細胞の分化について報告している。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９４７７（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、生じた集団内の少なくとも１０％のＭＡＰ−２陽性細胞がドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシン水酸化酵素を発現する、ＥＳ細胞由来の神経系細胞集団について記載している。
【００１５】
最近になって、Ｂｉｌｌｏｎら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１５：３６５７、２００２）は、遺伝子操作したマウスＥＳ細胞からのオリゴデンドロサイト発生のタイミングについて記載している。Ｋｕｏら（Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｃ １１／０２）は、２８％ ＧＦＡＰ陽性であるサルＥＳ由来細胞の集団について記載しており；Ｘｉａｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：４１、２００３）は、細胞系譜特異的転写因子Ｏｌｉｇ２を用いた、マウスＥＳ細胞からのオリゴデンドロサイトの作製について報告している。
【００１６】
ヒトの健康および疾患の管理におけるｐＰＳ細胞の全般的な可能性を理解するため、脱髄状態の治療に有用な細胞の濃縮された集団を作製する新しいパラダイムを開発することが必要である。
【発明の概要】
【００１７】
概要
本発明は、研究および薬学的組成物の調製に用いるための、グリア系譜の霊長動物細胞を効率的に産生する系を提供する。
【００１８】
本発明の分化細胞集団は単離されまたはインビトロで培養され、グリア細胞または神経組織を有髄化し得る細胞の特徴に関して高度に濃縮されている。この細胞は、オリゴデンドロサイトの形態的特徴、本開示で後に記載する特定の抗体で検出可能なもしくは増幅可能なマーカーの発現、またはさらなる分化においてオリゴデンドロサイトを形成する能力を有し得る。この細胞はまた、同時培養アッセイにおいて神経節を有髄化する能力、インビボにおいて脱髄した軸索に対してミエリンを回復する能力、またはヒトもしくは非ヒト動物において神経機能を改善する能力等の、オリゴデンドロサイトの特定の機能的特徴を有し得る。これらの特徴の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上が任意の組み合わせで存在し得る。
【００１９】
この細胞集団は、あまり分化していない様々な種類の幹細胞から調製することができる。起源となり得る細胞には、胚盤胞由来の霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞（胚性幹細胞に例証される）または初期胚の胚組織が含まれる。したがって、細胞はその起源の元となった組織の子孫であるという特徴を有することになり、このことは起源細胞と分化細胞が同じゲノムを有することを示すことによって確認され得る。
【００２０】
本発明の他の態様は、すでに記載した分化細胞を作製または維持する方法に関する。この方法は、本開示において後に説明するような１つまたは複数の成長因子または分化因子の存在下で、多分化能幹細胞または多分化能性幹細胞を培養する段階を含む。
【００２１】
例証として、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）等のマイトジェンと共にまたはそれなしで、トリヨードチロニン（Ｔ３）、セレン、またはレチノイン酸等の１つまたは複数の分化因子を含む培地中で幹細胞を培養することができる。分化細胞の最初の形成は、オリゴデンドロサイト系譜細胞が比較的均一な球体を形成し得る懸濁培養において起こり得る。他の細胞型は、所望の細胞型に選択的に付着する表面上に培養物をプレーティングする等の適切な分離手段によって、除去することができる。任意で、多くは細胞の最初の誘導に用いたような１つまたは複数の分化因子の存在下で、ＦＧＦまたは上皮成長因子等のマイトジェンと共に培養することによる、選択の前または後に分化細胞をさらに増殖させることができる。次に、任意でマイトジェンの非存在下で、または後期分化を亢進するポリ−Ｌ−リジン等の表面の存在下で培養することにより、細胞をさらに成熟させることができる。
【００２２】
本発明の細胞は、多くの商業上重要な用途に用いることができる。例えば、この細胞は、その存在が細胞の維持、毒性、さらなる分化、またはグリア細胞として機能する能力に関連する化合物を、グリア細胞に及ぼす影響についてスクリーニングするのに適している。この細胞はまた、インビトロおよびインビボにおいて隣接する神経組織の髄鞘形成をもたらすのにも適している。
【００２３】
ヒトまたは動物治療用の薬学的組成物の調製において、本発明の細胞を用いることも可能である。次にこの組成物を用いて、軸索の髄鞘形成障害に関連するような病態または脊髄損傷を治療することができる。
本発明のさらなる局面は、以下の記載により明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】塩基性ＦＧＦおよびオリゴデンドロサイト分化因子を含む培地中、懸濁状態で２日間培養したヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を示す、倒立顕微鏡を用いて撮影した位相差像である。
【図２】レチノイン酸と共に７日間培養した後の細胞を示す。培養物中の８０〜９０％を示す、細胞の大きな透明な球体が存在した。
【図３】レチノイン酸を除去し、細胞を低濃度のＦＧＦの存在下で維持した後に何が起こるかを示す。
【図４】ｂＦＧＦを除去した後に現れる変化を示す。大きな凝集塊が解離し、培養液全体が単一細胞および小さな細胞塊でいっぱいになった。同時に、新たに鮮黄色の球体が観察された（矢印）。
【図５】細胞をＦＧＦの非存在下で上皮成長因子と共に培養した場合に成長する鮮黄色の球体（矢印）を示す。
【図６】マトリゲル（登録商標）上にプレーティングしてから２日または３日後の、球体からのグリアに拘束された神経前駆細胞の遊走および分枝を示す。
【図７】１０〜２０時間だけ細胞をマトリゲル（登録商標）に接着させることにより、オリゴデンドロサイト系譜細胞が選択されたという結果を示す。非接着細胞を除去したが、これによりオリゴデンドロサイトマーカーをもたない細胞は実質的にすべて除去される。次に接着細胞を再懸濁して、ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびグリア前駆細胞培地の存在下で７日間拡大した。これは、治療的投与および他の目的に対してより適したより分散した細胞集団を産生する利点を有する。この顕微鏡写真は、ヘマトキシンを用いて細胞核を対比染色した（黒矢印）、ガラクトセレブロシドに対する染色（ＧａｌＣ；白矢印）を示す。この条件下でＧａｌＣに染色された細胞の割合は、少なくとも約９５％であった。
【図８】より高い倍率のＥＳ由来オリゴデンドロサイトを示す。細胞は、成熟オリゴデンドロサイトに特有の形態的特徴（間にミエリン皮膜を有するように見える多数の複雑な突起）を有する。
【図９】分化過程における細胞形態の進行を示す。（Ａ）： 未分化ｈＥＳ細胞。（Ｂ）： レチノイン酸を含む懸濁培養において胚様体から成長する透明な球体。（Ｃ）： ＥＧＦの存在下における、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む黄色球体の拡大。 （Ｄ）： マトリゲル（登録商標）上にプレーティングすることによりポジティブ選択されたオリゴデンドロサイト系譜細胞。（Ｅ、Ｆ）： 培養におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞の隆起の増加。（Ｇ、Ｈ）： 次に続くプレーティングによって、成熟オリゴデンドロサイトへのさらなる分化が起こる。
【図１０】成熟オリゴデンドロサイトの免疫細胞化学的解析を示す。プレーティングしてから１週間後、細胞は初期グリア細胞のマーカーＮＧ２に関して陽性である（Ａ）。プレーティングしてから８週間後、細胞は、ＧａｌＣ（Ｃ）、Ｏ４（Ｄ）、およびＲＩＰ（Ｅ）に関して陽性である。パネルＢは、示したマーカーで染色された細胞の数を示す。
【図１１】ヒト核タンパク質に特異的な抗体で染色した、ラットの脊髄に投与したオリゴデンドロサイト前駆細胞の組織切片を示す
【図１２】移植してから９週間後、細胞が白質に向けて遊走または増殖したことを示す。
【図１３】移植したオリゴデンドロサイトが、脊髄の断面積として測定される、挫傷後の二次拡大に起因する損傷を悪化させないことを示す。
【図１４】ｈＥＳ細胞が軸索分枝を誘導することを示す。オリゴデンドロサイトを移植した動物の像では（上のパネル）、ＢＤＡ染色の濃い細い線として新たな軸索が示される。未処置の動物では、分枝は認められなかった。移植した細胞は、再生可塑性を誘導する
【図１５】損傷部位（中心点）からのニューロン分枝の定量を示す（ブロック当たり３切片の平均値±ＳＥＭ）。処置した動物は、有意に高いレベルで、中心点の損傷のすぐ頭側にまで標識軸索を有した。
【図１６】ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物における、実質的な再ミエリン化の証拠を示す。上段の電子顕微鏡写真における厚い環は、正常にミエリン化した繊維である。視野内の残りの軸索は、薄い層のミエリンを示す。右上のパネルの軸索は、約５層または６層の外被、および進行中の再ミエリン化の証拠を示す。移植した動物のみが、オリゴデンドロサイト活性に起因する新たなミエリンを示した。これにより、移植動物における動作の改善を説明する手段が提供される。
【図１７】未分化ｈＥＳ細胞コロニーで検出されたマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列は、多能性細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に標識されたコロニーを示す。下列は、中胚葉マーカーＢＭＰ４に標識されたコロニーを囲む間質細胞を示す。
【図１８】分化過程における転写因子Ｐａｘ６の一過性の出現を示す。上列は、１０日目の細胞塊の中心に向かった染色、周辺に向かってより分化した細胞でのすでにダウンレギュレートされた染色を示す。下列は、分化３５日目では実質的に染色されないことを示す。
【図１９】分化１０日目に存在する初期のオリゴデンドロサイト系譜細胞で検出されるマーカーを示す。上列：転写因子Ｏｌｉｇ１。中列：転写因子ＳＯＸ１０。下列：オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーＡ２Ｂ５。
【図２０Ａ】３５日目の移植に適したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。実質的にすべての細胞がオリゴデンドログリアマーカーを有したが、神経細胞、間葉細胞、または未分化ｈＥＳ細胞のマーカーは有さない（２０Ｂ、下のグラフ）。
【図２０Ｂ】３５日目の移植に適したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。実質的にすべての細胞がオリゴデンドログリアマーカーを有したが、神経細胞、間葉細胞、または未分化ｈＥＳ細胞のマーカーは有さない（２０Ｂ、下のグラフ）。
【図２１】ミエリン塩基性タンパク質を作り出す能力が遺伝的に欠損しているシバラーマウスにオリゴデンドロサイトを投与した結果を示す。超微細構造的に、シバラーマウスの軸索はミエリンを欠いているか、または１もしくは２層の緻密でないミエリンによって囲まれている（上のパネル）。細胞を移植してから６週間後、電子顕微鏡解析により多層の緻密なミエリンが示され、このことから移植集団のミエリン形成能が示唆された（下のパネル）。緻密なミエリンは、投与したオリゴデンドロサイトによって直接産生されている。
【図２２】衝撃装置を用いてラットの脊髄を挫傷させ、ＢＢＢ尺度での定量によりその後の期間の脊髄機能について評価する実験の結果を示す。上のグラフ：２００キロダイン挫傷；下のグラフ：２５０キロダイン挫傷。 （■）損傷から１週間後にＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物（ｎ＝５）；（▲）同じ挫傷を被るが細胞を投与していない対照動物（ｎ＝３）。盲検で評価した平均値±ＳＥＭ。ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物は、治療後５週間を超えて持続する有意に優れた地上歩行を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞を効率的に産生することにより、それらの細胞の大きな集団を作製する問題を解決する。
【００２６】
分化細胞集団は著しく均一である。図７は、オリゴデンドロサイトに特有である形態学的特徴を有するヒト細胞の例示的な調製を示す。集団を、オリゴデンドロサイト系譜の細胞のマーカーであるＧａｌＣについて染色した。図８はより高い倍率の視野であり、近傍の任意のニューロンを有髄化しようとしているミエリンのシートの生成を示している。これらの細胞の機能的特徴から、これらの細胞はオリゴデンドロサイトの性質のさらなる特徴付けおよびヒトの治療での使用によく適している。
【００２７】
本発明の細胞の理想的な供給源は、様々な種類の霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞である。以下に記載する戦略に従っていくつもの適切な培養条件および補因子の中から選択することにより、ｐＰＳ細胞をオリゴデンドロサイト経路に導出することができる。未分化ｐＰＳ細胞のオリゴデンドロサイトへの変換は、最適条件下で２５％程度の効率で起こり得ることが明らかになった。
【００２８】
本発明の組成物および方法により、これまでに利用可能であった技術を超える重要な利点が提供される。所望のアロタイプのｐＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを分化させることにより、任意の組織適合性を有するオリゴデンドロサイトを産生することができる。必要に応じて、移植を亢進する任意の方法で、分化の前または後に細胞を遺伝子改変することができる。細胞は天然細胞株に由来するが継続的な組織解剖を必要としないため、規制認可の品質管理要求事項を満たすのに最適である。
【００２９】
重要なことには、各出発幹細胞集団から産生され得る細胞の供給量はほぼ無限である。実施例１に説明するように、ひとたびオリゴデンドロサイト系譜細胞を産生かつ選択すれば、成長因子の存在下で培養することによりその細胞を大幅に拡大することができる。さらに、起源ｐＰＳ細胞をほぼ無期限に増殖させて、それによってより分化した細胞の供給源を連続的に提供することができる。
【００３０】
以下の開示により、本発明の分化細胞をいかにして作製および使用するかのさらなる説明を提供する。集団は著しく均一であり、したがって多くの商業的に重要な用途における使用に適している。
【００３１】
本発明の１つの局面により、少なくとも約８０％の細胞が、霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞の子孫であり；ＮＧ２プロテオグリカン（または他のオリゴデンドロサイトマーカー）に特異的な抗体で染色され；かつＮｅｕＮ（または神経細胞および他の潜在的混入物の他のマーカー）に関して陰性である、分化細胞集団を提供する。分化細胞集団は、オリゴデンドロサイト系譜細胞を産生するのに適した成分のシステムの一部であってよい。このシステムは、分化細胞が産生される元ととなったｐＰＳ細胞（ヒト胚性幹細胞等）の系統をさらに含み得る。任意で、分化細胞集団の少なくとも８０％の細胞が、Ａ２Ｂ５またはＰＤＧＦＲαも発現する。細胞の少なくとも２０％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞に特有である双極性形態を示す可能性がある。
【００３２】
ある状況下では、シバラー変異（ｓｈｉｖｅｒｅｒ ｍｕｔａｎｔ）マウスの脊髄に分化細胞集団を移植した後、その集団により神経軸索の周りに緻密なミエリンの沈着が起こる；または挫傷ラットの脊髄内もしくは脊髄の周りに集団を移植した後、地上歩行が改善される。あるいは、本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞集団を（例えば、マイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上で３日間培養することにより）インビトロでさらに分化させてもよい。これにより、少なくとも１０％の細胞が成熟オリゴデンドロサイトに特有である複雑な突起を有し；かつ約８０％、９０％、９５％、またはそれ以上がＧａｌＣ等の成熟オリゴデンドロサイトマーカーを有する、より成熟した集団が産生され得る。増殖段階中に産生されたオリゴデンドロサイト系譜細胞は、前駆細胞段階で発現しているマーカーばかりでなく、成熟細胞の濃縮された集団を産生する能力またはインビボで所望の機能を遂行する能力によっても特徴付けることができる。
【００３３】
以下に説明するように、本発明のいくつかの分化細胞集団は、マイトジェンおよび少なくとも２つのオリゴデンドロサイト分化因子を含む培地中で未分化ｐＰＳ細胞を培養する過程により得ることができる。例えば、細胞凝集体を形成させるために、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、レチノイン酸、およびおそらくセレンの存在下で、未分化ｐＰＳ細胞を懸濁状態で培養してもよい。
【００３４】
本発明のさらなる説明および例証を以下の項で提供する。
【００３５】
定義
オリゴデンドロサイトとは、中枢神経系の外膜構造（神経膠）の一部を形成する外胚葉起源の神経系細胞である。この細胞は、個々の軸索の周りを覆いＣＮＳのミエリン鞘を形成する、不定数のベール様またはシート様突起を有する。この細胞は、本開示で後に説明する形態学的基準、表現型基準、または機能的基準によって同定することができる。
【００３６】
「神経系前駆細胞」または「神経上皮幹細胞」とは、神経細胞（ニューロン前駆細胞もしくは成熟ニューロン等）またはグリア細胞のいずれかである子孫を産生し得る細胞である。「グリア細胞」という用語は、成熟オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびこれらの細胞のいずれかまたは両方に拘束された前駆細胞を包含する。
【００３７】
「オリゴデンドロサイト前駆細胞」は、ニューロンまたは非神経組織に優先して、成熟オリゴデンドロサイトおよび／またはさらなる前駆細胞を含む子孫を形成するように拘束された神経系細胞である。特記しない限りこの細胞は、必ずしも必要ではないが、アストロサイト等の他の種類のグリア細胞を産生する能力を有してもよい。特記しない限り、本開示での「オリゴデンドロサイト」または「オリゴデンドロサイト系譜細胞」への言及は、オリゴデンドロサイト前駆細胞および成熟細胞の両方を指す。
【００３８】
細胞の個体発生との関連では、形容詞「分化した」とは相対語である。「分化細胞」とは、比較する細胞よりも発生経路をさらに下方に進行した細胞のことである。したがって、多能性胚性幹細胞は、上記の様々な種類の前駆細胞等の系譜を限定した前駆細胞に分化することが可能である。これらの細胞は、次に経路のさらに下流にある細胞、または成熟オリゴデンドロサイト等の最終段階の分化細胞にさらに分化することが可能である。
【００３９】
本開示で用いる「分化剤」とは、オリゴデンドロサイト系譜の分化細胞（前駆細胞および最終分化細胞を含む）を産生するために、本発明の培養系で用いる一群の化合物の１つを指す。化合物の作用形態に関しては限定しない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導もしくは補助することにより、特定の表現型を有する細胞の成長を促進することによりもしくは他の細胞の成長を遅らせることにより、または他の薬剤と合わせて未知の機構で作用することにより、分化過程を補助する可能性がある。
【００４０】
特記しない限り、本開示における「セレン」への言及は、溶液中で任意の対イオンを伴う亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）、セレン酸（ＳｅＯ４２−）、またはセレン化物（Ｓｅ２−）を含む、Ｓｅの任意の酸化型を指す。
【００４１】
原型の「霊長動物多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）とは、前胚組織、胚組織、または受精後の任意の時期の胎児組織に由来する多能性細胞であり、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスで奇形腫を形成する能力等の標準技術として公認の試験によると、適切な条件下で３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物である様々な異なった細胞型の子孫を産生し得る特徴を有する。ｐＰＳ細胞の定義には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞に例証される様々な種類の胚細胞が含まれる。ｐＰＳ細胞は、悪性供給源に由来しないことが好ましい。細胞は正倍数体であることが望ましい（が必ずしも必要ではない）。その供給源および培養法に依存して、ｐＰＳ細胞は、人体のすべての異なる細胞型に発達する能力を有するという意味で、全能性であってもなくてもよい。
【００４２】
ｐＰＳ細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその派生物の実質的な割合が、胚起源または成体起源の分化細胞と区別できる未分化細胞の形態学的特徴を示す場合に、「未分化である」と記載される。集団内の未分化細胞のコロニーは、分化した隣接細胞に囲まれていることが多いと理解されている。
【００４３】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、別の種類の細胞と共培養され、第２の種類の細胞が成長できる環境を提供する１つの種類の細胞を表すのに用いられる用語である。ｐＰＳ細胞集団は、分割後にｐＰＳの成長を支持するために新鮮なフィーダー細胞を添加せずに少なくとも１回成長した場合、フィーダー細胞を「本質的に含まない」と称される。
【００４４】
「胚様体」という用語は、ｐＰＳ細胞が単層培養において過剰成長する場合、または懸濁培養で維持される場合に現れる、分化および未分化細胞の凝集体を指す。胚様体は、形態学的基準および免疫細胞化学法により検出可能な細胞マーカーによって識別可能ないくつかの胚葉に典型的に由来する、様々な細胞型の混合物である。
【００４５】
「成長環境」とは、関心対象の細胞がインビトロにおいて増殖、分化、または成熟する環境のことである。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在し得る任意の成長因子または分化誘導因子、および存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基層）が含まれる。
【００４６】
特記しない限り、個々の細胞および細胞集団における表現型マーカーの判定では、細胞は、アイソタイプ対照と比較して、二次免疫細胞化学染色において特異的抗体を用いて実質的により高い染色を示した場合にマーカーに関して「陽性」であると称される。特記しない限り細胞は、この種の免疫細胞化学的解析によりマーカーが抗体で検出不可能である場合に、「陰性」であると称される。
【００４７】
任意の適切な人工的操作手段によりポリヌクレオチドが細胞に導入された場合、または細胞がそのポリヌクレオチドを受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合、その細胞は「遺伝子改変された」、「トランスフェクションされた」、または「 遺伝的に形質転換された」と称される。ポリヌクレオチドは関心対象のタンパク質をコードする転写可能な配列を含む場合が多く、これにより細胞はこのタンパク質を高いレベルで発現することが可能になる。改変した細胞の子孫が同じ改変を有する場合、遺伝的改変は「遺伝性である」と称される。
【００４８】
一般的技術
分子遺伝学および遺伝子工学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ） の現行版に記載されている。分子生物学、タンパク質化学、および抗体技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に見出すことができる。本開示で引用する遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．等の市販業者から入手可能である。
【００４９】
細胞培養法は、一般に、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ． ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＩ．Ｆ． Ｒａｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）、およびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ． Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）の現行版に記載されている。組織培養用の供給品および試薬は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、およびＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ等の市販業者から入手可能である。
【００５０】
本開示に関連する専門的な参考文献には、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第４版、Ｋａｎｄｅｌら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ２０００；ＣＮＳ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ、Ｍ．Ｈ． ＴｕｓｚｙｎｓｋｉおよびＪ．Ｈ． Ｋｏｒｄｏｗｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｎ： Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｉ．Ｂ． ＬｅｖｉｔａｎおよびＬ．Ｋ． Ｋａｃｚｍａｒｅｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ、Ｐ．Ｒ． Ｌａｍｉｎｇら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ、１９９８；Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＭａｔｓａｓおよびＴｓａｃｏｐｏｕｌｏｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ． Ｃｏｒｐ、１９９９；Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＪｗｅｓｓｅｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ ２００１；およびＭａｎ ｏｆ Ｓｔｅｅｌ、Ａｄｒｉａｎ Ｈａｖｉｌｌ、１９９６が含まれる。
【００５１】
幹細胞の供給源
本発明は、様々な種類の幹細胞を用いて実施することができる。本発明の使用に特に適しているのは、胚盤胞等の妊娠後に形成される組織または妊娠期間の任意の時期に採取した胎児組織もしくは胚組織等に由来する霊長動物多能性幹（ｐＰＳ）細胞である。限定されない例は、以下に記載するような胚性幹細胞もしくは胚性生殖細胞の初代培養または樹立株である。本発明の技法を初代胚組織または胎児組織に直接実行し、最初に未分化細胞株を樹立することなく初代胚性細胞から神経系細胞を直接導出することも可能である。
【００５２】
実施例の項に提供する例証は、ヒト胚性幹細胞を用いて行った研究の結果である。しかし、特記しない限り、本発明は任意の脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することが可能である。これには、ヒト、ならびに非ヒト霊長動物および他の非ヒト哺乳動物の多能性幹細胞が含まれる。
【００５３】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長動物組織から単離することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第６，２００，８０６号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ページ以降、１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：３９９、２０００の記載する技法により、ヒト割球から調製することが可能である。ｈＥＳ細胞に相当する細胞型には、国際公開公報第０１／５１６１０号（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説されるような、原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞等のその多能性派生物が含まれる。
【００５４】
１つの方法では、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から透明帯を除去する。１：５０希釈したウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に胚盤胞を３０分間曝露し、次にＤＭＥＭで５分間３回洗浄し、１：５希釈したモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する免疫手術により、内部細胞塊を単離する（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：５０９９、１９７５）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、穏やかにピペッティングして無傷の内部細胞塊（ＩＣＭ）から溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【００５５】
９〜１５日後、１ ｍＭ ＥＤＴＡを添加したカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に曝露することにより、ディスパーゼもしくはトリプシンに曝露することにより、またはマイクロピペットで機械的に解離することにより、内部細胞塊に由来する増殖物を凝集塊に解離し；次に新鮮な培地中でｍＥＦ上に再度プレーティングする。未分化の形態を有して増殖するコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に凝集塊に解離し、再度プレーティングする。ＥＳ様の形態は、細胞質に対して核の比率が明らかに高くかつ顕著な核小体を有する小型のコロニーとして特徴付けられる。次に、得られたＥＳ細胞を短時間トリプシン処理してダルベッコＰＢＳ（２ ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に曝露し、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００ Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）に曝露することにより、またはマイクロピペットで個別にコロニーを選択することにより、１〜２週間ごとに日常的に分割する。凝集塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【００５６】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されているように、始原生殖細胞から調製することができる。
【００５７】
簡潔に説明すると、約８〜１１週間後に採取した生殖隆起を等張緩衝液ですすぎ、０．０５％トリプシン／０．５３ ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム溶液（ＢＲＬ）０．１ ｍＬ中に入れ、＜１ ｍｍ３の塊に切断する。脱凝集した後、細胞をＥＧ増殖培地（Ｄ−グルコース、ＮａＨＣＯ３；１５％ ＥＳ認定ウシ胎仔血清；２ ｍＭグルタミン；１ ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０００〜２０００ Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子；１〜２ ｎｇ／ｍＬ ヒト組換えｂＦＧＦ；および１０μＭフォルスコリン（１０％ ＤＭＳＯ中）を含むＤＭＥＭ）約３．５ ｍＬ中、３７℃で１時間または一晩インキュベートする。
【００５８】
次に細胞をＥＧ増殖培地１〜３ ｍＬに再懸濁し、フィーダー層上にプレーティングする（例えば、５０００ｒａｄのγ−照射で不活性化したＳＴＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５０３）。７〜１０日後に１回目の継代を行い、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、毎日培地を交換して培養するが、典型的にこれは７〜３０日後または１〜４継代後である。
【００５９】
他の幹細胞
オリゴデンドロサイトを作製するための出発材料として有用なｐＰＳまたは胚性幹細胞を産生するために、本発明の実施はヒト胚または胚盤胞を脱凝集することを決して必要としない。ｈＥＳ細胞は、公共の受託所（例えば、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国、ウィスコンシン州、マディソン、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、バージニア州、マナッサス）から入手可能な樹立株から得ることができる。米国特許公報第２００３−０１１３９１０Ａ１号は、胚または胎児組織を用いずに導出された多能性幹細胞について報告している。多能性表現型を誘導する因子を使用することにより、臍帯血または他の前駆細胞をｐＰＳ細胞に再プログラミングすることも可能であると考えられる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ １１３：６４３、２００３；Ｍｉｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ １１３：６３１、２００３）。適切な条件下において、別の方法でｐＰＳまたはｈＥＳ細胞の定義に見合う任意の細胞を、本発明によりオリゴデンドロサイト系譜細胞の導出に用いることができる。
【００６０】
本開示で提供する技法のいくつかを用いて、外胚葉細胞、および胎児組織もしくは成体組織から得られた神経系細胞、または神系前駆細胞等のより拘束された細胞型の分化を維持または促進することも可能である。そのような細胞を得る方法は、例えば、米国特許第５，８５２，８３２号；第５，６５４，１８３号；第５，８４９，５５３号；および第５，９６８，８２９号；ならびに国際公開公報第９８／５０５２６号および国際公開公報第９９／０１１５９号に記載されている。
【００６１】
未分化状態でのｐＰＳ細胞の増殖
ｐＰＳ細胞は、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を用いて培養し、連続して増殖させることが可能である。血清を含む例示的なＥＳ培地は、８０％ ＤＭＥＭ（ノックアウトＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ等）、２０％の既知組成ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替品（国際公開公報第９８／３０６７９号）のいずれか、１％非必須アミノ酸、１ ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１ ｍＭβ−メルカプトエタノールから作製する。使用する直前に、ヒトｂＦＧＦを４ ｎｇ／ｍＬになるように添加する（国際公開公報第９９／２０７４１号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）
【００６２】
分化を阻害する環境において培養することによってのみ、ｐＰＳ細胞を未分化状態で拡大することができる。慣例的に、ｐＰＳ細胞は、マウスの胚組織または胎児組織に由来するフィーダー細胞層上で培養する。増殖を阻害するがｐＰＳ細胞を支持する因子の合成はできるように照射した照射ｍＥＦを、培養プレートにウェル当たり３７５，０００個プレーティングし、プレーティングしてから５時間〜４日後に使用する（米国特許第６，２００，８０６号）。最近になって、ヒト胚性幹細胞の増殖を分化させることなく支持するヒトフィーダー細胞が開発された（国際公開公報第０１／５１６１６号：米国特許出願第０９／８８８，３０９号；Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。ｈＥＳ細胞を分化させ、所望の活性を有する細胞を選択し、次にテロメラーゼ逆転写酵素を発現するようにトランスフェクションして不死化することにより、細胞が得られる。
【００６３】
ｐＰＳ細胞は、フィーダー細胞なしでも未分化状態で維持することができる。無フィーダー培養の環境には、適切な培養基層、特にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）またはラミニン等の細胞外マトリックスが含まれる。ｐＰＳ細胞は、＞１５，０００細胞ｃｍ−２（最適には９０，０００ ｃｍ−２〜１７０，０００ ｃｍ−２）でプレーティングする。無フィーダー培養物は、分化させることなく細胞の増殖を支持する因子を含む栄養培地により支持される。そのような因子は、照射した（約４，０００ｒａｄ）初代マウス胚線維芽細胞、テロメル化（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）したマウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞由来のヒトフィーダー細胞等のそのような因子を分泌する細胞と共に培地を培養することにより、培地中に導入され得る。フィーダーを、２０％ 血清代替品および４〜８ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＫＯ ＤＭＥＭ等の無血清培地で約５〜６ ｘ １０４ ｃｍ−２の密度でプレーティングすることにより、培地を馴化することができる。１〜２日間馴化した培地にさらにｂＦＧＦを添加し、これを用いてｐＰＳ細胞培養物を１〜２日間支持する。無フィーダー培養法の特徴は、国際公開公報第９９／２０７４１号および国際公開公報第０１／５１６１６号；ならびにＸｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：９７１、２００１においてさらに考察されている。
【００６４】
ＥＳ細胞は顕微鏡下で、高い核／細胞質比、顕著な核小体、および細胞の接合部が識別困難な小型のコロニー形成を伴って見える。霊長動物ＥＳ細胞は典型的に、時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３および４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称する抗体を用いて検出できるマーカー（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８）、ならびにテロメラーゼ活性を発現する。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化により、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現が消失し、未分化ｈＥＧ細胞においても認められるＳＳＥＡ−１の発現が増加する。
【００６５】
幹細胞からのオリゴデンドロサイトの作製
本発明のオリゴデンドロサイト系譜細胞は、所望の表現型を有する細胞を濃縮および拡大する特殊な成長環境において幹細胞を培養することによって得られる。成長環境によって、オリゴデンドロサイト系譜への分化が特異的に方向づけられ得る、所望の細胞の成長が促進され得る、他の細胞型の成長が阻害され得る、またはこれらの活性の任意の組み合わせが起こり得る。
【００６６】
本項は、本発明のオリゴデンドロサイトを得るためにとり得るいくつかのアプローチを当業者に説明する指針である。別に規定する場合を除き、過程の根本的な機構に関する説明は、さらなる詳細を支援するための作業仮説としてのみ提供する。使用者が仮説を理解する必要はなく、また本発明を実施するためにこれを仮説に合わせる必要もない。多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトを作製することができ、手順のさらなる適合化を行うことができ、本開示に記載する新規産物を得るために別法を見出すことが可能であることを、本出願者らがこれから実証する。
【００６７】
ｐＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを産生する段階には、ａ） オリゴデンドロサイトを産生するように拘束された細胞の集団を得る段階；ｂ） オリゴデンドロサイト系譜細胞の拡大；およびｃ） 細胞の後期オリゴデンドロサイトへのさらなる成熟が含まれ得る。
【００６８】
幹細胞のオリゴデンドロサイト系譜への方向付け
オリゴデンドロサイトを産生する過程は、典型的に２つの局面、起源幹細胞集団に分化を引き起こす段階；およびオリゴデンドロサイト系譜細胞を主要細胞型にする段階を含む。これらの事象は、経時的にまたは同時に起こり得る。
【００６９】
例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過剰成長により、または胚様体の形成を可能にする低接着性特性を備えた基層を有する培養容器中でｐＰＳ細胞を懸濁状態で培養することにより、ｐＰＳ細胞に胚様体または凝集体の形成を引き起こすことによって分化の過程を誘導することができる。例示的な方法では、ｈＥＳ細胞のコンフルエントな単層培養物を回収し、非接着性細胞培養プレートにプレーティングし、細胞を懸濁状態に保ち、定期的に栄養培地でフィードする。
【００７０】
別法としてまたはさらに加えて、細胞が未分化表現型を維持するのを妨げる特定の因子と共に培養することによって、分化過程を開始することができる。最初の分化因子は分化をオリゴデンドロサイト系譜に限定する必要はないが、分化集団内の細胞型の範囲内にオリゴデンドロサイトまたはその前駆細胞を含めるべきである。この種の例示的な成長因子は、レチノイド受容体に結合する、または細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路を活性化するリガンドである。典型的に線維芽細胞成長因子（または次項に記載するマイトジェン）等のマイトジェンを培地に含めて、分化過程の進行中に増殖を促進する。
【００７１】
ある段階で、培養物をより特異的にオリゴデンドロサイト系譜に方向づけることができる。これは、オリゴデンドロサイトの成長をより特異的に促進する因子を培養物に含めることによって行うことができる。例示的なオリゴデンドロサイト分化因子は、約４０ ｎｇ／ｍｌのＴ３（３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン）およびＴ４（Ｌ−チロキシン）によって例証される、細胞表面上または核内の甲状腺ホルモン受容体に結合するリガンドおよび抗体である。甲状腺ホルモンは、レチノイン酸受容体の発現を増加させる、さもなければオリゴデンドロサイト系譜の細胞への分化を促進すると考えられている。
【００７２】
別のオリゴデンドロサイト分化因子は、分化しているオリゴデンドロサイトにおいてミエリン遺伝子の上方制御に関与すると考えられている抗酸化剤であるセレンである。他の候補分化因子は、ビタミンＥのような他の抗酸化剤、ならびにチオレドキシン還元酵素およびヨードチロニン脱ヨウ素酵素のファミリー等のセレンが補因子である酵素の活性を増加させる因子である。セレンは、亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）の形で少なくとも２０ ｎｇ／ｍＬまたは１００ ｎｇ／ｍＬの比較的高い濃度で培地に含めた場合に、特に効果的である。他の候補分化因子または補因子には、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれる。神経組織によって産生されるオリゴデンドロサイト分化因子の組み合わせも意図するが、これは、胚性ＣＤ−１マウス脳および組織または細胞株から得られる因子含有抽出物によって例証される、選択された解離した神経組織または細胞株と共培養することによって産生され得る。
【００７３】
これらの技法をすべて組み合わせることにより：マイトジェン、レチノイン酸等の一般的な分化因子、ならびに甲状腺ホルモンおよび亜セレン酸ナトリウムのような特異的分化因子の存在下で胚様体を形成させることによって分化を開始することにより、驚くほど効率的にオリゴデンドロサイトを産生できることを見出した。実施例の項に提供する限定されない例証には、これらの因子、ならびに栄養補充物、インスリン等の成長因子、および抗生物質等の他の標準的な培養成分が含まれる。分化の開始時に適切な組み合わせの分化因子を含めることによって、培養物はオリゴデンドロサイト系譜により拘束された細胞を迅速に産生することになる。
【００７４】
オリゴデンドロサイト系譜細胞の拡大
所望の目的のために細胞を用いる以前の任意の段階として、本発明の使用者は、オリゴデンドロサイト系譜細胞を培養において増殖させることによりこの細胞の数を増やしてもよい。
【００７５】
これは、１つまたは複数のマイトジェンの存在下で、細胞を栄養培地中で培養することによって達成できる。ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）およびＦＧＦ−４等の線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーが例示的である。上皮成長因子（ＥＧＦ）、機能的相同体、およびＥＧＦ受容体に結合する他の因子も例示的である。他の候補成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、およびフォルスコリン等のサイクリックＡＭＰレベルを上昇させる因子である。
【００７６】
そのようなマイトジェンの存在下では、レチノイン酸等の分化因子イニシエーターを取り除くことができる。マイトジェンによって細胞は非特異的に成長することから、オリゴデンドロサイト系譜細胞の優先的な成長を維持するために、培地中にオリゴデンドロサイト特異的分化因子を含め続けることが有利な場合が多い。培養液中のマイトジェンのバランスを調整することによって、オリゴデンドロサイトの優先的な成長を支持することも可能である。例えば、ＥＧＦは外胚葉を維持するが線維芽細胞を維持せず、線維芽細胞はＦＧＦが存在しなくなれば死滅し得る。ＦＧＦに厳密に依存する細胞が除去されたならば、培養液にＦＧＦを再度添加して所望の細胞型の成長を促進できる。
【００７７】
細胞の調製における別の任意の段階として、本発明の使用者は、培養物中に存在し得る他の細胞型からオリゴデンドロサイト系譜細胞を分離してもよい。抗体もしくはレクチンを介した接着または細胞表面マーカーについてのソーティング等の、様々な分離手順を意図する。ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方に関する適切な表現型マーカーを以下に記載する。ＵＤＰ−ガラクトース・セラミド・ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＧ２プロテオグリカン、ＮＣＡＭ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、または様々なミエリン関連タンパク質のプロモーター等の組織特異的プロモーターを、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子に連結して構築したプロモーター−レポータープラスミドを用いた、オリゴデンドロサイト系譜細胞のソーティングも意図する。
【００７８】
細胞を適切な基層に接着させることによる単純な様式で、オリゴデンドロサイト分化因子の存在下で増殖する他の細胞からオリゴデンドロサイト系譜細胞を分離することができることを見出した。オリゴデンドロサイトは細胞特異的糖質および細胞表面受容体を有し、複合リガンドに優先的に接着することになる。詳細には、ラミニン、ゼラチン、または室温でゲル化し再構成された基底膜を形成するエンゲルブレス・ホルム・スワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）腫瘍細胞に由来する市販の細胞外マトリックス調製品マトリゲル（登録商標）等の、ある種の基底膜成分への接着によって、オリゴデンドロサイトを分離することができる（実施例１）。オリゴデンドロサイトがマトリックスに接着したら（数時間〜数日）、他の細胞型を洗浄除去し、例えば短時間トリプシン消化することによって接着細胞を回収することができる。この手順は、所望の細胞型の濃縮に加えて、さらなる操作を容易にするために細胞の大きな凝集塊を解離する利点を有する。
【００７９】
分離手順の効果は、以下に記載するマーカーに関して濃縮を測定することによって判定することができる。このような方法でオリゴデンドロサイトを精製したならば、すでに記載したようにマイトジェンの存在下でこの細胞をさらに拡大する、以下の項に記載するように成熟させる、または最終用途に適した方法で調製することができる。
【００８０】
さらなる成熟
必要に応じて、本発明の細胞を、複製段階を超えて機能的表現型にさらに成熟させることができる。これを行うことで、前駆細胞の可能性を特徴付ける、または治療目的もしくは薬剤スクリーニング目的のために最終段階の細胞を得ることができる。
【００８１】
成熟は、前駆細胞表現型のさらなる増殖を阻害する様式で成長条件を変化させることによって達成される。例えば、成熟表現型の出現を促進するポリ−Ｌ−リジン等の基層上に細胞をプレーティングすることができる。別法としてまたはさらに加えて、細胞の拡大に用いた１つまたは複数の成長因子を除去する。繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）およびＣＮＴＦ受容体の他のアゴニスト等の成熟を亢進する因子を、成熟培地中に含めることができる。細胞が所望の成熟度に達したならば、培養液から細胞を回収し（例えば、トリプシンまたはコラーゲンを用いて）、解析または最終的な使用のために調製することができる。
【００８２】
分化細胞の特徴
多くの表現型基準に従って、細胞を特徴付けることができる。基準には、形態学的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出または定量、インビトロで測定可能な機能的基準、および宿主動物に注入した際の反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
表現型マーカー
オリゴデンドロサイトに特有の表現型マーカーを発現するかどうかに従って、本発明の分化細胞を特徴付けることができる。細胞集団の成熟度に従って存在し得るオリゴデンドロサイト細胞の古典的な免疫細胞化学的マーカーは、以下の通りである：
・ＮＧ２、マクロファージおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞によって発現されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン
・ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、拘束されたオリゴデンドロサイトのマーカー
・ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、成熟ミエリンおよびミエリン産生細胞のマーカー。
【００８４】
オリゴデンドロサイト系譜細胞によって発現される他の有用なマーカーには、以下が含まれる：
・ＰＤＧＦＲα、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、および他の細胞型によって発現されるＰＤＧＦの膜受容体
・ＴＲα１、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン、および他の細胞型によって発現される甲状腺ホルモンの核受容体
・ミエリンプロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトおよびグリア前駆細胞で発現されるミエリンの成分
・Ｏ４抗体によって規定されるエピトープ、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびそれらの前駆細胞のマーカー
・ビメンチン、アストロサイト前駆細胞を特徴付ける線維芽細胞型フィラメントタンパク質（オリゴデンドロサイトでは陰性である場合が多い）
・神経膠繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、アストロサイトのマーカー（オリゴデンドロサイトでは陰性）
・Ａ２Ｂ５、ＩＩ型アストロサイト、グリア前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、および膵臓β細胞で発現されるエピトープ
・オリゴデンドロサイトおよびその突起を染色し、脊髄および小脳両方の有髄化軸索と一致する、ＲＩＰ抗体によって認識されるエピトープ。
【００８５】
オリゴデンドロサイト分化の経路における様々な時点で発現される転写因子には、以下が含まれる：
・Ｏｌｉｇ１、オリゴ前駆細胞、運動ニューロン前駆細胞、および腎細胞によって発現されるヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）ファミリー転写因子
・Ｏｌｉｇ２、オリゴ前駆細胞、運動ニューロン前駆細胞、および松果体によって発現される別のＨＬＨファミリー転写因子
・Ｓｏｘ１０、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、神経堤、蝸牛、前立腺、およびメラノサイトによって発現されるＳｏｘファミリー転写因子
・Ｎｋｘ２．２、オリゴ前駆細胞、オリゴデンドロサイト、ニューロン前駆細胞、膵臓α細胞および膵臓β細胞によって発現されるＨｏｘファミリー転写因子
・Ｐａｘ６、オリゴ前駆細胞、ニューロン前駆細胞、膵αおよびβ細胞、水晶体網膜、下垂体、肝臓、および脾臓によって発現されるＨＬＨファミリー転写因子。
【００８６】
他の細胞型の有用なマーカーには以下が含まれる：
・ニューロン核抗原（ＮｅｕＮ）、ニューロン成熟のマーカー（通常、オリゴデンドロサイト系譜細胞では陰性）
・クラスＩＩＩβチューブリン（ＴｕＪ１）、神経細胞の別のマーカー
・微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ＣＮＳ細胞のマーカー（おそらく陽性）
・ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、未分化ｐＰＳ細胞のマーカー（オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞では陰性）。
【００８７】
組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフロー免疫細胞化学法、または細胞内もしくは細胞表面マーカーについての免疫組織化学法（例えば、固定化細胞または組織切片）等の、任意の適切な免疫学的技法を用いて検出することができる。フローサイトメトリー解析の詳細な方法は、Ｇａｌｌａｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１７４０、２０００に記載されている。細胞表面抗原の発現は、標準的な免疫細胞化学法またはフローサイトメトリーアッセイ法において、選択的に細胞を固定化した後、および選択的に標識二次抗体または標識を増幅する他のコンジュゲートを用いて、有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合した場合に陽性と定義される。
【００８８】
組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット解析法、ドットブロットハイブリダイゼーション解析法により、または標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により、ｍＲＮＡレベルで検出することもできる。さらなる詳細については、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。特定マーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベースから入手可能である。例えば、ミエリンガラクトリピド生合成酵素ＵＤＰ−ガラクトース・セラミド・ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００６６５１）は、ＧａｌＣの合成の最終段階を触媒する酵素である。
【００８９】
研究または治療における使用を容易にするために、集団内のオリゴデンドロサイトまたはその前駆細胞の特徴を有する細胞の割合を最大にすることが有利である場合が多い。以下の実施例の項で説明するように、上記のようなオリゴデンドロサイトまたは成熟細胞に特有の表現型マーカーのいずれかの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上に関して陽性であると同定されるそのような細胞（または両方の混合物）が少なくとも約２０％から約６０％、８０％、９０％、９５％、さらに９８％を超えるまでのいずれかの細胞集団を得ることが可能である。
【００９０】
神経機能の再構成に関連する治療的応用では、細胞集団が他の細胞型 − 詳細には未分化ｐＰＳ細胞および非外胚葉系譜の細胞を形成する能力を最小限に抑えることが望ましい場合が多い。用途に応じて、ニューロン系譜およびその拘束前駆細胞、アストロサイト系譜およびその拘束前駆細胞、ならびにグリア細胞またはすべての種類の神経系細胞の共通の前駆細胞の割合を最小限に抑えることが有利である可能性もある。特定の態様では、本発明によるオリゴデンドロサイト集団は、これらの他の細胞型による混入を約１％、０．２％、または０．０５％未満しか有さない。
【００９１】
当業者は、オリゴデンドロサイト系譜細胞に特有の形態学的特徴をすでに理解していると考えられる。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、中心体から反対極に２つの突起を伸長した双極の形状をとる場合がある。この細胞はまた、同様のマーカーおよびオリゴデンドロサイトの他の特徴の多くを有する、比較的扁平な細胞の形態をとる場合もある。この細胞は、比較的遅い成長速度ならびに細胞外マトリックスおよび可溶性因子への依存によって、他の細胞（線維芽細胞のような）から識別することができる。双極細胞と扁平細胞は、扁平細胞の優位性を促進する成長因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等）の有無により、相互変換が可能である。本発明の前駆細胞集団は、少なくとも約２０％、４０％。６０％、８０％、またはそれ以上の双極細胞または扁平細胞表現型を含み得る。
【００９２】
より成熟したオリゴデンドロサイトへの分化に際して、突起の数および複雑度は典型的に増加する。突起はそれらの間にミエリン皮膜を有するようであり、個々の軸索の周りを覆って軸索に沿った神経伝達を促進するミエリン鞘を形成する。
【００９３】
遺伝子型特性
単離したｐＰＳ細胞またはｐＰＳ細胞の樹立株に由来する場合、本発明のオリゴデンドロサイトは起源細胞または細胞株の子孫であると特徴付けられ得る。したがって、オリゴデンドロサイトはその由来の元となった細胞と同じゲノムを有することになる。このことは、任意の核型変化のほかに、ｐＰＳ細胞とオリゴデンドロサイトとの間で染色体ＤＮＡが９０％を超えて同一であることを意味する。導入遺伝子を導入する、または内因性遺伝子をノックアウトするために組換え法により処理したオリゴデンドロサイトは、未操作の遺伝子要素はすべて保存されているため、依然として由来の元となった株と同じゲノムを有すると見なされる。
【００９４】
オリゴデンドロサイトおよびｐＰＳ細胞は、標準的な遺伝子フィンガープリント技法により同じゲノムを有することが同定され得る。オリゴデンドロサイトが、未分化株から正常な有糸分裂の過程を経て得られる場合にも、同じゲノムを所有することが示され得る。
【００９５】
特定の産業用途において、この特徴は本発明のオリゴデンドロサイトの貴重な特性である。詳細には、ｐＰＳ細胞に増殖を引き起こし、細分し、要求に応じてさらなるオリゴデンドロサイトに分化させることができるため、起源ｐＰＳ細胞が利用できることによって遺伝的に一致したオリゴデンドロサイトがさらにまた供給される。さらに、ｐＰＳ細胞を他の治療的に重要な系譜に分化させることもできる。例えば、ｐＰＳ細胞を免疫寛容細胞集団に分化させることが可能であり、この細胞集団は対象とするレシピエントを対応するオリゴデンドロサイトを用いた移植に対して寛容にするのに役立ち得る（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４３４３４、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）
【００９６】
本明細書に記載する技法により、分化の前または後に細胞を拡大することによって、同じゲノムを共有するオリゴデンドロサイト系譜細胞の大きな集団の産生が可能となる。理論的に、１０８、１０１０、または１０１２個の細胞の集団が可能である。そのような大きな集団は、通常、さらなる培養、薬剤スクリーニング、または治療投与に適した個々の容器に分割する。
【００９７】
本発明の特定の態様は、グリア細胞またはオリゴデンドロサイトの特徴を有する分化細胞と組み合わせた起源細胞（未分化ｐＰＳ細胞株または中間の集団等）を含む。２つの集団は同じ容器中に存在しても、同じ施設内の別の容器に存在しても、または２つの別の場所に存在してもよい。すでに記載したように未分化細胞の培養物にオリゴデンドロサイト系譜細胞への分化を全体として引き起こす場合のように、未分化細胞および分化細胞は同時に存在しても別の時点で存在してもよい。
【００９８】
機能特性
品質管理の目的で、本発明の分化細胞の特性を機能的基準によって特徴付けることが望ましい場合が多い。目的とする最終的な用途により、異なる機能が異なる相対的関心となり得る。例えば、組織培養において神経組織を再ミエリン化する能力、インビボで脱髄が誘導された部位を修復する能力、または損傷した対象において神経機能を回復する能力について、細胞を評価することができる。これらの特性を判定するための、以下の限定されない例証を含む多くの実験モデルが存在する。
【００９９】
１． 共培養におけるインビトロ髄鞘形成
２〜３ヶ月齢雌ラットから腰椎および頚椎後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを回収することにより、成体ＤＲＧ培養物を調製する。細胞を粉砕し、遠心分離し、ｍＬ当たり約１００，０００個の生存ニューロンでＤＭＥＭ Ｆ１２培地に再懸濁し、ラミニンコーティングした皿にプレーティングして４週間培養する。約２．５ ｘ １０４個のオリゴデンドロサイト系譜細胞を添加し、毎日フィードしながらさらに４週間培養することにより、インビトロ髄鞘形成を行う。ヒトオリゴデンドロサイトによるげっ歯類軸索の髄鞘形成は、ＴａｒｇｅｔおよびＢｌａｋｅｍｏｒｅ、Ｅｙｅ ８（ｐａｒｔ２）：２３８、１９９４に例証されている。
【０１００】
オリゴデンドロサイト系譜細胞がミエリンを形成する能力を判定するため、共培養物を４％パラフォルムアルデヒドで一晩固定し、ＧａｌＣについて染色する。神経節に隣接した視野を選択し、視野当たりのミエリン部分の数をスコアリングする。ネスチン、βチューブリンＩＩＩ、ＧＦＡＰ、ＣＮＰ、ＧａｌＣ、Ｋｉ−６７抗原、ＮｅｕＮ、または神経フィラメント７０等のマーカーについて低密度培養物を染色することによって、分化の潜在能力を判定する。
【０１０１】
培養におけるＤＲＧの髄鞘形成の証拠は、一般的にオリゴデンドロサイトの生物学的有効性と関連がある。細胞がインビボで生存し髄鞘形成または軸索の再成長を亢進する能力は、適切な動物モデルを用いてより一層得られる。これに反して、共培養における髄鞘形成は培養の条件に依存することになり、否定的な結果によってインビボにおける有効性は排除されない。インビトロ試験の予測値は、例えばＩＧＦまたはＮＴ−３のようなニューロトロフィン等の髄鞘形成を亢進すると考えられている因子を添加することにより、培養条件を調製することによって、改善することができる。
【０１０２】
２． 慢性脱髄モデル
成体ラット脊柱において、慢性脱髄の領域を誘導することができる（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：７５２９、１９９９）。鉛遮蔽を用いてＴ９を中心に、２ ｃｍを超える距離で脊髄を４０ ＧのＸ線照射に曝露するが、これにより曝露細胞のＤＮＡにニックが導入され、細胞分裂している細胞が死滅する。２日後に、Ｔ９においてエチジウムブロマイドを脊髄内に直接注入する。エチジウムブロマイドはこれに曝露した細胞を死滅させるインターカレート剤であり、これによって慢性脱髄の無細胞領域ならびに脊柱領域の約６０％を通して生存オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトがない状態が提供される。
【０１０３】
３日後、ラットの脱髄部位にオリゴデンドロサイト系譜細胞の移植を行う。任意で、４８時間前に培地にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加して細胞を予め標識することができる。第一に、細胞を前駆細胞約３０個の凝集塊として調製し、μＬ当たり約６０，０００個の細胞密度に濃縮することができる。外径約８０ ｕｍのガラスマイクロピペットを用いて、約１０分を上回る時間をかけて細胞１μＬを損傷部位に投与する。約２〜４週間後、組織試料を調製し、１ ｍｍの横軸ブロックになるように樹脂またはクリオスタット切片を作製する。
【０１０４】
冠状面の切片をトルイジンブルーで染色し、一般病理、再ミエリン化の証拠、および細胞形態について解析する。誘導した部位は無細胞であるため、移植後に存在する細胞は投与した細胞に由来する。クリオスタット切片を、ＧＦＡＰ（アストロサイト）、ＣＮＰ（オリゴデンドロサイト）、ＲＩＰ（オリゴデンドロサイト）、またはＮｅｕＮ（ニューロン）等の関連する細胞型のマーカーについて染色することができる。超薄切片を、ミエリン層板の数および細胞の超微細構造について電子顕微鏡により解析することもできる。脱髄部位にわたる移植細胞の再分布、および成熟有髄化細胞への分化を判定することができる。約２５％、５０％、または７５％のレベルでの脱髄した軸索に占める再ミエリン化が、生物学的有効性の増加の証拠である。
【０１０５】
オリゴデンドロサイト系譜細胞の治療能力は、脱髄の先天性モデルにおいて試験することも可能である。ミエリン塩基性タンパク質における変異または欠陥を含む樹立モデルには、シバラー変異マウス（Ｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ ４２：１４９、１９８５）およびロングエバンス・シェーカー（Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ ｓｈａｋｅｒ）ラット（Ｋｗｉｅｃｉｅｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２７：５８１、１９８９；Ｄｅｌａｎｅｙら、Ｌａｂ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ４５：５４７、１９９５）が含まれる。脳室内または大槽移植により（Ｍｉｔｏｍｅら、Ｂｒａｉｎ １３４：２１４７、２００１）、または脊髄への直接投与により（Ｌｉｕ、ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：６１２６、２０００）、再構築を試験することができる。ＭＢＰにおける変異または欠陥を伴うモデルは通常は適切な髄鞘形成の能力がなく、結果として神経欠損を被るため、これらのモデルでの緻密なミエリンの形成は投与細胞に直接起因する。
【０１０６】
３． 脊髄損傷モデル
ＳＣＩモデルは、挫傷および背側片側切断を含む。挫傷では、適切な脊髄損傷装置を用いて、脊髄層を２３ミリ秒を上回る時間をかけて約０．９ ｍｍ除去する（中程度の損傷）。片側切断損傷では、定位的なマニピュレーターを用いて先のとがった手術用メスで脊髄の背側の半分を切断する。どちらの手順とも、その後適切な術後処置を行う。
【０１０７】
移植した細胞の遊走を促進しかつミエリン関連成長抑制物質を除去するため、任意で脊髄もまた脱髄する（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． １５１：３０３、１９９８）。脊柱管の中央かつ軸索損傷部位の後方に２ ｍｍの孔を作製する。露出した脊髄に、リン酸緩衝食塩水に溶解した３３％モルモット補体（Ｈａｒｌａｎ ＳｅｒａＬａｂ）で１：２に希釈したポリクローナル抗ＧａｌＣ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）約４μＬを注入する。
【０１０８】
損傷から約２４時間後に、ガラスマイクロピペットを通して動物にオリゴデンドロサイト系譜細胞を移植する。あるいは、１〜３ヶ月間治療を保留することにより、慢性損傷モデルを作製することができる。細胞を用いて処置した後、ビデオテープに機能的反応を記録し、臨床的改善の証拠を得るために定期的にモニターすることができる。例えば、ＢＢＢ尺度、関節運動に基づいた２１ポイント尺度、体重支持、四肢の協調、および他の特性を用いて、地上歩行を定量化することができる（実施例２）。
【０１０９】
組織学的精密検査をするため、ビオチン標識コレラ毒素βサブユニット（ＣＴＢ、坐骨神経の両側に０．１％を４μＬ注入）またはビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ、感覚運動皮質に１０％を１０μＬ注入）等のトレーサーを動物に予め注射することができる。約２週間後、脱髄モデルでのように組織切片を調製し、移植した細胞の位置および再ミエリン化の証拠について検討するが、再ミエリン化は形態学的基準によって正常な髄鞘形成または部分的脱髄と識別可能である。特徴的な神経突起の成長円錐の証拠を得るために、注射したトレーサーで標識した軸索についても切片を解析する。軸索再生の免疫化学的証拠は、ＲＴ９７抗原（神経フィラメントのマーカー）、セロトニン（５ＨＴ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）等のニューロンマーカーについて染色することによって評価することができる。
【０１１０】
オリゴデンドロサイトの遺伝子改変
本発明の特定のオリゴデンドロサイト前駆細胞集団は、実質的な増殖能を有する。必要に応じて、内因性遺伝子からの転写を増加させることによって、または導入遺伝子を導入することによって、細胞内ののテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることにより複製能をさらに亢進することができる。特に適切なのは、国際公開公報第９８／１４５９２号に提供されているヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）の触媒成分である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３４９、１９９８、およびＪｉａｎｇら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２１：１１１、１９９９に記載されている。
【０１１１】
未分化ｐＰＳ細胞においてテロメラーゼ発現を増加させることができ、その後本発明に従ってオリゴデンドロサイトに分化させることができる。あるいは、ｐＰＳ細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させ、その後トランスフェクションしてＴＥＲＴ発現を増加させることもできる。遺伝子改変細胞は、標準的な方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法、テロメラーゼ活性（ＴＲＡＰアッセイ法）、ＴＥＲＴの免疫細胞化学染色、または複製能により、ＴＥＲＴの発現について評価することができる。用途によっては、ｍｙｃ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、またはＭＯＴ−２をコードするＤＮＡで細胞を形質転換する等の、細胞を不死化する他の方法もまた意図している（米国特許第５，８６９，２４３号、国際公開公報第９７／３２９７２号、および国際公開公報第０１／２３５５５号）。
【０１１２】
必要に応じて、本発明の細胞を調製もしくはさらに処理し、インビトロで未分化細胞を除去すること、またはインビボで復帰細胞を防ぐことができる。集団から未分化幹細胞を減少させる１つの方法は、エフェクター遺伝子が、ＴＥＲＴプロモーターまたはＯＣＴ−４プロモーター等の未分化細胞において優先的な発現を引き起こすプロモーターの制御下にあるベクターを、集団にトランスフェクションすることである。エフェクター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質等のセルソーティング導くレポーターであってよい。エフェクターは、例えば毒素またはカスパーゼ等のアポトーシスの介在物質をコードし、細胞に対して直接溶解性であってもよい（Ｓｈｉｎｏｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：７３９， ２０００）。エフェクター遺伝子は、抗体またはプロドラッグ等の外部薬剤の毒素効果に対して細胞を感受性にする効果を有してもよい。発現する細胞をガンシクロビルに対して感受性にする単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が例示的である（米国特許第６，５７６，４６４ Ｂ１号）。あるいは、エフェクターは、未分化表現型に復帰する任意の細胞をインビボで天然抗体に感受性にする外来決定因子を、細胞表面に発現させてもよい（Ｕ．Ｓ． ２００３−００３２１８７ Ａ１）。
【０１１３】
本発明の細胞はまた、組織再生に関与する能力、または治療する対象に治療遺伝子を送達する能力を増強するために、遺伝子改変することも可能である。所望の遺伝子をコードする既知の配列を用いてベクターを設計し、構成的（ＣＭＶプロモーター等）またはオリゴデンドロサイト系譜細胞の細胞において特異的（ミエリン塩基性タンパク質のプロモーター等）に活性のあるプロモーターに機能的に連結する。この戦略に従って、オリゴデンドロサイトの成長を亢進する、再ミエリン化を活性化する、または軸索の再生を促進するような、様々な導入遺伝子を発現させることができる。神経成長因子をコードする遺伝子が例示的である（米国特許第５，８８５，５８４号および第６，２６８，３４０号）。
【０１１４】
研究および臨床治療におけるオリゴデンドロサイトの使用
本発明は、様々な重要な研究、開発、および商業目的のために、多数のオリゴデンドロサイトを産生する方法を提供する。
【０１１５】
本発明の細胞を用いて、他の系譜の細胞で優先的に発現されるｃＤＮＡが比較的混入していないｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。本発明の分化細胞を用いて、標準的な方法に従い、オリゴデンドロサイトおよびその派生物のマーカーに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製することも可能である。
【０１１６】
特に関心が持たれるのは、薬剤開発および臨床治療を目的とした本発明の組成物の使用である。
【０１１７】
薬剤スクリーニング
本発明の細胞を用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞および成熟オリゴデンドロサイト両方の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）または環境条件（培養環境または操作等）をスクリーニングすることができる。
【０１１８】
一例では、ｐＰＳ細胞（未分化または分化パラダイムに向けて起動した）を用いて、オリゴデンドロサイトへの成熟を促進する因子、または長期培養におけるオリゴデンドロサイトの増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、別のウェル内の細胞に候補成熟因子または成長因子を添加し、さらなる培養および細胞用途の所望の基準に従って生じる任意の表現型変化を判断することにより、それら因子を試験する。これにより、ｐＰＳ由来オリゴデンドロサイトばかりでなく初代神経組織から単離したオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞に関しても、導出および培養法の改良がもたらされ得る。
【０１１９】
本発明の他のスクリーニング法は、オリゴデンドロサイトの成長、発達、または毒性に及ぼす潜在的副作用についての薬学的化合物の試験に関する。この種のスクリーニングは、化合物がオリゴデンドロサイト自体への薬学的効果を有するように設計される場合ばかりでなく、他所での主要な薬学的効果のために設計された化合物のオリゴデンドロサイトに関連する副作用を試験するためにも適している。
【０１２０】
他のスクリーニング法は、軸索を有髄化する役割におけるオリゴデンドロサイト活性に影響を及ぼす可能性を有する小分子薬剤の効果を測定するための、オリゴデンドロサイトの使用に関する。この目的のため、細胞をインビトロで試験化合物と混合することができ、ミエリンに関連する活性に及ぼす化合物の効果を判定する − 例えば、ミエリン塩基性タンパク質等のミエリン関連成分の発現；組織学的に検出可能なミエリン鞘の形成；および神経細胞との共培養において隣接する軸索を有髄化する能力。
【０１２１】
薬剤スクリーニングの一般原理に関しては、当業者には、米国特許第５，０３０，０１５号および教科書Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般に本発明の分化細胞を、単独または他の薬剤との組み合わせのどちらかで、候補化合物と混合することを伴う。研究者は、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または機能的活性の任意の変化を判断し（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、化合物の効果を観察した変化と関連づける。
【０１２２】
臨床治療におけるオリゴデンドロサイト
本発明は、治療を必要とする患者において神経機能を保持または回復するための、オリゴデンドロサイト前駆細胞およびその派生物の使用を提供する。特に、神経組織を再ミエリン化するため、またはさもなければ神経ネットワークの維持もしくは再生を支持するために、本発明の細胞を投与することができる。いかなる限定も意味することなく、投与した細胞は、すでに所定の位置にあるニューロンの機能を安定化するもしくは改善する効果を有する、またはニューロンが相互にもしくはそれが制御する組織と新たな連結を形成するのを支持する可能性がある。
【０１２３】
薬学的組成物の性質は、部分的には治療する病態に依存する。ある症例では、優れた複製能および操作に必要な回復力を有する前駆細胞（ＮＰ２またはＧａｌＣに関して陽性）で組成物を製剤化することが適切である場合がある。別の症例では、より迅速に髄鞘形成能を提供するために、より成熟した細胞（ＧａｌＣまたはＭＢＰに関して陽性）で組成物を製剤化することが適切である場合がある。
【０１２４】
懸濁培養において形成される大きな凝集体をマトリゲル（登録商標）等の適切なマトリックスに接着させることにより、ｐＰＳ由来細胞からオリゴデンドロサイト系譜細胞の比較的分散した集団が容易に得られること見出した。培養した細胞を基層上にプレーティングして数時間〜数日間培養し、非接着細胞を除去する。次に、短時間酵素消化した後に粉砕する等の適切な化学的または機械的手段によって、オリゴデンドロサイト系譜細胞を回収する。細胞操作、保存特性、および投与に際して有利な効果を提供する能力の点から見て、単分散集団または約３０個以下の細胞の凝集塊は利点を有すると考えられる。細胞は典型的に洗浄し、その後疾患部位に細胞を保持するために効果的な用量を投与するのに適した濃度で（例えば、μＬ当たり細胞２０，０００個〜１００，０００個、治療領域の量によって調整する）、薬学的に適合する培地中に懸濁する。
【０１２５】
神経に適応した治療（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の通常の手順に従って、患者の準備をする。拒絶を防ぐために、シクロスポリンＡ等の標準的な免疫抑制療法により患者を処置してもよい。別法としてまたはさらに加えて、同じｐＰＳ細胞株から調製した造血細胞または未分化細胞を用いて、患者をオリゴデンドロサイトのアロタイプに対して特異的に寛容化してもよい（国際公開公報第０２／４４３４３号；国際公開公報第０３／０５０２５１号）。症例によっては、損傷部位においてニューロンを一次的に脱髄すること、投与細胞の接近を促進すること、または再ミエリン化を阻害し得る因子を除去することが有利である場合がある。これを達成する１つの手段は、ＧａｌＣ、Ｏ４、またはエリン関連糖タンパク質等の、ミエリン鞘上の１つまたは複数のエピトープに対する補体結合抗体を局所環境に投与することである。Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌ． ４４：７２７、１９９７；およびカナダ特許第２，２５３，０７８号を参照されたい。次に、本発明の分化細胞を、髄鞘形成もしくは神経機能の再生を所望する部位またはその周りに、１回または複数回投与する。
【０１２６】
その後対象に支持的な術後処置を施し、移植片の許容または神経機能の再生についてモニターする。適切であれば、患者をファムプリジン（Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）−ＳＲ（４−アミノピリジン）等の、オリゴデンドロサイト機能を回復すると考えられる他の手段を用いて同時に治療してもよい。組織試料を、すでに記載した関連マーカーに関して免疫細胞化学法によって解析し、軸索の再ミエリン化、投与細胞の存在に起因する神経突起の発芽等の機能的事象に関して評価することができる。それらの疾患の典型的な病理学的特性により病態の維持または改善に関して、および例えば障害状態尺度（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｔｕｓ ｓｃａｌｅ； ＥＤＳＳ）での機能の評価に関して、患者をモニターすることができる。
【０１２７】
本発明の組成物を用いた治療に適切な病態には、ミエリンを維持するまたは産生する能力が、治癒またはさらなる悪化の防止に役立つ進行性脱髄および中枢神経系の外傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
多発性硬化症は、脳および脊髄における脱髄部分の散在を特徴とする緩徐進行性疾患である。オリゴデンドログリアの破壊および血管周囲の炎症を伴う脱髄プラークは、ＣＮＳを通じて、主として白質（特に、頚部および背部）、視神経、および周室部に起こる。中脳、脳橋、および小脳の路、ならびに大脳および脊髄の灰白質もまた影響を受ける。
【０１２９】
急性散在性脳脊髄炎（感染後脳脊髄炎）は血管周囲のＣＮＳ脱髄を特徴とし、これは自発的に起こり得るが、通常はウイルス感染またはウイルスワクチン接種の後に起こる。慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）は、炎症性Ｔ細胞およびマクロファージを伴う神経内膜の間質および血管周囲浸潤を特徴とし、末梢神経の分節性脱髄を引き起こす。ＨＴＬＶ関連ミエロパシーは、両脚の痙性衰弱を特徴とする緩徐進行性脊髄疾患である。ギランバレー症候群等のいくつかの末梢神経障害も、脱髄を特徴とする。
【０１３０】
先天性代謝病（フェニルケトン尿症および他のアミノ酸尿症；テイ・サックス病、ニ−マン・ピック病、およびゴーシェ病；フルラー症候群；クラッベ病および他の白質萎縮症等）は、ＣＮＳにおけるミエリン鞘の発達に影響を及ぼし、永久的な広汎性神経欠損を起こす可能性がある。副腎白質萎縮症および副腎脊髄神経障害は、副腎機能不全および神経系の広範な脱髄を特徴とする伴性劣性代謝病である。ペリツェウス・メルツバッハー病は、プロテオリピドタンパク質遺伝子の点突然変異のために患者がミエリンを形成しない病態である。レーバー遺伝性視神経萎縮および関連するミトコンドリア障害は、主に両側の中心視力の喪失を特徴とする。
【０１３１】
ＣＮＳの外傷によって起こる任意の急性または長期異常も、無酸素症および虚血によるミエリンの喪失に関連する病態と同様に、治療が検討され得る。この分類には、脳卒中および外傷性脳損傷に関連する病態が含まれる。
【０１３２】
対麻痺または任意のレベルの不完全な運動機能を起こす様々な種類の脊髄損傷が、本発明の細胞を用いた治療の第一候補である。性質および到達性次第で、頚椎、腰椎、胸椎、および仙椎の損傷は、すべてその病態の改善または安定化を得る可能性がある。ＳＣ機能の完全なまたは不完全な喪失を起こす急性損傷は、減圧手術と同時にまたはその直後に治療することができる。慢性病態は、必要に応じていつでも治療または再治療することができる。針、カニューレ、または他の適切な装置を使用して、手術、内視鏡、または経皮注射により、細胞を損傷部位にまたはその近傍に投与することができる。保証されている場合、誘発電位試験により電気生理学的効果を測定することができる。米国脊髄損傷学会（ＡＳＩＡ）の運動スコアならびにフェランズおよびパワーズの生活の質指標（ＱＬＩ）等の基準により、患者を運動経路および感覚経路の臨床的改善について評価することもできる。
【０１３３】
いつもと同様、患者の選択、投与形態、およびリハビリテーションのモニタリングの最終責任は、管理する臨床医の責任である。
【０１３４】
商品流通できるように、本発明のオリゴデンドロサイトは典型的に等張賦形剤を含む薬学的組成物の形態で提供し、ヒト投与に十分に無菌的な条件下で調製する。本発明はまた、生産、流通、または使用の任意の時点で存在する細胞のセットまたは組み合わせを含む試薬系を含む。細胞セットは、同じゲノムを共有する場合がある未分化ｐＰＳ細胞または他の分化細胞型と組み合わせた、分化したｐＰＳ由来細胞の種類（グリア細胞、オリゴデンドロサイト、それらの前駆細胞およびサブタイプ等）に例証されるがこれらに限定されない、本開示に記載する２つまたはそれ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット中の各細胞型は、同じ事業体もしくは事業関係を共有する別の事業体の管理下で、同時にもしくは別の時点で、一緒にもしくは同じ施設内の別の容器に包装しても、または別の場所で包装してもよい。
【０１３５】
細胞組成物の医薬品製剤化における一般原則については、当業者には、Ｇ． ＭｏｒｓｔｙｎおよびＷ． Ｓｈｅｒｉｄａｎ編によるＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６、およびＣｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔ．Ｂ． Ｆｒｅｅｍａｎら編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９８を参照されたい。細胞は、任意で細胞の保存または上記の病態を治療するための医薬品としての使用に関する情報を添付して、流通もしくは臨床用途に適した装置もしくは容器に、または他の価値ある目的に適した装置もしくは容器に包装する。
【０１３６】
本発明の特定の態様の限定されないさらなる例証として、以下の実施例を提供する。
【０１３７】
実施例
実施例１：ｈＥＳ細胞のオリゴデンドロサイトへの分化
Ｈ７株およびＨ１株のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、初代マウスフィーダー細胞により馴化しｂＦＧＦを添加したノックアウト（無血清）培地中、マトリゲル（登録商標）基層上で無フィーダー条件において未分化状態で増殖させた（国際公開公報第９９／２０７４１号； 国際公開公報第０１／５１６１６号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。
【０１３８】
以下の計画に従って、ｈＥＳ細胞をオリゴデンドロサイト系譜の細胞に分化させた：
【０１３９】
（表１）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の産生
【表１】
ＧＲＭはグリア制限培地である（表２を参照のこと）。
移行培地（ＴＲ）は、ＧＲＭおよびｈＥＳ細胞を作製するための馴化培地の１：１混合物として作製する。
【０１４０】
（表２）グリア制限培地（ＧＲＭ）の成分
【表２】
【０１４１】
分化手順は以下の通りに行った：
・１日目：コラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ １７１０１−０１５）を用いて接着基層からＥＳコロニーを解離し、コロニーを４ ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ １３２５６−０２９）を有するＴＲ中で低接着性６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３４７１）に入れた。分化手順の最初の３日間のみ、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １０３７８−０１６）を用いた。
・２〜１０日目：細胞をレチノイン酸（ＲＡ；オールトランス−レチノイン酸、Ｓｉｇｍａ ２２３０１８）、１０μＭと共に培養し、合計８日間毎日フィードした。ＲＡ保存液は、６ ｍｇ／ｍＬの濃度で（約０．０２ Ｍ）ＤＭＳＯに溶解して調製した。
・３日目から：培地をＧＲＭに置換し、それ以上はｂＦＧＦを添加しなかった。培地は毎日交換した。ＲＡは光感受性であるため、フィード中は照明を最小限に落とした。ＥＳ細胞凝集体を含むウェルの培地を、１５ ｍＬチューブに回収した。低速で短時間遠心分離した後（８００ ｒｐｍ、１分間）、上清を吸引除去し、新鮮培地を添加した。穏やかに上下にピペッティングし（２〜３回）、６ウェルプレートの各ウェルに４ ｍＬずつ確実に均一に分配した。
・１０〜１５日目：１０日目以後は、毎日フィードする際に、２０ ｎｇ／ｍＬ濃度のＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ｅ９６４４）および２ ｎｇ／ｍＬ濃度のｂＦＧＦを添加した。
・１５〜２１日目：ＥＧＦは２０ ｎｇ／ｍＬ濃度で添加し続けたが、ｂＦＧＦは培地から除去した。
・２１日目以後：２０ ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦを有するＧＲＭ培地を維持することにより、４２日目以降でも神経の特徴を有する新たな凝集体／凝集塊が産生され得た。
・これらの神経球を選択するため、分化手順の２８日目に、マトリゲル（登録商標）をコーティングした６ウェルプレート（マトリゲル（登録商標）１：３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ３５６２３１）に、培養物全体を解離手順を行うことなく、１２〜２０時間（一晩）移した。翌日、培養物を穏やかに振盪すると、神経球のみが接着したままであるので、培養物の残りを新鮮なＧＲＭ培地で置換した。
・３５日目：ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ Ｐ２６３６）およびラミニンでコーティングした４チャンバー・イメージングスライド（Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １５４９１７）に、神経凝集体をプレーティングした。トリプシン−ＥＤＴＡで短時間（５分）処理し、細胞の凝集を解離させた。ＰＬＬ−ラミニン上で細胞を７日間培養し、その間一日おきに培養物にフィードした。
・４２日目：培養物をパラフォルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学法により細胞を特徴付けした。使用したマーカー：ＮｅｕＮ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、Ｍａｐ２、Ｏ４、ビメンチン、ＧＦＡＰ。
【０１４２】
結果を添付の位相倒立顕微鏡写真（ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）に示す。
【０１４３】
図１は、移行培地（５０％グリア前駆細胞培地）中、懸濁状態で２日間培養した胚様体を示す。
【０１４４】
図２は、レチノイン酸中での培養の最終時点における、分化７日目の球体を示す。３日目から、透明な球体が懸濁培養物中に現れ始めた。７日目までに、これらの球体が培養物中の細胞の８０〜９０％を構成した。
【０１４５】
図３は、ＲＡ処理の抑制後の球体の崩壊を示す。いくつかの小胞は、細胞を球体の内部および外部に添加することにより成長し続けた。細胞集塊は濃い陰影の球状の形をとっていた。球体は、２０ ｎｇ ＥＧＦのみの存在下では崩壊した。しかし、低濃度のｂＦＧＦを添加することにより、球体は維持され得た。いくつかの球体は新たな細胞を添加することによって成長し続け、球状の濃い陰影の細胞集塊を生じた。厚い壁を有するいくつかの小さな球体は成長し続けたが、数日後に完全に消失した。従って、ｂＦＧＦを低濃度（２ ｎｇ／ｍＬ）で培養物中に５日間保持し続け、それにより球体は層の添加で成長し続けた。
【０１４６】
図４は、ｂＦＧＦを除去した後に現れる変化を示す。細胞集塊のほとんどが解離し始め、培養液全体が単一細胞および小さな細胞塊でいっぱいになった。同時に、新たな鮮黄色の球体が観察された（矢印）。
【０１４７】
図５は、鮮黄色の球体（矢印）が培養を続けながら選択的に維持されたことを示す。あるものは他の球体から、あるものは単離した細胞集団から、あるものは濃い細胞集塊から発芽し、新たな球体が毎日出現した。
【０１４８】
２８日目に、培養物全体をマトリゲル（登録商標）基層上に一晩接着させた。神経に拘束された球体のみが基質に接着し、その他の培養物は浮遊したままであった。
【０１４９】
図６は、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングしてから２、３日後の、球体からのグリアに拘束された神経前駆細胞の遊走および分枝を示す。より小さいコロニーは個々の細胞の縦裂により環を形成したのに対し、大きなコロニーは長い突起を有する星型の遊走を示した。マトリゲル（登録商標）で培養してから数日後に、より多くの遊走細胞が出現した。
【０１５０】
一週間後、トリプシンを用いてマトリゲル（登録商標）から培養物を解離し、さらなる特徴付けを行うために、ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン（Ｇｉｂｃｏ １２１６３−０１０）でコーティングしたＮｕｎｃイメージングチャンバーに低密度でプレーティングした。プレーティングした細胞は、ラミニン基層上で成長してから３〜４日後に、特徴としてオリゴデンドロサイト形状をとった。
【０１５１】
次に、マトリゲル（登録商標）選択段階が１０〜２０時間に短縮できることを見出した。非接着細胞を除去し、次に接着細胞を再懸濁して、ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびグリア前駆細胞培地の存在下で拡大した。これは、治療投与および他の目的に対してより適した、より分散した細胞集団を産生する利点を有する。
【０１５２】
図７はこの技法の結果を示す。細胞をマトリゲル（登録商標）に接着させた後、７日間拡大し、ポリ−Ｌ−リジン・ラミニン上にプレーティングし、マイトジェンの非存在下で培養した。４％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、３％ヤギ血清および０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（登録商標）界面活性剤中でブロッキングした。ガラクトセレブロシドに対する抗体（ＧａｌＣ、Ｃｈｅｍｉｃｏｍ）、次にペルオキシダーゼ標識した抗免疫グロブリンを用いて、免疫細胞化学法を行った。ヘマトキシンにより核を対比染色した。（第１パネル倍率２０ Ｘ；第２パネル倍率４０ Ｘ）。
【０１５３】
視野内の少なくとも約９５％の細胞が、成熟オリゴデンドロサイト系譜細胞のマーカーであるＧａｌＣの染色を示す。
【０１５４】
図８は、ＧａｌＣに関して染色された、高倍率のＥＳ由来オリゴデンドロサイトを示す（倍率６０ Ｘ）。少なくとも約１０％〜２０％の細胞がオリゴデンドロサイトに特有の形態（具体的には、ミエリンシートを示唆する、間に皮膜を有する多数の突起）を示す。
【０１５５】
実施例２：ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトはインビボにおいて再ミエリン化および神経発芽を起こす
本実施例では、実施例１と同様の戦略にいくつかの改良点を加え、Ｈ７株由来のｈＥＳ細胞を移植用のオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させた。ＧＲＭの処方は、プロゲステロン濃度を６５ ｎｇ／ｍＬに再検討する点以外は同様とした。ＥＧＦを初めから添加し、２日後にｂＦＧＦを除いた。
【０１５６】
（表３）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体の産生
【表３】
【０１５７】
最初の週は、低速で４〜５分間遠心分離してからフィードした。球体が成長を開始した後は、１５〜５０ ｍＬ円錐管内に入れインキュベーター中で５〜１０分間培養物を沈降させてフィードした。接着因子を発現する細胞は凝集体（球体）を形成し、単一細胞懸濁液中では非接着細胞よりも早く沈降する。これにより、細胞間接着特性を有する培養物の精度が増す。
【０１５８】
図９は、分化計画過程における細胞形態の進行を示す。（Ａ）： ｍＥＦ馴化培地中、マトリゲル（登録商標）上で無フィーダー培養にて成長する未分化ｈＥＳ細胞。（Ｂ）： ３日目までに、レチノイン酸を含む培地での懸濁培養で胚様体から透明な球体が成長し、迅速な細胞の分散を示す。（Ｃ）： 黄色い球体が大きな塊状で蓄積することから、レチノイン酸による神経系譜細胞の誘導（段階３）、その後のＥＧＦの存在下でのオリゴデンドロサイト前駆細胞の拘束および拡大（段階４）が明白であった。（Ｄ）： 次に、所望の細胞型のポジティブセレクションのため細胞をマトリゲル（登録商標）上にプレーティングした。（Ｅ、Ｆ）： 拡大段階が進行するにつれて、球体の大きさおよび培養物の割合が増加した。優先的に選択した後、最大で８週までグリア拘束前駆細胞を維持し増幅することができた。（Ｇ、Ｈ）： 次にマイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上にオリゴデンドロサイト前駆細胞をプレーティングすると、細胞は１週間以内に成熟オリゴデンドロサイトの形態をとった。
【０１５９】
図１０は、成熟オリゴデンドロサイトの免疫細胞化学的解析を示す。プレーティングしてから１週間後、９４％を超える細胞が初期グリア細胞のマーカーであるＮＧ２に対する抗体で標識された（Ａ）。プレーティングしてから８週間後、９５％を超える細胞がＧａｌＣ（Ｃ）、Ｏ４（Ｄ）、およびＲＩＰ（Ｅ）について陽性に染色された。細胞を抗ＧＦＡＰで染色し、かつＤＡＰＩで対比染色したところ、オリゴデンドログリアマーカーで標識されなかった細胞の実質的にすべてが、ＧＦＡＰ陽性であった（Ｂ）。
【０１６０】
次に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）衝撃装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ＬＬＣ）を用いて中程度の脊椎挫傷を誘導した成体スプラーグ・ド−リー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを麻酔し、低位胸髄にオリゴデンドロサイト前駆細胞を投与した。
【０１６１】
図１１は、細胞を投与した後に得られた、ヒト核タンパク質に特異的な抗体で染色した組織切片を示す。濃く染色されたことから、移植後にヒト細胞が生存していることが確認される。
【０１６２】
図１２は、移植してから９週間後の、ヒト核タンパク質について染色した脊髄の周囲領域の横断切片を示す。拒絶を防ぐために、シクロスポリンＡで動物を処置しておいた。細胞は白質に向けて遊走または増殖した。
【０１６３】
図１３は、移植細胞が投与部位に副作用をもたらすかどうかを判定する詳細な解析の結果を示す。未処置のラットおよび移植したラットの損傷部位にわたり、脊髄の長さに沿って連続切片を得た。各棒グラフは、５枚の切片で測定した平均断面積を示す（平均値±ＳＥＭ）。挫傷近傍の小さな断面積は、損傷後の二次拡大の結果である。オリゴデンドロサイトは救済（ｓｐａｒｉｎｇ）を誘導しないが、損傷を悪化させることもない。このことから、ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトは脊髄損傷の１ ｍｍ以内に投与しても安全であることが示される。
【０１６４】
図１４は、ニューロン分枝を測定する実験から得られたものである。損傷から８週間後、運動皮質の順行性トレーサーとして、動物の皮質脊髄路にＢＤＡを注射した。これらの切片は２週間後に採取したものである。ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物においてのみ、軸索分枝の証拠が存在した（上の２枚のパネルにおいて、濃く染色された細い線として示される）。分枝は、損傷部位の真上の脊髄の領域で観察された。
【０１６５】
図１５は、損傷および細胞投与部位（中心点）から１ ｍｍの間隔で測定したニューロン分枝の定量を示す（ブロック当たり３切片の平均値±ＳＥＭ）。処置を受けなかった損傷動物では、部位の３ ｍｍ上で標識軸索を計測した。処置した動物は、有意に高いレベルで、中心点の損傷のすぐ頭側にまで標識軸索を有した。このことから、移植細胞が再生可塑性を誘導することが確認される。
【０１６６】
図１６は、移植した動物から採取した、実質的な再ミエリン化の証拠を示す切片の一連の電子顕微鏡写真である。左上のパネルの厚い環は、正常にミエリン化した繊維である。視野内の残りの軸索は、薄い層のミエリンを示す。軸索直径に対する鞘の比率から、これらの軸索が新たにミエリン化されたことが示唆される。右上のパネルは、新たにミエリン化した軸索のより解像度の高い像である。約５または６層の外被、および上部にはオリゴデンドロサイトの先端を示す軸索の舌状の縁が存在する。これは、この軸索のミエリン化が進行中であることを示す。下のパネルは、シュワン細胞によって沈着した厚いミエリン鞘を示す。これは移植にかかわらず生じ、未処置動物において限られた程度の回復が提供される。しかし、ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物のみが、オリゴデンドロサイトに特有の、上のパネルで観察される性質のミエリン化の証拠を示した。
【０１６７】
実施例３：オリゴデンドロサイト系譜細胞の表現型特徴付け
本実施例では、表４に示す手順に従ったｈＥＳ株Ｈ７からのオリゴデンドロサイトの産生過程におけるマーカー発現を追跡する。
【０１６８】
（表４）ｈＥＳ細胞からのオリゴデンドロ前駆体の産生
【表４】
【０１６９】
本手順の一般的な適用では、固相選択段階後（約２３日目以後の任意の時点）に移植に適したオリゴデンドロサイト前駆細胞が得られる。トリプシンを用いて週に一度継代することにより、最終段階の培養を行い必要に応じて細胞を拡大することができる（少なくとも８週間）。
【０１７０】
本実施例での表現型解析のために、５％ノックアウト血清代替物を含むＧＲＭを用いて細胞を低密度培養に適合化した。２１日目に５％ ＫＯ−ＳＲを存在させ始めることによって、マトリゲル（登録商標）上にプレーティングした際に双極細胞の増殖が改善された。細胞を低密度でラミニン（ポリ−Ｌ−リジン上で１５μｇ／ｍＬ）上にプレーティングした場合には、ＫＯ−ＳＲにより細胞の生存度および成長が改善された。手順の早い時期にＫＯ−ＳＲを使用しても、成長速度および黄色球体の比率から見て分化の過程に影響を及ぼさなかった。
【０１７１】
図１７は、未分化ｈＥＳ細胞コロニーで検出されたマーカーを示す。左側のパネルは、視野内のすべての細胞核の位置を表すＤＡＰＩ染色の青蛍光の上に重ね合わせた、各マーカーに特異的な抗体による赤蛍光を白黒で示す。右側のパネルは、マーカー染色のみを示す。２つの像を比較することにより、問題のマーカーを発現する、視野内の全細胞の比率の推定が可能となる。
【０１７２】
上列は、多能性細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に陽性標識されたコロニーを示す。下列は、中胚葉マーカーＢＭＰ４に陽性標識されたコロニーを囲む間質細胞を示す。各コロニー内の未分化細胞はＢＭＰ４陰性である。
【０１７３】
図１８は、分化過程における転写因子Ｐａｘ６の一過性の出現を示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列は、１０日目の細胞塊の中心に向かった染色、周辺に向かってより分化した細胞でのすでにダウンレギュレートされた染色を示す。下列は、３５日目に採取した細胞では実質的に染色されないことを示す。
【０１７４】
図１９は、１０日目にレチノイン酸を除去した直後に存在する、初期のオリゴデンドロサイト系譜細胞で検出されるマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。上列：転写因子Ｏｌｉｇ１（８３％±７％）。中列：転写因子ＳＯＸ１０（７２％±１２％）。下列：非特異的オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーＡ２Ｂ５（９７％±３％）。
【０１７５】
図２０Ａ〜２０Ｂは、３５日目の完全に分化したオリゴ前駆細胞において優位を占めるマーカーを示す（左側：抗体＋ＤＡＰＩ；右側：抗体染色のみ）。１列目および２列目（２０Ａ）：ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカー）； ３列目（２０Ａ）：ＧａｌＣ；４列目（２０Ｂ）：Ｏ４；５列目（２０Ｂ）：Ｔｕｊ１（ニューロンのマーカー）。
【０１７６】
結果から、少なくとも約８０％の細胞がオリゴデンドログリアマーカーＮＧ２、ＧａｌＣ、およびＯ４に陽性であることが示される。オリゴデンドログリアマーカーで標識されなかった細胞は、主にニューロンマーカーＧＦＡＰまたはＴｕｊ１（２０Ｂ、下列）に陽性であった。二重免疫細胞化学法により、ＧＦＡＰまたはＴｕｊ１陽性細胞はオリゴデンドログリアマーカーを同時に発現しないことが示される。さらに、ＢＭＰ４またはＳＳＥＡ−４は検出されず、このことからこれらの培養物が未分化細胞または中胚葉系譜細胞を欠いていることが示唆される。この細胞集団は、少なくとも８回の連続した継代を通して増殖させることが可能であると考えられる。
【０１７７】
実施例４：ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトは、ミエリン欠損動物において軸索
を再ミエリン化する
これらの細胞によってインビボで起こった髄鞘形成が（内因性オリゴデンドロサイトの誘導によるのではなく）直接的な効果であることを実証するため、分化手順の２８日目の細胞を脱髄のシバラーマウスモデルに移植した。シバラーマウスは、染色体１８に位置するミエリン塩基性タンパク質遺伝子の変異に関してホモ接合性である（Ｍｂｐｓｈｉ／Ｍｂｐｓｈｉ）。この遺伝子は重複しており、重複遺伝子の大部分が反転し、アンチセンスＲＮＡの形成を引き起こす。これにより、ＣＮＳを通じて重篤なミエリン欠損が生じる。
【０１７８】
培養物からオリゴデンドロサイト前駆細胞を回収し、ＤＭＥＭで洗浄し、濃縮し、シリコンコーティングしたハミルトンシリンジに装填する。すべての実験と同様に、ここでも１０ ｍｇ／ｋｇ シクロスポリンＡにより動物を免疫抑制した。６週間後、動物を屠殺しＥＭ解析のために切片を作製した。
【０１７９】
図２１はその結果を示す。超微細構造的に、シバラーマウスの軸索はミエリンを欠いているか、または１もしくは２層の緻密でないミエリンによって囲まれている（上のパネル）。細胞を移植してから６週間後、電子顕微鏡解析により多層の緻密なミエリンが示され、このことから移植集団のミエリン形成能が示唆された（下のパネル）。
【０１８０】
マウスはミエリン塩基性タンパク質を産生する能力を欠いているため、緻密なミエリンは栄養作用ではなく、投与したオリゴデンドロサイトによって直接産生されるに違いない。
【０１８１】
実施例５：ＥＳ由来オリゴデンドロサイトによる脊髄機能の回復
ＥＳ由来オリゴデンドロサイト系譜細胞が神経活性を回復する能力を、脊髄損傷のラット挫傷モデルで判定した。
【０１８２】
衝撃装置を用いて、麻酔した成体スプラーグ・ド−リーラットの低位胸髄に中程度の挫傷を誘導した。損傷から１週間後、４μＬ培地中の細胞２．５ ｘ １０５個を挫傷部位に移植した。分化計画（実施例１）の３５日目の細胞を、トリプシンおよびＥＤＴＡに３分間曝露して細胞を非接着性にすることにより、移植細胞集団を調製した。次に細胞を基礎培地ですすぎ、μｌ当たり細胞６ ｘ １０４個に濃縮した。
【０１８３】
損傷から６週間後、順行性トレーサーＢＤＡ（ビオチン化デキストランアミン）を動物の運動皮質に注射した。腰椎にエメラルドグリーンを注射し、腰椎路を標識した。８週目に実験を終了した時点で、これらのマーカーの位置を判定した。
【０１８４】
図２２は、本実験の２群それぞれについての地上歩行スコアを示す。上のグラフは、２００キロダイン挫傷を受けた動物の結果を示す。下のグラフは、２５０キロダイン挫傷の結果を示す。ＢＢＢ尺度は、関節運動、体重支持、四肢の協調、足の配置、および歩行安定性に基づく正常な地上歩行を評価する２１ポイント尺度である（Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１２：１、１９９５）。（■）損傷から１週間後にＥＳ由来オリゴデンドロサイトで処置した動物（ｎ＝５）；（▲）同じ挫傷を被るが細胞を投与していない対照動物（ｎ＝３）。盲検で評価した平均値±ＳＥＭ。
【０１８５】
ｈＥＳ由来オリゴデンドロサイトを移植した動物は、処置後５週間を超えて持続する有意に優れた機能を示した（＊≡ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
これらの結果から、ＥＳ由来オリゴデンドロサイトが脊髄損傷の動物モデルにおいて機能の回復を助けることが実証される。先の実施例から、移植したオリゴデンドロサイトにより神経発芽およびミエリン欠損軸索の再ミエリン化が起こることが示される。これらの効果のいずれかまたは両方が、ここで認められた動作の改善に寄与する可能性がある。
【０１８７】
本発明のある種の適応は日常的な最適化の問題であり、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく実施可能であることは自明である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、
および前記未分化細胞から分化した細胞集団であって、細胞表面ＮＧ２プロテオグリカンを発現し、かつニューロンマーカーＮｅｕＮに対して陰性であるグリア細胞を少なくとも８０％含む細胞集団を含むシステムであって、
前記分化した細胞集団は、前記未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、成長因子、甲状腺ホルモン受容体のリガンド、およびレチノイン酸受容体のリガンドを含む培地において培養することにより得られる、グリア細胞を産生するためのシステム。
【請求項２】
前記成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子である、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記甲状腺ホルモン受容体のリガンドが甲状腺ホルモンＴ３であり、前記レチノイン酸受容体のリガンドがレチノイン酸である、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記甲状腺ホルモン受容体のリガンドが甲状腺ホルモンＴ３であり、前記培地がセレンを更に含む、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
分化細胞集団が以下の特徴の１つまたは複数を有する、請求項１記載のシステム：
・分化細胞集団内の約９４％の細胞が、ＮＧ２プロテオグリカンを発現する；
・少なくとも８０％の細胞が血小板由来成長因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）も発現する；
・少なくとも２０％の細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞に特有である双極性形態を示す；または
・マイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上で細胞を３日間培養した後に、少なくとも１０％の細胞が成熟オリゴデンドロサイトに特有である複雑な突起を有する。
【請求項６】
・シバラー変異（ｓｈｉｖｅｒｅｒ ｍｕｔａｎｔ）マウスの脊髄に分化細胞集団を移植することによりニューロン軸索の周りに緻密なミエリンの沈着が起こる；または
・挫傷ラットの脊髄内または脊髄の周りに分化細胞集団を移植することにより地上歩行が改善される、
請求項１から５のいずれか一項記載のシステム。
【請求項７】
未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の系統、
成長因子、甲状腺ホルモン受容体のリガンド、およびレチノイン酸受容体のリガンドを含む培地、
および細胞表面ＮＧ２プロテオグリカンを発現する少なくとも８０％のグリア細胞を含むが、神経細胞を実質的に含まない、それらから分化した細胞集団を含む、グリア細胞を産生するためのシステム。
【請求項１】
未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、
および前記未分化細胞から分化した細胞集団であって、細胞表面ＮＧ２プロテオグリカンを発現し、かつニューロンマーカーＮｅｕＮに対して陰性であるグリア細胞を少なくとも８０％含む細胞集団を含むシステムであって、
前記分化した細胞集団は、前記未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、成長因子、甲状腺ホルモン受容体のリガンド、およびレチノイン酸受容体のリガンドを含む培地において培養することにより得られる、グリア細胞を産生するためのシステム。
【請求項２】
前記成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子である、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記甲状腺ホルモン受容体のリガンドが甲状腺ホルモンＴ３であり、前記レチノイン酸受容体のリガンドがレチノイン酸である、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記甲状腺ホルモン受容体のリガンドが甲状腺ホルモンＴ３であり、前記培地がセレンを更に含む、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
分化細胞集団が以下の特徴の１つまたは複数を有する、請求項１記載のシステム：
・分化細胞集団内の約９４％の細胞が、ＮＧ２プロテオグリカンを発現する；
・少なくとも８０％の細胞が血小板由来成長因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）も発現する；
・少なくとも２０％の細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞に特有である双極性形態を示す；または
・マイトジェンの非存在下でポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上で細胞を３日間培養した後に、少なくとも１０％の細胞が成熟オリゴデンドロサイトに特有である複雑な突起を有する。
【請求項６】
・シバラー変異（ｓｈｉｖｅｒｅｒ ｍｕｔａｎｔ）マウスの脊髄に分化細胞集団を移植することによりニューロン軸索の周りに緻密なミエリンの沈着が起こる；または
・挫傷ラットの脊髄内または脊髄の周りに分化細胞集団を移植することにより地上歩行が改善される、
請求項１から５のいずれか一項記載のシステム。
【請求項７】
未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の系統、
成長因子、甲状腺ホルモン受容体のリガンド、およびレチノイン酸受容体のリガンドを含む培地、
および細胞表面ＮＧ２プロテオグリカンを発現する少なくとも８０％のグリア細胞を含むが、神経細胞を実質的に含まない、それらから分化した細胞集団を含む、グリア細胞を産生するためのシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１１−１５５９７８（Ｐ２０１１−１５５９７８Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４７７１６（Ｐ２０１１−４７７１６）
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【分割の表示】特願２００５−５０５０９０（Ｐ２００５−５０５０９０）の分割
【原出願日】平成１５年７月１１日（２００３．７．１１）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【分割の表示】特願２００５−５０５０９０（Ｐ２００５−５０５０９０）の分割
【原出願日】平成１５年７月１１日（２００３．７．１１）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
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