再構成ヒト乳房腫瘍モデル
組み換えヒト乳房腫瘍モデルを開示する。マウスに組み込まれるモデルは、自発的に生じる実際の腫瘍を提供し、それによって、天然に起こる乳癌を模倣する。腫瘍は、宿主マウスに移植したヒト乳房上皮細胞から発生したヒト乳房組織から生じるため、遺伝子的にヒトの腫瘍である。移植の前に、乳房上皮細胞を遺伝子的に改変して、（ａ）組み換えヒト癌遺伝子及びＳＶ４０ｅｒ、又は（ｂ）組み換えヒト癌遺伝子、ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡを含有させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願第１１／００６，４１３号（２００４年１２月７日出願）及び米国特許出願第１１／１７０，３３８号（２００５年６月２８日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、分子生物学及び腫瘍学である。
【背景技術】
【０００３】
従来のヒト−マウス異種移植モデルは、ヒト癌細胞をインビボで扱える利点を提供する。しかし不都合なことは、ヒト細胞が長年にわたり、別個の細胞系（ＮＣＩ６０パネル）として培養中に維持されてきたことである。このことは、原発性腫瘍細胞と比較すると、異種移植細胞の間の特性及び挙動に有意な差をもたらす可能性がある。原発性腫瘍細胞を扱う必要性に対処するため、マウスに自然発生腫瘍をもたらすインビボモデルが開発されてきた。例えば、特許文献１を参照のこと。しかし、これらのモデルにおける腫瘍細胞はマウスの腫瘍細胞である。したがって、ヒトの癌研究において、種を越えた実験結果の推定が依然として必要である。
【特許文献１】米国特許第６，６３９，１２１号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
遺伝子的にヒトの乳房腫瘍をマウスに生じる技法が発見された。この発見に基づいて、本発明は、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを特徴とする。
【０００５】
モデルは、少なくとも一つの自然発生腫瘍を含む。腫瘍は、複数のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を含む。一部の実施形態において、ＨＭＥＣは、組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、及び組み換えＳＶ４０初期領域（ＳＶ４０ｅｒ）を含む。別の実施形態において、ＨＭＥＣは、組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、又はｐ５３経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡを含む。ｐ５３経路を阻害する代表的な導入遺伝子は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈのような、ヒトｐ５３不能突然変異をコードする導入遺伝子である。ヒトＲｂ経路は、例えば、組み換えサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）遺伝子の発現又は過剰発現により阻止又は阻害される可能性がある。
【０００６】
好ましくは、腫瘍成長部位は、マウスの乳房脂肪パッド、マウスの生殖腺脂肪パッド、マウスの腎臓莢膜、又はマウスの皮下部位、例えば側腹部の皮下部位である。本発明の一部の実施形態において、モデルは又、複数のヒト線維芽細胞、例えばヒト乳房線維芽細胞も含む。ヒト線維芽細胞の一部又は全ては、腫瘍の中に位置することができる。ヒト線維芽細胞は、癌腫関連線維芽細胞、又は遺伝子操作された線維芽細胞、例えば不死化線維芽細胞、並びに始原ヒト線維芽細胞であってもよい。
【０００７】
本発明に従ってヒト乳房上皮細胞に導入できるヒト癌遺伝子の例には、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫとも呼ばれる）、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＥ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２とも呼ばれる）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、及びＢｍｉ１が挙げられる。好ましいヒト癌遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＥｒＢ２、及びサイクリンＤ１である。
【０００８】
本発明の一部の実施形態において、組み換えヒト癌遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。有用な誘導性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター、及びミフェプリストン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましい誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。
【０００９】
本発明は又、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスの作製方法も提供する。一つの方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；（ｂ）ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｃ）ヒト乳房上皮細胞に組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを導入する工程；及び（ｄ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び形質導入ヒト乳房上皮細胞を互いに近接してマウスに移植する工程。
【００１０】
代替の方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；（ｂ）ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｃ）ヒト乳房上皮細胞に、（ｉ）組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、（ｉｉ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを導入し、それによって、形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；及び（ｄ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程。
【００１１】
線維芽細胞及び上皮細胞は、乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は皮下部位（例えば側腹部の皮下部位）が含まれるが、これらに限定されない部位に移植することができる。
【００１２】
本発明は又、癌関連遺伝子を同定する方法も提供する。該方法には、（ａ）マウスの再構成ヒト乳房腫瘍モデルにおける自然発生腫瘍から腫瘍細胞を提供する工程（この場合、該腫瘍は、（１）誘導性プロモーターの制御下の組み換えヒト癌遺伝子、及び（２）ＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む）；（ｂ）細胞のゲノムに組み込まれる核酸を細胞に導入し、それによって核酸が組み込まれた遺伝子座を標識する工程；（ｃ）誘導性プロモーターのインデューサーが存在しない条件下で細胞を培養する工程；（ｄ）腫瘍形成性が核酸分子の組み込みにより誘導された細胞を同定する工程；及び（ｅ）組み込んだ核酸分子により工程（ｃ）の細胞中で標識された遺伝子を、癌関連遺伝子として同定する工程が含まれる。一部の実施形態において、核酸分子はレトロウイルス配列、例えばモロニーマウス白血病ウイルスを含む。
【００１３】
本発明は又、化合物の抗腫瘍効果を試験する方法も提供する。一部の実施形態において、該方法には、（ａ）組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む自然発生腫瘍を含む再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを準備する工程；（ｂ）マウスに試験化合物を投与する工程；及び（ｃ）適切な対照と比較して、腫瘍に対する試験化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程が含まれる。
【００１４】
代替の実施形態において、該方法には、（ａ）（ｉ）組み換えヒト癌遺伝子、（ｉｉ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含有する複数のヒト乳房上皮細胞を含有する自然発生腫瘍を含む再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを準備する工程；（ｂ）マウスに試験化合物を投与する工程；及び（ｃ）適切な対照と比較して、腫瘍に対する試験化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程が含まれる。
【００１５】
本発明は又、マウスにおいてヒト乳房原発性腫瘍を増殖させる方法も提供する。該方法には、（ａ）腫瘍からヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｂ）不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を提供する工程；（ｃ）上皮細胞及び線維芽細胞を互いに近接してマウスに移植する工程；及び（ｄ）腫瘍を増殖させる上で十分な時間にわたりマウスを維持する工程が含まれる。上皮細胞及び線維芽細胞は、マウスの乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は側腹部皮下の部位に移植することができる。本発明の好ましい実施形態において、上皮細胞及び線維芽細胞は、乳房脂肪パッドに移植される。一部の実施形態において、乳房脂肪パッドには、不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞が予め注入される。本発明の一部の実施形態において、上皮細胞及び線維芽細胞は移植の前に混合され、細胞混合物として移植される。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関係する当業者により通例理解されるものと同じ意味を有する。不一致が起こる場合、定義を含めた本発明の明細書が支配する。本明細書に記述される全ての出版物、特許、及びその他の参考文献は、全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することできるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。材料、方法及び実施例は、説明のためのものであり、限定するものとして意図されていない。本発明のその他の特徴及び利点は、詳細な説明及び請求項から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを提供する。前記モデルにおいて、腫瘍は、マウスで成長しているヒト乳房組織から自然発生する。ヒト癌生物学の基礎研究、並びに医薬品の発見及び開発において、このモデルは三つの主要な利点を提供する。第一に、前記モデルは、自然発生する原発性腫瘍を提供し、それによって天然に生じるヒト乳癌を模倣するという点である。第二に、腫瘍は、宿主マウスに移植したヒト乳房上皮細胞から発生したヒト乳腺から生じるため、遺伝子的にヒトであるという点である。第三に、腫瘍は限定した遺伝子要素により形成されるため、ヒト原発性腫瘍の経路関連腫瘍形成性を研究する機会をもたらすという点である。
【００１９】
乳房間質線維芽細胞が乳房上皮細胞の成長及び分化を支持する証拠が発表されている。例えば、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：４８８６−４８９８６；及びＰａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １１： ４３７−４５８を参照のこと。したがって、ヒト線維芽細胞、例えばヒト乳房線維芽細胞は、本発明を実施する際に本目的に使用することができる。ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、互いに隣接して、例えば単一の乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は皮下の注入部位内に移植される。ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、混合して、マウスにおける移植の選択された部位に共注入することができる。場合により、線維芽細胞は、上皮細胞の注入の前、例えば１〜４週間前に注入して、ヒト乳房上皮細胞の導入の前に、線維芽細胞が繁殖し、マウスの組織に進入する時間を持たせることができる。
【００２０】
マウス乳房上皮は、出産後、乳首領域から広がることにより発達する。３週齢では、乳房上皮細胞からなる乳管は、リンパ節に達していない。したがって、乳腺のマウス上皮成分は、乳首とリンパ節の間の部分を除去することによって排除でき、それにより「除去済みの」脂肪パッドが残る。例えば、Ｄｅ Ｏｍｅ ｅｔ ａｌ， １９５９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９： ５１５−５２０； Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １： ７５−８９を参照のこと。本発明の一部の実施形態において、ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、宿主マウスの除去済み乳房脂肪パッドに移植される。しかし、脂肪パッドを除去する必要はない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態において、線維芽細胞及び上皮細胞は、マウスの生殖腺脂肪パッドに移植される。別の実施形態において、線維芽細胞及び上皮細胞は、マウスの腎臓莢膜に移植される。例えば、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２， ｓｕｐｒａを参照のこと。別の代替案には、線維芽細胞及び上皮細胞をマウスの皮下、例えばマウスの側腹部の皮下に移植することがある。
【００２２】
線維芽細胞及び上皮細胞をマウスへ移植するための関連する多様な外科手技が開発されており、当該技術分野において知られている。例えば、Ｏｕｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ５５： １４６１−１４６６； Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３６： ２６０５−２６１０； ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４１： ３３００−３３０５； ＭａｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃａｎｃｅｒ ５４： １９２０−１９２７； Ｅｄｗａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照のこと。一般的に移植は、ハミルトンシリンジを使用する注入によるが、ヒト細胞をマウスへ導入するあらゆる適切な技法を用いることができる。
【００２３】
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞は、ヌードマウスに腫瘍を形成しない及び軟寒天アッセイでコロニーを形成しない、ヒト線維芽細胞である。移植される非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞の種類は、一般的に重要ではない。便宜上、不死化線維芽細胞を使用することができる。不死化ヒト線維芽細胞は、老化することなくインビトロで永久的に分割することができるヒト線維芽細胞である。一次ヒト間質線維芽細胞は、任意の適切な方法により不死化することができる。当該技術分野では多様な方法が知られている。例えば、線維芽細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）をコードする発現ベクターによる適切な形質転換により、不死化することができる。例えば、米国特許第６，２６１，８３６号（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと。又、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｒｅｓ． ４３： １６７−１７４を参照のこと。或いは、通常細胞培養において幾つかの経路を生存させることができる一次線維芽細胞は、本発明を実施する際に、移植に使用することができる。別の代替案には、癌腫関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を使用することがある。ＣＡＦ細胞は、ヒト乳房腫瘍、例えば乳房切除切片から単離することができる。
【００２４】
培養（並びにその後の線維芽細胞不死化プロトコールにおける使用、又は一次線維芽細胞としての使用）のためのヒト乳房線維芽細胞の単離に適切な供給源は、還元乳房形成組織である。ヒト組織は、基本的にＰａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３： ４８８６−４８９６に記載されるように、培養中に入れることができる。ヒト線維芽細胞材料は、必要に応じて従来の細胞培養技法により広げることができる。
【００２５】
好ましくは、本発明の実施に使用されるマウスは、免疫無防備状態である。損傷した免疫系は、マウスが移植ヒト細胞を拒絶することを防止する上で望ましい。免疫不全マウスの例には、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、胸腺を外科的に除去したマウス、及び医薬品又は遺伝子操作により免疫系を抑制したマウスが挙げられる。遺伝子的免疫不全マウスは市販されており、本発明の目的に適切な免疫不全マウスの選択は、当該技術分野における通常の技能範囲内に含まれる。
【００２６】
本発明の実施において、核酸は、安定した形質転換をもたらす任意の方法によって、非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞に導入することができる。当該技術分野で既知の有用な形質転換方法の例には、スフェロプラスト融合、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、微量注入法、並びにレトロウイルス、アデノウイルス及びレンチウイルスのようなウイルスベクターによる感染が挙げられる。適切な真核発生ベクターは、当該技術分野で既知であり、市販されている。一般的に当該ベクターは、所望の組み換え配列の挿入のために好都合な制限部位を含む。該ベクターは、選択マーカー、例えば薬剤耐性遺伝子を含んでもよい。代表的な薬剤耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子であり（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｎａｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ３２７−３４１）、ネオマイシン耐性を付与する。或いは、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、若しくは青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、又は生物発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を、選択マーカーとして使用することができる。
【００２７】
本発明の一部の実施形態において、組み換え癌遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。前記の目的に有用な誘導性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、及びエクジソンプロモーターが挙げられる。加えて、「ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ」系を、翻訳又は転写のために阻害配列を非可逆的に削除するために使用することができる。誘導性癌遺伝子構成体は、本発明に従って遺伝子改変ヒト乳房上皮細胞を作製する際に使用することができ、これを本発明に従って宿主マウスに移植する。移植したヒト乳房上皮細胞は、インデューサーの存在下で、例えば、インデューサーを宿主マウスの飲み水に投与することにより、腫瘍が形成されるまで維持される。その後、腫瘍細胞は、インデューサーの非存在下で外植、培養される。この時点で、外植腫瘍細胞は、腫瘍形成性とは離れた、単なる「１ヒット」、即ち、一つの突然変異となる。
【００２８】
前記細胞のゲノムに組み込む核酸分子、例えば、レトロウイルスベクターは、腫瘍形成の引き金を引く上で必要な突然変異をもたらすことができる。ベクターが、組み込まれる部位を標識するように設計される場合、ベクターは、活性化（又は不活性化）が腫瘍形成をもたらす遺伝子を同定するために使用することができる。外植腫瘍細胞は、インデューサーの非存在下で、例えば、ヌードマウスのような動物への再移植、及び腫瘍形成のモニタリングにより、腫瘍形成を分析することができる。移植細胞が腫瘍を生じる場合、ベクター挿入部位をクローン化し、配列決定して、周囲の遺伝子をマッピングし、同定する。前記方法により、組み換え癌遺伝子を機能的に補完する遺伝子が同定される。当該遺伝的相補性は、癌治療において標的を同定するために有用である。癌関連遺伝子を同定する前記手法は、詳細に記載されており、「ＭａＳＳ」スクリーニングとして知られている。ＭａＳＳスクリーニング技法は、ヒト再構成乳房腫瘍モデルを利用する本発明の方法に、容易に組み込むことができる。ＭａＳＳスクリーニングの詳細な説明については、ＰＣＴ国際公開公報第０２／０７９４１９号を参照のこと。
【００２９】
前述の通り、本発明は、腫瘍生物学を研究し、抗癌剤をスクリーニングするために有用な誘導性ヒト乳癌モデルを提供する。一部の実施形態において、再構成乳房腫瘍モデルはヒト乳房組織を提供するが、そのゲノムは、（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結される癌遺伝子、例えばＥｒｂＢ２遺伝子又はＫＲＡＳ遺伝子、及び（ｂ）ＳＶ４０ｅｒを含むように改変されており、これらが一緒になることで、ヒト乳房組織は、前記遺伝子修飾を含まない再構成ヒト乳房組織よりも癌への感受性が大きくなる。腫瘍は、癌遺伝子の発現が止まると退行する。再構成ヒト乳房組織を癌に対して更により敏感にする任意の突然変異には、ＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＭＳＨ２）における不能突然変異、及び癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ及びｒａｓ）における活性化突然変異が挙げられる。
【００３０】
一つの実施形態において、再構成ヒト乳房組織は、（ｉ）適切なプロモーターに作動可能に連結される逆テトラサイクリントランス活性化因子をコードする遺伝子を含有する第１発現構成体、及び（ｉｉ）逆テトラサイクリントランス活性化因子及びテトラサイクリン（又はテトラサイクリン類似体、例えばドキシサイクリン）により調節されるプロモーターに作動可能に連結される癌遺伝子を含有する第２発現構成体からなる、注入されたヒト乳房上皮細胞から発生する。宿主マウスでは、テトラサイクリン依存性である腫瘍の発生、維持又は進行を、テトラサイクリン（又はその類似体）の投与の有無にかかわらず観察する。前述のようなその他の誘導性系も使用することができる。ドキシサイクリンを逆テトラサイクリントランス活性化因子制御誘導性プロモーター系のためにインデューサーとして使用する場合、ドキシサイクリンを投与する好ましい方法は、動物の飲み水を介した投与である。
【００３１】
試験化合物の効果と、遺伝子スイッチをオフにした誘導性癌遺伝子とを比較するこの系の能力は、化合物に対する臨床反応を予測する代理マーカーの同定を可能にする。誘導性モデルは、化合物が最小限の残存腫瘍を根絶することができるかを判定するために使用することができる。通常、誘導性モデルでは、癌遺伝子が誘導性プロモーターを使用してスイッチを「オン」から「オフ」にした時に、腫瘍が退行する。しかし、試験化合物が最小限の残存腫瘍を根絶できる場合には、試験化合物の投与後に遺伝子のスイッチを戻しても、腫瘍は戻ってこない。
【００３２】
本発明に基づく再構成乳房腫瘍モデルは、癌を予防又は治療する試験化合物の効能を判定する方法に有用である。当該方法は、宿主マウスに試験化合物を投与すること、及びマウスにおける腫瘍発生、腫瘍維持、腫瘍進行又は血管新生に対する化合物の効果があればその効果を観察することを伴う。適切な対照と比較した、化合物の存在下における腫瘍の大きさの退行及び／又は低減は、化合物の抗腫瘍効果を示す。この種の薬剤効能試験は、癌遺伝子が誘導性又は非誘導性であるモデルを使用して実施することができる。
【００３３】
該モデルは又、その他の癌関連遺伝子を同定するために使用することもできる。これを行うため、癌遺伝子の不活性化又は活性化によって退行又は再生している腫瘍における遺伝子発現の詳細な発現プロフィールを確立する。プロフィールを確立するために使用される技法には、（細胞培養中における）抑制減法、ディファレンシャルディスプレイ、プロテオミクス分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、並びにｃＤＮＡ及び／又はオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用する発現／転写プロフィールの使用が挙げられる。次に、癌発達の異なる段階における発現プロフィールの比較を実施することで、発現パターンが変化している遺伝子を同定することができる。
【００３４】
本明細書で使用される「試験化合物」とは、巨大分子、例えば、ポリペプチド、核酸、多糖類、及び脂質、並びに小型分子を意味する。試験化合物は、本発明の再構成ヒト乳房腫瘍モデルからなる宿主マウスに、経口、直腸内、膣内、局所、経鼻、経眼又は非経口投与によって投与することができる。非経口投与には、皮下、静脈内、筋肉内及び胸骨内注入、並びに輸液技法が挙げられる。マウス実験における代表的な投与経路は、尾静脈への注入である。
【００３５】
好ましくは、試験化合物は、投与量、化合物の溶解性、及び投与経路のような要因を考慮して配合される。経口投与用の固体製剤は、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又はアルギン酸のような適切な担体又は賦形剤を含有することができる。使用できる崩壊剤には、例えば、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、ナトリウムデンプングリコレート、及びアルギン酸が挙げられる。錠剤結合剤には、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプン、及びエチルセルロースが挙げられる。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン油、タルク、ロウ、油、及びコロイドシリカが挙げられる。水又はその他の水性ビヒクルで調製される経口投与用の液体製剤は、メチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコールのような懸濁剤を含有してもよい。該液体製剤には又、活性成分と共に、湿潤剤、甘味料及び風味剤を含有する、液剤、乳剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれてもよい。注射用製剤は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）のような担体を含有してもよい。生理学的に許容される賦形剤には、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル溶液、又はその他の適切な賦形剤が挙げられる。筋肉内調合剤、例えば化合物の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水、又は５％グルコース溶液のような医薬賦形剤に溶解し、投与することができる。化合物の適切な不溶性形態は、長鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸エチル）のエステルのような、水性基剤又は薬学的に許容される油基剤中の懸濁剤として調製し、投与することができる。局所半固体軟膏製剤は一般的に、医薬クリーム基剤のような担体中に約１〜２０％、例えば５〜１０％の濃度で活性成分を含有する。局所使用のための多様な製剤には、滴薬、チンキ剤、ローション剤、クリーム剤、液剤、及び活性成分を含有する軟膏、並びに多様な支持体及びビヒクルが挙げられる。各医薬製剤中の治療薬の最適な比率は、製剤自体、及び特定の病理において望まれる治療効果、並びに相関する治療レジームによって変動する。医薬製剤は、十分に確立された技術分野であり、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２０００） （ＩＳＢＮ： ０６８３３０６４７２）； Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ７ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０６８３３０５７２７）；及びＫｉｂｂｅ （ｅｄ．）， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ３ｒｄ ｅｄ． （２０００） （ＩＳＢＮ： ０９１７３３０９６Ｘ）に更に記載される。
【００３６】
多様なパラメータを使用することで、試験化合物が「抗腫瘍効果」を示すかどうかを判定することができる。当該パラメータの例には、腫瘍組織中のアポトーシスの量、腫瘍組織中の血管新生のレベル、導管過形成のような過形成性成長の数、腫瘍組織の分化若しくは形態形成の効果、又は単に大きさ、例えば腫瘍の直径若しくは容量が挙げられる。測定されるパラメータの選択及びそれらの解釈は、特定の実験における目的により左右される。当該選択及び解釈は、当該技術分野における通常の技能の範囲内に含まれる。
【００３７】
実験設計には相当な許容範囲がある。例えば、任意の種類の実験設計では、試験動物と対照動物が個別に分かれ、実質的に同一である場合もあれば、別の種類の実験設計では、試験化合物とビヒクルが、同じ動物における別々の腫瘍、例えば、左側と右側に局所的に投与される場合もある。当然のことながら、動物の一団は、用量反応試験において広範な投与を受けることができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例により更に説明する。実施例は、説明の目的のためにのみ提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を如何様にも制限するものとして解釈するべきではない。
【００３９】
（実施例１：乳房腫瘍モデルの作成）
ヒト組織及び細胞株
還元乳房形成術からの新鮮ヒト乳房組織は、施設の指針及びＩＲＢ認可に従って、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（米国マサチューセッツ州ボストン）のＤｒ． Ａｎｄｒｅａ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎにより提供された。新鮮組織を、２．８ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及び０．６ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを使用して、３７℃で一晩消化した。翌朝、消化されたヒト上皮オルガノイド（上皮細胞のクラスター）及び一次線維芽細胞を遠心分離により収集した。上皮オルガノイド及び一次線維芽細胞の混合物を、標準寒剤で凍結し、液体窒素中に保存した。不死化ヒト乳房線維芽細胞株は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｄのＣｈａｒｌｏｔｔｅ Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒから提供された。
【００４０】
ベクター構成体
レンチウイルスベクターを、ヒト乳房上皮細胞の形質導入に使用した。以下の全てのレンチウイルスベクターを構成する際に使用したレンチウイルスバックボーンは、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯであり、これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド；カタログ番号Ｋ４９５５−１０）から市販されている。
【００４１】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒは、以下のように構成した。２．７ｋｂのＳＶ４０ｅｒ ＤＮＡフラグメント（ＬＴ及びｓｔを含む）は、ｐＳＶ３−ｄｈｆｒベクター（ＡＴＣＣ番号３７１４７）をＳｆｉ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化することにより得た。次に、２．７ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。続いて、ＳＶ４０−ブラストシジンＤＮＡフラグメントを、得られた構成体から除去して、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒレンチウイルス構成体を形成した。
【００４２】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰは、以下のように構成した。ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒ構成体と同様に、５５８ｂｐのＫＲＡＳ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化し、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ｃＤＮＡをＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ（カタログ番号２４０１４３）から購入し、ＳＶ４０プロモーターの下流にクローン化した。この構成体を作製する際に使用したＫＲＡＳは、ＫＲＡＳＧ１２Ｖであった。野生型ＫＲＡＳ ｃＤＮＡのＧｅｎｂａｎｋ受入番号は、ＮＭ−０３３３６０である。本発明者等は、アミノ酸残基１２がグリシンからバリンに変わった突然変異形である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（Ｈａｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＬｙｎｄａ Ｃｈｉｎからの贈呈品）を使用した。
【００４３】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２は、以下のように構成した。３９９２ｂｐのｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； カタログ番号Ｋ４９５５−１０）におけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。この構成体を作製する際に使用したｅｒｂＢ２は、ｅｒｂＢ２Ｖ６５９Ｅであった。野生型ｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡの受入番号は、Ｍ１１７３０である。特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸残基６５９をＶからＥに変えた。
【００４４】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２は、以下のように構成した。ｐ５３ｓｈＲＮＡ配列は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６： ５５０−５５３に記載される通りであった。Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡカセットを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２におけるＣＭＶプロモーターの前に置いて、このベクターを形成した。
【００４５】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰは、以下のように構成した。ｐ５３ｓｈＲＮＡ配列は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６： ５５０−５５３に記載される通りであった。Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡカセットを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにおけるＣＭＶプロモーターの前に置いて、最終構成体Ｐｌｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを形成した。
【００４６】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように構成した。ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットのｃＤＮＡクローンは、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＥＨＳ１００１−１２５９６８７）から購入した。ミリストイル化配列を、ｐ１１０αの５′末端にクローン化して、ミリストイル化ｐ１１０α ｃＤＮＡクローンのＰＩＫ３ＣＡ−ｍｙｒを形成した。ＰＩＫ３ＣＡ−ｍｙｒ ｃＤＮＡを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化して、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡを形成した。
【００４７】
ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ カタログ番号ＭＧＣ−２３１６）から得た。ＣＭＶプロモーターを、ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡの５′末端に置いた。次にＣＭＶ−ＣＣＮＤ１フラグメントを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡにおけるＰＩＫ３ＣＡの３′末端にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を形成した。
【００４８】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈは、以下のように構成した。野生型ヒトｐ５３クローンは、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＭＧＣ−６４６）から購入した。特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸残基１７５をＲからＨに変えた。次に、突然変異ｐ５３ ｃＤＮＡ（ｐ５３Ｒ１７５Ｈ）を、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように作成した。ＰＰ２Ａ Ｂ５６γ ｓｈＲＮＡの配列は、ｇｃａｇａｇｔａａｃｔｇｇａａａｔａａｔｇｇｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｔｃｃａｇｔａａｃｔｃｔｇｃである。ＰＰ２Ａ ｓｈＲＮＡを、Ｕ６プロモーターの下流に置き、Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡフラグメントを、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化して、ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡを生成した。構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３Ａ（１１０α−ｍｙｒ）＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１における前述のＣＭＶ−ＣＣＮＤ１フラグメントを、−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡの３′末端にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を生成した。
【００４９】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように作成した。ヒトＢｍｉ１及びＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡの両クローンは、ＡＴＣＣ（それぞれ、カタログ番号ＭＧＣ−１２６８５及びＭＧＣ−２３１６）から得た。ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。ＣＭＶ−Ｂｍｉ１フラグメントを、ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１の５′末端の直前にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を生成した。
【００５０】
レンチウイルスを、前述のレンチウイルス構成体及び最適化したパッケージングプラスミドミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； カタログ番号Ｋ４９７５−００）による２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより産生した。トランスフェクションは、製造元の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１６６８−０１９）に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００トランスフェクション試薬を使用して実施した。
【００５１】
脂肪パッドの除去及び線維芽細胞の感染
乳腺の上皮成分を、乳首とリンパ節の間の部分を除去することよって排除し、それにより除去済み脂肪パッドを残した。前記除去技法は、基本的にＤｅ Ｏｍｅ ｅｔ ａｌ．， １９５９ （ｓｕｐｒａ）により記載される通りであった。次に、不死化ヒト線維芽細胞（ＲＭＦ−ＨＧＦ）を、脂肪パッドが除去済みになった直後又は脂肪パッドが除去済みになったおよそ２週間後の何れかで、除去済み脂肪パッドに注入した。
【００５２】
不死化ヒト線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び５０ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞の半分を、注入の前日に、２ｍＵ／ｍｌのブレオマイシンで３０分間処理した。注入日に、ブレオマイシン処理線維芽細胞と未処理線維芽細胞の１：１ミックスを、除去済み脂肪パッドに注入した。注入部位当たり、およそ０．５×１０６の細胞を注入した。
【００５３】
ヒト乳房上皮細胞の形質導入
ヒト上皮細胞オルガノイドと一次線維芽細胞の混合物を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で４時間培養し、その間に線維芽細胞は培養皿に付着した。付着していないオルガノイドを上澄みから収集し、２回のスピン感染に付した。１回目のスピン感染の際に、約５０μｌのオルガノイドペレットを、形質導入される遺伝子を発現する１０５〜１０９ｃｆｕのレンチウイルスを含有するＨＭＥＣ培地１ｍｌに再懸濁した。オルガノイド／ウイルス混合物を、６ウエル培養平板の一つのウエルで平板培養し、４００×ｇで９０分間回転させた。感染の終了時に、１ｍｌの新鮮なＨＭＥＣ培地をウエルに加え、該培養平板を３７℃のインキュベーターに最低２時間戻した。次にオルガノイドを、形質導入される別のセットの遺伝子を発現する１０５〜１０９ｃｆｕのレンチウイルスを含有するＨＭＥＣ培地１ｍｌを加えて、２回目のスピン感染に付した。２回目のスピン感染の終了時に、１ｍｌの新鮮なＨＭＥＣ培地をオルガノイド懸濁液に加え、インキュベーターに戻した。感染したオルガノイドは、２回目の感染の２〜１８時間後に脂肪パッドへの注入の準備が整った。
【００５４】
感染オルガノイドの注入
約１〜１００の感染オルガノイドを、（ａ）２週間前にヒト線維芽細胞を注入した脂肪パッドに単独で注入するか、又は（ｂ）０．２５×１０６の癌腫関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と混合した後に注入するか、又は（ｃ）０．２５×１０６のブレオマイシン処理不死化ヒト線維芽細胞及び０．２５×１０６の未処理不死化ヒト線維芽細胞の混合物と混合した後に注入した。該細胞調製物を、コラーゲン対マトリゲルミック比１：１のミックスに再懸濁し、注入部位当たり約３０〜５０μｌの容量で注入した。
【００５５】
（実施例２：レンチウイルス感染及びｐ５８ ｓｈＲＮＡノックダウンの効果）
ｐ５３の発現をノックダウンするｐ５３ ｓｈＲＮＡの効果を判定するため、及びレンチウイルス系による遺伝子移入の効果を判定するため、２９３Ｔ細胞及びＨＭＥＣオルガノイドを、ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを発現するレンチウイルスで感染させた。試料の処理、並びにレンチウイルスの調製及び感染は、実施例１に記載される通りであった。感染の３日後、細胞は、感染率の推定をＵＶ光線下で観察し、実時間ＲＴ−ＰＣＲによりｐ５３及びＫＲＡＳ発現を分析するために収集した。ほぼ全ての２９３Ｔ細胞が、レンチウイルスに感染していた。感染した２９３Ｔ細胞におけるｐ５３の発現レベルが、模擬感染細胞の約３．６％であったため、本発明者等は、ｐ５３転写の約９７．４％のノックダウンがレンチウイルス感染により２９３Ｔ細胞において達成されたと結論付けた。ＨＭＥＣオルガノイドでは、細胞の約５０％がレンチウイルスに感染していた。又、感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物におけるｐ５３の発現レベルが、模擬感染ヒト乳房上皮細胞の約５０％であるため、本発明等は、ｐ５３転写のほぼ１００％のノックダウンもレンチウイルス感染によりＨＭＥＣにおいて達成されたと結論付けた。同様に、ＫＲＡＳ発現は、２９３Ｔ細胞及びＨＭＥＣの両方においてレンチウイルス感染により約７０倍増加した。
【００５６】
（実施例３：ｐ５３ ｓｈＲＮＡ及びｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣから発生するヒト乳房前癌性病巣及びＣＩＳ）
レンチウイルス系を使用して、本発明者等は、限られたセットの遺伝因子で形質導入された正常な一次ＨＭＥＣからヒト乳癌を生成できるかを判定することにした。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。マウスにヒト乳房腫瘍モデルを生成する第一段階として、本発明者等は、レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰ又はｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒＢｂ２を使用して、ｐ５３ ｓｈＲＮＡとｅｒｂＢ２Ｖ６５９Ｅ又はＫＲＡＳＧ１２Ｖとにより、ヒト乳房上皮細胞を形質導入した。感染させたＨＭＥＣオルガノイドを、注入の前にヒト乳房線維芽細胞と混合するか、又は２週間前に不死化ヒト線維芽細胞を注入した脂肪パッドに単独で注入した。全ての組み合わせにおいて、正常な、例えば末端管小葉単位、及び過形成ヒト乳房構造は、移植後１〜１２ヶ月の間に移植部位で発生した（図１及び図２）。しかし、形質導入されたＨＭＥＣから腫瘍は発生しなかった。
【００５７】
（実施例４：ＳＶ４０初期領域及びｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣから発生した癌腫）
実施例３に例示される通り、ｅｒｂＢ２又はＲＡＳは単独でマウス乳房上皮細胞を形質転換することができるが、ＨＭＥＣは形質転換しない。本発明等は、ＳＶ４０ｅｒとｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳが本発明の組織再構成系によりインビボでＨＭＥＣを形質転換できるかを判定することにした。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒ及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２又はｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを使用して、ＨＭＥＣをＳＶ４０ｅｒとｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入した。感染させたＨＭＥＣを、注入の前に不死化ヒト線維芽細胞と混合するか、又は不死化ヒト線維芽細胞を予め注入した脂肪パッドに単独で注入した。全ての組み合わせにおいて、腫瘍は感染させたＨＭＥＣから発生し、腫瘍潜伏は１〜３ヶ月の範囲であった。
【００５８】
２人の独立した病理学者である、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｃａｌのＤｒ． Ａｎｒｅａｓ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＶｅｒｍｏｎｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ． Ｍａｒｃｕｓ Ｂｏｓｅｎｇｂｕｒｇが、腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色を調べ、発生した腫瘍は低分化浸潤癌であったと結論付けた（図３及び図４）。発生した腫瘍は、ヒトの腫瘍との著しい相違を示していない。該腫瘍は、マウスの乳房に発生する大多数の腫瘍よりも更にヒトの乳癌に似ていた。これは、多い間質成分、腫瘍細胞の侵入巣及び島の構築、並びに高レベルの細胞多形性のためであった。
【００５９】
（実施例５：ＭａＳＳスクリーニング）
この実施例では、ヒト細胞における癌関連遺伝子を同定する工程を記載する。
【００６０】
腫瘍細胞のレトロウイルス感染
Ｍｏ−ＭｕＬＶ産生細胞株ＴＭＪ（ＮＩＨ３Ｔ３系細胞株）を、必要な数のプレート（１００ｍｍ）で平板培養する。前記細胞を培養し、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地で維持する。ウイルス産生では、ＴＭＪ細胞を４〜５ｍｌの新鮮な培養基に供給し、培養上澄みを８〜１２時間後に採取する。該上澄みを０．４５μＭフィルターで濾過する。
【００６１】
ヒトの細胞はエコトロピック受容体を発現しないため、Ｍｏ−ＭｕＬＶにより感染させることはできない。そこで、最初にヒト乳癌細胞をＭＣＡＴ１とブラストシジン選択マーカーを発現するレンチウイルスの感染を介して、エコトロピック受容体遺伝子であるＭＣＡＴ１により形質導入する。次にブラストシジン耐性偽型ヒト乳癌細胞を、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）の存在下で、１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ培地中に維持する。平板培養のおよそ１８〜２４時間後、又はプレートが７０〜８０％のコンフルエントになった段階で、乳癌細胞を、ポリブレン（６〜８μｇ／ｍｌ）の存在下で、濾過ウイルス上澄みにより感染させる。この時点から、乳癌細胞を、ドキシサイクリンの非存在下で維持する。
【００６２】
感染のおよそ１８時間後、感染乳癌細胞をトリプシン処理して、すすぎ洗いし、ハンクス平衡塩類溶液に懸濁する。細胞懸濁液を氷上に保持し、トリプシン処理後の取り扱い時間を最小限に保つ。約１×１０６の細胞を、ドキシサイクリンを含まない水を与えたＳＣＩＤマウスの側腹部に注入する。動物では腫瘍発生を観察する。対照動物にも１×１０６の非感染細胞を同様に注入する。一般的に腫瘍はおよそ２１日後に発生する。腫瘍を採取し、腫瘍組織を直ぐに液体窒素中で素早く凍結する。
【００６３】
逆ポリメラーゼ連鎖反応
ＤＮＡをＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ単離キットを使用して腫瘍組織から単離した。１０μｇのゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ又はＳａｃＩＩで完全に消化し、６５℃で２０分間インキュベートすることにより反応を終了させる。消化試料を、４０００Ｕの高濃度Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）を使用して、稀釈６００μｌの反応容量中で自己結合させる。結合は１６℃で一晩から２４時間実施する。結合したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、４０μｌの滅菌水に溶解する。次に、結合したＤＮＡを１：１０及び１：１００の比率に連続して稀釈し、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）に付す。
【００６４】
候補遺伝子の同定
ヒトゲノムへのレトロウイルスの組み込み部位を、全てのＩＰＣＲ配列で以下のようにマッピングする。レトロウイルスリーダー配列をＩＰＣＲ産物の生配列から切り取り、切り取った配列のホモロジー検索を、ＢＬＡＳＴソフトウェアプログラムを使用して、ＮＣＢＩ ＭＧＳＣＶ３データベースで実施する。ＢＬＡＳＴヒットを分析し、マウスの多発性腫瘍における反復組み込み部位を同定する。反復は１０ｋｂの領域内における２回以上の組み込みとして定義される。発現がレトロウイルスの組み込みによる影響を受ける遺伝子を同定するため、ＮＣＢＩ Ｍａｐ Ｖｉｅｗを使用して、マウスゲノムに対するそれぞれのレトロウイルス反復組み込み部位を確認した。当該部位のすぐ近くに隣接する遺伝子を、ＭＧＳＣＶ３ Ｇｅｎｅマップを使用して同定する。前記遺伝子は癌関連候補遺伝子として定義されるが、それは、圧倒的多数の場合において、ＭｕＬＶ組み込みが最も近位の遺伝子に影響を与えるためである。組み込みが遺伝子内で起こると、当該遺伝子は、レトロウイルス組み込みの効果の標的として最良の候補と考えられる。
【００６５】
（実施例６：マウスにおけるヒト乳房腫瘍の増殖）
ヒト原発性乳房腫瘍をマウスで増殖させることは困難であり、実用的ではなかった（Ｓｅｂｅｓｔｅｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｊ， Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ６３： １３３１−７； Ｒａｅ−Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４０： ９５−１００； Ｓａｋａｋｉｂａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｓｃｉ． Ａｍ． ２： ２９１）。大部分の腫瘍は、マウスでは非常にゆっくりと成長して、６ヶ月から１２ヶ月の潜伏期間があり、或いは全く成長しないこともあった。したがって、本発明等は、ｅｒｂＢ２２及びＳＶ４０ｅｒでトランスフェクトしたヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の腫瘍形成性に対する、周囲の始原ヒト線維芽細胞における表現型の差の効果を試験することにした。
【００６６】
ＨＭＥＣ及びヒト線維芽細胞は、実施例１（上記）に記載されるようにして得た上、培養した。本発明等は、ＨＭＥＣを単独で、又は培養線維芽細胞（ＲＭＥ；還元乳房線維芽細胞）と混合して、組み換え肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を発現する不死化ヒト線維芽細胞を予め注入したマウス乳房脂肪パッドに移植した。結果を表１にまとめる。
【００６７】
５人の患者（ＨＭＥＣ５〜ＨＭＥＣ９）から得たＨＭＥＣは、移植時にｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒにより形質導入され、ＲＭＦ−ＨＧＦ（還元乳房形成線維芽細胞−肝細胞成長因子）と混合されると、一貫して腫瘍を生じた（頻度８３％〜１００％）。対照的に、同じＨＭＥＣを同じ遺伝子（ｅｒｂＢ２及びＳＶ４０ｅｒ）により形質導入するものの、不死化されていない始原ヒト線維芽細胞（一次ＲＭＦ１１及び一次ＲＭＦ１３）と混合されると、腫瘍は稀にしか発生しなかった（０％〜１７％（１／６））。何れの線維芽細胞とも混合しないで移植した場合、ｅｒｂＢ２２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣは、移植部位の１１％（１／９）で腫瘍を生じた。腫瘍潜伏期間は１〜３ヶ月の範囲であった。これらの結果は、不死化ヒト線維芽細胞がｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣの腫瘍形成性を促進する一方で、非不死化ヒト一次乳房線維芽細胞が腫瘍形成性を促進せず、おそらくは阻害したことを示した。
【００６８】
ｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣからの腫瘍発生率に対するヒト間質線維芽細胞の効果を実証するこれらのデータは、不死化ヒト線維芽細胞と混合する適切な微環境を前提とすると、ヒトの患者の原発性乳房腫瘍はマウスで成長し、従ってマウスで有効に増殖できることを示している。
【００６９】
【表１】
１．ＨＧＦを発現する不死化ＲＭＦ
２．ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するが、組み換えＨＧＦを発現しないＲＭＦ
３．遺伝子操作していないＲＭＦ。
【００７０】
（実施例７：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＰＩＫ３ＣＡ＋ＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生したヒト乳腺癌）
ＳＶ４０ｅｒを含有する再構成ヒト乳癌モデルを開発した後、本発明等は、ヒトの遺伝子のみを使用して、或いはＳＶ４０ｅｒの非存在下で遺伝子突然変異、又はノックダウン若しくはノックアウトを使用して、マウスでヒト乳房腫瘍を発生させようとした。本発明等は、（ａ）ヒトＫＲＡＳ、（ｂ）ヒトｐ５３における点突然変異、即ち、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、（ｃ）Ｒｂ機能を不活性化するＣＣＮＤ１を過剰発現する遺伝子構成体、及び（ｄ）ＰＩ３Ｋのヒトｐ１１０α触媒サブユニット（ＰＩＫ３ＣＡ）を過剰発現する遺伝子構成体を、ＨＭＥＣに導入した。
【００７１】
試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを使用して、ＨＭＥＣをｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ＣＣＮＤ１、ＰＩＫ３ＣＡ及びＫＲＡＳにより形質導入した。感染させたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、ＲＭＦ−ＨＧＦを注入した除去済みマウス脂肪パッドに移植した。移植の２ヶ月後に、注入部位のおよそ５０％で触診可能な腫瘍が発生した。腫瘍を移植の３ヶ月後に収集し、組織病理学的分析にかけた。Ｖｅｒｍｏｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの病理学者であるＤｒ． Ｍａｒｃｕｓ Ｂｏｓｅｎｂｕｒｇが、Ｈ＆Ｅ染色移植切片を調べ、腫瘍は低悪性度浸潤性腺管癌として発生したと結論付けた（図５）。
【００７２】
新たに収集した腫瘍は、ＵＶ光線下で緑色蛍光を示した。このことは、ＣＭＶ−ＫＲＡＳ及びＳＶ４０−ＧＦＰが同じレンチウイルス構成体、即ちｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰに存在するため、ＫＲＡＳ癌遺伝子を発現したことを示している。ｐ５８抗体を使用して、腫瘍切片でＩＨＣを実施した。これにより、腫瘍におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈの発現を確認した。ゲノムＤＮＡをＫＲＡＳ／ｐ５８Ｒ１７５Ｈ／ＣＣＮＤ１／ＰＩ３Ｋ腫瘍から抽出し、ＰＣＲにより遺伝子型分析にかけた。前記分析によって、腫瘍ゲノムが、腫瘍の生成に使用したレンチウイルスＤＮＡ構成体の全て、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを担持したことが明らかになった。
【００７３】
（実施例８：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋ＰＰ２Ａ ｓｈＲＮＡにより形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生した腺癌）
一次ＨＭＥＣの形質転換に必要な遺伝因子を解明するため、三つのレンチウイルス、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰ、及びｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１それぞれを介して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡによりＨＭＥＣを形質導入した。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。形質導入されたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、予めＲＭＦ−ＨＧＦを注入した２０個の腺に注入した。移植の２ヶ月後に、腺の２５％（５／２０）で触診可能な腫瘍が発生した。
【００７４】
２個の腺を同時に収集したが、これらはＵＶ光線下で緑色蛍光を示した。このことは、腫瘍がｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにより形質導入されたＨＭＥＣから誘導されたことを示している。腫瘍のＨ＆Ｅ染色により、これらが高分化から中程度の分化の腺癌であったことが明らかになった（図６）。
【００７５】
（実施例９：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋Ｂｍｉ１により形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生した腺癌）
一次ＨＭＥＣの形質転換に必要な遺伝因子に関する追加のデータを得るため、三つのレンチウイルス、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを介して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋Ｂｍｉ１によりＨＭＥＣを形質導入した。形質導入されたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、ＲＭＦ−ＨＧＦでヒト化した２０個の腺に注入した。移植の２ヶ月後に、腺の２５％（５／２０）で触診可能な腫瘍が発生した。
【００７６】
２個の腺を同時に収集したが、これらはＵＶ光線下で緑色蛍光を示しており、このことは、腫瘍がｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにより形質導入されたＨＭＥＣから誘導されたことを示している。腫瘍のＨ＆Ｅ染色により、これらが中程度の分化の腺癌であったことが明らかになった（図７）。
【００７７】
その他の実施形態は、請求項の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により形質導入されたヒト乳房上皮細胞から成長したヒト乳房組織の全載標本の蛍光写真である。ヒト乳房上皮細胞オルガノイドは、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及びＧＦＰを発現するレンチウイルスに感染させた。感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物は、不死化ヒト乳房線維芽細胞を予め注入した、除去済み脂肪パッドに注入した。乳腺を移植の６ヶ月後に収集し、ＵＶ顕微鏡検査にかけた。ＴＤＬＵ＝末端管小葉単位。括弧は図２に示される領域を示す。
【図２】図１の乳腺画像の蛍光の強い領域のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である（倍率：４０倍）。ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及びＧＦＰにより形質導入されたヒト乳房上皮細胞から過形成が発生している。
【図３】実施例４に記載される、ＳＶ４０ｅｒ及びＫＲＡＳにより形質導入されたヒト乳房上皮細胞から発生する原発性ヒト乳房腫瘍の写真である。ヒト乳房上皮細胞オルガノイドは、ＳＶ４０ｅｒ及びＫＲＡＳを発現するレンチウイルスに感染させた。感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物は、不死化ヒト乳房線維芽細胞を予め注入した、除去済み脂肪パッドに注入した。乳腺を移植の１ヶ月後に収集した。腫瘍は十分に血管新生化していたことがこの画像から見て取ることができる。
【図４】実施例４の図３に示されるヒト乳房腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。発生した腫瘍は、低分化浸潤性腺癌である。多い間質成分、腫瘍細胞の侵入巣及び島、並びに高レベルの細胞多形性が、ヒト乳癌の特徴である。
【図５】実施例７に記載される３ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、中程度の分化から低分化の腺癌であることが明らかである。いくらかの腺性分化が認めれれるが、より多くの細胞学的異型性及びより多くの混乱した構築の領域（中央から右上）が存在する。
【図６】実施例８に記載される２ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、高分化から中程度の分化の腺癌であることが明らかである。
【図７】実施例９に記載される２ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、中程度の分化の腺癌であることが明らかである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願第１１／００６，４１３号（２００４年１２月７日出願）及び米国特許出願第１１／１７０，３３８号（２００５年６月２８日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、分子生物学及び腫瘍学である。
【背景技術】
【０００３】
従来のヒト−マウス異種移植モデルは、ヒト癌細胞をインビボで扱える利点を提供する。しかし不都合なことは、ヒト細胞が長年にわたり、別個の細胞系（ＮＣＩ６０パネル）として培養中に維持されてきたことである。このことは、原発性腫瘍細胞と比較すると、異種移植細胞の間の特性及び挙動に有意な差をもたらす可能性がある。原発性腫瘍細胞を扱う必要性に対処するため、マウスに自然発生腫瘍をもたらすインビボモデルが開発されてきた。例えば、特許文献１を参照のこと。しかし、これらのモデルにおける腫瘍細胞はマウスの腫瘍細胞である。したがって、ヒトの癌研究において、種を越えた実験結果の推定が依然として必要である。
【特許文献１】米国特許第６，６３９，１２１号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
遺伝子的にヒトの乳房腫瘍をマウスに生じる技法が発見された。この発見に基づいて、本発明は、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを特徴とする。
【０００５】
モデルは、少なくとも一つの自然発生腫瘍を含む。腫瘍は、複数のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を含む。一部の実施形態において、ＨＭＥＣは、組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、及び組み換えＳＶ４０初期領域（ＳＶ４０ｅｒ）を含む。別の実施形態において、ＨＭＥＣは、組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、又はｐ５３経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子若しくはｓｈＲＮＡを含む。ｐ５３経路を阻害する代表的な導入遺伝子は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈのような、ヒトｐ５３不能突然変異をコードする導入遺伝子である。ヒトＲｂ経路は、例えば、組み換えサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）遺伝子の発現又は過剰発現により阻止又は阻害される可能性がある。
【０００６】
好ましくは、腫瘍成長部位は、マウスの乳房脂肪パッド、マウスの生殖腺脂肪パッド、マウスの腎臓莢膜、又はマウスの皮下部位、例えば側腹部の皮下部位である。本発明の一部の実施形態において、モデルは又、複数のヒト線維芽細胞、例えばヒト乳房線維芽細胞も含む。ヒト線維芽細胞の一部又は全ては、腫瘍の中に位置することができる。ヒト線維芽細胞は、癌腫関連線維芽細胞、又は遺伝子操作された線維芽細胞、例えば不死化線維芽細胞、並びに始原ヒト線維芽細胞であってもよい。
【０００７】
本発明に従ってヒト乳房上皮細胞に導入できるヒト癌遺伝子の例には、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫとも呼ばれる）、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＥ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２とも呼ばれる）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、及びＢｍｉ１が挙げられる。好ましいヒト癌遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＥｒＢ２、及びサイクリンＤ１である。
【０００８】
本発明の一部の実施形態において、組み換えヒト癌遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。有用な誘導性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター、及びミフェプリストン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましい誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。
【０００９】
本発明は又、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスの作製方法も提供する。一つの方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；（ｂ）ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｃ）ヒト乳房上皮細胞に組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを導入する工程；及び（ｄ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び形質導入ヒト乳房上皮細胞を互いに近接してマウスに移植する工程。
【００１０】
代替の方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；（ｂ）ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｃ）ヒト乳房上皮細胞に、（ｉ）組み換えヒト癌遺伝子、例えばＫＲＡＳ、（ｉｉ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを導入し、それによって、形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；及び（ｄ）非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程。
【００１１】
線維芽細胞及び上皮細胞は、乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は皮下部位（例えば側腹部の皮下部位）が含まれるが、これらに限定されない部位に移植することができる。
【００１２】
本発明は又、癌関連遺伝子を同定する方法も提供する。該方法には、（ａ）マウスの再構成ヒト乳房腫瘍モデルにおける自然発生腫瘍から腫瘍細胞を提供する工程（この場合、該腫瘍は、（１）誘導性プロモーターの制御下の組み換えヒト癌遺伝子、及び（２）ＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む）；（ｂ）細胞のゲノムに組み込まれる核酸を細胞に導入し、それによって核酸が組み込まれた遺伝子座を標識する工程；（ｃ）誘導性プロモーターのインデューサーが存在しない条件下で細胞を培養する工程；（ｄ）腫瘍形成性が核酸分子の組み込みにより誘導された細胞を同定する工程；及び（ｅ）組み込んだ核酸分子により工程（ｃ）の細胞中で標識された遺伝子を、癌関連遺伝子として同定する工程が含まれる。一部の実施形態において、核酸分子はレトロウイルス配列、例えばモロニーマウス白血病ウイルスを含む。
【００１３】
本発明は又、化合物の抗腫瘍効果を試験する方法も提供する。一部の実施形態において、該方法には、（ａ）組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む自然発生腫瘍を含む再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを準備する工程；（ｂ）マウスに試験化合物を投与する工程；及び（ｃ）適切な対照と比較して、腫瘍に対する試験化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程が含まれる。
【００１４】
代替の実施形態において、該方法には、（ａ）（ｉ）組み換えヒト癌遺伝子、（ｉｉ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含有する複数のヒト乳房上皮細胞を含有する自然発生腫瘍を含む再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスを準備する工程；（ｂ）マウスに試験化合物を投与する工程；及び（ｃ）適切な対照と比較して、腫瘍に対する試験化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程が含まれる。
【００１５】
本発明は又、マウスにおいてヒト乳房原発性腫瘍を増殖させる方法も提供する。該方法には、（ａ）腫瘍からヒト乳房上皮細胞を提供する工程；（ｂ）不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を提供する工程；（ｃ）上皮細胞及び線維芽細胞を互いに近接してマウスに移植する工程；及び（ｄ）腫瘍を増殖させる上で十分な時間にわたりマウスを維持する工程が含まれる。上皮細胞及び線維芽細胞は、マウスの乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は側腹部皮下の部位に移植することができる。本発明の好ましい実施形態において、上皮細胞及び線維芽細胞は、乳房脂肪パッドに移植される。一部の実施形態において、乳房脂肪パッドには、不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞が予め注入される。本発明の一部の実施形態において、上皮細胞及び線維芽細胞は移植の前に混合され、細胞混合物として移植される。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関係する当業者により通例理解されるものと同じ意味を有する。不一致が起こる場合、定義を含めた本発明の明細書が支配する。本明細書に記述される全ての出版物、特許、及びその他の参考文献は、全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することできるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。材料、方法及び実施例は、説明のためのものであり、限定するものとして意図されていない。本発明のその他の特徴及び利点は、詳細な説明及び請求項から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、再構成ヒト乳房腫瘍モデルを提供する。前記モデルにおいて、腫瘍は、マウスで成長しているヒト乳房組織から自然発生する。ヒト癌生物学の基礎研究、並びに医薬品の発見及び開発において、このモデルは三つの主要な利点を提供する。第一に、前記モデルは、自然発生する原発性腫瘍を提供し、それによって天然に生じるヒト乳癌を模倣するという点である。第二に、腫瘍は、宿主マウスに移植したヒト乳房上皮細胞から発生したヒト乳腺から生じるため、遺伝子的にヒトであるという点である。第三に、腫瘍は限定した遺伝子要素により形成されるため、ヒト原発性腫瘍の経路関連腫瘍形成性を研究する機会をもたらすという点である。
【００１９】
乳房間質線維芽細胞が乳房上皮細胞の成長及び分化を支持する証拠が発表されている。例えば、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：４８８６−４８９８６；及びＰａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １１： ４３７−４５８を参照のこと。したがって、ヒト線維芽細胞、例えばヒト乳房線維芽細胞は、本発明を実施する際に本目的に使用することができる。ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、互いに隣接して、例えば単一の乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、又は皮下の注入部位内に移植される。ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、混合して、マウスにおける移植の選択された部位に共注入することができる。場合により、線維芽細胞は、上皮細胞の注入の前、例えば１〜４週間前に注入して、ヒト乳房上皮細胞の導入の前に、線維芽細胞が繁殖し、マウスの組織に進入する時間を持たせることができる。
【００２０】
マウス乳房上皮は、出産後、乳首領域から広がることにより発達する。３週齢では、乳房上皮細胞からなる乳管は、リンパ節に達していない。したがって、乳腺のマウス上皮成分は、乳首とリンパ節の間の部分を除去することによって排除でき、それにより「除去済みの」脂肪パッドが残る。例えば、Ｄｅ Ｏｍｅ ｅｔ ａｌ， １９５９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９： ５１５−５２０； Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １： ７５−８９を参照のこと。本発明の一部の実施形態において、ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞は、宿主マウスの除去済み乳房脂肪パッドに移植される。しかし、脂肪パッドを除去する必要はない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態において、線維芽細胞及び上皮細胞は、マウスの生殖腺脂肪パッドに移植される。別の実施形態において、線維芽細胞及び上皮細胞は、マウスの腎臓莢膜に移植される。例えば、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２， ｓｕｐｒａを参照のこと。別の代替案には、線維芽細胞及び上皮細胞をマウスの皮下、例えばマウスの側腹部の皮下に移植することがある。
【００２２】
線維芽細胞及び上皮細胞をマウスへ移植するための関連する多様な外科手技が開発されており、当該技術分野において知られている。例えば、Ｏｕｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ５５： １４６１−１４６６； Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３６： ２６０５−２６１０； ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４１： ３３００−３３０５； ＭａｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃａｎｃｅｒ ５４： １９２０−１９２７； Ｅｄｗａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照のこと。一般的に移植は、ハミルトンシリンジを使用する注入によるが、ヒト細胞をマウスへ導入するあらゆる適切な技法を用いることができる。
【００２３】
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞は、ヌードマウスに腫瘍を形成しない及び軟寒天アッセイでコロニーを形成しない、ヒト線維芽細胞である。移植される非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞の種類は、一般的に重要ではない。便宜上、不死化線維芽細胞を使用することができる。不死化ヒト線維芽細胞は、老化することなくインビトロで永久的に分割することができるヒト線維芽細胞である。一次ヒト間質線維芽細胞は、任意の適切な方法により不死化することができる。当該技術分野では多様な方法が知られている。例えば、線維芽細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）をコードする発現ベクターによる適切な形質転換により、不死化することができる。例えば、米国特許第６，２６１，８３６号（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと。又、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｒｅｓ． ４３： １６７−１７４を参照のこと。或いは、通常細胞培養において幾つかの経路を生存させることができる一次線維芽細胞は、本発明を実施する際に、移植に使用することができる。別の代替案には、癌腫関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を使用することがある。ＣＡＦ細胞は、ヒト乳房腫瘍、例えば乳房切除切片から単離することができる。
【００２４】
培養（並びにその後の線維芽細胞不死化プロトコールにおける使用、又は一次線維芽細胞としての使用）のためのヒト乳房線維芽細胞の単離に適切な供給源は、還元乳房形成組織である。ヒト組織は、基本的にＰａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３： ４８８６−４８９６に記載されるように、培養中に入れることができる。ヒト線維芽細胞材料は、必要に応じて従来の細胞培養技法により広げることができる。
【００２５】
好ましくは、本発明の実施に使用されるマウスは、免疫無防備状態である。損傷した免疫系は、マウスが移植ヒト細胞を拒絶することを防止する上で望ましい。免疫不全マウスの例には、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、胸腺を外科的に除去したマウス、及び医薬品又は遺伝子操作により免疫系を抑制したマウスが挙げられる。遺伝子的免疫不全マウスは市販されており、本発明の目的に適切な免疫不全マウスの選択は、当該技術分野における通常の技能範囲内に含まれる。
【００２６】
本発明の実施において、核酸は、安定した形質転換をもたらす任意の方法によって、非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及びヒト乳房上皮細胞に導入することができる。当該技術分野で既知の有用な形質転換方法の例には、スフェロプラスト融合、リポソーム融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、微量注入法、並びにレトロウイルス、アデノウイルス及びレンチウイルスのようなウイルスベクターによる感染が挙げられる。適切な真核発生ベクターは、当該技術分野で既知であり、市販されている。一般的に当該ベクターは、所望の組み換え配列の挿入のために好都合な制限部位を含む。該ベクターは、選択マーカー、例えば薬剤耐性遺伝子を含んでもよい。代表的な薬剤耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子であり（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｎａｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ３２７−３４１）、ネオマイシン耐性を付与する。或いは、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、若しくは青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、又は生物発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を、選択マーカーとして使用することができる。
【００２７】
本発明の一部の実施形態において、組み換え癌遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。前記の目的に有用な誘導性プロモーターの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、及びエクジソンプロモーターが挙げられる。加えて、「ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ」系を、翻訳又は転写のために阻害配列を非可逆的に削除するために使用することができる。誘導性癌遺伝子構成体は、本発明に従って遺伝子改変ヒト乳房上皮細胞を作製する際に使用することができ、これを本発明に従って宿主マウスに移植する。移植したヒト乳房上皮細胞は、インデューサーの存在下で、例えば、インデューサーを宿主マウスの飲み水に投与することにより、腫瘍が形成されるまで維持される。その後、腫瘍細胞は、インデューサーの非存在下で外植、培養される。この時点で、外植腫瘍細胞は、腫瘍形成性とは離れた、単なる「１ヒット」、即ち、一つの突然変異となる。
【００２８】
前記細胞のゲノムに組み込む核酸分子、例えば、レトロウイルスベクターは、腫瘍形成の引き金を引く上で必要な突然変異をもたらすことができる。ベクターが、組み込まれる部位を標識するように設計される場合、ベクターは、活性化（又は不活性化）が腫瘍形成をもたらす遺伝子を同定するために使用することができる。外植腫瘍細胞は、インデューサーの非存在下で、例えば、ヌードマウスのような動物への再移植、及び腫瘍形成のモニタリングにより、腫瘍形成を分析することができる。移植細胞が腫瘍を生じる場合、ベクター挿入部位をクローン化し、配列決定して、周囲の遺伝子をマッピングし、同定する。前記方法により、組み換え癌遺伝子を機能的に補完する遺伝子が同定される。当該遺伝的相補性は、癌治療において標的を同定するために有用である。癌関連遺伝子を同定する前記手法は、詳細に記載されており、「ＭａＳＳ」スクリーニングとして知られている。ＭａＳＳスクリーニング技法は、ヒト再構成乳房腫瘍モデルを利用する本発明の方法に、容易に組み込むことができる。ＭａＳＳスクリーニングの詳細な説明については、ＰＣＴ国際公開公報第０２／０７９４１９号を参照のこと。
【００２９】
前述の通り、本発明は、腫瘍生物学を研究し、抗癌剤をスクリーニングするために有用な誘導性ヒト乳癌モデルを提供する。一部の実施形態において、再構成乳房腫瘍モデルはヒト乳房組織を提供するが、そのゲノムは、（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結される癌遺伝子、例えばＥｒｂＢ２遺伝子又はＫＲＡＳ遺伝子、及び（ｂ）ＳＶ４０ｅｒを含むように改変されており、これらが一緒になることで、ヒト乳房組織は、前記遺伝子修飾を含まない再構成ヒト乳房組織よりも癌への感受性が大きくなる。腫瘍は、癌遺伝子の発現が止まると退行する。再構成ヒト乳房組織を癌に対して更により敏感にする任意の突然変異には、ＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＭＳＨ２）における不能突然変異、及び癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ及びｒａｓ）における活性化突然変異が挙げられる。
【００３０】
一つの実施形態において、再構成ヒト乳房組織は、（ｉ）適切なプロモーターに作動可能に連結される逆テトラサイクリントランス活性化因子をコードする遺伝子を含有する第１発現構成体、及び（ｉｉ）逆テトラサイクリントランス活性化因子及びテトラサイクリン（又はテトラサイクリン類似体、例えばドキシサイクリン）により調節されるプロモーターに作動可能に連結される癌遺伝子を含有する第２発現構成体からなる、注入されたヒト乳房上皮細胞から発生する。宿主マウスでは、テトラサイクリン依存性である腫瘍の発生、維持又は進行を、テトラサイクリン（又はその類似体）の投与の有無にかかわらず観察する。前述のようなその他の誘導性系も使用することができる。ドキシサイクリンを逆テトラサイクリントランス活性化因子制御誘導性プロモーター系のためにインデューサーとして使用する場合、ドキシサイクリンを投与する好ましい方法は、動物の飲み水を介した投与である。
【００３１】
試験化合物の効果と、遺伝子スイッチをオフにした誘導性癌遺伝子とを比較するこの系の能力は、化合物に対する臨床反応を予測する代理マーカーの同定を可能にする。誘導性モデルは、化合物が最小限の残存腫瘍を根絶することができるかを判定するために使用することができる。通常、誘導性モデルでは、癌遺伝子が誘導性プロモーターを使用してスイッチを「オン」から「オフ」にした時に、腫瘍が退行する。しかし、試験化合物が最小限の残存腫瘍を根絶できる場合には、試験化合物の投与後に遺伝子のスイッチを戻しても、腫瘍は戻ってこない。
【００３２】
本発明に基づく再構成乳房腫瘍モデルは、癌を予防又は治療する試験化合物の効能を判定する方法に有用である。当該方法は、宿主マウスに試験化合物を投与すること、及びマウスにおける腫瘍発生、腫瘍維持、腫瘍進行又は血管新生に対する化合物の効果があればその効果を観察することを伴う。適切な対照と比較した、化合物の存在下における腫瘍の大きさの退行及び／又は低減は、化合物の抗腫瘍効果を示す。この種の薬剤効能試験は、癌遺伝子が誘導性又は非誘導性であるモデルを使用して実施することができる。
【００３３】
該モデルは又、その他の癌関連遺伝子を同定するために使用することもできる。これを行うため、癌遺伝子の不活性化又は活性化によって退行又は再生している腫瘍における遺伝子発現の詳細な発現プロフィールを確立する。プロフィールを確立するために使用される技法には、（細胞培養中における）抑制減法、ディファレンシャルディスプレイ、プロテオミクス分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、並びにｃＤＮＡ及び／又はオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用する発現／転写プロフィールの使用が挙げられる。次に、癌発達の異なる段階における発現プロフィールの比較を実施することで、発現パターンが変化している遺伝子を同定することができる。
【００３４】
本明細書で使用される「試験化合物」とは、巨大分子、例えば、ポリペプチド、核酸、多糖類、及び脂質、並びに小型分子を意味する。試験化合物は、本発明の再構成ヒト乳房腫瘍モデルからなる宿主マウスに、経口、直腸内、膣内、局所、経鼻、経眼又は非経口投与によって投与することができる。非経口投与には、皮下、静脈内、筋肉内及び胸骨内注入、並びに輸液技法が挙げられる。マウス実験における代表的な投与経路は、尾静脈への注入である。
【００３５】
好ましくは、試験化合物は、投与量、化合物の溶解性、及び投与経路のような要因を考慮して配合される。経口投与用の固体製剤は、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又はアルギン酸のような適切な担体又は賦形剤を含有することができる。使用できる崩壊剤には、例えば、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、ナトリウムデンプングリコレート、及びアルギン酸が挙げられる。錠剤結合剤には、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプン、及びエチルセルロースが挙げられる。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン油、タルク、ロウ、油、及びコロイドシリカが挙げられる。水又はその他の水性ビヒクルで調製される経口投与用の液体製剤は、メチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコールのような懸濁剤を含有してもよい。該液体製剤には又、活性成分と共に、湿潤剤、甘味料及び風味剤を含有する、液剤、乳剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれてもよい。注射用製剤は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）のような担体を含有してもよい。生理学的に許容される賦形剤には、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル溶液、又はその他の適切な賦形剤が挙げられる。筋肉内調合剤、例えば化合物の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水、又は５％グルコース溶液のような医薬賦形剤に溶解し、投与することができる。化合物の適切な不溶性形態は、長鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸エチル）のエステルのような、水性基剤又は薬学的に許容される油基剤中の懸濁剤として調製し、投与することができる。局所半固体軟膏製剤は一般的に、医薬クリーム基剤のような担体中に約１〜２０％、例えば５〜１０％の濃度で活性成分を含有する。局所使用のための多様な製剤には、滴薬、チンキ剤、ローション剤、クリーム剤、液剤、及び活性成分を含有する軟膏、並びに多様な支持体及びビヒクルが挙げられる。各医薬製剤中の治療薬の最適な比率は、製剤自体、及び特定の病理において望まれる治療効果、並びに相関する治療レジームによって変動する。医薬製剤は、十分に確立された技術分野であり、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２０００） （ＩＳＢＮ： ０６８３３０６４７２）； Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ７ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０６８３３０５７２７）；及びＫｉｂｂｅ （ｅｄ．）， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ３ｒｄ ｅｄ． （２０００） （ＩＳＢＮ： ０９１７３３０９６Ｘ）に更に記載される。
【００３６】
多様なパラメータを使用することで、試験化合物が「抗腫瘍効果」を示すかどうかを判定することができる。当該パラメータの例には、腫瘍組織中のアポトーシスの量、腫瘍組織中の血管新生のレベル、導管過形成のような過形成性成長の数、腫瘍組織の分化若しくは形態形成の効果、又は単に大きさ、例えば腫瘍の直径若しくは容量が挙げられる。測定されるパラメータの選択及びそれらの解釈は、特定の実験における目的により左右される。当該選択及び解釈は、当該技術分野における通常の技能の範囲内に含まれる。
【００３７】
実験設計には相当な許容範囲がある。例えば、任意の種類の実験設計では、試験動物と対照動物が個別に分かれ、実質的に同一である場合もあれば、別の種類の実験設計では、試験化合物とビヒクルが、同じ動物における別々の腫瘍、例えば、左側と右側に局所的に投与される場合もある。当然のことながら、動物の一団は、用量反応試験において広範な投与を受けることができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例により更に説明する。実施例は、説明の目的のためにのみ提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を如何様にも制限するものとして解釈するべきではない。
【００３９】
（実施例１：乳房腫瘍モデルの作成）
ヒト組織及び細胞株
還元乳房形成術からの新鮮ヒト乳房組織は、施設の指針及びＩＲＢ認可に従って、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（米国マサチューセッツ州ボストン）のＤｒ． Ａｎｄｒｅａ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎにより提供された。新鮮組織を、２．８ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及び０．６ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを使用して、３７℃で一晩消化した。翌朝、消化されたヒト上皮オルガノイド（上皮細胞のクラスター）及び一次線維芽細胞を遠心分離により収集した。上皮オルガノイド及び一次線維芽細胞の混合物を、標準寒剤で凍結し、液体窒素中に保存した。不死化ヒト乳房線維芽細胞株は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｄのＣｈａｒｌｏｔｔｅ Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒから提供された。
【００４０】
ベクター構成体
レンチウイルスベクターを、ヒト乳房上皮細胞の形質導入に使用した。以下の全てのレンチウイルスベクターを構成する際に使用したレンチウイルスバックボーンは、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯであり、これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド；カタログ番号Ｋ４９５５−１０）から市販されている。
【００４１】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒは、以下のように構成した。２．７ｋｂのＳＶ４０ｅｒ ＤＮＡフラグメント（ＬＴ及びｓｔを含む）は、ｐＳＶ３−ｄｈｆｒベクター（ＡＴＣＣ番号３７１４７）をＳｆｉ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化することにより得た。次に、２．７ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。続いて、ＳＶ４０−ブラストシジンＤＮＡフラグメントを、得られた構成体から除去して、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒレンチウイルス構成体を形成した。
【００４２】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰは、以下のように構成した。ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒ構成体と同様に、５５８ｂｐのＫＲＡＳ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化し、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ｃＤＮＡをＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ（カタログ番号２４０１４３）から購入し、ＳＶ４０プロモーターの下流にクローン化した。この構成体を作製する際に使用したＫＲＡＳは、ＫＲＡＳＧ１２Ｖであった。野生型ＫＲＡＳ ｃＤＮＡのＧｅｎｂａｎｋ受入番号は、ＮＭ−０３３３６０である。本発明者等は、アミノ酸残基１２がグリシンからバリンに変わった突然変異形である、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（Ｈａｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＬｙｎｄａ Ｃｈｉｎからの贈呈品）を使用した。
【００４３】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２は、以下のように構成した。３９９２ｂｐのｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； カタログ番号Ｋ４９５５−１０）におけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。この構成体を作製する際に使用したｅｒｂＢ２は、ｅｒｂＢ２Ｖ６５９Ｅであった。野生型ｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡの受入番号は、Ｍ１１７３０である。特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸残基６５９をＶからＥに変えた。
【００４４】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２は、以下のように構成した。ｐ５３ｓｈＲＮＡ配列は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６： ５５０−５５３に記載される通りであった。Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡカセットを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２におけるＣＭＶプロモーターの前に置いて、このベクターを形成した。
【００４５】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰは、以下のように構成した。ｐ５３ｓｈＲＮＡ配列は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６： ５５０−５５３に記載される通りであった。Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡカセットを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにおけるＣＭＶプロモーターの前に置いて、最終構成体Ｐｌｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを形成した。
【００４６】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように構成した。ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットのｃＤＮＡクローンは、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＥＨＳ１００１−１２５９６８７）から購入した。ミリストイル化配列を、ｐ１１０αの５′末端にクローン化して、ミリストイル化ｐ１１０α ｃＤＮＡクローンのＰＩＫ３ＣＡ−ｍｙｒを形成した。ＰＩＫ３ＣＡ−ｍｙｒ ｃＤＮＡを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化して、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡを形成した。
【００４７】
ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ カタログ番号ＭＧＣ−２３１６）から得た。ＣＭＶプロモーターを、ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡの５′末端に置いた。次にＣＭＶ−ＣＣＮＤ１フラグメントを、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡにおけるＰＩＫ３ＣＡの３′末端にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を形成した。
【００４８】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈは、以下のように構成した。野生型ヒトｐ５３クローンは、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＭＧＣ−６４６）から購入した。特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸残基１７５をＲからＨに変えた。次に、突然変異ｐ５３ ｃＤＮＡ（ｐ５３Ｒ１７５Ｈ）を、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。ベクターｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように作成した。ＰＰ２Ａ Ｂ５６γ ｓｈＲＮＡの配列は、ｇｃａｇａｇｔａａｃｔｇｇａａａｔａａｔｇｇｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｔｃｃａｇｔａａｃｔｃｔｇｃである。ＰＰ２Ａ ｓｈＲＮＡを、Ｕ６プロモーターの下流に置き、Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡフラグメントを、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにクローン化して、ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡを生成した。構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３Ａ（１１０α−ｍｙｒ）＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１における前述のＣＭＶ−ＣＣＮＤ１フラグメントを、−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡの３′末端にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を生成した。
【００４９】
ベクターｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１は、以下のように作成した。ヒトＢｍｉ１及びＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡの両クローンは、ＡＴＣＣ（それぞれ、カタログ番号ＭＧＣ−１２６８５及びＭＧＣ−２３１６）から得た。ＣＣＮＤ１ ｃＤＮＡを、ベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯにおけるＣＭＶプロモーターの後にクローン化した。ＣＭＶ−Ｂｍｉ１フラグメントを、ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１の５′末端の直前にクローン化して、最終構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１を生成した。
【００５０】
レンチウイルスを、前述のレンチウイルス構成体及び最適化したパッケージングプラスミドミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； カタログ番号Ｋ４９７５−００）による２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより産生した。トランスフェクションは、製造元の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１６６８−０１９）に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００トランスフェクション試薬を使用して実施した。
【００５１】
脂肪パッドの除去及び線維芽細胞の感染
乳腺の上皮成分を、乳首とリンパ節の間の部分を除去することよって排除し、それにより除去済み脂肪パッドを残した。前記除去技法は、基本的にＤｅ Ｏｍｅ ｅｔ ａｌ．， １９５９ （ｓｕｐｒａ）により記載される通りであった。次に、不死化ヒト線維芽細胞（ＲＭＦ−ＨＧＦ）を、脂肪パッドが除去済みになった直後又は脂肪パッドが除去済みになったおよそ２週間後の何れかで、除去済み脂肪パッドに注入した。
【００５２】
不死化ヒト線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び５０ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞の半分を、注入の前日に、２ｍＵ／ｍｌのブレオマイシンで３０分間処理した。注入日に、ブレオマイシン処理線維芽細胞と未処理線維芽細胞の１：１ミックスを、除去済み脂肪パッドに注入した。注入部位当たり、およそ０．５×１０６の細胞を注入した。
【００５３】
ヒト乳房上皮細胞の形質導入
ヒト上皮細胞オルガノイドと一次線維芽細胞の混合物を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で４時間培養し、その間に線維芽細胞は培養皿に付着した。付着していないオルガノイドを上澄みから収集し、２回のスピン感染に付した。１回目のスピン感染の際に、約５０μｌのオルガノイドペレットを、形質導入される遺伝子を発現する１０５〜１０９ｃｆｕのレンチウイルスを含有するＨＭＥＣ培地１ｍｌに再懸濁した。オルガノイド／ウイルス混合物を、６ウエル培養平板の一つのウエルで平板培養し、４００×ｇで９０分間回転させた。感染の終了時に、１ｍｌの新鮮なＨＭＥＣ培地をウエルに加え、該培養平板を３７℃のインキュベーターに最低２時間戻した。次にオルガノイドを、形質導入される別のセットの遺伝子を発現する１０５〜１０９ｃｆｕのレンチウイルスを含有するＨＭＥＣ培地１ｍｌを加えて、２回目のスピン感染に付した。２回目のスピン感染の終了時に、１ｍｌの新鮮なＨＭＥＣ培地をオルガノイド懸濁液に加え、インキュベーターに戻した。感染したオルガノイドは、２回目の感染の２〜１８時間後に脂肪パッドへの注入の準備が整った。
【００５４】
感染オルガノイドの注入
約１〜１００の感染オルガノイドを、（ａ）２週間前にヒト線維芽細胞を注入した脂肪パッドに単独で注入するか、又は（ｂ）０．２５×１０６の癌腫関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と混合した後に注入するか、又は（ｃ）０．２５×１０６のブレオマイシン処理不死化ヒト線維芽細胞及び０．２５×１０６の未処理不死化ヒト線維芽細胞の混合物と混合した後に注入した。該細胞調製物を、コラーゲン対マトリゲルミック比１：１のミックスに再懸濁し、注入部位当たり約３０〜５０μｌの容量で注入した。
【００５５】
（実施例２：レンチウイルス感染及びｐ５８ ｓｈＲＮＡノックダウンの効果）
ｐ５３の発現をノックダウンするｐ５３ ｓｈＲＮＡの効果を判定するため、及びレンチウイルス系による遺伝子移入の効果を判定するため、２９３Ｔ細胞及びＨＭＥＣオルガノイドを、ｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｐ５３ｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを発現するレンチウイルスで感染させた。試料の処理、並びにレンチウイルスの調製及び感染は、実施例１に記載される通りであった。感染の３日後、細胞は、感染率の推定をＵＶ光線下で観察し、実時間ＲＴ−ＰＣＲによりｐ５３及びＫＲＡＳ発現を分析するために収集した。ほぼ全ての２９３Ｔ細胞が、レンチウイルスに感染していた。感染した２９３Ｔ細胞におけるｐ５３の発現レベルが、模擬感染細胞の約３．６％であったため、本発明者等は、ｐ５３転写の約９７．４％のノックダウンがレンチウイルス感染により２９３Ｔ細胞において達成されたと結論付けた。ＨＭＥＣオルガノイドでは、細胞の約５０％がレンチウイルスに感染していた。又、感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物におけるｐ５３の発現レベルが、模擬感染ヒト乳房上皮細胞の約５０％であるため、本発明等は、ｐ５３転写のほぼ１００％のノックダウンもレンチウイルス感染によりＨＭＥＣにおいて達成されたと結論付けた。同様に、ＫＲＡＳ発現は、２９３Ｔ細胞及びＨＭＥＣの両方においてレンチウイルス感染により約７０倍増加した。
【００５６】
（実施例３：ｐ５３ ｓｈＲＮＡ及びｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣから発生するヒト乳房前癌性病巣及びＣＩＳ）
レンチウイルス系を使用して、本発明者等は、限られたセットの遺伝因子で形質導入された正常な一次ＨＭＥＣからヒト乳癌を生成できるかを判定することにした。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。マウスにヒト乳房腫瘍モデルを生成する第一段階として、本発明者等は、レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰ又はｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒＢｂ２を使用して、ｐ５３ ｓｈＲＮＡとｅｒｂＢ２Ｖ６５９Ｅ又はＫＲＡＳＧ１２Ｖとにより、ヒト乳房上皮細胞を形質導入した。感染させたＨＭＥＣオルガノイドを、注入の前にヒト乳房線維芽細胞と混合するか、又は２週間前に不死化ヒト線維芽細胞を注入した脂肪パッドに単独で注入した。全ての組み合わせにおいて、正常な、例えば末端管小葉単位、及び過形成ヒト乳房構造は、移植後１〜１２ヶ月の間に移植部位で発生した（図１及び図２）。しかし、形質導入されたＨＭＥＣから腫瘍は発生しなかった。
【００５７】
（実施例４：ＳＶ４０初期領域及びｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣから発生した癌腫）
実施例３に例示される通り、ｅｒｂＢ２又はＲＡＳは単独でマウス乳房上皮細胞を形質転換することができるが、ＨＭＥＣは形質転換しない。本発明等は、ＳＶ４０ｅｒとｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳが本発明の組織再構成系によりインビボでＨＭＥＣを形質転換できるかを判定することにした。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｅｒ及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｅｒｂＢ２又はｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを使用して、ＨＭＥＣをＳＶ４０ｅｒとｅｒｂＢ２又はＫＲＡＳにより形質導入した。感染させたＨＭＥＣを、注入の前に不死化ヒト線維芽細胞と混合するか、又は不死化ヒト線維芽細胞を予め注入した脂肪パッドに単独で注入した。全ての組み合わせにおいて、腫瘍は感染させたＨＭＥＣから発生し、腫瘍潜伏は１〜３ヶ月の範囲であった。
【００５８】
２人の独立した病理学者である、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｃａｌのＤｒ． Ａｎｒｅａｓ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＶｅｒｍｏｎｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ． Ｍａｒｃｕｓ Ｂｏｓｅｎｇｂｕｒｇが、腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色を調べ、発生した腫瘍は低分化浸潤癌であったと結論付けた（図３及び図４）。発生した腫瘍は、ヒトの腫瘍との著しい相違を示していない。該腫瘍は、マウスの乳房に発生する大多数の腫瘍よりも更にヒトの乳癌に似ていた。これは、多い間質成分、腫瘍細胞の侵入巣及び島の構築、並びに高レベルの細胞多形性のためであった。
【００５９】
（実施例５：ＭａＳＳスクリーニング）
この実施例では、ヒト細胞における癌関連遺伝子を同定する工程を記載する。
【００６０】
腫瘍細胞のレトロウイルス感染
Ｍｏ−ＭｕＬＶ産生細胞株ＴＭＪ（ＮＩＨ３Ｔ３系細胞株）を、必要な数のプレート（１００ｍｍ）で平板培養する。前記細胞を培養し、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地で維持する。ウイルス産生では、ＴＭＪ細胞を４〜５ｍｌの新鮮な培養基に供給し、培養上澄みを８〜１２時間後に採取する。該上澄みを０．４５μＭフィルターで濾過する。
【００６１】
ヒトの細胞はエコトロピック受容体を発現しないため、Ｍｏ−ＭｕＬＶにより感染させることはできない。そこで、最初にヒト乳癌細胞をＭＣＡＴ１とブラストシジン選択マーカーを発現するレンチウイルスの感染を介して、エコトロピック受容体遺伝子であるＭＣＡＴ１により形質導入する。次にブラストシジン耐性偽型ヒト乳癌細胞を、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）の存在下で、１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ培地中に維持する。平板培養のおよそ１８〜２４時間後、又はプレートが７０〜８０％のコンフルエントになった段階で、乳癌細胞を、ポリブレン（６〜８μｇ／ｍｌ）の存在下で、濾過ウイルス上澄みにより感染させる。この時点から、乳癌細胞を、ドキシサイクリンの非存在下で維持する。
【００６２】
感染のおよそ１８時間後、感染乳癌細胞をトリプシン処理して、すすぎ洗いし、ハンクス平衡塩類溶液に懸濁する。細胞懸濁液を氷上に保持し、トリプシン処理後の取り扱い時間を最小限に保つ。約１×１０６の細胞を、ドキシサイクリンを含まない水を与えたＳＣＩＤマウスの側腹部に注入する。動物では腫瘍発生を観察する。対照動物にも１×１０６の非感染細胞を同様に注入する。一般的に腫瘍はおよそ２１日後に発生する。腫瘍を採取し、腫瘍組織を直ぐに液体窒素中で素早く凍結する。
【００６３】
逆ポリメラーゼ連鎖反応
ＤＮＡをＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ単離キットを使用して腫瘍組織から単離した。１０μｇのゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ又はＳａｃＩＩで完全に消化し、６５℃で２０分間インキュベートすることにより反応を終了させる。消化試料を、４０００Ｕの高濃度Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）を使用して、稀釈６００μｌの反応容量中で自己結合させる。結合は１６℃で一晩から２４時間実施する。結合したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、４０μｌの滅菌水に溶解する。次に、結合したＤＮＡを１：１０及び１：１００の比率に連続して稀釈し、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）に付す。
【００６４】
候補遺伝子の同定
ヒトゲノムへのレトロウイルスの組み込み部位を、全てのＩＰＣＲ配列で以下のようにマッピングする。レトロウイルスリーダー配列をＩＰＣＲ産物の生配列から切り取り、切り取った配列のホモロジー検索を、ＢＬＡＳＴソフトウェアプログラムを使用して、ＮＣＢＩ ＭＧＳＣＶ３データベースで実施する。ＢＬＡＳＴヒットを分析し、マウスの多発性腫瘍における反復組み込み部位を同定する。反復は１０ｋｂの領域内における２回以上の組み込みとして定義される。発現がレトロウイルスの組み込みによる影響を受ける遺伝子を同定するため、ＮＣＢＩ Ｍａｐ Ｖｉｅｗを使用して、マウスゲノムに対するそれぞれのレトロウイルス反復組み込み部位を確認した。当該部位のすぐ近くに隣接する遺伝子を、ＭＧＳＣＶ３ Ｇｅｎｅマップを使用して同定する。前記遺伝子は癌関連候補遺伝子として定義されるが、それは、圧倒的多数の場合において、ＭｕＬＶ組み込みが最も近位の遺伝子に影響を与えるためである。組み込みが遺伝子内で起こると、当該遺伝子は、レトロウイルス組み込みの効果の標的として最良の候補と考えられる。
【００６５】
（実施例６：マウスにおけるヒト乳房腫瘍の増殖）
ヒト原発性乳房腫瘍をマウスで増殖させることは困難であり、実用的ではなかった（Ｓｅｂｅｓｔｅｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｊ， Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ６３： １３３１−７； Ｒａｅ−Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４０： ９５−１００； Ｓａｋａｋｉｂａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｓｃｉ． Ａｍ． ２： ２９１）。大部分の腫瘍は、マウスでは非常にゆっくりと成長して、６ヶ月から１２ヶ月の潜伏期間があり、或いは全く成長しないこともあった。したがって、本発明等は、ｅｒｂＢ２２及びＳＶ４０ｅｒでトランスフェクトしたヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の腫瘍形成性に対する、周囲の始原ヒト線維芽細胞における表現型の差の効果を試験することにした。
【００６６】
ＨＭＥＣ及びヒト線維芽細胞は、実施例１（上記）に記載されるようにして得た上、培養した。本発明等は、ＨＭＥＣを単独で、又は培養線維芽細胞（ＲＭＥ；還元乳房線維芽細胞）と混合して、組み換え肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を発現する不死化ヒト線維芽細胞を予め注入したマウス乳房脂肪パッドに移植した。結果を表１にまとめる。
【００６７】
５人の患者（ＨＭＥＣ５〜ＨＭＥＣ９）から得たＨＭＥＣは、移植時にｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒにより形質導入され、ＲＭＦ−ＨＧＦ（還元乳房形成線維芽細胞−肝細胞成長因子）と混合されると、一貫して腫瘍を生じた（頻度８３％〜１００％）。対照的に、同じＨＭＥＣを同じ遺伝子（ｅｒｂＢ２及びＳＶ４０ｅｒ）により形質導入するものの、不死化されていない始原ヒト線維芽細胞（一次ＲＭＦ１１及び一次ＲＭＦ１３）と混合されると、腫瘍は稀にしか発生しなかった（０％〜１７％（１／６））。何れの線維芽細胞とも混合しないで移植した場合、ｅｒｂＢ２２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣは、移植部位の１１％（１／９）で腫瘍を生じた。腫瘍潜伏期間は１〜３ヶ月の範囲であった。これらの結果は、不死化ヒト線維芽細胞がｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣの腫瘍形成性を促進する一方で、非不死化ヒト一次乳房線維芽細胞が腫瘍形成性を促進せず、おそらくは阻害したことを示した。
【００６８】
ｅｒｂＢ２／ＳＶ４０ｅｒ ＨＭＥＣからの腫瘍発生率に対するヒト間質線維芽細胞の効果を実証するこれらのデータは、不死化ヒト線維芽細胞と混合する適切な微環境を前提とすると、ヒトの患者の原発性乳房腫瘍はマウスで成長し、従ってマウスで有効に増殖できることを示している。
【００６９】
【表１】
１．ＨＧＦを発現する不死化ＲＭＦ
２．ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するが、組み換えＨＧＦを発現しないＲＭＦ
３．遺伝子操作していないＲＭＦ。
【００７０】
（実施例７：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＰＩＫ３ＣＡ＋ＫＲＡＳにより形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生したヒト乳腺癌）
ＳＶ４０ｅｒを含有する再構成ヒト乳癌モデルを開発した後、本発明等は、ヒトの遺伝子のみを使用して、或いはＳＶ４０ｅｒの非存在下で遺伝子突然変異、又はノックダウン若しくはノックアウトを使用して、マウスでヒト乳房腫瘍を発生させようとした。本発明等は、（ａ）ヒトＫＲＡＳ、（ｂ）ヒトｐ５３における点突然変異、即ち、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、（ｃ）Ｒｂ機能を不活性化するＣＣＮＤ１を過剰発現する遺伝子構成体、及び（ｄ）ＰＩ３Ｋのヒトｐ１１０α触媒サブユニット（ＰＩＫ３ＣＡ）を過剰発現する遺伝子構成体を、ＨＭＥＣに導入した。
【００７１】
試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。レンチウイルス構成体ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを使用して、ＨＭＥＣをｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ＣＣＮＤ１、ＰＩＫ３ＣＡ及びＫＲＡＳにより形質導入した。感染させたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、ＲＭＦ−ＨＧＦを注入した除去済みマウス脂肪パッドに移植した。移植の２ヶ月後に、注入部位のおよそ５０％で触診可能な腫瘍が発生した。腫瘍を移植の３ヶ月後に収集し、組織病理学的分析にかけた。Ｖｅｒｍｏｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの病理学者であるＤｒ． Ｍａｒｃｕｓ Ｂｏｓｅｎｂｕｒｇが、Ｈ＆Ｅ染色移植切片を調べ、腫瘍は低悪性度浸潤性腺管癌として発生したと結論付けた（図５）。
【００７２】
新たに収集した腫瘍は、ＵＶ光線下で緑色蛍光を示した。このことは、ＣＭＶ−ＫＲＡＳ及びＳＶ４０−ＧＦＰが同じレンチウイルス構成体、即ちｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰに存在するため、ＫＲＡＳ癌遺伝子を発現したことを示している。ｐ５８抗体を使用して、腫瘍切片でＩＨＣを実施した。これにより、腫瘍におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈの発現を確認した。ゲノムＤＮＡをＫＲＡＳ／ｐ５８Ｒ１７５Ｈ／ＣＣＮＤ１／ＰＩ３Ｋ腫瘍から抽出し、ＰＣＲにより遺伝子型分析にかけた。前記分析によって、腫瘍ゲノムが、腫瘍の生成に使用したレンチウイルスＤＮＡ構成体の全て、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＰＩＫ３ＣＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを担持したことが明らかになった。
【００７３】
（実施例８：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋ＰＰ２Ａ ｓｈＲＮＡにより形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生した腺癌）
一次ＨＭＥＣの形質転換に必要な遺伝因子を解明するため、三つのレンチウイルス、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰ、及びｐＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡ＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１それぞれを介して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋ＰＰ２ＡｓｈＲＮＡによりＨＭＥＣを形質導入した。試料処理、細胞培養、レンチウイルス構成体の生成、ウイルス産生、及びマウス外科手術の手順は、実施例１に記載される通りであった。形質導入されたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、予めＲＭＦ−ＨＧＦを注入した２０個の腺に注入した。移植の２ヶ月後に、腺の２５％（５／２０）で触診可能な腫瘍が発生した。
【００７４】
２個の腺を同時に収集したが、これらはＵＶ光線下で緑色蛍光を示した。このことは、腫瘍がｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにより形質導入されたＨＭＥＣから誘導されたことを示している。腫瘍のＨ＆Ｅ染色により、これらが高分化から中程度の分化の腺癌であったことが明らかになった（図６）。
【００７５】
（実施例９：ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋Ｂｍｉ１により形質導入されたＨＭＥＣからインビボで発生した腺癌）
一次ＨＭＥＣの形質転換に必要な遺伝因子に関する追加のデータを得るため、三つのレンチウイルス、即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−Ｂｍｉ１＋ＣＭＶ−ＣＣＮＤ１、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ、及びｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰを介して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋ＣＣＮＤ１＋ＫＲＡＳ＋Ｂｍｉ１によりＨＭＥＣを形質導入した。形質導入されたＨＭＥＣをＲＭＦ−ＨＧＦと混合し、ＲＭＦ−ＨＧＦでヒト化した２０個の腺に注入した。移植の２ヶ月後に、腺の２５％（５／２０）で触診可能な腫瘍が発生した。
【００７６】
２個の腺を同時に収集したが、これらはＵＶ光線下で緑色蛍光を示しており、このことは、腫瘍がｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＫＲＡＳ＋ＳＶ４０−ＧＦＰにより形質導入されたＨＭＥＣから誘導されたことを示している。腫瘍のＨ＆Ｅ染色により、これらが中程度の分化の腺癌であったことが明らかになった（図７）。
【００７７】
その他の実施形態は、請求項の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により形質導入されたヒト乳房上皮細胞から成長したヒト乳房組織の全載標本の蛍光写真である。ヒト乳房上皮細胞オルガノイドは、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及びＧＦＰを発現するレンチウイルスに感染させた。感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物は、不死化ヒト乳房線維芽細胞を予め注入した、除去済み脂肪パッドに注入した。乳腺を移植の６ヶ月後に収集し、ＵＶ顕微鏡検査にかけた。ＴＤＬＵ＝末端管小葉単位。括弧は図２に示される領域を示す。
【図２】図１の乳腺画像の蛍光の強い領域のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である（倍率：４０倍）。ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、ＫＲＡＳ及びＧＦＰにより形質導入されたヒト乳房上皮細胞から過形成が発生している。
【図３】実施例４に記載される、ＳＶ４０ｅｒ及びＫＲＡＳにより形質導入されたヒト乳房上皮細胞から発生する原発性ヒト乳房腫瘍の写真である。ヒト乳房上皮細胞オルガノイドは、ＳＶ４０ｅｒ及びＫＲＡＳを発現するレンチウイルスに感染させた。感染及び非感染のヒト乳房上皮細胞の混合物は、不死化ヒト乳房線維芽細胞を予め注入した、除去済み脂肪パッドに注入した。乳腺を移植の１ヶ月後に収集した。腫瘍は十分に血管新生化していたことがこの画像から見て取ることができる。
【図４】実施例４の図３に示されるヒト乳房腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。発生した腫瘍は、低分化浸潤性腺癌である。多い間質成分、腫瘍細胞の侵入巣及び島、並びに高レベルの細胞多形性が、ヒト乳癌の特徴である。
【図５】実施例７に記載される３ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、中程度の分化から低分化の腺癌であることが明らかである。いくらかの腺性分化が認めれれるが、より多くの細胞学的異型性及びより多くの混乱した構築の領域（中央から右上）が存在する。
【図６】実施例８に記載される２ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、高分化から中程度の分化の腺癌であることが明らかである。
【図７】実施例９に記載される２ヶ月の腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。前記切片は、中程度の分化の腺癌であることが明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスであって、該モデルが自然発生腫瘍を含み、該腫瘍が、組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む、マウス。
【請求項２】
再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスであって、該モデルが自然発生腫瘍を含み、該腫瘍が、（ａ）組み換えヒト癌遺伝子、（ｂ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｃ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む、マウス。
【請求項３】
前記組み換え癌遺伝子が、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫとも呼ばれる）、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、及びＢｍｉ１からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項４】
前記組み換えヒト癌遺伝子が、ＫＲＡＳ、ｅｒｂＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、サイクリンＤ１及びＢｍｉ１からなる群より選択される、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
前記組み換えヒト癌遺伝子がｅｒｂＢ２である、請求項４に記載のマウス。
【請求項６】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳである、請求項４に記載のマウス。
【請求項７】
前記ＫＲＡＳがＫＲＡＳＧ１２Ｖである、請求項６に記載のマウス。
【請求項８】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、請求項４に記載のマウス。
【請求項９】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＢｍｉ１である、請求項４に記載のマウス。
【請求項１０】
前記ヒト乳房上皮細胞が二つの組み換えヒト癌遺伝子を含む、請求項２に記載のマウス。
【請求項１１】
前記二つの組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳ及びＰＩＫ３ＣＡである、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１２】
前記二つの組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳ及びＢｍｉ１である、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１３】
前記ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈをコードする導入遺伝子である、請求項２に記載のマウス。
【請求項１４】
前記ヒトＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又は突然変異が、ＣＣＮＤ１をコードする組み換え遺伝子である、請求項２に記載のマウス。
【請求項１５】
前記ヒト乳房上皮細胞が更に、前記ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び前記Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡに加えて、腫瘍抑制経路を阻害する追加の導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含む、請求項２に記載のマウス。
【請求項１６】
前記追加の導入遺伝子又はｓｈＲＮＡが、ＰＰ２Ａ Ｂ５６γサブユニット、ＰＴＥＮ、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の発現に対して標的化されるｓｈＲＮＡである、請求項１５に記載のマウス。
【請求項１７】
前記腫瘍成長部位が、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの側腹部の皮下部位からなる群より選択される部位である、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項１８】
前記モデルが更に複数のヒト線維芽細胞を含む、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項１９】
前記ヒト線維芽細胞がヒト乳房線維芽細胞である、請求項１８に記載のマウス。
【請求項２０】
前記ヒト線維芽細胞の少なくとも一部が前記腫瘍の中に位置する、請求項１８に記載のマウス。
【請求項２１】
前記ヒト線維芽細胞が、不死化線維芽細胞、癌腫関連線維芽細胞、及び始原ヒト線維芽細胞からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項２２】
前記組み換えヒト癌遺伝子が誘導性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項２３】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター、及びミフェプリストン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２４】
前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項２３に記載のマウス。
【請求項２５】
請求項１に記載のマウスの作製方法であって、
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該ヒト乳房上皮細胞に組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを導入し、それによって形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；ならびに
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を細胞混合物として移植する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの皮下部位からなる群より選択される部位に移植する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記皮下部位が前記マウスの側腹部の皮下部位である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２に記載のマウスの作製方法であって、
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該ヒト乳房上皮細胞に、組み換えヒト癌遺伝子、ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを導入し、それによって形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；ならびに
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を細胞混合物として移植する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの皮下部位からなる群より選択される部位に移植する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記皮下部位が前記マウスの側腹部の皮下部位である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌関連遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２２に記載のマウスの腫瘍から細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞のゲノムに組み込まれる核酸を該細胞に導入し、それによって該核酸が組み込まれる遺伝子座を標識する工程；
（ｃ）誘導性プロモーターのインデューサーが存在しない条件下で該細胞を培養する工程；
（ｄ）腫瘍形成性が該核酸分子の組み込みにより誘導された細胞を同定する工程；ならびに
（ｅ）該組み込んだ核酸分子により工程（ｃ）の細胞中で標識された遺伝子を、癌関連遺伝子として同定する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記核酸分子がレトロウイルス配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸分子がモロニーマウス白血病ウイルスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
化合物の抗腫瘍効果を試験する方法であって、
（ａ）請求項１又は２のマウスを提供する工程；
（ｂ）該マウスに該化合物を投与する工程；
（ｃ）適切な対照と比較して、該腫瘍に対する該化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
癌関連間質遺伝子を同定する方法であって、
一つ以上の組み換え試験遺伝子を発現する非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含むヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該ヒト乳房上皮細胞を近接して試験マウスに移植する工程；ならびに
適切な対照と比較して、形成された腫瘍の数又は腫瘍形成の潜伏の増加又は減少を、試験マウスにおいて検出する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
癌関連間質遺伝子を同定する方法であって、
一つ以上の組み換え試験遺伝子を発現する非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
組み換えヒト癌遺伝子、ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含むヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該ヒト乳房上皮細胞を近接して試験マウスに移植する工程；ならびに
適切な対照と比較して、形成された腫瘍の数又は腫瘍形成の潜伏の増加又は減少を、試験マウスにおいて検出する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
マウスにヒト乳房原発性腫瘍を増殖させる方法であって、
（ａ）該腫瘍からヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
（ｂ）不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を提供する工程；
（ｃ）該上皮細胞及び該線維芽細胞を互いに近接してマウスに移植する工程；ならびに
（ｄ）該腫瘍を増殖させる上で十分な時間にわたり該マウスを維持する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記上皮細胞及び線維芽細胞を、乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、及び側腹部の皮下部位からなる群より選択される部位で前記マウスに移植する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記部位が乳房脂肪パッドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記乳房脂肪パッドに不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を予め注入する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記上皮細胞及び線維芽細胞を移植の前に混合し、細胞混合物として移植する、請求項４０に記載の方法。
【請求項１】
再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスであって、該モデルが自然発生腫瘍を含み、該腫瘍が、組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む、マウス。
【請求項２】
再構成ヒト乳房腫瘍モデルを含むマウスであって、該モデルが自然発生腫瘍を含み、該腫瘍が、（ａ）組み換えヒト癌遺伝子、（ｂ）ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び（ｃ）Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含む複数のヒト乳房上皮細胞を含む、マウス。
【請求項３】
前記組み換え癌遺伝子が、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫとも呼ばれる）、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＴＧＦα、ＴＧＦ−β、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、及びＢｍｉ１からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項４】
前記組み換えヒト癌遺伝子が、ＫＲＡＳ、ｅｒｂＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、サイクリンＤ１及びＢｍｉ１からなる群より選択される、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
前記組み換えヒト癌遺伝子がｅｒｂＢ２である、請求項４に記載のマウス。
【請求項６】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳである、請求項４に記載のマウス。
【請求項７】
前記ＫＲＡＳがＫＲＡＳＧ１２Ｖである、請求項６に記載のマウス。
【請求項８】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、請求項４に記載のマウス。
【請求項９】
前記組み換えヒト癌遺伝子がＢｍｉ１である、請求項４に記載のマウス。
【請求項１０】
前記ヒト乳房上皮細胞が二つの組み換えヒト癌遺伝子を含む、請求項２に記載のマウス。
【請求項１１】
前記二つの組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳ及びＰＩＫ３ＣＡである、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１２】
前記二つの組み換えヒト癌遺伝子がＫＲＡＳ及びＢｍｉ１である、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１３】
前記ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈをコードする導入遺伝子である、請求項２に記載のマウス。
【請求項１４】
前記ヒトＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又は突然変異が、ＣＣＮＤ１をコードする組み換え遺伝子である、請求項２に記載のマウス。
【請求項１５】
前記ヒト乳房上皮細胞が更に、前記ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及び前記Ｒｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡに加えて、腫瘍抑制経路を阻害する追加の導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含む、請求項２に記載のマウス。
【請求項１６】
前記追加の導入遺伝子又はｓｈＲＮＡが、ＰＰ２Ａ Ｂ５６γサブユニット、ＰＴＥＮ、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の発現に対して標的化されるｓｈＲＮＡである、請求項１５に記載のマウス。
【請求項１７】
前記腫瘍成長部位が、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの側腹部の皮下部位からなる群より選択される部位である、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項１８】
前記モデルが更に複数のヒト線維芽細胞を含む、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項１９】
前記ヒト線維芽細胞がヒト乳房線維芽細胞である、請求項１８に記載のマウス。
【請求項２０】
前記ヒト線維芽細胞の少なくとも一部が前記腫瘍の中に位置する、請求項１８に記載のマウス。
【請求項２１】
前記ヒト線維芽細胞が、不死化線維芽細胞、癌腫関連線維芽細胞、及び始原ヒト線維芽細胞からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項２２】
前記組み換えヒト癌遺伝子が誘導性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１又は２に記載のマウス。
【請求項２３】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター、及びミフェプリストン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２４】
前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項２３に記載のマウス。
【請求項２５】
請求項１に記載のマウスの作製方法であって、
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該ヒト乳房上皮細胞に組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを導入し、それによって形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；ならびに
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を細胞混合物として移植する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの皮下部位からなる群より選択される部位に移植する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記皮下部位が前記マウスの側腹部の皮下部位である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２に記載のマウスの作製方法であって、
非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
ヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該ヒト乳房上皮細胞に、組み換えヒト癌遺伝子、ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを導入し、それによって形質導入乳房上皮細胞を形成する工程；ならびに
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該形質導入ヒト乳房上皮細胞を近接してマウスに移植する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を細胞混合物として移植する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記線維芽細胞及び上皮細胞を、前記マウスの乳房脂肪パッド、該マウスの生殖腺脂肪パッド、該マウスの腎臓莢膜、及び該マウスの皮下部位からなる群より選択される部位に移植する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記皮下部位が前記マウスの側腹部の皮下部位である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌関連遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２２に記載のマウスの腫瘍から細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞のゲノムに組み込まれる核酸を該細胞に導入し、それによって該核酸が組み込まれる遺伝子座を標識する工程；
（ｃ）誘導性プロモーターのインデューサーが存在しない条件下で該細胞を培養する工程；
（ｄ）腫瘍形成性が該核酸分子の組み込みにより誘導された細胞を同定する工程；ならびに
（ｅ）該組み込んだ核酸分子により工程（ｃ）の細胞中で標識された遺伝子を、癌関連遺伝子として同定する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記核酸分子がレトロウイルス配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸分子がモロニーマウス白血病ウイルスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
化合物の抗腫瘍効果を試験する方法であって、
（ａ）請求項１又は２のマウスを提供する工程；
（ｂ）該マウスに該化合物を投与する工程；
（ｃ）適切な対照と比較して、該腫瘍に対する該化合物の抗腫瘍効果があればその効果を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
癌関連間質遺伝子を同定する方法であって、
一つ以上の組み換え試験遺伝子を発現する非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
組み換えヒト癌遺伝子及び組み換えＳＶ４０ｅｒを含むヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該ヒト乳房上皮細胞を近接して試験マウスに移植する工程；ならびに
適切な対照と比較して、形成された腫瘍の数又は腫瘍形成の潜伏の増加又は減少を、試験マウスにおいて検出する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
癌関連間質遺伝子を同定する方法であって、
一つ以上の組み換え試験遺伝子を発現する非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞を提供する工程；
組み換えヒト癌遺伝子、ｐ５３経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡ、及びＲｂ経路を阻害する導入遺伝子又はｓｈＲＮＡを含むヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
該非腫瘍形成性ヒト線維芽細胞及び該ヒト乳房上皮細胞を近接して試験マウスに移植する工程；ならびに
適切な対照と比較して、形成された腫瘍の数又は腫瘍形成の潜伏の増加又は減少を、試験マウスにおいて検出する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
マウスにヒト乳房原発性腫瘍を増殖させる方法であって、
（ａ）該腫瘍からヒト乳房上皮細胞を提供する工程；
（ｂ）不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を提供する工程；
（ｃ）該上皮細胞及び該線維芽細胞を互いに近接してマウスに移植する工程；ならびに
（ｄ）該腫瘍を増殖させる上で十分な時間にわたり該マウスを維持する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記上皮細胞及び線維芽細胞を、乳房脂肪パッド、生殖腺脂肪パッド、腎臓莢膜、及び側腹部の皮下部位からなる群より選択される部位で前記マウスに移植する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記部位が乳房脂肪パッドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記乳房脂肪パッドに不死化非腫瘍形成性ヒト乳房線維芽細胞を予め注入する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記上皮細胞及び線維芽細胞を移植の前に混合し、細胞混合物として移植する、請求項４０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５２２６２６（Ｐ２００８−５２２６２６Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５６４４（Ｐ２００７−５４５６４４）
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４５０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３１８２
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０６０７０２２４）アベオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４５０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３１８２
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０６０７０２２４）アベオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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