冠動脈疾患の危険性を層別化するための動脈血栓および炎症の基部マーカー
本発明は、個体が冠状動脈性事象を罹患しているのかという診断または個体が冠状動脈性事象を罹患する危険にあるのかという予後を確立するための方法に関する。この方法は、個体の体液中のsCD40Lの濃度を測定し；基部炎症性マーカー、好ましくは、PAPP-AまたはLp-PLA2の濃度を測定し；得られた値と基準値とを比較し；そして心血管系事象に関する診断または予後を確立することを含む。本発明による組合せは、さらに炎症性マーカー、抗炎症性マーカーおよび／または神経液性マーカーから選択されるさらなるマーカーと用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈障害の危険性を決定するための特定の診断マーカーの組合せに関する。より詳細には、本発明による組合せによって、試験した患者がリスクを被る冠状動脈性事象のより正確な予測が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
冠動脈疾患は未だに、西洋諸国において最も一般的な死亡原因である。様々な冠動脈障害を誘導する複数の危険因子が知られている。一例として、血中の総コレステロールおよびHDLコレステロールのレベルがある。しかしながら、コレステロールレベルの予測有用性は低く、冠状動脈性事象の高いリスクプロファイルを有する多数の個体を同定することは、コレステロールレベルを測定することによっては不可能である。
【０００３】
冠動脈疾患とは、異なる治療および、試験下における個体管理の異なる程度を必要とする患者の異なる危険度を示す様々な冠状動脈性事象を含む一般的な用語である。
【０００４】
冠動脈疾患を罹患する個体は、臨床的な症状を示さない個体と息切れおよび／または胸痛がみられる個体とに分けることができる。後者の群は、安定狭心症(SAP)を有する個体と急性冠症候群(ACS)を有する個体とに分けることができる。ACS患者は、不安定狭心症(UAP)を示しうるか、あるいはこれらの患者は既に、心筋梗塞(MI)を罹患している。MIは、ST上昇MIまたは非ST上昇MIでありうる。MIの発症に続いて、左心室機能不全(LVD)が発症しうる。最終的に、LVD患者は、おおよそ15 %の死亡率を有するうっ血性心不全(CHF)を罹患するか、あるいは、なんの症状も示さない。
【０００５】
胸痛を示す患者は、ST上昇またはST下降について試験される。これが症状であるならば、患者個人は、100 %に近い確率でMIを罹患しており、入院させられる。しかし、MIの全ての個体がST異常を示すわけではないので、心筋トロポニン(cTnTまたはcTNI)レベルを測定する。これは、異常に高い数値の場合に、高い確率でMIを発症していることを示している。
【０００６】
トロポニンレベルの測定は、MIの分析に有用な道具として確立され、また医者にとって慣用的なステップになっている。
【０００７】
しかし、冠疾患の複雑性、およびうっ血性心不全（CHF)を発症する前にこのような疾患を有する個体が経験する様々な段階の故に、医者は、AMIおよびCHFに先立つ何らかの冠状動脈性事象の危険にある個体の早期診断を可能とする系を必要とする。
【０００８】
当業者は、冠動脈疾患の診断に有用でありうる多数の異なる分子マーカー、またはそれらそれぞれのサブタイプを知っている。このようなマーカーの例は、以下のものである：
妊娠関連血漿タンパク質A(PAPP-A)；高感度 C 反応性タンパク質(hsCRP；胎盤増殖因子(PlGF)；インターロイキン-18(IL-18／IL-18b)；脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)；NT-プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロNP)；虚血性変性アルブミン(IMA)、可溶性CD40リガンド(sCD40L)、心筋トロポニン I／T(cTnI／T)、IL-10、ICAM-1、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン、IL-6、VEGF、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、CKMB、MPO、LpPLA2、GP-BB、IL1RA、TAFI、可溶性フィブリン、抗oxLDL、MCP-1、凝血促進性組織因子(TF)、MMP-9、Ang-2、IL-8、bFGF、フォン・ウィルブランド因子(vWF)、VLDL、PAI-1。
【０００９】
上記のいくつかのマーカーは、公知であり、かつ特徴付けされ、冠疾患の病態生理学においてそれらの機能が確立されているが、それに対して他のものは、その予後の有用性に関して詳細に調べられていない。
【００１０】
上記のほぼ全てのマーカーは、特定の冠状動脈性事象に関して診断上有用である。例えば、CRPのようなマーカーは、プラーク破綻およびMIを誘導しうる炎症の診断および予測に有用である。
【００１１】
たとえ複数のマーカーの診断上の有用性が確立され、いくつかのものは特定の冠状動脈性事象に関して極めて重要で正確な情報を得られることが見出されていても、多くのマーカーは単独で、または特定の他のマーカーと組み合わせて用いられるのみでありうる。マーカーの組合せの使用は、限定的に記載されているだけである。
【００１２】
Pengらは、Clinica Chimica Acta 319(2002) 19-26に、sICAM-1およびsVCAM-1とのsCD40Lの組合せを開示している。Blankenbergらは、Circulation. 2002；106:24-30に、CRPとIL-6との組合せを記載している。Autieroらは、Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370に、PlGFとVEGFとの組合せを記載している。
【００１３】
かなりの量のマーカーは、体液、一般に血液中におけるそれらの発現が互いに独立していないために、特定のさらなるマーカーとの組合せにおいてさらなる情報を生じない。マーカーとして適切な特定のタンパク質の産生は、他のマーカーの産生を誘導しうる。これは両方のマーカーが、同一の病態生理学的現象を示すことを意味している。どのマーカーまたはどのマーカーのサブグループを、高い正確性を有する診断情報を得る組合せに用いるか、あるいは患者の冠動脈のリスクプロファイルを確立するために用いることができるのか、実際に確立されていない。
【非特許文献１】Clinica Chimica Acta 319(2002) 19-26
【非特許文献２】Circulation. 2002；106:24-30
【非特許文献３】Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、冠状動脈性事象の診断マーカーの一般的な組合せを見出すことである。この組合せによって、試験下の個体が将来的に罹患する可能性のある冠状動脈性事象のより正確な診断および予後を可能とする。さらに、本発明はまた、急性疾患の症状を示さないCHDの危険にある個体の診断と予後も可能とする。特に、本発明は、CHDの危険にある個体の診断を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本目的は、個体が、将来的に冠状動脈性事象を罹患する危険性にあるのかという診断および予後を確立するための方法によって達成される。この方法は、
個体の体液中のsCD40Lおよび基部炎症性マーカーの濃度を測定する工程；
得られた値と基準値とを比較する工程；ならびに
冠状動脈性事象に関する診断または予後を確立する工程、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明との関係において、「冠状動脈性事象」に言及する場合、この語句は、一般に、冠動脈疾患に関する特定の病態生理学的状態をいう。冠状動脈性事象の例としては、ACS、AMI(急性心筋梗塞)、SAP、UAP、CHF、LVD、および当業者に公知であるその他の疾患がある。本発明による方法を用いて診断および／または予測することができる冠状動脈性事象のリストは、以下に記述する。
【００１７】
個体とは、胸痛を示す個体または冠動脈疾患に関するいずれの症状も示さない個体でありうる。例えば、個体は、胸痛も、および／またはST上昇も示さないかもしれない。
【００１８】
本発明による方法は、疾患症状を明確に示さない、高い危険にある個体にとって特に有利である。
【００１９】
CHDの危険にある患者、特に、I型およびII型の糖尿病の患者、腎不全の糖尿病患者、急性心血管事象後、例えば、心筋梗塞または脳卒中後の患者、進行性および重篤な動脈硬化の患者、末梢動脈疾患(PAD)、高コレステロール血症、高血圧、遺伝的体質(例えば、AMIおよび／または虚血性脳卒中の家族の病歴)、代謝症候群、肥満、前喫煙者ならびに従来の危険因子を伴わない他の無症候性患者は、フラミンガム（Framingham）、プロカム（Procam）に従って算出された危険値ならびに同等の危険値を有しうる。
【００２０】
基部炎症性マーカーの濃度は、sCD40Lの濃度が測定される前に測定できる。基部炎症性マーカーの測定はまた、sCD40Lの測定と同時に、または後に行うことも可能である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは炎症性マーカーである。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは抗炎症性マーカーである。
【００２３】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えてさらに少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは神経液性マーカーである。
【００２４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも二つのマーカーの濃度が測定される。一つのさらなるマーカーは、抗炎症性マーカーから選択され、他のさらなるマーカーは、神経液性マーカーから選択される。
【００２５】
本発明による特定のマーカーの組合せ、すなわち、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーによって、個体の病態生理学的冠動脈状態の信頼できる分析が可能であることが見出された。
【００２６】
本発明による方法はそれ自体が、冠状動脈性事象の診断および予後、ならびに治療の層別化および処置管理のためのものとなる。
【００２７】
本発明の関係において「診断」とは、個体が、特定の冠状動脈性事象に罹患しているかを確かめることをいう。
【００２８】
本発明の関係において「予後」とは、個体が、特定の冠状動脈性事象に罹患するであろう予測可能性（％）をいう。
【００２９】
本発明の関係において「治療の層別化」とは、発症しうるまたは発症した冠状動脈性事象に対する適切な治療処置を評価することをいう。
【００３０】
本発明の関係において「処置管理」とは、個体の治療処置を制御および必要な場合には調整することをいう。
【００３１】
「治療処置」とは、個体の病態生理学的状態を変えることができる任意の処置を含み、例えば、医薬物の投与、および外科的処置(例えば、血行再建術、バルーン拡張術、ステント留置術)を含む。
【００３２】
本発明による組合せは、特定の心血管系事象または特定の冠状動脈性事象の危険性をそれぞれ予測するマーカーを使用し、各マーカー濃度の測定は、独立した結果を生じ、従って、それぞれの事象各々についての予測可能性は、他のマーカーの結果と独立している。
【００３３】
sCD40Lは、炎症性マーカー、特にhsCRPと組み合わせて用いることが有利でありうることが確立されている(WO 03／040692およびCirculation 2001；104:2266-2268を参照のこと)。しかし、本発明の発明者らが見出したsCD40Lと基部炎症性マーカーとの組合せが、有利な診断結果をもたらすということはまったく確立されていない。
【００３４】
本発明の関係において用いられる場合、「心血管系事象」とは、健康な個体には見出されない、「心血管系疾患」という一般用語にあてはまる特定の病態生理学的冠動脈状態を示す。当業者は、哺乳動物、特にヒトで発症しうる様々な心血管系事象を知っている。
【００３５】
本発明によるマーカーの組合せを用いて診断または予測することができる心血管系事象としては、以下のものが挙げられる：冠動脈疾患(CHD)；安定狭心症(SAP)；不安定狭心症(UAP)；急性冠症候群(ACS)；ST上昇および非ST上昇の両方の場合の急性心筋梗塞(AMI)；左心室機能不全(LVD)；うっ血性心不全(CHF)。
【００３６】
sCD40Lは特に、既に傷つきやすくなっているプラークが破綻し、結果として、左心室機能不全(LVD)、うっ血性心不全(CHF)および死をもたらしうる可逆的血管閉塞(UAP)または不可逆的血管閉塞(AMI)を生じる危険性の代表である血小板の活性化、血小板の凝集および血栓の生長に関連する。
【００３７】
当業者に特定の診断値を有することが知られているTnT（AMIについての実験室でのゴールドスタンダード）に加えて、sCD40Lが、危険性のある患者における冠状動脈性事象の診断および予測に最も重要なマーカーであることが、本発明者らにより認識された。しかし、TnTの予測値は、心臓組織の虚血性の損傷、例えば、心筋壊死を示すので、急性心血管事象に限定される。
【００３８】
sCD40Lは、炎症のマーカーであり（Aukrust, Circulation 1999；100: 604-620を参照のこと）、従って、冠状動脈性事象発症の危険性を示すと考えられている。以前に言及したWO 03／040691において、sCD40Lは、炎症の体系的なマーカーとして記載されている。しかし、WO 03／040691には、sCD40Lが、冠状動脈性事象の体系的なマーカーとしてみなされるだけではなく、動脈プラークの糜爛および破綻の結果として生じる、アテローム血栓性事象、すなわち、血小板の活性化の基部体系的マーカーでもありうることについてはまったく言及されていない。さらに、WO 03／040691においては、sCD40Lが、基部炎症性マーカーと組み合わせて有利に用いることができることについて言及も示唆もしていない。
【００３９】
基部炎症性マーカーは特に、個体に既に存在するプラークが、炎症を受け、プラーク破綻および血栓形成の可能性を増大させる危険性に関連する。
【００４０】
当業者に公知である炎症性マーカーとして、以下のものが挙げられる：
CRP、好ましくは、hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)；血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)；フォン・ウィルブランド因子(vWF)。
【００４１】
基部炎症性マーカーは、当業者に公知であり、非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼ A2(Lp-PLA2)；フォン・ウィルブランド因子(vWF)。
【００４２】
基部マーカーの群内において、後者は、マトリックスメタロプロテアーゼMMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12、PAPP-A、およびLp-PLA2から選ばれた場合が好ましい。
【００４３】
好ましい基部炎症性マーカーは、PAPP-A、MMP-9およびLp-PLA2である。
【００４４】
最も好ましい基部炎症性マーカーは、PAPP-AおよびLp-PLA2、特にPAPP-Aである。
【００４５】
基部炎症性マーカーは、上流、すなわち、疾患事象の病原箇所（ethiopathogenetic origin）の近傍またはその箇所に位置している巨大分子である。特に、これらの分子は、冠動脈病変部、好ましくは動脈プラークにて産生される。
【００４６】
基部炎症性マーカーに対して、反応性炎症性マーカーは、疾患事象の下流または、疾患事象に対して二次的に産生される。例えば、急性期タンパク質CRP(C-反応性タンパク質)は、根本病変部に由来するケモカインまたはインターロイキンに応答または反応して、遠位器官（すなわち、肝臓)によって産生される。
【００４７】
これらのいわゆる反応性炎症性マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)。
【００４８】
hsCRPは、急性冠症候群の危険性を層別化するのに、現在最も好ましい炎症性マーカーである。しかし、hsCRPは、基部炎症性マーカーと同じようには、その診断力および予測力を及ぼさない。
【００４９】
本発明に従って組み合わせて用いることができる抗炎症性マーカーには、IL-10がある。
【００５０】
本発明に従って組み合わせて用いることができる神経液性マーカーは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)；NT-プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロANP)；脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)；NT-プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロBNP)である。
【００５１】
好ましい神経液性マーカーはBNP、NT-プロBNPである。
【００５２】
最も好ましい神経液性マーカーは、NT-プロBNPである。
【００５３】
神経液性マーカーは、特に、既にMI(ST上昇または非ST上昇)を罹患している患者ならびにLVDおよびCHFを罹患する危険にある患者に関連する。
【００５４】
本発明によるマーカーの組合せと共に用いることができるさらなる炎症性マーカーは、前に述べた群、すなわち以下：CRP、好ましくはhsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼ A2(Lp-PLA2)；vWF、から選択される。
【００５５】
さらなる炎症性マーカーは、用いた第一の(基部)炎症性マーカーとは異なるように選択される。
【００５６】
さらなる炎症性マーカーもまた、基部マーカー(好ましくは、Lp-PLA2)である場合が好ましい。；すなわち、マーカーの組合せであるPAPP-A／Lp-PLA2は、マーカーの組合せであるPAPP-A／hsCRPよりも好ましい。
【００５７】
本発明による基部炎症性マーカーとのsCD40Lの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40、PAPP-A；
sCD40L、Lp-PLA2；
sCD40L、MMP-9。
【００５８】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-Aである。
【００５９】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよびさらなる炎症性マーカーの好ましい組合せは、以下のとおりである：
sCD40L、PAPP-A、Lp-PLA2
sCD40L、PAPP-A、hsCRP
sCD40L、MMP-9、Lp-PLA2
sCD40L、MMP-9、hsCRP。
【００６０】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、Lp-PLA2である。
【００６１】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよび抗炎症性マーカーの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40L、PAPP-A、IL-10；
sCD40L、Lp-PLA2、IL-10；
sCD40L、MMP-9、IL-10。
【００６２】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、IL10である。
【００６３】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよび神経液性マーカーの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40l、PAPP-A、NT-プロBNP；
sCD40L、Lp-PLA2、NT-プロBNP ；
sCD40L、MMP-9、NT-プロBNP。
【００６４】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、NT-プロBNPである。
【００６５】
sCD40Lと炎症性マーカーとの組合せに加えて二つのマーカーを用いる場合、好ましいものとして上に示した組合せを用い、これらをその組合せと組合せ可能であるマーカーの群に由来する好ましいマーカーと組み合わせることが好ましい。
【００６６】
このような好ましい組合せの例としては、以下のものが挙げられる：
個体が、本発明による方法を用いて、将来的に冠状動脈性事象を罹患する危険性について分析された場合、あるいは個体が既に冠状動脈性事象に罹患している場合には、この個体は、1つまたは複数の特定の治療処置について層別化できる。これらは、抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体)、低分子、薬理学的に活性な化合物、すなわち、抗炎症性および脂質低下薬(例えば、スタチン)、血液凝固溶解剤(例えば、血小板アンタゴニスト)、繊維素溶解剤(例えば、ヘパリン)、血行再建治療(例えば、PCTI(経皮的治療処置)、バルーン拡張術、ステント留置術、バイパス外科手術)。
【００６７】
本発明による方法によって、上記レジメンによって処置される個体の治療処置管理を可能にする。
【００６８】
本発明の1つの実施形態において、冠状動脈性事象を罹患しているか、または罹患する危険にある個体は、血小板 糖タンパク質IIb／IIIa受容体のインヒビターまたはアンタゴニストを投与することによって処置される。このようなインヒビターの例としては、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、チロフィバン、エプチフィバチド（eptifibatide）などが挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、糖タンパク質IIb／IIIa受容体インヒビターは、抗体、特に、Abciximabの名前で知られる抗体である。Abciximabは、Centocor Europe BVよりReoProの商品名で入手することが可能であるFab抗体である。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態において、抗CD40Lモノクローナル抗体が、個体に投与され得る。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、抗炎症剤が、監視下にて個体に投与される。抗炎症剤は、非ステロイド抗炎症剤またはステロイド抗炎症剤でありうる。
【００７２】
非ステロイド抗炎症剤の例としては、アルクロフェナック（Alclofenac）；二プロピオン酸アルクロメタゾン（Alclometasone Dipropionate）；アルゲストン・アセトニド(Algestone Acetonide)；αアミラーゼ（Alpha Amylase）；アムシナファル（Amcinafal）；アムシナフィド(Amcinafide)；アンフェナクナトリウム（Amfenac Sodium）；塩酸アミプリロース（Amiprilose Hydrochloride）；アナキンラ（Anakinra）；アニロラック(Anirolac)；アニトラザフェン(Anitrazafen)；アパゾン（Apazone）；バルサラジド二ナトリウム（Balsalazide Disodium）；ベンダザック（Bendazac）；ベノキサプロフェン(Benoxaprofen)；塩酸ベンジダミン（Benzydamine Hydrochloride）；ブロメライン（Bromelains）；ブロペラモール(Broperamole)；ブデソニド(Budesonide)；カープロフェン(Carprofen)；シクロプロフェン(Cicloprofen)；シンタゾン(Cintazone)；クリプロフェン(Cliprofen)；プロピオン酸クロベタゾール（Clobetasol Propionate）；酪酸クロベタゾン（Clobetasone Butyrate）；クロピラク(Clopirac)；プロピオン酸クロチカゾン（Cloticasone Propionate）；酢酸コルメタゾン（Cormethasone Acetate）；コルトドキソン（Cortodoxone）；デフラザコート（Deflazacort）；デソニド(Desonide)；デソキシメタゾン（Desoximetasone）；二プロピオン酸デキサメタゾン（Dexamethasone Dipropionate）；ジクロフェナクカリウム（Diclofenac Potassium）；ジクロフェナクナトリウム（Diclofenac Sodium）；二酢酸ジフロラゾン（Diflorasone Diacetate）；ジフルミドンナトリウム(Diflumidone Sodium)；ジフルニサル(Diflunisal)；ジフルプレドネート(Difluprednate)；ジフタロン（Diftalone）；ジメチルスルホキシド（Dimethyl Sulfoxide）；ドロシノニド(Drocinonide)；エンドリソン(Endrysone)；エンリモマブ(Enlimomab)；エノリカムナトリウム（Enolicam Sodium）；エピリゾール（Epirizole）；エトドラク（Etodolac）；エトフェナメート（Etofenamate）；フェルビナク（Felbinac）；フェナモール(Fenamole)；フェンブフェン(Fenbufen)；フェンクロフェナク(Fenclofenac)；フェンクロラク（Fenclorac）；フェンドサール（Fendosal）；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザク（Fentiazac）；フラザロン（Flazalone）；フルアザコルト（Fluazacort）；フルフェナム酸（Flufenamic Acid）；フルミゾール（Flumizole）；酢酸フルニソリド（Flunisolide Acetate）；フルニキシン（Flunixin）；フルニキシンメグルミン（Flunixin Meglumine）；フルコルチンブチル(Fluocortin Butyl)；酢酸フルオロメソロン（Fluormetholone Acetate）；フルクァゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン（Flurbiprofen）；フルレトフェン（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカゾン（Fluticasone Propionate）；フラプロフェン（Furaprofen）；フロブフェン（Furobufen）；ハルシノニド（Halcinonide）；プロピオン酸ハロベタゾール（Halobetasol Propionate）；酢酸ハロプレドン（Halopredone Acetate）；イブフェナク（Ibufenac）；イブプロフェン（Ibuprofen）；イブプロフェンアルミニウム(Ibuprofen Aluminium)；イブプロフェンピコナール(Ibuprofen Piconol)；イロニダプ（Ilonidap）；インドメタシン(Indomethacin)；インドメタシンナトリウム(Indomethacin Sodium)；インドプロフェン(Indoprofen)；インドキソール（Indoxole）；イントラゾール（Intrazole）；酢酸イソフルプレドン（Isoflupredone Acetate）；イソキセパク（Isoxepac）；イソキシカ（Isoxicam）；ケトプロフェン(Ketoprofen)；塩酸ロフェミゾール（Lofemizole Hydrochloride）；ロルノキシカム（Lornoxicam）；ロテプレドノールエタボネート(Loteprednol Etabonate)；メクロフェナメートナトリウム(Meclofenamate Sodium)；メクロフェナム酸（Meclofenamic Acid）；メクロリンジブチラート(Meclorisone Dibutyrate)；メフェナム酸（Mefenamic Acid）；メサラミン（Mesalamine）；メセクラゾン(Meseclazone)；メチルプレドニソロンスレプタネート(Methylprednisolone Suleptanate)；モルニフルマート（Morniflumate）；ナブメトン（Nabumetone）；ナプロキセン（Naproxen）；ナプロキセンナトリウム(Naproxen Sodium)；ナプロキソール（Naproxol）；ニマゾン(Nimazone)；オルサラジンナトリウム(Olsalazine Sodium)；オルゴテイン(Orgotein)；オルパノキシン（Orpanoxin）；オキサプロジン（Oxaprozin）；オキシフェンブタゾン（Oxyphenbutazone）；塩酸パラニリン（Paranyline Hydrochloride）；ペントサン・ポリサルフェート・ナトリウム(Pentosan Polysulfate Sodium)；フェンブタゾン・ナトリウム・グリセラート(Phenbutazone Sodium Glycerate)；ピルフェニドン(Pirfenidone)；ピロキシカム(Piroxicam)；ピロキシカムシンナマート（Piroxicam Cinnamate）；ピロキシカムオラミン(Piroxicam Olamine)；ピルプロフェン（Pirprofen）；プレドナゼート(Prednazate)；プリフェロン（Prifelone）；プロドール酸（Prodolic Acid）；プロクァゾン（Proquazone）；プロキサゾール（Proxazole）；クエン酸プロキサゾール（Proxazole Citrate）；リメキソロン(Rimexolone)；ロマザリット（Romazarit）；サルコレクス（Salcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート（Salsalate）；サリシレート(Salycilates)；塩化サングイナリウム（Sanguinarium Chloride）；セクラゾン（Seclazone）；セルメタシン(Sermetacin)；スドキシカム（Sudoxicam）；スリンダク（Sulindac）；スプロフェン（Suprofen）；タルメタシン（Talmetacin）；タルニフルマート（Talniflumate）；タロサラート（Talosalate）；テブフェロン（Tebufelone）；テニダプ（Tenidap）；テニダプナトリウム(Tenidap Soidum)；テノキシカム（Tenoxicam）；テシカム（Tesicam）；テシミド(Tesimide)；テトライダミン(Tetrydamine)；チオピナック(Tiopinac)；ピバリン酸チクソコルトール(Tixocortol Pivalate)；トルメチン(Tolmetin)；トルメチンナトリウム(Tolmetin Sodium)；トリクロニド(Triclonide)；トリフルミデート(Triflumidate)；ジドメタシン(Zidometacin)；グルココルチコイド(Glucocorticoid)；ゾメピラック・ナトリウム(Zomepirac Sodium)が挙げられる。
【００７３】
ステロイド抗炎症剤の例としては、グルココルチコイド(Glucocorticoid)、例えば、デキサメタゾン、および当業者に公知であるその他の薬剤が挙げられる。
【００７４】
監視下にて個体に投与することができるさらなる化合物クラスおよび化合物は：ヘパリン（Heparin)および誘導体；マルクマル（Marcumar）；rTpA：組換え組織プラスミノゲンアクチベーター、トロンビン受容体アンタゴニスト様アスピリンおよびクロピドグレル；インスリン感受性増強物質(グリタゾン)；カルシウムチャネル阻害剤；ACEインヒビター、である。
【００７５】
監視下にて個体に投与することができるさらなる化合物クラスは、スタチンである。
【００７６】
試験下にて個体の体液中のそれぞれのマーカーの濃度を測定するために用いることができる方法は、当業者に知られている。これらの方法は、マイクロプレートELISA系方法、完全自動化免疫アッセイ(例えば、cTnTを試験するためのElecsys（商標）分析器で利用可能)、CBA(酵素コバルト結合アッセイ（Cobalt Binding Assay）、例えば、IMAを試験するためのRoche-Hitachi（商標）分析器で利用可能)；ラテックス凝集アッセイ(例えば、hsCRPを試験するためのRoche-Hitachi（登録商標）分析器で利用可能)を含む。
【００７７】
以下、当業者に公知である方法を概観する。
【００７８】
ペプチドおよびポリペプチド（タンパク質）は、組織、細胞、および体液のサンプル内にて、すなわち好ましくはin vitro にて測定できる。体液中のマーカー（タンパク質）を測定することが好ましい。
【００７９】
本発明による体液は特に、全血、血液血清、血液血漿、リンパ液、大脳液（cerebral liquor）、唾液、および尿を含む。本発明の関連における測定のために、全血、血液血清または血漿を用いることが好ましい。
【００８０】
本発明による組織サンプルとは、死亡したもしくは生きているヒト、または動物の体から得られた任意の種類の組織をいう。組織サンプルは、当業者に公知である任意の方法、例えば、生検または掻爬によって得ることができる。
【００８１】
細胞試料を得るための方法は、単一の細胞または小細胞群を直接的に調製する方法、例えば、トリプシンを用いて組織を解離する方法、および、例えば、濾過または遠心分離によって体液から細胞を分離する方法を含む。本発明による細胞はまた、血小板および他の非核細胞、例えば、赤血球を含む。
【００８２】
必要であるならば、試料はさらに処理してもよい。特に、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを、濾過、遠心分離、または例えば、クロロホルム／フェノール抽出のような抽出方法を含む、当該分野で公知の方法に従って、試料から精製しても良い。
【００８３】
当業者は、試料中のペプチドまたはポリペプチド(マーカー)の濃度（体積に対する重量）を決定（測定）するための様々な方法を良く知っている。測定は、細胞の応答、結合リガンドの量、標識、または酵素による反応生成物を測定することによって、間接的に行うことができる。
【００８４】
細胞応答を測定するために、試料または処理した試料を細胞培養物に加え、そして内部または外部の細胞応答を測定する。細胞応答としては、受容体遺伝子の発現または基質、例えば、ペプチド、ポリペプチド、または低分子の分泌を挙げることができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、目的（マーカー）のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドの濃度を測定する。本発明による結合には、共有結合および非共有結合の両方を含む。
【００８６】
本発明によるリガンドは、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合する任意のペプチド、ポリペプチド、核酸または他の物質でありうる。ペプチドまたはポリペプチドは、ヒトまたは動物体から得たか、または精製された場合に、例えば、グリコシル化によって改変できることが周知である。本発明による適切なリガンドは、ペプチドまたはポリペプチドに、また、そのような部位を介して結合することができる。
【００８７】
好ましくは、リガンドは、測定されるべきマーカーに特異的に結合すべきである。本発明による「特異的結合」とは、リガンドが、調べられる試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（交叉反応）しない。好ましくは、特異的に結合されるタンパク質またはイソフォームは、任意の他の関連のあるペプチドまたはポリペプチドよりも、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも50倍、高い親和性により結合されるべきである。
【００８８】
調べられるペプチドまたはポリペプチドが、ウエスタンブロットにおけるその大きさによって、または試料中に比較的豊富に存在することによって、明確に区別かつ測定することができる場合には、非特異的結合であってもよい。
【００８９】
リガンドの結合は、当該分野にて公知である任意の方法によって測定できる。好ましくは、この方法は、半定量的または定量的である。好適な方法は、以下に記載される。
【００９０】
第一に、リガンドの結合は、例えば、NMRまたは表面プラズモン共鳴によって直接的に測定できる。
【００９１】
第二に、リガンドがまた、目的のペプチドまたはポリペプチドの酵素活性の基質として作用する場合に、酵素による反応生成物を測定できる(例えば、プロテアーゼの量は、切断された基質の量を、例えば、ウエスタンブロットで測定することによって測定できる)。
【００９２】
酵素による反応生成物の測定のために、基質の量は飽和するのが好ましい。基質はまた、反応の前に、検出可能な標識で標識することができる。好ましくは、試料を、適当な期間、基質と接触させる。適当な期間とは、生成されるべき生成物を検出できる、好ましくは、測定できるのに必要な時間をいう。生成物の量を測定する代わりに、一定（例えば、検出可能である）量の生成物の出現に必要な時間を測定することができる。
【００９３】
第三に、リガンドは、リガンドの検出および測定を可能にする標識と共有的にまたは非共有的に結合できる。
【００９４】
標識付けは、直接的または間接的な方法によって行うことができる。直接的な標識付けには、リガンドに対する標識の直接的な（共有的または非共有的）結合を含む。間接的な標識付けには、第一のリガンドに対する第二のリガンドの（共有的または非共有的）結合を含む。第二のリガンドは、第一のリガンドに特異的に結合すべきである。この第二のリガンドは、好適な標識と結合され、および／またはこの第二のリガンドに結合する第三のリガンドの標的（受容体）であってもよい。第二、第三またはさらに高次のリガンドの使用は、シグナルを増加させるために頻繁に用いられている。好適な第二およびそれ以上の高次のリガンドは、抗体、二次抗体、および周知であるストレプトアビジン-ビオチン系(Vector Laboratories, Inc.)を含みうる。
【００９５】
リガンドまたは基質はまた、当該分野にて公知であるような一つもしくは複数個のタグ を用いて「タグ付け」することができる。そして、このようなタグは、より高次のリガンドの標的でありうる。好適なタグとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ヒス-タグ、グルタチオン-S-トラスフェラーゼ、FLAG、GFP、mycタグなどが挙げられる。ペプチドまたはポリペプチドの場合には、タグは好ましくは、N末端および／またはC末端にある。
【００９６】
好適な標識は、適切な検出方法によって検出することが可能である任意の標識である。典型的な標識としては、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁性標識（「例えば、磁性ビーズ」、半磁性標識および超磁性標識を含む）、および蛍光標識が挙げられる。
【００９７】
酵素的に活性な標識としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの誘導体が挙げられる。検出に好適な基質としては、ジ-アミノ-ベンジジン(DAB)、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP(4-塩化ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート、既製の保存溶液としてRoche Diagnosticsより入手可能)、CDP-Star（登録商標）(Amersham Biosciences)、ECF（登録商標）(Amersham Biosciences)が挙げられる。好適な酵素-基質の組合せによって、当該分野で公知である方法(例えば、感光フィルムもしくは好適なカメラ系)を用いて測定できる有色反応生成物、蛍光または化学発光を生じることができる。酵素による反応を測定する場合には、上記の所定の基準を同様に適用する。
【００９８】
典型的な蛍光標識としては、蛍光タンパク質(例えば、GFPおよびその誘導体)、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、およびアレクサ色素(例えば、アレクサ568)が挙げられる。さらなる蛍光標識は、例えば、Molcular Probes(Oregon)より入手可能である。
【００９９】
典型的な放射性標識としては、35S、125I、32P、33Pなどが挙げられる。放射性標識は、公知でありかつ適切な任意の方法、例えば、感光フィルムまたは発光映像器によって検出することができる。
【０１００】
本発明による好適な測定方法にはまた、電気化学発光（電気発生化学発光）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、比濁分析、ネフェロ分析、ラッテクス増強比濁分析もしくはネフェロ分析、または固相免疫試験を含む。
【０１０１】
好ましいリガンドとしては、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド、およびアプタマー、例えば、核酸アプタマーもしくはペプチドアプタマーが挙げられる。このようなリガンドの方法は、当該分野において周知である。例えば、好適な抗体またはアプタマーの同定および製造はまた、販売業者から提供される。当業者は、高い親和性または特異性を有するこのようなリガンドの誘導体を造るための方法を良く知っている。例えば、ランダム変異を、核酸、ペプチドまたはポリペプチドに導入することができる。次に、これらの誘導体を、当該分野で公知であるスクリーニング手順（例えば、ファージ・ディスプレイ）に従って、結合について試験できる。
【０１０２】
本明細書中にて用いられる場合に用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにFv、FabおよびF(ab)2断片のような抗原またはハプテンに結合することができるそれらの断片を含む。本発明はまた、「ヒト化」ハイブリッド抗体を含み、その中で所望される抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列は、ヒト受容体抗体の配列と組み合わせられる。このドナー配列は一般に、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むが、他の構造的および／または機能的に関連のあるドナー抗体のアミノ酸残基も含む。このようなハイブリッドは、当該分野において周知である複数の方法によって調製できる。
【０１０３】
特定の目的のペプチドまたはポリペプチドの測定のためのリガンドまたは試薬の例としては、以下が挙げられる：
sCD40L
ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany またはBenderMedSystems, Vienna, Austria, およびAlexis Biochemicals)；FITCタグ抗体およびFLAGタグ抗体を含む抗体はまた、Alexis(Gruenberg, Germany), Ancell,およびImmunotech(Hamburg, Germany)から入手可能である；Abbott Pharmaceuticals, Abbott Park, Illinoisに由来する抗原；CD40受容体。
【０１０４】
NT-プロBNP:
電気化学発光技術(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany製のElecsys 2010 およびE170)に基づく１ステップの免疫アッセイが利用可である。
【０１０５】
PAPP-A:
PAPP-Aは、手動または半自動化ELISAマイクロプレートによって測定することができ、また例えば、IBL(Hamburg, Germany)またはDSL(Webster, TX, USA)から入手可能である。
【０１０６】
IL-10:
手動ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany)
MMP-9:
手動ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany)
Lp-PLA2:
手動ELISA(例えば、diaDexus, USA)
別の好ましい実施形態において、好ましくは、核酸、ペプチド、ポリペプチドからなる群、より好ましくは、核酸、抗体、またはアプタマーの群からなるリガンドが、アレイ上に存在する。
このアレイは、少なくとも一つのさらなるリガンドを含み、このリガンドは、目的のペプチド、ポリペプチドまたは核酸に対して指向されうる。このさらなるリガンドはまた、本発明の関連において特定の目的ではないペプチド、ポリペプチドまたは核酸に対して指向されうる。好ましくは、本発明の関連において、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも８つの目的のペプチドまたはポリペプチドのリガンドが、アレイに収容される。
【０１０７】
本発明によると、用語「アレイ」とは、固相またはゲル様担体をいい、この上に少なくとも二つの複合体が、１次元、２次元、３次元の配置で付着または結合されている。このようなアレイ（「遺伝子チップ」、「タンパク質チップ」、抗体アレイなどを含む）は、一般に当業者に公知であり、また典型的に顕微鏡用スライドガラス、特に、ポリカチオン、ニトロセルロース、またはビオチンでコートされたスライドのようなコートされたスライドガラス、カバーガラス、およびメンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン系のメンブレン）上に作製される。
【０１０８】
上記のアレイには、結合リガンドまたは少なくとも一つのリガンドを発現している少なくとも二つの細胞を含みうる。
【０１０９】
このようなアレイ、例えば、固相化学および光に不安定な保護基に基づくアレイを作製する方法は、一般に公知である(US 5,744,305)。このようなアレイはまた、基質または基質ライブラリーとの接触をもたらし、そして相互作用、例えば、結合または構造変化について試験できる。従って、上記に規定されるペプチドまたはポリペプチドを含むアレイは、このペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドを同定するために用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈障害の危険性を決定するための特定の診断マーカーの組合せに関する。より詳細には、本発明による組合せによって、試験した患者がリスクを被る冠状動脈性事象のより正確な予測が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
冠動脈疾患は未だに、西洋諸国において最も一般的な死亡原因である。様々な冠動脈障害を誘導する複数の危険因子が知られている。一例として、血中の総コレステロールおよびHDLコレステロールのレベルがある。しかしながら、コレステロールレベルの予測有用性は低く、冠状動脈性事象の高いリスクプロファイルを有する多数の個体を同定することは、コレステロールレベルを測定することによっては不可能である。
【０００３】
冠動脈疾患とは、異なる治療および、試験下における個体管理の異なる程度を必要とする患者の異なる危険度を示す様々な冠状動脈性事象を含む一般的な用語である。
【０００４】
冠動脈疾患を罹患する個体は、臨床的な症状を示さない個体と息切れおよび／または胸痛がみられる個体とに分けることができる。後者の群は、安定狭心症(SAP)を有する個体と急性冠症候群(ACS)を有する個体とに分けることができる。ACS患者は、不安定狭心症(UAP)を示しうるか、あるいはこれらの患者は既に、心筋梗塞(MI)を罹患している。MIは、ST上昇MIまたは非ST上昇MIでありうる。MIの発症に続いて、左心室機能不全(LVD)が発症しうる。最終的に、LVD患者は、おおよそ15 %の死亡率を有するうっ血性心不全(CHF)を罹患するか、あるいは、なんの症状も示さない。
【０００５】
胸痛を示す患者は、ST上昇またはST下降について試験される。これが症状であるならば、患者個人は、100 %に近い確率でMIを罹患しており、入院させられる。しかし、MIの全ての個体がST異常を示すわけではないので、心筋トロポニン(cTnTまたはcTNI)レベルを測定する。これは、異常に高い数値の場合に、高い確率でMIを発症していることを示している。
【０００６】
トロポニンレベルの測定は、MIの分析に有用な道具として確立され、また医者にとって慣用的なステップになっている。
【０００７】
しかし、冠疾患の複雑性、およびうっ血性心不全（CHF)を発症する前にこのような疾患を有する個体が経験する様々な段階の故に、医者は、AMIおよびCHFに先立つ何らかの冠状動脈性事象の危険にある個体の早期診断を可能とする系を必要とする。
【０００８】
当業者は、冠動脈疾患の診断に有用でありうる多数の異なる分子マーカー、またはそれらそれぞれのサブタイプを知っている。このようなマーカーの例は、以下のものである：
妊娠関連血漿タンパク質A(PAPP-A)；高感度 C 反応性タンパク質(hsCRP；胎盤増殖因子(PlGF)；インターロイキン-18(IL-18／IL-18b)；脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)；NT-プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロNP)；虚血性変性アルブミン(IMA)、可溶性CD40リガンド(sCD40L)、心筋トロポニン I／T(cTnI／T)、IL-10、ICAM-1、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン、IL-6、VEGF、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、CKMB、MPO、LpPLA2、GP-BB、IL1RA、TAFI、可溶性フィブリン、抗oxLDL、MCP-1、凝血促進性組織因子(TF)、MMP-9、Ang-2、IL-8、bFGF、フォン・ウィルブランド因子(vWF)、VLDL、PAI-1。
【０００９】
上記のいくつかのマーカーは、公知であり、かつ特徴付けされ、冠疾患の病態生理学においてそれらの機能が確立されているが、それに対して他のものは、その予後の有用性に関して詳細に調べられていない。
【００１０】
上記のほぼ全てのマーカーは、特定の冠状動脈性事象に関して診断上有用である。例えば、CRPのようなマーカーは、プラーク破綻およびMIを誘導しうる炎症の診断および予測に有用である。
【００１１】
たとえ複数のマーカーの診断上の有用性が確立され、いくつかのものは特定の冠状動脈性事象に関して極めて重要で正確な情報を得られることが見出されていても、多くのマーカーは単独で、または特定の他のマーカーと組み合わせて用いられるのみでありうる。マーカーの組合せの使用は、限定的に記載されているだけである。
【００１２】
Pengらは、Clinica Chimica Acta 319(2002) 19-26に、sICAM-1およびsVCAM-1とのsCD40Lの組合せを開示している。Blankenbergらは、Circulation. 2002；106:24-30に、CRPとIL-6との組合せを記載している。Autieroらは、Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370に、PlGFとVEGFとの組合せを記載している。
【００１３】
かなりの量のマーカーは、体液、一般に血液中におけるそれらの発現が互いに独立していないために、特定のさらなるマーカーとの組合せにおいてさらなる情報を生じない。マーカーとして適切な特定のタンパク質の産生は、他のマーカーの産生を誘導しうる。これは両方のマーカーが、同一の病態生理学的現象を示すことを意味している。どのマーカーまたはどのマーカーのサブグループを、高い正確性を有する診断情報を得る組合せに用いるか、あるいは患者の冠動脈のリスクプロファイルを確立するために用いることができるのか、実際に確立されていない。
【非特許文献１】Clinica Chimica Acta 319(2002) 19-26
【非特許文献２】Circulation. 2002；106:24-30
【非特許文献３】Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、冠状動脈性事象の診断マーカーの一般的な組合せを見出すことである。この組合せによって、試験下の個体が将来的に罹患する可能性のある冠状動脈性事象のより正確な診断および予後を可能とする。さらに、本発明はまた、急性疾患の症状を示さないCHDの危険にある個体の診断と予後も可能とする。特に、本発明は、CHDの危険にある個体の診断を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本目的は、個体が、将来的に冠状動脈性事象を罹患する危険性にあるのかという診断および予後を確立するための方法によって達成される。この方法は、
個体の体液中のsCD40Lおよび基部炎症性マーカーの濃度を測定する工程；
得られた値と基準値とを比較する工程；ならびに
冠状動脈性事象に関する診断または予後を確立する工程、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明との関係において、「冠状動脈性事象」に言及する場合、この語句は、一般に、冠動脈疾患に関する特定の病態生理学的状態をいう。冠状動脈性事象の例としては、ACS、AMI(急性心筋梗塞)、SAP、UAP、CHF、LVD、および当業者に公知であるその他の疾患がある。本発明による方法を用いて診断および／または予測することができる冠状動脈性事象のリストは、以下に記述する。
【００１７】
個体とは、胸痛を示す個体または冠動脈疾患に関するいずれの症状も示さない個体でありうる。例えば、個体は、胸痛も、および／またはST上昇も示さないかもしれない。
【００１８】
本発明による方法は、疾患症状を明確に示さない、高い危険にある個体にとって特に有利である。
【００１９】
CHDの危険にある患者、特に、I型およびII型の糖尿病の患者、腎不全の糖尿病患者、急性心血管事象後、例えば、心筋梗塞または脳卒中後の患者、進行性および重篤な動脈硬化の患者、末梢動脈疾患(PAD)、高コレステロール血症、高血圧、遺伝的体質(例えば、AMIおよび／または虚血性脳卒中の家族の病歴)、代謝症候群、肥満、前喫煙者ならびに従来の危険因子を伴わない他の無症候性患者は、フラミンガム（Framingham）、プロカム（Procam）に従って算出された危険値ならびに同等の危険値を有しうる。
【００２０】
基部炎症性マーカーの濃度は、sCD40Lの濃度が測定される前に測定できる。基部炎症性マーカーの測定はまた、sCD40Lの測定と同時に、または後に行うことも可能である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは炎症性マーカーである。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは抗炎症性マーカーである。
【００２３】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えてさらに少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、このさらなるマーカーは神経液性マーカーである。
【００２４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも二つのマーカーの濃度が測定される。一つのさらなるマーカーは、抗炎症性マーカーから選択され、他のさらなるマーカーは、神経液性マーカーから選択される。
【００２５】
本発明による特定のマーカーの組合せ、すなわち、sCD40Lおよび基部炎症性マーカーによって、個体の病態生理学的冠動脈状態の信頼できる分析が可能であることが見出された。
【００２６】
本発明による方法はそれ自体が、冠状動脈性事象の診断および予後、ならびに治療の層別化および処置管理のためのものとなる。
【００２７】
本発明の関係において「診断」とは、個体が、特定の冠状動脈性事象に罹患しているかを確かめることをいう。
【００２８】
本発明の関係において「予後」とは、個体が、特定の冠状動脈性事象に罹患するであろう予測可能性（％）をいう。
【００２９】
本発明の関係において「治療の層別化」とは、発症しうるまたは発症した冠状動脈性事象に対する適切な治療処置を評価することをいう。
【００３０】
本発明の関係において「処置管理」とは、個体の治療処置を制御および必要な場合には調整することをいう。
【００３１】
「治療処置」とは、個体の病態生理学的状態を変えることができる任意の処置を含み、例えば、医薬物の投与、および外科的処置(例えば、血行再建術、バルーン拡張術、ステント留置術)を含む。
【００３２】
本発明による組合せは、特定の心血管系事象または特定の冠状動脈性事象の危険性をそれぞれ予測するマーカーを使用し、各マーカー濃度の測定は、独立した結果を生じ、従って、それぞれの事象各々についての予測可能性は、他のマーカーの結果と独立している。
【００３３】
sCD40Lは、炎症性マーカー、特にhsCRPと組み合わせて用いることが有利でありうることが確立されている(WO 03／040692およびCirculation 2001；104:2266-2268を参照のこと)。しかし、本発明の発明者らが見出したsCD40Lと基部炎症性マーカーとの組合せが、有利な診断結果をもたらすということはまったく確立されていない。
【００３４】
本発明の関係において用いられる場合、「心血管系事象」とは、健康な個体には見出されない、「心血管系疾患」という一般用語にあてはまる特定の病態生理学的冠動脈状態を示す。当業者は、哺乳動物、特にヒトで発症しうる様々な心血管系事象を知っている。
【００３５】
本発明によるマーカーの組合せを用いて診断または予測することができる心血管系事象としては、以下のものが挙げられる：冠動脈疾患(CHD)；安定狭心症(SAP)；不安定狭心症(UAP)；急性冠症候群(ACS)；ST上昇および非ST上昇の両方の場合の急性心筋梗塞(AMI)；左心室機能不全(LVD)；うっ血性心不全(CHF)。
【００３６】
sCD40Lは特に、既に傷つきやすくなっているプラークが破綻し、結果として、左心室機能不全(LVD)、うっ血性心不全(CHF)および死をもたらしうる可逆的血管閉塞(UAP)または不可逆的血管閉塞(AMI)を生じる危険性の代表である血小板の活性化、血小板の凝集および血栓の生長に関連する。
【００３７】
当業者に特定の診断値を有することが知られているTnT（AMIについての実験室でのゴールドスタンダード）に加えて、sCD40Lが、危険性のある患者における冠状動脈性事象の診断および予測に最も重要なマーカーであることが、本発明者らにより認識された。しかし、TnTの予測値は、心臓組織の虚血性の損傷、例えば、心筋壊死を示すので、急性心血管事象に限定される。
【００３８】
sCD40Lは、炎症のマーカーであり（Aukrust, Circulation 1999；100: 604-620を参照のこと）、従って、冠状動脈性事象発症の危険性を示すと考えられている。以前に言及したWO 03／040691において、sCD40Lは、炎症の体系的なマーカーとして記載されている。しかし、WO 03／040691には、sCD40Lが、冠状動脈性事象の体系的なマーカーとしてみなされるだけではなく、動脈プラークの糜爛および破綻の結果として生じる、アテローム血栓性事象、すなわち、血小板の活性化の基部体系的マーカーでもありうることについてはまったく言及されていない。さらに、WO 03／040691においては、sCD40Lが、基部炎症性マーカーと組み合わせて有利に用いることができることについて言及も示唆もしていない。
【００３９】
基部炎症性マーカーは特に、個体に既に存在するプラークが、炎症を受け、プラーク破綻および血栓形成の可能性を増大させる危険性に関連する。
【００４０】
当業者に公知である炎症性マーカーとして、以下のものが挙げられる：
CRP、好ましくは、hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)；血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)；フォン・ウィルブランド因子(vWF)。
【００４１】
基部炎症性マーカーは、当業者に公知であり、非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼ A2(Lp-PLA2)；フォン・ウィルブランド因子(vWF)。
【００４２】
基部マーカーの群内において、後者は、マトリックスメタロプロテアーゼMMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12、PAPP-A、およびLp-PLA2から選ばれた場合が好ましい。
【００４３】
好ましい基部炎症性マーカーは、PAPP-A、MMP-9およびLp-PLA2である。
【００４４】
最も好ましい基部炎症性マーカーは、PAPP-AおよびLp-PLA2、特にPAPP-Aである。
【００４５】
基部炎症性マーカーは、上流、すなわち、疾患事象の病原箇所（ethiopathogenetic origin）の近傍またはその箇所に位置している巨大分子である。特に、これらの分子は、冠動脈病変部、好ましくは動脈プラークにて産生される。
【００４６】
基部炎症性マーカーに対して、反応性炎症性マーカーは、疾患事象の下流または、疾患事象に対して二次的に産生される。例えば、急性期タンパク質CRP(C-反応性タンパク質)は、根本病変部に由来するケモカインまたはインターロイキンに応答または反応して、遠位器官（すなわち、肝臓)によって産生される。
【００４７】
これらのいわゆる反応性炎症性マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)。
【００４８】
hsCRPは、急性冠症候群の危険性を層別化するのに、現在最も好ましい炎症性マーカーである。しかし、hsCRPは、基部炎症性マーカーと同じようには、その診断力および予測力を及ぼさない。
【００４９】
本発明に従って組み合わせて用いることができる抗炎症性マーカーには、IL-10がある。
【００５０】
本発明に従って組み合わせて用いることができる神経液性マーカーは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)；NT-プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロANP)；脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)；NT-プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-プロBNP)である。
【００５１】
好ましい神経液性マーカーはBNP、NT-プロBNPである。
【００５２】
最も好ましい神経液性マーカーは、NT-プロBNPである。
【００５３】
神経液性マーカーは、特に、既にMI(ST上昇または非ST上昇)を罹患している患者ならびにLVDおよびCHFを罹患する危険にある患者に関連する。
【００５４】
本発明によるマーカーの組合せと共に用いることができるさらなる炎症性マーカーは、前に述べた群、すなわち以下：CRP、好ましくはhsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；TF；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼ A2(Lp-PLA2)；vWF、から選択される。
【００５５】
さらなる炎症性マーカーは、用いた第一の(基部)炎症性マーカーとは異なるように選択される。
【００５６】
さらなる炎症性マーカーもまた、基部マーカー(好ましくは、Lp-PLA2)である場合が好ましい。；すなわち、マーカーの組合せであるPAPP-A／Lp-PLA2は、マーカーの組合せであるPAPP-A／hsCRPよりも好ましい。
【００５７】
本発明による基部炎症性マーカーとのsCD40Lの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40、PAPP-A；
sCD40L、Lp-PLA2；
sCD40L、MMP-9。
【００５８】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-Aである。
【００５９】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよびさらなる炎症性マーカーの好ましい組合せは、以下のとおりである：
sCD40L、PAPP-A、Lp-PLA2
sCD40L、PAPP-A、hsCRP
sCD40L、MMP-9、Lp-PLA2
sCD40L、MMP-9、hsCRP。
【００６０】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、Lp-PLA2である。
【００６１】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよび抗炎症性マーカーの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40L、PAPP-A、IL-10；
sCD40L、Lp-PLA2、IL-10；
sCD40L、MMP-9、IL-10。
【００６２】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、IL10である。
【００６３】
sCD40L、基部炎症性マーカーおよび神経液性マーカーの好ましい組合せは、以下のものである：
sCD40l、PAPP-A、NT-プロBNP；
sCD40L、Lp-PLA2、NT-プロBNP ；
sCD40L、MMP-9、NT-プロBNP。
【００６４】
最も好ましい組合せは、sCD40L、PAPP-A、NT-プロBNPである。
【００６５】
sCD40Lと炎症性マーカーとの組合せに加えて二つのマーカーを用いる場合、好ましいものとして上に示した組合せを用い、これらをその組合せと組合せ可能であるマーカーの群に由来する好ましいマーカーと組み合わせることが好ましい。
【００６６】
このような好ましい組合せの例としては、以下のものが挙げられる：
個体が、本発明による方法を用いて、将来的に冠状動脈性事象を罹患する危険性について分析された場合、あるいは個体が既に冠状動脈性事象に罹患している場合には、この個体は、1つまたは複数の特定の治療処置について層別化できる。これらは、抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体)、低分子、薬理学的に活性な化合物、すなわち、抗炎症性および脂質低下薬(例えば、スタチン)、血液凝固溶解剤(例えば、血小板アンタゴニスト)、繊維素溶解剤(例えば、ヘパリン)、血行再建治療(例えば、PCTI(経皮的治療処置)、バルーン拡張術、ステント留置術、バイパス外科手術)。
【００６７】
本発明による方法によって、上記レジメンによって処置される個体の治療処置管理を可能にする。
【００６８】
本発明の1つの実施形態において、冠状動脈性事象を罹患しているか、または罹患する危険にある個体は、血小板 糖タンパク質IIb／IIIa受容体のインヒビターまたはアンタゴニストを投与することによって処置される。このようなインヒビターの例としては、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、チロフィバン、エプチフィバチド（eptifibatide）などが挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、糖タンパク質IIb／IIIa受容体インヒビターは、抗体、特に、Abciximabの名前で知られる抗体である。Abciximabは、Centocor Europe BVよりReoProの商品名で入手することが可能であるFab抗体である。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態において、抗CD40Lモノクローナル抗体が、個体に投与され得る。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、抗炎症剤が、監視下にて個体に投与される。抗炎症剤は、非ステロイド抗炎症剤またはステロイド抗炎症剤でありうる。
【００７２】
非ステロイド抗炎症剤の例としては、アルクロフェナック（Alclofenac）；二プロピオン酸アルクロメタゾン（Alclometasone Dipropionate）；アルゲストン・アセトニド(Algestone Acetonide)；αアミラーゼ（Alpha Amylase）；アムシナファル（Amcinafal）；アムシナフィド(Amcinafide)；アンフェナクナトリウム（Amfenac Sodium）；塩酸アミプリロース（Amiprilose Hydrochloride）；アナキンラ（Anakinra）；アニロラック(Anirolac)；アニトラザフェン(Anitrazafen)；アパゾン（Apazone）；バルサラジド二ナトリウム（Balsalazide Disodium）；ベンダザック（Bendazac）；ベノキサプロフェン(Benoxaprofen)；塩酸ベンジダミン（Benzydamine Hydrochloride）；ブロメライン（Bromelains）；ブロペラモール(Broperamole)；ブデソニド(Budesonide)；カープロフェン(Carprofen)；シクロプロフェン(Cicloprofen)；シンタゾン(Cintazone)；クリプロフェン(Cliprofen)；プロピオン酸クロベタゾール（Clobetasol Propionate）；酪酸クロベタゾン（Clobetasone Butyrate）；クロピラク(Clopirac)；プロピオン酸クロチカゾン（Cloticasone Propionate）；酢酸コルメタゾン（Cormethasone Acetate）；コルトドキソン（Cortodoxone）；デフラザコート（Deflazacort）；デソニド(Desonide)；デソキシメタゾン（Desoximetasone）；二プロピオン酸デキサメタゾン（Dexamethasone Dipropionate）；ジクロフェナクカリウム（Diclofenac Potassium）；ジクロフェナクナトリウム（Diclofenac Sodium）；二酢酸ジフロラゾン（Diflorasone Diacetate）；ジフルミドンナトリウム(Diflumidone Sodium)；ジフルニサル(Diflunisal)；ジフルプレドネート(Difluprednate)；ジフタロン（Diftalone）；ジメチルスルホキシド（Dimethyl Sulfoxide）；ドロシノニド(Drocinonide)；エンドリソン(Endrysone)；エンリモマブ(Enlimomab)；エノリカムナトリウム（Enolicam Sodium）；エピリゾール（Epirizole）；エトドラク（Etodolac）；エトフェナメート（Etofenamate）；フェルビナク（Felbinac）；フェナモール(Fenamole)；フェンブフェン(Fenbufen)；フェンクロフェナク(Fenclofenac)；フェンクロラク（Fenclorac）；フェンドサール（Fendosal）；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザク（Fentiazac）；フラザロン（Flazalone）；フルアザコルト（Fluazacort）；フルフェナム酸（Flufenamic Acid）；フルミゾール（Flumizole）；酢酸フルニソリド（Flunisolide Acetate）；フルニキシン（Flunixin）；フルニキシンメグルミン（Flunixin Meglumine）；フルコルチンブチル(Fluocortin Butyl)；酢酸フルオロメソロン（Fluormetholone Acetate）；フルクァゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン（Flurbiprofen）；フルレトフェン（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカゾン（Fluticasone Propionate）；フラプロフェン（Furaprofen）；フロブフェン（Furobufen）；ハルシノニド（Halcinonide）；プロピオン酸ハロベタゾール（Halobetasol Propionate）；酢酸ハロプレドン（Halopredone Acetate）；イブフェナク（Ibufenac）；イブプロフェン（Ibuprofen）；イブプロフェンアルミニウム(Ibuprofen Aluminium)；イブプロフェンピコナール(Ibuprofen Piconol)；イロニダプ（Ilonidap）；インドメタシン(Indomethacin)；インドメタシンナトリウム(Indomethacin Sodium)；インドプロフェン(Indoprofen)；インドキソール（Indoxole）；イントラゾール（Intrazole）；酢酸イソフルプレドン（Isoflupredone Acetate）；イソキセパク（Isoxepac）；イソキシカ（Isoxicam）；ケトプロフェン(Ketoprofen)；塩酸ロフェミゾール（Lofemizole Hydrochloride）；ロルノキシカム（Lornoxicam）；ロテプレドノールエタボネート(Loteprednol Etabonate)；メクロフェナメートナトリウム(Meclofenamate Sodium)；メクロフェナム酸（Meclofenamic Acid）；メクロリンジブチラート(Meclorisone Dibutyrate)；メフェナム酸（Mefenamic Acid）；メサラミン（Mesalamine）；メセクラゾン(Meseclazone)；メチルプレドニソロンスレプタネート(Methylprednisolone Suleptanate)；モルニフルマート（Morniflumate）；ナブメトン（Nabumetone）；ナプロキセン（Naproxen）；ナプロキセンナトリウム(Naproxen Sodium)；ナプロキソール（Naproxol）；ニマゾン(Nimazone)；オルサラジンナトリウム(Olsalazine Sodium)；オルゴテイン(Orgotein)；オルパノキシン（Orpanoxin）；オキサプロジン（Oxaprozin）；オキシフェンブタゾン（Oxyphenbutazone）；塩酸パラニリン（Paranyline Hydrochloride）；ペントサン・ポリサルフェート・ナトリウム(Pentosan Polysulfate Sodium)；フェンブタゾン・ナトリウム・グリセラート(Phenbutazone Sodium Glycerate)；ピルフェニドン(Pirfenidone)；ピロキシカム(Piroxicam)；ピロキシカムシンナマート（Piroxicam Cinnamate）；ピロキシカムオラミン(Piroxicam Olamine)；ピルプロフェン（Pirprofen）；プレドナゼート(Prednazate)；プリフェロン（Prifelone）；プロドール酸（Prodolic Acid）；プロクァゾン（Proquazone）；プロキサゾール（Proxazole）；クエン酸プロキサゾール（Proxazole Citrate）；リメキソロン(Rimexolone)；ロマザリット（Romazarit）；サルコレクス（Salcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート（Salsalate）；サリシレート(Salycilates)；塩化サングイナリウム（Sanguinarium Chloride）；セクラゾン（Seclazone）；セルメタシン(Sermetacin)；スドキシカム（Sudoxicam）；スリンダク（Sulindac）；スプロフェン（Suprofen）；タルメタシン（Talmetacin）；タルニフルマート（Talniflumate）；タロサラート（Talosalate）；テブフェロン（Tebufelone）；テニダプ（Tenidap）；テニダプナトリウム(Tenidap Soidum)；テノキシカム（Tenoxicam）；テシカム（Tesicam）；テシミド(Tesimide)；テトライダミン(Tetrydamine)；チオピナック(Tiopinac)；ピバリン酸チクソコルトール(Tixocortol Pivalate)；トルメチン(Tolmetin)；トルメチンナトリウム(Tolmetin Sodium)；トリクロニド(Triclonide)；トリフルミデート(Triflumidate)；ジドメタシン(Zidometacin)；グルココルチコイド(Glucocorticoid)；ゾメピラック・ナトリウム(Zomepirac Sodium)が挙げられる。
【００７３】
ステロイド抗炎症剤の例としては、グルココルチコイド(Glucocorticoid)、例えば、デキサメタゾン、および当業者に公知であるその他の薬剤が挙げられる。
【００７４】
監視下にて個体に投与することができるさらなる化合物クラスおよび化合物は：ヘパリン（Heparin)および誘導体；マルクマル（Marcumar）；rTpA：組換え組織プラスミノゲンアクチベーター、トロンビン受容体アンタゴニスト様アスピリンおよびクロピドグレル；インスリン感受性増強物質(グリタゾン)；カルシウムチャネル阻害剤；ACEインヒビター、である。
【００７５】
監視下にて個体に投与することができるさらなる化合物クラスは、スタチンである。
【００７６】
試験下にて個体の体液中のそれぞれのマーカーの濃度を測定するために用いることができる方法は、当業者に知られている。これらの方法は、マイクロプレートELISA系方法、完全自動化免疫アッセイ(例えば、cTnTを試験するためのElecsys（商標）分析器で利用可能)、CBA(酵素コバルト結合アッセイ（Cobalt Binding Assay）、例えば、IMAを試験するためのRoche-Hitachi（商標）分析器で利用可能)；ラテックス凝集アッセイ(例えば、hsCRPを試験するためのRoche-Hitachi（登録商標）分析器で利用可能)を含む。
【００７７】
以下、当業者に公知である方法を概観する。
【００７８】
ペプチドおよびポリペプチド（タンパク質）は、組織、細胞、および体液のサンプル内にて、すなわち好ましくはin vitro にて測定できる。体液中のマーカー（タンパク質）を測定することが好ましい。
【００７９】
本発明による体液は特に、全血、血液血清、血液血漿、リンパ液、大脳液（cerebral liquor）、唾液、および尿を含む。本発明の関連における測定のために、全血、血液血清または血漿を用いることが好ましい。
【００８０】
本発明による組織サンプルとは、死亡したもしくは生きているヒト、または動物の体から得られた任意の種類の組織をいう。組織サンプルは、当業者に公知である任意の方法、例えば、生検または掻爬によって得ることができる。
【００８１】
細胞試料を得るための方法は、単一の細胞または小細胞群を直接的に調製する方法、例えば、トリプシンを用いて組織を解離する方法、および、例えば、濾過または遠心分離によって体液から細胞を分離する方法を含む。本発明による細胞はまた、血小板および他の非核細胞、例えば、赤血球を含む。
【００８２】
必要であるならば、試料はさらに処理してもよい。特に、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを、濾過、遠心分離、または例えば、クロロホルム／フェノール抽出のような抽出方法を含む、当該分野で公知の方法に従って、試料から精製しても良い。
【００８３】
当業者は、試料中のペプチドまたはポリペプチド(マーカー)の濃度（体積に対する重量）を決定（測定）するための様々な方法を良く知っている。測定は、細胞の応答、結合リガンドの量、標識、または酵素による反応生成物を測定することによって、間接的に行うことができる。
【００８４】
細胞応答を測定するために、試料または処理した試料を細胞培養物に加え、そして内部または外部の細胞応答を測定する。細胞応答としては、受容体遺伝子の発現または基質、例えば、ペプチド、ポリペプチド、または低分子の分泌を挙げることができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、目的（マーカー）のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドの濃度を測定する。本発明による結合には、共有結合および非共有結合の両方を含む。
【００８６】
本発明によるリガンドは、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合する任意のペプチド、ポリペプチド、核酸または他の物質でありうる。ペプチドまたはポリペプチドは、ヒトまたは動物体から得たか、または精製された場合に、例えば、グリコシル化によって改変できることが周知である。本発明による適切なリガンドは、ペプチドまたはポリペプチドに、また、そのような部位を介して結合することができる。
【００８７】
好ましくは、リガンドは、測定されるべきマーカーに特異的に結合すべきである。本発明による「特異的結合」とは、リガンドが、調べられる試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（交叉反応）しない。好ましくは、特異的に結合されるタンパク質またはイソフォームは、任意の他の関連のあるペプチドまたはポリペプチドよりも、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも50倍、高い親和性により結合されるべきである。
【００８８】
調べられるペプチドまたはポリペプチドが、ウエスタンブロットにおけるその大きさによって、または試料中に比較的豊富に存在することによって、明確に区別かつ測定することができる場合には、非特異的結合であってもよい。
【００８９】
リガンドの結合は、当該分野にて公知である任意の方法によって測定できる。好ましくは、この方法は、半定量的または定量的である。好適な方法は、以下に記載される。
【００９０】
第一に、リガンドの結合は、例えば、NMRまたは表面プラズモン共鳴によって直接的に測定できる。
【００９１】
第二に、リガンドがまた、目的のペプチドまたはポリペプチドの酵素活性の基質として作用する場合に、酵素による反応生成物を測定できる(例えば、プロテアーゼの量は、切断された基質の量を、例えば、ウエスタンブロットで測定することによって測定できる)。
【００９２】
酵素による反応生成物の測定のために、基質の量は飽和するのが好ましい。基質はまた、反応の前に、検出可能な標識で標識することができる。好ましくは、試料を、適当な期間、基質と接触させる。適当な期間とは、生成されるべき生成物を検出できる、好ましくは、測定できるのに必要な時間をいう。生成物の量を測定する代わりに、一定（例えば、検出可能である）量の生成物の出現に必要な時間を測定することができる。
【００９３】
第三に、リガンドは、リガンドの検出および測定を可能にする標識と共有的にまたは非共有的に結合できる。
【００９４】
標識付けは、直接的または間接的な方法によって行うことができる。直接的な標識付けには、リガンドに対する標識の直接的な（共有的または非共有的）結合を含む。間接的な標識付けには、第一のリガンドに対する第二のリガンドの（共有的または非共有的）結合を含む。第二のリガンドは、第一のリガンドに特異的に結合すべきである。この第二のリガンドは、好適な標識と結合され、および／またはこの第二のリガンドに結合する第三のリガンドの標的（受容体）であってもよい。第二、第三またはさらに高次のリガンドの使用は、シグナルを増加させるために頻繁に用いられている。好適な第二およびそれ以上の高次のリガンドは、抗体、二次抗体、および周知であるストレプトアビジン-ビオチン系(Vector Laboratories, Inc.)を含みうる。
【００９５】
リガンドまたは基質はまた、当該分野にて公知であるような一つもしくは複数個のタグ を用いて「タグ付け」することができる。そして、このようなタグは、より高次のリガンドの標的でありうる。好適なタグとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ヒス-タグ、グルタチオン-S-トラスフェラーゼ、FLAG、GFP、mycタグなどが挙げられる。ペプチドまたはポリペプチドの場合には、タグは好ましくは、N末端および／またはC末端にある。
【００９６】
好適な標識は、適切な検出方法によって検出することが可能である任意の標識である。典型的な標識としては、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁性標識（「例えば、磁性ビーズ」、半磁性標識および超磁性標識を含む）、および蛍光標識が挙げられる。
【００９７】
酵素的に活性な標識としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの誘導体が挙げられる。検出に好適な基質としては、ジ-アミノ-ベンジジン(DAB)、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP(4-塩化ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート、既製の保存溶液としてRoche Diagnosticsより入手可能)、CDP-Star（登録商標）(Amersham Biosciences)、ECF（登録商標）(Amersham Biosciences)が挙げられる。好適な酵素-基質の組合せによって、当該分野で公知である方法(例えば、感光フィルムもしくは好適なカメラ系)を用いて測定できる有色反応生成物、蛍光または化学発光を生じることができる。酵素による反応を測定する場合には、上記の所定の基準を同様に適用する。
【００９８】
典型的な蛍光標識としては、蛍光タンパク質(例えば、GFPおよびその誘導体)、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、およびアレクサ色素(例えば、アレクサ568)が挙げられる。さらなる蛍光標識は、例えば、Molcular Probes(Oregon)より入手可能である。
【００９９】
典型的な放射性標識としては、35S、125I、32P、33Pなどが挙げられる。放射性標識は、公知でありかつ適切な任意の方法、例えば、感光フィルムまたは発光映像器によって検出することができる。
【０１００】
本発明による好適な測定方法にはまた、電気化学発光（電気発生化学発光）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、比濁分析、ネフェロ分析、ラッテクス増強比濁分析もしくはネフェロ分析、または固相免疫試験を含む。
【０１０１】
好ましいリガンドとしては、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド、およびアプタマー、例えば、核酸アプタマーもしくはペプチドアプタマーが挙げられる。このようなリガンドの方法は、当該分野において周知である。例えば、好適な抗体またはアプタマーの同定および製造はまた、販売業者から提供される。当業者は、高い親和性または特異性を有するこのようなリガンドの誘導体を造るための方法を良く知っている。例えば、ランダム変異を、核酸、ペプチドまたはポリペプチドに導入することができる。次に、これらの誘導体を、当該分野で公知であるスクリーニング手順（例えば、ファージ・ディスプレイ）に従って、結合について試験できる。
【０１０２】
本明細書中にて用いられる場合に用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにFv、FabおよびF(ab)2断片のような抗原またはハプテンに結合することができるそれらの断片を含む。本発明はまた、「ヒト化」ハイブリッド抗体を含み、その中で所望される抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列は、ヒト受容体抗体の配列と組み合わせられる。このドナー配列は一般に、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むが、他の構造的および／または機能的に関連のあるドナー抗体のアミノ酸残基も含む。このようなハイブリッドは、当該分野において周知である複数の方法によって調製できる。
【０１０３】
特定の目的のペプチドまたはポリペプチドの測定のためのリガンドまたは試薬の例としては、以下が挙げられる：
sCD40L
ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany またはBenderMedSystems, Vienna, Austria, およびAlexis Biochemicals)；FITCタグ抗体およびFLAGタグ抗体を含む抗体はまた、Alexis(Gruenberg, Germany), Ancell,およびImmunotech(Hamburg, Germany)から入手可能である；Abbott Pharmaceuticals, Abbott Park, Illinoisに由来する抗原；CD40受容体。
【０１０４】
NT-プロBNP:
電気化学発光技術(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany製のElecsys 2010 およびE170)に基づく１ステップの免疫アッセイが利用可である。
【０１０５】
PAPP-A:
PAPP-Aは、手動または半自動化ELISAマイクロプレートによって測定することができ、また例えば、IBL(Hamburg, Germany)またはDSL(Webster, TX, USA)から入手可能である。
【０１０６】
IL-10:
手動ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany)
MMP-9:
手動ELISA(例えば、R&D Systems, Wiesbaden, Germany)
Lp-PLA2:
手動ELISA(例えば、diaDexus, USA)
別の好ましい実施形態において、好ましくは、核酸、ペプチド、ポリペプチドからなる群、より好ましくは、核酸、抗体、またはアプタマーの群からなるリガンドが、アレイ上に存在する。
このアレイは、少なくとも一つのさらなるリガンドを含み、このリガンドは、目的のペプチド、ポリペプチドまたは核酸に対して指向されうる。このさらなるリガンドはまた、本発明の関連において特定の目的ではないペプチド、ポリペプチドまたは核酸に対して指向されうる。好ましくは、本発明の関連において、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも８つの目的のペプチドまたはポリペプチドのリガンドが、アレイに収容される。
【０１０７】
本発明によると、用語「アレイ」とは、固相またはゲル様担体をいい、この上に少なくとも二つの複合体が、１次元、２次元、３次元の配置で付着または結合されている。このようなアレイ（「遺伝子チップ」、「タンパク質チップ」、抗体アレイなどを含む）は、一般に当業者に公知であり、また典型的に顕微鏡用スライドガラス、特に、ポリカチオン、ニトロセルロース、またはビオチンでコートされたスライドのようなコートされたスライドガラス、カバーガラス、およびメンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン系のメンブレン）上に作製される。
【０１０８】
上記のアレイには、結合リガンドまたは少なくとも一つのリガンドを発現している少なくとも二つの細胞を含みうる。
【０１０９】
このようなアレイ、例えば、固相化学および光に不安定な保護基に基づくアレイを作製する方法は、一般に公知である(US 5,744,305)。このようなアレイはまた、基質または基質ライブラリーとの接触をもたらし、そして相互作用、例えば、結合または構造変化について試験できる。従って、上記に規定されるペプチドまたはポリペプチドを含むアレイは、このペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドを同定するために用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が冠状動脈性事象に罹患しているのかという診断、または冠状動脈性事象を罹患する危険にある個体の予後を確立するための方法であって、該方法は、
該個体の体液中のsCD40Lおよび基部炎症性マーカーの濃度を測定する工程；
得られた値と基準値とを比較する工程；および
該冠状動脈性事象に関する診断または予後を確立する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-A、細胞間接着分子、ICAM-1、VCAM-1、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；MPO；TF；MCP-1；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ；Lp-PLA2；フォン・ウィルブランド因子(vWF)から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基部炎症性マーカーが、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12、Lp-PLA2、およびPAPP-Aから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-A、MMP-9およびLp-PLA2から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-Aである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組合せが、以下：sCD40L、PAPP-A；sCD40L、Lp-PLA2；sCD40L、MMP-9から選択される請求項1〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
CD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、抗炎症性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗炎症性マーカーが、IL-10である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、神経液性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記神経液性マーカーが、ANP；NT-プロANP；BNP；NT-プロBNPから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経液性マーカーが、NT-プロBNPである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、第一の炎症性マーカーとは異なるさらなる炎症性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる炎症性マーカーが、CRP、hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1, VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；凝血組織因子(TF)；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9, -10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)；vWFから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記さらなる炎症性マーカーが、基部炎症性マーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる炎症性マーカーが、PAPP-A、Lp-PLA2またはMMP-9である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも二つのマーカーの濃度が測定され、一つのさらなるマーカーは、抗炎症性マーカーから選択され、他のマーカーは、神経液性マーカーから選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記個体が、急性冠症候群(ACS)、胸痛もしくは息切れを示す個体、または冠動脈疾患に関連するいずれの症状も示さない個体である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記個体が、冠動脈疾患に関連するいずれの症状も示さない個体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ACSが、冠動脈疾患(CHD)；安定狭心症(SAP)；不安定狭心症(UAP)；急性冠症候群(ACS)；ST-上昇と非ST-上昇との両方の場合の急性心筋梗塞(AMI)；左心室機能不全(LVD)；うっ血性心不全(CHF)から選択される１つまたは複数の事象である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記CHDの危険性が、フラミンガム（Framingham）、プロカム（Procam）、I型およびII型の糖尿病の患者、腎不全の糖尿病患者、急性心血管事象後、心筋梗塞または脳卒中後の患者、進行性および重篤な動脈硬化の患者、末梢動脈疾患(PAD)、高コレステロール血症、高血圧、遺伝的体質（AMIまたは脳卒中の家族の病歴）、代謝症候群、肥満、前喫煙者、ならびに従来の危険因子を伴わない他の無症候性患者に従った危険度スコアを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記診断または予後が、治療の層別化または治療管理に用いられる、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
治療管理が、抗体、低分子、および薬理学的に活性なタンパク質から選択される薬学的に活性な物質を前記個体に投与した後に確立される、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
個体が冠状動脈性事象に罹患しているのかという診断、または冠状動脈性事象を罹患する危険にある個体の予後を確立するための方法であって、該方法は、
該個体の体液中のsCD40Lおよび基部炎症性マーカーの濃度を測定する工程；
得られた値と基準値とを比較する工程；および
該冠状動脈性事象に関する診断または予後を確立する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-A、細胞間接着分子、ICAM-1、VCAM-1、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；MPO；TF；MCP-1；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ；Lp-PLA2；フォン・ウィルブランド因子(vWF)から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基部炎症性マーカーが、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12、Lp-PLA2、およびPAPP-Aから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-A、MMP-9およびLp-PLA2から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基部炎症性マーカーが、PAPP-Aである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組合せが、以下：sCD40L、PAPP-A；sCD40L、Lp-PLA2；sCD40L、MMP-9から選択される請求項1〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
CD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、抗炎症性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗炎症性マーカーが、IL-10である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、神経液性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記神経液性マーカーが、ANP；NT-プロANP；BNP；NT-プロBNPから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経液性マーカーが、NT-プロBNPである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも一つのマーカーの濃度が測定され、該さらに加えたマーカーは、第一の炎症性マーカーとは異なるさらなる炎症性マーカーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる炎症性マーカーが、CRP、hsCRP、フィブリノゲン、血清アミロイドA(SAA)、妊娠関連ポリペプチドA(PAPP-A)、細胞間接着分子(例えば、ICAM-1, VCAM-1)、IL-1-β、IL-6、IL-18／IL-18b；TNF-α；ミエロペルオキシダーゼ(MPO)；凝血組織因子(TF)；単球走化性タンパク質1(MCP-1)；P-セレクチン；E-セレクチン；マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP、例えば、MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9, -10、-11、-12)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAF-AH)；リポタンパク関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)；vWFから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記さらなる炎症性マーカーが、基部炎症性マーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる炎症性マーカーが、PAPP-A、Lp-PLA2またはMMP-9である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
sCD40Lおよび基部炎症性マーカーに加えて少なくとも二つのマーカーの濃度が測定され、一つのさらなるマーカーは、抗炎症性マーカーから選択され、他のマーカーは、神経液性マーカーから選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記個体が、急性冠症候群(ACS)、胸痛もしくは息切れを示す個体、または冠動脈疾患に関連するいずれの症状も示さない個体である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記個体が、冠動脈疾患に関連するいずれの症状も示さない個体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ACSが、冠動脈疾患(CHD)；安定狭心症(SAP)；不安定狭心症(UAP)；急性冠症候群(ACS)；ST-上昇と非ST-上昇との両方の場合の急性心筋梗塞(AMI)；左心室機能不全(LVD)；うっ血性心不全(CHF)から選択される１つまたは複数の事象である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記CHDの危険性が、フラミンガム（Framingham）、プロカム（Procam）、I型およびII型の糖尿病の患者、腎不全の糖尿病患者、急性心血管事象後、心筋梗塞または脳卒中後の患者、進行性および重篤な動脈硬化の患者、末梢動脈疾患(PAD)、高コレステロール血症、高血圧、遺伝的体質（AMIまたは脳卒中の家族の病歴）、代謝症候群、肥満、前喫煙者、ならびに従来の危険因子を伴わない他の無症候性患者に従った危険度スコアを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記診断または予後が、治療の層別化または治療管理に用いられる、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
治療管理が、抗体、低分子、および薬理学的に活性なタンパク質から選択される薬学的に活性な物質を前記個体に投与した後に確立される、請求項２１に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５１０８９２（Ｐ２００７−５１０８９２Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３７２６１（Ｐ２００６−５３７２６１）
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１２５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４５４４０
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１２５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４５４４０
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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