凝固活性測定装置、測定チップおよび測定方法
【課題】凝固反応の活性を少量の血漿サンプルで測定する。
【解決手段】凝固活性測定装置は、溶液が流れる流路を備えた測定チップ１００の流路の表面における屈折率を測定する表面プラズモン共鳴測定装置を備える。表面プラズモン共鳴測定装置は、プリズム１と、光源２と、偏光板３と、集光レンズ４と、ＣＣＤカメラ５と、データ処理装置６とから構成される。さらに、データ処理装置６は、測定チップ１００の流路中に凝固活性化剤が充填された後に流路中に血漿が投入されたときの屈折率の変化から流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出部と、血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、流速算出部が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出部とを備える。
【解決手段】凝固活性測定装置は、溶液が流れる流路を備えた測定チップ１００の流路の表面における屈折率を測定する表面プラズモン共鳴測定装置を備える。表面プラズモン共鳴測定装置は、プリズム１と、光源２と、偏光板３と、集光レンズ４と、ＣＣＤカメラ５と、データ処理装置６とから構成される。さらに、データ処理装置６は、測定チップ１００の流路中に凝固活性化剤が充填された後に流路中に血漿が投入されたときの屈折率の変化から流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出部と、血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、流速算出部が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出部とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的な指標である凝固活性を測定する凝固活性測定装置、凝固活性測定方法、および凝固活性測定装置で用いる測定チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
凝固活性は、臨床検査の重要な項目である。その一つの凝固活性指標であるプロトロンビン時間（血液凝固時間：ＰＴ）は、外因系の凝固因子への感度が高いと考えられており、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや、肝機能の異常、さらに経口の抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる指標である。
【０００３】
従来、血液凝固時間の測定には、かくはん抵抗方式、光散乱方式、熱伝導方式、水晶振動子方式などの方法が発明されているが、一般にかくはん抵抗方式と光散乱方式が多く用いられている（非特許文献１参照）。かくはん抵抗方式は、サンプルを活性化剤と一緒に導入してフィンでかくはんし、かくはんの抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。
【０００４】
光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、その散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「自動分析装置による血液凝固時間測定 −ＡＣＬ ＴＯＰシリーズ、ＳＴＡＣＩＡ−」，生物試料分析，生物試料分析科学会，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ５，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように散乱光から血液凝固時間を求めるために多数の方法が検討されている背景として、本質的に血管や皮膚を構成する細胞との接触界面にて起こる表面反応である凝固反応を、試験用容器内での活性化剤と混合した血漿のバルクの液体内で起こる凝固反応で置き換えて解釈している問題があると考えられる。加えて、血液凝固指標は、被験者の状態を表す有用な指標でありながら、その反応経路については、現在でも完全には解明されていない。そのため、医療現場の臨床検査では、血液凝固反応と実際の検査での反応の違いを担当者が経験的に理解しながら臨床医に説明する努力が行われており、さらには、臨床検査の教科書にも記載されていない珍しい疾患については、検査担当者の個人的な力量によって判明できているという現状がある。
【０００７】
一方、学術的には、血液凝固の表面反応は、テンショメトリーと呼ばれる、量りを用いた方法でモニタリングされている。しかし、この方法では大量の血液サンプルが要求され、また自動化も困難であることから、診療現場での測定法としての適用はされていない。
【０００８】
以上のように、従来のかくはん抵抗方式や光散乱方式などの測定方法では、血液凝固の表面反応を測定することができないために血液凝固時間の測定精度が低く、一方、量りを用いて凝固反応をモニタリングする方法では、大量の血液サンプルを必要とするために診療現場での測定に適していないという問題点があった。
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたもので、本質的に表面反応である凝固反応の活性を少量の血漿サンプルで測定することができる凝固活性測定装置、測定チップおよび測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の凝固活性測定装置は、溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出手段とを備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定装置の１構成例は、さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出手段を備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定装置の１構成例において、前記屈折率測定装置は、表面プラズモン共鳴測定装置であることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明は、凝固活性化剤が充填された流路の表面における屈折率に基づいて流路中を進行する血漿の流速を算出し凝固活性を算出する凝固活性測定装置用の測定チップであって、基板表面に形成された金薄膜と、この金薄膜上に形成された流路とを備え、前記金薄膜は、その一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていることを特徴とするものである。
また、本発明の測定チップの１構成例は、前記金薄膜上の前記流路の位置に、流路方向に沿って前記生化学測定用ブロッキング剤のスポットが複数形成されていることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明の凝固活性測定方法は、溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定ステップと、前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出ステップとを備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定方法の１構成例は、さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出ステップを備えることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に流路中に血漿が投入されたときの屈折率の変化から流路中を進行する血漿の流速を算出し、この流速から凝固活性値を算出することにより、本質的に表面反応である凝固反応の活性を少量の血漿サンプルで測定することができ、凝固反応の測定精度を向上させることができる。
【００１４】
また、本発明では、測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを導出することにより、凝固活性以外に、血漿の基板上への凝固の様子と最終的な凝固形態とを表すデータを求めることができ、凝固形態を簡便に観測することができる。
【００１５】
また、本発明では、測定チップの基板表面に形成された金薄膜の一部を、凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤で覆うことにより、凝固活性を物理的かつ生化学的に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の原理を説明する断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る測定チップの平面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
【図５】凝固活性測定装置において測定チップの測定で得られる入射角−反射率曲線の１例を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置のデータ処理装置の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る凝固活性の測定方法の処理の流れを示すフローチャートである。
【図８】本発明の実施の形態においてＣＣＤカメラが撮影した画像と血漿の進行方向との関係を示す図である。
【図９】本発明の実施の形態においてＣＣＤカメラが撮影した画像の１ラインにおける光強度プロファイルの例を示す図である。
【図１０】本発明の実施の形態における血漿の流速の算出方法を説明する図である。
【図１１】血漿の流速と凝固活性値との関係の１例を示す図である。
【図１２】測定チップに正常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを示す図である。
【図１３】測定チップに異常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［発明の原理］
本発明は、プロトロンビン時間（血液凝固時間）に相当する指標である凝固活性を、測定対象が進行する平面流路の表面における屈折率測定に基づいた流速測定から求めるものである。
流路表面の屈折率を測定できる屈折率測定装置としては、例えば、測定対象の流路の反対側から光を入射させる全反射光学系と、２次元領域を一度にあるいは走査しながらモニタする光学系とを有し、かつ測定対象物により大きく吸収されない光波長に対応していればよい。したがって、屈折率測定装置として、２次元に対応した表面プラズモン共鳴測定装置を用いる。
【００１８】
このように基板の表面反応を効率よく測定できる表面プラズモン共鳴測定装置と、少量の血漿サンプルから凝固反応をモニタできるように流路を形成した測定チップとを用いる。凝固活性を測定するためには、測定対象物が血液由来の血漿であることから、使い捨ての測定チップを用意することが衛生的で望ましい。
【００１９】
キャピラリーフロー型の測定チップの流路部分にあらかじめ凝固活性を測定するための凝固活性化剤を満たしておき、凝固活性化剤の中に測定対象の血漿を少量投入すると、投入された血漿は流路中の活性化剤の中を進行しながら、血漿そのものの凝固機能が活性化され、凝固しながら流路内を進行していくという現象が起こる。測定チップの流路内に、適正温度に設定した凝固活性化剤を導入し、さらに測定対象の血漿を凝固活性化剤導入量の例えば１／１０量投入して、測定チップの基板表面での凝固反応をリアルタイムで観測する。
【００２０】
屈折率測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置を利用する場合には、測定チップの基板表面を金薄膜とする必要がある。本発明では、この金薄膜の表面を生化学測定用ブロッキング剤によりブロッキングする。これにより、金属による凝固活性を抑えることができる。
また、ブロッキング剤として凝固活性に影響する因子を含むものを使い、さらに流路方向に沿ってブロッキング剤をアレイ状にスポットとして形成して配置することにより、物理的かつ生化学的に凝固活性を制御しながら、血漿サンプルの凝固機能をより詳細に観測することができる。
【００２１】
図１（Ａ）〜図１（Ｃ）は本発明の原理を説明する断面図であり、凝固活性化剤で満たされた測定チップの流路内を進行する血漿と血漿の凝固とを示す図である。
測定チップの基板１０００上に形成された流路１００１の中に満たされた凝固活性化剤１００２の中を、投入された血漿１００３が進行すると、進行しながら凝固反応が始まる（図１（Ａ）、図１（Ｂ））。そして、血漿１００３が凝固したところで血漿１００３の進行が停止する（図１（Ｃ））。
【００２２】
凝固活性の高い血漿では、凝固活性化剤との接触により凝固が始まり、血漿そのものの進行速度も、早い時刻から減少しやすい。したがって、凝固活性の高い血漿の場合には、血漿の進行速度である流速、および測定チップ内の進行距離ともに小さくなる。一方、凝固活性の低い血漿の場合には、血漿の進行速度が維持されやすいことから、流速は大きく、かつ測定チップ内の進行距離も長くなる。本発明では、血漿の進行速度である流速を求めて、現在一般的に求められている血液凝固時間と相関のある指標である凝固活性を求める。また、本発明では、血漿の進行距離および凝固の停止様式も並行して観測することができ、試験サンプルである血漿の従来と異なる凝固因子パラメータを提供することができる。
【００２３】
［実施の形態］
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図２は本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図、図３は測定チップの平面図、図４は本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
本実施の形態の測定チップ１００は、略直方体状の外形をなし積層構造を有している。すなわち、水平方向の大きさが１６ｍｍ×１６ｍｍで厚さが１ｍｍのＢＫ７ガラスあるいはプラスチックからなる矩形板状の透明の基板１０１と、平面視の外形が基板１０１と略同一に形成され、基板１０１上に積層される例えば樹脂からなる両面シール状のシート１０２と、平面視の外形が基板１０１と略同一に形成され、シート１０２上に積層されるアクリル筺体１０３とを備えている。
【００２４】
基板１０１上には、スパッタリングによって厚さ約５０ｎｍの金薄膜１０４が形成される。さらに、金薄膜１０４の表面の一部に牛乳由来、魚由来、または化学合成由来の生化学測定用のブロッキング剤１０５を形成して、金薄膜１０４の表面を覆う。本実施の形態の測定チップ１００では、タンパク質から構成されるブロッキング剤１０５のスポットを３５０μｍ間隔で形成した。このブロッキング剤１０５のスポットは、基板１０１上にシート１０２が積層されたときに、後述する観測領域に位置するように形成されている。ブロッキング剤１０５のスポットは、凝固反応の化学的障害となるほか、物理的障害としても機能する。タンパク質を含むブロッキング剤はスポットの形成が容易であるため、好適である。
【００２５】
金薄膜１０４の表面にブロッキング剤１０５のスポットを形成した後に、基板１０１を水で洗浄して、基板１０１の金薄膜１０４の上にシート１０２を積層する。シート１０２の後述するインレットに対応する位置には、円孔１０６が形成されている。また、シート１０２には、シート１０２を板厚方向（図２上下方向）に貫通し、円孔１０６に連通する流路１０７と、シート１０２を板厚方向に貫通し、流路１０７に連通する流路１０８と、シート１０２を板厚方向に貫通し、流路１０８に連通する吸引流路１０９とが形成されている。流路１０７が形成されている領域が、観測領域である。
【００２６】
このようにシート１０２に形成される流路１０７〜１０９は、円孔１０６から測定チップ中央部の流路１０７へ繋がり、さらに流路１０８を経て測定チップ周辺部の吸引流路１０９へと繋がる形状となっている。流路１０７，１０８の断面寸法は、測定対象の血漿に対して毛細管現象を発現する寸法に設定されている。また、シート１０２および流路１０７〜１０９は、流路１０７〜１０９中に凝固活性化剤が充填された後に流路１０７〜１０９中に留まるような材質、流路の高さ、流路の幅、流路の表面状態であることが好ましい。
【００２７】
このようなシート１０２の上にアクリル筺体１０３を積層する。アクリル筺体１０３には、凝固活性化剤および測定対象の血漿を投入するための円孔であるインレット１１０がアクリル筺体１０３を板厚方向に貫通するように形成されている。このインレット１１０は、アクリル筺体１０３がシート１０２上に積層されたときに、上端が外気に開放されると共に下端が円孔１０６と連通する位置に形成されている。
【００２８】
また、アクリル筺体１０３には、多数の貫通孔１１１がアクリル筺体１０３を板厚方向に貫通するように形成されている。これら多数の貫通孔１１１は、アクリル筺体１０３がシート１０２上に積層されたときに、上端が外気に開放されると共に下端が流路１０８または吸引流路１０９と連通する位置に形成されており、観測領域である流路１０７の部分には形成されていない。貫通孔１１１の直径は、測定対象の血漿に対して毛細管現象を発現する値、例えば約１００ミクロンに設定されている。こうして、基板１０１とシート１０２とアクリル筺体１０３とを組み合わせることで、毛細管現象によって血漿の導入を行うキャピラリーフロー型の流路を有する測定チップ１００が完成する。
【００２９】
凝固活性測定装置は、図４に示すように、プリズム１と、ＬＥＤなどの光源２と、偏光板３と、集光レンズ４と、ＣＣＤカメラ５と、データ処理装置６とを有する。本実施の形態では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して凝固活性測定装置を実現しており、図４に示した構成は表面プラズモン共鳴測定装置と同様である。
【００３０】
ここで、表面プラズモン共鳴測定装置の測定原理について簡単に説明する。単色光の光源２から放射された光が偏光板３を通過すると、ｐ偏光光のみが通過する。このｐ偏光光は、集光レンズ４で集光されて半球状のプリズム１に入射する。プリズム１の上面には、基板１０１がプリズム１と接するように測定チップ１００が載置され、基板１０１側から測定チップ１００にｐ偏光光が入射する。このように、ｐ偏光光をプリズム１を介して測定チップ１００に入射させることによって、測定チップ１００からの反射光の強度変化をＣＣＤカメラ５で検出する。
【００３１】
光源２から放射された光は、プリズム１と測定チップ１００の金薄膜１０４との境界でエバネッセント波となる。一方、この金薄膜１０４の表面では、表面プラズモン波が生じる。エバネッセント波と表面プラズモン波の波数が一致する入射角のとき、エバネッセント波は表面プラズモン波の励起に使われ、反射光として計測される光量が減少する。このとき、ＣＣＤカメラ５によって反射光の強度を測定すると、図５に示すように、エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる入射角で、反射率の低下が観測される。エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる表面プラズモン共鳴角度は、測定チップ１００の金薄膜１０４に接する被測定物質の屈折率に依存するため、金薄膜１０４上に例えば抗体などの被測定物質を固定すると、抗原との結合によって抗体の屈折率が変化し、谷の現れる角度が僅かに変化する。この変化を測定することにより、被測定物質の定量を行うことができる。以上が、表面プラズモン共鳴測定装置の測定原理である。
【００３２】
図６は本実施の形態の凝固活性測定装置のデータ処理装置６の構成を示すブロック図である。データ処理装置６は、凝固活性測定装置全体を制御する制御部６０と、制御部６０のプログラム等を記憶する記憶部６１と、凝固活性測定装置を使用する使用者が装置に対して指示を与えるための入力部６２と、使用者に対して情報を表示するための表示部６３とを有する。
【００３３】
制御部６０は、ＣＣＤカメラ５によって撮影された画像を処理して光強度プロファイルを求める画像処理部６４と、光強度プロファイルのデータから屈折率の変化を求め、この屈折率の変化から血漿の流速を算出する流速算出部６５と、血漿の流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出部６６と、屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出部６７とを有する。
【００３４】
次に、凝固活性測定装置による凝固活性の測定方法について詳細に説明する。図７は凝固活性の測定方法の処理の流れを示すフローチャートである。
まず、測定チップ１００を凝固活性測定装置のプリズム１の平面上に載置する（図６ステップＳ１）。
続いて、３７℃で１分間温めた凝固活性化剤６μＬをピペットによってインレット１１０から測定チップ１００内に投入する（ステップＳ２）。凝固活性化剤は、インレット１１０および円孔１０６を経て流路１０７〜１０９中に充填される。シート１０２に形成された流路１０７〜１０９のうち、観測領域の流路１０７が最も細くデザインされていることから、凝固活性化剤は流路１０７内に留まる。
【００３５】
そして、データ処理装置６の制御部６０は、流速測定を開始する（ステップＳ３）。次に、３７℃で１分間温めた０．６μＬの血漿を、凝固活性化剤の投入から６０秒後にインレット１１０から測定チップ１００内に投入する（ステップＳ４）。血漿は、インレット１１０および円孔１０６を経て流路１０７中に投入され、毛細管現象によって流路１０７中を進行する。血漿は、シーメンス社製のものを使用した。
【００３６】
データ処理装置６の制御部６０は、血漿の流速Ｖを算出し終えた時点で、測定を終了する（ステップＳ５）。そして、制御部６０は、流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する（ステップＳ６）。制御部６０は、算出した凝固活性値Ｃを記憶部６１に記憶させ、また凝固活性値Ｃを表示部６３に表示させる。
【００３７】
最後に、制御部６０は、血漿の凝固形態を表すデータを導出する（ステップＳ７）。制御部６０は、算出したデータを記憶部６１に記憶させ、またこのデータを表示部６３に表示させる。以上で、測定が終了する。
各測定チップ１００について１回のみ測定を行い、測定を終えた測定チップ１００は廃棄される。
【００３８】
次に、ステップＳ５の血漿の流速Ｖの算出方法について説明する。凝固活性測定装置のＣＣＤカメラ５は、測定チップ１００からの反射光を検出して、濃淡画像データを出力する。
データ処理装置６の画像処理部６４は、ＣＣＤカメラ５から出力された濃淡画像データを取り込み、この濃淡画像データを処理して、光強度プロファイルを画像の１ライン毎に求める。
【００３９】
図８はＣＣＤカメラ５が撮影した画像と血漿の進行方向との関係を示す図、図９は画像のＹｎラインにおける光強度プロファイルの例を示す図である。
図８のＸ方向は図２〜図４のＰＸ方向に対応し、図８のＹ方向は図２〜図４のＰＹ方向に対応する。このＹ方向が、血漿の進行方向に相当する。図８の例では、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像は、Ｘ方向が座標０〜４７９の４８０ピクセルからなり、Ｙ方向も座標０〜４７９の４８０ピクセルからなるものとしている。図８におけるＹｎは、画像上のある１ラインのＹ座標を示している。
【００４０】
ＣＣＤカメラ５が撮像した画像には、測定チップ１００の各所の光の反射率に応じて明るい（反射率が高い）領域と暗い（反射率が低い）領域とが現れる。画像処理部６４は、濃淡画像データを処理して、図９に示すような光強度プロファイルを画像の１ライン毎に求める。上記のとおり、図８のＸ方向は、図２〜図４のＰＸ方向に対応しているので、測定チップ１００の金薄膜１０４に対する光の入射角に対応している。したがって、図９において、光強度が最も弱い位置、すなわち光が最も吸収された位置は表面プラズモン共鳴角度に相当する。
【００４１】
屈折率変化を観測する凝固活性測定装置においては、ＣＣＤカメラ５の１ライン毎に屈折率を反映したデータが観測される。よって、観測領域の位置にある流路１０７内において、凝固活性化剤の中を血漿が進行していくと、屈折率変化が起こり、ＣＣＤカメラ５の１ライン毎にどのタイミングで血漿進行による屈折率変化が起こったか記録されることになる。
【００４２】
データ処理装置６の流速算出部６５は、画像処理部６４が求めた、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、血漿が進行したことにより生じる屈折率の変化を求めて、この屈折率の変化から血漿の流速Ｖを算出する。表面プラズモン共鳴角度は、測定チップ１００の金薄膜１０４に接する血漿の屈折率に依存するため、表面プラズモン共鳴角度の変化は、血漿の進行によって屈折率が変化したことを示す。したがって、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、表面プラズモン共鳴角度が変化した時刻（屈折率の変化が起きた時刻）を図８のＹ方向に沿って読み取れば、屈折率変化の時間変化を求めることができる。そして、この屈折率変化の時間変化の傾きが、血漿の流速Ｖを示している。
【００４３】
図１０を用いて、この流速Ｖの算出方法を説明する。図１０は、流速Ｖの算出方法を視覚的に説明する図であり、屈折率の変化が起きた時刻とＹ方向の画素位置との関係の１例を示す図である。図１０は、観測領域の流路１０７に対応するＸ座標（例えばＸ＝２３０）におけるデータを示している。図１０におけるＰは、表面プラズモン共鳴角度が変化した画素位置、すなわち屈折率の変化が起きた画素位置を示している。この屈折率変化の時間変化の傾きｙ／ｔ（ピクセル／ｓｅｃ）が、血漿の流速Ｖを示している。ＣＣＤカメラ５が撮像した画像におけるＹ方向の１画素は、流路１０７上の実距離に換算すると例えば１０μｍに相当する。したがって、血漿の流速Ｖ（μｍ／ｓｅｃ）は、傾き（ピクセル／ｓｅｃ）×実距離（μｍ／ピクセル）、すなわちｙ／ｔ×１０（μｍ／ｓｅｃ）で求めることができる。こうして、データ処理装置６の流速算出部６５は、血漿の流速Ｖを算出することができる。
【００４４】
なお、言うまでもなく、血漿の流速Ｖは時間と共に変化するので、屈折率変化の時間変化の傾きも時間と共に変化する。ここでは、血漿の進行によって最初に屈折率変化が起きた時点以降の複数点の屈折率変化から得られる血漿の流速Ｖ、すなわち初速を計算すればよい。
【００４５】
次に、ステップＳ６の凝固活性値Ｃの算出方法について説明する。制御部６０の凝固活性値算出部６６は、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの既知の関係が予め登録された記憶部６１を参照し、この関係に基づいて、流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する。
まず、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係の求め方について説明する。血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係を求めるには、図７のステップＳ２で説明したとおり、流路中に凝固活性化剤を充填した測定チップを用い、この測定チップに凝固活性値Ｃが既知の市販の正常血漿を投入して、本実施の形態の凝固活性測定装置を用いて正常血漿の流速Ｖを算出すればよい。これにより、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係式を求めることができる。
【００４６】
例えば金薄膜１０４上にブロッキング剤１０５のスポットを形成しない測定チップを用い、この測定チップに、市販正常血漿をバッファで２倍、４倍希釈したサンプルを投入した場合の測定結果から、図１１に示す検量線を求めることができた。この検量線から、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係式を次式のように得ることができた。言うまでもなく、式（１）のＬｎ（）は自然対数である。
Ｖ＝−２３．６９６Ｌｎ（Ｃ）＋１３５．８９ ・・・（１）
【００４７】
また、金薄膜１０４上にタンパク質から構成されるブロッキング剤１０５のスポットを３５０μｍ間隔で形成した本実施の形態の測定チップ１００を用い、この測定チップ１００に、市販正常血漿をバッファで２倍、４倍希釈したサンプルを投入した場合の測定結果から、以下のような関係式を得ることができた。
Ｖ＝−８．３２８３Ｌｎ（Ｃ）＋５８．１５７ ・・・（２）
【００４８】
金薄膜１０４上にブロッキング剤１０５のスポットを形成しない測定チップを用いる場合に比べて、本実施の形態の測定チップ１００を用いる場合の方が血漿の流速Ｖの値が全体的に小さくなっている。その理由としては、タンパク質を含むブロッキング剤１０５のスポットが、血漿の物理的障害あるいは凝固反応の生化学的障害となっていることが考えられる。
【００４９】
データ処理装置６の記憶部６１には、予め得られた式（２）が登録されている。凝固活性値算出部６６は、式（２）を用いて、血漿の流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する。
本実施の形態の測定チップ１００と凝固活性測定装置を用い、正常域血漿、異常域血漿の凝固活性値Ｃを求めたところ、表１のようになった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
このように、予め血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係を求めておくことで、従来の凝固時間指標に相当する凝固活性値Ｃを血漿の流速Ｖから算出することができる。なお、活性とは、血液を凝固させる活性能力、ということであり、臨床統計的に定義された「活性値」が知られている。活性１００％とは、正常な血液（血漿）が持っている凝固能力があることを示している。表１においては、試薬販売会社が正常人多数の血液を集めたプール血漿を作製し、このプール血漿と国際的基準に基づく１００％正常血漿性能との差をロット毎に測定した結果から得られたプール血漿の活性値を、性能表として記述している。性能表が示す活性値は、測定上の問題で値がずれるので、ある範囲をもった値となっている。
【００５２】
次に、血漿の凝固形態を表すデータの導出方法について説明する。凝固形態導出部６７は、画像処理部６４が求めた、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、観測領域の屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する。
表面プラズモン共鳴測定装置における深さ方向の感度は４００ｎｍ程度である。したがって、図１（Ａ）〜図１（Ｃ）に示したモデルのような凝固塊が形成される様子を、表面プラズモン共鳴測定装置が感度を持つ深さにおいてリアルタイムに追うことができる。血液凝固反応は、本来、血管内皮でおこる表面反応であることから、基板上に生化学的な処理を実施した場での反応を観測することは、より理想的な凝固測定に近づけた環境とも考えられる。
【００５３】
上記のとおり、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像のＸ方向は、測定チップ１００の金薄膜１０４に対する光の入射角に対応しており、Ｘ座標を入射角に換算することができる。したがって、光強度プロファイルにおいて反射光強度が最も弱いＸ座標の値を、表面プラズモン共鳴角度に換算することができる。表面プラズモン共鳴角度は測定チップ１００の金薄膜１０４に接する物質の屈折率に依存するので、表面プラズモン共鳴角度を屈折率に換算することができる。
【００５４】
記憶部６１には、表面プラズモン共鳴角度と屈折率との関係があらかじめ登録されている。凝固形態導出部６７は、記憶部６１を参照することにより、表面プラズモン共鳴角度から屈折率を算出することができる。凝固形態導出部６７は、このような屈折率の算出を、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像の１ライン毎に行う。こうして、血漿の進行方向に沿った屈折率のデータを求めることができる。さらに、凝固形態導出部６７は、屈折率のデータを時間毎に算出する。
【００５５】
測定チップ１００に正常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを図１２に示す。図１２では、血漿投入前、血漿投入４秒後、血漿投入６秒後、血漿投入８秒後、血漿投入１４秒後、血漿投入２４秒後の屈折率のデータを示している。縦軸は屈折率、横軸はＹ方向の画素位置である。すなわち、図１２の右向きの方向が血漿の進行方向である。図１２の屈折率は、血漿投入前の屈折率の値を０として規格化してある。
【００５６】
図１２の１２０の箇所は、血漿の到達によって屈折率が変化したことを示している。１２１の箇所は、溜まった血漿の凝固によって屈折率が上昇したことを示している。１２２の箇所は、血漿が完全に停止したことを示している。以上のように、屈折率の時間変化のデータを見れば、血漿が流路内を進行するにつれて、凝固が活性化され、固まって流路の途中で停止している様子が分かる。
【００５７】
一方、異常域血漿は、凝固しにくい血漿である。測定チップ１００に異常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを図１３に示す。図１３では、血漿投入前、血漿投入１３秒後、血漿投入１３８秒後の屈折率のデータを示している。図１３の屈折率のデータによると、血漿が一箇所に固まって停止する様子は見られない。ただし、基板上にところどころ、固まって凝固が起こっている様子も観測される。
【００５８】
以上のように、本実施の形態では、従来の凝固測定により得られる凝固時間と同様の指標である凝固活性以外に、屈折率の時間変化のデータを求めることにより、血漿の基板上への凝固の様子と最終的な凝固形態とを表すデータを求めることができ、凝固形態を簡便に観測することができる。
【００５９】
なお、本実施の形態では、多孔構造による毛細管現象によって、液体試料の導入を行うが、多孔構造を形成せずに測定にポンプ等を用いて試料の導入を行ってもよい。
また、本実施の形態では、屈折率を測定する屈折率測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置を利用したが、例えばエリプソメトリー装置を利用することもできる。
【００６０】
本実施の形態のデータ処理装置６は、ＣＰＵ、記憶装置および外部とのインタフェースを備えたコンピュータと、これらのハードウェア資源を制御するプログラムによって実現することができる。このコンピュータにおいて、本発明の凝固活性測定方法を実現させるためのプログラムは、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリカードなどの記録媒体に記録された状態で提供される。ＣＰＵは、記録媒体から読み込んだプログラムを記憶装置に書き込み、プログラムに従って本実施の形態で説明した処理を実行する。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、臨床的な指標である凝固活性を測定する凝固活性測定装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１…プリズム、２…光源、３…偏光板、４…集光レンズ、５…ＣＣＤカメラ、６…データ処理装置、６０…制御部、６１…記憶部、６２…入力部、６３…表示部、６４…画像処理部、６５…流速算出部、６６…凝固活性値算出部、６７…凝固形態導出部、１００…測定チップ、１０１…基板、１０２…シート、１０３…アクリル筺体、１０４…金薄膜、１０５…ブロッキング剤、１０６…円孔、１０７，１０８…流路、１０９…吸引流路、１１０…インレット、１１１…貫通孔。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的な指標である凝固活性を測定する凝固活性測定装置、凝固活性測定方法、および凝固活性測定装置で用いる測定チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
凝固活性は、臨床検査の重要な項目である。その一つの凝固活性指標であるプロトロンビン時間（血液凝固時間：ＰＴ）は、外因系の凝固因子への感度が高いと考えられており、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや、肝機能の異常、さらに経口の抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる指標である。
【０００３】
従来、血液凝固時間の測定には、かくはん抵抗方式、光散乱方式、熱伝導方式、水晶振動子方式などの方法が発明されているが、一般にかくはん抵抗方式と光散乱方式が多く用いられている（非特許文献１参照）。かくはん抵抗方式は、サンプルを活性化剤と一緒に導入してフィンでかくはんし、かくはんの抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。
【０００４】
光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、その散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「自動分析装置による血液凝固時間測定 −ＡＣＬ ＴＯＰシリーズ、ＳＴＡＣＩＡ−」，生物試料分析，生物試料分析科学会，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ５，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように散乱光から血液凝固時間を求めるために多数の方法が検討されている背景として、本質的に血管や皮膚を構成する細胞との接触界面にて起こる表面反応である凝固反応を、試験用容器内での活性化剤と混合した血漿のバルクの液体内で起こる凝固反応で置き換えて解釈している問題があると考えられる。加えて、血液凝固指標は、被験者の状態を表す有用な指標でありながら、その反応経路については、現在でも完全には解明されていない。そのため、医療現場の臨床検査では、血液凝固反応と実際の検査での反応の違いを担当者が経験的に理解しながら臨床医に説明する努力が行われており、さらには、臨床検査の教科書にも記載されていない珍しい疾患については、検査担当者の個人的な力量によって判明できているという現状がある。
【０００７】
一方、学術的には、血液凝固の表面反応は、テンショメトリーと呼ばれる、量りを用いた方法でモニタリングされている。しかし、この方法では大量の血液サンプルが要求され、また自動化も困難であることから、診療現場での測定法としての適用はされていない。
【０００８】
以上のように、従来のかくはん抵抗方式や光散乱方式などの測定方法では、血液凝固の表面反応を測定することができないために血液凝固時間の測定精度が低く、一方、量りを用いて凝固反応をモニタリングする方法では、大量の血液サンプルを必要とするために診療現場での測定に適していないという問題点があった。
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたもので、本質的に表面反応である凝固反応の活性を少量の血漿サンプルで測定することができる凝固活性測定装置、測定チップおよび測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の凝固活性測定装置は、溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出手段とを備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定装置の１構成例は、さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出手段を備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定装置の１構成例において、前記屈折率測定装置は、表面プラズモン共鳴測定装置であることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明は、凝固活性化剤が充填された流路の表面における屈折率に基づいて流路中を進行する血漿の流速を算出し凝固活性を算出する凝固活性測定装置用の測定チップであって、基板表面に形成された金薄膜と、この金薄膜上に形成された流路とを備え、前記金薄膜は、その一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていることを特徴とするものである。
また、本発明の測定チップの１構成例は、前記金薄膜上の前記流路の位置に、流路方向に沿って前記生化学測定用ブロッキング剤のスポットが複数形成されていることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明の凝固活性測定方法は、溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定ステップと、前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出ステップとを備えることを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定方法の１構成例は、さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出ステップを備えることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に流路中に血漿が投入されたときの屈折率の変化から流路中を進行する血漿の流速を算出し、この流速から凝固活性値を算出することにより、本質的に表面反応である凝固反応の活性を少量の血漿サンプルで測定することができ、凝固反応の測定精度を向上させることができる。
【００１４】
また、本発明では、測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを導出することにより、凝固活性以外に、血漿の基板上への凝固の様子と最終的な凝固形態とを表すデータを求めることができ、凝固形態を簡便に観測することができる。
【００１５】
また、本発明では、測定チップの基板表面に形成された金薄膜の一部を、凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤で覆うことにより、凝固活性を物理的かつ生化学的に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の原理を説明する断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る測定チップの平面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
【図５】凝固活性測定装置において測定チップの測定で得られる入射角−反射率曲線の１例を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置のデータ処理装置の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る凝固活性の測定方法の処理の流れを示すフローチャートである。
【図８】本発明の実施の形態においてＣＣＤカメラが撮影した画像と血漿の進行方向との関係を示す図である。
【図９】本発明の実施の形態においてＣＣＤカメラが撮影した画像の１ラインにおける光強度プロファイルの例を示す図である。
【図１０】本発明の実施の形態における血漿の流速の算出方法を説明する図である。
【図１１】血漿の流速と凝固活性値との関係の１例を示す図である。
【図１２】測定チップに正常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを示す図である。
【図１３】測定チップに異常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［発明の原理］
本発明は、プロトロンビン時間（血液凝固時間）に相当する指標である凝固活性を、測定対象が進行する平面流路の表面における屈折率測定に基づいた流速測定から求めるものである。
流路表面の屈折率を測定できる屈折率測定装置としては、例えば、測定対象の流路の反対側から光を入射させる全反射光学系と、２次元領域を一度にあるいは走査しながらモニタする光学系とを有し、かつ測定対象物により大きく吸収されない光波長に対応していればよい。したがって、屈折率測定装置として、２次元に対応した表面プラズモン共鳴測定装置を用いる。
【００１８】
このように基板の表面反応を効率よく測定できる表面プラズモン共鳴測定装置と、少量の血漿サンプルから凝固反応をモニタできるように流路を形成した測定チップとを用いる。凝固活性を測定するためには、測定対象物が血液由来の血漿であることから、使い捨ての測定チップを用意することが衛生的で望ましい。
【００１９】
キャピラリーフロー型の測定チップの流路部分にあらかじめ凝固活性を測定するための凝固活性化剤を満たしておき、凝固活性化剤の中に測定対象の血漿を少量投入すると、投入された血漿は流路中の活性化剤の中を進行しながら、血漿そのものの凝固機能が活性化され、凝固しながら流路内を進行していくという現象が起こる。測定チップの流路内に、適正温度に設定した凝固活性化剤を導入し、さらに測定対象の血漿を凝固活性化剤導入量の例えば１／１０量投入して、測定チップの基板表面での凝固反応をリアルタイムで観測する。
【００２０】
屈折率測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置を利用する場合には、測定チップの基板表面を金薄膜とする必要がある。本発明では、この金薄膜の表面を生化学測定用ブロッキング剤によりブロッキングする。これにより、金属による凝固活性を抑えることができる。
また、ブロッキング剤として凝固活性に影響する因子を含むものを使い、さらに流路方向に沿ってブロッキング剤をアレイ状にスポットとして形成して配置することにより、物理的かつ生化学的に凝固活性を制御しながら、血漿サンプルの凝固機能をより詳細に観測することができる。
【００２１】
図１（Ａ）〜図１（Ｃ）は本発明の原理を説明する断面図であり、凝固活性化剤で満たされた測定チップの流路内を進行する血漿と血漿の凝固とを示す図である。
測定チップの基板１０００上に形成された流路１００１の中に満たされた凝固活性化剤１００２の中を、投入された血漿１００３が進行すると、進行しながら凝固反応が始まる（図１（Ａ）、図１（Ｂ））。そして、血漿１００３が凝固したところで血漿１００３の進行が停止する（図１（Ｃ））。
【００２２】
凝固活性の高い血漿では、凝固活性化剤との接触により凝固が始まり、血漿そのものの進行速度も、早い時刻から減少しやすい。したがって、凝固活性の高い血漿の場合には、血漿の進行速度である流速、および測定チップ内の進行距離ともに小さくなる。一方、凝固活性の低い血漿の場合には、血漿の進行速度が維持されやすいことから、流速は大きく、かつ測定チップ内の進行距離も長くなる。本発明では、血漿の進行速度である流速を求めて、現在一般的に求められている血液凝固時間と相関のある指標である凝固活性を求める。また、本発明では、血漿の進行距離および凝固の停止様式も並行して観測することができ、試験サンプルである血漿の従来と異なる凝固因子パラメータを提供することができる。
【００２３】
［実施の形態］
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図２は本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図、図３は測定チップの平面図、図４は本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
本実施の形態の測定チップ１００は、略直方体状の外形をなし積層構造を有している。すなわち、水平方向の大きさが１６ｍｍ×１６ｍｍで厚さが１ｍｍのＢＫ７ガラスあるいはプラスチックからなる矩形板状の透明の基板１０１と、平面視の外形が基板１０１と略同一に形成され、基板１０１上に積層される例えば樹脂からなる両面シール状のシート１０２と、平面視の外形が基板１０１と略同一に形成され、シート１０２上に積層されるアクリル筺体１０３とを備えている。
【００２４】
基板１０１上には、スパッタリングによって厚さ約５０ｎｍの金薄膜１０４が形成される。さらに、金薄膜１０４の表面の一部に牛乳由来、魚由来、または化学合成由来の生化学測定用のブロッキング剤１０５を形成して、金薄膜１０４の表面を覆う。本実施の形態の測定チップ１００では、タンパク質から構成されるブロッキング剤１０５のスポットを３５０μｍ間隔で形成した。このブロッキング剤１０５のスポットは、基板１０１上にシート１０２が積層されたときに、後述する観測領域に位置するように形成されている。ブロッキング剤１０５のスポットは、凝固反応の化学的障害となるほか、物理的障害としても機能する。タンパク質を含むブロッキング剤はスポットの形成が容易であるため、好適である。
【００２５】
金薄膜１０４の表面にブロッキング剤１０５のスポットを形成した後に、基板１０１を水で洗浄して、基板１０１の金薄膜１０４の上にシート１０２を積層する。シート１０２の後述するインレットに対応する位置には、円孔１０６が形成されている。また、シート１０２には、シート１０２を板厚方向（図２上下方向）に貫通し、円孔１０６に連通する流路１０７と、シート１０２を板厚方向に貫通し、流路１０７に連通する流路１０８と、シート１０２を板厚方向に貫通し、流路１０８に連通する吸引流路１０９とが形成されている。流路１０７が形成されている領域が、観測領域である。
【００２６】
このようにシート１０２に形成される流路１０７〜１０９は、円孔１０６から測定チップ中央部の流路１０７へ繋がり、さらに流路１０８を経て測定チップ周辺部の吸引流路１０９へと繋がる形状となっている。流路１０７，１０８の断面寸法は、測定対象の血漿に対して毛細管現象を発現する寸法に設定されている。また、シート１０２および流路１０７〜１０９は、流路１０７〜１０９中に凝固活性化剤が充填された後に流路１０７〜１０９中に留まるような材質、流路の高さ、流路の幅、流路の表面状態であることが好ましい。
【００２７】
このようなシート１０２の上にアクリル筺体１０３を積層する。アクリル筺体１０３には、凝固活性化剤および測定対象の血漿を投入するための円孔であるインレット１１０がアクリル筺体１０３を板厚方向に貫通するように形成されている。このインレット１１０は、アクリル筺体１０３がシート１０２上に積層されたときに、上端が外気に開放されると共に下端が円孔１０６と連通する位置に形成されている。
【００２８】
また、アクリル筺体１０３には、多数の貫通孔１１１がアクリル筺体１０３を板厚方向に貫通するように形成されている。これら多数の貫通孔１１１は、アクリル筺体１０３がシート１０２上に積層されたときに、上端が外気に開放されると共に下端が流路１０８または吸引流路１０９と連通する位置に形成されており、観測領域である流路１０７の部分には形成されていない。貫通孔１１１の直径は、測定対象の血漿に対して毛細管現象を発現する値、例えば約１００ミクロンに設定されている。こうして、基板１０１とシート１０２とアクリル筺体１０３とを組み合わせることで、毛細管現象によって血漿の導入を行うキャピラリーフロー型の流路を有する測定チップ１００が完成する。
【００２９】
凝固活性測定装置は、図４に示すように、プリズム１と、ＬＥＤなどの光源２と、偏光板３と、集光レンズ４と、ＣＣＤカメラ５と、データ処理装置６とを有する。本実施の形態では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して凝固活性測定装置を実現しており、図４に示した構成は表面プラズモン共鳴測定装置と同様である。
【００３０】
ここで、表面プラズモン共鳴測定装置の測定原理について簡単に説明する。単色光の光源２から放射された光が偏光板３を通過すると、ｐ偏光光のみが通過する。このｐ偏光光は、集光レンズ４で集光されて半球状のプリズム１に入射する。プリズム１の上面には、基板１０１がプリズム１と接するように測定チップ１００が載置され、基板１０１側から測定チップ１００にｐ偏光光が入射する。このように、ｐ偏光光をプリズム１を介して測定チップ１００に入射させることによって、測定チップ１００からの反射光の強度変化をＣＣＤカメラ５で検出する。
【００３１】
光源２から放射された光は、プリズム１と測定チップ１００の金薄膜１０４との境界でエバネッセント波となる。一方、この金薄膜１０４の表面では、表面プラズモン波が生じる。エバネッセント波と表面プラズモン波の波数が一致する入射角のとき、エバネッセント波は表面プラズモン波の励起に使われ、反射光として計測される光量が減少する。このとき、ＣＣＤカメラ５によって反射光の強度を測定すると、図５に示すように、エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる入射角で、反射率の低下が観測される。エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる表面プラズモン共鳴角度は、測定チップ１００の金薄膜１０４に接する被測定物質の屈折率に依存するため、金薄膜１０４上に例えば抗体などの被測定物質を固定すると、抗原との結合によって抗体の屈折率が変化し、谷の現れる角度が僅かに変化する。この変化を測定することにより、被測定物質の定量を行うことができる。以上が、表面プラズモン共鳴測定装置の測定原理である。
【００３２】
図６は本実施の形態の凝固活性測定装置のデータ処理装置６の構成を示すブロック図である。データ処理装置６は、凝固活性測定装置全体を制御する制御部６０と、制御部６０のプログラム等を記憶する記憶部６１と、凝固活性測定装置を使用する使用者が装置に対して指示を与えるための入力部６２と、使用者に対して情報を表示するための表示部６３とを有する。
【００３３】
制御部６０は、ＣＣＤカメラ５によって撮影された画像を処理して光強度プロファイルを求める画像処理部６４と、光強度プロファイルのデータから屈折率の変化を求め、この屈折率の変化から血漿の流速を算出する流速算出部６５と、血漿の流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出部６６と、屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出部６７とを有する。
【００３４】
次に、凝固活性測定装置による凝固活性の測定方法について詳細に説明する。図７は凝固活性の測定方法の処理の流れを示すフローチャートである。
まず、測定チップ１００を凝固活性測定装置のプリズム１の平面上に載置する（図６ステップＳ１）。
続いて、３７℃で１分間温めた凝固活性化剤６μＬをピペットによってインレット１１０から測定チップ１００内に投入する（ステップＳ２）。凝固活性化剤は、インレット１１０および円孔１０６を経て流路１０７〜１０９中に充填される。シート１０２に形成された流路１０７〜１０９のうち、観測領域の流路１０７が最も細くデザインされていることから、凝固活性化剤は流路１０７内に留まる。
【００３５】
そして、データ処理装置６の制御部６０は、流速測定を開始する（ステップＳ３）。次に、３７℃で１分間温めた０．６μＬの血漿を、凝固活性化剤の投入から６０秒後にインレット１１０から測定チップ１００内に投入する（ステップＳ４）。血漿は、インレット１１０および円孔１０６を経て流路１０７中に投入され、毛細管現象によって流路１０７中を進行する。血漿は、シーメンス社製のものを使用した。
【００３６】
データ処理装置６の制御部６０は、血漿の流速Ｖを算出し終えた時点で、測定を終了する（ステップＳ５）。そして、制御部６０は、流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する（ステップＳ６）。制御部６０は、算出した凝固活性値Ｃを記憶部６１に記憶させ、また凝固活性値Ｃを表示部６３に表示させる。
【００３７】
最後に、制御部６０は、血漿の凝固形態を表すデータを導出する（ステップＳ７）。制御部６０は、算出したデータを記憶部６１に記憶させ、またこのデータを表示部６３に表示させる。以上で、測定が終了する。
各測定チップ１００について１回のみ測定を行い、測定を終えた測定チップ１００は廃棄される。
【００３８】
次に、ステップＳ５の血漿の流速Ｖの算出方法について説明する。凝固活性測定装置のＣＣＤカメラ５は、測定チップ１００からの反射光を検出して、濃淡画像データを出力する。
データ処理装置６の画像処理部６４は、ＣＣＤカメラ５から出力された濃淡画像データを取り込み、この濃淡画像データを処理して、光強度プロファイルを画像の１ライン毎に求める。
【００３９】
図８はＣＣＤカメラ５が撮影した画像と血漿の進行方向との関係を示す図、図９は画像のＹｎラインにおける光強度プロファイルの例を示す図である。
図８のＸ方向は図２〜図４のＰＸ方向に対応し、図８のＹ方向は図２〜図４のＰＹ方向に対応する。このＹ方向が、血漿の進行方向に相当する。図８の例では、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像は、Ｘ方向が座標０〜４７９の４８０ピクセルからなり、Ｙ方向も座標０〜４７９の４８０ピクセルからなるものとしている。図８におけるＹｎは、画像上のある１ラインのＹ座標を示している。
【００４０】
ＣＣＤカメラ５が撮像した画像には、測定チップ１００の各所の光の反射率に応じて明るい（反射率が高い）領域と暗い（反射率が低い）領域とが現れる。画像処理部６４は、濃淡画像データを処理して、図９に示すような光強度プロファイルを画像の１ライン毎に求める。上記のとおり、図８のＸ方向は、図２〜図４のＰＸ方向に対応しているので、測定チップ１００の金薄膜１０４に対する光の入射角に対応している。したがって、図９において、光強度が最も弱い位置、すなわち光が最も吸収された位置は表面プラズモン共鳴角度に相当する。
【００４１】
屈折率変化を観測する凝固活性測定装置においては、ＣＣＤカメラ５の１ライン毎に屈折率を反映したデータが観測される。よって、観測領域の位置にある流路１０７内において、凝固活性化剤の中を血漿が進行していくと、屈折率変化が起こり、ＣＣＤカメラ５の１ライン毎にどのタイミングで血漿進行による屈折率変化が起こったか記録されることになる。
【００４２】
データ処理装置６の流速算出部６５は、画像処理部６４が求めた、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、血漿が進行したことにより生じる屈折率の変化を求めて、この屈折率の変化から血漿の流速Ｖを算出する。表面プラズモン共鳴角度は、測定チップ１００の金薄膜１０４に接する血漿の屈折率に依存するため、表面プラズモン共鳴角度の変化は、血漿の進行によって屈折率が変化したことを示す。したがって、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、表面プラズモン共鳴角度が変化した時刻（屈折率の変化が起きた時刻）を図８のＹ方向に沿って読み取れば、屈折率変化の時間変化を求めることができる。そして、この屈折率変化の時間変化の傾きが、血漿の流速Ｖを示している。
【００４３】
図１０を用いて、この流速Ｖの算出方法を説明する。図１０は、流速Ｖの算出方法を視覚的に説明する図であり、屈折率の変化が起きた時刻とＹ方向の画素位置との関係の１例を示す図である。図１０は、観測領域の流路１０７に対応するＸ座標（例えばＸ＝２３０）におけるデータを示している。図１０におけるＰは、表面プラズモン共鳴角度が変化した画素位置、すなわち屈折率の変化が起きた画素位置を示している。この屈折率変化の時間変化の傾きｙ／ｔ（ピクセル／ｓｅｃ）が、血漿の流速Ｖを示している。ＣＣＤカメラ５が撮像した画像におけるＹ方向の１画素は、流路１０７上の実距離に換算すると例えば１０μｍに相当する。したがって、血漿の流速Ｖ（μｍ／ｓｅｃ）は、傾き（ピクセル／ｓｅｃ）×実距離（μｍ／ピクセル）、すなわちｙ／ｔ×１０（μｍ／ｓｅｃ）で求めることができる。こうして、データ処理装置６の流速算出部６５は、血漿の流速Ｖを算出することができる。
【００４４】
なお、言うまでもなく、血漿の流速Ｖは時間と共に変化するので、屈折率変化の時間変化の傾きも時間と共に変化する。ここでは、血漿の進行によって最初に屈折率変化が起きた時点以降の複数点の屈折率変化から得られる血漿の流速Ｖ、すなわち初速を計算すればよい。
【００４５】
次に、ステップＳ６の凝固活性値Ｃの算出方法について説明する。制御部６０の凝固活性値算出部６６は、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの既知の関係が予め登録された記憶部６１を参照し、この関係に基づいて、流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する。
まず、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係の求め方について説明する。血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係を求めるには、図７のステップＳ２で説明したとおり、流路中に凝固活性化剤を充填した測定チップを用い、この測定チップに凝固活性値Ｃが既知の市販の正常血漿を投入して、本実施の形態の凝固活性測定装置を用いて正常血漿の流速Ｖを算出すればよい。これにより、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係式を求めることができる。
【００４６】
例えば金薄膜１０４上にブロッキング剤１０５のスポットを形成しない測定チップを用い、この測定チップに、市販正常血漿をバッファで２倍、４倍希釈したサンプルを投入した場合の測定結果から、図１１に示す検量線を求めることができた。この検量線から、血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係式を次式のように得ることができた。言うまでもなく、式（１）のＬｎ（）は自然対数である。
Ｖ＝−２３．６９６Ｌｎ（Ｃ）＋１３５．８９ ・・・（１）
【００４７】
また、金薄膜１０４上にタンパク質から構成されるブロッキング剤１０５のスポットを３５０μｍ間隔で形成した本実施の形態の測定チップ１００を用い、この測定チップ１００に、市販正常血漿をバッファで２倍、４倍希釈したサンプルを投入した場合の測定結果から、以下のような関係式を得ることができた。
Ｖ＝−８．３２８３Ｌｎ（Ｃ）＋５８．１５７ ・・・（２）
【００４８】
金薄膜１０４上にブロッキング剤１０５のスポットを形成しない測定チップを用いる場合に比べて、本実施の形態の測定チップ１００を用いる場合の方が血漿の流速Ｖの値が全体的に小さくなっている。その理由としては、タンパク質を含むブロッキング剤１０５のスポットが、血漿の物理的障害あるいは凝固反応の生化学的障害となっていることが考えられる。
【００４９】
データ処理装置６の記憶部６１には、予め得られた式（２）が登録されている。凝固活性値算出部６６は、式（２）を用いて、血漿の流速Ｖから凝固活性値Ｃを算出する。
本実施の形態の測定チップ１００と凝固活性測定装置を用い、正常域血漿、異常域血漿の凝固活性値Ｃを求めたところ、表１のようになった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
このように、予め血漿の流速Ｖと凝固活性値Ｃとの関係を求めておくことで、従来の凝固時間指標に相当する凝固活性値Ｃを血漿の流速Ｖから算出することができる。なお、活性とは、血液を凝固させる活性能力、ということであり、臨床統計的に定義された「活性値」が知られている。活性１００％とは、正常な血液（血漿）が持っている凝固能力があることを示している。表１においては、試薬販売会社が正常人多数の血液を集めたプール血漿を作製し、このプール血漿と国際的基準に基づく１００％正常血漿性能との差をロット毎に測定した結果から得られたプール血漿の活性値を、性能表として記述している。性能表が示す活性値は、測定上の問題で値がずれるので、ある範囲をもった値となっている。
【００５２】
次に、血漿の凝固形態を表すデータの導出方法について説明する。凝固形態導出部６７は、画像処理部６４が求めた、観測領域の光強度プロファイルの時系列データから、観測領域の屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する。
表面プラズモン共鳴測定装置における深さ方向の感度は４００ｎｍ程度である。したがって、図１（Ａ）〜図１（Ｃ）に示したモデルのような凝固塊が形成される様子を、表面プラズモン共鳴測定装置が感度を持つ深さにおいてリアルタイムに追うことができる。血液凝固反応は、本来、血管内皮でおこる表面反応であることから、基板上に生化学的な処理を実施した場での反応を観測することは、より理想的な凝固測定に近づけた環境とも考えられる。
【００５３】
上記のとおり、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像のＸ方向は、測定チップ１００の金薄膜１０４に対する光の入射角に対応しており、Ｘ座標を入射角に換算することができる。したがって、光強度プロファイルにおいて反射光強度が最も弱いＸ座標の値を、表面プラズモン共鳴角度に換算することができる。表面プラズモン共鳴角度は測定チップ１００の金薄膜１０４に接する物質の屈折率に依存するので、表面プラズモン共鳴角度を屈折率に換算することができる。
【００５４】
記憶部６１には、表面プラズモン共鳴角度と屈折率との関係があらかじめ登録されている。凝固形態導出部６７は、記憶部６１を参照することにより、表面プラズモン共鳴角度から屈折率を算出することができる。凝固形態導出部６７は、このような屈折率の算出を、ＣＣＤカメラ５が撮影した画像の１ライン毎に行う。こうして、血漿の進行方向に沿った屈折率のデータを求めることができる。さらに、凝固形態導出部６７は、屈折率のデータを時間毎に算出する。
【００５５】
測定チップ１００に正常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを図１２に示す。図１２では、血漿投入前、血漿投入４秒後、血漿投入６秒後、血漿投入８秒後、血漿投入１４秒後、血漿投入２４秒後の屈折率のデータを示している。縦軸は屈折率、横軸はＹ方向の画素位置である。すなわち、図１２の右向きの方向が血漿の進行方向である。図１２の屈折率は、血漿投入前の屈折率の値を０として規格化してある。
【００５６】
図１２の１２０の箇所は、血漿の到達によって屈折率が変化したことを示している。１２１の箇所は、溜まった血漿の凝固によって屈折率が上昇したことを示している。１２２の箇所は、血漿が完全に停止したことを示している。以上のように、屈折率の時間変化のデータを見れば、血漿が流路内を進行するにつれて、凝固が活性化され、固まって流路の途中で停止している様子が分かる。
【００５７】
一方、異常域血漿は、凝固しにくい血漿である。測定チップ１００に異常域血漿を投入した場合の屈折率のデータを図１３に示す。図１３では、血漿投入前、血漿投入１３秒後、血漿投入１３８秒後の屈折率のデータを示している。図１３の屈折率のデータによると、血漿が一箇所に固まって停止する様子は見られない。ただし、基板上にところどころ、固まって凝固が起こっている様子も観測される。
【００５８】
以上のように、本実施の形態では、従来の凝固測定により得られる凝固時間と同様の指標である凝固活性以外に、屈折率の時間変化のデータを求めることにより、血漿の基板上への凝固の様子と最終的な凝固形態とを表すデータを求めることができ、凝固形態を簡便に観測することができる。
【００５９】
なお、本実施の形態では、多孔構造による毛細管現象によって、液体試料の導入を行うが、多孔構造を形成せずに測定にポンプ等を用いて試料の導入を行ってもよい。
また、本実施の形態では、屈折率を測定する屈折率測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置を利用したが、例えばエリプソメトリー装置を利用することもできる。
【００６０】
本実施の形態のデータ処理装置６は、ＣＰＵ、記憶装置および外部とのインタフェースを備えたコンピュータと、これらのハードウェア資源を制御するプログラムによって実現することができる。このコンピュータにおいて、本発明の凝固活性測定方法を実現させるためのプログラムは、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリカードなどの記録媒体に記録された状態で提供される。ＣＰＵは、記録媒体から読み込んだプログラムを記憶装置に書き込み、プログラムに従って本実施の形態で説明した処理を実行する。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、臨床的な指標である凝固活性を測定する凝固活性測定装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１…プリズム、２…光源、３…偏光板、４…集光レンズ、５…ＣＣＤカメラ、６…データ処理装置、６０…制御部、６１…記憶部、６２…入力部、６３…表示部、６４…画像処理部、６５…流速算出部、６６…凝固活性値算出部、６７…凝固形態導出部、１００…測定チップ、１０１…基板、１０２…シート、１０３…アクリル筺体、１０４…金薄膜、１０５…ブロッキング剤、１０６…円孔、１０７，１０８…流路、１０９…吸引流路、１１０…インレット、１１１…貫通孔。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出手段とを備えることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の凝固活性測定装置において、
さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出手段を備えることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の凝固活性測定装置において、
前記屈折率測定装置は、表面プラズモン共鳴測定装置であることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項４】
凝固活性化剤が充填された流路の表面における屈折率に基づいて流路中を進行する血漿の流速を算出し凝固活性を算出する凝固活性測定装置用の測定チップであって、
基板表面に形成された金薄膜と、
この金薄膜上に形成された流路とを備え、
前記金薄膜は、その一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていることを特徴とする測定チップ。
【請求項５】
請求項４記載の測定チップにおいて、
前記金薄膜上の前記流路の位置に、流路方向に沿って前記生化学測定用ブロッキング剤のスポットが複数形成されていることを特徴とする測定チップ。
【請求項６】
溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定ステップと、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出ステップとを備えることを特徴とする凝固活性測定方法。
【請求項７】
請求項６記載の凝固活性測定方法において、
さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出ステップを備えることを特徴とする凝固活性測定方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の凝固活性測定方法において、
前記屈折率測定ステップは、表面プラズモン共鳴測定装置によって前記屈折率を測定することを特徴とする凝固活性測定方法。
【請求項１】
溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出手段とを備えることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の凝固活性測定装置において、
さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出手段を備えることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の凝固活性測定装置において、
前記屈折率測定装置は、表面プラズモン共鳴測定装置であることを特徴とする凝固活性測定装置。
【請求項４】
凝固活性化剤が充填された流路の表面における屈折率に基づいて流路中を進行する血漿の流速を算出し凝固活性を算出する凝固活性測定装置用の測定チップであって、
基板表面に形成された金薄膜と、
この金薄膜上に形成された流路とを備え、
前記金薄膜は、その一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていることを特徴とする測定チップ。
【請求項５】
請求項４記載の測定チップにおいて、
前記金薄膜上の前記流路の位置に、流路方向に沿って前記生化学測定用ブロッキング剤のスポットが複数形成されていることを特徴とする測定チップ。
【請求項６】
溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定ステップと、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときの前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出ステップとを備えることを特徴とする凝固活性測定方法。
【請求項７】
請求項６記載の凝固活性測定方法において、
さらに、前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを血漿の凝固形態を表すデータとして導出する凝固形態導出ステップを備えることを特徴とする凝固活性測定方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の凝固活性測定方法において、
前記屈折率測定ステップは、表面プラズモン共鳴測定装置によって前記屈折率を測定することを特徴とする凝固活性測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−２３２１３７（Ｐ２０１１−２３２１３７Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０１８３１（Ｐ２０１０−１０１８３１）
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
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