分子診断システム及び方法
【課題】抽出、増幅及び検出を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供する。
【解決手段】核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、全て便利で携帯可能な様式での、細胞から得られる核酸の抽出、核酸の増幅及び核酸の検出のための自動化された装置及び方法、特に、看護の地点での医学的診断検査に適している。
【解決手段】核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、全て便利で携帯可能な様式での、細胞から得られる核酸の抽出、核酸の増幅及び核酸の検出のための自動化された装置及び方法、特に、看護の地点での医学的診断検査に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抽出、増幅及び検出を一緒に行うことができる一体化された核酸検査カートリッジに関する。本発明は、核酸抽出のみ、又は抽出と増幅を組み合わせて行うための装置及び方法にも関する。さらに、本発明は、増幅と検出を組み合わせて行うための装置及び方法に関する。カートリッジには、光学的及び電気化学的検出法を可能にするなどの検知手段を装備することができ、標的核酸を試料から分離するために蝋又は吸収性フィルター抽出機構も装備し得る。カートリッジは、ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅及び鎖置換増幅などの増幅の様々な方法を実施することが可能である。本発明は、選択される増幅方法に応じて、単一の修飾されたプライマー又は修飾されたプライマーの対を含む新規増幅方法及び試薬にも取り組む。さらに、本発明は、核酸検査中のアンプリコンからプライマーのための一体化された電気泳動分離を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸検査の重要性に対する一般的な背景
核酸検査の応用は広範である。現在の商業的検査の多くは、クラミジア、淋病、肝炎及びヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）ウイルス負荷などの感染性疾患、嚢胞性繊維症などの遺伝病、血色素症などの凝固及び血液学因子、並びに乳癌遺伝子などの癌に関する。興味が持たれるその他の領域には、心血管疾患及び薬理ゲノム学と名付けられた薬物耐性スクリーニングが含まれる。現在、検査の大半は、操作が複雑な非携帯性装置を用いて、集中管理方式の研究室で行われている。現在、検査は、一般的には、アッセイを実施するために高度な技術を身に付けた個人を必要とする。その結果、特異的な核酸断片を含有すると疑われる試料の取得と、その有無の測定との間に要する時間は、しばしば、数時間、時には数日にさえ及ぶ。しかしながら、血液検査の他の種類と同様、医師及びその他の者は、より迅速に、ユーザーが使いやすい便利な形式で取得できる結果を必要とすることが多い。従って、核酸検査を迅速且つ便利に実施することができる携帯分析システムに対する必要性が存在する。核酸検査の様々な態様に関する従来技術の論述は、以下の部に記載されている。
【０００３】
遺伝情報を特徴付けるための方法
特定の遺伝的な特徴の臨床徴候は、遺伝を基礎とする疾患の異なる種類又はクラスに応じて異なり得る。これは、ＳＮＰ変異検出、遺伝子コピー変異及び遺伝子過剰発現変異などの遺伝的な特徴を測定するための様々なアプローチに結び付いた。例えば、血色素症、嚢胞性繊維症又は発癌遺伝子ｐ５３などの幾つかの疾病は、特異的なヌクレオチドにのみ影響を与える１つ又は数個の極めて特異的な突然変異を有する。血色素症を考えると、２つの特異的突然変異が存在する。本疾病の臨床徴候は、様々な組織内への鉄の蓄積であり、これは治療しなければ致死的となり得る。最も多い変異は、遺伝子中のヌクレオチド８４５におけるＧからＡへの転位（Ｃ２８２Ｙとも称される。）である。Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネットサイトで見ることができるＯＭＩＭ：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎデータベースを参照されたい。同じ血色素症遺伝子中に、次に多く見られる突然変異は、エキソン２中のＣからＧへの塩基転換（Ｈ６３Ｄとしても知られる。）である。これらは、一塩基多型（ＳＮＰ）として知られる。全ての個体は各遺伝子の２コピーを有するので、これらの遺伝子の可能な組み合わせは２つの野生型（ホモ接合野生型）、２つの変異された遺伝子（ホモ接合変異体）又は１つの野生型及び１つの変異遺伝子（ヘテロ接合）である。血色素症の場合には、ホモ接合変異体である個体は病気の状態を呈し、ヘテロ接合の個体は、ホモ接合野生型の個体に比べて、鉄のより高いレベルを蓄積するので、本疾病の幾つかの側面に対して感受性が高い場合があり得る。また、個体がその子孫へ疾病を伝達するかどうかを決定する目的で、個体がヘテロ接合であることを決定できることは有用であり得る。
【０００４】
その結果、血色素症のような遺伝病を検査する上で、分析手段又は検出用チャンネルを少なくとも４つ有し得ることは有用である。ここで、１つのチャンネルは野生型Ｃ２８２の存在を検出し、第二のチャンネルは変異体Ｙ２８２遺伝子の存在を検出し、第三のチャンネルは、野生型Ｈ６３遺伝子の存在を検出し、第四のチャンネルは変異体Ｄ６３遺伝子の存在を検出する。図１２は、この種の血色素症検査から得られ得る結果の表を表し、ホモ接合又はヘテロ接合を識別できること、及びホモ接合チャンネルはほぼ２倍の発現レベルを生じるため、検査におけるシグナルもほぼ２倍となっていることを示している。陽性及び陰性対照として使用するために１つ又はそれ以上のさらなるチャンネルを有することも有用であることに留意されたい。
【０００５】
幾つかの遺伝的変異には、ゲノム中に存在し、患者に病気の状態をもたらす遺伝子の複数コピーが含まれる。一例として、２０ｑｌ３．２の中にマッピングされた発癌遺伝子ＺＮＦ２１７が、大腸癌の個体中に複数コピーで発見されている（Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｖｏｌ ２０４（３）：２８２）。α−シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の遺伝的三重重複が、認知症を伴う遺伝的早発性パーキンソン病を引き起こすことが報告されている（Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｌａｎｃｅｔ， ｖｏｌ ３６４（９４４０）：１１６７）。「Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ５２（２）：１０１．，」は、運動神経細胞生存因子（ＳＭＮ２）遺伝子の増加した遺伝子コピーに関連する成人期発症のＩＩＩ型脊髄性筋萎縮症の増加が存在することを見出した。これらの遺伝子コピー突然変異は、ハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）などの１つ又はそれ以上の必要とされる遺伝子を使用することによって検出することができる。過剰発現突然変異は、典型的には、ｍＲＮＡの増加したレベルを生じ、これらは検出することが可能である。
【０００６】
核酸の抽出のための方法及び装置
細胞中に見出される核酸は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸であり得、並びにゲノムＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（例えば、プラスミド及びエピソーム）、ミトコンドリアＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及び転移ＲＮＡであり得る。核酸は、宿主にとって外来性であってもよく、感染性因子（例えば、細菌、ウイルス、真菌又は単細胞生物及び感染性多細胞生物（寄生生物）として細胞に混入し得る。最近、一塩基多型（ＳＮＰ）、染色体の再編成及び外来遺伝子の挿入の同定のために、核酸の存在の検出及び分析が重要となっている。これらには、感染性ウイルス（例えば、ＨＩＶ及びその他のレトロウイルス）、ジャンピング遺伝子（例えば、トランスポゾン）及び組換え的に操作された外来遺伝子含有生物（例えば、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＲｅａｄｙＴＭ植物）から得られる核酸の同定が含まれる。
【０００７】
核酸の分析は、幅広い用途を有する。例えば、外来因子の存在は、医学的診断ツールとして使用することが可能である。癌組織の遺伝的構成の同定は、医学的診断ツールとして使用することが可能であり、組織が癌であることを確認し、及び癌組織の浸潤性を決定する。染色体の再編成、ＳＮＰ及び遺伝子発現の異常な変化は、特定の疾病状態に対する医学的診断として使用することが可能である。さらに、遺伝情報は、特定の医薬の有効性を確かめるために使用することが可能であり、薬理ゲノム学の分野として知られている。ヒト間及び家畜間での遺伝的変動は、ＤＮＡ分析によって確かめることもできる。これは、法医学、父子鑑定及び畜産業などの分野で使用されている。
【０００８】
細胞から核酸を抽出する方法は、当業者に周知である。細胞壁は、様々な方法によって弱化させることができ、核酸を細胞から押し出すことを可能とし、核酸のさらなる精製及び分析を可能とする。核酸抽出の具体的な方法は、単離されるべき核酸の種類、細胞の種類及び核酸を分析するために使用される具体的な用途に依存する。ＤＮＡを単離する多くの方法が当業者に公知であり、例えば、一般的な参考文献である「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”」を参照されたい。例えば、従来技術には、体液からＤＮＡを抽出及び単離するための化学的に含浸され及び脱水された固体基材の例が含まれ、本固体基材は、溶解性の塩及び界面活性剤を使用し、並びにＤＮＡ試料の長期保存のためのさらなる試薬を含有する。例えば、ＦＴＡペーパーについて詳述する米国特許第５，８０７，５２７号及びＩｓｏｃａｒｄ Ｐａｐｅｒについて詳述する米国特許第６，１６８，９２２号。従来技術には、粒子分離方法の例（例えば、ＵＳ ＲＥ３７，８９１）も含まれる。
【０００９】
ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離する方法は、当業者に周知である。典型的には、細胞破壊は、ＲＮＡ単離操作中にＲＮＡｓｅを不活化する強いタンパク質変性溶液の存在下で行われる。次いで、ＲＮＡは、遠心を用いた差異的エタノール沈殿を用いて単離される。周知のごとく、ＲＮＡは極めて脆弱であり、アルカリ条件及びＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅに対して感受性である。ＲＮＡｓｅは環境内に遍在しており、ＲＮＡを単離するために使用される溶液及び容器からＲＮＡを除去するのは困難であることが明らかとなっている。
【００１０】
核酸の増幅のための方法及び装置
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、組織試料の数多くの種類からのゲノムＤＮＡの精製の標準的方法中に持ち込まれる多数のタンパク質及び他の夾雑物によって阻害される。血液からゲノムＤＮＡ試料中のＰＣＲ阻害剤を除去するために、フェノール、クロロホルム及びエーテルを用いた有機抽出又はカラムクロマトグラフィー又は勾配ＣｓＣｌ超遠心のさらなる工程を行い得ることが知られている。しかしながら、これらの工程は、時間、複雑さ及び費用を増加させる。この複雑さにより、核酸分析に有用な単純な使い捨てカートリッジへの導入が制約される。従って、核酸増幅過程のために使用される核酸試料中に見出される阻害剤を克服するための新しい単純な方法の開発が望まれる。
【００１１】
核酸ハイブリダイゼーションは、標的核酸分子についての識別可能な特徴を検出するために使用される。「サザン分析」のような技術が、当業者に周知である。標的核酸は、電気泳動で分離された後、膜に結合される。 次いで、標識されたプローブ分子は、本分野で周知の技術を用いて、膜に結合された核酸にハイブリダイズされる。検出の感度は標的材料の量及びプローブの特異的活性に依存するので、本方法には限界がある。プローブの特異的活性は不変であり得るので、これらのアッセイの感度を向上させるために、核酸を増幅する方法が使用される。核酸増幅技術については、標的コピーの数を増幅した後に検出の感度を増加させるか、又は検出のために生じたシグナルを増加するために核酸の存在を使用するという２つの基本的な戦略が使用される。第一のアプローチの例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル（米国特許第５，８５４，０３３号参照）及び核酸系に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。第二の例には、ＣＰＲと呼ばれるサイクリングプローブ反応（米国特許第４，８７６，１８７号及び米国特許第５，６６０，９８８号参照）及びＳＮＰアーゼアッセイ、例えば、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（米国特許第５，６５６，４３０号及び米国特許第５，７６３，１７８号を参照）が含まれる。
【００１２】
ＰＣＲ反応は当業者に周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号に最初に記載された。本方法は、核酸を変性すること、ハイブリダイゼーション工程及び伸長工程の反復サイクルを含み、核酸試料及び試薬の温度の変化させることによって実施される。異なる温度へ試料を供する本方法は、異なる温度の水槽中にチューブを配置することにより、又は米国特許第５，３３３，６７５号及び米国特許第５，６５６，４９３号に記載されているように、電流の方向に応じて加熱若しくは冷却を生成することができるペルチェを基礎とした装置を使用することにより実施することができる。多くの市販の温度サイクル装置が入手可能であり、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆによって販売されている。これらの装置は一般的に大きく且つ重いので、非研究室環境、例えば看護の場所で使用するには一般に適していない。
【００１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための微細加工された装置が米国特許第５，６３９，４２３号に記載されているが、核酸を抽出するための一体化された手段を提供することに関しては触れていない。ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための装置が米国特許第５，６４５，８０１号に記載されており、該装置は検出用チャンバーに対して密閉可能な様式で結合することが可能な増幅チャンバーを有する。米国特許第５，９３９，３１２号は、小型化されたマルチチャンバーポリメラーゼ連鎖反応装置を記載している。米国特許第６，０５４，２７７号は、増幅及び検出用の、シリコンを基礎とした小型遺伝検査プラットフォームを記載している。ポリマーをベースとした増幅反応用加熱コンポーネントが米国特許第６，４３６，３５５号に記載されている。米国特許第６，３０３，２８８号は、増幅用試薬を含有する破裂可能な小袋を有する増幅及び検出システムを記載している。米国特許第６，３７２，４８４号は、一体化された装置中でポリメラーゼ連鎖反応並びにこれに続くキャピラリー電気泳動分離及び検出を実施するための装置を記載している。
【００１４】
反応が単一温度で実施されるという点でＰＣＲ反応とは異なる幾つかの核酸増幅技術が存在する。これらの等温法には、プローブ反応、鎖置換、ＩｎｖａｄｅｒＴＭ、ＳＮＰアーゼ、ローリングサークル反応及びＮＡＳＢＡを繰り返すことが含まれる。米国特許第６，３７９，９２９号は、等温核酸増幅反応を実施するための装置を記載している。
【００１５】
より最近では、等温的にポリメラーゼ連鎖反応を実施するための戦略が「Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ｖｏｌ ５（８）」によって記載されており、米国特許出願２００４００５８３７８号も参照されたい。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅を実施するために試料を加熱することの制約を克服するためにＤＮＡヘリカーゼ酵素が使用される。
【００１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用される酵素
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、幾つかの中核的特徴を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素の能力に基づいており、この能力には、３’−ヒドロキシル基を有するプライマー及びＤＮＡテンプレート配列を使用する能力及びテンプレート鎖を用いてＤＮＡの新たに合成された鎖を伸長する能力が含まれ、全て当業者に周知である。さらに、ＰＣＲ反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡテンプレートを変性するために使用される高温（例えば９０ないし９９℃）に耐えることができなければならず、及びＤＮＡプライマーがＤＮＡテンプレートにハイブリダイズするより低い温度（例えば、４０ないし６０℃）で不活性でなければならない。さらに、ハイブリダイゼーション温度（例えば、６０ないし８０℃）に近い温度で最適なＤＮＡ合成を有すること。
【００１７】
さらに、これらの中核的な特徴に加え、ＤＮＡポリメラーゼは、多くのＤＮＡポリメラーゼに固有の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に起因する校正能力も示す。末端の３’ヌクレオチドが標準的な核酸プライマーから切り出され、両対立遺伝子の合成が可能となるので、ＰＣＲを用いた識別的プライマー伸長（３’対立遺伝子特異的プライマー伸長とも称される。）に基づく一塩基多型（ＳＮＰ）検出においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す酵素を使用することは不利である。
【００１８】
「Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００３， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ｖｏｌ ８３（８）：１１４７）」は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対して使用されるＤＮＡポリメラーゼの制約を克服するための、末端ホスホロチオアート結合の使用について記載している。ホスホロチオアート結合は、３’−５’エキソヌクレアーゼによって切断されない。これにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは末端のミスマッチの除去及びＤＮＡ伸長を伴う進行、正常なＤＮＡで観察される区別の欠如の軽減ができなくなる。
【００１９】
ＤＮＡポリメラーゼの別の特徴は、それらの伸長速度である。「Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ６３（１１）：４５０４）」は、ピロコッカス種の株ＫＯＤ１（現在、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）及びサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）が、それぞれ、１０６ないし１３８、２５、２３及び６１塩基／秒の伸長速度を有することを教示する。これらの酵素の加工速度も記載されており、伸長速度と同様に挙動する。明らかに、サーモコッカス・コダカエレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｅｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１は、他の周知の酵素に比べて、ずっと高い伸長及び加工速度を有しており、このため、感度と速度が重要事項である用途において、本酵素は有益なものとなる。さらに、サーモコッカス・コダカエレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｅｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１は、ＳＮＰ分析に対して使用される３’−対立遺伝子特異的プライマー伸長アッセイにおいて使用する場合に有害であるエキソヌクレアーゼ活性を有している。
【００２０】
合成オリゴヌクレオチドの設計
増幅反応において使用するための合成オリゴヌクレオチドの設計に関しては、「Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ １７（２１）：８５４３−８５５１）」及び「Ｒｙｃｈｌｉｋ （１９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ３：１２９−１３４）」は、ＤＮＡのインビトロ増幅用プライマーなどの、プローブ及びプライマーを設計するための選択基準及びコンピュータプログラムについて記載さしている。何れも、プライマーは、二次構造を生成すべきでなく、又は自己ハイブリダイゼーションを示すべきでないことを教示している。
【００２１】
分子ビーコンとして設計されたＰＣＲプライマー（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ ９６：６１７１−６１７６）は、ドナー及び消光分子を互いに物理的に近接して配置することによって蛍光シグナルを消光するために、ヘアピンループ構造として知られる相補的な生成である短い領域を５’及び３’両末端に有する。重合及び新たに合成された２本鎖分子中への取り込み後、ドナー分子及び消光分子は、互いに物理的に離れて、蛍光シグナルの生成が可能となる。相補性の領域は短く、典型的には、相補的である約５ヌクレオチドを有するに過ぎず、好ましくはヘアピンステムを生成する。「Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ３１（４）：１３１９−１３３０」は、より長いステム長を有する分子ビーコンが、より広い温度範囲にわたって、標的間を識別する向上した能力を有することを教示している。しかしながら、これには、分子ビーコン−標的ハイブリダイゼーションの速度の減少が伴う。より長いプローブ長を有する分子ビーコンは、より低い解離定数、増加した速度論的速度定数及び減少した特異性を有する傾向がある。従って、より長いステムループを有することは、ハイブリダイゼーション速度論の効率性を低下させる影響を有しており、次いで、これは、ＰＣＲ増幅のレベルを低下させる。従って、ステムループ構造を使用するＰＣＲは、一般的には、本分野において望ましくない。「Ｋａｂｏｅｖ ｅｔ ａｌ．， （２０００， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ２８（２１）：ｅ９４）」は、３’末端に対して相補的であるプライマーの５’末端に追加配列を付加することによって、ステムループ構造を有するＰＣＲプライマーを設計することを教示している。本参考文献は、この二次構造を追加することがＰＣＲ反応の特異性を増加させるが、一本鎖尾部の生成を可能とするＰＣＲプライマーを使用することも教示している。さらに、Ｋａｂｏｅｖは、二次構造の生成が一本鎖領域の捕捉部分へのハイブリダイゼーションを妨害することを教示していない。
【００２２】
検出方法
核酸分析中の最後の工程のための慣用の検出方法が本分野において周知であり、放射能、比色分析、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）及び電気化学に基づくサンドイッチ型の捕捉方法が含まれる。例えば、共有米国特許第５，０６３，０８１号は、核酸検出用センサーを取り上げている。本センサーは、電極上に選択透過性の層及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有するタンパク質性のパターン化された層を有する。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの活性な断片又はサブユニット又は一本鎖であり得る。核酸を固定化するためのカップリング手段は、固定化された核酸プローブが試料中の相補的標的配列に結合する方法とともに記載されている。
【００２３】
検出は、好ましくは、電気化学的であり、標的の異なる領域にも結合する標識されたプローブに基づく。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質とともに、プローブ及びポリヌクレオチド配列によって形成されるハイブリッドに対する固定化された抗体を使用することが可能である。’０８１特許は、センサーを用いて試料中でアッセイを実施するための使い捨てカートリッジを取り上げる共有米国特許第５，０９６，６６９号を参照により組み込む。これらのセンサーは、’０８１に記載されている種類のセンサーであり得る。
【００２４】
’０８１に関連する他の分割特許には、核酸成分であり得るリガンド受容体で被覆された選択透過性膜を用いて複数のセンサーを製造する方法を取り上げている米国特許第５，２００，０５１号が含まれる。米国特許第５，５５４，３３９号は、分配のための、フィルム形成ラテックス又はタンパク質性の光形成可能なマトリックス中に核酸成分が取り込まれる、微量分配を取り上げる。米国特許第５，４６６，５７５号は、フィルム形成ラテックス又はタンパク質性の光形成可能なマトリックス中に取り込まれた核酸成分を有するセンサーを作製するための方法を取り上げる。米国特許第５，８３７，４６６号は、核酸成分などのセンサー成分を用いてリガンドをアッセイするための方法を取り上げる。例えば、標的がセンサー上の受容体に結合し、及び標識されたプローブによっても標的が結合される定量的オリゴヌクレオチドアッセイが記載されている。本標識は、センサー、例えば電気化学的センサーによって検出されるシグナルを生成することが可能である。米国特許第５，８３７，４５４号は、核酸成分であり得るリガンド受容体で被覆された選択透過性膜を用いて複数のセンサーを製造する方法を取り上げる。最後に、共有米国特許第５，４４７，４４０号は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対して適用可能な凝固アフィニティーに基づくアッセイを取り上げる。これらの共有特許は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２５】
共有米国特許第５，６０９，８２４号は、試料（例えば、血液）を３７℃になるように温度制御するために適用することができる使い捨てカートリッジ内で使用するための温度制御されたチップを開示していることは注目に値する。共有米国特許第６，７５０，０５３号及び係属中の米国特許公開２００３０１７０８８１は、ＤＮＡ分析を含む様々な検査に適した使い捨てカートリッジの機能的流動性要素について取り組む。これらの更なる共有特許及び出願は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
幾つかの他の特許は、核酸の電気化学的検出に取り組んでおり、例えば、米国特許第４，８４０，８９３号は、媒介物質、例えばフェロセンを使用する酵素標識を用いた検出を開示している。米国特許第６，３９１，５５８号は、電圧パルスの終了時に電極によってレポーター基が検出され、レポーター基が電極上の金粒子及びビオチン固定化を使用する、標的へ結合する電極上の一本鎖ＤＮＡを開示している。米国特許第６，３４６，３８７号は、別の媒介物質アプローチを開示しているが、遷移金属媒介物質が通過することができる電極上に膜層を有する。米国特許第５，９４５，２８６号は、インターカレート分子を用いた電気化学に基づいている。米国特許第６，１９７，５０８号は、負の電圧に続いて正の電圧を用いて２本鎖を形成するために、核酸の一本鎖をアニールすることについて開示している。類似の特許には、二本鎖ＤＮＡの電気化学的変性を開示する米国特許第５，８１４，４５０号、米国特許第５，８２４，４７７号、米国特許第５，６０７，８３２号及び米国特許第５，５２７，６７０号が含まれる。米国特許第５，９５２，１７２号及び米国特許第６，２７７，５７６号は、酸化還元基で直接標識されたＤＮＡを開示している。
【００２７】
幾つかの特許は、核酸分析を実施するための、カートリッジを基礎とした装備又は装置の考案について取り組んでおり、これらには、例えば、変性装置（米国特許第６，４８５，９１５号）、一体化された流体操作カートリッジ（米国特許第６，４４０，７２５号）、微少流体システム（米国特許第５，９７６，３３６号）並びに分離及び増幅用マイクロチップ（米国特許第６，５８９，７４２号）が含まれる。
【００２８】
先述の記載に基づき、核酸検査を実施することができる便利で、携帯可能な分析システムに対する要求が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許第５，８０７，５２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１６８，９２２号明細書
【特許文献３】米国再発行特許発明第３７，８９１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５４，０３３号明細書
【特許文献５】米国特許第４，８７６，１８７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６６０，９８８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５６，４３０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，７６３，１７８号明細書
【特許文献９】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，３３３，６７５号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，６５６，４９３号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６３９，４２３号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，６４５，８０１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９３９，３１２号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，０５４，２７７号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，４３６，３５５号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，３０３，２８８号明細書
【特許文献１８】米国特許第６，３７２，４８４号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，３７９，９２９号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００４／００５８３７８号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，０６３，０８１号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，０９６，６６９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，２００，０５１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，５５４，３３９号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，４６６，５７５号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，８３７，４６６号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，８３７，４５４号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，４４７，４４０号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，６０９，８２４号明細書
【特許文献３０】米国特許第６，７５０，０５３号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号明細書
【特許文献３２】米国特許第４，８４０，８９３号明細書
【特許文献３３】米国特許第６，３９１，５５８号明細書
【特許文献３４】米国特許第６，３４６，３８７号明細書
【特許文献３５】米国特許第５，９４５，２８６号明細書
【特許文献３６】米国特許第６，１９７，５０８号明細書
【特許文献３７】米国特許第５，８１４，４５０号明細書
【特許文献３８】米国特許第５，８２４，４７７号明細書
【特許文献３９】米国特許第５，６０７，８３２号明細書
【特許文献４０】米国特許第５，５２７，６７０号明細書
【特許文献４１】米国特許第５，９５２，１７２号明細書
【特許文献４２】米国特許第６，２７７，５７６号明細書
【特許文献４３】米国特許第６，４８５，９１５号明細書
【特許文献４４】米国特許第６，４４０，７２５号明細書
【特許文献４５】米国特許第５，９７６，３３６号明細書
【特許文献４６】米国特許第６，５８９，７４２号明細書
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｖｏｌ ２０４（３）：２８２
【非特許文献２】Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ，ｖｏｌ ３６４（９４４０）：１１６７
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ５２（２）：１０１
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”
【非特許文献５】Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ ５（８）
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｖｏｌ ８３（８）：１１４７）
【非特許文献７】Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ６３（１１）：４５０４）
【非特許文献８】Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ １７（２１）：８５４３−８５５１）
【非特許文献９】Ｒｙｃｈｌｉｋ （１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ３：１２９−１３４）
【非特許文献１０】Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，ｖｏｌ ９６：６１７１−６１７６
【非特許文献１１】Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ３１（４）：１３１９−１３３０
【非特許文献１２】Ｋａｂｏｅｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２８（２１）：ｅ９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
発明の目的
本発明の目的は、抽出、増幅及び検出を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、光学的及び電気化学的検出を有する一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、フィルター抽出に基づく、又は水性流体と非混和性の層を通じた粒子輸送に基づく抽出工程を有する一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、抽出及び増幅を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、増幅及び検出を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３６】
本発明の目的は、リーダー装置と共同で作動する一体化された核酸検査用カートリッジを提供することである。
【００３７】
本発明の目的は、ベッドサイド、医師の職場及び伝統的に検査が実施される研究室環境から離れたその他の場所で実施される分析に適した、一体化された核酸検査システム及び方法を提供することである。
【００３８】
本発明の目的は、水性流体と非混和性である層を通じた粒子輸送を含む精製工程を有する試料から核酸を抽出する装置及び方法を提供することである。
【００３９】
本発明の目的は、増幅前に溶出工程を有する、フィルターを基礎とする試料からの核酸抽出の装置及び方法を提供することである。
【００４０】
本発明の目的は、遺伝的分析を行うための装置中に組み込むのに適した試料から核酸を分離するための単純な方法及び構成要素を提供することである。
【００４１】
本発明の目的は、核酸検査カートリッジと統合可能な、増幅後におけるアンプリコンからのプライマーの電気泳動分離を提供することである。
【００４２】
本発明の目的は、最短時間で多くの合成を与えるＤＮＡポリメラーゼ酵素、従って、１００塩基／秒を超える伸長速度又は３００塩基を超える加工速度を有するＤＮＡポリメラーゼを提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、短い期間に、小型サーモサイクラー装置中において機能するＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４４】
本発明は、核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、（ａ）収容部と；（ｂ）標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口と；（ｃ）標的核酸を抽出するための試薬を含有する、前記入口に作動可能に接続された第一のチャンバーと；（ｄ）増幅条件を制御するための加熱手段及び温度検知手段を含む増幅チャンバー中を抽出された核酸が通過できるようにする第一の伝導路と；（ｅ）前記増幅チャンバーへ作動可能に連結されており、及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路と、を含み、前記収容部が、（ｉ）検出可能な標識を増幅された核酸標的中に取り込むことができる増幅試薬と、及び（ｉｉ）前記増幅された核酸標的を前記検知領域へ移動させて、前記増幅された標的の前記捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を可能とするための手段を含有し、並びに前記第二の伝導路が、前記検知領域から捕捉されていない増幅された標的を実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された前記検出可能な標識を検知することができる保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、前記装置を含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明は、核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、（ａ）収容部と；（ｂ）標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口と；（ｃ）第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、前記入口へ作動可能に接続された第一のチャンバーと（前記第一のチャンバーは、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋又は油ろ過層を形成するための蝋又は油ろ過材料も含有し、抽出された標的核酸を伴う磁気ビーズは、付与された磁場を用いることにより、蝋層を通して第一の伝導路中に通過することができ、前記第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの増幅チャンバー中への通過を可能とし、前記収容部は、検出可能な標識を増幅された核酸標的中に取り込むことが可能な増幅試薬を含有し；前記増幅チャンバーは増幅条件を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有する。）、（ｄ）前記増幅チャンバーへ作動可能に連結されており、及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路と、を含み、（ｉ）前記収容部が、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とする手段を含み、及び（ｉｉ）前記第二の伝導路が、捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、前記装置を含む。
【００４６】
本発明は、好ましい組織源として血液を使用したときに、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ反応の公知の阻害剤を除去するための新規抽出操作を示す。本操作は、十分に単純であるので、典型的な研究室環境の外部で遺伝的分析を行うための装置中に組み込むことが可能である。この新規操作は市販のキット由来の構成要素を使用することが可能であるが、抽出過程の時間を著しく簡略化し、低減する新規プロトコールが開示されている。新規プロトコールは、看護の場所での迅速な核酸診断検査のための全血の初期プロセッシングに対して容易に適合させることが可能である。
【００４７】
本発明の装置及び方法は、化学的に含浸された固体基材技術を、時間を都合よく最小限に抑えるためのろ過装置及び低容量の体液から得られたゲノムＤＮＡの増幅可能な量を抽出するための資源に結合することによって、既存の技術水準を著しく向上させる。 上述のように、本技術は、ＤＮＡ単離、増幅及び検出のための使い捨て可能なカートリッジ装置で使用するのに特に適している。
【００４８】
本発明は、とりわけ、看護の地点での診断検査のための機会を増大させる、すなわち、血液又は口腔細胞などの利用しやすい少量の体液を用いて、迅速、安価且つ便利な検査に取り組む。
【００４９】
体液、好ましくは血液又は口腔綿棒から、１０−４０μＬの容積で、増幅可能なゲノムＤＮＡ試料を抽出及び単離するための信頼性が高く、再現性のある装置及び方法が、磁気粒子分離及びフィルター結合に基づいて開示されている。これらの装置及び方法は、抽出のみのために個別に、または検査装置中に組み込まれて使用され得る。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明は、好ましい組織源として血液を使用したときに、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ反応の公知の阻害剤を除去するための新規抽出手順を示す。本操作は、典型的な研究室環境の外部で遺伝的分析を行うための装置中に統合できるほど十分に単純である。この新規操作は市販のキット由来の構成要素を使用することが可能であるが、抽出過程の時間を著しく簡略化し、低減する新規プロトコールが開示されている。新規プロトコールは、看護の場所での迅速な核酸診断検査のための全血の初期プロセッシングに対して容易に適合させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、溶解緩衝液層、蝋層及び磁気ビーズを用いた、チューブ中での核酸精製を示している。
【図２】図２は、ビーズなし及びビーズあり、並びに血液あり及び血液なしのＰＣＲ産物、並びに精製されたＤＮＡ対照のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図３】図３は、ビーズ及び血液ありのＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図４Ａ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｂ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｃ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｄ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図５】図５は、フィルターから単離された口腔綿棒標本試料のＰＣＲ増幅を示している。
【図６】図６は、一体化された使い捨て装置及び機器とのその相互作用の幾何学的表示を示している。
【図７Ａ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図７Ｂ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図７Ｃ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図８Ａ】図８（ａ）は、ＰＣＲ＋抱合体及び抱合体単独に対する典型的な経時電流測定の出力を示しており、図８（ｂ）は、対照＋抱合体及び抱合体のみに対する典型的な経時電流測定の出力を示している。
【図８Ｂ】図８（ａ）は、ＰＣＲ＋抱合体及び抱合体単独に対する典型的な経時電流測定の出力を示しており、図８（ｂ）は、対照＋抱合体及び抱合体のみに対する典型的な経時電流測定の出力を示している。
【図９Ａ】図９（ａ）は、異なるアンプリコン濃度の経時電流測定を示し、図９（ｂ）は、定常状態電流シグナル対アンプリコン数のプロットを示している。
【図９Ｂ】図９（ａ）は、異なるアンプリコン濃度の経時電流測定を示し、図９（ｂ）は、定常状態電流シグナル対アンプリコン数のプロットを示している。
【図１０】図１０は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に対する模式図を示している。
【図１１】図１１は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）に対する模式図を示している。
【図１２Ａ】図１２（ａ）−（ｂ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための電気泳動構成要素の２つの投影図を示している。
【図１２Ｂ】図１２（ａ）−（ｂ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための電気泳動構成要素の２つの投影図を示している。
【図１３Ａ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｂ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｃ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｄ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｅ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｆ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｇ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１４】図１４は、第二の電気泳動ゲルによって確認された、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素（図１３に示されている）を用いたプライマー及びアンプリコンの電気泳動分離を示している。
【図１５】図１５は、ＣＬＡＭ様の特徴を欠くオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
【図１６Ａ】図１６（ａ）は、ＣＬＡＭ１プライアマーを示しており、図１６（ｂ）はＣＬＡＭ２プライマーを示している。
【図１６Ｂ】図１６（ａ）は、ＣＬＡＭ１プライアマーを示しており、図１６（ｂ）はＣＬＡＭ２プライマーを示している。
【図１７Ａ】図１７（ａ）は、光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示しており、図１７（ｂ）は、検知領域が光源による検出を可能とするキュベット機構であり、及び装置中に一体化された検出装置である、光学的使い捨てカートリッジを示している。
【図１７Ｂ】図１７（ａ）は、光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示しており、図１７（ｂ）は、検知領域が光源による検出を可能とするキュベット機構であり、及び装置中に一体化された検出装置である、光学的使い捨てカートリッジを示している。
【図１８】図１８は、核酸検査用使い捨てカートリッジ中に組み込まれたフィルター領域を含有する抽出装置を示している。
【図１９】図１９は、増幅及び検出要素と合体させることができる分離した抽出要素を有する２つの部分からなるカートリッジを示している。
【図２０】図２０は、抽出及び増幅要素と合体させることができる分離した検出要素を有する２つの部分からなるカートリッジを示している。
【図２１Ａ】図２１（ａ）は、分離された状態にあるカートリッジと装置を示しており、図２１（ｂ）は装置中に挿入されたカートリッジを示している。
【図２１Ｂ】図２１（ａ）は、分離された状態にあるカートリッジと装置を示しており、図２１（ｂ）は装置中に挿入されたカートリッジを示している。
【図２２】図２２は、光学的検出化学の例を示している。
【図２３】図２３は、シリコンチップが抽出及び増幅チャンバーを形成する壁の一つを与える抽出及び増幅要素を示している。
【図２４】図２４は、増幅後に未使用プライマーの電気泳動分離を有する使い捨て装置を示している。
【図２５Ａ】図２５（ａ）−（ｂ）は、さらなる増幅及び検出のための「誘発現象」を生成する切断反応を示している。
【図２５Ｂ】図２５（ａ）−（ｂ）は、さらなる増幅及び検出のための「誘発現象」を生成する切断反応を示している。
【図２６】図２６は、変異及び野生型ＳＮＰ配列を識別するＰＣＲ増幅法の模式図を示している。
【図２７】図２７は、血色素症検査から得られる可能性があるシグナルの結果の表を示している。
【図２８Ａ】図２８（ａ）−（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図を示している。この抽出及び増幅装置は、検出カートリッジに取り付ける。
【図２８Ｂ】図２８（ａ）−（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図を示している。この抽出及び増幅装置は、検出カートリッジに取り付ける。
【図２９Ａ】図２９（ａ）−（ｂ）は、対照オリゴヌクレオチドの量に比べて増加するシグナルの比較を示している。
【図２９Ｂ】図２９（ａ）−（ｂ）は、対照オリゴヌクレオチドの量に比べて増加するシグナルの比較を示している。
【図３０Ａ】図３０（ａ）−（ｂ）は、野生型と血色素症の変異ＳＮＰ配列を識別するカートリッジの能力を示している。
【図３０Ｂ】図３０（ａ）−（ｂ）は、野生型と血色素症の変異ＳＮＰ配列を識別するカートリッジの能力を示している。
【図３１】図３１は、ＥｘｏＩ酵素が、約６−７ヌクレオチド長まで分子量を低下させることができる活性な３’−＞５’エキソヌクレアーゼであることを示す３２Ｐ放射線標識された合成オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフを示している。
【図３２Ａ】図３２（ａ）は、１０％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて、ｗｔ／ｍｕｔＤＮＡテンプレートを識別するホスホロチオアートプライマーを用いるＰＣＲを示している。各ウェル中に負荷された６μＬ試料＋１．６μＬのＬＤ−＞６μＬ（４５分のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色、光陰性、実験ＨＦＥ８４−２、Ｔｈｙｂ６８℃。７つのカラムには、以下のように負荷した。１野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的なＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；２変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；３ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド；４野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；５変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；６ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド並びに７ 野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する両選択的ＰＣＲプライマー、一切バンドを生成しない。図３２（ｂ）は、関連する経時電流測定プロットを示している。
【図３２Ｂ】図３２（ａ）は、１０％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて、ｗｔ／ｍｕｔＤＮＡテンプレートを識別するホスホロチオアートプライマーを用いるＰＣＲを示している。各ウェル中に負荷された６μＬ試料＋１．６μＬのＬＤ−＞６μＬ（４５分のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色、光陰性、実験ＨＦＥ８４−２、Ｔｈｙｂ６８℃。７つのカラムには、以下のように負荷した。１野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的なＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；２変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；３ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド；４野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；５変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；６ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド並びに７ 野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する両選択的ＰＣＲプライマー、一切バンドを生成しない。図３２（ｂ）は、関連する経時電流測定プロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
磁気粒子に基づく核酸分離法及び装置
本開示は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を実施するという主要な目的のために、全血からゲノムＤＮＡを単離するための迅速で、簡易なプロトコールを示す。本方法は、従来技術の迅速ＤＮＡ抽出プロトコールに認められたＰＣＲの一般的な阻害剤（例えば、ヘモグロビン）の著しい減少を示すという利点を有している。血液試料において、キレート剤、ヘパリン、ＥＤＴＡ及びシトラートなどの添加された抗凝固試薬も、阻害剤として作用し得る。本方法は、これらの阻害剤及び天然に存在する他のキレート剤並びに核酸テンプレートを損傷し得る酵素及びタンパク質を除去する。本技術は、他の核酸材料源（例えば、口腔綿棒標本、尿及び他の組織試料）に対しても適用可能であり、他の増幅方法と一緒に使用することもできることに留意することが重要である。
【００５３】
例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄキット（Ｐｒｏｄ．Ｎｏ． ６３４．０２， Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）及び米国特許公開２００３／０１８０７５４Ａ１に見出される核酸抽出に３０−４０分を要する従来技術と比べて、本発明の方法は、再現可能なＤＮＡ抽出に必要とされる時間を約５分未満まで、好ましく及び典型的には、約２分まで短縮する。結果が得られる速さが重要である遺伝的分析（例えば、高度に感染性の因子の同定）を考える場合、これは重要な改善である。患者から試料を取得し、医師が一度訪れる間に結果をもたらすことが望ましい、医師の職場環境中での検査、又はベッドサイドでの検査にさえ適用することも可能である。
【００５４】
本発明の方法は、好ましくは、内側の核が常磁性材料である被覆されたビーズ並びに溶解及び結合緩衝液を使用する。ゲノムＤＮＡを含有する溶解された細胞溶液が好ましい実施形態のビーズと混合されると、ビーズ上の表面化学は、強い負の表面電荷のために、低い特異性でＤＮＡを弱く結合するため、ビーズーＤＮＡ複合体を生成する。好ましい表面コーティングは、カルボン酸で被覆された表面であり、常磁性ビーズは、典型的には、２．８μｍの直径を有するが、約０．１ないし１００μｍの直径範囲のビーズを使用することが可能である。ビーズ用の別の陰イオン性コーティングには、極めて小さな直径のガラスビーズ（例えば、Ｇｌａｓｓ Ｍｉｌｋ）、Ｗｈａｔｍａｎホスホセルロース及びＤＥＡＥ樹脂（例えば、ＤＥ５２）を含む以下の材料が含まれる。
【００５５】
非磁気ビーズを使用し得るが、磁気ビーズは反応容器の側面に引き付けることができ、磁石を用いて側面に対して固定することができるので、磁気ビーズを使用することが確かに有利である。これは、短時間のうちに起こることが可能であり、ビーズを１つの位置に濃縮するための手段を提供し、並びにビーズを移動及び操作するための手段を提供する。磁場は、本分野において周知であるように、永久磁石によって、又は電磁石手段によって付与し得る。
【００５６】
標準的なポリプロピレンＰＣＲチューブを使用する例では、水６０−１００重量％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１０−３０％、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）５−１０％、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１−５％、ドデシル硫酸リチウム（ＬｉＤＳ）０．１−１％、ＥＤＴＡ０−１％及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）０−０．１％を含有する標準的な溶解緩衝液（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）は、０．６５Ｍの最終アルカリ濃度のＮａＯＨ試薬を含むように改変された。本分野で公知の他の溶解緩衝液も、塩基、例えばＮａＯＨの適切な添加とともに使用し得る。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（２３μＬ）を加えたアルカリ修飾された溶解緩衝液へ、全血（１０μＬ）を直接添加した。これにより、手動ピペット混合の約１５秒、続いて、ゲノムＤＮＡをビーズ上に吸着させるための留置時間約１５秒内に血液細胞の溶解が誘導された。次いで、永久磁石で、チューブの側面に対してビーズ−ＤＮＡ複合体を捕捉したが、これは、約１５秒未満を要する。次いで、ピペットにより、溶解された細胞の全上清を除去した。ピペットによって、洗浄緩衝液（５０μＬ）、例えばＤｙａｎｌ洗浄緩衝液（Ｄｙｎａｌキットから得られる。）を導入し、チューブ壁に対して捕捉されたビーズ−ＤＮＡペレットを濯ぐために使用した。次いで、残ったペレットをチューブ壁に対して細くしながら、ピペットにより、洗浄溶液を完全に除去した。次いで、残存するビーズ−ＤＮＡペレット（１−２μＬ等容量）を除去し、鉱物油の重層（約１０μＬ）とともに、ポリメラーゼ酵素、プライマー、ｄＮＴＰ及び緩衝液を含むＰＣＲカクテル（約２５μＬ）を加えた新しいチューブに添加し、慣用のサーモサイクラー中に配置した。この抽出プロセスの合計時間は、約２分であることが明らかとなった。この新しい精製プロトコールは、抽出物中に残存するＰＣＲ反応の阻害剤に伴う問題を克服することが以下で示されていることに留意されたい。
【００５７】
好ましい実施形態において、抽出方法は、アルカリ溶解緩衝液、磁気ビーズを使用し、蝋又は油ろ過媒体も使用する。同じく、本方法は、本明細書に記載されているように、手動操作として実施することも可能であり、又は使い捨て装置中での自動化された分析の基礎として実施することも可能である。溶解された細胞ビーズ−ＤＮＡ複合体を重層するろ過媒体として、蝋又は油を使用することによって、さらなる流体移動が不要となり、ビーズ−ＤＮＡ複合体の精製を補助した。例えば、血液を溶解緩衝液及びビーズと合わせ、得られたＤＮＡ−ビーズ複合体をペレットで採取し、永久磁石を用いて上方のろ過層を通じて引き付け、このようにして、溶液のバルクから複合体を選択的に分離する。これは、図１に詳細に記されている。
【００５８】
図１は、チューブ１が溶解緩衝液３及び磁気ビーズ４の上に蝋ろ過媒体２を含有することを示している。典型的には、チューブは、周囲温度で保存されるので、まず、蝋を融解するためにチューブは加熱される。一般的に、これは、約３５℃超への温度変化である。ピペット６を用いて血液５を導入し、細胞が緩衝液中で溶解するように、血液をよく混合する。次いで、核酸７は、非特異的な表面結合を介してビーズに結合する。次いで、ビーズ及び若干の余分な溶解された材料及び緩衝液を、チューブの側面に引き付けるために磁石８を使用して、ペレットを形成させる。次いで、蝋層の上方向を通じてペレットを引き付けるために、磁石をチューブの側面に沿って移動させる。蝋のより大きな表面張力によって過剰な水性流体が取り除かれるので、これは効果的にペレットをろ過することが驚くべきことに見出された。場合により、この工程の後に、熱を取り除くことによって、蝋は、再度硬化させ得る。得られたビーズ−核酸ペレットは、チューブの側面で容易に接近可能な蝋の薄層中に捕捉された状態を保つが、一方、溶解緩衝液及び血液は蝋の下に捕捉された状態を保つ。次いで、チューブの側面から、ビーズ−核酸ペレットを除去し、ＰＣＲカクテルが存在する新しいチューブに導入することができる。８０℃を上回る温度の水が溶出に十分であることが明らかとなっているので、核酸は、ＰＣＲの最初の加熱サイクルの間にビーズから溶出される。ビーズも、蝋もＰＣＲを妨害しないことも明らかとなった。
【００５９】
本願のための蝋の理想的な特徴には、２５℃と４５℃の間で固体から液体へと融解する蝋が含まれる。さらに、これらの好ましい蝋は、６０℃ないし９０℃の範囲の温度で著しく蒸発しない。これらの蝋が固体である場合には、これらの蝋は、これらの蝋の存在によって捕捉されているビーズ及びその他の溶液の移動を妨げるが、これらの蝋が液体状態である場合には、それらの粘度は、磁場の下で磁気ビーズの通過を可能とするほど十分に低い。蝋は、ＤＮＡ増幅用試薬と適合性であるという特性も有する。本発明において使用することが可能な蝋の４つの例は、ヘネイコサン（９８％、融点４０−４２℃、Ｓｉｇｍａ）、ドコサン（９９％、融点４３−４５℃、Ｓｉｇｍａ）、トリコサン（９９％、融点４８−５０℃、Ｓｉｇｍａ）及びトリコサヘネイコサンである。好ましい蝋は、ヘネイコサンである。ビーズが通過する障壁層を形成するために使用することが可能なその他の有機液体には、シリコーン油及びメシチレンが含まれる。
【００６０】
図２は、蝋プロセスを通じて移動するビーズを用いて、精製されたＤＮＡ試料が血液から首尾よく除去されることを示しており、予期されるバンド（レーン２に合致するゲルレーン５及び６）が存在する。本図は、ビーズなし及びビーズあり、並びに血液あり及び血液なしのＰＣＲ産物、並びに精製されたＤＮＡ対照のポリアクリルアミドゲルを示している。「＊」で標識されたバンドは、公知の野生型対立遺伝子ＡＣＤ血液チューブ試料に対して調製された、修飾された野生型血色素症オリゴヌクレオチドプライマー組を用いた対称ＰＣＲに対する予想される塩基対の長さを表していることに留意されたい。陽性対照（レーン２）は、試料調製用のＱｉａｇｅｎ市販キットを用いて精製されたゲノムＤＮＡ（野生型対立遺伝子）も表し、及び陰性対照（レーン１）は、ＰＣＲカクテルにＤＮＡが添加されていない。本例では、鉱物油のオーバーレイを有する慣用のサーモサイクラー中で、３０サイクルを用いてＰＣＲを行った。図２に示されているように、ローディング色素２μＬを加えた試料１０μＬの容量を、１０％非変性ポリアクリルアミドゲル、１×ＴＢＥ緩衝液の各ウェル中に添加した。
【００６１】
図３は、蝋プロトコール（ゲルレーン１−４）を通過して移動するビーズを使用して、精製されたＤＮＡが血液から首尾よく除去されることを、フィルター媒体として蝋を使用しないプロトコール（ゲルレーン５）と比較対照したものである。「＊」で標識されたバンドは、公知の野生型対立遺伝子ＡＣＤ血液チューブ試料に対して調製された、修飾された野生型血色素症オリゴヌクレオチドプライマー組を用いた対称ＰＣＲに対する予想される塩基対の長さを表している。鉱物油の重層を有する慣用のサーモサイクラー中で、３０サイクルを用いてＰＣＲを行った。図３に示されているように、ローディング色素２μＬを加えた試料１０μＬの容量を、１０％非変性ポリアクリルアミドゲル、１×ＴＢＥ緩衝液の各ウェル中に添加した。
【００６２】
上記記述によって示された原理は、図１に示されている種類の手動操作に基づいて、各核酸抽出装置中に取り込むことができ、又は使用者が試料を装置に添加する必要があるだけで、その他の全ての工程が自動で行われる下記のような自動装置に取り込むことができる。
【００６３】
吸収性フィルターに基づく核酸分離法及び装置
体液中に見出される核酸を迅速に抽出及び単離するための別のアプローチが提供される。本アプローチは、フィルター材料の使用に基づく。開示されている装置及び方法は、化学的に含浸された固体基材技術を小型ろ過装置に結合させることによって、既存の技術を著しく改善する。小容量の体液から得られるゲノムＤＮＡの増幅可能量を抽出するための時間も都合よく最小化される。本装置は個別の分離装置として使用し得るが、ＤＮＡ単離、増幅及び場合により検出のための使い捨て可能なカートリッジ装置中に組み込むのに特に適している。
【００６４】
各装置は、例えば、血液又は口腔細胞などの流体の小容量を採取し、増幅に適したＤＮＡを素早く単離するための迅速な手段として臨床環境及び研究環境において使用することが可能である。あるいは、使い捨て可能なカートリッジ中に組み込まれる場合には、カートリッジ内の試料を自動的に移動させ、抽出プロセスに作用するために微小流体素子が使用される。両用途が記載されている。
【００６５】
前記装置及び方法の主な特徴には、（ｉ）典型的には２分未満の迅速な核酸の単離、（ｉｉ）使い捨てカートリッジ中に取り込むのに適した要素、（ｉｉｉ）増幅と適合性のある形態の結合された核酸又は未結合の核酸の何れかの生成、（ｉｖ）少ない試料容量の使用（例えば、血液、口腔細胞及び組織）、及び（ｖ）操作を実施するための他の液体試薬の少量の使用が組み合わされる。
【００６６】
装置に関しては、化学的に含浸された固体基材マトリックスを配置するために、低容量フィルター保持装置の支持構造を使用した。これは、そのマトリックス内にこれらの核酸を保持することによって、適用された試料からＤＮＡを抽出及び単離するろ過層として機能する。ろ過マトリックスは、溶解性の塩が含浸され、及び場合により界面活性剤が含浸され、これは、次いで、結合工程後に、増幅の一般的な阻害剤を除去し、変性したタンパク質を濯いで除去するために、溶媒、好ましくは蒸留された若しくは滅菌された脱イオン水を流されるか、又は溶媒、好ましくは蒸留された若しくは滅菌された脱イオン水で洗浄される。試料からの核酸を保持するフィルターは、次いで、支持装置から取り外し、増幅試薬、例えばＰＣＲへ直接適用することができる。これは、ＤＮＡに対する定量的な要求に応じて、完全なフィルターディスク又はその一部を使用して行うことができる。望ましい場合には、好ましくは７５ないし９５℃の範囲の温度の脱イオン水を用いて、核酸材料をフィルターから溶出し得る。他の溶出試薬には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７などの及び５ｍＭないし２０ｍＭのリン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液などの希中性緩衝液が含まれる。あるいは、ろ過マトリックスは、以下に記載されているような使い捨て核酸検査カートリッジ中に取り込むことができる。
【００６７】
各抽出装置の好ましい実施形態は、以下に記載されている。すなわち、化学的に含浸されたフィルターは、生化学的に不活性である再生可能な薄いマトリックスから構成される円板、好ましくは市販のろ紙である。溶解性の塩及び場合により使用される界面活性剤は、フィルターの表面上に分配された後、マトリックス内で乾燥される。実際的な問題として、フィルターディスクのサイズは、フィルター保持装置の外径によって制約され、洗浄流体が通過するチャネルより広くなければならない。化学的含浸は、界面活性剤、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を加えた又は加えないカオトロピック塩を含有する液体カクテルを用いて行われる。カクテルは、フィルターディスク上に分配され、乾燥され、次いで、フィルターは、使用時まで密閉された環境中で保存される。
【００６８】
好ましい実施形態において、フィルター保持装置は、洗浄流体がそれを通じてフィルターディスクの一方側から他方側へと通過し得る中央の小さな直径のチャンネルにより、（場合により、配置補助ガスケットを有する。）フィルターディスクに対して強固な支持を与える。前記装置は、洗浄流体の導入及びその後の除去を可能とするために、フィルターディスクの反対側に入口及び出口の両方を含有する。その構築材料は、生化学的に不活性であるべきであり、好ましくは成型されたプラスチックであるべきである。これは、使い捨てとして設計されるが、適切に清浄化される、例えば高圧滅菌処理されるのであれば、場合により、再使用可能とすることもできる。フィルターベースパッドは、洗浄流体チャンネルに合致してフィルターディスクを適切に配置する補助を与える従属部品である。場合により、装置の内径より小さなフィルターのサイズに対しては、フィルター位置調整ガスケットを使用し得る。例えば、チャンネル上のフィルターベースパッド上にフィルターディスクを保持する中央穴を有する薄い接着性の層を使用し得る。本実施形態において、フィルターディスクの外径より僅かに小さな中央穴を有する両面粘着テープが好ましい。洗浄流体は、好ましくは、蒸留水であり、増幅の化学的阻害剤を除去するために使用される。
【００６９】
本分野において周知であるように、滅菌性及び生化学的不活性の条件は、装置の構築のために用いられる材料の選択、流体の取り扱い及び洗浄流体の取得源に対して固有のものである。試料、例えば体液は、フィルター支持装置の入口を通じてフィルターディスクに導入し、又は装置へ組み立てる前にフィルターディスク上に（但し、滅菌性が確保されるように注意を払うものとする。）導入することが可能である。
【００７０】
一実施形態において、フィルター保持装置は、Ｓｗｉｎｎｅｘフィルター保持装置、好ましくは１３ｍｍ直径のもの（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）とすることができ、また、これは、ＴｅｆｌｏｎＴＭガスケットとともに提供され、成型されたポリプロピレンから構築される。好ましい実施形態において、フィルター保持装置に対して修飾が行われ、この場合、フィルター保持装置の上部片及び底部片の両片の内側に存在する空隙に正確に適合するように、さらなるアクリル片が切断される。これらの片は、好ましくは、接着剤、例えばＬｏｃｔｉｔｅエポキシ糊で定位置に保持され、標準的な装置より小さな直径の、穴があけられた中央チャンネルを有する。フィルター保持装置への入口は、接着剤で定位置に固定されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆの１００μＬピペット先端から得られる末端片で場合により修飾することもできる。
【００７１】
フィルター位置調整ガスケットは、好ましくは両面粘着テープガスケット（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）であり、ゴム−アクリルハイブリッド接着剤の約７５μｍを有するＰＥＴフィルム基材上に約２５μｍの厚さになるようにレーザーで切断し、保護のために２つのポリエステルライナーの間に挟まれる。両面接着剤は、洗浄操作の間に、フィルター保持装置のよりよい密着を与えるという利点を有する。ポリエステルライナーは、接着剤を露出させるために、装置の組み立ての間に除去されることに留意されたい。
【００７２】
フィルターディスクは、好ましくはＷｈａｔｍａｎ ４ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｇｒａｄｅの普通のセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．）であり、以下の製造業者の仕様：２０−２５μｍを上回る粒子保持、粗い多孔率、ろ過速度ＡＳＴＭ１２秒、Ｈｅｒｚｂｅｒｇ３７秒及び滑らかな表面、を有する。他の類似のフィルター材料及び等級を使用することができ、Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭ、Ｐａｌｌ ＧＦ Ａ／Ｂ、Ｔｅｘｗｉｐｅ （布巾）、Ｗｈａｔｍａｎ１、Ｗｈａｔｍａｎ３、Ｗｈａｔｍａｎ４、Ｗｈａｔｍａｎ６及びＰａｌｌ１６６０膜が含まれる。
【００７３】
フィルターの化学的含浸は、好ましくは、界面活性剤（好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ＴＭ）、弱塩基性緩衝液（好ましくは、ＴＲＩＳ）及びキレート剤（好ましくはＥＤＴＡ）を加えた又は加えない、カオトロピック塩（好ましくは、イソチオシアン酸グアニジンなどのグアニジニウム塩）を含有する液体カクテルを用いて行われる。別の試薬には、グアニジニウム塩（例えば、グアニジニウム塩酸塩及びチオシアン酸グアニジニウム）、非イオン性界面活性剤及びキレート材料が含まれる。２Ｍイソチオシアン酸グアニジン、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．８まで緩衝化された１０ｍＭのＴＲＩＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡの約３．７５μＬ／ｃｍ２の最少負荷を行うために、カクテルは、溶液中のＷｈａｔｍａｎ４ペーパーに付与される。次いで、光表面の下約５ｃｍで、加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ， Ｈｅａｔ−Ｒａｙ ２５Ｏｗ赤外線）下にてカクテルを３分間乾燥させ、次いで、室温で最低１０分間冷却し、使用時まで滅菌遠心管の中に保存した。目的とする試料材料が血液である場合には、カクテル溶液中で使用される全ての試薬を、２００ｍＭのＮａＯＨの溶液による含浸で置換できることが明らかとなっていることに留意されたい。他の強塩基溶液、例えば、ＫＯＨも使用することが可能である。
【００７４】
実例として、２つの異なる体液が、ゲノムＤＮＡの抽出用に使用されている。これらは、（ｉ）キレート剤又は抗凝固剤の何れによっても処理されていない全血試料内の白血球細胞及び（ｉｉ）口頬綿棒から得られた口腔細胞である。以下に記載されているように使用される場合、本装置は、プロトコールを僅かに変更して、増幅可能なＤＮＡを両流体から抽出することができる。本開示に基づき、当業者は、プロトコールにさらに僅かな変更を加えることによって、核酸を含有する試料のその他の種類も抽出し得ることを認識する。
【００７５】
フィルター保持装置の構成要素は、側面図で図４（ａ）に、拡大された側面図で図４（ｂ）に、図４（ｃ）上面図、空隙容量に挿入された図４（ｄ）に示されている。装置は、フィルター固定装置上部２０及び下部２１、入口チャンネル２２、空隙容量２３及び２４、フィルターディスク基部上のフィルターディスク２５及び出口チャンネル２６を含む。好ましい実施形態において、図４（ｄ）に示されているように、より低容量にする改変は、間隙充填構造（２７、２９）を使用し、及び入口２２を介して、より狭い中央チャンネル中へ流体が移動しやすくするための入口適合素子２８を使用する。より低容量の装置は、適合素子２９に取り付けられたフィルターガスケットを用いて、フィルターディスクの位置を調整することを必要とする。実際的な問題として、装置は、滅菌された作業環境中で調製され、核酸及び酵素の交差汚染を防ぐための道具が使用される。
【００７６】
１３ｍｍのフィルターディスク２５を使用する場合には、体液約３−１０μＬが化学的に含浸されたフィルター表面に適用できるのに対して、４．８ｍｍのフィルターディスクを用いた低容量の改変された装置は、流体１−３μＬでも十分に機能する。試料の適用は、入口ポートを通じて、組み立てられた装置を用いて行うことが可能であり、又は組み立て前に直接フィルター上に行うことが可能である。口腔綿棒標本が綿棒で取得される場合には、フィルターディスク上に拭い取ることが可能であり、又は入口ポートを通じて、フィルターディスク上に洗浄することが可能である。口腔細胞を単離するための別の方法は、市販の洗口剤（例えば、Ｓｃｏｐｅブランド）を用いることによることが見出されている。使用した洗口剤の数μＬを、次いで、装置中に付与することができる。
【００７７】
妨害物質の除去に関しては、周囲温度の滅菌水は、ディスクのマトリックス内から核酸を除去せずにフィルターディスクを通して妨害物質を流すことができるので、洗浄流体として満足に機能することが明らかとなった。入口において、フィルター保持装置にきつく密封するために配置された分配チップから水がくみ出される場合、水は、フィルターディスクを通じて流れて、試料を洗浄し、出口まで通り抜ける。口腔細胞試料の場合、試料１μＬ当り滅菌水２０μＬ／を一度流せば十分である。血液試料の場合、試料１μＬ当り滅菌水２０μＬ／を、フィルターを通して流し、３回繰り返すことが好ましい。あるいは、単回容量を、三回、前後に通過させることも十分である。滅菌水の代わりとして、以下の滅菌緩衝溶液、すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７及び５ｍＭないし２０ｍＭのリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムを使用し得る。
【００７８】
洗浄操作の後、フィルターディスクは、ＤＮＡの増幅可能な量を保持する。次いで、これは、フィルター保持装置から取り外され、増幅反応において使用することができる。１００μＬのＰＣＲ増幅では、４．７６ｍｍの直径のディスクを直接使用することができるのに対して、１３ｍｍのディスクは、より小さな部分へ最適に切断されることが明らかとなった。別の実施形態において、核酸材料は、熱い脱イオン水又は様々な緩衝溶液を用いることによって、フィルターから溶出することができ、次いで、増幅装置中に導入することが可能である。別の実施形態において、ろ過プロセスは、以下に記載されているように核酸検査のための使い捨て装置中に組み込まれる。
【００７９】
図５は、前記方法及びフィルター保持装置の有効性を示しており、口腔綿棒標本試料のＰＣＲ増幅を示している。抽出過程後、フィルターを装置から取り外し、血色素症遺伝子（Ｈｆｅ）に対して特異的な２つのプライマーを用いる１００μＬのＰＣＲ反応チャンバー中に配置した。増幅過程が完了したら、１０％アクリルアミドゲル１×ＴＢＥ電気泳動ゲルのレーン１に材料を適用した。予想通り、これは、矢印によって記されている３９０ｂｐ（塩基対）の断片を生成した。対照レーン２は１００ｂｐのラダーを含有し、レーン３は陰性対照として水を含有することに留意されたい。
【００８０】
上記手動の操作は、遺伝的分析を実行するための使い捨て装置内に導入され、及び組み込まれる抽出モジュールの設計に対する基礎を形成し得ること、又は使い捨て装置へ抽出物を送達する別個のモジュールであり得ることが理解される。送達は、例えば、ピペット移動によって、又は移動を促進する機構５００、５２０及び５２１を互いに合体させることによって（図１９及び２０参照）行うことが可能である。このような装置は、核酸検査用の一体化された使い捨て装置を取り扱うセクションに詳しく記載されている。
【００８１】
増幅方法の詳細な説明
本発明において、電気化学的検出が好ましい場合、核酸増幅工程の主な目的は、標的分子から検出可能な核酸の約０．０１ｐＭ濃度を生成することであるが、これは、酵素的増幅及び電気化学的検出を用いたサンドイッチアッセイのより低い検出限界の範囲にあることが見出されているからである。断片の所望される１ｐＭ濃度は、アボガドロ数（１モル＝６×１０（２３）分子）に基づいており、ここに、１ｐｍｏｌは、６×１０（２３）×１０（−１２）又は約１０（１２）分子に等しい。公知のように、血液１μＬがＤＮＡ約５×１０（３）分子を含有する場合、１ｍＬ（合理的に採取可能な試料容量である。）は、５×１０（６）分子又は概ね約１０（７）分子を含有する。血液１ｍＬ中のＤＮＡの量からＤＮＡの０．０１ｐｍｏｌへ移行するためには、約１０（３）倍の増幅が必要である。これは、幾つかの周知の増幅技術を用いて確実に達成することができる。増幅の程度を決定するために、様々な試料の種類及び試料の容積に対して類似の計算を実行することは、当業者に自明である。
【００８２】
光学的検出が使用される使い捨てカートリッジの別の実施形態においても、核酸増幅工程の目的は、同じく、所定の光学的方法のより低い検出限界の範囲内とするために、検出可能な核酸の所定のモル濃度を標的分子から生成することである。このような計算は、当業者に周知である。光学的検出を用いて試料の濃度を測定する能力は、ノイズのバックグラウンドレベル、検出すべき光学的化合物の吸光係数、光学系の電気的増幅率、試料の容量及びその他のパラメータに依存することが本分野において周知である。化合物濃度と試料の吸光度の単純な関係は、ベール・ランベルトの法則（Ａ＝εｃｌ）（Ａは吸光度であり、εは吸光係数であり、ｃは試料のモル濃度であり、ｌは試料の経路長である。）を用いて表すことが可能である。典型的には、長さは、原則的に、１ｃｍである（下記装置では、約０．０２ないし約０．４ｃｍがより典型的である。）。これにより、吸光度は吸光係数の定数を用いて濃度と関連付けられ、通常、ｐＭ域内の検出限界が許容される。
【００８３】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＣＲ反応に対して選択されたプライマー配列に基づいて、標的ＤＮＡの領域を特異的に増幅できることが周知である。この材料を処理することに伴う困難は、均一に、ハイブリダイゼーションに基づいて、シグナルの検出を試みることに存する。本質的に、ＰＣＲ反応は、平滑末端化された２本鎖の産物を生成する。しかしながら、ある種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ポリＡポリメラーゼ活性を有しており、これは、さらなるＡヌクレオチドを追加するために使用することが可能である。これは、クローニングの目的で商業的に使用されてきたが、単一のヌクレオチドの突出は、ハイブリダイゼーションについては非効率である。ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ反応を使用することを試みるための別のアプローチとして、制限エンドヌクレアーゼ酵素に対する認識配列がＰＣＲプライマー中に設計されてきた。しかしながら、典型的には短い突出を生成するに過ぎない追加の酵素を必要とするので、これには限界がある。多くの二本鎖種と同様、ＰＣＲ産物は、均一な反応でのハイブリダイゼーションに適していない。この制約を克服するために、他方のプライマーに対して一方のプライマーの限定量を使用する戦略が考案されている。別の方法は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６）に対するプロモーター領域を有することである。プライマーの１つを限定することには、増幅の効率が低減するという欠点がある。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡの生成はさらなる試薬を必要とし、検出用の壊れやすいＲＮＡ種を生成する。
【００８４】
ここで、本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマーの量（第一の修飾されたプライマーは、標的の領域に対する塩基の配列を有する。）を組み合わせることによってＰＣＲ反応を実施する新規方法を記載する。ポリメラーゼ遮断領域が、一本鎖ハイブリダイゼーション領域に連結された本プライマーに付着されている。第二の修飾されたプライマーは、標的の第二の領域に対する塩基の配列を有し、並びにポリメラーゼ遮断領域及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域も有する。検出可能な部分（例えば、ビオチン、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ））が、２つの修飾されたプライマーの一方又は両方に付着される。ＰＣＲ反応を実行するために、混合物をサイクルにかけて、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを生成させる。第二の工程では、取り込まれていない過剰の修飾されたポリマー（検出可能な部分を有する。）は、混合物から実質的に除去される。幾つかの異なる方法が利用可能であり、これらは以下に記載されている。次いで、アンプリコンとのハイブリダイゼーションを可能とするために、一本鎖ハイブリダイゼーション領域の一方又は両方に対して相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに混合物を添加する。最後の工程では、このハイブリダイゼーションに伴う部分が、例えば、フルオロセインの光学的検出によって、直接検出される。あるいは、この部分（例えば、ビオチン）は、露出され、ストレプトアビジン標識された酵素（例えば、アルカリホスファーターゼ）と結合し、光学的に又は電気化学的に酵素活性が測定される。同じく、幾つかの具体的な方法が可能であり、これらの例は、以下に記載されている。
【００８５】
反応の流れは図７（ａ）に示されており、ここで、３１は検出部分（例えば、ビオチン、ＦＡＭ、ＤＮＰ、コレステロール、フルオロセイン）であり、３２は第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域であり、３３はポリメラーゼ遮断領域（例えば、ヘキサＰＥＧ）であり、３４は第一のＰＣＲプライマーであり、３５は第二のＰＣＲプライマーであり、３６は第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域であり、３７は第二の検出可能な部分であり、３８は二本鎖核酸標的配列であり、３９は固体基材（例えば、ビーズ又は表面）であり、及び４０は３６に対して相補的なハイブリダイゼーション領域である。
【００８６】
ＰＣＲプライマー３４及び３５は、好ましくは、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成され、ポリメラーゼ遮断領域３３中を除き、ＤＮＡポリメラーゼに対して適している全てのヌクレオチド又は修飾された塩基を含むことができる。ポリメラーゼ遮断領域配列の例は、スペーサーであるホスホルアミダイト１８−Ｏ−ジメトキシルトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（以下、「ＨＰＥＧ」と称される。）からなることができる。このホスホルアミダイトは、ヘキサエチレングリコールスペーサー領域を生成する。この目的のために、類似の特性を有するその他のスペーサー分子を使用することも可能である。３’−３’又は５’−５’ホスホジエステル骨格並びにＮｅｗｔｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１， １１５５−６２， １９９３）及び米国特許第５，５２５，４９４号によって記載されているような修飾されたヌクレオチドを作製するなど、ホスホルアミダイト化学に対する代替法を使用することが可能である。
【００８７】
付随する構成部品とともに適切な標的及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、これらの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを進行させることにより、取り込まれた一本鎖領域３２及び３６を有する新たに合成されたＤＮＡ分子を生成する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、好ましい実施形態は、著しくより高い回転数を示すＴ．コダキエンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋｉｅｎｓｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼを使用することが見出された。次いで、本分子は、３６を用いて、固体支持体３９上の標的配列４０にハイブリダイズすることができる。次いで、シグナルを生成するために、結合部分領域を使用することが可能である。例えば、結合部分としてビオチンを使用し、及び検出酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））に抱合されたストレプトアビジンを用いることによる。
【００８８】
ＰＣＲプライマーは、好ましくは末端ホスホロチオアート結合も含有し、Ｔ．コダキエンシスＫＯＤ１ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、末端塩基が異なることに基づいて、ＳＮＰ分析で使用されるプライマーの対立遺伝子の差を識別できないようになることを防ぐ。
【００８９】
上記フィルター保持装置を用いて単離されたヒトゲノムＤＮＡを用いる好ましい実施形態において、約３９０ｂｐのサイズのヒト血色素症遺伝子（ｈｆｅ）の領域を生成するために、２つの合成オリゴヌクレオチド（プライマー１及び２）を使用した。これらは、オリゴ１：
【００９０】
【化１】
であった。
【００９１】
ここで、５６−ＦＡＭは蛍光性の種であり、ＨＰＥＧは、１８−Ｏ−ジメトキシルトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを用いて取り込まれたヘキサＰＥＧ配列である。オリゴ１配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号１と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ−３’は、配列番号２と表記される。オリゴ２配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡ−３’は、配列番号３と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡ−３’は、配列番号４と表記される。
【００９２】
これらのプライマーの使用を実証するために、洗口剤（Ｓｃｏｐｅブランド）に由来する口腔細胞ＤＮＡ試料を使用した。溶解性塩３μＬ及び２Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．８及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む界面活性剤溶液が含浸されたＷｈａｔｍａｎ４ろ紙から穿孔された５ｍｍの直径のディスク上に、この体液の３μＬの容量を分注した。抽出後、１００μＬまで充填されるように設計された０．５ｍＬのＭβＰ ＥａｓｙｓｔａｒｔＰＣＲ反応チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＰＮ ２１− ４０２−４９）中に、直ちにフィルターディスクを配置した。水溶液１００ｍＬ中に、以下の試薬：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ及び０．２ｍＭ ｄＮＴＰの最終濃度を得るために、蝋層下で、流体５０μＬをチューブに供給した。記載した０．３１ｐＭのプライマー１及び２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）の最終反応濃度を得るために、上層反応混合物４７μＬを添加した。本水溶液は、５ＵのＶｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００も含有した。Ｔｅｃｈｎｅ Ｔｅｃｈｇｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で、増幅反応を行った。９７℃３分間、６０℃１分間及び７２℃１分間の３サイクルの後、９７℃１分間及び６２℃４５秒の３６サイクルを用いて、配列を増幅した。次いで、１００μＬの分注試料を用いて、使い捨てカートリッジ中で、増幅操作から得られた試料を検査した。電気化学的センサーを含有する検出カートリッジの設計素子の完全な記載は、参照により組み込まれる共有米国特許公開２００３０１７０８８１号に見出される。経時電流測定及び使い捨て検査カートリッジ中に組み込まれるセンサーに対して適用可能なその他の電気化学的方法の一般的な記載は、参照により本明細書に組み込まれた共有米国特許５，１１２，４５５号に見出される。
【００９３】
１００μＬの水性分注試料は、以下のようにして、すなわち、１４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、ｌμＬのＦＩＴＣ−ＡＬＰ 抱合体１／１００希釈及び１０μＬの増幅されたＤＮＡとして調製された。ＦＩＴＣ−ＡＬＰ抱合体は、３５０μｇ／ｍＬの最終濃度である。あるいは、増幅されたＤＮＡの代わりに対照オリゴヌクレオチド配列を使用した。対照オリゴヌクレオチド配列は、経時電流測定検出用の陽性対照として製造された。この一本鎖配列は、図７（ａ）に示されている３６と類似しており、領域４０に対して相補的であり、３６−ＦＡＭ蛍光種を含有する。図７（ｂ）は、検出工程における、標準的プライマーの望ましくない競合を示しているのに対して、図７（ｃ）のように、貝状プライマーを用いると、これは回避される。これらの両試料から得られた結果が、図８（ａ）及び８（ｂ）に示されている。図８（ａ）は、抗ＦＩＴＣ ＡＬＰ抱合体のみと、センサーにハイブリダイズされたアンプリコンとの抱合体を比較した経時電流測定の読み取りを示す。図８（ｂ）は、抗ＦＩＴＣ ＡＬＰ抱合体のみと、陽性対照オリゴヌクレオチド配列との抱合体を比較した経時電流測定の読み取りを示す。
【００９４】
検出カートリッジは、以下のように操作された。共有米国特許公開２００３０１７０８８１号に記載されているように、分注試料１００μＬの２０μＬ部分を、酵素が連結されたＤＮＡハイブリッドセンサーカートリッジ中に負荷し、ｉ−ＳＴＡＴモデル３００電気化学的分析装置（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に配置した。センサーカートリッジは、特異的なＤＮＡオリゴマーで被覆された複数の（２又は４個の）電流測定センサーを含有した。本例では、オリゴマーは、５’−ビオチン化されたオリゴヌクレオチドであり、センサー表面上に吸着されたストレプトアビジン被覆されたビーズに結合された。対照として、ＰＣＲプライマーの一本鎖部分の１つに対する相補的一本鎖ＤＮＡオリゴマーで、センサーの１つを被覆した。このカートリッジ内には、別個の抗ＦＡＭ−アルカリホスファターゼ抱合体も存在した。
【００９５】
好ましい実施形態において、単一の溶液中に溶解された、ＰＣＲ増幅された産物及び抗ＦＡＭ−ＡＬＰ抱合体を、ＤＮＡ捕捉センターと接触させた。あるいは、まず、ＰＣＲ産物をセンサーと接触させた後に、抱合体と接触させ得ることに留意されたい。好ましい実施形態において、両一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含有する二本鎖ＰＣＲ産物は、電気測定センサー上の捕捉領域に結合する。アルカリホスファターゼ標識の結合は、ＰＣＲ産物の捕捉前に又はＰＣＲ産物がビーズに結合した後に、溶液中で起こり得る。調節された時間の後、典型的には、５ないし１５分後、及び調節された温度で、好ましくは３７℃で、溶液は、センサー領域から出て、カートリッジ内の廃棄チャンバーへ送達される。ＡＬＰに対する基質を含有する洗浄溶液はセンサー上に運ばれ、センサー領域から過剰のａＦＡＭ−ＡＬＰ抱合体を洗浄除去する。洗浄溶液の後方部分がセンサー上に残存し、ＡＬＰ標識に対する電気発生基質を提供する。別の実施形態において、まず、洗浄溶液を使用し、続いて、基質を含有する第二の溶液を使用し得る。光学的センサー又はセンサーの他の種類が使用される場合には、他の適切な基質が使用されることにも留意されたい。好ましい実施形態において、捕捉センサーにおける測定された電流は、センサー上に存在するＡＬＰ標識の数に実質的に正比例する。相補的ＤＮＡ結合配列で被覆されていない隣接する電流測定センサーは、センサー上のＡＬＰ試薬の何れかの非特異的結合を打ち消し、これにより、検出限界を改善するために、対照センサーとして使用することが可能である。あるいは、相補的ＤＮＡ結合配列とは異なる配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、陰性対照として使用することができる。
【００９６】
図８（ａ）及び図８（ｂ）を参照すると、これらは、ＤＮＡカートリッジから得られる、測定された電流特性又は経時電流測定の出力を示している。抱合体を加えたＰＣＲ産物は、図８（ａ）において、抱合体単独に比べて、測定された電流の増加を示す。ここで、未結合のプライマーを競合することが、減少するシグナルであり得る。図８（ｂ）に示されているように、３６−ＦＡＭ種で標識されている陽性対照オリゴヌクレオチド配列を用いると、信号の同様の増加が観察される。正味電流は、試料中のＰＣＲアンプリコンの数に比例することも見出された（ここで、定常状態電流は、アンプリコン濃度の増加につれて増加することが示されている。）、図９（ａ）参照。これらの活動は、図９（ｂ）にプロットされている。
【００９７】
本例において機器２００及び６５０に対して使用されたソフトウェア（図６及び２１を参照。）は、検出過程中の一連の工程を実行する改変されたｉ−ＳＴＡＴ３００分析機器（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。第一の工程において、本機器はカートリッジと接触して、カートリッジを特定した後、蓄電池のチェック及び他の内部機器のチェックを行う。次いで、機器は、センサーチップを３７℃まで加熱するために熱的サイクルを開始し、終了する。次いで、捕捉工程を可能とするために、増幅された標的を含有する液体を、空気圧によって、伝導路１２５からセンサーチャンバー１２６中に押し出す。次いで、一時的な保持チャンバーとして機能する伝導路１２５中に、分析パックから、分析中に分析流体を分注させる前記機器の第二のモーターの動きの間に、機器中のプッシュピン２１３は要素１３５と接触する。次いで、センサーチップに対する温度の設定点は４７℃まで増加され、チップ上の伝導センサーが初期化される。次いで、アンプリコンの効率的な捕捉を実施するために、捕捉オリゴヌクレオチドビーズの最上部の上で、標的液体が前後に押される。この工程は、約３ないし９分を要する。本捕捉プロセス中に流体の位置をモニターするために伝導性センサーが使用されることに留意されたい。最後の２つの振幅の前に、機器中のソフトウェアはチップの加熱を停止させ、残りのサイクルは周囲温度で実施される。次いで、非捕捉アンプリコンを含有する液体は、廃棄チャンバー１３７の試料入口側へゆっくり移動し、（２ｐＡ／ビットで）Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対して＋３０ｍＶの平衡電位でデータを収集するようにセンサーが設定される。この液体が廃棄チャンバー中に押し出されるにつれて、揺動ウィック機構が飽和状態になると、揺動ウィック機構が排出口を閉じる。この機構は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許出願第２００３０１７０８８１号に記載されている種類の機構である。次いで、本ソフトウェアは、捕捉オリゴヌクレオチド由来の未結合の残存材料を洗浄するために、分析流体がセンサーを横切って引き込まれるように、機器にカートリッジを作動させ、酵素と反応することができ、電極で酸化され得るｐ−アミノフェノールホスファートを含有する分析流体の薄層を残存させる。図９（ａ）に示されているように、時間の関数として生じる電流が記録され、生じた電流は、結果を表示するために、ソフトウェアアルゴリズムによって使用され得る。
【００９８】
ＤＮＡ配列決定反応中に取り込まれなかった一本鎖オリゴヌクレオチドを分解するためにＥｘｏＩを使用できることが本分野において公知であるが、ヘキサＰＥＧ領域のような非天然ＤＮＡがＥｘｏＩ酵素によって分解されるかどうかは不明であった。ＥｘｏＩがこの非天然塩基に対して作用することを示すために、図３１に示されている実験を行った。この図は、ＥｘｏＩ処理後における、３２Ｐ放射線標識された合成オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフを示している。図３１において、レーン１のｉｓ０１５オリゴヌクレオチドは、上記オリゴ１と同一である。オリゴヌクレオチド標識されたｉｓ０２６及びｉｓ０２７は、ｉｓ０１５と同様、ＨＰＥＧスペーサーを含有していたが、ｉｓｏ２０オリゴヌクレオチドはＨＰＥＧスペーサーを含有していなかった。図３１は、ＥｘｏＩ酵素が、約６−７ヌクレオチド長まで分子量を低下させる能力を有する、活性な３’−＞５’エキソヌクレアーゼであることを示している。さらに、ＥｘｏＩ酵素は、ヘキサＰＥＧ領域を過ぎて加工することができ、貝状プライマーの二本鎖領域中では、ＥｘｏＩ酵素は阻害される。従って、これは、ＥｘｏＩが、ヘキサＰＥＧ領域によってエキソヌクレアーゼであることを妨害されないことを示している。
【００９９】
本発明の別の実施形態において、標的遺伝子と１つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）の両方を使用することによって、遺伝子コピー変異（例えば、ＺＮＦ２１７）が検出される。これは、一方が標的用であり、他方がハウスキーパー用である、検出チャンバー１２６中の２つのセンサーによって達成される。ここで、ＰＣＲプライマーは、ハウスキーピング遺伝子と目的遺伝子の両方を増幅するために使用される。ＺＮＦ２１７がハウスキーピング遺伝子と同じコピー数で存在すれば、シグナルのレベルは類似する。しかしながら、ＺＮＦ２１７遺伝子は複数コピーで存在すれば、ＺＮＦ２１７センサーでのシグナルのレベルは、ハウスキーピング遺伝子センサーでのシグナルレベルより大きい。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、遺伝子発現変異を含む病状を引き起こす遺伝子の突然変異に取り組む。Ｗｉｌｄｅｎｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ｖｏｌ ５（６）：８７９）は、ｎｅｕタンパク質−チロシンキナーゼの過剰発現を記載しており、ｐ１８５は乳癌と関連している。ｃ−Ｍｙｃ発癌遺伝子は、癌の多くの形態で同定されている（Ｗａｉｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ｖｏｌ １８（３４）：４８７０）。発癌遺伝子過剰発現の他の例は、「Ｒｅｎ （２００４， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｖｏｌ １１（１）：２５）」によって記載された。過剰発現変異は、典型的には、ｍＲＮＡの増加したレベルを生じ、このため、本発明においてｍＲＮＡを検出するために、ｃＤＮＡ合成の最初の工程が、ＰＣＲ増幅の前に使用される。逆転写を用いたｃＤＮＡの合成（ＰＣＲによる本材料の増幅など）は、本分野において周知である。以前に記載されたＰＣＲ増幅を使用すると、シグナルのレベルを測定することにより、細胞中に存在するｍＲＮＡの量の存在を決定することができる。特定の発癌遺伝子に対するシグナルを比較することにより（例えば、ハウスキーピング遺伝子に対するＨｅｒ２／ｎｅｕ）、正常なレベルでの発癌遺伝子発現又は病状、特にＨｅｒ２／ｎｅｕの場合には乳癌を有する病状を示唆するレベルでの発癌遺伝子の識別が可能となる。
【０１０１】
図２６は、本方法のための別のアッセイ法を示しており、この方法に対する模式及び実験データは、ゲル電気泳動による図３２（ａ）に、及び経時電流測定による図３２（ｂ）に示されている。標的核酸（ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）３２９は、ＰＣＲ及び／又はＣｌａｍプライマーが３３０及び３３３を結合する２つの領域によって隣接されて示されており、介在配列は３３１によってマークされている。ＰＣＲ反応の間、３つのプライマー配列３１、３４１及び３７が反応混合物に添加され、３１及び３４１は、３３７及び３３８によって示されているように、それらの３’末端３４０の単一ヌクレオチドが異なっている。
【０１０２】
要素３１、３４１及び３７はＰＣＲプライマーとして作用し、プライマー３１及び３４１用の領域３３６は、標的分子３２９上の領域３３０にハイブリダイズする。分子３７の領域３５は、標的分子３２９上の領域３３３にハイブリダイズする。プライマー３７は、プライマー３１、３４１又は３１と３４１の両者に対して相補的なＰＣＲプライマーとして機能することができる。プライマー３７は、領域３５に塩基の特異的配列という特徴も有しており、これが標的分子３２９の位置３３３にハイブリダイズする。プライマー３７は、３３にＤＮＡポリメラーゼ遮断基を有し、検出の間の後のハイブリダイゼーションのための一本鎖領域を形成する別のユニークな領域を３６に有し、及び場合により、３７に結合部分を有する。
【０１０３】
貝状プライマー（ｃｌａｍ ｐｒｉｍｅｒ）３１及び３４１は、多くの同様の特徴を有するが、特異的な幾つかの相違も有する。両貝状プライマー３１及び３４１は、場合によって、検出可能な部分を３３４に有する。これは、例えば、３１上のビオチン分子及び３４１上のＦＡＭタグである。しかしながら、これらは、分子を後に識別できるようにするために、３１と３４１について異なる。貝状プライマー３１及び３４１はともに、それぞれ、異なって設計された一本鎖結合領域３２及び３３９を有する。さらに、「Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ３２（２）：６８１）」、「Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ １７（７）：２５０３）」及び欧州特許出願第８９３０２３３１．７号に記載されているように、貝状プライマー３１及び３４１はともに、ＤＮＡポリメラーゼ遮断基３３を有し、並びに貝状プライマー３１及び３４１はともに、一塩基多型の識別を補助するために、第四のヌクレオチド塩基中に設計された点変異を有する。既に述べたように、貝状プライマー３１及び３４１の両方の領域３３６は、標的分子３２９上の領域３３０に結合し、３３７又は３３８における一塩基変異は、単一のヌクレオチドの差を識別する。両貝状プライマーは、ある種の熱安定性ＤＮＡポリマー中に存在する３’→５’エキソヌクレアーゼに対して耐性である修飾された末端ホスホジエステル結合を３４０に有し、これは、２つの異なる分子の識別をさらに補助する。この修飾された末端ホスホジエステル結合は、ホスホロチオアート又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。貝状プライマーは、分子内構造を有するという特徴も有しており、これにより、取り込まれなかった一本鎖プライマー分子が、検出段階において、捕捉オリゴヌクレオチド４０又は３０に結合することが妨げられるが、新たに合成されたＰＣＲアンプリコン中にそれらが取り込まれた場合には、捕捉オリゴヌクレオチド４０及び３０へ、それらがハイブリダイズできるようにする。
【０１０４】
ＰＣＲの第一ラウンドでは、二本鎖標的の一本鎖への変性後、プライマー３７並びに貝状プライマー３１若しくは３４１又は３１及び３４１の両方が標的分子３２９に結合する。ホモ接合体の場合のように、貝状プライマー３１若しくは３４１のみが標的分子３２９に結合する場合には、２つの染色体の両コピー上の単一ヌクレオチドは同一である。ヘテロ接合体の場合のように、３１及び３４１がともに標的３２９の２つの別個の分子に結合する場合には、一方の染色体がある単一ヌクレオチド塩基配列を有するのに対して、他方の染色体は、一塩基多型において認められるように、異なる単一ヌクレオチド塩基配列を有する。これは、貝状プライマー３１若しくは３４１又は３１及び３４１の両方を取り込み、並びに他方末端にＰＣＲプライマー３７及び新たに合成された介在領域３３１を取り込む。
【０１０５】
１５サイクルと５０サイクルの間にわたって、ＰＣＲ増幅を進行させて、新たに合成された被増幅分子を生成する。図２６では、貝状プライマー３４１が取り込まれたアンプリコン３４４を示す。これは、例示のために行われている。他の突然変異が存在する場合、又は染色体の何れかの上に異なる配列が存在する場合には、３１が取り込まれたアンプリコンが見出される。簡略化のために、図には、３４１を有するアンプリコンのみが示されている。
【０１０６】
本過程の検出工程の間、取り込まれた貝状プライマー３４１及びＰＣＲプライマー３７を有する新たに合成されたアンプリコン３４４は、互いに結合している相補的配列の性質に基づいて、捕捉オリゴヌクレオチド４０に領域３３９の箇所で結合する。配列３３９は、異なる配列を有する物理的に隔てられた異なる捕捉オリゴヌクレオチド３０に結合しない。捕捉オリゴヌクレオチド３０及び４０は何れも、３９に示されているような固体基材又はビーズに結合される。
【０１０７】
このハイブリダイズされた複合体の検出は、分子３７中の結合部分３３４に結合する抱合体分子によって検出することができるか、又は抱合体分子によって検出され得る独自の検出可能部分３４２を有する分子３４４上の領域３６と、領域３４３において結合する別の一本鎖オリゴヌクレオチド３１８によって検出することができる。抱合体分子は、２つの特徴、すなわち（ｉ）結合部分３３４又は３４２に結合する領域及び（ｉｉ）検出領域を有する。一例は、ＦＭＡ結合部分に対して特異的な抗体であり、これは、検出要素としてのアルカリホスファターゼ酵素で修飾されている。
【０１０８】
別の増幅法
非ＰＣＲ核酸増幅アッセイを実施するために、同じ検出カートリッジを使用する本方法の別の実施形態を使用することができる。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の模式図が図１０に示されており、鎖置換増幅（ＳＤＡ）の模式図が図１１に示されている。成分要素は、図７（ａ）に示されているようにＰＣＲに対して記載されているものに対応することに留意されたい。両アッセイは、図２５において、２つの異なる方法を用いて示されているように、標的から作製される３’−ＯＨ部分を有する短いｓｓＤＮＡ断片（３０８及び３１０）を必要とする。図２５（ａ）は、現象惹起法（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｅｖｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、ＳＮＰアーゼ及びサイクリングプローブ）を示しており、図２５（ｂ）はＩｎｖａｄｅｒＴＭ法を示している。
【０１０９】
上記セクションにおける試薬と同じ試薬が使用されるが、前記標的核酸の第一の領域に対する塩基の配列を含む１つの修飾されたプライマーのみが必要とされる。同じく、修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを提供するために混合物をサイクルにかけた後、取り込まれなかった全ての過剰な修飾プライマーを混合物から実質的に取り除く。以下に論述されているように幾つかの方法を使用することが可能である。次いで、一本鎖ハイブリダイゼーション領域に対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに、混合物を曝露した後、前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの一本鎖ハイブリダイゼーション領域の、捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行う。同じく、最終工程は、前記ハイブリダイゼーションを伴う前記部分を検出している（例えば、アルカリホスファターゼによって生成される電気活性種の電気化学的検出）。好ましい実施形態において、プライマーは、ポリメラーゼ遮断領域に付着され、次いで、これは、一本鎖ハイブリダイゼーションに付着される。
【０１１０】
ローリングサークル増幅戦略の場合、プライマーの３’末端は遮断領域を有し、ホスファート又はジデオキシヌクレオチドを含むことができる。サイクリングプローブ反応又はＳＮＰアーゼアッセイに対して見出されるものと同様の切断反応が起こり、図２５（ａ）に示されているように遮断部分を除去し、反応３０６に参加している、標的ＤＮＡ３００並びに試薬３０１、３０２及び３０９を含む。予め作製された環状分子を反応混合物に添加することが可能である。遮断されたプライマーを用いると伸長は起こり得ないが、切断されたプライマー分子に対しては伸長が起こる。切断されたプライマーは、予め作製された環状分子に対して相補的な特異的領域の重複を有する長い一本鎖分子を生成する。検出可能部分を有する合成オリゴヌクレオチドが混合物中に含まれ、ここで、本ヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡのある領域に対して相補的であり、これは、一本鎖ＤＮＡに沿って、複数回見出すことができる。プライマーの一つの領域（一本鎖であり、及びユニークである。）は、捕捉オリゴヌクレオチド領域に結合する。本領域は予め作製された環状ＤＡに対して相補的でないので、この領域は捕捉オリゴヌクレオチドと全く競合しない。図１０に示されているように、ローリングサークルアッセイでは、ｓｓＤＮＡ３’−ＯＨ部分（３０８、３１０）は、反応３１２を介して、ローリングサークル試薬（３１１、３１５）に結合する。サイクリングは、３０８又は３１０の３’末端から始まる、付着された部分３１６の連なりを、産生された３１４に取り込む。要素３１４の検出は、ビーズ３９上に固定された相補的要素４０及び３１６に対して相補的な標識されたポリヌクレオチド３１７に要素３１４の５’−３’−ＯＨ領域を結合することによって達成される。次いで、標識は、アルカリホスファターゼ３１８に結合された抗体によって認識される。
【０１１１】
非ＰＣＲ核酸増幅アッセイを実施するために、同じ検出カートリッジを使用する本方法の別の実施形態を使用することができる。鎖置換増幅のための模式図が、図１１に示されている。構成要素は、図７（ａ）で使用されたＰＣＲ中のものに対応することに留意されたい。上記のものと類似の試薬が使用されるが、ＳＤＡプライマーは、まず、増幅不能フォーマットで提供しなければならず、これは、増幅可能フォーマットへと変換される。これを達成するための１つのアプローチは、例えば、３’末端ジデオキシ配列を用いて、遮断された３’末端ブロックを有するプライマーを提供することである。次いで、誘発現象が起こり、これは、遮断している３’末端を切除する。誘発現象の一例は、Ｉｎｖａｄｅｒ反応であり得（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＲＷ， Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ Ｖ， ｄｅ Ａｒｒｕｄａ Ｍ， Ｎｅｒｉ Ｂ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ， ｇｅｎｅｔｉｃ， ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ． ＭｏｌＤｉａｇｎ． １９９９；４：３５３−３６４．）、ここでは、フラッパーゼ活性が、ゲノム標的核酸の存在により、遮断されたプライマーをハイブリダイズされた連結部において切断して、利用可能な３’水酸基を与える。これは、標的ＤＮＡ３００並びに反応３０７に関与する３０４、３０３、３０５及び３０９を含む試薬とともに図２５（ｂ）に示されている。あるいは、誘発現象の別の例は、サイクリングプローブ反応（Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ９（２）：１４２）であり、ゲノム標的核酸の存在は、サイクリングプローブオリゴヌクレオチド上の４ヌクレオチド配列において、サイクリングプローブオリゴヌクレオチドを切断させ、次いで、遊離の３’水酸基を生成する。別の類似の例は、ＳＮＰアーゼに対して記載されているように、ゲノム標的核酸及び修復酵素に対するミスマッチであり、遊離の３’水酸基を生成する。
【０１１２】
プライマー配列中に遊離の３’水酸基を生成した誘発現象の後、相補的鎖置換プライマーが存在する。このＳＤプライマーは、上記プライマーに対して、その３’末端が相補的であり、これは３’水酸基を生成した。さらに、ＳＤプライマーは、米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているように、新たに合成されたときに、ニッカーゼ制限エンドヌクレアーゼによって切断される領域である３’水酸基相補的オリゴヌクレオチドに対して３’を有する。これにより、鎖置換反応は、新たに合成された配列の多数コピーを生成することが可能となり、これは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されているような非チオ鎖置換増幅の基礎を形成する。上述のように、ＤＮＡは架橋して、捕捉オリゴヌクレオチドとのシグナルを生成するので、本過程における次の工程は、鎖置換プライマーに対して相補的な、これらの増幅された新たに合成された断片を使用することである。これは図１１に示されており、鎖置換アッセイにおいて、ｓｓＤＮＡ３’−ＯＨ部分（３０８、３１０）が、領域３２０、３２１及び３２２から構成される３１９の３’末端において、領域３２０に結合する。次いで、反応３２４で切れ目が導入されて、ｓｓＤＮＡ３２５の短い一部を生じる伸長反応３２３が起こり、ｓｓＤＮＡ３２５の短い一部は、プライマー伸長と切れ目の反応３２６を繰り返すことにより蓄積する。要素３２５の検出は、ビーズ３９上に固定された相補的な４０に３２５の第一の部分を、及び標識されたポリヌクレオチド３１７に３２５の第二の部分を結合することによって達成される。次いで、標識は、アルカリホスファターゼ３１８に結合された抗体によって認識される。
【０１１３】
増幅後のプライマーの除去
完了したＰＣＲ反応から、未使用のＰＣＲプライマーを除去するための幾つかの新規アプローチについて記載する。迅速なＰＣＲ反応（すなわち、約１５分未満で増幅が完了する。）を取り込むシステムを開発することを求める結果、プライマー濃度を増加させる必要があることが明らかとなった。しかしながら、これは、通例、検出工程において増加したプライマーバックグラウンドを生じさせ、捕捉オリゴヌクレオチド上でのシグナル生成を低減させ得る。精製されたアンプリコン及び増加した非標識標的オリゴヌクレオチド（とりわけ、標識された対照オリゴヌクレオチド）を用いた実験は、これらのバックグラウンドオリゴヌクレオチドがシグナルを除去又は低減できることを示した。１つのアプローチ又は以下に記載されているアプローチの組み合わせを、バックグラウンドシグナルを低減するために使用することができる。
【０１１４】
反応増幅混合物からプライマーを簡単に除去するための１つの方法は、貝状オリゴヌクレオチドプライマーを使用することである。このオリゴヌクレオチドは、主として、第一の温度範囲において、溶液中である種の所望される二次構造を示すが、より高い第二の温度範囲においては示さない。本例では、オリゴヌクレオチドは、第二の温度範囲において標的核酸の反応を開始させることができるが、第一の温度範囲では反応を開始させることができない。一次構造が、好ましくは主として分子内様式でハイブリダイズするが、分子間様式でもハイブリダイズする１つ又はそれ以上の領域を有する二次構造をもたらすようにオリゴヌクレオチドを設計することによって、これは達成される。これは、第一の温度範囲では起こるが、前記第二の温度範囲では起こらないので、温度を変化させることによって、プライミング型と非プライミング型の間でプライマーを切り替えることが可能となる。その結果、増幅反応の終了時に温度を下げることにより、混合物から過剰のプライマーが効果的に除去される。この種の貝状プライマーは、ポリメラーゼ遮断領域、一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び場合により存在する検出可能な部分を取り込んで調製され得ることが見出された。増幅反応終了時にプライマーを除去するための別の方法も考案されている。これらは、電気泳動、ＰＣＲ後ハイブリダイゼーション及び酵素的変換による。
【０１１５】
電気泳動分離
記載されている第一のアプローチは電気泳動分離である。それらの分子量に基づいて核酸を分離できることは周知である。ＰＣＲアンプリコンとオリゴヌクレオチドプライマーとのサイズの相違を活用することによって、アンプリコンを迅速に精製することが可能である。好ましい実施形態において、電気泳動モジュールは、使い捨て装置中に取り込まれる。例えば、電気泳動精製モジュールは、図１２に示されているように、精製を実施するのに便利な位置に、装置中のチャンネルに沿った地点に置くことができる。本装置は、装置のチャンネル中の電極５０及び隣接する空洞５２中の第二の電極５１から構成される。各電極は、電気的接触パッド５３に接続される。装置中のチャンネル５４は、より初期の段階（ＰＣＲ増幅工程）からより後期の段階（例えば、検出工程）へ、それを通じて流体が移動する手段を提供する。
【０１１６】
図１２に示されている精製モジュールは、チャンネルの何れかの側面及び上又は下に置くことができる。これは、２つ又はそれ以上の電極を有することができる。例えば、示されている２つの電極の間の位置に、さらなる第三の電極を置くことができる。図１２に示されている２電極の実施形態の場合、プライマー配列用の捕捉膜が使用され、これは、プライマーを効果的に、不可逆的に吸収する。適切な材料には、ニトロセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ ＤＥ５２膜及びその他のＤＮＡ結合膜が含まれ、本分野において周知である。
【０１１７】
一実施形態において、電気泳動緩衝液を有する固体化されたゲルマトリックス（例えば、アガロース）が、空洞中に配置される。ＰＣＲ増幅された材料の試料セグメントは、次いで、チャンネルを通じて移動し、空洞上に配置される。場合により、参照により本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，０９６，６６９号に記載されているように、材料がチャンネルを通じて移動する際に材料の位置を感知するために伝導性電極の第二の対を使用することができる。一旦、試料が適切に配置されたら、２つの電極（５０が負であり、５１が正である。）を横切って電気泳動電荷を印加する。これは、ゲルマトリックス中で分子の電気泳動移動を引き起こし、より小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーが最も速く移動し、より大きなＰＣＲアンプリコンはよりゆっくり移動する。断片が適切な距離を（すなわちチャンネルを出て、空洞中に）移動したら、電気泳動の電荷を逆転させ、断片を反対方向に移動させる。一定の時間後、並びに特定の電荷及び電圧を用いると、より大きな分子はチャンネル中に戻り、より小さなプライマー分子はゲル材料中に残る。従って、これは、アンプリコンの精製を実施する方法である。
【０１１８】
別の実施形態において、図１２に示されている２つの電極間に第三の電極が配置される。ここで、電極５０及び５１は、それぞれ、負及び正として設定される。プライマー分子が第三の中間電極を通過するが、アンプリコンは通過しない時間が経過した後、電極５０を正電荷に逆転させ、電極５１は正のままとする。この点で、第三の中間電極は負とされる。これは、プライマーをチャンネルから離れるように移動させ続け、アンプリコンの方向をチャンネルに向かうように逆転させる。
【０１１９】
図１３（ａ）−（ｇ）は、装置中の帯電した色素を用いることを含む工程を示している。図１３（ａ）は、共有米国特許第５，０９６，６６９号に記載されている種類の修飾されたｉ−ＳＴＡＴカートリッジベースを示している。これは、入口ポート７１、チャンネル７２、チャンネルに隣接した空洞７３並びに３つの電極７４、７５及び７６（これらの２つは空洞中に存在し、１つはチャンネル中に存在する。）を有する。空洞は、透明なゲルとして、緩衝液とともに１％アガロースを含有する。図１３（ｂ）に示されているように、一般的な電気泳動ローディング色素５μＬ、ブロモフェノールブルー及びキシレンシアノール（何れも、負に帯電している。）を含む試料を、入口ポートを通じて添加し、試料は流体セグメント７７としてチャンネルに入る。実際のＤＮＡ分離が５０ｂｐ及び３００ｂｐ断片であるのと同様に、これらの色素は概ね２５ないし５０ｂｐのサイズで移動することに注目されたい。
【０１２０】
図１３（ｃ）では、負の電位が７４に対して印加され、正の電位が７６に対して印加される（本ケースでは、１０−５０Ｖ）。帯電した色素は、７６に向けて、アガロースゲル中を迅速に移動する。２つの色素は、それらの電荷対質量比に従って、ゲルを通じて、異なる速度で移動する。図１３（ｄ）に示されているように、色素は、７５の両側に、２つのバンド７８と７９へと分割される。これには、約３分を要する。この点で、７４及び７６は正に、７５は負となり、これにより、図１３（ｅ）に示されているように２つの移動する色素は、キシレンシアノール色素が再度チャンネルに進入するまで、反対方向に誘導される、図１３（ｆ）。最後に、図１３（ｇ）に示されているように、さらに下流への適用のために、キシレンシアノールはチャンネルの下に向けて空気圧で移動するが、他の色素は空洞中に残存する。
【０１２１】
明らかに、２つの色素の挙動は、異なる長さのヌクレオチド配列又は電気泳動を用いて迅速にお互いから分離することが可能な、異なる電荷対質量比を有するその他の何らかの化学種の代表である。さらに、電気泳動特性及び本装置の能力は、所望の分離を達成するために、ゲル密度、緩衝液塩選択、印加される電位及び時間、物理的サイズなどに従って調整することができる。
【０１２２】
別の実施形態において、当初の液体試料は、空洞に接しているチャンネルの領域を出て、電極の極性を逆転する前に、異なる液体のより少量と置き換える。これは、アンプリコンの濃縮を実施することができ、次いで、この濃縮は、アッセイプロセス中のさらに後の段階でのハイブリダイゼーション速度を増加させることができる。別の実施形態において、プライマーは、空洞内の捕捉膜又は粒子と接触され、これにより、不可逆的な結合が行われるため、プライマーがチャンネルの方向に戻ることは妨げられる。別の実施形態において、アガロースは、アクリルアミド、アガロースの混合物及びイナゴマメのガム、ハイドロコロイド又は他の適切な分離媒体を含む異なるマトリックスと置換され得る。別の実施形態において、図１２に示されているように、シリコン上の従属部品として装置が製造され、微小装置中に挿入される。別の実施形態において、この分離した構成部品を遺伝子検査装置中に組み込むことに付随する制約に対処するために、電気泳動チャンネルは、「Ｌ」の肘に、又はその近くに位置する電極７５を用いてＬ字型とし得る。例えば、図２４は、入口ポート６５７及びマトリックス６５６とともに電極６５２、６５３及び６５４を有する、伝導路４０９に隣接する一体化された検査装置６５１中に取り込まれたＬ字型のチャンネル機構６５５を示している。他の要素は、図１９のとおりである。
【０１２３】
図１４は、ＰＣＲ反応からのアンプリコン及びプライマーを用いた、電気泳動装置の操作を示している。レーン（Ａ）は、ゲル空洞中に電気泳動し、新鮮な第二の回収分取試料中に再度戻して、６％の非変性アクリルアミドゲルにかけた後のＰＣＲ反応産物の一部を示している。レーン（Ｂ）は、一方向移動後に除去された元の分取試料中に残存する試料の一部を示している。レーン（Ｃ）は、試料と等しい濃度の対象であり、レーン（Ｄ）は、試料及び対照より３倍高濃度の１０塩基対ラダーである。ラダーの主な種の塩基対の長さは、３３０、１００及び１０である。
【０１２４】
貝状オリゴヌクレオチド
通常、ＰＣＲ用途の場合、二次構造の量を減少することは、標的の非特異的で、不良なプライミングを減少するのに役立つので、合成オリゴヌクレオチド配列を設計するときには望ましいアプローチである。Ｈｆｅ１遺伝子に対して相補的であり、５塩基対のアデノシドスペーサー配列を有し、及び遊離の一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドの予想される折り畳み構造が図１５に示されている。図１５の配列は、
【０１２５】
【化２】
である。潜在的な分子の折り畳みの理論的な予測として、ＲＮＡ折り畳みプログラム（Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ）は、１０℃を上回るあらゆる温度で、一本鎖の性質を有するオリゴヌクレオチドを予測する。低温で二次構造を有するが、ＰＣＲ及びＰＣＲハイブリダイゼーションの変性工程中にはそれらの二次構造を喪失する合成オリゴヌクレオチドを設計することによって、ハイブリダイゼーション及び検出の後の段階でアンプリコンのハイブリダイゼーションを実施できるが、プライマー分子のハイブリダイゼーションは実施できない。ｉｓ０１５配列を出発点として使用し、図１６（ａ）及び（ｂ）に示されているように、ヘアピンループ構造を有するオリゴヌクレオチドを設計し、モデル化した。図１６（ａ）における塩基対配列は、
【０１２６】
【化３】
である。
【０１２７】
図１６のモデルでは、ＨＰＥＧスペーサーの効果をモデル化するために、ボックス中に示されている５塩基対の配列が使用される。図１６のモデルに基づいて、２つのオリゴヌクレオチドがＣＬＡＭ１及びＣＬＡＭ２と表記された。２つの配列は、４つのヌクレオチドが異なる。
【０１２８】
【化４】
【０１２９】
ＣＬＡＭ１配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号８と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣ−３’は、配列番号９と表記される。
【０１３０】
ＣＬＡＭ２配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＣＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号１０と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣ−３’は、配列番号１１と表記される。
【０１３１】
これらのオリゴヌクレオチド配列は、ＰＣＲ反応におけるＨｆｅ１プライミング及び捕捉オリゴヌクレオチドへの結合のための主要な一次配列の特徴を維持しているが、分子内結合を生成して、これらの「貝状」構造を作出するために追加配列が付加されている。ＨＰＥＣスペーサー領域配列は５つの「Ａ」で記されていること、及びこれらの配列は約４０℃ないし４５℃を上回ると、二次構造を有しないと予測されることに留意されたい。
【０１３２】
図７（ｂ）及び７（ｃ）は、二次構造をほとんど又は全く持たないＰＣＲプライマー配列を使用した場合とＣＬＡＭ ＰＣＲプライアーを使用した場合の差を比較対照している。ＰＣＲ中の温度で、特に、ハイブリダイゼーションの温度又はハイブリダイゼーションを上回る温度で、ＣＬＡＭプライマーは二次構造を形成せず、一旦、ＰＣＲアンプリコン中に取り込まれると、貝状構造を形成する能力を喪失する。ＰＣＲハイブリダイゼーションを下回る温度及び捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにたいして使用される温度では、ＣＬＡＭ ＰＣＲプライマーは二次構造を形成する。従って、取り込まれなかったＣＬＡＭ ＰＣＲプライマーは捕捉オリゴヌクレオチドに結合せず、及びシグナル生成を妨害しない。
【０１３３】
図７（ｂ）は、非ＣＬＡＭオリゴヌクレオチド配列を使用し、及び標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＰＣＲ反応を示している。二次構造を持たないｉｓ０１５のような配列が、２個のＰＣＲプライマー８１のうちの１つとして使用される。ＰＥＧスペーサーは、ＰＣＲアンプリコン中に一本鎖領域を生成し、反応８２において、過剰なプライマー配列が生成される。段階８３において、ＰＣＲアンプリコンと未反応プライマー配列の両方が、ビーズのような固体基材に結合された捕捉オリゴヌクレオチドに結合することが可能である。典型的には、未反応プライマーは、ＰＣＲアンプリコンと比較して著しいモル過剰にあり、シグナル検出を減少させる。
【０１３４】
図７（ｃ）は、ＰＣＲアンプリコンのみを標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるＣＬＡＭオリゴヌクレオチド配列を使用するＰＣＲ反応を示している。ＣＬＡＭ１又はＣＬＡＭ２配列の何れかを生成するためにｉｓ０１５配列に対する修飾を使用して、ＰＣＲ反応８１を行う。ＰＣＲで使用される温度では、二次構造は除去される。ＣＬＡＭオリゴヌクレオチドの一方末端がＰＣＲアンプリコン中に取り込まれたら、これは、もはや、二次構造とともに機能せず、一本鎖領域８２を与える。工程８３において、温度は、取り込まれていないＣＬＡＭプライマー配列の二次構造を生成するために必要とされる温度を下回る。その結果、ＰＣＲアンプリコン中に取り込まれたＣＬＡＭプライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドに結合することができる一本鎖領域を有する。
【０１３５】
酵素の除去
プライマーを除去するために、２つの酵素的アプローチが考案されており、これらは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチド上のＴｄＴ尾部及び取り込まれなかったオリゴヌクレオチドの分解に関する。ＰＣＲ反応混合物内には、ｉＳｐ１８プライマーを有する上記の例では一本鎖領域有するアンプリコン及び取り込まれなかった合成オリゴヌクレオチドという２種類の構造が存在する。アンプリコン上のプライマーは、伸長する５’領域のみを有するのに対して、取り込まれなかったプライマーは遊離の５’及び３’一本鎖末端を有する。３’末端におけるこれらの差に特異的な酵素を用いて、これらの分子を識別して除去するための戦略が開発された。
【０１３６】
ＰＣＲ反応産物のウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジル転移（ＴｄＴ）酵素処理は、一本鎖３’伸長に対して特異的であるので、取り込まれなかったプライマーのみが、新たに取り込まれた尾部を生成する。これに対して、アンプリコンは、５’尾部を有する一本鎖領域のみを有するが、これはＴｄＴと反応しない。
【０１３７】
普遍的捕捉システムに対しては非効率的で且つ特有ではないが、「Ｔ」などの単一ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を使用して、ＰＣＲプライマーの３’末端に伸長されたＴ尾部を作製することができる。この用途のために、リボヌクレオチドを含む修飾されたヌクレオチドなどの、ＴｄＴ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼとともに機能する全てのヌクレオチドを使用することができる。取り込まれなかったＴ尾部付きプライマー配列を有する修飾されたＰＣＲ反応混合物は、ポリ（Ａ）配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドに対して曝露されることができる。Ｔ尾部を有する、取り込まれなかったＰＣＲプライマーのみが、捕捉ポリ（Ａ）配列に結合する。これにより、ポリ（Ｔ）配列を伴うＰＣＲアンプリコンに対して反応混合物が濃縮される。ポリ（Ａ）捕捉オリゴヌクレオチドは、固体表面、ビーズ、マトリックス様アガロース中、アクリルアミド、ポリビニルアルコール又は他の適切なハイドロコロイドに結合することができる。
【０１３８】
別の方法は、エンドヌクレアーゼの使用に基づく。取り込まれなったオリゴヌクレオチドプライマーは遊離の３’水酸基を有し、アンプリコンは有していないので、取り込まれなったオリゴヌクレオチドプライマーを除去するために３’−５’エキソヌクレアーゼが使用される。ＥｘｏＩ及びＥｘｏＴを含む酵素は、遊離の３’水酸基を有する一本鎖ＤＮＡと特異的な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。本実施形態において、５’−リン酸基を有するプライマーを使用することが好ましい。
【０１３９】
ＰＣＲ後のハイブリダイゼーション
上記ＰＣＲ反応では、２つの異なる一本鎖領域を生成する２つのプライマーを含有するアンプリコンが生成される。シグナルを生成するために、２つの一本鎖領域間の架橋である新たに増幅された領域の他に、両方の一本鎖領域が必要である。
【０１４０】
本例では、一本鎖Ａ領域は、バイオセンサーにおける相補的Ａプライム捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。一本鎖Ｂ領域は、酵素的抱合体に対する部分を有する合成オリゴヌクレオチドＢプライムに結合する。あるいは、酵素的抱合体は、Ｂ領域に直接結合する。
【０１４１】
まず、Ｂプライム捕捉オリゴヌクレオチドが結合した固体基材を、本例では、検出領域に通じるチャンネル中に作製し、適切な条件下でＰＣＲ反応材料をハイブリダイズさせることにより、アンプリコン中に取り込まれなかった全てのＢ領域オリゴヌクレオチドがチャンネルから失われ、Ｂ領域オリゴヌクレオチドに対するチャンネル及びアンプリコン中に取り込まれたＢ領域オリゴヌクレオチドが濃縮される。未結合材料は、洗浄除去される。
【０１４２】
次いで、熱又はアルカリ条件によって、この濃縮された、結合したＢ領域オリゴヌクレオチド及びアンプリコンを固体支持体から放出させる。装置の検出領域の方向に、この材料を移動させる。Ａ領域を有するオリゴヌクレオチド又はアンプリコン中に取り込まれたオリゴヌクレオチドは、バイオセンサーにおいてＡプライム捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。バイオセンサーは洗浄することが可能であり、全ての取り込まれなかったＢプライマーが除去され、完全に取り込まれたアンプリコンのみが残存する。これは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドからバックグラウンドを効率的に除去する。
【０１４３】
核酸検査カートリッジの詳細な説明
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置及び読み取り機器とのその相互作用が、図６に幾何学的に示されている。これは、標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポート１０１を有する収容部１００を含む。入口ポートは、前記標的核酸を抽出するための試薬を有するチャンバー１０２に通じる。試薬１０３は、チャンバーの壁上に被覆することができる。チャンバーは、ビーズ１０４、例えば、核酸を結合するのに適したコーティングを有する磁気ビーズを含有し得る。好ましくは、チャンバーは、融解して、伝導路１０６への出口の領域中に連続した蝋層１０５を形成することができる蝋も含有する。好ましい磁気ビーズが前記標的核酸と会合したら、蝋層を通じて伝導路中にこれらを引き付けるために磁場を付与する。付与されるこの磁場は、試料からの核酸の抽出を促進するために、チャンバー中で振幅させてもよいことに留意されたい。場合により、抽出チャンバーを出る前に、洗浄流体をビーズに付与してもよい。洗浄流体チャンバー１２２は、入口ポートと抽出チャンバーの間に接続される。さらに、試料及び洗浄流体廃棄チャンバー１２３は、入口ポートに関して、抽出チャンバーの遠位末端に接続される。作動時には、抽出工程の後、磁気手段によってビーズはチャンバーの壁上に保持され、次いで、洗浄流体は、チャンバー１２２からチャンバー１０２を通じて、チャンバー１２３中に送られる。これにより、望ましくない試料材料が排除され、チャンバー１０２はビーズ及び主として洗浄流体を含有する状態になる。機器２００はチャンバー１２２に対して整列された作動手段２１１を含有し、チャンバーから洗浄流体を追放するために、柔軟な隔壁１２４に対する力を付与する。
【０１４４】
洗浄後、次いで、ビーズは、蝋層を通過して、伝導路１０６中に、次いで増幅チャンバー１０７中に進む。伝導路中のビーズの移動は、好ましくは、同じ磁気手段により、又は空気圧とすることも可能である。増幅チャンバーは増幅試薬保持チャンバー１０８にも取り付けられ、これは、好ましい実施形態におけるように、又はビーズがこのチャンバーに進入する前又は進入した後の分離された工程において、ビーズを有する増幅チャンバーへとこれらの試薬を送達することができる。あるいは、これらの試薬は、このチャンバー中に存在してもよく、要素１０８は省略してもよい。増幅試薬が最良に乾燥保存される別の代替法において、チャンバー１０８は、増幅チャンバーの壁上に被覆された希釈剤及び試薬を含有し得る。
【０１４５】
様々な増幅法、例えばローリングサークル及びリガーゼ連鎖反応に対して、上述のような増幅試薬を提供することができる。好ましい実施形態において、試薬は、ＰＣＲを用いて増幅された標的中に検出可能な部分を取り込む。場合により、付与される磁場は、増幅チャンバー中のビーズを混合するために使用され得る。これは、抽出チャンバーについて記載したものと同様の様式である。
【０１４６】
前記増幅チャンバーは、加熱手段１０９及び増幅チャンバーの温度を調節し、このため、標的核酸の増幅に適した条件を実施するための温度検知サーミスタ１１０も有する。好ましい実施形態において、増幅チャンバーは、３０サイクルにわたって、６８℃及び９０℃の間でサイクルにかけられる。各温度での時間は、それぞれ、５秒超及び３０秒未満である。収容部１００の主要部分はプラスチック製であるが、増幅チャンバーの少なくとも１つの壁は、優れた熱伝導特性を有する不活性材料（好ましくは、シリコン）から作製される。シリコンの逆側は抵抗性経路１１１並びに２つの電気接触パッド１１２及び１１３を有し、これらは加熱素子１０９を構成する。抵抗性経路を通過する電流は、シリコンチップの加熱を引き起こし、従って、増幅チャンバーの内容物の加熱を引き起こす。シリコンの逆側は、２つの電気的接触パッド１１５及び１１６への導線１１４によって配線されたサーミスタ１１０も有する。抵抗性経路を通過する電流を制御し、これにより、増幅チャンバーの温度を調節するために、サーミスタの出力は機器によって使用される。
【０１４７】
使い捨て装置１００は、場合により、入口ポートを密封するための閉鎖要素１１７も含み得る。これは、共有米国特許５，０９６，６６９号に記載されている種類のプラスチック留め金式閉鎖要素又は係属中の共有米国特許出願１０／６５８，５２８号のスライド閉鎖とすることができる。
【０１４８】
増幅チャンバーは、それぞれ、１１８及び１１９により、入口及び出口にも密封し得る。これは、温度サイクリングの間に試薬がチャンバー中に留まるように確保するのに望ましい。例えば、要素１１８及び１１９は、変形可能なゴムシールであり得る。収容部中の開口部１２０及び１２１を通じて移動し、１１８及び１１９と接触して密封をもたらす、機器中のピン要素２０９及び２１０によって、作動させることができる。ピン要素２０９及び２１０は、独立に、又は機器によって一緒に作動し得る。
【０１４９】
増幅チャンバーの出口は、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド１２７及びセンサー１２８を含む検知領域１２６を含有する第二の伝導路１２５に作動可能に取り付けられている。収容部１００は、前記検知領域へ増幅された標的を移動させるために増幅チャンバーに取り付けられた第二のポンプ手段１２９を含有する。ポンプ手段は、隔壁１３１を有する、空気が充填されたチャンバー１３０を含む。機器２００は、空気圧によってチャンバー１３０から空気を排除することにより、増幅された標的を検知領域の方向へ排除するために要素１３１に力を加えるための作動手段２１２を含有する。
【０１５０】
増幅された標的が検出装置領域に到達すると、増幅された標的は捕捉オリゴヌクレオチドに結合し、保持され得る。検出領域は、壁１５１上に被覆された乾燥した試薬層も含有する。好ましい実施形態において、プライマーを伴う部分（アンプリコンの一部となる。）はビオチンであり、乾燥した試薬１５１は、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである。アンプリコンとともに試薬を溶解すると、試薬は、周知のビオチン−アビジン相互作用を介して、ビオチンに結合する。作動中、この工程は、一般的には、約５分から約１５分を要する。別の実施形態において、前記部分は５’ＦＡＭ又は５’−ビオチンとすることができ、及び乾燥試薬は、抗ＦＩＴＣ−ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）又はストレプトアビジン−グルコースオキシダーゼ抱合体とすることができる。
【０１５１】
第三の伝導路１３２は、増幅チャンバーの出口と検知領域の間において、第二の伝導路１２５に取り付けられている。第三の伝導路１３２は、検出試薬１３４が入ったチャンバー１３３を有する。場合により、試薬は、柔軟な密閉されたホイル小袋１３５中に含有され、作動時には、機器は、小袋に力を与えて破裂機構１３６（好ましくは、収容部中に成型された鋭いプラスチックの点）に対して小袋を押し付けることにより小袋を破裂させることができる作動手段２１３を含有する。これにより、検出試薬は、第三の伝導路を通じて、第二の伝導路中に移動する。これにより、増幅された標的を捕捉オリゴヌクレオチドに結合させた状態に保ちながら、全ての未破裂の増幅された標的及びその他の材料が検知領域から排除及び洗浄除去される。収容部２００は、排除された材料を受容するために第二の伝導路に取り付けられた廃棄チャンバー１３７も含有している。
【０１５２】
最終工程において、検出試薬は、前記増幅された標的１３９中に取り込まれた部分１３８と反応して、センサー１４０にシグナルを生成する。部分がビオチンであり、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼに結合されている好ましい実施形態において、検出試薬は、酵素により加水分解されてｐ−アミノフェノールを形成するｐ−アミノフェノールホスファートである。次いで、これは、電流測定センサーの電極表面で電気化学的に酸化されて、経時電流測定（電流対時間のプロット）を示す図に記されているように、存在する部分の量に比例する電流を生じる。
【０１５３】
一体化された使い捨て装置を作動させるために使用される図６中の機器２００及び図２１中の６５０は、図２１では、検査装置と相互作用している状態で示されている。これは、使い捨て装置１００及び６５１を受容するためのポート６５４を含む。機器は、ユーザーが入力するためのキーパッド６５２及びディスプレイ６５３を有している。電気的接続要素及び作動要素の所望される相互作用を提供するために、機器に関して装置の位置を決めるための１つ又はそれ以上の位置決め機構２０２が提供される。機器は、チャンバー１０３中のビーズ１０４の位置に隣接する電磁石２０３を含有する。抽出チャンバーから増幅チャンバーへとビーズを移動させ、各チャンバー内でのビーズの混合を促進するために、電磁石を使用し得る。機器には、チャンバーに圧力を与え、試薬を増幅チャンバー中に排除させることができる増幅試薬保持チャンバー１０８の位置に隣接する作動手段２０４が含まれる。機器は、要素１１２と１１３を接触するための電気的接触２０５及び２０６の一対並びに１１１を通じて電流を通過させるための電力源も有する。機器は、サーミスタ１１０を接触させるための要素１１５及び１１６を接触させるための電気的接触２０７及び２０８の一対も含む。さらに、機器は、適切な電気的回路及びこれらの手段を通じて増幅チャンバーの温度を制御するための内蔵されたアルゴリズムを含む。
【０１５４】
機器は、収容部中の開口部１２０及び１２１を通じて移動し、１１８及び１１９と接触して１１８及び１１９を閉鎖し、増幅チャンバーを密封する、作動ピン要素２０９及び２１０を含む。分析サイクル中の適切な段階で密封を開始するための制御アルゴリズムとともにこの作動を実施するために、適切な電気力学的装備が含められる。
【０１５５】
機器は、共有米国特許第４，９５４，０８７号及び米国特許第５，０９６，６６９号に記載されている種類の電気的接続装置も有する。これは、収容部１００中のセンサー１２８への電気的接続を与えるために使用される。制御された温度、例えば３７℃で、検出工程を実施することが望ましい場合には、コネクターは加熱要素及びサーミスタ要素も取り込み、これらは、センサーに対して基材を提供するシリコンチップの裏側に接触する。これらの要素は、増幅チャンバーについて記載したものと同様の種類である。機器は、センサーの電位を調節し、及び電流を測定するために電流測定回路を有する。機器は、核酸測定を行い及び機器上のディスプレイスクリーン上に結果を表示するために、使い捨て装置上の機器によって行われる全分析系列を制御するための内蔵されたアルゴリズムも有する。電気的活性種が捕捉された標的に比例して生成又は消費される場合には、電位測定又は伝導度測定を用いてより適切に検出されるが、本分野において周知の別の回路も、機器に取り込まれる。
【０１５６】
別の実施形態において、使い捨て装置は、図１９及び２０に示されている２つの分離した部分から構成される。図１９は、分離した抽出装置４７０及び組み合わされた増幅及び検出装置４７１を示している。組み合わせた形態の要素は、抽出された材料を一方から他方へと移動させることに関連する装備を除き、図６中の一体化された装置に対して示されたものと同じ装備を有する。要素４７０は、入口ポート４１３、伝導路４１１、洗浄流体４１７及び廃棄チャンバー４１８、分離領域４２１、伝導路の末端部分６０１及び入口ポート５０２と合体する出口ポート５０２を含む。要素４７０は、４７１中の１つ又はそれ以上の開口部５００と合致する合体機構５２０及び５２１も有する。要素４７１は、増幅チャンバー４１０、伝導路４０９、チャンバー４０８、４０９及びセンサー４１９、４２０、出口伝導路４０５及び密封機構４０６を有する。図２０は図１９と類似しているが、組み合わされた抽出及び増幅コンポーネント４７２及び分離された検出コンポーネント４７３を含むことが異なる。適切には、合体機構が２つの間に配置される。
【０１５７】
図１８は、抽出、増幅及び検出を実行する装置中にフィルター領域４２１が組み込まれた追加の実施形態を示している。他の要素は、図１９のとおりである。図１７（ａ）は、反射率法によって調べられる光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示している。要素４０１によって光が生成され、センサー４０３と相互作用し、検出装置４００によって捕捉される。図１７（ｂ）は、検知領域がキュベット機構４０４である光学的使い捨てカートリッジを示しており、機器中に一体化された光源４０２と検出装置４００を用いた検出を可能とする。
【０１５８】
試料が口腔綿棒標本である場合には、抽出構成要素（磁石又はフィルターの何れかをベースとしたもの）は不要であり、試料は、増幅チャンバー中に直接挿入し得ることが見出される。図２８（ａ）及び図２８（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図（上及び下）を示している。この抽出及び増幅装置は、上記合体機構によって（図示せず）、検出カートリッジに取り付ける。
【０１５９】
収容部１００の一般的な寸法は、長さ約６ｃｍ、幅３ｃｍ及び高さ０．３ｃｍである。介在する両面接着テープ１４５によって一緒に固定される装置基部１４３と装置カバー１４４中には、好ましくは、伝導路及びその他の機構が設けられる、図６参照。基部及びカバーがプラスチック中に射出成型されている場合には、典型的には、ＡＢＳ又はポリカーボナート、伝導路及びシリコンチップを収容するための陥凹部、流体含有小袋などが成型された装備である。本実施形態において、粘着テープは、液体を所望の伝導路及びチャンバーに限定するための密封ガスケットとして作用する。粘着性テープガスケットの使用とともに、成型されたカバー及び基部要素の使用についての詳しい論述が、共有米国特許第５，０９６，６６９号及び係属中の米国特許公開２００３０１７０８８１号に見出され、これらは参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６０】
検出の詳細な説明
使い捨てカートリッジにおける検出の好ましい方法は電気化学であるが、蛍光、発光、比色、温度測定、光ファイバー、光導波路、表面音波、エバネセント波、プラスモン共鳴などのその他の検知方法を使用することが可能である。
【０１６１】
好ましいセンサー１２８は、カウンター参照電極３０１によって作動される電流測定電極３００を含み、図６に示されている。電流測定電極３００は、シリコンチップ３０２上に微小加工された１００μｍの直径の金層を含む。本分野で周知であるように、表面上に二酸化ケイ素の絶縁層を作製するために製造の第一工程では、シリコンチップが処理される。電極は、伝導線３０３によって、機器の電気的コネクターと接触するコネクターパッド３０４に接続される。伝導線は、典型的には、ポリイミド３０５の絶縁層で被覆される。増幅された標的に対して相補的であり、増幅された標的を捕捉することができるリガンド３０８を有する接着されたポリマー粒子３０７は、電極３００の上に直接、又はチップ上の隣接する位置３０６に位置する。カウンター参照電極は、同じシリコンチップ上に微小加工してもよく、又は第二の伝導路１２５中に隣接して配置してもよい。カウンター参照電極は、接触線３０９により、機器コネクターと接触する接触パッド３１０に付着された２００μｍの直径の銀−塩化銀層を含む。同じく、線３０９は、好ましくは、ポリイミド３の絶縁層で被覆される。電流測定センサーの微小加工の詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，２００，０５１号に見出される。
【０１６２】
２つの伝導性バー３１１及び３１２を含む伝導性センサーは、チップ３０２又は隣接するチップ３５０上に存在し、それぞれ、線３１５及び３１６により、パッド３１３及び３１４を接触させるために接続されている。図６を参照。液体又は空気がセンサーと接触しているかどうかを識別し、これにより、センサー３００に対する、第二の伝導路中での溶液の位置を決定するために、伝導性センサーは前記機器によって使用され得る。この溶液は、増幅された標的又は検出試薬を含有する溶液であり得る。場合により、伝導性センサーは、流体の位置を決定するために、抽出チャンバーと増幅チャンバーの両方に取り込まれ、又は隣接し得る。伝導性センサーの微小加工及び使用の詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，４４７，４４０号及び米国特許第６，７５０，０５３号に見出される。
【０１６３】
使い捨て装置１００の別の実施形態において、シリコンチップ３０２が透明なガラス窓に置き換えられ、装置の検知領域はキュベットを形成する。図１７。増幅された標的捕捉試薬はガラス上に固定され、本事例では、検出試薬は、前記部分（例えば、アルカリホスファターゼ）は、光学的に検出可能な信号（例えば、蛍光）を生成させる分子を含有する。このような分子は、本分野において周知である。他の全ての観点において、使い捨て装置の動作は、電気化学的検出モードと同じである。
【０１６４】
使い捨て装置を用いた核酸検査サイクルの詳細な説明
機器２００とともに、使い捨て装置１００を用いたアッセイサイクルの好ましい実施形態は、以下のとおりである。約１０μＬの血液試料が入口ポート１０１に添加され、毛管作用により、抽出チャンバー１０２の中へ引き込まれる。次いで、入口ポート閉鎖要素１１７を使用して、入口ポートを密封する。カオトロピック剤、ドデシル硫酸リチウム及びジチオスレイトール及びキレート剤（エチレンジアミン四酢酸）を含み、チャンバーの壁上に被覆されている試薬１０３は、血液試料中に溶解し、細胞の溶解を引き起こし、細胞内から得られた核酸が開放され、磁気ビーズ１０４上のカルボキシラートコーティング上に吸着される。ビーズを撹拌してチャンバー内での混合を促進し、抽出の速度を加速するために、磁場を使用することができる。抽出プロセスの本工程は、一般的には、約０．３ないし１分未満を要する。磁場が配備される場合には、これは、機器の自動制御下にあり、検査サイクルを制御する内蔵されたアルゴリズムによって決定される。一旦、この工程が完了したら、機器は、抽出チャンバーの側面に磁気粒子を保持する磁場を配備する。洗浄流体チャンバー１２２からの洗浄流体は、次いで、抽出チャンバー中に空気圧で強制的に送り込まれ、洗浄流体廃棄チャンバー１２３中に内容物を流す。洗浄流体廃棄チャンバーは排気口１４６を有すること、及びこの工程の間、機器は入口１１８を増幅チャンバーに密封させ、従って、廃棄流体は伝導路１０６に進入せずに、廃棄チャンバー中に誘導されることに留意されたい。本工程は、約３０秒を要する。好ましい実施形態における洗浄液は脱イオン水であり、抽出チャンバーを通して通過する洗浄流体の容積は２０ないし３０μＬである。図２３に示されているように、増幅チャンバーの１つの壁を形成するシリコンチップは、抽出チャンバーの１つの壁も形成し、従って、抽出過程は制御された温度で行われ得ることにも留意されたい。好ましい実施形態において、血液からの核酸抽出は室温で行われる。
【０１６５】
次の工程では、機器は入口シール１１８を開放し、抽出チャンバーの壁から磁気粒子を放出させ、抽出チャンバー及び増幅チャンバーに通じる伝導路の境界において蝋層を通じて磁気粒子を引き付ける。機器は、抽出チャンバーの温度が蝋を液体形態にするのに十分であり、及び磁気粒子が通過できるように確保する。好ましい実施形態において、蝋はパラフィンであり、制御された温度は４５℃ないし７０℃である。前に論述したように、蝋を通じた粒子の通過は、ＰＣＲ増幅の妨害物質（ヘモグロビンを含み得る。）を最小限に抑える。次いで、粒子は、増幅チャンバー中に引き込まれる。好ましい実施形態において、増幅チャンバーは１０ないし２０μＬの容量を有する。図２３に示されているように、チャンバー６０６は、計８ｍｍの長さ、８ｍｍの幅及び０．２５ｍｍの高さを有する「Ｕ字」形状である。図２３に示されている要素６０９の他の装備は、チャンバー６００及び６０２、ポート６０３、６０４及び６０７、伝導路６０１及び６０８並びに加熱装置６０５である。
【０１６６】
本過程の次の工程は、そのチャンバーから増幅チャンバー中にＰＣＲ増幅試薬を空気圧で排除する機器を含む。ＰＣＲ増幅試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液及び修飾されたプライマーを含む。プライマーは、標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域、付着された検出可能な部分（ビオチンである。）を有するポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含む。好ましい実施形態において、緩衝液は、抗ＫＯＤ抗体と複合体を形成したサーモコッカス種のＫＯＤ熱安定的ポリメラーゼ２２Ｕ／ｍＬ、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ８．４）、３０．８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１１ｍＭのＫＣｌ、１．１ｍＭのＭｇＳＯ４、３３０μＭのｄＮＴＰ並びにタンパク質及び安定化剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｍａｎｕａｌ， Ｃａｔ． Ｎｏ．１２３４４−０４０）からなるが、あるいは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｃａｔ＃ ６００１３５ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ＄ ０６４００３ｄ）に記載されているように、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．８）， ２ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌの無ヌクレアーゼＢＳＡでもあり得る。
【０１６７】
次の工程では、機器は、増幅チャンバー中にビーズ及び試薬を保持するために、装置中の２つの密封要素１１８及び１１９を密封し、９５℃と９９℃の間での温度及び６８℃でのハイブリダイゼーション工程（各温度での持続時間は、それぞれ、２秒及び１２秒）を３０サイクル繰り返す。総増幅時間は、約１２分である。一旦、この工程が完了したら、次いで、増幅チャンバーから、装置の検出領域に通じる伝導路中に増幅された標的を移す。一実施形態において、ＰＣＲ反応の終了時に、ＰＣＲチップの入口及び出口ポートを密封するガスケットは、入口及び出口ポートの両方から離昇される。カートリッジ中に空気袋が沈降されており、入口ポートガスケット中に正の空気圧を作出し、液体を出口ポートガスケットから排出し、チップの最終検出領域方向に液体を移動させる。ここでは、検出領域への液体の移動をモニタリングするために、伝導性バーの組が使用される。
【０１６８】
好ましい実施形態において、貝状プライマーが使用され、従って、検出領域につながる加熱されていない伝導路中では、これらのプライマーはそれ自身に再アニールし、妨害物質としてアッセイから効果的に除去される。別の実施形態において、望まれないプライマーを分離するために電気泳動が使用される場合、図１２及び１３に記載されている要素は、図２４に示されているような使い捨て装置へと組み合わされる。この分離過程は上記されている。電気泳動分離を有する使い捨て装置において、機器は、電気泳動電極７４、７５及び７６（図１３参照）並びに６５２、６５３及び６５４（図２４参照）への電気的な接続を作る。本装置において、本工程の時間は、プライマー及びアンプリコンのサイズに応じて、典型的には、１ないし２分未満である。未使用のプライマーの酵素的除去が使用される別の実施形態において、増幅チャンバーから検出領域へと至る伝導路の壁１５０の一部へ酵素的混合物が適用される。この材料は、アンプリコンを含有する液体上に溶解し、上記の非妨害形態へとプライマーを変換する。壁上の乾燥した試薬混合物は、好ましくは、迅速な溶解を促進するトレハロース又はフィコールを含む支持体マトリックス中の酵素である。酵素的工程に要する時間は、典型的には、約６分であり、酵素の量、温度、除去されているプライマーの種類に依存する。別の実施形態において、アンプリコンの検出領域を除去する、第一の捕捉オリゴヌクレオチドを用いたアンプリコンの後ハイブリダイゼーションに続いて、最終捕捉工程中で関与する全ての未結合の取り込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する洗浄工程を使用することができる。第一の捕捉工程で結合されたアンプリコン及びプライマーは、次いで、熱又はアルカリ条件を用いて未結合にされ、次いで、最終検出領域へと移動され、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは作製されたアンプリコンを完全に捕捉する。
【０１６９】
次の工程において、アンプリコンは検出領域に到達し、検出チャンバー１５１の壁上で試薬の溶解が起こる。好ましい実施形態において、本試薬は、好ましくはビオチンである、アンプリコン上の部分に結合して、アンプリコン及び酵素の複合体を形成するストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである。次いで、この複合体は、センサー上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合することができる。速度論に応じて、アンプリコンは、まず、捕捉オリゴヌクレオチドに結合し、次いで、標識された酵素に結合し得る。この装置において、本工程の時間は、典型的には、約５ないし１５分である。
【０１７０】
最終工程では、検出試薬は、検出試薬チャンバーから検知領域中へと排除され、これにより、未結合の、アンプリコン及び標識された酵素は全て、廃棄チャンバーへと排除される。ハイブリダイゼーション工程の効率を向上させ、これにより、ハイブリダイゼーション時間及び必要とされる洗浄流体の量を減らすために、センサーの領域中に乱流を引き起こすくびれである要素１５２及び１５３を場合により含めてもよい。本装置において、本工程の時間は、典型的には、７０秒未満であり、使用される洗浄流体の量は、約１０ないし５０μＬである。前に述べたとおり、洗浄流体は、検出を可能とする試薬も含有する。流体の後ろの部分がセンサー上に保持されるので、捕捉されたアルカリホスファターゼは、試薬ｐ−アミノフェノールホスファートをｐ−アミノフェノールへと変換させることが可能であり、ｐ−アミノフェノールは、次いで、電極で酸化されて、測定可能な電流を生じる。この装置において、本工程の時間は、典型的には、１分未満である。センサーに対する後方末端の位置決めは、上述のように伝導性センサーを形成する電極１５５及び１５６の対を用いて達成し得る。
【０１７１】
測定された電流は、元の試料中に存在することが疑われる標的核酸の存在又は不存在を決定するために、前記機器によって使用される。これは、定性的結果であってもよく、又は標的が存在する場合には、試料中の標的の量の定量的測定であってもよい。特定の標的因子に対するアルゴリズム、抽出チャンバーに進入する当初試料容量、増幅サイクルの数及び効率並びに捕捉反応の効率性の他、試料中の標的の当初濃度を決定するためのその他のあらゆる必要な因子。このような因子は、基準方法から得られた公知の試料を用いて、独立に決定される。これらの方法は、本分野において周知である。
【０１７２】
関連する実施形態において、第一のセンサーへの、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼの何らかの非特異的結合を計上するために、検出領域中に第二のセンサー１５４が提供される。第二のセンサーは第一のセンサーと同じであるが、アンプリコンに結合しない捕捉オリゴヌクレオチドを有する。第二のセンサーにおける一切のシグナルは、アルゴリズムによって、第一のセンサーにおけるシグナルから差し引かれる。
【０１７３】
使い捨て装置中への試料の進入及び機器中への挿入からの、本アッセイの総時間は約１０と２０分の間を要し、一般的に、特異的標的及び増幅サイクルの必要とされる数に依存する。遺伝的検査が完了し、結果が機器によって表示されると、機器内の作動機構は、次いで、装置を開放し、装置はユーザーによって取り外され、廃棄できる。次いで、機器は、新しい使い捨て装置を受容できる状態となる。開示されている装置と機器の組み合わせの著しい利点は、一旦、試料が装置に入ると、全ての他の工程が機器によって制御されるため、検査サイクルにおいて起こり得る人為的エラーがなくなることである。これは、分析的研究室の測定に特に習熟していない者によって、信頼性高く、システムを使用できるということを意味する。例えば、医師は、ベッドサイドで、又は患者が職場を訪問している間にシステムを使用し得る。システムは、離れた場所、例えば、環境のモニタリング及び有害性評価においても使用し得る。この設計のさらなる利点は、それが、より安全な廃棄のために装置内に試料残留物及び増幅された材料を保持することである。
【０１７４】
収容部１００の別の実施形態において、抽出チャンバー１０２は、キレート剤及びカオトロピック剤を含む抽出試薬が含浸された、フィルター材料１５７及び４２１を含有する。抽出チャンバーの１つの壁は、温度を調節するためのサーミスタを有する加熱要素からも構成される。フィルター材料は、好ましくは、３ＭＭ Ｗｈａｔｍａｎペーパーから構成され、核酸を優先的に結合するカルボキシル化された表面を有する。試料、例えば血液が、抽出チャンバーに進入すると、試料は抽出試薬を溶解し、細胞材料から得られた核酸はフィルターに結合する。抽出プロセスの本工程は、約０．５ないし２分を要する。洗浄流体チャンバー１２２由来の洗浄流体の塊は、次いで、抽出チャンバーを通じて押し出され、洗浄流体廃棄チャンバー１２３中に排出され、抽出された核酸をフィルター上に吸着された状態にしつつ、溶解された細胞の細片を試料から運び去る。完全な洗浄を確保するために、洗浄流体の複数の塊を使用し得る。次いで、洗浄流体のさらなる塊がチャンバー中に押し出され、機器は加熱要素を活性化し、サーミスタにより、流体の塊の温度が９０℃になるように調節する。これは、フィルター上に吸収された核酸を、フィルターから脱離させ、流体中に溶解させる。次いで、核酸材料を含有する流体は、空気圧で、増幅チャンバーに移される。本実施形態において、洗浄流体は、好ましくは、脱イオン水である。
【０１７５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１
＜２１１＞長さ：３１
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３１
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１
【０１７６】
【化５】
【０１７７】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号２
＜２１１＞長さ：２０
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２０
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：２
【０１７８】
【化６】
【０１７９】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号３
＜２１１＞長さ：２２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：３
【０１８０】
【化７】
【０１８１】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号４
＜２１１＞長さ：２２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：４
【０１８２】
【化８】
【０１８３】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号５
＜２１１＞長さ：５９
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−５９
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：５
【０１８４】
【化９】
【０１８５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号６
＜２１１＞長さ：７５
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−７５
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：６
【０１８６】
【化１０】
【０１８７】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号７
＜２１１＞長さ：７９
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−７９
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：７
【０１８８】
【化１１】
【０１８９】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号８
＜２１１＞長さ：３８
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿特徴
＜２２２＞位置：１−３８
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：８
【０１９０】
【化１２】
【０１９１】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号９
＜２１１＞長さ：３３
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３３
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：９
【０１９２】
【化１３】
【０１９３】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１０
＜２１１＞長さ：３５
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３５
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１０
【０１９４】
【化１４】
【０１９５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１１
＜２１１＞長さ：３２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１１
【０１９６】
【化１５】
【０１９７】
上記の典型的な実施形態は、あらゆる観点において例示を意図したものであり、本発明を限定することを意図したものではない。従って、本発明は、当業者により、本明細書の記述から誘導され得る多くの変更及び改変を実施することができる。このような変更及び改変は全て、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲及び精神に属するものであると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抽出、増幅及び検出を一緒に行うことができる一体化された核酸検査カートリッジに関する。本発明は、核酸抽出のみ、又は抽出と増幅を組み合わせて行うための装置及び方法にも関する。さらに、本発明は、増幅と検出を組み合わせて行うための装置及び方法に関する。カートリッジには、光学的及び電気化学的検出法を可能にするなどの検知手段を装備することができ、標的核酸を試料から分離するために蝋又は吸収性フィルター抽出機構も装備し得る。カートリッジは、ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅及び鎖置換増幅などの増幅の様々な方法を実施することが可能である。本発明は、選択される増幅方法に応じて、単一の修飾されたプライマー又は修飾されたプライマーの対を含む新規増幅方法及び試薬にも取り組む。さらに、本発明は、核酸検査中のアンプリコンからプライマーのための一体化された電気泳動分離を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸検査の重要性に対する一般的な背景
核酸検査の応用は広範である。現在の商業的検査の多くは、クラミジア、淋病、肝炎及びヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）ウイルス負荷などの感染性疾患、嚢胞性繊維症などの遺伝病、血色素症などの凝固及び血液学因子、並びに乳癌遺伝子などの癌に関する。興味が持たれるその他の領域には、心血管疾患及び薬理ゲノム学と名付けられた薬物耐性スクリーニングが含まれる。現在、検査の大半は、操作が複雑な非携帯性装置を用いて、集中管理方式の研究室で行われている。現在、検査は、一般的には、アッセイを実施するために高度な技術を身に付けた個人を必要とする。その結果、特異的な核酸断片を含有すると疑われる試料の取得と、その有無の測定との間に要する時間は、しばしば、数時間、時には数日にさえ及ぶ。しかしながら、血液検査の他の種類と同様、医師及びその他の者は、より迅速に、ユーザーが使いやすい便利な形式で取得できる結果を必要とすることが多い。従って、核酸検査を迅速且つ便利に実施することができる携帯分析システムに対する必要性が存在する。核酸検査の様々な態様に関する従来技術の論述は、以下の部に記載されている。
【０００３】
遺伝情報を特徴付けるための方法
特定の遺伝的な特徴の臨床徴候は、遺伝を基礎とする疾患の異なる種類又はクラスに応じて異なり得る。これは、ＳＮＰ変異検出、遺伝子コピー変異及び遺伝子過剰発現変異などの遺伝的な特徴を測定するための様々なアプローチに結び付いた。例えば、血色素症、嚢胞性繊維症又は発癌遺伝子ｐ５３などの幾つかの疾病は、特異的なヌクレオチドにのみ影響を与える１つ又は数個の極めて特異的な突然変異を有する。血色素症を考えると、２つの特異的突然変異が存在する。本疾病の臨床徴候は、様々な組織内への鉄の蓄積であり、これは治療しなければ致死的となり得る。最も多い変異は、遺伝子中のヌクレオチド８４５におけるＧからＡへの転位（Ｃ２８２Ｙとも称される。）である。Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネットサイトで見ることができるＯＭＩＭ：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎデータベースを参照されたい。同じ血色素症遺伝子中に、次に多く見られる突然変異は、エキソン２中のＣからＧへの塩基転換（Ｈ６３Ｄとしても知られる。）である。これらは、一塩基多型（ＳＮＰ）として知られる。全ての個体は各遺伝子の２コピーを有するので、これらの遺伝子の可能な組み合わせは２つの野生型（ホモ接合野生型）、２つの変異された遺伝子（ホモ接合変異体）又は１つの野生型及び１つの変異遺伝子（ヘテロ接合）である。血色素症の場合には、ホモ接合変異体である個体は病気の状態を呈し、ヘテロ接合の個体は、ホモ接合野生型の個体に比べて、鉄のより高いレベルを蓄積するので、本疾病の幾つかの側面に対して感受性が高い場合があり得る。また、個体がその子孫へ疾病を伝達するかどうかを決定する目的で、個体がヘテロ接合であることを決定できることは有用であり得る。
【０００４】
その結果、血色素症のような遺伝病を検査する上で、分析手段又は検出用チャンネルを少なくとも４つ有し得ることは有用である。ここで、１つのチャンネルは野生型Ｃ２８２の存在を検出し、第二のチャンネルは変異体Ｙ２８２遺伝子の存在を検出し、第三のチャンネルは、野生型Ｈ６３遺伝子の存在を検出し、第四のチャンネルは変異体Ｄ６３遺伝子の存在を検出する。図１２は、この種の血色素症検査から得られ得る結果の表を表し、ホモ接合又はヘテロ接合を識別できること、及びホモ接合チャンネルはほぼ２倍の発現レベルを生じるため、検査におけるシグナルもほぼ２倍となっていることを示している。陽性及び陰性対照として使用するために１つ又はそれ以上のさらなるチャンネルを有することも有用であることに留意されたい。
【０００５】
幾つかの遺伝的変異には、ゲノム中に存在し、患者に病気の状態をもたらす遺伝子の複数コピーが含まれる。一例として、２０ｑｌ３．２の中にマッピングされた発癌遺伝子ＺＮＦ２１７が、大腸癌の個体中に複数コピーで発見されている（Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｖｏｌ ２０４（３）：２８２）。α−シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の遺伝的三重重複が、認知症を伴う遺伝的早発性パーキンソン病を引き起こすことが報告されている（Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｌａｎｃｅｔ， ｖｏｌ ３６４（９４４０）：１１６７）。「Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ５２（２）：１０１．，」は、運動神経細胞生存因子（ＳＭＮ２）遺伝子の増加した遺伝子コピーに関連する成人期発症のＩＩＩ型脊髄性筋萎縮症の増加が存在することを見出した。これらの遺伝子コピー突然変異は、ハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）などの１つ又はそれ以上の必要とされる遺伝子を使用することによって検出することができる。過剰発現突然変異は、典型的には、ｍＲＮＡの増加したレベルを生じ、これらは検出することが可能である。
【０００６】
核酸の抽出のための方法及び装置
細胞中に見出される核酸は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸であり得、並びにゲノムＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（例えば、プラスミド及びエピソーム）、ミトコンドリアＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ及び転移ＲＮＡであり得る。核酸は、宿主にとって外来性であってもよく、感染性因子（例えば、細菌、ウイルス、真菌又は単細胞生物及び感染性多細胞生物（寄生生物）として細胞に混入し得る。最近、一塩基多型（ＳＮＰ）、染色体の再編成及び外来遺伝子の挿入の同定のために、核酸の存在の検出及び分析が重要となっている。これらには、感染性ウイルス（例えば、ＨＩＶ及びその他のレトロウイルス）、ジャンピング遺伝子（例えば、トランスポゾン）及び組換え的に操作された外来遺伝子含有生物（例えば、Ｒｏｕｎｄｕｐ ＲｅａｄｙＴＭ植物）から得られる核酸の同定が含まれる。
【０００７】
核酸の分析は、幅広い用途を有する。例えば、外来因子の存在は、医学的診断ツールとして使用することが可能である。癌組織の遺伝的構成の同定は、医学的診断ツールとして使用することが可能であり、組織が癌であることを確認し、及び癌組織の浸潤性を決定する。染色体の再編成、ＳＮＰ及び遺伝子発現の異常な変化は、特定の疾病状態に対する医学的診断として使用することが可能である。さらに、遺伝情報は、特定の医薬の有効性を確かめるために使用することが可能であり、薬理ゲノム学の分野として知られている。ヒト間及び家畜間での遺伝的変動は、ＤＮＡ分析によって確かめることもできる。これは、法医学、父子鑑定及び畜産業などの分野で使用されている。
【０００８】
細胞から核酸を抽出する方法は、当業者に周知である。細胞壁は、様々な方法によって弱化させることができ、核酸を細胞から押し出すことを可能とし、核酸のさらなる精製及び分析を可能とする。核酸抽出の具体的な方法は、単離されるべき核酸の種類、細胞の種類及び核酸を分析するために使用される具体的な用途に依存する。ＤＮＡを単離する多くの方法が当業者に公知であり、例えば、一般的な参考文献である「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”」を参照されたい。例えば、従来技術には、体液からＤＮＡを抽出及び単離するための化学的に含浸され及び脱水された固体基材の例が含まれ、本固体基材は、溶解性の塩及び界面活性剤を使用し、並びにＤＮＡ試料の長期保存のためのさらなる試薬を含有する。例えば、ＦＴＡペーパーについて詳述する米国特許第５，８０７，５２７号及びＩｓｏｃａｒｄ Ｐａｐｅｒについて詳述する米国特許第６，１６８，９２２号。従来技術には、粒子分離方法の例（例えば、ＵＳ ＲＥ３７，８９１）も含まれる。
【０００９】
ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離する方法は、当業者に周知である。典型的には、細胞破壊は、ＲＮＡ単離操作中にＲＮＡｓｅを不活化する強いタンパク質変性溶液の存在下で行われる。次いで、ＲＮＡは、遠心を用いた差異的エタノール沈殿を用いて単離される。周知のごとく、ＲＮＡは極めて脆弱であり、アルカリ条件及びＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅに対して感受性である。ＲＮＡｓｅは環境内に遍在しており、ＲＮＡを単離するために使用される溶液及び容器からＲＮＡを除去するのは困難であることが明らかとなっている。
【００１０】
核酸の増幅のための方法及び装置
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、組織試料の数多くの種類からのゲノムＤＮＡの精製の標準的方法中に持ち込まれる多数のタンパク質及び他の夾雑物によって阻害される。血液からゲノムＤＮＡ試料中のＰＣＲ阻害剤を除去するために、フェノール、クロロホルム及びエーテルを用いた有機抽出又はカラムクロマトグラフィー又は勾配ＣｓＣｌ超遠心のさらなる工程を行い得ることが知られている。しかしながら、これらの工程は、時間、複雑さ及び費用を増加させる。この複雑さにより、核酸分析に有用な単純な使い捨てカートリッジへの導入が制約される。従って、核酸増幅過程のために使用される核酸試料中に見出される阻害剤を克服するための新しい単純な方法の開発が望まれる。
【００１１】
核酸ハイブリダイゼーションは、標的核酸分子についての識別可能な特徴を検出するために使用される。「サザン分析」のような技術が、当業者に周知である。標的核酸は、電気泳動で分離された後、膜に結合される。 次いで、標識されたプローブ分子は、本分野で周知の技術を用いて、膜に結合された核酸にハイブリダイズされる。検出の感度は標的材料の量及びプローブの特異的活性に依存するので、本方法には限界がある。プローブの特異的活性は不変であり得るので、これらのアッセイの感度を向上させるために、核酸を増幅する方法が使用される。核酸増幅技術については、標的コピーの数を増幅した後に検出の感度を増加させるか、又は検出のために生じたシグナルを増加するために核酸の存在を使用するという２つの基本的な戦略が使用される。第一のアプローチの例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル（米国特許第５，８５４，０３３号参照）及び核酸系に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。第二の例には、ＣＰＲと呼ばれるサイクリングプローブ反応（米国特許第４，８７６，１８７号及び米国特許第５，６６０，９８８号参照）及びＳＮＰアーゼアッセイ、例えば、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（米国特許第５，６５６，４３０号及び米国特許第５，７６３，１７８号を参照）が含まれる。
【００１２】
ＰＣＲ反応は当業者に周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号に最初に記載された。本方法は、核酸を変性すること、ハイブリダイゼーション工程及び伸長工程の反復サイクルを含み、核酸試料及び試薬の温度の変化させることによって実施される。異なる温度へ試料を供する本方法は、異なる温度の水槽中にチューブを配置することにより、又は米国特許第５，３３３，６７５号及び米国特許第５，６５６，４９３号に記載されているように、電流の方向に応じて加熱若しくは冷却を生成することができるペルチェを基礎とした装置を使用することにより実施することができる。多くの市販の温度サイクル装置が入手可能であり、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆによって販売されている。これらの装置は一般的に大きく且つ重いので、非研究室環境、例えば看護の場所で使用するには一般に適していない。
【００１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための微細加工された装置が米国特許第５，６３９，４２３号に記載されているが、核酸を抽出するための一体化された手段を提供することに関しては触れていない。ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための装置が米国特許第５，６４５，８０１号に記載されており、該装置は検出用チャンバーに対して密閉可能な様式で結合することが可能な増幅チャンバーを有する。米国特許第５，９３９，３１２号は、小型化されたマルチチャンバーポリメラーゼ連鎖反応装置を記載している。米国特許第６，０５４，２７７号は、増幅及び検出用の、シリコンを基礎とした小型遺伝検査プラットフォームを記載している。ポリマーをベースとした増幅反応用加熱コンポーネントが米国特許第６，４３６，３５５号に記載されている。米国特許第６，３０３，２８８号は、増幅用試薬を含有する破裂可能な小袋を有する増幅及び検出システムを記載している。米国特許第６，３７２，４８４号は、一体化された装置中でポリメラーゼ連鎖反応並びにこれに続くキャピラリー電気泳動分離及び検出を実施するための装置を記載している。
【００１４】
反応が単一温度で実施されるという点でＰＣＲ反応とは異なる幾つかの核酸増幅技術が存在する。これらの等温法には、プローブ反応、鎖置換、ＩｎｖａｄｅｒＴＭ、ＳＮＰアーゼ、ローリングサークル反応及びＮＡＳＢＡを繰り返すことが含まれる。米国特許第６，３７９，９２９号は、等温核酸増幅反応を実施するための装置を記載している。
【００１５】
より最近では、等温的にポリメラーゼ連鎖反応を実施するための戦略が「Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４， ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ｖｏｌ ５（８）」によって記載されており、米国特許出願２００４００５８３７８号も参照されたい。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅を実施するために試料を加熱することの制約を克服するためにＤＮＡヘリカーゼ酵素が使用される。
【００１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用される酵素
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、幾つかの中核的特徴を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素の能力に基づいており、この能力には、３’−ヒドロキシル基を有するプライマー及びＤＮＡテンプレート配列を使用する能力及びテンプレート鎖を用いてＤＮＡの新たに合成された鎖を伸長する能力が含まれ、全て当業者に周知である。さらに、ＰＣＲ反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡテンプレートを変性するために使用される高温（例えば９０ないし９９℃）に耐えることができなければならず、及びＤＮＡプライマーがＤＮＡテンプレートにハイブリダイズするより低い温度（例えば、４０ないし６０℃）で不活性でなければならない。さらに、ハイブリダイゼーション温度（例えば、６０ないし８０℃）に近い温度で最適なＤＮＡ合成を有すること。
【００１７】
さらに、これらの中核的な特徴に加え、ＤＮＡポリメラーゼは、多くのＤＮＡポリメラーゼに固有の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に起因する校正能力も示す。末端の３’ヌクレオチドが標準的な核酸プライマーから切り出され、両対立遺伝子の合成が可能となるので、ＰＣＲを用いた識別的プライマー伸長（３’対立遺伝子特異的プライマー伸長とも称される。）に基づく一塩基多型（ＳＮＰ）検出においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す酵素を使用することは不利である。
【００１８】
「Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００３， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ｖｏｌ ８３（８）：１１４７）」は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対して使用されるＤＮＡポリメラーゼの制約を克服するための、末端ホスホロチオアート結合の使用について記載している。ホスホロチオアート結合は、３’−５’エキソヌクレアーゼによって切断されない。これにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは末端のミスマッチの除去及びＤＮＡ伸長を伴う進行、正常なＤＮＡで観察される区別の欠如の軽減ができなくなる。
【００１９】
ＤＮＡポリメラーゼの別の特徴は、それらの伸長速度である。「Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ６３（１１）：４５０４）」は、ピロコッカス種の株ＫＯＤ１（現在、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）及びサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）が、それぞれ、１０６ないし１３８、２５、２３及び６１塩基／秒の伸長速度を有することを教示する。これらの酵素の加工速度も記載されており、伸長速度と同様に挙動する。明らかに、サーモコッカス・コダカエレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｅｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１は、他の周知の酵素に比べて、ずっと高い伸長及び加工速度を有しており、このため、感度と速度が重要事項である用途において、本酵素は有益なものとなる。さらに、サーモコッカス・コダカエレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｅｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１は、ＳＮＰ分析に対して使用される３’−対立遺伝子特異的プライマー伸長アッセイにおいて使用する場合に有害であるエキソヌクレアーゼ活性を有している。
【００２０】
合成オリゴヌクレオチドの設計
増幅反応において使用するための合成オリゴヌクレオチドの設計に関しては、「Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ １７（２１）：８５４３−８５５１）」及び「Ｒｙｃｈｌｉｋ （１９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ３：１２９−１３４）」は、ＤＮＡのインビトロ増幅用プライマーなどの、プローブ及びプライマーを設計するための選択基準及びコンピュータプログラムについて記載さしている。何れも、プライマーは、二次構造を生成すべきでなく、又は自己ハイブリダイゼーションを示すべきでないことを教示している。
【００２１】
分子ビーコンとして設計されたＰＣＲプライマー（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ ９６：６１７１−６１７６）は、ドナー及び消光分子を互いに物理的に近接して配置することによって蛍光シグナルを消光するために、ヘアピンループ構造として知られる相補的な生成である短い領域を５’及び３’両末端に有する。重合及び新たに合成された２本鎖分子中への取り込み後、ドナー分子及び消光分子は、互いに物理的に離れて、蛍光シグナルの生成が可能となる。相補性の領域は短く、典型的には、相補的である約５ヌクレオチドを有するに過ぎず、好ましくはヘアピンステムを生成する。「Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ３１（４）：１３１９−１３３０」は、より長いステム長を有する分子ビーコンが、より広い温度範囲にわたって、標的間を識別する向上した能力を有することを教示している。しかしながら、これには、分子ビーコン−標的ハイブリダイゼーションの速度の減少が伴う。より長いプローブ長を有する分子ビーコンは、より低い解離定数、増加した速度論的速度定数及び減少した特異性を有する傾向がある。従って、より長いステムループを有することは、ハイブリダイゼーション速度論の効率性を低下させる影響を有しており、次いで、これは、ＰＣＲ増幅のレベルを低下させる。従って、ステムループ構造を使用するＰＣＲは、一般的には、本分野において望ましくない。「Ｋａｂｏｅｖ ｅｔ ａｌ．， （２０００， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ２８（２１）：ｅ９４）」は、３’末端に対して相補的であるプライマーの５’末端に追加配列を付加することによって、ステムループ構造を有するＰＣＲプライマーを設計することを教示している。本参考文献は、この二次構造を追加することがＰＣＲ反応の特異性を増加させるが、一本鎖尾部の生成を可能とするＰＣＲプライマーを使用することも教示している。さらに、Ｋａｂｏｅｖは、二次構造の生成が一本鎖領域の捕捉部分へのハイブリダイゼーションを妨害することを教示していない。
【００２２】
検出方法
核酸分析中の最後の工程のための慣用の検出方法が本分野において周知であり、放射能、比色分析、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）及び電気化学に基づくサンドイッチ型の捕捉方法が含まれる。例えば、共有米国特許第５，０６３，０８１号は、核酸検出用センサーを取り上げている。本センサーは、電極上に選択透過性の層及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有するタンパク質性のパターン化された層を有する。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの活性な断片又はサブユニット又は一本鎖であり得る。核酸を固定化するためのカップリング手段は、固定化された核酸プローブが試料中の相補的標的配列に結合する方法とともに記載されている。
【００２３】
検出は、好ましくは、電気化学的であり、標的の異なる領域にも結合する標識されたプローブに基づく。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質とともに、プローブ及びポリヌクレオチド配列によって形成されるハイブリッドに対する固定化された抗体を使用することが可能である。’０８１特許は、センサーを用いて試料中でアッセイを実施するための使い捨てカートリッジを取り上げる共有米国特許第５，０９６，６６９号を参照により組み込む。これらのセンサーは、’０８１に記載されている種類のセンサーであり得る。
【００２４】
’０８１に関連する他の分割特許には、核酸成分であり得るリガンド受容体で被覆された選択透過性膜を用いて複数のセンサーを製造する方法を取り上げている米国特許第５，２００，０５１号が含まれる。米国特許第５，５５４，３３９号は、分配のための、フィルム形成ラテックス又はタンパク質性の光形成可能なマトリックス中に核酸成分が取り込まれる、微量分配を取り上げる。米国特許第５，４６６，５７５号は、フィルム形成ラテックス又はタンパク質性の光形成可能なマトリックス中に取り込まれた核酸成分を有するセンサーを作製するための方法を取り上げる。米国特許第５，８３７，４６６号は、核酸成分などのセンサー成分を用いてリガンドをアッセイするための方法を取り上げる。例えば、標的がセンサー上の受容体に結合し、及び標識されたプローブによっても標的が結合される定量的オリゴヌクレオチドアッセイが記載されている。本標識は、センサー、例えば電気化学的センサーによって検出されるシグナルを生成することが可能である。米国特許第５，８３７，４５４号は、核酸成分であり得るリガンド受容体で被覆された選択透過性膜を用いて複数のセンサーを製造する方法を取り上げる。最後に、共有米国特許第５，４４７，４４０号は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対して適用可能な凝固アフィニティーに基づくアッセイを取り上げる。これらの共有特許は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２５】
共有米国特許第５，６０９，８２４号は、試料（例えば、血液）を３７℃になるように温度制御するために適用することができる使い捨てカートリッジ内で使用するための温度制御されたチップを開示していることは注目に値する。共有米国特許第６，７５０，０５３号及び係属中の米国特許公開２００３０１７０８８１は、ＤＮＡ分析を含む様々な検査に適した使い捨てカートリッジの機能的流動性要素について取り組む。これらの更なる共有特許及び出願は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
幾つかの他の特許は、核酸の電気化学的検出に取り組んでおり、例えば、米国特許第４，８４０，８９３号は、媒介物質、例えばフェロセンを使用する酵素標識を用いた検出を開示している。米国特許第６，３９１，５５８号は、電圧パルスの終了時に電極によってレポーター基が検出され、レポーター基が電極上の金粒子及びビオチン固定化を使用する、標的へ結合する電極上の一本鎖ＤＮＡを開示している。米国特許第６，３４６，３８７号は、別の媒介物質アプローチを開示しているが、遷移金属媒介物質が通過することができる電極上に膜層を有する。米国特許第５，９４５，２８６号は、インターカレート分子を用いた電気化学に基づいている。米国特許第６，１９７，５０８号は、負の電圧に続いて正の電圧を用いて２本鎖を形成するために、核酸の一本鎖をアニールすることについて開示している。類似の特許には、二本鎖ＤＮＡの電気化学的変性を開示する米国特許第５，８１４，４５０号、米国特許第５，８２４，４７７号、米国特許第５，６０７，８３２号及び米国特許第５，５２７，６７０号が含まれる。米国特許第５，９５２，１７２号及び米国特許第６，２７７，５７６号は、酸化還元基で直接標識されたＤＮＡを開示している。
【００２７】
幾つかの特許は、核酸分析を実施するための、カートリッジを基礎とした装備又は装置の考案について取り組んでおり、これらには、例えば、変性装置（米国特許第６，４８５，９１５号）、一体化された流体操作カートリッジ（米国特許第６，４４０，７２５号）、微少流体システム（米国特許第５，９７６，３３６号）並びに分離及び増幅用マイクロチップ（米国特許第６，５８９，７４２号）が含まれる。
【００２８】
先述の記載に基づき、核酸検査を実施することができる便利で、携帯可能な分析システムに対する要求が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許第５，８０７，５２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１６８，９２２号明細書
【特許文献３】米国再発行特許発明第３７，８９１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５４，０３３号明細書
【特許文献５】米国特許第４，８７６，１８７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６６０，９８８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５６，４３０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，７６３，１７８号明細書
【特許文献９】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，３３３，６７５号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，６５６，４９３号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６３９，４２３号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，６４５，８０１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９３９，３１２号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，０５４，２７７号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，４３６，３５５号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，３０３，２８８号明細書
【特許文献１８】米国特許第６，３７２，４８４号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，３７９，９２９号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００４／００５８３７８号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，０６３，０８１号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，０９６，６６９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，２００，０５１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，５５４，３３９号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，４６６，５７５号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，８３７，４６６号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，８３７，４５４号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，４４７，４４０号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，６０９，８２４号明細書
【特許文献３０】米国特許第６，７５０，０５３号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号明細書
【特許文献３２】米国特許第４，８４０，８９３号明細書
【特許文献３３】米国特許第６，３９１，５５８号明細書
【特許文献３４】米国特許第６，３４６，３８７号明細書
【特許文献３５】米国特許第５，９４５，２８６号明細書
【特許文献３６】米国特許第６，１９７，５０８号明細書
【特許文献３７】米国特許第５，８１４，４５０号明細書
【特許文献３８】米国特許第５，８２４，４７７号明細書
【特許文献３９】米国特許第５，６０７，８３２号明細書
【特許文献４０】米国特許第５，５２７，６７０号明細書
【特許文献４１】米国特許第５，９５２，１７２号明細書
【特許文献４２】米国特許第６，２７７，５７６号明細書
【特許文献４３】米国特許第６，４８５，９１５号明細書
【特許文献４４】米国特許第６，４４０，７２５号明細書
【特許文献４５】米国特許第５，９７６，３３６号明細書
【特許文献４６】米国特許第６，５８９，７４２号明細書
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｖｏｌ ２０４（３）：２８２
【非特許文献２】Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ，ｖｏｌ ３６４（９４４０）：１１６７
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ５２（２）：１０１
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”
【非特許文献５】Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ ５（８）
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｖｏｌ ８３（８）：１１４７）
【非特許文献７】Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ６３（１１）：４５０４）
【非特許文献８】Ｒｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ １７（２１）：８５４３−８５５１）
【非特許文献９】Ｒｙｃｈｌｉｋ （１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ３：１２９−１３４）
【非特許文献１０】Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，ｖｏｌ ９６：６１７１−６１７６
【非特許文献１１】Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ３１（４）：１３１９−１３３０
【非特許文献１２】Ｋａｂｏｅｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２８（２１）：ｅ９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
発明の目的
本発明の目的は、抽出、増幅及び検出を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、光学的及び電気化学的検出を有する一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、フィルター抽出に基づく、又は水性流体と非混和性の層を通じた粒子輸送に基づく抽出工程を有する一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、抽出及び増幅を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、増幅及び検出を行うことができる一体化された核酸検査カートリッジを提供することである。
【００３６】
本発明の目的は、リーダー装置と共同で作動する一体化された核酸検査用カートリッジを提供することである。
【００３７】
本発明の目的は、ベッドサイド、医師の職場及び伝統的に検査が実施される研究室環境から離れたその他の場所で実施される分析に適した、一体化された核酸検査システム及び方法を提供することである。
【００３８】
本発明の目的は、水性流体と非混和性である層を通じた粒子輸送を含む精製工程を有する試料から核酸を抽出する装置及び方法を提供することである。
【００３９】
本発明の目的は、増幅前に溶出工程を有する、フィルターを基礎とする試料からの核酸抽出の装置及び方法を提供することである。
【００４０】
本発明の目的は、遺伝的分析を行うための装置中に組み込むのに適した試料から核酸を分離するための単純な方法及び構成要素を提供することである。
【００４１】
本発明の目的は、核酸検査カートリッジと統合可能な、増幅後におけるアンプリコンからのプライマーの電気泳動分離を提供することである。
【００４２】
本発明の目的は、最短時間で多くの合成を与えるＤＮＡポリメラーゼ酵素、従って、１００塩基／秒を超える伸長速度又は３００塩基を超える加工速度を有するＤＮＡポリメラーゼを提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、短い期間に、小型サーモサイクラー装置中において機能するＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４４】
本発明は、核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、（ａ）収容部と；（ｂ）標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口と；（ｃ）標的核酸を抽出するための試薬を含有する、前記入口に作動可能に接続された第一のチャンバーと；（ｄ）増幅条件を制御するための加熱手段及び温度検知手段を含む増幅チャンバー中を抽出された核酸が通過できるようにする第一の伝導路と；（ｅ）前記増幅チャンバーへ作動可能に連結されており、及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路と、を含み、前記収容部が、（ｉ）検出可能な標識を増幅された核酸標的中に取り込むことができる増幅試薬と、及び（ｉｉ）前記増幅された核酸標的を前記検知領域へ移動させて、前記増幅された標的の前記捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を可能とするための手段を含有し、並びに前記第二の伝導路が、前記検知領域から捕捉されていない増幅された標的を実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された前記検出可能な標識を検知することができる保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、前記装置を含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明は、核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、（ａ）収容部と；（ｂ）標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口と；（ｃ）第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、前記入口へ作動可能に接続された第一のチャンバーと（前記第一のチャンバーは、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋又は油ろ過層を形成するための蝋又は油ろ過材料も含有し、抽出された標的核酸を伴う磁気ビーズは、付与された磁場を用いることにより、蝋層を通して第一の伝導路中に通過することができ、前記第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの増幅チャンバー中への通過を可能とし、前記収容部は、検出可能な標識を増幅された核酸標的中に取り込むことが可能な増幅試薬を含有し；前記増幅チャンバーは増幅条件を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有する。）、（ｄ）前記増幅チャンバーへ作動可能に連結されており、及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路と、を含み、（ｉ）前記収容部が、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とする手段を含み、及び（ｉｉ）前記第二の伝導路が、捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、前記装置を含む。
【００４６】
本発明は、好ましい組織源として血液を使用したときに、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ反応の公知の阻害剤を除去するための新規抽出操作を示す。本操作は、十分に単純であるので、典型的な研究室環境の外部で遺伝的分析を行うための装置中に組み込むことが可能である。この新規操作は市販のキット由来の構成要素を使用することが可能であるが、抽出過程の時間を著しく簡略化し、低減する新規プロトコールが開示されている。新規プロトコールは、看護の場所での迅速な核酸診断検査のための全血の初期プロセッシングに対して容易に適合させることが可能である。
【００４７】
本発明の装置及び方法は、化学的に含浸された固体基材技術を、時間を都合よく最小限に抑えるためのろ過装置及び低容量の体液から得られたゲノムＤＮＡの増幅可能な量を抽出するための資源に結合することによって、既存の技術水準を著しく向上させる。 上述のように、本技術は、ＤＮＡ単離、増幅及び検出のための使い捨て可能なカートリッジ装置で使用するのに特に適している。
【００４８】
本発明は、とりわけ、看護の地点での診断検査のための機会を増大させる、すなわち、血液又は口腔細胞などの利用しやすい少量の体液を用いて、迅速、安価且つ便利な検査に取り組む。
【００４９】
体液、好ましくは血液又は口腔綿棒から、１０−４０μＬの容積で、増幅可能なゲノムＤＮＡ試料を抽出及び単離するための信頼性が高く、再現性のある装置及び方法が、磁気粒子分離及びフィルター結合に基づいて開示されている。これらの装置及び方法は、抽出のみのために個別に、または検査装置中に組み込まれて使用され得る。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明は、好ましい組織源として血液を使用したときに、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ反応の公知の阻害剤を除去するための新規抽出手順を示す。本操作は、典型的な研究室環境の外部で遺伝的分析を行うための装置中に統合できるほど十分に単純である。この新規操作は市販のキット由来の構成要素を使用することが可能であるが、抽出過程の時間を著しく簡略化し、低減する新規プロトコールが開示されている。新規プロトコールは、看護の場所での迅速な核酸診断検査のための全血の初期プロセッシングに対して容易に適合させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、溶解緩衝液層、蝋層及び磁気ビーズを用いた、チューブ中での核酸精製を示している。
【図２】図２は、ビーズなし及びビーズあり、並びに血液あり及び血液なしのＰＣＲ産物、並びに精製されたＤＮＡ対照のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図３】図３は、ビーズ及び血液ありのＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図４Ａ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｂ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｃ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図４Ｄ】図４（ａ）−（ｄ）は、フィルター支持装置の異なる投影図を示している。
【図５】図５は、フィルターから単離された口腔綿棒標本試料のＰＣＲ増幅を示している。
【図６】図６は、一体化された使い捨て装置及び機器とのその相互作用の幾何学的表示を示している。
【図７Ａ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図７Ｂ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図７Ｃ】図７（ａ）は、ＰＣＲ増幅法の模式図を示しており、図７（ｂ）は自己アニーリングプライマーなしでのＰＣＲ増幅の模式図を示しており、及び図７（ｃ）は自己アニーリングプライマーを用いたＰＣＲ増幅の模式図を示している。
【図８Ａ】図８（ａ）は、ＰＣＲ＋抱合体及び抱合体単独に対する典型的な経時電流測定の出力を示しており、図８（ｂ）は、対照＋抱合体及び抱合体のみに対する典型的な経時電流測定の出力を示している。
【図８Ｂ】図８（ａ）は、ＰＣＲ＋抱合体及び抱合体単独に対する典型的な経時電流測定の出力を示しており、図８（ｂ）は、対照＋抱合体及び抱合体のみに対する典型的な経時電流測定の出力を示している。
【図９Ａ】図９（ａ）は、異なるアンプリコン濃度の経時電流測定を示し、図９（ｂ）は、定常状態電流シグナル対アンプリコン数のプロットを示している。
【図９Ｂ】図９（ａ）は、異なるアンプリコン濃度の経時電流測定を示し、図９（ｂ）は、定常状態電流シグナル対アンプリコン数のプロットを示している。
【図１０】図１０は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に対する模式図を示している。
【図１１】図１１は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）に対する模式図を示している。
【図１２Ａ】図１２（ａ）−（ｂ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための電気泳動構成要素の２つの投影図を示している。
【図１２Ｂ】図１２（ａ）−（ｂ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための電気泳動構成要素の２つの投影図を示している。
【図１３Ａ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｂ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｃ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｄ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｅ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｆ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１３Ｇ】図１３（ａ）−（ｇ）は、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素を用いた電気泳動分離を示している。
【図１４】図１４は、第二の電気泳動ゲルによって確認された、核酸検査用使い捨て装置中に組み込むための構成要素（図１３に示されている）を用いたプライマー及びアンプリコンの電気泳動分離を示している。
【図１５】図１５は、ＣＬＡＭ様の特徴を欠くオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
【図１６Ａ】図１６（ａ）は、ＣＬＡＭ１プライアマーを示しており、図１６（ｂ）はＣＬＡＭ２プライマーを示している。
【図１６Ｂ】図１６（ａ）は、ＣＬＡＭ１プライアマーを示しており、図１６（ｂ）はＣＬＡＭ２プライマーを示している。
【図１７Ａ】図１７（ａ）は、光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示しており、図１７（ｂ）は、検知領域が光源による検出を可能とするキュベット機構であり、及び装置中に一体化された検出装置である、光学的使い捨てカートリッジを示している。
【図１７Ｂ】図１７（ａ）は、光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示しており、図１７（ｂ）は、検知領域が光源による検出を可能とするキュベット機構であり、及び装置中に一体化された検出装置である、光学的使い捨てカートリッジを示している。
【図１８】図１８は、核酸検査用使い捨てカートリッジ中に組み込まれたフィルター領域を含有する抽出装置を示している。
【図１９】図１９は、増幅及び検出要素と合体させることができる分離した抽出要素を有する２つの部分からなるカートリッジを示している。
【図２０】図２０は、抽出及び増幅要素と合体させることができる分離した検出要素を有する２つの部分からなるカートリッジを示している。
【図２１Ａ】図２１（ａ）は、分離された状態にあるカートリッジと装置を示しており、図２１（ｂ）は装置中に挿入されたカートリッジを示している。
【図２１Ｂ】図２１（ａ）は、分離された状態にあるカートリッジと装置を示しており、図２１（ｂ）は装置中に挿入されたカートリッジを示している。
【図２２】図２２は、光学的検出化学の例を示している。
【図２３】図２３は、シリコンチップが抽出及び増幅チャンバーを形成する壁の一つを与える抽出及び増幅要素を示している。
【図２４】図２４は、増幅後に未使用プライマーの電気泳動分離を有する使い捨て装置を示している。
【図２５Ａ】図２５（ａ）−（ｂ）は、さらなる増幅及び検出のための「誘発現象」を生成する切断反応を示している。
【図２５Ｂ】図２５（ａ）−（ｂ）は、さらなる増幅及び検出のための「誘発現象」を生成する切断反応を示している。
【図２６】図２６は、変異及び野生型ＳＮＰ配列を識別するＰＣＲ増幅法の模式図を示している。
【図２７】図２７は、血色素症検査から得られる可能性があるシグナルの結果の表を示している。
【図２８Ａ】図２８（ａ）−（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図を示している。この抽出及び増幅装置は、検出カートリッジに取り付ける。
【図２８Ｂ】図２８（ａ）−（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図を示している。この抽出及び増幅装置は、検出カートリッジに取り付ける。
【図２９Ａ】図２９（ａ）−（ｂ）は、対照オリゴヌクレオチドの量に比べて増加するシグナルの比較を示している。
【図２９Ｂ】図２９（ａ）−（ｂ）は、対照オリゴヌクレオチドの量に比べて増加するシグナルの比較を示している。
【図３０Ａ】図３０（ａ）−（ｂ）は、野生型と血色素症の変異ＳＮＰ配列を識別するカートリッジの能力を示している。
【図３０Ｂ】図３０（ａ）−（ｂ）は、野生型と血色素症の変異ＳＮＰ配列を識別するカートリッジの能力を示している。
【図３１】図３１は、ＥｘｏＩ酵素が、約６−７ヌクレオチド長まで分子量を低下させることができる活性な３’−＞５’エキソヌクレアーゼであることを示す３２Ｐ放射線標識された合成オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフを示している。
【図３２Ａ】図３２（ａ）は、１０％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて、ｗｔ／ｍｕｔＤＮＡテンプレートを識別するホスホロチオアートプライマーを用いるＰＣＲを示している。各ウェル中に負荷された６μＬ試料＋１．６μＬのＬＤ−＞６μＬ（４５分のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色、光陰性、実験ＨＦＥ８４−２、Ｔｈｙｂ６８℃。７つのカラムには、以下のように負荷した。１野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的なＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；２変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；３ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド；４野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；５変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；６ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド並びに７ 野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する両選択的ＰＣＲプライマー、一切バンドを生成しない。図３２（ｂ）は、関連する経時電流測定プロットを示している。
【図３２Ｂ】図３２（ａ）は、１０％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて、ｗｔ／ｍｕｔＤＮＡテンプレートを識別するホスホロチオアートプライマーを用いるＰＣＲを示している。各ウェル中に負荷された６μＬ試料＋１．６μＬのＬＤ−＞６μＬ（４５分のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色、光陰性、実験ＨＦＥ８４−２、Ｔｈｙｂ６８℃。７つのカラムには、以下のように負荷した。１野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的なＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；２変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する野生型選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；３ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド；４野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成しない；５変異体ＤＮＡテンプレートとともに存在する変異体選択的ＰＣＲプライマー、予想される約１５０ｂｐのバンドを生成する；６ １０塩基対のラダー、１００、３３０及び１６６０塩基に顕著なバンド並びに７ 野生型ＤＮＡテンプレートとともに存在する両選択的ＰＣＲプライマー、一切バンドを生成しない。図３２（ｂ）は、関連する経時電流測定プロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
磁気粒子に基づく核酸分離法及び装置
本開示は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を実施するという主要な目的のために、全血からゲノムＤＮＡを単離するための迅速で、簡易なプロトコールを示す。本方法は、従来技術の迅速ＤＮＡ抽出プロトコールに認められたＰＣＲの一般的な阻害剤（例えば、ヘモグロビン）の著しい減少を示すという利点を有している。血液試料において、キレート剤、ヘパリン、ＥＤＴＡ及びシトラートなどの添加された抗凝固試薬も、阻害剤として作用し得る。本方法は、これらの阻害剤及び天然に存在する他のキレート剤並びに核酸テンプレートを損傷し得る酵素及びタンパク質を除去する。本技術は、他の核酸材料源（例えば、口腔綿棒標本、尿及び他の組織試料）に対しても適用可能であり、他の増幅方法と一緒に使用することもできることに留意することが重要である。
【００５３】
例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄキット（Ｐｒｏｄ．Ｎｏ． ６３４．０２， Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）及び米国特許公開２００３／０１８０７５４Ａ１に見出される核酸抽出に３０−４０分を要する従来技術と比べて、本発明の方法は、再現可能なＤＮＡ抽出に必要とされる時間を約５分未満まで、好ましく及び典型的には、約２分まで短縮する。結果が得られる速さが重要である遺伝的分析（例えば、高度に感染性の因子の同定）を考える場合、これは重要な改善である。患者から試料を取得し、医師が一度訪れる間に結果をもたらすことが望ましい、医師の職場環境中での検査、又はベッドサイドでの検査にさえ適用することも可能である。
【００５４】
本発明の方法は、好ましくは、内側の核が常磁性材料である被覆されたビーズ並びに溶解及び結合緩衝液を使用する。ゲノムＤＮＡを含有する溶解された細胞溶液が好ましい実施形態のビーズと混合されると、ビーズ上の表面化学は、強い負の表面電荷のために、低い特異性でＤＮＡを弱く結合するため、ビーズーＤＮＡ複合体を生成する。好ましい表面コーティングは、カルボン酸で被覆された表面であり、常磁性ビーズは、典型的には、２．８μｍの直径を有するが、約０．１ないし１００μｍの直径範囲のビーズを使用することが可能である。ビーズ用の別の陰イオン性コーティングには、極めて小さな直径のガラスビーズ（例えば、Ｇｌａｓｓ Ｍｉｌｋ）、Ｗｈａｔｍａｎホスホセルロース及びＤＥＡＥ樹脂（例えば、ＤＥ５２）を含む以下の材料が含まれる。
【００５５】
非磁気ビーズを使用し得るが、磁気ビーズは反応容器の側面に引き付けることができ、磁石を用いて側面に対して固定することができるので、磁気ビーズを使用することが確かに有利である。これは、短時間のうちに起こることが可能であり、ビーズを１つの位置に濃縮するための手段を提供し、並びにビーズを移動及び操作するための手段を提供する。磁場は、本分野において周知であるように、永久磁石によって、又は電磁石手段によって付与し得る。
【００５６】
標準的なポリプロピレンＰＣＲチューブを使用する例では、水６０−１００重量％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１０−３０％、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）５−１０％、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１−５％、ドデシル硫酸リチウム（ＬｉＤＳ）０．１−１％、ＥＤＴＡ０−１％及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）０−０．１％を含有する標準的な溶解緩衝液（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）は、０．６５Ｍの最終アルカリ濃度のＮａＯＨ試薬を含むように改変された。本分野で公知の他の溶解緩衝液も、塩基、例えばＮａＯＨの適切な添加とともに使用し得る。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（２３μＬ）を加えたアルカリ修飾された溶解緩衝液へ、全血（１０μＬ）を直接添加した。これにより、手動ピペット混合の約１５秒、続いて、ゲノムＤＮＡをビーズ上に吸着させるための留置時間約１５秒内に血液細胞の溶解が誘導された。次いで、永久磁石で、チューブの側面に対してビーズ−ＤＮＡ複合体を捕捉したが、これは、約１５秒未満を要する。次いで、ピペットにより、溶解された細胞の全上清を除去した。ピペットによって、洗浄緩衝液（５０μＬ）、例えばＤｙａｎｌ洗浄緩衝液（Ｄｙｎａｌキットから得られる。）を導入し、チューブ壁に対して捕捉されたビーズ−ＤＮＡペレットを濯ぐために使用した。次いで、残ったペレットをチューブ壁に対して細くしながら、ピペットにより、洗浄溶液を完全に除去した。次いで、残存するビーズ−ＤＮＡペレット（１−２μＬ等容量）を除去し、鉱物油の重層（約１０μＬ）とともに、ポリメラーゼ酵素、プライマー、ｄＮＴＰ及び緩衝液を含むＰＣＲカクテル（約２５μＬ）を加えた新しいチューブに添加し、慣用のサーモサイクラー中に配置した。この抽出プロセスの合計時間は、約２分であることが明らかとなった。この新しい精製プロトコールは、抽出物中に残存するＰＣＲ反応の阻害剤に伴う問題を克服することが以下で示されていることに留意されたい。
【００５７】
好ましい実施形態において、抽出方法は、アルカリ溶解緩衝液、磁気ビーズを使用し、蝋又は油ろ過媒体も使用する。同じく、本方法は、本明細書に記載されているように、手動操作として実施することも可能であり、又は使い捨て装置中での自動化された分析の基礎として実施することも可能である。溶解された細胞ビーズ−ＤＮＡ複合体を重層するろ過媒体として、蝋又は油を使用することによって、さらなる流体移動が不要となり、ビーズ−ＤＮＡ複合体の精製を補助した。例えば、血液を溶解緩衝液及びビーズと合わせ、得られたＤＮＡ−ビーズ複合体をペレットで採取し、永久磁石を用いて上方のろ過層を通じて引き付け、このようにして、溶液のバルクから複合体を選択的に分離する。これは、図１に詳細に記されている。
【００５８】
図１は、チューブ１が溶解緩衝液３及び磁気ビーズ４の上に蝋ろ過媒体２を含有することを示している。典型的には、チューブは、周囲温度で保存されるので、まず、蝋を融解するためにチューブは加熱される。一般的に、これは、約３５℃超への温度変化である。ピペット６を用いて血液５を導入し、細胞が緩衝液中で溶解するように、血液をよく混合する。次いで、核酸７は、非特異的な表面結合を介してビーズに結合する。次いで、ビーズ及び若干の余分な溶解された材料及び緩衝液を、チューブの側面に引き付けるために磁石８を使用して、ペレットを形成させる。次いで、蝋層の上方向を通じてペレットを引き付けるために、磁石をチューブの側面に沿って移動させる。蝋のより大きな表面張力によって過剰な水性流体が取り除かれるので、これは効果的にペレットをろ過することが驚くべきことに見出された。場合により、この工程の後に、熱を取り除くことによって、蝋は、再度硬化させ得る。得られたビーズ−核酸ペレットは、チューブの側面で容易に接近可能な蝋の薄層中に捕捉された状態を保つが、一方、溶解緩衝液及び血液は蝋の下に捕捉された状態を保つ。次いで、チューブの側面から、ビーズ−核酸ペレットを除去し、ＰＣＲカクテルが存在する新しいチューブに導入することができる。８０℃を上回る温度の水が溶出に十分であることが明らかとなっているので、核酸は、ＰＣＲの最初の加熱サイクルの間にビーズから溶出される。ビーズも、蝋もＰＣＲを妨害しないことも明らかとなった。
【００５９】
本願のための蝋の理想的な特徴には、２５℃と４５℃の間で固体から液体へと融解する蝋が含まれる。さらに、これらの好ましい蝋は、６０℃ないし９０℃の範囲の温度で著しく蒸発しない。これらの蝋が固体である場合には、これらの蝋は、これらの蝋の存在によって捕捉されているビーズ及びその他の溶液の移動を妨げるが、これらの蝋が液体状態である場合には、それらの粘度は、磁場の下で磁気ビーズの通過を可能とするほど十分に低い。蝋は、ＤＮＡ増幅用試薬と適合性であるという特性も有する。本発明において使用することが可能な蝋の４つの例は、ヘネイコサン（９８％、融点４０−４２℃、Ｓｉｇｍａ）、ドコサン（９９％、融点４３−４５℃、Ｓｉｇｍａ）、トリコサン（９９％、融点４８−５０℃、Ｓｉｇｍａ）及びトリコサヘネイコサンである。好ましい蝋は、ヘネイコサンである。ビーズが通過する障壁層を形成するために使用することが可能なその他の有機液体には、シリコーン油及びメシチレンが含まれる。
【００６０】
図２は、蝋プロセスを通じて移動するビーズを用いて、精製されたＤＮＡ試料が血液から首尾よく除去されることを示しており、予期されるバンド（レーン２に合致するゲルレーン５及び６）が存在する。本図は、ビーズなし及びビーズあり、並びに血液あり及び血液なしのＰＣＲ産物、並びに精製されたＤＮＡ対照のポリアクリルアミドゲルを示している。「＊」で標識されたバンドは、公知の野生型対立遺伝子ＡＣＤ血液チューブ試料に対して調製された、修飾された野生型血色素症オリゴヌクレオチドプライマー組を用いた対称ＰＣＲに対する予想される塩基対の長さを表していることに留意されたい。陽性対照（レーン２）は、試料調製用のＱｉａｇｅｎ市販キットを用いて精製されたゲノムＤＮＡ（野生型対立遺伝子）も表し、及び陰性対照（レーン１）は、ＰＣＲカクテルにＤＮＡが添加されていない。本例では、鉱物油のオーバーレイを有する慣用のサーモサイクラー中で、３０サイクルを用いてＰＣＲを行った。図２に示されているように、ローディング色素２μＬを加えた試料１０μＬの容量を、１０％非変性ポリアクリルアミドゲル、１×ＴＢＥ緩衝液の各ウェル中に添加した。
【００６１】
図３は、蝋プロトコール（ゲルレーン１−４）を通過して移動するビーズを使用して、精製されたＤＮＡが血液から首尾よく除去されることを、フィルター媒体として蝋を使用しないプロトコール（ゲルレーン５）と比較対照したものである。「＊」で標識されたバンドは、公知の野生型対立遺伝子ＡＣＤ血液チューブ試料に対して調製された、修飾された野生型血色素症オリゴヌクレオチドプライマー組を用いた対称ＰＣＲに対する予想される塩基対の長さを表している。鉱物油の重層を有する慣用のサーモサイクラー中で、３０サイクルを用いてＰＣＲを行った。図３に示されているように、ローディング色素２μＬを加えた試料１０μＬの容量を、１０％非変性ポリアクリルアミドゲル、１×ＴＢＥ緩衝液の各ウェル中に添加した。
【００６２】
上記記述によって示された原理は、図１に示されている種類の手動操作に基づいて、各核酸抽出装置中に取り込むことができ、又は使用者が試料を装置に添加する必要があるだけで、その他の全ての工程が自動で行われる下記のような自動装置に取り込むことができる。
【００６３】
吸収性フィルターに基づく核酸分離法及び装置
体液中に見出される核酸を迅速に抽出及び単離するための別のアプローチが提供される。本アプローチは、フィルター材料の使用に基づく。開示されている装置及び方法は、化学的に含浸された固体基材技術を小型ろ過装置に結合させることによって、既存の技術を著しく改善する。小容量の体液から得られるゲノムＤＮＡの増幅可能量を抽出するための時間も都合よく最小化される。本装置は個別の分離装置として使用し得るが、ＤＮＡ単離、増幅及び場合により検出のための使い捨て可能なカートリッジ装置中に組み込むのに特に適している。
【００６４】
各装置は、例えば、血液又は口腔細胞などの流体の小容量を採取し、増幅に適したＤＮＡを素早く単離するための迅速な手段として臨床環境及び研究環境において使用することが可能である。あるいは、使い捨て可能なカートリッジ中に組み込まれる場合には、カートリッジ内の試料を自動的に移動させ、抽出プロセスに作用するために微小流体素子が使用される。両用途が記載されている。
【００６５】
前記装置及び方法の主な特徴には、（ｉ）典型的には２分未満の迅速な核酸の単離、（ｉｉ）使い捨てカートリッジ中に取り込むのに適した要素、（ｉｉｉ）増幅と適合性のある形態の結合された核酸又は未結合の核酸の何れかの生成、（ｉｖ）少ない試料容量の使用（例えば、血液、口腔細胞及び組織）、及び（ｖ）操作を実施するための他の液体試薬の少量の使用が組み合わされる。
【００６６】
装置に関しては、化学的に含浸された固体基材マトリックスを配置するために、低容量フィルター保持装置の支持構造を使用した。これは、そのマトリックス内にこれらの核酸を保持することによって、適用された試料からＤＮＡを抽出及び単離するろ過層として機能する。ろ過マトリックスは、溶解性の塩が含浸され、及び場合により界面活性剤が含浸され、これは、次いで、結合工程後に、増幅の一般的な阻害剤を除去し、変性したタンパク質を濯いで除去するために、溶媒、好ましくは蒸留された若しくは滅菌された脱イオン水を流されるか、又は溶媒、好ましくは蒸留された若しくは滅菌された脱イオン水で洗浄される。試料からの核酸を保持するフィルターは、次いで、支持装置から取り外し、増幅試薬、例えばＰＣＲへ直接適用することができる。これは、ＤＮＡに対する定量的な要求に応じて、完全なフィルターディスク又はその一部を使用して行うことができる。望ましい場合には、好ましくは７５ないし９５℃の範囲の温度の脱イオン水を用いて、核酸材料をフィルターから溶出し得る。他の溶出試薬には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７などの及び５ｍＭないし２０ｍＭのリン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液などの希中性緩衝液が含まれる。あるいは、ろ過マトリックスは、以下に記載されているような使い捨て核酸検査カートリッジ中に取り込むことができる。
【００６７】
各抽出装置の好ましい実施形態は、以下に記載されている。すなわち、化学的に含浸されたフィルターは、生化学的に不活性である再生可能な薄いマトリックスから構成される円板、好ましくは市販のろ紙である。溶解性の塩及び場合により使用される界面活性剤は、フィルターの表面上に分配された後、マトリックス内で乾燥される。実際的な問題として、フィルターディスクのサイズは、フィルター保持装置の外径によって制約され、洗浄流体が通過するチャネルより広くなければならない。化学的含浸は、界面活性剤、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を加えた又は加えないカオトロピック塩を含有する液体カクテルを用いて行われる。カクテルは、フィルターディスク上に分配され、乾燥され、次いで、フィルターは、使用時まで密閉された環境中で保存される。
【００６８】
好ましい実施形態において、フィルター保持装置は、洗浄流体がそれを通じてフィルターディスクの一方側から他方側へと通過し得る中央の小さな直径のチャンネルにより、（場合により、配置補助ガスケットを有する。）フィルターディスクに対して強固な支持を与える。前記装置は、洗浄流体の導入及びその後の除去を可能とするために、フィルターディスクの反対側に入口及び出口の両方を含有する。その構築材料は、生化学的に不活性であるべきであり、好ましくは成型されたプラスチックであるべきである。これは、使い捨てとして設計されるが、適切に清浄化される、例えば高圧滅菌処理されるのであれば、場合により、再使用可能とすることもできる。フィルターベースパッドは、洗浄流体チャンネルに合致してフィルターディスクを適切に配置する補助を与える従属部品である。場合により、装置の内径より小さなフィルターのサイズに対しては、フィルター位置調整ガスケットを使用し得る。例えば、チャンネル上のフィルターベースパッド上にフィルターディスクを保持する中央穴を有する薄い接着性の層を使用し得る。本実施形態において、フィルターディスクの外径より僅かに小さな中央穴を有する両面粘着テープが好ましい。洗浄流体は、好ましくは、蒸留水であり、増幅の化学的阻害剤を除去するために使用される。
【００６９】
本分野において周知であるように、滅菌性及び生化学的不活性の条件は、装置の構築のために用いられる材料の選択、流体の取り扱い及び洗浄流体の取得源に対して固有のものである。試料、例えば体液は、フィルター支持装置の入口を通じてフィルターディスクに導入し、又は装置へ組み立てる前にフィルターディスク上に（但し、滅菌性が確保されるように注意を払うものとする。）導入することが可能である。
【００７０】
一実施形態において、フィルター保持装置は、Ｓｗｉｎｎｅｘフィルター保持装置、好ましくは１３ｍｍ直径のもの（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）とすることができ、また、これは、ＴｅｆｌｏｎＴＭガスケットとともに提供され、成型されたポリプロピレンから構築される。好ましい実施形態において、フィルター保持装置に対して修飾が行われ、この場合、フィルター保持装置の上部片及び底部片の両片の内側に存在する空隙に正確に適合するように、さらなるアクリル片が切断される。これらの片は、好ましくは、接着剤、例えばＬｏｃｔｉｔｅエポキシ糊で定位置に保持され、標準的な装置より小さな直径の、穴があけられた中央チャンネルを有する。フィルター保持装置への入口は、接着剤で定位置に固定されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆの１００μＬピペット先端から得られる末端片で場合により修飾することもできる。
【００７１】
フィルター位置調整ガスケットは、好ましくは両面粘着テープガスケット（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）であり、ゴム−アクリルハイブリッド接着剤の約７５μｍを有するＰＥＴフィルム基材上に約２５μｍの厚さになるようにレーザーで切断し、保護のために２つのポリエステルライナーの間に挟まれる。両面接着剤は、洗浄操作の間に、フィルター保持装置のよりよい密着を与えるという利点を有する。ポリエステルライナーは、接着剤を露出させるために、装置の組み立ての間に除去されることに留意されたい。
【００７２】
フィルターディスクは、好ましくはＷｈａｔｍａｎ ４ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｇｒａｄｅの普通のセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．）であり、以下の製造業者の仕様：２０−２５μｍを上回る粒子保持、粗い多孔率、ろ過速度ＡＳＴＭ１２秒、Ｈｅｒｚｂｅｒｇ３７秒及び滑らかな表面、を有する。他の類似のフィルター材料及び等級を使用することができ、Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭ、Ｐａｌｌ ＧＦ Ａ／Ｂ、Ｔｅｘｗｉｐｅ （布巾）、Ｗｈａｔｍａｎ１、Ｗｈａｔｍａｎ３、Ｗｈａｔｍａｎ４、Ｗｈａｔｍａｎ６及びＰａｌｌ１６６０膜が含まれる。
【００７３】
フィルターの化学的含浸は、好ましくは、界面活性剤（好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ＴＭ）、弱塩基性緩衝液（好ましくは、ＴＲＩＳ）及びキレート剤（好ましくはＥＤＴＡ）を加えた又は加えない、カオトロピック塩（好ましくは、イソチオシアン酸グアニジンなどのグアニジニウム塩）を含有する液体カクテルを用いて行われる。別の試薬には、グアニジニウム塩（例えば、グアニジニウム塩酸塩及びチオシアン酸グアニジニウム）、非イオン性界面活性剤及びキレート材料が含まれる。２Ｍイソチオシアン酸グアニジン、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．８まで緩衝化された１０ｍＭのＴＲＩＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡの約３．７５μＬ／ｃｍ２の最少負荷を行うために、カクテルは、溶液中のＷｈａｔｍａｎ４ペーパーに付与される。次いで、光表面の下約５ｃｍで、加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ， Ｈｅａｔ−Ｒａｙ ２５Ｏｗ赤外線）下にてカクテルを３分間乾燥させ、次いで、室温で最低１０分間冷却し、使用時まで滅菌遠心管の中に保存した。目的とする試料材料が血液である場合には、カクテル溶液中で使用される全ての試薬を、２００ｍＭのＮａＯＨの溶液による含浸で置換できることが明らかとなっていることに留意されたい。他の強塩基溶液、例えば、ＫＯＨも使用することが可能である。
【００７４】
実例として、２つの異なる体液が、ゲノムＤＮＡの抽出用に使用されている。これらは、（ｉ）キレート剤又は抗凝固剤の何れによっても処理されていない全血試料内の白血球細胞及び（ｉｉ）口頬綿棒から得られた口腔細胞である。以下に記載されているように使用される場合、本装置は、プロトコールを僅かに変更して、増幅可能なＤＮＡを両流体から抽出することができる。本開示に基づき、当業者は、プロトコールにさらに僅かな変更を加えることによって、核酸を含有する試料のその他の種類も抽出し得ることを認識する。
【００７５】
フィルター保持装置の構成要素は、側面図で図４（ａ）に、拡大された側面図で図４（ｂ）に、図４（ｃ）上面図、空隙容量に挿入された図４（ｄ）に示されている。装置は、フィルター固定装置上部２０及び下部２１、入口チャンネル２２、空隙容量２３及び２４、フィルターディスク基部上のフィルターディスク２５及び出口チャンネル２６を含む。好ましい実施形態において、図４（ｄ）に示されているように、より低容量にする改変は、間隙充填構造（２７、２９）を使用し、及び入口２２を介して、より狭い中央チャンネル中へ流体が移動しやすくするための入口適合素子２８を使用する。より低容量の装置は、適合素子２９に取り付けられたフィルターガスケットを用いて、フィルターディスクの位置を調整することを必要とする。実際的な問題として、装置は、滅菌された作業環境中で調製され、核酸及び酵素の交差汚染を防ぐための道具が使用される。
【００７６】
１３ｍｍのフィルターディスク２５を使用する場合には、体液約３−１０μＬが化学的に含浸されたフィルター表面に適用できるのに対して、４．８ｍｍのフィルターディスクを用いた低容量の改変された装置は、流体１−３μＬでも十分に機能する。試料の適用は、入口ポートを通じて、組み立てられた装置を用いて行うことが可能であり、又は組み立て前に直接フィルター上に行うことが可能である。口腔綿棒標本が綿棒で取得される場合には、フィルターディスク上に拭い取ることが可能であり、又は入口ポートを通じて、フィルターディスク上に洗浄することが可能である。口腔細胞を単離するための別の方法は、市販の洗口剤（例えば、Ｓｃｏｐｅブランド）を用いることによることが見出されている。使用した洗口剤の数μＬを、次いで、装置中に付与することができる。
【００７７】
妨害物質の除去に関しては、周囲温度の滅菌水は、ディスクのマトリックス内から核酸を除去せずにフィルターディスクを通して妨害物質を流すことができるので、洗浄流体として満足に機能することが明らかとなった。入口において、フィルター保持装置にきつく密封するために配置された分配チップから水がくみ出される場合、水は、フィルターディスクを通じて流れて、試料を洗浄し、出口まで通り抜ける。口腔細胞試料の場合、試料１μＬ当り滅菌水２０μＬ／を一度流せば十分である。血液試料の場合、試料１μＬ当り滅菌水２０μＬ／を、フィルターを通して流し、３回繰り返すことが好ましい。あるいは、単回容量を、三回、前後に通過させることも十分である。滅菌水の代わりとして、以下の滅菌緩衝溶液、すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７及び５ｍＭないし２０ｍＭのリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムを使用し得る。
【００７８】
洗浄操作の後、フィルターディスクは、ＤＮＡの増幅可能な量を保持する。次いで、これは、フィルター保持装置から取り外され、増幅反応において使用することができる。１００μＬのＰＣＲ増幅では、４．７６ｍｍの直径のディスクを直接使用することができるのに対して、１３ｍｍのディスクは、より小さな部分へ最適に切断されることが明らかとなった。別の実施形態において、核酸材料は、熱い脱イオン水又は様々な緩衝溶液を用いることによって、フィルターから溶出することができ、次いで、増幅装置中に導入することが可能である。別の実施形態において、ろ過プロセスは、以下に記載されているように核酸検査のための使い捨て装置中に組み込まれる。
【００７９】
図５は、前記方法及びフィルター保持装置の有効性を示しており、口腔綿棒標本試料のＰＣＲ増幅を示している。抽出過程後、フィルターを装置から取り外し、血色素症遺伝子（Ｈｆｅ）に対して特異的な２つのプライマーを用いる１００μＬのＰＣＲ反応チャンバー中に配置した。増幅過程が完了したら、１０％アクリルアミドゲル１×ＴＢＥ電気泳動ゲルのレーン１に材料を適用した。予想通り、これは、矢印によって記されている３９０ｂｐ（塩基対）の断片を生成した。対照レーン２は１００ｂｐのラダーを含有し、レーン３は陰性対照として水を含有することに留意されたい。
【００８０】
上記手動の操作は、遺伝的分析を実行するための使い捨て装置内に導入され、及び組み込まれる抽出モジュールの設計に対する基礎を形成し得ること、又は使い捨て装置へ抽出物を送達する別個のモジュールであり得ることが理解される。送達は、例えば、ピペット移動によって、又は移動を促進する機構５００、５２０及び５２１を互いに合体させることによって（図１９及び２０参照）行うことが可能である。このような装置は、核酸検査用の一体化された使い捨て装置を取り扱うセクションに詳しく記載されている。
【００８１】
増幅方法の詳細な説明
本発明において、電気化学的検出が好ましい場合、核酸増幅工程の主な目的は、標的分子から検出可能な核酸の約０．０１ｐＭ濃度を生成することであるが、これは、酵素的増幅及び電気化学的検出を用いたサンドイッチアッセイのより低い検出限界の範囲にあることが見出されているからである。断片の所望される１ｐＭ濃度は、アボガドロ数（１モル＝６×１０（２３）分子）に基づいており、ここに、１ｐｍｏｌは、６×１０（２３）×１０（−１２）又は約１０（１２）分子に等しい。公知のように、血液１μＬがＤＮＡ約５×１０（３）分子を含有する場合、１ｍＬ（合理的に採取可能な試料容量である。）は、５×１０（６）分子又は概ね約１０（７）分子を含有する。血液１ｍＬ中のＤＮＡの量からＤＮＡの０．０１ｐｍｏｌへ移行するためには、約１０（３）倍の増幅が必要である。これは、幾つかの周知の増幅技術を用いて確実に達成することができる。増幅の程度を決定するために、様々な試料の種類及び試料の容積に対して類似の計算を実行することは、当業者に自明である。
【００８２】
光学的検出が使用される使い捨てカートリッジの別の実施形態においても、核酸増幅工程の目的は、同じく、所定の光学的方法のより低い検出限界の範囲内とするために、検出可能な核酸の所定のモル濃度を標的分子から生成することである。このような計算は、当業者に周知である。光学的検出を用いて試料の濃度を測定する能力は、ノイズのバックグラウンドレベル、検出すべき光学的化合物の吸光係数、光学系の電気的増幅率、試料の容量及びその他のパラメータに依存することが本分野において周知である。化合物濃度と試料の吸光度の単純な関係は、ベール・ランベルトの法則（Ａ＝εｃｌ）（Ａは吸光度であり、εは吸光係数であり、ｃは試料のモル濃度であり、ｌは試料の経路長である。）を用いて表すことが可能である。典型的には、長さは、原則的に、１ｃｍである（下記装置では、約０．０２ないし約０．４ｃｍがより典型的である。）。これにより、吸光度は吸光係数の定数を用いて濃度と関連付けられ、通常、ｐＭ域内の検出限界が許容される。
【００８３】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＣＲ反応に対して選択されたプライマー配列に基づいて、標的ＤＮＡの領域を特異的に増幅できることが周知である。この材料を処理することに伴う困難は、均一に、ハイブリダイゼーションに基づいて、シグナルの検出を試みることに存する。本質的に、ＰＣＲ反応は、平滑末端化された２本鎖の産物を生成する。しかしながら、ある種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ポリＡポリメラーゼ活性を有しており、これは、さらなるＡヌクレオチドを追加するために使用することが可能である。これは、クローニングの目的で商業的に使用されてきたが、単一のヌクレオチドの突出は、ハイブリダイゼーションについては非効率である。ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ反応を使用することを試みるための別のアプローチとして、制限エンドヌクレアーゼ酵素に対する認識配列がＰＣＲプライマー中に設計されてきた。しかしながら、典型的には短い突出を生成するに過ぎない追加の酵素を必要とするので、これには限界がある。多くの二本鎖種と同様、ＰＣＲ産物は、均一な反応でのハイブリダイゼーションに適していない。この制約を克服するために、他方のプライマーに対して一方のプライマーの限定量を使用する戦略が考案されている。別の方法は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６）に対するプロモーター領域を有することである。プライマーの１つを限定することには、増幅の効率が低減するという欠点がある。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡの生成はさらなる試薬を必要とし、検出用の壊れやすいＲＮＡ種を生成する。
【００８４】
ここで、本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマーの量（第一の修飾されたプライマーは、標的の領域に対する塩基の配列を有する。）を組み合わせることによってＰＣＲ反応を実施する新規方法を記載する。ポリメラーゼ遮断領域が、一本鎖ハイブリダイゼーション領域に連結された本プライマーに付着されている。第二の修飾されたプライマーは、標的の第二の領域に対する塩基の配列を有し、並びにポリメラーゼ遮断領域及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域も有する。検出可能な部分（例えば、ビオチン、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ））が、２つの修飾されたプライマーの一方又は両方に付着される。ＰＣＲ反応を実行するために、混合物をサイクルにかけて、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを生成させる。第二の工程では、取り込まれていない過剰の修飾されたポリマー（検出可能な部分を有する。）は、混合物から実質的に除去される。幾つかの異なる方法が利用可能であり、これらは以下に記載されている。次いで、アンプリコンとのハイブリダイゼーションを可能とするために、一本鎖ハイブリダイゼーション領域の一方又は両方に対して相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに混合物を添加する。最後の工程では、このハイブリダイゼーションに伴う部分が、例えば、フルオロセインの光学的検出によって、直接検出される。あるいは、この部分（例えば、ビオチン）は、露出され、ストレプトアビジン標識された酵素（例えば、アルカリホスファーターゼ）と結合し、光学的に又は電気化学的に酵素活性が測定される。同じく、幾つかの具体的な方法が可能であり、これらの例は、以下に記載されている。
【００８５】
反応の流れは図７（ａ）に示されており、ここで、３１は検出部分（例えば、ビオチン、ＦＡＭ、ＤＮＰ、コレステロール、フルオロセイン）であり、３２は第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域であり、３３はポリメラーゼ遮断領域（例えば、ヘキサＰＥＧ）であり、３４は第一のＰＣＲプライマーであり、３５は第二のＰＣＲプライマーであり、３６は第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域であり、３７は第二の検出可能な部分であり、３８は二本鎖核酸標的配列であり、３９は固体基材（例えば、ビーズ又は表面）であり、及び４０は３６に対して相補的なハイブリダイゼーション領域である。
【００８６】
ＰＣＲプライマー３４及び３５は、好ましくは、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成され、ポリメラーゼ遮断領域３３中を除き、ＤＮＡポリメラーゼに対して適している全てのヌクレオチド又は修飾された塩基を含むことができる。ポリメラーゼ遮断領域配列の例は、スペーサーであるホスホルアミダイト１８−Ｏ−ジメトキシルトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（以下、「ＨＰＥＧ」と称される。）からなることができる。このホスホルアミダイトは、ヘキサエチレングリコールスペーサー領域を生成する。この目的のために、類似の特性を有するその他のスペーサー分子を使用することも可能である。３’−３’又は５’−５’ホスホジエステル骨格並びにＮｅｗｔｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１， １１５５−６２， １９９３）及び米国特許第５，５２５，４９４号によって記載されているような修飾されたヌクレオチドを作製するなど、ホスホルアミダイト化学に対する代替法を使用することが可能である。
【００８７】
付随する構成部品とともに適切な標的及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、これらの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを進行させることにより、取り込まれた一本鎖領域３２及び３６を有する新たに合成されたＤＮＡ分子を生成する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、好ましい実施形態は、著しくより高い回転数を示すＴ．コダキエンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋｉｅｎｓｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼを使用することが見出された。次いで、本分子は、３６を用いて、固体支持体３９上の標的配列４０にハイブリダイズすることができる。次いで、シグナルを生成するために、結合部分領域を使用することが可能である。例えば、結合部分としてビオチンを使用し、及び検出酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））に抱合されたストレプトアビジンを用いることによる。
【００８８】
ＰＣＲプライマーは、好ましくは末端ホスホロチオアート結合も含有し、Ｔ．コダキエンシスＫＯＤ１ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、末端塩基が異なることに基づいて、ＳＮＰ分析で使用されるプライマーの対立遺伝子の差を識別できないようになることを防ぐ。
【００８９】
上記フィルター保持装置を用いて単離されたヒトゲノムＤＮＡを用いる好ましい実施形態において、約３９０ｂｐのサイズのヒト血色素症遺伝子（ｈｆｅ）の領域を生成するために、２つの合成オリゴヌクレオチド（プライマー１及び２）を使用した。これらは、オリゴ１：
【００９０】
【化１】
であった。
【００９１】
ここで、５６−ＦＡＭは蛍光性の種であり、ＨＰＥＧは、１８−Ｏ−ジメトキシルトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを用いて取り込まれたヘキサＰＥＧ配列である。オリゴ１配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号１と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣ−３’は、配列番号２と表記される。オリゴ２配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡ−３’は、配列番号３と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡ−３’は、配列番号４と表記される。
【００９２】
これらのプライマーの使用を実証するために、洗口剤（Ｓｃｏｐｅブランド）に由来する口腔細胞ＤＮＡ試料を使用した。溶解性塩３μＬ及び２Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．８及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む界面活性剤溶液が含浸されたＷｈａｔｍａｎ４ろ紙から穿孔された５ｍｍの直径のディスク上に、この体液の３μＬの容量を分注した。抽出後、１００μＬまで充填されるように設計された０．５ｍＬのＭβＰ ＥａｓｙｓｔａｒｔＰＣＲ反応チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＰＮ ２１− ４０２−４９）中に、直ちにフィルターディスクを配置した。水溶液１００ｍＬ中に、以下の試薬：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ及び０．２ｍＭ ｄＮＴＰの最終濃度を得るために、蝋層下で、流体５０μＬをチューブに供給した。記載した０．３１ｐＭのプライマー１及び２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）の最終反応濃度を得るために、上層反応混合物４７μＬを添加した。本水溶液は、５ＵのＶｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００も含有した。Ｔｅｃｈｎｅ Ｔｅｃｈｇｅｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中で、増幅反応を行った。９７℃３分間、６０℃１分間及び７２℃１分間の３サイクルの後、９７℃１分間及び６２℃４５秒の３６サイクルを用いて、配列を増幅した。次いで、１００μＬの分注試料を用いて、使い捨てカートリッジ中で、増幅操作から得られた試料を検査した。電気化学的センサーを含有する検出カートリッジの設計素子の完全な記載は、参照により組み込まれる共有米国特許公開２００３０１７０８８１号に見出される。経時電流測定及び使い捨て検査カートリッジ中に組み込まれるセンサーに対して適用可能なその他の電気化学的方法の一般的な記載は、参照により本明細書に組み込まれた共有米国特許５，１１２，４５５号に見出される。
【００９３】
１００μＬの水性分注試料は、以下のようにして、すなわち、１４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、ｌμＬのＦＩＴＣ−ＡＬＰ 抱合体１／１００希釈及び１０μＬの増幅されたＤＮＡとして調製された。ＦＩＴＣ−ＡＬＰ抱合体は、３５０μｇ／ｍＬの最終濃度である。あるいは、増幅されたＤＮＡの代わりに対照オリゴヌクレオチド配列を使用した。対照オリゴヌクレオチド配列は、経時電流測定検出用の陽性対照として製造された。この一本鎖配列は、図７（ａ）に示されている３６と類似しており、領域４０に対して相補的であり、３６−ＦＡＭ蛍光種を含有する。図７（ｂ）は、検出工程における、標準的プライマーの望ましくない競合を示しているのに対して、図７（ｃ）のように、貝状プライマーを用いると、これは回避される。これらの両試料から得られた結果が、図８（ａ）及び８（ｂ）に示されている。図８（ａ）は、抗ＦＩＴＣ ＡＬＰ抱合体のみと、センサーにハイブリダイズされたアンプリコンとの抱合体を比較した経時電流測定の読み取りを示す。図８（ｂ）は、抗ＦＩＴＣ ＡＬＰ抱合体のみと、陽性対照オリゴヌクレオチド配列との抱合体を比較した経時電流測定の読み取りを示す。
【００９４】
検出カートリッジは、以下のように操作された。共有米国特許公開２００３０１７０８８１号に記載されているように、分注試料１００μＬの２０μＬ部分を、酵素が連結されたＤＮＡハイブリッドセンサーカートリッジ中に負荷し、ｉ−ＳＴＡＴモデル３００電気化学的分析装置（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に配置した。センサーカートリッジは、特異的なＤＮＡオリゴマーで被覆された複数の（２又は４個の）電流測定センサーを含有した。本例では、オリゴマーは、５’−ビオチン化されたオリゴヌクレオチドであり、センサー表面上に吸着されたストレプトアビジン被覆されたビーズに結合された。対照として、ＰＣＲプライマーの一本鎖部分の１つに対する相補的一本鎖ＤＮＡオリゴマーで、センサーの１つを被覆した。このカートリッジ内には、別個の抗ＦＡＭ−アルカリホスファターゼ抱合体も存在した。
【００９５】
好ましい実施形態において、単一の溶液中に溶解された、ＰＣＲ増幅された産物及び抗ＦＡＭ−ＡＬＰ抱合体を、ＤＮＡ捕捉センターと接触させた。あるいは、まず、ＰＣＲ産物をセンサーと接触させた後に、抱合体と接触させ得ることに留意されたい。好ましい実施形態において、両一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含有する二本鎖ＰＣＲ産物は、電気測定センサー上の捕捉領域に結合する。アルカリホスファターゼ標識の結合は、ＰＣＲ産物の捕捉前に又はＰＣＲ産物がビーズに結合した後に、溶液中で起こり得る。調節された時間の後、典型的には、５ないし１５分後、及び調節された温度で、好ましくは３７℃で、溶液は、センサー領域から出て、カートリッジ内の廃棄チャンバーへ送達される。ＡＬＰに対する基質を含有する洗浄溶液はセンサー上に運ばれ、センサー領域から過剰のａＦＡＭ−ＡＬＰ抱合体を洗浄除去する。洗浄溶液の後方部分がセンサー上に残存し、ＡＬＰ標識に対する電気発生基質を提供する。別の実施形態において、まず、洗浄溶液を使用し、続いて、基質を含有する第二の溶液を使用し得る。光学的センサー又はセンサーの他の種類が使用される場合には、他の適切な基質が使用されることにも留意されたい。好ましい実施形態において、捕捉センサーにおける測定された電流は、センサー上に存在するＡＬＰ標識の数に実質的に正比例する。相補的ＤＮＡ結合配列で被覆されていない隣接する電流測定センサーは、センサー上のＡＬＰ試薬の何れかの非特異的結合を打ち消し、これにより、検出限界を改善するために、対照センサーとして使用することが可能である。あるいは、相補的ＤＮＡ結合配列とは異なる配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドは、陰性対照として使用することができる。
【００９６】
図８（ａ）及び図８（ｂ）を参照すると、これらは、ＤＮＡカートリッジから得られる、測定された電流特性又は経時電流測定の出力を示している。抱合体を加えたＰＣＲ産物は、図８（ａ）において、抱合体単独に比べて、測定された電流の増加を示す。ここで、未結合のプライマーを競合することが、減少するシグナルであり得る。図８（ｂ）に示されているように、３６−ＦＡＭ種で標識されている陽性対照オリゴヌクレオチド配列を用いると、信号の同様の増加が観察される。正味電流は、試料中のＰＣＲアンプリコンの数に比例することも見出された（ここで、定常状態電流は、アンプリコン濃度の増加につれて増加することが示されている。）、図９（ａ）参照。これらの活動は、図９（ｂ）にプロットされている。
【００９７】
本例において機器２００及び６５０に対して使用されたソフトウェア（図６及び２１を参照。）は、検出過程中の一連の工程を実行する改変されたｉ−ＳＴＡＴ３００分析機器（ｉ−ＳＴＡＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。第一の工程において、本機器はカートリッジと接触して、カートリッジを特定した後、蓄電池のチェック及び他の内部機器のチェックを行う。次いで、機器は、センサーチップを３７℃まで加熱するために熱的サイクルを開始し、終了する。次いで、捕捉工程を可能とするために、増幅された標的を含有する液体を、空気圧によって、伝導路１２５からセンサーチャンバー１２６中に押し出す。次いで、一時的な保持チャンバーとして機能する伝導路１２５中に、分析パックから、分析中に分析流体を分注させる前記機器の第二のモーターの動きの間に、機器中のプッシュピン２１３は要素１３５と接触する。次いで、センサーチップに対する温度の設定点は４７℃まで増加され、チップ上の伝導センサーが初期化される。次いで、アンプリコンの効率的な捕捉を実施するために、捕捉オリゴヌクレオチドビーズの最上部の上で、標的液体が前後に押される。この工程は、約３ないし９分を要する。本捕捉プロセス中に流体の位置をモニターするために伝導性センサーが使用されることに留意されたい。最後の２つの振幅の前に、機器中のソフトウェアはチップの加熱を停止させ、残りのサイクルは周囲温度で実施される。次いで、非捕捉アンプリコンを含有する液体は、廃棄チャンバー１３７の試料入口側へゆっくり移動し、（２ｐＡ／ビットで）Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対して＋３０ｍＶの平衡電位でデータを収集するようにセンサーが設定される。この液体が廃棄チャンバー中に押し出されるにつれて、揺動ウィック機構が飽和状態になると、揺動ウィック機構が排出口を閉じる。この機構は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許出願第２００３０１７０８８１号に記載されている種類の機構である。次いで、本ソフトウェアは、捕捉オリゴヌクレオチド由来の未結合の残存材料を洗浄するために、分析流体がセンサーを横切って引き込まれるように、機器にカートリッジを作動させ、酵素と反応することができ、電極で酸化され得るｐ−アミノフェノールホスファートを含有する分析流体の薄層を残存させる。図９（ａ）に示されているように、時間の関数として生じる電流が記録され、生じた電流は、結果を表示するために、ソフトウェアアルゴリズムによって使用され得る。
【００９８】
ＤＮＡ配列決定反応中に取り込まれなかった一本鎖オリゴヌクレオチドを分解するためにＥｘｏＩを使用できることが本分野において公知であるが、ヘキサＰＥＧ領域のような非天然ＤＮＡがＥｘｏＩ酵素によって分解されるかどうかは不明であった。ＥｘｏＩがこの非天然塩基に対して作用することを示すために、図３１に示されている実験を行った。この図は、ＥｘｏＩ処理後における、３２Ｐ放射線標識された合成オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフを示している。図３１において、レーン１のｉｓ０１５オリゴヌクレオチドは、上記オリゴ１と同一である。オリゴヌクレオチド標識されたｉｓ０２６及びｉｓ０２７は、ｉｓ０１５と同様、ＨＰＥＧスペーサーを含有していたが、ｉｓｏ２０オリゴヌクレオチドはＨＰＥＧスペーサーを含有していなかった。図３１は、ＥｘｏＩ酵素が、約６−７ヌクレオチド長まで分子量を低下させる能力を有する、活性な３’−＞５’エキソヌクレアーゼであることを示している。さらに、ＥｘｏＩ酵素は、ヘキサＰＥＧ領域を過ぎて加工することができ、貝状プライマーの二本鎖領域中では、ＥｘｏＩ酵素は阻害される。従って、これは、ＥｘｏＩが、ヘキサＰＥＧ領域によってエキソヌクレアーゼであることを妨害されないことを示している。
【００９９】
本発明の別の実施形態において、標的遺伝子と１つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）の両方を使用することによって、遺伝子コピー変異（例えば、ＺＮＦ２１７）が検出される。これは、一方が標的用であり、他方がハウスキーパー用である、検出チャンバー１２６中の２つのセンサーによって達成される。ここで、ＰＣＲプライマーは、ハウスキーピング遺伝子と目的遺伝子の両方を増幅するために使用される。ＺＮＦ２１７がハウスキーピング遺伝子と同じコピー数で存在すれば、シグナルのレベルは類似する。しかしながら、ＺＮＦ２１７遺伝子は複数コピーで存在すれば、ＺＮＦ２１７センサーでのシグナルのレベルは、ハウスキーピング遺伝子センサーでのシグナルレベルより大きい。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、遺伝子発現変異を含む病状を引き起こす遺伝子の突然変異に取り組む。Ｗｉｌｄｅｎｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ｖｏｌ ５（６）：８７９）は、ｎｅｕタンパク質−チロシンキナーゼの過剰発現を記載しており、ｐ１８５は乳癌と関連している。ｃ−Ｍｙｃ発癌遺伝子は、癌の多くの形態で同定されている（Ｗａｉｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ｖｏｌ １８（３４）：４８７０）。発癌遺伝子過剰発現の他の例は、「Ｒｅｎ （２００４， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｖｏｌ １１（１）：２５）」によって記載された。過剰発現変異は、典型的には、ｍＲＮＡの増加したレベルを生じ、このため、本発明においてｍＲＮＡを検出するために、ｃＤＮＡ合成の最初の工程が、ＰＣＲ増幅の前に使用される。逆転写を用いたｃＤＮＡの合成（ＰＣＲによる本材料の増幅など）は、本分野において周知である。以前に記載されたＰＣＲ増幅を使用すると、シグナルのレベルを測定することにより、細胞中に存在するｍＲＮＡの量の存在を決定することができる。特定の発癌遺伝子に対するシグナルを比較することにより（例えば、ハウスキーピング遺伝子に対するＨｅｒ２／ｎｅｕ）、正常なレベルでの発癌遺伝子発現又は病状、特にＨｅｒ２／ｎｅｕの場合には乳癌を有する病状を示唆するレベルでの発癌遺伝子の識別が可能となる。
【０１０１】
図２６は、本方法のための別のアッセイ法を示しており、この方法に対する模式及び実験データは、ゲル電気泳動による図３２（ａ）に、及び経時電流測定による図３２（ｂ）に示されている。標的核酸（ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）３２９は、ＰＣＲ及び／又はＣｌａｍプライマーが３３０及び３３３を結合する２つの領域によって隣接されて示されており、介在配列は３３１によってマークされている。ＰＣＲ反応の間、３つのプライマー配列３１、３４１及び３７が反応混合物に添加され、３１及び３４１は、３３７及び３３８によって示されているように、それらの３’末端３４０の単一ヌクレオチドが異なっている。
【０１０２】
要素３１、３４１及び３７はＰＣＲプライマーとして作用し、プライマー３１及び３４１用の領域３３６は、標的分子３２９上の領域３３０にハイブリダイズする。分子３７の領域３５は、標的分子３２９上の領域３３３にハイブリダイズする。プライマー３７は、プライマー３１、３４１又は３１と３４１の両者に対して相補的なＰＣＲプライマーとして機能することができる。プライマー３７は、領域３５に塩基の特異的配列という特徴も有しており、これが標的分子３２９の位置３３３にハイブリダイズする。プライマー３７は、３３にＤＮＡポリメラーゼ遮断基を有し、検出の間の後のハイブリダイゼーションのための一本鎖領域を形成する別のユニークな領域を３６に有し、及び場合により、３７に結合部分を有する。
【０１０３】
貝状プライマー（ｃｌａｍ ｐｒｉｍｅｒ）３１及び３４１は、多くの同様の特徴を有するが、特異的な幾つかの相違も有する。両貝状プライマー３１及び３４１は、場合によって、検出可能な部分を３３４に有する。これは、例えば、３１上のビオチン分子及び３４１上のＦＡＭタグである。しかしながら、これらは、分子を後に識別できるようにするために、３１と３４１について異なる。貝状プライマー３１及び３４１はともに、それぞれ、異なって設計された一本鎖結合領域３２及び３３９を有する。さらに、「Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ３２（２）：６８１）」、「Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ １７（７）：２５０３）」及び欧州特許出願第８９３０２３３１．７号に記載されているように、貝状プライマー３１及び３４１はともに、ＤＮＡポリメラーゼ遮断基３３を有し、並びに貝状プライマー３１及び３４１はともに、一塩基多型の識別を補助するために、第四のヌクレオチド塩基中に設計された点変異を有する。既に述べたように、貝状プライマー３１及び３４１の両方の領域３３６は、標的分子３２９上の領域３３０に結合し、３３７又は３３８における一塩基変異は、単一のヌクレオチドの差を識別する。両貝状プライマーは、ある種の熱安定性ＤＮＡポリマー中に存在する３’→５’エキソヌクレアーゼに対して耐性である修飾された末端ホスホジエステル結合を３４０に有し、これは、２つの異なる分子の識別をさらに補助する。この修飾された末端ホスホジエステル結合は、ホスホロチオアート又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。貝状プライマーは、分子内構造を有するという特徴も有しており、これにより、取り込まれなかった一本鎖プライマー分子が、検出段階において、捕捉オリゴヌクレオチド４０又は３０に結合することが妨げられるが、新たに合成されたＰＣＲアンプリコン中にそれらが取り込まれた場合には、捕捉オリゴヌクレオチド４０及び３０へ、それらがハイブリダイズできるようにする。
【０１０４】
ＰＣＲの第一ラウンドでは、二本鎖標的の一本鎖への変性後、プライマー３７並びに貝状プライマー３１若しくは３４１又は３１及び３４１の両方が標的分子３２９に結合する。ホモ接合体の場合のように、貝状プライマー３１若しくは３４１のみが標的分子３２９に結合する場合には、２つの染色体の両コピー上の単一ヌクレオチドは同一である。ヘテロ接合体の場合のように、３１及び３４１がともに標的３２９の２つの別個の分子に結合する場合には、一方の染色体がある単一ヌクレオチド塩基配列を有するのに対して、他方の染色体は、一塩基多型において認められるように、異なる単一ヌクレオチド塩基配列を有する。これは、貝状プライマー３１若しくは３４１又は３１及び３４１の両方を取り込み、並びに他方末端にＰＣＲプライマー３７及び新たに合成された介在領域３３１を取り込む。
【０１０５】
１５サイクルと５０サイクルの間にわたって、ＰＣＲ増幅を進行させて、新たに合成された被増幅分子を生成する。図２６では、貝状プライマー３４１が取り込まれたアンプリコン３４４を示す。これは、例示のために行われている。他の突然変異が存在する場合、又は染色体の何れかの上に異なる配列が存在する場合には、３１が取り込まれたアンプリコンが見出される。簡略化のために、図には、３４１を有するアンプリコンのみが示されている。
【０１０６】
本過程の検出工程の間、取り込まれた貝状プライマー３４１及びＰＣＲプライマー３７を有する新たに合成されたアンプリコン３４４は、互いに結合している相補的配列の性質に基づいて、捕捉オリゴヌクレオチド４０に領域３３９の箇所で結合する。配列３３９は、異なる配列を有する物理的に隔てられた異なる捕捉オリゴヌクレオチド３０に結合しない。捕捉オリゴヌクレオチド３０及び４０は何れも、３９に示されているような固体基材又はビーズに結合される。
【０１０７】
このハイブリダイズされた複合体の検出は、分子３７中の結合部分３３４に結合する抱合体分子によって検出することができるか、又は抱合体分子によって検出され得る独自の検出可能部分３４２を有する分子３４４上の領域３６と、領域３４３において結合する別の一本鎖オリゴヌクレオチド３１８によって検出することができる。抱合体分子は、２つの特徴、すなわち（ｉ）結合部分３３４又は３４２に結合する領域及び（ｉｉ）検出領域を有する。一例は、ＦＭＡ結合部分に対して特異的な抗体であり、これは、検出要素としてのアルカリホスファターゼ酵素で修飾されている。
【０１０８】
別の増幅法
非ＰＣＲ核酸増幅アッセイを実施するために、同じ検出カートリッジを使用する本方法の別の実施形態を使用することができる。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の模式図が図１０に示されており、鎖置換増幅（ＳＤＡ）の模式図が図１１に示されている。成分要素は、図７（ａ）に示されているようにＰＣＲに対して記載されているものに対応することに留意されたい。両アッセイは、図２５において、２つの異なる方法を用いて示されているように、標的から作製される３’−ＯＨ部分を有する短いｓｓＤＮＡ断片（３０８及び３１０）を必要とする。図２５（ａ）は、現象惹起法（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｅｖｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、ＳＮＰアーゼ及びサイクリングプローブ）を示しており、図２５（ｂ）はＩｎｖａｄｅｒＴＭ法を示している。
【０１０９】
上記セクションにおける試薬と同じ試薬が使用されるが、前記標的核酸の第一の領域に対する塩基の配列を含む１つの修飾されたプライマーのみが必要とされる。同じく、修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを提供するために混合物をサイクルにかけた後、取り込まれなかった全ての過剰な修飾プライマーを混合物から実質的に取り除く。以下に論述されているように幾つかの方法を使用することが可能である。次いで、一本鎖ハイブリダイゼーション領域に対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに、混合物を曝露した後、前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの一本鎖ハイブリダイゼーション領域の、捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行う。同じく、最終工程は、前記ハイブリダイゼーションを伴う前記部分を検出している（例えば、アルカリホスファターゼによって生成される電気活性種の電気化学的検出）。好ましい実施形態において、プライマーは、ポリメラーゼ遮断領域に付着され、次いで、これは、一本鎖ハイブリダイゼーションに付着される。
【０１１０】
ローリングサークル増幅戦略の場合、プライマーの３’末端は遮断領域を有し、ホスファート又はジデオキシヌクレオチドを含むことができる。サイクリングプローブ反応又はＳＮＰアーゼアッセイに対して見出されるものと同様の切断反応が起こり、図２５（ａ）に示されているように遮断部分を除去し、反応３０６に参加している、標的ＤＮＡ３００並びに試薬３０１、３０２及び３０９を含む。予め作製された環状分子を反応混合物に添加することが可能である。遮断されたプライマーを用いると伸長は起こり得ないが、切断されたプライマー分子に対しては伸長が起こる。切断されたプライマーは、予め作製された環状分子に対して相補的な特異的領域の重複を有する長い一本鎖分子を生成する。検出可能部分を有する合成オリゴヌクレオチドが混合物中に含まれ、ここで、本ヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡのある領域に対して相補的であり、これは、一本鎖ＤＮＡに沿って、複数回見出すことができる。プライマーの一つの領域（一本鎖であり、及びユニークである。）は、捕捉オリゴヌクレオチド領域に結合する。本領域は予め作製された環状ＤＡに対して相補的でないので、この領域は捕捉オリゴヌクレオチドと全く競合しない。図１０に示されているように、ローリングサークルアッセイでは、ｓｓＤＮＡ３’−ＯＨ部分（３０８、３１０）は、反応３１２を介して、ローリングサークル試薬（３１１、３１５）に結合する。サイクリングは、３０８又は３１０の３’末端から始まる、付着された部分３１６の連なりを、産生された３１４に取り込む。要素３１４の検出は、ビーズ３９上に固定された相補的要素４０及び３１６に対して相補的な標識されたポリヌクレオチド３１７に要素３１４の５’−３’−ＯＨ領域を結合することによって達成される。次いで、標識は、アルカリホスファターゼ３１８に結合された抗体によって認識される。
【０１１１】
非ＰＣＲ核酸増幅アッセイを実施するために、同じ検出カートリッジを使用する本方法の別の実施形態を使用することができる。鎖置換増幅のための模式図が、図１１に示されている。構成要素は、図７（ａ）で使用されたＰＣＲ中のものに対応することに留意されたい。上記のものと類似の試薬が使用されるが、ＳＤＡプライマーは、まず、増幅不能フォーマットで提供しなければならず、これは、増幅可能フォーマットへと変換される。これを達成するための１つのアプローチは、例えば、３’末端ジデオキシ配列を用いて、遮断された３’末端ブロックを有するプライマーを提供することである。次いで、誘発現象が起こり、これは、遮断している３’末端を切除する。誘発現象の一例は、Ｉｎｖａｄｅｒ反応であり得（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＲＷ， Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ Ｖ， ｄｅ Ａｒｒｕｄａ Ｍ， Ｎｅｒｉ Ｂ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ， ｇｅｎｅｔｉｃ， ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ． ＭｏｌＤｉａｇｎ． １９９９；４：３５３−３６４．）、ここでは、フラッパーゼ活性が、ゲノム標的核酸の存在により、遮断されたプライマーをハイブリダイズされた連結部において切断して、利用可能な３’水酸基を与える。これは、標的ＤＮＡ３００並びに反応３０７に関与する３０４、３０３、３０５及び３０９を含む試薬とともに図２５（ｂ）に示されている。あるいは、誘発現象の別の例は、サイクリングプローブ反応（Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ９（２）：１４２）であり、ゲノム標的核酸の存在は、サイクリングプローブオリゴヌクレオチド上の４ヌクレオチド配列において、サイクリングプローブオリゴヌクレオチドを切断させ、次いで、遊離の３’水酸基を生成する。別の類似の例は、ＳＮＰアーゼに対して記載されているように、ゲノム標的核酸及び修復酵素に対するミスマッチであり、遊離の３’水酸基を生成する。
【０１１２】
プライマー配列中に遊離の３’水酸基を生成した誘発現象の後、相補的鎖置換プライマーが存在する。このＳＤプライマーは、上記プライマーに対して、その３’末端が相補的であり、これは３’水酸基を生成した。さらに、ＳＤプライマーは、米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているように、新たに合成されたときに、ニッカーゼ制限エンドヌクレアーゼによって切断される領域である３’水酸基相補的オリゴヌクレオチドに対して３’を有する。これにより、鎖置換反応は、新たに合成された配列の多数コピーを生成することが可能となり、これは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されているような非チオ鎖置換増幅の基礎を形成する。上述のように、ＤＮＡは架橋して、捕捉オリゴヌクレオチドとのシグナルを生成するので、本過程における次の工程は、鎖置換プライマーに対して相補的な、これらの増幅された新たに合成された断片を使用することである。これは図１１に示されており、鎖置換アッセイにおいて、ｓｓＤＮＡ３’−ＯＨ部分（３０８、３１０）が、領域３２０、３２１及び３２２から構成される３１９の３’末端において、領域３２０に結合する。次いで、反応３２４で切れ目が導入されて、ｓｓＤＮＡ３２５の短い一部を生じる伸長反応３２３が起こり、ｓｓＤＮＡ３２５の短い一部は、プライマー伸長と切れ目の反応３２６を繰り返すことにより蓄積する。要素３２５の検出は、ビーズ３９上に固定された相補的な４０に３２５の第一の部分を、及び標識されたポリヌクレオチド３１７に３２５の第二の部分を結合することによって達成される。次いで、標識は、アルカリホスファターゼ３１８に結合された抗体によって認識される。
【０１１３】
増幅後のプライマーの除去
完了したＰＣＲ反応から、未使用のＰＣＲプライマーを除去するための幾つかの新規アプローチについて記載する。迅速なＰＣＲ反応（すなわち、約１５分未満で増幅が完了する。）を取り込むシステムを開発することを求める結果、プライマー濃度を増加させる必要があることが明らかとなった。しかしながら、これは、通例、検出工程において増加したプライマーバックグラウンドを生じさせ、捕捉オリゴヌクレオチド上でのシグナル生成を低減させ得る。精製されたアンプリコン及び増加した非標識標的オリゴヌクレオチド（とりわけ、標識された対照オリゴヌクレオチド）を用いた実験は、これらのバックグラウンドオリゴヌクレオチドがシグナルを除去又は低減できることを示した。１つのアプローチ又は以下に記載されているアプローチの組み合わせを、バックグラウンドシグナルを低減するために使用することができる。
【０１１４】
反応増幅混合物からプライマーを簡単に除去するための１つの方法は、貝状オリゴヌクレオチドプライマーを使用することである。このオリゴヌクレオチドは、主として、第一の温度範囲において、溶液中である種の所望される二次構造を示すが、より高い第二の温度範囲においては示さない。本例では、オリゴヌクレオチドは、第二の温度範囲において標的核酸の反応を開始させることができるが、第一の温度範囲では反応を開始させることができない。一次構造が、好ましくは主として分子内様式でハイブリダイズするが、分子間様式でもハイブリダイズする１つ又はそれ以上の領域を有する二次構造をもたらすようにオリゴヌクレオチドを設計することによって、これは達成される。これは、第一の温度範囲では起こるが、前記第二の温度範囲では起こらないので、温度を変化させることによって、プライミング型と非プライミング型の間でプライマーを切り替えることが可能となる。その結果、増幅反応の終了時に温度を下げることにより、混合物から過剰のプライマーが効果的に除去される。この種の貝状プライマーは、ポリメラーゼ遮断領域、一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び場合により存在する検出可能な部分を取り込んで調製され得ることが見出された。増幅反応終了時にプライマーを除去するための別の方法も考案されている。これらは、電気泳動、ＰＣＲ後ハイブリダイゼーション及び酵素的変換による。
【０１１５】
電気泳動分離
記載されている第一のアプローチは電気泳動分離である。それらの分子量に基づいて核酸を分離できることは周知である。ＰＣＲアンプリコンとオリゴヌクレオチドプライマーとのサイズの相違を活用することによって、アンプリコンを迅速に精製することが可能である。好ましい実施形態において、電気泳動モジュールは、使い捨て装置中に取り込まれる。例えば、電気泳動精製モジュールは、図１２に示されているように、精製を実施するのに便利な位置に、装置中のチャンネルに沿った地点に置くことができる。本装置は、装置のチャンネル中の電極５０及び隣接する空洞５２中の第二の電極５１から構成される。各電極は、電気的接触パッド５３に接続される。装置中のチャンネル５４は、より初期の段階（ＰＣＲ増幅工程）からより後期の段階（例えば、検出工程）へ、それを通じて流体が移動する手段を提供する。
【０１１６】
図１２に示されている精製モジュールは、チャンネルの何れかの側面及び上又は下に置くことができる。これは、２つ又はそれ以上の電極を有することができる。例えば、示されている２つの電極の間の位置に、さらなる第三の電極を置くことができる。図１２に示されている２電極の実施形態の場合、プライマー配列用の捕捉膜が使用され、これは、プライマーを効果的に、不可逆的に吸収する。適切な材料には、ニトロセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ ＤＥ５２膜及びその他のＤＮＡ結合膜が含まれ、本分野において周知である。
【０１１７】
一実施形態において、電気泳動緩衝液を有する固体化されたゲルマトリックス（例えば、アガロース）が、空洞中に配置される。ＰＣＲ増幅された材料の試料セグメントは、次いで、チャンネルを通じて移動し、空洞上に配置される。場合により、参照により本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，０９６，６６９号に記載されているように、材料がチャンネルを通じて移動する際に材料の位置を感知するために伝導性電極の第二の対を使用することができる。一旦、試料が適切に配置されたら、２つの電極（５０が負であり、５１が正である。）を横切って電気泳動電荷を印加する。これは、ゲルマトリックス中で分子の電気泳動移動を引き起こし、より小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーが最も速く移動し、より大きなＰＣＲアンプリコンはよりゆっくり移動する。断片が適切な距離を（すなわちチャンネルを出て、空洞中に）移動したら、電気泳動の電荷を逆転させ、断片を反対方向に移動させる。一定の時間後、並びに特定の電荷及び電圧を用いると、より大きな分子はチャンネル中に戻り、より小さなプライマー分子はゲル材料中に残る。従って、これは、アンプリコンの精製を実施する方法である。
【０１１８】
別の実施形態において、図１２に示されている２つの電極間に第三の電極が配置される。ここで、電極５０及び５１は、それぞれ、負及び正として設定される。プライマー分子が第三の中間電極を通過するが、アンプリコンは通過しない時間が経過した後、電極５０を正電荷に逆転させ、電極５１は正のままとする。この点で、第三の中間電極は負とされる。これは、プライマーをチャンネルから離れるように移動させ続け、アンプリコンの方向をチャンネルに向かうように逆転させる。
【０１１９】
図１３（ａ）−（ｇ）は、装置中の帯電した色素を用いることを含む工程を示している。図１３（ａ）は、共有米国特許第５，０９６，６６９号に記載されている種類の修飾されたｉ−ＳＴＡＴカートリッジベースを示している。これは、入口ポート７１、チャンネル７２、チャンネルに隣接した空洞７３並びに３つの電極７４、７５及び７６（これらの２つは空洞中に存在し、１つはチャンネル中に存在する。）を有する。空洞は、透明なゲルとして、緩衝液とともに１％アガロースを含有する。図１３（ｂ）に示されているように、一般的な電気泳動ローディング色素５μＬ、ブロモフェノールブルー及びキシレンシアノール（何れも、負に帯電している。）を含む試料を、入口ポートを通じて添加し、試料は流体セグメント７７としてチャンネルに入る。実際のＤＮＡ分離が５０ｂｐ及び３００ｂｐ断片であるのと同様に、これらの色素は概ね２５ないし５０ｂｐのサイズで移動することに注目されたい。
【０１２０】
図１３（ｃ）では、負の電位が７４に対して印加され、正の電位が７６に対して印加される（本ケースでは、１０−５０Ｖ）。帯電した色素は、７６に向けて、アガロースゲル中を迅速に移動する。２つの色素は、それらの電荷対質量比に従って、ゲルを通じて、異なる速度で移動する。図１３（ｄ）に示されているように、色素は、７５の両側に、２つのバンド７８と７９へと分割される。これには、約３分を要する。この点で、７４及び７６は正に、７５は負となり、これにより、図１３（ｅ）に示されているように２つの移動する色素は、キシレンシアノール色素が再度チャンネルに進入するまで、反対方向に誘導される、図１３（ｆ）。最後に、図１３（ｇ）に示されているように、さらに下流への適用のために、キシレンシアノールはチャンネルの下に向けて空気圧で移動するが、他の色素は空洞中に残存する。
【０１２１】
明らかに、２つの色素の挙動は、異なる長さのヌクレオチド配列又は電気泳動を用いて迅速にお互いから分離することが可能な、異なる電荷対質量比を有するその他の何らかの化学種の代表である。さらに、電気泳動特性及び本装置の能力は、所望の分離を達成するために、ゲル密度、緩衝液塩選択、印加される電位及び時間、物理的サイズなどに従って調整することができる。
【０１２２】
別の実施形態において、当初の液体試料は、空洞に接しているチャンネルの領域を出て、電極の極性を逆転する前に、異なる液体のより少量と置き換える。これは、アンプリコンの濃縮を実施することができ、次いで、この濃縮は、アッセイプロセス中のさらに後の段階でのハイブリダイゼーション速度を増加させることができる。別の実施形態において、プライマーは、空洞内の捕捉膜又は粒子と接触され、これにより、不可逆的な結合が行われるため、プライマーがチャンネルの方向に戻ることは妨げられる。別の実施形態において、アガロースは、アクリルアミド、アガロースの混合物及びイナゴマメのガム、ハイドロコロイド又は他の適切な分離媒体を含む異なるマトリックスと置換され得る。別の実施形態において、図１２に示されているように、シリコン上の従属部品として装置が製造され、微小装置中に挿入される。別の実施形態において、この分離した構成部品を遺伝子検査装置中に組み込むことに付随する制約に対処するために、電気泳動チャンネルは、「Ｌ」の肘に、又はその近くに位置する電極７５を用いてＬ字型とし得る。例えば、図２４は、入口ポート６５７及びマトリックス６５６とともに電極６５２、６５３及び６５４を有する、伝導路４０９に隣接する一体化された検査装置６５１中に取り込まれたＬ字型のチャンネル機構６５５を示している。他の要素は、図１９のとおりである。
【０１２３】
図１４は、ＰＣＲ反応からのアンプリコン及びプライマーを用いた、電気泳動装置の操作を示している。レーン（Ａ）は、ゲル空洞中に電気泳動し、新鮮な第二の回収分取試料中に再度戻して、６％の非変性アクリルアミドゲルにかけた後のＰＣＲ反応産物の一部を示している。レーン（Ｂ）は、一方向移動後に除去された元の分取試料中に残存する試料の一部を示している。レーン（Ｃ）は、試料と等しい濃度の対象であり、レーン（Ｄ）は、試料及び対照より３倍高濃度の１０塩基対ラダーである。ラダーの主な種の塩基対の長さは、３３０、１００及び１０である。
【０１２４】
貝状オリゴヌクレオチド
通常、ＰＣＲ用途の場合、二次構造の量を減少することは、標的の非特異的で、不良なプライミングを減少するのに役立つので、合成オリゴヌクレオチド配列を設計するときには望ましいアプローチである。Ｈｆｅ１遺伝子に対して相補的であり、５塩基対のアデノシドスペーサー配列を有し、及び遊離の一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドの予想される折り畳み構造が図１５に示されている。図１５の配列は、
【０１２５】
【化２】
である。潜在的な分子の折り畳みの理論的な予測として、ＲＮＡ折り畳みプログラム（Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ）は、１０℃を上回るあらゆる温度で、一本鎖の性質を有するオリゴヌクレオチドを予測する。低温で二次構造を有するが、ＰＣＲ及びＰＣＲハイブリダイゼーションの変性工程中にはそれらの二次構造を喪失する合成オリゴヌクレオチドを設計することによって、ハイブリダイゼーション及び検出の後の段階でアンプリコンのハイブリダイゼーションを実施できるが、プライマー分子のハイブリダイゼーションは実施できない。ｉｓ０１５配列を出発点として使用し、図１６（ａ）及び（ｂ）に示されているように、ヘアピンループ構造を有するオリゴヌクレオチドを設計し、モデル化した。図１６（ａ）における塩基対配列は、
【０１２６】
【化３】
である。
【０１２７】
図１６のモデルでは、ＨＰＥＧスペーサーの効果をモデル化するために、ボックス中に示されている５塩基対の配列が使用される。図１６のモデルに基づいて、２つのオリゴヌクレオチドがＣＬＡＭ１及びＣＬＡＭ２と表記された。２つの配列は、４つのヌクレオチドが異なる。
【０１２８】
【化４】
【０１２９】
ＣＬＡＭ１配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号８と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣ−３’は、配列番号９と表記される。
【０１３０】
ＣＬＡＭ２配列において、ＨＥＰＧスペーサーに対して５’に位置する配列５’−ＡＣＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴ−３’は、配列番号１０と表記され、ＨＥＰＧスペーサーに対して３’に位置する配列５’−ＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣ−３’は、配列番号１１と表記される。
【０１３１】
これらのオリゴヌクレオチド配列は、ＰＣＲ反応におけるＨｆｅ１プライミング及び捕捉オリゴヌクレオチドへの結合のための主要な一次配列の特徴を維持しているが、分子内結合を生成して、これらの「貝状」構造を作出するために追加配列が付加されている。ＨＰＥＣスペーサー領域配列は５つの「Ａ」で記されていること、及びこれらの配列は約４０℃ないし４５℃を上回ると、二次構造を有しないと予測されることに留意されたい。
【０１３２】
図７（ｂ）及び７（ｃ）は、二次構造をほとんど又は全く持たないＰＣＲプライマー配列を使用した場合とＣＬＡＭ ＰＣＲプライアーを使用した場合の差を比較対照している。ＰＣＲ中の温度で、特に、ハイブリダイゼーションの温度又はハイブリダイゼーションを上回る温度で、ＣＬＡＭプライマーは二次構造を形成せず、一旦、ＰＣＲアンプリコン中に取り込まれると、貝状構造を形成する能力を喪失する。ＰＣＲハイブリダイゼーションを下回る温度及び捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにたいして使用される温度では、ＣＬＡＭ ＰＣＲプライマーは二次構造を形成する。従って、取り込まれなかったＣＬＡＭ ＰＣＲプライマーは捕捉オリゴヌクレオチドに結合せず、及びシグナル生成を妨害しない。
【０１３３】
図７（ｂ）は、非ＣＬＡＭオリゴヌクレオチド配列を使用し、及び標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＰＣＲ反応を示している。二次構造を持たないｉｓ０１５のような配列が、２個のＰＣＲプライマー８１のうちの１つとして使用される。ＰＥＧスペーサーは、ＰＣＲアンプリコン中に一本鎖領域を生成し、反応８２において、過剰なプライマー配列が生成される。段階８３において、ＰＣＲアンプリコンと未反応プライマー配列の両方が、ビーズのような固体基材に結合された捕捉オリゴヌクレオチドに結合することが可能である。典型的には、未反応プライマーは、ＰＣＲアンプリコンと比較して著しいモル過剰にあり、シグナル検出を減少させる。
【０１３４】
図７（ｃ）は、ＰＣＲアンプリコンのみを標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるＣＬＡＭオリゴヌクレオチド配列を使用するＰＣＲ反応を示している。ＣＬＡＭ１又はＣＬＡＭ２配列の何れかを生成するためにｉｓ０１５配列に対する修飾を使用して、ＰＣＲ反応８１を行う。ＰＣＲで使用される温度では、二次構造は除去される。ＣＬＡＭオリゴヌクレオチドの一方末端がＰＣＲアンプリコン中に取り込まれたら、これは、もはや、二次構造とともに機能せず、一本鎖領域８２を与える。工程８３において、温度は、取り込まれていないＣＬＡＭプライマー配列の二次構造を生成するために必要とされる温度を下回る。その結果、ＰＣＲアンプリコン中に取り込まれたＣＬＡＭプライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドに結合することができる一本鎖領域を有する。
【０１３５】
酵素の除去
プライマーを除去するために、２つの酵素的アプローチが考案されており、これらは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチド上のＴｄＴ尾部及び取り込まれなかったオリゴヌクレオチドの分解に関する。ＰＣＲ反応混合物内には、ｉＳｐ１８プライマーを有する上記の例では一本鎖領域有するアンプリコン及び取り込まれなかった合成オリゴヌクレオチドという２種類の構造が存在する。アンプリコン上のプライマーは、伸長する５’領域のみを有するのに対して、取り込まれなかったプライマーは遊離の５’及び３’一本鎖末端を有する。３’末端におけるこれらの差に特異的な酵素を用いて、これらの分子を識別して除去するための戦略が開発された。
【０１３６】
ＰＣＲ反応産物のウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジル転移（ＴｄＴ）酵素処理は、一本鎖３’伸長に対して特異的であるので、取り込まれなかったプライマーのみが、新たに取り込まれた尾部を生成する。これに対して、アンプリコンは、５’尾部を有する一本鎖領域のみを有するが、これはＴｄＴと反応しない。
【０１３７】
普遍的捕捉システムに対しては非効率的で且つ特有ではないが、「Ｔ」などの単一ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を使用して、ＰＣＲプライマーの３’末端に伸長されたＴ尾部を作製することができる。この用途のために、リボヌクレオチドを含む修飾されたヌクレオチドなどの、ＴｄＴ又はポリ（Ａ）ポリメラーゼとともに機能する全てのヌクレオチドを使用することができる。取り込まれなかったＴ尾部付きプライマー配列を有する修飾されたＰＣＲ反応混合物は、ポリ（Ａ）配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドに対して曝露されることができる。Ｔ尾部を有する、取り込まれなかったＰＣＲプライマーのみが、捕捉ポリ（Ａ）配列に結合する。これにより、ポリ（Ｔ）配列を伴うＰＣＲアンプリコンに対して反応混合物が濃縮される。ポリ（Ａ）捕捉オリゴヌクレオチドは、固体表面、ビーズ、マトリックス様アガロース中、アクリルアミド、ポリビニルアルコール又は他の適切なハイドロコロイドに結合することができる。
【０１３８】
別の方法は、エンドヌクレアーゼの使用に基づく。取り込まれなったオリゴヌクレオチドプライマーは遊離の３’水酸基を有し、アンプリコンは有していないので、取り込まれなったオリゴヌクレオチドプライマーを除去するために３’−５’エキソヌクレアーゼが使用される。ＥｘｏＩ及びＥｘｏＴを含む酵素は、遊離の３’水酸基を有する一本鎖ＤＮＡと特異的な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。本実施形態において、５’−リン酸基を有するプライマーを使用することが好ましい。
【０１３９】
ＰＣＲ後のハイブリダイゼーション
上記ＰＣＲ反応では、２つの異なる一本鎖領域を生成する２つのプライマーを含有するアンプリコンが生成される。シグナルを生成するために、２つの一本鎖領域間の架橋である新たに増幅された領域の他に、両方の一本鎖領域が必要である。
【０１４０】
本例では、一本鎖Ａ領域は、バイオセンサーにおける相補的Ａプライム捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。一本鎖Ｂ領域は、酵素的抱合体に対する部分を有する合成オリゴヌクレオチドＢプライムに結合する。あるいは、酵素的抱合体は、Ｂ領域に直接結合する。
【０１４１】
まず、Ｂプライム捕捉オリゴヌクレオチドが結合した固体基材を、本例では、検出領域に通じるチャンネル中に作製し、適切な条件下でＰＣＲ反応材料をハイブリダイズさせることにより、アンプリコン中に取り込まれなかった全てのＢ領域オリゴヌクレオチドがチャンネルから失われ、Ｂ領域オリゴヌクレオチドに対するチャンネル及びアンプリコン中に取り込まれたＢ領域オリゴヌクレオチドが濃縮される。未結合材料は、洗浄除去される。
【０１４２】
次いで、熱又はアルカリ条件によって、この濃縮された、結合したＢ領域オリゴヌクレオチド及びアンプリコンを固体支持体から放出させる。装置の検出領域の方向に、この材料を移動させる。Ａ領域を有するオリゴヌクレオチド又はアンプリコン中に取り込まれたオリゴヌクレオチドは、バイオセンサーにおいてＡプライム捕捉オリゴヌクレオチドに結合する。バイオセンサーは洗浄することが可能であり、全ての取り込まれなかったＢプライマーが除去され、完全に取り込まれたアンプリコンのみが残存する。これは、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドからバックグラウンドを効率的に除去する。
【０１４３】
核酸検査カートリッジの詳細な説明
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置及び読み取り機器とのその相互作用が、図６に幾何学的に示されている。これは、標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポート１０１を有する収容部１００を含む。入口ポートは、前記標的核酸を抽出するための試薬を有するチャンバー１０２に通じる。試薬１０３は、チャンバーの壁上に被覆することができる。チャンバーは、ビーズ１０４、例えば、核酸を結合するのに適したコーティングを有する磁気ビーズを含有し得る。好ましくは、チャンバーは、融解して、伝導路１０６への出口の領域中に連続した蝋層１０５を形成することができる蝋も含有する。好ましい磁気ビーズが前記標的核酸と会合したら、蝋層を通じて伝導路中にこれらを引き付けるために磁場を付与する。付与されるこの磁場は、試料からの核酸の抽出を促進するために、チャンバー中で振幅させてもよいことに留意されたい。場合により、抽出チャンバーを出る前に、洗浄流体をビーズに付与してもよい。洗浄流体チャンバー１２２は、入口ポートと抽出チャンバーの間に接続される。さらに、試料及び洗浄流体廃棄チャンバー１２３は、入口ポートに関して、抽出チャンバーの遠位末端に接続される。作動時には、抽出工程の後、磁気手段によってビーズはチャンバーの壁上に保持され、次いで、洗浄流体は、チャンバー１２２からチャンバー１０２を通じて、チャンバー１２３中に送られる。これにより、望ましくない試料材料が排除され、チャンバー１０２はビーズ及び主として洗浄流体を含有する状態になる。機器２００はチャンバー１２２に対して整列された作動手段２１１を含有し、チャンバーから洗浄流体を追放するために、柔軟な隔壁１２４に対する力を付与する。
【０１４４】
洗浄後、次いで、ビーズは、蝋層を通過して、伝導路１０６中に、次いで増幅チャンバー１０７中に進む。伝導路中のビーズの移動は、好ましくは、同じ磁気手段により、又は空気圧とすることも可能である。増幅チャンバーは増幅試薬保持チャンバー１０８にも取り付けられ、これは、好ましい実施形態におけるように、又はビーズがこのチャンバーに進入する前又は進入した後の分離された工程において、ビーズを有する増幅チャンバーへとこれらの試薬を送達することができる。あるいは、これらの試薬は、このチャンバー中に存在してもよく、要素１０８は省略してもよい。増幅試薬が最良に乾燥保存される別の代替法において、チャンバー１０８は、増幅チャンバーの壁上に被覆された希釈剤及び試薬を含有し得る。
【０１４５】
様々な増幅法、例えばローリングサークル及びリガーゼ連鎖反応に対して、上述のような増幅試薬を提供することができる。好ましい実施形態において、試薬は、ＰＣＲを用いて増幅された標的中に検出可能な部分を取り込む。場合により、付与される磁場は、増幅チャンバー中のビーズを混合するために使用され得る。これは、抽出チャンバーについて記載したものと同様の様式である。
【０１４６】
前記増幅チャンバーは、加熱手段１０９及び増幅チャンバーの温度を調節し、このため、標的核酸の増幅に適した条件を実施するための温度検知サーミスタ１１０も有する。好ましい実施形態において、増幅チャンバーは、３０サイクルにわたって、６８℃及び９０℃の間でサイクルにかけられる。各温度での時間は、それぞれ、５秒超及び３０秒未満である。収容部１００の主要部分はプラスチック製であるが、増幅チャンバーの少なくとも１つの壁は、優れた熱伝導特性を有する不活性材料（好ましくは、シリコン）から作製される。シリコンの逆側は抵抗性経路１１１並びに２つの電気接触パッド１１２及び１１３を有し、これらは加熱素子１０９を構成する。抵抗性経路を通過する電流は、シリコンチップの加熱を引き起こし、従って、増幅チャンバーの内容物の加熱を引き起こす。シリコンの逆側は、２つの電気的接触パッド１１５及び１１６への導線１１４によって配線されたサーミスタ１１０も有する。抵抗性経路を通過する電流を制御し、これにより、増幅チャンバーの温度を調節するために、サーミスタの出力は機器によって使用される。
【０１４７】
使い捨て装置１００は、場合により、入口ポートを密封するための閉鎖要素１１７も含み得る。これは、共有米国特許５，０９６，６６９号に記載されている種類のプラスチック留め金式閉鎖要素又は係属中の共有米国特許出願１０／６５８，５２８号のスライド閉鎖とすることができる。
【０１４８】
増幅チャンバーは、それぞれ、１１８及び１１９により、入口及び出口にも密封し得る。これは、温度サイクリングの間に試薬がチャンバー中に留まるように確保するのに望ましい。例えば、要素１１８及び１１９は、変形可能なゴムシールであり得る。収容部中の開口部１２０及び１２１を通じて移動し、１１８及び１１９と接触して密封をもたらす、機器中のピン要素２０９及び２１０によって、作動させることができる。ピン要素２０９及び２１０は、独立に、又は機器によって一緒に作動し得る。
【０１４９】
増幅チャンバーの出口は、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド１２７及びセンサー１２８を含む検知領域１２６を含有する第二の伝導路１２５に作動可能に取り付けられている。収容部１００は、前記検知領域へ増幅された標的を移動させるために増幅チャンバーに取り付けられた第二のポンプ手段１２９を含有する。ポンプ手段は、隔壁１３１を有する、空気が充填されたチャンバー１３０を含む。機器２００は、空気圧によってチャンバー１３０から空気を排除することにより、増幅された標的を検知領域の方向へ排除するために要素１３１に力を加えるための作動手段２１２を含有する。
【０１５０】
増幅された標的が検出装置領域に到達すると、増幅された標的は捕捉オリゴヌクレオチドに結合し、保持され得る。検出領域は、壁１５１上に被覆された乾燥した試薬層も含有する。好ましい実施形態において、プライマーを伴う部分（アンプリコンの一部となる。）はビオチンであり、乾燥した試薬１５１は、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである。アンプリコンとともに試薬を溶解すると、試薬は、周知のビオチン−アビジン相互作用を介して、ビオチンに結合する。作動中、この工程は、一般的には、約５分から約１５分を要する。別の実施形態において、前記部分は５’ＦＡＭ又は５’−ビオチンとすることができ、及び乾燥試薬は、抗ＦＩＴＣ−ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）又はストレプトアビジン−グルコースオキシダーゼ抱合体とすることができる。
【０１５１】
第三の伝導路１３２は、増幅チャンバーの出口と検知領域の間において、第二の伝導路１２５に取り付けられている。第三の伝導路１３２は、検出試薬１３４が入ったチャンバー１３３を有する。場合により、試薬は、柔軟な密閉されたホイル小袋１３５中に含有され、作動時には、機器は、小袋に力を与えて破裂機構１３６（好ましくは、収容部中に成型された鋭いプラスチックの点）に対して小袋を押し付けることにより小袋を破裂させることができる作動手段２１３を含有する。これにより、検出試薬は、第三の伝導路を通じて、第二の伝導路中に移動する。これにより、増幅された標的を捕捉オリゴヌクレオチドに結合させた状態に保ちながら、全ての未破裂の増幅された標的及びその他の材料が検知領域から排除及び洗浄除去される。収容部２００は、排除された材料を受容するために第二の伝導路に取り付けられた廃棄チャンバー１３７も含有している。
【０１５２】
最終工程において、検出試薬は、前記増幅された標的１３９中に取り込まれた部分１３８と反応して、センサー１４０にシグナルを生成する。部分がビオチンであり、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼに結合されている好ましい実施形態において、検出試薬は、酵素により加水分解されてｐ−アミノフェノールを形成するｐ−アミノフェノールホスファートである。次いで、これは、電流測定センサーの電極表面で電気化学的に酸化されて、経時電流測定（電流対時間のプロット）を示す図に記されているように、存在する部分の量に比例する電流を生じる。
【０１５３】
一体化された使い捨て装置を作動させるために使用される図６中の機器２００及び図２１中の６５０は、図２１では、検査装置と相互作用している状態で示されている。これは、使い捨て装置１００及び６５１を受容するためのポート６５４を含む。機器は、ユーザーが入力するためのキーパッド６５２及びディスプレイ６５３を有している。電気的接続要素及び作動要素の所望される相互作用を提供するために、機器に関して装置の位置を決めるための１つ又はそれ以上の位置決め機構２０２が提供される。機器は、チャンバー１０３中のビーズ１０４の位置に隣接する電磁石２０３を含有する。抽出チャンバーから増幅チャンバーへとビーズを移動させ、各チャンバー内でのビーズの混合を促進するために、電磁石を使用し得る。機器には、チャンバーに圧力を与え、試薬を増幅チャンバー中に排除させることができる増幅試薬保持チャンバー１０８の位置に隣接する作動手段２０４が含まれる。機器は、要素１１２と１１３を接触するための電気的接触２０５及び２０６の一対並びに１１１を通じて電流を通過させるための電力源も有する。機器は、サーミスタ１１０を接触させるための要素１１５及び１１６を接触させるための電気的接触２０７及び２０８の一対も含む。さらに、機器は、適切な電気的回路及びこれらの手段を通じて増幅チャンバーの温度を制御するための内蔵されたアルゴリズムを含む。
【０１５４】
機器は、収容部中の開口部１２０及び１２１を通じて移動し、１１８及び１１９と接触して１１８及び１１９を閉鎖し、増幅チャンバーを密封する、作動ピン要素２０９及び２１０を含む。分析サイクル中の適切な段階で密封を開始するための制御アルゴリズムとともにこの作動を実施するために、適切な電気力学的装備が含められる。
【０１５５】
機器は、共有米国特許第４，９５４，０８７号及び米国特許第５，０９６，６６９号に記載されている種類の電気的接続装置も有する。これは、収容部１００中のセンサー１２８への電気的接続を与えるために使用される。制御された温度、例えば３７℃で、検出工程を実施することが望ましい場合には、コネクターは加熱要素及びサーミスタ要素も取り込み、これらは、センサーに対して基材を提供するシリコンチップの裏側に接触する。これらの要素は、増幅チャンバーについて記載したものと同様の種類である。機器は、センサーの電位を調節し、及び電流を測定するために電流測定回路を有する。機器は、核酸測定を行い及び機器上のディスプレイスクリーン上に結果を表示するために、使い捨て装置上の機器によって行われる全分析系列を制御するための内蔵されたアルゴリズムも有する。電気的活性種が捕捉された標的に比例して生成又は消費される場合には、電位測定又は伝導度測定を用いてより適切に検出されるが、本分野において周知の別の回路も、機器に取り込まれる。
【０１５６】
別の実施形態において、使い捨て装置は、図１９及び２０に示されている２つの分離した部分から構成される。図１９は、分離した抽出装置４７０及び組み合わされた増幅及び検出装置４７１を示している。組み合わせた形態の要素は、抽出された材料を一方から他方へと移動させることに関連する装備を除き、図６中の一体化された装置に対して示されたものと同じ装備を有する。要素４７０は、入口ポート４１３、伝導路４１１、洗浄流体４１７及び廃棄チャンバー４１８、分離領域４２１、伝導路の末端部分６０１及び入口ポート５０２と合体する出口ポート５０２を含む。要素４７０は、４７１中の１つ又はそれ以上の開口部５００と合致する合体機構５２０及び５２１も有する。要素４７１は、増幅チャンバー４１０、伝導路４０９、チャンバー４０８、４０９及びセンサー４１９、４２０、出口伝導路４０５及び密封機構４０６を有する。図２０は図１９と類似しているが、組み合わされた抽出及び増幅コンポーネント４７２及び分離された検出コンポーネント４７３を含むことが異なる。適切には、合体機構が２つの間に配置される。
【０１５７】
図１８は、抽出、増幅及び検出を実行する装置中にフィルター領域４２１が組み込まれた追加の実施形態を示している。他の要素は、図１９のとおりである。図１７（ａ）は、反射率法によって調べられる光学的センサーが装置中に一体化された光学的検出に基づく使い捨てカートリッジを示している。要素４０１によって光が生成され、センサー４０３と相互作用し、検出装置４００によって捕捉される。図１７（ｂ）は、検知領域がキュベット機構４０４である光学的使い捨てカートリッジを示しており、機器中に一体化された光源４０２と検出装置４００を用いた検出を可能とする。
【０１５８】
試料が口腔綿棒標本である場合には、抽出構成要素（磁石又はフィルターの何れかをベースとしたもの）は不要であり、試料は、増幅チャンバー中に直接挿入し得ることが見出される。図２８（ａ）及び図２８（ｂ）は、ＰＣＲチャンバーに口腔試料を直接付与するための口腔試料装置の２つの図（上及び下）を示している。この抽出及び増幅装置は、上記合体機構によって（図示せず）、検出カートリッジに取り付ける。
【０１５９】
収容部１００の一般的な寸法は、長さ約６ｃｍ、幅３ｃｍ及び高さ０．３ｃｍである。介在する両面接着テープ１４５によって一緒に固定される装置基部１４３と装置カバー１４４中には、好ましくは、伝導路及びその他の機構が設けられる、図６参照。基部及びカバーがプラスチック中に射出成型されている場合には、典型的には、ＡＢＳ又はポリカーボナート、伝導路及びシリコンチップを収容するための陥凹部、流体含有小袋などが成型された装備である。本実施形態において、粘着テープは、液体を所望の伝導路及びチャンバーに限定するための密封ガスケットとして作用する。粘着性テープガスケットの使用とともに、成型されたカバー及び基部要素の使用についての詳しい論述が、共有米国特許第５，０９６，６６９号及び係属中の米国特許公開２００３０１７０８８１号に見出され、これらは参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６０】
検出の詳細な説明
使い捨てカートリッジにおける検出の好ましい方法は電気化学であるが、蛍光、発光、比色、温度測定、光ファイバー、光導波路、表面音波、エバネセント波、プラスモン共鳴などのその他の検知方法を使用することが可能である。
【０１６１】
好ましいセンサー１２８は、カウンター参照電極３０１によって作動される電流測定電極３００を含み、図６に示されている。電流測定電極３００は、シリコンチップ３０２上に微小加工された１００μｍの直径の金層を含む。本分野で周知であるように、表面上に二酸化ケイ素の絶縁層を作製するために製造の第一工程では、シリコンチップが処理される。電極は、伝導線３０３によって、機器の電気的コネクターと接触するコネクターパッド３０４に接続される。伝導線は、典型的には、ポリイミド３０５の絶縁層で被覆される。増幅された標的に対して相補的であり、増幅された標的を捕捉することができるリガンド３０８を有する接着されたポリマー粒子３０７は、電極３００の上に直接、又はチップ上の隣接する位置３０６に位置する。カウンター参照電極は、同じシリコンチップ上に微小加工してもよく、又は第二の伝導路１２５中に隣接して配置してもよい。カウンター参照電極は、接触線３０９により、機器コネクターと接触する接触パッド３１０に付着された２００μｍの直径の銀−塩化銀層を含む。同じく、線３０９は、好ましくは、ポリイミド３の絶縁層で被覆される。電流測定センサーの微小加工の詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，２００，０５１号に見出される。
【０１６２】
２つの伝導性バー３１１及び３１２を含む伝導性センサーは、チップ３０２又は隣接するチップ３５０上に存在し、それぞれ、線３１５及び３１６により、パッド３１３及び３１４を接触させるために接続されている。図６を参照。液体又は空気がセンサーと接触しているかどうかを識別し、これにより、センサー３００に対する、第二の伝導路中での溶液の位置を決定するために、伝導性センサーは前記機器によって使用され得る。この溶液は、増幅された標的又は検出試薬を含有する溶液であり得る。場合により、伝導性センサーは、流体の位置を決定するために、抽出チャンバーと増幅チャンバーの両方に取り込まれ、又は隣接し得る。伝導性センサーの微小加工及び使用の詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれる共有米国特許第５，４４７，４４０号及び米国特許第６，７５０，０５３号に見出される。
【０１６３】
使い捨て装置１００の別の実施形態において、シリコンチップ３０２が透明なガラス窓に置き換えられ、装置の検知領域はキュベットを形成する。図１７。増幅された標的捕捉試薬はガラス上に固定され、本事例では、検出試薬は、前記部分（例えば、アルカリホスファターゼ）は、光学的に検出可能な信号（例えば、蛍光）を生成させる分子を含有する。このような分子は、本分野において周知である。他の全ての観点において、使い捨て装置の動作は、電気化学的検出モードと同じである。
【０１６４】
使い捨て装置を用いた核酸検査サイクルの詳細な説明
機器２００とともに、使い捨て装置１００を用いたアッセイサイクルの好ましい実施形態は、以下のとおりである。約１０μＬの血液試料が入口ポート１０１に添加され、毛管作用により、抽出チャンバー１０２の中へ引き込まれる。次いで、入口ポート閉鎖要素１１７を使用して、入口ポートを密封する。カオトロピック剤、ドデシル硫酸リチウム及びジチオスレイトール及びキレート剤（エチレンジアミン四酢酸）を含み、チャンバーの壁上に被覆されている試薬１０３は、血液試料中に溶解し、細胞の溶解を引き起こし、細胞内から得られた核酸が開放され、磁気ビーズ１０４上のカルボキシラートコーティング上に吸着される。ビーズを撹拌してチャンバー内での混合を促進し、抽出の速度を加速するために、磁場を使用することができる。抽出プロセスの本工程は、一般的には、約０．３ないし１分未満を要する。磁場が配備される場合には、これは、機器の自動制御下にあり、検査サイクルを制御する内蔵されたアルゴリズムによって決定される。一旦、この工程が完了したら、機器は、抽出チャンバーの側面に磁気粒子を保持する磁場を配備する。洗浄流体チャンバー１２２からの洗浄流体は、次いで、抽出チャンバー中に空気圧で強制的に送り込まれ、洗浄流体廃棄チャンバー１２３中に内容物を流す。洗浄流体廃棄チャンバーは排気口１４６を有すること、及びこの工程の間、機器は入口１１８を増幅チャンバーに密封させ、従って、廃棄流体は伝導路１０６に進入せずに、廃棄チャンバー中に誘導されることに留意されたい。本工程は、約３０秒を要する。好ましい実施形態における洗浄液は脱イオン水であり、抽出チャンバーを通して通過する洗浄流体の容積は２０ないし３０μＬである。図２３に示されているように、増幅チャンバーの１つの壁を形成するシリコンチップは、抽出チャンバーの１つの壁も形成し、従って、抽出過程は制御された温度で行われ得ることにも留意されたい。好ましい実施形態において、血液からの核酸抽出は室温で行われる。
【０１６５】
次の工程では、機器は入口シール１１８を開放し、抽出チャンバーの壁から磁気粒子を放出させ、抽出チャンバー及び増幅チャンバーに通じる伝導路の境界において蝋層を通じて磁気粒子を引き付ける。機器は、抽出チャンバーの温度が蝋を液体形態にするのに十分であり、及び磁気粒子が通過できるように確保する。好ましい実施形態において、蝋はパラフィンであり、制御された温度は４５℃ないし７０℃である。前に論述したように、蝋を通じた粒子の通過は、ＰＣＲ増幅の妨害物質（ヘモグロビンを含み得る。）を最小限に抑える。次いで、粒子は、増幅チャンバー中に引き込まれる。好ましい実施形態において、増幅チャンバーは１０ないし２０μＬの容量を有する。図２３に示されているように、チャンバー６０６は、計８ｍｍの長さ、８ｍｍの幅及び０．２５ｍｍの高さを有する「Ｕ字」形状である。図２３に示されている要素６０９の他の装備は、チャンバー６００及び６０２、ポート６０３、６０４及び６０７、伝導路６０１及び６０８並びに加熱装置６０５である。
【０１６６】
本過程の次の工程は、そのチャンバーから増幅チャンバー中にＰＣＲ増幅試薬を空気圧で排除する機器を含む。ＰＣＲ増幅試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液及び修飾されたプライマーを含む。プライマーは、標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域、付着された検出可能な部分（ビオチンである。）を有するポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含む。好ましい実施形態において、緩衝液は、抗ＫＯＤ抗体と複合体を形成したサーモコッカス種のＫＯＤ熱安定的ポリメラーゼ２２Ｕ／ｍＬ、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ８．４）、３０．８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１１ｍＭのＫＣｌ、１．１ｍＭのＭｇＳＯ４、３３０μＭのｄＮＴＰ並びにタンパク質及び安定化剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｍａｎｕａｌ， Ｃａｔ． Ｎｏ．１２３４４−０４０）からなるが、あるいは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｃａｔ＃ ６００１３５ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ＄ ０６４００３ｄ）に記載されているように、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．８）， ２ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌの無ヌクレアーゼＢＳＡでもあり得る。
【０１６７】
次の工程では、機器は、増幅チャンバー中にビーズ及び試薬を保持するために、装置中の２つの密封要素１１８及び１１９を密封し、９５℃と９９℃の間での温度及び６８℃でのハイブリダイゼーション工程（各温度での持続時間は、それぞれ、２秒及び１２秒）を３０サイクル繰り返す。総増幅時間は、約１２分である。一旦、この工程が完了したら、次いで、増幅チャンバーから、装置の検出領域に通じる伝導路中に増幅された標的を移す。一実施形態において、ＰＣＲ反応の終了時に、ＰＣＲチップの入口及び出口ポートを密封するガスケットは、入口及び出口ポートの両方から離昇される。カートリッジ中に空気袋が沈降されており、入口ポートガスケット中に正の空気圧を作出し、液体を出口ポートガスケットから排出し、チップの最終検出領域方向に液体を移動させる。ここでは、検出領域への液体の移動をモニタリングするために、伝導性バーの組が使用される。
【０１６８】
好ましい実施形態において、貝状プライマーが使用され、従って、検出領域につながる加熱されていない伝導路中では、これらのプライマーはそれ自身に再アニールし、妨害物質としてアッセイから効果的に除去される。別の実施形態において、望まれないプライマーを分離するために電気泳動が使用される場合、図１２及び１３に記載されている要素は、図２４に示されているような使い捨て装置へと組み合わされる。この分離過程は上記されている。電気泳動分離を有する使い捨て装置において、機器は、電気泳動電極７４、７５及び７６（図１３参照）並びに６５２、６５３及び６５４（図２４参照）への電気的な接続を作る。本装置において、本工程の時間は、プライマー及びアンプリコンのサイズに応じて、典型的には、１ないし２分未満である。未使用のプライマーの酵素的除去が使用される別の実施形態において、増幅チャンバーから検出領域へと至る伝導路の壁１５０の一部へ酵素的混合物が適用される。この材料は、アンプリコンを含有する液体上に溶解し、上記の非妨害形態へとプライマーを変換する。壁上の乾燥した試薬混合物は、好ましくは、迅速な溶解を促進するトレハロース又はフィコールを含む支持体マトリックス中の酵素である。酵素的工程に要する時間は、典型的には、約６分であり、酵素の量、温度、除去されているプライマーの種類に依存する。別の実施形態において、アンプリコンの検出領域を除去する、第一の捕捉オリゴヌクレオチドを用いたアンプリコンの後ハイブリダイゼーションに続いて、最終捕捉工程中で関与する全ての未結合の取り込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する洗浄工程を使用することができる。第一の捕捉工程で結合されたアンプリコン及びプライマーは、次いで、熱又はアルカリ条件を用いて未結合にされ、次いで、最終検出領域へと移動され、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは作製されたアンプリコンを完全に捕捉する。
【０１６９】
次の工程において、アンプリコンは検出領域に到達し、検出チャンバー１５１の壁上で試薬の溶解が起こる。好ましい実施形態において、本試薬は、好ましくはビオチンである、アンプリコン上の部分に結合して、アンプリコン及び酵素の複合体を形成するストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである。次いで、この複合体は、センサー上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合することができる。速度論に応じて、アンプリコンは、まず、捕捉オリゴヌクレオチドに結合し、次いで、標識された酵素に結合し得る。この装置において、本工程の時間は、典型的には、約５ないし１５分である。
【０１７０】
最終工程では、検出試薬は、検出試薬チャンバーから検知領域中へと排除され、これにより、未結合の、アンプリコン及び標識された酵素は全て、廃棄チャンバーへと排除される。ハイブリダイゼーション工程の効率を向上させ、これにより、ハイブリダイゼーション時間及び必要とされる洗浄流体の量を減らすために、センサーの領域中に乱流を引き起こすくびれである要素１５２及び１５３を場合により含めてもよい。本装置において、本工程の時間は、典型的には、７０秒未満であり、使用される洗浄流体の量は、約１０ないし５０μＬである。前に述べたとおり、洗浄流体は、検出を可能とする試薬も含有する。流体の後ろの部分がセンサー上に保持されるので、捕捉されたアルカリホスファターゼは、試薬ｐ−アミノフェノールホスファートをｐ−アミノフェノールへと変換させることが可能であり、ｐ−アミノフェノールは、次いで、電極で酸化されて、測定可能な電流を生じる。この装置において、本工程の時間は、典型的には、１分未満である。センサーに対する後方末端の位置決めは、上述のように伝導性センサーを形成する電極１５５及び１５６の対を用いて達成し得る。
【０１７１】
測定された電流は、元の試料中に存在することが疑われる標的核酸の存在又は不存在を決定するために、前記機器によって使用される。これは、定性的結果であってもよく、又は標的が存在する場合には、試料中の標的の量の定量的測定であってもよい。特定の標的因子に対するアルゴリズム、抽出チャンバーに進入する当初試料容量、増幅サイクルの数及び効率並びに捕捉反応の効率性の他、試料中の標的の当初濃度を決定するためのその他のあらゆる必要な因子。このような因子は、基準方法から得られた公知の試料を用いて、独立に決定される。これらの方法は、本分野において周知である。
【０１７２】
関連する実施形態において、第一のセンサーへの、ストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼの何らかの非特異的結合を計上するために、検出領域中に第二のセンサー１５４が提供される。第二のセンサーは第一のセンサーと同じであるが、アンプリコンに結合しない捕捉オリゴヌクレオチドを有する。第二のセンサーにおける一切のシグナルは、アルゴリズムによって、第一のセンサーにおけるシグナルから差し引かれる。
【０１７３】
使い捨て装置中への試料の進入及び機器中への挿入からの、本アッセイの総時間は約１０と２０分の間を要し、一般的に、特異的標的及び増幅サイクルの必要とされる数に依存する。遺伝的検査が完了し、結果が機器によって表示されると、機器内の作動機構は、次いで、装置を開放し、装置はユーザーによって取り外され、廃棄できる。次いで、機器は、新しい使い捨て装置を受容できる状態となる。開示されている装置と機器の組み合わせの著しい利点は、一旦、試料が装置に入ると、全ての他の工程が機器によって制御されるため、検査サイクルにおいて起こり得る人為的エラーがなくなることである。これは、分析的研究室の測定に特に習熟していない者によって、信頼性高く、システムを使用できるということを意味する。例えば、医師は、ベッドサイドで、又は患者が職場を訪問している間にシステムを使用し得る。システムは、離れた場所、例えば、環境のモニタリング及び有害性評価においても使用し得る。この設計のさらなる利点は、それが、より安全な廃棄のために装置内に試料残留物及び増幅された材料を保持することである。
【０１７４】
収容部１００の別の実施形態において、抽出チャンバー１０２は、キレート剤及びカオトロピック剤を含む抽出試薬が含浸された、フィルター材料１５７及び４２１を含有する。抽出チャンバーの１つの壁は、温度を調節するためのサーミスタを有する加熱要素からも構成される。フィルター材料は、好ましくは、３ＭＭ Ｗｈａｔｍａｎペーパーから構成され、核酸を優先的に結合するカルボキシル化された表面を有する。試料、例えば血液が、抽出チャンバーに進入すると、試料は抽出試薬を溶解し、細胞材料から得られた核酸はフィルターに結合する。抽出プロセスの本工程は、約０．５ないし２分を要する。洗浄流体チャンバー１２２由来の洗浄流体の塊は、次いで、抽出チャンバーを通じて押し出され、洗浄流体廃棄チャンバー１２３中に排出され、抽出された核酸をフィルター上に吸着された状態にしつつ、溶解された細胞の細片を試料から運び去る。完全な洗浄を確保するために、洗浄流体の複数の塊を使用し得る。次いで、洗浄流体のさらなる塊がチャンバー中に押し出され、機器は加熱要素を活性化し、サーミスタにより、流体の塊の温度が９０℃になるように調節する。これは、フィルター上に吸収された核酸を、フィルターから脱離させ、流体中に溶解させる。次いで、核酸材料を含有する流体は、空気圧で、増幅チャンバーに移される。本実施形態において、洗浄流体は、好ましくは、脱イオン水である。
【０１７５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１
＜２１１＞長さ：３１
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３１
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１
【０１７６】
【化５】
【０１７７】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号２
＜２１１＞長さ：２０
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２０
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：２
【０１７８】
【化６】
【０１７９】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号３
＜２１１＞長さ：２２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：３
【０１８０】
【化７】
【０１８１】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号４
＜２１１＞長さ：２２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−２２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：４
【０１８２】
【化８】
【０１８３】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号５
＜２１１＞長さ：５９
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−５９
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：５
【０１８４】
【化９】
【０１８５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号６
＜２１１＞長さ：７５
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−７５
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：６
【０１８６】
【化１０】
【０１８７】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号７
＜２１１＞長さ：７９
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
＜２２０＞特徴：
＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−７９
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：７
【０１８８】
【化１１】
【０１８９】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号８
＜２１１＞長さ：３８
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
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＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿特徴
＜２２２＞位置：１−３８
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：８
【０１９０】
【化１２】
【０１９１】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号９
＜２１１＞長さ：３３
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
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＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３３
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：９
【０１９２】
【化１３】
【０１９３】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１０
＜２１１＞長さ：３５
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
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＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３５
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１０
【０１９４】
【化１４】
【０１９５】
＜２００＞配列の特徴：
＜２１０＞配列番号１１
＜２１１＞長さ：３２
＜２１２＞種類：ＤＮＡ
＜２１３＞生物：人工
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＜２２１＞名称／キー：Ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞位置：１−３２
＜２２３＞他の情報：配列は合成される
＜４００＞配列：１１
【０１９６】
【化１５】
【０１９７】
上記の典型的な実施形態は、あらゆる観点において例示を意図したものであり、本発明を限定することを意図したものではない。従って、本発明は、当業者により、本明細書の記述から誘導され得る多くの変更及び改変を実施することができる。このような変更及び改変は全て、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲及び精神に属するものであると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、入口ポートに作動可能に接続され、前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する第一のチャンバーと、
抽出された核酸の、増幅チャンバーへの通過を可能とする第一の伝導路とを含み、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路に作動可能に連結され、
前記収容部は、前記増幅された標的を検知領域へ移動させて、前記増幅された標的と前記捕捉オリゴヌクレオチドとの結合を可能とするための手段を含有し、前記第二の伝導路は、検知領域から捕捉されていない増幅された標的を実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された前記検出可能な標識の検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項２】
標識部分が、フルオロセイン、ジニトロフェノール、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン及びエストラジオールからなる群から選択される、請求項１の装置。
【請求項３】
検知領域が光学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項４】
検知領域が一体化された光学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項５】
検知領域が一体化された電気化学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項６】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項１の装置。
【請求項７】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項８】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項９】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項１０】
前記流体が洗浄流体である、請求項１の装置。
【請求項１１】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項１の装置。
【請求項１２】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された第一のチャンバーと、を含み、
前記第一のチャンバーはまた、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、ここにおいて、抽出された標的核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場によって、蝋層を通過して第一の伝導路中に通じることができ、
第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの、増幅チャンバー中への通過を可能し、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路へ作動可能に連結されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の伝導路は、捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除することができる流体を含有し、及び検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項１３】
検出可能な標識が、フルオロセイン、ジニトロフェノール、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン及びエストラジオールからなる群から選択される、請求項１２の装置。
【請求項１４】
検知領域が光学的検出装置によって調査される、請求項１２の装置。
【請求項１５】
検知領域が一体化された光学的検出装置によって調査される、請求項１２の装置。
【請求項１６】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１７】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１８】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１９】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項２０】
前記流体が洗浄流体である、請求項１２の装置。
【請求項２１】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項１２の装置。
【請求項２２】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する入口ポートへ作動可能に接続された第一のチャンバーと、を含み、
前記第一のチャンバーはまた、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、ここにおいて、抽出された核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場によって、蝋層を通過して第一の伝導路中に通じることができ、
第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの、増幅チャンバー中への通過を可能とし、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域及び前記検出可能な標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及び電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ作動可能に連結されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へ移動させて、増幅された標的の捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を可能とするための手段を含有し、第二の伝導路は、検知領域から全ての捕捉されていない増幅された標的及び検出可能な標識へ結合されていないシグナル発生試薬を実質的に排除する検出試薬を含有する保持チャンバーへ作動可能に付着されており、
前記検出試薬は、検出可能な標識へ結合され及びセンサーにおいてシグナルを発生するシグナル発生試薬と反応することができる、装置。
【請求項２３】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２４】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２５】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２６】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２７】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項２３の装置。
【請求項２８】
磁気ビーズを作動させるための手段と、１つ以上の機械的作動手段と、増幅チャンバーの温度を測定及び調節するための手段と、センサーを作動させ、及びセンサーシグナルをアルゴリズムに適用し、及び試料中の標的核酸の存在に関連する結果を表示するための手段とを含むリーダー中に挿入させるために適合された、請求項２２に記載の一体化された使い捨て装置。
【請求項２９】
洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーをさらに含み、両者が第一の伝導路へ作動可能に取り付けられており、及び洗浄流体が第一の伝導路中に保持されたビーズ上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてビーズの洗浄を実施する、請求項２２の装置。
【請求項３０】
洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーをさらに含み、両者が第一のチャンバーへ作動可能に取り付けられており、洗浄流体が、洗浄流体保持チャンバーから、第一のチャンバー中に保持されたビーズの上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてビーズの洗浄を実施する、請求項２２の装置。
【請求項３１】
増幅チャンバーが、入口に第一の反転可能な密封手段を含む、請求項２２の装置。
【請求項３２】
増幅チャンバーが、出口に第二の反転可能な密封手段を含む、請求項２２の装置。
【請求項３３】
第二の廃棄チャンバーが、センサーを越えて、第二の伝導路に取り付けられている、請求項２２の装置。
【請求項３４】
増幅試薬が、ＤＮＡポリメラーゼと、並びに標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、これに付着されたポリメラーゼ遮断領域、ポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び検出可能な標識を含有する修飾されたプライマーとを含む、請求項２２の装置。
【請求項３５】
第二の伝導路が、プライマーを含有する未使用の増幅試薬を実質的に除去することができるエキソヌクレアーゼを含有する、請求項２２の装置。
【請求項３６】
第二の伝導路が、自己アニーリングプライマーを含有する増幅試薬を、開環形態から自己アニールされた形態へと実質的に変換するのに十分な温度を有する、請求項２２の装置。
【請求項３７】
第二の伝導路が、増幅試薬と特異的にハイブリダイズして、検知領域へ入る前に、未使用のプライマーを増幅された標的から実質的に除去することができる、増幅チャンバーの出口に対して近位の固定されたオリゴヌクレオチドを含有する、請求項２２の装置。
【請求項３８】
第二の伝導路が、増幅された標的を電気泳動することができ及び検知領域へ入る前に、未使用の増幅試薬を増幅された標的から実質的に除去することができる、増幅チャンバーの出口に対して近位の電気泳動要素を含有する、請求項２２の装置。
【請求項３９】
センサーが電気化学的センサーである、請求項２２の装置。
【請求項４０】
センサーが電流測定である、請求項２２の装置。
【請求項４１】
検出可能な標識がビオチンである、請求項２２の装置。
【請求項４２】
シグナル発生試薬がストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである、請求項２２の装置。
【請求項４３】
検出試薬がｐ−アミノフェノールホスファートであり、及びセンサーにおけるシグナルがｐ−アミノフェノールの形成に関連する、請求項２２の装置。
【請求項４４】
抽出試薬がキレート剤及びカオトロピック剤を含む、請求項２２の装置。
【請求項４５】
磁気ビーズが２から５μｍの範囲の直径を有し、及び表面上にカルボン酸基を有する親水性グリシジルエーテル層を有する架橋されたポリスチレンで被覆されている、請求項２２の装置。
【請求項４６】
蝋が、ヘネイコサン、トリコサヘネイコサン、ドコサン及びトリコサンからなる群から選択される、請求項２２の装置。
【請求項４７】
増幅チャンバーが、プラスチックで形成された１つ以上の壁及び少なくとも１つのシリコンで形成された壁を含む、請求項２２の装置。
【請求項４８】
抽出チャンバーが、プラスチックで形成された１つ以上の壁及び少なくとも１つのシリコンで形成された壁を含む、請求項２２の装置。
【請求項４９】
増幅試薬が、標的の増幅用の少なくとも１つのプライマー及び捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドに付着されたＰＥＧ遮断領域を取り込む少なくとも１つのプライマーを含有する、請求項２２の装置。
【請求項５０】
増幅試薬が、ローリングサークル増幅、ヘリカーゼ増幅、ポリメラーゼ連鎖反応増幅又は鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のために選択される試薬を含有する、請求項２２の装置。
【請求項５１】
試料中の標的核酸の存在又は不存在を決定することができる、請求項２２の装置。
【請求項５２】
試料中の標的核酸の量を定量することができる、請求項２２の装置。
【請求項５３】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
抽出チャンバー中に位置するフィルター材料上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された抽出チャンバーとを含み、前記抽出チャンバーは、核酸の抽出を促進するための抽出試薬も含有し、
収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーも含み、両者は前記抽出チャンバーへ作動可能に接続されており、及び洗浄流体がフィルター材料上を廃棄チャンバーへと通過するようにし、これによりフィルターを洗浄し、
前記抽出チャンバーは、フィルターからの標的核酸の脱離に適した条件を実施するために抽出チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段も有し、
抽出チャンバーは、増幅チャンバーへ作動可能に接続された第一の伝導路へ作動可能に接続されており、
前記収容部は、検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬を含有し、
前記増幅チャンバーは、標的核酸の増幅に適した条件を実施するために増幅チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段も有し、
前記増幅チャンバーは、検知領域及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチド、前記検出可能な標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬並びに電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ作動可能に付着されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、捕捉オリゴヌクレオチドへの増幅された標的の結合及び前記シグナル発生試薬の前記検出可能な標識への結合を可能とする手段を含有し、
第二の伝導路は、捕捉されていない全ての増幅された標的及び検出可能な標識へ結合されていないシグナル発生試薬を検知領域から実質的に排除することができる検出試薬を含有する保持チャンバーへ作動可能に付着され、
前記検出試薬は、検出可能な標識へ結合されて、センサーにおいてシグナルを発生する前記シグナル発生試薬と反応することができる、装置。
【請求項５４】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５５】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５６】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５７】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５８】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項５３の装置。
【請求項５９】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
抽出チャンバー中に位置するフィルター上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された抽出チャンバーと、を含み、
収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーも含み、両者は前記抽出チャンバーへ作動可能に取り付けられており、及び洗浄流体がフィルター上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてフィルターの洗浄を実施し、
抽出チャンバーは、フィルターからの標的核酸の脱離に適した条件を実施するために温度を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
抽出チャンバーは、増幅チャンバーへ作動可能に取り付けられており、抽出チャンバーから増幅チャンバーへと標的核酸を移動させることを可能にする第一の伝導路へ作動可能に取り付けられており、
前記収容部は、検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、標的核酸の増幅に適した条件を実施するために温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域を含有する第二の伝導路へ作動可能に取り付けられており、
収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、捕捉オリゴヌクレオチドへの増幅された標的の結合を可能とするための手段を含有し、
第二の伝導路は、流体を第二の伝導路中に送達して捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除し、検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする第二の洗浄チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項６０】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６１】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６２】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６３】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６４】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項５９の装置。
【請求項６５】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸を磁気ビーズ上に抽出するための試薬に添加すること、
実質的に連続した蝋層を通じてビーズを引き付けるために前記ビーズに磁場を付与すること、
検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬をビーズへ添加すること、
ビーズと増幅試薬の前記混合物を、前記増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
検出可能な標識及び電気化学センサーの領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドへ結合することができるシグナル発生試薬へ増幅された標的を添加して、増幅された標的と捕捉オリゴヌクレオチドの及び前記シグナル発生試薬と検出可能な標識の抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的及びシグナル発生試薬を抱合体から実質的に排除すること、
検出可能な標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができ、及びセンサーにおいて標的核酸の存在又は不存在に関連するシグナルを発生する検出試薬を抱合体に添加すること、を含む、方法。
【請求項６６】
前記加熱が約１ないし２秒間約８８℃ないし９９℃、及び次いで、約４ないし６０秒間約６０℃ないし７２℃、２０ないし４０サイクル反復される、請求項６５の方法。
【請求項６７】
一体化された使捨て装置中で実施され、増幅チャンバーが約１ないし２秒の間、約９７℃、及び次いで、約１２秒間、約６８℃で加熱され、及び約３０サイクル反復される、請求項６５の方法。
【請求項６８】
一体化された使い捨て装置中で実施され、増幅試薬が、ローリングサークル増幅、ヘリカーゼ増幅、ポリメラーゼ連鎖反応増幅又は鎖置換増幅のために選択される試薬を含む、請求項６５の方法。
【請求項６９】
磁気ビーズを有する一体化された使い捨て装置中で実施され、増幅試薬を接触させる前に前記磁気ビーズが洗浄される、請求項６５の方法。
【請求項７０】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を磁気ビーズ上に抽出するための試薬に添加すること、
前記ビーズに磁場を付与して、実質的に連続した蝋層を通じてビーズを引き付けること、
検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬をビーズへ添加すること、
ビーズと増幅試薬の前記混合物を、前記増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を検知領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに添加して、前記増幅された標的及び前記捕捉オリゴヌクレオチドの抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的を実質的に排除させること、
検知領域中の前記標識からシグナルを光学的に検出すること、及びシグナルを試料中の標的核酸の存在又は不存在に関連付けること、を含む方法。
【請求項７１】
試料中の標的核酸の量を測定するためにシグナルが使用される、請求項７０の方法。
【請求項７２】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を抽出するための試薬へ添加しこれにより前記標的核酸をフィルター上に抽出すること、
フィルターを洗浄して、試料残留物を実質的に除去すること、水性流体の存在下でフィルターを加熱して、標的核酸をフィルターから水性流体中に溶出すること、及び前記水性流体を検出可能な標識を増幅された標的中に取り込ませることができる増幅試薬へ添加すること、
前記混合物を増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を検知領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに添加して、前記増幅された標的と前記捕捉オリゴヌクレオチドの抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的を実質的に排除すること、
検知領域中の前記標識からシグナルを光学的に検出すること、及びシグナルを試料中の標的核酸の存在又は不存在に関連付けること、を含む方法。
【請求項７３】
試料中の標的核酸の量を測定するためにシグナルが使用される、請求項７２の方法。
【請求項７４】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を抽出するための試薬へ添加しこれにより前記標的核酸をフィルター上に抽出すること、
フィルターを洗浄して、試料残留物を実質的に除去すること、水性流体の存在下でフィルターを加熱して、標的核酸をフィルターから水性流体中に溶出すること、及び前記水性流体を検出可能な標識を増幅された標的中に取り込ませることができる増幅試薬へ添加すること、
前記混合物を増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を電気化学的センサーの領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及びシグナル発生試薬に添加して、前記増幅された標的及び前記捕捉オリゴヌクレオチドならびに前記シグナル発生試薬及び前記標識の抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的及びシグナル発生試薬を前記抱合体から実質的に排除すること、
標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができる検出試薬を前記抱合体へ添加し、及び前記電気化学的センサーにおいて検出可能な標的核酸の存在又は不存在に関連するシグナルを発生させること、を含む前記方法。
【請求項７５】
核酸増幅及び検出を実施するための使い捨て装置であり、
収容部を含み、
前記収容部は、標的核酸を含有することが疑われる抽出された試料を、増幅チャンバーに取り付けられた第一の伝導路中に受容するための入口ポートを含み
前記増幅チャンバーはまた増幅試薬保持チャンバーに取り付けられており、前記試薬は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込ませることが可能であり、
前記収容部は、試料及び増幅試薬を増幅チャンバー中に移動させることができる手段を有し、前記増幅チャンバーはまた、温度を調節して標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域、前記検出可能な標識を結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及び電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ取り付けられており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、増幅された標的の捕捉オリゴヌクレオチドへの及び前記シグナル発生試薬の前記検出可能な標識への結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の伝導路は、検出試薬を第二の伝導路中に送達して、検知領域から未捕捉の増幅された標的及び未結合のシグナル発生試薬を実質的に排除することが可能な検出試薬保持チャンバーに取り付けられており、
ここで検出試薬は、標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができ及びセンサーにおいてシグナルを発生する、装置。
【請求項７６】
前記入口ポートが、核酸抽出装置と合体（ｍａｔｔｉｎｇ ｗｉｔｈ）して抽出された標的核酸を前記使い捨て装置中に移動させることができる、請求項７５の使い捨て装置。
【請求項７７】
前記入口ポートが、核酸抽出装置と合体して抽出された標的核酸を前記使い捨て装置中に移動させることができ、
前記抽出装置が、標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するためのチャンバーを含み、前記チャンバーは、前記標的核酸を前記チャンバー中に位置した磁気ビーズ上に抽出するためのキレート剤及びカオトロピック剤を含む試薬を含有し、
前記チャンバーが、前記チャンバー及び伝導路の領域中に連続した蝋層を含有し、
前記標的核酸を伴う磁気ビーズが、付与される磁場を用いて、前記蝋層を通じて前記伝導路中に通過することが可能であり、前記第一の伝導路が前記ビーズを前記入口ポートへ移動させることが可能である、請求項７５の使い捨て装置。
【請求項７８】
前記磁気ビーズが前記伝導路中に保持されて、洗浄流体が洗浄流体保持チャンバーから前記ビーズ上を経て廃棄チャンバーへと通過して、前記ビーズの洗浄を実行することができる、請求項７７の使い捨て装置。
【請求項７９】
前記入口ポートが核酸抽出装置と合体して、抽出された標的核酸を使い捨て装置中に移動させることが可能であり、前記抽出装置が、試料から開放された核酸を吸収することができ、及び約７５℃を上回る温度で水溶液に曝露されたときに前記核酸を脱離させて前記移動を許容することができるフィルターを含有する収容部を含む、請求項７７に記載の使い捨て装置。
【請求項８０】
核酸増幅及び検出を実施するための使い捨て装置であり、
標的核酸を含有することが疑われる抽出された試料を、増幅チャンバーに取り付けられた第一の伝導路中に受容するための入口ポートを含む収容部を含み、前記増幅チャンバーは増幅試薬保持チャンバーに取り付けられており、前記増幅試薬は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込ませることが可能であり、
前記収容部は、前記試料及び前記増幅試薬を前記増幅チャンバー中に移動させることができる手段を有し、
前記増幅チャンバーは、前記増幅チャンバーの温度を調節して、前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域を含有する第二の伝導路に取り付けられており、
前記収容部は、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とする手段を含有し、
前記第二の伝導路が、洗浄流体保持チャンバー（前記洗浄流体を前記第二の伝導路中に送達して捕捉されていない増幅された標的を前記検知領域から実質的に排除し、前記検知領域中に保持された前記部分の光学的検知を可能とする）に取り付けられている、装置。
【請求項８１】
核酸抽出及び増幅を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートを含む収容部と、
前記入口ポートに接続された第一のチャンバー（前記第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する。）と、を含み、
前記第一のチャンバーは、前記チャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、
標的核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場を用いて、前記蝋層を通じて前記第一の伝導路中に通過することができ、
前記第一の伝導路は増幅チャンバーへ取り付けられており、前記収容部は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込むことができる増幅試薬を含有し、前記ビーズ及び前記増幅試薬は前記増幅チャンバー中に移動することができ、前記増幅チャンバーはまた、前記増幅チャンバーの温度を調節して、前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーが、前記一体化された装置から増幅された標的の脱出を可能とする第二の伝導路に取り付けられている、装置。
【請求項８２】
請求項８１に記載の一体化された装置であり、前記増幅された標的が、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド、前記標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及びセンサーを含む検知領域を含む第二の収容部中に導入され、
前記収容部が、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合及び前記標識への前記シグナル発生試薬の結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の収容部が、検出試薬を前記検知領域中に送達して、前記検知領域から未捕捉の増幅された標的及び前記標識に結合されていないシグナル発生試薬を実質的に排除することが可能な検出試薬保持チャンバーを有し、
前記検出試薬は、前記標識へ結合された前記シグナル発生試薬と反応して、前記センサーにおいて検出可能なシグナルを発生することができる、装置。
【請求項８３】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートを含む収容部と、
前記入口ポートへ接続された抽出チャンバー（前記抽出チャンバー中に位置するフィルター上に前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する。）とを含み、前記チャンバーはまた、核酸の抽出を促進するための抽出試薬を含有し、
前記収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーを含み、両チャンバーは前記抽出チャンバーへ取り付けられて、前記洗浄流体が洗浄流体保持チャンバーからフィルター上を前記廃棄チャンバーへと通過して前記フィルターを洗浄できるようにし、
前記抽出チャンバーは、前記フィルターからの前記標的核酸の脱離に適した条件を実施するために前記抽出チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記抽出チャンバーは、第一の伝導路へ取り付けられており、前記第一の伝導路は増幅チャンバーへ取り付けられており、前記伝導路は前記抽出チャンバーから前記増幅チャンバーへの前記標的核酸の移動を可能とし、
前記収容部は増幅試薬を含有し、前記増幅試薬は増幅された標的中に標識を取り込むことができ、
前記増幅チャンバーは、前記増幅チャンバーの温度を調節し、及び前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーが、前記一体化された装置から増幅された標的の脱出を可能とする第二の伝導路に取り付けられている、装置。
【請求項８４】
核酸分離方法であり、
核酸を含有する細胞を有する試料を、溶解（ｌｙｔｉｃ）試薬及び前記細胞から放出される核酸を結合することができる１つ以上のビーズを含む水性混合物に曝露すること、
前記水性混合物が実質的に非混和性の液体の層と接触すること、
前記非混和性の液体層を通じて前記ビーズを通過させて、前記水性混合物から前記核酸を分離することを含む、方法。
【請求項８５】
前記ビーズが磁気であり、及び負荷される磁場によって前記非混和性液体層を通過する、請求項８４の方法。
【請求項８６】
前記非混和性液体層が有機液体である、請求項８４の方法。
【請求項８７】
前記非混和性液体層が蝋である、請求項８４の方法。
【請求項８８】
前記非混和性液体が、前記１つ以上のビーズの通過を可能とするために、周囲温度から高温度へと加熱される、請求項８４の方法。
【請求項８９】
中間層を通じて第一の位置から第二の位置へと核酸を移動させる方法であり、
第一の位置において核酸に１つ以上のビーズとの会合を生じさせて、液体中に核酸−ビーズ複合体を形成させること、
前記液体と実質的に非混和性である中間層によって第一の位置と離隔された第二の位置へ、前記核酸−ビーズ複合体を通過させること、
を含む、方法。
【請求項９０】
核酸及び核酸増幅過程の阻害剤が前記中間層中に実質的に可溶性である、請求項８９の方法。
【請求項９１】
核酸分離用の装置であり、
水性溶解試薬と、及び核酸を結合して複合体を形成することができる１つ以上の磁気ビーズとを含む第一の層を有するチャンバーと、
前記第一の層と実質的に非混和性であり、及び第二の層が液体形態である場合に、前記ビーズがこれを通じて通過し得る第二の層と、を含み、核酸及び核酸増幅過程の阻害剤が前記第二の層中で実質的に不溶性である、装置。
【請求項９２】
核酸分離用の装置を使用する方法であり、
（ａ）無傷の生物細胞を含有する試料が、前記第二の層を通じて前記第一の層中にピペットで移動されること、
（ｂ）前記細胞の溶解及び核酸−ビーズ複合体の形成を可能とするのに十分な時間、前記装置をインキュベートすること、
（ｃ）前記装置に近接して前記第一の層から及び前記第二の層を通じて前記１つ以上のビーズを移動するのに十分な磁場を生成すること、を含む方法。
【請求項９３】
前記第二の層が蝋であり、および蝋を融解させ及び前記第一の層を覆う層を形成させるのに十分な温度まで前記装置が加熱される、請求項９２の方法。
【請求項９４】
前記ビーズが核酸増幅用の手段に移される、請求項９２の方法。
【請求項９５】
生物学的試料から核酸を抽出するための装置であり、
第一及び第二の位置を含む収容部と、
前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターと、を含み、前記フィルターの少なくとも一部に、カオトロピック塩、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を含む混合物が含浸されている、装置。
【請求項９６】
血液試料から核酸を抽出するための装置であり、
第一及び第二の位置を含む収容部と、
前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターと、を含み、前記フィルターの少なくとも一部に強塩基が含浸されている、装置。
【請求項９７】
請求項９５の装置を用いて生物学的試料から核酸を抽出するための方法であり、
伝導路中の第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターに生物学的試料を付与すること、
（前記フィルターの少なくとも一部には、カオトロピック塩、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を含む混合物が含浸されている。）
核酸を前記フィルター上に抽出するのに十分な時間、前記フィルター上に前記試料を保持すること、
前記伝導路を通じて洗浄流体を付与すること（前記洗浄流体は、前記フィルター上に前記抽出された核酸を実質的に保持しながら、核酸増幅反応を妨害することができる物質を前記フィルターから実質的に除去する。）、
約７５℃を上回る温度で、前記フィルターに水溶液を付与して、前記フィルターから核酸を溶出すること、を含む方法。
【請求項９８】
請求項の装置を用いて血液試料から核酸を抽出するための方法であり、
伝導路中の前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターに血液試料を付与すること（前記フィルターの少なくとも一部には、強塩基が含浸されている。）、
前記フィルター上に核酸を抽出するのに十分な時間、前記フィルター上に前記試料を保持すること、
前記伝導路を通じて洗浄流体を付与すること（前記洗浄流体は、前記フィルター上に前記抽出された核酸を実質的に保持しながら、核酸増幅反応を妨害することができる物質を前記フィルターから実質的に除去する。）、
約７５℃を上回る温度で、前記フィルターに水溶液を付与して、前記フィルターから核酸を溶出すること、を含む方法。
【請求項９９】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離する装置であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を電気泳動要素に送達するための第一の伝導路と（前記要素は、前記第一の伝導路中に第一の電極を含む。）、
電気泳動分離材料と第二の電極を含有する、前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路と、を含む装置。
【請求項１００】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離する装置であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を電気泳動要素に送達するための第一の伝導路と（前記要素は、前記第一の伝導路中に第一の電極を含む。）、
電気泳動分離材料と、及び前記第一の電極に対して近位に位置する第二の電極と、及び前記第一の電極から遠位に位置する第三の電極とを含有する、前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路と、を含む装置。
【請求項１０１】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離するための方法であり、
プライマーおよび増幅された標的の混合物を第一の伝導路中に導入して、前記第一の伝導路中の第一の電極を含む電気泳動要素と接触させること、
前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路は、電気泳動分離材料と第二の電極を含有しており、
前記第一の電極に負の極性を付与し、及び前記第二の電極に正の極性を付与して、プライマー及び増幅された標的を分離させること、
前記プライマーを分離材料中に実質的に保持しながら、前記増幅された標的が前記第一の伝導路に再度進入するのに十分に極性を逆転させること、
前記電極から極性を除去し、及び前記第一の伝導路から前記増幅された標的を除去することを、含む方法。
【請求項１０２】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離するための方法であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を第一の伝導路中に導入して、前記第一の伝導路中の第一の電極を含む電気泳動要素と接触させること、
前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路は、電気泳動分離材料と、及び前記第一の電極に対して近位に位置する第二の電極と、及び前記第一の電極から遠位に位置する第三の電極とを含有し、
前記第一の電極に負の極性を付与し、及び前記第二の電極に正の極性を付与して、プライマー及び増幅された標的を分離させること、
第一の電極の極性を正に、及び前記第二の電極を負に変化させ、並びに前記プライマーが前記第二の電極を過ぎて移動するのに十分な時間後に前記第三の電極に正の極性を付与すること、
前記プライマーを分離材料中に実質的に保持しながら、前記増幅された標的が前記第一の伝導路に再度進入するのに十分な時間にわたり、新たに極性を付与すること、
前記電極から極性を除去し、及び前記第一の伝導路から前記増幅された標的を除去することを、含む方法。
【請求項１０３】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列を含む修飾された大量のプライマー、前記プライマーに付着されたポリメラーゼ遮断領域、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域並びに検出可能な標識を合わせること、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から過剰の取り込まれていない修飾されたポリマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域に対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、及び
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う前記標識を検出すること、を含む方法。
【請求項１０４】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマー（第一の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域及び前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含み、前記第二の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第二の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域及び前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含む。）を合わせること、
ここにおいて、検出可能な標識が、前記第一及び第二の修飾されたプライマーの少なくとも１つに付着されており、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から前記検出可能な標識を有する、取り込まれていない修飾されたプライマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記第一及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域の少なくとも１つに対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、並びに
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う前記標識を検出すること、を含む方法。
【請求項１０５】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマーを合わせること（第一の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び付着された検出可能な標識を含み、前記第二の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第二の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び付着された検出可能な標識を含む。）、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から取り込まれていない修飾されたポリマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記第一及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域の少なくとも１つに対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、並びに
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う標識を検出すること、を含む方法。
【請求項１】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、入口ポートに作動可能に接続され、前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する第一のチャンバーと、
抽出された核酸の、増幅チャンバーへの通過を可能とする第一の伝導路とを含み、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路に作動可能に連結され、
前記収容部は、前記増幅された標的を検知領域へ移動させて、前記増幅された標的と前記捕捉オリゴヌクレオチドとの結合を可能とするための手段を含有し、前記第二の伝導路は、検知領域から捕捉されていない増幅された標的を実質的に排除することができる流体を含有し、及び前記検知領域中に保持された前記検出可能な標識の検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項２】
標識部分が、フルオロセイン、ジニトロフェノール、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン及びエストラジオールからなる群から選択される、請求項１の装置。
【請求項３】
検知領域が光学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項４】
検知領域が一体化された光学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項５】
検知領域が一体化された電気化学的検出装置によって調査される、請求項１の装置。
【請求項６】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項１の装置。
【請求項７】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項８】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項９】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１の装置。
【請求項１０】
前記流体が洗浄流体である、請求項１の装置。
【請求項１１】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項１の装置。
【請求項１２】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された第一のチャンバーと、を含み、
前記第一のチャンバーはまた、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、ここにおいて、抽出された標的核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場によって、蝋層を通過して第一の伝導路中に通じることができ、
第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの、増幅チャンバー中への通過を可能し、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域を含有する第二の伝導路へ作動可能に連結されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の伝導路は、捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除することができる流体を含有し、及び検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする保持チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項１３】
検出可能な標識が、フルオロセイン、ジニトロフェノール、ビオチン、コレステロール、ジゴキシゲニン及びエストラジオールからなる群から選択される、請求項１２の装置。
【請求項１４】
検知領域が光学的検出装置によって調査される、請求項１２の装置。
【請求項１５】
検知領域が一体化された光学的検出装置によって調査される、請求項１２の装置。
【請求項１６】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１７】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１８】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項１９】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項１２の装置。
【請求項２０】
前記流体が洗浄流体である、請求項１２の装置。
【請求項２１】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項１２の装置。
【請求項２２】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する入口ポートへ作動可能に接続された第一のチャンバーと、を含み、
前記第一のチャンバーはまた、第一のチャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、ここにおいて、抽出された核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場によって、蝋層を通過して第一の伝導路中に通じることができ、
第一の伝導路は、標的核酸及びビーズの、増幅チャンバー中への通過を可能とし、前記収容部は、増幅された核酸標的中に検出可能な標識を取り込ませることができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、増幅条件を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する検知領域及び前記検出可能な標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及び電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ作動可能に連結されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へ移動させて、増幅された標的の捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を可能とするための手段を含有し、第二の伝導路は、検知領域から全ての捕捉されていない増幅された標的及び検出可能な標識へ結合されていないシグナル発生試薬を実質的に排除する検出試薬を含有する保持チャンバーへ作動可能に付着されており、
前記検出試薬は、検出可能な標識へ結合され及びセンサーにおいてシグナルを発生するシグナル発生試薬と反応することができる、装置。
【請求項２３】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２４】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２５】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２６】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項２２の装置。
【請求項２７】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項２３の装置。
【請求項２８】
磁気ビーズを作動させるための手段と、１つ以上の機械的作動手段と、増幅チャンバーの温度を測定及び調節するための手段と、センサーを作動させ、及びセンサーシグナルをアルゴリズムに適用し、及び試料中の標的核酸の存在に関連する結果を表示するための手段とを含むリーダー中に挿入させるために適合された、請求項２２に記載の一体化された使い捨て装置。
【請求項２９】
洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーをさらに含み、両者が第一の伝導路へ作動可能に取り付けられており、及び洗浄流体が第一の伝導路中に保持されたビーズ上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてビーズの洗浄を実施する、請求項２２の装置。
【請求項３０】
洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーをさらに含み、両者が第一のチャンバーへ作動可能に取り付けられており、洗浄流体が、洗浄流体保持チャンバーから、第一のチャンバー中に保持されたビーズの上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてビーズの洗浄を実施する、請求項２２の装置。
【請求項３１】
増幅チャンバーが、入口に第一の反転可能な密封手段を含む、請求項２２の装置。
【請求項３２】
増幅チャンバーが、出口に第二の反転可能な密封手段を含む、請求項２２の装置。
【請求項３３】
第二の廃棄チャンバーが、センサーを越えて、第二の伝導路に取り付けられている、請求項２２の装置。
【請求項３４】
増幅試薬が、ＤＮＡポリメラーゼと、並びに標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、これに付着されたポリメラーゼ遮断領域、ポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び検出可能な標識を含有する修飾されたプライマーとを含む、請求項２２の装置。
【請求項３５】
第二の伝導路が、プライマーを含有する未使用の増幅試薬を実質的に除去することができるエキソヌクレアーゼを含有する、請求項２２の装置。
【請求項３６】
第二の伝導路が、自己アニーリングプライマーを含有する増幅試薬を、開環形態から自己アニールされた形態へと実質的に変換するのに十分な温度を有する、請求項２２の装置。
【請求項３７】
第二の伝導路が、増幅試薬と特異的にハイブリダイズして、検知領域へ入る前に、未使用のプライマーを増幅された標的から実質的に除去することができる、増幅チャンバーの出口に対して近位の固定されたオリゴヌクレオチドを含有する、請求項２２の装置。
【請求項３８】
第二の伝導路が、増幅された標的を電気泳動することができ及び検知領域へ入る前に、未使用の増幅試薬を増幅された標的から実質的に除去することができる、増幅チャンバーの出口に対して近位の電気泳動要素を含有する、請求項２２の装置。
【請求項３９】
センサーが電気化学的センサーである、請求項２２の装置。
【請求項４０】
センサーが電流測定である、請求項２２の装置。
【請求項４１】
検出可能な標識がビオチンである、請求項２２の装置。
【請求項４２】
シグナル発生試薬がストレプトアビジン標識されたアルカリホスファターゼである、請求項２２の装置。
【請求項４３】
検出試薬がｐ−アミノフェノールホスファートであり、及びセンサーにおけるシグナルがｐ−アミノフェノールの形成に関連する、請求項２２の装置。
【請求項４４】
抽出試薬がキレート剤及びカオトロピック剤を含む、請求項２２の装置。
【請求項４５】
磁気ビーズが２から５μｍの範囲の直径を有し、及び表面上にカルボン酸基を有する親水性グリシジルエーテル層を有する架橋されたポリスチレンで被覆されている、請求項２２の装置。
【請求項４６】
蝋が、ヘネイコサン、トリコサヘネイコサン、ドコサン及びトリコサンからなる群から選択される、請求項２２の装置。
【請求項４７】
増幅チャンバーが、プラスチックで形成された１つ以上の壁及び少なくとも１つのシリコンで形成された壁を含む、請求項２２の装置。
【請求項４８】
抽出チャンバーが、プラスチックで形成された１つ以上の壁及び少なくとも１つのシリコンで形成された壁を含む、請求項２２の装置。
【請求項４９】
増幅試薬が、標的の増幅用の少なくとも１つのプライマー及び捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドに付着されたＰＥＧ遮断領域を取り込む少なくとも１つのプライマーを含有する、請求項２２の装置。
【請求項５０】
増幅試薬が、ローリングサークル増幅、ヘリカーゼ増幅、ポリメラーゼ連鎖反応増幅又は鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のために選択される試薬を含有する、請求項２２の装置。
【請求項５１】
試料中の標的核酸の存在又は不存在を決定することができる、請求項２２の装置。
【請求項５２】
試料中の標的核酸の量を定量することができる、請求項２２の装置。
【請求項５３】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
抽出チャンバー中に位置するフィルター材料上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された抽出チャンバーとを含み、前記抽出チャンバーは、核酸の抽出を促進するための抽出試薬も含有し、
収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーも含み、両者は前記抽出チャンバーへ作動可能に接続されており、及び洗浄流体がフィルター材料上を廃棄チャンバーへと通過するようにし、これによりフィルターを洗浄し、
前記抽出チャンバーは、フィルターからの標的核酸の脱離に適した条件を実施するために抽出チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段も有し、
抽出チャンバーは、増幅チャンバーへ作動可能に接続された第一の伝導路へ作動可能に接続されており、
前記収容部は、検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬を含有し、
前記増幅チャンバーは、標的核酸の増幅に適した条件を実施するために増幅チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段も有し、
前記増幅チャンバーは、検知領域及び固定化された捕捉オリゴヌクレオチド、前記検出可能な標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬並びに電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ作動可能に付着されており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、捕捉オリゴヌクレオチドへの増幅された標的の結合及び前記シグナル発生試薬の前記検出可能な標識への結合を可能とする手段を含有し、
第二の伝導路は、捕捉されていない全ての増幅された標的及び検出可能な標識へ結合されていないシグナル発生試薬を検知領域から実質的に排除することができる検出試薬を含有する保持チャンバーへ作動可能に付着され、
前記検出試薬は、検出可能な標識へ結合されて、センサーにおいてシグナルを発生する前記シグナル発生試薬と反応することができる、装置。
【請求項５４】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５５】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５６】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５７】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５３の装置。
【請求項５８】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項５３の装置。
【請求項５９】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
収容部と、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートと、
抽出チャンバー中に位置するフィルター上に標的核酸を抽出するための試薬を含有する、入口ポートへ作動可能に接続された抽出チャンバーと、を含み、
収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーも含み、両者は前記抽出チャンバーへ作動可能に取り付けられており、及び洗浄流体がフィルター上を廃棄チャンバーへと通過できるようにしてフィルターの洗浄を実施し、
抽出チャンバーは、フィルターからの標的核酸の脱離に適した条件を実施するために温度を調節するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
抽出チャンバーは、増幅チャンバーへ作動可能に取り付けられており、抽出チャンバーから増幅チャンバーへと標的核酸を移動させることを可能にする第一の伝導路へ作動可能に取り付けられており、
前記収容部は、検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬を含有し、
増幅チャンバーは、標的核酸の増幅に適した条件を実施するために温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域を含有する第二の伝導路へ作動可能に取り付けられており、
収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、捕捉オリゴヌクレオチドへの増幅された標的の結合を可能とするための手段を含有し、
第二の伝導路は、流体を第二の伝導路中に送達して捕捉されていない増幅された標的を検知領域から実質的に排除し、検知領域中に保持された検出可能な標識の光学的検知を可能とする第二の洗浄チャンバーへ作動可能に取り付けられている、装置。
【請求項６０】
増幅試薬が前記第一の伝導路中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６１】
増幅試薬が前記増幅チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６２】
増幅試薬が、前記増幅チャンバーへ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６３】
増幅試薬が、前記第一の伝導路へ作動可能に接続された保持チャンバー中に位置する、請求項５９の装置。
【請求項６４】
増幅標的を移動させるための前記手段が空気圧式である、請求項５９の装置。
【請求項６５】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸を磁気ビーズ上に抽出するための試薬に添加すること、
実質的に連続した蝋層を通じてビーズを引き付けるために前記ビーズに磁場を付与すること、
検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬をビーズへ添加すること、
ビーズと増幅試薬の前記混合物を、前記増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
検出可能な標識及び電気化学センサーの領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドへ結合することができるシグナル発生試薬へ増幅された標的を添加して、増幅された標的と捕捉オリゴヌクレオチドの及び前記シグナル発生試薬と検出可能な標識の抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的及びシグナル発生試薬を抱合体から実質的に排除すること、
検出可能な標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができ、及びセンサーにおいて標的核酸の存在又は不存在に関連するシグナルを発生する検出試薬を抱合体に添加すること、を含む、方法。
【請求項６６】
前記加熱が約１ないし２秒間約８８℃ないし９９℃、及び次いで、約４ないし６０秒間約６０℃ないし７２℃、２０ないし４０サイクル反復される、請求項６５の方法。
【請求項６７】
一体化された使捨て装置中で実施され、増幅チャンバーが約１ないし２秒の間、約９７℃、及び次いで、約１２秒間、約６８℃で加熱され、及び約３０サイクル反復される、請求項６５の方法。
【請求項６８】
一体化された使い捨て装置中で実施され、増幅試薬が、ローリングサークル増幅、ヘリカーゼ増幅、ポリメラーゼ連鎖反応増幅又は鎖置換増幅のために選択される試薬を含む、請求項６５の方法。
【請求項６９】
磁気ビーズを有する一体化された使い捨て装置中で実施され、増幅試薬を接触させる前に前記磁気ビーズが洗浄される、請求項６５の方法。
【請求項７０】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を磁気ビーズ上に抽出するための試薬に添加すること、
前記ビーズに磁場を付与して、実質的に連続した蝋層を通じてビーズを引き付けること、
検出可能な標識を増幅された標的中に取り込むことができる増幅試薬をビーズへ添加すること、
ビーズと増幅試薬の前記混合物を、前記増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を検知領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに添加して、前記増幅された標的及び前記捕捉オリゴヌクレオチドの抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的を実質的に排除させること、
検知領域中の前記標識からシグナルを光学的に検出すること、及びシグナルを試料中の標的核酸の存在又は不存在に関連付けること、を含む方法。
【請求項７１】
試料中の標的核酸の量を測定するためにシグナルが使用される、請求項７０の方法。
【請求項７２】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を抽出するための試薬へ添加しこれにより前記標的核酸をフィルター上に抽出すること、
フィルターを洗浄して、試料残留物を実質的に除去すること、水性流体の存在下でフィルターを加熱して、標的核酸をフィルターから水性流体中に溶出すること、及び前記水性流体を検出可能な標識を増幅された標的中に取り込ませることができる増幅試薬へ添加すること、
前記混合物を増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を検知領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに添加して、前記増幅された標的と前記捕捉オリゴヌクレオチドの抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的を実質的に排除すること、
検知領域中の前記標識からシグナルを光学的に検出すること、及びシグナルを試料中の標的核酸の存在又は不存在に関連付けること、を含む方法。
【請求項７３】
試料中の標的核酸の量を測定するためにシグナルが使用される、請求項７２の方法。
【請求項７４】
核酸分析を実施するための方法であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を前記標的核酸を抽出するための試薬へ添加しこれにより前記標的核酸をフィルター上に抽出すること、
フィルターを洗浄して、試料残留物を実質的に除去すること、水性流体の存在下でフィルターを加熱して、標的核酸をフィルターから水性流体中に溶出すること、及び前記水性流体を検出可能な標識を増幅された標的中に取り込ませることができる増幅試薬へ添加すること、
前記混合物を増幅された標的の形成を促進する温度まで加熱すること、
増幅された標的を電気化学的センサーの領域中の固定化された捕捉オリゴヌクレオチド及びシグナル発生試薬に添加して、前記増幅された標的及び前記捕捉オリゴヌクレオチドならびに前記シグナル発生試薬及び前記標識の抱合体を形成させること、
洗浄流体を付与して、未抱合の増幅された標的及びシグナル発生試薬を前記抱合体から実質的に排除すること、
標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができる検出試薬を前記抱合体へ添加し、及び前記電気化学的センサーにおいて検出可能な標的核酸の存在又は不存在に関連するシグナルを発生させること、を含む前記方法。
【請求項７５】
核酸増幅及び検出を実施するための使い捨て装置であり、
収容部を含み、
前記収容部は、標的核酸を含有することが疑われる抽出された試料を、増幅チャンバーに取り付けられた第一の伝導路中に受容するための入口ポートを含み
前記増幅チャンバーはまた増幅試薬保持チャンバーに取り付けられており、前記試薬は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込ませることが可能であり、
前記収容部は、試料及び増幅試薬を増幅チャンバー中に移動させることができる手段を有し、前記増幅チャンバーはまた、温度を調節して標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域、前記検出可能な標識を結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及び電気化学的センサーを含有する第二の伝導路へ取り付けられており、
前記収容部は、増幅された標的を検知領域へと移動させて、増幅された標的の捕捉オリゴヌクレオチドへの及び前記シグナル発生試薬の前記検出可能な標識への結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の伝導路は、検出試薬を第二の伝導路中に送達して、検知領域から未捕捉の増幅された標的及び未結合のシグナル発生試薬を実質的に排除することが可能な検出試薬保持チャンバーに取り付けられており、
ここで検出試薬は、標識へ結合されたシグナル発生試薬と反応することができ及びセンサーにおいてシグナルを発生する、装置。
【請求項７６】
前記入口ポートが、核酸抽出装置と合体（ｍａｔｔｉｎｇ ｗｉｔｈ）して抽出された標的核酸を前記使い捨て装置中に移動させることができる、請求項７５の使い捨て装置。
【請求項７７】
前記入口ポートが、核酸抽出装置と合体して抽出された標的核酸を前記使い捨て装置中に移動させることができ、
前記抽出装置が、標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するためのチャンバーを含み、前記チャンバーは、前記標的核酸を前記チャンバー中に位置した磁気ビーズ上に抽出するためのキレート剤及びカオトロピック剤を含む試薬を含有し、
前記チャンバーが、前記チャンバー及び伝導路の領域中に連続した蝋層を含有し、
前記標的核酸を伴う磁気ビーズが、付与される磁場を用いて、前記蝋層を通じて前記伝導路中に通過することが可能であり、前記第一の伝導路が前記ビーズを前記入口ポートへ移動させることが可能である、請求項７５の使い捨て装置。
【請求項７８】
前記磁気ビーズが前記伝導路中に保持されて、洗浄流体が洗浄流体保持チャンバーから前記ビーズ上を経て廃棄チャンバーへと通過して、前記ビーズの洗浄を実行することができる、請求項７７の使い捨て装置。
【請求項７９】
前記入口ポートが核酸抽出装置と合体して、抽出された標的核酸を使い捨て装置中に移動させることが可能であり、前記抽出装置が、試料から開放された核酸を吸収することができ、及び約７５℃を上回る温度で水溶液に曝露されたときに前記核酸を脱離させて前記移動を許容することができるフィルターを含有する収容部を含む、請求項７７に記載の使い捨て装置。
【請求項８０】
核酸増幅及び検出を実施するための使い捨て装置であり、
標的核酸を含有することが疑われる抽出された試料を、増幅チャンバーに取り付けられた第一の伝導路中に受容するための入口ポートを含む収容部を含み、前記増幅チャンバーは増幅試薬保持チャンバーに取り付けられており、前記増幅試薬は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込ませることが可能であり、
前記収容部は、前記試料及び前記増幅試薬を前記増幅チャンバー中に移動させることができる手段を有し、
前記増幅チャンバーは、前記増幅チャンバーの温度を調節して、前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む検知領域を含有する第二の伝導路に取り付けられており、
前記収容部は、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合を可能とする手段を含有し、
前記第二の伝導路が、洗浄流体保持チャンバー（前記洗浄流体を前記第二の伝導路中に送達して捕捉されていない増幅された標的を前記検知領域から実質的に排除し、前記検知領域中に保持された前記部分の光学的検知を可能とする）に取り付けられている、装置。
【請求項８１】
核酸抽出及び増幅を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートを含む収容部と、
前記入口ポートに接続された第一のチャンバー（前記第一のチャンバー中に位置する磁気ビーズ上に前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する。）と、を含み、
前記第一のチャンバーは、前記チャンバー及び第一の伝導路の領域中に実質的に連続した蝋層を形成するための蝋を含有し、
標的核酸を伴う磁気ビーズは、負荷される磁場を用いて、前記蝋層を通じて前記第一の伝導路中に通過することができ、
前記第一の伝導路は増幅チャンバーへ取り付けられており、前記収容部は増幅された標的中に検出可能な標識を取り込むことができる増幅試薬を含有し、前記ビーズ及び前記増幅試薬は前記増幅チャンバー中に移動することができ、前記増幅チャンバーはまた、前記増幅チャンバーの温度を調節して、前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーが、前記一体化された装置から増幅された標的の脱出を可能とする第二の伝導路に取り付けられている、装置。
【請求項８２】
請求項８１に記載の一体化された装置であり、前記増幅された標的が、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド、前記標識へ結合することができる溶解可能なシグナル発生試薬及びセンサーを含む検知領域を含む第二の収容部中に導入され、
前記収容部が、前記増幅された標的を前記検知領域へと移動させて、前記捕捉オリゴヌクレオチドへの前記増幅された標的の結合及び前記標識への前記シグナル発生試薬の結合を可能とするための手段を含有し、
前記第二の収容部が、検出試薬を前記検知領域中に送達して、前記検知領域から未捕捉の増幅された標的及び前記標識に結合されていないシグナル発生試薬を実質的に排除することが可能な検出試薬保持チャンバーを有し、
前記検出試薬は、前記標識へ結合された前記シグナル発生試薬と反応して、前記センサーにおいて検出可能なシグナルを発生することができる、装置。
【請求項８３】
核酸分析を実施するための一体化された使い捨て装置であり、
標的核酸を含有すると疑われる試料を受容するための入口ポートを含む収容部と、
前記入口ポートへ接続された抽出チャンバー（前記抽出チャンバー中に位置するフィルター上に前記標的核酸を抽出するための試薬を含有する。）とを含み、前記チャンバーはまた、核酸の抽出を促進するための抽出試薬を含有し、
前記収容部は、洗浄流体を含有する洗浄流体保持チャンバー及び廃棄チャンバーを含み、両チャンバーは前記抽出チャンバーへ取り付けられて、前記洗浄流体が洗浄流体保持チャンバーからフィルター上を前記廃棄チャンバーへと通過して前記フィルターを洗浄できるようにし、
前記抽出チャンバーは、前記フィルターからの前記標的核酸の脱離に適した条件を実施するために前記抽出チャンバーの温度を調節するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記抽出チャンバーは、第一の伝導路へ取り付けられており、前記第一の伝導路は増幅チャンバーへ取り付けられており、前記伝導路は前記抽出チャンバーから前記増幅チャンバーへの前記標的核酸の移動を可能とし、
前記収容部は増幅試薬を含有し、前記増幅試薬は増幅された標的中に標識を取り込むことができ、
前記増幅チャンバーは、前記増幅チャンバーの温度を調節し、及び前記標的核酸の増幅に適した条件を実施するための、加熱手段及び温度検知手段を有し、
前記増幅チャンバーが、前記一体化された装置から増幅された標的の脱出を可能とする第二の伝導路に取り付けられている、装置。
【請求項８４】
核酸分離方法であり、
核酸を含有する細胞を有する試料を、溶解（ｌｙｔｉｃ）試薬及び前記細胞から放出される核酸を結合することができる１つ以上のビーズを含む水性混合物に曝露すること、
前記水性混合物が実質的に非混和性の液体の層と接触すること、
前記非混和性の液体層を通じて前記ビーズを通過させて、前記水性混合物から前記核酸を分離することを含む、方法。
【請求項８５】
前記ビーズが磁気であり、及び負荷される磁場によって前記非混和性液体層を通過する、請求項８４の方法。
【請求項８６】
前記非混和性液体層が有機液体である、請求項８４の方法。
【請求項８７】
前記非混和性液体層が蝋である、請求項８４の方法。
【請求項８８】
前記非混和性液体が、前記１つ以上のビーズの通過を可能とするために、周囲温度から高温度へと加熱される、請求項８４の方法。
【請求項８９】
中間層を通じて第一の位置から第二の位置へと核酸を移動させる方法であり、
第一の位置において核酸に１つ以上のビーズとの会合を生じさせて、液体中に核酸−ビーズ複合体を形成させること、
前記液体と実質的に非混和性である中間層によって第一の位置と離隔された第二の位置へ、前記核酸−ビーズ複合体を通過させること、
を含む、方法。
【請求項９０】
核酸及び核酸増幅過程の阻害剤が前記中間層中に実質的に可溶性である、請求項８９の方法。
【請求項９１】
核酸分離用の装置であり、
水性溶解試薬と、及び核酸を結合して複合体を形成することができる１つ以上の磁気ビーズとを含む第一の層を有するチャンバーと、
前記第一の層と実質的に非混和性であり、及び第二の層が液体形態である場合に、前記ビーズがこれを通じて通過し得る第二の層と、を含み、核酸及び核酸増幅過程の阻害剤が前記第二の層中で実質的に不溶性である、装置。
【請求項９２】
核酸分離用の装置を使用する方法であり、
（ａ）無傷の生物細胞を含有する試料が、前記第二の層を通じて前記第一の層中にピペットで移動されること、
（ｂ）前記細胞の溶解及び核酸−ビーズ複合体の形成を可能とするのに十分な時間、前記装置をインキュベートすること、
（ｃ）前記装置に近接して前記第一の層から及び前記第二の層を通じて前記１つ以上のビーズを移動するのに十分な磁場を生成すること、を含む方法。
【請求項９３】
前記第二の層が蝋であり、および蝋を融解させ及び前記第一の層を覆う層を形成させるのに十分な温度まで前記装置が加熱される、請求項９２の方法。
【請求項９４】
前記ビーズが核酸増幅用の手段に移される、請求項９２の方法。
【請求項９５】
生物学的試料から核酸を抽出するための装置であり、
第一及び第二の位置を含む収容部と、
前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターと、を含み、前記フィルターの少なくとも一部に、カオトロピック塩、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を含む混合物が含浸されている、装置。
【請求項９６】
血液試料から核酸を抽出するための装置であり、
第一及び第二の位置を含む収容部と、
前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターと、を含み、前記フィルターの少なくとも一部に強塩基が含浸されている、装置。
【請求項９７】
請求項９５の装置を用いて生物学的試料から核酸を抽出するための方法であり、
伝導路中の第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターに生物学的試料を付与すること、
（前記フィルターの少なくとも一部には、カオトロピック塩、弱塩基性緩衝液及びキレート剤を含む混合物が含浸されている。）
核酸を前記フィルター上に抽出するのに十分な時間、前記フィルター上に前記試料を保持すること、
前記伝導路を通じて洗浄流体を付与すること（前記洗浄流体は、前記フィルター上に前記抽出された核酸を実質的に保持しながら、核酸増幅反応を妨害することができる物質を前記フィルターから実質的に除去する。）、
約７５℃を上回る温度で、前記フィルターに水溶液を付与して、前記フィルターから核酸を溶出すること、を含む方法。
【請求項９８】
請求項の装置を用いて血液試料から核酸を抽出するための方法であり、
伝導路中の前記第一及び第二の位置の間に位置する生化学的に不活性なフィルターに血液試料を付与すること（前記フィルターの少なくとも一部には、強塩基が含浸されている。）、
前記フィルター上に核酸を抽出するのに十分な時間、前記フィルター上に前記試料を保持すること、
前記伝導路を通じて洗浄流体を付与すること（前記洗浄流体は、前記フィルター上に前記抽出された核酸を実質的に保持しながら、核酸増幅反応を妨害することができる物質を前記フィルターから実質的に除去する。）、
約７５℃を上回る温度で、前記フィルターに水溶液を付与して、前記フィルターから核酸を溶出すること、を含む方法。
【請求項９９】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離する装置であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を電気泳動要素に送達するための第一の伝導路と（前記要素は、前記第一の伝導路中に第一の電極を含む。）、
電気泳動分離材料と第二の電極を含有する、前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路と、を含む装置。
【請求項１００】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離する装置であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を電気泳動要素に送達するための第一の伝導路と（前記要素は、前記第一の伝導路中に第一の電極を含む。）、
電気泳動分離材料と、及び前記第一の電極に対して近位に位置する第二の電極と、及び前記第一の電極から遠位に位置する第三の電極とを含有する、前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路と、を含む装置。
【請求項１０１】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離するための方法であり、
プライマーおよび増幅された標的の混合物を第一の伝導路中に導入して、前記第一の伝導路中の第一の電極を含む電気泳動要素と接触させること、
前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路は、電気泳動分離材料と第二の電極を含有しており、
前記第一の電極に負の極性を付与し、及び前記第二の電極に正の極性を付与して、プライマー及び増幅された標的を分離させること、
前記プライマーを分離材料中に実質的に保持しながら、前記増幅された標的が前記第一の伝導路に再度進入するのに十分に極性を逆転させること、
前記電極から極性を除去し、及び前記第一の伝導路から前記増幅された標的を除去することを、含む方法。
【請求項１０２】
より高質量の増幅された標的核酸から核酸プライマーを分離するための方法であり、
プライマーと増幅された標的の混合物を第一の伝導路中に導入して、前記第一の伝導路中の第一の電極を含む電気泳動要素と接触させること、
前記第一の伝導路に取り付けられた第二の伝導路は、電気泳動分離材料と、及び前記第一の電極に対して近位に位置する第二の電極と、及び前記第一の電極から遠位に位置する第三の電極とを含有し、
前記第一の電極に負の極性を付与し、及び前記第二の電極に正の極性を付与して、プライマー及び増幅された標的を分離させること、
第一の電極の極性を正に、及び前記第二の電極を負に変化させ、並びに前記プライマーが前記第二の電極を過ぎて移動するのに十分な時間後に前記第三の電極に正の極性を付与すること、
前記プライマーを分離材料中に実質的に保持しながら、前記増幅された標的が前記第一の伝導路に再度進入するのに十分な時間にわたり、新たに極性を付与すること、
前記電極から極性を除去し、及び前記第一の伝導路から前記増幅された標的を除去することを、含む方法。
【請求項１０３】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列を含む修飾された大量のプライマー、前記プライマーに付着されたポリメラーゼ遮断領域、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された一本鎖ハイブリダイゼーション領域並びに検出可能な標識を合わせること、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から過剰の取り込まれていない修飾されたポリマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域に対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、及び
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う前記標識を検出すること、を含む方法。
【請求項１０４】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマー（第一の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域及び前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含み、前記第二の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第二の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域及び前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域を含む。）を合わせること、
ここにおいて、検出可能な標識が、前記第一及び第二の修飾されたプライマーの少なくとも１つに付着されており、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から前記検出可能な標識を有する、取り込まれていない修飾されたプライマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記第一及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域の少なくとも１つに対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、並びに
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う前記標識を検出すること、を含む方法。
【請求項１０５】
核酸増幅アッセイを実施するための方法であり、
（ａ）試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸及び２つの修飾されたプライマーを合わせること（第一の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第一の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断領域、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第一の一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び付着された検出可能な標識を含み、前記第二の修飾されたプライマーは、前記標的核酸の第二の領域に対して相補的な塩基の配列、ポリメラーゼ遮断、前記ポリメラーゼ遮断領域に付着された第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域及び付着された検出可能な標識を含む。）、
（ｂ）（ａ）の混合物をサイクルに供して、前記修飾されたプライマーを取り込んだアンプリコンの複数コピーを与えること、
（ｃ）前記混合物から取り込まれていない修飾されたポリマーを実質的に除去すること、
（ｄ）前記第一及び第二の一本鎖ハイブリダイゼーション領域の少なくとも１つに対して相補的な捕捉オリゴヌクレオチドに前記混合物を曝露すること、
（ｅ）前記修飾されたプライマーを取り込んだ前記アンプリコンの前記一本鎖ハイブリダイゼーション領域を、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、並びに
（ｆ）前記ハイブリダイゼーションに伴う標識を検出すること、を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−１００６５７（Ｐ２０１２−１００６５７Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２４９４２６（Ｐ２０１１−２４９４２６）
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【分割の表示】特願２００７−５４８５１６（Ｐ２００７−５４８５１６）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２１日（２００５．１２．２１）
【出願人】（５０７２０９３８８）アイ−スタツト・コーポレイシヨン (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４９４２６（Ｐ２０１１−２４９４２６）
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【分割の表示】特願２００７−５４８５１６（Ｐ２００７−５４８５１６）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２１日（２００５．１２．２１）
【出願人】（５０７２０９３８８）アイ−スタツト・コーポレイシヨン (2)
【Ｆターム（参考）】
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