分岐α−グルカン及びこれを生成するα−グルコシル転移酵素とそれらの製造方法並びに用途
【課題】 水溶性食物繊維として有用なグルカンとその製造方法並びにその用途を提供することを課題とする。
【解決手段】 グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、詳細には、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカン：
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンと当該分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決する。
【解決手段】 グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、詳細には、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカン：
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンと当該分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐α−グルカン及びこれを生成するα−グルコシル転移酵素とそれらの製造方法並びに用途に関し、詳細には、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカン、及び、マルトース及びグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカン、すなわち、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンに作用し、α−グルコシル転移することによって、当該分岐α−グルカンを生成する作用を有するα−グルコシル転移酵素とそれらの製造方法、並びに当該分岐α−グルカンを含んでなる組成物とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物繊維とは、本来、動物が消化し難いセルロース、リグニン、ヘミセルロース、ペクチンなど植物細胞成分を意味するものの、広義には、アミラーゼで消化されない難消化性の水溶性多糖類も含まれ、これらは水溶性食物繊維と呼ばれている。近年、食物繊維は、その本来の機能としての整腸作用、血中コレステロール低下作用、血糖調節作用などに加えて、腸内フローラを改善するプレバイオティクスとしての機能も注目されつつある。しかしながら、食物繊維はカルシウムと並んで日本人の食生活で不足している栄養素と言われており、現在の日本人の平均的な食物繊維摂取量は、平成６年に出された第５次改定「日本人の栄養所要量」において示された食物繊維の目標摂取量２０〜２５ｇ／日に対し、目標の５〜８割にしか達していないことが指摘されている（例えば、非特許文献１などを参照）。このような状況下、各種飲食物の原料として利用でき、且つ、水溶性食物繊維として有用な難消化性の多糖類が種々提案されている。
【０００３】
例えば、水溶性食物繊維として、難消化澱粉（湿熱処理ハイアミロースコーンスターチ）、グァーガム分解物、グルコマンナン、低分子アルギン酸など、自然界に存在する多糖を原料とするものが市場に流通している。しかしながら、これらはいずれも粘性が高く、食品に添加した場合、風味・食感を損なうなどの欠点を有することから、その利用は一部に限定されている。一方、低粘度の水溶性食物繊維として、ポリデキストロース（米国ファイザー社が開発）や難消化性デキストリンが食品分野で広く利用されている。ポリデキストロースは、グルコースとソルビトール及びクエン酸を高真空下で加熱し、化学的な反応により重合させて得られる合成多糖であり、グルコースが１，２、１，３、１，４、１，６、１，２，６、１，４，６位などでグルコシド結合した複雑な分岐を有することが知られている。また、難消化性デキストリンは、化学的な反応により澱粉を分解すると同時に転移や逆合成反応を起こさせ、澱粉が本来有さない、１，２、１，３、１，２，４、１，３，４の各グルコシド結合を導入することにより消化性を低減させた合成多糖である。この難消化性デキストリンは、澱粉に少量の塩酸を添加し、粉末の状態で加熱して得た焙焼デキストリンを水に溶解し、α−アミラーゼを添加して加水分解して得られた低粘度溶液を精製し、濃縮、噴霧乾燥して製造されている。難消化性デキストリンには、さらに消化性を低減させる目的で、グルコアミラーゼを添加して可消化部分をグルコースにまで分解し、グルコースを分離除去して同様に精製、噴霧乾燥して製造した製品もある。しかしながら、難消化性デキストリンは、原料澱粉からの収率が低く、加えて、着色し易く、工業生産する上で大きな欠点となっている。これらポリデキストロースや難消化性デキストリンに導入された新たなグルコシド結合はα−及びβ−の両アノマー型が共に含まれ、さらに還元末端グルコース残基は部分的に１，６−アンヒドロ−グルコースに変化していると言われている（例えば、非特許文献２などを参照）。
【０００４】
グルカンにおけるグルコースの結合様式であるグルコシド結合（以下、本明細書では「グルコシド結合」を単に「結合」と略称する。）の内、α−１，６結合はα−１，４結合に比べてアミラーゼで分解され難いことから、α−１，６結合を多く含むグルカンにも水溶性食物繊維としての用途が期待できる。例えば、乳酸菌に属するロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のデキストランスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５）によりスクロースを原料として製造されるデキストランは、グルコースが主にα−１，６結合で重合したグルカンであって、α−１，２結合及びα−１，３結合の分岐を有する場合もある。ロイコノストック・メセンテロイデス Ｂ−５１２Ｆ株由来のデキストランスクラーゼを用いた場合、得られるデキストランにおける結合のα−１，６結合の含量は９０％以上にもなり、難消化性であることが期待される。しかしながら、デキストランは、スクロースからの収率が低く、また、粘性が高いため精製操作が煩雑で、コスト高になることから、水溶性食物繊維として利用しようとする試みはほとんど行われていない。
【０００５】
また、安価な澱粉にアミラーゼを作用させ、主としてα−１，４結合を分解することによりα−１，６結合の含量を高めて水溶性食物繊維を調製しようとする試みも為されている。特許文献１には、澱粉液化液に、α−アミラーゼとβ−アミラーゼの混合物を作用させた後、残存するデキストリン部を回収することにより、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合を１０〜２０％に高めた分岐デキストリンを調製する方法が提案されている。しかしながら、この分岐デキストリンは、澱粉が本来持つ分岐（α−１，６結合）を保持しつつ、グルコースがα−１，４結合で連なった直鎖部分を取り除くことでα−１，６結合の割合を高めるという方法で製造されるため、原料澱粉からの収率が低く、また、大幅な消化性の低減が期待できないなどの課題がある。また、澱粉部分分解物（デキストリン）に作用しα−１，６結合を導入する酵素として、デキストリンデキストラナーゼ（ＥＣ ２．１．１．２）が知られている（例えば、非特許文献３を参照）。デキストリンデキストラナーゼは、澱粉部分分解物に作用し、主としてα−１，６グルコシル転移反応を触媒することにより、デキストラン構造（グルコースがα−１，６結合で連なった構造）を生成する酵素であるものの、従来から知られている、酢酸菌に属するアセトバクター・カプスラタム(Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)由来のデキストリンデキストラナーゼは、α−１，６結合の導入割合が少ない（例えば、非特許文献４などを参照）こと、また、酵素自体の安定性が低いことなどの問題点があり、現実に使用されるに至っていない。このような状況下、水溶性食物繊維の選択肢を広げる意味でも、新たな難消化性グルカン及びそれを製造する手段の提供が強く望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１１１０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】『食物繊維の市場動向を探る』、「食品と開発」、第３４巻、第２号、第２４乃至２７頁（１９９９年）
【非特許文献２】『低分子水溶性食物繊維』、食品成分シリーズ「食物繊維の科学」、第１１６頁乃至１３１頁、朝倉書店（１９９７年）
【非特許文献３】山本一也ら、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー」、第５６巻、(１９９２年)、第１６９頁乃至１７３頁
【非特許文献４】鈴木雅之ら、「ジャーナル・オブ・アプライド・グリコサイエンス(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、第４８巻、第２号、第１４３頁乃至１５１頁（２００１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、水溶性食物繊維として有用なグルカンとその製造方法並びにその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らはマルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを原料（基質）とし、分岐（本明細書において、「分岐」とは、グルカンにおけるグルコースの結合様式の内、α−１，４結合以外のグルコースの結合様式を意味する）を比較的多く有する分岐α−グルカンを生成する酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く探索した。その結果、土壌から単離した微生物、ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株が、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、α−１，４、α−１，６、α−１，３、α−１，４，６及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素を菌体外に産生することを見出した。そして、この新規酵素が澱粉部分分解物などのα−１，４グルカンから、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを効率よく生成することを見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、ＰＰ７１０株を培養して得たα−グルコシル転移酵素の粗酵素液には澱粉を分解するアミラーゼが混在しており、この粗酵素液を用いるか、又は単離した当該アミラーゼをα−グルコシル転移酵素と併用することにより、α−グルコシル転移酵素を単独で用いた場合よりも水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンが製造できることを見出した。さらに、当該アミラーゼのみならず、公知のα−アミラーゼや澱粉枝切酵素などをα−グルコシル転移酵素と併用することによって、得られる分岐α−グルカンの重量平均分子量や水溶性食物繊維含量を調整することができることも見出した。加えて、本発明者らは、これらの方法によって得られる分岐α−グルカンは、原料α−１，４グルカンに比べα−１，６結合の割合が大幅に増加しており、且つ、α−１，３及びα−１，３，６結合を有し、顕著な難消化性を示すことから水溶性食物繊維として有用であり、血糖上昇抑制作用や生体内脂質低減作用をも有することを見出して本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンと、当該分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、食品分野をはじめとする様々な分野において、水溶性食物繊維として有用であり、着色の少ない難消化性の分岐α−グルカンを、収率よく大量・安価に製造し、供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素標品をそれぞれ用いて澱粉部分分解物より調製したグルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図２】澱粉部分分解物及び本発明の分岐α−グルカンの構造を模式的に示す図である。
【図３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図７】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図８】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図９】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１０】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適温度を示す図である。
【図１２】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの温度安定性を示す図である。
【図１４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とアミラーゼ精製品とを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とイソアミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１７】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とα−アミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１８】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とＣＧＴａｓｅとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１９】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品と、イソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【符号の説明】
【００１４】
図１及び図１５〜１９において、
イ：分子量１０００，０００ダルトン（グルコース重合度約６，２００）に相当する溶出位置
ロ：分子量１００，０００ダルトン（グルコース重合度約６２０）に相当する溶出位置
ハ：分子量１０，０００ダルトン（グルコース重合度約６２）に相当する溶出位置
ニ：分子量１，０００ダルトン（グルコース重合度約６）に相当する溶出位置
ホ：分子量１００ダルトンに相当する溶出位置
図１において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：グルカンＡのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：グルカンＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
１：グルコース重合度４９９に相当する位置
２：グルコース重合度６．３に相当する位置
３：グルコース重合度３８４に相当する位置
４：グルコース重合度２２．２に相当する位置
５：グルコース重合度１０．９に相当する位置
６：グルコース重合度１に相当する位置
７：グルコース重合度４３３に相当する位置
８：グルコース重合度２２．８に相当する位置
９：グルコース重合度１０．９に相当する位置
１０：グルコース重合度１に相当する位置
図２において、
１：澱粉部分分解物の模式図
２：本発明の分岐α−グルカンの模式図
ａ：非還元末端グルコース残基
ｂ：α−１，３結合しているグルコース残基
ｃ：α−１，４結合しているグルコース残基
ｄ：α−１，６結合しているグルコース残基
ｅ：α−１，３，６結合しているグルコース残基
ｆ：α−１，４，６結合しているグルコース残基
斜め向き破線：α−１，３結合
横向き実線：α−１，４結合
縦向き実線：α−１，６結合
図１３において、
●：カルシウムイオン非存在下
○：１ｍＭカルシウムイオン存在下
図１５において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１６において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１７において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１８において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１９において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で言うグルカンとは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度３以上のオリゴ糖ないしは多糖を意味する。本発明の分岐α−グルカンは、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする。
【００１６】
本発明でいうメチル化分析とは、多糖又はオリゴ糖においてこれを構成する単糖の結合様式を決定する方法として一般的に知られている方法である。メチル化分析をグルカンにおけるグルコースの結合様式の分析に用いる場合、まず、グルカンを構成するグルコース残基における全ての遊離の水酸基をメチル化し、次いで、完全メチル化したグルカンを加水分解する。次いで、加水分解により得られたメチル化グルコースを還元してアノマー型を消去したメチル化グルシトールとし、さらに、このメチル化グルシトールにおける遊離の水酸基をアセチル化することにより部分メチル化グルシトールアセテート（以下、本明細書では、「部分メチル化グルシトールアセテート」におけるアセチル化された部位と「グルシトールアセテート」の表記を省略して、「部分メチル化物」と略称する場合がある。）を得る。得られる部分メチル化物を、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、グルカンにおいて結合様式がそれぞれ異なるグルコース残基に由来する各種部分メチル化物は、ガスクロマトグラムにおける全ての部分メチル化物のピーク面積に占めるピーク面積の百分率（％）で表すことができる。そして、このピーク面積％から当該グルカンにおける結合様式の異なるグルコース残基の存在比、すなわち、各グルコシド結合の存在比率を決定することができる。本願明細書においては、部分メチル化物についての「比」は、メチル化分析のガスクロマトグラムにおけるピーク面積の比を意味し、部分メチル化物についての「％」はメチル化分析のガスクロマトグラムにおける「面積％」を意味するものとする。
【００１７】
上述した（１）における、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，６−トリメチル化物」と略称する）とはＣ−４位が１，４結合にあずかるグルコース残基を意味し、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，４−トリメチル化物」と略称する）はＣ−６位が１，６結合にあずかるグルコース残基を意味する。そして、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある」とは、すなわちメチル化分析における部分メチル化グルシトールアセテートのガスクロマトグラムにおいて、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計に対するＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の割合が３７．５乃至８０．０％の範囲を示すことを意味する。
【００１８】
上述した（２）における、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との合計が部分メチル化物の６０％以上を占める」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計がグルカンを構成する全グルコース残基の６０％以上を占めることを意味する。
【００１９】
同様に、上述した（３）における、「２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトール」（以下、「２，４，６−トリメチル化物」と略称する）とは、Ｃ−３位が１，３結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４，６−トリメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上１０％未満である」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位のみが結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上１０％未満存在することを意味する。
【００２０】
さらに同様に、上述した（４）における「２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトール」（以下、「２，４−ジメチル化物と略称する」）とは、Ｃ−３位及びＣ−６位の両方がそれぞれ１，３結合と１，６結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４−ジメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上である」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位とＣ−６位が結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上存在することを意味する。
【００２１】
上記の（１）乃至（４）の条件を全て充足する本発明の分岐α−グルカンは、これまで知られていない新規なグルカンである。本発明の分岐α−グルカンは、メチル化分析において、上記（１）乃至（４）の条件を充足する限り、グルコース残基の結合順序は特に限定されない。
【００２２】
本発明の分岐α−グルカンは、通常、グルコース重合度が１０以上の様々なグルコース重合度を有する分岐α−グルカンの混合物の形態にある。また、本発明の分岐α−グルカンにおいて、その重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は、通常、２０未満である。
【００２３】
さらに、本発明の分岐α−グルカンは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−１，２、α−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれの結合であっても加水分解する特徴を有するイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させると、消化物の固形物当たりイソマルトースを、通常、２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００２４】
また、本発明の分岐α−グルカンは、平成８年５月厚生省告示第１４６号の栄養表示基準、「栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）」における第８項、「食物繊維」に記載された、「高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）」に準じて水溶性食物繊維含量を求めると、水溶性食物繊維を、通常、４０質量％以上含有する。上記高速液体クロマトグラフ法（以下、本明細書では「酵素−ＨＰＬＣ法」と略称する）の概略を説明するならば、試料を熱安定α−アミラーゼ、プロテアーゼ及びアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）による一連の酵素処理により分解処理し、イオン交換樹脂により処理液から蛋白質、有機酸、無機塩類を除去することにより高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の試料溶液を調製する。次いで、ゲル濾過ＨＰＬＣに供し、クロマトグラムにおける、未消化グルカンとグルコースのピーク面積を求め、それぞれのピーク面積と、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法により求めておいた試料溶液中のグルコース量を用いて、試料の水溶性食物繊維含量を算出する方法である。本法の詳細については後述の実験の項で説明する。
【００２５】
本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験１９に示すように、経口摂取しても唾液α−アミラーゼ、膵液α−アミラーゼや小腸粘膜α−グルコシダーゼによる分解を受け難いことから、消化吸収されにくく、血糖を急激に上昇させたり、インスリンの分泌を刺激することの少ない、低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。また、当該分岐α−グルカンは、口腔内の微生物によって、酸発酵を起こし難く、スクロースと併用した場合にも歯垢の原因となる不溶性デキストランの生成を抑制する作用を有しているので、低う蝕性又は抗う蝕性糖質としても有利に利用できる。さらに、本発明の分岐α−グルカンは、マウスを用いた急性毒性試験において、何ら毒性を示さないグルカンである。
【００２６】
さらに、本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験２０及び２１に示すように、通常の澱粉質とともに摂取すると、澱粉質のみを摂取した場合に比べ、血糖値やインスリン量の上昇を抑制することから、血糖上昇抑制剤として使用することもできる。
【００２７】
またさらに、本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験２２に示すように、摂取することにより生体内の脂質の過剰な蓄積を抑制する作用をも有していることから、生体内脂質低減剤として使用することもできる。
【００２８】
本発明の分岐α−グルカンを上記血糖抑制剤や生体内脂質低減剤として用いる場合、分岐α−グルカンは、水溶性食物繊維含量が高いものほど作用効果に優れていることから、水溶性食物繊維として、通常、４０質量％以上、望ましくは、５０質量％以上、さらに望ましくは、６０質量％以上含有するものが好適に利用できる。
【００２９】
本発明でいうα−グルコシル転移酵素とは、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、実質的に加水分解することなくα−グルコシル転移を触媒することにより、本発明の分岐α−グルカンを生成する酵素を意味する。本発明のα−グルコシル転移酵素は、加水分解活性が弱い点、低濃度から高濃度まで基質溶液の濃度に依存せず効率の良い転移活性を有する点、及び、α−１，３及びα−１，３，６結合をも生成する点で、従来公知の真菌由来α−グルコシダーゼや酢酸菌由来デキストリンデキストラナーゼとは異なる酵素である。
【００３０】
本発明のα−グルコシル転移酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。マルトースを最終濃度１ｗ／ｖ％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液５ｍｌに、酵素液０．５ｍｌを加え４０℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．５ｍｌと５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコース・オキシダーゼ法で測定し、反応によって生成したグルコース量を算出する。α−グルコシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００３１】
本発明のα−グルコシル転移酵素の１つの具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定；
【００３２】
本発明のα−グルコシル転移酵素の別の具体例としては、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、約５０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定；
【００３３】
本発明のα−グルコシル転移酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として微生物が挙げられ、とりわけ、本発明者らが土壌より単離した微生物ＰＰ７１０株又はＰＰ３４９株が好適に用いられる。以下、本発明のα−グルコシル転移酵素の産生能を有する微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株の同定試験において判明した菌学的諸性質を表１及び２にそれぞれ示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
以上の菌学的性質に基づき、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）、及び、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株と公知菌との異同をそれぞれ検討した。その結果、微生物ＰＰ７１０株は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属する微生物であり、微生物ＰＰ３４９株は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。本発明者等は、これら２菌株をそれぞれ、新規微生物バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９と命名し、いずれも平成１８年２月１日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、それぞれ受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０として受託された。本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物には、上記菌株はもとより、上記菌株に突然変異を誘発し、選抜して得られる酵素高産生変異株なども包含される。
【００３７】
本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のα−グルコシル転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３８】
本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００３９】
このようにしてα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養した後、本発明のα−グルコシル転移酵素を含む培養物を回収する。α−グルコシル転移酵素活性は、培養微生物がバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）のいずれの場合も、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液はそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００４０】
さらに、α−グルコシル転移酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、α−グルコシル転移酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００４１】
上記のように本発明のα−グルコシル転移酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、調製用電気泳動などの方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。
【００４２】
本発明のα−グルコシル転移酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、及びマルトース以上のマルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレーテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下、本明細書では「ＣＧＴａｓｅ」と略称する）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。さらには、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させることも随意である。澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよい。澱粉から本発明のグルカンを製造するに際しては、上記のような原料澱粉を、通常、糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。さらに、本発明のα−グルコシル転移酵素の基質は、エーテル化澱粉（ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、酢酸澱粉など）、エステル化澱粉（リン酸化澱粉、オクテニルコハク酸澱粉など）及び架橋澱粉（アセチル化アジピン酸架橋澱粉、リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉など）など、澱粉の一部を化学的方法により誘導体化した化工澱粉であってもよい。
【００４３】
本発明のα−グルコシル転移酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．５％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のα−グルコシル転移酵素の反応は進行して分岐α−グルカンを生成する。工業的には、基質濃度は１％（ｗ／ｖ）以上、望ましくは５乃至６０％（ｗ／ｖ）、更に望ましくは、１０乃至５０％（ｗ／ｖ）の範囲から選ばれる濃度が好適であり、この条件下で、本発明の分岐α−グルカンを有利に生成させることができる。反応温度は反応が進行する温度、すなわち６０℃付近までの温度で行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至８の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００４４】
例えば、澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に、本発明のα−グルコシル転移酵素を作用させた場合の分岐α−グルカンの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらも、α−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明の分岐α−グルカンを生成する。
【００４５】
また、本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有するバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）は、その培養物中に本発明のα−グルコシル転移酵素のみならず、ある種のアミラーゼをも同時に産生し、意外にも、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用してマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると、α−グルコシル転移酵素を単独で作用させた場合よりも水溶性食物繊維含量を更に高めた分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【００４６】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）が産生するアミラーゼとしては、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（１）作用
澱粉を加水分解するとともにグリコシル基の転移を触媒し、シクロデキストリンをも生成する。プルランを加水分解しパノースを生成する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、５８，０００±１０，０００ダルトン；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５５℃；
（４）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下で６乃至７；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定、
ｐＨ６．０、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下で５０℃まで安定；及び
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ６．０〜８．０の範囲で安定；
【００４７】
本発明のα−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させた場合に得られる分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量が、α−グルコシル転移酵素のみを用いて調製した分岐α−グルカンの場合よりも高い理由としては、α−グルコシル転移酵素の作用で生成する分岐α−グルカンに対し、アミラーゼがさらにグリコシル基を転移し、グルカンにおける分岐の程度（頻度）をさらに高めたものと推察される。
【００４８】
また、酵素反応によって本発明の分岐α−グルカンを調製する際、他の公知のアミラーゼを併用して反応させることにより、分岐α−グルカンの分子量分布を調節することも、また、消化性をさらに低減した分岐α−グルカンにすることも、さらには還元力を低減することも有利に実施できる。例えば、澱粉液化液に、本発明のα−グルコシル転移酵素とともに、α−アミラーゼやＣＧＴａｓｅなど、澱粉の内部のα−１，４結合を加水分解し、新たな非還元末端グルコース残基を生じさせる酵素を併用して作用させることにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させ消化性の低減に寄与するα−１，３、α−１，６及びα−１，３，６結合の割合をさらに増加させることも有利に実施できる。また、イソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を併用することにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させたり、特開平７−１４３８７６号公報などに開示された非還元性糖質生成酵素（別名：マルトオリゴシルトレハロース生成酵素（ＥＣ ５．４．９９．１５））を併用することにより、還元末端部分を部分的にトレハロース構造に変換して還元力を低減させることも有利に実施できる。
【００４９】
また、本発明の分岐α−グルカンは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含有する栄養培地で、本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生成する分岐α−グルカンを採取することによっても製造することができる。
【００５０】
上記の反応又は培養によって得られた分岐α−グルカンは、そのまま分岐α−グルカン製品とすることもできる。また、必要に応じて、反応液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、可消化部分を加水分解した後、非消化部分を分画により回収したり、酵母などを用いた発酵処理によりグルコースをはじめとする分解物を除去したりすることにより、消化性のさらに低減した分岐α−グルカンを調製することもできる。一般的には、分岐α−グルカンを含有する反応液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００５１】
本発明のα−グルコシル転移酵素は、糊化澱粉や比較的低ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、好ましくはＤＥ２０未満の澱粉部分分解物に作用させた場合、グルコースやマルトースなどの低分子オリゴ糖をほとんど生成しないので、得られる反応生成物をカラムクロマトグラフィーなどの精製手段で精製する必要は特にないものの、用途など目的に応じてさらに分画することも随意である。分画にイオン交換クロマトグラフィーを採用する場合、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを有利に用いることができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００５２】
このようにして得られた本発明の分岐α−グルカンは溶液のまま利用できるものの、保存に有利で、且つ、用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末品とするのが望ましい。乾燥には、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法を用いることができる。乾燥物は、必要に応じて、粉砕し粉末化することも、篩別又は造粒して、特定粒度の範囲に整えることも有利に実施できる。
【００５３】
また、本発明の分岐α−グルカンは、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘度付与性、接着性、他の糖の結晶防止性、難発酵性などの性質を具備している。従って、本発明の分岐α−グルカン又はこれを含む糖質は、水溶性食物繊維、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５４】
本発明の分岐α−グルカンは、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような甘味料と、また、デキストリン、澱粉、デキストラン、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５５】
また、本発明の分岐α−グルカンの粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５６】
また、本発明の分岐α−グルカンは、経口摂取しても消化され難いので、水溶性食物繊維として一般の飲食物などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬などの漬物類、たくわん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物に配合可能な水溶性食物繊維として有利に利用できる。
【００５７】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などとして整腸、便秘の改善、肥満の防止目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などの形態で嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への品質改良剤、安定化剤などとして有利に利用できる。
【００５８】
品質改良剤、安定化剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、本発明の分岐α−グルカンを品質改良剤、安定化剤として用いることにより、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００５９】
以上、述べたような各種組成物に、本発明の分岐α−グルカンを含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程において含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、組成物の、通常、０．１質量％以上、望ましくは、１質量％以上含有せしめるのが好適である。
【００６０】
また、本発明のα−グルコシル転移酵素は、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含んでなる組成物に作用させると、α−１，４グルカンを本発明の分岐α−グルカンに変換することから、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含んでなる組成物の改質剤として用いることもできる。
【００６１】
さらに、本発明のα−グルコシル転移酵素は、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると本発明の分岐α−グルカンを生成し、一方、本発明の分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）により消化するとイソマルトースが基質固形物当たり２５質量％以上５０質量％以下生成することから、本発明のα−グルコシル転移酵素をマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを原料として、これら２段階の酵素反応により、イソマルトース又はこれを含む糖質を製造することができる。
【００６２】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００６３】
＜実験１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
＜実験１−１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社販売）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６４】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除去し、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、２．８単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約２０ｍｌを得た。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．１８Ｍ付近から０．４５Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６５】
＜実験１−２：α−グルコシル転移酵素を用いた分岐α−グルカンの調製＞
実験１−１で得たα−グルコシル転移酵素標品１００ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８５．８％の収率で得た。
【００６６】
＜実験２：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
【００６７】
＜実験２−１：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験１−１と同様に培養したものを種培養とした。
【００６８】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、０．５３単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．０５Ｍ付近から０．２Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６９】
＜実験２−２：α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
実験２−１で得たα−グルコシル転移酵素標品２０ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８３．６％の収率で得た。
【００７０】
以下の実験３及び４では、実験１−２で得たグルカンと実験２−２で得たグルカンを区別する目的で、それぞれを「グルカンＡ」及び「グルカンＢ」と呼称する。
【００７１】
＜実験３：グルカンＡ及びＢの水溶性食物繊維としての評価＞
得られたグルカンの水溶性食物繊維含量を、栄養表示基準（平成８年５月厚生省告示第１４６号）における栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）、８．食物繊維、（２）高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）記載の方法に準じて下記の方法により調べた。酵素処理用のキットとして、総食物繊維測定キット（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ，Ｔｏｔａｌ，Ａｓｓａｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ、シグマ社製）を用いた。また、グルカンＡ及びＢの調製に用いた基質である澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を対照１とし、市販の難消化性グルカン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）を対照２として、同様にそれぞれの水溶性食物繊維含量を調べた。
【００７２】
＜分析用試料溶液の調製＞
被験試料として固形分０．１ｇのグルカンを試験管にとり、０．０８Ｍリン酸緩衝液５ｍｌを添加しｐＨを６．０に調整した。これに、食物繊維測定キット付属の熱安定α−アミラーゼ（バチルス・リケニホルミス由来耐熱性α−アミラーゼ、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、沸騰水浴中で５分毎に攪拌しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られた反応液に、０．２７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液約１ｍｌを添加しｐＨを７．５に調整した後、キット付属のプロテアーゼ（バチルス・リケニホルミス由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られたプロテアーゼ処理液に０．３２５Ｍ塩酸を約１ｍｌ添加し、ｐＨを４．３に調整した後、キット付属のアミログルコシダーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。次いで、得られた反応液約７ｍｌを、イオン交換樹脂（オルガノ株式会社販売のアンバーライトＩＲＡ−６７（ＯＨ型）とアンバーライト２００ＣＴ（Ｈ型）を１：１で混合）にＳＶ１．０で通液することにより脱塩し、さらに約３倍量の脱イオン水にて溶出し、溶出液の総量を約２８ｍｌとした。得られた溶出液をエバポレーターにて濃縮し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過した後、メスフラスコで２５ｍｌに定容したものを分析用試料溶液とした。
【００７３】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
上記で得られた分析用試料溶液は、下記の条件による高速液体クロマトグラフィーに供した。
カラム ：ＴＧＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×長さ３００ｍｍ，株式会社東ソー製）２本を直列に連結したもの
溶離液 ：脱イオン水
試料糖濃度：０．８質量％
カラム温度：８０℃
流 速 ：０．５ｍｌ／分
検 出 ：示差屈折計
注入量 ：２０μｌ
分析時間：５０分
【００７４】
＜被験試料の水溶性食物繊維含量の算出＞
上記で得られたクロマトグラムにおいて、酵素処理によっても分解されずに残存する未消化グルカンを水溶性食物繊維とした。この水溶性食物繊維と分解されて生成したグルコースのピーク面積をそれぞれ求め、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法にて定量した分析用試料溶液中のグルコース量を用いて、下記の式１により水溶性食物繊維量を求めた。さらに、下記の式２により被験試料の水溶性食物繊維含量を求めた。
【００７５】
式１：
【数１】
【００７６】
式２：
【数２】
【００７７】
上記の酵素−ＨＰＬＣ法により求めたグルカンＡ及びグルカンＢの水溶性食物繊維含量はそれぞれ４２．１質量％及び４１．８質量％であった。一方、対照１の澱粉部分分解物は酵素処理により全てグルコースにまで分解され、水溶性食物繊維含量は０質量％と評価された。また、対照２の市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）のそれは４８．７質量％であった。これらの結果は、水溶性食物繊維を含まない澱粉部分分解物を基質として本発明のα−グルコシル転移酵素を作用させることにより、市販の難消化性デキストリンとほぼ同等の水溶性食物繊維含量を示すグルカンを容易に調製できることを示している。
【００７８】
＜実験４：グルカンＡ及びＢの構造解析＞
＜実験４−１：メチル化分析＞
実験１−２及び２−２の方法で得たグルカンＡ及びＢについて、常法に従って、メチル化分析を行い、下記の条件によるガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。結果を表３にまとめた。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
カラム ：ＤＢ−５ キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ×膜厚１μｍ，Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス ：ヘリウム
カラム温度：１３０℃で２分間保持した後、２５０℃まで５℃／分で昇温し、２５０℃で２０分間保持
流 速 ：１．０ｍｌ／分
検 出 ：ＦＩＤ
注入量 ：３μｌ（スプリット１／３０）
分析時間：４６分
【００７９】
【表３】
【００８０】
表３の結果から明らかなように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素によりそれぞれ調製したグルカンＡ及びＢのメチル化分析の結果を、基質である澱粉部分分解物のそれと比較すると、いずれのグルカンの場合も、２，３，６−トリメチル化物が著しく減少しており、一方、２，３，４−トリメチル化物が３０％以上まで著しく増加していた。このことは、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の反応によって、グルコースが主としてα−１，４結合によって重合した構造を有する澱粉部分分解物が、α−１，６結合を３０％以上含む分岐α−グルカンに変換されたことを物語っている。また、２，３，４，６−テトラメチル化物、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物が増加していることから、非還元末端グルコース、α−１，３結合及びα−１，３，６結合が新たに生成していることも判明した。グルカンＡの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ１．１％及び０．８％であり、グルカンＢの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ０．９％及び１．１％であった。さらに、グルカンＡ及びＢにおいて、２，３−ジメチル化物の存在比は基質とほとんど差がないことから、基質に元々存在する分岐であるα−１，４，６結合に大きな変化はないと考えられた。この結果から、グルカンＡ及びＢは、基質である澱粉部分分解物とは大きく異なり、グルコースの結合様式がα−１，４結合及びα−１，６結合を主体とし、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも僅かに有する分岐グルカン（分岐α−グルカン）であることが判明した。なお、分岐α−グルカンＡ及びＢを構成するグルコースの１位のアノマー型は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、全てα型であることが判明した。
【００８１】
＜実験４−２：分岐α−グルカンＡ及びＢのイソマルトデキストラナーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ及びＢの構造を特徴づける目的で、イソマルトデキストラナーゼ消化試験を行った。分岐α−グルカンＡ及びＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアルスロバクター・グロビホルミス由来のイソマルトデキストラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所内にて調製）を基質固形物１グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その反応液中の糖組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）及びガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略称する）を用いて調べた。ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ』（株式会社三菱化学製造）２本を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。ＧＣは、常法に従って糖質をトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）した後、カラムに『２％シリコンＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＳ』（株式会社ジー・エル・サイエンス製造）を用い、１分間当たり７．５℃の昇温速度で温度１６０℃から３２０℃まで昇温した。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、検出はＦＩＤ法にて行った。イソマルトデキストラナーゼ消化において、分岐α−グルカンの調製に用いた基質である澱粉部分分解物からはイソマルトースが全く生成しなかったのに対し、分岐α−グルカンＡからは糖組成として２８．４質量％のイソマルトースが、また、分岐α−グルカンＢからは糖組成として２７．２質量％のイソマルトースが、それぞれ生成した。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがイソマルトース構造をそれぞれ、少なくとも２８．４質量％及び２７．２質量％程度含んでいることを示しており、分岐α−グルカンではα−１，６結合の割合が増加していることを示した実験４−１におけるメチル化分析の結果を支持するものである。なお、イソマルトデキストラナーゼは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−グルコシド結合であれば、それがα−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれであっても加水分解する特異性を有していることから、得られたイソマルトースが分岐α−グルカンＡ及びＢにおいてどのような結合様式で結合しているのか、その詳細は不明である。
【００８２】
＜実験４−３：分岐α−グルカンＡ及びＢのα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ又はＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼアマノＬ』、天野エンザイム製）及びリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来グルコアミラーゼを同時に作用させ消化試験を行った。基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを５，０００単位とグルコアミラーゼを１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その酵素反応液の糖組成を実験４−２と同じ条件でＨＰＬＣを用いて調べた。その結果、グルカンＡ及びＢはいずれも、基質である澱粉部分分解物の場合と同様に、実質的に全てグルコースにまで分解された。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがいずれもグルコースを構成糖とするα−グルカンであることを示すものである。
【００８３】
＜実験４−４：分子量分布分析＞
分岐α−グルカンＡ及びＢについて、分子量分布を常法のゲル濾過ＨＰＬＣ法にて分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣは、カラムに『ＴＳＫ ＧＥＬ α−Ｍ』（株式会社東ソー製）を２本連結したものを用い、溶離液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。なお、試料中のグルカンの分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原生物化学研究所販売）を同様にゲル濾過分析に供して作成した分子量の検量線に基づき算出した。図１に分岐α−グルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム（図１における符号ｂ及びｃ）を、基質として用いた澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』）のそれ（図１における符号ａ）と比較しつつ、それぞれ示した。なお、図１における符号イ、ロ、ハ、ニ及びホは、それぞれ、分子量１，０００，０００（グルコース重合度約６，２００に相当）、１００，０００（グルコース重合度約６２０に相当）、１０，０００（グルコース重合度約６２に相当）、１，０００（グルコース重合度約６に相当）及び１００ダルトン、に相当する溶出位置を意味する（後述する図１５乃至１９においても同様）。また、ゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づき各試料の分子量分布を分析した結果を表４に示した。
【００８４】
【表４】
【００８５】
基質として用いた澱粉部分分解物が、分子量分布分析においてグルコース重合度４９９及び６．３に相当する位置に２つのピーク（図１のクロマトグラムａにおける符号１及び２）を有する糖質混合物であるのに対して、分岐α−グルカンＡは、グルコース重合度３８４、２２．２、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｂにおける符号３、４、５及び６）を有する糖質の混合物、また、分岐α−グルカンＢは、グルコース重合度４３３、２２．８、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｃにおける符号７、８、９及び１０）を有する糖質の混合物であった。符号６及び１０のピークはグルコースに相当するものの、その含量はごく僅かであることから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来酵素の加水分解作用は僅かであることがわかる。表４から明らかなように、基質である澱粉部分分解物に比べ、グルカンＡ及びＢの数平均分子量及び重量平均分子量は共に６０％程度に減少しており、全体として低分子化していた。また、分子量分布の拡がりの指標である重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が澱粉部分分解物とグルカンＡ及びＢ間でそれほど変化していないことから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素は、澱粉部分分解物の非還元末端にのみ作用していると考えられた。
【００８６】
表３の結果から、基質として用いた澱粉部分分解物においてはグルコースの結合様式の約９０％がα−１，４結合であり、わずかにα−１，４，６結合を有しているのに対し、グルカンＡ及びＢは、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合が極めて高く、α−１，４，６結合に加えて、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも有する分岐を有するグルカンであることが判明した。このような構造を有する分岐α−グルカンはこれまで全く知られていない。
【００８７】
メチル化分析の結果に基づいて本発明の分岐α−グルカンの構造を推定し、その構造を模式的に示した図を基質である澱粉部分分解物のそれとともに図２に示した。図２中、符号１及び２は、それぞれ原料澱粉部分分解物及び本発明の分岐α−グルカンの模式図である。なお、図２において、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆはそれぞれ、澱粉部分分解物または本発明の分岐α−グルカンにおける、非還元末端グルコース残基、α−１，３結合しているグルコース残基、α−１，４結合しているグルコース残基、α−１，６結合しているグルコース残基、α−１，３，６結合しているグルコース残基及びα−１，４，６結合しているグルコース残基を意味している。また、同模式図におけるグルコース間の斜め破線、横実線及び縦実線はそれぞれ、α−１，３結合、α−１，４結合及びα−１，６結合を意味している。
【００８８】
＜実験５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０株由来α−グルコシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００８９】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約２．７単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約２．６単位／ｍｌであった。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０によって生産される本発明のα−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００９０】
＜実験６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験５で得た培養上清のうち、約４Ｌ（総活性約１０，４００単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約６５ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約７４単位／ｍｌであった（総活性約４，７８０単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量９ｍｌ）に供した。本発明のα−グルコシル転移酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３．３ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表５に示す。
【００９１】
【表５】
【００９２】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００９３】
＜実験７：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験７−１：分子量＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【００９４】
＜実験７−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３であることが判明した。
【００９５】
＜実験７−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示した。図５及び図６から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素は４０℃まで安定であり、また、ｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定であった。
【００９６】
＜実験７−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
表６の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【００９９】
＜実験８：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験５と同様に培養して種培養とした。
【０１００】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至７．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約０．３６単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約０．４２単位／ｍｌであった。アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９によって生産される本α−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【０１０１】
＜実験９：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験８で得た培養上清約１８Ｌ（総活性約７，５６０単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、遠心分離して不溶物を除き、粗酵素液約５００ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約１４単位／ｍｌであった（総活性約７，０００単位）。この粗酵素液に終濃度２Ｍとなるように硫安を添加し、遠心分離して不溶物を除き、２Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、ゲルに吸着し、硫安濃度２Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．６Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表７に示す。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１０４】
＜実験１０：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験１０−１：分子量＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１０５】
＜実験１０−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図７（至適温度）及び図８（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約５０℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０であることが判明した。
【０１０６】
＜実験１０−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験９方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図９（温度安定性）及び図１０（ｐＨ安定性）に示した。図９及び図１０から明らかなように、本発明のアルスロバクター・グロビホルミス由来α−グルコシル転移酵素は、４０℃まで安定であり、ｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１０７】
＜実験１０−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験９の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１０８】
【表８】
【０１０９】
表８の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【０１１０】
＜実験１１：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本発明のα−グルコシル転移酵素の基質特異性を調べた。メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、グルコース、スクロース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトトリオース又はイソパノースを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、基質濃度を１ｗ／ｖ％になるように調製し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、加熱することにより糖質を検出した。ＴＬＣにおける基質糖質以外の反応生成物の生成の有無を調べ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表９に示す。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素についても基質特異性を同様にして調べた結果、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素と同様であった。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
表９の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、ニゲロース、イソマルトース、ネオトレハロース、イソマルトトリオース、イソパノースに作用した。さらに、コージビオースにも僅かに作用した。作用した糖質からは、いずれも分解生成物と共に、糖転移生成物も認められた。一方、本発明のα−グルコシル転移酵素は、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、トレハロース、セロビオース、スクロース、ラクトースなどには作用が認められなかった。これらの結果及び本α−グルコシル転移酵素が澱粉部分分解物に作用し分岐α−グルカンを生成することより、本酵素はマルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカン又はグルコースから構成されるα−グルコオリゴ糖に幅広く作用することが判明した。
【０１１３】
＜実験１２：作用メカニズム＞
本発明のα−グルコシル転移酵素の作用メカニズムを検討するため、最小の基質であるマルトースに作用させた場合の生成糖の構造を調べた。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であった。本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１１４】
＜実験１２−１：マルトースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ及びＧＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。結果を表１０に示す。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
表１０の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、本発明のα−グルコシル転移酵素の作用により、基質マルトースから、主としてグルコース、マルトトリオース及びパノースが生成した。さらに反応２時間及び４時間からグルコース重合度４及び５のオリゴ糖が生成した。反応が進むと、マルトトリオースは反応２時間（１４．４％）をピークに、また、パノースは反応４時間（２９．３％）をピークに減少し、その減少とともにイソマルトースの増加が認められた。さらに、反応４８時間までイソマルトース及び重合度４以上のオリゴ糖の増加が認められた。
【０１１７】
これらの結果から推察すると、本発明のα−グルコシル転移酵素はマルトースに作用し、反応初期において、α−１，４グルコシル転移とα−１，６グルコシル転移の両グルコシル転移を触媒することにより、グルコース、マルトトリオース及びパノースを生成し、反応の進行にともない、グルコースにα−１，６グルコシル転移したイソマルトースや、そのイソマルトースにα−１，４グルコシル転移及びα−１，６グルコシル転移したイソパノース及びイソマルトトリオースが生成することがわかった。本実験においては、多種類存在する重合度４以上のオリゴ糖を同定することは困難であることから、実験１２−２において、マルトースより重合度の高いマルトペンタオースを基質として、さらに反応メカニズムを解析した。
【０１１８】
＜実験１２−２：マルトペンタオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。また、酵素反応液について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。生成する部分メチル化物の組成からグルコースの結合様式における各グルコシド結合の存在比を求めた。また、実験４−２と同様にイソマルトデキストラナーゼ消化試験も行った。反応中の糖組成の変化を表１１に、反応生成物のメチル化分析とイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表１２に示す。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
表１１及び１２の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、基質マルトペンタオースから、基質よりグルコース重合度が１小さいオリゴ糖とグルコース重合度が１大きいオリゴ糖が優先的に生成したことから、本酵素がグルコシル転移を触媒していることが確認された。さらに反応が進むと、種々のグルコース重合度を有する反応生成物が生成し、反応２４時間後には、グルコース重合度９以上のグルカンが２１．１％にも達した。メチル化分析の結果から、反応が進行するにつれて、反応生成物においては１，４結合したグルコース残基が減少するとともに、１，６結合したグルコース残基が顕著に増加し、また、１，３結合したグルコース残基、１，４，６結合したグルコース残基及び１，３，６結合したグルコース残基が徐々に増加することが判明した。また、イソマルトデキストラナーゼ消化後の糖組成におけるイソマルトース含量もまた、反応の進行とともに顕著に増加することが判明した。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２２】
実験１２−１及び１２−２の結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらもα−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明の分岐α−グルカンを生成する。
【０１２３】
＜実験１３：α−グルコシル転移反応と反応液の還元力の変化＞
マルトース水溶液（最終濃度１又は３０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形物１グラム当たり４単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。反応液中に残存するマルトース量を実験４−２に記載のＨＰＬＣ法及びＧＣ法で定量した。また、酵素反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で定量し、次式、 還元力＝（還元糖量／全糖量）×１００ で還元力を算出した。結果を表１３に示す。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
表１３の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素をマルトースに作用させたところ、マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低い場合には、ごく僅かな還元力の増加が認められ、また、マルトース濃度が３０ｗ／ｖ％と比較的高い場合には、ほとんど反応液の還元力の増加は認められなかった。マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低く、且つ、マルトースの残存量が１０％以下の場合においても反応液の還元力の増加がごく僅かであることは、本発明のα−グルコシル転移酵素は本質的に転移反応を触媒する酵素であり、反応に際してほとんど加水分解を行わないことを意味している。本発明のα−グルコシル転移酵素は効率良くα−グルコシル転移を行う酵素であることがわかった。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２６】
＜実験１４：分岐α−グルカンの生成における精製α−グルコシル転移酵素と粗酵素の比較＞
分岐α−グルカンの工業的生産を考慮した場合、α−グルコシル転移酵素の粗酵素が使用できれば酵素を精製する手間と労力が省けることとなり、より好適である。そこで、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて、実験１−２で調製したグルカンＡと同等の分岐α−グルカンが得られるか否かを検討した。実験１−１に記載した方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０を培養し、培養上清を硫安塩析し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析したものをα−グルコシル転移酵素の粗酵素液とした。この粗酵素液を実験１−２に記載した方法で澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）に作用させ、固形分濃度３０％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８８．２％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンを「グルカンＣ」と名付け、そのメチル化分析を行った結果を表１４に、また、実験４及び実験３に記載した方法によって分子量分布及び水溶性食物繊維含量を測定した結果を表１５にそれぞれ示す。なお、表１４及び表１５には、比較のため表３及び表４より調製の原料とした澱粉部分分解物と部分精製α−グルコシル転移酵素を用いて調製したグルカンＡのデータをそれぞれ再掲した。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
表１４に示すように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて調製したグルカンＣは、意外にも、メチル化分析において、非還元末端グルコース残基に相当する２，３，４，６−テトラメチル化物と、α−１，６結合したグルコース残基に相当する２，３，４−トリメチル化物の含量がグルカンＡに比べ増加していた。この結果は、グルカンＣにはグルカンＡに比べて非還元末端が多く、また、α−１，６結合がより多く存在することを物語っている。さらに、グルカンＣでは２，４−ジメチル化物が４．８％と、グルカンＡの０．８％に比べ増加していた。この結果は、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基が増加していることを示している。
【０１３０】
また、表１５から明らかなように、グルカンＣは、グルカンＡに比べ数平均分子量及び重量平均分子量がいずれも小さく（グルコース重合度が小さく）、遙かに高い水溶性食物繊維含量を示した。この結果は、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素には、α−グルコシル転移酵素とは相違する他の酵素が混在しており、その混在酵素が分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に寄与していることを示唆するものである。
【０１３１】
＜実験１５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在する酵素の同定と単離・精製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在し、分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に関与する酵素を同定し、単離・精製する実験を行った。
【０１３２】
＜実験１５−１：混在する酵素の同定と活性測定＞
実験１−１と同じ方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を培養し、得られた培養上清約３Ｌを硫安塩析した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に対して透析して得た透析液約４０ｍｌを粗酵素液とした。この粗酵素液を、２ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液又は２ｗ／ｖ％プルラン溶液にｐＨ６．０、４０℃で１６時間作用させ、１００℃、１０分間加熱して反応を停止させた後、縦１０ｃｍ、横２０ｃｍのシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）ＴＬＣプレートを用いたＴＬＣに供した。展開溶媒としてｎ−ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）を用いて２回展開を行い、２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、１００℃で５分間加熱して生成物のスポットを検出した。その結果、可溶性澱粉からは、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の生成が、また、プルランからは僅かなイソマルトースとパノースの生成が認められた。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）のα−グルコシル転移酵素の粗酵素には澱粉を分解し、さらにプルランをも分解するアミラーゼが混在していることが判明した。
【０１３３】
混在するアミラーゼの活性は、以下のようにして測定した。すなわち、短鎖アミロース（商品名「アミロースＥＸ−Ｉ」、株式会社林原生物化学研究所販売、平均重合度１７）を最終濃度１ｗ／ｖ％となるように１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液２ｍｌに、酵素液０．２ｍｌを加え３５℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．２ｍｌを８ｍｌの０．０２Ｎ硫酸溶液に混合し、反応停止させた後、０．２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、２５℃で１５分間保持した後に６６０ｎｍの吸光度を測定する。別途反応０時間の反応液について同様に測定し、反応時間当たりのヨウ素呈色の減少を測定する。アミラーゼの活性１単位は、上記の条件下で２０ｍｇの短鎖アミロースの６６０ｎｍにおける吸光度（ヨウ素呈色）を１０％低下させる酵素量の１０倍量と定義した。
【０１３４】
＜実験１５−２：混在アミラーゼの単離・精製＞
実験１５−１で調製した粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。アミラーゼ活性を有する画分は、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１．５Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、ファルマシアバイオテク製『リソース ＰＨＥ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。目的のアミラーゼ活性を有する画分は、１．５Ｍ硫安、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース ＰＨＥ』ゲルに吸着し、硫安濃度１．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、濃縮した後、ファルマシアバイオテク製『スーパーデックス ２００ｐｇ』ゲルを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１１８ｍｌ）に供し、０．２Ｍ食塩、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出した。活性画分を回収し、ファルマシアバイオテク製『リソース Ｑ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。アミラーゼ活性を有する画分は、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース Ｑ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。得られた活性画分をアミラーゼ精製標品とした。各精製の各工程におけるアミラーゼ活性、アミラーゼの比活性及び収率を表１６に示す。
【０１３５】
【表１６】
【０１３６】
精製したアミラーゼ標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１３７】
＜実験１６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの性質＞
＜実験１６−１：分子量＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、当該アミラーゼの分子量は５８，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１３８】
＜実験１６−２：アミラーゼの至適温度及び至適ｐＨ＞
実験１５−２の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼ精製標品を用いて、アミラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１１（至適温度）及び図１２（至適ｐＨ）に示した。当該アミラーゼの至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５５℃であり、至適ｐＨは３５℃、３０分間反応の条件下で６．０乃至７．０であることが判明した。
【０１３９】
＜実験１６−３：アミラーゼの温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０又は１ｍＭ塩化カルシウムを含む同緩衝液）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１３（温度安定性）及び図１４（ｐＨ安定性）に示した。図１３及び図１４から明らかなように、当該アミラーゼはカルシウムイオン非存在下では４０℃まで安定であり、１ｍＭカルシウムイオン存在下では５０℃まで安定であった。また、当該アミラーゼはｐＨ６．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１４０】
＜実験１６−５：アミラーゼの基質特異性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、当該アミラーゼの各種基質への作用を調べたところ、当該アミラーゼは、澱粉、マルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを加水分解するとともに、グリコシル転移をも触媒することが判明した。また、当該アミラーゼは、澱粉からシクロデキストリンを生成し、プルランを加水分解してパノースを生成する作用を有することも判明した。
【０１４１】
＜実験１７：α−グルコシル転移酵素とアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品と実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、実験１４に記載したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いたグルカンＣの調製が再現できるか否かを検討した。すなわち、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、実験１５―２の方法で得たアミラーゼを固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１５に示した。図１５において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである（α−グルコシル転移酵素のみ１０単位作用させた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示したグルカンＡのクロマトグラムとほぼ同様であり、図１５では省略した。後述する図１６〜１９についても同様）。これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１７に示す。また、基質として用いた澱粉部分分解物について調べた分子量分布分析と水溶性食物繊維含量の結果（α−グルコシル転移酵素０単位、アミラーゼ０単位）を表６に併記した。
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
表１７の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素にアミラーゼを併用すると、得られる分岐α−グルカンの分子量は低下し、水溶性食物繊維含量は飛躍的に増加した。また、アミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．１まで低下した。さらに、得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位以上で約７６質量％にまで達した。
【０１４４】
この結果から、実験１４においてバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて得られたグルカンＣにおいて、分子量が小さく、食物繊維含量が高くなったのは、粗酵素に混在するアミラーゼに起因することが確認された。混在するアミラーゼが、基質である澱粉部分分解物およびα−グルコシル転移酵素の産物である分岐α−グルカンを部分的に加水分解することにより分岐α−グルカンの分子量を低下させ、また、グリコシル基をさらに分岐α−グルカンに転移することにより、結果的に食物繊維含量を高めるよう作用しているものと推察される。さらに、この結果は、アミラーゼを本発明のα−グルコシル転移酵素と組み合わせることにより分子量が小さく、水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンを製造できることを示している。
【０１４５】
＜実験１８：α−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
本発明のα−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用して、澱粉部分分解物に作用させて分岐α−グルカンを調製し、その構造的な特徴及び水溶性食物繊維含量を検討した。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であったことから、本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１４６】
＜実験１８−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼに変えて、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、５０、２００、５００又は１，０００単位加えた以外は実験１７と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１６に示した。図１６において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１８に示す。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
表１８のα−グルコシル転移酵素のみを澱粉部分分解物に作用させた場合の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素のみでは分子量分布に大きな影響を及ぼさないものの、表１８及び図１６の結果から明らかなように、イソアミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。イソアミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１０００単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは１．９まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度２０．６にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、イソアミラーゼの作用量にあまり影響されず、４０乃至４４質量％程度であった。
【０１４９】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にさらにイソアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量をほとんど変化させることなく、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５０】
＜実験１８−２：α−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えて市販のα−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１７に示した。図１７において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、α−アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
図１７及び表１９の結果から明らかなように、α−アミラーゼの作用量が多くなるにつれて得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。α−アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１７の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．４まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度１１．８にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、α−アミラーゼの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められた。
【０１５３】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量が増加し、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５４】
＜実験１８−３：α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１８に示した。図１８において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、ＣＧＴａｓｅを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２０に示す。
【０１５５】
【表２０】
【０１５６】
図１８及び表２０の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるにつれて、数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。ＣＧＴａｓｅの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１８の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは３．２まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度７９．１にピークを有する分子量分布を示した。一方、分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められ、実験１８−２のα−アミラーゼを併用した場合よりも顕著に増加し、ＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり１．０単位用いた場合では、水溶性食物繊維含量は７０．５質量％に達した。
【０１５７】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることで、分子量が低下し、水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンが調製できることが判明した。ＣＧＴａｓｅはα−１，４結合の加水分解作用と共に転移作用をも有していることから、α−アミラーゼと比較して極端に分子量を低下させることなく、非還元末端グルコシル残基を生成するため、α−グルコシル転移酵素の作用頻度が高くなり、α−アミラーゼ添加よりも水溶性食物繊維含量が増加した分岐α−グルカンが得られたものと推察される。
【０１５８】
＜実験１８−４：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
実験１８−１に記載した実験において、さらにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり０又は１．０単位を加えた以外は実験１８−１と同様にして反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１９に示した。図１９において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、いずれもα−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅをそれぞれ１０単位及び１単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２１に示す。
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
図１９及び表２１の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素と固形物１グラム当たり１単位のＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンの重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は３．２まで低下し、さらに固形物１グラム当たり１０００単位のイソアミラーゼを併用した場合（図１９の符号ｅ）には１．９まで低下した。α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量は約７０質量％にまで増加し、さらにイソアミラーゼを併用した場合にも低下することなく、高い含量を維持していた。
【０１６１】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、分子量が顕著に低下すると共に水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンを調製できることが判明した。
【０１６２】
＜実験１９：分岐α−グルカンの機能性＞
水溶性食物繊維含量が最も高く、分子量が比較的小さい分岐α−グルカンとして、実験１８−４において固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位ＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンを選択し、当該分岐α−グルカンの消化性及び構造的な特徴及び機能性を検討した。
【０１６３】
＜実験１９−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの精製＞
固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位のＣＧＴａｓｅを用い、実験１８−４と同様に反応させて得た分岐α−グルカンの反応液を、濾過して不溶物を除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０％の分岐α−グルカン含有液を、用いた澱粉から固形物当り８５．８％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンのメチル化分析を実験４−１記載の方法で行った結果を表２２に示した。また、実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法で行った分子量分布分析、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法で求めた水溶性食物繊維含量、実験４−２記載のイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表２３にまとめた。
【０１６４】
【表２２】
【０１６５】
【表２３】
【０１６６】
表２２及び２３の結果から明らかなように、得られた分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物を１対２．４の比で含有し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７７．５％を占めていた。また、本分岐α−グルカンにおいて、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．６％及び２．４％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量５，４８０ダルトン、Ｍｗ／Ｍｎ２．３を示し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量が６８．６質量％、イソマルトデキストラナーゼ消化により、糖組成当たりイソマルトースを３６．４質量％生成するグルカンであった。
【０１６７】
本発明の分岐α−グルカンの有用性を評価する目的で、実験１９−１で調製した分岐α−グルカンを用いて、う蝕原性、消化性、血糖値とインスリン量に及ぼす影響、及び急性毒性を実験１９−２乃至１９−７で調べた。
【０１６８】
＜実験１９−２：分岐α−グルカンのう蝕原性菌による酸発酵性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用い、『インフェクション・アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）』、第３９巻、４３乃至４９頁（１９８３年）に記載の大島らの方法に準じて、う蝕原性菌を用いた酸発酵性試験を行った。う蝕原性菌として、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５株及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ−１７６株の２株を用いた。対照として、スクロースを用いて同様に操作した。結果を表２４に示す。
【０１６９】
【表２４】
【０１７０】
表２４の結果から明らかなように、酸発酵を受けるスクロースの場合はｐＨ約４にまで低下するのに対して、本発明の分岐α−グルカンは、ストレプトコッカス・ソブリナス及びストレプトコッカス・ミュータンスによる酸発酵をほとんど受けず、ｐＨは約６を維持しており、歯のエナメル質が脱灰する臨界ｐＨである５．５より高いｐＨであった。本発明の分岐α−グルカンは、う蝕原性が極めて低いことが確認された。
【０１７１】
＜実験１９−３：分岐α−グルカンの消化性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内において唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素による本発明の分岐α−グルカンの消化性を調べた。対照として、市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。結果を表２５に示す。
【０１７２】
【表２５】
【０１７３】
表２５の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、唾液アミラーゼ、人工胃液によっては全く消化されず、膵液アミラーゼでごく僅か分解された。また、対照の難消化性デキストリンの小腸粘膜酵素による分解率が４１．１％であるのに対して、分岐α−グルカンの分解率は１６．４％と低く、本発明の分岐α−グルカンは市販の難消化性デキストリンよりもさらに消化され難いことが判明した。
【０１７４】
＜実験１９−４：分岐α−グルカンの摂取が血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、血糖値の上昇及びインスリンの上昇を調べた。７週齢のウィスター系雄ラット各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて分岐α−グルカンの水溶液を経口投与した。投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇとした。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値はグルコース・オキシダーゼ法で測定し、インスリン量はラットインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製造）を用いて測定した。対照１としてグルコースを、また、対照２として市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。それぞれの試験系における血糖値及びインスリン量の結果をそれぞれ表２６及び表２７に示す。
【０１７５】
【表２６】
【０１７６】
【表２７】
【０１７７】
表２６及び表２７の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリンと同様に、血糖値の上昇及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べ低いことが判明した。
【０１７８】
＜実験１９−５：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、本発明の分岐α−グルカンは無毒性であり、投与可能な最大量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１７９】
＜実験２０：分岐α−グルカンの血糖上昇抑制作用＞
実験１９−４において、分岐α−グルカンの摂取により、血糖値及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べて低いことが判明したので、後述する実施例５の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、分岐α−グルカンの摂取が血糖上昇に与える影響をさらに詳細に検討した。
【０１８０】
＜実験２０−１：分岐α−グルカンの摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
本発明の分岐α−グルカンが、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学工業株式会社販売）摂取後の血糖上昇に与える影響を検討した。ラット飼育用飼料（株式会社林原生物化学研究所調製、「ＡＩＮ−９３Ｇ」；ジャーナル・オブ・ニュートリッション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、第１２３巻、第１９３９−１９５１頁（１９９３）参照、以下「精製飼料」という。後述の表３３に示す配合組成を参照）で、１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）３群各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）と分岐α−グルカンとを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として、０．１５ｇ、０．３０ｇ又は０．７５ｇとした。ラットの血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットに澱粉部分分解物のみを固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重経口投与した。また、対照２として、分岐α−グルカンに換えて、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社製造）を、澱粉部分分解物と同時に、２群各群５匹のラットに、体重１ｋｇ当り固形物として０．１５ｇ又は０．７５ｇの何れかを経口投与した。それぞれの試験系における血糖値の変化、血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積）、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表２８、表２９、表３０及び表３１に示す。
【０１８１】
【表２８】
【０１８２】
【表２９】
【０１８３】
【表３０】
【０１８４】
【表３１】
【０１８５】
表２８乃至表３１の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、用量依存的に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇を、澱粉部分分解物を単独で摂取させた場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの上昇抑制効果の程度を比較すると、測定した何れの指標においても、本発明の分岐α−グルカンの方が市販の難消化性デキストリンよりも強い抑制効果を示した。
【０１８６】
＜実験２０−２：澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量への分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２０−１において、本発明の分岐α−グルカンが、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を何れも抑制することが判明したので、この分岐α−グルカンの分子量の違いが、糖質負荷時の血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用に及ぼす影響を検討した。すなわち、原料澱粉部分分解物、α−グルコシル転移酵素、アミラーゼの使用量等を調整して、表３２に示す重量平均分子量の分岐α−グルカンを調製した。実験２０−１と同様に、精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）９群各群５匹を用いて、１日絶食後、８群各群５匹のラットには、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）又は表３２に示す分岐α−グルカンの何れかを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として０．７５ｇとした。残りの１群５匹のラットには、澱粉部分分解物のみをラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇ経口投与し、対照群とした。これらのラットの血液を、経口投与直前及び投与３０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液をヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。各群における血糖値及びインスリン量の測定結果を表３２に併せて示す。なお、投与後の採血時間は、澱粉部分分解物のみを投与した場合に、血糖値及び血中インスリン量がピークとなる投与３０分後とした。
【０１８７】
【表３２】
【０１８８】
表３２の結果から明らかなように、重量平均分子量が１，１６８乃至２００，０００の範囲にある本発明の分岐α−グルカンは、何れも澱粉部分分解物を経口投与した後の血糖値及びインスリン量の上昇を抑制した。また、この血糖値及びインスリン量の上昇抑制効果の強さの程度で比較すると、分岐α−グルカンの分子量が１，１６８乃至６０，０００（水溶性食物繊維含量が５８．１乃至８０．４質量％）の場合に抑制効果が顕著となり、２，６７０乃至４４，１５１（水溶性食物繊維含量が６４．２乃至８０．４質量％）の場合に特に強い抑制効果が認められた。
【０１８９】
＜実験２０−３：分岐α−グルカンの長期摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験２０−１において、本発明の分岐α−グルカンの摂取により、糖質負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンを長期摂取後（８週間）に、糖質負荷時の血糖値、血糖値ＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇抑制作用を検討した。精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）５群各群５匹を使用した。３群各群５匹のラットを、各々表３３に示す分岐α−グルカン（固形物換算）を１、２又は５質量％配合した３種類の試験飼料の何れかで８週間飼育した。飼育期間中の餌及び水は自由摂取とした。試験飼料での飼育４週間と８週間で、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物の水溶液を固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重となるように経口投与した。ラットの血液を、投与直前、投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットを精製飼料のみで飼育した。また、残りの１群５匹のラットは、対照２として、精製飼料のコーンスターチの一部を、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社販売）で置き換えた表３３に示す配合組成の飼料で飼育した。飼育４週間と８週間とはほぼ同じ結果となったので、試験飼料で飼育４週間における、それぞれの試験系における血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表３４、表３５、表３６及び表３７に示す。
【０１９０】
【表３３】
【０１９１】
【表３４】
【０１９２】
【表３５】
【０１９３】
【表３６】
【０１９４】
【表３７】
【０１９５】
表３３乃至３７の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を、精製飼料のみで飼育した場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの数値上昇の抑制は、飼料に配合した分岐α−グルカンの濃度に依存しており、その効果は固形物として、分岐α−グルカンを２質量％配合した場合に顕著となり、５質量％では特に強い抑制が認められた。また、市販の難消化性デキストリンを、固形物として５質量％配合した飼料で飼育したラットにおける、これらの指標の抑制の程度は、固形分として分岐α−グルカンを１質量％配合した飼料と同程度の抑制が認められたことから、本発明の分岐α−グルカンは、当該難消化性デキストリンよりも、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇抑制効果に優れていることが確認された。更に、澱粉部分分解物投与前の血糖値及びインスリン量を比較すると、分岐α−グルカンを固形物として２質量％又は５質量％配合した飼料を摂取させた群では、精製飼料のみ或いは難消化性デキストリンを固形物として５質量％含む飼料を摂取させた群よりも低く、本発明の分岐α−グルカンは、長期摂取により空腹時血糖値及び血中インスリン量を、市販の難消化性デキストリンよりも効果的に抑制する作用を有していることも明らかになった。なお、試験飼料又は対照飼料で飼育４週間及び８週間で、ラットの体重を比較したところ、何れの群間でも、平均体重に差は認められなかったので、本実験で確認された分岐α−グルカンによる血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用は、ラットの健康状態には何ら影響を与えないと判断した。
【０１９６】
＜実験２１：分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンをラットに摂取させると澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べて、血糖値及びインスリン量の増加が抑制されることが明らかになったので、分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及び血中のインスリン量に与える影響を調べる試験を行った。市販の澱粉部分分解物（松谷化学工業株式会社販売、商品名「パインデックス＃１」）及び後述する実施例５の方法に準じて調製した分岐α−グルカンを用いて、ヒトでの血糖値及びインスリンの上昇を調べた。健康なボランティアの男性１２名（年齢２６乃至５４歳、平均４１±７歳）を被験者として、試験前日の２１時以降、翌日の試験開始時（９時頃）までの間、水以外の飲食物の摂取を禁止した。この被験者に、まず澱粉部分分解物５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を、摂取開始から２分以内に摂取させた。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後に採血した。次いで、１週間以上の間隔をあけて、同じ被験者に分岐α−グルカン５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を用いた以外は澱粉部分分解物の場合と同様にして試験し、採血した。それぞれの血液の血糖値及びインスリン量を、民間の臨床検査機関（社団法人岡山市医師会総合メディカルセンター）に委託して測定した。試験標品摂取時の血糖値及びインスリン量の経時的な変化、及び、その数値に基づき計算した、摂取直後乃至摂取１２０分間血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積：ＡＵＣ０−２ｈｒ（ｍｇ・ｈｒ／ｄｌ））及びインスリン量のＡＵＣ０−２ｈｒ（μＵ・ｈｒ／ｄｌ）値、摂取直後乃至摂取１２０分間の血糖値のＡＵＣ値の増加量及びインスリン量のＡＵＣ値の増加量（ΔＡＵＣ０−２ｈｒ）を、表３８にまとめて示す。
【０１９７】
【表３８】
【０１９８】
表３８の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンを摂取した場合には、ラットを用いた実験（実験２０）と同様に、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値が、澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べ有意に低いことが判明した。
【０１９９】
＜実験２２：分岐α−グルカンの生体内脂質低減作用＞
実験１９−４、実験２１において、分岐α−グルカンを摂取することにより、血糖値及び血中のインスリン量の上昇が低くなることが判明したので、当該分岐α−グルカンの摂取が生体内脂質に及ぼす影響についても検討した。
【０２００】
＜実験２２−１：分岐α−グルカンの摂取が脂肪吸収に与える影響＞
後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを用いて、７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に４群各群１５匹に分けて、１週間、表３３に示す精製飼料で予備飼育後、２群各１５匹は、同表に示す分岐α−グルカンを固形物として５質量％配合した組成の飼料で、４週間または８週間飼育した。残りの２群各１５匹は、対照として、精製飼料で同様に４週間または８週間飼育した。分岐α−グルカン配合飼料で飼育した１群１５匹を飼育開始４週間で、及び、残り１群１５匹を８週間で、各々、エーテル麻酔下で下大静脈より採血後屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量、血清脂質、腸粘膜湿質量および盲腸内容物などを調べた。対照のラットも同様に処理した。その結果を表３９に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２０−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、解剖前は一晩絶食とした。分岐α−グルカン配合飼料飼育４週間及び８週間の体重増加量、摂餌量、飼料利用効率（体重増加量／摂餌量）、解剖時の、体重、臓器等の質量、腸粘膜質量、内臓脂肪質量、盲腸内の内容物の質量、水分、ｐＨを表３９に示す。また、血清脂質の測定結果も表３９に併せて示す。なお、血清脂質のうち、中性脂肪、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの測定は、それぞれ市販の中性脂肪トリグリセライド測定用キット（商品名「トリグリセライド Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）、総コレステロール測定用キット（商品名「コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売、）及びＨＤＬ−コレステロール測定用キット（商品名「ＨＤＬ−コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）を使用した。また、総コレステロール値からＨＤＬ−コレステロール値を減じてＬＤＬ−コレステロール値とした。
【０２０１】
【表３９】
【０２０２】
表３９の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンを、固形物として５％配合した飼料を摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合に比して、摂取４週間では、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、摂取８週間では、腎臓周囲及び睾丸周囲脂肪のいずれも有意に低値を示し、その低下は、特に睾丸周囲脂肪で顕著であった。また、摂取４週間及び８週間で腸粘膜質量が有意に増加し、その増加は摂取８週間で顕著となった。また、摂取８週間で盲腸内ｐＨが有意に低下した。さらに、血清脂質についてみると、中性脂肪値が摂取８週間で、総コレステロールが摂取４週間及び８週間で、何れも低下傾向を示し、ＬＤＬ−コレステロールも低下した。これら以外の測定値は、対照と差は認められなかった。なお、具体的なデータは示さないが、盲腸内の有機酸濃度は、対照と差は認められなかった。この結果は、本発明の分岐α−グルカンが、生体内脂質の低減作用を有することを物語っている。また、腸粘膜の質量増加が認められることから、分岐α−グルカンによる脂質の過剰蓄積の抑制や実験２０乃至２１で確認された耐糖性の増強には、この試験で確認されたムチン分泌の増大を伴う小腸粘膜層の肥厚に起因する消化酵素の作用性低下や消化されたグルコースや脂肪の消化・吸収阻害、遅延が、重要な役割を果たしていると推察される。
【０２０３】
＜実験２２−２：生体内脂質の過剰蓄積抑制に与える分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２２−１において、本発明の分岐α−グルカンの摂取により、生体内脂質の過剰蓄積が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンの重量平均分子量の違いによる作用を検討した。すなわち、精製飼料に、実験２０−２で使用したものと同じ重量平均分子量の異なる８種類の分岐α−グルカンを、それぞれ固形物として５質量％配合した８種類の試験飼料を調製した。ウィスター系ラット雌性７週齢（日本チャールスリバー株式会社販売）４５匹を、無作為に９群各群５匹に分けて、１週間、精製飼料で予備飼育した。このラットのうち、８群については、表４０に示す重量平均分子量の異なる分岐α−グルカンの何れかを配合した試験飼料（試験飼料１乃至８）で８週間飼育した。残りの１群５匹のラットは、精製飼料でそのまま８週間飼育し、対照群とした。分岐α−グルカンを配合した飼料を摂取して８週間経過したラット及び精製飼料を摂取して８週間経過した対照群のラットを、それぞれエーテル麻酔下で採血後、屠殺して、その腸間膜周囲、腎臓周囲及び睾丸周囲の脂肪質量（湿質量）、並びに、血清中の中性脂肪及び総コレステロールを、実験２２−１と同じ方法で測定した。結果を表４０に示す。
【０２０４】
【表４０】
【０２０５】
表４０の結果から明らかなように、重量平均分子量が異なる本発明の分岐α−グルカンを摂取させた場合、何れの群においても内臓脂肪質量及び血清脂質量が、対照群よりも低値となり、本発明の分岐α−グルカンが内臓脂肪質量及び血清脂質量の上昇を抑制することが分かった。また、この抑制効果の程度で比較すると、分岐α−グルカンの重量平均分子量が２，６７０乃至４４，１５１のもので効果が顕著となり、２，６７０乃至２５，６１８の場合に特に強い効果が認められた。
【０２０６】
以上の実験１９−２乃至１９−５の結果から、本発明の分岐α−グルカンは、経口摂取しても虫歯になり難く、消化吸収され難く、低カロリーの水溶性食物繊維として有利に利用できることが判明した。また、実験２０乃至２２の結果から、本発明の分岐α−グルカンは、血糖上昇抑制剤及び生体内脂質低減剤として利用できることも判明した。
【０２０７】
以下、本発明のα−グルコシル転移酵素の製造例を実施例１及び２に、本発明の分岐α−グルカンの製造例を実施例３乃至６に示す。また、本発明の分岐α−グルカンの物理化学的性質を実施例７に例示する。本発明のα−グルコシル転移酵素を含んでなる品質改良剤を実施例８に、さらに、本発明の分岐α−グルカンを含有せしめた組成物を実施例９乃至２２に示す。
【実施例１】
【０２０８】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を実験５の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮粗酵素液を調製した。本濃縮粗酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は２００単位／ｍｌであった。また、本濃縮酵素液には約２５単位／ｍｌのアミラーゼ活性も認められた。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明の分岐α−グルカンの製造に、また、飲食物に含まれる澱粉質の品質改良剤などに有利に利用できる。
【実施例２】
【０２０９】
アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を実験８の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は５０単位／ｍｌであった。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明の分岐α−グルカンの製造に、また、飲食物に含まれる澱粉質の品質改良剤などに有利に利用できる。
【実施例３】
【０２１０】
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実施例１の方法で得た濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、４０℃、４８時間作用させた。反応終了後、反応液を９５℃に加熱し、１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度５０質量％の分岐α−グルカン溶液を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析における２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１対１．３を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７０．３％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の３．０％及び４．８％であった。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量６，２２０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．２であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．１質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７５．８質量％であった。本品は、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０２１１】
３０％タピオカ澱粉乳に最終濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２質量％になるように加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液を、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行った後、４０℃に冷却し、これに実施例２の方法で調製したα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１：１．６を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の８０．０％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．４及び１．７％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量１０，３３０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．９であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．７質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は６８．６質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０２１２】
２７．１質量％トウモロコシ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また、最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却し、これに実施例１の方法で調製した濃縮粗酵素液を固形物１グラム当たり１１．１単位加え、さらに、５０℃、ｐＨ６．０で６８時間作用させた。その反応液を８０℃で６０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：２．５を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６８．４％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．６及び６．８％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量４，０９７ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．１であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７９．４質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０２１３】
濃縮粗酵素液に替えて実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素を用い、シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１，０００単位加えた以外は実施例５と同様にして分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比は１：４を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６７．９％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．３及び５．３％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量２，９７９ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．０であった。さらに、本分岐α−グルカンはイソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７７質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【０２１４】
実施例５で調製した分岐α−グルカンについて、常法に従って物理化学的性質を調べ、本発明の分岐α−グルカンの性質の一例として表４１にまとめた。
【０２１５】
【表４１】
【実施例８】
【０２１６】
＜品質改良剤＞
無水マルトース（登録商標『ファイントース』、株式会社林原商事販売）４００質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）２００質量部及び実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素液２質量部を均一に混合し、常法により通風乾燥してα−グルコシル転移酵素を含有する酵素剤を調製した。本品は、澱粉質を含む飲食物を製造する際に配合することにより、澱粉質を改質し、澱粉の老化を抑制できることから、品質改良剤、とりわけ澱粉老化防止剤として有利に利用できる。
【実施例９】
【０２１７】
＜餅＞
白玉粉５００質量部と上新粉５００質量部を均一に混合した後、水７００質量部を加えて混合し、水蒸気で４０分間蒸した。次いで、蒸したものをミキサー（ＡＣＭ２０ＬＶＷ、株式会社愛工舎製作所）で攪拌しながら生地が約５５℃になったところで、スクロース３６０質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）２４０質量部及び実験６の方法で精製して得た本発明のα−グルコシル転移酵素を、α−グルコシル転移酵素活性が最終で澱粉質１グラム当たり５０単位になるよう４回に分けて添加・混合し、その後さらに３分間混合してからプラスチック製の内径６０ｍｍ、高さ２２ｍｍの容器に詰めて成形し、放冷し保存した。本品は、α−グルコシル転移酵素の作用により澱粉質が分岐α−グルカンに改質されて老化が抑制され、柔らかさが持続して伸びがあり、歯切れがよい高品質の餅である。
【実施例１０】
【０２１８】
＜おはぎ＞
マルトース（登録商標『サンマルト』、株式会社林原商事販売）３５０質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）１５０質量部を温水に溶解し、濃度７０質量％の糖液を調製して５５℃に保温した。次いで、予め水に浸漬しておいた１０００質量部の餅米を常法により蒸し器で蒸し上げ、５５℃まで冷却した後、前記糖液５００質量部と実験９の方法で精製して得た本発明のα−グルコシル転移酵素を澱粉質１グラム当たり２５単位になるよう加えて均質に攪拌した。これを保温容器に入れて約１時間、４５〜５０℃に保持した後、取り出し、こし餡を用いておはぎを調製した。本品は、α−グルコシル転移酵素の作用により糊化澱粉が分岐α−グルカンに改質されて老化が抑制され、冷蔵、或いは冷凍保存後に解凍しても離水などの発生もなく、調製直後の柔らかさが保持される高品質のおはぎである。
【実施例１１】
【０２１９】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液２質量部及び蔗糖３重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、水溶性食物繊維を多く含む加糖練乳として、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１２】
【０２２０】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末５０質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０質量部を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンやオリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１３】
【０２２１】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１０質量部、含水結晶トレハロース２０質量部、無水結晶マルチトール２０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、水溶性食物繊維を多く含む低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１４】
【０２２２】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液３０質量部、トレハロース含水結晶７０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、水溶性食物繊維を多く含む、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１５】
【０２２３】
＜餡＞
原料小豆１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、小豆粒餡約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えて粒餡を壊さないように練り上げ、製品の餡を約３５質量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンを多く含み、舌触り、風味良好で、餡パン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例１６】
【０２２４】
＜パン＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンを多く含み、適度の弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例１７】
【０２２５】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための食物繊維又は整腸剤量としても有用である。
【実施例１８】
【０２２６】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部、α−グルコシルルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、分岐α−グルカンを配合していることから優れた保湿性を有しており、安定性は高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例１９】
【０２２７】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液１５質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、使用後感も良好である。
【実施例２０】
【０２２８】
＜流動食用固体製剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物を２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、水溶性食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食として、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２１】
【０２２９】
＜錠剤＞
アスピリン５０質量部にトレハロース含水結晶粉末１４質量部、実施例４の方法で調製した分岐α−グルカン粉末４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、難消化性グルカンとトレハロースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。また、分岐α−グルカンが水溶性食物繊維として働くことから、整腸作用をも有する錠剤である。
【実施例２２】
【０２３０】
＜外傷治療用膏薬＞
マルトース４００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に実施例４の方法で調製した分岐α−グルカン粉末の１０ｗ／ｖ％水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、分岐α−グルカンによる適度な粘度、保湿性を有しており、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。また、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
本発明の分岐α−グルカンは安全性が高く、消化性も市販の難消化性デキストリンと遜色ないことから、水溶性食物繊維としての機能を十分に備えている。また、本発明の分岐α−グルカンは、血糖上昇抑制作用や生体内脂質の低減作用をも有していることから、健康食品としても有用である。本発明によれば、従来、化学的な反応や、煩雑で効率の悪い方法により澱粉から製造されていた難消化性デキストリンと同等の難消化性を有する分岐α−グルカンを、澱粉部分分解物を基質として、酵素法で、大量に、且つ、効率良く製造することができる。難消化性の分岐α−グルカンとその製造方法を提供する本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐α−グルカン及びこれを生成するα−グルコシル転移酵素とそれらの製造方法並びに用途に関し、詳細には、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカン、及び、マルトース及びグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカン、すなわち、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンに作用し、α−グルコシル転移することによって、当該分岐α−グルカンを生成する作用を有するα−グルコシル転移酵素とそれらの製造方法、並びに当該分岐α−グルカンを含んでなる組成物とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物繊維とは、本来、動物が消化し難いセルロース、リグニン、ヘミセルロース、ペクチンなど植物細胞成分を意味するものの、広義には、アミラーゼで消化されない難消化性の水溶性多糖類も含まれ、これらは水溶性食物繊維と呼ばれている。近年、食物繊維は、その本来の機能としての整腸作用、血中コレステロール低下作用、血糖調節作用などに加えて、腸内フローラを改善するプレバイオティクスとしての機能も注目されつつある。しかしながら、食物繊維はカルシウムと並んで日本人の食生活で不足している栄養素と言われており、現在の日本人の平均的な食物繊維摂取量は、平成６年に出された第５次改定「日本人の栄養所要量」において示された食物繊維の目標摂取量２０〜２５ｇ／日に対し、目標の５〜８割にしか達していないことが指摘されている（例えば、非特許文献１などを参照）。このような状況下、各種飲食物の原料として利用でき、且つ、水溶性食物繊維として有用な難消化性の多糖類が種々提案されている。
【０００３】
例えば、水溶性食物繊維として、難消化澱粉（湿熱処理ハイアミロースコーンスターチ）、グァーガム分解物、グルコマンナン、低分子アルギン酸など、自然界に存在する多糖を原料とするものが市場に流通している。しかしながら、これらはいずれも粘性が高く、食品に添加した場合、風味・食感を損なうなどの欠点を有することから、その利用は一部に限定されている。一方、低粘度の水溶性食物繊維として、ポリデキストロース（米国ファイザー社が開発）や難消化性デキストリンが食品分野で広く利用されている。ポリデキストロースは、グルコースとソルビトール及びクエン酸を高真空下で加熱し、化学的な反応により重合させて得られる合成多糖であり、グルコースが１，２、１，３、１，４、１，６、１，２，６、１，４，６位などでグルコシド結合した複雑な分岐を有することが知られている。また、難消化性デキストリンは、化学的な反応により澱粉を分解すると同時に転移や逆合成反応を起こさせ、澱粉が本来有さない、１，２、１，３、１，２，４、１，３，４の各グルコシド結合を導入することにより消化性を低減させた合成多糖である。この難消化性デキストリンは、澱粉に少量の塩酸を添加し、粉末の状態で加熱して得た焙焼デキストリンを水に溶解し、α−アミラーゼを添加して加水分解して得られた低粘度溶液を精製し、濃縮、噴霧乾燥して製造されている。難消化性デキストリンには、さらに消化性を低減させる目的で、グルコアミラーゼを添加して可消化部分をグルコースにまで分解し、グルコースを分離除去して同様に精製、噴霧乾燥して製造した製品もある。しかしながら、難消化性デキストリンは、原料澱粉からの収率が低く、加えて、着色し易く、工業生産する上で大きな欠点となっている。これらポリデキストロースや難消化性デキストリンに導入された新たなグルコシド結合はα−及びβ−の両アノマー型が共に含まれ、さらに還元末端グルコース残基は部分的に１，６−アンヒドロ−グルコースに変化していると言われている（例えば、非特許文献２などを参照）。
【０００４】
グルカンにおけるグルコースの結合様式であるグルコシド結合（以下、本明細書では「グルコシド結合」を単に「結合」と略称する。）の内、α−１，６結合はα−１，４結合に比べてアミラーゼで分解され難いことから、α−１，６結合を多く含むグルカンにも水溶性食物繊維としての用途が期待できる。例えば、乳酸菌に属するロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のデキストランスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５）によりスクロースを原料として製造されるデキストランは、グルコースが主にα−１，６結合で重合したグルカンであって、α−１，２結合及びα−１，３結合の分岐を有する場合もある。ロイコノストック・メセンテロイデス Ｂ−５１２Ｆ株由来のデキストランスクラーゼを用いた場合、得られるデキストランにおける結合のα−１，６結合の含量は９０％以上にもなり、難消化性であることが期待される。しかしながら、デキストランは、スクロースからの収率が低く、また、粘性が高いため精製操作が煩雑で、コスト高になることから、水溶性食物繊維として利用しようとする試みはほとんど行われていない。
【０００５】
また、安価な澱粉にアミラーゼを作用させ、主としてα−１，４結合を分解することによりα−１，６結合の含量を高めて水溶性食物繊維を調製しようとする試みも為されている。特許文献１には、澱粉液化液に、α−アミラーゼとβ−アミラーゼの混合物を作用させた後、残存するデキストリン部を回収することにより、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合を１０〜２０％に高めた分岐デキストリンを調製する方法が提案されている。しかしながら、この分岐デキストリンは、澱粉が本来持つ分岐（α−１，６結合）を保持しつつ、グルコースがα−１，４結合で連なった直鎖部分を取り除くことでα−１，６結合の割合を高めるという方法で製造されるため、原料澱粉からの収率が低く、また、大幅な消化性の低減が期待できないなどの課題がある。また、澱粉部分分解物（デキストリン）に作用しα−１，６結合を導入する酵素として、デキストリンデキストラナーゼ（ＥＣ ２．１．１．２）が知られている（例えば、非特許文献３を参照）。デキストリンデキストラナーゼは、澱粉部分分解物に作用し、主としてα−１，６グルコシル転移反応を触媒することにより、デキストラン構造（グルコースがα−１，６結合で連なった構造）を生成する酵素であるものの、従来から知られている、酢酸菌に属するアセトバクター・カプスラタム(Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)由来のデキストリンデキストラナーゼは、α−１，６結合の導入割合が少ない（例えば、非特許文献４などを参照）こと、また、酵素自体の安定性が低いことなどの問題点があり、現実に使用されるに至っていない。このような状況下、水溶性食物繊維の選択肢を広げる意味でも、新たな難消化性グルカン及びそれを製造する手段の提供が強く望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１１１０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】『食物繊維の市場動向を探る』、「食品と開発」、第３４巻、第２号、第２４乃至２７頁（１９９９年）
【非特許文献２】『低分子水溶性食物繊維』、食品成分シリーズ「食物繊維の科学」、第１１６頁乃至１３１頁、朝倉書店（１９９７年）
【非特許文献３】山本一也ら、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー」、第５６巻、(１９９２年)、第１６９頁乃至１７３頁
【非特許文献４】鈴木雅之ら、「ジャーナル・オブ・アプライド・グリコサイエンス(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、第４８巻、第２号、第１４３頁乃至１５１頁（２００１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、水溶性食物繊維として有用なグルカンとその製造方法並びにその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らはマルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを原料（基質）とし、分岐（本明細書において、「分岐」とは、グルカンにおけるグルコースの結合様式の内、α−１，４結合以外のグルコースの結合様式を意味する）を比較的多く有する分岐α−グルカンを生成する酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く探索した。その結果、土壌から単離した微生物、ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株が、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、α−１，４、α−１，６、α−１，３、α−１，４，６及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素を菌体外に産生することを見出した。そして、この新規酵素が澱粉部分分解物などのα−１，４グルカンから、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを効率よく生成することを見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、ＰＰ７１０株を培養して得たα−グルコシル転移酵素の粗酵素液には澱粉を分解するアミラーゼが混在しており、この粗酵素液を用いるか、又は単離した当該アミラーゼをα−グルコシル転移酵素と併用することにより、α−グルコシル転移酵素を単独で用いた場合よりも水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンが製造できることを見出した。さらに、当該アミラーゼのみならず、公知のα−アミラーゼや澱粉枝切酵素などをα−グルコシル転移酵素と併用することによって、得られる分岐α−グルカンの重量平均分子量や水溶性食物繊維含量を調整することができることも見出した。加えて、本発明者らは、これらの方法によって得られる分岐α−グルカンは、原料α−１，４グルカンに比べα−１，６結合の割合が大幅に増加しており、且つ、α−１，３及びα−１，３，６結合を有し、顕著な難消化性を示すことから水溶性食物繊維として有用であり、血糖上昇抑制作用や生体内脂質低減作用をも有することを見出して本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、より詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンと、当該分岐α−グルカンを生成する新規なα−グルコシル転移酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、食品分野をはじめとする様々な分野において、水溶性食物繊維として有用であり、着色の少ない難消化性の分岐α−グルカンを、収率よく大量・安価に製造し、供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素標品をそれぞれ用いて澱粉部分分解物より調製したグルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図２】澱粉部分分解物及び本発明の分岐α−グルカンの構造を模式的に示す図である。
【図３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図７】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図８】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図９】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１０】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適温度を示す図である。
【図１２】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの温度安定性を示す図である。
【図１４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とアミラーゼ精製品とを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とイソアミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１７】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とα−アミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１８】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とＣＧＴａｓｅとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１９】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品と、イソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【符号の説明】
【００１４】
図１及び図１５〜１９において、
イ：分子量１０００，０００ダルトン（グルコース重合度約６，２００）に相当する溶出位置
ロ：分子量１００，０００ダルトン（グルコース重合度約６２０）に相当する溶出位置
ハ：分子量１０，０００ダルトン（グルコース重合度約６２）に相当する溶出位置
ニ：分子量１，０００ダルトン（グルコース重合度約６）に相当する溶出位置
ホ：分子量１００ダルトンに相当する溶出位置
図１において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：グルカンＡのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：グルカンＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
１：グルコース重合度４９９に相当する位置
２：グルコース重合度６．３に相当する位置
３：グルコース重合度３８４に相当する位置
４：グルコース重合度２２．２に相当する位置
５：グルコース重合度１０．９に相当する位置
６：グルコース重合度１に相当する位置
７：グルコース重合度４３３に相当する位置
８：グルコース重合度２２．８に相当する位置
９：グルコース重合度１０．９に相当する位置
１０：グルコース重合度１に相当する位置
図２において、
１：澱粉部分分解物の模式図
２：本発明の分岐α−グルカンの模式図
ａ：非還元末端グルコース残基
ｂ：α−１，３結合しているグルコース残基
ｃ：α−１，４結合しているグルコース残基
ｄ：α−１，６結合しているグルコース残基
ｅ：α−１，３，６結合しているグルコース残基
ｆ：α−１，４，６結合しているグルコース残基
斜め向き破線：α−１，３結合
横向き実線：α−１，４結合
縦向き実線：α−１，６結合
図１３において、
●：カルシウムイオン非存在下
○：１ｍＭカルシウムイオン存在下
図１５において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１６において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１７において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１８において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１９において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で言うグルカンとは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度３以上のオリゴ糖ないしは多糖を意味する。本発明の分岐α−グルカンは、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカン、詳細には、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする。
【００１６】
本発明でいうメチル化分析とは、多糖又はオリゴ糖においてこれを構成する単糖の結合様式を決定する方法として一般的に知られている方法である。メチル化分析をグルカンにおけるグルコースの結合様式の分析に用いる場合、まず、グルカンを構成するグルコース残基における全ての遊離の水酸基をメチル化し、次いで、完全メチル化したグルカンを加水分解する。次いで、加水分解により得られたメチル化グルコースを還元してアノマー型を消去したメチル化グルシトールとし、さらに、このメチル化グルシトールにおける遊離の水酸基をアセチル化することにより部分メチル化グルシトールアセテート（以下、本明細書では、「部分メチル化グルシトールアセテート」におけるアセチル化された部位と「グルシトールアセテート」の表記を省略して、「部分メチル化物」と略称する場合がある。）を得る。得られる部分メチル化物を、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、グルカンにおいて結合様式がそれぞれ異なるグルコース残基に由来する各種部分メチル化物は、ガスクロマトグラムにおける全ての部分メチル化物のピーク面積に占めるピーク面積の百分率（％）で表すことができる。そして、このピーク面積％から当該グルカンにおける結合様式の異なるグルコース残基の存在比、すなわち、各グルコシド結合の存在比率を決定することができる。本願明細書においては、部分メチル化物についての「比」は、メチル化分析のガスクロマトグラムにおけるピーク面積の比を意味し、部分メチル化物についての「％」はメチル化分析のガスクロマトグラムにおける「面積％」を意味するものとする。
【００１７】
上述した（１）における、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，６−トリメチル化物」と略称する）とはＣ−４位が１，４結合にあずかるグルコース残基を意味し、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，４−トリメチル化物」と略称する）はＣ−６位が１，６結合にあずかるグルコース残基を意味する。そして、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある」とは、すなわちメチル化分析における部分メチル化グルシトールアセテートのガスクロマトグラムにおいて、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計に対するＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の割合が３７．５乃至８０．０％の範囲を示すことを意味する。
【００１８】
上述した（２）における、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との合計が部分メチル化物の６０％以上を占める」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計がグルカンを構成する全グルコース残基の６０％以上を占めることを意味する。
【００１９】
同様に、上述した（３）における、「２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトール」（以下、「２，４，６−トリメチル化物」と略称する）とは、Ｃ−３位が１，３結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４，６−トリメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上１０％未満である」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位のみが結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上１０％未満存在することを意味する。
【００２０】
さらに同様に、上述した（４）における「２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトール」（以下、「２，４−ジメチル化物と略称する」）とは、Ｃ−３位及びＣ−６位の両方がそれぞれ１，３結合と１，６結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４−ジメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上である」とは、本発明の分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位とＣ−６位が結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上存在することを意味する。
【００２１】
上記の（１）乃至（４）の条件を全て充足する本発明の分岐α−グルカンは、これまで知られていない新規なグルカンである。本発明の分岐α−グルカンは、メチル化分析において、上記（１）乃至（４）の条件を充足する限り、グルコース残基の結合順序は特に限定されない。
【００２２】
本発明の分岐α−グルカンは、通常、グルコース重合度が１０以上の様々なグルコース重合度を有する分岐α−グルカンの混合物の形態にある。また、本発明の分岐α−グルカンにおいて、その重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は、通常、２０未満である。
【００２３】
さらに、本発明の分岐α−グルカンは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−１，２、α−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれの結合であっても加水分解する特徴を有するイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させると、消化物の固形物当たりイソマルトースを、通常、２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００２４】
また、本発明の分岐α−グルカンは、平成８年５月厚生省告示第１４６号の栄養表示基準、「栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）」における第８項、「食物繊維」に記載された、「高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）」に準じて水溶性食物繊維含量を求めると、水溶性食物繊維を、通常、４０質量％以上含有する。上記高速液体クロマトグラフ法（以下、本明細書では「酵素−ＨＰＬＣ法」と略称する）の概略を説明するならば、試料を熱安定α−アミラーゼ、プロテアーゼ及びアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）による一連の酵素処理により分解処理し、イオン交換樹脂により処理液から蛋白質、有機酸、無機塩類を除去することにより高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の試料溶液を調製する。次いで、ゲル濾過ＨＰＬＣに供し、クロマトグラムにおける、未消化グルカンとグルコースのピーク面積を求め、それぞれのピーク面積と、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法により求めておいた試料溶液中のグルコース量を用いて、試料の水溶性食物繊維含量を算出する方法である。本法の詳細については後述の実験の項で説明する。
【００２５】
本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験１９に示すように、経口摂取しても唾液α−アミラーゼ、膵液α−アミラーゼや小腸粘膜α−グルコシダーゼによる分解を受け難いことから、消化吸収されにくく、血糖を急激に上昇させたり、インスリンの分泌を刺激することの少ない、低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。また、当該分岐α−グルカンは、口腔内の微生物によって、酸発酵を起こし難く、スクロースと併用した場合にも歯垢の原因となる不溶性デキストランの生成を抑制する作用を有しているので、低う蝕性又は抗う蝕性糖質としても有利に利用できる。さらに、本発明の分岐α−グルカンは、マウスを用いた急性毒性試験において、何ら毒性を示さないグルカンである。
【００２６】
さらに、本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験２０及び２１に示すように、通常の澱粉質とともに摂取すると、澱粉質のみを摂取した場合に比べ、血糖値やインスリン量の上昇を抑制することから、血糖上昇抑制剤として使用することもできる。
【００２７】
またさらに、本発明の分岐α−グルカンは、後述する実験２２に示すように、摂取することにより生体内の脂質の過剰な蓄積を抑制する作用をも有していることから、生体内脂質低減剤として使用することもできる。
【００２８】
本発明の分岐α−グルカンを上記血糖抑制剤や生体内脂質低減剤として用いる場合、分岐α−グルカンは、水溶性食物繊維含量が高いものほど作用効果に優れていることから、水溶性食物繊維として、通常、４０質量％以上、望ましくは、５０質量％以上、さらに望ましくは、６０質量％以上含有するものが好適に利用できる。
【００２９】
本発明でいうα−グルコシル転移酵素とは、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、実質的に加水分解することなくα−グルコシル転移を触媒することにより、本発明の分岐α−グルカンを生成する酵素を意味する。本発明のα−グルコシル転移酵素は、加水分解活性が弱い点、低濃度から高濃度まで基質溶液の濃度に依存せず効率の良い転移活性を有する点、及び、α−１，３及びα−１，３，６結合をも生成する点で、従来公知の真菌由来α−グルコシダーゼや酢酸菌由来デキストリンデキストラナーゼとは異なる酵素である。
【００３０】
本発明のα−グルコシル転移酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。マルトースを最終濃度１ｗ／ｖ％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液５ｍｌに、酵素液０．５ｍｌを加え４０℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．５ｍｌと５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコース・オキシダーゼ法で測定し、反応によって生成したグルコース量を算出する。α−グルコシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００３１】
本発明のα−グルコシル転移酵素の１つの具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定；
【００３２】
本発明のα−グルコシル転移酵素の別の具体例としては、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、約５０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定；
【００３３】
本発明のα−グルコシル転移酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として微生物が挙げられ、とりわけ、本発明者らが土壌より単離した微生物ＰＰ７１０株又はＰＰ３４９株が好適に用いられる。以下、本発明のα−グルコシル転移酵素の産生能を有する微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株の同定試験において判明した菌学的諸性質を表１及び２にそれぞれ示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
以上の菌学的性質に基づき、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）、及び、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株と公知菌との異同をそれぞれ検討した。その結果、微生物ＰＰ７１０株は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属する微生物であり、微生物ＰＰ３４９株は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。本発明者等は、これら２菌株をそれぞれ、新規微生物バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９と命名し、いずれも平成１８年２月１日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、それぞれ受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０として受託された。本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物には、上記菌株はもとより、上記菌株に突然変異を誘発し、選抜して得られる酵素高産生変異株なども包含される。
【００３７】
本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のα−グルコシル転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３８】
本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００３９】
このようにしてα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養した後、本発明のα−グルコシル転移酵素を含む培養物を回収する。α−グルコシル転移酵素活性は、培養微生物がバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）のいずれの場合も、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液はそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００４０】
さらに、α−グルコシル転移酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、α−グルコシル転移酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００４１】
上記のように本発明のα−グルコシル転移酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、調製用電気泳動などの方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。
【００４２】
本発明のα−グルコシル転移酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、及びマルトース以上のマルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレーテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下、本明細書では「ＣＧＴａｓｅ」と略称する）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。さらには、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させることも随意である。澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよい。澱粉から本発明のグルカンを製造するに際しては、上記のような原料澱粉を、通常、糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。さらに、本発明のα−グルコシル転移酵素の基質は、エーテル化澱粉（ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、酢酸澱粉など）、エステル化澱粉（リン酸化澱粉、オクテニルコハク酸澱粉など）及び架橋澱粉（アセチル化アジピン酸架橋澱粉、リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉など）など、澱粉の一部を化学的方法により誘導体化した化工澱粉であってもよい。
【００４３】
本発明のα−グルコシル転移酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．５％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のα−グルコシル転移酵素の反応は進行して分岐α−グルカンを生成する。工業的には、基質濃度は１％（ｗ／ｖ）以上、望ましくは５乃至６０％（ｗ／ｖ）、更に望ましくは、１０乃至５０％（ｗ／ｖ）の範囲から選ばれる濃度が好適であり、この条件下で、本発明の分岐α−グルカンを有利に生成させることができる。反応温度は反応が進行する温度、すなわち６０℃付近までの温度で行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至８の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００４４】
例えば、澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に、本発明のα−グルコシル転移酵素を作用させた場合の分岐α−グルカンの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらも、α−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明の分岐α−グルカンを生成する。
【００４５】
また、本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有するバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）は、その培養物中に本発明のα−グルコシル転移酵素のみならず、ある種のアミラーゼをも同時に産生し、意外にも、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用してマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると、α−グルコシル転移酵素を単独で作用させた場合よりも水溶性食物繊維含量を更に高めた分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【００４６】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）が産生するアミラーゼとしては、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（１）作用
澱粉を加水分解するとともにグリコシル基の転移を触媒し、シクロデキストリンをも生成する。プルランを加水分解しパノースを生成する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、５８，０００±１０，０００ダルトン；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５５℃；
（４）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下で６乃至７；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定、
ｐＨ６．０、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下で５０℃まで安定；及び
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ６．０〜８．０の範囲で安定；
【００４７】
本発明のα−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させた場合に得られる分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量が、α−グルコシル転移酵素のみを用いて調製した分岐α−グルカンの場合よりも高い理由としては、α−グルコシル転移酵素の作用で生成する分岐α−グルカンに対し、アミラーゼがさらにグリコシル基を転移し、グルカンにおける分岐の程度（頻度）をさらに高めたものと推察される。
【００４８】
また、酵素反応によって本発明の分岐α−グルカンを調製する際、他の公知のアミラーゼを併用して反応させることにより、分岐α−グルカンの分子量分布を調節することも、また、消化性をさらに低減した分岐α−グルカンにすることも、さらには還元力を低減することも有利に実施できる。例えば、澱粉液化液に、本発明のα−グルコシル転移酵素とともに、α−アミラーゼやＣＧＴａｓｅなど、澱粉の内部のα−１，４結合を加水分解し、新たな非還元末端グルコース残基を生じさせる酵素を併用して作用させることにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させ消化性の低減に寄与するα−１，３、α−１，６及びα−１，３，６結合の割合をさらに増加させることも有利に実施できる。また、イソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を併用することにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させたり、特開平７−１４３８７６号公報などに開示された非還元性糖質生成酵素（別名：マルトオリゴシルトレハロース生成酵素（ＥＣ ５．４．９９．１５））を併用することにより、還元末端部分を部分的にトレハロース構造に変換して還元力を低減させることも有利に実施できる。
【００４９】
また、本発明の分岐α−グルカンは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含有する栄養培地で、本発明のα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生成する分岐α−グルカンを採取することによっても製造することができる。
【００５０】
上記の反応又は培養によって得られた分岐α−グルカンは、そのまま分岐α−グルカン製品とすることもできる。また、必要に応じて、反応液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、可消化部分を加水分解した後、非消化部分を分画により回収したり、酵母などを用いた発酵処理によりグルコースをはじめとする分解物を除去したりすることにより、消化性のさらに低減した分岐α−グルカンを調製することもできる。一般的には、分岐α−グルカンを含有する反応液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００５１】
本発明のα−グルコシル転移酵素は、糊化澱粉や比較的低ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、好ましくはＤＥ２０未満の澱粉部分分解物に作用させた場合、グルコースやマルトースなどの低分子オリゴ糖をほとんど生成しないので、得られる反応生成物をカラムクロマトグラフィーなどの精製手段で精製する必要は特にないものの、用途など目的に応じてさらに分画することも随意である。分画にイオン交換クロマトグラフィーを採用する場合、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを有利に用いることができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００５２】
このようにして得られた本発明の分岐α−グルカンは溶液のまま利用できるものの、保存に有利で、且つ、用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末品とするのが望ましい。乾燥には、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法を用いることができる。乾燥物は、必要に応じて、粉砕し粉末化することも、篩別又は造粒して、特定粒度の範囲に整えることも有利に実施できる。
【００５３】
また、本発明の分岐α−グルカンは、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘度付与性、接着性、他の糖の結晶防止性、難発酵性などの性質を具備している。従って、本発明の分岐α−グルカン又はこれを含む糖質は、水溶性食物繊維、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５４】
本発明の分岐α−グルカンは、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような甘味料と、また、デキストリン、澱粉、デキストラン、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５５】
また、本発明の分岐α−グルカンの粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５６】
また、本発明の分岐α−グルカンは、経口摂取しても消化され難いので、水溶性食物繊維として一般の飲食物などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬などの漬物類、たくわん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物に配合可能な水溶性食物繊維として有利に利用できる。
【００５７】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などとして整腸、便秘の改善、肥満の防止目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などの形態で嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への品質改良剤、安定化剤などとして有利に利用できる。
【００５８】
品質改良剤、安定化剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、本発明の分岐α−グルカンを品質改良剤、安定化剤として用いることにより、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００５９】
以上、述べたような各種組成物に、本発明の分岐α−グルカンを含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程において含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、組成物の、通常、０．１質量％以上、望ましくは、１質量％以上含有せしめるのが好適である。
【００６０】
また、本発明のα−グルコシル転移酵素は、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含んでなる組成物に作用させると、α−１，４グルカンを本発明の分岐α−グルカンに変換することから、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含んでなる組成物の改質剤として用いることもできる。
【００６１】
さらに、本発明のα−グルコシル転移酵素は、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると本発明の分岐α−グルカンを生成し、一方、本発明の分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）により消化するとイソマルトースが基質固形物当たり２５質量％以上５０質量％以下生成することから、本発明のα−グルコシル転移酵素をマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを原料として、これら２段階の酵素反応により、イソマルトース又はこれを含む糖質を製造することができる。
【００６２】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００６３】
＜実験１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
＜実験１−１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社販売）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６４】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除去し、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、２．８単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約２０ｍｌを得た。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．１８Ｍ付近から０．４５Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６５】
＜実験１−２：α−グルコシル転移酵素を用いた分岐α−グルカンの調製＞
実験１−１で得たα−グルコシル転移酵素標品１００ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８５．８％の収率で得た。
【００６６】
＜実験２：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
【００６７】
＜実験２−１：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験１−１と同様に培養したものを種培養とした。
【００６８】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、０．５３単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．０５Ｍ付近から０．２Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６９】
＜実験２−２：α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
実験２−１で得たα−グルコシル転移酵素標品２０ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８３．６％の収率で得た。
【００７０】
以下の実験３及び４では、実験１−２で得たグルカンと実験２−２で得たグルカンを区別する目的で、それぞれを「グルカンＡ」及び「グルカンＢ」と呼称する。
【００７１】
＜実験３：グルカンＡ及びＢの水溶性食物繊維としての評価＞
得られたグルカンの水溶性食物繊維含量を、栄養表示基準（平成８年５月厚生省告示第１４６号）における栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）、８．食物繊維、（２）高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）記載の方法に準じて下記の方法により調べた。酵素処理用のキットとして、総食物繊維測定キット（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ，Ｔｏｔａｌ，Ａｓｓａｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ、シグマ社製）を用いた。また、グルカンＡ及びＢの調製に用いた基質である澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を対照１とし、市販の難消化性グルカン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）を対照２として、同様にそれぞれの水溶性食物繊維含量を調べた。
【００７２】
＜分析用試料溶液の調製＞
被験試料として固形分０．１ｇのグルカンを試験管にとり、０．０８Ｍリン酸緩衝液５ｍｌを添加しｐＨを６．０に調整した。これに、食物繊維測定キット付属の熱安定α−アミラーゼ（バチルス・リケニホルミス由来耐熱性α−アミラーゼ、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、沸騰水浴中で５分毎に攪拌しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られた反応液に、０．２７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液約１ｍｌを添加しｐＨを７．５に調整した後、キット付属のプロテアーゼ（バチルス・リケニホルミス由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られたプロテアーゼ処理液に０．３２５Ｍ塩酸を約１ｍｌ添加し、ｐＨを４．３に調整した後、キット付属のアミログルコシダーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。次いで、得られた反応液約７ｍｌを、イオン交換樹脂（オルガノ株式会社販売のアンバーライトＩＲＡ−６７（ＯＨ型）とアンバーライト２００ＣＴ（Ｈ型）を１：１で混合）にＳＶ１．０で通液することにより脱塩し、さらに約３倍量の脱イオン水にて溶出し、溶出液の総量を約２８ｍｌとした。得られた溶出液をエバポレーターにて濃縮し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過した後、メスフラスコで２５ｍｌに定容したものを分析用試料溶液とした。
【００７３】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
上記で得られた分析用試料溶液は、下記の条件による高速液体クロマトグラフィーに供した。
カラム ：ＴＧＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×長さ３００ｍｍ，株式会社東ソー製）２本を直列に連結したもの
溶離液 ：脱イオン水
試料糖濃度：０．８質量％
カラム温度：８０℃
流 速 ：０．５ｍｌ／分
検 出 ：示差屈折計
注入量 ：２０μｌ
分析時間：５０分
【００７４】
＜被験試料の水溶性食物繊維含量の算出＞
上記で得られたクロマトグラムにおいて、酵素処理によっても分解されずに残存する未消化グルカンを水溶性食物繊維とした。この水溶性食物繊維と分解されて生成したグルコースのピーク面積をそれぞれ求め、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法にて定量した分析用試料溶液中のグルコース量を用いて、下記の式１により水溶性食物繊維量を求めた。さらに、下記の式２により被験試料の水溶性食物繊維含量を求めた。
【００７５】
式１：
【数１】
【００７６】
式２：
【数２】
【００７７】
上記の酵素−ＨＰＬＣ法により求めたグルカンＡ及びグルカンＢの水溶性食物繊維含量はそれぞれ４２．１質量％及び４１．８質量％であった。一方、対照１の澱粉部分分解物は酵素処理により全てグルコースにまで分解され、水溶性食物繊維含量は０質量％と評価された。また、対照２の市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）のそれは４８．７質量％であった。これらの結果は、水溶性食物繊維を含まない澱粉部分分解物を基質として本発明のα−グルコシル転移酵素を作用させることにより、市販の難消化性デキストリンとほぼ同等の水溶性食物繊維含量を示すグルカンを容易に調製できることを示している。
【００７８】
＜実験４：グルカンＡ及びＢの構造解析＞
＜実験４−１：メチル化分析＞
実験１−２及び２−２の方法で得たグルカンＡ及びＢについて、常法に従って、メチル化分析を行い、下記の条件によるガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。結果を表３にまとめた。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
カラム ：ＤＢ−５ キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ×膜厚１μｍ，Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス ：ヘリウム
カラム温度：１３０℃で２分間保持した後、２５０℃まで５℃／分で昇温し、２５０℃で２０分間保持
流 速 ：１．０ｍｌ／分
検 出 ：ＦＩＤ
注入量 ：３μｌ（スプリット１／３０）
分析時間：４６分
【００７９】
【表３】
【００８０】
表３の結果から明らかなように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素によりそれぞれ調製したグルカンＡ及びＢのメチル化分析の結果を、基質である澱粉部分分解物のそれと比較すると、いずれのグルカンの場合も、２，３，６−トリメチル化物が著しく減少しており、一方、２，３，４−トリメチル化物が３０％以上まで著しく増加していた。このことは、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の反応によって、グルコースが主としてα−１，４結合によって重合した構造を有する澱粉部分分解物が、α−１，６結合を３０％以上含む分岐α−グルカンに変換されたことを物語っている。また、２，３，４，６−テトラメチル化物、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物が増加していることから、非還元末端グルコース、α−１，３結合及びα−１，３，６結合が新たに生成していることも判明した。グルカンＡの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ１．１％及び０．８％であり、グルカンＢの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ０．９％及び１．１％であった。さらに、グルカンＡ及びＢにおいて、２，３−ジメチル化物の存在比は基質とほとんど差がないことから、基質に元々存在する分岐であるα−１，４，６結合に大きな変化はないと考えられた。この結果から、グルカンＡ及びＢは、基質である澱粉部分分解物とは大きく異なり、グルコースの結合様式がα−１，４結合及びα−１，６結合を主体とし、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも僅かに有する分岐グルカン（分岐α−グルカン）であることが判明した。なお、分岐α−グルカンＡ及びＢを構成するグルコースの１位のアノマー型は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、全てα型であることが判明した。
【００８１】
＜実験４−２：分岐α−グルカンＡ及びＢのイソマルトデキストラナーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ及びＢの構造を特徴づける目的で、イソマルトデキストラナーゼ消化試験を行った。分岐α−グルカンＡ及びＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアルスロバクター・グロビホルミス由来のイソマルトデキストラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所内にて調製）を基質固形物１グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その反応液中の糖組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）及びガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略称する）を用いて調べた。ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ』（株式会社三菱化学製造）２本を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。ＧＣは、常法に従って糖質をトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）した後、カラムに『２％シリコンＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＳ』（株式会社ジー・エル・サイエンス製造）を用い、１分間当たり７．５℃の昇温速度で温度１６０℃から３２０℃まで昇温した。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、検出はＦＩＤ法にて行った。イソマルトデキストラナーゼ消化において、分岐α−グルカンの調製に用いた基質である澱粉部分分解物からはイソマルトースが全く生成しなかったのに対し、分岐α−グルカンＡからは糖組成として２８．４質量％のイソマルトースが、また、分岐α−グルカンＢからは糖組成として２７．２質量％のイソマルトースが、それぞれ生成した。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがイソマルトース構造をそれぞれ、少なくとも２８．４質量％及び２７．２質量％程度含んでいることを示しており、分岐α−グルカンではα−１，６結合の割合が増加していることを示した実験４−１におけるメチル化分析の結果を支持するものである。なお、イソマルトデキストラナーゼは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−グルコシド結合であれば、それがα−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれであっても加水分解する特異性を有していることから、得られたイソマルトースが分岐α−グルカンＡ及びＢにおいてどのような結合様式で結合しているのか、その詳細は不明である。
【００８２】
＜実験４−３：分岐α−グルカンＡ及びＢのα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ又はＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼアマノＬ』、天野エンザイム製）及びリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来グルコアミラーゼを同時に作用させ消化試験を行った。基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを５，０００単位とグルコアミラーゼを１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その酵素反応液の糖組成を実験４−２と同じ条件でＨＰＬＣを用いて調べた。その結果、グルカンＡ及びＢはいずれも、基質である澱粉部分分解物の場合と同様に、実質的に全てグルコースにまで分解された。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがいずれもグルコースを構成糖とするα−グルカンであることを示すものである。
【００８３】
＜実験４−４：分子量分布分析＞
分岐α−グルカンＡ及びＢについて、分子量分布を常法のゲル濾過ＨＰＬＣ法にて分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣは、カラムに『ＴＳＫ ＧＥＬ α−Ｍ』（株式会社東ソー製）を２本連結したものを用い、溶離液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。なお、試料中のグルカンの分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原生物化学研究所販売）を同様にゲル濾過分析に供して作成した分子量の検量線に基づき算出した。図１に分岐α−グルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム（図１における符号ｂ及びｃ）を、基質として用いた澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』）のそれ（図１における符号ａ）と比較しつつ、それぞれ示した。なお、図１における符号イ、ロ、ハ、ニ及びホは、それぞれ、分子量１，０００，０００（グルコース重合度約６，２００に相当）、１００，０００（グルコース重合度約６２０に相当）、１０，０００（グルコース重合度約６２に相当）、１，０００（グルコース重合度約６に相当）及び１００ダルトン、に相当する溶出位置を意味する（後述する図１５乃至１９においても同様）。また、ゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づき各試料の分子量分布を分析した結果を表４に示した。
【００８４】
【表４】
【００８５】
基質として用いた澱粉部分分解物が、分子量分布分析においてグルコース重合度４９９及び６．３に相当する位置に２つのピーク（図１のクロマトグラムａにおける符号１及び２）を有する糖質混合物であるのに対して、分岐α−グルカンＡは、グルコース重合度３８４、２２．２、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｂにおける符号３、４、５及び６）を有する糖質の混合物、また、分岐α−グルカンＢは、グルコース重合度４３３、２２．８、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｃにおける符号７、８、９及び１０）を有する糖質の混合物であった。符号６及び１０のピークはグルコースに相当するものの、その含量はごく僅かであることから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来酵素の加水分解作用は僅かであることがわかる。表４から明らかなように、基質である澱粉部分分解物に比べ、グルカンＡ及びＢの数平均分子量及び重量平均分子量は共に６０％程度に減少しており、全体として低分子化していた。また、分子量分布の拡がりの指標である重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が澱粉部分分解物とグルカンＡ及びＢ間でそれほど変化していないことから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素は、澱粉部分分解物の非還元末端にのみ作用していると考えられた。
【００８６】
表３の結果から、基質として用いた澱粉部分分解物においてはグルコースの結合様式の約９０％がα−１，４結合であり、わずかにα−１，４，６結合を有しているのに対し、グルカンＡ及びＢは、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合が極めて高く、α−１，４，６結合に加えて、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも有する分岐を有するグルカンであることが判明した。このような構造を有する分岐α−グルカンはこれまで全く知られていない。
【００８７】
メチル化分析の結果に基づいて本発明の分岐α−グルカンの構造を推定し、その構造を模式的に示した図を基質である澱粉部分分解物のそれとともに図２に示した。図２中、符号１及び２は、それぞれ原料澱粉部分分解物及び本発明の分岐α−グルカンの模式図である。なお、図２において、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆはそれぞれ、澱粉部分分解物または本発明の分岐α−グルカンにおける、非還元末端グルコース残基、α−１，３結合しているグルコース残基、α−１，４結合しているグルコース残基、α−１，６結合しているグルコース残基、α−１，３，６結合しているグルコース残基及びα−１，４，６結合しているグルコース残基を意味している。また、同模式図におけるグルコース間の斜め破線、横実線及び縦実線はそれぞれ、α−１，３結合、α−１，４結合及びα−１，６結合を意味している。
【００８８】
＜実験５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０株由来α−グルコシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００８９】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約２．７単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約２．６単位／ｍｌであった。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０によって生産される本発明のα−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００９０】
＜実験６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験５で得た培養上清のうち、約４Ｌ（総活性約１０，４００単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約６５ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約７４単位／ｍｌであった（総活性約４，７８０単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量９ｍｌ）に供した。本発明のα−グルコシル転移酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３．３ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表５に示す。
【００９１】
【表５】
【００９２】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００９３】
＜実験７：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験７−１：分子量＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【００９４】
＜実験７−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３であることが判明した。
【００９５】
＜実験７−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示した。図５及び図６から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素は４０℃まで安定であり、また、ｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定であった。
【００９６】
＜実験７−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
表６の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【００９９】
＜実験８：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験５と同様に培養して種培養とした。
【０１００】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至７．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約０．３６単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約０．４２単位／ｍｌであった。アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９によって生産される本α−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【０１０１】
＜実験９：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験８で得た培養上清約１８Ｌ（総活性約７，５６０単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、遠心分離して不溶物を除き、粗酵素液約５００ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約１４単位／ｍｌであった（総活性約７，０００単位）。この粗酵素液に終濃度２Ｍとなるように硫安を添加し、遠心分離して不溶物を除き、２Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、ゲルに吸着し、硫安濃度２Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．６Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表７に示す。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１０４】
＜実験１０：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験１０−１：分子量＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１０５】
＜実験１０−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図７（至適温度）及び図８（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約５０℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０であることが判明した。
【０１０６】
＜実験１０−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験９方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図９（温度安定性）及び図１０（ｐＨ安定性）に示した。図９及び図１０から明らかなように、本発明のアルスロバクター・グロビホルミス由来α−グルコシル転移酵素は、４０℃まで安定であり、ｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１０７】
＜実験１０−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験９の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１０８】
【表８】
【０１０９】
表８の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【０１１０】
＜実験１１：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本発明のα−グルコシル転移酵素の基質特異性を調べた。メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、グルコース、スクロース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトトリオース又はイソパノースを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、基質濃度を１ｗ／ｖ％になるように調製し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、加熱することにより糖質を検出した。ＴＬＣにおける基質糖質以外の反応生成物の生成の有無を調べ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表９に示す。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素についても基質特異性を同様にして調べた結果、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素と同様であった。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
表９の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、ニゲロース、イソマルトース、ネオトレハロース、イソマルトトリオース、イソパノースに作用した。さらに、コージビオースにも僅かに作用した。作用した糖質からは、いずれも分解生成物と共に、糖転移生成物も認められた。一方、本発明のα−グルコシル転移酵素は、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、トレハロース、セロビオース、スクロース、ラクトースなどには作用が認められなかった。これらの結果及び本α−グルコシル転移酵素が澱粉部分分解物に作用し分岐α−グルカンを生成することより、本酵素はマルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカン又はグルコースから構成されるα−グルコオリゴ糖に幅広く作用することが判明した。
【０１１３】
＜実験１２：作用メカニズム＞
本発明のα−グルコシル転移酵素の作用メカニズムを検討するため、最小の基質であるマルトースに作用させた場合の生成糖の構造を調べた。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であった。本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１１４】
＜実験１２−１：マルトースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ及びＧＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。結果を表１０に示す。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
表１０の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、本発明のα−グルコシル転移酵素の作用により、基質マルトースから、主としてグルコース、マルトトリオース及びパノースが生成した。さらに反応２時間及び４時間からグルコース重合度４及び５のオリゴ糖が生成した。反応が進むと、マルトトリオースは反応２時間（１４．４％）をピークに、また、パノースは反応４時間（２９．３％）をピークに減少し、その減少とともにイソマルトースの増加が認められた。さらに、反応４８時間までイソマルトース及び重合度４以上のオリゴ糖の増加が認められた。
【０１１７】
これらの結果から推察すると、本発明のα−グルコシル転移酵素はマルトースに作用し、反応初期において、α−１，４グルコシル転移とα−１，６グルコシル転移の両グルコシル転移を触媒することにより、グルコース、マルトトリオース及びパノースを生成し、反応の進行にともない、グルコースにα−１，６グルコシル転移したイソマルトースや、そのイソマルトースにα−１，４グルコシル転移及びα−１，６グルコシル転移したイソパノース及びイソマルトトリオースが生成することがわかった。本実験においては、多種類存在する重合度４以上のオリゴ糖を同定することは困難であることから、実験１２−２において、マルトースより重合度の高いマルトペンタオースを基質として、さらに反応メカニズムを解析した。
【０１１８】
＜実験１２−２：マルトペンタオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。また、酵素反応液について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。生成する部分メチル化物の組成からグルコースの結合様式における各グルコシド結合の存在比を求めた。また、実験４−２と同様にイソマルトデキストラナーゼ消化試験も行った。反応中の糖組成の変化を表１１に、反応生成物のメチル化分析とイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表１２に示す。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
【表１２】
【０１２１】
表１１及び１２の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、基質マルトペンタオースから、基質よりグルコース重合度が１小さいオリゴ糖とグルコース重合度が１大きいオリゴ糖が優先的に生成したことから、本酵素がグルコシル転移を触媒していることが確認された。さらに反応が進むと、種々のグルコース重合度を有する反応生成物が生成し、反応２４時間後には、グルコース重合度９以上のグルカンが２１．１％にも達した。メチル化分析の結果から、反応が進行するにつれて、反応生成物においては１，４結合したグルコース残基が減少するとともに、１，６結合したグルコース残基が顕著に増加し、また、１，３結合したグルコース残基、１，４，６結合したグルコース残基及び１，３，６結合したグルコース残基が徐々に増加することが判明した。また、イソマルトデキストラナーゼ消化後の糖組成におけるイソマルトース含量もまた、反応の進行とともに顕著に増加することが判明した。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２２】
実験１２−１及び１２−２の結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらもα−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明の分岐α−グルカンを生成する。
【０１２３】
＜実験１３：α−グルコシル転移反応と反応液の還元力の変化＞
マルトース水溶液（最終濃度１又は３０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形物１グラム当たり４単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。反応液中に残存するマルトース量を実験４−２に記載のＨＰＬＣ法及びＧＣ法で定量した。また、酵素反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で定量し、次式、 還元力＝（還元糖量／全糖量）×１００ で還元力を算出した。結果を表１３に示す。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
表１３の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素をマルトースに作用させたところ、マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低い場合には、ごく僅かな還元力の増加が認められ、また、マルトース濃度が３０ｗ／ｖ％と比較的高い場合には、ほとんど反応液の還元力の増加は認められなかった。マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低く、且つ、マルトースの残存量が１０％以下の場合においても反応液の還元力の増加がごく僅かであることは、本発明のα−グルコシル転移酵素は本質的に転移反応を触媒する酵素であり、反応に際してほとんど加水分解を行わないことを意味している。本発明のα−グルコシル転移酵素は効率良くα−グルコシル転移を行う酵素であることがわかった。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２６】
＜実験１４：分岐α−グルカンの生成における精製α−グルコシル転移酵素と粗酵素の比較＞
分岐α−グルカンの工業的生産を考慮した場合、α−グルコシル転移酵素の粗酵素が使用できれば酵素を精製する手間と労力が省けることとなり、より好適である。そこで、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて、実験１−２で調製したグルカンＡと同等の分岐α−グルカンが得られるか否かを検討した。実験１−１に記載した方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０を培養し、培養上清を硫安塩析し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析したものをα−グルコシル転移酵素の粗酵素液とした。この粗酵素液を実験１−２に記載した方法で澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）に作用させ、固形分濃度３０％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８８．２％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンを「グルカンＣ」と名付け、そのメチル化分析を行った結果を表１４に、また、実験４及び実験３に記載した方法によって分子量分布及び水溶性食物繊維含量を測定した結果を表１５にそれぞれ示す。なお、表１４及び表１５には、比較のため表３及び表４より調製の原料とした澱粉部分分解物と部分精製α−グルコシル転移酵素を用いて調製したグルカンＡのデータをそれぞれ再掲した。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
表１４に示すように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて調製したグルカンＣは、意外にも、メチル化分析において、非還元末端グルコース残基に相当する２，３，４，６−テトラメチル化物と、α−１，６結合したグルコース残基に相当する２，３，４−トリメチル化物の含量がグルカンＡに比べ増加していた。この結果は、グルカンＣにはグルカンＡに比べて非還元末端が多く、また、α−１，６結合がより多く存在することを物語っている。さらに、グルカンＣでは２，４−ジメチル化物が４．８％と、グルカンＡの０．８％に比べ増加していた。この結果は、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基が増加していることを示している。
【０１３０】
また、表１５から明らかなように、グルカンＣは、グルカンＡに比べ数平均分子量及び重量平均分子量がいずれも小さく（グルコース重合度が小さく）、遙かに高い水溶性食物繊維含量を示した。この結果は、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素には、α−グルコシル転移酵素とは相違する他の酵素が混在しており、その混在酵素が分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に寄与していることを示唆するものである。
【０１３１】
＜実験１５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在する酵素の同定と単離・精製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在し、分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に関与する酵素を同定し、単離・精製する実験を行った。
【０１３２】
＜実験１５−１：混在する酵素の同定と活性測定＞
実験１−１と同じ方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を培養し、得られた培養上清約３Ｌを硫安塩析した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に対して透析して得た透析液約４０ｍｌを粗酵素液とした。この粗酵素液を、２ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液又は２ｗ／ｖ％プルラン溶液にｐＨ６．０、４０℃で１６時間作用させ、１００℃、１０分間加熱して反応を停止させた後、縦１０ｃｍ、横２０ｃｍのシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）ＴＬＣプレートを用いたＴＬＣに供した。展開溶媒としてｎ−ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）を用いて２回展開を行い、２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、１００℃で５分間加熱して生成物のスポットを検出した。その結果、可溶性澱粉からは、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の生成が、また、プルランからは僅かなイソマルトースとパノースの生成が認められた。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）のα−グルコシル転移酵素の粗酵素には澱粉を分解し、さらにプルランをも分解するアミラーゼが混在していることが判明した。
【０１３３】
混在するアミラーゼの活性は、以下のようにして測定した。すなわち、短鎖アミロース（商品名「アミロースＥＸ−Ｉ」、株式会社林原生物化学研究所販売、平均重合度１７）を最終濃度１ｗ／ｖ％となるように１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液２ｍｌに、酵素液０．２ｍｌを加え３５℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．２ｍｌを８ｍｌの０．０２Ｎ硫酸溶液に混合し、反応停止させた後、０．２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、２５℃で１５分間保持した後に６６０ｎｍの吸光度を測定する。別途反応０時間の反応液について同様に測定し、反応時間当たりのヨウ素呈色の減少を測定する。アミラーゼの活性１単位は、上記の条件下で２０ｍｇの短鎖アミロースの６６０ｎｍにおける吸光度（ヨウ素呈色）を１０％低下させる酵素量の１０倍量と定義した。
【０１３４】
＜実験１５−２：混在アミラーゼの単離・精製＞
実験１５−１で調製した粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。アミラーゼ活性を有する画分は、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１．５Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、ファルマシアバイオテク製『リソース ＰＨＥ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。目的のアミラーゼ活性を有する画分は、１．５Ｍ硫安、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース ＰＨＥ』ゲルに吸着し、硫安濃度１．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、濃縮した後、ファルマシアバイオテク製『スーパーデックス ２００ｐｇ』ゲルを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１１８ｍｌ）に供し、０．２Ｍ食塩、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出した。活性画分を回収し、ファルマシアバイオテク製『リソース Ｑ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。アミラーゼ活性を有する画分は、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース Ｑ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。得られた活性画分をアミラーゼ精製標品とした。各精製の各工程におけるアミラーゼ活性、アミラーゼの比活性及び収率を表１６に示す。
【０１３５】
【表１６】
【０１３６】
精製したアミラーゼ標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１３７】
＜実験１６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの性質＞
＜実験１６−１：分子量＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、当該アミラーゼの分子量は５８，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１３８】
＜実験１６−２：アミラーゼの至適温度及び至適ｐＨ＞
実験１５−２の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼ精製標品を用いて、アミラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１１（至適温度）及び図１２（至適ｐＨ）に示した。当該アミラーゼの至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５５℃であり、至適ｐＨは３５℃、３０分間反応の条件下で６．０乃至７．０であることが判明した。
【０１３９】
＜実験１６−３：アミラーゼの温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０又は１ｍＭ塩化カルシウムを含む同緩衝液）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１３（温度安定性）及び図１４（ｐＨ安定性）に示した。図１３及び図１４から明らかなように、当該アミラーゼはカルシウムイオン非存在下では４０℃まで安定であり、１ｍＭカルシウムイオン存在下では５０℃まで安定であった。また、当該アミラーゼはｐＨ６．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１４０】
＜実験１６−５：アミラーゼの基質特異性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、当該アミラーゼの各種基質への作用を調べたところ、当該アミラーゼは、澱粉、マルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを加水分解するとともに、グリコシル転移をも触媒することが判明した。また、当該アミラーゼは、澱粉からシクロデキストリンを生成し、プルランを加水分解してパノースを生成する作用を有することも判明した。
【０１４１】
＜実験１７：α−グルコシル転移酵素とアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品と実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、実験１４に記載したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いたグルカンＣの調製が再現できるか否かを検討した。すなわち、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、実験１５―２の方法で得たアミラーゼを固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１５に示した。図１５において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである（α−グルコシル転移酵素のみ１０単位作用させた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示したグルカンＡのクロマトグラムとほぼ同様であり、図１５では省略した。後述する図１６〜１９についても同様）。これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１７に示す。また、基質として用いた澱粉部分分解物について調べた分子量分布分析と水溶性食物繊維含量の結果（α−グルコシル転移酵素０単位、アミラーゼ０単位）を表６に併記した。
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
表１７の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素にアミラーゼを併用すると、得られる分岐α−グルカンの分子量は低下し、水溶性食物繊維含量は飛躍的に増加した。また、アミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．１まで低下した。さらに、得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位以上で約７６質量％にまで達した。
【０１４４】
この結果から、実験１４においてバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて得られたグルカンＣにおいて、分子量が小さく、食物繊維含量が高くなったのは、粗酵素に混在するアミラーゼに起因することが確認された。混在するアミラーゼが、基質である澱粉部分分解物およびα−グルコシル転移酵素の産物である分岐α−グルカンを部分的に加水分解することにより分岐α−グルカンの分子量を低下させ、また、グリコシル基をさらに分岐α−グルカンに転移することにより、結果的に食物繊維含量を高めるよう作用しているものと推察される。さらに、この結果は、アミラーゼを本発明のα−グルコシル転移酵素と組み合わせることにより分子量が小さく、水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンを製造できることを示している。
【０１４５】
＜実験１８：α−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
本発明のα−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用して、澱粉部分分解物に作用させて分岐α−グルカンを調製し、その構造的な特徴及び水溶性食物繊維含量を検討した。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であったことから、本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１４６】
＜実験１８−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼに変えて、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、５０、２００、５００又は１，０００単位加えた以外は実験１７と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１６に示した。図１６において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１８に示す。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
表１８のα−グルコシル転移酵素のみを澱粉部分分解物に作用させた場合の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素のみでは分子量分布に大きな影響を及ぼさないものの、表１８及び図１６の結果から明らかなように、イソアミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。イソアミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１０００単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは１．９まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度２０．６にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、イソアミラーゼの作用量にあまり影響されず、４０乃至４４質量％程度であった。
【０１４９】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にさらにイソアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量をほとんど変化させることなく、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５０】
＜実験１８−２：α−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えて市販のα−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１７に示した。図１７において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、α−アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
図１７及び表１９の結果から明らかなように、α−アミラーゼの作用量が多くなるにつれて得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。α−アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１７の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．４まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度１１．８にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、α−アミラーゼの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められた。
【０１５３】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量が増加し、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５４】
＜実験１８−３：α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１８に示した。図１８において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、ＣＧＴａｓｅを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２０に示す。
【０１５５】
【表２０】
【０１５６】
図１８及び表２０の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるにつれて、数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。ＣＧＴａｓｅの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１８の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは３．２まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度７９．１にピークを有する分子量分布を示した。一方、分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められ、実験１８−２のα−アミラーゼを併用した場合よりも顕著に増加し、ＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり１．０単位用いた場合では、水溶性食物繊維含量は７０．５質量％に達した。
【０１５７】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素にＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることで、分子量が低下し、水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンが調製できることが判明した。ＣＧＴａｓｅはα−１，４結合の加水分解作用と共に転移作用をも有していることから、α−アミラーゼと比較して極端に分子量を低下させることなく、非還元末端グルコシル残基を生成するため、α−グルコシル転移酵素の作用頻度が高くなり、α−アミラーゼ添加よりも水溶性食物繊維含量が増加した分岐α−グルカンが得られたものと推察される。
【０１５８】
＜実験１８−４：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
実験１８−１に記載した実験において、さらにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり０又は１．０単位を加えた以外は実験１８−１と同様にして反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１９に示した。図１９において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、いずれもα−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅをそれぞれ１０単位及び１単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２１に示す。
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
図１９及び表２１の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシル転移酵素と固形物１グラム当たり１単位のＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンの重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は３．２まで低下し、さらに固形物１グラム当たり１０００単位のイソアミラーゼを併用した場合（図１９の符号ｅ）には１．９まで低下した。α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量は約７０質量％にまで増加し、さらにイソアミラーゼを併用した場合にも低下することなく、高い含量を維持していた。
【０１６１】
この結果から、本発明のα−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、分子量が顕著に低下すると共に水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンを調製できることが判明した。
【０１６２】
＜実験１９：分岐α−グルカンの機能性＞
水溶性食物繊維含量が最も高く、分子量が比較的小さい分岐α−グルカンとして、実験１８−４において固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位ＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンを選択し、当該分岐α−グルカンの消化性及び構造的な特徴及び機能性を検討した。
【０１６３】
＜実験１９−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの精製＞
固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位のＣＧＴａｓｅを用い、実験１８−４と同様に反応させて得た分岐α−グルカンの反応液を、濾過して不溶物を除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０％の分岐α−グルカン含有液を、用いた澱粉から固形物当り８５．８％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンのメチル化分析を実験４−１記載の方法で行った結果を表２２に示した。また、実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法で行った分子量分布分析、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法で求めた水溶性食物繊維含量、実験４−２記載のイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表２３にまとめた。
【０１６４】
【表２２】
【０１６５】
【表２３】
【０１６６】
表２２及び２３の結果から明らかなように、得られた分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物を１対２．４の比で含有し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７７．５％を占めていた。また、本分岐α−グルカンにおいて、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．６％及び２．４％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量５，４８０ダルトン、Ｍｗ／Ｍｎ２．３を示し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量が６８．６質量％、イソマルトデキストラナーゼ消化により、糖組成当たりイソマルトースを３６．４質量％生成するグルカンであった。
【０１６７】
本発明の分岐α−グルカンの有用性を評価する目的で、実験１９−１で調製した分岐α−グルカンを用いて、う蝕原性、消化性、血糖値とインスリン量に及ぼす影響、及び急性毒性を実験１９−２乃至１９−７で調べた。
【０１６８】
＜実験１９−２：分岐α−グルカンのう蝕原性菌による酸発酵性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用い、『インフェクション・アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）』、第３９巻、４３乃至４９頁（１９８３年）に記載の大島らの方法に準じて、う蝕原性菌を用いた酸発酵性試験を行った。う蝕原性菌として、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５株及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ−１７６株の２株を用いた。対照として、スクロースを用いて同様に操作した。結果を表２４に示す。
【０１６９】
【表２４】
【０１７０】
表２４の結果から明らかなように、酸発酵を受けるスクロースの場合はｐＨ約４にまで低下するのに対して、本発明の分岐α−グルカンは、ストレプトコッカス・ソブリナス及びストレプトコッカス・ミュータンスによる酸発酵をほとんど受けず、ｐＨは約６を維持しており、歯のエナメル質が脱灰する臨界ｐＨである５．５より高いｐＨであった。本発明の分岐α−グルカンは、う蝕原性が極めて低いことが確認された。
【０１７１】
＜実験１９−３：分岐α−グルカンの消化性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内において唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素による本発明の分岐α−グルカンの消化性を調べた。対照として、市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。結果を表２５に示す。
【０１７２】
【表２５】
【０１７３】
表２５の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、唾液アミラーゼ、人工胃液によっては全く消化されず、膵液アミラーゼでごく僅か分解された。また、対照の難消化性デキストリンの小腸粘膜酵素による分解率が４１．１％であるのに対して、分岐α−グルカンの分解率は１６．４％と低く、本発明の分岐α−グルカンは市販の難消化性デキストリンよりもさらに消化され難いことが判明した。
【０１７４】
＜実験１９−４：分岐α−グルカンの摂取が血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、血糖値の上昇及びインスリンの上昇を調べた。７週齢のウィスター系雄ラット各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて分岐α−グルカンの水溶液を経口投与した。投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇとした。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値はグルコース・オキシダーゼ法で測定し、インスリン量はラットインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製造）を用いて測定した。対照１としてグルコースを、また、対照２として市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。それぞれの試験系における血糖値及びインスリン量の結果をそれぞれ表２６及び表２７に示す。
【０１７５】
【表２６】
【０１７６】
【表２７】
【０１７７】
表２６及び表２７の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリンと同様に、血糖値の上昇及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べ低いことが判明した。
【０１７８】
＜実験１９−５：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、本発明の分岐α−グルカンは無毒性であり、投与可能な最大量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１７９】
＜実験２０：分岐α−グルカンの血糖上昇抑制作用＞
実験１９−４において、分岐α−グルカンの摂取により、血糖値及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べて低いことが判明したので、後述する実施例５の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、分岐α−グルカンの摂取が血糖上昇に与える影響をさらに詳細に検討した。
【０１８０】
＜実験２０−１：分岐α−グルカンの摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
本発明の分岐α−グルカンが、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学工業株式会社販売）摂取後の血糖上昇に与える影響を検討した。ラット飼育用飼料（株式会社林原生物化学研究所調製、「ＡＩＮ−９３Ｇ」；ジャーナル・オブ・ニュートリッション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、第１２３巻、第１９３９−１９５１頁（１９９３）参照、以下「精製飼料」という。後述の表３３に示す配合組成を参照）で、１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）３群各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）と分岐α−グルカンとを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として、０．１５ｇ、０．３０ｇ又は０．７５ｇとした。ラットの血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットに澱粉部分分解物のみを固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重経口投与した。また、対照２として、分岐α−グルカンに換えて、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社製造）を、澱粉部分分解物と同時に、２群各群５匹のラットに、体重１ｋｇ当り固形物として０．１５ｇ又は０．７５ｇの何れかを経口投与した。それぞれの試験系における血糖値の変化、血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積）、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表２８、表２９、表３０及び表３１に示す。
【０１８１】
【表２８】
【０１８２】
【表２９】
【０１８３】
【表３０】
【０１８４】
【表３１】
【０１８５】
表２８乃至表３１の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、用量依存的に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇を、澱粉部分分解物を単独で摂取させた場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの上昇抑制効果の程度を比較すると、測定した何れの指標においても、本発明の分岐α−グルカンの方が市販の難消化性デキストリンよりも強い抑制効果を示した。
【０１８６】
＜実験２０−２：澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量への分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２０−１において、本発明の分岐α−グルカンが、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を何れも抑制することが判明したので、この分岐α−グルカンの分子量の違いが、糖質負荷時の血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用に及ぼす影響を検討した。すなわち、原料澱粉部分分解物、α−グルコシル転移酵素、アミラーゼの使用量等を調整して、表３２に示す重量平均分子量の分岐α−グルカンを調製した。実験２０−１と同様に、精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）９群各群５匹を用いて、１日絶食後、８群各群５匹のラットには、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）又は表３２に示す分岐α−グルカンの何れかを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として０．７５ｇとした。残りの１群５匹のラットには、澱粉部分分解物のみをラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇ経口投与し、対照群とした。これらのラットの血液を、経口投与直前及び投与３０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液をヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。各群における血糖値及びインスリン量の測定結果を表３２に併せて示す。なお、投与後の採血時間は、澱粉部分分解物のみを投与した場合に、血糖値及び血中インスリン量がピークとなる投与３０分後とした。
【０１８７】
【表３２】
【０１８８】
表３２の結果から明らかなように、重量平均分子量が１，１６８乃至２００，０００の範囲にある本発明の分岐α−グルカンは、何れも澱粉部分分解物を経口投与した後の血糖値及びインスリン量の上昇を抑制した。また、この血糖値及びインスリン量の上昇抑制効果の強さの程度で比較すると、分岐α−グルカンの分子量が１，１６８乃至６０，０００（水溶性食物繊維含量が５８．１乃至８０．４質量％）の場合に抑制効果が顕著となり、２，６７０乃至４４，１５１（水溶性食物繊維含量が６４．２乃至８０．４質量％）の場合に特に強い抑制効果が認められた。
【０１８９】
＜実験２０−３：分岐α−グルカンの長期摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験２０−１において、本発明の分岐α−グルカンの摂取により、糖質負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンを長期摂取後（８週間）に、糖質負荷時の血糖値、血糖値ＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇抑制作用を検討した。精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）５群各群５匹を使用した。３群各群５匹のラットを、各々表３３に示す分岐α−グルカン（固形物換算）を１、２又は５質量％配合した３種類の試験飼料の何れかで８週間飼育した。飼育期間中の餌及び水は自由摂取とした。試験飼料での飼育４週間と８週間で、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物の水溶液を固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重となるように経口投与した。ラットの血液を、投与直前、投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットを精製飼料のみで飼育した。また、残りの１群５匹のラットは、対照２として、精製飼料のコーンスターチの一部を、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社販売）で置き換えた表３３に示す配合組成の飼料で飼育した。飼育４週間と８週間とはほぼ同じ結果となったので、試験飼料で飼育４週間における、それぞれの試験系における血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表３４、表３５、表３６及び表３７に示す。
【０１９０】
【表３３】
【０１９１】
【表３４】
【０１９２】
【表３５】
【０１９３】
【表３６】
【０１９４】
【表３７】
【０１９５】
表３３乃至３７の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を、精製飼料のみで飼育した場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの数値上昇の抑制は、飼料に配合した分岐α−グルカンの濃度に依存しており、その効果は固形物として、分岐α−グルカンを２質量％配合した場合に顕著となり、５質量％では特に強い抑制が認められた。また、市販の難消化性デキストリンを、固形物として５質量％配合した飼料で飼育したラットにおける、これらの指標の抑制の程度は、固形分として分岐α−グルカンを１質量％配合した飼料と同程度の抑制が認められたことから、本発明の分岐α−グルカンは、当該難消化性デキストリンよりも、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇抑制効果に優れていることが確認された。更に、澱粉部分分解物投与前の血糖値及びインスリン量を比較すると、分岐α−グルカンを固形物として２質量％又は５質量％配合した飼料を摂取させた群では、精製飼料のみ或いは難消化性デキストリンを固形物として５質量％含む飼料を摂取させた群よりも低く、本発明の分岐α−グルカンは、長期摂取により空腹時血糖値及び血中インスリン量を、市販の難消化性デキストリンよりも効果的に抑制する作用を有していることも明らかになった。なお、試験飼料又は対照飼料で飼育４週間及び８週間で、ラットの体重を比較したところ、何れの群間でも、平均体重に差は認められなかったので、本実験で確認された分岐α−グルカンによる血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用は、ラットの健康状態には何ら影響を与えないと判断した。
【０１９６】
＜実験２１：分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンをラットに摂取させると澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べて、血糖値及びインスリン量の増加が抑制されることが明らかになったので、分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及び血中のインスリン量に与える影響を調べる試験を行った。市販の澱粉部分分解物（松谷化学工業株式会社販売、商品名「パインデックス＃１」）及び後述する実施例５の方法に準じて調製した分岐α−グルカンを用いて、ヒトでの血糖値及びインスリンの上昇を調べた。健康なボランティアの男性１２名（年齢２６乃至５４歳、平均４１±７歳）を被験者として、試験前日の２１時以降、翌日の試験開始時（９時頃）までの間、水以外の飲食物の摂取を禁止した。この被験者に、まず澱粉部分分解物５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を、摂取開始から２分以内に摂取させた。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後に採血した。次いで、１週間以上の間隔をあけて、同じ被験者に分岐α−グルカン５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を用いた以外は澱粉部分分解物の場合と同様にして試験し、採血した。それぞれの血液の血糖値及びインスリン量を、民間の臨床検査機関（社団法人岡山市医師会総合メディカルセンター）に委託して測定した。試験標品摂取時の血糖値及びインスリン量の経時的な変化、及び、その数値に基づき計算した、摂取直後乃至摂取１２０分間血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積：ＡＵＣ０−２ｈｒ（ｍｇ・ｈｒ／ｄｌ））及びインスリン量のＡＵＣ０−２ｈｒ（μＵ・ｈｒ／ｄｌ）値、摂取直後乃至摂取１２０分間の血糖値のＡＵＣ値の増加量及びインスリン量のＡＵＣ値の増加量（ΔＡＵＣ０−２ｈｒ）を、表３８にまとめて示す。
【０１９７】
【表３８】
【０１９８】
表３８の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンを摂取した場合には、ラットを用いた実験（実験２０）と同様に、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値が、澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べ有意に低いことが判明した。
【０１９９】
＜実験２２：分岐α−グルカンの生体内脂質低減作用＞
実験１９−４、実験２１において、分岐α−グルカンを摂取することにより、血糖値及び血中のインスリン量の上昇が低くなることが判明したので、当該分岐α−グルカンの摂取が生体内脂質に及ぼす影響についても検討した。
【０２００】
＜実験２２−１：分岐α−グルカンの摂取が脂肪吸収に与える影響＞
後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを用いて、７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に４群各群１５匹に分けて、１週間、表３３に示す精製飼料で予備飼育後、２群各１５匹は、同表に示す分岐α−グルカンを固形物として５質量％配合した組成の飼料で、４週間または８週間飼育した。残りの２群各１５匹は、対照として、精製飼料で同様に４週間または８週間飼育した。分岐α−グルカン配合飼料で飼育した１群１５匹を飼育開始４週間で、及び、残り１群１５匹を８週間で、各々、エーテル麻酔下で下大静脈より採血後屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量、血清脂質、腸粘膜湿質量および盲腸内容物などを調べた。対照のラットも同様に処理した。その結果を表３９に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２０−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、解剖前は一晩絶食とした。分岐α−グルカン配合飼料飼育４週間及び８週間の体重増加量、摂餌量、飼料利用効率（体重増加量／摂餌量）、解剖時の、体重、臓器等の質量、腸粘膜質量、内臓脂肪質量、盲腸内の内容物の質量、水分、ｐＨを表３９に示す。また、血清脂質の測定結果も表３９に併せて示す。なお、血清脂質のうち、中性脂肪、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの測定は、それぞれ市販の中性脂肪トリグリセライド測定用キット（商品名「トリグリセライド Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）、総コレステロール測定用キット（商品名「コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売、）及びＨＤＬ−コレステロール測定用キット（商品名「ＨＤＬ−コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）を使用した。また、総コレステロール値からＨＤＬ−コレステロール値を減じてＬＤＬ−コレステロール値とした。
【０２０１】
【表３９】
【０２０２】
表３９の結果から明らかなように、本発明の分岐α−グルカンを、固形物として５％配合した飼料を摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合に比して、摂取４週間では、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、摂取８週間では、腎臓周囲及び睾丸周囲脂肪のいずれも有意に低値を示し、その低下は、特に睾丸周囲脂肪で顕著であった。また、摂取４週間及び８週間で腸粘膜質量が有意に増加し、その増加は摂取８週間で顕著となった。また、摂取８週間で盲腸内ｐＨが有意に低下した。さらに、血清脂質についてみると、中性脂肪値が摂取８週間で、総コレステロールが摂取４週間及び８週間で、何れも低下傾向を示し、ＬＤＬ−コレステロールも低下した。これら以外の測定値は、対照と差は認められなかった。なお、具体的なデータは示さないが、盲腸内の有機酸濃度は、対照と差は認められなかった。この結果は、本発明の分岐α−グルカンが、生体内脂質の低減作用を有することを物語っている。また、腸粘膜の質量増加が認められることから、分岐α−グルカンによる脂質の過剰蓄積の抑制や実験２０乃至２１で確認された耐糖性の増強には、この試験で確認されたムチン分泌の増大を伴う小腸粘膜層の肥厚に起因する消化酵素の作用性低下や消化されたグルコースや脂肪の消化・吸収阻害、遅延が、重要な役割を果たしていると推察される。
【０２０３】
＜実験２２−２：生体内脂質の過剰蓄積抑制に与える分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２２−１において、本発明の分岐α−グルカンの摂取により、生体内脂質の過剰蓄積が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンの重量平均分子量の違いによる作用を検討した。すなわち、精製飼料に、実験２０−２で使用したものと同じ重量平均分子量の異なる８種類の分岐α−グルカンを、それぞれ固形物として５質量％配合した８種類の試験飼料を調製した。ウィスター系ラット雌性７週齢（日本チャールスリバー株式会社販売）４５匹を、無作為に９群各群５匹に分けて、１週間、精製飼料で予備飼育した。このラットのうち、８群については、表４０に示す重量平均分子量の異なる分岐α−グルカンの何れかを配合した試験飼料（試験飼料１乃至８）で８週間飼育した。残りの１群５匹のラットは、精製飼料でそのまま８週間飼育し、対照群とした。分岐α−グルカンを配合した飼料を摂取して８週間経過したラット及び精製飼料を摂取して８週間経過した対照群のラットを、それぞれエーテル麻酔下で採血後、屠殺して、その腸間膜周囲、腎臓周囲及び睾丸周囲の脂肪質量（湿質量）、並びに、血清中の中性脂肪及び総コレステロールを、実験２２−１と同じ方法で測定した。結果を表４０に示す。
【０２０４】
【表４０】
【０２０５】
表４０の結果から明らかなように、重量平均分子量が異なる本発明の分岐α−グルカンを摂取させた場合、何れの群においても内臓脂肪質量及び血清脂質量が、対照群よりも低値となり、本発明の分岐α−グルカンが内臓脂肪質量及び血清脂質量の上昇を抑制することが分かった。また、この抑制効果の程度で比較すると、分岐α−グルカンの重量平均分子量が２，６７０乃至４４，１５１のもので効果が顕著となり、２，６７０乃至２５，６１８の場合に特に強い効果が認められた。
【０２０６】
以上の実験１９−２乃至１９−５の結果から、本発明の分岐α−グルカンは、経口摂取しても虫歯になり難く、消化吸収され難く、低カロリーの水溶性食物繊維として有利に利用できることが判明した。また、実験２０乃至２２の結果から、本発明の分岐α−グルカンは、血糖上昇抑制剤及び生体内脂質低減剤として利用できることも判明した。
【０２０７】
以下、本発明のα−グルコシル転移酵素の製造例を実施例１及び２に、本発明の分岐α−グルカンの製造例を実施例３乃至６に示す。また、本発明の分岐α−グルカンの物理化学的性質を実施例７に例示する。本発明のα−グルコシル転移酵素を含んでなる品質改良剤を実施例８に、さらに、本発明の分岐α−グルカンを含有せしめた組成物を実施例９乃至２２に示す。
【実施例１】
【０２０８】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を実験５の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮粗酵素液を調製した。本濃縮粗酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は２００単位／ｍｌであった。また、本濃縮酵素液には約２５単位／ｍｌのアミラーゼ活性も認められた。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明の分岐α−グルカンの製造に、また、飲食物に含まれる澱粉質の品質改良剤などに有利に利用できる。
【実施例２】
【０２０９】
アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を実験８の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は５０単位／ｍｌであった。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明の分岐α−グルカンの製造に、また、飲食物に含まれる澱粉質の品質改良剤などに有利に利用できる。
【実施例３】
【０２１０】
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実施例１の方法で得た濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、４０℃、４８時間作用させた。反応終了後、反応液を９５℃に加熱し、１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度５０質量％の分岐α−グルカン溶液を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析における２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１対１．３を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７０．３％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の３．０％及び４．８％であった。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量６，２２０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．２であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．１質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７５．８質量％であった。本品は、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０２１１】
３０％タピオカ澱粉乳に最終濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２質量％になるように加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液を、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行った後、４０℃に冷却し、これに実施例２の方法で調製したα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１：１．６を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の８０．０％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．４及び１．７％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量１０，３３０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．９であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．７質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は６８．６質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０２１２】
２７．１質量％トウモロコシ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また、最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却し、これに実施例１の方法で調製した濃縮粗酵素液を固形物１グラム当たり１１．１単位加え、さらに、５０℃、ｐＨ６．０で６８時間作用させた。その反応液を８０℃で６０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：２．５を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６８．４％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．６及び６．８％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量４，０９７ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．１であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７９．４質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０２１３】
濃縮粗酵素液に替えて実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素を用い、シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１，０００単位加えた以外は実施例５と同様にして分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比は１：４を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６７．９％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．３及び５．３％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量２，９７９ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．０であった。さらに、本分岐α−グルカンはイソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７７質量％であった。本分岐α−グルカンは、非う蝕性、難消化性の性質、適度の粘度を有し、水溶性食物繊維、脂肪代替食品材料、ダイエット用飲食物、品質改良剤、安定剤、賦形剤、増粘剤、増量剤などとして、食品、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【０２１４】
実施例５で調製した分岐α−グルカンについて、常法に従って物理化学的性質を調べ、本発明の分岐α−グルカンの性質の一例として表４１にまとめた。
【０２１５】
【表４１】
【実施例８】
【０２１６】
＜品質改良剤＞
無水マルトース（登録商標『ファイントース』、株式会社林原商事販売）４００質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）２００質量部及び実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素液２質量部を均一に混合し、常法により通風乾燥してα−グルコシル転移酵素を含有する酵素剤を調製した。本品は、澱粉質を含む飲食物を製造する際に配合することにより、澱粉質を改質し、澱粉の老化を抑制できることから、品質改良剤、とりわけ澱粉老化防止剤として有利に利用できる。
【実施例９】
【０２１７】
＜餅＞
白玉粉５００質量部と上新粉５００質量部を均一に混合した後、水７００質量部を加えて混合し、水蒸気で４０分間蒸した。次いで、蒸したものをミキサー（ＡＣＭ２０ＬＶＷ、株式会社愛工舎製作所）で攪拌しながら生地が約５５℃になったところで、スクロース３６０質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）２４０質量部及び実験６の方法で精製して得た本発明のα−グルコシル転移酵素を、α−グルコシル転移酵素活性が最終で澱粉質１グラム当たり５０単位になるよう４回に分けて添加・混合し、その後さらに３分間混合してからプラスチック製の内径６０ｍｍ、高さ２２ｍｍの容器に詰めて成形し、放冷し保存した。本品は、α−グルコシル転移酵素の作用により澱粉質が分岐α−グルカンに改質されて老化が抑制され、柔らかさが持続して伸びがあり、歯切れがよい高品質の餅である。
【実施例１０】
【０２１８】
＜おはぎ＞
マルトース（登録商標『サンマルト』、株式会社林原商事販売）３５０質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）１５０質量部を温水に溶解し、濃度７０質量％の糖液を調製して５５℃に保温した。次いで、予め水に浸漬しておいた１０００質量部の餅米を常法により蒸し器で蒸し上げ、５５℃まで冷却した後、前記糖液５００質量部と実験９の方法で精製して得た本発明のα−グルコシル転移酵素を澱粉質１グラム当たり２５単位になるよう加えて均質に攪拌した。これを保温容器に入れて約１時間、４５〜５０℃に保持した後、取り出し、こし餡を用いておはぎを調製した。本品は、α−グルコシル転移酵素の作用により糊化澱粉が分岐α−グルカンに改質されて老化が抑制され、冷蔵、或いは冷凍保存後に解凍しても離水などの発生もなく、調製直後の柔らかさが保持される高品質のおはぎである。
【実施例１１】
【０２１９】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液２質量部及び蔗糖３重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、水溶性食物繊維を多く含む加糖練乳として、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１２】
【０２２０】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末５０質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０質量部を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンやオリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１３】
【０２２１】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１０質量部、含水結晶トレハロース２０質量部、無水結晶マルチトール２０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、水溶性食物繊維を多く含む低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１４】
【０２２２】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液３０質量部、トレハロース含水結晶７０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、水溶性食物繊維を多く含む、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１５】
【０２２３】
＜餡＞
原料小豆１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、小豆粒餡約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えて粒餡を壊さないように練り上げ、製品の餡を約３５質量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンを多く含み、舌触り、風味良好で、餡パン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例１６】
【０２２４】
＜パン＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、水溶性食物繊維としての分岐α−グルカンを多く含み、適度の弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例１７】
【０２２５】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための食物繊維又は整腸剤量としても有用である。
【実施例１８】
【０２２６】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部、α−グルコシルルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、分岐α−グルカンを配合していることから優れた保湿性を有しており、安定性は高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例１９】
【０２２７】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液１５質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、使用後感も良好である。
【実施例２０】
【０２２８】
＜流動食用固体製剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物を２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、水溶性食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食として、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２１】
【０２２９】
＜錠剤＞
アスピリン５０質量部にトレハロース含水結晶粉末１４質量部、実施例４の方法で調製した分岐α−グルカン粉末４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、難消化性グルカンとトレハロースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。また、分岐α−グルカンが水溶性食物繊維として働くことから、整腸作用をも有する錠剤である。
【実施例２２】
【０２３０】
＜外傷治療用膏薬＞
マルトース４００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に実施例４の方法で調製した分岐α−グルカン粉末の１０ｗ／ｖ％水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、分岐α−グルカンによる適度な粘度、保湿性を有しており、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。また、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
本発明の分岐α−グルカンは安全性が高く、消化性も市販の難消化性デキストリンと遜色ないことから、水溶性食物繊維としての機能を十分に備えている。また、本発明の分岐α−グルカンは、血糖上昇抑制作用や生体内脂質の低減作用をも有していることから、健康食品としても有用である。本発明によれば、従来、化学的な反応や、煩雑で効率の悪い方法により澱粉から製造されていた難消化性デキストリンと同等の難消化性を有する分岐α−グルカンを、澱粉部分分解物を基質として、酵素法で、大量に、且つ、効率良く製造することができる。難消化性の分岐α−グルカンとその製造方法を提供する本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖転移作用を有する酵素とシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとを、澱粉原料に作用させる工程を含んでなる、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項２】
分岐α−グルカンのグルコース重合度が約６乃至６２０である請求項１記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項３】
分岐α−グルカンにおける分岐構造の直鎖状グルカンへの結合様式がα−１，６結合である請求項１又は２記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項４】
糖転移作用を有する酵素が、α−グルコシル転移酵素である請求項１乃至３のいずれかに記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項５】
糖転移作用を有する酵素とシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼに加えて、澱粉枝切り酵素を更に作用させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項６】
澱粉枝切り酵素が、イソアミラーゼである請求項５記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項１】
糖転移作用を有する酵素とシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとを、澱粉原料に作用させる工程を含んでなる、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンにおける少なくとも非還元末端にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有する分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項２】
分岐α−グルカンのグルコース重合度が約６乃至６２０である請求項１記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項３】
分岐α−グルカンにおける分岐構造の直鎖状グルカンへの結合様式がα−１，６結合である請求項１又は２記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項４】
糖転移作用を有する酵素が、α−グルコシル転移酵素である請求項１乃至３のいずれかに記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項５】
糖転移作用を有する酵素とシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼに加えて、澱粉枝切り酵素を更に作用させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項６】
澱粉枝切り酵素が、イソアミラーゼである請求項５記載の分岐α−グルカンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−２０２８８４（Ｐ２０１０−２０２８８４Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３２７３５（Ｐ２０１０−１３２７３５）
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【分割の表示】特願２００９−５１２９４４（Ｐ２００９−５１２９４４）の分割
【原出願日】平成２０年４月２３日（２００８．４．２３）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【分割の表示】特願２００９−５１２９４４（Ｐ２００９−５１２９４４）の分割
【原出願日】平成２０年４月２３日（２００８．４．２３）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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