分析用チップ
【課題】検体と選択的に結合する物質を固定化した基板を備えた分析用チップにおいて、検体と固定化された選択結合性物質との選択的結合を阻害する気泡の発生を抑え、反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下を抑える。
【解決手段】選択結合性物質がその表面に固定された基板１と、該基板と接着されたカバー部材３とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子２が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップ。
【解決手段】選択結合性物質がその表面に固定された基板１と、該基板と接着されたカバー部材３とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子２が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択結合性物質、すなわち検体と選択的に結合する物質を固定化した基板を備えた分析用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
分析用チップは、遺伝子、タンパク質、脂質、糖などの選択結合性物質が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質と検体を通常溶液として反応させて、反応結果からの存在の有無、状態又は量などを分析するために用いられる。この基板としては、一般にガラス製、金属製、樹脂製のものが用いられる。
【０００３】
分析用チップの一態様として、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定することを目的として、基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置した分析用チップであって、マイクロアレイと呼ばれるものがある。マイクロアレイを使用することによって、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になる。
【０００４】
分析用チップは、ＤＮＡ等の核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されるようになってきた。とりわけ、プロテイン分析用チップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定される。
【０００５】
分析用チップの使用時は、調製した検体を含む溶液を、分析用チップ上の選択結合性物質が固定化された領域全体に均等に拡がるようにアプライすることが重要である。このための工夫として、分析用チップ内部に、検体を含む溶液を攪拌するための微粒子を備えた分析用チップが知られている。
【０００６】
特許文献１には、検体ＤＮＡ溶液にあらかじめ微粒子を添加した微粒子分散溶液を分析用チップにアプライして、カバーガラスを被せ、シール剤により密閉し、カバーガラス、分析用チップ基板及びシール剤により規定される密閉された空隙を形成するような分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子の運動を利用して撹拌を行いながら、検体溶液が蒸発することなくハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０００７】
また、特許文献２には、分析用チップ基板に凹凸を設け、凸部上端面に選択結合性物質を固定化し、凹部に攪拌用微粒子を移動可能に格納して、反応液の攪拌を行うことができる分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子が凸部上端面と接触することがないため、選択結合性物質を傷つけずに微粒子による攪拌を行うことができる。
【０００８】
しかし、このように微粒子を用いて攪拌を行う分析用チップにおいては、検体を含む液体をアプライする際に分析用チップ基板内部の表面又は微粒子表面に気泡が残留したり、反応液中に気泡が発生したりすることがある。生じた気泡が障害となって、気泡が滞留した部分において選択結合性物質と検体との反応が阻害されるという問題があった。また、気泡の滞留した部分とそれ以外の部分とで反応むらが生じるため、分析用チップ上で検出感度のばらつき又は検出感度の低下を生じるという問題があった。
【０００９】
特許文献３には、ＤＮＡチップ使用時に気泡が発生すること、気泡がハイブリダイゼーション反応の均一性を阻害することが言及され、更にハイブリダイゼーション反応液組成に抑泡剤を添加することについて言及があるが、抑泡剤添加の実際的効果、使用する抑泡剤の種類には言及がなく、いかなる種類の抑泡剤が実際的に気泡抑泡効果をもつのか全く検討されていない。
【特許文献１】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０９０９９７号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−２０９２３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するものであり、検体と固定化された選択結合性物質との選択的反応を阻害する気泡の発生を抑え、反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下を抑える分析用チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、分析用チップの選択結合性物質と反応する検体を含む反応液に消泡剤（以下、抑泡剤、破泡剤、溶泡剤、脱泡剤とも称する）及び／又は非イオン系界面活性剤を添加することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップである。
【００１３】
本発明の分析用チップの好ましい一態様は、前記消泡剤がポリエーテル系消泡剤又はシリコーン系消泡剤である。
【００１４】
また、本発明の分析チップの好ましい一態様は、前記微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされている。
【００１５】
また、本発明の分析チップの好ましい一態様は、前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である。
【００１６】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である。
【００１７】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、カバー部材が、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものである。
【００１８】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である。
【００１９】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である。
【００２０】
さらに本発明は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を含む分析用キットである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の分析用チップによれば、分析用チップ内部の反応液中での気泡の残留や発生が抑えられる。この結果、気泡が選択結合性物質と検体との反応を阻害して反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下が抑制され、検体を高い感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の分析用チップは、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を保持することを特徴とする。
【００２３】
本発明の微粒子を格納した分析用チップの例を図１に示す。図１に示す例において、基板１の表面は、凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている。凹部１０に微粒子２が格納されており、凸部１１の上面には、選択結合性物質４５（例えば核酸）が固定化されている。
【００２４】
この基板１に固定化された選択結合性物質４５（例えば核酸）と反応させるために、分析用チップに検体を含む溶液を加えると、微粒子２の表面に付着した微小気泡が液体中に遊離し、図２に示すように気泡２６となって凸部を覆うため、覆われた凸部表面上の選択結合性物質は検体と反応できない。本発明の分析用チップにおいては、該選択結合性物質と検体との反応液が消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有することにより、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくいので、気泡の発生を抑制することができる。これにより、基板１表面の全ての選択結合性物質４５が検体と反応することが可能となり、得られるデータの信頼性と再現性とを上昇させることができる。
【００２５】
選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液に含まれる消泡剤としては、シリコーン系、ポリエーテル系、アルコール系の消泡剤が挙げられる。
【００２６】
シリコーン系消泡剤としては、和光純薬工業製のSI、TEGO製のAirex901W及びFoamax810が挙げられる。
【００２７】
ポリエーテル系消泡剤としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノアルキルエーテル、及び和光純薬工業株式会社製の３種の消泡剤（PE-H、 PE-M、 PE-L） が挙げられる。
【００２８】
アルコール系消泡剤としては、オクチルアルコール、グリコール酸、シクロヘキサノール、高級アルコール、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレングリコールアルキルエーテル、ジエチレングリコールラウレート、ポリオキシアルキレンソルビタンモノオレートが挙げられる。
【００２９】
これら消泡剤の中でもポリエーテル系又はシリコーン系の消泡剤が好ましく、ポリエーテル系消泡剤がより好ましく用いられる。
【００３０】
選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液に含まれる非イオン界面活性剤としては特に限定はないが、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ−５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）などが挙げられる。
【００３１】
これら非イオン系界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）が好ましく、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）がより好ましく用いられる。
【００３２】
本発明で使用される消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤は、分析チップが保持する反応液中の気泡の発生を抑制する効果を有していれば使用される組み合わせに限定はなく、消泡剤及び非イオン界面活性剤からなる群から一種類又は二種類以上の薬剤が選択されうるが、非イオン界面活性剤から一種類又は二種類以上選択されることが好ましく、非イオン界面活性剤から一種類選択されることがより好ましい。
【００３３】
微粒子の形状は、検体溶液を攪拌することができれば特に限定されず、球状の形状以外に、多角形でも良く、円筒形、角柱形などのマイクロロッド状（微細な棒状）など任意の形状とすることができる。
【００３４】
微粒子のサイズも特に限定されないが、微粒子の直径が、前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば球状の微粒子の場合、０．１μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。微粒子が円筒形の微粒子の場合は、その底面直径を微粒子の直径と見なして、底面直径が前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば、円筒形の微粒子の場合、長さ５０μｍ〜５０００μｍ、底面直径１０μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。
【００３５】
微粒子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金、白金、ステンレス、鉄、酸化アルミ（アルミナ）、酸化チタン（チタニア）等の金属若しくは金属酸化物、ナイロンやポリスチレン等のプラスチックを用いることができる。
【００３６】
微粒子の表面に界面活性剤をコーティングすることは、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくくし、気泡の発生を抑制することができるため、本発明の好ましい態様の１つである。
【００３７】
微粒子表面を界面活性剤でコーティングする方法としては、微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬したのちに取り出して乾燥させる方法、微粒子表面に界面活性剤を含む溶液を噴霧したのちに乾燥させる方法、微粒子を界面活性剤の溶液を含んだ物質に触れさせる方法、微粒子を液体に触れさせた後、粉末状の界面活性剤をまぶして付着させる方法など、公知の方法を用いることができる。これらの方法で用いる界面活性剤を含む溶液の濃度は、０．０１％〜１０％が、より好ましくは０．０５％〜２％の濃度が用いられる。
【００３８】
微粒子の表面処理に使用する界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられ、これらの中でも陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく用いられる。
【００３９】
陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。
【００４０】
陽イオン界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
【００４１】
両性界面活性剤としては、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１２ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
【００４２】
非イオン界面活性剤としては、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ−５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）などが挙げられる。
【００４３】
これらの中でも、陰イオン界面活性剤としては、界面活性効果が強力であることからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウムが特に好ましく用いられ、非イオン界面活性剤としては、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１２７が特に好ましく用いられる。
【００４４】
また、界面活性剤がコーティングされる微粒子の表面は、適度な粗さを有していることが好ましい。即ち、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。この範囲の表面粗さを有する微粒子を使用することで、ビーズの表面積がより大きいためにより多くの界面活性剤を微粒子表面にコーティングすることが可能となる。セラミックス製微粒子の場合、材質の強度を考慮すると、Ｒａ値が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００４５】
本発明の分析用チップを構成する基板は、その表面に、凹部及び選択結合性物質を固定化する凸部からなる凹凸部を有することが好ましい。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、凸部上面に選択結合性物質を固定化した基板をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００４６】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的には、高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本発明でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
【００４７】
本発明の分析用チップを構成する基板において、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化される領域は、該基板の表面であり、上述のような粗面化がなされていない領域であれば、特に限定されないが、具体的には、上述した凹凸部のうち凸部の上面（上端面）であることが好ましい。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良いし、固定化しないで基板のみを用意しておき、検体の分析の際に所望の検体に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。
【００４８】
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部上面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部上面を有していても良い。
【００４９】
本発明の分析用チップを構成する基板において、凸部上面に選択結合性物質が固定化される場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００５０】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１０μｍ２以上、１ｍｍ２以下であることが好ましく、３００μｍ２以上、０．８ｍｍ２以下であることがより好ましい。
【００５１】
本発明の分析用チップを構成する基板において、さらに好ましくは、その基板における選択結合性物質が固定化された領域を有する面の周囲がさらに凹凸部の凸部上端と略同一の高さの平坦部で囲まれていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に検体を含む溶液をアプライすることが容易となり、攪拌用の微粒子を選択結合性物質に接触させること無く凹部に保持することが可能となる。
【００５２】
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００５３】
本発明の分析用チップで好ましく用いられる基板の凹凸部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下がより好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００５４】
本発明の分析用チップを構成する基板の具体例を、図３及び図４に例示する。
【００５５】
図３及び図４に示す例において、基板１の表面は、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。
【００５６】
本発明の分析用チップの基板の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコーン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー等のシリコーンゴムなどを挙げることができる。これらの中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス又はシリコーン樹脂を好ましく用いることができる。
【００５７】
本発明の分析用チップの基板は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、基板からの自家蛍光を低減することができる。基板の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた基板の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。
【００５８】
本発明の分析用チップを構成する基板は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコーン樹脂の場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
【００５９】
成型した基板は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００６０】
本発明において、分析用チップとは、検体が含まれる溶液を当該チップにアプライし、検体の存在の有無や、検体の量や、検体の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、基板表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基板表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基板表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基板表面に固定化した糖鎖チップ、及び基板表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００６１】
本発明において、選択結合性物質とは、検体と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。基板の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
【００６２】
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。
【００６３】
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００６４】
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
【００６５】
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。
【００６６】
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
【００６７】
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、基板の表面に細胞を固定化してもよい。
【００６８】
本発明の分析用チップは、該基板の表面を覆い該基板と接着されたカバー部材を更に備えるものである。カバー部材を備えることにより、検体が含まれる溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、検体と、基板の領域（図３又は図４中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、本発明の分析用チップには予め微粒子を注入（格納）しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。
【００６９】
図５は、前記基板に加え、更にカバー部材、接着部材、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図である。
【００７０】
前記カバー部材は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、基板は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記基板に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。
【００７１】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、検体が含まれる溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは上記の通り直径０．０１ｍｍから２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１ｍｍ〜１．０ｍｍとすることが好ましい。
【００７２】
このようなカバー部材は、前述の基板に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００７３】
カバー部材を基板に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と基板が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着することができる。
【００７４】
上記カバー部材の形状は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、基板に近い部分より基板に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、基板を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。
【００７５】
本発明の分析用チップを構成するカバー部材の材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバー部材の作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００７６】
本発明の分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子の関係の好ましい例を、図１２を参照して説明する。図６に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、基板１の凸部１１の上面に固定化されている。そして、微粒子（この場合は球状のビーズ）２は、基板１の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質４５及び微粒子２は、検体が含まれる溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、基板１、接着部材３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図６の例においては、基板の凸部１１上面とカバー部材３との間隔の最短距離が、微粒子２の直径未満となっている。それにより、微粒子が凸部１１上面に接触できなくなり、凸部１１上面上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。微粒子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が微粒子の最小径未満であれば、同様に凸部１１上面と微粒子との接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。
【００７７】
このような本発明の分析用チップは、各種検体の分析に利用することができる。すなわち、本発明の分析用チップの選択結合性物質を固定化した基板に、検体を接触させて該選択結合性物質と選択的に結合させ、基板上に該選択結合性物質を介して結合した該検体の有無又は量を測定することにより、検体を分析することができる。
【００７８】
前記検体の分析方法においては、まず、前記本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質を固定化した基板に検体を接触させて選択的に結合させる。すなわち、基板に上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた溶液（本明細書において「検体溶液」ということがある）とし、基板に接触させれば良い。
【００７９】
選択結合性物質が結合された基板への接触は、検体を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、該基板の凹凸部にピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。
【００８０】
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（登録商標、東レ・デュポン社製）などのポリイミドフィルム製、ポリエステル製、セロハン製又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできる。液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。
【００８１】
封止の具体例を、再び図６を参照して説明する。図６の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、封止部材として可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００８２】
前記検体の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と検体とを相互作用させ、前記検体を、前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質を固定化した基板に結合させることを意味する。本発明の分析用チップの場合には、前記チップを揺動、回転させることにより、重量、振動、遠心力によって微粒子が検体溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。
【００８３】
前記選択結合性物質と検体の選択的結合を行う際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜５０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて、選択結合性物質を固定化した基板を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。
【００８４】
本発明の分析用チップは、分析用チップ内の微粒子を移動させることにより、検体溶液を効率よく撹拌することができる。微粒子を移動させる手段としては、好ましくは分析チップを回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、振とう機に微粒子を含んだ分析チップをセットし基板を振とう若しくは揺動させる方法や、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法が用いられるが、チップを振とう機にセットし、水平面内で旋回回転させる方法が、微粒子の移動範囲が大きく、偏り無く移動するため、その結果、効率よく液を攪拌できるため好ましく用いられる。このとき、旋回回転の回転数は、好ましくは１０〜１０００回転／分であり、より好ましくは１００〜５００回転／分である。
【００８５】
選択的結合の終了後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。
【００８６】
分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記基板上に前記選択結合性物質を介して結合した前記検体の質量を測定する。この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した検体の質量について、公知のスキャナー等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００８７】
前記検体の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者の意味が含まれる。
【００８８】
さらに本発明は分析用キットに関する。ここでいう分析用キットとは、本発明の分析用チップを構成するためのものであり、少なくとも選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液が含まれる。
【００８９】
その他、上記に加えて本発明の分析用キットに含まれうるものとしては、封止シール、アプライ用ティップ、アプライ用スタンド、綿棒等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９０】
本発明の分析用キットの使用方法としては、分析用チップに固定化された選択結合性物質と選択的に結合する検体の検出に使用できる。具体的には、検体を標識し、上記の「反応液」と混合し、これを前記基板と接着されたカバー部材に設けられている貫通孔から分析用チップ内部に注入する。注入終了後の分析用チップの貫通孔を封止シールで塞ぎ、検体と分析用チップ基板表面の選択結合性物質の反応を行ない、検体の標識を検出することで該選択結合性物質と特異的に結合する検体を検出することができる。
【実施例】
【００９１】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。
【００９２】
比較例１
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００９３】
基板としては、図３及び図４に例示される形状を有する基板である、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に、縦３９．４mm、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部（図３の凹部１０に相当）を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部（図３の凸部１１に相当）を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部（図３の凸部１１に相当）上面と平坦部（図３の凸部１３に相当）上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部（図３の凸部１３に相当）上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（図４のＬ１；凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。
【００９４】
上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
【００９５】
（２）選択結合性物質の固定化
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Homo sapiens (human) AROS V4.0（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
【００９６】
（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを図６の３２、３３に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。
【００９７】
（４）検体の調製
検体としては、マイクロアレイの検体として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た
（５）選択結合性物質と検体とのハイブリダイゼーションのための反応液
以下の実施例、比較例で特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。
【００９８】
（６）分析用チップへの微粒子の注入（格納）
上記（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
【００９９】
検体としては、マイクロアレイの検体として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た。
【０１００】
（７）ハイブリダイゼーション反応と気泡発生数の評価
マイクロピペットを用いて、分析用チップ１の基板Ａとカバー部材との空隙（反応槽）に、Ｃｙ３標識ａＲＮＡ２００ｎｇを含む反応液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてカプトンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株）製））を、シート振盪台（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、分析用チップ１をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析用チップ１をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバー蓋を閉めた後、６本の固定ネジを締めて固定し、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製 ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析用チップ１を取り出した。
【０１０１】
カバー部材を通して、分析用チップ１の基板Ａ上に観察された反応液中の気泡数を計数した。分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施した結果、反応液中に発生した気泡数は、１回当たりの平均で１３．０個であった（表１）。
【０１０２】
（８）蛍光シグナル値の測定と検出感度ばらつきの評価
分析用チップ１の基板Ａに接着したカバー部材と両面テープを脱離した後、基板Ａを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板Ａをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した検体の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全９２４８個のスポットのうち、３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。
【０１０３】
気泡の出現によるハイブリダイゼーション反応の反応むらによる検出感度のばらつきの評価として、分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施し、各回におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値＝全回のバックグラウンドシグナル値の標準偏差／全回のバックグラウンドシグナル値の平均値（％））を計算した。その結果、１０回の評価におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）の平均値は１２．１％であった（表１）。
【０１０４】
比較例２
比較例１（５）で調製した反応液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。反応液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ−０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は、装置の表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。
【０１０５】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が９．０個であった（表１）。また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１０．５％であった（表１）。
【０１０６】
実施例１
比較例１（５）で調製した反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製消泡剤“PE-L”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加し、反応液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。反応液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ−０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は装置表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。
【０１０７】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された反応液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の回実施した結果の１回当たりの平均値が１．２個であった（表１）。また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．９％であった（表１）。
【０１０８】
実施例２
反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製消泡剤“ＳＩ”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、実施例１と同様に脱気した分析用チップ１を用いた評価を実施した。脱気時間は２５分間とした。
【０１０９】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が２．９個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．３％であった（表１）。
【０１１０】
実施例３
反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製“グリコール酸”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、実施例１と同様に脱気した分析用チップ１を用いた評価を実施した。脱気時間は２５分間とした。
【０１１１】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が４．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．８％であった（表１）。
【０１１２】
実施例４
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ２」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１３】
ＳＤＳをコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、０．１％ＳＤＳ水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。なお、処理前の微粒子の表面粗さを測定したところ、表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）は１６５ｎｍであった。微粒子表面のＲａ値の測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で測定した。中心線平均粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。
【０１１４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．２％であった（表１）。
【０１１５】
実施例５
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ３」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１６】
Ｔｗｅｅｎ２０をコーティングした微粒子は、実施例４と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥して得た。
【０１１７】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．５％であった（表１）。
【０１１８】
実施例６
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ４」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１９】
ＣＴＡＢをコーティングした微粒子は、実施例４と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥して得た。
【０１２０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が３．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．７％であった（表１）。
【０１２１】
実施例７
実施例４と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については実施例１の反応液に含まれる界面活性剤ＳＤＳ濃度を０．１％から２％に増やしたものを使用した。
【０１２２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．２個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１２３】
実施例８
比較例１（５）で調製した反応液に、和光純薬工業株式会社製消泡剤“PE-L”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。
【０１２４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が６．２個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．７％であった（表１）。
【０１２５】
実施例９
実施例４と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１２６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．０％であった（表１）。
【０１２７】
実施例１０
実施例４及び８と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１２８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。 また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．６％であった（表１）。
【０１２９】
実施例１１
実施例５と同様に「分析用チップ３」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１３０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１３１】
実施例１２
実施例５及び１０と同様に「分析用チップ３」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１３２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１３３】
実施例１３
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ６０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ５」とした。
【０１３４】
Ｔｗｅｅｎ６０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｔｗｅｅｎ６０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｔｗｅｅｎ２０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１３５】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ６０に変更したものを使用した。
【０１３６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１３７】
実施例１４
実施例１３と同様に「分析用チップ５」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ６０に変更したものを使用した。
【０１３８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１３９】
実施例１５
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ６」とした。
【０１４０】
Ｔｗｅｅｎ８０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｔｗｅｅｎ８０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１４１】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に変更したものを使用した。
【０１４２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１４３】
実施例１６
実施例１５と同様に「分析用チップ６」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ８０に変更したものを使用した。
【０１４４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、５．９％であった（表１）。
【０１４５】
実施例１７
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１４６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．９個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１４７】
実施例１８
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ７」とした。
【０１４８】
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、３％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１４９】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１５０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１５１】
実施例１９
実施例１５と同様に「分析用チップ７」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから３％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１５２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１５３】
実施例２０
実施例４及び８と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７に変更したものを使用した。
【０１５４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．５％であった（表１）。
【０１５５】
実施例２１
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ８」とした。
【０１５６】
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１５７】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７に変更したものを使用した。
【０１５８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．８個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。
【０１５９】
実施例２２
実施例２１と同様に「分析用チップ８」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７に変更したものを使用した。
【０１６０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１６１】
実施例２３
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．０％であった（表１）。
【０１６３】
実施例２４
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ９」とした。
【０１６４】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１６５】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、１．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。
【０１６７】
実施例２５
実施例２４と同様に「分析用チップ９」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、５．９％であった（表１）。
【０１６９】
実施例２６
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が２．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。
【０１７１】
実施例２７
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＮＰ−４０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１０」とした。
【０１７２】
ＮＰ−４０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％０．１％ ＮＰ−４０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（０．１％ ＮＰ−４０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１７３】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、１．８個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。
【０１７５】
実施例２８
実施例２７と同様に「分析用チップ９」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．９％であった（表１）。
【０１７７】
比較例３
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＣＨＡＰＳＯをコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１１」とした。
【０１７８】
ＣＨＡＰＳＯをコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、１％ＣＨＡＰＳＯ水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＣＨＡＰＳＯ成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１７９】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＣＨＡＰＳＯに変更したものを使用した。
【０１８０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、２．０個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、９．０％であった（表１）。
【０１８１】
比較例４
比較例３と同様に「分析用チップ１１」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１％ＣＨＡＰＳＯに変更したものを使用した。
【０１８２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が４．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．１％であった（表１）。
【０１８３】
【表１−１】
【０１８４】
【表１−２】
【０１８５】
【表１−３】
【０１８６】
以上の実施例１〜２８、比較例１〜４の結果から、該チップと検体との反応液が消泡剤、又は非イオン系界面活性剤を含有させることによって、気泡の発生が抑制されてデータのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を低減できること、また検体溶液の脱気処理及びビーズ表面の界面活性剤処理と組み合わせることにより、さらに効果的に気泡の発生を抑制できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明は、検体と選択的に結合する選択結合性物質を固定化した基板を備え、微粒子によって検体溶液を攪拌することのできる分析用チップにおいて、検出感度のばらつきを抑え、高感度の検出を可能とするものである。本発明は、特に医薬・医療分野における様々な生体関連物質の検出等のための分析用チップとして有用であり、その他、食品、環境分野における微量物質の検出のための分析用チップとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図２】図２は、図１の基板の使用により、基板表面に気泡が発生した例を概略的に示す断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す斜視図である。
【図４】図４は、図３の本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図５】図５は、本発明の分析用チップの凹凸部、カバー部材及び微粒子の好ましい関係の一例を概略的に示す斜視図である。
【図６】図６は、本発明の分析用チップの凹凸部、カバー部材及び微粒子の好ましい関係の一例を概略的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【０１８９】
１ 基板
２ 微粒子
３ カバー部材
１０ 凹部
１１ 凸部
１２ 選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３ 平坦部
２６ 発生した気泡の例
３０ 接着部材
３０Ａ 仕切り構造の接着部材
３２ 貫通孔
３３ 液面駐止用チャンバー
３４ 封止部材（テープ）
４５ 基板に固定化された選択結合性物質
Ｌ１ 凸部ピッチ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択結合性物質、すなわち検体と選択的に結合する物質を固定化した基板を備えた分析用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
分析用チップは、遺伝子、タンパク質、脂質、糖などの選択結合性物質が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質と検体を通常溶液として反応させて、反応結果からの存在の有無、状態又は量などを分析するために用いられる。この基板としては、一般にガラス製、金属製、樹脂製のものが用いられる。
【０００３】
分析用チップの一態様として、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定することを目的として、基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置した分析用チップであって、マイクロアレイと呼ばれるものがある。マイクロアレイを使用することによって、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になる。
【０００４】
分析用チップは、ＤＮＡ等の核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されるようになってきた。とりわけ、プロテイン分析用チップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定される。
【０００５】
分析用チップの使用時は、調製した検体を含む溶液を、分析用チップ上の選択結合性物質が固定化された領域全体に均等に拡がるようにアプライすることが重要である。このための工夫として、分析用チップ内部に、検体を含む溶液を攪拌するための微粒子を備えた分析用チップが知られている。
【０００６】
特許文献１には、検体ＤＮＡ溶液にあらかじめ微粒子を添加した微粒子分散溶液を分析用チップにアプライして、カバーガラスを被せ、シール剤により密閉し、カバーガラス、分析用チップ基板及びシール剤により規定される密閉された空隙を形成するような分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子の運動を利用して撹拌を行いながら、検体溶液が蒸発することなくハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０００７】
また、特許文献２には、分析用チップ基板に凹凸を設け、凸部上端面に選択結合性物質を固定化し、凹部に攪拌用微粒子を移動可能に格納して、反応液の攪拌を行うことができる分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子が凸部上端面と接触することがないため、選択結合性物質を傷つけずに微粒子による攪拌を行うことができる。
【０００８】
しかし、このように微粒子を用いて攪拌を行う分析用チップにおいては、検体を含む液体をアプライする際に分析用チップ基板内部の表面又は微粒子表面に気泡が残留したり、反応液中に気泡が発生したりすることがある。生じた気泡が障害となって、気泡が滞留した部分において選択結合性物質と検体との反応が阻害されるという問題があった。また、気泡の滞留した部分とそれ以外の部分とで反応むらが生じるため、分析用チップ上で検出感度のばらつき又は検出感度の低下を生じるという問題があった。
【０００９】
特許文献３には、ＤＮＡチップ使用時に気泡が発生すること、気泡がハイブリダイゼーション反応の均一性を阻害することが言及され、更にハイブリダイゼーション反応液組成に抑泡剤を添加することについて言及があるが、抑泡剤添加の実際的効果、使用する抑泡剤の種類には言及がなく、いかなる種類の抑泡剤が実際的に気泡抑泡効果をもつのか全く検討されていない。
【特許文献１】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０９０９９７号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−２０９２３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するものであり、検体と固定化された選択結合性物質との選択的反応を阻害する気泡の発生を抑え、反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下を抑える分析用チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、分析用チップの選択結合性物質と反応する検体を含む反応液に消泡剤（以下、抑泡剤、破泡剤、溶泡剤、脱泡剤とも称する）及び／又は非イオン系界面活性剤を添加することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップである。
【００１３】
本発明の分析用チップの好ましい一態様は、前記消泡剤がポリエーテル系消泡剤又はシリコーン系消泡剤である。
【００１４】
また、本発明の分析チップの好ましい一態様は、前記微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされている。
【００１５】
また、本発明の分析チップの好ましい一態様は、前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である。
【００１６】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である。
【００１７】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、カバー部材が、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものである。
【００１８】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である。
【００１９】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である。
【００２０】
さらに本発明は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を含む分析用キットである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の分析用チップによれば、分析用チップ内部の反応液中での気泡の残留や発生が抑えられる。この結果、気泡が選択結合性物質と検体との反応を阻害して反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下が抑制され、検体を高い感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の分析用チップは、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有する反応液を保持することを特徴とする。
【００２３】
本発明の微粒子を格納した分析用チップの例を図１に示す。図１に示す例において、基板１の表面は、凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている。凹部１０に微粒子２が格納されており、凸部１１の上面には、選択結合性物質４５（例えば核酸）が固定化されている。
【００２４】
この基板１に固定化された選択結合性物質４５（例えば核酸）と反応させるために、分析用チップに検体を含む溶液を加えると、微粒子２の表面に付着した微小気泡が液体中に遊離し、図２に示すように気泡２６となって凸部を覆うため、覆われた凸部表面上の選択結合性物質は検体と反応できない。本発明の分析用チップにおいては、該選択結合性物質と検体との反応液が消泡剤及び／又は非イオン系界面活性剤を含有することにより、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくいので、気泡の発生を抑制することができる。これにより、基板１表面の全ての選択結合性物質４５が検体と反応することが可能となり、得られるデータの信頼性と再現性とを上昇させることができる。
【００２５】
選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液に含まれる消泡剤としては、シリコーン系、ポリエーテル系、アルコール系の消泡剤が挙げられる。
【００２６】
シリコーン系消泡剤としては、和光純薬工業製のSI、TEGO製のAirex901W及びFoamax810が挙げられる。
【００２７】
ポリエーテル系消泡剤としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノアルキルエーテル、及び和光純薬工業株式会社製の３種の消泡剤（PE-H、 PE-M、 PE-L） が挙げられる。
【００２８】
アルコール系消泡剤としては、オクチルアルコール、グリコール酸、シクロヘキサノール、高級アルコール、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレングリコールアルキルエーテル、ジエチレングリコールラウレート、ポリオキシアルキレンソルビタンモノオレートが挙げられる。
【００２９】
これら消泡剤の中でもポリエーテル系又はシリコーン系の消泡剤が好ましく、ポリエーテル系消泡剤がより好ましく用いられる。
【００３０】
選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液に含まれる非イオン界面活性剤としては特に限定はないが、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ−５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）などが挙げられる。
【００３１】
これら非イオン系界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）が好ましく、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）がより好ましく用いられる。
【００３２】
本発明で使用される消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤は、分析チップが保持する反応液中の気泡の発生を抑制する効果を有していれば使用される組み合わせに限定はなく、消泡剤及び非イオン界面活性剤からなる群から一種類又は二種類以上の薬剤が選択されうるが、非イオン界面活性剤から一種類又は二種類以上選択されることが好ましく、非イオン界面活性剤から一種類選択されることがより好ましい。
【００３３】
微粒子の形状は、検体溶液を攪拌することができれば特に限定されず、球状の形状以外に、多角形でも良く、円筒形、角柱形などのマイクロロッド状（微細な棒状）など任意の形状とすることができる。
【００３４】
微粒子のサイズも特に限定されないが、微粒子の直径が、前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば球状の微粒子の場合、０．１μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。微粒子が円筒形の微粒子の場合は、その底面直径を微粒子の直径と見なして、底面直径が前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば、円筒形の微粒子の場合、長さ５０μｍ〜５０００μｍ、底面直径１０μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。
【００３５】
微粒子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金、白金、ステンレス、鉄、酸化アルミ（アルミナ）、酸化チタン（チタニア）等の金属若しくは金属酸化物、ナイロンやポリスチレン等のプラスチックを用いることができる。
【００３６】
微粒子の表面に界面活性剤をコーティングすることは、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくくし、気泡の発生を抑制することができるため、本発明の好ましい態様の１つである。
【００３７】
微粒子表面を界面活性剤でコーティングする方法としては、微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬したのちに取り出して乾燥させる方法、微粒子表面に界面活性剤を含む溶液を噴霧したのちに乾燥させる方法、微粒子を界面活性剤の溶液を含んだ物質に触れさせる方法、微粒子を液体に触れさせた後、粉末状の界面活性剤をまぶして付着させる方法など、公知の方法を用いることができる。これらの方法で用いる界面活性剤を含む溶液の濃度は、０．０１％〜１０％が、より好ましくは０．０５％〜２％の濃度が用いられる。
【００３８】
微粒子の表面処理に使用する界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられ、これらの中でも陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく用いられる。
【００３９】
陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。
【００４０】
陽イオン界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
【００４１】
両性界面活性剤としては、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１２ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
【００４２】
非イオン界面活性剤としては、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ−５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）などが挙げられる。
【００４３】
これらの中でも、陰イオン界面活性剤としては、界面活性効果が強力であることからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウムが特に好ましく用いられ、非イオン界面活性剤としては、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１２７が特に好ましく用いられる。
【００４４】
また、界面活性剤がコーティングされる微粒子の表面は、適度な粗さを有していることが好ましい。即ち、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。この範囲の表面粗さを有する微粒子を使用することで、ビーズの表面積がより大きいためにより多くの界面活性剤を微粒子表面にコーティングすることが可能となる。セラミックス製微粒子の場合、材質の強度を考慮すると、Ｒａ値が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００４５】
本発明の分析用チップを構成する基板は、その表面に、凹部及び選択結合性物質を固定化する凸部からなる凹凸部を有することが好ましい。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、凸部上面に選択結合性物質を固定化した基板をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００４６】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的には、高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本発明でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
【００４７】
本発明の分析用チップを構成する基板において、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化される領域は、該基板の表面であり、上述のような粗面化がなされていない領域であれば、特に限定されないが、具体的には、上述した凹凸部のうち凸部の上面（上端面）であることが好ましい。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良いし、固定化しないで基板のみを用意しておき、検体の分析の際に所望の検体に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。
【００４８】
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部上面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部上面を有していても良い。
【００４９】
本発明の分析用チップを構成する基板において、凸部上面に選択結合性物質が固定化される場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００５０】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１０μｍ２以上、１ｍｍ２以下であることが好ましく、３００μｍ２以上、０．８ｍｍ２以下であることがより好ましい。
【００５１】
本発明の分析用チップを構成する基板において、さらに好ましくは、その基板における選択結合性物質が固定化された領域を有する面の周囲がさらに凹凸部の凸部上端と略同一の高さの平坦部で囲まれていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に検体を含む溶液をアプライすることが容易となり、攪拌用の微粒子を選択結合性物質に接触させること無く凹部に保持することが可能となる。
【００５２】
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００５３】
本発明の分析用チップで好ましく用いられる基板の凹凸部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下がより好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００５４】
本発明の分析用チップを構成する基板の具体例を、図３及び図４に例示する。
【００５５】
図３及び図４に示す例において、基板１の表面は、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。
【００５６】
本発明の分析用チップの基板の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコーン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー等のシリコーンゴムなどを挙げることができる。これらの中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス又はシリコーン樹脂を好ましく用いることができる。
【００５７】
本発明の分析用チップの基板は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、基板からの自家蛍光を低減することができる。基板の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた基板の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。
【００５８】
本発明の分析用チップを構成する基板は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコーン樹脂の場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
【００５９】
成型した基板は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００６０】
本発明において、分析用チップとは、検体が含まれる溶液を当該チップにアプライし、検体の存在の有無や、検体の量や、検体の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、基板表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基板表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基板表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基板表面に固定化した糖鎖チップ、及び基板表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００６１】
本発明において、選択結合性物質とは、検体と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。基板の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
【００６２】
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。
【００６３】
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００６４】
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
【００６５】
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。
【００６６】
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
【００６７】
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、基板の表面に細胞を固定化してもよい。
【００６８】
本発明の分析用チップは、該基板の表面を覆い該基板と接着されたカバー部材を更に備えるものである。カバー部材を備えることにより、検体が含まれる溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、検体と、基板の領域（図３又は図４中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、本発明の分析用チップには予め微粒子を注入（格納）しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。
【００６９】
図５は、前記基板に加え、更にカバー部材、接着部材、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図である。
【００７０】
前記カバー部材は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、基板は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記基板に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。
【００７１】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、検体が含まれる溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは上記の通り直径０．０１ｍｍから２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１ｍｍ〜１．０ｍｍとすることが好ましい。
【００７２】
このようなカバー部材は、前述の基板に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００７３】
カバー部材を基板に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と基板が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着することができる。
【００７４】
上記カバー部材の形状は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、基板に近い部分より基板に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、基板を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。
【００７５】
本発明の分析用チップを構成するカバー部材の材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバー部材の作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００７６】
本発明の分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子の関係の好ましい例を、図１２を参照して説明する。図６に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、基板１の凸部１１の上面に固定化されている。そして、微粒子（この場合は球状のビーズ）２は、基板１の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質４５及び微粒子２は、検体が含まれる溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、基板１、接着部材３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図６の例においては、基板の凸部１１上面とカバー部材３との間隔の最短距離が、微粒子２の直径未満となっている。それにより、微粒子が凸部１１上面に接触できなくなり、凸部１１上面上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。微粒子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が微粒子の最小径未満であれば、同様に凸部１１上面と微粒子との接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。
【００７７】
このような本発明の分析用チップは、各種検体の分析に利用することができる。すなわち、本発明の分析用チップの選択結合性物質を固定化した基板に、検体を接触させて該選択結合性物質と選択的に結合させ、基板上に該選択結合性物質を介して結合した該検体の有無又は量を測定することにより、検体を分析することができる。
【００７８】
前記検体の分析方法においては、まず、前記本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質を固定化した基板に検体を接触させて選択的に結合させる。すなわち、基板に上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた溶液（本明細書において「検体溶液」ということがある）とし、基板に接触させれば良い。
【００７９】
選択結合性物質が結合された基板への接触は、検体を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、該基板の凹凸部にピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。
【００８０】
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（登録商標、東レ・デュポン社製）などのポリイミドフィルム製、ポリエステル製、セロハン製又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできる。液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。
【００８１】
封止の具体例を、再び図６を参照して説明する。図６の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、封止部材として可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００８２】
前記検体の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と検体とを相互作用させ、前記検体を、前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質を固定化した基板に結合させることを意味する。本発明の分析用チップの場合には、前記チップを揺動、回転させることにより、重量、振動、遠心力によって微粒子が検体溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。
【００８３】
前記選択結合性物質と検体の選択的結合を行う際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜５０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて、選択結合性物質を固定化した基板を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。
【００８４】
本発明の分析用チップは、分析用チップ内の微粒子を移動させることにより、検体溶液を効率よく撹拌することができる。微粒子を移動させる手段としては、好ましくは分析チップを回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、振とう機に微粒子を含んだ分析チップをセットし基板を振とう若しくは揺動させる方法や、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法が用いられるが、チップを振とう機にセットし、水平面内で旋回回転させる方法が、微粒子の移動範囲が大きく、偏り無く移動するため、その結果、効率よく液を攪拌できるため好ましく用いられる。このとき、旋回回転の回転数は、好ましくは１０〜１０００回転／分であり、より好ましくは１００〜５００回転／分である。
【００８５】
選択的結合の終了後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。
【００８６】
分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記基板上に前記選択結合性物質を介して結合した前記検体の質量を測定する。この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した検体の質量について、公知のスキャナー等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００８７】
前記検体の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者の意味が含まれる。
【００８８】
さらに本発明は分析用キットに関する。ここでいう分析用キットとは、本発明の分析用チップを構成するためのものであり、少なくとも選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液が含まれる。
【００８９】
その他、上記に加えて本発明の分析用キットに含まれうるものとしては、封止シール、アプライ用ティップ、アプライ用スタンド、綿棒等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９０】
本発明の分析用キットの使用方法としては、分析用チップに固定化された選択結合性物質と選択的に結合する検体の検出に使用できる。具体的には、検体を標識し、上記の「反応液」と混合し、これを前記基板と接着されたカバー部材に設けられている貫通孔から分析用チップ内部に注入する。注入終了後の分析用チップの貫通孔を封止シールで塞ぎ、検体と分析用チップ基板表面の選択結合性物質の反応を行ない、検体の標識を検出することで該選択結合性物質と特異的に結合する検体を検出することができる。
【実施例】
【００９１】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。
【００９２】
比較例１
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００９３】
基板としては、図３及び図４に例示される形状を有する基板である、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に、縦３９．４mm、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部（図３の凹部１０に相当）を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部（図３の凸部１１に相当）を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部（図３の凸部１１に相当）上面と平坦部（図３の凸部１３に相当）上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部（図３の凸部１３に相当）上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（図４のＬ１；凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。
【００９４】
上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
【００９５】
（２）選択結合性物質の固定化
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Homo sapiens (human) AROS V4.0（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
【００９６】
（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを図６の３２、３３に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。
【００９７】
（４）検体の調製
検体としては、マイクロアレイの検体として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た
（５）選択結合性物質と検体とのハイブリダイゼーションのための反応液
以下の実施例、比較例で特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。
【００９８】
（６）分析用チップへの微粒子の注入（格納）
上記（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
【００９９】
検体としては、マイクロアレイの検体として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た。
【０１００】
（７）ハイブリダイゼーション反応と気泡発生数の評価
マイクロピペットを用いて、分析用チップ１の基板Ａとカバー部材との空隙（反応槽）に、Ｃｙ３標識ａＲＮＡ２００ｎｇを含む反応液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてカプトンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株）製））を、シート振盪台（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、分析用チップ１をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析用チップ１をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバー蓋を閉めた後、６本の固定ネジを締めて固定し、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製 ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析用チップ１を取り出した。
【０１０１】
カバー部材を通して、分析用チップ１の基板Ａ上に観察された反応液中の気泡数を計数した。分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施した結果、反応液中に発生した気泡数は、１回当たりの平均で１３．０個であった（表１）。
【０１０２】
（８）蛍光シグナル値の測定と検出感度ばらつきの評価
分析用チップ１の基板Ａに接着したカバー部材と両面テープを脱離した後、基板Ａを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板Ａをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した検体の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全９２４８個のスポットのうち、３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。
【０１０３】
気泡の出現によるハイブリダイゼーション反応の反応むらによる検出感度のばらつきの評価として、分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施し、各回におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値＝全回のバックグラウンドシグナル値の標準偏差／全回のバックグラウンドシグナル値の平均値（％））を計算した。その結果、１０回の評価におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）の平均値は１２．１％であった（表１）。
【０１０４】
比較例２
比較例１（５）で調製した反応液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。反応液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ−０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は、装置の表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。
【０１０５】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が９．０個であった（表１）。また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１０．５％であった（表１）。
【０１０６】
実施例１
比較例１（５）で調製した反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製消泡剤“PE-L”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加し、反応液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。反応液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ−０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は装置表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。
【０１０７】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された反応液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の回実施した結果の１回当たりの平均値が１．２個であった（表１）。また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．９％であった（表１）。
【０１０８】
実施例２
反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製消泡剤“ＳＩ”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、実施例１と同様に脱気した分析用チップ１を用いた評価を実施した。脱気時間は２５分間とした。
【０１０９】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が２．９個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．３％であった（表１）。
【０１１０】
実施例３
反応液に、消泡剤として和光純薬工業株式会社製“グリコール酸”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、実施例１と同様に脱気した分析用チップ１を用いた評価を実施した。脱気時間は２５分間とした。
【０１１１】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が４．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．８％であった（表１）。
【０１１２】
実施例４
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ２」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１３】
ＳＤＳをコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、０．１％ＳＤＳ水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。なお、処理前の微粒子の表面粗さを測定したところ、表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）は１６５ｎｍであった。微粒子表面のＲａ値の測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で測定した。中心線平均粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。
【０１１４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．２％であった（表１）。
【０１１５】
実施例５
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ３」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１６】
Ｔｗｅｅｎ２０をコーティングした微粒子は、実施例４と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥して得た。
【０１１７】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．５％であった（表１）。
【０１１８】
実施例６
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ）をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ４」とした。また、反応液については実施例１と同様に調整した。
【０１１９】
ＣＴＡＢをコーティングした微粒子は、実施例４と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥して得た。
【０１２０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が３．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．７％であった（表１）。
【０１２１】
実施例７
実施例４と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については実施例１の反応液に含まれる界面活性剤ＳＤＳ濃度を０．１％から２％に増やしたものを使用した。
【０１２２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．２個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１２３】
実施例８
比較例１（５）で調製した反応液に、和光純薬工業株式会社製消泡剤“PE-L”をｖ／ｖ濃度で０．０５％となるよう添加したこと以外は、比較例１と同様に作製した分析用チップ１を用いた評価を実施した。
【０１２４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が６．２個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．７％であった（表１）。
【０１２５】
実施例９
実施例４と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１２６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．０％であった（表１）。
【０１２７】
実施例１０
実施例４及び８と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１２８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。 また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．６％であった（表１）。
【０１２９】
実施例１１
実施例５と同様に「分析用チップ３」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１３０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１３１】
実施例１２
実施例５及び１０と同様に「分析用チップ３」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ２０に変更したものを使用した。
【０１３２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１３３】
実施例１３
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ６０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ５」とした。
【０１３４】
Ｔｗｅｅｎ６０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｔｗｅｅｎ６０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｔｗｅｅｎ２０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１３５】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ６０に変更したものを使用した。
【０１３６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１３７】
実施例１４
実施例１３と同様に「分析用チップ５」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ６０に変更したものを使用した。
【０１３８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．１％であった（表１）。
【０１３９】
実施例１５
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ６」とした。
【０１４０】
Ｔｗｅｅｎ８０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｔｗｅｅｎ８０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１４１】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に変更したものを使用した。
【０１４２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１４３】
実施例１６
実施例１５と同様に「分析用チップ６」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％Ｔｗｅｅｎ８０に変更したものを使用した。
【０１４４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、５．９％であった（表１）。
【０１４５】
実施例１７
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１４６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．９個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１４７】
実施例１８
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ７」とした。
【０１４８】
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、３％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１４９】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１５０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１５１】
実施例１９
実施例１５と同様に「分析用チップ７」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから３％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８に変更したものを使用した。
【０１５２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．８％であった（表１）。
【０１５３】
実施例２０
実施例４及び８と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７に変更したものを使用した。
【０１５４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．７個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．５％であった（表１）。
【０１５５】
実施例２１
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ８」とした。
【０１５６】
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１５７】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７に変更したものを使用した。
【０１５８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、０．８個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。
【０１５９】
実施例２２
実施例２１と同様に「分析用チップ８」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７に変更したものを使用した。
【０１６０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が０．４個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．３％であった（表１）。
【０１６１】
実施例２３
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．０％であった（表１）。
【０１６３】
実施例２４
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ９」とした。
【０１６４】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１６５】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、１．３個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。
【０１６７】
実施例２５
実施例２４と同様に「分析用チップ９」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に変更したものを使用した。
【０１６８】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、５．９％であった（表１）。
【０１６９】
実施例２６
実施例４及び９と同様に「分析用チップ２」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が２．１個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。
【０１７１】
実施例２７
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＮＰ−４０をコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１０」とした。
【０１７２】
ＮＰ−４０をコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、５％０．１％ ＮＰ−４０水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（０．１％ ＮＰ−４０成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１７３】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７４】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、１．８個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。
【０１７５】
実施例２８
実施例２７と同様に「分析用チップ９」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１０％ＮＰ−４０に変更したものを使用した。
【０１７６】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が１．６個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．９％であった（表１）。
【０１７７】
比較例３
比較例１（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、界面活性剤ＣＨＡＰＳＯをコーティングした直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）し、その他は実施例１と同様に分析用チップを作製した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図１、２、６に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１１」とした。
【０１７８】
ＣＨＡＰＳＯをコーティングした微粒子は、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、１％ＣＨＡＰＳＯ水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＣＨＡＰＳＯ成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させて得た。
【０１７９】
反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから０．１％ＣＨＡＰＳＯに変更したものを使用した。
【０１８０】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数し、１０回の評価の平均値を求めたところ、２．０個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、９．０％であった（表１）。
【０１８１】
比較例４
比較例３と同様に「分析用チップ１１」を用い、反応液については比較例２の反応液に含まれる界面活性剤を０．１％ＳＤＳから１％ＣＨＡＰＳＯに変更したものを使用した。
【０１８２】
比較例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、１０回の評価の平均が４．５個であった（表１）。また、比較例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．１％であった（表１）。
【０１８３】
【表１−１】
【０１８４】
【表１−２】
【０１８５】
【表１−３】
【０１８６】
以上の実施例１〜２８、比較例１〜４の結果から、該チップと検体との反応液が消泡剤、又は非イオン系界面活性剤を含有させることによって、気泡の発生が抑制されてデータのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を低減できること、また検体溶液の脱気処理及びビーズ表面の界面活性剤処理と組み合わせることにより、さらに効果的に気泡の発生を抑制できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明は、検体と選択的に結合する選択結合性物質を固定化した基板を備え、微粒子によって検体溶液を攪拌することのできる分析用チップにおいて、検出感度のばらつきを抑え、高感度の検出を可能とするものである。本発明は、特に医薬・医療分野における様々な生体関連物質の検出等のための分析用チップとして有用であり、その他、食品、環境分野における微量物質の検出のための分析用チップとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図２】図２は、図１の基板の使用により、基板表面に気泡が発生した例を概略的に示す断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す斜視図である。
【図４】図４は、図３の本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図５】図５は、本発明の分析用チップの凹凸部、カバー部材及び微粒子の好ましい関係の一例を概略的に示す斜視図である。
【図６】図６は、本発明の分析用チップの凹凸部、カバー部材及び微粒子の好ましい関係の一例を概略的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【０１８９】
１ 基板
２ 微粒子
３ カバー部材
１０ 凹部
１１ 凸部
１２ 選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３ 平坦部
２６ 発生した気泡の例
３０ 接着部材
３０Ａ 仕切り構造の接着部材
３２ 貫通孔
３３ 液面駐止用チャンバー
３４ 封止部材（テープ）
４５ 基板に固定化された選択結合性物質
Ｌ１ 凸部ピッチ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップ。
【請求項２】
前記消泡剤が、ポリエーテル系消泡剤又はシリコーン系消泡剤である請求項１に記載の分析用チップ。
【請求項３】
前記微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされている、請求項１又は２に記載の分析用チップ。
【請求項４】
前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である、請求項３に記載の分析用チップ。
【請求項５】
前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項６】
前記カバー部材が前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項７】
前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項８】
前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項９】
選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を含む分析用キット。
【請求項１】
選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップであって、該空隙に該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を保持する分析用チップ。
【請求項２】
前記消泡剤が、ポリエーテル系消泡剤又はシリコーン系消泡剤である請求項１に記載の分析用チップ。
【請求項３】
前記微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされている、請求項１又は２に記載の分析用チップ。
【請求項４】
前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である、請求項３に記載の分析用チップ。
【請求項５】
前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項６】
前記カバー部材が前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項７】
前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項８】
前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項９】
選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップと、該選択結合性物質と検体の結合反応のための反応液であって消泡剤及び／又は非イオン界面活性剤を含有する反応液を含む分析用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−８３９１（Ｐ２０１０−８３９１Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９００８６（Ｐ２００８−１９００８６）
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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