分析用試薬および分析用デバイス
【課題】ドライケミストリー方式の装置において、極めて溶解性が高く、血中のＨＤＬコレステロール濃度を正確かつ迅速に測定できる前処理試薬を提供することを目的とする。
【解決手段】ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とし、試薬のドライ化および潮解性を改善できる。
【解決手段】ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とし、試薬のドライ化および潮解性を改善できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料の高比重リポ蛋白コレステロールを精度よく分析するための試薬および分析用デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、１台の装置により血液等の生物学的試料と分析試薬と反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。
【０００３】
しかしながら、すべての病院においてそのような装置が導入されているわけではなく、特に診療所等の小規模な医療機関においては、運用コスト等の様々な理由により、試料の分析を外部委託するという形態をとる病院も少なくない。分析を外部委託する形態をとる場合、分析結果を得るまでに時間を要し、その結果、患者は検査結果に基づく適切な治療を受けるために、必然的に再来院を余儀なくされるという不便さや、急患等の緊急を要する場合の迅速対応が難しい等の問題がある。
【０００４】
そのような背景により、医療の現場から低コスト、試料液の少量化、装置の小型化、短時間測定など、より高精度で、運用の自由度が高い分析装置の登場が望まれている。このような迅速で簡便な診断システムは、ポイント・オブ・ケア・テスティング（以下、ＰＯＣＴ）と呼ばれ、検査の必要性が生じた時、被検者の傍らで迅速に検査結果が得られ、医療の質の向上、患者の生活の質向上ということに主眼を置いた検査として定義されている。
【０００５】
ＰＯＣＴで定義されるような運用の自由度、および医療サービスの質を向上させることができるような分析装置を実現するためには、例えば、患者負担の少ない指先採血等で採取される少量の検体から複数種の成分濃度を短時間で高精度に測定できるという条件を満たすことが一つの理想形であろう。しかしながら、指先採血等でストレス無く得られる検体量は、せいぜい十数マイクロリットル程度であり、そのような少量の検体から前述の条件、特に複数種の成分分析を高精度に行うことは、技術的に難しい。特に、前処理を必要とする分析項目については、少量の検体に対し短時間で繰り返し精度のよい前処理を行うことが難しく、十分な測定精度を持つ製品はいまだ数少ない状況にある。
【０００６】
特許文献１には、前処理用の試薬が多孔質体に担持されており、そこに検体を浸透させることにより検体の前処理（血球分離および沈澱、分離処理）を実施し、高比重リポ蛋白コレステロール（以下、ＨＤＬコレステロール）を測定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平７−６６００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血中のコレステロールは、脂質と蛋白質の複合体であるリポ蛋白の構成成分として体内を循環する。リポ蛋白は比重の差によって分類されており、比重の低い順にカイロミクロン、超低比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、高比重リポ蛋白（以下ＨＤＬ）と大きく分かれている。このＨＤＬに含まれるコレステロールがＨＤＬコレステロールであり、俗に善玉コレステロールと呼ばれるように動脈硬化の負の因子であることが明らかとなっている。そのため、このＨＤＬコレステロールは主に動脈硬化のリスク評価や、脂質代謝異常のスクリーニング用途に分析されている。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定方法は、大きく２通りに分けることができる。
第１の分析手法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿、除去後、残存したＨＤＬに含まれるＨＤＬコレステロールを分析する手法があるが、この手法は手技により煩雑な前処理を実施しなければならない問題が存在する。また、特許文献１のように、小型の多孔質体に前処理試薬を担持させ、その多孔質体に少量の検体を浸透させることで、沈殿発生と沈殿除去処理を自動で行うドライケミストリーと呼ばれる装置も存在するが、前処理反応が多孔質体と毛細管力を利用したものであるため、多孔質体の孔径等の物理的形状のばらつきや、多孔質体内部に先に導入された検体先端部とその後に導入された検体の間の前処理試薬濃度勾配や、検体の物理特性のばらつきにより、沈殿生成除去にムラが生じやすい等の問題が存在する。また前記前処理試薬としては、ポリアニオンと二価の陽イオンからなるものが一般的であるが、そのままではドライ化時の潮解性および溶解性に問題がある。
【００１０】
第２の分析手法は、ある特定の高分子材料や界面活性剤を使用することにより、ＨＤＬコレステロール以外のリポ蛋白コレステロールの反応性を阻害する等の効果を発揮し、沈殿生成、除去等の前処理行程自体を省略するものである。これは直接法と呼ばれ、現在ＨＤＬコレステロールの分析方法として主流となっているが、前記大型の自動分析装置用に開発された方法であるため、前述の通り装置が大型であったり、運用コストの問題から全ての医療機関での導入が難しい。また、試薬形状が液体であるということを前提に設計されているため、その使用には多くの機械的機構が必要であり装置の小型化も難しく、ＰＯＣＴとして運用するにあたっての短所を有し、ＰＯＣＴで定義されるような運用に至っていないというのが現状である。
【００１１】
本発明は、ＰＯＣＴで定義されるような医療サービスの質、患者の生活の質向上を実現するために、我々は、患者負担軽減のために指先採血による十数マイクロリットル以下の血液検体で分析が可能、かつ数分という短時間で高精度に血中の目的成分を測定できるシステムが必要であると考え、それを満たすための方法としてドライケミストリー方式の測定システムを選択し、その方式において血中のＨＤＬコレステロール濃度を正確で短時間に測定できる極めて溶解性が高く、かつ安定性の高い前処理試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の分析用試薬は、生物学的試料に含まれるＨＤＬコレステロールを分析するに当たり、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の分析用試薬は、生物学的試料に含まれるＨＤＬコレステロールを分析するに当たり、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする。
【００１４】
具体的には、前記ジカルボン酸が、コハク酸またはグルタル酸またはグルコン酸のいずれかであることを特徴とする。
具体的には、前記糖アルコールが、マルチトールまたはグリシトールまたはラクチトールまたはマンニトールのいずれかであることを特徴とする。
【００１５】
具体的には、前記二糖類が、スクロールまたはラクトースまたはトレハロースのいずれかであることを特徴とする。
具体的には、前記三糖類が、ラフィノースまたはマルトトリオースのいずれかであることを特徴とする。
【００１６】
具体的には、前記ポリアニオン化合物が、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からからなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする。
【００１７】
具体的には、前記二価の陽イオン化合物が、マグネシウムイオン化合物、またはマグネシウムイオン化合物塩、カルシウムイオン化合物、またはカルシウムイオン化合物塩からなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする。
【００１８】
本発明の分析用デバイスは、試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持していることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の分析用デバイスは、試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類のうちの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の分析用試薬は、コハク酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールから選択される化合物を少なくとも１つ以上含んでいることによって、前処理試薬の溶解性を高めることができ、短時間で前処理が可能であり、濃度勾配や検体毎に異なる物理的性質の影響を受けにくいことから均一な処理が可能である。これにより、ＨＤＬコレステロールを短時間で高精度に測定することができる。
【００２１】
詳しくは、本発明の分析用試薬は、ポリアニオンと二価の陽イオンからなる公知の技術を基にするが、そのままではドライ化時の潮解性および溶解性に問題があり、前記課題を解決することができない。その課題を解決するためにドライ化時の潮解性の軽減とその溶解性を向上させたものである。
【００２２】
前処理試薬の潮解性を軽減し、溶解性を向上させるための手段として、各試薬成分の塩の種類や添加剤の選定が重要になってくる。これは塩の種類や添加剤によって、潮解性の強弱や溶解性が大きく変化するからである。試薬成分の塩の種類としては、全ての化合物について当てはまるとはいえないが、例えば塩酸塩よりも硫酸塩の方が潮解性が低い傾向がある。また、添加剤については、試薬混合物の乾燥時の結晶状態を例えば巨大な結晶が析出し、溶解性の面で不利となる単結晶多寡の状態から、より溶解性の面で有利となる細かい結晶の集まりである多結晶状態やアモルファス、無結晶状態へと変化させ溶解性を向上させたり、潮解性の高い試薬成分を添加剤の結晶構造中に取り込み、コーティングするような効果で潮解性を低減させる効果を有している。ポリアニオン化合物については、非ＨＤＬを沈殿させるという機能を実現するのみであれば以下にあげる、リンタングステン酸、リンモリブデン酸、タングステン酸、モリブデン酸、それらの無機塩類、またはデキストラン硫酸、ヘパリン、硫酸アミロース、アミロペクチン硫酸等の硫酸多糖類から選択することができるが、前記条件を満たすためにはリンタングステン酸、リンモリブデン酸、またはそれらの塩から選択することが望ましく、更にいえばリンタングステン酸ナトリウムがよい。次に前記ポリアニオン化合物と組み合わされる二価の陽イオン化合物としては、非ＨＤＬを沈殿させるという機能を実現させるのみであれば以下に挙げるように、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、ストロンチウム、亜鉛、バリウム、銅の２価のイオン、またはアルミニウム、鉄、クロムの二価以外のイオン、またはアンモニウムイオンから選択することができる。しかしながら前記ポリアニオンの場合と同じく前記条件を満たすためにはカルシウム、またはマグネシウムイオンから選択することが望ましく、更に化合物名でいえば、硫酸カルシウムと硫酸マグネシウムを選択することが望ましく、これらを組み合わせて用いるのがよい。非ＨＤＬを沈殿させるためには前記ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせで実施可能であるが、前述の通り固体状態での溶解性や潮解性の低減条件を満たすためには、さらに添加剤の追加が必須である。添加剤としては糖類、アミノ酸、常温で固体のジカルボン酸またはその塩が望ましく、更に言えば糖類であればマンニトール、マルチトールが望ましく、アミノ酸であればアラニン、グリシン、ヒスチジン、ジカルボン酸であればコハク酸またはその塩が望ましく、前記ポリアニオンと二価の陽イオンの組み合わせと本発明の分析用デバイスに最も適するものはコハク酸二ナトリウムである。
【００２３】
この組み合わせからなる前処理試薬は、ドライ化時の潮解性が低く、かつ生物学的試料接触時の溶解性が極めて高いという性質を有し、この前処理試薬を使用することによる分析システムを使用することにより、前記ＰＯＣＴの定義に合致したＨＤＬコレステロールの測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】参照試薬と参照試薬に各種の添加剤を入れた試薬の実験結果の説明図
【図２】本発明の試薬を有する分析用デバイスを使用したＨＤＬコレステロールの分析フロー図
【図３】同分析用デバイスによるＨＤＬコレステロールの測定値の直線性の説明図
【図４】同実施の形態の分析装置のドアを開いた状態の斜視図
【図５】同実施の形態の分析装置の断面図
【図６】同実施の形態の分析装置の構成図
【図７】同実施の形態の分析用デバイスに点着しターンテーブルにセットして回転させる前の状態図
【図８】同実施の形態において分析用デバイスを揺動させる状態図とターンテーブルを時計方向に回転駆動して測定チャンバーおよび保持キャビティに流れ込んだ状態図
【図９】同実施の形態において分析用デバイスを揺動させる状態図とターンテーブルを時計方向に回転駆動させて操作キャビティの試薬と反応した希釈血漿が分離キャビティに流れ込み、さらに高速回転を維持することで、操作キャビティ内で生成された凝集物を遠心分離する状態図
【図１０】同実施の形態においてターンテーブルを停止させ希釈血漿が計量流路に流れて定量が保持された状態図と計量流路に保持されていた希釈血漿が測定チャンバーに流れ込んだ状態図
【図１１】同実施の形態において測定チャンバーの希釈血漿と試薬との反応が開始される状態図と試薬と希釈血漿の攪拌の状態図
【図１２】同実施の形態の分析用デバイスの図８におけるＦ−Ｆ断面図
【図１３】同実施の形態の分析用デバイスの毛細管エリアにおける試薬の担持状態を示す拡大平面図とＧ−Ｇ断面図
【図１４】同実施の形態の分析用デバイスの操作キャビティにおける試薬の担持状態を示す拡大平面図とＨ−Ｈ断面図
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図１〜図１４に基づいて説明する。
図４〜図６は分析用ディスク１とこれを使用する分析装置１００を示し、図７〜図１４は分析用ディスク１の内部の具体的な流路を示している。
【００２６】
分析用デバイス１は、微細な凹凸形状を表面に有するマイクロチャネル構造が片面に形成されたベース基板３と、ベース基板３の表面を覆うカバー基板４とを貼り合わせたものに、試料液飛散防止用の保護キャップ２が取り付けられている。
【００２７】
図７は、カバー基板４との貼り合わせ面から見たベース基板３を示しており、この図７から分かるように、分析用デバイス１の内部には、希釈液が入った希釈液容器５がセットされるとともに、収容エリアのうちの必要なものには各種の分析に必要な前処理剤としての試薬５８ａ１，５８ａ２，５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２，６７ａ，６７ｂが予め担持されている。
【００２８】
保護キャップ２を開いて露出した注入口１３に試料液を点着して保護キャップ２を閉じることによって、希釈液容器５が分析用デバイス１の内部で移動して開封リブ１１ａによってシール部材９が破られて、希釈液が希釈液容器５から流出する。
【００２９】
この分析用デバイス１を、図４に示す分析装置１００のターンテーブル１０１にセットした後にドア１０３を閉じると、セットされた分析用デバイス１は、図５に示すようにドア１０３の側に設けられたクランパ１０４によって、ターンテーブル１０１の回転軸心上の位置が付勢手段としてのバネ１０５ａの付勢力でターンテーブル１０１の側に押さえられて、分析用デバイス１は回転駆動手段１０６のブラシレスモータ７１ａによって回転駆動されるターンテーブル１０１と一体に回転する。１０７はターンテーブル１０１の回転中の軸心を示している。
【００３０】
この実施の形態では、ターンテーブル１０１は、傾斜した回転軸心１０７に取り付けられて水平線Ｈに対して角度θ°だけ傾斜しており、分析用デバイス１の回転停止位置に応じて、分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の方向を制御できる。
【００３１】
分析装置１００の電気制御系は図６に示すように構成されている。
この分析装置１００は、ターンテーブル１０１を回転させるための回転駆動手段１０６と、分析用デバイス１内の溶液を光学的に測定するための光学測定手段１０８と、ターンテーブル１０１の回転速度や回転方向および光学測定手段の測定タイミングなどを制御する制御手段１０９と、光学測定手段１０８によって得られた信号を処理し測定結果を演算するための演算部１１０と、演算部１１０で得られた結果を表示するための表示部１１１とで構成されている。
【００３２】
回転駆動手段１０６は、ターンテーブル１０１を介して分析用デバイス１を回転軸心１０７の回りに任意の方向に所定の回転速度で回転させるだけではなく、所定の停止位置で回転軸心１０７を中心に所定の振幅範囲、周期で左右に往復運動をさせて分析用デバイス１を揺動させることができるように構成されている。
【００３３】
光学測定手段１０８には、分析用デバイス１の測定部に特定の波長光を照射するための光源１１２と、光源１１２から照射された光のうち、分析用デバイス１を通過した透過光の光量を検出するフォトディテクタ１１３とを備えている。
【００３４】
分析用デバイス１をターンテーブル１０１によって回転駆動すると、注入口１３から内部に取り込んだ試料液が、注入口１３よりも内周にある回転軸心１０７を中心に分析用デバイス１を回転させて発生する遠心力と、分析用デバイス１内に設けられた毛細管流路の毛細管力を用いて、分析用デバイス１の内部で移送していくよう構成されており、この分析用デバイス１のマイクロチャネル構造を分析工程とともに詳しく説明する。
【００３５】
保護キャップ２を開いて注入口１３に試料液を直接に分析用デバイス１に付けることによって、注入口１３の付近に付着した試料液が誘導部１７の毛細管力によって分析用デバイス１の内部に取り込まれる。図７の２５ａ〜２５ｍはベース基板３に形成された空気孔である。
【００３６】
ドア１０３を閉じた後にターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、保持されている試料液が毛細管キャビティ１９と受容キャビティ２３ａを介して分離キャビティ２３ｂ，２３ｃに流入し、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃで血漿成分と血球成分とに遠心分離される。希釈液容器５から流出した希釈液は、排出流路２６を介して保持キャビティ２７に流入する。
【００３７】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、血漿成分は分離キャビティ２３ｂの壁面に形成された毛細管キャビティ３３に吸い上げられ、連結流路３０を介して計量流路３８に流れて定量が保持される。
【００３８】
また、希釈液８は保持キャビティ２７と混合キャビティ３９を連結しているサイホン形状を有する連結流路４１内に呼び水される。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、計量流路３８に保持されていた血漿成分は大気開放キャビティ３１の位置で破断し、定量だけ混合キャビティ３９に流れ込み、保持キャビティ２７内の希釈液８も連結流路４１を介して混合キャビティ３９に流れ込む。
【００３９】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止し、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を４０〜８０Ｈｚの周波数で制御して、混合キャビティ３９内に移送された希釈液８と血漿成分からなる測定対象の希釈血漿４０を攪拌する。
【００４０】
その後に、分析用デバイス１を図８（ａ）に示す位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を８０〜２００Ｈｚの周波数で制御して、混合キャビティ３９に保持される希釈血漿４０を希釈血漿４０の液面よりも内周側に形成された毛細管流路３７の入口まで移送する。
【００４１】
毛細管流路３７の入口まで移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって毛細管流路３７内に吸い出され、毛細管流路３７、計量流路４７ａ，４７ｂ，４７ｃ、溢流流路４７ｄに順次移送される。
【００４２】
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図８（ｂ）に示すように、計量流路４７ａ，４７ｂ，４７ｃに保持されていた希釈血漿４０は、大気と連通する大気開放キャビティ５０との連結部である屈曲部４８ａ，４８ｂ，４８ｃ，４８ｄの位置で破断して、定量だけ測定チャンバー５２ｂ，５２ｃおよび保持キャビティ５３に流れ込む。
【００４３】
また、このとき溢流流路４７ｄに保持されていた希釈血漿４０は、逆流防止通路５５を介して溢流キャビティ５４に流れ込む。また、このとき毛細管流路３７内の希釈血漿４０は、溢流キャビティ２９ｂ，溢流流路２８ｂを介して溢流キャビティ２９ｃに流れ込む。計量流路４７ａの一部の側壁は屈曲部４８ａの近傍に大気開放キャビティ５０と連通するよう凹部４９が形成されている。測定チャンバー５２ａ〜５０ｃの形状は、遠心力の働く方向に伸長した形状で、分析用デバイス１の回転中心から最外周に向かって分析用デバイス１の周方向の幅が細く形成されている。複数の測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの外周側の底部は、分析用デバイス１の同一半径上に配置されている。
【００４４】
さらに、各測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの周方向に位置する側壁の一側壁には、前記測定チャンバーの外周位置から内周方向に伸長するように毛細管エリア５６ａ〜５６ｃが形成されている。図８（ｂ）におけるＦ−Ｆ断面を図１２に示す。
【００４５】
測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの光路長は、それぞれの検査対象の成分と試薬を反応させた後の混合溶液から得られる吸光度の範囲によって調整されている。
また、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃ内には図１３（ａ）に示すように、それぞれの検査対象の成分と反応させるための試薬５８ａ１，５８ａ２,５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２が、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃ内に形成された試薬担持部５７ａ１，５７ａ２，５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３，５７ｃ１，５７ｃ２に担持されている。図１３（ａ）におけるＧ−Ｇ断面を図１３（ｂ）に示す。
【００４６】
試薬担持部５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３のカバー基板４との隙は、毛細管エリア５６ｂのカバー基板４との隙より薄くなるよう毛細管エリア５６ｂより突出して形成している。
【００４７】
毛細管エリア５６ｂは、５０〜３００μｍ程度の毛細管力が作用する隙で形成しているため、試薬担持部５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３は毛細管エリア５６ｂよりも数十μｍ程度突出するように形成している。毛細管エリア５６ａ，５６ｃにおいても同様に構成されている。
【００４８】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止し、分析用デバイス１を図９（ａ）に示す位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を６０〜１２０Ｈｚの周波数で制御して、保持キャビティ５３に保持される希釈血漿４０を希釈血漿４０の液面に浸かるよう保持キャビティ５３の側壁に形成された連結部５９を介して毛細管力の作用により操作キャビティ６１に移送する。
【００４９】
さらにターンテーブル１０１を１２０〜２００Ｈｚの周波数で制御して、図１４（ａ）に示す操作キャビティ６１に担持された試薬６７ａ，６７ｂと希釈血漿４０を攪拌し、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬を反応させる。ここで操作キャビティ６１は測定チャンバー５２ａへ到着前のマイクロチャネル構造の流路である。
【００５０】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって図９（ａ）に示すように毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられ、この時点で試薬５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２の溶解が開始され、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬の反応が開始される。
【００５１】
次に、ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図９（ｂ）に示すように、操作キャビティ６１の試薬と反応した希釈血漿が連結通路６４を通過して分離キャビティ６６に流れ込み、さらに高速回転を維持することで、操作キャビティ６１内で生成された凝集物を遠心分離する。ここで、この実施の形態では、検査対象の成分と試薬を反応させる際に、前記反応を阻害する成分を前工程で排除するよう構成しており、操作キャビティ６１で希釈血漿を試薬と反応させることで、後工程の反応を阻害する特定の成分を凝集処理し、次工程で遠心分離することで前記凝集物を排除している。
【００５２】
また、毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５３】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、希釈血漿４０は分離キャビティ６６の壁面に形成された毛細管キャビティ６９に吸い上げられ、毛細管キャビティ６９と連通する連結流路７０を介して図１０（ａ）に示すように計量流路８０に流れて定量が保持される。
【００５４】
また、分離キャビティ６６内の凝集物を含む希釈血漿４０は、分離キャビティ６６と溢流キャビティ８１ａを連結しているサイホン形状を有する連結流路６８内に呼び水される。
【００５５】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された試薬と希釈血漿の混合溶液は、毛細管力によって再び毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられる。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図１０（ｂ）に示すように、計量流路８０に保持されていた希釈血漿４０は、大気と連通する大気開放キャビティ８３との連結部である屈曲部８４の位置で破断して、定量だけ測定チャンバー５２ａに流れ込む。
【００５６】
また、分離キャビティ６６および連結通路７０、毛細管キャビティ６９内の希釈血漿４０はサイホン形状の連結流路６８を介して溢流キャビティ８１ａに流れ込む。
また、毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５７】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、測定チャンバー５２ａに移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって図１１（ａ）に示すように毛細管エリア５６ａに吸い上げられ、この時点で試薬５８ａ１，５８ａ２の溶解が開始され、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬の反応が開始される。
【００５８】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された試薬と希釈血漿の混合溶液は、毛細管力によって再び毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられる。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図１１（ｂ）に示すように、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ａ，５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５９】
分析用デバイス１を反時計方向（Ｃ１方向）または時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動して、各測定チャンバー５２ａ，５２ｂ，５２ｃが光源１１２とフォトディテクタ１１３の間を通過するタイミングに、演算部１１０がフォトディテクタ１１３の検出値を読み取って、特定成分の濃度を算出する。
【００６０】
測定チャンバー５２ａにおいてＨＤＬコレステロールを定量測定する場合には、試薬６７ａ，６７ｂとして、次のように調製したものを使用している。
血液検体から、ＨＤＬ以外のリポ蛋白である非ＨＤＬを除去するにあたっては、ポリアニオンと二価の陽イオンが必要である。一般的にポリアニオンとしては前述の通りリンタングステン酸、リンモリブデン酸、タングステン酸、モリブデン酸、それらの無機塩類、またはデキストラン硫酸、ヘパリン、硫酸アミロース、アミロペクチン硫酸等の硫酸多糖類からなる群より選択することができるが、溶解性や分析用デバイス上に固体状態で長期間安定に配置する必要性があることを考慮した場合、これらの内の無機化合物が望ましく、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からなる群の少なくとも一種から選択されることが望ましい。二価の陽イオンとしては、前述の通りカルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、ストロンチウム、亜鉛、バリウム、銅のイオンからなる群の少なくとも一種より選択できるが、分析用デバイス内で酵素による反応を行うことを考慮すると、酵素を失活させる可能性を有する金属イオンは望ましくなく、入手難易度を考慮するとカルシウムおよびマグネシウムから選択することが望ましい。さらに溶解性を考慮するとマグネシウムが望ましく、また潮解性を考慮すると硫酸塩つまり硫酸マグネシウムを使用することが望ましい。また、さらに前記リンタングステン酸ナトリウムと硫酸マグネシウム混合物に硫酸カルシウムを添加することが望ましく、これは結晶状態を変化させ試薬の溶解性を向上させる働きを有している。
【００６１】
リンタングステン酸ナトリウム ２０ｍｇ／ｍｌ
硫酸マグネシウム ４０ｍｇ／ｍｌ
硫酸カルシウム １２ｍＭ
コハク酸二ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ
非ＨＤＬの除去方法は、まず上記組成の試薬を調整し試験管へ２０μｌ滴下し、乾燥させた。一般人から採取した血液検体をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で４倍に希釈し、その検体２００μｌを前記乾燥させた試薬へ加え、ボルテックスミキサーにより４５秒攪拌後、７５秒静置し、生じた非ＨＤＬの凝集を１５００Ｇで３０秒間遠心分離した。検体の希釈倍率は２倍以上であれば本実施例の試薬がそのまま適用可能であるが、それ以下の検体希釈倍率の場合は各試薬成分の濃度を調整することで適用可能である。非ＨＤＬが除去された上澄み液を分取し、液中のコレステロール（ＨＤＬコレステロールに当る）を、株式会社日立ハイテクノロジーズ製７０２０形自動分析装置によって積水メディカル株式会社製「コレステスト−ＣＨＯ」を使用して測定した。
【００６２】
試薬の潮解性の判断方法としては、試薬を樹脂基板上に乾燥担持し、気温３０℃湿度８０％の条件下で３０分暴露後、樹脂基板水平方向に遠心力がかかるように５００Ｇで遠心し、遠心力方向への試薬の流れ出しの有無により潮解性の有無を判断した。この潮解性の有無の判断については、分析用デバイス１は、内部の検体移送等に遠心力を利用しており、それにより遠心力がかかった状態で試薬が飛散しないことが重要な判断基準になることを理由としている。
【００６３】
上記手順による非ＨＤＬコレステロールの除去率と潮解性の有無について本試薬とコハク酸二ナトリウムを含まない参照試薬、およびコハク酸二ナトリウム以外の添加剤を添加した試薬についての比較を実験結果を示す図１に示した。
【００６４】
ここでは前記添加剤として、図１に示すように下記のものを実験した。
ジカルボン酸では、コハク酸二ナトリウム、グルタル酸、グルコン酸ナトリウムを実験した。
【００６５】
アミノ酸では、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、バリン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン酸ナトリウム、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、プロリン、リシン・ＨＣｌ、アルギニン、システイン、ヒスチジン・ＨＣｌ、トレオニン、セリン、グリシルグリシン、アセチルグリシリン、アミノ酸様化合物であるタウリンを実験した。
【００６６】
糖アルコールでは、マルチトール、グルシトール、ラクチトール、マンニトールを実験した。
糖類では、単糖類ではグルコース、キシロースを実験し、二糖類ではスクロース、トレハロースを実験し、三糖類ではマルトトリオース、ラフィノース、ラクトースを実験した。
【００６７】
非ＨＤＬコレステロール除去率が１００％を大きく超えているものについては、ＨＤＬコレステロール自体も除去される過剰または異常な反応を起こしていると推測される。また潮解性については添加剤の種類と濃度が重要なファクターであり、図１の潮解性の欄には参考として潮解しにくい添加濃度条件について示している。添加剤を含まない参照試薬の非ＨＤＬコレステロール除去率２５％を上回る有効な添加剤は数多く存在することがわかるが、さらにより短い時間での検体中の非ＨＤＬコレステロールの除去、および分析用デバイス上に安定に固体状態で配置するための潮解性の無さが重要である。
【００６８】
図１より、コハク酸二ナトリウムを含まない公知の参照試薬では非ＨＤＬコレステロールの除去が２５％と不十分で、かつ潮解性を有するのに対し、コハク酸二ナトリウムを含んだ本試薬は非ＨＤＬコレステロールの除去が９２％と高い除去率と潮解性の無さを両立させている。
【００６９】
また非ＨＤＬコレステロール除去率については１００±２０％の範囲に入っていることを最適な添加剤の条件とし、その結果、最適な添加剤として、コハク酸二ナトリウム以外では、グルコン酸ナトリウム、アラニン、グリシンまたはバリン、ヒスチジン、マルチトールおよびマンニトールも優れた除去率、および潮解性の無さを有している。
【００７０】
また、これらの添加剤について潮解性を低減する添加濃度についてはコハク酸二ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、アラニン、グリシンまたはバリンおよびヒスチジンについては５ｍｇ／ｍｌ以上、マルチトールとマンニトールでは１ｍｇ／ｍｌ以上１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で効果を有している。
【００７１】
前記の本試薬を、分析用デバイス１の操作キャビティ６１の上に固体状態で配置して
ＨＤＬコレステロール濃度を測定する場合を、図２により説明する。
まず、ステップＳ１では、血液検体を検体導入部としての誘導部１７へ導入する。導入方法としては、指先採血による血液を注入部１３へ直接に点着するか、注射器等で採血管へ採血された血液をピペット等の器具を使用し採血管から血液を取り出して注入部１３へ点着しても良い。
【００７２】
ステップＳ２では、導入された血液検体を血球分離部としての分離キャビティ２３ｂ，２３ｃへ移送し、遠心力により血球成分と血漿成分を分離する。なお、血液検体としては全血に限定するものではなく、血清の導入も可能であり、その場合、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃの省略も可能である。また、検体の移送に関しては毛細管力、サイフォン構造および遠心力を組み合わせて行った。
【００７３】
ステップＳ３では、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃで分離された血漿成分を検体定量部としての計量流路３８へ移送し、任意の量の検体を定量分取する。
ステップＳ４では、定量された検体を検体希釈部としての混合キャビティ３９へ移送し、検体を任意の希釈倍率に希釈する。この検体の希釈倍率は分析システムの検出感度や分析用デバイスに必要な液量等により設定される。
【００７４】
ステップＳ５では、希釈された検体を希釈検体定量部としての計量流路４７ａへ移送し、希釈検体から任意の量の検体を定量分取する。
ステップＳ６では、その定量された検体を固体状態で配置された前処理試薬担持部としての操作キャビティ６１へ移送する。この操作キャビティ６１の試薬６７ａ，６７ｂで非ＨＤＬを凝集させる。
【００７５】
ステップＳ７では、非ＨＤＬ分離部としての分離キャビティ６６へ移送し遠心力により非ＨＤＬの凝集を取り除く。
ステップＳ８では、ＨＤＬが残った上澄み部分を酵素試薬担持部としての毛細管エリア５６ａへ移送する。この一連の非ＨＤＬの分離除去動作は攪拌を６０秒行い、その後、静置することなく５００Ｇで３０秒遠心分離することで行った。毛細管エリア５６ａにはコレステロールと特異的に反応し、コレステロールの濃度に応じた呈色反応する公知の酵素、色原体等の試薬５８ａ１，５８ａ２が固体状態で配置されている。
【００７６】
ステップＳ９では、毛細管エリア５６ａでＨＤＬコレステロール濃度に応じ呈色した検体を測定部としての測定チャンバー５２ａへ移送し、呈色の度合いを測定装置により光を照射しその吸光度を測定する。この検体の吸光度から、あらかじめ作成した検量線によりコレステロール濃度へと換算することで、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を求めることができる。
【００７７】
図３は、一般人から採取した血液検体について、分析用デバイス１を使用してＨＤＬコレステロール濃度の測定を行った結果であり、株式会社日立ハイテクノロジーズ製７０２０形自動分析装置によって積水メディカル株式会社製ＨＤＬ−コレストロールキット「コレステストＮ−ＨＤＬ」を使用した測定値を参照値として示した。
【００７８】
本試薬を使用した分析用デバイス１によるＨＤＬコレステロール濃度の測定では、参照値に対して相関係数０．９７９の良好な直線性を有しており、短時間の前処理でも十分なＨＤＬコレステロール濃度の測定能力を有していることがわかる。また本試薬は固体状態で分析用デバイス上に配置されるため、分析用デバイス自体を小型化することが可能であり、本実施例に必要な血液検体量は十数マイクロリットルであって、少ない検体量で短時間に高精度でＨＤＬコレステロール濃度を自動的に測定することができるので、ＰＯＣＴに定める所の医療の質向上や患者負担の軽減に有用である。
【００７９】
上記の添加剤の選別にあたっては１００±２０％の範囲に入っていることを最適な添加剤の条件としたが、参照試薬が単独の場合の非ＨＤＬコレステロール除去率が２５％であるのに比べると、非ＨＤＬコレステロール除去率が２５％を越えて１００＋２０％に選別の条件を拡大した場合であっても、分析装置の高性能化を実現できる。この条件に拡大することによって前記添加剤としては、図１の実験結果におけるグルタル酸、タウリン、グルシトール、ラクチトール、キシロース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、ラフィノース、ラクトースを添加剤とすることができる。このように条件に拡大することによって前記添加剤とできた各添加剤の添加濃度は、それぞれグルタル酸、タウリン、ラクチトール、キシロース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、ラフィノース、ラクトースについては５ｍｇ／ｍｌ以上、グルシトールについては５ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下程度であった。
【００８０】
なお、図１の実験例では添加剤として何れかを添加して前処理試薬としての試薬６７ａ，６７ｂとしたが、有効な添加剤の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含む場合であっても同様である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、生物などから採取した液体の成分分析に使用する分析用デバイスの小型化ならびに高性能化に寄与できる。
【符号の説明】
【００８２】
１ 分析用ディスク
２ 保護キャップ
３ ベース基板
４ カバー基板
５ 希釈液容器
８ 希釈液
９ シール部材
１１ａ 開封リブ
１３ 注入口
２８ｂ 溢流流路
２９ｂ 溢流キャビティ
２９ｃ 溢流キャビティ
１７ 誘導部（検体導入部）
１９ 毛細管キャビティ
２３ａ 受容キャビティ
２３ｂ，２３ｃ 分離キャビティ（血球分離部）
２５ａ〜２５ｍ 空気孔
２６ 排出流路
２７ 保持キャビティ
３０ 連結流路
３１ 大気開放キャビティ
３３ 毛細管キャビティ
３７ 毛細管流路
３８ 計量流路（検体定量部）
３９ 混合キャビティ（検体希釈部）
４０ 希釈血漿
４１ 連結流路
４７ａ 計量流路（希釈検体定量部）
４７ｂ，４７ｃ 計量流路
４７ｄ 溢流流路
４８ａ，４８ｂ，４８ｃ，４８ｄ 屈曲部
４９ 凹部
５０ 大気開放キャビティ
５２ａ 測定チャンバー（測定部）
５２ｂ，５２ｃ 測定チャンバー
５３ 保持キャビティ
５４ 溢流キャビティ
５５ 逆流防止通路
５６ａ〜５６ｃ毛細管エリア（酵素試薬担持部）
５７ａ１，５７ａ２ 試薬担持部
５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３ 試薬担持部
５７ｃ１，５７ｃ２ 試薬担持部
５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２ 試薬
５８ａ１，５８ａ２ 試薬
５９ 連結部
６１ 操作キャビティ（前処理試薬担持部）
６４ 連結通路
６６ 分離キャビティ（非ＨＤＬ分離部）
６７ａ，６７ｂ 試薬
６８ 連結流路
６９ 毛細管キャビティ
７０ 連結流路
７１ａ ブラシレスモータ
８０ 計量流路
８１ａ 溢流キャビティ
８３ 大気開放キャビティ
８４ 屈曲部
１００ 分析装置
１０１ ターンテーブル
１０３ ドア
１０４ クランパ
１０５ａ バネ
１０６ 回転駆動手段
１０７ 回転軸心
１０８ 光学測定手段
１０９ 制御手段
１１０ 演算部
１１１ 表示部
１１２ 光源
１１３ フォトディテクタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料の高比重リポ蛋白コレステロールを精度よく分析するための試薬および分析用デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、１台の装置により血液等の生物学的試料と分析試薬と反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。
【０００３】
しかしながら、すべての病院においてそのような装置が導入されているわけではなく、特に診療所等の小規模な医療機関においては、運用コスト等の様々な理由により、試料の分析を外部委託するという形態をとる病院も少なくない。分析を外部委託する形態をとる場合、分析結果を得るまでに時間を要し、その結果、患者は検査結果に基づく適切な治療を受けるために、必然的に再来院を余儀なくされるという不便さや、急患等の緊急を要する場合の迅速対応が難しい等の問題がある。
【０００４】
そのような背景により、医療の現場から低コスト、試料液の少量化、装置の小型化、短時間測定など、より高精度で、運用の自由度が高い分析装置の登場が望まれている。このような迅速で簡便な診断システムは、ポイント・オブ・ケア・テスティング（以下、ＰＯＣＴ）と呼ばれ、検査の必要性が生じた時、被検者の傍らで迅速に検査結果が得られ、医療の質の向上、患者の生活の質向上ということに主眼を置いた検査として定義されている。
【０００５】
ＰＯＣＴで定義されるような運用の自由度、および医療サービスの質を向上させることができるような分析装置を実現するためには、例えば、患者負担の少ない指先採血等で採取される少量の検体から複数種の成分濃度を短時間で高精度に測定できるという条件を満たすことが一つの理想形であろう。しかしながら、指先採血等でストレス無く得られる検体量は、せいぜい十数マイクロリットル程度であり、そのような少量の検体から前述の条件、特に複数種の成分分析を高精度に行うことは、技術的に難しい。特に、前処理を必要とする分析項目については、少量の検体に対し短時間で繰り返し精度のよい前処理を行うことが難しく、十分な測定精度を持つ製品はいまだ数少ない状況にある。
【０００６】
特許文献１には、前処理用の試薬が多孔質体に担持されており、そこに検体を浸透させることにより検体の前処理（血球分離および沈澱、分離処理）を実施し、高比重リポ蛋白コレステロール（以下、ＨＤＬコレステロール）を測定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平７−６６００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血中のコレステロールは、脂質と蛋白質の複合体であるリポ蛋白の構成成分として体内を循環する。リポ蛋白は比重の差によって分類されており、比重の低い順にカイロミクロン、超低比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、高比重リポ蛋白（以下ＨＤＬ）と大きく分かれている。このＨＤＬに含まれるコレステロールがＨＤＬコレステロールであり、俗に善玉コレステロールと呼ばれるように動脈硬化の負の因子であることが明らかとなっている。そのため、このＨＤＬコレステロールは主に動脈硬化のリスク評価や、脂質代謝異常のスクリーニング用途に分析されている。
【０００９】
ＨＤＬコレステロールの測定方法は、大きく２通りに分けることができる。
第１の分析手法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿、除去後、残存したＨＤＬに含まれるＨＤＬコレステロールを分析する手法があるが、この手法は手技により煩雑な前処理を実施しなければならない問題が存在する。また、特許文献１のように、小型の多孔質体に前処理試薬を担持させ、その多孔質体に少量の検体を浸透させることで、沈殿発生と沈殿除去処理を自動で行うドライケミストリーと呼ばれる装置も存在するが、前処理反応が多孔質体と毛細管力を利用したものであるため、多孔質体の孔径等の物理的形状のばらつきや、多孔質体内部に先に導入された検体先端部とその後に導入された検体の間の前処理試薬濃度勾配や、検体の物理特性のばらつきにより、沈殿生成除去にムラが生じやすい等の問題が存在する。また前記前処理試薬としては、ポリアニオンと二価の陽イオンからなるものが一般的であるが、そのままではドライ化時の潮解性および溶解性に問題がある。
【００１０】
第２の分析手法は、ある特定の高分子材料や界面活性剤を使用することにより、ＨＤＬコレステロール以外のリポ蛋白コレステロールの反応性を阻害する等の効果を発揮し、沈殿生成、除去等の前処理行程自体を省略するものである。これは直接法と呼ばれ、現在ＨＤＬコレステロールの分析方法として主流となっているが、前記大型の自動分析装置用に開発された方法であるため、前述の通り装置が大型であったり、運用コストの問題から全ての医療機関での導入が難しい。また、試薬形状が液体であるということを前提に設計されているため、その使用には多くの機械的機構が必要であり装置の小型化も難しく、ＰＯＣＴとして運用するにあたっての短所を有し、ＰＯＣＴで定義されるような運用に至っていないというのが現状である。
【００１１】
本発明は、ＰＯＣＴで定義されるような医療サービスの質、患者の生活の質向上を実現するために、我々は、患者負担軽減のために指先採血による十数マイクロリットル以下の血液検体で分析が可能、かつ数分という短時間で高精度に血中の目的成分を測定できるシステムが必要であると考え、それを満たすための方法としてドライケミストリー方式の測定システムを選択し、その方式において血中のＨＤＬコレステロール濃度を正確で短時間に測定できる極めて溶解性が高く、かつ安定性の高い前処理試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の分析用試薬は、生物学的試料に含まれるＨＤＬコレステロールを分析するに当たり、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の分析用試薬は、生物学的試料に含まれるＨＤＬコレステロールを分析するに当たり、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする。
【００１４】
具体的には、前記ジカルボン酸が、コハク酸またはグルタル酸またはグルコン酸のいずれかであることを特徴とする。
具体的には、前記糖アルコールが、マルチトールまたはグリシトールまたはラクチトールまたはマンニトールのいずれかであることを特徴とする。
【００１５】
具体的には、前記二糖類が、スクロールまたはラクトースまたはトレハロースのいずれかであることを特徴とする。
具体的には、前記三糖類が、ラフィノースまたはマルトトリオースのいずれかであることを特徴とする。
【００１６】
具体的には、前記ポリアニオン化合物が、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からからなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする。
【００１７】
具体的には、前記二価の陽イオン化合物が、マグネシウムイオン化合物、またはマグネシウムイオン化合物塩、カルシウムイオン化合物、またはカルシウムイオン化合物塩からなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする。
【００１８】
本発明の分析用デバイスは、試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持していることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の分析用デバイスは、試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類のうちの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の分析用試薬は、コハク酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールから選択される化合物を少なくとも１つ以上含んでいることによって、前処理試薬の溶解性を高めることができ、短時間で前処理が可能であり、濃度勾配や検体毎に異なる物理的性質の影響を受けにくいことから均一な処理が可能である。これにより、ＨＤＬコレステロールを短時間で高精度に測定することができる。
【００２１】
詳しくは、本発明の分析用試薬は、ポリアニオンと二価の陽イオンからなる公知の技術を基にするが、そのままではドライ化時の潮解性および溶解性に問題があり、前記課題を解決することができない。その課題を解決するためにドライ化時の潮解性の軽減とその溶解性を向上させたものである。
【００２２】
前処理試薬の潮解性を軽減し、溶解性を向上させるための手段として、各試薬成分の塩の種類や添加剤の選定が重要になってくる。これは塩の種類や添加剤によって、潮解性の強弱や溶解性が大きく変化するからである。試薬成分の塩の種類としては、全ての化合物について当てはまるとはいえないが、例えば塩酸塩よりも硫酸塩の方が潮解性が低い傾向がある。また、添加剤については、試薬混合物の乾燥時の結晶状態を例えば巨大な結晶が析出し、溶解性の面で不利となる単結晶多寡の状態から、より溶解性の面で有利となる細かい結晶の集まりである多結晶状態やアモルファス、無結晶状態へと変化させ溶解性を向上させたり、潮解性の高い試薬成分を添加剤の結晶構造中に取り込み、コーティングするような効果で潮解性を低減させる効果を有している。ポリアニオン化合物については、非ＨＤＬを沈殿させるという機能を実現するのみであれば以下にあげる、リンタングステン酸、リンモリブデン酸、タングステン酸、モリブデン酸、それらの無機塩類、またはデキストラン硫酸、ヘパリン、硫酸アミロース、アミロペクチン硫酸等の硫酸多糖類から選択することができるが、前記条件を満たすためにはリンタングステン酸、リンモリブデン酸、またはそれらの塩から選択することが望ましく、更にいえばリンタングステン酸ナトリウムがよい。次に前記ポリアニオン化合物と組み合わされる二価の陽イオン化合物としては、非ＨＤＬを沈殿させるという機能を実現させるのみであれば以下に挙げるように、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、ストロンチウム、亜鉛、バリウム、銅の２価のイオン、またはアルミニウム、鉄、クロムの二価以外のイオン、またはアンモニウムイオンから選択することができる。しかしながら前記ポリアニオンの場合と同じく前記条件を満たすためにはカルシウム、またはマグネシウムイオンから選択することが望ましく、更に化合物名でいえば、硫酸カルシウムと硫酸マグネシウムを選択することが望ましく、これらを組み合わせて用いるのがよい。非ＨＤＬを沈殿させるためには前記ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせで実施可能であるが、前述の通り固体状態での溶解性や潮解性の低減条件を満たすためには、さらに添加剤の追加が必須である。添加剤としては糖類、アミノ酸、常温で固体のジカルボン酸またはその塩が望ましく、更に言えば糖類であればマンニトール、マルチトールが望ましく、アミノ酸であればアラニン、グリシン、ヒスチジン、ジカルボン酸であればコハク酸またはその塩が望ましく、前記ポリアニオンと二価の陽イオンの組み合わせと本発明の分析用デバイスに最も適するものはコハク酸二ナトリウムである。
【００２３】
この組み合わせからなる前処理試薬は、ドライ化時の潮解性が低く、かつ生物学的試料接触時の溶解性が極めて高いという性質を有し、この前処理試薬を使用することによる分析システムを使用することにより、前記ＰＯＣＴの定義に合致したＨＤＬコレステロールの測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】参照試薬と参照試薬に各種の添加剤を入れた試薬の実験結果の説明図
【図２】本発明の試薬を有する分析用デバイスを使用したＨＤＬコレステロールの分析フロー図
【図３】同分析用デバイスによるＨＤＬコレステロールの測定値の直線性の説明図
【図４】同実施の形態の分析装置のドアを開いた状態の斜視図
【図５】同実施の形態の分析装置の断面図
【図６】同実施の形態の分析装置の構成図
【図７】同実施の形態の分析用デバイスに点着しターンテーブルにセットして回転させる前の状態図
【図８】同実施の形態において分析用デバイスを揺動させる状態図とターンテーブルを時計方向に回転駆動して測定チャンバーおよび保持キャビティに流れ込んだ状態図
【図９】同実施の形態において分析用デバイスを揺動させる状態図とターンテーブルを時計方向に回転駆動させて操作キャビティの試薬と反応した希釈血漿が分離キャビティに流れ込み、さらに高速回転を維持することで、操作キャビティ内で生成された凝集物を遠心分離する状態図
【図１０】同実施の形態においてターンテーブルを停止させ希釈血漿が計量流路に流れて定量が保持された状態図と計量流路に保持されていた希釈血漿が測定チャンバーに流れ込んだ状態図
【図１１】同実施の形態において測定チャンバーの希釈血漿と試薬との反応が開始される状態図と試薬と希釈血漿の攪拌の状態図
【図１２】同実施の形態の分析用デバイスの図８におけるＦ−Ｆ断面図
【図１３】同実施の形態の分析用デバイスの毛細管エリアにおける試薬の担持状態を示す拡大平面図とＧ−Ｇ断面図
【図１４】同実施の形態の分析用デバイスの操作キャビティにおける試薬の担持状態を示す拡大平面図とＨ−Ｈ断面図
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図１〜図１４に基づいて説明する。
図４〜図６は分析用ディスク１とこれを使用する分析装置１００を示し、図７〜図１４は分析用ディスク１の内部の具体的な流路を示している。
【００２６】
分析用デバイス１は、微細な凹凸形状を表面に有するマイクロチャネル構造が片面に形成されたベース基板３と、ベース基板３の表面を覆うカバー基板４とを貼り合わせたものに、試料液飛散防止用の保護キャップ２が取り付けられている。
【００２７】
図７は、カバー基板４との貼り合わせ面から見たベース基板３を示しており、この図７から分かるように、分析用デバイス１の内部には、希釈液が入った希釈液容器５がセットされるとともに、収容エリアのうちの必要なものには各種の分析に必要な前処理剤としての試薬５８ａ１，５８ａ２，５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２，６７ａ，６７ｂが予め担持されている。
【００２８】
保護キャップ２を開いて露出した注入口１３に試料液を点着して保護キャップ２を閉じることによって、希釈液容器５が分析用デバイス１の内部で移動して開封リブ１１ａによってシール部材９が破られて、希釈液が希釈液容器５から流出する。
【００２９】
この分析用デバイス１を、図４に示す分析装置１００のターンテーブル１０１にセットした後にドア１０３を閉じると、セットされた分析用デバイス１は、図５に示すようにドア１０３の側に設けられたクランパ１０４によって、ターンテーブル１０１の回転軸心上の位置が付勢手段としてのバネ１０５ａの付勢力でターンテーブル１０１の側に押さえられて、分析用デバイス１は回転駆動手段１０６のブラシレスモータ７１ａによって回転駆動されるターンテーブル１０１と一体に回転する。１０７はターンテーブル１０１の回転中の軸心を示している。
【００３０】
この実施の形態では、ターンテーブル１０１は、傾斜した回転軸心１０７に取り付けられて水平線Ｈに対して角度θ°だけ傾斜しており、分析用デバイス１の回転停止位置に応じて、分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の方向を制御できる。
【００３１】
分析装置１００の電気制御系は図６に示すように構成されている。
この分析装置１００は、ターンテーブル１０１を回転させるための回転駆動手段１０６と、分析用デバイス１内の溶液を光学的に測定するための光学測定手段１０８と、ターンテーブル１０１の回転速度や回転方向および光学測定手段の測定タイミングなどを制御する制御手段１０９と、光学測定手段１０８によって得られた信号を処理し測定結果を演算するための演算部１１０と、演算部１１０で得られた結果を表示するための表示部１１１とで構成されている。
【００３２】
回転駆動手段１０６は、ターンテーブル１０１を介して分析用デバイス１を回転軸心１０７の回りに任意の方向に所定の回転速度で回転させるだけではなく、所定の停止位置で回転軸心１０７を中心に所定の振幅範囲、周期で左右に往復運動をさせて分析用デバイス１を揺動させることができるように構成されている。
【００３３】
光学測定手段１０８には、分析用デバイス１の測定部に特定の波長光を照射するための光源１１２と、光源１１２から照射された光のうち、分析用デバイス１を通過した透過光の光量を検出するフォトディテクタ１１３とを備えている。
【００３４】
分析用デバイス１をターンテーブル１０１によって回転駆動すると、注入口１３から内部に取り込んだ試料液が、注入口１３よりも内周にある回転軸心１０７を中心に分析用デバイス１を回転させて発生する遠心力と、分析用デバイス１内に設けられた毛細管流路の毛細管力を用いて、分析用デバイス１の内部で移送していくよう構成されており、この分析用デバイス１のマイクロチャネル構造を分析工程とともに詳しく説明する。
【００３５】
保護キャップ２を開いて注入口１３に試料液を直接に分析用デバイス１に付けることによって、注入口１３の付近に付着した試料液が誘導部１７の毛細管力によって分析用デバイス１の内部に取り込まれる。図７の２５ａ〜２５ｍはベース基板３に形成された空気孔である。
【００３６】
ドア１０３を閉じた後にターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、保持されている試料液が毛細管キャビティ１９と受容キャビティ２３ａを介して分離キャビティ２３ｂ，２３ｃに流入し、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃで血漿成分と血球成分とに遠心分離される。希釈液容器５から流出した希釈液は、排出流路２６を介して保持キャビティ２７に流入する。
【００３７】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、血漿成分は分離キャビティ２３ｂの壁面に形成された毛細管キャビティ３３に吸い上げられ、連結流路３０を介して計量流路３８に流れて定量が保持される。
【００３８】
また、希釈液８は保持キャビティ２７と混合キャビティ３９を連結しているサイホン形状を有する連結流路４１内に呼び水される。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、計量流路３８に保持されていた血漿成分は大気開放キャビティ３１の位置で破断し、定量だけ混合キャビティ３９に流れ込み、保持キャビティ２７内の希釈液８も連結流路４１を介して混合キャビティ３９に流れ込む。
【００３９】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止し、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を４０〜８０Ｈｚの周波数で制御して、混合キャビティ３９内に移送された希釈液８と血漿成分からなる測定対象の希釈血漿４０を攪拌する。
【００４０】
その後に、分析用デバイス１を図８（ａ）に示す位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を８０〜２００Ｈｚの周波数で制御して、混合キャビティ３９に保持される希釈血漿４０を希釈血漿４０の液面よりも内周側に形成された毛細管流路３７の入口まで移送する。
【００４１】
毛細管流路３７の入口まで移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって毛細管流路３７内に吸い出され、毛細管流路３７、計量流路４７ａ，４７ｂ，４７ｃ、溢流流路４７ｄに順次移送される。
【００４２】
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図８（ｂ）に示すように、計量流路４７ａ，４７ｂ，４７ｃに保持されていた希釈血漿４０は、大気と連通する大気開放キャビティ５０との連結部である屈曲部４８ａ，４８ｂ，４８ｃ，４８ｄの位置で破断して、定量だけ測定チャンバー５２ｂ，５２ｃおよび保持キャビティ５３に流れ込む。
【００４３】
また、このとき溢流流路４７ｄに保持されていた希釈血漿４０は、逆流防止通路５５を介して溢流キャビティ５４に流れ込む。また、このとき毛細管流路３７内の希釈血漿４０は、溢流キャビティ２９ｂ，溢流流路２８ｂを介して溢流キャビティ２９ｃに流れ込む。計量流路４７ａの一部の側壁は屈曲部４８ａの近傍に大気開放キャビティ５０と連通するよう凹部４９が形成されている。測定チャンバー５２ａ〜５０ｃの形状は、遠心力の働く方向に伸長した形状で、分析用デバイス１の回転中心から最外周に向かって分析用デバイス１の周方向の幅が細く形成されている。複数の測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの外周側の底部は、分析用デバイス１の同一半径上に配置されている。
【００４４】
さらに、各測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの周方向に位置する側壁の一側壁には、前記測定チャンバーの外周位置から内周方向に伸長するように毛細管エリア５６ａ〜５６ｃが形成されている。図８（ｂ）におけるＦ−Ｆ断面を図１２に示す。
【００４５】
測定チャンバー５２ａ〜５２ｃの光路長は、それぞれの検査対象の成分と試薬を反応させた後の混合溶液から得られる吸光度の範囲によって調整されている。
また、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃ内には図１３（ａ）に示すように、それぞれの検査対象の成分と反応させるための試薬５８ａ１，５８ａ２,５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２が、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃ内に形成された試薬担持部５７ａ１，５７ａ２，５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３，５７ｃ１，５７ｃ２に担持されている。図１３（ａ）におけるＧ−Ｇ断面を図１３（ｂ）に示す。
【００４６】
試薬担持部５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３のカバー基板４との隙は、毛細管エリア５６ｂのカバー基板４との隙より薄くなるよう毛細管エリア５６ｂより突出して形成している。
【００４７】
毛細管エリア５６ｂは、５０〜３００μｍ程度の毛細管力が作用する隙で形成しているため、試薬担持部５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３は毛細管エリア５６ｂよりも数十μｍ程度突出するように形成している。毛細管エリア５６ａ，５６ｃにおいても同様に構成されている。
【００４８】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止し、分析用デバイス１を図９（ａ）に示す位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにターンテーブル１０１を６０〜１２０Ｈｚの周波数で制御して、保持キャビティ５３に保持される希釈血漿４０を希釈血漿４０の液面に浸かるよう保持キャビティ５３の側壁に形成された連結部５９を介して毛細管力の作用により操作キャビティ６１に移送する。
【００４９】
さらにターンテーブル１０１を１２０〜２００Ｈｚの周波数で制御して、図１４（ａ）に示す操作キャビティ６１に担持された試薬６７ａ，６７ｂと希釈血漿４０を攪拌し、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬を反応させる。ここで操作キャビティ６１は測定チャンバー５２ａへ到着前のマイクロチャネル構造の流路である。
【００５０】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって図９（ａ）に示すように毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられ、この時点で試薬５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２の溶解が開始され、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬の反応が開始される。
【００５１】
次に、ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図９（ｂ）に示すように、操作キャビティ６１の試薬と反応した希釈血漿が連結通路６４を通過して分離キャビティ６６に流れ込み、さらに高速回転を維持することで、操作キャビティ６１内で生成された凝集物を遠心分離する。ここで、この実施の形態では、検査対象の成分と試薬を反応させる際に、前記反応を阻害する成分を前工程で排除するよう構成しており、操作キャビティ６１で希釈血漿を試薬と反応させることで、後工程の反応を阻害する特定の成分を凝集処理し、次工程で遠心分離することで前記凝集物を排除している。
【００５２】
また、毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５３】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、希釈血漿４０は分離キャビティ６６の壁面に形成された毛細管キャビティ６９に吸い上げられ、毛細管キャビティ６９と連通する連結流路７０を介して図１０（ａ）に示すように計量流路８０に流れて定量が保持される。
【００５４】
また、分離キャビティ６６内の凝集物を含む希釈血漿４０は、分離キャビティ６６と溢流キャビティ８１ａを連結しているサイホン形状を有する連結流路６８内に呼び水される。
【００５５】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された試薬と希釈血漿の混合溶液は、毛細管力によって再び毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられる。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図１０（ｂ）に示すように、計量流路８０に保持されていた希釈血漿４０は、大気と連通する大気開放キャビティ８３との連結部である屈曲部８４の位置で破断して、定量だけ測定チャンバー５２ａに流れ込む。
【００５６】
また、分離キャビティ６６および連結通路７０、毛細管キャビティ６９内の希釈血漿４０はサイホン形状の連結流路６８を介して溢流キャビティ８１ａに流れ込む。
また、毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５７】
次に、ターンテーブル１０１の回転を停止させると、測定チャンバー５２ａに移送された希釈血漿４０は、毛細管力によって図１１（ａ）に示すように毛細管エリア５６ａに吸い上げられ、この時点で試薬５８ａ１，５８ａ２の溶解が開始され、希釈血漿４０内に含まれる特定の成分と試薬の反応が開始される。
【００５８】
また、測定チャンバー５２ｂ，５２ｃに移送された試薬と希釈血漿の混合溶液は、毛細管力によって再び毛細管エリア５６ｂ，５６ｃに吸い上げられる。
ターンテーブル１０１を時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動すると、図１１（ｂ）に示すように、毛細管エリア５６ａ，５６ｂ，５６ｃに保持されていた試薬と希釈血漿の混合溶液は、遠心力によって測定チャンバー５２ａ，５２ｂ，５２ｃの外周側に移送することで、試薬と希釈血漿の攪拌が行われる。
【００５９】
分析用デバイス１を反時計方向（Ｃ１方向）または時計方向（Ｃ２方向）に回転駆動して、各測定チャンバー５２ａ，５２ｂ，５２ｃが光源１１２とフォトディテクタ１１３の間を通過するタイミングに、演算部１１０がフォトディテクタ１１３の検出値を読み取って、特定成分の濃度を算出する。
【００６０】
測定チャンバー５２ａにおいてＨＤＬコレステロールを定量測定する場合には、試薬６７ａ，６７ｂとして、次のように調製したものを使用している。
血液検体から、ＨＤＬ以外のリポ蛋白である非ＨＤＬを除去するにあたっては、ポリアニオンと二価の陽イオンが必要である。一般的にポリアニオンとしては前述の通りリンタングステン酸、リンモリブデン酸、タングステン酸、モリブデン酸、それらの無機塩類、またはデキストラン硫酸、ヘパリン、硫酸アミロース、アミロペクチン硫酸等の硫酸多糖類からなる群より選択することができるが、溶解性や分析用デバイス上に固体状態で長期間安定に配置する必要性があることを考慮した場合、これらの内の無機化合物が望ましく、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からなる群の少なくとも一種から選択されることが望ましい。二価の陽イオンとしては、前述の通りカルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、ストロンチウム、亜鉛、バリウム、銅のイオンからなる群の少なくとも一種より選択できるが、分析用デバイス内で酵素による反応を行うことを考慮すると、酵素を失活させる可能性を有する金属イオンは望ましくなく、入手難易度を考慮するとカルシウムおよびマグネシウムから選択することが望ましい。さらに溶解性を考慮するとマグネシウムが望ましく、また潮解性を考慮すると硫酸塩つまり硫酸マグネシウムを使用することが望ましい。また、さらに前記リンタングステン酸ナトリウムと硫酸マグネシウム混合物に硫酸カルシウムを添加することが望ましく、これは結晶状態を変化させ試薬の溶解性を向上させる働きを有している。
【００６１】
リンタングステン酸ナトリウム ２０ｍｇ／ｍｌ
硫酸マグネシウム ４０ｍｇ／ｍｌ
硫酸カルシウム １２ｍＭ
コハク酸二ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ
非ＨＤＬの除去方法は、まず上記組成の試薬を調整し試験管へ２０μｌ滴下し、乾燥させた。一般人から採取した血液検体をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で４倍に希釈し、その検体２００μｌを前記乾燥させた試薬へ加え、ボルテックスミキサーにより４５秒攪拌後、７５秒静置し、生じた非ＨＤＬの凝集を１５００Ｇで３０秒間遠心分離した。検体の希釈倍率は２倍以上であれば本実施例の試薬がそのまま適用可能であるが、それ以下の検体希釈倍率の場合は各試薬成分の濃度を調整することで適用可能である。非ＨＤＬが除去された上澄み液を分取し、液中のコレステロール（ＨＤＬコレステロールに当る）を、株式会社日立ハイテクノロジーズ製７０２０形自動分析装置によって積水メディカル株式会社製「コレステスト−ＣＨＯ」を使用して測定した。
【００６２】
試薬の潮解性の判断方法としては、試薬を樹脂基板上に乾燥担持し、気温３０℃湿度８０％の条件下で３０分暴露後、樹脂基板水平方向に遠心力がかかるように５００Ｇで遠心し、遠心力方向への試薬の流れ出しの有無により潮解性の有無を判断した。この潮解性の有無の判断については、分析用デバイス１は、内部の検体移送等に遠心力を利用しており、それにより遠心力がかかった状態で試薬が飛散しないことが重要な判断基準になることを理由としている。
【００６３】
上記手順による非ＨＤＬコレステロールの除去率と潮解性の有無について本試薬とコハク酸二ナトリウムを含まない参照試薬、およびコハク酸二ナトリウム以外の添加剤を添加した試薬についての比較を実験結果を示す図１に示した。
【００６４】
ここでは前記添加剤として、図１に示すように下記のものを実験した。
ジカルボン酸では、コハク酸二ナトリウム、グルタル酸、グルコン酸ナトリウムを実験した。
【００６５】
アミノ酸では、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸ナトリウム、バリン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン酸ナトリウム、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、プロリン、リシン・ＨＣｌ、アルギニン、システイン、ヒスチジン・ＨＣｌ、トレオニン、セリン、グリシルグリシン、アセチルグリシリン、アミノ酸様化合物であるタウリンを実験した。
【００６６】
糖アルコールでは、マルチトール、グルシトール、ラクチトール、マンニトールを実験した。
糖類では、単糖類ではグルコース、キシロースを実験し、二糖類ではスクロース、トレハロースを実験し、三糖類ではマルトトリオース、ラフィノース、ラクトースを実験した。
【００６７】
非ＨＤＬコレステロール除去率が１００％を大きく超えているものについては、ＨＤＬコレステロール自体も除去される過剰または異常な反応を起こしていると推測される。また潮解性については添加剤の種類と濃度が重要なファクターであり、図１の潮解性の欄には参考として潮解しにくい添加濃度条件について示している。添加剤を含まない参照試薬の非ＨＤＬコレステロール除去率２５％を上回る有効な添加剤は数多く存在することがわかるが、さらにより短い時間での検体中の非ＨＤＬコレステロールの除去、および分析用デバイス上に安定に固体状態で配置するための潮解性の無さが重要である。
【００６８】
図１より、コハク酸二ナトリウムを含まない公知の参照試薬では非ＨＤＬコレステロールの除去が２５％と不十分で、かつ潮解性を有するのに対し、コハク酸二ナトリウムを含んだ本試薬は非ＨＤＬコレステロールの除去が９２％と高い除去率と潮解性の無さを両立させている。
【００６９】
また非ＨＤＬコレステロール除去率については１００±２０％の範囲に入っていることを最適な添加剤の条件とし、その結果、最適な添加剤として、コハク酸二ナトリウム以外では、グルコン酸ナトリウム、アラニン、グリシンまたはバリン、ヒスチジン、マルチトールおよびマンニトールも優れた除去率、および潮解性の無さを有している。
【００７０】
また、これらの添加剤について潮解性を低減する添加濃度についてはコハク酸二ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、アラニン、グリシンまたはバリンおよびヒスチジンについては５ｍｇ／ｍｌ以上、マルチトールとマンニトールでは１ｍｇ／ｍｌ以上１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で効果を有している。
【００７１】
前記の本試薬を、分析用デバイス１の操作キャビティ６１の上に固体状態で配置して
ＨＤＬコレステロール濃度を測定する場合を、図２により説明する。
まず、ステップＳ１では、血液検体を検体導入部としての誘導部１７へ導入する。導入方法としては、指先採血による血液を注入部１３へ直接に点着するか、注射器等で採血管へ採血された血液をピペット等の器具を使用し採血管から血液を取り出して注入部１３へ点着しても良い。
【００７２】
ステップＳ２では、導入された血液検体を血球分離部としての分離キャビティ２３ｂ，２３ｃへ移送し、遠心力により血球成分と血漿成分を分離する。なお、血液検体としては全血に限定するものではなく、血清の導入も可能であり、その場合、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃの省略も可能である。また、検体の移送に関しては毛細管力、サイフォン構造および遠心力を組み合わせて行った。
【００７３】
ステップＳ３では、分離キャビティ２３ｂ，２３ｃで分離された血漿成分を検体定量部としての計量流路３８へ移送し、任意の量の検体を定量分取する。
ステップＳ４では、定量された検体を検体希釈部としての混合キャビティ３９へ移送し、検体を任意の希釈倍率に希釈する。この検体の希釈倍率は分析システムの検出感度や分析用デバイスに必要な液量等により設定される。
【００７４】
ステップＳ５では、希釈された検体を希釈検体定量部としての計量流路４７ａへ移送し、希釈検体から任意の量の検体を定量分取する。
ステップＳ６では、その定量された検体を固体状態で配置された前処理試薬担持部としての操作キャビティ６１へ移送する。この操作キャビティ６１の試薬６７ａ，６７ｂで非ＨＤＬを凝集させる。
【００７５】
ステップＳ７では、非ＨＤＬ分離部としての分離キャビティ６６へ移送し遠心力により非ＨＤＬの凝集を取り除く。
ステップＳ８では、ＨＤＬが残った上澄み部分を酵素試薬担持部としての毛細管エリア５６ａへ移送する。この一連の非ＨＤＬの分離除去動作は攪拌を６０秒行い、その後、静置することなく５００Ｇで３０秒遠心分離することで行った。毛細管エリア５６ａにはコレステロールと特異的に反応し、コレステロールの濃度に応じた呈色反応する公知の酵素、色原体等の試薬５８ａ１，５８ａ２が固体状態で配置されている。
【００７６】
ステップＳ９では、毛細管エリア５６ａでＨＤＬコレステロール濃度に応じ呈色した検体を測定部としての測定チャンバー５２ａへ移送し、呈色の度合いを測定装置により光を照射しその吸光度を測定する。この検体の吸光度から、あらかじめ作成した検量線によりコレステロール濃度へと換算することで、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を求めることができる。
【００７７】
図３は、一般人から採取した血液検体について、分析用デバイス１を使用してＨＤＬコレステロール濃度の測定を行った結果であり、株式会社日立ハイテクノロジーズ製７０２０形自動分析装置によって積水メディカル株式会社製ＨＤＬ−コレストロールキット「コレステストＮ−ＨＤＬ」を使用した測定値を参照値として示した。
【００７８】
本試薬を使用した分析用デバイス１によるＨＤＬコレステロール濃度の測定では、参照値に対して相関係数０．９７９の良好な直線性を有しており、短時間の前処理でも十分なＨＤＬコレステロール濃度の測定能力を有していることがわかる。また本試薬は固体状態で分析用デバイス上に配置されるため、分析用デバイス自体を小型化することが可能であり、本実施例に必要な血液検体量は十数マイクロリットルであって、少ない検体量で短時間に高精度でＨＤＬコレステロール濃度を自動的に測定することができるので、ＰＯＣＴに定める所の医療の質向上や患者負担の軽減に有用である。
【００７９】
上記の添加剤の選別にあたっては１００±２０％の範囲に入っていることを最適な添加剤の条件としたが、参照試薬が単独の場合の非ＨＤＬコレステロール除去率が２５％であるのに比べると、非ＨＤＬコレステロール除去率が２５％を越えて１００＋２０％に選別の条件を拡大した場合であっても、分析装置の高性能化を実現できる。この条件に拡大することによって前記添加剤としては、図１の実験結果におけるグルタル酸、タウリン、グルシトール、ラクチトール、キシロース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、ラフィノース、ラクトースを添加剤とすることができる。このように条件に拡大することによって前記添加剤とできた各添加剤の添加濃度は、それぞれグルタル酸、タウリン、ラクチトール、キシロース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、ラフィノース、ラクトースについては５ｍｇ／ｍｌ以上、グルシトールについては５ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下程度であった。
【００８０】
なお、図１の実験例では添加剤として何れかを添加して前処理試薬としての試薬６７ａ，６７ｂとしたが、有効な添加剤の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含む場合であっても同様である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、生物などから採取した液体の成分分析に使用する分析用デバイスの小型化ならびに高性能化に寄与できる。
【符号の説明】
【００８２】
１ 分析用ディスク
２ 保護キャップ
３ ベース基板
４ カバー基板
５ 希釈液容器
８ 希釈液
９ シール部材
１１ａ 開封リブ
１３ 注入口
２８ｂ 溢流流路
２９ｂ 溢流キャビティ
２９ｃ 溢流キャビティ
１７ 誘導部（検体導入部）
１９ 毛細管キャビティ
２３ａ 受容キャビティ
２３ｂ，２３ｃ 分離キャビティ（血球分離部）
２５ａ〜２５ｍ 空気孔
２６ 排出流路
２７ 保持キャビティ
３０ 連結流路
３１ 大気開放キャビティ
３３ 毛細管キャビティ
３７ 毛細管流路
３８ 計量流路（検体定量部）
３９ 混合キャビティ（検体希釈部）
４０ 希釈血漿
４１ 連結流路
４７ａ 計量流路（希釈検体定量部）
４７ｂ，４７ｃ 計量流路
４７ｄ 溢流流路
４８ａ，４８ｂ，４８ｃ，４８ｄ 屈曲部
４９ 凹部
５０ 大気開放キャビティ
５２ａ 測定チャンバー（測定部）
５２ｂ，５２ｃ 測定チャンバー
５３ 保持キャビティ
５４ 溢流キャビティ
５５ 逆流防止通路
５６ａ〜５６ｃ毛細管エリア（酵素試薬担持部）
５７ａ１，５７ａ２ 試薬担持部
５７ｂ１，５７ｂ２，５７ｂ３ 試薬担持部
５７ｃ１，５７ｃ２ 試薬担持部
５８ｂ１，５８ｂ２，５８ｂ３，５８ｃ１，５８ｃ２ 試薬
５８ａ１，５８ａ２ 試薬
５９ 連結部
６１ 操作キャビティ（前処理試薬担持部）
６４ 連結通路
６６ 分離キャビティ（非ＨＤＬ分離部）
６７ａ，６７ｂ 試薬
６８ 連結流路
６９ 毛細管キャビティ
７０ 連結流路
７１ａ ブラシレスモータ
８０ 計量流路
８１ａ 溢流キャビティ
８３ 大気開放キャビティ
８４ 屈曲部
１００ 分析装置
１０１ ターンテーブル
１０３ ドア
１０４ クランパ
１０５ａ バネ
１０６ 回転駆動手段
１０７ 回転軸心
１０８ 光学測定手段
１０９ 制御手段
１１０ 演算部
１１１ 表示部
１１２ 光源
１１３ フォトディテクタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料に含まれる高比重リポ蛋白コレステロールを分析するに当たり、高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸
またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする分析用試薬。
【請求項２】
生物学的試料に含まれる高比重リポ蛋白コレステロールを分析するに当たり、高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする分析用試薬。
【請求項３】
前記ジカルボン酸が、コハク酸またはグルタル酸またはグルコン酸のいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項４】
前記糖アルコールが、マルチトールまたはグリシトールまたはラクチトールまたはマンニトールのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項５】
前記二糖類が、スクロールまたはラクトースまたはトレハロースのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項６】
前記三糖類が、ラフィノースまたはマルトトリオースのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項７】
前記ポリアニオン化合物が、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からからなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする
請求項１または請求項２記載の分析用試薬。
【請求項８】
前記二価の陽イオン化合物が、マグネシウムイオン化合物、またはマグネシウムイオン化合物塩、カルシウムイオン化合物、またはカルシウムイオン化合物塩からなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする
請求項１または請求項２記載の分析用試薬。
【請求項９】
試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、
コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持している
分析用デバイス。
【請求項１０】
試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類のうちの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持している
分析用デバイス。
【請求項１】
生物学的試料に含まれる高比重リポ蛋白コレステロールを分析するに当たり、高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、コハク酸
またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする分析用試薬。
【請求項２】
生物学的試料に含まれる高比重リポ蛋白コレステロールを分析するに当たり、高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を沈殿させる分析用試薬であって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類の内の何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだことを特徴とする分析用試薬。
【請求項３】
前記ジカルボン酸が、コハク酸またはグルタル酸またはグルコン酸のいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項４】
前記糖アルコールが、マルチトールまたはグリシトールまたはラクチトールまたはマンニトールのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項５】
前記二糖類が、スクロールまたはラクトースまたはトレハロースのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項６】
前記三糖類が、ラフィノースまたはマルトトリオースのいずれかである
請求項２記載の分析用試薬。
【請求項７】
前記ポリアニオン化合物が、リンタングステン酸、またはリンタングステン酸塩、リンモリブデン酸、またはリンモリブデン酸塩からからなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする
請求項１または請求項２記載の分析用試薬。
【請求項８】
前記二価の陽イオン化合物が、マグネシウムイオン化合物、またはマグネシウムイオン化合物塩、カルシウムイオン化合物、またはカルシウムイオン化合物塩からなる群の少なくとも一種から選択されることを特徴とする
請求項１または請求項２記載の分析用試薬。
【請求項９】
試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、
コハク酸またはグルコン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはマルチトールまたはマンニトールの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持している
分析用デバイス。
【請求項１０】
試料液を遠心力によって測定チャンバーに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し前記測定チャンバーにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスであって、
ポリアニオン化合物と二価の陽イオン化合物の組み合わせからなる試薬中に、ジカルボン酸またはアラニンまたはグリシンまたはバリンまたはヒスチジンまたはタウリンまたは糖アルコールまたは単糖類のキシロースまたは二糖類，三糖類のうちの何れかまたはその化合物を少なくとも１つ以上含んだ固体状態の分析用試薬を、前記測定チャンバーへ到着前のマイクロチャネル構造の流路に担持している
分析用デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−４７８３５（Ｐ２０１１−４７８３５Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９７５０８（Ｐ２００９−１９７５０８）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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