分析装置用の沈殿防止用組成物
【課題】二価金属イオンを含む試薬と、アルカリ性洗浄液とを用いる分析装置において、前記二価金属イオンからアルカリ性条件下で形成される金属化合物の沈殿を防止するための組成物を提供する。
【解決手段】前記沈殿防止用組成物は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有する。
【効果】水不溶性又は難溶性化合物（例えば、水酸化マグネシウム）の形成を防ぎ、廃液チューブ等への水不溶性又は難溶性化合物の沈着を防止することができ、自動分析装置による分析を常に正確に実施し、安定に稼動させることが可能となる。
【解決手段】前記沈殿防止用組成物は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有する。
【効果】水不溶性又は難溶性化合物（例えば、水酸化マグネシウム）の形成を防ぎ、廃液チューブ等への水不溶性又は難溶性化合物の沈着を防止することができ、自動分析装置による分析を常に正確に実施し、安定に稼動させることが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析装置に適用する沈殿防止用組成物に関する。本発明の沈殿防止用組成物は、特に自動分析装置に好適に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断検査においては、多数の検体について疾病診断の指標となる多岐にわたる物質を短時間に、しかも高精度に測定し、その結果を迅速かつ正確に治療に当たる医師などにフィードバックすることが求められており、大多数の検査は、自動分析装置によって測定が行われている。自動分析装置は、血清等の被検体と診断用試薬とをセットしておけば、被検体のサンプリング、試薬の分注、反応による信号の検出、測定結果の計算及び結果の印刷までを自動的に行うことができる装置で、広く普及している。自動分析装置を用いると、従来の用手法に比較して、一般に検体量や試薬量を少なくすることができるため、コスト的にも有効であるが、操作の自動化が進行すると共に機械の高精度化が要求されている。例えば、検体や試薬分注に使われるノズルは微細になり、反応槽（セル）は同じものを洗浄しながら繰り返し使用しているため、次の検体や試薬を分注するまでに洗浄を行い、前の測定に起因する要因を排除して、次の検体や、試薬に影響のないようにしなくては正確な測定値を得ることはできない。このため、自動分析装置のメーカーは、これらの性能を有する高精度で処理能力の高い、洗浄機構等の優れた装置を開発してきた。
【０００３】
装置の性能向上と併せ、それに用いられる各診断用試薬の性能も向上させなくてはならない。しかしながら、試薬の性能が診断指標毎に個別に向上しても、１台の自動分析装置で測定される検査項目は多数あるので、各試薬間の影響についても考慮する必要がある。例えば、或る検査項目に用いる試薬に含まれる或る物質が、反応槽や反応終了後に廃棄される反応液を通過させる廃液チューブへ沈殿又は吸着し、そのために他の検査項目の測定結果へ影響を与えたり、装置自体の稼働に影響を与えるようなことがあってはならない。そのため、そのような事態を未然に防止するため、各試薬にはそれぞれ工夫が施されて市販されている。例えば、反応系自体には関係のない添加物（界面活性剤、又はキレート剤）が加えられている場合が多い。
【０００４】
しかしながら、体外診断用試薬は多岐に渡り、その種類も多いため、体外診断用試薬メーカーも努力はしているものの、充分な対応がされているとはいえず、問題点も多数存在した。例えば、自動分析装置で実際に用いる検体は、主に血清や血漿等の生体由来液であるので、検体に含まれるタンパク質が反応槽（セル）やチューブに吸着することによる汚れが問題になることが多い。そこで、反応終了後に行われる反応槽（セル）の洗浄には、水酸化ナトリウム及び界面活性剤等からなるアルカリ性の洗浄液が多用されている。一方、体外診断用試薬には、目的物質を正確に検出するために、金属塩を含むものが多い。例えば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、アミラーゼ活性、又はＨＤＬ−コレステロールを測定するためには、目的反応の原理から体外診断用試薬中に金属塩を含ませることは必須である。このような体外診断用試薬を用いる反応を行った後に、アルカリ性洗浄液で洗浄すると、反応液に含まれている金属塩が、洗浄液中の水酸化ナトリウムによって、洗浄時に水不溶性水酸化物に変換し、反応槽（セル）内や廃液吸引ノズルや廃液系チューブ内で沈殿し、他の測定に影響を与えることが少なくなかった。
【０００５】
上記問題を解決するために多くの試みがなされた。水酸基によって配位する化合物を含有させる事によりアルカリ性条件下で沈殿を防止する方法（特許文献１）、多糖類を含有せる事によりアルカリ性条件下で沈殿を防止する方法（特許文献２）が報告されている。しかしながら、特にマグネシウム化合物が含まれている試薬の場合、水酸化マグネシウムによる沈殿が発生しやすく、単にマグネシウムをキレートさせて沈殿を防止できるキレート能の高い物質の添加では体外診断用試薬の本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができなくなることが少なくなかった。また、アルカリ性条件下で、更にヘパリン、又はデキストラン硫酸等の硫酸多糖類が共存すると、前記の金属塩が沈殿するだけではなく凝集し、反応槽（セル）内や廃液系チューブへ沈着し、測定値誤差や詰まりの原因となり、自動分析装置自体の稼働にも影響を与えてしまうという問題もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−６２４１６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００３／０７１２８２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、アルカリ洗剤による金属塩の沈殿や、硫酸多糖類との凝集及び沈着による影響を受けることなく、自動分析装置における分析を常に正確に実施し、安定的に稼働させるため、更に、体外診断用試薬の本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができる試薬を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、本発明による、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置に適用して、二価金属イオンからアルカリ性条件下で形成される金属化合物の沈殿を防止するための組成物であって、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有することを特徴とする、前記沈殿防止用組成物により解決することができる。
本発明の沈殿防止用組成物の好ましい態様によれば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、ＨＤＬ−コレステロール、ヘモグロビンＡ１ｃ、又はアミラーゼ活性を測定することのできる体外診断用試薬組成物であるか、あるいは、分析装置の洗浄液であることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の沈殿防止性組成物は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を含有し、二価金属イオン（特にマグネシウムイオン）を含む試薬と、アルカリ性洗浄液とを用いる分析装置（特に自動分析装置）においても、水不溶性又は難溶性化合物（例えば、水酸化マグネシウム）の形成を防ぎ、廃液チューブ等への水不溶性又は難溶性化合物の沈着を防止することができ、自動分析装置による分析を常に正確に実施し、安定に稼動させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による沈殿防止性組成物は、アルカリ性条件下で塩として沈殿する二価の金属イオンに対して、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基によって配位する化合物を含有する。このＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物は、このＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物が存在しない場合には、アルカリ性条件下において生成する水不溶性あるいは難溶性の二価の金属化合物を生成させず、沈殿を生じさせない。
前記の二価の金属としては、カルシウム、マグネシウム等があげられるが、これらの中でも特にマグネシウムが好ましい。
【００１１】
本発明で用いることのできるＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物は、以下に限定されるものではないが、例えば、一般式（Ｉ）：
Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ （Ｉ）
［式中、基Ｒは、
【化１】
で表される基であって、ｎは０又は１〜１０（好ましくは１〜５）の整数であり、Ｚは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、又は−ＣＨ２ＯＨである］
で表される化合物であることができる。基Ｒとしては、例えば、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
なぜならば、本発明で達成できるアルカリ洗浄剤による金属塩の沈殿の防止や、目的物質を正確に検出する事ができる試薬を提供するために必要な組成は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基により達成されるものであり、一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ中のＲは、Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨとして試薬中に溶解できるものであれば良く、特に構造を限定されるものではない。つまり、化合物中にＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を持っていれば、本発明の目的を達成することができる。
【００１３】
本発明で用いることのできるＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物としては、例えば、エリトロン酸、エリトルロン酸、酒石酸、トレオン酸、トレウロン酸、トレアル酸、リボン酸、リブロン酸、リバル酸、アラビノン酸、アラビヌロン酸、アラビナル酸、キシロン酸、キシルロン酸、キシラル酸、リキソン酸、リキスロン酸、アロン酸、アルロン酸、アラル酸、アルトロン酸、アルトルロン酸、アルトラル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルカル酸、マンノン酸、マンヌロン酸、マンナル酸、グロン酸、グルロン酸、イドン酸、イズロン酸、イダル酸、ガラクトン酸、ガラクツロン酸、粘液酸、タロン酸、タルロン酸、グルコヘプトン酸のほか、ラクトビオン酸、（２Ｒ，３Ｒ）−タートラニル酸等を挙げることができる。前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。また、それらの水和物も挙げることができる。更に、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンのように、試薬中に溶解させると一般式（Ｉ）で表される構造をとる物質によっても本発明の目的を達成することができる。本発明では、これらのＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を、単独であるいは２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００１４】
なお、従来技術として、酒石酸を含むジカルボン酸によるグリセロリン酸オキシダーゼの安定化法（特開昭６０−１２６０８４）や、酒石酸、グルコン酸等を用いた酵素的測定試薬の安定化法（特開２００５−２７８６２６）があるが、これらはいずれも酵素または酵素的測定試薬中の色原体およびカップラーの安定性を向上させることを目的に用いられており、本発明の目的であるアルカリ条件下での二価金属化合物の沈殿防止とは用途が異なる。
【００１５】
本発明による沈殿防止性組成物は、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置、特には、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを分注及び排出する自動分析装置に適用する。本発明において、検体は特に限定されず、分析装置（特に、自動分析装置）で使用可能な検体であればよい。具体的には、生物学的試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、糞便抽出液、唾液、咽頭拭い液、髄液、又は細胞抽出液等である。
【００１６】
本発明においては、アルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物或いは二価の金属塩を形成する二価の金属イオンに対して、前記の化合物を作用させる。すなわち、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物が存在しない場合には、アルカリ性条件下で水不溶性あるいは難溶性化合物（例えば、水酸化物の形で沈殿するマグネシウム化合物）を生成する可能性のある二価の金属化合物或いは二価の金属塩（例えば、マグネシウム塩）に含まれる二価の金属イオンに対して、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を作用させる。
【００１７】
水不溶性あるいは難溶性の二価の金属化合物を生成する可能性のある二価の金属イオン又は二価の金属化合物（例えば、マグネシウム塩）は、種々の理由によって、試薬中に含有されている。例えば、特定の酵素反応を発現させるための必須金属［例えば、グルコース測定に使用するヘキソキナーゼは、マグネシウムの存在下でグルコースとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から、グルコース−６−リン酸及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を産生する反応を触媒する酵素である。また、トリグリセライド測定に使用するグリセロキナーゼは、マグネシウムの存在下でグリセロールとＡＴＰからα−グリセロリン酸とＡＤＰを産生する反応を触媒する酵素である］、あるいは特定の物質を沈殿させるための金属（例えば、ＨＤＬ−コレステロールを測定する際に、ＨＤＬ以外のリポタンパク質を凝集させるために、ポリアニオンと共に用いるマグネシウム等の２価金属塩）等を挙げることができる。その他、ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬、βリポ測定用試薬や遊離脂肪酸測定用試薬等にも、マグネシウム等の二価の金属イオン又はマグネシウム等の二価の金属化合物が含有されている。本発明は、それらの二価の金属イオン又は二価の金属化合物を含有する任意の試薬を用いる分析系に適用することができる。
【００１８】
例えば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨＤＬ−コレステロール、ＣＫ活性、ＣＫ−ＭＢ活性、アミラーゼ活性を測定する体外診断用試薬組成物中に、アルカリ条件下で、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止できる組成物を含有させ、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止することができても、本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができなくなるような体外診断用試薬組成物では意味がない。ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を含有させた体外診断用試薬組成物であれば、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止し、本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができる。なお、本明細書において「アルカリ性」とは、酸性及び中性以外の状態であり、ｐＨ７以上を意味する。
【００１９】
試薬中等に含まれる二価の金属イオンの量と、その二価の金属イオンのアルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を回避するために必要なＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の量とは比例関係にある。二価の金属イオンとＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物との至適濃度比（モル比）は、二価の金属イオンと使用するＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の種類との組み合わせによって変化するので限定することはできないが、基本的には、二価の金属イオンのモル濃度に対して、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を０．２５〜１００倍、好ましくは０．５〜５０倍のモル濃度範囲内で、適宜調整して用いることができる。
【００２０】
前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を試薬に含有させ、本発明による沈殿防止性組成物が試薬に相当する場合には、通常の試薬組成にそのまま前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。試薬構成が、現在汎用されている自動分析機にあわせて、１試薬系又はそれ以上からなる場合にも、アルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物を形成する二価の金属イオンを含有する試薬、及び／又はアルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物を形成する二価の金属イオンを含有しない試薬に、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。すなわち、二価の金属塩の沈殿又は反応槽や廃液チューブへの吸着は、洗浄液として使用されるアルカリ性洗浄液中の水酸化ナトリウムなどとの接触によって発生するので、前記の二価の金属イオンが洗浄液と接触する際に前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物が共存していればよく、従って、前記二価の金属イオンを含む試薬又は前記二価の金属イオンを含まない試薬のいずれか一方、又は両方に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。
【００２１】
また、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有する試薬は、目的とする物質を測定するために反応に必須の基質や酵素、反応によって消費あるいは生成する物質を検出するための組成物、又は試薬の安定化に必要な各種添加剤を含んでいることができる。すなわち、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物は、目的とする反応系には影響（干渉）せず、しかも反応に必要な二価の金属イオンの役割を損なわずに、アルカリ性条件下において、二価の金属化合物（特にマグネシウム水酸化物）の生成による沈殿を防止することができる。
【００２２】
本発明による沈殿防止性組成物が試薬に相当する場合には、試薬用の緩衝液も特に限定されるものではなく、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝液等を用いることができる。
【００２３】
また、液状の試薬に限らず、酵素の安定化等のために凍結乾燥した試薬にも、本発明を適用することができる。この場合、凍結乾燥品に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させるか、凍結乾燥品の溶解液に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。更に、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物をアルカリ性洗浄液に含有させ、本発明の沈殿防止性組成物をアルカリ性洗浄液とすることもできる。また、本発明の沈殿防止性組成物を、前記試薬又は洗浄液としてではなく、それ単独で自動分析装置に供給することもできる。この場合には、試薬と洗浄液との接触時に沈殿防止性組成物が共存するように供給する。
【００２４】
本発明によって沈殿防止効果が得られる理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように考えることができる。もっとも、本発明は、以下の説明に限定されるものではない。本発明においては、アルカリ性条件で水不溶性水酸化物形成する二価の金属イオンに対して、前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物に含まれる２つの水酸基とカルボキシル基が作用し、二価の金属イオンをキレートし、アルカリ性条件下でも水溶性を保つことができることになるものと思われる。キレートの状態はＥＤＴＡ等による金属キレートとは異なり、カルボキシル基の酸素原子による単独の配位ではなく、また、２つの水酸基の酸素原子によるだけの配位でもないため、アルカリ性条件下で水酸基による配位置換による水酸化物生成が起こらないだけではなく、試薬反応時にＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物による影響を受けることなく測定できるものと考えられる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
《実施例１：マグネシウム塩のアルカリ条件下での沈殿防止》
１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム６水和物５０μＬ、表１に示した化合物の１００ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液（ｐＨ７．０に調整）１００μＬ、蒸留水２５０μＬを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。比較例として、Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ類似化合物、特開平１０−６２４１６号公報で用いられているジヒドロキシベンゼン化合物である１，２−ジヒドロキシ−３，５−ベンゼンジスルホン酸２ナトリウム［別名：タイロン（Ｔｉｒｏｎ）］を用いた。
結果を表１に示す。ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を持つ化合物以外は沈殿を生じた。また、今回の条件下ではジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンでも沈殿を生じた。
【００２７】
【表１】
【００２８】
《実施例２：トリグリセライド測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、トリグリセライド測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−３リン酸ナトリウム（ＡＴＰ−Ｎａ） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）１ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．１ＫＵ／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ １２．５ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ４ＭＵ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《組成》
グッド緩衝液 （ｐＨ６．４） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン １．２ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １ＭＵ／Ｌ
【００２９】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体２μＬに第一試薬２００μＬを加え、３７℃で４分間加温した後、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度を測定した。更に、３７℃で１分間加温後、第二試薬１００μＬを加え、３７℃で４分間保温した後に、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度を測定し、吸光度変化量を求めた。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表２に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは、無添加の場合に比べ吸光度変化量の減少が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各２００μＬと、第二試薬１００μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表３に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】
《実施例３：グルコース測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、グルコース測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
トリス緩衝液（ｐＨ ９．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カリウム ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ） ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＡＴＰ−Ｎａ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコキナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《組成》
酢酸緩衝液（ｐＨ ４．０） １２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３４】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体２μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で４分間加温した後、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。更に、３７℃で１分間加温後、第二試薬６０μＬを加え、３７℃で４分間保温した後に、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度を測定し、吸光度変化量を求めた。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表４に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは、無添加の場合に比べ吸光度変化量の増加が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００３５】
【表４】
【００３６】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各２４０μＬと、第二試薬６０μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表５に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００３７】
【表５】
【００３８】
《実施例４：クレアチンキナーゼ活性測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、クレアチンキナーゼ活性測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
イミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸マグネシウム４水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−２リン酸（ＡＤＰ） ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−１リン酸（ＡＭＰ） １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアデノシン−５リン酸（ＡＰ５Ａ） ２５μｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−グルコース ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＡＤＰ ６ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコキナーゼ ４０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《基本組成》
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
クレアチンリン酸 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸マグネシウム４水和物 １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第二試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第二試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第二試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第二試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
【００３９】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体４μＬに第一試薬１６０μＬを加え、３７℃で３分間加温した後、３７℃で２分間加温しながら、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度変化量を測定した。第二試薬４０μＬを加え、３７℃で２分間保温した後に、３７℃で３分間加温しながら、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度変化量を測定した。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表６に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは無添加の場合に比べ吸光度変化量の減少が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００４０】
【表６】
【００４１】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各１６０μＬと、第二試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）４０μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表７に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００４２】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の沈殿防止用組成物は、臨床診断等の分析装置の用途に適用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析装置に適用する沈殿防止用組成物に関する。本発明の沈殿防止用組成物は、特に自動分析装置に好適に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断検査においては、多数の検体について疾病診断の指標となる多岐にわたる物質を短時間に、しかも高精度に測定し、その結果を迅速かつ正確に治療に当たる医師などにフィードバックすることが求められており、大多数の検査は、自動分析装置によって測定が行われている。自動分析装置は、血清等の被検体と診断用試薬とをセットしておけば、被検体のサンプリング、試薬の分注、反応による信号の検出、測定結果の計算及び結果の印刷までを自動的に行うことができる装置で、広く普及している。自動分析装置を用いると、従来の用手法に比較して、一般に検体量や試薬量を少なくすることができるため、コスト的にも有効であるが、操作の自動化が進行すると共に機械の高精度化が要求されている。例えば、検体や試薬分注に使われるノズルは微細になり、反応槽（セル）は同じものを洗浄しながら繰り返し使用しているため、次の検体や試薬を分注するまでに洗浄を行い、前の測定に起因する要因を排除して、次の検体や、試薬に影響のないようにしなくては正確な測定値を得ることはできない。このため、自動分析装置のメーカーは、これらの性能を有する高精度で処理能力の高い、洗浄機構等の優れた装置を開発してきた。
【０００３】
装置の性能向上と併せ、それに用いられる各診断用試薬の性能も向上させなくてはならない。しかしながら、試薬の性能が診断指標毎に個別に向上しても、１台の自動分析装置で測定される検査項目は多数あるので、各試薬間の影響についても考慮する必要がある。例えば、或る検査項目に用いる試薬に含まれる或る物質が、反応槽や反応終了後に廃棄される反応液を通過させる廃液チューブへ沈殿又は吸着し、そのために他の検査項目の測定結果へ影響を与えたり、装置自体の稼働に影響を与えるようなことがあってはならない。そのため、そのような事態を未然に防止するため、各試薬にはそれぞれ工夫が施されて市販されている。例えば、反応系自体には関係のない添加物（界面活性剤、又はキレート剤）が加えられている場合が多い。
【０００４】
しかしながら、体外診断用試薬は多岐に渡り、その種類も多いため、体外診断用試薬メーカーも努力はしているものの、充分な対応がされているとはいえず、問題点も多数存在した。例えば、自動分析装置で実際に用いる検体は、主に血清や血漿等の生体由来液であるので、検体に含まれるタンパク質が反応槽（セル）やチューブに吸着することによる汚れが問題になることが多い。そこで、反応終了後に行われる反応槽（セル）の洗浄には、水酸化ナトリウム及び界面活性剤等からなるアルカリ性の洗浄液が多用されている。一方、体外診断用試薬には、目的物質を正確に検出するために、金属塩を含むものが多い。例えば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、アミラーゼ活性、又はＨＤＬ−コレステロールを測定するためには、目的反応の原理から体外診断用試薬中に金属塩を含ませることは必須である。このような体外診断用試薬を用いる反応を行った後に、アルカリ性洗浄液で洗浄すると、反応液に含まれている金属塩が、洗浄液中の水酸化ナトリウムによって、洗浄時に水不溶性水酸化物に変換し、反応槽（セル）内や廃液吸引ノズルや廃液系チューブ内で沈殿し、他の測定に影響を与えることが少なくなかった。
【０００５】
上記問題を解決するために多くの試みがなされた。水酸基によって配位する化合物を含有させる事によりアルカリ性条件下で沈殿を防止する方法（特許文献１）、多糖類を含有せる事によりアルカリ性条件下で沈殿を防止する方法（特許文献２）が報告されている。しかしながら、特にマグネシウム化合物が含まれている試薬の場合、水酸化マグネシウムによる沈殿が発生しやすく、単にマグネシウムをキレートさせて沈殿を防止できるキレート能の高い物質の添加では体外診断用試薬の本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができなくなることが少なくなかった。また、アルカリ性条件下で、更にヘパリン、又はデキストラン硫酸等の硫酸多糖類が共存すると、前記の金属塩が沈殿するだけではなく凝集し、反応槽（セル）内や廃液系チューブへ沈着し、測定値誤差や詰まりの原因となり、自動分析装置自体の稼働にも影響を与えてしまうという問題もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−６２４１６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００３／０７１２８２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、アルカリ洗剤による金属塩の沈殿や、硫酸多糖類との凝集及び沈着による影響を受けることなく、自動分析装置における分析を常に正確に実施し、安定的に稼働させるため、更に、体外診断用試薬の本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができる試薬を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、本発明による、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置に適用して、二価金属イオンからアルカリ性条件下で形成される金属化合物の沈殿を防止するための組成物であって、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有することを特徴とする、前記沈殿防止用組成物により解決することができる。
本発明の沈殿防止用組成物の好ましい態様によれば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、ＨＤＬ−コレステロール、ヘモグロビンＡ１ｃ、又はアミラーゼ活性を測定することのできる体外診断用試薬組成物であるか、あるいは、分析装置の洗浄液であることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の沈殿防止性組成物は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を含有し、二価金属イオン（特にマグネシウムイオン）を含む試薬と、アルカリ性洗浄液とを用いる分析装置（特に自動分析装置）においても、水不溶性又は難溶性化合物（例えば、水酸化マグネシウム）の形成を防ぎ、廃液チューブ等への水不溶性又は難溶性化合物の沈着を防止することができ、自動分析装置による分析を常に正確に実施し、安定に稼動させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による沈殿防止性組成物は、アルカリ性条件下で塩として沈殿する二価の金属イオンに対して、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基によって配位する化合物を含有する。このＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物は、このＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物が存在しない場合には、アルカリ性条件下において生成する水不溶性あるいは難溶性の二価の金属化合物を生成させず、沈殿を生じさせない。
前記の二価の金属としては、カルシウム、マグネシウム等があげられるが、これらの中でも特にマグネシウムが好ましい。
【００１１】
本発明で用いることのできるＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物は、以下に限定されるものではないが、例えば、一般式（Ｉ）：
Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ （Ｉ）
［式中、基Ｒは、
【化１】
で表される基であって、ｎは０又は１〜１０（好ましくは１〜５）の整数であり、Ｚは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、又は−ＣＨ２ＯＨである］
で表される化合物であることができる。基Ｒとしては、例えば、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＯ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
なぜならば、本発明で達成できるアルカリ洗浄剤による金属塩の沈殿の防止や、目的物質を正確に検出する事ができる試薬を提供するために必要な組成は、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基により達成されるものであり、一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ中のＲは、Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨとして試薬中に溶解できるものであれば良く、特に構造を限定されるものではない。つまり、化合物中にＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を持っていれば、本発明の目的を達成することができる。
【００１３】
本発明で用いることのできるＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物としては、例えば、エリトロン酸、エリトルロン酸、酒石酸、トレオン酸、トレウロン酸、トレアル酸、リボン酸、リブロン酸、リバル酸、アラビノン酸、アラビヌロン酸、アラビナル酸、キシロン酸、キシルロン酸、キシラル酸、リキソン酸、リキスロン酸、アロン酸、アルロン酸、アラル酸、アルトロン酸、アルトルロン酸、アルトラル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルカル酸、マンノン酸、マンヌロン酸、マンナル酸、グロン酸、グルロン酸、イドン酸、イズロン酸、イダル酸、ガラクトン酸、ガラクツロン酸、粘液酸、タロン酸、タルロン酸、グルコヘプトン酸のほか、ラクトビオン酸、（２Ｒ，３Ｒ）−タートラニル酸等を挙げることができる。前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。また、それらの水和物も挙げることができる。更に、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンのように、試薬中に溶解させると一般式（Ｉ）で表される構造をとる物質によっても本発明の目的を達成することができる。本発明では、これらのＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を、単独であるいは２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００１４】
なお、従来技術として、酒石酸を含むジカルボン酸によるグリセロリン酸オキシダーゼの安定化法（特開昭６０−１２６０８４）や、酒石酸、グルコン酸等を用いた酵素的測定試薬の安定化法（特開２００５−２７８６２６）があるが、これらはいずれも酵素または酵素的測定試薬中の色原体およびカップラーの安定性を向上させることを目的に用いられており、本発明の目的であるアルカリ条件下での二価金属化合物の沈殿防止とは用途が異なる。
【００１５】
本発明による沈殿防止性組成物は、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置、特には、少なくとも検体と試薬と洗浄液とを分注及び排出する自動分析装置に適用する。本発明において、検体は特に限定されず、分析装置（特に、自動分析装置）で使用可能な検体であればよい。具体的には、生物学的試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、糞便抽出液、唾液、咽頭拭い液、髄液、又は細胞抽出液等である。
【００１６】
本発明においては、アルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物或いは二価の金属塩を形成する二価の金属イオンに対して、前記の化合物を作用させる。すなわち、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物が存在しない場合には、アルカリ性条件下で水不溶性あるいは難溶性化合物（例えば、水酸化物の形で沈殿するマグネシウム化合物）を生成する可能性のある二価の金属化合物或いは二価の金属塩（例えば、マグネシウム塩）に含まれる二価の金属イオンに対して、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を作用させる。
【００１７】
水不溶性あるいは難溶性の二価の金属化合物を生成する可能性のある二価の金属イオン又は二価の金属化合物（例えば、マグネシウム塩）は、種々の理由によって、試薬中に含有されている。例えば、特定の酵素反応を発現させるための必須金属［例えば、グルコース測定に使用するヘキソキナーゼは、マグネシウムの存在下でグルコースとアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から、グルコース−６−リン酸及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を産生する反応を触媒する酵素である。また、トリグリセライド測定に使用するグリセロキナーゼは、マグネシウムの存在下でグリセロールとＡＴＰからα−グリセロリン酸とＡＤＰを産生する反応を触媒する酵素である］、あるいは特定の物質を沈殿させるための金属（例えば、ＨＤＬ−コレステロールを測定する際に、ＨＤＬ以外のリポタンパク質を凝集させるために、ポリアニオンと共に用いるマグネシウム等の２価金属塩）等を挙げることができる。その他、ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬、βリポ測定用試薬や遊離脂肪酸測定用試薬等にも、マグネシウム等の二価の金属イオン又はマグネシウム等の二価の金属化合物が含有されている。本発明は、それらの二価の金属イオン又は二価の金属化合物を含有する任意の試薬を用いる分析系に適用することができる。
【００１８】
例えば、トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨＤＬ−コレステロール、ＣＫ活性、ＣＫ−ＭＢ活性、アミラーゼ活性を測定する体外診断用試薬組成物中に、アルカリ条件下で、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止できる組成物を含有させ、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止することができても、本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができなくなるような体外診断用試薬組成物では意味がない。ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を含有させた体外診断用試薬組成物であれば、アルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を防止し、本来の目的である目的物質を正確に検出する事ができる。なお、本明細書において「アルカリ性」とは、酸性及び中性以外の状態であり、ｐＨ７以上を意味する。
【００１９】
試薬中等に含まれる二価の金属イオンの量と、その二価の金属イオンのアルカリ性条件下での沈殿或いは反応槽や廃液チューブへの吸着を回避するために必要なＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の量とは比例関係にある。二価の金属イオンとＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物との至適濃度比（モル比）は、二価の金属イオンと使用するＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物の種類との組み合わせによって変化するので限定することはできないが、基本的には、二価の金属イオンのモル濃度に対して、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基化合物を０．２５〜１００倍、好ましくは０．５〜５０倍のモル濃度範囲内で、適宜調整して用いることができる。
【００２０】
前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を試薬に含有させ、本発明による沈殿防止性組成物が試薬に相当する場合には、通常の試薬組成にそのまま前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。試薬構成が、現在汎用されている自動分析機にあわせて、１試薬系又はそれ以上からなる場合にも、アルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物を形成する二価の金属イオンを含有する試薬、及び／又はアルカリ性条件下で沈殿する二価の金属化合物を形成する二価の金属イオンを含有しない試薬に、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。すなわち、二価の金属塩の沈殿又は反応槽や廃液チューブへの吸着は、洗浄液として使用されるアルカリ性洗浄液中の水酸化ナトリウムなどとの接触によって発生するので、前記の二価の金属イオンが洗浄液と接触する際に前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物が共存していればよく、従って、前記二価の金属イオンを含む試薬又は前記二価の金属イオンを含まない試薬のいずれか一方、又は両方に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。
【００２１】
また、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有する試薬は、目的とする物質を測定するために反応に必須の基質や酵素、反応によって消費あるいは生成する物質を検出するための組成物、又は試薬の安定化に必要な各種添加剤を含んでいることができる。すなわち、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物は、目的とする反応系には影響（干渉）せず、しかも反応に必要な二価の金属イオンの役割を損なわずに、アルカリ性条件下において、二価の金属化合物（特にマグネシウム水酸化物）の生成による沈殿を防止することができる。
【００２２】
本発明による沈殿防止性組成物が試薬に相当する場合には、試薬用の緩衝液も特に限定されるものではなく、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝液等を用いることができる。
【００２３】
また、液状の試薬に限らず、酵素の安定化等のために凍結乾燥した試薬にも、本発明を適用することができる。この場合、凍結乾燥品に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させるか、凍結乾燥品の溶解液に前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物を含有させることができる。更に、前記のＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物をアルカリ性洗浄液に含有させ、本発明の沈殿防止性組成物をアルカリ性洗浄液とすることもできる。また、本発明の沈殿防止性組成物を、前記試薬又は洗浄液としてではなく、それ単独で自動分析装置に供給することもできる。この場合には、試薬と洗浄液との接触時に沈殿防止性組成物が共存するように供給する。
【００２４】
本発明によって沈殿防止効果が得られる理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように考えることができる。もっとも、本発明は、以下の説明に限定されるものではない。本発明においては、アルカリ性条件で水不溶性水酸化物形成する二価の金属イオンに対して、前記ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物に含まれる２つの水酸基とカルボキシル基が作用し、二価の金属イオンをキレートし、アルカリ性条件下でも水溶性を保つことができることになるものと思われる。キレートの状態はＥＤＴＡ等による金属キレートとは異なり、カルボキシル基の酸素原子による単独の配位ではなく、また、２つの水酸基の酸素原子によるだけの配位でもないため、アルカリ性条件下で水酸基による配位置換による水酸化物生成が起こらないだけではなく、試薬反応時にＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基配位性化合物による影響を受けることなく測定できるものと考えられる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
《実施例１：マグネシウム塩のアルカリ条件下での沈殿防止》
１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム６水和物５０μＬ、表１に示した化合物の１００ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液（ｐＨ７．０に調整）１００μＬ、蒸留水２５０μＬを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。比較例として、Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ類似化合物、特開平１０−６２４１６号公報で用いられているジヒドロキシベンゼン化合物である１，２−ジヒドロキシ−３，５−ベンゼンジスルホン酸２ナトリウム［別名：タイロン（Ｔｉｒｏｎ）］を用いた。
結果を表１に示す。ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を持つ化合物以外は沈殿を生じた。また、今回の条件下ではジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンでも沈殿を生じた。
【００２７】
【表１】
【００２８】
《実施例２：トリグリセライド測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、トリグリセライド測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−３リン酸ナトリウム（ＡＴＰ−Ｎａ） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）１ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．１ＫＵ／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ １２．５ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ４ＭＵ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《組成》
グッド緩衝液 （ｐＨ６．４） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン １．２ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １ＭＵ／Ｌ
【００２９】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体２μＬに第一試薬２００μＬを加え、３７℃で４分間加温した後、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度を測定した。更に、３７℃で１分間加温後、第二試薬１００μＬを加え、３７℃で４分間保温した後に、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度を測定し、吸光度変化量を求めた。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表２に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは、無添加の場合に比べ吸光度変化量の減少が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各２００μＬと、第二試薬１００μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表３に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】
《実施例３：グルコース測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、グルコース測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
トリス緩衝液（ｐＨ ９．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カリウム ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ） ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＡＴＰ−Ｎａ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコキナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《組成》
酢酸緩衝液（ｐＨ ４．０） １２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３４】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体２μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で４分間加温した後、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。更に、３７℃で１分間加温後、第二試薬６０μＬを加え、３７℃で４分間保温した後に、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度を測定し、吸光度変化量を求めた。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表４に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは、無添加の場合に比べ吸光度変化量の増加が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００３５】
【表４】
【００３６】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各２４０μＬと、第二試薬６０μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表５に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００３７】
【表５】
【００３８】
《実施例４：クレアチンキナーゼ活性測定用試薬における沈殿防止》
（１）試薬調製
以下の組成で、クレアチンキナーゼ活性測定用試薬を調製した。
・第一試薬
《基本組成》
イミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸マグネシウム４水和物 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−２リン酸（ＡＤＰ） ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン５’−１リン酸（ＡＭＰ） １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアデノシン−５リン酸（ＡＰ５Ａ） ２５μｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−グルコース ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＡＤＰ ６ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコキナーゼ ４０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ
第一試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第一試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第一試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
・第二試薬
《基本組成》
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
クレアチンリン酸 １５ｍｍｏｌ／Ｌ
酢酸マグネシウム４水和物 １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第二試薬（ａ）：上記基本組成からなるもの（対照）。
第二試薬（ｂ）：上記基本組成に酒石酸ナトリウムカリウム４水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第二試薬（ｃ）：上記基本組成にグルコン酸ナトリウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（実施例）。
第二試薬（ｄ）：上記基本組成にタイロン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加したもの（比較例）。
【００３９】
（２）反応性
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と第二試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を測定に用いた。検体としてはコントロール血清を使用した。測定操作は、検体４μＬに第一試薬１６０μＬを加え、３７℃で３分間加温した後、３７℃で２分間加温しながら、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度変化量を測定した。第二試薬４０μＬを加え、３７℃で２分間保温した後に、３７℃で３分間加温しながら、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度変化量を測定した。
沈殿防止剤無添加に対する吸光度変化量の割合を表６に示す。ジヒドロキシベンゼン化合物であるタイロンを添加したものでは無添加の場合に比べ吸光度変化量の減少が認められたが、酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは反応に影響なかった。
【００４０】
【表６】
【００４１】
（３）水酸化マグネシウム沈殿の有無
前記（１）で調製した第一試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）各１６０μＬと、第二試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）４０μＬとを混合した後、４Ｎ ＮａＯＨ １００μＬを加え、混合攪拌した。攪拌３０分後に沈殿の有無を肉眼で確認した。
結果を表７に示す。酒石酸ナトリウムカリウム、グルコン酸ナトリウムを添加したものでは沈殿は生じていなかった。
【００４２】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の沈殿防止用組成物は、臨床診断等の分析装置の用途に適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置に適用して、二価金属イオンからアルカリ性条件下で形成される金属化合物の沈殿を防止するための組成物であって、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有することを特徴とする、前記沈殿防止用組成物。
【請求項２】
トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、ＨＤＬ−コレステロール、ヘモグロビンＡ１ｃ、又はアミラーゼ活性を測定することのできる体外診断用試薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
分析装置の洗浄液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１】
少なくとも検体と試薬と洗浄液とを注入及び排出する分析装置に適用して、二価金属イオンからアルカリ性条件下で形成される金属化合物の沈殿を防止するための組成物であって、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ基を有する化合物又はその塩を含有することを特徴とする、前記沈殿防止用組成物。
【請求項２】
トリグリセライド、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、ＣＫ−ＭＢ活性、ＨＤＬ−コレステロール、ヘモグロビンＡ１ｃ、又はアミラーゼ活性を測定することのできる体外診断用試薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
分析装置の洗浄液である、請求項１に記載の組成物。
【公開番号】特開２０１０−４３９１４（Ｐ２０１０−４３９１４Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７３３０（Ｐ２００８−２０７３３０）
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【Ｆターム（参考）】
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