分析試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの定量にホスホナゾＩＩＩを用いる方法
体液中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを測定するために、ホスホナゾＩＩＩを使用する新規な試薬製剤および方法を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホナゾＩＩＩを使用して、分析試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを定量する方法、および該方法に使用される新規な試薬組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
カルシウムは、体内で５番目に多い元素であり、結晶性ヒドロキシアパタイトとして骨中に９９％存在している。また、細胞外液は、体内総カルシウムの約０．１％を含有し、細胞外液中のカルシウムのうち、約３０％は血漿中に存在している。
【０００３】
カルシウムの生理的機能は多種多様である。細胞内カルシウムは、数種の酵素、特にアデニル酸シクラーゼおよびカルモジュリン（受容蛋白）の活性を調整するとともに、受精、有系分裂、細胞運動および補助作用を含む多数の細胞機能の調整にも関与する。また、横紋筋において、カルシウムは、カルシウム結合タンパク質であるトロポニンと組合わされて筋原線維の収縮を活性化するとともに、膜透過性を調整する働きをし、神経伝達物質を放出させ、筋神経の興奮を弱める。カルシウム代謝およびカルシウム機能に関する掘り下げた考察については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編、編集者Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｗ．Ｔｉｅｔｚ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ社（１９８７）を参照のこと。
【０００４】
臨床学的に、血清カルシウム値は、臨床診断を行う上で非常に重要な値である。血清カルシウム値の参照値の範囲は非常に狭く（２．２０〜２．５５ｍｍｏｌ／Ｌ）、この範囲より上または下の僅かな偏差によって、数種の生理的障害を診断することになる。高カルシウム血症（血清カルシウム値の上昇）と関連する最も一般的な２つの疾患として、副甲状腺機能亢進症および悪性腫瘍が挙げられ、特に悪性腫瘍は、骨格に転移して骨融解を起こすおそれがある。血清カルシウム値の低下（すなわち、低カルシウム血症）は、通例、副甲状腺機能低下症を伴う。新生児のうち約１％は重大な低カルシウム血症（血清カルシウム値が１．７５ｍｍｏｌ／Ｌよりも小さい場合）を患い、早急な医学的処置が必要な、興奮、れん縮および痙攣を発症する。
【０００５】
マグネシウムは、カルシウムと同様、体内で見られる主な元素の１つである。７０ｋｇの標準的なヒトの成人は、約２０〜２８ｇのマグネシウムを有しており、その約５５％が骨内に、２７％が筋肉内に存在する。また、血清マグネシウム値の参照値の範囲は、０．６５〜１．０５ｍｍｏｌ／Ｌと、かなり狭い。血清マグネシウム値の低下、すなわち低マグネシウム血症（＜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）は、上述した低カルシウム血症と殆ど同じ過剰興奮、テタニーおよび痙攣、つまり神経筋機能の障害を発症させる。逆に、血清マグネシウム値が上昇すると、体には鎮静効果がはたらく。
【０００６】
低カルシウム血症と低マグネシウム血症とは、臨床症状が殆ど同じであることから、どちらの元素が上述した臨床症状の原因となっているのかを判断しなければならない。このため、血清カルシウム値および血清マグネシウム値の両方を測定し、どちらの元素の値が低いのか、または両方の値が低いのかを知る必要がある。
【０００７】
カルシウム値およびマグネシウム値を測定するための方法として、原子吸光法を挙げることができる。原子吸光法は、干渉が殆どなく、小容量の試料しか必要とせず、また、精度が良いとともに再現性が高い。しかし、日常的に用いる測定方法として、原子吸光法は、やや使い難く、また、高価な装置とかなりの熟練者とを必要とする方法である。
【０００８】
カルシウムを測定するための臨床検査室において、現在、日常的には、オルト−クレゾールフタレインコンプレクソン（ＣＰＣ）あるいはアルセナゾＩＩＩを使用する方法が用いられている。両方法とも広く用いられており、互いに補完しあう関係にある。ＣＰＣ法の感度はｐＨに非常に左右されることから、最高感度を得るため、反応はｐＨ１１．７付近で行われる。しかし、このアルカリ性ｐＨの下で、試薬は、大気中の二酸化炭素を容易に吸収する。そして、吸収された二酸化炭素は、水と結合して炭酸となり、試薬のｐＨ値を徐々に減少させる（つまり、酸性化する）ので、最終的にこの試薬によるカルシウム測定ができなくなる。さらに云えば、ＣＰＣは著しく選択性に乏しいことから、マグネシウムおよび他の重金属とも結合する。血清中で一般的に発生するマグネシウムの干渉を排除するため、８−ヒドロキシキノリンを加えてマグネシウムをキレート化するが、この化合物は、カルシウムもキレート化してしまうので、カルシウム測定の感度が２５〜４０％低減する。一方、アルセナゾＩＩＩを用いる場合には、ＣＰＣ法のような、ｐＨを高くしなければならいという問題、およびマグネシウム干渉の問題はない。アルセナゾＩＩＩは、弱酸性下、たとえばｐＨ５〜６でカルシウムと結合するので、カルシウム測定をｐＨ７未満で行うことにより、マグネシウムの結合を無視することができる。アルセナゾＩＩＩは、ＣＰＣ法における多くの欠点を解消できるが、アルセナゾＩＩＩには、感度がやや低く、また、環境への悪影響という問題がある。すなわち、アルセナゾＩＩＩは、１モル当たりに２モルのヒ素を含んでおり、アルセナゾＩＩＩ試薬の廃棄がヒ素による上水の汚染につながることが、多くの国で重大な問題になりつつある。
【０００９】
Ｔａｎａｋａ（米国特許第４，９６６，７８４号）およびＫａｕｆｍａｎ（米国特許第５，５８９，３４８号）は、クロロホスホナゾＩＩＩを使用して、カルシウムを測定する方法を開発した。この測定方法で用いられる発色団はヒ素を含まないものの、比較的高い試薬ブランクの吸光度を有する傾向があり、この試薬ブランクの吸光度により、多くの分析器においてカルシウム測定値に対する直線性が限定されることになる。一方、Ｃｈａｐｏｔｅａｕは、四酢酸のフェノール誘導体を使用するカルシウム分析方法を開発している（米国特許第５，２６２，３３０号）。しかし、この分析方法では、カルシウムを結合させるため、アルカリ性ｐＨの下で行う必要があった。
【００１０】
カルシウム分析における問題は、マグネシウム分析における問題でもある。カルマガイト方法（Ｃａｌｍａｇｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄｓ；米国特許第４，３８３，０４３号）は、多くの臨床検査室において日常的に使用されており、また、キシリジルブルー、キシルアゾバイオレットＩおよびＩＩ（米国特許第４，５０３、１５６号）、およびＥｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｂｌａｃｋ Ｔ（米国特許第４，３８３，０４３号）を使用する他の方法が開発されている。カルシウム分析と同様に、先のマグネシウム測定方法の全ては、高ｐＨ（＞＞９）を必要とすることから、周囲の二酸化炭素の吸収により蓋をしていない試薬容器中の試薬のｐＨ安定性が損なわれる。マグネシウムを測定する最近の方法として、クロロホスホナゾＩＩＩを使用するものが公開されている（米国特許第５，５８９，３４８号および同第５，３９７，７１０号）。この発色団は、マグネシウムを結合するための高いｐＨを必要としないが、比較的高い試薬ブランクの吸光度を有する傾向があり、この試薬ブランクの吸光度により、多くの臨床化学分析器においてマグネシウム測定値に対する直線性が限定されることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、分析試料中のカルシウムおよびマグネシウムを定量的に測定する方法に関してまだ解決されていない課題がある。それは、ａ）カルシウムおよびマグネシウムを中性から弱酸性ｐＨの付近で結合させること、ｂ）発色団が、たとえばヒ素などの毒性元素を含んでいないこと、ｃ）発色体の試薬ブランクの吸光度が比較的低いこと、ｄ）試薬が皮膚などに触れても安全な取扱い特性を備えていること（たとえばｐＨが中性付近であること）である。
【００１２】
ナトリウムは、細胞外液、ならびに血漿および血清において群を抜いて広く認められるカチオンである。体内におけるナトリウムの主な機能は、細胞外コンパートメント（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）における水バランスと浸透圧とを維持することである。
【００１３】
血清や血漿といった体液中のナトリウムは、炎光発光分光法あるいはナトリウムイオン電極法を用いて測定するのが通例である。両方法とも、一般的にきわめて良好に機能するものの、それぞれに欠点が存在する。すなわち、ＯＳＨＡ（米国労働安全衛生局）は、炎光光度計の燃料としてプロパンを使用することを定めているが、プロパンのガス漏れはタンク、バルブ、および管継ぎ手から簡単に起こることから、プロパンが作業エリアに流出して爆発災害を引き起こすおそれがある。また、プロパンタンクの残量が極めて少なくなった場合、フレームの火炎特性が変化するおそれがあることから、より頻繁にキャリブレーションを行う必要がある。さもないと、フレームの火炎特性が分析に適さないものとなるからである。
【００１４】
一方、ナトリウムイオン電極法には、炎光光度計を用いる場合のような安全性に関する問題がない。ところが、電極は、一般的にうまく機能するものの、堆積したタンパク質を取り除くためのクリーニングを頻繁に必要とするとともに、経費のかかる該電極の交換が必要となる。また、ナトリウムイオン電極法を行う装置は、多くの小さな臨床検査室が導入するには高価すぎる。
【００１５】
ナトリウムを比色的に測定するためのいくつかの試みがなされている。Ｃｈａｐｏｔｅａｕ（米国特許第４，８０８，５３９号）およびＣｒａｍ（米国特許第５，０１１，９２４号）は、それぞれ、「発色性クリプタンド」および「発色性クリプタヘミスフェランド」を用いた血清中のナトリウムを測定する方法を開発した。また、酵素であるβ−ガラクトシダーゼを使用して、酵素活性を低濃度のナトリウムの存在下で活性化する動的酵素手段がＢｅｒｒｙによって公開されている（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４，２２９５−２２９８（１９８８））。
【００１６】
１９６６年、Ｂｕｄｅｓｉｎｓｋｙ（Ｔｓｃｈｅｃｈｏｓｌｏｗ．Ｐａｔ．Ｎｒ．１２２３７９）は、ホスホナゾＩＩＩを含む一連のクロモトロピン酸誘導体の合成および数種の重金属および遷移金属イオンのキレートの現存するスペクトルデータを記載した（Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３２，１９６７およびＴａｌａｎｔａ１５（１０），１０６３−４，１９６８）。該データの要約が後に、Ｃｈｅｌａｔｅｓ ｉｎ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，第２巻、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（ｐ１−９１）において公開された。ほぼ同じ時、ロシアの科学者のグループが、ホスホナゾＩＩＩおよび数種の２価の遷移金属イオンを持つ他の誘導体のスペクトルデータを提示し（Ｌｕｋｅｎら、Ｄｏｋｌ，．Ａｌａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲ１７３（２），３６１−３６３，１９６７）、他の研究者らは、ホスホナゾＩＩＩと数種の希土類金属との錯体形成およびスペクトル特性を例証した（Ｚｈ．Ａｎａｌ．Ｋｈｉｍ．，２６（４），Ｊ，７７２−６，１９７１；Ｚｈ．Ａｎａｌ．Ｋｈｉｍ．３２（４），６７４−６７８，１９７７；およびＴｒ．Ｖｓｅｓ．Ｎａｕｃｈ．−Ｉｓｓｌｅｄ．Ｉｎｓｔ．Ｋｈｉｍ．Ｒｅａｋｔｉｖｏｖ Ｏｓｏｂｏ Ｃｈｉｓｔ．Ｋｈｉｍ．Ｖｅｓｈｃｈｅｓｅｓｔｖ，１９６７，Ｎｏ．３０，４２−９）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１態様によれば、たとえば、カルシウム、マグネシウムあるいはナトリウムの測定に用いられる診断試薬キットを提供することができる。該キットは、式Ｉに示す化合物を含む。
［式Ｉ］
（但し、式Ｉ中のＲ１〜Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６エーテルアルキル、Ｃ３−６分岐アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびハロゲンから個々に選択される。）
本発明の好ましい態様の多くにおいて、Ｒ１〜Ｒ８は全てＨである。つまり、診断試薬キット内に含まれる化合物は、以下に示す構造のホスホナゾＩＩＩである。
【００１８】
本発明の好ましい他の態様では、分析試料中のカルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの濃度を定量的に測定する方法を提供することができる。該方法は、ａ）試料をホスホナゾＩＩＩなどの式Ｉの化合物と接触（ｃｏｎｔａｃｔ）させ；ｂ）上記接触ステップａ）で得られた、吸光度、反射率あるいは蛍光性の変化を測定するものである。
【００１９】
本発明の他の態様では、該方法は、ａ）式Ｉの化合物、すなわちホスホナゾＩＩＩを含む試薬の吸光度、反射率あるいは蛍光性を測定し（試薬ブランク）；ｂ）試料を診断試薬に加え；ｃ）試料を診断試薬に加えた後の吸光度、反射率あるいは蛍光性を測定し；ｄ）ステップａ）で得た吸光度、反射率あるいは蛍光性の測定値を、ステップｃ）の結果として得た測定値から減じて、試料中のカルシウム、マグネシウムあるいはナトリウムに基づく正味の吸光度、反射率あるいは蛍光性を得るものである。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、ナトリウムの測定に有用なキットおよび分析試料中のナトリウムの濃度を定量的に測定する方法を提供できる。これらの態様のそれぞれにおいて、キットおよび方法は、Ｒ３およびＲ７がＣｌである式Ｉ中の化合物を含んでいる。
【００２１】
本発明の利点の１つは、式Ｉの好ましい化合物であるホスホナゾＩＩＩが、ｐＨの広い範囲（約２〜１１）でカルシウムと結合することであり、ｐＨが約７のときに最高の感度となる。したがって、ｐＨが７あるいは弱酸性のｐＨの緩衝液中で調製された試薬溶液は、試薬が大気中の二酸化炭素を吸収することによる影響を受けないので、劣化した試薬を廃棄する必要がなく、殆ど無駄がない。また、ホスホナゾＩＩＩは、概ね６〜１１のｐＨ範囲においてマグネシウムとも結合する（ｐＨが約７のときに最高感度となる）。したがって、カルシウム用と同様に、マグネシウム用の試薬溶液のｐＨも、大気中の二酸化炭素を吸収することによる影響を受ける範囲にない。また、ホスホナゾＩＩＩは、概ね６〜１１のｐＨ範囲においてナトリウムと結合する（ｐＨが約９のときに最高感度となる）。
【００２２】
本発明の他の利点は、ホスホナゾＩＩＩ（上記式Ｉを参照）が、２モルのヒ素を含有するアルセナゾＩＩＩの場合のように、毒性元素を含まないことである。したがって、使用済み試薬の廃棄に際してアルセナゾＩＩＩの場合のように大きな毒性の問題がない。
【００２３】
ホスホナゾＩＩＩを使用する試薬キットおよびこれを用いた分析方法のさらに他の利点として、マグネシウムの分析における試薬ブランクの吸光度は、マグネシウム測定用のクロロホスホナゾＩＩＩのそれよりも幾分か低いことがあげられる。この結果、試薬ブランクの吸光度が高すぎるため、臨床化学分析器におけるマグネシウム試験値の直線性が損なわれるといったような心配はない。
【００２４】
カルシウムおよびマグネシウム用の試薬キットは、該試薬が皮膚などに触れても安全なように、ｐＨ７付近で調製することができる。
【００２５】
ナトリウム（特に血清中のナトリウム）の分析は、試料を混濁化する脂質の存在、および約４４０〜５７５ｎｍのスペクトルの可視領域における吸収作用を有するヘモグロビンおよびビリルビンの存在によって複雑になるおそれがある。一方、ホスホナゾＩＩＩを用いた場合、ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体の最大感度波長は約６５０ｎｍであり、この波長では、ヘモグロビンおよびビリルビンによるスペクトル干渉は存在せず、また、混濁による干渉は極めて小さい。これは、先の［Ｃｈａｐｏｔｅａｕ（米国特許第４，８０８，５３９号）およびＣｒａｍ（米国特許第５，０１１，９２４号）］ならびにＢｅｒｒｙ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４，２２９５−２２９８（１９８８））の手法における最大感度波長が、５００ｎｍあるいは４０５ｎｍといったより短い波長であるのに比べて非常に進歩した点である。
【発明の効果】
【００２６】
このように、分析試料、特に生物学的試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを定量的に測定するための分析用試薬にホスホナゾＩＩＩを用いることにより、カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを測定するために用いられている現在の方法が有する課題の多くを解決することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
式Ｉにおける好適な化合物のひとつであるホスホナゾＩＩＩは、Ｃｈｅｌａｔｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，第２巻，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ１−９１およびＪ．Ｏ．Ｃ．２４５０（１９６４）（これらの開示は参照によって本明細書に組み入れられる）などの文献によれば、種々の手順（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｓｓａｙｓ社，Ｍａｎｖｉｌｌｅ，ＮＪ）によって合成されている。該手順は、要約すると以下の通りである。
ステップ１． ジアゾ化ｏ−クロロアニリンを三塩化リンと反応させてｏ−クロロフェニルホスフィンを形成し、
ステップ２． 該ホスフィンを加水分解した後、ｏ−クロロフェニルホスホン酸をアンモニアと反応させてｏ−アミノフェニルホスホン酸を形成し、
ステップ３． ２モルのｏ−アミノフェニルホスホン酸をジアゾ化し、１モルのクロモトロープ酸と反応させてホスホナゾＩＩＩを形成する。
【００２８】
また、式Ｉにおける他の化合物は、当業者が公知技術を用いて合成することができ、また、クロロホスホナゾＩＩＩなどは、製造業者から入手することができる。ホスホナゾＩＩＩのメチル、メトキシまたはエトキシ誘導体を上記手順で調製することができるが、これは単に説明のためのものであって、これに限定されるものではない。たとえば、ｐ−メチルホスホナゾＩＩＩを調製するために、上記ステップ１において、ｏ−クロロアニリンの代わりに２−クロロ−５−メチルアニリンを代用することができる。同様に、ｐ−メトキシホスホナゾＩＩＩを調製するために、ｏ−クロロアニリンの代わりに５−クロロ−ｏ−アニシジンを代用することができる。
【００２９】
本発明は、分析試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの測定に有用な試薬組成物に関する。カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの測定は、１つまたは２つの試薬系を用いて行うことができる。試薬系の選択は、専門家の好みによるが、ビリルビン、ヘモグロビンおよび脂血症などの干渉スペクトル発色体を含む生物学的試料に関しては、これらのスペクトル干渉を補正するため、２バイアルシステムを用いるのが好ましい。ホスホナゾＩＩＩは、２〜１１という広いｐＨ範囲でカルシウムと結合する。しかし、酸性ｐＨ値（たとえば２〜６．５）において、カルシウム結合は、マグネシウム結合よりも促進される。たとえば、ｐＨ７で、マグネシウムの感度は、カルシウムの感度の約１．２倍であるのに対し、ｐＨ５．８で、マグネシウムの感度は、カルシウムの感度の約１／１０になる。したがって、カルシウムを測定する場合、マグネシウムの干渉を最小化するには、分析をｐＨ７未満で行うのが好ましく、より好ましくは６未満で行うべきである。マグネシウム干渉を実質的に回避するため、キレート剤を加えてマグネシウムを錯体化し、マグネシウムがホスホナゾＩＩＩと反応しないようにしてもよい。マグネシウムをキレート化するのに適切なキレート剤は、例えば１個のカルボン酸基、リン酸およびジカルボン酸基を含む化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらのうち好ましいキレート剤は、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、フタル酸、酒石酸、フェニルホスホン酸、マロン酸塩、シュウ酸塩であり、マロン酸およびシュウ酸が最も好ましい。マグネシウム用のキレート剤の濃度は、試料中のマグネシウムに対するカルシウムの比率によって変化するが、一般的に、殆どの臨床応用において、キレート剤の濃度は約３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。また、ｐＨが７を超える場合、８−ヒドロキシキノリンなどの追加のキレート剤を使用してもよい。
【００３０】
好適な緩衝液の例として、以下のものを挙げることができる。もちろん、これらに限定されるものではない。
ＢＩＳ−ＴＲＩＳ；ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、
ＭＥＳ；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、
ＢＥＳ；Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、
ＤＩＰＳＯ；３−（Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸、
ＭＯＰＳ；３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸、
ＭＯＰＳＯ；３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、イミダゾール、
ＴＥＳ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、
ＡＤＡ；Ｎ−（２−アセタミド）−イミノ二酢酸、
ＡＣＥＳ；Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、および
ＴＡＰＳＯ；Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸。
【００３１】
所望のｐＨを維持するのに十分な緩衝能力を持つ限り、他の緩衝液も使用可能である。適切な緩衝液の濃度は、約０．０１〜約１ｍｏｌ／Ｌである。また、上述したキレート剤に緩衝能力がある場合、キレート剤を追加しなくてもよい。
【００３２】
図１から明らかなように、カルシウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体は、スペクトルの可視領域内で極大吸光度を示す。また、５８０ｎｍ付近の等吸収点を除く５００〜７００ｎｍで任意の波長を使用することができる。
【００３３】
マグネシウム分析では、ｐＨが約７のときに最高感度が得られる。ｐＨが約６．５未満の場合、ホスホナゾＩＩＩによるマグネシウムの結合が大きく減少し、ｐＨが７よりも大きくなると、試薬ブランクが大きく増加する。しかし、ｐＨが約７のとき、ホスホナゾＩＩＩはカルシウムとも結合するため、とりわけ試料中に多量のカルシウムが存在する場合、カルシウムキレート剤を加える必要がある。ここで、ホスホナゾＩＩＩに加えるカルシウムキレート剤は、マグネシウムと顕著に結合しないものを用いるべきである。
【００３４】
ＥＧＴＡは、ホスホナゾＩＩＩの存在下において、ｐＨ７でマグネシウムと結合しない、好適なカルシウムキレート剤であることがわかった。適切な濃度は、約１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。また、約７あるいはそれより高いｐＨの下で、ホスホナゾＩＩＩは、水溶液中のナトリウムとわずかに結合することがわかった。したがって、わずかな干渉を補正するため、塩化ナトリウムの生理的濃縮液をマグネシウム標準液に加える必要がある。あるいは、クリプトフィックス（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）２２１（４，７，１３，１６，２１−ペンタオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．５］トリコサン）などの適切なナトリウムキレート剤を試薬に加えてもよい。マグネシウム−ホスホナゾＩＩＩキレートを測定するために使用する波長の選択は、カルシウムの場合とほぼ同じであり、５８０ｎｍ付近の等吸収点を除く５００〜７００ｎｍの間の任意の波長を使用することができる。
【００３５】
ナトリウム分析に関し、ナトリウム結合は、ｐＨ５から１１の範囲で生じるが、ｐＨ８．５〜９．５の間で最高感度となる。体液中のナトリウムを測定する場合、１または複数の適切な金属キレート剤を加えてナトリウム以外の金属イオンと結合させ、ナトリウム以外の金属イオンがホスホナゾＩＩＩと反応するのを回避する必要がある。また、ホスホナゾＩＩＩは、ナトリウムとほぼ同じホスホナゾＩＩＩに対する親和性および感度を有するカリウムと結合する。したがって、ホスホナゾＩＩＩがカリウムに結合するのを阻止することのできる適切なキレート剤が必要である。
【００３６】
リチウムもホスホナゾＩＩＩと結合し、その結合特性は、ナトリウムに類似する。リチウム治療を受けていない限り、リチウムは通常体液中には存在しない。また、リチウム治療を受けている場合であっても、血清中における濃度は、正常血液の血清ナトリウム濃度が１３５〜１４５ｍｍｏｌ／Ｌに対し、０．６〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌでしかない（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｅｄ．，Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｗ．Ｔｉｅｔｚ編集者，ｐ．９７１）。したがって、リチウムは、主要な干渉因子にならない。なお、リチウム結合化合物、たとえば、ジベンジル−１４−クラウン−４を加えてもよい。
【００３７】
血清中において通常見られるカルシウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛と結合する好適な重金属キレート剤の例として、ジカルボン酸類、ホスホン酸類、リン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、（１，２−シクロヘキシレンジニトリロ）四酢酸（ＣＥＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）を挙げることができる。該重金属キレート剤は、ナトリウム分析における緩衝液としての役目を果たすことができる。金属キレート剤の有効濃度は、約０．０００５〜０．３ｍｏｌ／Ｌである。
【００３８】
カリウム干渉は、５０％ジメチルスルホキシドの存在下、１８−クラウン−６といったクラウンエーテルの添加によって、約８０％減らすことができる。幸い、血清中のカリウム濃度は、ナトリウム濃度が通常１３５〜１４５ｍｍｏｌ／Ｌであるのに対し、約３．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌでしかない。したがって、カリウムによる干渉は小さく、このカリウム分析値の較正に使用するナトリウム標準液に加えることによって完全に防ぐことができる。
【００３９】
ホスホナゾＩＩＩとナトリウム、カリウムおよびリチウムとの錯体化の感度は、ホスホナゾＩＩＩ緩衝液に対する吸湿性の溶剤または化合物の添加によって劇的に改善されることがわかった。このような感度の改善は、アルカリ性ｐＨ下で試薬の吸光度を低下させる、ホスホナゾＩＩＩのホスホン酸基およびヒドロキシル基からのプロトンの解離を部分的に抑制するためと考えられる。これにより、緩衝液に添加するホスホナゾＩＩＩをより多くすることができ、ホスホナゾＩＩＩに結合するナトリウムをより多くすることができる（詳細については、以下の検討を参照のこと）。
【００４０】
吸湿性の溶剤または化合物を試薬に加えた時に感度の改善が見られる第２の理由は、ナトリウムおよび他のアルカリ金属イオンの周囲にある水和層（ｔｈｅ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）の部分的な除去または完全な除去にあると思われる。アルカリ金属イオン（この場合はナトリウム）を水溶液に加えた時、以下の式（１）により、アルカリ金属イオンは、水分子によって直ちに配位される（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｔ Ｃｏｔｔｏｎ編集，第２編１９６７，第２および５章参照）。ナトリウムの配位数ｎは４であると考えられ、４個の水分子がナトリウムと強固に配位する。ナトリウムに関し、この反応は発熱量の大きな反応であり、９７ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギー放出を伴う。他のリガンドＬ（この場合ホスホナゾＩＩＩ）との錯体化が生じる前、金属（この場合はナトリウム）は先ず、１個以上の強固に結合された水分子を失わなければならない。これらは式（２）および（３）に示されている。
【００４１】
ｎＨ２Ｏ＋Ｍ＋ ＜−−−−＞ Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ＋＋（ｎ−ｊ）Ｈ２Ｏ （１）
Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ＋ ＜−−−−＞ Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ＋＋ｋＨ２Ｏ （２）
（式中、ｋ＝１〜４である）
Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ＋＋Ｌ− ＜−−−−＞ ＭＬ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ （３）
【００４２】
したがって、上述したような水分子の損失は、式（２）をさらに右にシフトさせ、これは次に式（３）をさらに右にシフトさせる。最終的な結果は、より多くの金属イオンがリガンド（金属錯化合物の中心金属に結合している原子団「配位子」であり、この場合はホスホナゾＩＩＩ）によって結合されることになる。ホスホナゾＩＩＩ、ＰＨ６、によって放出されたプロトンは、水分子によって水和され、式（４）で示すようなヒドロニウムイオンを形成するので、前述した機構によるホスホナゾＩＩＩのイオン化が抑制される。この場合、系からの遊離水を除去することにより、反応（４）が左にシフトし、アルカリ性ｐＨ下でのホスホナゾＩＩＩのイオン化が抑えられ、吸光度が低下する。
【００４３】
ＰＨ６＋ｎＨ２Ｏ＜−−−＞ＰＨ６−ｘｘ−＋（ｎ−ｘ）Ｈ２Ｏ＋ｘＨ３Ｏ＋ （４）
（式中、ｘ＝１〜６）
【００４４】
アルカリ金属類との錯体反応において、ホスホナゾＩＩＩの感度を増加する吸湿性剤としていくつかの化合物が有益であることがわかった。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、非常に吸湿性があり、ホスホナゾＩＩＩのナトリウム結合を増強する有用な化合物である。この化合物は、５〜１１の広いｐＨ範囲にわたって効果的であり、５％〜９０％（ジメチルスルホキシド容量／緩衝液容量）の濃度範囲にわたって使用することができる。ホスホナゾＩＩＩを使用したナトリウム測定における感度増加に有用とわかった吸湿性化合物の他の種類として、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類およびポリアルコールを挙げることができる。これらの化合物の例として、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、デキストラン、マンニトールおよびソルビトールが挙げられる。また、１種以上の上記吸湿性化合物を含む混合物を加えて、ナトリウム結合の増強を図ることもできる。たとえば、５ｍｍｏｌ／ＬのＤＰＴＡ緩衝液にｐＨ９のナトリウム試薬を加え、さらに５０％ＤＭＳＯを加えると、感度の増加は、ＤＭＳＯなしの同じ試薬に比べて、４．１倍となった。また、グルコースを加えて濃度を２５％としたとき、感度はさらに倍になり、緩衝液のみの場合における感度と比べて８．３倍となった。
【００４５】
一般的に、吸湿性化合物を効果的に作用させるため、式（２）および（３）において平衡を右にシフトさせ、式（４）において平衡を左にシフトさせるのに十分な量を緩衝液に加える必要がある。この結果、より多くのホスホナゾＩＩＩを試薬に加えることができ、より多くのアルカリ金属（この場合はナトリウム）が結合され、感度が増加する。大きな感度増強を得るためには、通例、緩衝液は、少なくとも約５重量％または容量％の吸湿性化合物を含んでいる必要がある。これにより、ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を測定するために、約５００〜７００ｎｍの間の任意の波長を使用することができる。また、クロロホスホナゾＩＩＩがホスホナゾＩＩＩと同じ条件でアルカリイオンと結合することも確認されている。
【００４６】
本発明の他の好適な態様は、カルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの１つを測定するキットおよびそれを用いた測定方法である。いったん好適なキットについての説明がなされれば、公知の技術や装置を使用する比色定量分析に当該キットを用いることは、ことさら実験をすることなく当業者とって明らかなことである。たとえば、カルシウムを具体的に測定するための診断キットに含まれる化合物には、以下のものがある。
ａ）マロン酸（ｍａｌｏｎａｔｅ）、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）マロン酸（ｍａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸からなる群から選択される１種以上のマグネシウムキレート剤；および
ｃ）約１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約３〜１０の溶液中に存在すること。
【００４７】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約０．０８ｍｏｌ／Ｌのマロン酸緩衝液；および
ｂ）約８３μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｃ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５．５の溶液中に存在すること。
【００４８】
マグネシウムを測定するために有用な本発明における他の好適な診断キットには、以下のものがある。
ａ）ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯの群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＥＧＴＡなどからなる群から選択されるカルシウムキレート剤；および
ｃ）１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約６．０〜１０の溶液中に存在すること。
【００４９】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液；
ｂ）約６ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ；および
ｃ）約４０μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約７．０の溶液中に存在すること。
【００５０】
ナトリウムを測定するために有用な本発明における他の好適な診断キットには、以下のものがある。
ａ）トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の金属キレート化合物；
ｃ）１５−クラウン−５および１８−クラウン−６からなる群から選択される１種以上のカリウム結合化合物；
ｄ）３０〜５００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩ；および
ｅ）ジメチルスルホキシド、グルコース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、キシロースおよびキシリトールからなる群から選択される１種以上の吸湿性化合物を含み、
ｆ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５〜１１の溶液中に存在すること。
【００５１】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ；
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６；
ｃ）約２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩ；および
ｄ）約５０％ジメチルスルホキシドを含んでおり、
ｅ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在すること。
【００５２】
カルシウム分析
試料中のカルシウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）カルシウムを含有する試料を上記試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度をステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のカルシウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００５３】
試料中のカルシウムの量を測定する他の好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を入れたキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）たとえばＥＧＴＡから選択されるカルシウムキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５４】
試料中のカルシウムの量を測定する他の好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を入れたキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ホスホナゾＩＩＩを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５５】
試料中のカルシウムの量を測定するさらに好ましい測定方法は、
ａ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ、および
ｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート化合物を含む第２試薬を、ステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５６】
試料中のカルシウムの量を測定するさらに好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５７】
マグネシウム分析
試料中のマグネシウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）マグネシウムを含有する試料を試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定する；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度を、ステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のマグネシウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００５８】
試料中のマグネシウムの量を測定する他の好ましい方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉｉ）ＥＧＴＡを含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＣＥＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ ＧＥＤＴＡおよびＮＴＡからなる群から選択されるキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５９】
試料中のマグネシウムの量を測定する他の好ましい方法は、
ａ）ｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉ）ＥＧＴＡを含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ホスホナゾＩＩＩを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６０】
試料中のマグネシウムの量を測定するさらに別の好ましい測定方法は、
ａ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）ＥＧＴＡを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６１】
試料中のマグネシウムの量を測定するさらなる好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ＥＧＴＡを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６２】
ナトリウム分析
試料中のナトリウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、ホスホナゾＩＩＩまたは式Ｉの化合物を含有する上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）ナトリウムを含有する試料を上記試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度をステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、試料中のナトリウム量の測定に、２つのバイアルに入れたナトリウム試薬を用いる。ナトリウムを測定する方法は、先に記載したカルシウム試薬およびマグネシウム試薬と類似の方法で行う。この場合、ナトリウム緩衝液（複数を含む）は、以下の１種以上のものと置き換えられる。
ジカルボン酸類、ホスホン酸類、リン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、（１，２−シクロヘキシレンジニトリロ）四酢酸（ＣＥＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）。重金属キレート剤は、上記キレート剤のリストから選択することもでき、緩衝液（複数を含む）としての役割も果たす。重金属キレート剤は、第１または第２試薬のいずれかに加えられていればよい。また、必要であれば、１８−クラウン−６などのカリウムキレート剤を第１または第２試薬に加えてもよい。ＤＭＳＯなどの吸湿性化合物（複数を含む）を、どちらか一方の試薬に加えてもよく、あるいは両方の試薬に対して同じ量を加えてもよい。
【００６４】
２つ試薬を用いたナトリウム分析において、カルシウムおよびマグネシウムの測定と同様に、第１の吸光度の読み取りは、試料および第１試薬を混合した後で行う。次いで第２試薬を加えた後、第２の吸光度の読み取りを行う。第１および第２の吸光度読み取り値の間における絶対差から、適当なナトリウム標準液を使用して、試料中のナトリウムに基づく吸光度を測定することができる。
【００６５】
上述した本発明の各分析方法において、吸光度は、約５００〜７００ｎｍの波長の間で読み取る。
【００６６】
式Ｉの化合物がクロロホスホナゾＩＩＩである本発明の一態様において、診断キットは、約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ、約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６、約２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩ、約５０％のジメチルスルホキシドも含み、該クロロホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在する。
【実施例１】
【００６７】
１試薬系のカルシウム試薬
２００ｍＬ（リットル）の蒸留水に１．９５ｇのＭＥＳと０．２５２ｇのシュウ酸２水和物を溶解する。ｐＨ（２５℃）は、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールの添加によって５．８０に調整した。この溶液（１０ｍＬ）に、０．６ｍｇのホスホナゾＩＩＩを加える。カルシウム分析は、３７℃に設定されたＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（自動分析装置；登録商標）により行った。１８０μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をピペットでＭＩＲＡのキュベットに入れる。５０秒後、６００ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランクの吸光度を測定した。２μＬの水溶性試料を１８μＬの蒸留水に加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取る。そして、最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値（試薬ブランクの吸光度）を減ずることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度を求めた。この分析では、２．５ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム標準液を使用して較正を行い、カルシウム標準液の回収は以下の通りであった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
上記試薬に関し、約４．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または、試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、カルシウムを測定するため、６００ｎｍ以外の波長を使用することができる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じて、どの波長および直線性の範囲が要求されるかは専門家が選択すべきことである。
【００７０】
上記試薬を用いて上記容量の試料を分析する場合、シュウ酸を添加することにより、マグネシウム濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、マグネシウム干渉をほぼ排除することができる。カルシウム分析試料中におけるマグネシウム濃度について、以下に示す。
【００７１】
【表２】
【実施例２】
【００７２】
２試薬系のカルシウム分析
試料ブランク吸光度を補正するのが望ましい場合、２試薬系のカルシウム分析を行ってもよい。２試薬系のカルシウム分析では、数種の試薬構成が可能である。例えば、ホスホナゾＩＩＩは、濃縮調製され（必要に応じてオキサレートまたは他のキレート剤を加えてもよい）、「出発試薬」として加えられる。この出発試薬を、試料を含有する「一次試薬」に加え、試料中のカルシウムに基づく吸光度を測定するために使用する。一次試薬は、単なる水でもよいが、より好適には、ホスホナゾＩＩＩとのカルシウム反応に適したｐＨの緩衝液がよい。また、一次試薬には、他の金属イオンがホスホナゾＩＩＩと反応するのを防ぐためにキレート剤を含有させてもよい。
【００７３】
さらに別の２試薬系分析では、ホスホナゾＩＩＩおよびオキサレートを一次試薬中に含有させ、出発試薬には他のキレート剤（複数を含む）を含有させてもよい。これにより、出発試薬中のキレート剤（複数を含む）がカルシウム−ホスホナゾＩＩＩキレートを分裂させるので、試薬および試料に基づく吸光度のみが残存する。出発試薬に含めることのできる適切なキレート剤の例として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＥＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＩＤＡ、ＨＩＤＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨおよびクエン酸が挙げられる。出発試薬における適切なキレート剤の濃度は約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。出発試薬を加える前の吸光度から出発試薬を加えた後の吸光度を減じることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度を得ることができる。
【００７４】
上述したように、ホスホナゾＩＩＩおよびオキサレートを含む０．０５ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液中で一次試薬を調製した。９３．１ｍｇのＥＤＴＡ（２ナトリウム２水和物塩）を９ｍＬ（あるいはこれよりも少量）の蒸留水に加え、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨを５．８に調整後、蒸留水で希釈して１０ｍＬの出発試薬を調製した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を用いて、カルシウム分析を３７℃で次のように実施した。１８０μＬの一次試薬および２μＬの試料、その後で８μＬの蒸留水をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れた。約１０秒後、６００ｎｍにおける初期吸光度を読み取り、２５秒後、２０μＬの出発試薬および５μＬの蒸留水を加え、５０秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。初期吸光度から最終吸光度の読み取り値を減ずることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度が得られた。２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００７５】
【表３】
【００７６】
この分析は、基本的にマグネシウムからの干渉がなく、カルシウム濃度が４．０ｍｍｏｌ／Ｌまでは直線的な傾向を示した。
【実施例３】
【００７７】
１成分カルシウム分析
この実施例に係るカルシウムの測定において、緩衝液は、ｐＨを維持するだけでなく、マグネシウムおよび他の重金属の干渉を排除するキレート剤としての役割も果たす。４００ｍＬの蒸留水に４．１６ｇのマロン酸を加えた。トリエチルアミンでｐＨを５．５に調整し、２５０ｍｇのソルビン酸を加えて溶解するまで撹拌した。この溶液に、１．０ｍＬのＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ４８６７８）と、１．５ｍＬのＣＯＬＡＤＥＴ ＡＣＳ１２４０（Ｃｏｌｏｎｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，２２５Ｃｏｌｏｎｉａｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＴＮ３７３８０）と、３５ｍｇのホスホナゾＩＩＩとを加えた。蒸留水で５００ｍｌに希釈した後、２５℃でトリエチルアミンを用いてｐＨを５．５に調整した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し。３７℃で以下のようにカルシウム分析を実施した。２４０μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れた。５０秒後、６００ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランク吸光度を測定した。２μＬの水溶性カルシウムまたはマグネシウム試料と１０μＬの蒸留水とを加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値を減じて、試料に基づく正味の吸光度を求めた。この分析では、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ（１０ｍｇ／ｄＬ）のカルシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００７８】
【表４】
【実施例４】
【００７９】
１成分マグネシウム分析
２００ｍＬの蒸留水に、２．４３ｇのＤＩＰＳＯ［３−［Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、０．４４７ｇのＥＧＴＡおよび８．２ｍｇのホスホナゾＩＩＩを溶解する。２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨを７．０（２５℃）に調整した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し、３７℃で次のようにマグネシウム分析を実施した。１８０μＬの試薬をＭＩＲＡキュベットに加え、５０秒後、６００ｎｍにおいて初期吸光度を読み取り、試薬ブランク吸光度を測定した。２μＬの試料および１８μＬの蒸留水を加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値を減じた後、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を計算した。２．０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００８０】
【表５】
【００８１】
このように、上記試薬に関し、マグネシウムが約３．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、マグネシウムを測定するために、６００ｎｍ以外の波長を使用することできる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じて、どの波長および直線性の範囲が要求されるかに関しては専門家の選択に任せられる。
【００８２】
上記試薬を用いて上記容量の試料を分析する場合、ＥＧＴＡを添加することにより、カルシウム濃度が４ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、カルシウム干渉をほぼ排除することができる。このことは、以下の表に示すように、マグネシウムが０．５０ｍｍｏｌ／Ｌの試料におけるカルシウム濃度の関係からも明らかである。
【００８３】
【表６】
【００８４】
カルシウム分析と同様に、マグネシウム分析も２試薬系で行うことができる。一方の試薬の構成は、たとえば、試料を水や好ましくはＥＧＴＡなどホスホナゾＩＩＩと反応するカルシウムや他の金属イオンと結合するカルシウムキレート剤を含む緩衝液に加える。吸光度を読み取り、試料の吸光度寄与を得る。ホスホナゾＩＩＩを含む出発試薬を加え、第２吸光度を読み取る。第１吸光度読み取り値を第２吸光度から減じた後、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を得る。他方の試薬は、一次試薬がＥＧＴＡまたは他の適切なカルシウムキレート剤と、ホスホナゾＩＩＩとを含む緩衝液で構成され、これに試料を加える。ＥＤＴＡ、ＣＥＴＡまたはＤＴＰＡなどの緩衝化金属イオンキレート剤（複数を含む）で出発試薬を構成してもよい。第２試薬中のキレート剤（複数を含む）は、マグネシウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を分裂させ、ホスホナゾＩＩＩおよび試料ブランクに基づく吸光度を有する溶液となる。第２吸光度読み取り値を第１吸光度読み取り値から減じることにより、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度が得られる。
【実施例５】
【００８５】
２バイアルマグネシウム試薬
２バイアルマグネシウム試薬を以下のように調製した。上述したように、１バイアルマグネシウム試薬として一次試薬を調製した。３７．２ｍｇのジナトリウムＥＤＴＡ２水和物を９ｍＬの蒸留水に加え、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを用いてｐＨを２５℃で７．０に調整し、蒸留水で１０ｍＬに希釈して出発試薬を調製した。この分析をＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し、３７℃で次のように実施した。１８０μＬの一次試薬をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れ、２５秒後、６００ｎｍにおいて初期吸光度を読み取り、２０μＬの出発試薬、次いで１０μＬの蒸留水を、キュベットに加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおいて最終吸光度を読み取り、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を、最終吸光度読み取り値を初期吸光度読み取り値から減じることによって計算した。分析は、２．０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００８６】
【表７】
【００８７】
上記試薬に関し、約３．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、マグネシウムを測定するために、６００ｎｍ以外の波長を使用することできる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じてどの波長および直線性の範囲が要求されるかに関しては専門家の選択に任せられる。
【００８８】
ヒト血清試料を、硫酸マグネシウムを含む水性較正物質でマグネシウム分析した場合、他のマグネシウム分析方法に比較して、わずかに正のバイアスが認められた。そして、この正のバイアスが、血清試料中のナトリウムによるわずかな干渉によるものであることがわかった。したがって、血清中のマグネシウムを測定する場合、わずかなナトリウム干渉を排除するために、血清較正物質を使用することが推奨される。あるいは、ナトリウム干渉を防止するため、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（登録商標）などのナトリウムキレート剤をマグネシウム試薬に加えてもよい。
【実施例６】
【００８９】
１バイアルナトリウム試薬
０．９３８ｇのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）に４５ｍＬの蒸留水を加えた。トリエチルアミンを加えてｐＨを９．５に調整し、蒸留水で５０．０ｍＬに希釈した。１．５ｍＬのこの溶液に、１．５ｍＬのジメチルスルホキシドとホスホナゾＩＩＩとを加え、０．２ｍｍｏｌ／Ｌの溶液とした。この溶液を、ＣＯＢＡＳ ＢＩＯ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）を用い、３７℃で次のようにナトリウム分析を実施した。２００μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をキュベットに加え、６５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランクの吸光度を測定した。約２分後、２μＬの水性ナトリウム試料および４μＬの蒸留水を加えた。９０秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６５０ｎｍにおける第２吸光度を読み取り、第１吸光度読み取り値（試薬ブランク）を、第２吸光度読み取りから減算することによって、試料中のナトリウムに基づく吸光度を得た。この分析では、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ水性ナトリウム標準液を使用して較正した。
【００９０】
【表８】
【００９１】
ホスホナゾＩＩＩを使用するナトリウム試験は、ナトリウム濃度が１２０〜１６０ｍｍｏｌ／Ｌの間で直線的応答を示す。この範囲は、血清中において予想されるナトリウムの濃度をカバーしている。
【００９２】
ナトリウム分析が２またはそれ以上の試薬系で行うことができるのは明らかである。この場合、ホスホナゾＩＩＩ、吸湿性化合物（複数を含む）およびキレート剤、および緩衝液（複数を含む）をどの溶液に加えるかについては、数多くの選択肢がある。特定の用途に関してどの構成が最適であるかの判断は、専門家に任せられる。ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を測定するために、６５０ｎｍ以外の波長も使用することができる（図２参照）。
【実施例７】
【００９３】
０．６ｍｇのホスホアゾＩＩＩの代わりにｐ−メトキシホスホナゾＩＩＩ、０．６ｍｇを使用すること以外は、実施例１の手順と同じである。
【実施例８】
【００９４】
試薬を２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩにしたこと以外は、実施例６の手順と同じである。
【００９５】
細菌の成長を抑制または阻止するため、防腐剤をカルシウム、マグネシウムおよびナトリウム試薬に加えてもよい。また、界面活性剤、洗浄剤または湿潤剤を添加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）中のホスホナゾＩＩＩ、Ｃａ−ホスホナゾＩＩＩ錯体およびＭｇ−ホスホナゾＩＩＩ錯体の吸光度スペクトルを示す。ホスホナゾＩＩＩ、カルシウムおよびマグネシウムの濃度は、それぞれ、６２、２０および２０μｍｏｌ／Ｌである。
【図２】図２は、４８％ジメチルスルホキシドおよび１４．３％Ｄ−グルコースを含有する９．５ｍｍｏｌ／Ｌのジエチレントリアミン五酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ８．５）中のホスホナゾＩＩＩおよびＮａ−ホスホナゾＩＩＩ錯体の吸光度スペクトルを示す。ホスホナゾＩＩＩ濃度は２００μｍｏｌ／Ｌであり、ナトリウム濃度は９３０μｍｏｌ／Ｌである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホナゾＩＩＩを使用して、分析試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを定量する方法、および該方法に使用される新規な試薬組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
カルシウムは、体内で５番目に多い元素であり、結晶性ヒドロキシアパタイトとして骨中に９９％存在している。また、細胞外液は、体内総カルシウムの約０．１％を含有し、細胞外液中のカルシウムのうち、約３０％は血漿中に存在している。
【０００３】
カルシウムの生理的機能は多種多様である。細胞内カルシウムは、数種の酵素、特にアデニル酸シクラーゼおよびカルモジュリン（受容蛋白）の活性を調整するとともに、受精、有系分裂、細胞運動および補助作用を含む多数の細胞機能の調整にも関与する。また、横紋筋において、カルシウムは、カルシウム結合タンパク質であるトロポニンと組合わされて筋原線維の収縮を活性化するとともに、膜透過性を調整する働きをし、神経伝達物質を放出させ、筋神経の興奮を弱める。カルシウム代謝およびカルシウム機能に関する掘り下げた考察については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編、編集者Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｗ．Ｔｉｅｔｚ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ社（１９８７）を参照のこと。
【０００４】
臨床学的に、血清カルシウム値は、臨床診断を行う上で非常に重要な値である。血清カルシウム値の参照値の範囲は非常に狭く（２．２０〜２．５５ｍｍｏｌ／Ｌ）、この範囲より上または下の僅かな偏差によって、数種の生理的障害を診断することになる。高カルシウム血症（血清カルシウム値の上昇）と関連する最も一般的な２つの疾患として、副甲状腺機能亢進症および悪性腫瘍が挙げられ、特に悪性腫瘍は、骨格に転移して骨融解を起こすおそれがある。血清カルシウム値の低下（すなわち、低カルシウム血症）は、通例、副甲状腺機能低下症を伴う。新生児のうち約１％は重大な低カルシウム血症（血清カルシウム値が１．７５ｍｍｏｌ／Ｌよりも小さい場合）を患い、早急な医学的処置が必要な、興奮、れん縮および痙攣を発症する。
【０００５】
マグネシウムは、カルシウムと同様、体内で見られる主な元素の１つである。７０ｋｇの標準的なヒトの成人は、約２０〜２８ｇのマグネシウムを有しており、その約５５％が骨内に、２７％が筋肉内に存在する。また、血清マグネシウム値の参照値の範囲は、０．６５〜１．０５ｍｍｏｌ／Ｌと、かなり狭い。血清マグネシウム値の低下、すなわち低マグネシウム血症（＜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）は、上述した低カルシウム血症と殆ど同じ過剰興奮、テタニーおよび痙攣、つまり神経筋機能の障害を発症させる。逆に、血清マグネシウム値が上昇すると、体には鎮静効果がはたらく。
【０００６】
低カルシウム血症と低マグネシウム血症とは、臨床症状が殆ど同じであることから、どちらの元素が上述した臨床症状の原因となっているのかを判断しなければならない。このため、血清カルシウム値および血清マグネシウム値の両方を測定し、どちらの元素の値が低いのか、または両方の値が低いのかを知る必要がある。
【０００７】
カルシウム値およびマグネシウム値を測定するための方法として、原子吸光法を挙げることができる。原子吸光法は、干渉が殆どなく、小容量の試料しか必要とせず、また、精度が良いとともに再現性が高い。しかし、日常的に用いる測定方法として、原子吸光法は、やや使い難く、また、高価な装置とかなりの熟練者とを必要とする方法である。
【０００８】
カルシウムを測定するための臨床検査室において、現在、日常的には、オルト−クレゾールフタレインコンプレクソン（ＣＰＣ）あるいはアルセナゾＩＩＩを使用する方法が用いられている。両方法とも広く用いられており、互いに補完しあう関係にある。ＣＰＣ法の感度はｐＨに非常に左右されることから、最高感度を得るため、反応はｐＨ１１．７付近で行われる。しかし、このアルカリ性ｐＨの下で、試薬は、大気中の二酸化炭素を容易に吸収する。そして、吸収された二酸化炭素は、水と結合して炭酸となり、試薬のｐＨ値を徐々に減少させる（つまり、酸性化する）ので、最終的にこの試薬によるカルシウム測定ができなくなる。さらに云えば、ＣＰＣは著しく選択性に乏しいことから、マグネシウムおよび他の重金属とも結合する。血清中で一般的に発生するマグネシウムの干渉を排除するため、８−ヒドロキシキノリンを加えてマグネシウムをキレート化するが、この化合物は、カルシウムもキレート化してしまうので、カルシウム測定の感度が２５〜４０％低減する。一方、アルセナゾＩＩＩを用いる場合には、ＣＰＣ法のような、ｐＨを高くしなければならいという問題、およびマグネシウム干渉の問題はない。アルセナゾＩＩＩは、弱酸性下、たとえばｐＨ５〜６でカルシウムと結合するので、カルシウム測定をｐＨ７未満で行うことにより、マグネシウムの結合を無視することができる。アルセナゾＩＩＩは、ＣＰＣ法における多くの欠点を解消できるが、アルセナゾＩＩＩには、感度がやや低く、また、環境への悪影響という問題がある。すなわち、アルセナゾＩＩＩは、１モル当たりに２モルのヒ素を含んでおり、アルセナゾＩＩＩ試薬の廃棄がヒ素による上水の汚染につながることが、多くの国で重大な問題になりつつある。
【０００９】
Ｔａｎａｋａ（米国特許第４，９６６，７８４号）およびＫａｕｆｍａｎ（米国特許第５，５８９，３４８号）は、クロロホスホナゾＩＩＩを使用して、カルシウムを測定する方法を開発した。この測定方法で用いられる発色団はヒ素を含まないものの、比較的高い試薬ブランクの吸光度を有する傾向があり、この試薬ブランクの吸光度により、多くの分析器においてカルシウム測定値に対する直線性が限定されることになる。一方、Ｃｈａｐｏｔｅａｕは、四酢酸のフェノール誘導体を使用するカルシウム分析方法を開発している（米国特許第５，２６２，３３０号）。しかし、この分析方法では、カルシウムを結合させるため、アルカリ性ｐＨの下で行う必要があった。
【００１０】
カルシウム分析における問題は、マグネシウム分析における問題でもある。カルマガイト方法（Ｃａｌｍａｇｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄｓ；米国特許第４，３８３，０４３号）は、多くの臨床検査室において日常的に使用されており、また、キシリジルブルー、キシルアゾバイオレットＩおよびＩＩ（米国特許第４，５０３、１５６号）、およびＥｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｂｌａｃｋ Ｔ（米国特許第４，３８３，０４３号）を使用する他の方法が開発されている。カルシウム分析と同様に、先のマグネシウム測定方法の全ては、高ｐＨ（＞＞９）を必要とすることから、周囲の二酸化炭素の吸収により蓋をしていない試薬容器中の試薬のｐＨ安定性が損なわれる。マグネシウムを測定する最近の方法として、クロロホスホナゾＩＩＩを使用するものが公開されている（米国特許第５，５８９，３４８号および同第５，３９７，７１０号）。この発色団は、マグネシウムを結合するための高いｐＨを必要としないが、比較的高い試薬ブランクの吸光度を有する傾向があり、この試薬ブランクの吸光度により、多くの臨床化学分析器においてマグネシウム測定値に対する直線性が限定されることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、分析試料中のカルシウムおよびマグネシウムを定量的に測定する方法に関してまだ解決されていない課題がある。それは、ａ）カルシウムおよびマグネシウムを中性から弱酸性ｐＨの付近で結合させること、ｂ）発色団が、たとえばヒ素などの毒性元素を含んでいないこと、ｃ）発色体の試薬ブランクの吸光度が比較的低いこと、ｄ）試薬が皮膚などに触れても安全な取扱い特性を備えていること（たとえばｐＨが中性付近であること）である。
【００１２】
ナトリウムは、細胞外液、ならびに血漿および血清において群を抜いて広く認められるカチオンである。体内におけるナトリウムの主な機能は、細胞外コンパートメント（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）における水バランスと浸透圧とを維持することである。
【００１３】
血清や血漿といった体液中のナトリウムは、炎光発光分光法あるいはナトリウムイオン電極法を用いて測定するのが通例である。両方法とも、一般的にきわめて良好に機能するものの、それぞれに欠点が存在する。すなわち、ＯＳＨＡ（米国労働安全衛生局）は、炎光光度計の燃料としてプロパンを使用することを定めているが、プロパンのガス漏れはタンク、バルブ、および管継ぎ手から簡単に起こることから、プロパンが作業エリアに流出して爆発災害を引き起こすおそれがある。また、プロパンタンクの残量が極めて少なくなった場合、フレームの火炎特性が変化するおそれがあることから、より頻繁にキャリブレーションを行う必要がある。さもないと、フレームの火炎特性が分析に適さないものとなるからである。
【００１４】
一方、ナトリウムイオン電極法には、炎光光度計を用いる場合のような安全性に関する問題がない。ところが、電極は、一般的にうまく機能するものの、堆積したタンパク質を取り除くためのクリーニングを頻繁に必要とするとともに、経費のかかる該電極の交換が必要となる。また、ナトリウムイオン電極法を行う装置は、多くの小さな臨床検査室が導入するには高価すぎる。
【００１５】
ナトリウムを比色的に測定するためのいくつかの試みがなされている。Ｃｈａｐｏｔｅａｕ（米国特許第４，８０８，５３９号）およびＣｒａｍ（米国特許第５，０１１，９２４号）は、それぞれ、「発色性クリプタンド」および「発色性クリプタヘミスフェランド」を用いた血清中のナトリウムを測定する方法を開発した。また、酵素であるβ−ガラクトシダーゼを使用して、酵素活性を低濃度のナトリウムの存在下で活性化する動的酵素手段がＢｅｒｒｙによって公開されている（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４，２２９５−２２９８（１９８８））。
【００１６】
１９６６年、Ｂｕｄｅｓｉｎｓｋｙ（Ｔｓｃｈｅｃｈｏｓｌｏｗ．Ｐａｔ．Ｎｒ．１２２３７９）は、ホスホナゾＩＩＩを含む一連のクロモトロピン酸誘導体の合成および数種の重金属および遷移金属イオンのキレートの現存するスペクトルデータを記載した（Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３２，１９６７およびＴａｌａｎｔａ１５（１０），１０６３−４，１９６８）。該データの要約が後に、Ｃｈｅｌａｔｅｓ ｉｎ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，第２巻、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（ｐ１−９１）において公開された。ほぼ同じ時、ロシアの科学者のグループが、ホスホナゾＩＩＩおよび数種の２価の遷移金属イオンを持つ他の誘導体のスペクトルデータを提示し（Ｌｕｋｅｎら、Ｄｏｋｌ，．Ａｌａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲ１７３（２），３６１−３６３，１９６７）、他の研究者らは、ホスホナゾＩＩＩと数種の希土類金属との錯体形成およびスペクトル特性を例証した（Ｚｈ．Ａｎａｌ．Ｋｈｉｍ．，２６（４），Ｊ，７７２−６，１９７１；Ｚｈ．Ａｎａｌ．Ｋｈｉｍ．３２（４），６７４−６７８，１９７７；およびＴｒ．Ｖｓｅｓ．Ｎａｕｃｈ．−Ｉｓｓｌｅｄ．Ｉｎｓｔ．Ｋｈｉｍ．Ｒｅａｋｔｉｖｏｖ Ｏｓｏｂｏ Ｃｈｉｓｔ．Ｋｈｉｍ．Ｖｅｓｈｃｈｅｓｅｓｔｖ，１９６７，Ｎｏ．３０，４２−９）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１態様によれば、たとえば、カルシウム、マグネシウムあるいはナトリウムの測定に用いられる診断試薬キットを提供することができる。該キットは、式Ｉに示す化合物を含む。
［式Ｉ］
（但し、式Ｉ中のＲ１〜Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６エーテルアルキル、Ｃ３−６分岐アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびハロゲンから個々に選択される。）
本発明の好ましい態様の多くにおいて、Ｒ１〜Ｒ８は全てＨである。つまり、診断試薬キット内に含まれる化合物は、以下に示す構造のホスホナゾＩＩＩである。
【００１８】
本発明の好ましい他の態様では、分析試料中のカルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの濃度を定量的に測定する方法を提供することができる。該方法は、ａ）試料をホスホナゾＩＩＩなどの式Ｉの化合物と接触（ｃｏｎｔａｃｔ）させ；ｂ）上記接触ステップａ）で得られた、吸光度、反射率あるいは蛍光性の変化を測定するものである。
【００１９】
本発明の他の態様では、該方法は、ａ）式Ｉの化合物、すなわちホスホナゾＩＩＩを含む試薬の吸光度、反射率あるいは蛍光性を測定し（試薬ブランク）；ｂ）試料を診断試薬に加え；ｃ）試料を診断試薬に加えた後の吸光度、反射率あるいは蛍光性を測定し；ｄ）ステップａ）で得た吸光度、反射率あるいは蛍光性の測定値を、ステップｃ）の結果として得た測定値から減じて、試料中のカルシウム、マグネシウムあるいはナトリウムに基づく正味の吸光度、反射率あるいは蛍光性を得るものである。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、ナトリウムの測定に有用なキットおよび分析試料中のナトリウムの濃度を定量的に測定する方法を提供できる。これらの態様のそれぞれにおいて、キットおよび方法は、Ｒ３およびＲ７がＣｌである式Ｉ中の化合物を含んでいる。
【００２１】
本発明の利点の１つは、式Ｉの好ましい化合物であるホスホナゾＩＩＩが、ｐＨの広い範囲（約２〜１１）でカルシウムと結合することであり、ｐＨが約７のときに最高の感度となる。したがって、ｐＨが７あるいは弱酸性のｐＨの緩衝液中で調製された試薬溶液は、試薬が大気中の二酸化炭素を吸収することによる影響を受けないので、劣化した試薬を廃棄する必要がなく、殆ど無駄がない。また、ホスホナゾＩＩＩは、概ね６〜１１のｐＨ範囲においてマグネシウムとも結合する（ｐＨが約７のときに最高感度となる）。したがって、カルシウム用と同様に、マグネシウム用の試薬溶液のｐＨも、大気中の二酸化炭素を吸収することによる影響を受ける範囲にない。また、ホスホナゾＩＩＩは、概ね６〜１１のｐＨ範囲においてナトリウムと結合する（ｐＨが約９のときに最高感度となる）。
【００２２】
本発明の他の利点は、ホスホナゾＩＩＩ（上記式Ｉを参照）が、２モルのヒ素を含有するアルセナゾＩＩＩの場合のように、毒性元素を含まないことである。したがって、使用済み試薬の廃棄に際してアルセナゾＩＩＩの場合のように大きな毒性の問題がない。
【００２３】
ホスホナゾＩＩＩを使用する試薬キットおよびこれを用いた分析方法のさらに他の利点として、マグネシウムの分析における試薬ブランクの吸光度は、マグネシウム測定用のクロロホスホナゾＩＩＩのそれよりも幾分か低いことがあげられる。この結果、試薬ブランクの吸光度が高すぎるため、臨床化学分析器におけるマグネシウム試験値の直線性が損なわれるといったような心配はない。
【００２４】
カルシウムおよびマグネシウム用の試薬キットは、該試薬が皮膚などに触れても安全なように、ｐＨ７付近で調製することができる。
【００２５】
ナトリウム（特に血清中のナトリウム）の分析は、試料を混濁化する脂質の存在、および約４４０〜５７５ｎｍのスペクトルの可視領域における吸収作用を有するヘモグロビンおよびビリルビンの存在によって複雑になるおそれがある。一方、ホスホナゾＩＩＩを用いた場合、ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体の最大感度波長は約６５０ｎｍであり、この波長では、ヘモグロビンおよびビリルビンによるスペクトル干渉は存在せず、また、混濁による干渉は極めて小さい。これは、先の［Ｃｈａｐｏｔｅａｕ（米国特許第４，８０８，５３９号）およびＣｒａｍ（米国特許第５，０１１，９２４号）］ならびにＢｅｒｒｙ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４，２２９５−２２９８（１９８８））の手法における最大感度波長が、５００ｎｍあるいは４０５ｎｍといったより短い波長であるのに比べて非常に進歩した点である。
【発明の効果】
【００２６】
このように、分析試料、特に生物学的試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを定量的に測定するための分析用試薬にホスホナゾＩＩＩを用いることにより、カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムを測定するために用いられている現在の方法が有する課題の多くを解決することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
式Ｉにおける好適な化合物のひとつであるホスホナゾＩＩＩは、Ｃｈｅｌａｔｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，第２巻，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ１−９１およびＪ．Ｏ．Ｃ．２４５０（１９６４）（これらの開示は参照によって本明細書に組み入れられる）などの文献によれば、種々の手順（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｓｓａｙｓ社，Ｍａｎｖｉｌｌｅ，ＮＪ）によって合成されている。該手順は、要約すると以下の通りである。
ステップ１． ジアゾ化ｏ−クロロアニリンを三塩化リンと反応させてｏ−クロロフェニルホスフィンを形成し、
ステップ２． 該ホスフィンを加水分解した後、ｏ−クロロフェニルホスホン酸をアンモニアと反応させてｏ−アミノフェニルホスホン酸を形成し、
ステップ３． ２モルのｏ−アミノフェニルホスホン酸をジアゾ化し、１モルのクロモトロープ酸と反応させてホスホナゾＩＩＩを形成する。
【００２８】
また、式Ｉにおける他の化合物は、当業者が公知技術を用いて合成することができ、また、クロロホスホナゾＩＩＩなどは、製造業者から入手することができる。ホスホナゾＩＩＩのメチル、メトキシまたはエトキシ誘導体を上記手順で調製することができるが、これは単に説明のためのものであって、これに限定されるものではない。たとえば、ｐ−メチルホスホナゾＩＩＩを調製するために、上記ステップ１において、ｏ−クロロアニリンの代わりに２−クロロ−５−メチルアニリンを代用することができる。同様に、ｐ−メトキシホスホナゾＩＩＩを調製するために、ｏ−クロロアニリンの代わりに５−クロロ−ｏ−アニシジンを代用することができる。
【００２９】
本発明は、分析試料中のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの測定に有用な試薬組成物に関する。カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの測定は、１つまたは２つの試薬系を用いて行うことができる。試薬系の選択は、専門家の好みによるが、ビリルビン、ヘモグロビンおよび脂血症などの干渉スペクトル発色体を含む生物学的試料に関しては、これらのスペクトル干渉を補正するため、２バイアルシステムを用いるのが好ましい。ホスホナゾＩＩＩは、２〜１１という広いｐＨ範囲でカルシウムと結合する。しかし、酸性ｐＨ値（たとえば２〜６．５）において、カルシウム結合は、マグネシウム結合よりも促進される。たとえば、ｐＨ７で、マグネシウムの感度は、カルシウムの感度の約１．２倍であるのに対し、ｐＨ５．８で、マグネシウムの感度は、カルシウムの感度の約１／１０になる。したがって、カルシウムを測定する場合、マグネシウムの干渉を最小化するには、分析をｐＨ７未満で行うのが好ましく、より好ましくは６未満で行うべきである。マグネシウム干渉を実質的に回避するため、キレート剤を加えてマグネシウムを錯体化し、マグネシウムがホスホナゾＩＩＩと反応しないようにしてもよい。マグネシウムをキレート化するのに適切なキレート剤は、例えば１個のカルボン酸基、リン酸およびジカルボン酸基を含む化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらのうち好ましいキレート剤は、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、フタル酸、酒石酸、フェニルホスホン酸、マロン酸塩、シュウ酸塩であり、マロン酸およびシュウ酸が最も好ましい。マグネシウム用のキレート剤の濃度は、試料中のマグネシウムに対するカルシウムの比率によって変化するが、一般的に、殆どの臨床応用において、キレート剤の濃度は約３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。また、ｐＨが７を超える場合、８−ヒドロキシキノリンなどの追加のキレート剤を使用してもよい。
【００３０】
好適な緩衝液の例として、以下のものを挙げることができる。もちろん、これらに限定されるものではない。
ＢＩＳ−ＴＲＩＳ；ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、
ＭＥＳ；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、
ＢＥＳ；Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、
ＤＩＰＳＯ；３−（Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸、
ＭＯＰＳ；３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸、
ＭＯＰＳＯ；３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、イミダゾール、
ＴＥＳ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、
ＡＤＡ；Ｎ−（２−アセタミド）−イミノ二酢酸、
ＡＣＥＳ；Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、および
ＴＡＰＳＯ；Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸。
【００３１】
所望のｐＨを維持するのに十分な緩衝能力を持つ限り、他の緩衝液も使用可能である。適切な緩衝液の濃度は、約０．０１〜約１ｍｏｌ／Ｌである。また、上述したキレート剤に緩衝能力がある場合、キレート剤を追加しなくてもよい。
【００３２】
図１から明らかなように、カルシウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体は、スペクトルの可視領域内で極大吸光度を示す。また、５８０ｎｍ付近の等吸収点を除く５００〜７００ｎｍで任意の波長を使用することができる。
【００３３】
マグネシウム分析では、ｐＨが約７のときに最高感度が得られる。ｐＨが約６．５未満の場合、ホスホナゾＩＩＩによるマグネシウムの結合が大きく減少し、ｐＨが７よりも大きくなると、試薬ブランクが大きく増加する。しかし、ｐＨが約７のとき、ホスホナゾＩＩＩはカルシウムとも結合するため、とりわけ試料中に多量のカルシウムが存在する場合、カルシウムキレート剤を加える必要がある。ここで、ホスホナゾＩＩＩに加えるカルシウムキレート剤は、マグネシウムと顕著に結合しないものを用いるべきである。
【００３４】
ＥＧＴＡは、ホスホナゾＩＩＩの存在下において、ｐＨ７でマグネシウムと結合しない、好適なカルシウムキレート剤であることがわかった。適切な濃度は、約１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。また、約７あるいはそれより高いｐＨの下で、ホスホナゾＩＩＩは、水溶液中のナトリウムとわずかに結合することがわかった。したがって、わずかな干渉を補正するため、塩化ナトリウムの生理的濃縮液をマグネシウム標準液に加える必要がある。あるいは、クリプトフィックス（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）２２１（４，７，１３，１６，２１−ペンタオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．５］トリコサン）などの適切なナトリウムキレート剤を試薬に加えてもよい。マグネシウム−ホスホナゾＩＩＩキレートを測定するために使用する波長の選択は、カルシウムの場合とほぼ同じであり、５８０ｎｍ付近の等吸収点を除く５００〜７００ｎｍの間の任意の波長を使用することができる。
【００３５】
ナトリウム分析に関し、ナトリウム結合は、ｐＨ５から１１の範囲で生じるが、ｐＨ８．５〜９．５の間で最高感度となる。体液中のナトリウムを測定する場合、１または複数の適切な金属キレート剤を加えてナトリウム以外の金属イオンと結合させ、ナトリウム以外の金属イオンがホスホナゾＩＩＩと反応するのを回避する必要がある。また、ホスホナゾＩＩＩは、ナトリウムとほぼ同じホスホナゾＩＩＩに対する親和性および感度を有するカリウムと結合する。したがって、ホスホナゾＩＩＩがカリウムに結合するのを阻止することのできる適切なキレート剤が必要である。
【００３６】
リチウムもホスホナゾＩＩＩと結合し、その結合特性は、ナトリウムに類似する。リチウム治療を受けていない限り、リチウムは通常体液中には存在しない。また、リチウム治療を受けている場合であっても、血清中における濃度は、正常血液の血清ナトリウム濃度が１３５〜１４５ｍｍｏｌ／Ｌに対し、０．６〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌでしかない（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｅｄ．，Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｗ．Ｔｉｅｔｚ編集者，ｐ．９７１）。したがって、リチウムは、主要な干渉因子にならない。なお、リチウム結合化合物、たとえば、ジベンジル−１４−クラウン−４を加えてもよい。
【００３７】
血清中において通常見られるカルシウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛と結合する好適な重金属キレート剤の例として、ジカルボン酸類、ホスホン酸類、リン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、（１，２−シクロヘキシレンジニトリロ）四酢酸（ＣＥＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）を挙げることができる。該重金属キレート剤は、ナトリウム分析における緩衝液としての役目を果たすことができる。金属キレート剤の有効濃度は、約０．０００５〜０．３ｍｏｌ／Ｌである。
【００３８】
カリウム干渉は、５０％ジメチルスルホキシドの存在下、１８−クラウン−６といったクラウンエーテルの添加によって、約８０％減らすことができる。幸い、血清中のカリウム濃度は、ナトリウム濃度が通常１３５〜１４５ｍｍｏｌ／Ｌであるのに対し、約３．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌでしかない。したがって、カリウムによる干渉は小さく、このカリウム分析値の較正に使用するナトリウム標準液に加えることによって完全に防ぐことができる。
【００３９】
ホスホナゾＩＩＩとナトリウム、カリウムおよびリチウムとの錯体化の感度は、ホスホナゾＩＩＩ緩衝液に対する吸湿性の溶剤または化合物の添加によって劇的に改善されることがわかった。このような感度の改善は、アルカリ性ｐＨ下で試薬の吸光度を低下させる、ホスホナゾＩＩＩのホスホン酸基およびヒドロキシル基からのプロトンの解離を部分的に抑制するためと考えられる。これにより、緩衝液に添加するホスホナゾＩＩＩをより多くすることができ、ホスホナゾＩＩＩに結合するナトリウムをより多くすることができる（詳細については、以下の検討を参照のこと）。
【００４０】
吸湿性の溶剤または化合物を試薬に加えた時に感度の改善が見られる第２の理由は、ナトリウムおよび他のアルカリ金属イオンの周囲にある水和層（ｔｈｅ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）の部分的な除去または完全な除去にあると思われる。アルカリ金属イオン（この場合はナトリウム）を水溶液に加えた時、以下の式（１）により、アルカリ金属イオンは、水分子によって直ちに配位される（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｔ Ｃｏｔｔｏｎ編集，第２編１９６７，第２および５章参照）。ナトリウムの配位数ｎは４であると考えられ、４個の水分子がナトリウムと強固に配位する。ナトリウムに関し、この反応は発熱量の大きな反応であり、９７ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギー放出を伴う。他のリガンドＬ（この場合ホスホナゾＩＩＩ）との錯体化が生じる前、金属（この場合はナトリウム）は先ず、１個以上の強固に結合された水分子を失わなければならない。これらは式（２）および（３）に示されている。
【００４１】
ｎＨ２Ｏ＋Ｍ＋ ＜−−−−＞ Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ＋＋（ｎ−ｊ）Ｈ２Ｏ （１）
Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ＋ ＜−−−−＞ Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ＋＋ｋＨ２Ｏ （２）
（式中、ｋ＝１〜４である）
Ｍ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ＋＋Ｌ− ＜−−−−＞ ＭＬ（Ｈ２Ｏ）ｊ−ｋ （３）
【００４２】
したがって、上述したような水分子の損失は、式（２）をさらに右にシフトさせ、これは次に式（３）をさらに右にシフトさせる。最終的な結果は、より多くの金属イオンがリガンド（金属錯化合物の中心金属に結合している原子団「配位子」であり、この場合はホスホナゾＩＩＩ）によって結合されることになる。ホスホナゾＩＩＩ、ＰＨ６、によって放出されたプロトンは、水分子によって水和され、式（４）で示すようなヒドロニウムイオンを形成するので、前述した機構によるホスホナゾＩＩＩのイオン化が抑制される。この場合、系からの遊離水を除去することにより、反応（４）が左にシフトし、アルカリ性ｐＨ下でのホスホナゾＩＩＩのイオン化が抑えられ、吸光度が低下する。
【００４３】
ＰＨ６＋ｎＨ２Ｏ＜−−−＞ＰＨ６−ｘｘ−＋（ｎ−ｘ）Ｈ２Ｏ＋ｘＨ３Ｏ＋ （４）
（式中、ｘ＝１〜６）
【００４４】
アルカリ金属類との錯体反応において、ホスホナゾＩＩＩの感度を増加する吸湿性剤としていくつかの化合物が有益であることがわかった。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、非常に吸湿性があり、ホスホナゾＩＩＩのナトリウム結合を増強する有用な化合物である。この化合物は、５〜１１の広いｐＨ範囲にわたって効果的であり、５％〜９０％（ジメチルスルホキシド容量／緩衝液容量）の濃度範囲にわたって使用することができる。ホスホナゾＩＩＩを使用したナトリウム測定における感度増加に有用とわかった吸湿性化合物の他の種類として、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類およびポリアルコールを挙げることができる。これらの化合物の例として、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、デキストラン、マンニトールおよびソルビトールが挙げられる。また、１種以上の上記吸湿性化合物を含む混合物を加えて、ナトリウム結合の増強を図ることもできる。たとえば、５ｍｍｏｌ／ＬのＤＰＴＡ緩衝液にｐＨ９のナトリウム試薬を加え、さらに５０％ＤＭＳＯを加えると、感度の増加は、ＤＭＳＯなしの同じ試薬に比べて、４．１倍となった。また、グルコースを加えて濃度を２５％としたとき、感度はさらに倍になり、緩衝液のみの場合における感度と比べて８．３倍となった。
【００４５】
一般的に、吸湿性化合物を効果的に作用させるため、式（２）および（３）において平衡を右にシフトさせ、式（４）において平衡を左にシフトさせるのに十分な量を緩衝液に加える必要がある。この結果、より多くのホスホナゾＩＩＩを試薬に加えることができ、より多くのアルカリ金属（この場合はナトリウム）が結合され、感度が増加する。大きな感度増強を得るためには、通例、緩衝液は、少なくとも約５重量％または容量％の吸湿性化合物を含んでいる必要がある。これにより、ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を測定するために、約５００〜７００ｎｍの間の任意の波長を使用することができる。また、クロロホスホナゾＩＩＩがホスホナゾＩＩＩと同じ条件でアルカリイオンと結合することも確認されている。
【００４６】
本発明の他の好適な態様は、カルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの１つを測定するキットおよびそれを用いた測定方法である。いったん好適なキットについての説明がなされれば、公知の技術や装置を使用する比色定量分析に当該キットを用いることは、ことさら実験をすることなく当業者とって明らかなことである。たとえば、カルシウムを具体的に測定するための診断キットに含まれる化合物には、以下のものがある。
ａ）マロン酸（ｍａｌｏｎａｔｅ）、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）マロン酸（ｍａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸からなる群から選択される１種以上のマグネシウムキレート剤；および
ｃ）約１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約３〜１０の溶液中に存在すること。
【００４７】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約０．０８ｍｏｌ／Ｌのマロン酸緩衝液；および
ｂ）約８３μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｃ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５．５の溶液中に存在すること。
【００４８】
マグネシウムを測定するために有用な本発明における他の好適な診断キットには、以下のものがある。
ａ）ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯの群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＥＧＴＡなどからなる群から選択されるカルシウムキレート剤；および
ｃ）１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約６．０〜１０の溶液中に存在すること。
【００４９】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液；
ｂ）約６ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ；および
ｃ）約４０μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約７．０の溶液中に存在すること。
【００５０】
ナトリウムを測定するために有用な本発明における他の好適な診断キットには、以下のものがある。
ａ）トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の金属キレート化合物；
ｃ）１５−クラウン−５および１８−クラウン−６からなる群から選択される１種以上のカリウム結合化合物；
ｄ）３０〜５００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩ；および
ｅ）ジメチルスルホキシド、グルコース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、キシロースおよびキシリトールからなる群から選択される１種以上の吸湿性化合物を含み、
ｆ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５〜１１の溶液中に存在すること。
【００５１】
また、上記実施例は、以下の条件を満たすことが好適である。
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ；
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６；
ｃ）約２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩ；および
ｄ）約５０％ジメチルスルホキシドを含んでおり、
ｅ）ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在すること。
【００５２】
カルシウム分析
試料中のカルシウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）カルシウムを含有する試料を上記試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度をステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のカルシウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００５３】
試料中のカルシウムの量を測定する他の好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を入れたキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）たとえばＥＧＴＡから選択されるカルシウムキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５４】
試料中のカルシウムの量を測定する他の好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を入れたキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ホスホナゾＩＩＩを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５５】
試料中のカルシウムの量を測定するさらに好ましい測定方法は、
ａ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ、および
ｉｉ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート化合物を含む第２試薬を、ステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５６】
試料中のカルシウムの量を測定するさらに好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）たとえば、マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、マレイン酸、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸から選択されるマグネシウムキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、カルシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５７】
マグネシウム分析
試料中のマグネシウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）マグネシウムを含有する試料を試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定する；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度を、ステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のマグネシウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００５８】
試料中のマグネシウムの量を測定する他の好ましい方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉｉ）ＥＧＴＡを含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＣＥＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ ＧＥＤＴＡおよびＮＴＡからなる群から選択されるキレート剤を含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００５９】
試料中のマグネシウムの量を測定する他の好ましい方法は、
ａ）ｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液；および
ｉｉ）ＥＧＴＡを含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ホスホナゾＩＩＩを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６０】
試料中のマグネシウムの量を測定するさらに別の好ましい測定方法は、
ａ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）ＥＧＴＡを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６１】
試料中のマグネシウムの量を測定するさらなる好ましい測定方法は、
ａ）ｉ）ホスホナゾＩＩＩ；および
ｉｉ）たとえば、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯから選択される緩衝液を含む第１試薬を準備し；
ｂ）試料を、前記第１試薬を含むキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｃ）ＥＧＴＡを含む第２試薬をステップｂ）のキュベットに加え、その吸光度、反射率または蛍光を測定し；
ｄ）ステップｃ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光を、ステップｂ）の結果として得られた吸光度、反射率または蛍光から減じて、マグネシウムに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得る測定方法である。
【００６２】
ナトリウム分析
試料中のナトリウムの量を測定する場合の好適な測定方法は、ホスホナゾＩＩＩまたは式Ｉの化合物を含有する上述した好適な診断試薬キットを準備し、
ａ）該診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｂ）ナトリウムを含有する試料を上記試薬に加え；
ｃ）該試料を試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｄ）ステップａ）で得られた吸光度をステップｃ）で得られた吸光度から減じて、試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得る測定方法である。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、試料中のナトリウム量の測定に、２つのバイアルに入れたナトリウム試薬を用いる。ナトリウムを測定する方法は、先に記載したカルシウム試薬およびマグネシウム試薬と類似の方法で行う。この場合、ナトリウム緩衝液（複数を含む）は、以下の１種以上のものと置き換えられる。
ジカルボン酸類、ホスホン酸類、リン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、（１，２−シクロヘキシレンジニトリロ）四酢酸（ＣＥＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）。重金属キレート剤は、上記キレート剤のリストから選択することもでき、緩衝液（複数を含む）としての役割も果たす。重金属キレート剤は、第１または第２試薬のいずれかに加えられていればよい。また、必要であれば、１８−クラウン−６などのカリウムキレート剤を第１または第２試薬に加えてもよい。ＤＭＳＯなどの吸湿性化合物（複数を含む）を、どちらか一方の試薬に加えてもよく、あるいは両方の試薬に対して同じ量を加えてもよい。
【００６４】
２つ試薬を用いたナトリウム分析において、カルシウムおよびマグネシウムの測定と同様に、第１の吸光度の読み取りは、試料および第１試薬を混合した後で行う。次いで第２試薬を加えた後、第２の吸光度の読み取りを行う。第１および第２の吸光度読み取り値の間における絶対差から、適当なナトリウム標準液を使用して、試料中のナトリウムに基づく吸光度を測定することができる。
【００６５】
上述した本発明の各分析方法において、吸光度は、約５００〜７００ｎｍの波長の間で読み取る。
【００６６】
式Ｉの化合物がクロロホスホナゾＩＩＩである本発明の一態様において、診断キットは、約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ、約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６、約２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩ、約５０％のジメチルスルホキシドも含み、該クロロホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在する。
【実施例１】
【００６７】
１試薬系のカルシウム試薬
２００ｍＬ（リットル）の蒸留水に１．９５ｇのＭＥＳと０．２５２ｇのシュウ酸２水和物を溶解する。ｐＨ（２５℃）は、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールの添加によって５．８０に調整した。この溶液（１０ｍＬ）に、０．６ｍｇのホスホナゾＩＩＩを加える。カルシウム分析は、３７℃に設定されたＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（自動分析装置；登録商標）により行った。１８０μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をピペットでＭＩＲＡのキュベットに入れる。５０秒後、６００ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランクの吸光度を測定した。２μＬの水溶性試料を１８μＬの蒸留水に加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取る。そして、最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値（試薬ブランクの吸光度）を減ずることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度を求めた。この分析では、２．５ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム標準液を使用して較正を行い、カルシウム標準液の回収は以下の通りであった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
上記試薬に関し、約４．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または、試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、カルシウムを測定するため、６００ｎｍ以外の波長を使用することができる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じて、どの波長および直線性の範囲が要求されるかは専門家が選択すべきことである。
【００７０】
上記試薬を用いて上記容量の試料を分析する場合、シュウ酸を添加することにより、マグネシウム濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、マグネシウム干渉をほぼ排除することができる。カルシウム分析試料中におけるマグネシウム濃度について、以下に示す。
【００７１】
【表２】
【実施例２】
【００７２】
２試薬系のカルシウム分析
試料ブランク吸光度を補正するのが望ましい場合、２試薬系のカルシウム分析を行ってもよい。２試薬系のカルシウム分析では、数種の試薬構成が可能である。例えば、ホスホナゾＩＩＩは、濃縮調製され（必要に応じてオキサレートまたは他のキレート剤を加えてもよい）、「出発試薬」として加えられる。この出発試薬を、試料を含有する「一次試薬」に加え、試料中のカルシウムに基づく吸光度を測定するために使用する。一次試薬は、単なる水でもよいが、より好適には、ホスホナゾＩＩＩとのカルシウム反応に適したｐＨの緩衝液がよい。また、一次試薬には、他の金属イオンがホスホナゾＩＩＩと反応するのを防ぐためにキレート剤を含有させてもよい。
【００７３】
さらに別の２試薬系分析では、ホスホナゾＩＩＩおよびオキサレートを一次試薬中に含有させ、出発試薬には他のキレート剤（複数を含む）を含有させてもよい。これにより、出発試薬中のキレート剤（複数を含む）がカルシウム−ホスホナゾＩＩＩキレートを分裂させるので、試薬および試料に基づく吸光度のみが残存する。出発試薬に含めることのできる適切なキレート剤の例として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＥＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＩＤＡ、ＨＩＤＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨおよびクエン酸が挙げられる。出発試薬における適切なキレート剤の濃度は約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。出発試薬を加える前の吸光度から出発試薬を加えた後の吸光度を減じることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度を得ることができる。
【００７４】
上述したように、ホスホナゾＩＩＩおよびオキサレートを含む０．０５ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液中で一次試薬を調製した。９３．１ｍｇのＥＤＴＡ（２ナトリウム２水和物塩）を９ｍＬ（あるいはこれよりも少量）の蒸留水に加え、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨを５．８に調整後、蒸留水で希釈して１０ｍＬの出発試薬を調製した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を用いて、カルシウム分析を３７℃で次のように実施した。１８０μＬの一次試薬および２μＬの試料、その後で８μＬの蒸留水をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れた。約１０秒後、６００ｎｍにおける初期吸光度を読み取り、２５秒後、２０μＬの出発試薬および５μＬの蒸留水を加え、５０秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。初期吸光度から最終吸光度の読み取り値を減ずることにより、試料中のカルシウムに基づく正味の吸光度が得られた。２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００７５】
【表３】
【００７６】
この分析は、基本的にマグネシウムからの干渉がなく、カルシウム濃度が４．０ｍｍｏｌ／Ｌまでは直線的な傾向を示した。
【実施例３】
【００７７】
１成分カルシウム分析
この実施例に係るカルシウムの測定において、緩衝液は、ｐＨを維持するだけでなく、マグネシウムおよび他の重金属の干渉を排除するキレート剤としての役割も果たす。４００ｍＬの蒸留水に４．１６ｇのマロン酸を加えた。トリエチルアミンでｐＨを５．５に調整し、２５０ｍｇのソルビン酸を加えて溶解するまで撹拌した。この溶液に、１．０ｍＬのＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ４８６７８）と、１．５ｍＬのＣＯＬＡＤＥＴ ＡＣＳ１２４０（Ｃｏｌｏｎｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，２２５Ｃｏｌｏｎｉａｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＴＮ３７３８０）と、３５ｍｇのホスホナゾＩＩＩとを加えた。蒸留水で５００ｍｌに希釈した後、２５℃でトリエチルアミンを用いてｐＨを５．５に調整した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し。３７℃で以下のようにカルシウム分析を実施した。２４０μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れた。５０秒後、６００ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランク吸光度を測定した。２μＬの水溶性カルシウムまたはマグネシウム試料と１０μＬの蒸留水とを加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値を減じて、試料に基づく正味の吸光度を求めた。この分析では、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ（１０ｍｇ／ｄＬ）のカルシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００７８】
【表４】
【実施例４】
【００７９】
１成分マグネシウム分析
２００ｍＬの蒸留水に、２．４３ｇのＤＩＰＳＯ［３−［Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、０．４４７ｇのＥＧＴＡおよび８．２ｍｇのホスホナゾＩＩＩを溶解する。２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールでｐＨを７．０（２５℃）に調整した。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し、３７℃で次のようにマグネシウム分析を実施した。１８０μＬの試薬をＭＩＲＡキュベットに加え、５０秒後、６００ｎｍにおいて初期吸光度を読み取り、試薬ブランク吸光度を測定した。２μＬの試料および１８μＬの蒸留水を加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおける最終吸光度を読み取った。最終吸光度の読み取り値から初期吸光度の読み取り値を減じた後、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を計算した。２．０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００８０】
【表５】
【００８１】
このように、上記試薬に関し、マグネシウムが約３．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、マグネシウムを測定するために、６００ｎｍ以外の波長を使用することできる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じて、どの波長および直線性の範囲が要求されるかに関しては専門家の選択に任せられる。
【００８２】
上記試薬を用いて上記容量の試料を分析する場合、ＥＧＴＡを添加することにより、カルシウム濃度が４ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、カルシウム干渉をほぼ排除することができる。このことは、以下の表に示すように、マグネシウムが０．５０ｍｍｏｌ／Ｌの試料におけるカルシウム濃度の関係からも明らかである。
【００８３】
【表６】
【００８４】
カルシウム分析と同様に、マグネシウム分析も２試薬系で行うことができる。一方の試薬の構成は、たとえば、試料を水や好ましくはＥＧＴＡなどホスホナゾＩＩＩと反応するカルシウムや他の金属イオンと結合するカルシウムキレート剤を含む緩衝液に加える。吸光度を読み取り、試料の吸光度寄与を得る。ホスホナゾＩＩＩを含む出発試薬を加え、第２吸光度を読み取る。第１吸光度読み取り値を第２吸光度から減じた後、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を得る。他方の試薬は、一次試薬がＥＧＴＡまたは他の適切なカルシウムキレート剤と、ホスホナゾＩＩＩとを含む緩衝液で構成され、これに試料を加える。ＥＤＴＡ、ＣＥＴＡまたはＤＴＰＡなどの緩衝化金属イオンキレート剤（複数を含む）で出発試薬を構成してもよい。第２試薬中のキレート剤（複数を含む）は、マグネシウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を分裂させ、ホスホナゾＩＩＩおよび試料ブランクに基づく吸光度を有する溶液となる。第２吸光度読み取り値を第１吸光度読み取り値から減じることにより、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度が得られる。
【実施例５】
【００８５】
２バイアルマグネシウム試薬
２バイアルマグネシウム試薬を以下のように調製した。上述したように、１バイアルマグネシウム試薬として一次試薬を調製した。３７．２ｍｇのジナトリウムＥＤＴＡ２水和物を９ｍＬの蒸留水に加え、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを用いてｐＨを２５℃で７．０に調整し、蒸留水で１０ｍＬに希釈して出発試薬を調製した。この分析をＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（登録商標）を使用し、３７℃で次のように実施した。１８０μＬの一次試薬をピペットでＭＩＲＡキュベットに入れ、２５秒後、６００ｎｍにおいて初期吸光度を読み取り、２０μＬの出発試薬、次いで１０μＬの蒸留水を、キュベットに加え、７５秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６００ｎｍにおいて最終吸光度を読み取り、試料中のマグネシウムに基づく正味の吸光度を、最終吸光度読み取り値を初期吸光度読み取り値から減じることによって計算した。分析は、２．０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウム標準液を使用して較正を行い、結果は以下の通りであった。
【００８６】
【表７】
【００８７】
上記試薬に関し、約３．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの直線性が得られた。ホスホナゾＩＩＩ濃度を増やすこと、および／または試料容量を減らすことにより、より大きな直線性を得ることができる。さらに、マグネシウムを測定するために、６００ｎｍ以外の波長を使用することできる（図１参照）。特定の必要性や用途に応じてどの波長および直線性の範囲が要求されるかに関しては専門家の選択に任せられる。
【００８８】
ヒト血清試料を、硫酸マグネシウムを含む水性較正物質でマグネシウム分析した場合、他のマグネシウム分析方法に比較して、わずかに正のバイアスが認められた。そして、この正のバイアスが、血清試料中のナトリウムによるわずかな干渉によるものであることがわかった。したがって、血清中のマグネシウムを測定する場合、わずかなナトリウム干渉を排除するために、血清較正物質を使用することが推奨される。あるいは、ナトリウム干渉を防止するため、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（登録商標）などのナトリウムキレート剤をマグネシウム試薬に加えてもよい。
【実施例６】
【００８９】
１バイアルナトリウム試薬
０．９３８ｇのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）に４５ｍＬの蒸留水を加えた。トリエチルアミンを加えてｐＨを９．５に調整し、蒸留水で５０．０ｍＬに希釈した。１．５ｍＬのこの溶液に、１．５ｍＬのジメチルスルホキシドとホスホナゾＩＩＩとを加え、０．２ｍｍｏｌ／Ｌの溶液とした。この溶液を、ＣＯＢＡＳ ＢＩＯ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）を用い、３７℃で次のようにナトリウム分析を実施した。２００μＬのホスホナゾＩＩＩ試薬をキュベットに加え、６５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、試薬ブランクの吸光度を測定した。約２分後、２μＬの水性ナトリウム試料および４μＬの蒸留水を加えた。９０秒間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、６５０ｎｍにおける第２吸光度を読み取り、第１吸光度読み取り値（試薬ブランク）を、第２吸光度読み取りから減算することによって、試料中のナトリウムに基づく吸光度を得た。この分析では、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ水性ナトリウム標準液を使用して較正した。
【００９０】
【表８】
【００９１】
ホスホナゾＩＩＩを使用するナトリウム試験は、ナトリウム濃度が１２０〜１６０ｍｍｏｌ／Ｌの間で直線的応答を示す。この範囲は、血清中において予想されるナトリウムの濃度をカバーしている。
【００９２】
ナトリウム分析が２またはそれ以上の試薬系で行うことができるのは明らかである。この場合、ホスホナゾＩＩＩ、吸湿性化合物（複数を含む）およびキレート剤、および緩衝液（複数を含む）をどの溶液に加えるかについては、数多くの選択肢がある。特定の用途に関してどの構成が最適であるかの判断は、専門家に任せられる。ナトリウム−ホスホナゾＩＩＩ錯体を測定するために、６５０ｎｍ以外の波長も使用することができる（図２参照）。
【実施例７】
【００９３】
０．６ｍｇのホスホアゾＩＩＩの代わりにｐ−メトキシホスホナゾＩＩＩ、０．６ｍｇを使用すること以外は、実施例１の手順と同じである。
【実施例８】
【００９４】
試薬を２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩにしたこと以外は、実施例６の手順と同じである。
【００９５】
細菌の成長を抑制または阻止するため、防腐剤をカルシウム、マグネシウムおよびナトリウム試薬に加えてもよい。また、界面活性剤、洗浄剤または湿潤剤を添加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．０）中のホスホナゾＩＩＩ、Ｃａ−ホスホナゾＩＩＩ錯体およびＭｇ−ホスホナゾＩＩＩ錯体の吸光度スペクトルを示す。ホスホナゾＩＩＩ、カルシウムおよびマグネシウムの濃度は、それぞれ、６２、２０および２０μｍｏｌ／Ｌである。
【図２】図２は、４８％ジメチルスルホキシドおよび１４．３％Ｄ−グルコースを含有する９．５ｍｍｏｌ／Ｌのジエチレントリアミン五酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ８．５）中のホスホナゾＩＩＩおよびＮａ−ホスホナゾＩＩＩ錯体の吸光度スペクトルを示す。ホスホナゾＩＩＩ濃度は２００μｍｏｌ／Ｌであり、ナトリウム濃度は９３０μｍｏｌ／Ｌである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
式Ｉに示す化合物を含む診断試薬キット。
［式Ｉ］
（但し、式Ｉ中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６エーテルアルキル、Ｃ１−６分岐アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびハロゲンからなる群から選択される。）
【請求項２】
前記化合物は、下式に示すホスホナゾＩＩＩであることを特徴とする請求項１に記載の診断試薬キット。
【請求項３】
カルシウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）マロン酸塩、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸からなる群から選択される１種以上のマグネシウムキレート剤；および
ｃ）約１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約３〜１０の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項４】
請求項３に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約０．０８ｍｏｌ／Ｌのマロン酸緩衝液、および
ｂ）約８３μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｃ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５．５の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項５】
マグネシウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＥＧＴＡなどからなるカルシウムキレート剤；および
ｃ）１０〜２００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約６．０〜１０の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項６】
請求項５に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液、
ｂ）約６ｍｍｏｌ／Ｌの前記ＥＧＴＡ、および
ｃ）約４０μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約７．０の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項７】
ナトリウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＧＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の金属キレート化合物；
ｃ）１５−クラウン−５および１８−クラウン−６からなる群から選択される１種以上のカリウム結合化合物；
ｄ）３０〜５００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩ；および
ｅ）ジメチルスルホキシド、グルコース、マルトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、キシロースおよびキシリトールからなる群から選択される１種以上の吸湿性化合物を含み、
ｆ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５〜１１の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項８】
請求項７に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ、
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６、
ｃ）約２００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩ、および
ｄ）約５０％のジメチルスルホキシドを含んでおり、
ｅ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項９】
カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムからなる群中における１のメンバーの量を測定する方法であって、
ａ）請求項１の化合物を含有する試薬を準備し；
ｂ）前記試薬の吸光度、反射率または蛍光を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）前記群の前記メンバーを含有する試料を前記試薬に加え、その後、吸光度、反射率または蛍光を測定し
ｄ）ステップｂ）で得た吸光度、反射率または蛍光の値を、ステップｃ）で得た吸光度、反射率または蛍光の値から減じて、前記試料中の前記群の前記メンバーに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得ること
を含む方法。
【請求項１０】
カルシウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項４の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）カルシウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のカルシウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１１】
マグネシウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項６の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）マグネシウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のマグネシウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１２】
ナトリウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項８の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）ナトリウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１３】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
式Ｉ（但し式Ｉ中、Ｒ３およびＲ７はＣｌである）の化合物を含む、ナトリウムの測定に有用な診断試薬キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載の診断試薬キットにおいて、
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ；
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６；
ｃ）約２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩ；および
ｄ）約５０％のジメチルスルホキシドを含み、
ｅ）クロロホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項１８】
試料中のナトリウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項１６の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）ナトリウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１９】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
カルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
式Ｉに示す化合物を含む診断試薬キット。
［式Ｉ］
（但し、式Ｉ中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６エーテルアルキル、Ｃ１−６分岐アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルおよびハロゲンからなる群から選択される。）
【請求項２】
前記化合物は、下式に示すホスホナゾＩＩＩであることを特徴とする請求項１に記載の診断試薬キット。
【請求項３】
カルシウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）マロン酸塩、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）マロン酸、マロン酸塩、シュウ酸、シュウ酸塩、コハク酸、８−ヒドロキシキノリン、フタル酸、酒石酸およびフェニルホスホン酸からなる群から選択される１種以上のマグネシウムキレート剤；および
ｃ）約１０〜２００μｍｏｌ／ＬのホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約３〜１０の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項４】
請求項３に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約０．０８ｍｏｌ／Ｌのマロン酸緩衝液、および
ｂ）約８３μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｃ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５．５の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項５】
マグネシウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、イミダゾール、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳおよびＴＡＰＳＯからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＥＧＴＡなどからなるカルシウムキレート剤；および
ｃ）１０〜２００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含み、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約６．０〜１０の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項６】
請求項５に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約０．０５ｍｏｌ／ＬのＤＩＰＳＯ緩衝液、
ｂ）約６ｍｍｏｌ／Ｌの前記ＥＧＴＡ、および
ｃ）約４０μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩを含んでおり、
ｄ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約７．０の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項７】
ナトリウムの測定に有用な診断試薬キットであって、
ａ）トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＧＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の緩衝液；
ｂ）ＤＴＰＡ、ＣＥＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡおよびＧＥＤＴＡからなる群から選択される１種以上の金属キレート化合物；
ｃ）１５−クラウン−５および１８−クラウン−６からなる群から選択される１種以上のカリウム結合化合物；
ｄ）３０〜５００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩ；および
ｅ）ジメチルスルホキシド、グルコース、マルトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、キシロースおよびキシリトールからなる群から選択される１種以上の吸湿性化合物を含み、
ｆ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約５〜１１の溶液中に存在することを特徴とする請求項２に記載の診断試薬キット。
【請求項８】
請求項７に記載の診断試薬キットであって、
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ、
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６、
ｃ）約２００μｍｏｌ／Ｌの前記ホスホナゾＩＩＩ、および
ｄ）約５０％のジメチルスルホキシドを含んでおり、
ｅ）前記ホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項９】
カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムからなる群中における１のメンバーの量を測定する方法であって、
ａ）請求項１の化合物を含有する試薬を準備し；
ｂ）前記試薬の吸光度、反射率または蛍光を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）前記群の前記メンバーを含有する試料を前記試薬に加え、その後、吸光度、反射率または蛍光を測定し
ｄ）ステップｂ）で得た吸光度、反射率または蛍光の値を、ステップｃ）で得た吸光度、反射率または蛍光の値から減じて、前記試料中の前記群の前記メンバーに基づく正味の吸光度、反射率または蛍光を得ること
を含む方法。
【請求項１０】
カルシウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項４の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）カルシウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のカルシウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１１】
マグネシウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項６の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）マグネシウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のマグネシウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１２】
ナトリウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項８の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）ナトリウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１３】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
式Ｉ（但し式Ｉ中、Ｒ３およびＲ７はＣｌである）の化合物を含む、ナトリウムの測定に有用な診断試薬キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載の診断試薬キットにおいて、
ａ）約２５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＰＡ；
ｂ）約４ｍｍｏｌ／Ｌの１８−クラウン−６；
ｃ）約２００μｍｏｌ／ＬのクロロホスホナゾＩＩＩ；および
ｄ）約５０％のジメチルスルホキシドを含み、
ｅ）クロロホスホナゾＩＩＩがｐＨ約９の溶液中に存在することを特徴とする診断試薬キット。
【請求項１８】
試料中のナトリウムの存在を測定する方法であって、
ａ）請求項１６の診断試薬キットを準備し；
ｂ）前記診断試薬キットにおける試薬の吸光度を測定し（試薬ブランク）；
ｃ）ナトリウムを含有する試料を前記試薬に加え；
ｄ）前記試料を前記試薬に加えた後の吸光度を測定し；
ｅ）ステップｂ）で得られた吸光度をステップｄ）で得られた吸光度から減じて、前記試料中のナトリウムに基づく吸光度変化を得ること
を含む方法。
【請求項１９】
吸光度を、約５００〜７００ｎｍの波長において読み取る請求項１８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５３７１４４（Ｐ２００８−５３７１４４Ａ）
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７７５４（Ｐ２００８−５０７７５４）
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３４７７
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０７３４１２９７）スペシャルティー アッセイズ，インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＰＥＣＩＡＬＴＹ ＡＳＳＡＹＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１３４７７
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０７３４１２９７）スペシャルティー アッセイズ，インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＰＥＣＩＡＬＴＹ ＡＳＳＡＹＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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