分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの検出のための方法および組成物
本発明は、インフルエンザウイルスのごとき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量の検出のための組成物および方法を提供する。好ましくは、アンチセンス配向における、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲおよび３'ＵＴＲならびにレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む人工セグメントを含む遺伝子改変された脊椎動物細胞を、分節化されたマイナス鎖ウイルスを含むことが疑われる生物学的試料と接触させる。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染の結果、そのレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドを発現する。また、本発明の遺伝子改変された細胞は、人工セグメントをコードする組換えＤＮＡを含むことができる。その組換えＤＮＡは、人工セグメントの転写を指令するＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターを含むことができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本願は、一般的にウイルス学の分野、より詳細には、生物学的試料中のマイナス鎖の分節化されたＲＮＡウイルスを検出および定量する方法に関する。また、本願は、かかる方法に用いるために改変された細胞に関する。
【０００２】
背景
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ヒトおよび動物において多数の疾患の原因である。かくして、生物学的試料におけるマイナス鎖ＲＮＡウイルスの検出および定量化は、臨床医および研究者の双方に重要である。
【０００３】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、分節化されたＲＮＡまたは分節化されていないＲＮＡを含むことができる。分節化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて、全ウイルスゲノムは、単一のネガティブセンスＲＮＡ分子により含まれるが、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて、そのウイルスゲノムは複数のネガティブセンスのＲＮＡセグメントにより含まれる。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのうち、Arenaviridae、BunyaviridaeおよびOrthomyxoviridaeは、各々、２、３および６〜８個のセグメントを含む。ｖＲＮＡの各セグメントは、５'から３'の順序にて、ウイルスポリペプチドをコードする少なくとも１つのアンチセンスのオープンリーディングフレーム配列の５'非翻訳部位(「ＵＴＲ」)、および３'ＵＴＲを含む。ＵＴＲは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡ複製および／または遺伝子発現と関連した少なくとも１つの蛋白質により認識され、および／またはそれに結合する。セグメントによりコード化された蛋白質の発現は、セグメントが５'および３'末端配列を正確に規定することを必要とすることは今や一般的に受け入れられている。
【０００４】
Olivoらの米国特許第５,５９１,５７９号および第５,８５１,７５７号は、生物学的試料における分節化されていないＲＮＡウイルスの存在を検出するための細胞系および方法を開示する。その細胞系は、細胞内ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識できるプロモーターを含むＤＮＡ分子で形質転換される。構造上不完全なＲＮＡウイルスのｃＤＮＡの転写を指令できるプロモーターは、レポーターｃＤＮＡに連結される。ウイルス酵素のある種のトランス活性化に寄与する活性関連ウイルスが供されない限りは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたＲＮＡ分子は、レポーターｃＤＮＡの翻訳を引き起こすことができない。
【０００５】
Olivoらの米国特許第６,２７０,９５８号は、生物学的試料中の分節化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスの検出のための診断アッセイを開示する。その開示されたアッセイにおいて、遺伝子改変された細胞は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのミニゲノムまたはミニアンチゲノムを発現する。ミニゲノムまたはミニアンチゲノムは、レポーター遺伝子またはその相補体、およびウイルスＲＮＡからのフランキング配列を含む。また、該細胞は、各々がウイルスのヌクレオカプシド蛋白質の発現を指令するプロモーターを含む組換えＤＮＡ配列を含む。これらの細胞系におけるレポーター遺伝子の発現は、ヌクレオカプシド蛋白質の存在ならびにウイルスでの細胞の感染に依存する。
【０００６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントによりコード化されたポリペプチドの発現が、正確に規定された３'および５'末端配列を必要とするために、研究者は、ＲＮＡポリメラーゼＩ(Ｐｏｌ Ｉ)の生化学的特性を利用して、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントのｃＤＮＡの発現を調べた。Ｐｏｌ Ｉは、正確なヌクレオチド配列にて転写を開始および終了すると考えられる。この点に関してZobelら, Nucleic Acids Research 21: 3607-3614,1993およびNeumannら, Virology 202: 477-479,1994は、マウスリボソームＲＮＡ(rＤＮＡ)遺伝子に由来するＰｏｌ Ｉ(「Ｐｏｌ Ｉプロモーター」)により認識されるプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築体を生成した。これらの組換えＤＮＡ構築体におけるＰｏｌ Ｉプロモーターは、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位、インフルエンザウイルスＲＮＡセグメントの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素(CAT)コード配列に相補的な配列（赤血球凝集素ｃＤＮＡを置き換える）、および３’ＵＴＲを含むインフルエンザウイルスセグメント、ならびにＰｏｌ Ｉポリメラーゼにより認識される転写ターミネーター配列（Ｐｏｌ Ｉターミネーター）を含む作動可能に連結したＤＮＡ配列の転写（恐らくＰｏｌ Ｉによる）を指令する。このＤＮＡ構築体でトランスフェクトしたインフルエンザウイルスに感染した細胞は、ＣＡＴ活性を発現し、これはウイルスでコード化されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートとしてＰｏｌ Ｉ転写体を用いることができ、その結果、翻訳可能なｍＲＮＡが活性ＣＡＴ酵素をコードすることを示す。
【０００７】
これらおよび同様の試験が、インフルエンザウイルスセグメントのｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡを用いて、インフルエンザウイルスの完全な生成に導いた。この連結において、Neumannら、 Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999,およびHoffmannら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 6108-6113,2000は、クローン化されたｃＤＮＡからの完全なインフルエンザＡ型ウイルスの生成についての「逆遺伝学」ＤＮＡ感染系を開示する。これらの試験において、細胞は、第１のシリーズの、各々がｖＲＮＡセグメントのｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌ Ｉプロモーターを含むＤＮＡ配列を含むプラスミド、ならびに第２のシリーズの、各々がウイルス蛋白をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ ＩＩプロモーターを含むプラスミドでトランスフェクトされた。この系において転写されたウイルス蛋白質は、ウイルスの核タンパク質(ＮＰ)およびポリメラーゼ複合蛋白質(蛋白質ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２を含む)を含んだ。
【０００８】
発明の概要
本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における少なくとも１つの分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための組成物および方法を包含する。また、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物をスクリーニングするための組成物および方法を包含する。
【０００９】
１つの具体例において、本発明は、あるポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含む、遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。好ましい具体例において、脊椎動物細胞は哺乳動物細胞で有り得る。ある具体例において、細胞は、存在、不存在または量の検出または決定が求められる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含まない。レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成は、分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞へのその導入を必要とする。
【００１０】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と前記のごとき組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１１】
もう一つの具体例において、本発明は、発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。かくして、また、本発明は、ＤＮＡ分子を含む細胞内の発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む単離された組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するもう一つの方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１３】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。この具体例の細胞は、発現が第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＲＮＡ分子、ならびに発現が第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＲＮＡ分子を含む。
【００１４】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき第１の組換えＲＮＡ分子および第２の組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在または量、ならびに第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１５】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。この具体例の細胞は、発現が第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＤＮＡ分子、ならびに発現が第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含む。
【００１６】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき第１の組換えＤＮＡ分子および第２の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、第１のレポーター遺伝子によりコード化される第１のポリペプチドの不存在、存在または量ならびに第２のレポーター遺伝子によりコード化される第２のポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１７】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料において、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスの感染の間の鑑別診断を決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、遺伝子改変された細胞とを接触させることを含み、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの少なくとも１つのＵＴＲを含む組換えＲＮＡ分子、およびレポーター遺伝子を含む。この具体例において、レポーター遺伝子ポリペプチド発現は、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する。その細胞内のレポーター遺伝子発現の定量分析は、生物学的試料のウイルス含量：インフルエンザＡ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれより実質的に大きい量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、インフルエンザＢ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれよりわずかに大きな量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、病原体ウイルスを含まないか、またはインフルエンザＡ型ウイルスもしくはインフルエンザＢ型ウイルス以外の病原体を含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれほど著しく大きくない量のレポーター遺伝子産物を生成することを明らかにする。
【００１８】
もう一つの具体例において、本発明は、包装化または使用説明書、および単離組換えＤＮＡ分子を含み、単離組換えＤＮＡ分子が蛋白質発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含むキットを提供する。
【００１９】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。該方法は、候補抗ウイルス化合物と、前記のごときレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞とを接触させ、ここに、その細胞は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスタンパク質複合体も含み、次いで、そのレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを測定することを含む。ある具体例において、タンパク質複合体は、細胞により含まれた複数のプラスミドの発現により提供でき、各プラスミドは、タンパク質複合体を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする。もう一つの具体例において、タンパク質複合体は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる細胞の感染により提供できる。候補抗ウイルス化合物の効力は、その化合物と接触した細胞(または細胞集団)内のレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを、その化合物と接触していない対照の細胞または細胞集団のそれと比較することにより決定される。
【００２０】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向される抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。該方法は、候補抗ウイルス化合物と、ウイルスに感染した細胞とを接触させ；次いで、その細胞により生成されたウイルスの存在、不存在または量を検出することを含む。その検出は、前記のごとく、レポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞(または細胞の集団)と、候補抗ウイルス化合物と接触した細胞により生成されたウイルスとを接触させることを含む。候補抗ウイルス化合物の効力は、遺伝子改変された細胞または細胞集団によるレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを、候補抗ウイルス化合物と接触していない感染細胞により生成されたウイルスと接触した対照の細胞または細胞集団のそれと比較することにより決定される。
【００２１】
詳細な記載
本発明により、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法および組成物が提供される。本発明は、遺伝子改変された細胞により供された分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントが、細胞が分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む場合、レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成にアクセス可能であるという発明者らの観察に基づいている。ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのポリペプチド成分をコードする１以上の核酸をさらに含む細胞に基づくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの具体例において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、例えば、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染により供されるウイルスゲノムＲＮＡとなることができる。レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成は、感染に先立ち、細胞内のウイルスヌクレオカプシド蛋白質の不存在下でさえ生じることができる。他の具体例において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、１以上の組換えＤＮＡ分子になることができる。組換えＤＮＡ分子は、例えば、プラスミドまたは複数のプラスミドのごとき、例えば、ベクターまたは複数のベクターで有り得、ここに、そのベクターは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスタンパク質複合体に寄与するウイルスのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。組換えＤＮＡ分子は、ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質のｃＤＮＡを含む１以上のベクターをさらに含むことができる。加えて、本発明は、レポーター遺伝子の産物の発現が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの不存在下、バックグラウンドレベルを著しく超えて検出されないという発明者らの観察に基づいている。宿主細胞にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを導入する方法が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスにより細胞の感染を含むために、該方法および組成物は、生物学的試料における１以上の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または診断することを可能とする。
【００２２】
本明細書に記載された方法および組成物は、当業者によく知れた実験技術を利用し、Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYのごとき実験マニュアルに見出すことができる。
【００２３】
本発明による遺伝子改変された細胞は、組換え核酸を含む脊椎動物細胞であり、検出すべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性である。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、例えば、アレナウイルス、ブンヤウイルスまたはオルトミクソウイルスで有り得る。オルトミクソウイルスは、例えば、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルスで有り得る。本発明の遺伝子改変された細胞は、予め形成された人工セグメントＲＮＡからの翻訳可能なレポーター遺伝子ｍＲＮＡの効率的な合成に必要な蛋白質が発現されるように、感染させる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムが、細胞に入ることができ、その複製サイクルにおいて少なくともはるかに十分に進むことができるならば、感染に感受性である。好ましくは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染は、十分に増殖性であり、すなわち、子孫ウイルスが、感染細胞により生成され、次いで、細胞から細胞へ広がる。さらに、ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、好ましくは、人工セグメントが組換えＤＮＡ鋳型から転写できるように、(例えば、ヒトまたはマウス起源の)Ｐｏｌ Ｉプロモーターが機能するものである。特別の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性の細胞系が、公知の感受性細胞系についての文献を検索することにより、および／または単にルーチン実験を必要とするよく知られた手順を用いる候補細胞系をスクリーニングすることにより容易に同定できると当業者ならば理解するであろう。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに感受性の細胞の非限定の例は、以下を含む：２９３Ｔ腎臓、ＬＡ−４、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥｐ２、２ｆＴＧＨおよびＳＴＡＴＩ−欠損２ｆＴＧＨ(Ｕ３Ａ)のごときヒト細胞、ならびにベイビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)、ＣＶ−１、ベロ（Vero）、ＬＬＣ−ＭＫ１、サル初代腎臓およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のごとき非ヒト細胞。ヒト２９３Ｔ細胞は、ヒトを含めた哺乳動物を感染させる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを検出するための宿主細胞としての使用のために好ましい。感受性細胞は当該技術分野においてよく知られ、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209のごときソースから入手可能である。本明細書に記載された組換えＤＮＡ分子を含む本発明の遺伝子改変された細胞は、安定的にトランスフェクトした、あるいは一過性にトランスフェクトした細胞で有り得る。また、ある態様において、細胞により含まれた組換えＤＮＡは、ベクター、好ましくはプラスミドにより含むことができる。また、ベクターは、当該技術分野においてよく知られた方法により用いられる、例えば、選択マーカーまたは複製開始点のごとき、組換えＤＮＡ分子の選択、維持または増殖に有用な他の配列を含むことができる(例えば、Sambrookら、前記)。
【００２４】
また、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントまたはその相補体を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。本発明の人工セグメントは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含む一本鎖ＲＮＡである。好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは、双方の５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、その存在、不存在または量が、生物学的試料において検出されるべきある種の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスからのものである。その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、同一または異なるセグメントからのもので有り得る。好ましくは、その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、その存在、不存在または量が生物学的試料において検出されるべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの同一セグメントからのものである。好ましくは、人工セグメントのレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、アンチセンス配置にあって、人工セグメントの相補体のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、センス配置にある。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの不存在下、宿主細胞は、翻訳可能なウイルスｍＲＮＡ分子を提供も、そのセグメントに相補的なＲＮＡを合成することもできない。しかしながら、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下、宿主細胞は、翻訳可能なウイルスｍＲＮＡ分子を提供することができ、鋳型として相補鎖を用いて、各ケースにおいて、人工セグメントおよびその相補体の両方を合成も複製もできる。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む宿主細胞において、人工セグメントのＵＴＲを認識し、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写開始部位として機能できる。人工セグメントにおいて、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、好ましくはアンチセンス配向にある。理論により拘束されることなくして、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき１以上のウイルス蛋白質は、その人工セグメントのＵＴＲを認識し、それに結合すると考えられる。ウイルス蛋白質は、宿主細胞の感染に際してウイルスにより宿主細胞に導入できる。さらに、鋳型として人工セグメントを利用することにより、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、人工セグメント(「ポジティブセンス」鎖)に相補的なＲＮＡ鎖の合成を触媒し、ポジティブセンス鎖は、人工セグメントの合成用の鋳型として用いることができると考えられる。また、さらに、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、キャップされたポリアデニル化されたｍＲＮＡに処理できる人工ｍＲＮＡの合成用鋳型としてポジティブセンス鎖を利用する(例えば、Mikulasovaら, Acta Virol. 44: 273-282,2000参照)。センス配向にてレポーター遺伝子配列を含むｍＲＮＡは、細胞による翻訳に利用可能である結果、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドを生成する。従って、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染は、例えば、その細胞と診断テスト試料との接触により供されるウイルスが、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むものを含めたウイルスのポリペプチドの発現に導き、従って、レポーター遺伝子ポリペプチドの発現に導く。加えて、遺伝子改変された細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量は、ウイルスのレベルを飽和させるまで細胞(または細胞集団)を感染させる、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの量に単調に関連し、それにより、生物学的試料中のウイルスレベルの定量化のための手段を提供する。レポーター遺伝子をコード化するｍＲＮＡが、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ不存在下で宿主細胞内で合成されないので、本発明の感染していない遺伝子改変された細胞のレポーター遺伝子ポリペプチドの量は、人工セグメントを含まない対照細胞のものほど著しく大きくない。
【００２５】
その存在、不存在または量が検出されるべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、アレナウイルス、ブンヤウイルスまたはオルトミクソウイルスのごときいずれかの分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで有り得、好ましくは、オルトミクソウイルス、より好ましくは、インフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルスで有り得、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスである。好ましくは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの不存在、存在または量を検出するために用いた人工セグメントは、インフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからの５'ＵＴＲ、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含む。好ましくは、その人工セグメントは、インフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからの３'ＵＴＲ、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含む。好ましくは、その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、同一ウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスからのものであり、好ましくは、双方がインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントからのものである。
【００２６】
本発明のレポーター遺伝子は、細胞内で発現した場合、検出可能な産物をコードするいずれかの核酸配列(ＤＮＡまたはＲＮＡ)である。レポーター遺伝子は、例えば、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列または合成配列のごときオープンリーディングフレームを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列で有り得る。また、レポーター遺伝子は、イントロンを含むことができる。レポーター遺伝子核酸配列におけるイントロンの存在は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼでの細胞の刺激に際して、宿主細胞内でコード化されたポリペプチドの発現レベルを増加できると考えられる。レポーター遺伝子産物は、好ましくは、細胞内で容易にアッセイまたは検出できるポリペプチドである。ポリペプチドのアッセイまたは検出は、例えば、レポーター遺伝子ポリペプチドに指向された抗体を用いる免疫検出；例えば、蛍光発生的、色素生産性、化学発光もしくは放射性の基質を用いる酵素活性検出；または蛋白質蛍光のごときいずれかの公知の検出方法によることができる。レポーター遺伝子産物の非限定の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)および分泌アルカリフォスファターゼを含む。好ましくは、レポーター遺伝子産物は、緑色蛍光タンパク質のごとき本質的に蛍光性であるポリペプチドであるか、またはホタルルシフェラーゼのごとき化学発光の基質が利用可能である酵素である。好ましくは、ポリペプチドの不存在、存在または量の検出は、そのポリペプチドまたはその基質により発光した光量子シグナルの不存在、存在または量の検出を含む。光量子シグナルは、例えば、緑色蛍光タンパク質のごとき蛍光蛋白質からの蛍光発光、または例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼのごとき化学発光の基質が利用できる酵素からの化学発光で有り得る。光シグナルの検出または定量化は、当該技術分野において知られたいずれかの検出または定量化の方法、例えば、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーによることができる。「緑色蛍光蛋白質」なる用語は、Aequorea victoria (Chalfieら, Science, 263:802-805, 1994)からのＧＦＰの自然発生野生型配列、ならびに蛍光変異体およびその誘導体（色に拘わらず）、例えば、Tsienらへの米国特許第６,０５４,３２１号、Chalfieらへの米国特許第６,１４６、８２６号、Michaelsへの米国特許第６,０９６、８６５号に記載された蛍光蛋白質を含むもののごとき蛍光ポリペプチドを含む。ルシフェラーゼなる用語は、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼのごとき自然発生の化学発光基質を有する酵素を含む。
【００２７】
ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、人工セグメントをコードする組換えＤＮＡ配列を含む。遺伝子改変された細胞は、当該技術分野において知られたいずれかの方法により生成できる。いくつかの具体例において、遺伝子改変された細胞は、本発明の組換えＤＮＡでの細胞のトランスフェクションにより生成できる。トランスフェクションは、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて達成できる。好ましくは、トランスフェクションは、TransITR-LT１トランスフェクション試薬(Mirus Corporation, Madison, WI)のごときトランスフェクション剤を用いて達成される。組換えＤＮＡは、人工セグメントをコード化する組換えＤＮＡ配列を含む単離組換えＤＮＡ分子として提供できる。単離組換えＤＮＡ分子は、組換えプラスミドまたは組換えウイルスのごときベクターを含むことができる。組換えウイルスは、例えば、組換えバクテリオファージまたは組換え脊椎動物ウイルスで有り得る。
【００２８】
ある具体例において、これらの具体例の組換えＤＮＡ分子は、５'から３'の順序にて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位、人工セグメントまたはその相補体をコード化するＤＮＡ配列、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含む。組換えＤＮＡ配列の転写のための本発明の遺伝子改変された細胞により用いられたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、細胞に内因的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、または例えば、Olivoらへの特許第６,２７０,９５８号に開示されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき異種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで有り得る。好ましくは、そのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、細胞に内因的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩである。従って、そのプロモーターは、脊椎動物細胞内で機能できるいずれかのＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターで有り得、好ましくは、細胞に内因的なＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターである。プロモーターは、好ましくは、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位である転写開始部位に作動可能に連結される。Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位は、Ｐｏｌ Ｉが、例えば、配列５'-CCAATAA-３'のごとき転写を開始するために認識できるいずれかの配列で有り得る。この配列がＰｏｌ Ｉプロモーターに続く場合、転写は、この配列の直ぐ３'のヌクレオチドにて開始されると考えられる。Ｐｏｌ Ｉが正確に規定された配列にて転写を開始するために、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位は、好ましくは、ＤＮＡの転写体が、５'末端が人工セグメントをコードするｃＤＮＡの５'ＵＴＲの５'端と正確にまたはその５'端の約１０のヌクレオチド内で一致する人工セグメントを含むにように配置される。好ましくは、５'末端は、５'ＵＴＲの５'端と正確に一致する。別法として、人工セグメントがプロモーターに関してポジティブセンスの配置にあるならば、ＤＮＡの転写体は、５'末端が人工セグメントをコードするｃＤＮＡの３'ＵＴＲの相補体の５'端と正確にまたはその５'端の約１０のヌクレオチド内で一致する人工セグメントを含む。好ましくは、５'末端は、３'ＵＴＲの５'端と正確に一致する。人工セグメントをコードするｃＤＮＡは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む。レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ分子により含まれたプロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配置のいずれかで有り得、好ましくはプロモーターに関してアンチセンス配置にある。人工セグメントをコード化する配列は、プロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配向に有り得る。かくして、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列は、プロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配向のいずれかでも有り得る。さらに、いくつかの具体例において、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列もイントロンを含むことができる。
【００２９】
組換えＤＮＡ分子はさらに転写終結部位を含む。「転写終結部位」は、例えば、転写終了のためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、自己切断リボザイムのごとき触媒的なＲＮＡ配列をコード化する配列または直線ＤＮＡの末端配列のごとき規定された３’末端を有するＲＮＡ配列に転写または処理できるいずれかのＤＮＡ配列を含むように本明細書に規定される。転写終結部位は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩにより認識された転写終結部位である。好ましい具体例において、Ｐｏｌ Ｉ転写終結部位は、配列５'-GGGGGG-３'により描写できる。別法の具体例において、転写終結部位は、自己切断リボザイムのごとき触媒的なＲＮＡ配列をコードする配列を含むことができる。本発明の転写終結部位は、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端が人工セグメントの３'ＵＴＲの３'端に正確にあるか、またはその３’端の約１０ヌクレオチド内にあるようにＤＮＡ配列内に位置する。好ましい具体例において、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端は、正確に３'ＵＴＲの３'端にある。別法として、人工セグメントがプロモーターに関してポジティブセンスの配置にあるならば、本発明の転写終結部位は、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端が、人工セグメントの相補体の５'ＵＴＲの相補体の３'端に正確にあるか、またはその３'端の約１０ヌクレオチド内にあるようにＤＮＡ配列中に位置する。好ましい具体例において、そのＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端は、５'ＵＴＲの相補体の３'端に正確にある。
【００３０】
ある具体例において、組換えＤＮＡ分子は、例えば、組換えプラスミドまたは組換えウイルスのごときベクターである。好ましくは、ベクターは組換えプラスミドである。プラスミドの非限定の例は、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃおよびｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ＧＦＰを含み、ここに、各々、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターはＰｏｌ Ｉプロモーターであり、そのＵＴＲはインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントからのもであって、レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする。かかるベクターは、当業者によく知られた材料および方法を用いて構築できる(例えば、Sambrookら、前記)。非限定の例において、かかるベクターは、プラスミドプラスミドｐＨＨ２１のごときＰｏｌ Ｉプロモーターを含むプラスミドを用いて構築できる(Neumann, G.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999 ; Neumann, G.ら, Virology 202: 477-479,1994)。
【００３１】
理論により拘束されることなくして、その配列構造のために、本発明のいくつかの具体例における組換えＤＮＡは、Ｐｏｌ ＩのごときＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、分節化されたマイナス鎖ウイルスのセグメントまたはセグメント群のものに同一またはほとんど同一である５'および３'末端配列を有するＲＮＡ転写体を形成し、それにより、人工セグメントを形成すると考えられる。従って、人工セグメントは、生物学的試料により含まれたウイルスによる感染に先立ち細胞内に蓄積する。分節化されていないウイルスの検出方法と異なり、本発明の方法による分節化されたウイルスの検出は、ウイルス感染に先立ち、またはウイルス感染に加えて、ウイルス蛋白質の細胞内の発現を必要としない。しかしながら、遺伝子改変された細胞がヌクレオカプシド蛋白質のごときウイルス蛋白質をさらに含むならば、レポーターポリペプチドの発現レベルは増強できる。例えば、かかるウイルス蛋白質は、ウイルス蛋白質用のｃＤＮＡに作動可能に連結されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲＮＡポリメラーゼＩＩのごとき)用のプロモーターを各々含む１以上のプラスミドでの細胞のトランスフェクションを介して細胞に供することができる。
【００３２】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出するための組成物および方法を提供する。この具体例の遺伝子改変された細胞は、２つの人工セグメントまたはそれらの相補体を含む。第１の人工セグメントは、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、レポーターポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の３'ＵＴＲを含む。第２の人工セグメントは、第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、レポーターポリペプチドをコードする第２の核酸配列、および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の３'ＵＴＲを含む。第１および第２の人工セグメントの双方について、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、センスまたはアンチセンス配置で有り得、好ましくはアンチセンス配置にある。これらの具体例における細胞は、前記のごとき人工セグメントの転写用の配列に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを各々含む第１の組換えＤＮＡ分子および第２の組換えＤＮＡ分子のいずれもさらに含むことができる。あるいは、単一の組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の２つのプロモーターを含むことができ、各プロモーターは、前記のごとき２つの人工セグメントのうちの１つの転写のための配列に作動可能に連結される。これらの具体例において、ウイルスは、非限定の例において、アレナウイルス、ブンヤウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスから選択された１対のウイルスのごときいずれかの１対の分節化されたマイナス鎖ウイルスで有り得る。２つのウイルスを含む生物学的試料との接触に際して、レポーター遺伝子を含むｍＲＮＡは各ウイルスの量に比例して形成される。従って、レポーター遺伝子は比例して発現され、生物学的試料のウイルス含量を反映する。例えば、この具体例の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型からのＵＴＲを含む第１の人工セグメント、およびインフルエンザＢ型からのＵＴＲを含む第２の人工セグメントを含むことができ、人工セグメントは、異なったレポーター遺伝子を含む。その細胞と、インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型ウイルスの双方を含む生物学的試料との接触に際して、細胞により作成されたレポーター遺伝子ポリペプチドの量は、その標本におけるウイルス量に比例するであろう。好ましくは、これらの具体例のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドは、光発光ポリペプチドであるか、または光発光基質が利用可能である酵素、好ましくは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質よりなる群から選択される酵素である。
【００３３】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスの感染の間の鑑別診断を決定する方法を提供する。該方法は、その生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを接触させることを含み、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの少なくとも１つのＵＴＲおよびポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む。人工セグメントを含む「実質的に複数」の遺伝子改変された細胞は、人工セグメントを含む細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％で有り得る。レポーター遺伝子は、好ましくはアンチセンス配置にある。これらの細胞の人工セグメントの５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲの片方または双方は、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントのＵＴＲ、より好ましくはＮＰセグメントである。レポーター遺伝子ポリペプチドの発現は、インフルエンザウイルスＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する。好ましい具体例において、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドは、光発光により検出できる蛋白質、例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ蛋白質である。これらの具体例において、細胞集団中のレポーター遺伝子発現の定量的測定は、生物学的試料のウイルス含量：インフルエンザＡ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団が、感染していない対照培養物のそれより実質的に大きな量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、インフルエンザＢ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物よりわずかに大きな量のレポーター遺伝子産物を生成することを明らかにする。いくつかの具体例において、レポーター遺伝子発現の定量分析は、細胞集団で全体として発現されたレポーター遺伝子ポリペプチドの測定を含むことができる。もう一つの具体例において、定量分析は、例えば、レポーター遺伝子およびフローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器を用いて、細胞ごとのベースでレポーター遺伝子ポリペプチドレベルを測定することを含むことができる。かくして、いくつかの具体例において、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型またはどちらでもないウイルスを含むことが知られた試料を用いて、これらのウイルスに応じた培養によりレポーター遺伝子発現レベルを確立できる。これらの発現レベルは、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料により含まれたウイルスのタイプを決定するためのガイダンスを提供できる。例えば、レポーター遺伝子ポリペプチドを発現する細胞のパーセンテージは、そのウイルスのうちの１つに感染した対照培養物を用いて測定されたパーセンテージを反映するであろう。かくして、例えば、その細胞集団と接触した生物学的試料は、大多数の細胞中のレポーターポリペプチドの発現に導く、例えば、少なくとも約８０％の細胞、または少なくとも約９０％の細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスを含むと診断でき、一方、その細胞集団と接触した生物学的試料は、少数の細胞、例えば、約１０％の細胞におけるレポーターポリペプチドの発現に導き、インフルエンザＢ型ウイルスを含むと診断することができる。さらに、その細胞集団と接触した生物学的試料は、約３％未満の細胞におけるレポーターポリペプチドの発現に導き、どちらのウイルスも含まないと診断できる。
【００３４】
もう一つの具体例において、本発明は、包装化および単離組換えＤＮＡ分子を含むキットを提供し、単離組換え分子は、その分子でトランスフェクトされた細胞の発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む。この具体例において、単離組換えＤＮＡ分子は、５'から３'の順序にて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含む。この具体例のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列は、センスまたはアンチセンス配向で有り得、好ましくはアンチセンス配向にある。また、この具体例のキットは、前記されたもののごとき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性の細胞または細胞集団を含むことができる。その細胞または細胞集団は、単離組換えＤＮＡ分子で感染した遺伝子改変された細胞で有り得る。あるいは、その細胞または細胞集団は、非トランスフェクトで有り得る。キットの使用者は、当業者によく知られた標準的な方法を用いて、そのＤＮＡで細胞または細胞集団をトランスフェクトし、次いで、そのトランスフェクトした細胞を用いて、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を測定できる。トランスフェクションは、Sambrookら、前記に記載されたもののごとき当業者によく知られた標準的手順により行うことができる。
【００３５】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの増殖または遺伝子発現に指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。そのウイルスは、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのごときインフルエンザウイルスである。定量的スクリーニング方法は、 (ａ）候補抗ウイルス化合物と、(i)前記のレポーター遺伝子ポリペプチドのコード化した配列を含む人工セグメントおよび(ii)分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むタンパク質複合体を含む遺伝子改変された細胞または細胞集団とを接触させ、次いで、(ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む。ある具体例において、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むタンパク質複合体は、１以上の核酸により細胞または細胞集団において提供でき、各核酸は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製複合体の少なくとも１つのポリペプチド成分をコードする。他の具体例において、タンパク質複合体は、そのウイルスでの細胞の感染、またはウイルスＲＮＡでの細胞のトランスフェクションにより細胞に提供できる。候補抗ウイルス化合物の効力は、その化合物と接触した細胞または細胞集団のレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルをその化合物と接触しない対照の細胞または細胞集団のそれに比較することにより決定される。レポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルは、細胞により発現されたレポーター遺伝子ポリペプチドの合計量の測定により決定できる。いくつかの具体例において、レポーター遺伝子ポリペプチドの発現は、レポーター遺伝子ポリペプチドを発現する細胞のパーセンテージの測定により決定できる。非限定の例において、レポーター遺伝子ポリペプチドがＧＦＰまたはルシフェラーゼのいずれかである場合、フローサイトメトリーを用いて、細胞数−対−レポーター遺伝子ポリペプチド発現レベルの２次元プロットを提供できる。標準的な分析技術を用いて、候補化合物の効力を決定でき、例えば、集めたデータを用いて、候補化合物のレポーター遺伝子発現(ＥＤ５０)の５０％の低下を供する有効用量を決定できる。この定量的スクリーニング方法は、迅速な結果を提供し、実施するのは簡単である。
【００３６】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についてのウイルス生成アッセイ（viral yield assay）を提供する。この具体例において、第１の細胞(または細胞集団)は、候補抗ウイルス化合物と接触する。また、第１の細胞はウイルスに感染する。第１の細胞は、ウイルスによる増殖感染に感受性であるタイプである。次いで、細胞または細胞集団によるウイルスの生成は、候補抗ウイルス化合物との感染および接触後、第１の細胞または細胞集団により生成されたウイルスの試料(もしあれば)を含む生成試料を用いて測定される。その化合物の抗ウイルスの活性は、生成試料と、第２の細胞(または細胞集団)とを接触させることにより決定され、ここに、第２の細胞または細胞集団は、発現が前記のごとく、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内における存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞または細胞集団である。(対照と比較した)レポーター遺伝子の発現レベルの低下は、候補抗ウイルス化合物による抗ウイルス活性を示す。
【００３７】
以下の実施例は、例示的な目的だけに提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。その実施例は、本発明についてのより良好な理解およびその利点のより良好な認識を可能にするであろう。
【００３８】
実施例１
本実施例は、プラスミドｐＨＨ２１ ＮＰ ＵＴＲ ＨＩルシフェラーゼの構造および機能化を示す。
【００３９】
このプラスミド(図１)は、インフルエンザA/ＷＳＮ/３３のセグメント５のＵＴＲにより隣接して挟まれたルシフェラーゼＯＲＦをコードする。このプラスミドを含む細胞において、転写は、プラスミドがＰｏｌ Ｉにより転写される場合、ネガティブまたはゲノムのセンスＲＮＡ転写体が生成されるように、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーターにより制御される。このプラスミドにおいて、ルシフェラーゼ・レポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩ発現ベクターにより含まれたインフルエンザＡ型ウイルスＮＰセグメントのｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを交換する(plasmid pHH21 ; Neumann, G.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999 ; Neumann,G.ら, Virology 202: 477-479,1994)。そのプラスミドの機能領域に対応するヌクレオチド配列を示す。このプラスミドでトランスフェクトし、インフルエンザＡ型ウイルスに感染した細胞は、ルシフェラーゼを発現できる。同様に、このプラスミドでトランスフェクトし、さらにウイルス蛋白質ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞も、ルシフェラーゼを発現できる。
【００４０】
実施例２
この実施例はインフルエンザＡ型ウイルス検出プロセスを示す。
【００４１】
この実施例(図２)において、トランスフェクトした細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩ酵素を用いて、ネガティブまたはゲノムのセンスＲＮＡ転写体を生成する。インフルエンザＡ型ウイルスでの感染またはインフルエンザＡ型ウイルスのポリメラーゼ複合体の発現に際して、転写体は、全長のポジティブセンスＲＮＡまたは５’キャップされたポリアデニル化ｍＲＮＡに複製される。ポジティブセンスＲＮＡを複製して、さらなるウイルスネガティブセンスＲＮＡを形成し、一方、そのｍＲＮＡを宿主細胞機構によりレポーター蛋白質に翻訳する。ルシフェラーゼ・レポーターポリペプチドは、当該技術分野において知られた標準的な方法により検出および定量できる。
【００４２】
実施例３
この実施例はインフルエンザＡ型ウイルス検出手順を示す。
【００４３】
この手順において、細胞をそのｐＨＨ２１ルシフェラーゼまたは同様のプラスミドでトランスフェクトする(図３)。次いで、細胞を安定的にトランスフェクトした亜集団について選択するか、または直接的に用いることができる。次いで、生物学的試料(例えば、臨床検査試料またはウイルス試料)を検出可能なシグナルの生成に十分であると期待される期間細胞と共にインキュベートする。インキュベーション時間は少なくとも約６時間で有り得る。好ましくは、そのインキュベーション時間は、少なくとも約６時間から約１４日まで、少なくとも約６時間から約１２０時間まで、または少なくとも約６時間から約２４時間までで有り得る。試料に対する曝露後、その細胞を当該技術分野において知られた標準的な方法によりレポーター遺伝子ポリペプチドの発現について分析する。
【００４４】
実施例４
この実施例は、人工のインフルエンザＡ型セグメントからのレポーター遺伝子の発現を示す。
【００４５】
この実施例において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、そのＮＰセグメントからのＵＴＲを含むヒトＲＮＡポリメラーゼＩ発現ベクターｐＨＨ２１におけるＮＰオープンリーディングフレームに代えて、クローン化した。得られたプラスミドのｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃは、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体により転写できる機能的なインフルエンザウイルス人工セグメントＲＮＡを発現させ、それにより、ウイルス感染の存在下、ルシフェラーゼ発現を可能とする。ヒト２９３Ｔ細胞をｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃでトランスフェクトし、５の感染多重度(ＭＯＩ)にてインフルエンザウイルス株ＷＳＮ/３３でトランスフェクトさせたか、またはインフルエンザウイルス複製およびヌクレオカプシド蛋白質(ウイルスポリペプチドＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰを各々コードするｐＰＡ、ｐＰＢl、ｐＰＢ２およびｐＮＰ)用の発現ベクターで共トランスフェクトさせた。トランスフェクションの４２時間後(または、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃ単独でトランスフェクトした細胞については、インフルエンザウイルスによる感染の１８時間後）に、細胞を溶解し、GLOWキット(Promega, Madison WI)を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性につきアッセイした。感染の不存在下のそのプラスミドでのトランスフェクションは、１６,０００を超えるのシグナル対ノイズの非常に高いシグナル(＞２×１０６ ＬＣＰＳ)を生じさせた(図４、第３レーン)。しかしながら、人工セグメント(ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃ）を含むプラスミドだけでトランスフェクトした細胞のウイルス感染も、レポーター遺伝子発現を促すのに十分であった(図４、第２レーン)。
【００４６】
実施例５
この実施例は、インフルエンザＡ型ウイルス活性の指標としてのＧＦＰレポーター遺伝子を示す。
【００４７】
蛍光ベースの読取りを用いたインフルエンザＡ型ウイルス活性についてのスクリーニングを促すために、インフルエンザウイルスＡ/ＷＳＮ/３３のＮＰセグメントのＵＴＲにより隣接して挟まれたＧＦＰオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡを構築した。このｃＤＮＡを、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーターを介して、人工セグメント、ＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰの転写を駆動するそのｐＨＨ２１ベクターにクローン化した。２９３Ｔ細胞をＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をインフルエンザＡ型ウイルスに感染させた。感染の１８時間後、細胞をＧＦＰ発現につき分析した。多量のＧＦＰが、ウイルス感染細胞の１００％に存在した (図５Ａ；黒色、満たされたヒストグラム)が、偽感染させた細胞は、ほとんどないまたは全くＧＦＰを発現しなかった(図５Ａ；白色、破線ヒストグラム)。これらのデータは、ＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰを発現している細胞におけるＧＦＰの感染依存性の生成を示す。この感染依存性の方法は、ウイルス検出系を可能とする。
【００４８】
このレポーター遺伝子構築体が、感染に独立したプロセスにおいて機能できるかを決定するために、２９３Ｔ細胞を、ｐＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰと共に、ＲＮＡ複製および転写(ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰ)に必要なインフルエンザＯＲＦを発現するプラスミドでトランスフェクトした。外因性のＯＲＦを含まないプラスミドは、対照としてトランスフェクションに含まれた。４つのウイルスのポリメラーゼ蛋白質のすべてをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞の中で、ＧＦＰは、細胞の約３５％で検出され(図５Ｂ、黒色、満たされたヒストグラム)、一方、４つのウイルスのポリメラーゼ発現プラスミドのうちの３つだけでトランスフェクトした細胞は、ＧＦＰのかなりの発現を示さなかった(図５Ｂ、白色、破線ヒストグラム)。これらのデータは、ＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰからのＧＦＰレポーター遺伝子活性が感染に独立したアッセイにおいて検出可能であることを示す。かくして、図３におけるデータは、ポリメラーゼが感染またはトランスフェクションにより送達されるかのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を定量するためのツールとしてのインフルエンザＡ型ウイルスＵＴＲにより隣接して挟まれたレポーター遺伝子の使用を示す。
【００４９】
実施例６
この実施例は、インフルエンザＣ型ウイルスではなくインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスによるレポーター遺伝子発現の誘導を示す。
【００５０】
インフルエンザＡ型ウイルスＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰ転写体が、オルソミクソウイルスの他のメンバーのポリメラーゼ複合体により認識できるかを決定するために、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ＧＦＰトランスフェクトした細胞を、インフルエンザＡ型(ＷＳＮ/３３株)、インフルエンザＢ型(Yamagata/５９株)またはインフルエンザＣ型(Jerusalem/９９株)に感染させた。インフルエンザＡ型/ＷＳＮ/３３の感染細胞は、９９％を超えるＧＦＰポジティブ細胞を示し、一方、インフルエンザＢ/Yamagata/５９はわずか９.８％のＧＦＰポジティブ細胞を示した。さらに、ＧＦＰポジティブインフルエンザA/ＷＳＮ/３３-感染細胞における平均チャネル蛍光は２９６３であり、一方、インフルエンザB/Yamagata/５９-感染細胞における対応する集団は、わずか８８の平均チャネル蛍光を有した。これらのデータは、ＧＦＰレポーターがインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞において高度に発現されるが、インフルエンザＢ型ウイルス感染細胞においてはそれが単にわずかに発現されることを示す。偽感染およびンフルエンザＣ型感染した培養物の双方は、２.５％のＧＦＰのポジティブ細胞を有し、それはそのレポーターがインフルエンザＣ型感染細胞において発現されなかったことを示す。これは、ＮＰ ＵＴＲ ＧＦＰ転写体がインフルエンザＣ型ウイルスポリメラーゼ複合体により認識も転写もされなかったことを示唆する。このアッセイを診断的に用いて、生物学的試料、例えば、インフルエンザの症状を示すヒト患者からの血液試料がインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスを含むかどうかを決定できる。
【００５１】
本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が、前記の方法および組成物に行うことができるので、前記の記載に含まれたすべての内容は例示として解釈され、限定する意味に解釈されるものではないことを意図する。
【００５２】
本明細書に引用されたすべての引用文献は、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。本明細書の引用文献の説明は、それらの著者によりなされた主張を単に概括することを意図し、いずれの参考文献も特許性に関連する先行技術を構成するという承認はなされていない。出願人は、引用された参考文献の正確さおよび適切さを試みるための権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、プラスミドｐＨＨ２１ ＮＰ ＵＴＲ ＨＩルシフェラーゼの地図を示す。
【図２】図２は、人工セグメントを用いるインフルエンザＡ型ウイルス検出を示す。
【図３】図３は、インフルエンザＡ型ウイルス検出手順のブロックダイヤグラムを示す。
【図４】図４は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからのＵＴＲおよびルシフェラーゼＯＲＦを含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞によるホタルルシフェラーゼ発現を示す。
【図５】図５は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからのＵＴＲおよびＧＦＰ ＯＲＦを含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞による緑色蛍光タンパク質発現を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本願は、一般的にウイルス学の分野、より詳細には、生物学的試料中のマイナス鎖の分節化されたＲＮＡウイルスを検出および定量する方法に関する。また、本願は、かかる方法に用いるために改変された細胞に関する。
【０００２】
背景
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ヒトおよび動物において多数の疾患の原因である。かくして、生物学的試料におけるマイナス鎖ＲＮＡウイルスの検出および定量化は、臨床医および研究者の双方に重要である。
【０００３】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、分節化されたＲＮＡまたは分節化されていないＲＮＡを含むことができる。分節化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて、全ウイルスゲノムは、単一のネガティブセンスＲＮＡ分子により含まれるが、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて、そのウイルスゲノムは複数のネガティブセンスのＲＮＡセグメントにより含まれる。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのうち、Arenaviridae、BunyaviridaeおよびOrthomyxoviridaeは、各々、２、３および６〜８個のセグメントを含む。ｖＲＮＡの各セグメントは、５'から３'の順序にて、ウイルスポリペプチドをコードする少なくとも１つのアンチセンスのオープンリーディングフレーム配列の５'非翻訳部位(「ＵＴＲ」)、および３'ＵＴＲを含む。ＵＴＲは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡ複製および／または遺伝子発現と関連した少なくとも１つの蛋白質により認識され、および／またはそれに結合する。セグメントによりコード化された蛋白質の発現は、セグメントが５'および３'末端配列を正確に規定することを必要とすることは今や一般的に受け入れられている。
【０００４】
Olivoらの米国特許第５,５９１,５７９号および第５,８５１,７５７号は、生物学的試料における分節化されていないＲＮＡウイルスの存在を検出するための細胞系および方法を開示する。その細胞系は、細胞内ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識できるプロモーターを含むＤＮＡ分子で形質転換される。構造上不完全なＲＮＡウイルスのｃＤＮＡの転写を指令できるプロモーターは、レポーターｃＤＮＡに連結される。ウイルス酵素のある種のトランス活性化に寄与する活性関連ウイルスが供されない限りは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたＲＮＡ分子は、レポーターｃＤＮＡの翻訳を引き起こすことができない。
【０００５】
Olivoらの米国特許第６,２７０,９５８号は、生物学的試料中の分節化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスの検出のための診断アッセイを開示する。その開示されたアッセイにおいて、遺伝子改変された細胞は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのミニゲノムまたはミニアンチゲノムを発現する。ミニゲノムまたはミニアンチゲノムは、レポーター遺伝子またはその相補体、およびウイルスＲＮＡからのフランキング配列を含む。また、該細胞は、各々がウイルスのヌクレオカプシド蛋白質の発現を指令するプロモーターを含む組換えＤＮＡ配列を含む。これらの細胞系におけるレポーター遺伝子の発現は、ヌクレオカプシド蛋白質の存在ならびにウイルスでの細胞の感染に依存する。
【０００６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントによりコード化されたポリペプチドの発現が、正確に規定された３'および５'末端配列を必要とするために、研究者は、ＲＮＡポリメラーゼＩ(Ｐｏｌ Ｉ)の生化学的特性を利用して、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントのｃＤＮＡの発現を調べた。Ｐｏｌ Ｉは、正確なヌクレオチド配列にて転写を開始および終了すると考えられる。この点に関してZobelら, Nucleic Acids Research 21: 3607-3614,1993およびNeumannら, Virology 202: 477-479,1994は、マウスリボソームＲＮＡ(rＤＮＡ)遺伝子に由来するＰｏｌ Ｉ(「Ｐｏｌ Ｉプロモーター」)により認識されるプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築体を生成した。これらの組換えＤＮＡ構築体におけるＰｏｌ Ｉプロモーターは、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位、インフルエンザウイルスＲＮＡセグメントの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素(CAT)コード配列に相補的な配列（赤血球凝集素ｃＤＮＡを置き換える）、および３’ＵＴＲを含むインフルエンザウイルスセグメント、ならびにＰｏｌ Ｉポリメラーゼにより認識される転写ターミネーター配列（Ｐｏｌ Ｉターミネーター）を含む作動可能に連結したＤＮＡ配列の転写（恐らくＰｏｌ Ｉによる）を指令する。このＤＮＡ構築体でトランスフェクトしたインフルエンザウイルスに感染した細胞は、ＣＡＴ活性を発現し、これはウイルスでコード化されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートとしてＰｏｌ Ｉ転写体を用いることができ、その結果、翻訳可能なｍＲＮＡが活性ＣＡＴ酵素をコードすることを示す。
【０００７】
これらおよび同様の試験が、インフルエンザウイルスセグメントのｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡを用いて、インフルエンザウイルスの完全な生成に導いた。この連結において、Neumannら、 Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999,およびHoffmannら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 6108-6113,2000は、クローン化されたｃＤＮＡからの完全なインフルエンザＡ型ウイルスの生成についての「逆遺伝学」ＤＮＡ感染系を開示する。これらの試験において、細胞は、第１のシリーズの、各々がｖＲＮＡセグメントのｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌ Ｉプロモーターを含むＤＮＡ配列を含むプラスミド、ならびに第２のシリーズの、各々がウイルス蛋白をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌ ＩＩプロモーターを含むプラスミドでトランスフェクトされた。この系において転写されたウイルス蛋白質は、ウイルスの核タンパク質(ＮＰ)およびポリメラーゼ複合蛋白質(蛋白質ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２を含む)を含んだ。
【０００８】
発明の概要
本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における少なくとも１つの分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための組成物および方法を包含する。また、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物をスクリーニングするための組成物および方法を包含する。
【０００９】
１つの具体例において、本発明は、あるポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含む、遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。好ましい具体例において、脊椎動物細胞は哺乳動物細胞で有り得る。ある具体例において、細胞は、存在、不存在または量の検出または決定が求められる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含まない。レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成は、分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞へのその導入を必要とする。
【００１０】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と前記のごとき組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１１】
もう一つの具体例において、本発明は、発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。かくして、また、本発明は、ＤＮＡ分子を含む細胞内の発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む単離された組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するもう一つの方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１３】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。この具体例の細胞は、発現が第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＲＮＡ分子、ならびに発現が第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＲＮＡ分子を含む。
【００１４】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき第１の組換えＲＮＡ分子および第２の組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在または量、ならびに第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１５】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定するための遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。この具体例の細胞は、発現が第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＤＮＡ分子、ならびに発現が第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含む。
【００１６】
結果的に、もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、前記のごとき第１の組換えＤＮＡ分子および第２の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、次いで、第１のレポーター遺伝子によりコード化される第１のポリペプチドの不存在、存在または量ならびに第２のレポーター遺伝子によりコード化される第２のポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを含む。
【００１７】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料において、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスの感染の間の鑑別診断を決定する方法を提供する。該方法は、生物学的試料と、遺伝子改変された細胞とを接触させることを含み、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの少なくとも１つのＵＴＲを含む組換えＲＮＡ分子、およびレポーター遺伝子を含む。この具体例において、レポーター遺伝子ポリペプチド発現は、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する。その細胞内のレポーター遺伝子発現の定量分析は、生物学的試料のウイルス含量：インフルエンザＡ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれより実質的に大きい量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、インフルエンザＢ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれよりわずかに大きな量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、病原体ウイルスを含まないか、またはインフルエンザＡ型ウイルスもしくはインフルエンザＢ型ウイルス以外の病原体を含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物のそれほど著しく大きくない量のレポーター遺伝子産物を生成することを明らかにする。
【００１８】
もう一つの具体例において、本発明は、包装化または使用説明書、および単離組換えＤＮＡ分子を含み、単離組換えＤＮＡ分子が蛋白質発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含むキットを提供する。
【００１９】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。該方法は、候補抗ウイルス化合物と、前記のごときレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞とを接触させ、ここに、その細胞は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスタンパク質複合体も含み、次いで、そのレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを測定することを含む。ある具体例において、タンパク質複合体は、細胞により含まれた複数のプラスミドの発現により提供でき、各プラスミドは、タンパク質複合体を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする。もう一つの具体例において、タンパク質複合体は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる細胞の感染により提供できる。候補抗ウイルス化合物の効力は、その化合物と接触した細胞(または細胞集団)内のレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを、その化合物と接触していない対照の細胞または細胞集団のそれと比較することにより決定される。
【００２０】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向される抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。該方法は、候補抗ウイルス化合物と、ウイルスに感染した細胞とを接触させ；次いで、その細胞により生成されたウイルスの存在、不存在または量を検出することを含む。その検出は、前記のごとく、レポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞(または細胞の集団)と、候補抗ウイルス化合物と接触した細胞により生成されたウイルスとを接触させることを含む。候補抗ウイルス化合物の効力は、遺伝子改変された細胞または細胞集団によるレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルを、候補抗ウイルス化合物と接触していない感染細胞により生成されたウイルスと接触した対照の細胞または細胞集団のそれと比較することにより決定される。
【００２１】
詳細な記載
本発明により、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法および組成物が提供される。本発明は、遺伝子改変された細胞により供された分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントが、細胞が分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む場合、レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成にアクセス可能であるという発明者らの観察に基づいている。ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのポリペプチド成分をコードする１以上の核酸をさらに含む細胞に基づくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの具体例において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、例えば、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染により供されるウイルスゲノムＲＮＡとなることができる。レポーター遺伝子を含む翻訳可能なｍＲＮＡの形成は、感染に先立ち、細胞内のウイルスヌクレオカプシド蛋白質の不存在下でさえ生じることができる。他の具体例において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、１以上の組換えＤＮＡ分子になることができる。組換えＤＮＡ分子は、例えば、プラスミドまたは複数のプラスミドのごとき、例えば、ベクターまたは複数のベクターで有り得、ここに、そのベクターは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスタンパク質複合体に寄与するウイルスのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。組換えＤＮＡ分子は、ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質のｃＤＮＡを含む１以上のベクターをさらに含むことができる。加えて、本発明は、レポーター遺伝子の産物の発現が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの不存在下、バックグラウンドレベルを著しく超えて検出されないという発明者らの観察に基づいている。宿主細胞にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを導入する方法が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスにより細胞の感染を含むために、該方法および組成物は、生物学的試料における１以上の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出または診断することを可能とする。
【００２２】
本明細書に記載された方法および組成物は、当業者によく知れた実験技術を利用し、Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYのごとき実験マニュアルに見出すことができる。
【００２３】
本発明による遺伝子改変された細胞は、組換え核酸を含む脊椎動物細胞であり、検出すべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性である。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、例えば、アレナウイルス、ブンヤウイルスまたはオルトミクソウイルスで有り得る。オルトミクソウイルスは、例えば、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルスで有り得る。本発明の遺伝子改変された細胞は、予め形成された人工セグメントＲＮＡからの翻訳可能なレポーター遺伝子ｍＲＮＡの効率的な合成に必要な蛋白質が発現されるように、感染させる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムが、細胞に入ることができ、その複製サイクルにおいて少なくともはるかに十分に進むことができるならば、感染に感受性である。好ましくは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染は、十分に増殖性であり、すなわち、子孫ウイルスが、感染細胞により生成され、次いで、細胞から細胞へ広がる。さらに、ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、好ましくは、人工セグメントが組換えＤＮＡ鋳型から転写できるように、(例えば、ヒトまたはマウス起源の)Ｐｏｌ Ｉプロモーターが機能するものである。特別の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性の細胞系が、公知の感受性細胞系についての文献を検索することにより、および／または単にルーチン実験を必要とするよく知られた手順を用いる候補細胞系をスクリーニングすることにより容易に同定できると当業者ならば理解するであろう。分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに感受性の細胞の非限定の例は、以下を含む：２９３Ｔ腎臓、ＬＡ−４、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥｐ２、２ｆＴＧＨおよびＳＴＡＴＩ−欠損２ｆＴＧＨ(Ｕ３Ａ)のごときヒト細胞、ならびにベイビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)、ＣＶ−１、ベロ（Vero）、ＬＬＣ−ＭＫ１、サル初代腎臓およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のごとき非ヒト細胞。ヒト２９３Ｔ細胞は、ヒトを含めた哺乳動物を感染させる分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを検出するための宿主細胞としての使用のために好ましい。感受性細胞は当該技術分野においてよく知られ、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209のごときソースから入手可能である。本明細書に記載された組換えＤＮＡ分子を含む本発明の遺伝子改変された細胞は、安定的にトランスフェクトした、あるいは一過性にトランスフェクトした細胞で有り得る。また、ある態様において、細胞により含まれた組換えＤＮＡは、ベクター、好ましくはプラスミドにより含むことができる。また、ベクターは、当該技術分野においてよく知られた方法により用いられる、例えば、選択マーカーまたは複製開始点のごとき、組換えＤＮＡ分子の選択、維持または増殖に有用な他の配列を含むことができる(例えば、Sambrookら、前記)。
【００２４】
また、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの人工セグメントまたはその相補体を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞を提供する。本発明の人工セグメントは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含む一本鎖ＲＮＡである。好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは、双方の５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、その存在、不存在または量が、生物学的試料において検出されるべきある種の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスからのものである。その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、同一または異なるセグメントからのもので有り得る。好ましくは、その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、その存在、不存在または量が生物学的試料において検出されるべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの同一セグメントからのものである。好ましくは、人工セグメントのレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、アンチセンス配置にあって、人工セグメントの相補体のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、センス配置にある。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの不存在下、宿主細胞は、翻訳可能なウイルスｍＲＮＡ分子を提供も、そのセグメントに相補的なＲＮＡを合成することもできない。しかしながら、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下、宿主細胞は、翻訳可能なウイルスｍＲＮＡ分子を提供することができ、鋳型として相補鎖を用いて、各ケースにおいて、人工セグメントおよびその相補体の両方を合成も複製もできる。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む宿主細胞において、人工セグメントのＵＴＲを認識し、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写開始部位として機能できる。人工セグメントにおいて、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームは、好ましくはアンチセンス配向にある。理論により拘束されることなくして、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき１以上のウイルス蛋白質は、その人工セグメントのＵＴＲを認識し、それに結合すると考えられる。ウイルス蛋白質は、宿主細胞の感染に際してウイルスにより宿主細胞に導入できる。さらに、鋳型として人工セグメントを利用することにより、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、人工セグメント(「ポジティブセンス」鎖)に相補的なＲＮＡ鎖の合成を触媒し、ポジティブセンス鎖は、人工セグメントの合成用の鋳型として用いることができると考えられる。また、さらに、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、キャップされたポリアデニル化されたｍＲＮＡに処理できる人工ｍＲＮＡの合成用鋳型としてポジティブセンス鎖を利用する(例えば、Mikulasovaら, Acta Virol. 44: 273-282,2000参照)。センス配向にてレポーター遺伝子配列を含むｍＲＮＡは、細胞による翻訳に利用可能である結果、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドを生成する。従って、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスでの細胞の感染は、例えば、その細胞と診断テスト試料との接触により供されるウイルスが、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むものを含めたウイルスのポリペプチドの発現に導き、従って、レポーター遺伝子ポリペプチドの発現に導く。加えて、遺伝子改変された細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量は、ウイルスのレベルを飽和させるまで細胞(または細胞集団)を感染させる、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの量に単調に関連し、それにより、生物学的試料中のウイルスレベルの定量化のための手段を提供する。レポーター遺伝子をコード化するｍＲＮＡが、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ不存在下で宿主細胞内で合成されないので、本発明の感染していない遺伝子改変された細胞のレポーター遺伝子ポリペプチドの量は、人工セグメントを含まない対照細胞のものほど著しく大きくない。
【００２５】
その存在、不存在または量が検出されるべき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、アレナウイルス、ブンヤウイルスまたはオルトミクソウイルスのごときいずれかの分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで有り得、好ましくは、オルトミクソウイルス、より好ましくは、インフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルスで有り得、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスである。好ましくは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの不存在、存在または量を検出するために用いた人工セグメントは、インフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからの５'ＵＴＲ、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含む。好ましくは、その人工セグメントは、インフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからの３'ＵＴＲ、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含む。好ましくは、その５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、同一ウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスからのものであり、好ましくは、双方がインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントからのものである。
【００２６】
本発明のレポーター遺伝子は、細胞内で発現した場合、検出可能な産物をコードするいずれかの核酸配列(ＤＮＡまたはＲＮＡ)である。レポーター遺伝子は、例えば、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列または合成配列のごときオープンリーディングフレームを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列で有り得る。また、レポーター遺伝子は、イントロンを含むことができる。レポーター遺伝子核酸配列におけるイントロンの存在は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼでの細胞の刺激に際して、宿主細胞内でコード化されたポリペプチドの発現レベルを増加できると考えられる。レポーター遺伝子産物は、好ましくは、細胞内で容易にアッセイまたは検出できるポリペプチドである。ポリペプチドのアッセイまたは検出は、例えば、レポーター遺伝子ポリペプチドに指向された抗体を用いる免疫検出；例えば、蛍光発生的、色素生産性、化学発光もしくは放射性の基質を用いる酵素活性検出；または蛋白質蛍光のごときいずれかの公知の検出方法によることができる。レポーター遺伝子産物の非限定の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)および分泌アルカリフォスファターゼを含む。好ましくは、レポーター遺伝子産物は、緑色蛍光タンパク質のごとき本質的に蛍光性であるポリペプチドであるか、またはホタルルシフェラーゼのごとき化学発光の基質が利用可能である酵素である。好ましくは、ポリペプチドの不存在、存在または量の検出は、そのポリペプチドまたはその基質により発光した光量子シグナルの不存在、存在または量の検出を含む。光量子シグナルは、例えば、緑色蛍光タンパク質のごとき蛍光蛋白質からの蛍光発光、または例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼのごとき化学発光の基質が利用できる酵素からの化学発光で有り得る。光シグナルの検出または定量化は、当該技術分野において知られたいずれかの検出または定量化の方法、例えば、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーによることができる。「緑色蛍光蛋白質」なる用語は、Aequorea victoria (Chalfieら, Science, 263:802-805, 1994)からのＧＦＰの自然発生野生型配列、ならびに蛍光変異体およびその誘導体（色に拘わらず）、例えば、Tsienらへの米国特許第６,０５４,３２１号、Chalfieらへの米国特許第６,１４６、８２６号、Michaelsへの米国特許第６,０９６、８６５号に記載された蛍光蛋白質を含むもののごとき蛍光ポリペプチドを含む。ルシフェラーゼなる用語は、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼのごとき自然発生の化学発光基質を有する酵素を含む。
【００２７】
ある具体例において、遺伝子改変された細胞は、人工セグメントをコードする組換えＤＮＡ配列を含む。遺伝子改変された細胞は、当該技術分野において知られたいずれかの方法により生成できる。いくつかの具体例において、遺伝子改変された細胞は、本発明の組換えＤＮＡでの細胞のトランスフェクションにより生成できる。トランスフェクションは、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて達成できる。好ましくは、トランスフェクションは、TransITR-LT１トランスフェクション試薬(Mirus Corporation, Madison, WI)のごときトランスフェクション剤を用いて達成される。組換えＤＮＡは、人工セグメントをコード化する組換えＤＮＡ配列を含む単離組換えＤＮＡ分子として提供できる。単離組換えＤＮＡ分子は、組換えプラスミドまたは組換えウイルスのごときベクターを含むことができる。組換えウイルスは、例えば、組換えバクテリオファージまたは組換え脊椎動物ウイルスで有り得る。
【００２８】
ある具体例において、これらの具体例の組換えＤＮＡ分子は、５'から３'の順序にて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位、人工セグメントまたはその相補体をコード化するＤＮＡ配列、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含む。組換えＤＮＡ配列の転写のための本発明の遺伝子改変された細胞により用いられたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、細胞に内因的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、または例えば、Olivoらへの特許第６,２７０,９５８号に開示されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのごとき異種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで有り得る。好ましくは、そのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、細胞に内因的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩである。従って、そのプロモーターは、脊椎動物細胞内で機能できるいずれかのＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターで有り得、好ましくは、細胞に内因的なＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターである。プロモーターは、好ましくは、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位である転写開始部位に作動可能に連結される。Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位は、Ｐｏｌ Ｉが、例えば、配列５'-CCAATAA-３'のごとき転写を開始するために認識できるいずれかの配列で有り得る。この配列がＰｏｌ Ｉプロモーターに続く場合、転写は、この配列の直ぐ３'のヌクレオチドにて開始されると考えられる。Ｐｏｌ Ｉが正確に規定された配列にて転写を開始するために、Ｐｏｌ Ｉ転写開始部位は、好ましくは、ＤＮＡの転写体が、５'末端が人工セグメントをコードするｃＤＮＡの５'ＵＴＲの５'端と正確にまたはその５'端の約１０のヌクレオチド内で一致する人工セグメントを含むにように配置される。好ましくは、５'末端は、５'ＵＴＲの５'端と正確に一致する。別法として、人工セグメントがプロモーターに関してポジティブセンスの配置にあるならば、ＤＮＡの転写体は、５'末端が人工セグメントをコードするｃＤＮＡの３'ＵＴＲの相補体の５'端と正確にまたはその５'端の約１０のヌクレオチド内で一致する人工セグメントを含む。好ましくは、５'末端は、３'ＵＴＲの５'端と正確に一致する。人工セグメントをコードするｃＤＮＡは、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む。レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ分子により含まれたプロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配置のいずれかで有り得、好ましくはプロモーターに関してアンチセンス配置にある。人工セグメントをコード化する配列は、プロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配向に有り得る。かくして、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列は、プロモーターに関してセンスまたはアンチセンス配向のいずれかでも有り得る。さらに、いくつかの具体例において、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列もイントロンを含むことができる。
【００２９】
組換えＤＮＡ分子はさらに転写終結部位を含む。「転写終結部位」は、例えば、転写終了のためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、自己切断リボザイムのごとき触媒的なＲＮＡ配列をコード化する配列または直線ＤＮＡの末端配列のごとき規定された３’末端を有するＲＮＡ配列に転写または処理できるいずれかのＤＮＡ配列を含むように本明細書に規定される。転写終結部位は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩにより認識された転写終結部位である。好ましい具体例において、Ｐｏｌ Ｉ転写終結部位は、配列５'-GGGGGG-３'により描写できる。別法の具体例において、転写終結部位は、自己切断リボザイムのごとき触媒的なＲＮＡ配列をコードする配列を含むことができる。本発明の転写終結部位は、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端が人工セグメントの３'ＵＴＲの３'端に正確にあるか、またはその３’端の約１０ヌクレオチド内にあるようにＤＮＡ配列内に位置する。好ましい具体例において、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端は、正確に３'ＵＴＲの３'端にある。別法として、人工セグメントがプロモーターに関してポジティブセンスの配置にあるならば、本発明の転写終結部位は、転写に際して、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端が、人工セグメントの相補体の５'ＵＴＲの相補体の３'端に正確にあるか、またはその３'端の約１０ヌクレオチド内にあるようにＤＮＡ配列中に位置する。好ましい具体例において、そのＤＮＡから転写されたＲＮＡの３'末端は、５'ＵＴＲの相補体の３'端に正確にある。
【００３０】
ある具体例において、組換えＤＮＡ分子は、例えば、組換えプラスミドまたは組換えウイルスのごときベクターである。好ましくは、ベクターは組換えプラスミドである。プラスミドの非限定の例は、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃおよびｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ＧＦＰを含み、ここに、各々、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターはＰｏｌ Ｉプロモーターであり、そのＵＴＲはインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントからのもであって、レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする。かかるベクターは、当業者によく知られた材料および方法を用いて構築できる(例えば、Sambrookら、前記)。非限定の例において、かかるベクターは、プラスミドプラスミドｐＨＨ２１のごときＰｏｌ Ｉプロモーターを含むプラスミドを用いて構築できる(Neumann, G.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999 ; Neumann, G.ら, Virology 202: 477-479,1994)。
【００３１】
理論により拘束されることなくして、その配列構造のために、本発明のいくつかの具体例における組換えＤＮＡは、Ｐｏｌ ＩのごときＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、分節化されたマイナス鎖ウイルスのセグメントまたはセグメント群のものに同一またはほとんど同一である５'および３'末端配列を有するＲＮＡ転写体を形成し、それにより、人工セグメントを形成すると考えられる。従って、人工セグメントは、生物学的試料により含まれたウイルスによる感染に先立ち細胞内に蓄積する。分節化されていないウイルスの検出方法と異なり、本発明の方法による分節化されたウイルスの検出は、ウイルス感染に先立ち、またはウイルス感染に加えて、ウイルス蛋白質の細胞内の発現を必要としない。しかしながら、遺伝子改変された細胞がヌクレオカプシド蛋白質のごときウイルス蛋白質をさらに含むならば、レポーターポリペプチドの発現レベルは増強できる。例えば、かかるウイルス蛋白質は、ウイルス蛋白質用のｃＤＮＡに作動可能に連結されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲＮＡポリメラーゼＩＩのごとき)用のプロモーターを各々含む１以上のプラスミドでの細胞のトランスフェクションを介して細胞に供することができる。
【００３２】
もう一つの具体例において、本発明は、生物学的試料における第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出するための組成物および方法を提供する。この具体例の遺伝子改変された細胞は、２つの人工セグメントまたはそれらの相補体を含む。第１の人工セグメントは、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、レポーターポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の３'ＵＴＲを含む。第２の人工セグメントは、第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、レポーターポリペプチドをコードする第２の核酸配列、および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の３'ＵＴＲを含む。第１および第２の人工セグメントの双方について、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、センスまたはアンチセンス配置で有り得、好ましくはアンチセンス配置にある。これらの具体例における細胞は、前記のごとき人工セグメントの転写用の配列に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターを各々含む第１の組換えＤＮＡ分子および第２の組換えＤＮＡ分子のいずれもさらに含むことができる。あるいは、単一の組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の２つのプロモーターを含むことができ、各プロモーターは、前記のごとき２つの人工セグメントのうちの１つの転写のための配列に作動可能に連結される。これらの具体例において、ウイルスは、非限定の例において、アレナウイルス、ブンヤウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスから選択された１対のウイルスのごときいずれかの１対の分節化されたマイナス鎖ウイルスで有り得る。２つのウイルスを含む生物学的試料との接触に際して、レポーター遺伝子を含むｍＲＮＡは各ウイルスの量に比例して形成される。従って、レポーター遺伝子は比例して発現され、生物学的試料のウイルス含量を反映する。例えば、この具体例の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型からのＵＴＲを含む第１の人工セグメント、およびインフルエンザＢ型からのＵＴＲを含む第２の人工セグメントを含むことができ、人工セグメントは、異なったレポーター遺伝子を含む。その細胞と、インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型ウイルスの双方を含む生物学的試料との接触に際して、細胞により作成されたレポーター遺伝子ポリペプチドの量は、その標本におけるウイルス量に比例するであろう。好ましくは、これらの具体例のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドは、光発光ポリペプチドであるか、または光発光基質が利用可能である酵素、好ましくは、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質よりなる群から選択される酵素である。
【００３３】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料における、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスの感染の間の鑑別診断を決定する方法を提供する。該方法は、その生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを接触させることを含み、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの少なくとも１つのＵＴＲおよびポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む。人工セグメントを含む「実質的に複数」の遺伝子改変された細胞は、人工セグメントを含む細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％で有り得る。レポーター遺伝子は、好ましくはアンチセンス配置にある。これらの細胞の人工セグメントの５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲの片方または双方は、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントのＵＴＲ、より好ましくはＮＰセグメントである。レポーター遺伝子ポリペプチドの発現は、インフルエンザウイルスＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存する。好ましい具体例において、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドは、光発光により検出できる蛋白質、例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ蛋白質である。これらの具体例において、細胞集団中のレポーター遺伝子発現の定量的測定は、生物学的試料のウイルス含量：インフルエンザＡ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団が、感染していない対照培養物のそれより実質的に大きな量のレポーター遺伝子産物を生成し、一方、インフルエンザＢ型ウイルスを含む生物学的試料と接触した細胞集団は、感染していない対照培養物よりわずかに大きな量のレポーター遺伝子産物を生成することを明らかにする。いくつかの具体例において、レポーター遺伝子発現の定量分析は、細胞集団で全体として発現されたレポーター遺伝子ポリペプチドの測定を含むことができる。もう一つの具体例において、定量分析は、例えば、レポーター遺伝子およびフローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器を用いて、細胞ごとのベースでレポーター遺伝子ポリペプチドレベルを測定することを含むことができる。かくして、いくつかの具体例において、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型またはどちらでもないウイルスを含むことが知られた試料を用いて、これらのウイルスに応じた培養によりレポーター遺伝子発現レベルを確立できる。これらの発現レベルは、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる生物学的試料により含まれたウイルスのタイプを決定するためのガイダンスを提供できる。例えば、レポーター遺伝子ポリペプチドを発現する細胞のパーセンテージは、そのウイルスのうちの１つに感染した対照培養物を用いて測定されたパーセンテージを反映するであろう。かくして、例えば、その細胞集団と接触した生物学的試料は、大多数の細胞中のレポーターポリペプチドの発現に導く、例えば、少なくとも約８０％の細胞、または少なくとも約９０％の細胞は、インフルエンザＡ型ウイルスを含むと診断でき、一方、その細胞集団と接触した生物学的試料は、少数の細胞、例えば、約１０％の細胞におけるレポーターポリペプチドの発現に導き、インフルエンザＢ型ウイルスを含むと診断することができる。さらに、その細胞集団と接触した生物学的試料は、約３％未満の細胞におけるレポーターポリペプチドの発現に導き、どちらのウイルスも含まないと診断できる。
【００３４】
もう一つの具体例において、本発明は、包装化および単離組換えＤＮＡ分子を含むキットを提供し、単離組換え分子は、その分子でトランスフェクトされた細胞の発現が分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む。この具体例において、単離組換えＤＮＡ分子は、５'から３'の順序にて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含む。この具体例のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列は、センスまたはアンチセンス配向で有り得、好ましくはアンチセンス配向にある。また、この具体例のキットは、前記されたもののごとき分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染に感受性の細胞または細胞集団を含むことができる。その細胞または細胞集団は、単離組換えＤＮＡ分子で感染した遺伝子改変された細胞で有り得る。あるいは、その細胞または細胞集団は、非トランスフェクトで有り得る。キットの使用者は、当業者によく知られた標準的な方法を用いて、そのＤＮＡで細胞または細胞集団をトランスフェクトし、次いで、そのトランスフェクトした細胞を用いて、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を測定できる。トランスフェクションは、Sambrookら、前記に記載されたもののごとき当業者によく知られた標準的手順により行うことができる。
【００３５】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの増殖または遺伝子発現に指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法を提供する。そのウイルスは、好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスのごときインフルエンザウイルスである。定量的スクリーニング方法は、 (ａ）候補抗ウイルス化合物と、(i)前記のレポーター遺伝子ポリペプチドのコード化した配列を含む人工セグメントおよび(ii)分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むタンパク質複合体を含む遺伝子改変された細胞または細胞集団とを接触させ、次いで、(ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む。ある具体例において、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むタンパク質複合体は、１以上の核酸により細胞または細胞集団において提供でき、各核酸は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製複合体の少なくとも１つのポリペプチド成分をコードする。他の具体例において、タンパク質複合体は、そのウイルスでの細胞の感染、またはウイルスＲＮＡでの細胞のトランスフェクションにより細胞に提供できる。候補抗ウイルス化合物の効力は、その化合物と接触した細胞または細胞集団のレポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルをその化合物と接触しない対照の細胞または細胞集団のそれに比較することにより決定される。レポーター遺伝子ポリペプチドの発現レベルは、細胞により発現されたレポーター遺伝子ポリペプチドの合計量の測定により決定できる。いくつかの具体例において、レポーター遺伝子ポリペプチドの発現は、レポーター遺伝子ポリペプチドを発現する細胞のパーセンテージの測定により決定できる。非限定の例において、レポーター遺伝子ポリペプチドがＧＦＰまたはルシフェラーゼのいずれかである場合、フローサイトメトリーを用いて、細胞数−対−レポーター遺伝子ポリペプチド発現レベルの２次元プロットを提供できる。標準的な分析技術を用いて、候補化合物の効力を決定でき、例えば、集めたデータを用いて、候補化合物のレポーター遺伝子発現(ＥＤ５０)の５０％の低下を供する有効用量を決定できる。この定量的スクリーニング方法は、迅速な結果を提供し、実施するのは簡単である。
【００３６】
もう一つの具体例において、本発明は、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についてのウイルス生成アッセイ（viral yield assay）を提供する。この具体例において、第１の細胞(または細胞集団)は、候補抗ウイルス化合物と接触する。また、第１の細胞はウイルスに感染する。第１の細胞は、ウイルスによる増殖感染に感受性であるタイプである。次いで、細胞または細胞集団によるウイルスの生成は、候補抗ウイルス化合物との感染および接触後、第１の細胞または細胞集団により生成されたウイルスの試料(もしあれば)を含む生成試料を用いて測定される。その化合物の抗ウイルスの活性は、生成試料と、第２の細胞(または細胞集団)とを接触させることにより決定され、ここに、第２の細胞または細胞集団は、発現が前記のごとく、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内における存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞または細胞集団である。(対照と比較した)レポーター遺伝子の発現レベルの低下は、候補抗ウイルス化合物による抗ウイルス活性を示す。
【００３７】
以下の実施例は、例示的な目的だけに提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。その実施例は、本発明についてのより良好な理解およびその利点のより良好な認識を可能にするであろう。
【００３８】
実施例１
本実施例は、プラスミドｐＨＨ２１ ＮＰ ＵＴＲ ＨＩルシフェラーゼの構造および機能化を示す。
【００３９】
このプラスミド(図１)は、インフルエンザA/ＷＳＮ/３３のセグメント５のＵＴＲにより隣接して挟まれたルシフェラーゼＯＲＦをコードする。このプラスミドを含む細胞において、転写は、プラスミドがＰｏｌ Ｉにより転写される場合、ネガティブまたはゲノムのセンスＲＮＡ転写体が生成されるように、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーターにより制御される。このプラスミドにおいて、ルシフェラーゼ・レポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩ発現ベクターにより含まれたインフルエンザＡ型ウイルスＮＰセグメントのｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを交換する(plasmid pHH21 ; Neumann, G.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 9345-9350,1999 ; Neumann,G.ら, Virology 202: 477-479,1994)。そのプラスミドの機能領域に対応するヌクレオチド配列を示す。このプラスミドでトランスフェクトし、インフルエンザＡ型ウイルスに感染した細胞は、ルシフェラーゼを発現できる。同様に、このプラスミドでトランスフェクトし、さらにウイルス蛋白質ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞も、ルシフェラーゼを発現できる。
【００４０】
実施例２
この実施例はインフルエンザＡ型ウイルス検出プロセスを示す。
【００４１】
この実施例(図２)において、トランスフェクトした細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩ酵素を用いて、ネガティブまたはゲノムのセンスＲＮＡ転写体を生成する。インフルエンザＡ型ウイルスでの感染またはインフルエンザＡ型ウイルスのポリメラーゼ複合体の発現に際して、転写体は、全長のポジティブセンスＲＮＡまたは５’キャップされたポリアデニル化ｍＲＮＡに複製される。ポジティブセンスＲＮＡを複製して、さらなるウイルスネガティブセンスＲＮＡを形成し、一方、そのｍＲＮＡを宿主細胞機構によりレポーター蛋白質に翻訳する。ルシフェラーゼ・レポーターポリペプチドは、当該技術分野において知られた標準的な方法により検出および定量できる。
【００４２】
実施例３
この実施例はインフルエンザＡ型ウイルス検出手順を示す。
【００４３】
この手順において、細胞をそのｐＨＨ２１ルシフェラーゼまたは同様のプラスミドでトランスフェクトする(図３)。次いで、細胞を安定的にトランスフェクトした亜集団について選択するか、または直接的に用いることができる。次いで、生物学的試料(例えば、臨床検査試料またはウイルス試料)を検出可能なシグナルの生成に十分であると期待される期間細胞と共にインキュベートする。インキュベーション時間は少なくとも約６時間で有り得る。好ましくは、そのインキュベーション時間は、少なくとも約６時間から約１４日まで、少なくとも約６時間から約１２０時間まで、または少なくとも約６時間から約２４時間までで有り得る。試料に対する曝露後、その細胞を当該技術分野において知られた標準的な方法によりレポーター遺伝子ポリペプチドの発現について分析する。
【００４４】
実施例４
この実施例は、人工のインフルエンザＡ型セグメントからのレポーター遺伝子の発現を示す。
【００４５】
この実施例において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、そのＮＰセグメントからのＵＴＲを含むヒトＲＮＡポリメラーゼＩ発現ベクターｐＨＨ２１におけるＮＰオープンリーディングフレームに代えて、クローン化した。得られたプラスミドのｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃは、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体により転写できる機能的なインフルエンザウイルス人工セグメントＲＮＡを発現させ、それにより、ウイルス感染の存在下、ルシフェラーゼ発現を可能とする。ヒト２９３Ｔ細胞をｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃでトランスフェクトし、５の感染多重度(ＭＯＩ)にてインフルエンザウイルス株ＷＳＮ/３３でトランスフェクトさせたか、またはインフルエンザウイルス複製およびヌクレオカプシド蛋白質(ウイルスポリペプチドＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰを各々コードするｐＰＡ、ｐＰＢl、ｐＰＢ２およびｐＮＰ)用の発現ベクターで共トランスフェクトさせた。トランスフェクションの４２時間後(または、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃ単独でトランスフェクトした細胞については、インフルエンザウイルスによる感染の１８時間後）に、細胞を溶解し、GLOWキット(Promega, Madison WI)を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性につきアッセイした。感染の不存在下のそのプラスミドでのトランスフェクションは、１６,０００を超えるのシグナル対ノイズの非常に高いシグナル(＞２×１０６ ＬＣＰＳ)を生じさせた(図４、第３レーン)。しかしながら、人工セグメント(ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ｌｕｃ）を含むプラスミドだけでトランスフェクトした細胞のウイルス感染も、レポーター遺伝子発現を促すのに十分であった(図４、第２レーン)。
【００４６】
実施例５
この実施例は、インフルエンザＡ型ウイルス活性の指標としてのＧＦＰレポーター遺伝子を示す。
【００４７】
蛍光ベースの読取りを用いたインフルエンザＡ型ウイルス活性についてのスクリーニングを促すために、インフルエンザウイルスＡ/ＷＳＮ/３３のＮＰセグメントのＵＴＲにより隣接して挟まれたＧＦＰオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡを構築した。このｃＤＮＡを、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーターを介して、人工セグメント、ＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰの転写を駆動するそのｐＨＨ２１ベクターにクローン化した。２９３Ｔ細胞をＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をインフルエンザＡ型ウイルスに感染させた。感染の１８時間後、細胞をＧＦＰ発現につき分析した。多量のＧＦＰが、ウイルス感染細胞の１００％に存在した (図５Ａ；黒色、満たされたヒストグラム)が、偽感染させた細胞は、ほとんどないまたは全くＧＦＰを発現しなかった(図５Ａ；白色、破線ヒストグラム)。これらのデータは、ＮＰ ＵＴＲ-ＧＦＰを発現している細胞におけるＧＦＰの感染依存性の生成を示す。この感染依存性の方法は、ウイルス検出系を可能とする。
【００４８】
このレポーター遺伝子構築体が、感染に独立したプロセスにおいて機能できるかを決定するために、２９３Ｔ細胞を、ｐＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰと共に、ＲＮＡ複製および転写(ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰ)に必要なインフルエンザＯＲＦを発現するプラスミドでトランスフェクトした。外因性のＯＲＦを含まないプラスミドは、対照としてトランスフェクションに含まれた。４つのウイルスのポリメラーゼ蛋白質のすべてをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞の中で、ＧＦＰは、細胞の約３５％で検出され(図５Ｂ、黒色、満たされたヒストグラム)、一方、４つのウイルスのポリメラーゼ発現プラスミドのうちの３つだけでトランスフェクトした細胞は、ＧＦＰのかなりの発現を示さなかった(図５Ｂ、白色、破線ヒストグラム)。これらのデータは、ＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰからのＧＦＰレポーター遺伝子活性が感染に独立したアッセイにおいて検出可能であることを示す。かくして、図３におけるデータは、ポリメラーゼが感染またはトランスフェクションにより送達されるかのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を定量するためのツールとしてのインフルエンザＡ型ウイルスＵＴＲにより隣接して挟まれたレポーター遺伝子の使用を示す。
【００４９】
実施例６
この実施例は、インフルエンザＣ型ウイルスではなくインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスによるレポーター遺伝子発現の誘導を示す。
【００５０】
インフルエンザＡ型ウイルスＮＰ-ＵＴＲ-ＧＦＰ転写体が、オルソミクソウイルスの他のメンバーのポリメラーゼ複合体により認識できるかを決定するために、ｐＨＨ２１ＮＰＵＴＲ-ＧＦＰトランスフェクトした細胞を、インフルエンザＡ型(ＷＳＮ/３３株)、インフルエンザＢ型(Yamagata/５９株)またはインフルエンザＣ型(Jerusalem/９９株)に感染させた。インフルエンザＡ型/ＷＳＮ/３３の感染細胞は、９９％を超えるＧＦＰポジティブ細胞を示し、一方、インフルエンザＢ/Yamagata/５９はわずか９.８％のＧＦＰポジティブ細胞を示した。さらに、ＧＦＰポジティブインフルエンザA/ＷＳＮ/３３-感染細胞における平均チャネル蛍光は２９６３であり、一方、インフルエンザB/Yamagata/５９-感染細胞における対応する集団は、わずか８８の平均チャネル蛍光を有した。これらのデータは、ＧＦＰレポーターがインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞において高度に発現されるが、インフルエンザＢ型ウイルス感染細胞においてはそれが単にわずかに発現されることを示す。偽感染およびンフルエンザＣ型感染した培養物の双方は、２.５％のＧＦＰのポジティブ細胞を有し、それはそのレポーターがインフルエンザＣ型感染細胞において発現されなかったことを示す。これは、ＮＰ ＵＴＲ ＧＦＰ転写体がインフルエンザＣ型ウイルスポリメラーゼ複合体により認識も転写もされなかったことを示唆する。このアッセイを診断的に用いて、生物学的試料、例えば、インフルエンザの症状を示すヒト患者からの血液試料がインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスまたはどちらでもないウイルスを含むかどうかを決定できる。
【００５１】
本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が、前記の方法および組成物に行うことができるので、前記の記載に含まれたすべての内容は例示として解釈され、限定する意味に解釈されるものではないことを意図する。
【００５２】
本明細書に引用されたすべての引用文献は、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。本明細書の引用文献の説明は、それらの著者によりなされた主張を単に概括することを意図し、いずれの参考文献も特許性に関連する先行技術を構成するという承認はなされていない。出願人は、引用された参考文献の正確さおよび適切さを試みるための権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、プラスミドｐＨＨ２１ ＮＰ ＵＴＲ ＨＩルシフェラーゼの地図を示す。
【図２】図２は、人工セグメントを用いるインフルエンザＡ型ウイルス検出を示す。
【図３】図３は、インフルエンザＡ型ウイルス検出手順のブロックダイヤグラムを示す。
【図４】図４は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからのＵＴＲおよびルシフェラーゼＯＲＦを含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞によるホタルルシフェラーゼ発現を示す。
【図５】図５は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントからのＵＴＲおよびＧＦＰ ＯＲＦを含む人工セグメントを含む遺伝子改変された細胞による緑色蛍光タンパク質発現を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、そのポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分子が、人工セグメントまたはその相補体であり、人工セグメントが、さらにセグメントの５'ＵＴＲおよびセグメントの３'ＵＴＲを含み、ここに、該５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲのうちの少なくとも１つは、ウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
５'ＵＴＲを含む人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量の検出が、ポリペプチドにより発光された光量子シグナルの不存在、存在または量を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、該ポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ分子が、５'から３'の順序にて、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
人工セグメントをコード化するＤＮＡ配列；および
転写終結部位を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
人工セグメントをコードするＤＮＡ配列が、人工セグメントの転写がアンチセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
人工セグメントをコード化するＤＮＡが、人工セグメントの転写がセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結される請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
人工セグメントが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、レポーター遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含み、ここに、３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つは、生物学的試料を含むことが疑われるウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントのＵＴＲであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
分節化されたマイナス鎖ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されるウイルスであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼβ-よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２１】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩの転写終結シグナルであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される感染細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２６】
生物学的試料中のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびいずれでもないウイルス感染間の鑑別診断を決定する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを接触させ、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、ここに、該ポリペプチドの発現は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで
ｂ）遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現を測定することを特徴とする該方法。
【請求項２７】
組換えＲＮＡが、インフルエンザＡ型ウイルスの人工セグメントであり、人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよびインフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、レポーター遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを決定することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、平均シグナル強度を決定することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ポリペプチドまたはＧＦＰレポーター遺伝子ポリペプチドからの光量子シグナルを測定することを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子が、センス配向にあることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子が、アンチセンス配向にあることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約５０％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約７５％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約９０％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、該細胞が、第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し、ならびに第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在もしくは量、または第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在もしくは量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項３９】
第１の組換えＲＮＡ分子が、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよび第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３'ＵＴＲを含む第１の人工セグメントであって、第２の組換えＲＮＡ分子が、第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３'ＵＴＲを含む第２の人工セグメントであることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子が各々、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼβ-よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４２】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子が各々、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームが、アンチセンス配向にあることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームが、センス配向にあることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞、またチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞である請求項３８記載の方法。
【請求項４６】
第１もしくは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、その発現が第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＤＮＡ分子、ならびにその発現が第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ；次いで、
ｂ）第１および第２のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項４７】
第１の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第１の人工セグメント；
ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含み、
第２の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｆ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｇ）第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第２の人工セグメント；および
ｈ)ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の各プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の各転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
各転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
各転写終結部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ終止部位であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１の転写開始部位；
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の５'ＵＴＲおよび第１の３'ＵＴＲならびに第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第１の人工セグメントをコードする第１のＤＮＡ配列；
第１の転写終結部位；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２の転写開始部位；
第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の５'ＵＴＲおよび第２の３'ＵＴＲならびに第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第２の人工セグメントをコードする第２のＤＮＡ配列；ならびに
第２の転写終結部位を含む組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５６】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される感染細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５７】
使用説明書および単離された組換えＤＮＡ分子を含み、ここに、該単離された組換えＤＮＡ分子は、その分子でトランスフェクトした細胞における発現が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む、分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出するためのキット。
【請求項５８】
単離組換えＤＮＡ分子が、５'から３'の順序にて:
ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列を含む人工セグメントをコード化する配列；および
ｄ)ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位
を含む請求項５７記載のキット。
【請求項５９】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択される請求項５７記載のキット。
【請求項６０】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターである請求項５７記載のキット。
【請求項６１】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位である請求項５７記載のキット。
【請求項６２】
人工セグメントが、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡをさらに含む請求項５７記載のキット。
【請求項６３】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡの少なくとも１つが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントのＵＴＲのｃＤＮＡである請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする請求項５７記載のキット。
【請求項６５】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択される請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、アンチセンス配向にある請求項５７記載のキット。
【請求項６７】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、センス配向にある請求項５７記載のキット。
【請求項６８】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写終結シグナルである請求項５７記載のキット。
【請求項６９】
転写終結シグナルが、リボザイム配列を含む請求項５７記載のキット。
【請求項７０】
キットが、さらに脊椎動物細胞を含む請求項５７記載のキット。
【請求項７１】
脊椎動物細胞が、哺乳動物細胞である請求項５７記載のキット。
【請求項７２】
脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される請求項７１記載のキット。
【請求項７３】
単離組換えＤＮＡ分子が、脊椎動物細胞により含まれる請求項７２記載のキット。
【請求項７４】
脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される請求項８０記載のキット。
【請求項７５】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法であって、
ａ）候補抗ウイルス化合物と、遺伝子改変された細胞または細胞集団とを接触させ、ここに、該細胞または細胞集団は、その発現がそのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、さらに分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含み；次いで、
ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出する
ことを特徴とする該方法。
【請求項７６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７７】
組換えＲＮＡ分子が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲおよび分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲをさらに含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７８】
人工セグメントの５'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項７６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７９】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項７６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８０】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８１】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択され、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの量の検出が、ポリペプチドまたはその基質により発光された光量子シグナルの量による検出を含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８２】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が、組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含む請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞であることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８５】
候補抗ウイルス化合物と、そのウイルスによる増殖感染に感受性である第１の細胞とを接触させ；
第１の細胞を分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで感染させ、それにより生成試料を供し；
第２の細胞とその生成試料とを接触させ、ここに、第２が、その発現が該ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み；次いで、
第２の細胞により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む、
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗−ウイルス薬のための定量的スクリーニング方法。
【請求項８６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８７】
組換えＲＮＡ分子が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲおよび分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲをさらに含む人工セグメントであることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８８】
人工セグメントの５'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項８６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８９】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項８６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９０】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９１】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択され、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの量の検出が、ポリペプチドまたはその基質により発光された光量子シグナルの量による検出を含むことを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９２】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が、組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含む請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞であることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項１】
ウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、そのポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分子が、人工セグメントまたはその相補体であり、人工セグメントが、さらにセグメントの５'ＵＴＲおよびセグメントの３'ＵＴＲを含み、ここに、該５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲのうちの少なくとも１つは、ウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
５'ＵＴＲを含む人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量の検出が、ポリペプチドにより発光された光量子シグナルの不存在、存在または量を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、該ポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ分子が、５'から３'の順序にて、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
人工セグメントをコード化するＤＮＡ配列；および
転写終結部位を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
人工セグメントをコードするＤＮＡ配列が、人工セグメントの転写がアンチセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
人工セグメントをコード化するＤＮＡが、人工セグメントの転写がセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結される請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
人工セグメントが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、レポーター遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含み、ここに、３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つは、生物学的試料を含むことが疑われるウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントのＵＴＲであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
分節化されたマイナス鎖ウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されるウイルスであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼβ-よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２１】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩの転写終結シグナルであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される感染細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２６】
生物学的試料中のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびいずれでもないウイルス感染間の鑑別診断を決定する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを接触させ、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、ここに、該ポリペプチドの発現は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで
ｂ）遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現を測定することを特徴とする該方法。
【請求項２７】
組換えＲＮＡが、インフルエンザＡ型ウイルスの人工セグメントであり、人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよびインフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、レポーター遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを決定することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、平均シグナル強度を決定することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現の測定が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ポリペプチドまたはＧＦＰレポーター遺伝子ポリペプチドからの光量子シグナルを測定することを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子が、センス配向にあることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子が、アンチセンス配向にあることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約５０％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約７５％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
実質的に複数の遺伝子改変された細胞が、細胞の少なくとも約９０％を占めることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、該細胞が、第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し、ならびに第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在もしくは量、または第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在もしくは量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項３９】
第１の組換えＲＮＡ分子が、第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよび第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３'ＵＴＲを含む第１の人工セグメントであって、第２の組換えＲＮＡ分子が、第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ、第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの３'ＵＴＲを含む第２の人工セグメントであることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子が各々、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼβ-よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４２】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子が各々、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質よりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームが、アンチセンス配向にあることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームが、センス配向にあることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞、またチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞である請求項３８記載の方法。
【請求項４６】
第１もしくは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、その発現が第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＤＮＡ分子、ならびにその発現が第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ；次いで、
ｂ）第１および第２のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項４７】
第１の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第１の人工セグメント；
ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含み、
第２の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｆ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｇ）第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第２の人工セグメント；および
ｈ)ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが各々、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の各プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の各転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
各転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
各転写終結部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ終止部位であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１の転写開始部位；
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の５'ＵＴＲおよび第１の３'ＵＴＲならびに第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第１の人工セグメントをコードする第１のＤＮＡ配列；
第１の転写終結部位；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２の転写開始部位；
第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の５'ＵＴＲおよび第２の３'ＵＴＲならびに第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第２の人工セグメントをコードする第２のＤＮＡ配列；ならびに
第２の転写終結部位を含む組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５６】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される感染細胞であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５７】
使用説明書および単離された組換えＤＮＡ分子を含み、ここに、該単離された組換えＤＮＡ分子は、その分子でトランスフェクトした細胞における発現が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む、分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出するためのキット。
【請求項５８】
単離組換えＤＮＡ分子が、５'から３'の順序にて:
ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列を含む人工セグメントをコード化する配列；および
ｄ)ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位
を含む請求項５７記載のキット。
【請求項５９】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択される請求項５７記載のキット。
【請求項６０】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターである請求項５７記載のキット。
【請求項６１】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位である請求項５７記載のキット。
【請求項６２】
人工セグメントが、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡをさらに含む請求項５７記載のキット。
【請求項６３】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、および分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡの少なくとも１つが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントのＵＴＲのｃＤＮＡである請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする請求項５７記載のキット。
【請求項６５】
ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択される請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、アンチセンス配向にある請求項５７記載のキット。
【請求項６７】
レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列が、センス配向にある請求項５７記載のキット。
【請求項６８】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写終結シグナルである請求項５７記載のキット。
【請求項６９】
転写終結シグナルが、リボザイム配列を含む請求項５７記載のキット。
【請求項７０】
キットが、さらに脊椎動物細胞を含む請求項５７記載のキット。
【請求項７１】
脊椎動物細胞が、哺乳動物細胞である請求項５７記載のキット。
【請求項７２】
脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される請求項７１記載のキット。
【請求項７３】
単離組換えＤＮＡ分子が、脊椎動物細胞により含まれる請求項７２記載のキット。
【請求項７４】
脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択される請求項８０記載のキット。
【請求項７５】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法であって、
ａ）候補抗ウイルス化合物と、遺伝子改変された細胞または細胞集団とを接触させ、ここに、該細胞または細胞集団は、その発現がそのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、さらに分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含み；次いで、
ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出する
ことを特徴とする該方法。
【請求項７６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７７】
組換えＲＮＡ分子が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲおよび分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲをさらに含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７８】
人工セグメントの５'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項７６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項７９】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項７６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８０】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８１】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択され、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの量の検出が、ポリペプチドまたはその基質により発光された光量子シグナルの量による検出を含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８２】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が、組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含む請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞であることを特徴とする請求項７５記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８５】
候補抗ウイルス化合物と、そのウイルスによる増殖感染に感受性である第１の細胞とを接触させ；
第１の細胞を分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで感染させ、それにより生成試料を供し；
第２の細胞とその生成試料とを接触させ、ここに、第２が、その発現が該ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み；次いで、
第２の細胞により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む、
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗−ウイルス薬のための定量的スクリーニング方法。
【請求項８６】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８７】
組換えＲＮＡ分子が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲおよび分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲをさらに含む人工セグメントであることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８８】
人工セグメントの５'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項８６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項８９】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項８６記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９０】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９１】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択され、レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの量の検出が、ポリペプチドまたはその基質により発光された光量子シグナルの量による検出を含むことを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９２】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９３】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が、組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含む請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【請求項９４】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されるトランスフェクト細胞であることを特徴とする請求項８４記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２４４０４（Ｐ２００７−５２４４０４Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８１３６（Ｐ２００６−５３８１３６）
【出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３５１６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４９８６
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５９７０２５８０６）ワシントン・ユニバーシティ (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【出願人】（５０６１５１４６４）アパス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＡＴＨ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３５１６８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４９８６
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５９７０２５８０６）ワシントン・ユニバーシティ (26)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【出願人】（５０６１５１４６４）アパス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＡＴＨ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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