本発明は、本発明は、切断ＨＣＶ ＮＳ５ポリペプチド、およびＨＣＶポリタンパク質の別の領域に由来する少なくとも１種の他のＨＣＶエピトープに融合されるこの切断ＮＳ５ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。この融合体は、ＨＣＶに対する免疫応答（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞が挙げられるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）特異的Ｔ細胞を活性化するような、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答）を刺激する方法に使用され得る。この方法は、ＨＣＶ特異的な免疫原性組成物を開発するモデル系において使用され得、そしてＨＣＶに対して哺乳動物を免疫化するために使用され得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ） ポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、切断ＨＣＶ ＮＳ５ポリペプチドおよびこの切断ＮＳ５ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。このタンパク質は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）しそして／または活性化するために免疫応答（例えば、細胞媒介性免疫応答）を刺激するのに有用であり、そして診断用試薬として有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界中の人口の約１％がこのウイルスに感染する、重大な健康上の問題である。急性感染した個体の７５％超は、最終的に、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌を生じ得る慢性的なキャリア状態に進む。非特許文献１； 非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶは、最初に、ＨｏｕｇｈｔｏｎらによってＮＡＮＢＨの原因として同定されそして特徴付けられた。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法と同様に公知である。例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂの＋（センス）鎖の、一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、そしてフラビウイルス科のウイルスのメンバーである。少なくとも６つの、異なるが関連した遺伝子型のＨＣＶが、系統発生解析に基づいて同定された（非特許文献５）。このウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。このポリタンパク質は、翻訳と同時および翻訳後に、構造タンパク質ならびに非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００４】
特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断産物の順序および名称は、以下のようなものである：ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。このポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア（ｃｏｒｅ）」と称される）および２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知である）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知である））、およびウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を生じさせる宿主のプロテアーゼによって触媒される。これらのＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と称される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、そしてＮＳ３との組み合わせにおいて、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を生じる。このＮＳ３プロテアーゼが機能して、残りのポリタンパク質をプロセシングする。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を生じさせる。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３−ＮＳ４ａ連結における自己触媒的な切断によって開始され、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される。
【０００５】
ＨＩＶのような特定のウイルスに対する薬剤の開発における大きな進歩にもかかわらず、急性ＨＣＶ感染および慢性ＨＣＶ感染の制御は、限られた成果しか有さなかった（非特許文献９）。特に、細胞性免疫応答（例えば、強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答）の発生は、ＨＣＶ感染の制御および撲滅のために重要であると考えられる。
【０００６】
細胞性免疫応答を発生させ得る免疫原性ＨＣＶ融合タンパク質は、特許文献４および特許文献５；特許文献６および特許文献７に記載される。それにもかかわらず、ＨＣＶに対する免疫応答（例えば、細胞性免疫応答）を刺激するさらに有効な方法に対する必要性が、当該分野において存在し続ける。
【特許文献１】国際公開第８９／０４６６９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／１１０８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１４４３６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／００５４７３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第６，５６２，３４６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，５１４，７３１号明細書
【特許文献７】米国特許第６，４２８，７９２号明細書
【非特許文献１】Ａｌｔｅｒら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９２年、第３２７巻、ｐ．１８９９−１９０５
【非特許文献２】ＲｅｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ．、「Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｍ．Ｍｅｄ．」、１９９３年、第１５３巻、ｐ．１６７２−１６７７
【非特許文献３】Ｓｅｅｆｆ、「Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．」、１９９５年、第６巻、ｐ．２０−２７
【非特許文献４】Ｔｏｎｇら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９５年、第３３２巻、ｐ．１４６３−１４６６
【非特許文献５】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」、１９９３年、第７４巻、ｐ．２３９１−２３９９
【非特許文献６】Ｃｈｏｏら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２
【非特許文献７】Ｃｈｏｏら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９１年、第８８巻、ｐ．２４５１−２４５５
【非特許文献８】Ｈａｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９１年、第８８巻、ｐ．１７１１−１７１５
【非特許文献９】Ｈｏｏｆｎａｇｌｅおよびｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９７年、第３３６巻、ｐ．３４７−３５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的は、ＨＣＶポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を初回刺激しそして／または活性化するようなＨＣＶに対する免疫応答（例えば、細胞性免疫応答）を刺激するための試薬および方法を提供することである。本発明の目的はまた、ＨＣＶ感染の防止および／または処置のための組成物を提供することである。本発明の目的はまた、生物学的サンプル中のＨＣＶの存在を検出するための診断用アッセイにおいて使用する試薬および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、１つの実施形態において、本発明は、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドに関し、このポリペプチドは、全長ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドのＮ末端部分を含む。特定の実施形態において、このポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２５００とＣ末端との間の位置にて（例えば、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた、アミノ酸２９００とＣ末端との間か、または全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２９９０の直後のアミノ酸に対応するアミノ酸にて）切断される。
【０００９】
さらなる実施形態において、上記ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる。
【００１０】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の実施形態のいずれかのＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドおよびＮＳ５領域以外のＨＣＶポリタンパク質の領域に由来する少なくとも１種のポリペプチドを含む、免疫原性融合タンパク質に関する。
【００１１】
なおさらなる実施形態において、上記タンパク質は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む改変ＮＳ３ポリペプチドをさらに含むことによって、改変ＮＳ３ポリペプチドがＨＣＶ融合タンパク質中に存在する場合に、プロテアーゼ活性が阻害される。特定の実施形態において、この改変ＮＳ３ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含む。
【００１２】
さらなる実施形態において、上記タンパク質は、改変ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、および必要に応じてＨＣＶｃｏｒｅポリペプチドを含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、上記ｃｏｒｅポリペプチドは、Ｃ末端の切断を含む。特定の実施形態において、このｃｏｒｅポリペプチドは、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列からなる。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、上記融合タンパク質は、Ｅ２ポリペプチドをさらに含む。特定の実施形態において、このＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５に対応するアミノ酸配列からなるＣ末端切断Ｅ２ポリペプチドである。
【００１５】
さらなる実施形態において、上記融合体中に存在する上記ポリペプチドの各々は、同じＨＣＶ単離物に由来する。他の実施形態において、上記融合体中に存在する上記ポリペプチドの少なくとも１種は、上記Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドと異なる単離物に由来する。
【００１６】
なおさらなる実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、本質的に以下からなる免疫原性融合タンパク質に関する：
（ａ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含むことによって、プロテアーゼ活性が阻害される、改変ＮＳ３ポリペプチド；
（ｂ）ＮＳ４ポリペプチド；
（ｃ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド；および
（ｄ）必要に応じて、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチド。
【００１７】
なおさらなる実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、本質的に以下からなる免疫原性融合タンパク質に関する：
（ａ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５に対応するアミノ酸配列からなるＣ末端切断Ｅ２ポリペプチド；
（ｂ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含むことによって、プロテアーゼ活性が阻害される、改変ＮＳ３ポリペプチド；
（ｃ）ＮＳ４ポリペプチド；
（ｄ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド；および
（ｅ）必要に応じて、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチド。
【００１８】
特定の実施形態において、上記の融合タンパク質は、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、このｃｏｒｅポリペプチドは、ｃｏｒｅポリペプチドが図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列から構成されるように、Ｃ末端の切断を含む。
【００１９】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上記の実施形態のいずれかに従うＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチド、または上記の実施形態のいずれかに従う融合タンパク質を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含有する組成物に関する。特定の実施形態において、この組成物は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体のよう免疫原性ＨＣＶポリペプチドを含有する。このＥ１Ｅ２複合体は、ＮＳ５ポリペプチドまたはＮＳ５ポリペプチドを含む融合タンパク質とは、別個に提供され得る。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体中の細胞性免疫応答を刺激する方法であって、上に記載される組成物の治療有効量をこの被験体に投与する工程を包含する方法に関する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、組成物を生成するための方法であって、上記の実施形態のいずれかに従うＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドまたは上記の実施形態のいずれかに従う免疫原性融合タンパク質と、薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合わせる工程を包含する方法に関する。
【００２２】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上記の実施形態のいずれかに従うＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドをコードするか、または上記の実施形態のいずれかに従う免疫原性融合タンパク質をコードするコード配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む組換えベクターに関する：
（ａ）上に記載されるようなポリヌクレオチド；および
（ｂ）コード配列が宿主細胞中で転写され、そして翻訳され得るために、このポリヌクレオチドに作動可能に連結される少なくとも１つの制御エレメント。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、上に記載されるような組換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、免疫原性Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドまたはこのポリペプチドを含む免疫原性融合タンパク質を産生するための方法であって、これらのタンパク質を産生するための条件下で上に記載されるような宿主細胞の集団を培養する工程を包含する方法に関する。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣＶのＮＳ５ポリペプチドの産生を増強するための方法であって、この方法は、このタンパク質を産生するための条件下で上に記載されるような宿主細胞の集団を培養する工程を包含する方法に関し、ここでこのタンパク質は、同じ条件下で産生される全長ＮＳ５ポリペプチドの量と比較して、より多い量で産生される。
【００２７】
当業者は、本明細書中の開示を考慮して、本発明のこれらの実施形態および他の実施形態に容易に想到する。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、特に明記されない限り、当業者の技術の範囲内の従来の化学的方法、生物化学的方法、組換えＤＮＡ技術による方法および免疫学的方法を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈中で明らかに別のものを示さない限り、複数形が含まれることを留意しなければならない。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」には、２種以上のこのようなポリペプチドの混合物などが含まれる。
【００３０】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３１】
（１．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下で示すように定義されることを意図する。
【００３２】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の長さの下限に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、および多量体などは、この定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然の配列の改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般に、本質的に保存的である））を含むタンパク質をいう。これらの改変は部位特異的変異誘発による意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによる偶然のものであってもよい。
【００３３】
ＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質に由来する、上に定義されるようなポリペプチドである。このポリペプチドは、物質的にＨＣＶに由来することを必要としないが、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれか、およびＳｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）、７４：２３９１−２３９９に記載されるＨＣＶの６種の遺伝子型のいずれかを有する単離物（例えば、株１、株２、株３、株４など）を含む単離物、ならびに新たに同定された単離物およびこれらの単離物のサブタイプ（例えば、ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂなど）に由来し得る。これらの株の間の多くの保存領域および可変領域は、公知であり、そして一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が並列された場合に、高度の配列相同性（例えば、３０％を超える（好ましくは、４０％を超える）アミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ５」ポリペプチドとは、種々のＨＣＶ株、ならびに以下でさらに定義されるようなＮＳ５アナログ、ＮＳ５ムテインおよびＮＳ５免疫原性フラグメントのいずれかに由来するネイティブなＮＳ５をいう。
【００３４】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、以下に定義されるような、参照分子の生物学的に活性な誘導体、または所望の活性（例えば、細胞性免疫応答を刺激する能力）を保持するこのような誘導体のフラグメントをいう。改変ＮＳ３の場合において、「アナログ」または「ムテイン」とは、そのネイティブはタンパク質分解活性を欠くＮＳ３分子をいう。一般的に、用語「アナログ」とは、ネイティブな分子に対する１個以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に、本質的に保存的であるか、または改変ＮＳ３の場合においては、活性なタンパク質分解部位において本質的に非保存的である）および／または削除を（これらの改変が免疫原活性を破壊しない限り）含む、ネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、１種以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくともネイティブな分子と同一の免疫学的応答性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３５】
上記で説明される通り、アナログは、一般的に、天然において保存的な置換（すなわち、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的には、アミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、ときとして、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、または同様の、構造的に関連するアミノ酸とのアミノ酸の保存的置換は、生物活性に大きな影響を与えないことが容易に予想される。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらに約１５〜２５個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、変化を許容し得る、目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３６】
「Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド」は、全長ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドのＮ末端部分を含むが、ＮＳ５ｂ領域全体を含まないＮＳ５ポリペプチドを意味する。Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドの具体的な例は、以下に提供される。
【００３７】
「改変ＮＳ３」は、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性が破壊されるような改変を有するＮＳ３ポリペプチドを意味する。この改変は、ネイティブな分子に対する１個以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に、本質的に非保存的である）および／または欠失を包含し得、この改変において、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、破壊される。プロテアーゼ活性を測定する方法は、以下でさらに議論される。
【００３８】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端の削除、および／またはＮ末端の欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを定義する全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むが、但し、目的のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイによって測定されるような免疫原性活性を保持する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約３〜５個、好ましくは約５〜１０個または１５個、および約１，０００個以下（またはその間の任意の整数）のアミノ酸の配列であって、それ自体の配列またはより大きな配列の一部を定義し、このような配列に対する応答において産生される抗体に結合する配列をいう。フラグメントの長さの上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、ＨＣＶポリタンパク質由来の２種以上のエピトープを含む融合タンパク質ですら含み得る。本発明で使用するためのエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常に不安定な状態であり、単離物の間の比較的高い可変性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、ネイティブな配列と同一の配列、ならびに欠失、付加、および置換（一般的に、本質的に保存的である）のようなネイティブな配列に対する改変配列を包含する。
【００４０】
エピトープを含む所与のポリペプチド領域は、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編、１９９６）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮｅｗＪ ｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（タンパク質分子の一部に対応するペプチド）を同時に合成し、そしてこれらのペプチドが、なお支持体に結合している間に、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載される。同様に、高次構造的なエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などによるアミノ酸の空間的コンホメーションの決定によって容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前出を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性プロットおよびハイドロパシープロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから利用可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算したものなど）を使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）、７８：３８２４−３８２８）およびハイドロパシープロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）、１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００４１】
種々のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）、８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）、８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号；および米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、ペプチド構造または結合したハプテンに対するＴ細胞免疫を誘導し得る、ペプチド構造の特徴をいう。Ｔ細胞エピトープは、一般的に、ＭＨＣ分子のペプチドが結合する隙間（ｃｌｅｆｔ）内に延びたコンホメーションを前提とする直鎖状ポリペプチド決定因子を含む（Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）、２３６：５５１−５５７）。ポリペプチドの、ＭＨＣクラスＩＩ結合性の直鎖状ポリペプチド決定因子（一般的に、５アミノ酸長〜１４アミノ酸長の間である）への変換は、「抗原プロセシング」と称され、これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって行われる。より具体的に、Ｔ細胞エピトープは、短いペプチド構造（例えば、電荷および疎水性に関する主要なアミノ酸配列の性質）、およびポリペプチド全体の折り畳みに依存しない特定の型の二次構造（例えば、螺旋性）の局所的な特徴によって定義される。さらに、ヘルパーＴ細胞によって認識され得る短いペプチドは、一般的に、（ＭＨＣ分子との相互作用のための）疎水性の側面および（Ｔ細胞レセプターと相互作用するための）親水性の側面を含む両親媒性構造である（Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，編、Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら、（１９９０）、ｐｐ．１０９−１１６）と考えられ、そしてさらに、この両親媒性構造がα−へリックス構造を有する（例えば、Ｓｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）、１３８：２０４−２１２；Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）、１３６：２４９８−２５０３を参照のこと）と考えられる。
【００４３】
従って、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質のセグメントは、多くのコンピュータープログラムを使用して、容易に予測され得る。（例えば、Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ、編、Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら、（１９９０）、ｐｐ．１０９−１１６を参照のこと）。このようなプログラムは、一般的に、ペプチドのアミノ酸配列を、Ｔ細胞応答を誘導することが公知である配列と比較し、そしてＴ細胞エピトープに必要であると考えられるアミノ酸のパターンを検索する。
【００４４】
ＨＣＶ抗原（ポリペプチドおよびインビボで発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含む）または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における目的の組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方で、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を包含する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、かつ細胞表面上で発現するタンパク質に結合して提示されるペプチド抗原についての特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方は、ＨＣＶ感染細胞を殺傷し得る。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激することを補助し、そして非特異的エフェクター細胞の活性を、その表面上のＭＨＣ分子と結合してポリペプチド抗原を表示する細胞に対して集中させるように作用する。「細胞免疫応答」はまた、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって産生されたサイトカイン、ケモカイン、ならびに他のこのような分子（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞由来のものを含み、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない）の産生をいう。
【００４５】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンが機能して、細胞表面にてＭＨＣ分子と結合して抗原を提示することによって、脊椎動物被験体が感作され得る。この細胞媒介性の免疫応答は、表面に抗原を提示する細胞またはその近傍を指向する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が産生されて、免疫化された宿主のさらなる保護を可能にし得る。
【００４６】
細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイ）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）、１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）、２４：２３６９−２３７６および以下の実施例を参照のこと。
【００４７】
したがって、本明細書中で使用される場合、免疫学的応答は、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。したがって、免疫学的応答は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原を特異的に指向するサプレッサーＴ細胞および／またはγδ Ｔ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和し、そして／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主の防御を提供するように（すなわち、予防的に）機能し得るか、またはこの宿主の症状の緩和のために（すなわち、治療的に）機能し得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００４８】
「等価な抗原決定基」は、ＨＣＶの株１、株２、株３などの異なるＨＣＶの亜種または株に由来する抗原決定基を意味し、抗原決定基は、配列の変化に起因して必ずしも同一でなくて良いが、目的のＨＣＶ配列中の等価な位置に生じる。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が並列される場合、高度の配列相同性（例えば、３０％より大きく、通常は４０％より大きく（例えば、６０％より大きい）、そしてさらに８０〜９０％より大きいアミノ酸配列相同性）を有する。
【００４９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の調節下においた場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。
【００５０】
「核酸」分子または「ポリヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖の両方の配列を含み得、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物もしくは真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）もしくは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および特に合成ＤＮＡ配列をいうが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を包含する。
【００５１】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される成分がその所望の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合に、コード配列の発現を行い得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、イントロンを転写し得た場合、翻訳されないが転写される介在配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得るので、プロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【００５２】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え」は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作ゆえに、天然において結合するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、以下でさらに記載されるように、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【００５３】
「制御エレメント」とは、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、宿主細胞でのコード配列の転写および翻訳のために集合的に提供される、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ、ならびに、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが含まれる）を包含する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてそこに作動可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）が存在する。真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常にこれらを含むわけではない。
【００５５】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、制御配列は、細胞中のコード配列の「転写を指示し」、その後、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００５６】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。発現カセットは、上に記載されるような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指示するように）作動可能に連結されたプロモーター）を含み、多くの場合、同様にポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいい、挿入のために使用した方法（例えば、直接取り込み、トランスフェクション、および感染などによる形質転換）を問わない。特定のトランスフェクション法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【００５８】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換された細胞であるか、または形質転換可能である細胞である。
【００５９】
「単離」は、ポリペプチドを指す場合、示した分子が生物全体から別れて分離しており、この分子が、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下において、天然に見出されるかまたは存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関する用語「単離」は、通常は天然において結合している配列の全部または一部を欠く核酸分子、天然において存在するが、異種配列が結合した配列、または染色体から解離した分子である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、および最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ型の生物学的高分子が存在することを意味する。
【００６１】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の同一性の％をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、定義した長さの分子にわたって、これらの配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％またはそれ以上の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、「実質的に相同」とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をいう。
【００６２】
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の％は、配列を並列することによる２つの分子間の配列情報の直接比較、並列された２つの配列間の正確な適合の計数、より短い配列の長さで除算すること、およびこの結果に１００を掛けることによって決定され得る。容易に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、ペプチド分析用のＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１）に適合させたＡＬＩＧＮ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、第５補遺．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ））が、分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列の同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能）で利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムにも依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＡＰプログラム）。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、かつ上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載される初期設定のパラメータを使用して容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性の％は、初期設定のスコアリング表およびヌクレオチド上の６つの位置でのギャップペナルティを使用したＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００６３】
本発明の文脈中における同一性の％を確立する別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｌｍ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表のために初期設定のパラメータを使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、使用され得る（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）。作成されたデータから、「適合」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性の％を計算するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝ハイスコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳物＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＮＣＢＩのインターネットサイトにて容易に見出され得る。
【００６４】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化フラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について定義したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００６５】
「核酸免疫化」は、免疫原のインビボ発現のための、１つ以上の選択された免疫原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。核酸分子は、注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエントに直接導入されても、宿主から取出された細胞にエキソビボで導入されてもよい。後者の場合において、形質転換細胞は、免疫応答がこの核酸分子によってコードされた抗原に対して惹起（ｍｏｕｎｔ）され得る被験体に再導入される。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンによるような、感染または再感染の防止、（ｉｉ）症状の軽減または排除、および（ｉｉｉ）目的の病原体の実質的かまたは完全な排除のいずれかをいう。処置は、予防的（感染前）に行われても、治療的（感染後）に行われてもよい。
【００６７】
「脊椎動物被験体」は、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味し、これらとしては、ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサルの種を含む））；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜；イヌおよびネコなどのペット（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｍａｍｍｍａｌ）；実験用動物（マウス、ラット、およびモルモットのようなげっ歯類を含む）；トリ（家禽、野鳥および狩猟鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）、ならびに他のキジ類（アヒル、ガチョウなど）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢を意味しない。したがって、成体および新生個体の両方を網羅することが意図される。本明細書中に記載される発明は、これら全ての脊椎動物の免疫系が簡単に操作されるので、上記の脊椎動物種のいずれかでの使用が意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
（２．発明を実施する形態）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の処方物または処理パラメータに制限されず、当然に変更可能であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことがまた、理解されるべきである。
【００６９】
本明細書中に記載のものに類似するか、またはそれらと等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００７０】
本発明は、全長ＨＣＶ ＮＳ５ａポリペプチドおよびＣ末端の切断を有するＨＣＶ ＮＳ５ｂポリペプチドの一部を含むＨＣＶ ＮＳ５ポリペプチドに関連する。本発明はまた、切断ＮＳ５ポリペプチドおよびＨＣＶポリタンパク質由来の少なくとも１つの他のＨＣＶポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のタンパク質が使用されて、体液性および／または細胞性免疫応答のような免疫学的応答を刺激し得る（例えば、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞（すなわち、ＨＣＶのポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞）を活性化するか、そして／またはヘルパーＴ細胞の産生を誘発するか、そして／または抗ウイルス性のサイトカイン、ケモカインなどの産生を刺激する）。このような融合タンパク質によるＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化は、ＨＣＶワクチンの開発のため（特に、応答に関連するＨＣＶポリペプチドエピトープを同定するため）の、インビトロモデル系およびインビボモデル系の両方を提供する。このタンパク質はまた、治療目的または予防目的のいずれかのために使用されて、哺乳動物においてＨＣＶに対する免疫応答（例えば、ＣＴＬの応答）を発生させるか、そして／または抗ウイルス因子を産生するためにＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を初回刺激し得る。
【００７１】
したがって、これらのタンパク質は、ＨＣＶ感染を処置および／または予防するのに有用である。これらのタンパク質は、単独で使用されても、１種以上の細菌免疫原またはウイルス免疫原と組み合わせて使用されてもよい。この組み合わせは、同じ病原体由来の複数の免疫原、異なる病原体由来の多数の免疫原または同じ病原体および異なる病原体由来の多数の免疫原を包含し得る。したがって、細菌免疫原、ウイルス免疫原、および／または他の免疫原は、ＮＳ５ポリペプチドと同じ組成物中に含有されても、同じ被験体に別個に投与されても、さらにＮＳ５ポリペプチドを有する融合タンパク質中に含まれてもよい。以下にさらに記載されるように、ＮＳ５ポリペプチドと他のＨＣＶ免疫原との組み合わせは、特に有用である。
【００７２】
さらに、本発明のタンパク質はまた、生物学的サンプルにおいてＨＣＶ感染を検出する診断用試薬として使用され得る。
【００７３】
本発明のさらなる理解のために、本発明の組成物に使用するための融合タンパク質、ならびにこのタンパク質の産生、これを含有する組成物、およびこのタンパク質を使用する方法に関するより詳細な議論が、以下に提供される。
【００７４】
（融合タンパク質）
ＨＣＶ株のゲノムは、約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質に転写される。図１および表１に示されるように、切断の際、ＨＣＶポリタンパク質は、ＮＨ_２−Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０個の異なる生成物を生成する。ｃｏｒｅポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１位〜１９１位で生じる（ＨＣＶ−１ゲノムについては、Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドはさらにプロセシングされて、ほぼアミノ酸１〜１７３を含むＨＣＶポリペプチドを生じる。Ｅ１およびＥ２であるエンベロープポリペプチドは、それぞれ、ほぼ１９２位〜３８３位および３８４位〜７４６位に生じる。Ｐ７ドメインは、ほぼ７４７位〜８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、そしてこのポリタンパク質のほぼ８１０位〜１０２６位に見出される。ＮＳ３との組み合わせにおいて、ＮＳ２（ほぼ１０２７位〜１６５７位に見出される）は、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を切断し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼ（ほぼ１０２７位〜１２０７位に見出される）が機能して、残りのポリタンパク質をプロセシングする。このヘリカーゼ活性は、ほぼ１１９３位〜１６５７位に見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ほぼ１６５８位〜１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ほぼ１７１２位〜１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、およびほぼ１９７３位〜２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ほぼ２４２１位〜３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ連結における自己触媒的な切断によって開始される。
【００７５】
【表１】

＊ＨＣＶ−１に対して番号付けされた。Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１〜２４５５を参照のこと。
【００７６】
本発明の融合タンパク質は、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド（本明細書中で「ＮＳ５ｔ」とも称される）を含む。特に、このＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドは、全長ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドのＮ末端部分を含む。このＣ末端切断ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２５００とＣ末端との間の任意の位置（例えば、全長ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされたアミノ酸２５０５、アミノ酸２５５０、アミノ酸２６００、アミノ酸２６５０、アミノ酸２７００、アミノ酸２７５０、アミノ酸２８００、アミノ酸２８５０、アミノ酸２９００、アミノ酸２９５０、アミノ酸２９６０、アミノ酸２９７０、アミノ酸２９７５、アミノ酸２９８０、アミノ酸２９８５、アミノ酸２９９０、アミノ酸２９９５、アミノ酸３０００などの後）で切断され得る。この分子が全長ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされたアミノ酸２５００とアミノ酸３０１０との間のいずれかにて切断され得ることは、容易に明らかになる。１つの特に好ましいＮＳ５ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２９９０の直後のアミノ酸に対応するアミノ酸にて切断され、そして全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列を含む。このような構築物についての配列は、配列番号８のアミノ酸１位〜１０１８位（図５Ａ〜図５Ｅにおけるアミノ酸１９７３〜２９９０として示される）に認められる。本発明の融合体は、必要に応じて、発現のためにＮ末端のメチオニンを有する。
【００７７】
Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドは、以下に記載される組成物において、単独で使用されても、ＨＣＶポリタンパク質の種々のドメインのいずれかに由来する１種以上の他のＨＣＶ免疫原性ポリペプチドと組み合わせて使用されてもよい。さらなるＨＣＶポリペプチドは、別々か、または融合体で提供され得る。実際に、この融合体は、ＨＣＶポリタンパク質の全ての領域を含み得る。これらのポリペプチドは、ＮＳ５ポリペプチドと同じＨＣＶ単離物に由来してもよく、または広範なＨＣＶ遺伝子型に対する増加した保護を提供するために、異なる株および種々のＨＣＶ遺伝子型のいずれかを有する単離物を含む単離物に由来してもよい。さらに、これらのポリペプチドは、この融合体を含むワクチン組成物が使用される特定の地理的（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ）領域に固有である特定のウイルスのクレードに基づいて選択され得る。本発明の融合体が多種多様な状況においてＨＣＶ感染を処置する有効な手段を提供することは、容易に明らかになる。
【００７８】
したがって、ＮＳ５ｔは、ＨＣＶポリタンパク質中の他のドメインに由来する１つ以上の免疫原性ＨＣＶタンパク質とＮＳ５ｔとの任意の組み合わせ（すなわち、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、および／またはｃｏｒｅポリペプチドと組み合わされたＮＳ５ｔ）を含む融合タンパク質中に含まれ得る。これらの領域は、天然に存在する順番である必要ではない。さらに、これらの領域のそれぞれは、同じかまたは異なるＨＣＶ単離物に由来し得る。本明細書中に記載される種々の融合体中に存在する種々のＨＣＶポリペプチドは、全長ポリペプチドまたはその部分のいずれかであり得る。融合タンパク質を構成するＨＣＶポリペプチドの部分は、一般的に、少なくとも１つのエピトープを含み、このエピトープは、活性化されたＴ細胞上のＴ細胞レセプター（例えば、２１５２−ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０（配列番号１）および／または２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８（配列番号２））によって認識される。エピトープは、いくつかの方法によって同定され得る。例えば、上記の任意の組み合わせを含む個々のポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、このポリペプチドまたはタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用するイムノアフィニティー精製によって単離され得る。その後、単離されたタンパク質配列は、このタンパク質配列全体と共に、精製されたタンパク質のタンパク質分解的切断を用いて一連の短いペプチドを調製することによってスクリーニングされ得る。例えば、１００マーのポリペプチドから開始することによって、各ポリペプチドは、ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターによって認識されるエピトープの存在について試験され得、その後、同定された１００マーから次第により小さく、かつ重複するフラグメントが試験されて、目的のエピトープをマッピングし得る。
【００７９】
ＨＣＶ活性化Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターによって認識されるエピトープは、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイまたはリンパ球増殖アッセイ（実施例を参照のこと）によって同定され得る。^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、目的のエピトープを表示する標的細胞は、このエピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングし、そしてこの発現ベクターを標的細胞に形質転換することによって構築され得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、例えば、融合体中に見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域由来の１つ以上のエピトープを表示する標的細胞を溶解し、そしてこのようなエピトープを表示しない細胞を溶解しない。リンパ球増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、例えば、融合体中に見出されるＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域由来の１つ以上のエピトープと一緒に培養される場合に増殖するが、ＨＣＶエピトープのペプチドの非存在下においては増殖しない。
【００８０】
種々のＨＣＶポリペプチドは、融合タンパク質中に任意の順序で生じ得る。所望される場合、１種以上のポリペプチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個以上が、この融合タンパク質中に生じ得る。ＨＣＶの多数のウイルス株が生じ、そしてこれらの株のいずれかのＨＣＶポリペプチドが、融合タンパク質中に使用され得る。
【００８１】
ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域の核酸配列およびアミノ酸配列を含む多くのＨＣＶ株およびＨＣＶ単離物の核酸配列およびアミノ酸配列（Ｃｏｒｅ、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂの遺伝子およびポリペプチドが挙げられる）が、決定されてきた。例えば、単離物ＨＣＶ Ｊ１．１は、Ｋｕｂｏら、（１９８９）、Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）、Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載される。２つの独立した単離物であるＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全なコード配列は、それぞれ、Ｋａｔｏら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら、（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３に記載される。
【００８２】
ＨＣＶ−１単離物を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら、（１９９０）、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離物ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら、（１９９１）、Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載される。ＨＣＶ単離物ＨＣＴ １８〜、ＨＣＴ ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒら、（１９９１）、Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載される。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏら、（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載される。ＨＣＶ単離物Ａ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら、（１９９１）、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ５：２４３−２５４に記載される。
【００８３】
上記で説明される通り、融合タンパク質の構成成分の各々は、同じＨＣＶ株もしくは単離物または異なるＨＣＶ株もしくは単離物から得られ得る。例えば、ＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶの第１の株に由来し得、そして存在する他のＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来し得る。あるいは、他のＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、Ｃｏｒｅ、ｐ７、Ｅ１および／またはＥ２）の１種以上は、存在する場合、ＨＣＶの第１の株に由来し得、そして残りのＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来し得る。さらに、各ＨＣＶポリペプチドまたは存在するＨＣＶポリペプチドは、異なるＨＣＶ株に由来し得る。
【００８４】
本発明の融合体に使用するためのＨＣＶ領域由来の種々のＨＣＶエピトープに関する記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）、８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）、８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照のこと。
【００８５】
例えば、融合体は、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドおよびＮＳ３ポリペプチドを含み得る。ＮＳ３ポリペプチドが改変されて、プロテアーゼ活性が阻害され得、それによってこの融合体のさらなる切断が阻害される（本明細書中で「ＮＳ３^＊」とも称される）。ＮＳ３ポリペプチドは、ＮＳ３プロテアーゼドメインの全てまたは一部の欠失によって改変され得る。あるいは、タンパク質分解活性は、このプロテアーゼドメインの活性領域内のアミノ酸の置換によって阻害され得る。最後に、触媒部位が改変されるようなこのドメインの活性領域に対するアミノ酸の付加はまた、タンパク質分解活性を阻害するように機能する。
【００８６】
上記で説明される通り、このプロテアーゼ活性は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸ほぼ１０２７位〜１２０７位（図２の位置２〜１８２）に見出される（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）、８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。ＮＳ３プロテアーゼの構造および活性部位は、公知である。例えば、Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）、３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）、４０：６３１−６４０を参照のこと。したがって、ネイティブな配列に対する欠失または改変は、代表的に、この分子の活性部位か、またはその近傍に起きる。特に、図２の１位もしくは２位〜１８２位、好ましくは１位もしくは２位〜１７０位、または１位もしくは２位〜１５５位にて起きる、１個以上のアミノ酸に対する改変または欠失が望ましい。このプロテアーゼを不活化するために、プロテアーゼの活性部位における触媒的な三つ組（すなわち、Ｈ残基、Ｄ残基および／またはＳ残基）に対する改変が好ましい。これらの残基は、それぞれ、全長ＨＣＶポリタンパク質に対して番号付けされた１０８３位、１１０５位および１１６５位（それぞれ、図２の５８位、８０位および１４０位）に生じる。このような改変は、Ｔ細胞エピトープを維持しつつ、タンパク質分解的切断を抑制する。１つの特に好ましい改変は、Ｓｅｒ−１１６５のＡｌａによる置換である。当業者は、活性を破壊するために欠失させるＮＳ３プロテアーゼの位置を、容易に決定し得る。活性の存在または非存在は、当業者に公知の方法を使用して決定され得る。
【００８７】
例えば、プロテアーゼ活性またはその欠如は、以下の実施例に記載される手順および当該分野において周知であるアッセイを使用して決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）、２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）、１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）、３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）、７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）、２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）、２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）、８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）、５：１５３−１５８；およびＫｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）、２８４：４２−４８を参照のこと。
【００８８】
図３は、Ｎ末端から欠失されるＮＳ３プロテアーゼドメインを有し、そしてＣ末端上にＣｏｒｅのアミノ酸１〜１２１を含む代表的な改変ＮＳ３ポリペプチドを示す。
【００８９】
上記で説明される通り、本発明の融合体中にＨＣＶポリタンパク質のｃｏｒｅ領域に由来するポリペプチドを含むことが、所望され得る。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１位〜１９１位に生じる。全長タンパク質、そのフラグメント（例えば、アミノ酸１〜１６０（例えば、アミノ酸１〜１５０、アミノ酸１〜１４０、アミノ酸１〜１３０、アミノ酸１〜１２０（例えば、アミノ酸１〜１２１、アミノ酸１〜１２２、アミノ酸１〜１２３．．．アミノ酸１〜１５１など））または全長タンパク質のエピトープ（例えば、アミノ酸１０〜５３の間、アミノ酸１０〜４５の間、アミノ酸６７〜８８の間、アミノ酸１２０〜１３０の間に見出されるエピトープ、または、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）、８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）、８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号；ならびに米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号において同定されたｃｏｒｅエピトープのいずれか）を含むより小さいフラグメントは、本発明の融合体中に使用され得る。さらに、このポリタンパク質のｃｏｒｅ領域中のフレームシフトによって生じるタンパク質（例えば、国際公開第９９／６３９４１号に記載される）が、使用され得る。本発明の融合体と使用するための１つの特に望ましいｃｏｒｅポリペプチドは、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列を含む。このｃｏｒｅポリペプチドは、共通するアミノ酸Ａｒｇ−９およびＴｈｒ−１１（それぞれ、図３の１７８０位および１７８２位）を有するＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含む。図５Ａ〜５Ｅ（配列番号７および配列番号８）は、このｃｏｒｅポリペプチドと融合されるＮＳ５ポリペプチドのＣ末端を有するＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドを含む代表的な融合タンパク質の、ＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を示す。Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドは、上に記載されるようなＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１（配列番号７のアミノ酸１０１９〜１１３９）を含むｃｏｒｅポリペプチドに融合される、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０（配列番号７のアミノ酸１〜１０１８）を含む（Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【００９０】
ｃｏｒｅポリペプチドが存在する場合、これは、上記融合体のＮ末端、Ｃ末端および／または内部に生じ得る。以下でさらに記載される特定のアジュバント（例えば、ＩＳＣＯＭ）との複合体の形成を可能にするような、Ｃ末端上のｃｏｒｅポリペプチドが、特に好ましい。
【００９１】
上記ＨＣＶ融合体において有用な他のポリペプチドとしては、上記ポリタンパク質中の種々の領域のいずれかに由来するＴ細胞エピトープが挙げられる。このことに関して、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７およびＮＳ２は、ヒトＴ細胞エピトープ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）を含むことが公知であり、そしてワクチンの効力を増加させるように機能し、そして多数のＨＣＶ遺伝子型に対する保護のレベルを増加させるように機能するこれらのエピトープの１つ以上を含む。さらに、特定の保存されたＴ細胞エピトープの多数のコピーはまた、この融合体中に使用され得る（例えば、異なる遺伝子型由来のエピトープの複合物）。
【００９２】
例えば、ＨＣＶ Ｅ１領域および／またはＨＣＶ Ｅ２領域由来のポリペプチドは、本発明の融合体中に使用され得る。Ｅ２は、多数の種として存在し（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）、１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）、７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）、６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）、６７：４０１７−４０２６）、そして切り取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）およびタンパク質分解が、Ｅ２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端で生じ得る。したがって、本明細書中で使用するためのＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸４０５〜６６１（例えば、アミノ酸４００、４０１、４０２．．．〜６６１）、および全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＨＣＶポリタンパク質のポリペプチド（例えば、アミノ酸３８３もしくは３８４〜６６１、アミノ酸３８３もしくは３８４〜７１５、アミノ酸３８３もしくは３８４〜７４６、アミノ酸３８３もしくは３８４〜７４９またはアミノ酸３８３もしくは３８４〜８０９、あるいはアミノ酸３８３もしくは３８４〜任意のＣ末端（アミノ酸６６１〜アミノ酸８０９の間））を含み得る。同様に、本明細書中で使用するためのＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、アミノ酸１９２〜３３０、アミノ酸１９２〜３３３、アミノ酸１９２〜３６０、アミノ酸１９２〜３６３、アミノ酸１９２〜３８３、またはアミノ酸１９２〜任意のＣ末端（アミノ酸３２６〜アミノ酸３８３の間）を含み得る。
【００９３】
エピトープを含むＥ１および／またはＥ２の免疫原性フラグメントは、本発明の融合体中に使用され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドのフラグメントは、この分子の約５個〜ぼぼ全長（例えば、６個、１０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、１８５個またはそれ以上のＥ１ポリペプチドのアミノ酸）または一定の数の間の任意の整数を含み得る。同様に、Ｅ２ポリペプチドのフラグメントは、６個、１０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、もしくは３５０個のＥ２ポリペプチドのアミノ酸、または一定の数の間の任意の整数を含み得る。
【００９４】
例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４〜４１０またはアミノ酸３９０〜４１０にわたる領域）に由来するエピトープは、この融合体中に含まれ得る。Ｅ２ポリペプチド配列に組み込まれる特に有効なＥ２エピトープは、この領域に由来する共通配列（例えば、共通配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ）を含むものであり、これは、ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０についての共通配列を表す。Ｅ１およびＥ２のさらなるエピトープは、公知であり、そしてこれらは、例えば、Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号に記載される。
【００９５】
さらに、Ｅ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠き得る。Ｅ１に関して、一般的に、ほぼアミノ酸３７０位およびより大きい位置（ＨＣＶ−１ポリタンパク質の番号付けに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって保持され、従って増殖培地中に分泌されない。Ｅ２に関して、ほぼアミノ酸７３１位およびより大きい位置（ＨＣＶ−１ポリタンパク質の番号付けにまた基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって保持され、そして分泌されない（例えば、国際公開第９６／０４３０１号（１９９６年２月１５日公開）を参照のこと）。これらのアミノ酸の位置は、絶対的ではなく、そしてある程度変化し得ることに留意すべきである。したがって、本発明は、膜貫通型結合ドメインを保持するＥ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチド、ならびに膜貫通型結合ドメインの全てまたは一部を欠くポリペプチド（ほぼアミノ酸３６９、およびより小さい位置にて終結するＥ１ポリペプチド、およびほぼアミノ酸７３０、およびより小さい位置にて終結するＥ２ポリペプチドが挙げられる）の使用を企図する。さらに、Ｃ末端の切断は、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を超えてＮ末端に向かって伸び得る。したがって、例えば、３６０より小さい位置で起きるＥ１切断、および、例えば、７１５より小さい位置で起きるＥ２切断はまた、本発明に包含される。切断Ｅ１ポリペプチドおよび切断Ｅ２ポリペプチドが意図された目的のために機能的なままであることが必要であるにすぎない。しかし、特定の好ましい切断Ｅ１構築物は、ほぼアミノ酸３００を超える長さにならない構築物である。３６０位にて終結する構築物が、最も好ましい。好ましい切断Ｅ２構築物は、ほぼアミノ酸７１５位を超えて伸びないＣ末端の切断を有するものである。特に好ましいＥ２の切断は、アミノ酸７１５〜７３０のいずれかの後（例えば、７２５）にて切断される分子である。
【００９６】
特定の好ましい実施形態において、上記融合タンパク質は、ＨＣＶの改変ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよびＮＳ４ｂ）、Ｃ末端切断ＮＳ５および必要に応じて、ｃｏｒｅポリペプチド（ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ融合タンパク質（本明細書中でまた、「ＮＳ３^＊４５ｔ」および「ＮＳ３^＊４５ｔＣｏｒｅ」と称される））を含む。これらの領域は、それらがネイティブなＨＣＶポリタンパク質中に天然に存在する順序である必要はない。したがって、例えば、このｃｏｒｅポリペプチドは、融合体のＮ末端および／またはＣ末端にあり得る。特に好ましい実施形態において、ＮＳ５ｔは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０を含み、そしてＮＳ３^＊分子は、通常は１１６５位に見出されるＳｅｒからＡｌａへの置換を含み、そしてこれらの領域は、以下のＮ末端からＣ末端への順序で生じる：ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ。この融合体は、その分子のＣ末端にｃｏｒｅポリペプチドを含み得る。存在する場合、このｃｏｒｅポリペプチドは、好ましくは図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列を含む。このｃｏｒｅポリペプチドは、共通のアミノ酸Ａｒｇ−９およびＴｈｒ−１１（それぞれ、図３の１７８０位および１７８２位）を有するＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含む。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、この直前に記載された融合タンパク質は、上記のＮＳ３^＊のＮ末端にＥ２ポリペプチドを含む。好ましくは、Ｅ２ポリペプチドは、Ｃ末端切断ポリペプチドであり、そして全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５を含む。この融合体はまた、必要に応じて、上に記載されるようなｃｏｒｅポリペプチドを含み得る。
【００９８】
所望される場合、上記融合タンパク質、またはこれらのタンパク質の個々の構成成分はまた、他のアミノ酸配列（例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列）、およびタンパク質精製に有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌のプロテインＡ）を含み得る。
【００９９】
（融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
ポリヌクレオチドはＨＣＶゲノム全体より小さいか、あるいは上に記載されるようなＣ末端切断ＮＳ５ドメインを有するポリタンパク質全体の配列を含み得る。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、他の成分（例えば、タンパク質および脂質）を含まないで単離される。これらのポリヌクレオチドは、上に記載される融合タンパク質をコードし、したがってＮＳ５ｔについてのコード配列およびＨＣＶポリタンパク質の異なる領域由来の少なくとも１つの他のＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ｃｏｒｅなどに由来するポリペプチド）を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、他のヌクレオチド配列（例えば、リンカー、シグナル配列、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌のプロテインＡのようなタンパク質精製に有用なリガンドをコードする配列）を含み得る。
【０１００】
発現の収量を補助するために、ポリタンパク質を発現のためのフラグメントに分割することが望まれ得る。これらのフラグメントは、本明細書中に記載されるような組成物中に組み合わせて使用され得る。あるいは、これらのフラグメントは、発現後に連結され得る。したがって、例えば、ＮＳ３^＊ＮＳ４は、１つの構築物として発現され得、そしてＮＳ５ｔＣｏｒｅは、第２の構築物、およびその後に組成物に融合されるか、または組成物に別々に添加される２つのタンパク質として発現され得る。同様に、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４は、１つの構築物として発現され得、そしてＮＳ５ｔＣｏｒｅは、第２の構築物として発現され得る。上記の組み合わせは単に代表的なものであり、そして融合体の任意の組み合わせは別々に発現され得ることが、理解されるべきである。
【０１０１】
種々のＨＣＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染した個体の血漿、血清、または肝臓のホモジネートに存在する核酸配列に由来するゲノムライブラリーから単離されてもよく、例えば、自動合成器を使用して実験室中で合成されてもよい。ＰＣＲのような増幅方法が使用されて、ＨＣＶのゲノムＤＮＡまたはそれをコードするｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドが増幅され得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、天然に存在するこれらのポリペプチドについてのコード配列を含んでも、天然に存在しない人工的な配列であってもよい。これらのポリヌクレオチドはライゲーションされて、標準的な分子生物学技術を使用してこの融合タンパク質についてのコード配列が形成され得る。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現系において発現され得る発現ベクターに導入され得る。種々の細菌発現系、酵母発現系、哺乳動物発現系および昆虫発現系が、当該分野において利用可能であり、そして任意のこのような発現系が、使用され得る。必要に応じて、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、無細胞翻訳システム中で翻訳され得る。このような方法は、当該分野において周知である。これらのタンパク質はまた、固相タンパク質合成によって構築され得る。
【０１０３】
所望の融合体を含む本発明の発現構築物、またはこれらの融合体の個々の構成成分を含む個々の発現構築物が、核酸免疫化のために使用されて、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて細胞性免疫応答が刺激され得る。遺伝子送達のための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達される得るか、あるいは、この被験体から得られ、そしてこの被験体に再移植される細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、この構築物は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＣｏｌＥ１のようなプラスミド内に含まれるプラスミドＤＮＡとして送達され得る。
【０１０４】
さらに、上記発現構築物は、細胞への送達前にリポソーム中にパッケージ化され得る。脂質による封入は、一般的に、核酸と安定して結合するか、または核酸を封入して、核酸を保持し得るリポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する濃縮されたＤＮＡの比は変化し得るが、一般的に、約１：１（ＤＮＡのｍｇ：脂質のマイクロモル）、またはそれ以上の脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用に関する概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）、１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【０１０５】
本発明と使用するためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性調製物が挙げられ、カチオン性調製物が特に好ましい。カチオン性調製物は、容易に利用可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で利用可能である。（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）、８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと）。他の市販されている脂質としては、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知である技術を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）、７５：４１９４−４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載に関するＰＣＴ公開番号第９０／１１０９２号を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野において公知である方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、第１０１巻、ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）、７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）、３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）、１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）、４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）、７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）、７６：３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）、７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）、２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）、７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）、２１５：１６６を参照のこと。
【０１０６】
上記ＤＮＡはまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）、３９４：４８３−４９１に記載されるものと同様の渦巻形状の（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）脂質組成物中に送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号も参照のこと。
【０１０７】
多くのウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞中に遺伝子移入するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス（例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）は、遺伝子送達システムのために都合の良いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野において公知である技術を使用して、ベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージ化され得る。次いで組換えウイルスは、単離され得、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルスシステムが、記載されてきた（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）、７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）、１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）、１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）、９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）、３：１０２−１０９）。簡潔にいうと、本発明のレトロウイルスによる遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々のレトロウイルスから容易に構築され得、これらのウイルスとしては、例えば、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルスおよびレンチウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶが挙げられる（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。このようなレトロウイルスは、受託機関または収集機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９））から容易に得られ得るか、または一般的に利用可能な技術を利用して公知の供給源から単離され得る。
【０１０８】
多くのアデノウイルスベクター（例えば、アデノウイルス２型ベクターおよびアデノウイルス５型ベクター）がまた、記載されてきた。宿主ゲノム中に組み込むレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続し、したがって挿入性の突然変異に関連するリスクを最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）、５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）、６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９４）、５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）、６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）、１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）、６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）、４：４６１−４７６）。
【０１０９】
Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）、２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）、８９：６０９９−６１０３に記載される分子結合体ベクター（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖｅｃｔｏｒ）（例えば、アデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【０１１０】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス、ＶＥＥに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない）もまた、目的の遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての使用が見出される。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来のベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）、７０：５０８−５１９；および国際公開第９５／０７９９５号および同第９６／１７０７２号を参照のこと。
【０１１１】
他のベクターが、使用され得、これらのベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルス４０およびサイトメガロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌ベクター（例えば、サルモネラ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、赤痢菌種、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、ミコバクテリウム株ＢＣＧ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が、使用され得る。ミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（例えば、ＭＣおよびＭＣ１）、バクテリオファージ、コスミド（λファージのｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）およびレプリコン（細胞中で自らの制御下において複製し得る遺伝因子）がまた、使用され得る。
【０１１２】
上記発現構築物はまた、粒状キャリアに封入されても、吸着されても、結合されてもよい。このようなキャリアは、免疫系に対して選択された分子の多数のコピーを提示し、そして局在するリンパ節における分子の捕捉および保持を促進する。これらの粒子は、マクロファージによって貪食され得、そしてサイトカインの放出による抗原提示を増強し得る。粒状キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するキャリア、ならびにＰＬＧとして公知である、ポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）、１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
【０１１３】
広範な種々の他の方法は、細胞に発現構築物を送達するために使用され得る。このような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介性のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジン媒介性もしくはポリオルニチン媒介性のトランスフェクション、または他の不溶性の無機塩類（例えば、リン酸ストロンチウム、ベンナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなど）を使用する沈殿が挙げられる。トランスフェクションの有用な他の方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、原形質融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞を形質転換するための技術の議論に関するＳａｍｂｒｏｏｋら、前出；および遺伝子移入に有用な送達システムの概説に関するＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）、５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポレーションを使用してＤＮＡを送達する特に有効な１つの方法は、国際公開第００４５８２３号に記載される。
【０１１４】
さらに、粒状キャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達システムは、本発明の発現構築物を送達するのに特に有用である。これらの粒子は、この送達されるべき構築物によってコーティングされ、そして一般的に、減圧雰囲気下において、「遺伝子銃」からの黒色火薬による発射を使用して高速度まで加速される。このような技術、およびこれに有用な装置の説明については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。
【０１１５】
（融合タンパク質または融合ポリヌクレオチドを含有する組成物）
本発明はまた、上記融合タンパク質または融合ポリヌクレオチドを含有する組成物を提供する。これらの組成物は、上記で定義されるような免疫学的応答を刺激するために使用され得る。これらの組成物は、融合体のうちの１つが本明細書中に記載されるようなＣ末端切断ＮＳ５ドメインを含む限り、１つ以上の融合体を含有し得る。本発明の組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。このキャリアは、それ自体が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導べきではない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。この様なキャリアとしては、大きくて、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類（例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーのアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）、アミノ酸コポリマー、および不活化ウイルス粒子）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１６】
薬学的に受容可能な塩（例えば、無機塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩）、および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩））もまた、本発明の組成物中に使用され得る。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者にとって周知である他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど）を、単独かまたは組み合わせで含み得、そして湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドはまた、リポソームおよびＰＬＧのような粒状キャリアに吸着されても、それらの中に捕捉されても、そうでなければそれらに結合されてもよい。リポソームおよび他の粒状キャリアは、上に記載される。
【０１１７】
所望される場合、リンパ球（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２）、またはサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５からｓｅｒ１２５に）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、ＦＬＰ−３、リバビリンおよびＲＡＮＴＥＳのようなサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）に対する免疫原の提示を改良する同時刺激性の分子は、この組成物中に含有され得る。必要に応じて、アジュバントがまた、組成物中に含有され得る。使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルション処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌の細胞壁構成成分のような他の特定の免疫刺激性因子を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮ ８０、および０．５％のＳＰＡＮ ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）を含み、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を使用してサブミクロン粒子中に処方される、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号第９０／１４８３７号）、（ｂ）１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮ ８０、５％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含み、サブミクロンエマルションにマイクロフルイダイズされるか、またはボルテックスされてより大きい粒子サイズのエマルションを生成するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴＷＥＥＮ ８０、およびモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）と、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）と、細胞壁骨格（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）（ＣＷＳ）とからなる群由来の１種以上の細菌の細胞壁構成成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）が使用されても、そこからＩＳＣＯＭのような粒子（免疫刺激複合体）が生成されてもよい（ＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る）（例えば、国際公開第００／０７６２１号））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）（例えば、国際公開第９９／４４６３６号参照）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；（６）細菌のＡＤＰリボシル化毒素の無毒化変異体（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ）（特に、ＬＴ−Ｋ６３（リジンが、６３位の野生型アミノ酸を置換する）、ＬＴ−Ｒ７２（アルギニンが、７２位の野生型アミノ酸を置換する）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが、１０９位の野生型アミノ酸を置換する）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リジンが、９位の野生型アミノ酸を置換し、そしてグリシン１２９位にて置換される）（例えば、国際公開第９３／１３２０２号および同第９２／１９２６５号を参照のこと）；（７）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２２１号；欧州特許出願第０６８９４５４号を参照のこと）（必要に応じてかなりの量のミョウバンを欠く（例えば、国際公開第００／５６３５８号参照）；（８）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルションとの組み合わせ（例えば、欧州特許出願第０８３５３１８号；同第０７３５８９８号；同第０７６１２３１号を参照のこと）；（９）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開第９９／５２５４９号）；（１０）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）またはサポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、国際公開第００／６２８００号を参照のこと）；（１１）免疫刺激因子および金属塩の粒子（例えば、国際公開第００／２３１０５号参照）；（１２）サポニンおよび水中油型エマルション（例えば、国際公開第９９／１１２４１号を参照のこと）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、国際公開第９８／５７６５９号を参照のこと）；（１４）ＭＰＬ誘導体ＲＣ５２９；ならびに（１５）免疫刺激性因子として作用して、組成物の有効性を増強させる他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９が、好ましい。
【０１１８】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰと称されるＣＧＰ １１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと称される、ＣＧＰ １９８３５Ａ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
さらに、上記融合タンパク質は、ＩＳＣＯＭに吸着されても、ＩＳＣＯＭ内に捕捉されてもよい。伝統的なＩＳＣＯＭは、コレステロール、サポニン、リン脂質、および免疫原の組み合わせによって形成される。一般的に、免疫原（通常は疎水性領域を有する）は、界面活性剤中に可溶化され、そして反応混合物に添加される。したがって、ＩＳＣＯＭは、その中に取り込まれた免疫原と共に形成される。ＩＳＣＯＭマトリックス組成物は、ウイルスタンパク質と同じように形成されるが、ウイルスタンパク質を含まない。高い正の電荷を有するタンパク質は、疎水性力よりむしろＩＳＣＯＭ粒子中に静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭならびにＩＳＣＯＭを処方する方法についてのより詳細な一般的考察は、Ｂａｒｒら、（１９９８）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：２４７−２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１２０】
本発明で使用するためのＩＳＣＯＭは、当該分野において周知である標準的な技術を使用して生成され、そして、例えば、米国特許第４，９８１，６８４号、同第５，１７８，８６０号、同第５，６７９，３５４号および同第６，０２７，７３２号；欧州特許出願公開第１０９，９４２号；同第１８０，５６４号および同第２３１，０３９号；Ｃｏｕｌｔｅｒら、（１９９８）、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３に記載される。代表的に、用語「ＩＳＣＯＭ」とは、グリコシド（例えば、トリテルペノイドサポニン（特に、Ｑｕｉｌ Ａ））と疎水性領域を含む抗原との間に形成される免疫原性複合体をいう。例えば、欧州特許出願公開第１０９，９４２号および同第１８０，５６４号を参照のこと。この実施形態において、ＨＣＶ融合体（通常は疎水性領域を有する）は、界面活性剤中に可溶化され、そして反応混合物に添加される。したがって、ＩＳＣＯＭは、その中に取り込まれた融合体と共に形成される。ＨＣＶポリペプチドＩＳＣＯＭは、両親媒性を示すＨＣＶポリペプチドで容易に作製される。しかし、所望の疎水性を欠くタンパク質およびペプチドは、疎水性アミノ酸、脂肪酸ラジカル、アルキルラジカルなどを有するペプチドと結合した後に、この免疫原性複合体中に取り込まれ得る。
【０１２１】
欧州特許出願公開第２３１，０３９号で説明されるように、抗原の存在は、基本的なＩＳＣＯＭ構造（マトリックスまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと称される）を形成するために必要ではなく、この構造は、ステロール（例えば、コレステロール）、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）、およびグリコシド（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）から形成され得る。したがって、目的のＨＣＶ融合体は、このマトリックスに取り込まれるよりもむしろ、このマトリックスの外側に存在する（例えば、静電相互作用を介してこのマトリックスに吸着される）。例えば、高い正の電荷を有するＨＣＶ融合体は、疎水性力よりむしろＩＳＣＯＭ粒子に静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭならびにＩＳＣＯＭを処方する方法についてのより詳細な一般的考察は、Ｂａｒｒら、（１９９８）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：２４７−２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１２２】
上記ＩＳＣＯＭマトリックスは、例えば、可溶化したステロール、グリコシドおよび（必要に応じて）リン脂質を一緒に混合することによって調製され得る。リン脂質が使用されない場合、二次元構造が形成される。例えば、欧州特許出願公開第２３１，０３９号を参照のこと。用語「ＩＳＣＯＭマトリックス」は、３次元構造および２次元構造の両方をいうために使用される。使用されるべきグリコシドは、一般的に、両親媒性を示し、そしてその分子中に疎水性領域および親水性領域を含むグリコシドである。Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａからのサポニン抽出物およびＱｕｉｌ Ａのような好ましいサポニンが、使用される。他の好ましいサポニンは、Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ由来のアエスシン（Ｐａｔｔら、（１９６０）、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ １０：２７３−２７５）およびＧｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ由来のサポアルビン（ｓａｐｏａｌｂｉｎ）（Ｖｏｃｈｔｅｎら、（１９６８）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４２：２１３−２２６）である。
【０１２３】
ＩＳＣＯＭを調製するために、グリコシドは、少なくとも臨界ミセル形成濃度で使用される。Ｑｕｉｌ Ａの場合において、この濃度は、約０．０３重量％である。ＩＳＣＯＭを生成するために使用されるステロールは、動物由来または植物由来の公知のステロール（例えば、コレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スティグマステロールおよびシトステロール）であり得る。適切なリン脂質としては、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。一般的に、グリコシド（特に、Ｑｕｉｌ Ａである場合）とステロール（特に、コレステロールである場合）とリン脂質とのモル比は、１：１：０〜１（各数字について±２０％（好ましくは、±１０％より大きくない））である。これは、Ｑｕｉｌ Ａ：コレステロールの約５：１の重量比と等価である。
【０１２４】
可溶化剤もまた、存在し得、そしてこれは、例えば、界面活性剤、尿素またはグアニジンであり得る。一般的に、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤もしくは両性イオン界面活性剤、またはコール酸ベースの界面活性剤（例えば、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸塩およびＣＴＡＢ（臭化セチルトリアンモニウム）が、この目的のために使用され得る。適切な界面活性剤の例としては、オクチルグルコシド、ノニルＮ−メチルグルカミドまたはデカノイルＮ−メチルグルカミド、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（例えば、９個〜１０個のオキシエチレン基を有するポリエチレングリコールｐ−イソオクチル−フェニルエーテル（商品名ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００Ｒ^ＴＭで市販される））、アシルポリオキシエチレンエステル（例えば、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商品名ＴＷＥＥＮ ２０^ＴＭ、ＴＷＥＥＮ ８０^ＴＭなどで市販される））が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、可溶化剤は、ＩＳＣＯＭの処方のために、例えば、限外濾過、透析、超遠心分離またはクロマトグラフィーによって除去されるが、しかし、特定の方法では、この工程は、必要ない（例えば、米国特許第４，９８１，６８４を参照のこと）。
【０１２５】
一般に、ＨＣＶ融合体に対するグリコシド（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）の重量比は、５：１〜０．５：１の範囲である。好ましい重量比は、約３：１〜１：１であり、そしてより好ましくは、この比は、２：１である。
【０１２６】
一旦ＩＳＣＯＭが形成されると、これらは、本明細書中で記載されるように、組成物中に処方され、そして動物に投与され得る。所望される場合、得られた免疫原性複合体の溶液は、凍結乾燥され、次いで使用前に再構成され得る。
【０１２７】
上に記載されるＮＳ５融合タンパク質およびタンパク質またはポリヌクレオチドを含む組成物は、他のＨＣＶ免疫原性タンパク質、および／または他のＨＣＶ免疫原性タンパク質を含有する組成物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＮＳ５融合タンパク質は、表１に記載されるＨＣＶポリタンパク質の領域の１種以上に由来する種々のＨＣＶ免疫原性タンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。本発明の融合体および／またはＮＳ５融合体を含有する組成物と共に使用するための１つの特定のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原である。ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原は、公知であり、必要に応じてｐ７領域の一部または全てを有するＨＣＶ Ｅ１とＨＣＶ Ｅ２との複合体（例えば、ＰＣＴ公開番号第０３／００２０６５号に記載されるようなＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体）を含む。さらなるＨＣＶ免疫原性タンパク質は、上に記載されるような賦形剤、アジュバント、免疫刺激性分子などと一緒に、組成物中に提供され得る。例えば、Ｅ１Ｅ２複合体は、水中油型のサブミクロンエマルション（例えば、ＭＦ５９）および／またはオリゴヌクレオチド（免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）（例えば、ＣｐＹ、ＣｐＲおよびメチル化されていないＣｐＧモチーフ（シトシンの後にグアノシンが続き、そしてリン酸結合によって連結される））を含む）を含有する組成物中に提供され得る。このような組成物は、ＰＣＴ公開番号第０３／００２０６５号に詳細に記載される。
【０１２８】
したがって、本発明の組成物が、多くの免疫刺激性因子と組み合わせて投与され得、そして通常はアジュバントを含有することは、容易に明らかである。この組成物と使用するためのこのような因子およびアジュバントとしては、上に記載されるような物質のいずれか、および以下に示されるものの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機質含有組成物としては、無機塩類（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、水酸化リン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、（１９９５）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍの第８章および第９章を参照のこと）、または異なる無機化合物の混合物（例えば、リン酸塩と水酸化物アジュバントとの混合物であって、必要に応じて過剰なリン酸塩を含む）のような無機塩類を包含し、この混合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶質、不定形など）を取る化合物を含み、そして塩への吸着を伴うことが好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る（ＰＣＴ公開番号第００／２３１０５号）。
【０１３０】
アルミニウム塩は、Ａｌ^３＋の用量が１用量あたり０．２ｍｇと１．０ｍｇとの間であるように、本発明の組成物中に含有され得る。１つの実施形態において、本発明の組成物に使用するためのアルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２））、またはリン酸緩衝液中の抗原とミョウバンを混合し、次いで水酸化アルミニウムまたは水酸化ナトリウムのような塩基によって滴定し、そして沈殿させることによってインサイチュで形成されるようなミョウバン誘導体である。
【０１３１】
本発明のワクチン処方物において使用するための別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）_３）または優れた吸着剤である結晶質のオキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）であり、これは、１グラムあたり約５００ｍ^２の表面積を有する。あるいは、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ_４）、または水酸化リン酸アルミニウム（水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたは全てのヒドロキシル基の代わりにリン酸基を含む）が、提供される。本明細書中で提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、不定形であり、そして酸性の媒体、塩基性の媒体および中性の媒体において可溶性である。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明の組成物と共に使用するためのアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。それらのより特定の実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムより多量のリン酸アルミニウムを有する（例えば、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの重量比で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１より大きい）。より具体的に、アルミニウム塩は、１ワクチン用量あたり０．４ｍｇ〜１．０ｍｇか、または１ワクチン用量あたり０．４ｍｇ〜０．８ｍｇか、または１ワクチン用量あたり０．５ｍｇ〜０．７ｍｇか、または約１ワクチン用量あたり０．６ｍｇで存在し得る。
【０１３３】
一般的に、好ましいアルミニウムベースのアジュバント、または多数のアルミニウムベースのアジュバントの比（例えば、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウム）は、抗原が所望のｐＨにおいてアジュバントと反対の電荷を保有するような、分子間の静電気引力の最適化によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（等電点＝４）は、リゾチームを吸着するが、ｐＨ７．４においてはアルブミンを吸着しない。アルブミンが標的とされるべき場合、水酸化アルミニウムアジュバント（等電点１１．４）が選択される。あるいは、リン酸による水酸化アルミニウムの前処理は、その等電点を低下させ、水酸化アルミニウムを、より塩基性の抗原について好ましいアジュバントにする。
【０１３４】
（Ｂ．油エマルション）
この組成物中でアジュバントとして使用するのに適した油エマルション組成物としては、スクアレン−水エマルションが挙げられる。特に好ましいアジュバントは、水中油型のサブミクロンエマルションである。本明細書中で使用するための好ましい水中油型のサブミクロンエマルションは、必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水エマルション（例えば、４〜５％（ｗ／ｖ）のスクアレン、０．２５〜１．０％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ ８５^ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、ならびに必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む水中油型のサブミクロンエマルション（例えば、「ＭＦ５９」として公知である水中油型のサブミクロンエマルション））である（国際公開第９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号、ならびにＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）、Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．２７７−２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％（ｗ／ｖ）のスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、および０．５％（ｗ／ｖ）のＳｐａｎ ８５^ＴＭを含み、そして必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を使用してサブミクロン粒子中に処方される。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、１用量あたり約０〜５００μｇの量、より好ましくは１用量あたり０〜２５０μｇの量および最も好ましくは１用量あたり０〜１００μｇの量で存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」とは、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記の水中油型のサブミクロンエマルションをいう一方で、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、１用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥなどを含む。ＭＦ６９（本明細書中で使用するための別の水中油型のサブミクロンエマルション）は、４．３％（ｗ／ｖ）のスクアレン、０．２５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、および０．７５％（ｗ／ｖ）のＳｐａｎ ８５^ＴＭを含み、そして必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む。なお別の水中油型のサブミクロンエマルションは、ＭＦ７５（ＳＡＦとしても公知である）であり、これは、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む。ＭＦ７５はまた、サブミクロンエマルション中にマイクロフルイダイズされる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、１用量あたり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥのようなＭＴＰを含有するＭＦ７５処方物を示す。
【０１３５】
上記組成物に使用するための水中油型のサブミクロンエマルション、水中油型のサブミクロンエマルションおよび免疫刺激性因子（例えば、ムラミルペプチド）を作製する方法は、国際公開第９０／１４８３７号ならびに米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号に詳細に記載される。
【０１３６】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）はまた、本発明の組成物中にアジュバントとして使用され得る。
【０１３７】
（Ｃ．サポニン処方物）
サポニン処方物はまた、上記組成物中にアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な種々の植物種の樹皮、葉、茎、根および花にも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種性の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根）から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。
【０１３８】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製された。これらの技術を使用した特定の精製された画分が同定された。これらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、このサポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示される。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含有し得る（ＰＣＴ公開番号第９６／３３７３９号を参照のこと）。
【０１３９】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが使用されて、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される独特な粒子が形成され得る。代表的に、ＩＳＣＯＭとしてはまた、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭ中に使用され得る。好ましくは、このＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種以上を含む。ＩＳＣＯＭは、欧州特許第０１０９９４２号、国際公開第９６／１１７１１号および同第９６／３３７３９号にさらに記載される。必要に応じて、これらのＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る。国際公開第００／０７６２１号を参照のこと。
【０１４０】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、Ｂａｒｒら、「ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）、３２：２４７−２７１に見出され得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、「Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）、３２：３２１−３３８もまた参照のこと。
【０１４１】
（Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明の組成物と共に、アジュバントとして使用され得る。これらの構造物は、一般的に、ウイルス由来の１種以上のタンパク質を含み、このタンパク質は、必要に応じてリン脂質と組み合わされるか、またはそれと一緒に処方される。これらの構造物は、一般的に、非病原性、非複製性（ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）であり、そして一般的にはネイティブなウイルスゲノムを全く含まない。これらのウイルスタンパク質は組換え的に生成されても、ウイルス全体から、単離されてもよい。ビロゾームまたはＶＬＰに使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質、麻疹ウイルスに由来するタンパク質、シンドビスウイルスに由来するタンパク質、ロタウイルスに由来するタンパク質、口蹄疫ウイルスに由来するタンパク質、レトロウイルスに由来するタンパク質、ノーウォークウイルスに由来するタンパク質、ヒトパピローマウイルスに由来するタンパク質、ＨＩＶに由来するタンパク質、ＲＮＡファージに由来するタンパク質、Ｑβファージに由来するタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージに由来するタンパク質、ｆｒファージに由来するタンパク質、ＡＰ２０５ファージに由来するタンパク質、およびＴｙに由来するタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙのｐ１タンパク質）が挙げられる。ＶＬＰは、国際公開第０３／０２４４８０号、同第０３／０２４４８１号、およびＮｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）、２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）、５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ）−１６ Ｌ１ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）、１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｒｉｓｕ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）、７５（１０）：４７５２−４７６０においてさらに議論される。ビロゾームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら、「Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）、２０：Ｂ１０-Ｂ１６においてさらに議論される。免疫増強性の再構成されたインフルエンザビロゾーム（ＩＲＩＶ）は、サブユニット抗原送達システムとして、鼻腔内における三価のＩＮＦＬＥＸＡＬ^ＴＭ製品（ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ、（２００２）、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０補遺、５：Ｂ１７−２３）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳ^ＴＭ製品において使用される。
【０１４２】
（Ｅ．細菌性誘導体または微生物性誘導体）
本発明の組成物中に使用するのに適したアジュバントとしては、以下のような細菌性誘導体または微生物性誘導体が挙げられる。
【０１４３】
（（１）腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体）
このような誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４個か、５個かまたは６個のアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は、欧州特許第０６８９４５４号に開示される．３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２ミクロンのメンブレン（欧州特許第０６８９４５４号を参照のこと）を通して濾過滅菌されるために十分小さい。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）のようなモノホスホリルリピドＡ模倣物が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：２２７３−２２７８を参照のこと。
【０１４４】
（（２）リピドＡ誘導体）
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、「ＯＭ−１７４、ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２−３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）、２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋら、「Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）、２１：８３６−８４２に記載される。
【０１４５】
（（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
アジュバントとして使用するのに適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（メチル化されていないシトシンの後に、リン酸結合によって連結されるグアノシンを含む配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む細菌の二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドはまた、免疫刺激性であることが示された。
【０１４６】
これらのＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾物／アナログ（例えば、ホスホロチオエート修飾物）を含み、そして二本鎖であっても一本鎖であってもよい。必要に応じて、このグアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンのようなアナログによって置換され得る。考えられるアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ： ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）、３１（９）：２３９３−２４００；国際公開第０２／２６７５７号および同第９９／６２９２３号を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ、「ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）、９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ」、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）、３２：１７９−１８５；国際公開第９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号および同第６，４２９，１９９号においてさらに議論される。
【０１４７】
上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはモチーフＴＴＣＧＴＴ）に関し得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）、３１（第３部）：６５４−６５８を参照のこと。このＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）であり得るか、またはＣｐＧ配列は、Ｂ細胞の応答の誘導に、より特異的（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、「ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）、１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ、「Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）、２３（２）：６４−６５および国際公開第０１／９５９３５号において議論される。好ましくは、このＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１４８】
好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプターの認識のために使用され得るように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、それらの３’末端同士で接続されて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る．例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、ＢＢＲＣ（２００３）、３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＧｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）、３１（第３部）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら、「ＣｐＧ ｐｅｎｔａ− ａｎｄ ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」、ＢＢＲＣ（２００３）、３００：８５３−８６１および国際公開第０３／０３５８３６号を参照のこと。
【０１４９】
（（４）ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体）
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、上記組成物中にアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）から得られる。無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、国際公開第９５／１７２１１号に記載され、そして非経口アジュバントとしての使用は国際公開第９８／４２３７５号に記載される。好ましくは、このアジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇ）である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献中に見出され得る：Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎａｈｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）、７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）、１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２、ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）、２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ、Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）、６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）、６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴＫ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）、６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）、２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）、「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）」、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）、８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換についての数値的参照は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）、１５（６）：１１６５−１１６７に示されるＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアライメントに基づく。
【０１５０】
（Ｆ．生体接着物および粘膜接着物）
生体接着物および粘膜接着物はまた、本組成物中にアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着物としては、エステル化したヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら、（２００１）、Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）または粘膜接着物（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体はまた、本組成物中にアジュバントとして使用され得る。例えば、国際公開第９９／２７９６０号を参照のこと。
【０１５１】
（Ｇ．微粒子）
微粒子はまた、本組成物中にアジュバントとして使用され得る。微粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒子、および最も好ましくは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）は、生分解性かつ非毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成され、この物質としては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい。必要に応じて、この微粒子は、（例えば、ＳＤＳによって）負に荷電した表面を有するか、または（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤によって）正に荷電した表面を有するように処理される。
【０１５２】
（Ｈ．リポソーム）
アジュバントとして使用するのに適したリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、同第５，９１６，５８８号、および欧州特許第０６２６１６９号に記載される。
【０１５３】
（Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
上記組成物中に使用するのに適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。例えば、国際公開第９９／５２５４９号を参照のこと。このような処方物は、オクトオキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステルの界面活性剤（国際公開第０１／２１２０７号）、および少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトオキシノール）と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルエステルの界面活性剤（国際公開第０１／２１１５２号）をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１５４】
（Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）、１９（１−３）：１０９−１１５およびＰａｙｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）、３１（３）：１８５−１９６に記載される。
【０１５５】
（Ｋ．ムラミルペプチド）
アジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１５６】
（Ｌ．イミダゾキノリン化合物）
上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノリン化合物の例としては、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄおよびそのアナログが挙げられ、これらは、Ｓｔａｎｌｅｙ、「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）、２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）、４（２）：２１４−２１８；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号、および同第５，５２５，６１２号にさらに記載される。
【０１５７】
（Ｍ．チオセミカルバゾン化合物）
上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適したチオセミカルバゾン化合物の例、および上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適した全ての化合物を、処方し、製造し、そしてスクリーニングする方法としては、国際公開第０４／６０３０８号に記載されるものが挙げられる。これらのチオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）を産生するためのヒト末梢血単核細胞の刺激において、特に有効である。
【０１５８】
（Ｎ．トリプタントリン化合物）
上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適したトリプタントリン化合物の例、および上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適した全ての化合物を、処方し、製造し、そしてスクリーニングする方法としては、国際公開第０４／６４７５９号に記載されるものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）を産生するためのヒト末梢血単核細胞の刺激において、特に有効である。
【０１５９】
（Ｏ．ヒト免疫調節因子）
上記組成物中にアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節因子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子のようなサイトカインが挙げられる。
【０１６０】
上記組成物はまた、上で同定されるアジュバントの１種以上の局面の組み合わせを含有し得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：
（１）サポニンおよび水中油型エマルション（国際公開第９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（国際公開第９４／００１５３号を参照のこと）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（国際公開第９８／５７６５９号）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルションとの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、同第０７３５８９８号および同第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルションにマイクロフルイダイズされるか、またはボルテックスされてより大きい粒子サイズのエマルションを生成するＳＡＦ；
（７）２％のスクアレン、０．２％のＴＷＥＥＮ ８０、およびモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）と、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）と、細胞壁骨格（ＣＷＳ）とからなる群由来の１種以上の細菌の細胞壁構成成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに
（８）１種以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）；
（９）１種以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１６１】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射可能なワクチンと使用するために好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着物は、粘膜を介して送達されるワクチン（例えば、経鼻のワクチン）と共に使用するために好ましいアジュバントである。
【０１６２】
（ＨＣＶ特異的抗体を産生する方法）
上記ＨＣＶ融合タンパク質が使用されて、ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体が産生され得る。ＨＣＶ特異的ポリクローナル抗体およびＨＣＶ特異的モノクローナル抗体は、ＨＣＶ抗原と特異的に結合する。ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマ）に融合タンパク質を投与することによって産生され得る。免疫化された動物から血清が収集され、そして例えば、硫酸アルミニウムによって沈殿させ、次いでクロマトグラフィー（好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー）を行うことによって、抗体が血漿から精製される。ポリクローナル抗血清を産生し、そして処理するための技術は、公知である。
【０１６３】
融合タンパク質中に存在するＨＣＶ特異的エピトープに対して指向されるモノクローナル抗体もまた、容易に産生され得る。ＨＣＶ融合タンパク質によって免疫化された哺乳動物（例えば、マウス）由来の正常なＢ細胞は、例えば、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマを産生し得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを使用して同定され得、そして半固体の寒天中でクローニングすることによってか、または限界希釈によって単離され得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生するクローンは、別の回のスクリーニングによって単離される。
【０１６４】
ＨＣＶエピトープに対して指向される抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれかである）は、サンプル（例えば、ＨＣＶに感染したヒトから得た血清サンプル）中のＨＣＶまたはＨＣＶ抗原の存在を検出するために、特に有用である。ＨＣＶ抗原に対する免疫アッセイは、１種の抗体または数種の抗体を利用し得る。ＨＣＶ抗原に対する免疫アッセイは、例えば、ＨＣＶエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体、１種のＨＣＶポリペプチドのエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるＨＣＶポリペプチドのエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体、同じＨＣＶ抗原に対して指向されるポリクローナル抗体、異なるＨＣＶ抗原に対して指向されるポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用し得る。免疫アッセイプロトコールは、例えば、標識化抗体を使用する、例えば、競合型アッセイ、直接反応型アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。これらの標識は、例えば、蛍光、化学発光、または放射活性であり得る。
【０１６５】
これらのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体がさらに使用されて、ＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原が免疫親和性カラムによって単離され得る。これらの抗体は、これらの抗体がそれらの免疫選択活性を保持するように、例えば、吸着または共有結合的な連結によって固体支持体に固定され得る。必要に応じて、スペーサー群は、抗体の抗原結合部位が接近可能なままであるように、含まれ得る。次いでこれらの固定化された抗体が使用されて、生物学的サンプル（例えば、血液または血漿）からのＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原が結合され得る。これらの結合されたＨＣＶ粒子またはＨＣＶ抗原は、例えば、ｐＨの変化によってカラムマトリックスから回収される。
【０１６６】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞）
ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質を含む上に記載される融合体（ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まない）、および本明細書中に記載される種々の他の融合体のいずれかによって活性化され、これらの融合体は、インビボまたはインビトロで発現される。好ましくは、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドまたはＮＳ５ｂポリペプチド）のエピトープを認識し、これらのエピトープとしては、ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まない、ＮＳ５ｔを有するこれらのペプチドの１つ以上の融合体のエピトープが挙げられる。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋であり得る。
【０１６７】
ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣのクラスＩ分子と複合体化されたこれらのエピトープのいずれかを表示するＨＣＶ感染細胞を殺傷し得る細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得る。ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイ（実施例を参照のこと）によって検出され得る。^５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の、これらのエピトープの１種以上を表示する標的細胞を溶解する能力を測定する。抗ウイルス因子（例えば、ＩＦＮ−γ）を発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞もまた、本明細書中で企図され、そしてこの細胞はまた、免疫学的方法（好ましくは、ＨＣＶポリペプチド（例えば、Ｅ２ポリペプチド、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチド、またはＮＳ５ｂポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）の１種以上によるインビトロ刺激後にＩＦＮ−γまたは同様のサイトカインを細胞内染色することによって）によって検出され得る（実施例を参照のこと）。
【０１６８】
ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋細胞は、ｃｏｒｅポリペプチドを含むかまたはこれを含まない、上に記載される融合体（ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）によって活性化され、これらの融合体は、インビボまたはインビトロで発現される。好ましくは、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ２ポリペプチド、ｐ７ポリペプチド、Ｅ１ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチド、ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、ＮＳ５ａポリペプチドまたはＮＳ５ｂポリペプチドであるが、これらに限定されない）のエピトープ（これらの融合体のエピトープを含む）を認識し、そしてＨＣＶ感染細胞上のＭＨＣのクラスＩＩ分子に結合されて、例えば、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質（ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まない）の刺激に応答して増殖する。
【０１６９】
ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、リンパ球増殖アッセイによって検出され得る（実施例を参照のこと）。リンパ球増殖アッセイは、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の、例えば、ＮＳ２エピトープ、ｐ７エピトープ、Ｅ１エピトープ、Ｅ２エピトープ、ＮＳ３エピトープ、ＮＳ４エピトープ、ＮＳ５ａエピトープ、および／またはＮＳ５ｂエピトープに応答して増殖する能力を測定する。
【０１７０】
（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する方法）
上記ＨＣＶ融合タンパク質またはＨＣＶ融合ポリヌクレオチドが使用されて、インビトロまたはインビボのいずれかでＨＣＶ特異的Ｔ細胞が活性化され得る。ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化が使用されて、特に、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答を最適化するモデル系が提供され、そしてＨＣＶ感染に対する予防的処置または治療的処置が提供され得る。インビトロの活性化に関して、タンパク質は、好ましくは上に記載されるようなプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を介してＴ細胞に供給される。
【０１７１】
Ｔ細胞のポリクローナル集団は、ＨＣＶに感染した哺乳動物の血液に由来し得、そして好ましくはＨＣＶによって感染した哺乳動物の末梢リンパ器官（例えば、リンパ節、脾臓、または胸腺）に由来し得る。好ましい哺乳動物としては、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが挙げられる。ＨＣＶは、哺乳動物において活性化されたＨＣＶ特異的Ｔ細胞の数を増やすように機能する。次いで哺乳動物に由来するＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、本明細書中に記載されるようなＨＣＶ融合タンパク質（例えば、ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まないＨＣＶ ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＨＣＶ Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）をこれらのＴ細胞に添加することによってインビトロで再刺激され得る。次いでこれらのＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、特に、増殖、ＩＦＮ−γの産生、およびインビトロでＨＣＶエピトープを表示する標的細胞を溶解する能力について試験され得る。
【０１７２】
リンパ球増殖アッセイ（実施例６を参照のこと）において、ＨＣＶによって活性化されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、ＨＣＶポリペプチド（例えば、ＮＳ３エピトープペプチド、ＮＳ４エピトープペプチド、ＮＳ５ａエピトープペプチド、ＮＳ５ｂエピトープペプチド、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープペプチド、またはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）と一緒に培養される場合に増殖するが、エピトープペプチドの非存在下においては増殖しない。したがって、ＨＣＶ特異的ＣＤ４^＋ Ｔ細胞によって認識される特定のＨＣＶエピトープ（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、およびこれらのエピトープの融合体（例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープおよびＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープが挙げられるが、これらに限定されない））は、リンパ球増殖アッセイを使用して同定され得る。
【０１７３】
同様に、上に記載される融合タンパク質によるインビトロでの刺激後の、ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの検出が使用されて、例えば、ＩＦＮ−γを産生するためのＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞の刺激において特に有効である融合タンパク質エピトープ（例えば、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、およびこれらのエピトープ融合体（例えば、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープおよびＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープが挙げられるが、これらに限定されない）のエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）が同定され得る（実施例５を参照のこと）。
【０１７４】
さらに、^５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答のレベルを決定するために特に有用である。Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９−４４９を参照のこと。例えば、ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、ＨＣＶに感染した哺乳動物の肝臓に由来し得る。これらのＴ細胞は、例えば、Ｅ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープまたはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープを表示する標的細胞に対する^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験され得る。異なるＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープまたはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープを発現する数種の標的細胞集団は、それぞれの標的細胞集団がＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５またはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５の異なるエピトープを表示するように構築され得る。これらのＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋細胞は、これらの標的細胞集団の各々に対してアッセイされ得る。^５１Ｃｒ放出アッセイの結果が使用されて、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープまたはＥ２ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５エピトープのどちらがＨＣＶに対する最も強いＣＴＬ応答を引き起こすかが決定され得る。次いで最も強いＣＴＬ応答を引き起こすエピトープを含むＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質（ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まない）は、^５１Ｃｒ放出アッセイから得た情報を使用して構築され得る。
【０１７５】
上に記載されるようなＨＣＶ融合タンパク質、またはこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、哺乳動物（例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に投与されて、インビボでＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化するような体液性および／または細胞性免疫応答が刺激され得る。投与は、当該分野において公知である任意の手段によるものであり得、これらとしては、上記で議論されるような、生物学的な弾道銃（「遺伝子銃」）を使用する注入を含む、非経口的な注入、鼻腔内注入、筋肉内注射または皮下注射が挙げられる。
【０１７６】
好ましくは、ＨＣＶポリヌクレオチドの注入が使用されて、Ｔ細胞が活性化される。構築および改変の単純性の実施上の利点に加えて、これらのポリヌクレオチドの注入は、宿主における融合タンパク質の合成をもたらす。したがって、これらの免疫原は、ネイティブな翻訳後修飾、ネイティブな構造、およびネイティブなコンホメーションで、宿主の免疫系に提示される。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ヒトのような大型哺乳動物に対して、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内に注入される。
【０１７７】
ＨＣＶ融合タンパク質またはＨＣＶ融合ポリヌクレオチドを含有する本発明の組成物は、使用される特定の組成物に適合する様式で、かつＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化する（特に、^５１Ｃｒ放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイ、またはＩＦＮ−γの細胞内染色によって測定される）のに有効である量で投与される。これらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＨＣＶによって感染されていない哺乳動物に投与され得るか、またはＨＣＶに感染した哺乳動物に投与され得る。組成物におけるこれらのポリヌクレオチドまたは融合タンパク質の特定の投薬量は、多くの因子に依存し、この因子としては、この組成物が投与される哺乳動物の種、年齢、および全身状態、ならびにこの組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験のみを使用して容易に決定され得る。上に記載されるインビトロモデルおよびインビボモデルが利用されて、適切な用量が決定され得る。以下に記載される実施例において使用されるポリヌクレオチドの量は、インビボまたはインビトロのいずれかにおけるＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために使用され得る一般的な指標を提供する。一般に、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのＨＣＶ融合タンパク質またはＨＣＶ融合ポリヌクレオチド（ｃｏｒｅポリペプチドを含むか、またはこれを含まない）が、大型哺乳動物（例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に投与される。所望される場合、同時刺激性の分子または同時刺激性のアジュバントはまた、これらの組成物の前か、これらの組成物の後か、またはこれらの組成物と一緒に提供される。
【０１７８】
本発明の組成物の送達によって生成される哺乳動物の免疫応答（ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化が挙げられる）は、投薬量、投与経路、または追加免疫レジメンを変えることによって増強され得る。本発明の組成物は、単一用量スケジュールで与えられ得るか、または好ましくは複数用量スケジュールで与えられ得、複数用量スケジュールにおいて、ワクチン接種の第１の過程は１回〜１０回の別個の用量を含み、次いで免疫応答を維持するか、そして／または強化するのに必要とされる時間間隔（例えば、第２の用量について１〜４ヶ月）の後に他の用量を与えられ、および必要に応じて、数ヶ月後の次なる用量が与えられる。
【０１７９】
（３．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のみのために提供され、そして決して本発明の範囲を限定することを意図しない。当業者は、本発明が、本開示の教示によって与えられる種々の方法で実施され得ることを、容易に理解する。
【０１８０】
使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するために努力がなされたが、ある程度の実験的な誤差および偏差は、当然に考慮されるべきである。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１．ＮＳ５ＣｏｒｅポリヌクレオチドおよびＮＳ５ＣｏｒｅポリペプチドならびにＮＳ５ｔＣｏｒｅポリヌクレオチドおよびＮＳ５ｔＣｏｒｅポリペプチドの生成）
以下の実施例のＮＳ５ｔは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸を含むＣ末端切断ＮＳ５分子を示す。
【０１８２】
ＮＳ５ｔをコードするポリヌクレオチドを、標準的な組換え技術を使用して調製し、そしてこの構築物を、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるような、全長ポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含んだｃｏｒｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合して、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１を得た。
【０１８３】
ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１ポリヌクレオチドを、クローニングしそしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させた。特に、ＮＳ５Ｃｏｒｅタンパク質を酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１を使用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために遺伝子操作した。このベクターは、酵母における自律複製のために２μ配列を含み、そして選択マーカーとして酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよび酵母遺伝子ＵＲＡ３を含む。細菌におけるプラスミドの複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点ならびにα因子ターミネーターもまた、この発現ベクターに存在する。組換えタンパク質の発現は、ハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にある。
【０１８４】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＮＩ制限酵素末端を有する合成オリゴヌクレオチド（２７ｂｐ）を、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターとＨＣＶ−１ ＮＳ５ａとの間の連結部において使用した。ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂの一部をコードする２８９３ｂｐのＥｃｏＮＩ−ＮｄｅＩ制限酵素フラグメントを、ｐｄ．Δｎｓ３ｎｓ５Ｐｊｃｏｒｅ１２１ＲＴ（ＰＣＴ公開番号第０１／３８３６０号に記載される）からゲル精製した。ＮｄｅＩ末端およびＮｏｔＩ末端を有する合成オリゴヌクレオチド（２０５ｂｐ）を、ＮＳ５ｂ切断とｃｏｒｅとの間の連結のために使用した。ｃｏｒｅ１２１についての３１８ｂｐのＮｏｔＩ−ＳａｌＩ制限フラグメントを、ｐＴ７Ｂｌｕｅ２．ＨＣＶ１２１（ＰＣＴ公開番号第０１／３８３６０号に記載される）からゲル精製した。ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードする３４４２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩポリヌクレオチド全体を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にサブクローニングし、そして配列を確認した。その後、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１ポリヌクレオチドを、ｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター中のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターと連結した。
【０１８５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３（ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂ−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃ１−４０７，ｃｉｒ°，ｔｒｐ＋，：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］）を、酵母発現プラスミドによって形質転換し、そして単一の形質転換体を、培地中のグルコースの枯渇後の発現について確認した。細胞ペレットを、ガラスビーズによって溶解した。可溶性画分および不溶性画分のアリコートを、ＳＤＳサンプル緩衝液＋５０ｍＭのＤＴＴ中で煮沸し、４％〜２０％トリス−グリシンゲルで電気泳動し、そしてクマ−シーブルーによって染色した。これらの組換えタンパク質を、ガラスビーズによる溶解後の不溶性画分から得たサンプルにおいて検出した。
【０１８６】
ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１の発現を、全長ＮＳ５配列（全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜３０１１）を含む構築物であるＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１の発現と、２５℃および３０℃にて比較した。図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、ＮＳ５ｔを含む構築物の発現は、全長ＮＳ５配列を含む構築物の発現より多かった。
【０１８７】
（実施例２．ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔポリヌクレオチドおよびＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔポリペプチドならびにＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅポリヌクレオチドおよびＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅポリペプチドの生成）
以下の実施例のＮＳ３^＊は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた１１６５位において通常見出されるセリンを置換したアラニンを有する、改変ＮＳ３分子を示す。
【０１８８】
ＮＳ３ＮＳ４（ＨＣＶ−１に対して番号付けされた約アミノ酸１０２７〜１９７２）をコードするポリヌクレオチド（本明細書中で「ＮＳ３４」とも称される）を、ＨＣＶから単離する。この分子のＮＳ３部分を、得られる分子がＮＳ３プロテアーゼ活性を欠くように、１１６５位に見出されるＳｅｒ残基についてのコード配列をＡｌａについてのコード配列へ変異させることによって変異誘発させる（ｍｕｔａｇｅｎｚｙ）。この構築物を、実施例１に記載されるＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードするポリヌクレオチドと融合して、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１を得る。あるいは、この分子をＮＳ５ｔと融合して、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔを生成する。これらの構築物を、プラスミドベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびアデノウイルスベクター中にクローニングする。さらに、これらの構築物を、組換え発現ベクター中に挿入し、そしてこのベクターを使用して、宿主細胞を形質転換し、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１融合タンパク質およびＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質を産生する。
【０１８９】
プロテアーゼ酵素活性を、以下の通りに決定する。ＮＳ４Ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ）、および目的の融合タンパク質を、９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０．０５ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、５ｍＭのＤＴＴ）中に希釈し、そして室温で３０分間混合させる。９０μｌの上記混合物を、マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に添加し、そして１０μｌのＨＣＶ基質（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を添加する。このプレートを、混合し、そしてＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダー上で読み取る。結果を１分間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表す。
【０１９０】
（実施例３．Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔポリヌクレオチドおよびＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔポリペプチドならびにＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅポリヌクレオチドおよびＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅポリペプチドの生成）
以下の実施例のＥ２は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５を含むＣ末端切断Ｅ２分子を示す。切断Ｅ２分子をコードするポリヌクレオチドは、米国特許第６，１２１，０２０号および同第６，３２６，１７１号に記載される方法を使用して生成される。ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードするポリヌクレオチドは、実施例２に記載されるように生成される。これらの構築物を融合して、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１およびＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔを得る。これらの構築物を、プラスミドベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびアデノウイルスベクター中にクローニングする。さらに、これらの構築物を、組換え発現ベクター中に挿入し、そしてこのベクターを使用して宿主細胞を形質転換し、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１融合タンパク質およびＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ融合タンパク質を産生する。プロテアーゼ酵素活性は、上に記載されるように決定される。
【０１９１】
（実施例４．ワクチン接種された動物におけるＨＣＶ特異的ＣＴＬの初回刺激）
上に記載されるように生成されるＨＣＶ融合タンパク質（ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１およびＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ）を使用して、ＨＣＶ融合ＩＳＣＯＭを以下のように生成する。これらの融合ＩＳＣＯＭ処方物を、所望の融合タンパク質と前に形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（空のＩＳＣＯＭ）とを混合することにより、融合タンパク質とアジュバントとの間の会合を最大限にするためにイオン性相互作用を利用して調製される。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは、本質的に、Ｃｏｕｌｔｅｒら、（１９９８）、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３に記載されるように調製される。
【０１９２】
Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓを、麻酔下において免疫化する。動物を、２つの群に分ける。第１の群を、０ヶ月目において２×１０^８プラーク形成単位（ｐｆｕ）（皮内に１×１０^８および乱切法によって１×１０^８）のｒＶＶＣ／Ｅ１で感染させる。この群は、ＣＴＬ初回刺激についてのポジティブコントロールとして機能する。第２の群由来の動物を、左大腿四頭筋における筋肉内（ＩＭ）注射によって、０ヶ月目、１ヶ月目、２ヶ月目および６ヶ月目に、上に記載されるようなＩＳＣＯＭに吸着された２５〜１００μｇのＨＣＶ融合ポリペプチドを用いて免疫化する。細胞障害活性を、例えば、Ｐａｌｉａｒｄら、（２０００）、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：２７３に記載されるような標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにおいてアッセイする。
【０１９３】
（実施例５．融合ポリヌクレオチドによる免疫化）
１つの免疫化プロトコールにおいて、動物を、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする５０〜２５０μｇのプラスミドＤＮＡを用い、前脛骨筋中への筋肉内注射によって免疫化する。ＮＳ５ａ（腹腔内）、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^７ｐｆｕのワクシニアウイルス（ＶＶ）の追加免疫注射、または５０〜２５０μｇのプラスミドコントロール（筋肉内）の追加免疫注射を、６週間後に提供する。
【０１９４】
別の免疫化プロトコールにおいて、動物に、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^１０個のアデノウイルス粒子で、前脛骨筋において筋肉内に注射する。１０^７ｐｆｕのＶＶ−ＮＳ５ａの腹腔内追加免疫注射、またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^１０個のアデノウイルス粒子の筋肉内追加免疫注射を、６週間後に提供する。
【０１９５】
（実施例６．ＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化）
（^５１Ｃｒ放出アッセイ。）^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞のＮＳ５ａエピトープを表示する標的細胞を溶解する能力を測定する。脾臓細胞を、免疫化された動物からプールする。これらの細胞を、ＩＬ−２の存在下において、ＨＣＶ−ＮＳ５ａ由来のＣＴＬエピトープペプチドｐ２１４Ｋ９（２１５２−ＨＥＹＰＶＧＳＱＬ−２１６０；配列番号１）によって、６日間インビトロで再刺激する。次いでこれらの脾臓細胞を、、クラスＩのＭＨＣ分子を発現するが、クラスＩＩのＭＨＣ分子を発現しない、ペプチドによって感作された標的細胞（Ｌ９２９）に対する標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｗｅｉｓｓ、（１９８０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：９９１２−９９１７に記載される）において、細胞障害活性についてアッセイする。エフェクター（Ｔ細胞）対標的（Ｂ細胞）の比６０：１、２０：１、および７：１を、試験する。特異的溶解の％を、各エフェクター対標的について計算する。
【０１９６】
（実施例７．ＩＦＮ−γを発現するＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化）
（インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）に対する細胞内染色。）ＩＦＮ−γに対する細胞内染色を使用して、ＮＳ５ａエピトープｐ２１４Ｋ９によるインビトロでの刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８^＋ Ｔ細胞を同定する。個々の免疫化された動物の脾臓細胞を、ＩＬ−２およびモネンシンの存在下において、ｐ２１４Ｋ９または非特異的ペプチドのいずれかによって、６〜１２時間インビトロで再刺激する。次いでこれらの細胞は、表面のＣＤ８および細胞内のＩＦＮ−γについて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析する。次いでＩＦＮ−γについてもまたポジティブであるＣＤ８^＋ Ｔ細胞の％を、計算する。
【０１９７】
（実施例８．ＨＣＶ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖）
（リンパ球増殖アッセイ。）プールした免疫化された動物由来の脾臓細胞を、磁性ビーズの使用によってＣＤ８^＋ Ｔ細胞を枯渇させ、そしてｐ２２２Ｄ、ＨＣＶ−ＮＳ５ａ由来のＮＳ５ａエピトープペプチド（２２２４−ＡＥＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧ−２２３８；配列番号２）、または培地単独のいずれかを用いて３通りで培養する。７２時間後、細胞を、１ウェルあたり１μ Ｃｉの^３Ｈ−チミジンによってパルスし、そして６〜８時間後に回収する。放射能の取り込みを、回収後に測定する。平均ｃｐｍを、計算する。
【０１９８】
（実施例９．融合ＤＮＡワクチン処方物のＣＴＬを初回刺激する能力）
動物を、上記のＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０〜２５０μｇのプラスミドＤＮＡ；ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードするＰＬＧに連結したＤＮＡ（以下を参照のこと）；またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔコードするＤＮＡのいずれかをエレクトロポレーションを介して送達する（この送達技術については、例えば、国際公開第００４５８２３号を参照のこと）ことによって、免疫化する。免疫化の後、６週間目に、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードするプラスミドＤＮＡの追加免疫注射を行う。
【０１９９】
（ＰＬＧによって送達されるＤＮＡ。）ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマーを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手する。このＰＬＧポリマーは、ＲＧ５０５であり、これは、５０／５０のコポリマーの比および６５ｋＤａの分子量（製造業者のデータ）を有する。吸着されたＤＮＡを含むカチオン性微粒子を、本質的にＳｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）、９７：８１１−８１６に記載されるような改変溶媒エバポレーション処理を使用して調製する。簡潔には、これらの微粒子を、ＩＫＡホモジナイザーを高速で使用して、１ｍｌのＰＢＳを含む塩化メチレン中の、５％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液（１０ｍＬ）を乳化することによって調製する。次いで第一エマルションを、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）（０．５％（ｗ／ｖ））を含む５０ｍｌの蒸留水に添加する。これを、室温で１２時間、６０００ｒｐｍにて攪拌し、塩化メチレンを蒸発させて、ｗ／ｏ／ｗ型エマルション形成をもたらす。得られた微粒子を、蒸留水中で、１０，０００ｇでの遠心分離によって２回洗浄し、そして凍結乾燥させる。調製、洗浄および収集の後、ＤＮＡ構築物を、ＤＮＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液中で１００ｍｇのカチオン性微粒子を４℃で６時間インキュベートすることによって微粒子上に吸着させる。次いでこれらの微粒子を、遠心分離によって分離し、ペレットをＴＥ緩衝液によって洗浄し、微粒子を、凍結乾燥する。
【０２００】
ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γの発現を、上記の実施例に記載されるように、^５１Ｃｒ放出アッセイまたは細胞内染色によって測定する。
【０２０１】
（実施例１０．免疫化経路および融合タンパク質についてコードするレプリコン粒子ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）、９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物に、ＮＳ３^＊４５ｔＣｏｒｅについてコードする５×１０^６ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子を用い、上に記載されるように筋肉内（ＩＭ）注射するか、もしくは尾の基部（ＢｏＴ）および肉球（ＦＰ）において皮下（Ｓ／Ｃ）注射するか、または２／３のＤＮＡをＩＭ投与を介して送達し、かつ１／３をＢｏＴ経路を介して送達する組み合わせで、注射する。これらの免疫化の後に、上に記載されるようなワクシニアウイルスの追加免疫注射を行う。ＩＦＮ−γの発現を、上記の実施例に記載されるような細胞内染色によって測定する。
【０２０２】
（実施例１１．アルファウイルスレプリコンの初回刺激、その後の種々の追加免疫レジメン）
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋））を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）、９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物を、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）（上に記載されるような融合タンパク質をコードする１．５×１０^６ＩＵのレプリコン粒子）を用いた前脛骨筋への筋肉内注射によって初回刺激し、次いで６週間目においてＮＳ５ａ、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔについてコードする１０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡ；ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^１０アデノウイルス粒子；ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１．５×１０^６ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子；またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^７ｐｆｕのワクシニアウイルスのいずれかによる追加免疫を行う。ＩＦＮ−γの発現を、上に記載されるような細胞内染色によって測定する。
【０２０３】
（実施例１２．ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔを発現するアルファウイルス）
アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩＮＣＲ（ＬＰ））を、Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）、９６：４５９８−４６０３に記載されるように調製する。動物を、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１×１０^２ＩＵ〜１×１０^６ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコンを用い、送達経路の組み合わせ（２／３ ＩＭおよび１／３ Ｓ／Ｃ）を介して、およびＳ／Ｃ単独によって免疫化するか、またはＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１もしくはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１×１０^２ＩＵ〜１×１０^６ＩＵのＳＩＮＣＲ（ＬＰ）レプリコン粒子を用い、送達経路の組み合わせ（２／３ ＩＭおよび１／３ Ｓ／Ｃ）およびＳ／Ｃ単独によって免疫化する。これらの免疫化の後、６週間目に、ＮＳ５ａ、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１、ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔ、Ｅ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１またはＥ２ＮＳ３^＊ＮＳ４ＮＳ５ｔをコードする１０^７ｐｆｕのワクシニアウイルスの追加免疫注射を行う。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５に記載されるような細胞内染色によって測定する。
【０２０４】
したがって、Ｃ末端切断ＨＣＶ ＮＳ５およびこれを含む融合ポリペプチドが、開示される。本発明の好ましい実施形態は、ある程度詳細に記載されているが、明らかな変更は特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域を示す、ＨＣＶゲノムの図示である。
【図２】図２（配列番号３および配列番号４）は、代表的なネイティブの未改変ＮＳ３プロテアーゼドメインの、ＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図３】図３（配列番号５および配列番号６）は、Ｎ末端からＮＳ３プロテアーゼドメインを欠失し、そしてＣ末端上にＣｏｒｅのアミノ酸１〜１２１を含む代表的な改変融合タンパク質の、ＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３における、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１（ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜２９９０およびｃｏｒｅのアミノ酸１〜１２１）とＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１（全長ＮＳ５、ＮＳ５のアミノ酸１９７３〜３０１１およびｃｏｒｅのアミノ酸１〜１２１）との発現レベルの比較を示す。図４Ａは、２５℃での発現レベルを示し、そして図４Ｂは、３０℃での発現レベルを示す。レーン１、基準；レーン２、プラスミドのコントロール；レーン３、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン６）；レーン４、ＮＳ５ｔＣｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン７）；レーン５、ＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン８）；レーン６、ＮＳ５Ｃｏｒｅ１２１をコードするプラスミド（クローン９）；レーン７、基準。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅ（配列番号７および配列番号８）は、ｃｏｒｅポリペプチドに融合したＮＳ５ポリペプチドのＣ末端を有するＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドを含む代表的な融合タンパク質のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。特に、このＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１〜１２１を含むｃｏｒｅポリペプチドに融合した、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９７３〜２９９０（Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）を含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、全長ＮＳ５ａポリペプチドおよびＮＳ５ｂポリペプチドのＮ末端部分を含む、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２５００とＣ末端との間の位置にて切断される、請求項１に記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２９００とＣ末端との間の位置にて切断される、請求項１に記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸２９９０の直後のアミノ酸に対応するアミノ酸にて切断される、請求項３に記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドおよびＮＳ５領域以外のＨＣＶポリタンパク質の領域に由来する少なくとも１種のポリペプチドを含む、免疫原性融合タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＨｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む改変ＮＳ３ポリペプチドをさらに含むことによって、該改変ＮＳ３ポリペプチドがＨＣＶ融合タンパク質中に存在する場合にプロテアーゼ活性が阻害される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記改変ＮＳ３ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、改変ＮＳ３ポリペプチド、ＮＳ４ポリペプチド、および必要に応じてＨＣＶｃｏｒｅポリペプチドを含む、請求項６〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、Ｃ末端の切断を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列からなる、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、Ｅ２ポリペプチドをさらに含む、請求項６〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｅ２ポリペプチドが、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５に対応するアミノ酸配列からなるＣ末端切断Ｅ２ポリペプチドである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合体中に存在する前記ポリペプチドの各々が、同じＨＣＶ単離物に由来する、請求項６〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合体中に存在する前記ポリペプチドの少なくとも１種が、前記Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドと異なる単離物に由来する、請求項６〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、本質的に、以下：
（ａ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含むことによって、プロテアーゼ活性が阻害される、改変ＮＳ３ポリペプチド；
（ｂ）ＮＳ４ポリペプチド；
（ｃ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド；および
（ｄ）必要に応じて、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチド、
からなる、免疫原性融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチドを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、Ｃ末端の切断を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列からなる、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、本質的に、以下：
（ａ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸３８４〜７１５に対応するアミノ酸配列からなるＣ末端切断Ｅ２ポリペプチド；
（ｂ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸のアラニンへの置換を含むことによって、プロテアーゼ活性が阻害される、改変ＮＳ３ポリペプチド；
（ｃ）ＮＳ４ポリペプチド；
（ｄ）全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされたアミノ酸１９７３〜２９９０に対応するアミノ酸配列からなる、Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチド；および
（ｅ）必要に応じて、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチド、
からなる、免疫原性融合タンパク質。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、ＨＣＶｃｏｒｅポリペプチドを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、Ｃ末端の切断を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ｃｏｒｅポリペプチドが、図３のアミノ酸１７７２位〜１８９２位に示されるアミノ酸の配列からなる、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれかに記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドを、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含有する組成物。
【請求項２３】
請求項６〜２１のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含有する組成物。
【請求項２４】
請求項２２または請求項２３のいずれかに記載の組成物であって、さらなるＨＣＶ免疫原性ポリペプチドを、さらに含有する、組成物。
【請求項２５】
前記さらなるＨＣＶ免疫原性ポリペプチドは、Ｅ１Ｅ２複合体を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
脊椎動物被験体中の細胞性免疫応答を刺激する方法であって、請求項２２〜２５のいずれかに記載の組成物の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のいずれかに記載の組成物の使用であって、脊椎動物被験体中の細胞性免疫応答を刺激する方法における、使用。
【請求項２８】
請求項１〜５のいずれかに記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドまたは請求項６〜２１のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質の使用であって、脊椎動物被験体中の細胞性免疫応答を刺激するための医薬の製造における、使用。
【請求項２９】
組成物を生成するための方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドまたは請求項６〜２１のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質と、薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合わせる工程を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項１〜５のいずれかに記載のＣ末端切断ＮＳ５ポリペプチドをコードするか、または請求項６〜２１のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質をコードするコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３１】
組換えベクターであって、以下：
（ａ）請求項３０に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）コード配列が宿主細胞中で転写されそして翻訳され得るための、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される少なくとも１つの制御エレメント、
を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
免疫原性Ｃ末端切断ＮＳ５ポリペプチドまたは該ポリペプチドを含む免疫原性融合タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該タンパク質を産生するための条件下で請求項３２に記載の宿主細胞の集団を培養する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
ＨＣＶ ＮＳ５ポリペプチドの産生を増強するための方法であって、該方法は、該タンパク質を産生するための条件下で請求項３２に記載の宿主細胞の集団を培養する工程を包含し、ここで該タンパク質は、同じ条件下で産生される全長ＮＳ５ポリペプチドの量と比較して、より多い量で産生される、方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図３Ｈ】

【図３Ｉ】

【図３Ｊ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【公表番号】特表２００７−５３７７５７（Ｐ２００７−５３７７５７Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７４０５（Ｐ２００７−５２７４０５）
【出願日】平成１７年５月１７日（２００５．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７３７７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１３８３７
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（５０６１７５８２８）カイロン　コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】