初期の眼内リンパ腫の治療に対する抗ＣＤ２０抗体の使用方法
本発明はＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、その各軽鎖の可変領域は、配列番号１に示すマウス核酸配列にコードされ、その各重鎖の可変領域は、配列番号２に示すマウス核酸配列にコードされ、上記軽鎖及び上記重鎖の定常領域は、非マウス種由来である。本発明に係る抗体は、初期の眼内リンパ腫の治療のために用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初期の眼内リンパ腫（「ＰＩＯＬ」とも称する）の治療用薬剤としての、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、当該抗体の各軽鎖の可変領域は配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、各重鎖の可変領域は配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、さらに軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種由来である。
【０００２】
以下の概要において、大括弧（［］）の間の参照番号は、実施例の後ろに記載した参考文献のリストに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ２０抗体は、成熟Ｂリンパ球表面に存在する、分子量３５〜３７ｋＤａの疎水性膜貫通タンパク質である（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８４（２２）：８０８５−９［１］、Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）：１１２８２−１１２８７［２］）。ＣＤ２０抗体は、Ｂリンパ球が、初期の前駆Ｂリンパ球段階からプラズマ細胞に分化するまでの成長過程に発現する。分化段階において、この発現は消失する。ＣＤ２０抗原は、正常なＢリンパ球と悪性のＢ細胞との両方に存在する。より詳細には、ＣＤ２０抗原は、ほとんどの表現型−Ｂリンパ腫に発現し（リンパ腫の８０％）、例えば、非ホジキンＢリンパ球リンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：ＮＨＬ）の９０％以上に発現する。
【０００４】
ＣＤ２０の機能は、未だ完全には明らかになっていないが、カルシウムチャネルとして作用し得、かつＢリンパ球分化（Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１３５（６）：３７９５−８０１［３］）及び増殖（Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６ Ａｕｇ；１６（８）：８８１−７［４］）の初期段階の調節に関与し得る。
【０００５】
それゆえに、Ｂリンパ球の活性化及び増殖におけるその役割に関しては不確かなままであるが、ＣＤ２０抗原は、その位置により、例えば、ＣＤ２０を特異的に認識する抗体を用いた、ＮＨＬ又はＢ−ＣＬＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）のようなＢリンパ球腫瘍に関する薬理学的治療において、重要な標的である。加えて、この抗原は、発現調節又は多形性が全く知られていない膜タンパク質であるので、仮想抗原である。
【０００６】
ただ１つの非放射性同位体標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、Ｂ細胞リンパ腫の治療用として、近年商業的に入手可能になった。リツキシマブは、化学療法と伴って、ＮＨＬの患者において非常に有望な臨床的結果を示す。未だその有効性は不安定であり、唯一の因子として用いたとき、頻繁に緩やかになる（Ｔｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４（６）．−１７９３−８００［５］）。
【０００７】
初期の眼内リンパ腫（ＰＩＯＬ）は、中枢神経系の非ホジキンリンパ腫である。この種類は、一般に、硝子体又は網膜に影響する。
【０００８】
ＰＩＯＬの眼における兆候は、中枢又は全身神経の機能障害に先行し得、数年先行することもあり、眼科医が最初に診断を下すこともあり得る。
【０００９】
最初に兆候が現れる年齢は様々であるが、４０歳よりも前にこの影響が見られることはめったにない。一般に、患者は６０歳以上である。初期には、機能的な障害は片方であるが、患者の５０〜８０％において、傷害が両目に及ぶようになる。
【００１０】
眼における最初の症状の発生は、一般に、視力の低下又はかすみ眼である。
【００１１】
診断は、非常に悪性の非ホジキンリンパ腫の特徴を有する細胞の存在を明らかにする、後室穿孔による細胞対照により実施することが可能である。
【００１２】
最も一般的に用いられている治療方法は、全身性メトトレキサート系又は硝子体内注射による化学療法である。しかしながら、メトトレキサートによる治療は、数回の注入が必要であり、角膜上皮症（Ｏｈｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ／Ｖｏｌ．１２６ Ｎｏ．７；１００２−１００３［６］）のような眼における合併症を引き起こす。さらに、ＳＭＥＴ ＭＤにより報告された他の患者においては、硝子体内注入したメトトレキサートが一般に許容され、迅速な治癒を導くときでさえ、単独治療の患者において、再発を妨げる。さらに、メトトレキサートは、多くの他の逆反応を有し、特に免疫抑制及び肝機能障害が知られている。
【００１３】
ＰＩＯＬは、ＣＤ２０を発現する大きなＢ細胞腫瘍を含む、リンパ腫である。リツキシマブの静脈内注入は、全身性の大きなＢ細胞リンパ腫を有する患者の延命に貢献した。しかしながら、リツキシマブは、おそらくモノクローナル抗体が血液脳関門を通過しないことを理由として、中枢神経系リンパ腫の予後には影響しなかった。同様に、眼の傷害に対するリツキシマブの静脈内注入治療は、血液脳関門を理由として、中枢神経系リンパ腫に有利に結びつきそうもない（［６］）。
【００１４】
しかしながら、リツキシマブの静脈内注入試験は、中枢神経系初期リンパ腫の患者において顕著な眼の毒性作用の不在を示した（Ｋｉｔｚａｍｎｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｅｙｅ ２１， １５２４−１５２７ ［７］）。さらに、患者は相補的な全身又は眼内治療を受けるため、リツキシマブの静脈内投与による治療の有効性に関する結論を描くのは可能ではない。
【００１５】
さらに、二人のＰＩＯＬ患者における静脈内リツキシマブ注入試験が、眼におけるリンパ腫悪性細胞の消失を示した（［６］）。さらに、半分の患者において、眼の前室における炎症反応を示した。臨床試験もまた、合併症の不在を示した。しかしながら、調査はリツキシマブ治療後２ヶ月に限定されており、生検結果に基づいておらず、単なる臨床調査である。
【００１６】
それゆえに、ＰＩＯＬ治療に関するこれらの欠点及び障害を克服する治療技術の真の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の第１の目的は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体の、初期の眼内リンパ腫（「ＰＩＯＬ」とも称する）の治療のための使用に関し、当該抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列にコードされており、各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、さらに、各軽鎖及び各重鎖の定常領域は、非マウス種由来である。
【００１８】
抗体は、ジスルフィド結合により互いに連結された重鎖及び軽鎖により形成されている。各鎖は、本発明の抗体に対する抗原に特異的な、Ｎ末端位置の可変領域（又はドメイン）（再構築された軽鎖のＶ−Ｊ遺伝子及び重鎖のＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子にコードされた）と、軽鎖の単一のＣＬドメイン及び重鎖のいくつかのドメインにより形成された、Ｃ末端位置の定常領域とにより形成されている。
【００１９】
本発明の目的において、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体構成物」の発現は、同一の及び独自の特異性を有する抗体の調製に関する。本発明に係る抗体は、軽鎖及び重鎖の定常領域と異なる種に属する軽鎖及び重鎖の可変領域において、キメラ抗体として参照される。
【００２０】
配列番号１及び２のマウス核酸配列は、ドイツ微生物培養細胞コレクションセンター（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ））において、アクセッション番号ＡＣＣ ４７４の下で利用可能な、マウスハイブリドーマＣＡＴ−１３．６Ｅ１２により生成された抗体の、各軽鎖の可変領域及び各重鎖の可変領域をコードしている。このハイブリドーマは、ＣＤ２０に対する、マウスＩｇＧ２ａ、ｋ型モノクローナル抗体を生成する。
【００２１】
配列番号１の配列は、それにも関わらず、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウスハイブリドーマにより生成された抗体の軽鎖の可変領域をコードする配列とは異なる核酸を含む。
【００２２】
これらのマウス配列は、ＣＤ２０抗原に対するＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の特異性によって、本発明に係る抗体における可変領域の配列の作動を選択する。本発明に係る抗体の可変領域は、配列番号１及び２の配列と少なくとも７０％同一の配列を共有する。この配列同一性によって、本発明に係る抗体がＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と同一の特性を有するようになる。好ましくは、この配列同一性は、本発明に係る抗体とＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体との間で、標的に対する同一の親和性をも提供する。
【００２３】
さらに、本発明において用いられる抗体は、非マウス種に属する軽鎖及び重鎖の定常領域を有している。これに関して、非マウス哺乳動物の全てのファミリー及び種を使用できる可能性があり、特に、ヒト、サル、ネズミ（マウス以外）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、トリについても同様に使用できる可能性がある。
【００２４】
本発明において、治療に用いられる抗体は、当業者に公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて構築可能であり、より詳細には、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４）に記載の「キメラ」抗体構築技術により構築可能である。組み換えＤＮＡ技術は、非ヒト哺乳動物由来の抗体の重鎖の定常領域及び／又は軽鎖の定常領域の、ヒト免疫グロブリンの対応する領域による置換を利用する。詳細な実施形態は以下に説明する。
【００２５】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも８０％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも８０％同一の配列を共有する配列にコードされている。有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２６】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２７】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９９％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９９％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２８】
有利な点において、重鎖及び軽鎖の可変領域において、１以上の核酸の１以上の置換、挿入又は欠失を含み、これらの配列の変異が、上記で定義した配列の同一性比率に対応し、抗体の標的に対する特異性又は親和性に影響を及ぼさないような、いずれかの抗体を、本発明の文脈において使用可能である。
【００２９】
本発明において用いられる抗体は、また、ＦＲ（骨格、可変領域の高度に保存された領域、「背骨」としても知られる。）に結合したＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体のＣＤＲ領域（相補的決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ））を有する抗体に関する。このような抗体は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体に非常に類似した、かつ好ましくは同一の、親和性及び特異性を有している。
【００３０】
好ましくは、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、本発明において用いられる抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列にコードされている。
【００３１】
本発明の第一の実施形態において、本発明において用いる抗体は、特に薬剤として用いられ、各軽鎖の可変領域が配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、各重鎖の可変領域が配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、軽鎖及び重鎖の定常領域が、非マウス種由来の定常領域である、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体である。
【００３２】
それゆえに、「ＣＤ２０抗原に対する」の意味は、ＣＤ２０抗原の全て又は一部、及び、特に抗体ＥＭＡＢ６０３によって認識されるエピトープに接触するモノクローナル抗体の可能性である。
【００３３】
好ましくは、本発明において用いる抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域は、ヒト定常領域である。この本発明の好ましい実施形態は、ヒトにおいて抗体の免疫原性を低減させるのを可能にし、同時に、ヒトへの治療的投与におけるその有効性を向上させ得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体の各軽鎖の定常領域は、Ｋ型である。例えば、Ｋｍ（１）、Ｋｍ（１，２）、Ｋｍ（１，２，３）及びＫｍ（３）のような、いずれかのアロタイプが本発明の実施に適しているが、好ましいアロタイプはＫｍ（３）である。
【００３４】
他のさらなる実施形態において、本発明に係る抗体の各軽鎖の定常領域は、λ型である。
【００３５】
本発明の特有の局面において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域がヒト領域であるとき、抗体の各重鎖の定常領域は、γ型である。この代替によれば、抗体の各重鎖の定常領域は、γ１型、γ２型、γ３型であってもよく、これらの３つの定常領域型はヒト相補鎖に結合する特有の特徴を示す。また、定常領域はさらにγ４型であってもよい。各重鎖の定常領域がγ型である抗体は、ＩｇＧクラスに属する。免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって共に連結された、２つの重鎖及び２つの軽鎖により構成されるヘテロ二量体である。各鎖は、Ｎ末端位置における、抗体に対する抗原に特異的な可変領域又はドメイン（再設計した軽鎖のＶ−Ｊ遺伝子及び重鎖のＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によりコードされた）と、Ｃ末端位置における、軽鎖のための単一のＣＬドメイン又は重鎖のための３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）により構成された定常領域とにより構成されている。可変ドメイン、並びに重鎖及び軽鎖のＣＨ１及びＣＬドメインの組み合わせは、Ｆａｂ断片を形成し、抗体のエフェクター特性の媒介物であるＦｃ領域が、ＦｃγＲ及びＣ１ｑレセプターのようなエフェクター分子へのアクセス可能性を維持している一方で、各Ｆａｂをその標的抗原に結合するのを可能にする、高度に柔軟なヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結される。ＣＨ２及びＣＨ３の両方の球状ドメインにより構成されるＦｃ領域は、Ａｓｎ２９７に連結するラクトサミン型二分岐Ｎ−グリカンが存在する条件下において、２つの鎖のそれぞれにおけるＣＨ２ドメインにおいてグリコシル化される。
【００３６】
好ましくは、抗体の各重鎖の定常領域はγ１型である。このような抗体は、かなり多くの数の（ヒト）個体において、ＡＤＣＣ活性化が生じる可能性を示すからである。これに関連して、例えばＧ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１，２，１７）、Ｇ１ｍ（１，１７）またはＧ１ｍ（１，３）のような、どのアロタイプも本発明の実施において適切である。好ましいアロタイプはＧ１ｍ（１，１７）である。
【００３７】
本発明の特有の局面において、抗体の各重鎖の定常領域はγ１型であり、配列番号３に示すヒト核酸配列によってコードされており、その各軽鎖の定常領域は、配列番号４に示すヒト核酸配列によってコードされている。それゆえに、このような抗体は、γ１型重鎖と共に、マウス可変領域及びヒト定常領域を有する。この抗体は、それゆえに、ＩｇＧＩサブクラスに属する。本発明において用いられる抗体の実施形態によれば、抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有している。この２つの軽鎖の可変領域は配列番号１の核酸配列にコードされ、そのヒト定常領域は配列番号４の核酸配列にコードされている。また、２つの重鎖の可変領域は配列番号２のマウス核酸配列にコードされ、その定常領域は配列番号３のヒト核酸配列にコードされている。
【００３８】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、各重鎖は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている。抗体の各軽鎖をコードする配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖の可変領域をコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖の定常領域をコードする配列番号４のヒト核酸配列とを融合することによって得られる。
【００３９】
抗体の各重鎖をコードする配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖の可変領域をコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖の定常領域をコードする配列番号３のヒト核酸配列とを融合することによって得られる。
【００４０】
本発明の特有の局面において、抗体の各軽鎖が、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、重鎖のそれぞれが、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされているとき、配列番号５の核酸配列から推測される各軽鎖のペプチド配列は、配列番号７の配列であり、配列番号６の核酸配列から推測される各重鎖のペプチド配列は、配列番号８の配列である。
【００４１】
配列番号７の配列において、１０６番目に位置するアミノ酸はリシン（Ｋ）である。
【００４２】
また、本発明は、各軽鎖が、配列番号７のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の相同性又は同一性を有するマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされ、かつ各重鎖が、配列番号８のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の相同性又は同一性を有するマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされた抗体に関する。これらの修飾によって、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性のように、抗体の特異性もそのエフェクター活性も変化しない。
【００４３】
特に有効な方法において、本発明において用いられる抗体は、ラットハイブリドーマ細胞ラインにより生成される。本発明による抗体を生成する細胞ラインは、いくつかの特定の性質を有する抗体を提供するために、重要な機構である。つまり、特にグリコシル化修飾のような翻訳後修飾を引き起こす抗体を発現する方法では、１つの細胞ラインから他の細胞ラインへと変化し得、それにより、むしろ異なる機能特性を有する同一の一次構造を有する抗体を提供する。
【００４４】
好ましい実施形態において、抗体は、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞ライン（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録されたＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）において生成される。例えばＣＨＯ細胞において生成した同一の一次構造を有する抗体と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を有する抗体を生成する可能性を有するので、この細胞ラインを選択した。
【００４５】
他の特定の実施形態において、本発明の他の抗体は、国立微生物培養保管所（ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５）に、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で、２００５年１１月２９日に登録された、クローンＲ６０３により生成されたＥＭＡＢ６０３抗体である。ＥＭＡＢ６０３抗体の各軽鎖は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、各重鎖は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている。このキメラ抗体は、ＣＤ２０結合においてＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と競合し、リツキシマブよりも大きな細胞傷害活性を有している。このような特性は、これらの抗体の重鎖におけるＮ−グリカンの特異的グリコシル化の部分に起因し得る。事実、Ｒ６０３クローンの特定の特徴は、フルクトース／ガラクトース比率が０．６以下のＥＭＡＢ６０３抗体構成物を生成することであり、このことは、強いＡＤＣＣ活性を有する抗体を提供するために最適であると、特許出願ＦＲ ０３ １２２２９に記載されている。この抗体は、ＰＩＯＬの治療のための治療手段として、特に有用であり得る。
【００４６】
有利な点として、本発明の抗体は記憶Ｔリンパ細胞の構成を許容し得る。これらの記憶Ｔリンパ細胞は、増殖能及び腫瘍細胞に対する２回目の暴露の間に即座に再活性化する能力を有し得る。
【００４７】
有利な点として、本発明の抗体は、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を可能にし得、これにより腫瘍成長の減速及び腫瘍細胞除去の向上を導き得る。
【００４８】
有利な点として、このようなモノクローナル抗体は、顕著な抗腫瘍効果を有し得る。例えば、このような抗体は、これが投与された眼内リンパ腫を有する患者において、腫瘍細胞の複製を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％、及び好ましくは少なくとも６０％又は７０％抑制するのを許容し得る。
【００４９】
このような抗体は、これを生成する方法と同様に、ＷＯ２００６／０６４１２１に記載されている。
【００５０】
本発明に係る抗体発現ベクターの一例は、配列番号１７に示す配列のベクターである。このベクターは、軽鎖が配列番号５の核酸配列にコードされ、推定ペプチド配列が配列番号７に示されており、重鎖が配列番号６の核酸配列にコードされ、推定ペプチド配列が配列番号８に示された、本発明の抗体の発現を可能にする。このベクターは、抗体の各軽鎖をコードする配列番号５の核酸配列と、抗体の各重鎖をコードする配列番号６の核酸配列とを、宿主細胞中に導入し、かつ維持するために、これらの配列が挿入された核酸分子である。このベクターは、この発現に不可欠な配列（プロモーター、ポリアデニレーション配列、遺伝子選択）を有しているので、これらの外来核酸フラグメントの宿主細胞における発現を可能にする。このようなベクターは、当業者に公知であり、完全に網羅してはいないが、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド、又はバクテリオファージがある。さらに、いずれかの哺乳動物細胞を宿主細胞として、すなわち、本発明に係る抗体を発現する細胞として使用可能であり、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ ＢＩＩ、ＣＨＯ ＤＧ４４）、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳが挙げられる。
【００５１】
他の実施形態において、本発明の抗体は、一方は抗体の軽鎖を発現し、他方は抗体の重鎖を発現する、２つの発現ベクター細胞において共発現することによって生成することができる。上述したように、これらのベクターは、この発現に不可欠な配列（プロモーター、ポリアデニレーション配列、遺伝子選択）を有する。上記のように、ベクターは、例えばプラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、又はバクテリオファージであり得、さらに宿主細胞は、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ ＢＩＩ、ＣＨＯ ＤＧ４４）、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳのような、いずれかの哺乳動物細胞であり得る。
【００５２】
有利な点として、本発明において用いられる抗体を発現する安定した細胞ラインは、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０．ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａのようなヒト骨髄腫、又はＰＥＲＣ６、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（ＤＸ ＢＩＩ ＣＨＯ、ＣＨＯ ＤＧ４４）のようなＣＨＯラインのようなヒト由来の他の細胞からなる群より選択され、又はＷｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される他の細胞ラインである。
【００５３】
好ましくは、使用する細胞ラインは、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞ライン（ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．Ａｇ．２０細胞、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録された）である。この細胞ラインは、例えば、ＣＨＯ細胞において生成した同一の一次構造を有する抗体と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を有する抗体を生成する可能性を有するので、この細胞ラインを選択した。
【００５４】
これらの細胞に適した培養培地は、当業者によく知られており、完全に網羅してはいないが、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）［１４］）、イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）［１５］）、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）変法ＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）［１６］）、Ｆ１２培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）［１７］）、ＩＭＤＭ（Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）［１８］）、又は文献ＥＰ１２２９１２５に記載されたものが挙げられる。
【００５５】
本発明に特有の目的は、上述した抗体を用いた、初期眼内リンパ腫の治療方法に関する。
【００５６】
有利な点として、治療方法は、ＰＩＯＬ患者に抗体を投与する工程を包含する。
【００５７】
有利な点として、本発明において用いられる抗体を、所望の治療効果に適した、薬学的に許容される担体と共に投与する。
【００５８】
この点について、本発明において用いられる抗体は、例えばモノクローナル抗体のように、リンパ系細胞に発現する１つ以上の抗原に対する、１つ以上の他の抗体との組み合わせとして用いられ得る。このような抗原として、完全に網羅してはいないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１３２、ＣＤ２１０、ＣＤ２１７抗原が上げられる。
【００５９】
他の実施形態において、本発明に係る抗体は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラー細胞）、Ｔγσリンパ球、マクロファージ、単球、又は樹状細胞のように、ＦｃγＲを発現する細胞と組み合わせて用いてもよく、すなわち細胞療法と組み合わせてもよい（Ｐｅｌｌｅｒ Ｓ，Ｋａｕｆｍａｎ Ｓ Ｂｌｏｏｄ １９９１，７８：１５６９（［８］）；Ｋｉｍｂｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３（７）：５０１−５０４（［９］）；Ｓｏｏｒｓｋａａｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８７（２），１５９−１６４（［１０］）；Ｚｉｅｇｌｅｒ ＨＷ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８１ ２７（３），３２１−３２７（［１１］）；Ｃｈａｐｅｒｏｔ Ｌ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４（９）：１６６７−１６７７（［１２］）；Ｖｕｉｌｌｉｅｒ Ｆ，Ｄｉｇｈｉｅｒｏ Ｇ ２００３ Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ．９０（８−９）：７４４−５０（［１３］））。
【００６０】
さらに、抗体を、好ましくは、投与量３７５ｍｇ／ｍ２、１８７．５ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、３７．５ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、７．５ｍｇ／ｍ２未満で患者に投与し得、また、３．７５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２または０．５ｍｇ／ｍ２で患者に投与すると特に有利である。投与量は、１８７．５ｍｇ／ｍ２から７５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から３７．５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から１５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から７．５ｍｇ／ｍ２の間、又は７５ｍｇ／ｍ２から３．７５ｍｇ／ｍ２の間であれば有利である。好ましくは、投与量が、３．７５ｍｇ／ｍ２から０．５ｍｇ／ｍ２の間であり、これらの量が２ｍｇ／ｍ２から１ｍｇ／ｍ２の間であれば有利である。これらの量が静脈内投与されれば有利である。
【００６１】
抗体が静脈内投与されるとき、患者に投与される抗体の量は、０．００１μｇから１０００μｇの間、０．００１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間であれば有利であり、０．０１μｇから１０μｇの間、１μｇから１０μｇの間、０．０１μｇから１μｇの間、０．０１μｇから０．１μｇの間、又は０．０２μｇから０．０８μｇの間であれば有利である。
【００６２】
有利な点において、抗体の投与は、疾患に冒された眼において行われてもよい。
【００６３】
患者に投与する抗体の量は、一眼あたりの抗体量が０．００１μｇから１０００μｇの間、０．００１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間であってよく、好ましくは０．０１μｇから１０μｇの間、１μｇから１０μｇの間、０．０１μｇから１μｇの間、０．０１μｇから０．１μｇの間、又は０．０２μｇから０．０８μｇであることが好ましい。
【００６４】
硝子体液１ｍＬあたり０．１μｇから１０００μｇの間、０．１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間で投与することが有利であり、硝子体液１ｍＬあたり１μｇから１００μｇの間、１００μｇから１０００μｇの間、１μｇから１００μｇの間、１μｇから１０μｇの間、又は２μｇから８μｇの間であれば好ましい。
【００６５】
単一の投与量注入又は繰返しの投与量注入のいずれかにより投与されることが好ましい。代替として、各投与を前回の投与位置から十分に離間して行い、各投与を単一の投与としてみなす。例えば、各投与を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、１０週間、又は６ヶ月間隔で行うことができる。
【００６６】
抗体の投与を、一眼あたり０．０２μｇ量の抗体、又は硝子体液１ｍＬあたり０．００２ｍｇ量の抗体を硝子体内に注入することによって達成されることが好ましい。各投与を、最小で1週間隔、例えば1週間、２週間、３週間、４週間、又は５週間隔で行うことが有利である。
【００６７】
本発明において用いられる抗体の投与形態は、例えば、硝子体への注入、眼の周囲及び眼の中への注入、結膜への注入、眼球の周囲又は眼球側への注入、眼球後への注入、特に硝子体内点眼のように点眼剤の点眼、イオントフォレーゼ、部分皮下注入、眼の軟膏の塗布、網膜静脈へ注入、又は超音波照射により、眼内において行われる。
【００６８】
抗体は、当業者に公知の標準的なルールに基づいて、リンパ腫の治療薬として投与することができる。
【００６９】
本発明において用いられる抗体は、細胞傷害性であるという特徴及び利点を有している。
【００７０】
このように、これらは、そのＦｃ領域のＦｃγＲＩＩＩＡレセプターによって、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性化する能力を有している。このレセプターは、「エフェクター細胞」と呼ばれる細胞の表面に発現し、エフェクター細胞に担持されたそのレセプターに、抗体のＦｃ領域が結合するので、ＦｃγＩＩＩＡの活性化及び標的細胞の破壊の原因となる。したがって、このレセプターは非常に興味深い。エフェクター細胞として、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγσリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球、又は肥満細胞が挙げられる。
【００７１】
本発明の他の目的は、本発明に係る抗体を、初期眼内リンパ腫の治療のための薬剤の製造のために用いる。
【００７２】
さらに、本発明の他の目的は、初期眼内リンパ腫の治療のための薬剤を調製する方法であって、本発明において用いるモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを混合し、薬剤として得ることからなる。
【００７３】
本発明の他の目的は、初期眼内リンパ腫の治療処置方法であり、必要性が認められる患者に投与することを含む。上述したような抗体又は薬剤の投与を含む。
【００７４】
他の利点は、以下の実施例を読んだ当業者に明らかであり得、添付の図面における説明を、説明の目的で与えた。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＥＭＡＢ６０３抗体のカッパー軽鎖のキメラ化に用いたＣＫＨｕベクターの概略図である。
【図２】図２は、ＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のキメラ化に用いたＧ１Ｈｕベクターの概略図である。
【図３】図３は、ＥＭＡＢ６０３抗体の生成のために用いた重鎖及び軽鎖の発現ベクターの概略図である。
【図４】図４は、ＰＩＯＬマウスモデルにおいて腫瘍を成長させた眼に、ＰＢＳ １×、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（２０μｇ）、又はリツキシマブ抗体（２０μｇ）を注入した後の、眼球腫瘍細胞（×１０６）の絶対数を示す図である。結果を、２回の実験の合計から得た。
【図５】図５は、ＰＩＯＬマウスモデルにおいて腫瘍を成長させた眼に、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、又はＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体を、０．０２μｇ及び０．２μｇの投与量で注入した後の、眼球腫瘍細胞（×１０６）の絶対数を示す図である。結果を、6回の実験の合計から得た。
【実施例】
【００７６】
〔実施例１：抗ＣＤ２０キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の発現ベクターの構築〕
（Ａ．マウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の可変領域の配列決定）
ＩｇＧ２ａ,κ型免疫グロブリンを生成するマウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体（供給元：ＤＳＭＺ、ｒｅｆ．ＡＣＣ ４７４）の総ＲＮＡを単離した（キット ＲＮＡｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ ｒｅｆ．７４１０４）。逆転写の後、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の軽鎖（ＶＫ）及び重鎖（ＶＫ）の可変領域を、５’ＲＡＣＥ方法（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）（キット ＧｅｎｅＲａｃｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｆ．Ｌ１５００−０１）によって増幅させた。これらの２つの工程に用いたプライマーは以下の通りである。
【００７７】
１．逆転写プライマー
ａ．カッパーマウス特異的逆方向プライマー（配列番号９）
【００７８】
【化１】
【００７９】
ｂ．Ｇ２ａマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１０）
【００８０】
【化２】
【００８１】
２．５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー
ａ．カッパーマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１１）
【００８２】
【化３】
【００８３】
ｂ．Ｇ２ａマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１２）
【００８４】
【化４】
【００８５】
結果として得られたＶＨ及びＶＫ ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｚｅｒｏ ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．Ｋ２８７５−２０）にクローニングした後、配列決定した。ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の領域Ｖκのヌクレオチド配列において、末端ヌクレオチドをＡに置換したもの（ＡＡＣに換えてＡＡＡ）を、配列番号１の配列に示した。Ｖκ遺伝子は、Ｖκ４ファミリーに属している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１）［１９］）。ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２の領域ＶＨのヌクレオチド配列は、配列番号２の配列である。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１ファミリーに属する（［１９］）。
（Ｂ．キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖及び軽鎖の発現ベクターの構築）
１．抗体ＥＭＡＢ６０３のカッパー軽鎖ベクター
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター配列にクローニングされたＶＫ配列を、以下のクローニングプライマーを用いて増幅した。
【００８６】
ａ．順方向ＶＫプライマー（配列番号１３）
【００８７】
【化５】
【００８８】
下線を付した配列は、制限部位Ｓｐｅ Ｉの部位に対応しており、太字で示した配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列であり、ＡＴＧ開始コドンをイタリック体で示した。
【００８９】
ｂ．逆方向ＶＫプライマー（配列番号１４）
【００９０】
【化６】
【００９１】
このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体で示す）とヒト定常領域（Ｃκ）（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＤｒａＩＩＩの制限酵素認識部位に対応する。
【００９２】
このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体で示す）とヒト定常領域（Ｃκ）（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＤｒａＩＩＩの制限酵素認識部位に対応する。
【００９３】
ＶκＰＣＲの結果として得られる産物は、マウス抗体ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含み、ＡＡＣがＡＡＡに変異している（配列番号１４の逆方向プライマーの配列において、囲み線の中のヌクレオチド）。この変異は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２のＶκ天然配列に対して、Ｎ１０６Ｋの変異に相当する。
【００９４】
このベクターにコードされたＥＭＡＢ６０３キメラ抗体の軽鎖配列を、配列番号５にヌクレオチド配列として示し、配列番号７が推定ペプチド配列に相当する。
【００９５】
その後、このＶκＰＣＲを、配列番号４に示すヌクレオチド配列に相当するヒト定常領域Ｃκの５’において、配列番号１の配列に相当する軽鎖キメラベクター（図１）のＳｐｅＩ部位とＤｒａＩＩＩ部位との間にクローニングした。マウスＶκ配列をクローニング可能にするために、ＤｒａＩＩＩ制限酵素認識部位を形成するためのサイレント変異することによって、このキメラベクターのヒト配列Ｖκを予め修飾した。このキメラベクターは、ｄｈｆ選択遺伝子（ジヒドロ葉酸還元酵素）と同様に、ＲＳＶプロモーター及びポリアデニレーションｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）の配列を含む。
【００９６】
２．重鎖ベクター
同様の方法をＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のキメラ化に適用した。
【００９７】
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングされたＶＨ配列を、以下のクローニングプライマーを用いて最初に増幅した。
【００９８】
ａ．順方向ＶＨプライマー（配列番号１５）
【００９９】
【化７】
【０１００】
下線を付した配列は、ＳｐｅＩ制限酵素認識部位に相当し、太字で示す配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に相当し、ＡＴＧ開始コドンをイタリック体で示す。
【０１０１】
ｂ．逆方向ＶＨプライマー（配列番号１６）
【０１０２】
【化８】
【０１０３】
このプライマーは、マウスＶＨ配列（イタリック体で示す）とＧＩヒト定常領域（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＡｐａＩ制限酵素認識部位に相当する。
【０１０４】
増幅したＶＨ断片は、マウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。その後、このＶＨ ＰＣＲを、配列番号３に示す核酸配列のヒト定常領域γＩの５’において、配列番号１の配列に相当する、キメラベクター（図２）の重鎖のＳｐｅＩ部位とＡｐａＩ部位との間にクローニングした。このキメラベクターは、ｎｅｏ選択遺伝子と同様に、ＲＳＶプロモーター及びポリアデニレーションｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）を含む。
【０１０５】
このベクターにコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖の配列は、ヌクレオチド配列として配列番号６に示し、推定ペプチド配列を配列番号８に示す。
【０１０６】
３．目的の発現ベクター
（ＥＭＡＢ６０３抗体の発現ベクター）
抗ＣＤ２０抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖転写及び軽鎖転写の２つのユニットを包含する独自の発現ベクターを、重鎖及び軽鎖の２つのキメラベクターから構築した。この発現ベクターＨＫ４６３−２５（ＦＤＡ）には、ＲＳＶプロモーター（図３）の制御下にある重鎖及び軽鎖の２つの転写ユニットと同様に、ｎｅｏ（ｎｅｏフォスフォトランスフェラーゼＩＩ）及びｄｈｆ（ジヒドロ葉酸還元酵素）が存在する。
【０１０７】
〔実施例２：抗ＣＤ２０キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３のＹＢ２／０ラインを生成する、細胞ライン誘導体の生成〕
ラット細胞ラインＹＢ２／０（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−１６６２）を、５％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．１２１０７）を含むＥＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．０４１−９５１８１Ｍ）において培養した。トランスフェクトのために、抗体ＥＭＡＢ６０３の発現のための、軽鎖ベクターであるｐＲＳＶ−ＨＬ−ＥＭＡＢ−６０３ ２５μｇと共に、細胞５百万個をＯｐｔｉｍｉｘ培地（Ｅｑｕｉｂｉｏ，ｒｅｆ．ＥＫＩＴＥ １）中で、エレクトロポレートした（エレクトロポレーター Ｂｉｏｒａｄ，ｍｏｄｅｌ１６５２０７７）。適用したエレクトロポレーション条件は、０．５ｍｌのキュベットに対して、２３０ボルト及び９６０マイクロファラッドであった。各エレクトロポレーションキュベットを、その後、５０００細胞／ウエルの密度で、５つのプレートＰ９６に分配した。５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０６３−０１７）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０１３１−０２７）、及び２５ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）を含むＲＰＭＩ選択培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ２１８７５−０３４）における認識は、トランスフェクトの３日後に達した。
【０１０８】
耐性のあったトランスフェクションウエルの上清を、ヒトＩｇ配列特異的ＥＬＩＳＡテストによる、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在のスクリーニングに用いた。
【０１０９】
最も多くの抗体を生成する１０個のトランスフェクション産物を、Ｐ２４プレートにおいて増幅し、限界希釈法（４０細胞／プレート）によるクローニングのために、その生産性を評価し、３つの最も優れた生産体を選択するために、その上清をＥＬＩＳＡにより再度試験した。
【０１１０】
クローニングの後、クローンＲ６０３をキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の生成のために選択し、生成培地ＣＤハイブリドーマ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１１２７９−０２３）に徐々に適応させた。キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の生成を、ＣＤハイブリドーマ培地に適応したラインの拡張によって達成し、７５ｃｍ２及び１７５ｃｍ２ボトル中において３ｘ１０−５細胞／ｍｌの希釈液、その後、ローラー型ボトル中において４．５ｘ１０−５細胞／ｍｌの希釈液を得た。最大量に達した後、細胞ラインを、細胞生存率がわずか２０％になるまで行った。生産の後、プロテインＡについてのアフィニティクロマトグラフィ（精製度をＨＰＬＣ<９５％で評価した）によってキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって観察した。
【０１１１】
〔実施例３：第１の実験プロトコルに基づいた、ＰＩＯＬマウスモデルにおけるＬＢ＿Ｒ６０３及びリツキシマブ抗体の有効性の研究〕
（材料及び方法）
＜細胞ライン＞
ＩＩＡ１．６細胞を、リンパ腫性ＢマウスＡ２０−ｎＪ細胞ラインから得た（Ｊｏｎｅｓ Ｃ． ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ Ａ２０／２Ｊ ａｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｇｅｎ− ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｌ３Ｔ４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｉ−Ａ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６；１３６−３４８−３５６，［２１］）。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ペニシリン １００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１０ｍＭのピルビン酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）、及び５０ｍＭのメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）が添加された、ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｌｕｔａｍａｘ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）において培養し、５％ＣＯ２雰囲気下において３７℃で保持した（Ｔｏｕｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｔｈ１／Ｔｃ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｌｙ ２００７，ｖｏｌ．４８，ｎｏ．７，［２２］）。
【０１１２】
＜トランスフェクション＞
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御の下、３．５ｋｂ ｐｍａｘ ＧＦＰ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びヒトＣＤ２０のコード遺伝子を有するプラスミドを用いて、ＩＩＡ１．６細胞をヌクレオフェクションによってトランスフェクトした。４８８ｎｍのアルゴンレーザを細胞に照射したとき、ＧＦＰ分子（緑色蛍光タンパク質）が５１０ｎｍの緑色波長において発光し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてトランスフェクト細胞を検出することが可能になる。トランスフェクションの後、０．５ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を含むラインの培地において細胞を培養した。ＧＦＰ及びヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）を高い割合で発現するクローンを、限界希釈法によって得て、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０と称した。
【０１１３】
＜マウス＞
６〜１２週齢のメスのマウスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。マウスに滅菌した食物及び濾過した水を無制限に与え、１２時間の暗条件サイクルに維持した。全てのマウスを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、及び“ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ”にしたがって扱った。
【０１１４】
＜硝子体内注入及び臨床評価＞
１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン（ｌｍａｌｇｅｎｅ １０００；Ｍｅｒｉａｌ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）及び６ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ ２％；Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組み合わせを腹腔内注入することによって、麻酔した。腫瘍細胞（１０４細胞）を２μＬ １×のＰＢＳ（ｐＨ７．４）内においてインキュベートし、解剖顕微鏡を用いて扁平部を経て硝子体内に注入した。
【０１１５】
０．５％のトロピカミド（Ｔｈｅａ，Ｃｌｅｒｍｏｎｄ−Ｆｅｒｒａｎｄ，Ｆｒａｎｃｅ）で膨張させた後、シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に取り付けられた３２ゲージの針を通して、無菌状態で右眼に注入を行った。試験マウスの右眼の硝子体内に、２μＬのＰＢＳを注入した。注入後、リファマイシンドロップ（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ−Ｃｈｒｉｂｅｒｔ，Ｃｌｅｒｍｏｎｔ−Ｆｅｒｒａｎｄ，Ｆｒａｎｃｅ）を滴下した。
【０１１６】
各マウスの眼底の両側実験を含む、細隙灯実験を、標準的な間隔で行った。臨床的な進行度を、眼が関与する臨床スコアにしたがって、等級付けた。
【０１１７】
Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入の７日後、マウスを以下の３つのグループに分けた：腫瘍細胞を受けた眼にＰＢＳ １×（２μＬ）の注入を受けた８匹のマウスのグループ、腫瘍細胞を受けた眼に２０μｇ／２μＬの抗体ＬＦＢ＿Ｒ６０３（「ＥＭＡＢ６０３」とも称する）の注入を受けた１６匹のマウスのグループ、及び２０μｇ／２μＬのリツキシマブ抗体の注入を受けた８匹のマウスのグループ。
【０１１８】
ＰＢＳ、ＬＦＢ＿Ｒ６０３、又はリツキシマブ抗体の注入の８日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させた。
【０１１９】
＜組織学試験＞
死亡後、眼を回収し、５％スクロースを含む４％パラフォルムアルデヒド中で２時間固定し、供給元からの使用説明書にしたがって、薄片組織学試験のために、樹脂に包埋した（Ｈｉｓｔｏｒｅｓｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｋｉｔ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。連続切片（５μｍ）を、トルイジンブルーにより標識した。このように、眼の切片の顕微鏡試験を行った（Ｌｅｉｔｚ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ，Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）。画像を収集した（ＤＦＣ４８０ Ｌｅｉｃａ，ｗｉｔｈ ａ ＩＭ２０ Ｉｍａｇｅ ｍａｎａｇｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１２０】
＜免疫細胞化学＞
除核した眼を、４％パラフォルムアルデヒド及び５％スクロースを含む溶液中で２時間固定し、１５％スクロースを含むＰＢＳ中に一晩浸漬した。サンプルを、適合させた構成要素（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ）中に包埋して凍結し、−８０℃で保管した。凍結した眼の眼神経における前後切片（厚さ１０μｍ）を、クリオスタット（ＣＭ２０５０Ｓ；Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に切断し、免疫細胞化学解析のために、ゼラチンでコーティングされたスライド上に載せた。免疫標識のために、組織切片を、Ｔ細胞（ｃｌｏｎｅ ＣＤ４ ＧＫ１．５，ｃｌｏｎｅ ＣＤ８ ５３−６−７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅ Ｐｏｎｔ−ｄｅ−Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、マクロファージ（ｃｌｏｎｅ Ｆ４／８０）、及び多核好中球（ｃｌｏｎｅ ７／４；Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｃｅｒｇｙ Ｓａｉｎｔ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を対象とした、精製したラットモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ５９４抗マウス共役抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）を用いて可視化した。
【０１２１】
一部の実験において、核標識剤であるヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共にスライドをインキュベートした。ネガティブテストの実験を、ｍＡｂアイソタイプコントロールと共に組織切片中でインキュベートすることによって達成した。切片を、５％グリセロールを含むＰＢＳ中に固定し、蛍光顕微鏡で観察した（ＦＸＡ，Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ；Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）。
【０１２２】
＜共焦点顕微鏡検査及び画像解析＞
共焦点顕微鏡検査を、アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）及びヘリウムネオンレーザ（５４３ｎｍ）を備えたレーザ走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ，ＧｍｂＨ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、凍結眼の切片において行った。画像を、ｉｍａｇｅ−ｂｒｏｗｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＳＭ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ，ＧｍｂＨ）を用いて融合し、多色複合画像を生成した。
【０１２３】
＜フローサイトメトリー＞
眼をＲＰＭＩ培地中で切除し、０．１ｍｇ／ｍＬのＤｎａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、及び精製した酵素（Ｌｉｂｅｒａｓｅ，Ｒｏｃｈｅ）のＷｕｎｓｃｈ／ｍＬの１．６７ユニットを用いて、３７℃で２０分間消化して濾過し、２ｍＭのＥＤＴＡ及び３％ ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＰＢＳ中ですすぎ洗いした。
【０１２４】
細胞を２．４Ｇ２ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートし、Ｆｃレセプターとの非特異的な連結を阻害した。その後、１ウエルあたり１０５細胞を、以下のｍＡｂｓで標識した：ビオチン共役抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ４（ＧＫ１，５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、蛍光色素（Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ）共役抗ＣＤ８（５３−６．７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ１９（６Ｄ５；ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ２０（ＬＦＢ＿Ｒ６０３，ＬＦＢ ＳＡ）、又は対応するｍＡｂアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１２５】
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウエアを用いて行った。
【０１２６】
（結果）
＜Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入における、Ｂ細胞リンパ腫の眼内成長＞
眼内リンパ腫モデルを生成するために、正常な免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウスに、ヒトＣＤ２０を発現するＢ細胞リンパ腫 Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０の合成ラインの硝子体内注入を受けさせた。これらの細胞はまた、ＧＦＰを発現し、これにより、リンパ腫由来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＧＦＰ＋）と正常な宿主Ｂ細胞由来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＧＦＰ−）とを区別することができる。
【０１２７】
フローサイトメトリーによるＧＦＰ及びＣＤ１９の二重検出によって、インキュベートした全ての眼において、Ｂ細胞 Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０を検出した。眼内リンパ腫細胞の割合は、初期注入量１０４細胞で右眼に初期注入された細胞数と、用量反応的に相関関係がある。結果は再現可能であり、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の注入を受けた全ての眼において、眼内リンパ腫が進行していた。
【０１２８】
＜ヒトＰＩＯＬに非常によく似たモデル＞
＜ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＩＯＬの治療に対する抗体ＬＦＢ＿Ｒ６０３の効果＞
ヒトＣＤ２０を発現するリンパ腫Ｂ細胞の注入により得られたＰＩＯＬモデルにおいて、８匹のマウスにＰＢＳ １×を注入し、１６匹のマウスをＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（２０μｇ／２μＬ）で処理し、８匹のマウスをリツキシマブ抗体（２０μｇ／２μＬ）で処理する。
【０１２９】
ＬＣ＿０８及びＬＣ＿０９と称する２つの独立した実験群において試験した各グループに対して、以下に詳細を示すプロトコルにしたがって、眼における腫瘍細胞の絶対数を測定し、マン−ホイットニーの統計学的検定により比較した。
【０１３０】
図４は、ＰＢＳの注入後、又はＬＦＢ＿６０３抗体若しくはリツキシマブ抗体による処置後の生存細胞の総数における腫瘍細胞の数を示している。
【０１３１】
腫瘍細胞複製の抑制率を表１に示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
ＰＢＳ １×を受けたマウスにおいては、抑制は観察されなかった。
【０１３４】
リツキシマブ抗体により処理したマウスにおいては、有意な抗腫瘍効果は観察されなかった。
【０１３５】
ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体により処理したマウスにおいては、有意な抗腫瘍効果が観察された。
【０１３６】
〔実施例４：第２の実験プロトコルに基づいた、ＰＩＯＬマウスモデルにおけるＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体及びリツキシマブの有効性の研究〕
（材料及び方法）
実施例３の詳細なプロトコル中で、マウスの眼におけるヒトＣＤ２０を発現するリンパ腫Ｂ細胞の注入によって、ＰＩＯＬ方法を得た。
【０１３７】
この第２の実験プロトコルにおいて、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入の４日後に、マウスを以下の３つのグループに分けた：ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファの注入を受けた４６匹のマウスのグループ、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．０２μＬ／２μＬ）により処理した１６匹のマウスのグループ、及びＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．２μＬ／２μＬ）により処理した３２匹のマウスのグループ。
【０１３８】
ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、０．０２μＬ／２μＬのＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体、又は０．２μＬ／２μＬのＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体の注入の１２日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させた。
【０１３９】
（結果）
実施例３に詳細を示すように、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０（ヒトＣＤ２０を発現する）細胞の硝子体内注入の結果として、マウスにおいてＢ細胞の眼内リンパ腫が成長した。
【０１４０】
ＬＣ＿１２、ＬＣ＿１４、ＬＣ＿１５、ＬＣ＿１６、ＬＣ＿１９、及びＬＣ＿２０と称する６つの独立した実験群において試験した各グループに対して、上記に詳細を示すプロトコルにしたがって、リンパ腫を受けた眼における腫瘍細胞の絶対数を測定し、マン−ホイットニーの統計学的検定により比較した。
【０１４１】
図５は、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、及びＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．０２μＬ／２μＬ）による処置後の生存細胞の総数における腫瘍細胞の数を示している。
【０１４２】
腫瘍細胞複製の抑制率を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
これらの実験の結果は、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体を用いた処置により、例え注入濃度が低かったとしても（０．０２μｇ／２μＬ及び０．２μｇ／２μＬ）、処置の１２日後に有意な抗腫瘍効果が得られることを示した。
【０１４５】
〔参考文献のリスト〕
[1] Valentine et al. (1987) ; Proc Natl Acad SciU S A. 84 (22) : 8085-9.
[2] Valentine et al. 1989 J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287.
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、初期の眼内リンパ腫（「ＰＩＯＬ」とも称する）の治療用薬剤としての、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、当該抗体の各軽鎖の可変領域は配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、各重鎖の可変領域は配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、さらに軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種由来である。
【０００２】
以下の概要において、大括弧（［］）の間の参照番号は、実施例の後ろに記載した参考文献のリストに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ２０抗体は、成熟Ｂリンパ球表面に存在する、分子量３５〜３７ｋＤａの疎水性膜貫通タンパク質である（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８４（２２）：８０８５−９［１］、Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）：１１２８２−１１２８７［２］）。ＣＤ２０抗体は、Ｂリンパ球が、初期の前駆Ｂリンパ球段階からプラズマ細胞に分化するまでの成長過程に発現する。分化段階において、この発現は消失する。ＣＤ２０抗原は、正常なＢリンパ球と悪性のＢ細胞との両方に存在する。より詳細には、ＣＤ２０抗原は、ほとんどの表現型−Ｂリンパ腫に発現し（リンパ腫の８０％）、例えば、非ホジキンＢリンパ球リンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：ＮＨＬ）の９０％以上に発現する。
【０００４】
ＣＤ２０の機能は、未だ完全には明らかになっていないが、カルシウムチャネルとして作用し得、かつＢリンパ球分化（Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１３５（６）：３７９５−８０１［３］）及び増殖（Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６ Ａｕｇ；１６（８）：８８１−７［４］）の初期段階の調節に関与し得る。
【０００５】
それゆえに、Ｂリンパ球の活性化及び増殖におけるその役割に関しては不確かなままであるが、ＣＤ２０抗原は、その位置により、例えば、ＣＤ２０を特異的に認識する抗体を用いた、ＮＨＬ又はＢ−ＣＬＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）のようなＢリンパ球腫瘍に関する薬理学的治療において、重要な標的である。加えて、この抗原は、発現調節又は多形性が全く知られていない膜タンパク質であるので、仮想抗原である。
【０００６】
ただ１つの非放射性同位体標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、Ｂ細胞リンパ腫の治療用として、近年商業的に入手可能になった。リツキシマブは、化学療法と伴って、ＮＨＬの患者において非常に有望な臨床的結果を示す。未だその有効性は不安定であり、唯一の因子として用いたとき、頻繁に緩やかになる（Ｔｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４（６）．−１７９３−８００［５］）。
【０００７】
初期の眼内リンパ腫（ＰＩＯＬ）は、中枢神経系の非ホジキンリンパ腫である。この種類は、一般に、硝子体又は網膜に影響する。
【０００８】
ＰＩＯＬの眼における兆候は、中枢又は全身神経の機能障害に先行し得、数年先行することもあり、眼科医が最初に診断を下すこともあり得る。
【０００９】
最初に兆候が現れる年齢は様々であるが、４０歳よりも前にこの影響が見られることはめったにない。一般に、患者は６０歳以上である。初期には、機能的な障害は片方であるが、患者の５０〜８０％において、傷害が両目に及ぶようになる。
【００１０】
眼における最初の症状の発生は、一般に、視力の低下又はかすみ眼である。
【００１１】
診断は、非常に悪性の非ホジキンリンパ腫の特徴を有する細胞の存在を明らかにする、後室穿孔による細胞対照により実施することが可能である。
【００１２】
最も一般的に用いられている治療方法は、全身性メトトレキサート系又は硝子体内注射による化学療法である。しかしながら、メトトレキサートによる治療は、数回の注入が必要であり、角膜上皮症（Ｏｈｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ／Ｖｏｌ．１２６ Ｎｏ．７；１００２−１００３［６］）のような眼における合併症を引き起こす。さらに、ＳＭＥＴ ＭＤにより報告された他の患者においては、硝子体内注入したメトトレキサートが一般に許容され、迅速な治癒を導くときでさえ、単独治療の患者において、再発を妨げる。さらに、メトトレキサートは、多くの他の逆反応を有し、特に免疫抑制及び肝機能障害が知られている。
【００１３】
ＰＩＯＬは、ＣＤ２０を発現する大きなＢ細胞腫瘍を含む、リンパ腫である。リツキシマブの静脈内注入は、全身性の大きなＢ細胞リンパ腫を有する患者の延命に貢献した。しかしながら、リツキシマブは、おそらくモノクローナル抗体が血液脳関門を通過しないことを理由として、中枢神経系リンパ腫の予後には影響しなかった。同様に、眼の傷害に対するリツキシマブの静脈内注入治療は、血液脳関門を理由として、中枢神経系リンパ腫に有利に結びつきそうもない（［６］）。
【００１４】
しかしながら、リツキシマブの静脈内注入試験は、中枢神経系初期リンパ腫の患者において顕著な眼の毒性作用の不在を示した（Ｋｉｔｚａｍｎｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｅｙｅ ２１， １５２４−１５２７ ［７］）。さらに、患者は相補的な全身又は眼内治療を受けるため、リツキシマブの静脈内投与による治療の有効性に関する結論を描くのは可能ではない。
【００１５】
さらに、二人のＰＩＯＬ患者における静脈内リツキシマブ注入試験が、眼におけるリンパ腫悪性細胞の消失を示した（［６］）。さらに、半分の患者において、眼の前室における炎症反応を示した。臨床試験もまた、合併症の不在を示した。しかしながら、調査はリツキシマブ治療後２ヶ月に限定されており、生検結果に基づいておらず、単なる臨床調査である。
【００１６】
それゆえに、ＰＩＯＬ治療に関するこれらの欠点及び障害を克服する治療技術の真の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の第１の目的は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体の、初期の眼内リンパ腫（「ＰＩＯＬ」とも称する）の治療のための使用に関し、当該抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列にコードされており、各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、さらに、各軽鎖及び各重鎖の定常領域は、非マウス種由来である。
【００１８】
抗体は、ジスルフィド結合により互いに連結された重鎖及び軽鎖により形成されている。各鎖は、本発明の抗体に対する抗原に特異的な、Ｎ末端位置の可変領域（又はドメイン）（再構築された軽鎖のＶ−Ｊ遺伝子及び重鎖のＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子にコードされた）と、軽鎖の単一のＣＬドメイン及び重鎖のいくつかのドメインにより形成された、Ｃ末端位置の定常領域とにより形成されている。
【００１９】
本発明の目的において、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体構成物」の発現は、同一の及び独自の特異性を有する抗体の調製に関する。本発明に係る抗体は、軽鎖及び重鎖の定常領域と異なる種に属する軽鎖及び重鎖の可変領域において、キメラ抗体として参照される。
【００２０】
配列番号１及び２のマウス核酸配列は、ドイツ微生物培養細胞コレクションセンター（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ））において、アクセッション番号ＡＣＣ ４７４の下で利用可能な、マウスハイブリドーマＣＡＴ−１３．６Ｅ１２により生成された抗体の、各軽鎖の可変領域及び各重鎖の可変領域をコードしている。このハイブリドーマは、ＣＤ２０に対する、マウスＩｇＧ２ａ、ｋ型モノクローナル抗体を生成する。
【００２１】
配列番号１の配列は、それにも関わらず、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウスハイブリドーマにより生成された抗体の軽鎖の可変領域をコードする配列とは異なる核酸を含む。
【００２２】
これらのマウス配列は、ＣＤ２０抗原に対するＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の特異性によって、本発明に係る抗体における可変領域の配列の作動を選択する。本発明に係る抗体の可変領域は、配列番号１及び２の配列と少なくとも７０％同一の配列を共有する。この配列同一性によって、本発明に係る抗体がＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と同一の特性を有するようになる。好ましくは、この配列同一性は、本発明に係る抗体とＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体との間で、標的に対する同一の親和性をも提供する。
【００２３】
さらに、本発明において用いられる抗体は、非マウス種に属する軽鎖及び重鎖の定常領域を有している。これに関して、非マウス哺乳動物の全てのファミリー及び種を使用できる可能性があり、特に、ヒト、サル、ネズミ（マウス以外）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、トリについても同様に使用できる可能性がある。
【００２４】
本発明において、治療に用いられる抗体は、当業者に公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて構築可能であり、より詳細には、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４）に記載の「キメラ」抗体構築技術により構築可能である。組み換えＤＮＡ技術は、非ヒト哺乳動物由来の抗体の重鎖の定常領域及び／又は軽鎖の定常領域の、ヒト免疫グロブリンの対応する領域による置換を利用する。詳細な実施形態は以下に説明する。
【００２５】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも８０％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも８０％同一の配列を共有する配列にコードされている。有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２６】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２７】
有利な点において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも９９％同一の配列を共有する配列にコードされており、本発明に係る抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも９９％同一の配列を共有する配列にコードされている。
【００２８】
有利な点において、重鎖及び軽鎖の可変領域において、１以上の核酸の１以上の置換、挿入又は欠失を含み、これらの配列の変異が、上記で定義した配列の同一性比率に対応し、抗体の標的に対する特異性又は親和性に影響を及ぼさないような、いずれかの抗体を、本発明の文脈において使用可能である。
【００２９】
本発明において用いられる抗体は、また、ＦＲ（骨格、可変領域の高度に保存された領域、「背骨」としても知られる。）に結合したＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体のＣＤＲ領域（相補的決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ））を有する抗体に関する。このような抗体は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体に非常に類似した、かつ好ましくは同一の、親和性及び特異性を有している。
【００３０】
好ましくは、本発明において用いられる抗体の各軽鎖の可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、本発明において用いられる抗体の各重鎖の可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列にコードされている。
【００３１】
本発明の第一の実施形態において、本発明において用いる抗体は、特に薬剤として用いられ、各軽鎖の可変領域が配列番号１のマウス核酸配列にコードされ、各重鎖の可変領域が配列番号２のマウス核酸配列にコードされており、軽鎖及び重鎖の定常領域が、非マウス種由来の定常領域である、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体である。
【００３２】
それゆえに、「ＣＤ２０抗原に対する」の意味は、ＣＤ２０抗原の全て又は一部、及び、特に抗体ＥＭＡＢ６０３によって認識されるエピトープに接触するモノクローナル抗体の可能性である。
【００３３】
好ましくは、本発明において用いる抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域は、ヒト定常領域である。この本発明の好ましい実施形態は、ヒトにおいて抗体の免疫原性を低減させるのを可能にし、同時に、ヒトへの治療的投与におけるその有効性を向上させ得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体の各軽鎖の定常領域は、Ｋ型である。例えば、Ｋｍ（１）、Ｋｍ（１，２）、Ｋｍ（１，２，３）及びＫｍ（３）のような、いずれかのアロタイプが本発明の実施に適しているが、好ましいアロタイプはＫｍ（３）である。
【００３４】
他のさらなる実施形態において、本発明に係る抗体の各軽鎖の定常領域は、λ型である。
【００３５】
本発明の特有の局面において、本発明において用いられる抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域がヒト領域であるとき、抗体の各重鎖の定常領域は、γ型である。この代替によれば、抗体の各重鎖の定常領域は、γ１型、γ２型、γ３型であってもよく、これらの３つの定常領域型はヒト相補鎖に結合する特有の特徴を示す。また、定常領域はさらにγ４型であってもよい。各重鎖の定常領域がγ型である抗体は、ＩｇＧクラスに属する。免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって共に連結された、２つの重鎖及び２つの軽鎖により構成されるヘテロ二量体である。各鎖は、Ｎ末端位置における、抗体に対する抗原に特異的な可変領域又はドメイン（再設計した軽鎖のＶ−Ｊ遺伝子及び重鎖のＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によりコードされた）と、Ｃ末端位置における、軽鎖のための単一のＣＬドメイン又は重鎖のための３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）により構成された定常領域とにより構成されている。可変ドメイン、並びに重鎖及び軽鎖のＣＨ１及びＣＬドメインの組み合わせは、Ｆａｂ断片を形成し、抗体のエフェクター特性の媒介物であるＦｃ領域が、ＦｃγＲ及びＣ１ｑレセプターのようなエフェクター分子へのアクセス可能性を維持している一方で、各Ｆａｂをその標的抗原に結合するのを可能にする、高度に柔軟なヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結される。ＣＨ２及びＣＨ３の両方の球状ドメインにより構成されるＦｃ領域は、Ａｓｎ２９７に連結するラクトサミン型二分岐Ｎ−グリカンが存在する条件下において、２つの鎖のそれぞれにおけるＣＨ２ドメインにおいてグリコシル化される。
【００３６】
好ましくは、抗体の各重鎖の定常領域はγ１型である。このような抗体は、かなり多くの数の（ヒト）個体において、ＡＤＣＣ活性化が生じる可能性を示すからである。これに関連して、例えばＧ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１，２，１７）、Ｇ１ｍ（１，１７）またはＧ１ｍ（１，３）のような、どのアロタイプも本発明の実施において適切である。好ましいアロタイプはＧ１ｍ（１，１７）である。
【００３７】
本発明の特有の局面において、抗体の各重鎖の定常領域はγ１型であり、配列番号３に示すヒト核酸配列によってコードされており、その各軽鎖の定常領域は、配列番号４に示すヒト核酸配列によってコードされている。それゆえに、このような抗体は、γ１型重鎖と共に、マウス可変領域及びヒト定常領域を有する。この抗体は、それゆえに、ＩｇＧＩサブクラスに属する。本発明において用いられる抗体の実施形態によれば、抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有している。この２つの軽鎖の可変領域は配列番号１の核酸配列にコードされ、そのヒト定常領域は配列番号４の核酸配列にコードされている。また、２つの重鎖の可変領域は配列番号２のマウス核酸配列にコードされ、その定常領域は配列番号３のヒト核酸配列にコードされている。
【００３８】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、各重鎖は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている。抗体の各軽鎖をコードする配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖の可変領域をコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖の定常領域をコードする配列番号４のヒト核酸配列とを融合することによって得られる。
【００３９】
抗体の各重鎖をコードする配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖の可変領域をコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖の定常領域をコードする配列番号３のヒト核酸配列とを融合することによって得られる。
【００４０】
本発明の特有の局面において、抗体の各軽鎖が、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、重鎖のそれぞれが、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされているとき、配列番号５の核酸配列から推測される各軽鎖のペプチド配列は、配列番号７の配列であり、配列番号６の核酸配列から推測される各重鎖のペプチド配列は、配列番号８の配列である。
【００４１】
配列番号７の配列において、１０６番目に位置するアミノ酸はリシン（Ｋ）である。
【００４２】
また、本発明は、各軽鎖が、配列番号７のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の相同性又は同一性を有するマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされ、かつ各重鎖が、配列番号８のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の相同性又は同一性を有するマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされた抗体に関する。これらの修飾によって、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性のように、抗体の特異性もそのエフェクター活性も変化しない。
【００４３】
特に有効な方法において、本発明において用いられる抗体は、ラットハイブリドーマ細胞ラインにより生成される。本発明による抗体を生成する細胞ラインは、いくつかの特定の性質を有する抗体を提供するために、重要な機構である。つまり、特にグリコシル化修飾のような翻訳後修飾を引き起こす抗体を発現する方法では、１つの細胞ラインから他の細胞ラインへと変化し得、それにより、むしろ異なる機能特性を有する同一の一次構造を有する抗体を提供する。
【００４４】
好ましい実施形態において、抗体は、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞ライン（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録されたＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）において生成される。例えばＣＨＯ細胞において生成した同一の一次構造を有する抗体と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を有する抗体を生成する可能性を有するので、この細胞ラインを選択した。
【００４５】
他の特定の実施形態において、本発明の他の抗体は、国立微生物培養保管所（ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５）に、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で、２００５年１１月２９日に登録された、クローンＲ６０３により生成されたＥＭＡＢ６０３抗体である。ＥＭＡＢ６０３抗体の各軽鎖は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされており、各重鎖は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている。このキメラ抗体は、ＣＤ２０結合においてＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と競合し、リツキシマブよりも大きな細胞傷害活性を有している。このような特性は、これらの抗体の重鎖におけるＮ−グリカンの特異的グリコシル化の部分に起因し得る。事実、Ｒ６０３クローンの特定の特徴は、フルクトース／ガラクトース比率が０．６以下のＥＭＡＢ６０３抗体構成物を生成することであり、このことは、強いＡＤＣＣ活性を有する抗体を提供するために最適であると、特許出願ＦＲ ０３ １２２２９に記載されている。この抗体は、ＰＩＯＬの治療のための治療手段として、特に有用であり得る。
【００４６】
有利な点として、本発明の抗体は記憶Ｔリンパ細胞の構成を許容し得る。これらの記憶Ｔリンパ細胞は、増殖能及び腫瘍細胞に対する２回目の暴露の間に即座に再活性化する能力を有し得る。
【００４７】
有利な点として、本発明の抗体は、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を可能にし得、これにより腫瘍成長の減速及び腫瘍細胞除去の向上を導き得る。
【００４８】
有利な点として、このようなモノクローナル抗体は、顕著な抗腫瘍効果を有し得る。例えば、このような抗体は、これが投与された眼内リンパ腫を有する患者において、腫瘍細胞の複製を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％、及び好ましくは少なくとも６０％又は７０％抑制するのを許容し得る。
【００４９】
このような抗体は、これを生成する方法と同様に、ＷＯ２００６／０６４１２１に記載されている。
【００５０】
本発明に係る抗体発現ベクターの一例は、配列番号１７に示す配列のベクターである。このベクターは、軽鎖が配列番号５の核酸配列にコードされ、推定ペプチド配列が配列番号７に示されており、重鎖が配列番号６の核酸配列にコードされ、推定ペプチド配列が配列番号８に示された、本発明の抗体の発現を可能にする。このベクターは、抗体の各軽鎖をコードする配列番号５の核酸配列と、抗体の各重鎖をコードする配列番号６の核酸配列とを、宿主細胞中に導入し、かつ維持するために、これらの配列が挿入された核酸分子である。このベクターは、この発現に不可欠な配列（プロモーター、ポリアデニレーション配列、遺伝子選択）を有しているので、これらの外来核酸フラグメントの宿主細胞における発現を可能にする。このようなベクターは、当業者に公知であり、完全に網羅してはいないが、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド、又はバクテリオファージがある。さらに、いずれかの哺乳動物細胞を宿主細胞として、すなわち、本発明に係る抗体を発現する細胞として使用可能であり、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ ＢＩＩ、ＣＨＯ ＤＧ４４）、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳが挙げられる。
【００５１】
他の実施形態において、本発明の抗体は、一方は抗体の軽鎖を発現し、他方は抗体の重鎖を発現する、２つの発現ベクター細胞において共発現することによって生成することができる。上述したように、これらのベクターは、この発現に不可欠な配列（プロモーター、ポリアデニレーション配列、遺伝子選択）を有する。上記のように、ベクターは、例えばプラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、又はバクテリオファージであり得、さらに宿主細胞は、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ ＢＩＩ、ＣＨＯ ＤＧ４４）、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳのような、いずれかの哺乳動物細胞であり得る。
【００５２】
有利な点として、本発明において用いられる抗体を発現する安定した細胞ラインは、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０．ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａのようなヒト骨髄腫、又はＰＥＲＣ６、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（ＤＸ ＢＩＩ ＣＨＯ、ＣＨＯ ＤＧ４４）のようなＣＨＯラインのようなヒト由来の他の細胞からなる群より選択され、又はＷｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される他の細胞ラインである。
【００５３】
好ましくは、使用する細胞ラインは、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞ライン（ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．Ａｇ．２０細胞、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録された）である。この細胞ラインは、例えば、ＣＨＯ細胞において生成した同一の一次構造を有する抗体と比較して、向上したＡＤＣＣ活性を有する抗体を生成する可能性を有するので、この細胞ラインを選択した。
【００５４】
これらの細胞に適した培養培地は、当業者によく知られており、完全に網羅してはいないが、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）［１４］）、イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）［１５］）、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）変法ＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）［１６］）、Ｆ１２培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）［１７］）、ＩＭＤＭ（Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）［１８］）、又は文献ＥＰ１２２９１２５に記載されたものが挙げられる。
【００５５】
本発明に特有の目的は、上述した抗体を用いた、初期眼内リンパ腫の治療方法に関する。
【００５６】
有利な点として、治療方法は、ＰＩＯＬ患者に抗体を投与する工程を包含する。
【００５７】
有利な点として、本発明において用いられる抗体を、所望の治療効果に適した、薬学的に許容される担体と共に投与する。
【００５８】
この点について、本発明において用いられる抗体は、例えばモノクローナル抗体のように、リンパ系細胞に発現する１つ以上の抗原に対する、１つ以上の他の抗体との組み合わせとして用いられ得る。このような抗原として、完全に網羅してはいないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１３２、ＣＤ２１０、ＣＤ２１７抗原が上げられる。
【００５９】
他の実施形態において、本発明に係る抗体は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラー細胞）、Ｔγσリンパ球、マクロファージ、単球、又は樹状細胞のように、ＦｃγＲを発現する細胞と組み合わせて用いてもよく、すなわち細胞療法と組み合わせてもよい（Ｐｅｌｌｅｒ Ｓ，Ｋａｕｆｍａｎ Ｓ Ｂｌｏｏｄ １９９１，７８：１５６９（［８］）；Ｋｉｍｂｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３（７）：５０１−５０４（［９］）；Ｓｏｏｒｓｋａａｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８７（２），１５９−１６４（［１０］）；Ｚｉｅｇｌｅｒ ＨＷ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８１ ２７（３），３２１−３２７（［１１］）；Ｃｈａｐｅｒｏｔ Ｌ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４（９）：１６６７−１６７７（［１２］）；Ｖｕｉｌｌｉｅｒ Ｆ，Ｄｉｇｈｉｅｒｏ Ｇ ２００３ Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ．９０（８−９）：７４４−５０（［１３］））。
【００６０】
さらに、抗体を、好ましくは、投与量３７５ｍｇ／ｍ２、１８７．５ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、３７．５ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、７．５ｍｇ／ｍ２未満で患者に投与し得、また、３．７５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２または０．５ｍｇ／ｍ２で患者に投与すると特に有利である。投与量は、１８７．５ｍｇ／ｍ２から７５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から３７．５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から１５ｍｇ／ｍ２の間、７５ｍｇ／ｍ２から７．５ｍｇ／ｍ２の間、又は７５ｍｇ／ｍ２から３．７５ｍｇ／ｍ２の間であれば有利である。好ましくは、投与量が、３．７５ｍｇ／ｍ２から０．５ｍｇ／ｍ２の間であり、これらの量が２ｍｇ／ｍ２から１ｍｇ／ｍ２の間であれば有利である。これらの量が静脈内投与されれば有利である。
【００６１】
抗体が静脈内投与されるとき、患者に投与される抗体の量は、０．００１μｇから１０００μｇの間、０．００１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間であれば有利であり、０．０１μｇから１０μｇの間、１μｇから１０μｇの間、０．０１μｇから１μｇの間、０．０１μｇから０．１μｇの間、又は０．０２μｇから０．０８μｇの間であれば有利である。
【００６２】
有利な点において、抗体の投与は、疾患に冒された眼において行われてもよい。
【００６３】
患者に投与する抗体の量は、一眼あたりの抗体量が０．００１μｇから１０００μｇの間、０．００１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間であってよく、好ましくは０．０１μｇから１０μｇの間、１μｇから１０μｇの間、０．０１μｇから１μｇの間、０．０１μｇから０．１μｇの間、又は０．０２μｇから０．０８μｇであることが好ましい。
【００６４】
硝子体液１ｍＬあたり０．１μｇから１０００μｇの間、０．１μｇから１００μｇの間、又は１０μｇから１００μｇの間で投与することが有利であり、硝子体液１ｍＬあたり１μｇから１００μｇの間、１００μｇから１０００μｇの間、１μｇから１００μｇの間、１μｇから１０μｇの間、又は２μｇから８μｇの間であれば好ましい。
【００６５】
単一の投与量注入又は繰返しの投与量注入のいずれかにより投与されることが好ましい。代替として、各投与を前回の投与位置から十分に離間して行い、各投与を単一の投与としてみなす。例えば、各投与を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、１０週間、又は６ヶ月間隔で行うことができる。
【００６６】
抗体の投与を、一眼あたり０．０２μｇ量の抗体、又は硝子体液１ｍＬあたり０．００２ｍｇ量の抗体を硝子体内に注入することによって達成されることが好ましい。各投与を、最小で1週間隔、例えば1週間、２週間、３週間、４週間、又は５週間隔で行うことが有利である。
【００６７】
本発明において用いられる抗体の投与形態は、例えば、硝子体への注入、眼の周囲及び眼の中への注入、結膜への注入、眼球の周囲又は眼球側への注入、眼球後への注入、特に硝子体内点眼のように点眼剤の点眼、イオントフォレーゼ、部分皮下注入、眼の軟膏の塗布、網膜静脈へ注入、又は超音波照射により、眼内において行われる。
【００６８】
抗体は、当業者に公知の標準的なルールに基づいて、リンパ腫の治療薬として投与することができる。
【００６９】
本発明において用いられる抗体は、細胞傷害性であるという特徴及び利点を有している。
【００７０】
このように、これらは、そのＦｃ領域のＦｃγＲＩＩＩＡレセプターによって、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性化する能力を有している。このレセプターは、「エフェクター細胞」と呼ばれる細胞の表面に発現し、エフェクター細胞に担持されたそのレセプターに、抗体のＦｃ領域が結合するので、ＦｃγＩＩＩＡの活性化及び標的細胞の破壊の原因となる。したがって、このレセプターは非常に興味深い。エフェクター細胞として、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγσリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球、又は肥満細胞が挙げられる。
【００７１】
本発明の他の目的は、本発明に係る抗体を、初期眼内リンパ腫の治療のための薬剤の製造のために用いる。
【００７２】
さらに、本発明の他の目的は、初期眼内リンパ腫の治療のための薬剤を調製する方法であって、本発明において用いるモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを混合し、薬剤として得ることからなる。
【００７３】
本発明の他の目的は、初期眼内リンパ腫の治療処置方法であり、必要性が認められる患者に投与することを含む。上述したような抗体又は薬剤の投与を含む。
【００７４】
他の利点は、以下の実施例を読んだ当業者に明らかであり得、添付の図面における説明を、説明の目的で与えた。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＥＭＡＢ６０３抗体のカッパー軽鎖のキメラ化に用いたＣＫＨｕベクターの概略図である。
【図２】図２は、ＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のキメラ化に用いたＧ１Ｈｕベクターの概略図である。
【図３】図３は、ＥＭＡＢ６０３抗体の生成のために用いた重鎖及び軽鎖の発現ベクターの概略図である。
【図４】図４は、ＰＩＯＬマウスモデルにおいて腫瘍を成長させた眼に、ＰＢＳ １×、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（２０μｇ）、又はリツキシマブ抗体（２０μｇ）を注入した後の、眼球腫瘍細胞（×１０６）の絶対数を示す図である。結果を、２回の実験の合計から得た。
【図５】図５は、ＰＩＯＬマウスモデルにおいて腫瘍を成長させた眼に、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、又はＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体を、０．０２μｇ及び０．２μｇの投与量で注入した後の、眼球腫瘍細胞（×１０６）の絶対数を示す図である。結果を、6回の実験の合計から得た。
【実施例】
【００７６】
〔実施例１：抗ＣＤ２０キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の発現ベクターの構築〕
（Ａ．マウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の可変領域の配列決定）
ＩｇＧ２ａ,κ型免疫グロブリンを生成するマウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体（供給元：ＤＳＭＺ、ｒｅｆ．ＡＣＣ ４７４）の総ＲＮＡを単離した（キット ＲＮＡｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ ｒｅｆ．７４１０４）。逆転写の後、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の軽鎖（ＶＫ）及び重鎖（ＶＫ）の可変領域を、５’ＲＡＣＥ方法（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）（キット ＧｅｎｅＲａｃｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｆ．Ｌ１５００−０１）によって増幅させた。これらの２つの工程に用いたプライマーは以下の通りである。
【００７７】
１．逆転写プライマー
ａ．カッパーマウス特異的逆方向プライマー（配列番号９）
【００７８】
【化１】
【００７９】
ｂ．Ｇ２ａマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１０）
【００８０】
【化２】
【００８１】
２．５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー
ａ．カッパーマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１１）
【００８２】
【化３】
【００８３】
ｂ．Ｇ２ａマウス特異的逆方向プライマー（配列番号１２）
【００８４】
【化４】
【００８５】
結果として得られたＶＨ及びＶＫ ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｚｅｒｏ ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．Ｋ２８７５−２０）にクローニングした後、配列決定した。ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の領域Ｖκのヌクレオチド配列において、末端ヌクレオチドをＡに置換したもの（ＡＡＣに換えてＡＡＡ）を、配列番号１の配列に示した。Ｖκ遺伝子は、Ｖκ４ファミリーに属している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１）［１９］）。ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２の領域ＶＨのヌクレオチド配列は、配列番号２の配列である。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１ファミリーに属する（［１９］）。
（Ｂ．キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖及び軽鎖の発現ベクターの構築）
１．抗体ＥＭＡＢ６０３のカッパー軽鎖ベクター
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター配列にクローニングされたＶＫ配列を、以下のクローニングプライマーを用いて増幅した。
【００８６】
ａ．順方向ＶＫプライマー（配列番号１３）
【００８７】
【化５】
【００８８】
下線を付した配列は、制限部位Ｓｐｅ Ｉの部位に対応しており、太字で示した配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列であり、ＡＴＧ開始コドンをイタリック体で示した。
【００８９】
ｂ．逆方向ＶＫプライマー（配列番号１４）
【００９０】
【化６】
【００９１】
このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体で示す）とヒト定常領域（Ｃκ）（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＤｒａＩＩＩの制限酵素認識部位に対応する。
【００９２】
このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体で示す）とヒト定常領域（Ｃκ）（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＤｒａＩＩＩの制限酵素認識部位に対応する。
【００９３】
ＶκＰＣＲの結果として得られる産物は、マウス抗体ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含み、ＡＡＣがＡＡＡに変異している（配列番号１４の逆方向プライマーの配列において、囲み線の中のヌクレオチド）。この変異は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２のＶκ天然配列に対して、Ｎ１０６Ｋの変異に相当する。
【００９４】
このベクターにコードされたＥＭＡＢ６０３キメラ抗体の軽鎖配列を、配列番号５にヌクレオチド配列として示し、配列番号７が推定ペプチド配列に相当する。
【００９５】
その後、このＶκＰＣＲを、配列番号４に示すヌクレオチド配列に相当するヒト定常領域Ｃκの５’において、配列番号１の配列に相当する軽鎖キメラベクター（図１）のＳｐｅＩ部位とＤｒａＩＩＩ部位との間にクローニングした。マウスＶκ配列をクローニング可能にするために、ＤｒａＩＩＩ制限酵素認識部位を形成するためのサイレント変異することによって、このキメラベクターのヒト配列Ｖκを予め修飾した。このキメラベクターは、ｄｈｆ選択遺伝子（ジヒドロ葉酸還元酵素）と同様に、ＲＳＶプロモーター及びポリアデニレーションｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）の配列を含む。
【００９６】
２．重鎖ベクター
同様の方法をＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のキメラ化に適用した。
【００９７】
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングされたＶＨ配列を、以下のクローニングプライマーを用いて最初に増幅した。
【００９８】
ａ．順方向ＶＨプライマー（配列番号１５）
【００９９】
【化７】
【０１００】
下線を付した配列は、ＳｐｅＩ制限酵素認識部位に相当し、太字で示す配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に相当し、ＡＴＧ開始コドンをイタリック体で示す。
【０１０１】
ｂ．逆方向ＶＨプライマー（配列番号１６）
【０１０２】
【化８】
【０１０３】
このプライマーは、マウスＶＨ配列（イタリック体で示す）とＧＩヒト定常領域（太字で示す）の連結部に達する。下線を付した配列は、ＡｐａＩ制限酵素認識部位に相当する。
【０１０４】
増幅したＶＨ断片は、マウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。その後、このＶＨ ＰＣＲを、配列番号３に示す核酸配列のヒト定常領域γＩの５’において、配列番号１の配列に相当する、キメラベクター（図２）の重鎖のＳｐｅＩ部位とＡｐａＩ部位との間にクローニングした。このキメラベクターは、ｎｅｏ選択遺伝子と同様に、ＲＳＶプロモーター及びポリアデニレーションｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）を含む。
【０１０５】
このベクターにコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖の配列は、ヌクレオチド配列として配列番号６に示し、推定ペプチド配列を配列番号８に示す。
【０１０６】
３．目的の発現ベクター
（ＥＭＡＢ６０３抗体の発現ベクター）
抗ＣＤ２０抗体ＥＭＡＢ６０３の重鎖転写及び軽鎖転写の２つのユニットを包含する独自の発現ベクターを、重鎖及び軽鎖の２つのキメラベクターから構築した。この発現ベクターＨＫ４６３−２５（ＦＤＡ）には、ＲＳＶプロモーター（図３）の制御下にある重鎖及び軽鎖の２つの転写ユニットと同様に、ｎｅｏ（ｎｅｏフォスフォトランスフェラーゼＩＩ）及びｄｈｆ（ジヒドロ葉酸還元酵素）が存在する。
【０１０７】
〔実施例２：抗ＣＤ２０キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３のＹＢ２／０ラインを生成する、細胞ライン誘導体の生成〕
ラット細胞ラインＹＢ２／０（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−１６６２）を、５％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．１２１０７）を含むＥＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．０４１−９５１８１Ｍ）において培養した。トランスフェクトのために、抗体ＥＭＡＢ６０３の発現のための、軽鎖ベクターであるｐＲＳＶ−ＨＬ−ＥＭＡＢ−６０３ ２５μｇと共に、細胞５百万個をＯｐｔｉｍｉｘ培地（Ｅｑｕｉｂｉｏ，ｒｅｆ．ＥＫＩＴＥ １）中で、エレクトロポレートした（エレクトロポレーター Ｂｉｏｒａｄ，ｍｏｄｅｌ１６５２０７７）。適用したエレクトロポレーション条件は、０．５ｍｌのキュベットに対して、２３０ボルト及び９６０マイクロファラッドであった。各エレクトロポレーションキュベットを、その後、５０００細胞／ウエルの密度で、５つのプレートＰ９６に分配した。５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０６３−０１７）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０１３１−０２７）、及び２５ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）を含むＲＰＭＩ選択培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ２１８７５−０３４）における認識は、トランスフェクトの３日後に達した。
【０１０８】
耐性のあったトランスフェクションウエルの上清を、ヒトＩｇ配列特異的ＥＬＩＳＡテストによる、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在のスクリーニングに用いた。
【０１０９】
最も多くの抗体を生成する１０個のトランスフェクション産物を、Ｐ２４プレートにおいて増幅し、限界希釈法（４０細胞／プレート）によるクローニングのために、その生産性を評価し、３つの最も優れた生産体を選択するために、その上清をＥＬＩＳＡにより再度試験した。
【０１１０】
クローニングの後、クローンＲ６０３をキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の生成のために選択し、生成培地ＣＤハイブリドーマ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１１２７９−０２３）に徐々に適応させた。キメラ抗体ＥＭＡＢ６０３の生成を、ＣＤハイブリドーマ培地に適応したラインの拡張によって達成し、７５ｃｍ２及び１７５ｃｍ２ボトル中において３ｘ１０−５細胞／ｍｌの希釈液、その後、ローラー型ボトル中において４．５ｘ１０−５細胞／ｍｌの希釈液を得た。最大量に達した後、細胞ラインを、細胞生存率がわずか２０％になるまで行った。生産の後、プロテインＡについてのアフィニティクロマトグラフィ（精製度をＨＰＬＣ<９５％で評価した）によってキメラ抗体ＥＭＡＢ６０３を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって観察した。
【０１１１】
〔実施例３：第１の実験プロトコルに基づいた、ＰＩＯＬマウスモデルにおけるＬＢ＿Ｒ６０３及びリツキシマブ抗体の有効性の研究〕
（材料及び方法）
＜細胞ライン＞
ＩＩＡ１．６細胞を、リンパ腫性ＢマウスＡ２０−ｎＪ細胞ラインから得た（Ｊｏｎｅｓ Ｃ． ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ Ａ２０／２Ｊ ａｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｇｅｎ− ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｌ３Ｔ４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｉ−Ａ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６；１３６−３４８−３５６，［２１］）。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ペニシリン １００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１０ｍＭのピルビン酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）、及び５０ｍＭのメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）が添加された、ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｌｕｔａｍａｘ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）において培養し、５％ＣＯ２雰囲気下において３７℃で保持した（Ｔｏｕｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｔｈ１／Ｔｃ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｌｙ ２００７，ｖｏｌ．４８，ｎｏ．７，［２２］）。
【０１１２】
＜トランスフェクション＞
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御の下、３．５ｋｂ ｐｍａｘ ＧＦＰ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びヒトＣＤ２０のコード遺伝子を有するプラスミドを用いて、ＩＩＡ１．６細胞をヌクレオフェクションによってトランスフェクトした。４８８ｎｍのアルゴンレーザを細胞に照射したとき、ＧＦＰ分子（緑色蛍光タンパク質）が５１０ｎｍの緑色波長において発光し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてトランスフェクト細胞を検出することが可能になる。トランスフェクションの後、０．５ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を含むラインの培地において細胞を培養した。ＧＦＰ及びヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）を高い割合で発現するクローンを、限界希釈法によって得て、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０と称した。
【０１１３】
＜マウス＞
６〜１２週齢のメスのマウスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。マウスに滅菌した食物及び濾過した水を無制限に与え、１２時間の暗条件サイクルに維持した。全てのマウスを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、及び“ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ”にしたがって扱った。
【０１１４】
＜硝子体内注入及び臨床評価＞
１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン（ｌｍａｌｇｅｎｅ １０００；Ｍｅｒｉａｌ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）及び６ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ ２％；Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組み合わせを腹腔内注入することによって、麻酔した。腫瘍細胞（１０４細胞）を２μＬ １×のＰＢＳ（ｐＨ７．４）内においてインキュベートし、解剖顕微鏡を用いて扁平部を経て硝子体内に注入した。
【０１１５】
０．５％のトロピカミド（Ｔｈｅａ，Ｃｌｅｒｍｏｎｄ−Ｆｅｒｒａｎｄ，Ｆｒａｎｃｅ）で膨張させた後、シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に取り付けられた３２ゲージの針を通して、無菌状態で右眼に注入を行った。試験マウスの右眼の硝子体内に、２μＬのＰＢＳを注入した。注入後、リファマイシンドロップ（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ−Ｃｈｒｉｂｅｒｔ，Ｃｌｅｒｍｏｎｔ−Ｆｅｒｒａｎｄ，Ｆｒａｎｃｅ）を滴下した。
【０１１６】
各マウスの眼底の両側実験を含む、細隙灯実験を、標準的な間隔で行った。臨床的な進行度を、眼が関与する臨床スコアにしたがって、等級付けた。
【０１１７】
Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入の７日後、マウスを以下の３つのグループに分けた：腫瘍細胞を受けた眼にＰＢＳ １×（２μＬ）の注入を受けた８匹のマウスのグループ、腫瘍細胞を受けた眼に２０μｇ／２μＬの抗体ＬＦＢ＿Ｒ６０３（「ＥＭＡＢ６０３」とも称する）の注入を受けた１６匹のマウスのグループ、及び２０μｇ／２μＬのリツキシマブ抗体の注入を受けた８匹のマウスのグループ。
【０１１８】
ＰＢＳ、ＬＦＢ＿Ｒ６０３、又はリツキシマブ抗体の注入の８日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させた。
【０１１９】
＜組織学試験＞
死亡後、眼を回収し、５％スクロースを含む４％パラフォルムアルデヒド中で２時間固定し、供給元からの使用説明書にしたがって、薄片組織学試験のために、樹脂に包埋した（Ｈｉｓｔｏｒｅｓｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｋｉｔ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。連続切片（５μｍ）を、トルイジンブルーにより標識した。このように、眼の切片の顕微鏡試験を行った（Ｌｅｉｔｚ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ，Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）。画像を収集した（ＤＦＣ４８０ Ｌｅｉｃａ，ｗｉｔｈ ａ ＩＭ２０ Ｉｍａｇｅ ｍａｎａｇｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１２０】
＜免疫細胞化学＞
除核した眼を、４％パラフォルムアルデヒド及び５％スクロースを含む溶液中で２時間固定し、１５％スクロースを含むＰＢＳ中に一晩浸漬した。サンプルを、適合させた構成要素（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ）中に包埋して凍結し、−８０℃で保管した。凍結した眼の眼神経における前後切片（厚さ１０μｍ）を、クリオスタット（ＣＭ２０５０Ｓ；Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に切断し、免疫細胞化学解析のために、ゼラチンでコーティングされたスライド上に載せた。免疫標識のために、組織切片を、Ｔ細胞（ｃｌｏｎｅ ＣＤ４ ＧＫ１．５，ｃｌｏｎｅ ＣＤ８ ５３−６−７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅ Ｐｏｎｔ−ｄｅ−Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、マクロファージ（ｃｌｏｎｅ Ｆ４／８０）、及び多核好中球（ｃｌｏｎｅ ７／４；Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｃｅｒｇｙ Ｓａｉｎｔ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を対象とした、精製したラットモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ５９４抗マウス共役抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）を用いて可視化した。
【０１２１】
一部の実験において、核標識剤であるヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共にスライドをインキュベートした。ネガティブテストの実験を、ｍＡｂアイソタイプコントロールと共に組織切片中でインキュベートすることによって達成した。切片を、５％グリセロールを含むＰＢＳ中に固定し、蛍光顕微鏡で観察した（ＦＸＡ，Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ；Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）。
【０１２２】
＜共焦点顕微鏡検査及び画像解析＞
共焦点顕微鏡検査を、アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）及びヘリウムネオンレーザ（５４３ｎｍ）を備えたレーザ走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ，ＧｍｂＨ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、凍結眼の切片において行った。画像を、ｉｍａｇｅ−ｂｒｏｗｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＬＳＭ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ，ＧｍｂＨ）を用いて融合し、多色複合画像を生成した。
【０１２３】
＜フローサイトメトリー＞
眼をＲＰＭＩ培地中で切除し、０．１ｍｇ／ｍＬのＤｎａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、及び精製した酵素（Ｌｉｂｅｒａｓｅ，Ｒｏｃｈｅ）のＷｕｎｓｃｈ／ｍＬの１．６７ユニットを用いて、３７℃で２０分間消化して濾過し、２ｍＭのＥＤＴＡ及び３％ ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＰＢＳ中ですすぎ洗いした。
【０１２４】
細胞を２．４Ｇ２ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートし、Ｆｃレセプターとの非特異的な連結を阻害した。その後、１ウエルあたり１０５細胞を、以下のｍＡｂｓで標識した：ビオチン共役抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ４（ＧＫ１，５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、蛍光色素（Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ）共役抗ＣＤ８（５３−６．７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ１９（６Ｄ５；ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、フィコエリトリン共役抗ＣＤ２０（ＬＦＢ＿Ｒ６０３，ＬＦＢ ＳＡ）、又は対応するｍＡｂアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１２５】
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウエアを用いて行った。
【０１２６】
（結果）
＜Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入における、Ｂ細胞リンパ腫の眼内成長＞
眼内リンパ腫モデルを生成するために、正常な免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウスに、ヒトＣＤ２０を発現するＢ細胞リンパ腫 Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０の合成ラインの硝子体内注入を受けさせた。これらの細胞はまた、ＧＦＰを発現し、これにより、リンパ腫由来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＧＦＰ＋）と正常な宿主Ｂ細胞由来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＧＦＰ−）とを区別することができる。
【０１２７】
フローサイトメトリーによるＧＦＰ及びＣＤ１９の二重検出によって、インキュベートした全ての眼において、Ｂ細胞 Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０を検出した。眼内リンパ腫細胞の割合は、初期注入量１０４細胞で右眼に初期注入された細胞数と、用量反応的に相関関係がある。結果は再現可能であり、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の注入を受けた全ての眼において、眼内リンパ腫が進行していた。
【０１２８】
＜ヒトＰＩＯＬに非常によく似たモデル＞
＜ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＩＯＬの治療に対する抗体ＬＦＢ＿Ｒ６０３の効果＞
ヒトＣＤ２０を発現するリンパ腫Ｂ細胞の注入により得られたＰＩＯＬモデルにおいて、８匹のマウスにＰＢＳ １×を注入し、１６匹のマウスをＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（２０μｇ／２μＬ）で処理し、８匹のマウスをリツキシマブ抗体（２０μｇ／２μＬ）で処理する。
【０１２９】
ＬＣ＿０８及びＬＣ＿０９と称する２つの独立した実験群において試験した各グループに対して、以下に詳細を示すプロトコルにしたがって、眼における腫瘍細胞の絶対数を測定し、マン−ホイットニーの統計学的検定により比較した。
【０１３０】
図４は、ＰＢＳの注入後、又はＬＦＢ＿６０３抗体若しくはリツキシマブ抗体による処置後の生存細胞の総数における腫瘍細胞の数を示している。
【０１３１】
腫瘍細胞複製の抑制率を表１に示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
ＰＢＳ １×を受けたマウスにおいては、抑制は観察されなかった。
【０１３４】
リツキシマブ抗体により処理したマウスにおいては、有意な抗腫瘍効果は観察されなかった。
【０１３５】
ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体により処理したマウスにおいては、有意な抗腫瘍効果が観察された。
【０１３６】
〔実施例４：第２の実験プロトコルに基づいた、ＰＩＯＬマウスモデルにおけるＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体及びリツキシマブの有効性の研究〕
（材料及び方法）
実施例３の詳細なプロトコル中で、マウスの眼におけるヒトＣＤ２０を発現するリンパ腫Ｂ細胞の注入によって、ＰＩＯＬ方法を得た。
【０１３７】
この第２の実験プロトコルにおいて、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０細胞の硝子体内注入の４日後に、マウスを以下の３つのグループに分けた：ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファの注入を受けた４６匹のマウスのグループ、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．０２μＬ／２μＬ）により処理した１６匹のマウスのグループ、及びＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．２μＬ／２μＬ）により処理した３２匹のマウスのグループ。
【０１３８】
ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、０．０２μＬ／２μＬのＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体、又は０．２μＬ／２μＬのＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体の注入の１２日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させた。
【０１３９】
（結果）
実施例３に詳細を示すように、Ａ２０．ＩＩＡ−ＧＦＰ−ｈＣＤ２０（ヒトＣＤ２０を発現する）細胞の硝子体内注入の結果として、マウスにおいてＢ細胞の眼内リンパ腫が成長した。
【０１４０】
ＬＣ＿１２、ＬＣ＿１４、ＬＣ＿１５、ＬＣ＿１６、ＬＣ＿１９、及びＬＣ＿２０と称する６つの独立した実験群において試験した各グループに対して、上記に詳細を示すプロトコルにしたがって、リンパ腫を受けた眼における腫瘍細胞の絶対数を測定し、マン−ホイットニーの統計学的検定により比較した。
【０１４１】
図５は、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体バッファ、及びＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体（０．０２μＬ／２μＬ）による処置後の生存細胞の総数における腫瘍細胞の数を示している。
【０１４２】
腫瘍細胞複製の抑制率を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
これらの実験の結果は、ＬＦＢ＿Ｒ６０３抗体を用いた処置により、例え注入濃度が低かったとしても（０．０２μｇ／２μＬ及び０．２μｇ／２μＬ）、処置の１２日後に有意な抗腫瘍効果が得られることを示した。
【０１４５】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体であって、
その軽鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号１に示すマウス核酸配列にコードされ、
その重鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号２に示すマウス核酸配列にコードされ、
上記軽鎖及び上記重鎖の定常領域は、非マウス種由来である、初期の眼内リンパ腫を治療するためのモノクローナル抗体。
【請求項２】
上記軽鎖のそれぞれ及び上記重鎖のそれぞれの上記定常領域は、ヒト定常領域である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
上記重鎖のそれぞれの上記定常領域は、配列番号３に示すヒト核酸配列にコードされ、かつ
上記軽鎖のそれぞれの上記定常領域は、配列番号４に示すヒト核酸配列にコードされている、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
上記軽鎖のそれぞれは、配列番号５に示すマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされ、
上記重鎖のそれぞれは、配列番号６に示すマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
上記軽鎖のそれぞれは、配列番号７に示すアミノ酸配列から構成されており、
上記重鎖のそれぞれは、配列番号８によって構成されている、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ラットハイブリドーマＹＢ２／０（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録されたＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）において生成された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
国立微生物培養保管所（ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＣＮＣＭ）に、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で登録されたクローンＲ６０３により生成された、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
初期の眼内リンパ腫を治療するための薬剤の製造に用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の使用方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体、又は当該抗体を含む薬剤を、治療の必要がある患者に投与することを含む、初期の眼内リンパ腫を治療する、治療方法。
【請求項１】
ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体であって、
その軽鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号１に示すマウス核酸配列にコードされ、
その重鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号２に示すマウス核酸配列にコードされ、
上記軽鎖及び上記重鎖の定常領域は、非マウス種由来である、初期の眼内リンパ腫を治療するためのモノクローナル抗体。
【請求項２】
上記軽鎖のそれぞれ及び上記重鎖のそれぞれの上記定常領域は、ヒト定常領域である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
上記重鎖のそれぞれの上記定常領域は、配列番号３に示すヒト核酸配列にコードされ、かつ
上記軽鎖のそれぞれの上記定常領域は、配列番号４に示すヒト核酸配列にコードされている、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
上記軽鎖のそれぞれは、配列番号５に示すマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされ、
上記重鎖のそれぞれは、配列番号６に示すマウス−ヒトキメラ核酸配列にコードされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
上記軽鎖のそれぞれは、配列番号７に示すアミノ酸配列から構成されており、
上記重鎖のそれぞれは、配列番号８によって構成されている、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ラットハイブリドーマＹＢ２／０（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に、番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２で登録されたＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）において生成された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
国立微生物培養保管所（ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＣＮＣＭ）に、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で登録されたクローンＲ６０３により生成された、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
初期の眼内リンパ腫を治療するための薬剤の製造に用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の使用方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体、又は当該抗体を含む薬剤を、治療の必要がある患者に投与することを含む、初期の眼内リンパ腫を治療する、治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１３７６１（Ｐ２０１２−５１３７６１Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４０６６（Ｐ２０１１−５４４０６６）
【出願日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１３４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６４００
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１０２５７５２５）エルエフベ−バイオテクノロジース (6)
【氏名又は名称原語表記】ＬＦＢ−ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１３４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６４００
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１０２５７５２５）エルエフベ−バイオテクノロジース (6)
【氏名又は名称原語表記】ＬＦＢ−ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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