本発明は、加齢黄斑変性症を治療または加齢黄斑変性症の進行を制限する方法と、かかる使用に適した化合物を識別する方法とを提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢黄斑変性症を治療する方法および組成物ならびに加齢黄斑変性症を治療する化合物を識別する方法に関する。
（関連出願）
本願は、その全体を本明細書に援用する２００８年４月１８日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１２４，６２４号の優先権を主張する。
（政府の権利の記述）
本発明は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成番号Ｒ０３ ＥＹ０１４４０３の下、政府支援で成されたものである。米国政府は本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（「ＡＭＤ」）は、網膜の損傷により黄斑（視野中心）の視力喪失を生じさせる加齢に関連する疾病である。ＡＭＤは高齢者に一般的な疾患であり、６６−７４歳の患者の約１０％、７５−８５歳の患者の３０％が何らかのレベルの黄斑変性を有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、大部分のＡＭＤ患者に有効な治療は存在せず、初期段階の介入法もない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１態様では、本発明は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストをＡＭＤ患者に投与することを含む、ＡＭＤを治療する方法を提供する。第２の態様では、本発明は、ＡＭＤの進行の制限に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストをＡＭＤが進行する危険性のある患者に投与することを含む、ＡＭＤの進行を制限する方法を提供する。本発明のこれらの態様のいずれかの１つの好ましい実施形態では、ＯＡ１受容体のアゴニストは、Ｌ−ＤＯＰＡおよびＬ−ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択される。
【０００５】
別の態様では、本発明は、ＡＭＤを治療する化合物を識別する方法であって、細胞を試験化合物と接触させることを含み、該細胞は、
（ａ）ＯＡ１を発現している第１の細胞集団；および任意選択で、
（ｂ）ＯＡ１を発現していない第２の細胞集団；を含み、
（ｃ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）うちの一方または両方を増大させる試験化合物を陽性試験化合物と識別し；
（ｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）発現および（Ｂ）第２の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現の一方又は両方に対する、第１の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現；
（ｉｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度および（Ｂ）第２の細胞集団；
陽性試験化合物は、ＡＭＤの治療およびＡＭＤの進行の制限の少なくとも一方を行うための候補化合物である方法を提供する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、以下の工程を含む、ＡＭＤを治療する化合物を識別する方法を提供する：
（ａ）チロシナーゼ欠損の妊娠している雌の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工
程であって、試験化合物は胚の光受容体および／または網膜神経節の発達中に投与される工程、
（ｂ）胚または出生後の非ヒト哺乳動物における光受容体および／または網膜神経節の発達に対する試験化合物の効果を、試験化合物を投与しなかった胚または出生後における光受容体および／または非ヒト哺乳動物網膜神経節の発達と比較する工程であって、光受容体および／または網膜神経節の発達を増大させる試験化合物が、ＡＭＤの進行を治療および／または制限する候補化合物である工程。
【０００７】
またさらなる態様では、本発明は以下を含む組成物を提供する：
（ａ）ＡＭＤの進行を治療または制限するのに有効な量のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体；
（ｂ）ＡＭＤの進行を治療または制限するのに有効な量のビタミンＣ源、ビタミンＥ源、ビタミンＡ源、亜鉛源および銅源を含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ｉｎ ｓｉｔｕでＲＰＥをビオチン化（Ａ）した後、ストレプトアビジン結合ビーズに（Ｂ）結合させるか、または（Ｃ）結合させないタンパク質のウェスタンブロット解析。（Ｂ）培養ＲＰＥ、（Ｃ）ＯＡ１−ＧＦＰを発現するようトランスフェクトしたＣＯＳ細胞。ブロットはストレプトアビジン結合ビーズを使用して細胞表面をビオチン化および細分化した後にＯＡ１およびアクチンを可視化するようブローブ標識した。培養細胞（Ｂ、Ｃ）について、細胞は分析に先立ち５００μＭ（通常ＤＭＥＭ）または１μＭのチロシンで３日間維持した。
【図１Ｂ】ストレプトアビジン結合ビーズに結合させたタンパク質のウェスタンブロット解析。
【図１Ｃ】ストレプトアビジン結合ビーズに結合させないタンパク質のウェスタンブロット解析。
【図１Ｄ】デンシトメトリーによるウェスタンブロット解析の定量化。ＯＡ１デンシトメトリーはペアになった細胞培養物対照の％として示される。ペアになった細胞培養物は、トランスフェクト後２つの等しい群へ分割したものであり、一方は通常ＤＭＥＭ（対照）に維持した対照であり、他方の群は収集するまで１μＭチロシンＤＭＥＭ（ＬＴ）で維持した。Ｐａｉｒｅｄ−ｔ検定分析を使用して、差が有意であるか否か試験した。＊はｐ＜０．００１を示す。同じ方法を分析したアクチンは差を示さず、ｐ＝０．７２４であった。
【図１Ｅ】通常ＤＭＥＭに維持し、その後抗ＯＡ１抗体で染色し、２０倍で画像化した色素ＲＰＥ細胞の複合焦点顕微鏡検査法。バー＝２５μｍ。
【図１Ｆ】１μＭチロシンに維持し、その後抗ＯＡ１抗体で染色し、２０倍で画像化した色素ＲＰＥ細胞の複合焦点顕微鏡検査法。バー＝２５μｍ。
【図２Ａ】トランスフェクトしたまたはトランスフェクトしていないＣＨＯ細胞における標準実験プロトコルの時間経過中の［Ｃａ²⁺］ｉのトレース例。３分間の安定な基準線の確立後、試験薬を１μＭで加えた。５分目に、対照として機能するようＫＣｌを加え、細胞にＦｕｒａ−２を装填し、利用できるようにした。トランスフェクト細胞とペアにした非トランスフェクト細胞の両方に同一のプロトコルを行なった。
【図２Ｂ】トランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞におけるチロシン、ドーパミンおよびＬ−ＤＯＰＡに応じた［Ｃａ²⁺］ｉの概要データ。非トランスフェクト細胞を、Ｌ−ＤＯＰＡ処理で示す。ＫＣｌによる膜脱分極の実験対照も示される。バーはそれぞれ少なくとも１０回の実験から集めたデータを表わし、検査薬添加後の基準線［Ｃａ²⁺］ｉからの平均変化として示される。エラーバーは標準偏差を表し、有意差試験にｔ検定分析を使用した。＊はｐ＜０．０１を示す。天然タンパク質を発現するＯＡ１またはＲＰＥを発現するようトランスフェクト細胞の［Ｃａ²⁺］ｉ増加の百日咳毒素感受性分析。データは少なくとも６回の実験の平均を表わす。
【図２Ｃ】天然タンパク質を発現するＯＡ１またはＲＰＥを発現するようトランスフェクト細胞の［Ｃａ²⁺］ｉ増加の百日咳毒素感度分析。データはトランスフェクト細胞の各群に対する少なくとも６回の実験および内因性ＯＡ１発現した処理済みおよび未処理ＲＰＥの２０回の個々の実験の平均を示す。ｔ検定分析を使用して有意差を試験した。＊はｐ＜０．０１を示す。
【図２Ｄ】ＯＡ１を発現するようトランスフェクトされたＣＨＯにおけるｃＡＭＰを測定した。対照群はトランスフェクトされたが未処理のＣＨＯ細胞であり、かかる細胞におけるｃＡＭＰの基準レベルを表わす。細胞を１．０μＭ Ｌ−ＤＯＰＡ、０．１μＭホルスコリン、Ｌ−ＤＯＰＡ＋０．１μＭホルスコリン、および陽性対照として１μＭホルスコリンでを処理した。結果は、同じ培養プレートでレプリカ単層を使用して、すべての実験群をすべてペアにして分析した少なくとも６回の実験で観察された平均ｃＡＭＰレベルに相当する。エラーバーは各群の標準偏差を示し、観察された唯一の有意差は、ホルスコリン処理後のｃＡＭＰレベルの増加であった。
【図３Ａ】ＯＡ１とＬ−ＤＯＰＡの間の結合反応速度を放射性標識リガンド結合アッセイを使用して決定した。結果は、５回のかかる実験から集めたデータを表わし、平均特異的結合＋／−ＳＥＭとして示す。双曲線適合は０．９９４のＲ²値を示し、Ｋｄは９．３４×１０^-6Ｍ＋／１．１４ｘ１０^-6Ｍと決定された。
【図３Ｂ】ＯＡ１トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する５μＭ［Ｈ³］Ｌ−ＤＯＰＡの相対的結合を、１．０ｍＭドーパミン、チロシンまたはＬ−ＤＯＰＡの存在下で比較した。データは各群の平均合計結合＋／−標準偏差を示す。＊は、対照群間の結果を、潜在的な競争リガンドの存在下での結合と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。
【図３Ｃ】ドーパミンがＯＡ１活性アンタゴニストとして機能するか否かを決定するために、５μＭ［Ｈ³］Ｌ−ＤＯＰＡおよびドーパミン間の競争相互作用を評価した。結果は、ドーパミンおよびＬ−ＤＯＰＡが同じＯＡ１結合部位に競争することを示し、データはｒ²値が０．９５の結合モデルに適合する。ドーパミンのＫｉは２．３８８＋／−０．２６６μＭ（平均＋／−ＳＥＭ）であり、Ｌ−ＤＯＰＡのＫｄと同様であった。
【図３Ｄ】ＯＡ１による用量依存的ＯＡ１シグナリング。データは所与の濃度（各用量ｎ＝６）での細胞のＬ−ＤＯＰＡ処理により誘発された［Ｃａ²⁺］ｉの平均増加量を示す。ｔ検定を使用して、各用量で達成された応答を比較した。＊は１および１０μＭでの比較が＜０．０１であることを示す。
【図３Ｅ】図３（ａ）に基づく単一部位の結合関係の動力学を示すScatchardプロット。
【図４】（Ａ）−（Ｈ）。画像はすべて、ＯＡ１−ＧＦＰを発現するようトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の２μｍ厚の共焦切断片を示す。β−アレスチンは免疫蛍光法を使用して可視化した。Ｌ−ＤＯＰＡ（Ａ−Ｃ）の追加前、１μＭ Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｄ−Ｆ）の処理後、および合一画像（Ｃ，Ｆ）は、白色光イメージングの解像度で２つのタンパク質が同時局在化する領域を示す。（Ｇ、Ｈ）はトランスフェクトＣＨＯ細胞の視野の低倍率であり、２個のトランスフェクト細胞が見える（矢印）（Ｇ）。残りの細胞集団は膜へのβ−アレスチンの集合がＯＡ１発現細胞でのみ生じている（矢印）を示すためにβ−アレスチン抗体を使用して可視化している（Ｈ）。
【図５Ａ】ＰＥＤＦ濃度を細胞馴化培地のＥＬＩＳＡにより決定した。ＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞は、Ｌ−ＤＯＰＡ処理をしない対照細胞か、または通常ＤＭＥＭで３日間維持する前に１μＭ Ｌ−ＤＯＰＡで処理したＯＡ１刺激細胞である。データは３連で行った３回の実験の平均として示され、エラーバーは標準偏差を示し、＊はｐａｉｒｅｄ ｔ検定を使用してＰ＜０．０１を示す。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定された色素ＲＰＥからの馴化培地中のＰＥＤＦ濃度。細胞は、対照色素ＲＰＥ培養物または２００μＭのフェニルチオ尿素（ＰＴＵ）で処理したペアになった培養物とした。データは３連で行った３回の実験の平均として示され、エラーバーは標準偏差を示し、＊はｐａｉｒｅｄ ｔ検定を使用してＰ＜０．０１を示す。
【図５Ｃ】ＯＡ１シグナリングを刺激するための、ＰＴＵで処理し、次にＬ−ＤＯＰＡで処理した色素ＲＰＥ細胞の馴化培地におけるＰＥＤＦ濃度。ＰＴＵ処理前、次にＰＴＵ処理後、Ｌ−ＤＯＰＡ刺激後の同じ培養物から、ＥＬＩＳＡ分析を行った。結果を細胞培養物に関連して達成された値の平均＋／−標準偏差として示す。＊は、ＰＴＵを対照（ＰＴＵを対照前に試験した同じ培養物）と比較した場合ならびに同じ培養物からのＰＴＵサンプルとＬ−ＤＯＰＡ／ＰＴＵを比較した場合に、ｐ＜０．０１であることを示す。
【図６Ａ】データは、全量、特異的、および非特異的のすべての分画における平均＋／−標準誤差の結合［³Ｈ］−Ｌ−ＤＯＰＡを示す。非特異的結合は、超過の未標識Ｌ−ＤＯＰＡ（１ｍＭ）の存在下で結合した放射性標識Ｌ−ＤＯＰＡの測定により決定された。各所与濃度の特異的結合は、測定した結合合計から測定した非特異的結合を減算することにより決定される。
【図６Ｂ】チロシンおよび５μＭ［Ｈ³］Ｌ−ＤＯＰＡの濃度の増大を使用して測定した、チロシンとＬ−ＤＯＰＡの間の競争的相互作用を示す。各データポイントは、５つの複製ウェルからの平均データを示し、エラーバーは標準偏差である。データは、チロシンがＬ−ＤＯＰＡとの結合に競争するが、親和性は低いことを示している。結果は、チロシンが５２．９μＭのＫｉを有し、ｒ²値が０．８５の単一部位結合モデルに適合する。チロシンの溶解度が制限されているため、飽和に達しない可能性がある。
【図７】野性型対ＯＡ欠損マウスにおけるウェスタンブロットおよびＰＥＤＦ分泌のグラフ図。
【図８Ａ】正常野性型マウスで予想されるのと比較して、Ｌ−ＤＯＰＡの補給が網膜神経節細胞数を増加させることを示すデータのグラフ図。
【図８Ｂ】正常野性型マウスで予想されるのと比較して、Ｌ−ＤＯＰＡの補給が光受容体数を増加することを示すデータのグラフ図。
【図８Ｃ】２匹の野性型および２匹のＯＡ１−／ｙマウスにおけるＰＥＤＦ検出を示すウェスタンブロット。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で引用した文献はすべてその全体が本明細書に組み込まれる。
本願では、他に別記されていなければ、使用される技術は以下のいくつかの周知の参照文献に見い出されてもよい：Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), 敵uide to Protein Purification・in Methods in Enzymology
(M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); stocktickerPCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2^nd
Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), and the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX).
本明細書に使用する場合、単数形（英語で「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は文脈が別段指示していない限り、複数の参照物を含む。
【００１０】
第１態様では、本発明は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療する方法であって、ＡＭＤの治療に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストをＡＭＤ患者に投与することからなる方法を提供する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、ＡＭＤの進行を制限する方法であって、ＡＭＤの進行の制限に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストを、ＡＭＤが進行する危険性のある患者に投与することからなる方法を提供する。
【００１２】
ヒトＯａ１遺伝子はＸ染色体上に見出され、配列分析［１４］に基づけばＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）［１２，１３］であると考えられる４０４個のアミノ酸からなるタンパク質ＯＡ１（配列番号２）をコードすることが示されている。本明細書に詳細に開示するように、本願発明者は、神経感覚網膜生存の重要な決定因子としてＯＡ１シグナル伝達経路を同定した。ＯＡ１シグナル伝達経路の刺激は、ＡＭＤの治療を提供するとともに、潜在的リスクのあるＡＭＤ進行を制限する手段も提供する。いかなる機構によっても拘束されないが、本願発明者は少なくとも１つの効き目のある神経栄養因子であるＰＥＤＦの分泌を規制するＬ−ＤＯＰＡによる自己分泌ループにＯＡ１およびチロシナーゼが関与していると考える。したがって、Ｌ−ＤＯＰＡの投与を使用して、ＯＡ１活性を刺激し、したがってＰＥＤＦ発現をアップレギュレートし、これをＡＭＤの治療およびＡＭＤ進行の制限のための有用な治療手段とすることが可能である。
【００１３】
以下に詳細に論ずるように、そのようなＯＡ１アゴニストは、例えば本発明の第３および第４の態様の新薬発見方法を使用して識別することが可能である。ＯＡ１アゴニストの例は以下に詳細に論ずる。
【００１４】
好適には、患者はヒトである。
本明細書に使用する場合、本発明のすべての態様および実施形態について、「ＡＭＤ」は、加齢黄斑変性症として知られる、網膜に対する損傷のために黄斑（視野中心）の視力が喪失する加齢に関連する疾患を意味する。本明細書に使用する場合、ＡＭＤは、以下により詳細に説明する滲出型ＡＭＤと萎縮型ＡＭＤの両方を包含する。
【００１５】
ＡＭＤは、網膜色素上皮とその下の脈絡膜との間の黄斑における特徴的なドルーセン（黄色沈着物）から始まる。これらの初期の変化（加齢性黄斑変性症と呼ばれる）を有する人の大半は、良好な視力を維持している。ドルーセンのある人は、引き続き進行したＡＭＤに進展する可能性がある。この危険性は、ドルーセンが大きく、多く、かつ黄斑の下の色素細胞層における妨害に関連している場合には、かなり高くなる。
【００１６】
加齢性黄斑変性症の患者は進行したＡＭＤの２つの主な形式のうちのいずれかに進み得るが、そのいずれも本発明の方法を使用して、治療可能であるか、またはその進行を制限することが可能である。「滲出型」ＡＭＤは、Bruch膜中の脈絡膜毛細血管の以上な血管
増殖による視力喪失を引き起こし、究極的には黄斑の下の血液およびタンパク質の漏出につながる。このような血管からの出血、漏出、および瘢痕は、もし治療していないで放置されると、光受容体への不可逆的な損傷および急速な視力喪失をもたらす。「萎縮型」ＡＭＤは黄斑中の感光性細胞がゆっくり分解したときに起こり、次第に罹患した目の視力喪失を徐々に引き起こす。ＡＭＤにおける目のかすみは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の下のドルーセンの蓄積によるものであり、これは光受容体を焦点平面から異動させることにより光受容体の焦点特性を変化させる。
【００１７】
萎縮型ＡＭＤは一方又は両方の目に生じ、加齢性黄斑変性症から、萎縮型ＡＭＤの中間期または進行期へと進行する可能性がある。
中間期の萎縮型ＡＭＤ：中間サイズの多くのドルーセンがあるか、または１つまたは複数の大きなドルーセンがある。人によっては自身の視野中心にぼやけた点が見える。読書や他の作業のためにはより多くの光が必要され得る。
【００１８】
進行期の萎縮型ＡＭＤ：ドルーセンに加え、網膜中心領域の感光性細胞および支持組織の分解。この分解により視野中心にぼやけた点が生じ得る。時間が経つにつれ、ぼやけた点はより大きく暗くなり、中心視力のより多くを占めるようになり、読書することや、顔が非常に近づくまで顔を認識するのが困難となり得る。
【００１９】
ＡＭＤ症状には、中心視野のぼやけ／減少、中心暗点（影または視力の喪失領域）、ある暗色を別の暗色と区別し、かつ／または、ある光の色を別の光の色と区別する困難さ、明るい光に曝された後の視覚機能の回復の遅さ、コントラスト感度の喪失（その結果、環郭、影および色覚がより鮮明でなくなる）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）妨害（色素の凝集および／または脱落を含む）、ＲＰＥ剥離、地図状萎縮、網膜下血管新生、円盤形瘢痕、および乱視（変形視）（複数の直線からなるグリッドが波状に見え、グリッドの部分がブランクに見える）が含まれるがこれらに限定されない。萎縮型ＡＭＤおよび滲出型ＡＭＤの症状は、一般に、疾患の進行の間同様に早いため、どの初期の患者でＡＭＤの萎縮型対滲出型が進行しているかを決定するのは可能でない場合がある。萎縮型ＡＭＤは「地図状萎縮」として発達し、新しい血管が発生した場合、初期ＡＭＤは「滲出型」ＡＭＤとなる。
【００２０】
本明細書に使用する場合、ＡＭＤを「治療する」とは、以下の１つまたは複数を遂行することを意味する：（ａ）ＡＭＤの重篤度の低下；（ｂ）上述したＡＭＤに特徴的な１つまたは複数の症状の進行の制限または予防；（ｃ）上述したＡＭＤに特徴的な１つまたは複数の症状の悪化の抑制；（ｄ）以前に障害のあった患者のＡＭＤ再発の制限または予防；および（ｅ）以前にＡＭＤの症状があった患者の１つまたは複数の症状の再発の制限または予防。そのような治療は、滲出型ＡＭＤと萎縮型ＡＭＤの治療を含む。
【００２１】
本明細書に使用する場合、ＡＭＤの「進行の制限」という用語は、ＡＭＤが進行する危険性のある個体におけるＡＭＤの進行を予防するかまたは最小限にすること、ならびに加齢性黄斑変性症のＡＭＤ（滲出型または萎縮型）への進行または中間期の萎縮型ＡＭＤから進行期の萎縮型または「滲出型」ＡＭＤへの進行を制限すること、を意味する。１つの好ましい実施形態では、方法は、ＡＭＤの進行を制限するために、ドルーセン蓄積（加齢性黄斑変性症）のある患者を治療することを含む。別の好ましい実施形態では、方法は、治療していないＡＭＤ患者またはＡＭＤの危険性のある患者と比較した視力喪失のラインの割合を減少させるのに有効な量のＯＡ１アゴニストで患者を治療することを含む。別の好ましい実施形態では、方法は、滲出型ＡＭＤ患者または滲出型ＡＭＤが進行する危険性のある患者を、新たな血管形成の速度および数を減少させるのに有効な量のＯＡ１アゴニストで治療することを含む。より以下に詳細に論ずるように、ＯＡ１刺激はＲＰＥにＰＥＤＦ分泌を増大させ、ＰＥＤＦは効き目のある抗血管新生因子である。したがって、ＯＡ１刺激戦略は、本明細書で論じた網膜の進行に対するその効果に加えて、「滲出型」ＡＭＤでの新たな血管の発達を止めることが可能である。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、方法は、中心視力がぼけているか減少している患者を、一方又は両方の目の視力のラインを増加させるのに有効な量のＯＡ１アゴニストで治療することを含む。この実施形態では、視力のラインは標準Ｓｎｅｌｌｅｎ試験により測定されるのと同じものであり、視力「ライン」の増大または減少はＳｎｅｌｌｅｎ視力表上のどの最も細いラインを患者がはっきりと読むことができるかに基づく。
【００２３】
「ＡＭＤが進行する危険性のある患者」とは、５０歳以上（種々の好ましい実施形態では６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、または７５歳以上）で、ドルーセン沈着物の存在、白色人種、ＡＭＤを現在有しているか過去に有していた血族の存在、（Ｔｙｒ４０２Ｈｉｓ）の補体因子Ｈ遺伝子（ＣＦＨ）の突然変異、補体タンパク質Ｃ３遺伝子のＡｒｇ８０Ｇｌｙ変異型、高血圧、高いコレステロール値、肥満、喫煙、高脂肪摂取、およびフィブリン５遺伝子中の突然変異を含むがそれに限定されないＡＭＤを進行させる任意の危険因子を有する任意の者を意味する。したがって、好ましい実施形態では、治療される患者は、特にＡＭＤの進行を制限する方法において、これらの危険因子の１つまたは複数を有している。
【００２４】
「治療上有効量」という語句は、本明細書に使用する場合、ＡＭＤの進行を制限するか
またはＡＭＤを治療する（進行を防ぐか、または逆行させる）のに十分または有効な量を指す。適切な用量の範囲は、化合物の選択、投与経路、製剤の性質、患者の症状の状態、および関与する医師の判断によって決まる。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高用量が必要であると予想される。当該技術分野でよく理解されるように、かかる投薬レベルの違いは、最適化のための標準の経験的ルーチンを使用して調節することが可能である。
【００２５】
好ましい実施形態では、ＯＡ１受容体ゴニストは、Ｌ−ＤＯＰＡおよびＬ−ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択された化合物を含む。
Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン病の治療の際に使用されることが知られている［２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸］であり、以下の構造を有している。
【００２６】
【化１】

Ｌ−ＤＯＰＡは市販されており、またその合成方法は当業者に周知である。
【００２７】
本明細書に使用する場合、「Ｌ−ＤＯＰＡ類似体」は、その多くが当該技術分野で周知であるＬ−ＤＯＰＡプロドラッグを含む、ＯＡ１刺激活性を保持しているＬ−ＤＯＰＡの変異型であり、かかる類似体の例については以下に開示する。特定の作用機序によって拘束されるわけではないが、本願発明者は、ＯＡ１へのＬ−ＤＯＰＡの結合には２つの結合部位が関与し、１つは一方又は両方の水酸基が関与し、１つはカルボン酸基が関与すると考えている。１実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡ類似体は、投与後（かつ一般に細胞表面上のＯＡ１への結合前）にＬ−ＤＯＰＡに代謝され、そのためＯＡ１刺激活性を保持すると予想されるＬ−ＤＯＰＡプロドラッグである。別の実施形態では、一方又は両方の水酸基および／またはカルボキシル基は、本発明の方法に使用される種々の類似体（プロドラッグまたは別のもの）を生産するために置換可能である。
【００２８】
別の実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡ類似体はＬ−ＤＯＰＡエステルを含む。Ｌ−ＤＯＰＡエステルの例およびそれらを製造する方法は、ＷＯ／１９９７／０１６１８１；米国特許第４６６３３４９号；米国特許第４８７３２６３号；米国特許第４８７３２６３号；米国特許第５３４５８８５号、および米国特許第４７７１０７３号に開示されている。種々の好ましい実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡエステルは、Ｌ−ＤＯＰＡメチルエステル、Ｌ−ＤＯＰＡブチルエステル、Ｌ−ＤＯＰＡペンチルエステル、Ｌ−ＤＯＰＡシクロヘキシルエステル、Ｌ−ＤＯＰＡベンジルエステル、およびＬ−ＤＯＰＡエチルエステルからなるグループから選択される。種々のさらなる好ましい実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡエステルは、Ｌ−ＤＯＰＡのアルキル、アリール、および置換および非置換のアラルキルエステルからなるグループから選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡエステルは以下の式により表わされる：
【００２９】
【化２】

式中、Ｒは、
直鎖または分岐鎖のアルキル基（Ｃ₁−Ｃ₂₀）、例えばメチル、エチル、プロピル、ブ
チル、ミリスチル、パルミチル、ペンチル、テトラデシル、ヘキサデシル等；
アリール基（Ｃ₆−Ｃ₉）、例えばフェニル、トリル等；
アルコキシ（Ｃ₁₋₅）［メトキシ、エトキシ、ブトキシ等］等の置換基を任意選択で有する置換または非置換のモノ、ジ、またはポリヒドロキシアルキル基（Ｃ₁−Ｃ₂₀）、例
えばベンジル、アルコキシベンジル、４−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、６−ヒドロキシヘキシルおよび５−ヒドロキシペンチル等；
カルボアルコキシ（Ｃ₁₋₅）［メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル等］；
アミノ；
モノまたはジアルキルアミノ（Ｃ₁₋₁₀）［メチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエ
チルアミノ等］；
アシルアミノ（Ｃ₁₋₅）［アセタミド、ブチルアミド］；
ケトアルキル（Ｃ₁₋₅）［メチルケト、エチルケト、ブチルケト等］；
ハロ［クロロ、ブロモ等］またはカルボキサミド；
置換および非置換のアラルキル（Ｃ₇₋₂₀）、例えばベンジル、アルコキシベンジルＣ₈₋₁₄［メトキシ、エトキシ、イソブトキシ等］；
フェニルエチル；
フェニルプロピル；
フェニルブチル；
フェニルヘキシル；
フェニルオクチル等；および
医薬として許容される有機または無機のカウンターイオン塩類。
【００３０】
Ｌ−ＤＯＰＡのエステルおよびその塩を製造するための合成法は当該技術分野で周知であり、例えばその各々を本明細書に援用する米国特許第３，８９１，６９６号、米国特許第４，０３５，５０７号；および米国特許第５，３５４，８８５号；ならびにJournal of
Pharmaceutical Sciences, 62, p.510(1973)に記載されている。
【００３１】
別の実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡ類似体は、当該技術分野で周知の胆汁酸抱合体を含む。Ｌ−ＤＯＰＡ胆汁酸抱合体の例およびそれらを製造する方法はＷＯ／２００２／０２８８８２および米国特許出願公開第２００２０１５１５２６号に開示されている。経口投与に際して、これらのプロドラッグは腸肝系内で開裂し、ペアレント薬および／または胆汁酸からの活性代謝物を体循環へ放出する。重要なことに、プロドラッグの一部のみ（通常＜５０％）しか腸肝サイクルの各通過間に開裂されない。したがって、腸肝循環は、持続的な全身の薬物濃度の達成を可能にする薬物の貯蔵庫として作用する。コール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソコラン酸およびリトコール酸のような天然の胆汁酸が特に好ましい。Ｌ−ＤＯＰＡまたは他のＬ−ＤＯＰＡ類似体へのこれらの胆汁酸の接合部位は、好ましくは３−ヒドロキシ基またはＣ−２４カルボキシル部分を介してである。任意選択で、薬物と胆汁酸の間に開裂リンカー官能基を導入し、かかるリンカーが選択されてもよい。好ましい実施形態では、そのようなＬ−ＤＯＰＡ胆汁酸抱合体は以下の式またはその医薬として許容される塩により表わされる：
【００３２】
【化３】

式中、Ｒ１は水素およびＯＨからなるグループから選択され；
Ｒ２は水素およびＯＨからなるグループから選択され；
ＸはＯＨおよびＤ−Ｙ−からなるグループから選択され、ＹはＤをステロイドに共有結合させる共有結合および開裂リンカー基からなるグループから選択され；
ＤはＬ−ＤＯＰＡおよび他のＬ−ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択されたメンバーであり；
Ｗは以下の（ａ）および（ｂ）からなるグループから選択され、
（ａ）生理的ｐＨで負に帯電する部分（かかる部分は−ＣＯＯＨ、−ＳＯ₃Ｈ、−−Ｓ
Ｏ₂Ｈ、−−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＨ）、−−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＨ）、−−Ｏ
ＳＯ₃Ｈ等からなるグループから選択される）を含む置換アルキル基およびその医薬とし
て許容される塩類、Ｒ６はアルキル、置換アルキル、アリール、および置換アリールからなるグループから選択される；および
（ｂ）式−Ｍ−Ｙ’−Ｄ’の基、式中Ｍは−ＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）−−および−ＣＨ₂ＣＨ₂
Ｃ（Ｏ）−−からなるグループから選択され；Ｙ’はＤ’をＭに共有結合させる共有結合または開裂リンカー基であり、；Ｄ’はＬ−ＤＯＰＡおよび他のＬ−ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択されたメンバーである；
Ｘが−Ｙ−Ｄであるか、Ｗが−Ｍ−Ｙ’−Ｄ’であるかの少なくとも一方を満たし、
式（Ｉ）の化合物は腸胆汁酸輸送体の基質である。
【００３３】
別の実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡ類似体はジまたはトリペプチド誘導体を含む。Ｌ−ＤＯＰＡジペプチドまたはトリペプチド類似体の例およびそれらを製造する方法は、米国特許第３８０３１２０号および米国特許第５６８６４２３号に開示されている。ジペプチドおよびトリペプチドＬ−ＤＯＰＡプロドラッグの経口吸収は高い経口生物学的利用能を示し、いくつかの化合物はＬ−ＤＯＰＡの６０−１００倍の血漿濃度を有する。好ましい実施形態では、かかるＬ−ＤＯＰＡプロドラッグは以下の式により表わされる：
【００３４】
【化４】

式中、ｎは０または１であり；
Ｒは水素またはヒドロキシル、好ましくはＲはヒドロキシルであり；
Ｒ１は水素であり；
Ｒ２は水素、１−４個の炭素原子を有するアルキル、１つの−−ＯＨ、−−ＳＨ、−−ＳＣＨ₃、−−ＮＨ₂、−−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ₂、−−ＣＯＯＨ、フェニル、ヒドロキシ
フェニル、インドリルまたはイミダゾリル基で置換された１−４個の炭素原子を有するアルキル、１−６個の炭素原子を有する１つのカルボアルコキシル基で置換された１−４個の炭素原子を有するアルキル、好ましくはＲ２は水素、メチルまたはヒドロキシメチルであり；または
Ｒ１およびＲ２はともにトリメチレンである。
【００３５】
好ましくは、式（Ｉ）のＬ−ＤＯＰＡ（２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル−）プロパン酸）のジまたはトリペプチド誘導体は共にトリメチレンである。
別の実施形態では、式（Ｉ）のＬ−ＤＯＰＡ［２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル−）プロパン酸］のジペプチド誘導体は、以下の式により表される：
【００３６】
【化５】

式中、Ｒ３は水素であり；Ｒ４はフェニルまたはヒドロキシフェニルであり；またはＲ３およびＲ４はともにトリメチレンである。
【００３７】
別の実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡ類似体は当該技術分野で周知のアミンプロドラッグを含む。Ｌ−ＤＯＰＡアミン類似体の例およびそれらを製造する方法は米国特許出願公開第２００６００２５３８５号およびＷＯ／２００４／０６９１４６に開示されている。１つの好ましい実施形態では、かかるＬ−ＤＯＰＡアミン類似体は以下の式またはその医薬として許容される塩により表わされる：
【００３８】
【化６】

式中、＊Ｃは不斉炭素を示し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、水素、１−３０個の炭素原子を有するアルキル、１−３０個の炭素原子を有するアルケニル、１−３０個の炭素原子を有するアルキニル、シクロアルキル、アリール、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−カルボキシ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミルおよび脂肪酸アシルから成るグループから選択されるか、または
他の選択肢としてＲ１およびＲ２と、Ｒ３およびＲ４との少なくとも一方が五員環または六員環を形成し；
Ｒ５およびＲ６は各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびホスホニルから成るグループから選択される。
【００３９】
好ましいＬ−ＤＯＰＡアミン類似体には以下のものが含まれる：Ｒ５およびＲ６が各々水素である化合物；Ｒ１およびＲ２が各々水素である化合物；Ｒ３およびＲ４が各々水素である化合物；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つ、好ましくはＲ３および／
またはＲ４がカルボニル（例えばアセチル）である化合物。現在の実施形態によるさらなる好ましい化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが１−３０個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、またはアルキニルである化合物、または他の選択肢として、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが脂肪酸アシル、例えばミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸またはリノレン酸に由来する脂肪酸アシルである。現在の実施形態によるＬ−ＤＯＰＡアミン類似体のさらに好ましい例はα−アミノ−３，４−ジヒドロキシ−ベンゼンプロパンアミド、α−Ｎ−アセチル−３，４−ジヒドロキシ−ベンゼンプロパンアミドおよびその医薬として許容される塩類を含む。
【００４０】
さらに好ましい実施形態では、本発明で使用されるＬ−ＤＯＰＡプロドラッグおよびそれらの合成方法は、米国特許第４０６５５６６号および第４０３５５０７号に開示され、以下の式により表わされる：
【００４１】
【化７】

各Ｒは独立して、水素原子、アシル基、
【００４２】
【化８】

基、−−ＣＯピリジン基、−−ＣＯ−−Ｒ３基（Ｒ３はＮ，Ｎ−Ｃ１−Ｃ２ジアルキルアミノ酸またはＣ４−Ｃ６シクロアルキルアミノ酸の残基を表わす）から選択され、
【００４３】
【化９】

Ｒ１は水酸基および−−ＯＭ基から成るグループから選択されたメンバーであり、−−Ｍはアルカリ金属（Ｎａ、Ｋ等）またはアンモニウムイオンであり
；
Ｒ２は
【００４４】
【化１０】

基、−−ＣＯ−ピリジン基、および−−ＣＯ−−Ｒ３基から選択されたメンバーであり、Ｒ３はＮ，Ｎ−−（Ｃ１−Ｃ２）ジアルキルアミノ酸またはＣ４ −Ｃ６−シクロアルキルアミノ酸
【００４５】
【化１１】

の残基を示す。
【００４６】
本発明で使用されるさらなるＬ−ＤＯＰＡプロドラッグおよびそれらの合成方法は米国特許第４０６５５６６号および第４０３５５０７号に開示され、以下の式およびそのＨＸ塩（Ｘは以前の医薬として許容される酸付加塩陰イオン、例えば塩化物、臭化物、過塩素酸塩、メタンスルフォナート、コハク酸塩等である）により表わされる：
【００４７】
【化１２】

式中、Ｒはアシル基を表わし；
Ｒ２は水素原子を表わし；
Ｒ１は−ＮＨＣＨ（Ｒ４）ＣＯＯＲ５基を表し、Ｒ４は任意の天然アミノ酸の残基を表わし、Ｒ５は水素原子、Ｃ１−Ｃ５アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル）およびＣ１−Ｃ５アルキルアリール基（例えば−−ＣＨ₂、−Ｃ₆Ｈ₅、−−
ＣＨ₂−−ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₅等）から成るグループから選択されたメンバーである。
【００４８】
米国特許第４０６５５６６号および第４０３５５０７号に開示された好ましいＬ−ＤＯＰＡプロドラッグの例には、以下が含まれる：
１．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−グリシンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４．Ｎ−ニコチノイル−３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
５．Ｎ−ニコチノイル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）
６．Ｎ−ニコチノイル−３，４−ジピバリルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
７．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−グリシンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
８．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
９．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン−エチルエステル およびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１０．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１１．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１２．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１３．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１４．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１５．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−イソロイシンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１６．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−イソロイシン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１７．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−イソロイシン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１８．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−イソロイシン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
１９．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２０．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２１．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−フェニルアラニン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２２．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２３．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２４．グリシル−３，４−ジピバリルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２５．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２６．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２７．グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２８．Ｌ−ロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
２９．Ｌ−ロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３０．Ｌ−ロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３１．Ｌ−ロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３２．Ｌ−イソロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３３．Ｌ−イソロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３４．Ｌ−イソロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３５．Ｌ−イソロイシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３６．フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３７．フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３８．フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−エチル およびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
３９．フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４０．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４１．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４２．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−エチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４３．３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−ベンジルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４４．Ｎ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基］−グリシル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
４５．Ｎ−ニコチノイル−３，４−ジニコチノイルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
４６．Ｎ−３−ピリジルアセチル−３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
４７．Ｎ−３−ピリジルアセチル−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン およびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
４８．３，４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノグリシル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルおよびそのＨＸ塩（Ｘは医薬として許容される陰イオンを表わす）。
４９．Ｎ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基］グリシル−３，４−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノグリシル］−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
５０．Ｎ−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノグリシル］−３，４−ジアセチルオキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびそのＭ塩（Ｍはアルカリ金属を表わす）。
【００４９】
本明細書に使用する場合、用語「アルキル」は、直鎖および分岐鎖の基を有する脂肪族飽和炭化水素を指す。アルキル基は好ましくは１−３０個の炭素原子、より好ましくは１−２０個の炭素原子を有する。より低級のアルキル、例えば、１−６個の炭素原子のアル
キルは化合物の処方を容易にし、より高級のアルキルはＢＢＢ（脳血管関門）を通るその透過性の増強を提供する。
【００５０】
アルキル基は、本発明によれば、置換されてもよいし、非置換でもよい。置換される場合、置換基は例えばシクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリサイクリック、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、ハロ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、チオカルボキシ、カルバミルおよびアミノであってよく、これらの用語については本明細書に定義した通りである。
【００５１】
本明細書に使用する場合、用語「シクロアルキル」は、環の１つまたは複数が完全に共役したπ電子系を有していないすべてが炭素からなる単環または縮合環（つまり隣接した炭素原子対を共有する環）からなる基を指す。非制限的なシクロアルキル基の例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンである。シクロアルキル基は、本発明によれば、置換されてもよいし、非置換でもよい。置換される場合、置換基は例えばアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリサイクリック、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、ハロ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、チオカルボキシ、カルバミルおよびアミノであってよく、これらの用語については本明細書に定義した通りである。
【００５２】
用語「アルケニル」は、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素二重結合とから成るアルキル基を指す。
用語「アルキニル」は、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素三重結合とから成るアルキル基を指す。
【００５３】
上述したように、アルケニル基およびアルキニル基はいずれも好ましくは１−３０個の炭素原子を有する。
「アリール」基は、完全に共役したπ電子系を有するすべてが炭素からなる単環式または縮合環の多環式（つまり隣接した炭素原子対を共有する環）からなる基を指す。非制限的なアリールの例は、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルである。アリール基は、本発明によれば、置換されてもよいし、非置換でもよい。置換される場合、置換基は例えばアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリサイクリック、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、ハロ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、チオカルボキシ、カルバミルおよびアミノであってよく、これらの用語については本明細書に定義した通りである。
【００５４】
用語「Ｃ−カルボキシ」は＋Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’基 を指し、Ｒ’は、本明細書で定義
される、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合）またはヘテロアリサイクリック（環炭素を介して結合）である。
【００５５】
用語「Ｏ−カルボキシ」はＲ’−−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基を指し、Ｒ’は、本明細書で定義される、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合）またはヘテロアリサイクリック（環炭素を介して結合）である。
【００５６】
用語「カルボニル」は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’基を指し、Ｒ’は上記に定義した通りである。
用語「チオカルボニル」は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’基を指し、Ｒ’は上記に定義した通りで
ある。
【００５７】
「Ｏ−カルバミル」基は−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”基を指し、Ｒ’は上記に定義した通りであり、Ｒ”はＲ’に対して定義された通りである。
「Ｏ−チオカルバミル」基は−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”基を指し、Ｒ’およびＲ”は上記に定義した通りである。
【００５８】
「脂肪酸アシル」は、Ｒ'''Ｃ（＝Ｏ）−（Ｏ）−基を指し、Ｒ'''は少なくとも１０個の炭素原子を有する飽和または不飽和の炭化水素鎖である。
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ−シクロアルキル基の両方を指し、上記に定義した通りである。アルコキシ基の代表的な例はメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを含む。
【００５９】
−Ｏ−アルキルおよびＯ−シクロアルキル基は、本発明によれば、置換されてもよいし、非置換でもよい。置換される場合、置換基は、例えばシクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリサイクリック、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、ハロ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、チオカルボキシ、カルバミルおよびアミノであってよく、これらの用語については本明細書に定義した通りである。
【００６０】
用語「チオアルコキシ」は−Ｓ−アルキル基および−Ｓ−シクロアルキル基の両方を指し、本明細書に定義した通りである。
用語「ヒドロキシ」は−ＯＨグループを指す。
【００６１】
用語「チオヒドロキシ」は−ＳＨ基を指す。
「アリールオキシ」基は−Ｏ−アリール基および−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を指し、本明細書に定義した通りである。
【００６２】
「チオアリールオキシ」基は−Ｓ−アリール基および−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を指し、本明細書に定義した通りである。
用語「アミノ」は−ＮＲ’Ｒ”基を指し、Ｒ’およびＲ”は上記に定義した通りである。
【００６３】
用語「アルコキシカルボニル」は、本明細書では互換的に「カルバルコキシ」とも呼ばれるが、上記に定義した通りカルボキシ基を指し、Ｒ’は水素ではない。
用語「ヘテロアリール」基は、環内に、例えば窒素、酸素および硫黄等の１つまたは複数の原子を有し、さらには完全に共役したπ電子系を有する単環または縮合環（つまり隣接した原子対を共有する環）を含む。ヘテロアリール基の非制限的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。
【００６４】
「ヘテロアリサイクリック」基は、環内に、例えば窒素、酸素および硫黄等の１つまたは複数の原子を有する単環または縮合環を指す。環はさらに１つまたは複数の二重結合を有してもよいが、環は完全に共役したπ電子系を有しない。
【００６５】
用語「ハロ」はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を指す。
用語「ホスホニル」は−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）₂基を指し、Ｒ’は上記に定義した通り
である。
【００６６】
本発明の第１または第２態様の任意の実施形態では、方法は、Ｌ−ＤＯＰＡおよびＬ−
ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択された２つ以上の化合物を投与することを含んでもよい。別の好ましい実施形態では、方法はさらに、カルビドパまたはベンセラジド等のＬ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害剤を含むがそれらに限定されるわけではないさらなる治療化合物を患者へ投与することを含んでもよい。かかるＬ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害剤は、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡの血漿半減期を増大させ、かつＬ−ＤＯＰＡからドーパミンへの末梢での変換を減少させるために使用することが可能であり、これはＬ−ＤＯＰＡ処理の副作用を低減する。別の実施形態では、方法は、ＡＭＤを治療またはＡＭＤの進行を制限するのに有効な１つまたは複数の別の化合物を投与することをさらに含んでもよく、かかる化合物には、抗血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）剤等の抗血管新生治療薬、ラニビツマブまたはベバシツマブ等のＶＥＧＦ抗体（またはその断片）、またはペガプタニブ等のＶＥＧＦアプタマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、Ｌ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体を含有する栄養剤のような、より複雑な混合物中に存在してもよい。
【００６７】
好ましい実施形態では、本明細書で説明している任意の１つまたは複数Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を、栄養補助食品（ダイエタリーサプリメント）の形で使用してもよい。かかるサプリメントは、ＡＭＤの治療またはＡＭＤの進行の制限に有益であり得る１つまたは複数のさらなる成分と組み合わせてもよい。１つの好ましい実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、ビタミンＣ源、ビタミンＥ源、ビタミンＡ源、亜鉛源、および銅源の組み合わせと組み合わされ、それらはＡＭＤの治療に有用なものとして米国特許第６，６６０，２９７号に開示されており、この米国特許第６，６６０，２９７号全体は本明細書に援用する。任意の適切な量のかかる追加の成分の各々を、本発明の方法を実行する際にＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体と組み合わせて使用することが可能である。さらに好ましい実施形態では、かかる組み合わせはさらに、好ましくは１日当たり１ｍｇ−１００ｍｇの間；１ｍｇ−５０ｍｇの間、２ｍｇ−２５ｍｇの間、または２ｍｇ−１０ｍｇの間の、網膜保護効果を提供するのに適切な量のルテインおよび／またはゼアキサンシンをさらに含む。上記の好ましい実施形態のうちのいずれかのさらに好ましい実施形態では、かかる組み合わせはさらに、好ましくは１日当たり２５０ｍｇ−１０００ｍｇの間、３００ｍｇ−７５０ｍｇの間、３５０ｍｇ−７５０ｍｇの間、または３５０ｍｇ−６５０ｍｇの間の、網膜保護効果を提供するのに適切な量にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）をさらに含む。ＡＭＤ患者を治療するかかる組成物の使用方法については、例えばウェブサイトwww.areds2.org/およびその中のリンクで検討されている。
【００６８】
アスコルビン酸はビタミンＣの好ましい供給源であるが、例えばアスコルビン酸ナトリウムのような他の供給源を代わりに使用してもよい。
Ｄ１−α酢酸トコフェロールはビタミンＥの好ましい供給源であるが、例えばトリメチル酢酸トコフェリルおよび／またはコハク酸ビタミンＥのような他の供給源を代わりに使用してもよい。
【００６９】
β−カロチンは容易に商業的に入手できるため対象組成物に好ましいが、ビタミンＡの代替カロテノイド代用形も同様に使用することが可能である。
亜鉛は、亜鉛元素を最も濃縮した形で供給し、消化器系によく許容されるため対象錠剤には酸化亜鉛の形が好まれるが、例えばグルコン酸亜鉛のような他の亜鉛の形式も代わりに使用でき、または対象組成物中の酸化亜鉛と組み合わせて使用してもよい。
【００７０】
酸化第二銅の形をした銅は、亜鉛誘導性の銅欠乏貧血の予防を促すのに対象錠剤に好ましいが、例えばグルコン酸銅のような他の銅の形式も代わりに使用でき、または対象組成物中の酸化第二銅と組み合わせて使用してもよい。
【００７１】
好ましい実施形態では、これらの他の成分の各々の量（１日当たりに基づく）は、以下の通りである：
４５０ｍｇ−６００ｍｇの間のビタミンＣ（一日摂取許容量（ＲＤＡ）の約７−１０倍）；
４００ＩＵ−５４０ＩＵの間のビタミンＥ（ＲＤＡの約１３−１８倍）；
１７．２ｍｇ−２８ｍｇの間のβカロチン（ビタミンＡのＲＤＡの約６−１０倍；βカロチンはビタミンＡのプロドラッグである。）；
６８ｍｇ−１００ｍｇの間の亜鉛（亜鉛のＲＤＡの約４−７倍）；および
１．６ｍｇ−２．４ｍｇの間の銅。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、これらの他の成分の各々の量（１日当たりに基づく）は、以下の通りである：
５００ｍｇのビタミンＣ；
４００ＩＵビタミンＥ；
０ｍｇまたは１５ｍｇのβカロチン；
２５ｍｇまたは８０ｍｇの酸化亜鉛；
２ｍｇの酸化第二銅。
【００７３】
本明細書の別の実施形態と組み合わせてもよいさらに好ましい実施形態では、目の健康を維持するのに有用であると考えられている他の成分を同様にＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体と組み合わせても良く、それには例えば、保護網膜効果をさらに提供するのに適切な量、好ましくは１日当たり１ｍｇ−１００ｍｇの間、１ｍｇ−５０ｍｇの間、２ｍｇ−２５ｍｇの間、または２ｍｇ−１０ｍｇの間のルテインおよび／またはゼアキサンシン；保護網膜効果をさらに提供するのに適切な量、好ましくは１日当たり２５０ｍｇ−１０００ｍｇの間、３００ｍｇ−７５０ｍｇの間、３５０ｍｇ−７５０ｍｇの間、または３５０ｍｇ−６５０ｍｇの間のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれるがそれらに限定されない。任意選択で使用可能なさらなる化合物の例には、α−リポ酸や、オリゴマーのアントシアニジン、アントシアノシドおよびその組み合わせを含むがそれらに限定されないフェノール化合物が含まれるが、それらに限定されない。
【００７４】
Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、通常、医薬組成物の形で個別にまたは組み合わせて投与することが可能である。かかる組成物は医薬の分野で周知の方法で調製される。Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、唯一の活性薬物として投与してもよいし、または本発明の方法を実施するのに有用な１つまたは複数の別の化合物と組み合わせて使用してもよく、かかる別の化合物にはＶＥＧ−Ｆ等の抗血管治療薬や、カルビドパおよびベンセラジド等のＬ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。併用投与される場合、組み合わせは、同時または異なる時期に与えられる別々の組成物として処方してもよいし、単一の組成物として与えてもよい。
【００７５】
Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、固体形式（顆粒剤、粉末剤または坐剤を含む）または液体形式（例えば溶液、懸濁剤または乳剤）に構成されてよい。Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は種々の溶液に適用され、滅菌等の従来の医薬操作に曝されてもよく、および／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液等の以前の佐剤（アジュバント）を含んでもよい。
【００７６】
Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、任意の適切な経路により投与されてよく、それには経口、局所（点眼薬および眼軟膏剤を含むが、それらに限定されない）、非経口、鼻腔内、肺、または直腸が含まれるが、それらに限定されるわけではなく、以
前の非毒性の医薬として許容される担体、佐剤および賦形剤を含む投薬単位製剤として投与される。本明細書に使用する場合、用語「非経口」は経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入技術等を含む。さらに、本発明の化合物と医薬として許容される担体とを含む医薬製剤が提供される。Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、１つまたは複数の非毒性医薬として許容される担体、希釈剤および／または佐剤、ならびに所望の場合には別の有効成分と共に存在してよい、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、菱形錠剤、水性または油性の懸濁剤、分散粉末剤または顆粒剤、乳剤（エマルション）、硬質または軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、経口使用に適した形式であってもよい。
【００７７】
点眼薬は当該技術分野の任意の技術を使用して調製することが可能であり、それには塩化ナトリウムまたは濃グリセリン等の等張化剤、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム等の緩衝液、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸等の界面活性剤、ポリオキシル４０ステアリン酸またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、クエン酸ナトリウムまたはエデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウムまたはパラベン等の防腐剤の必要に応じた使用が含まれるが、それらに限定されるわけではない。点眼薬のｐＨは好ましくは４−８の範囲である。眼軟膏剤は、白色ワセリンまたは流動パラフィン等の一般に使用されている基剤と共に調製することが可能である。
【００７８】
経口使用向けのＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体は、医薬組成物の製造ための当該技術分野の任意の周知方法により調製可能であり、かかる組成物は、口当たりのよい調製物を提供すべく甘味剤、香料、着色剤および防腐剤からグループから選択された１つまたは複数の薬物を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の医薬として許容される添加剤と組み合わせて、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を含む。これらの添加剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；例えばコーンスターチまたはアルギン酸等の顆粒および崩壊剤；例えばデンプン、ゼラチン、アラビアゴム等の結合剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石等の潤滑剤であってよい。錠剤はコーティングされなくてもよいし、既知の技術によりコーティングされてもよい。ある場合には、かかるコーティングが、胃腸管での崩壊および吸収を遅らせる既知の技術により調製され、それにより長期間にわたる持続作用を提供する。例えば、グリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸のような時間遅延材料を使用することが可能である。
【００７９】
経口使用のための製剤は、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体が不活性の固体希釈剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン）と混合された硬質カプセル剤として、または有効成分が水性または油性媒体（例えばピーナッツ油、流動パラフィン、オリーブ油）と混合された軟質ゼラチンカプセル剤として与えられてもよい。
【００８０】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合されたＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を含む。かかる賦形剤は、懸濁化剤（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴム）であり、分散剤または湿潤剤は天然のリン脂質（例えばレシチン）または脂肪酸を有するアルキレンオキシド縮合物（例えばポリオキシエチレンステアリン酸）、長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキシド縮合物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルを有するエチレンオキシド縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸）、または脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルを有するエチレンオキシド縮合物（例えばポリエチレ
ンソルビタンモノオレイン酸）であってよい。水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤、（例えばエチルまたはｎ−プロピル ｐ−オキシ安息香酸）、１つまたは複数の着色剤）、１つまたは複数の香料、および１つまたは複数の甘味剤（例えばスクロースまたはサッカリン）を含んでよい。
【００８１】
油性懸濁液は、のＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を、植物油（例えばピーナッツ油、オリーブ油、胡麻油、ココナツオイル）または鉱油（例えば流動パラフィン）に懸濁させることにより調製可能である。油性懸濁液は、増粘剤（例えば密蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコール）を含んでもよい。口当たりのよい経口用製剤を与えるために、甘味剤と香料が添加されてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存されてもよい。
【００８２】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な粉末剤および顆粒剤は、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および１つまたは複数の防腐剤と混合して、有効成分を提供する。適切な分散もしくは湿潤剤または懸濁化剤は、既に上述したものにより例示されている。追加の添加剤（例えば甘味剤、香料、および着色剤）がさらに存在してもよい。
【００８３】
本発明の方法に使用される医薬組成物は、水中油型エマルションの形をしていてもよい。油相は、植物油、鉱油、またはそれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は天然ゴム（例えばアラビアゴムまたはトラガカントゴム）、天然のリン脂質（例えば、大豆、レシチン、および脂肪酸とヘキシトール、無水物とに由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレイン酸）、および該部分エステルのエチレンオキシドとの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸）であってよい。エマルションは甘味剤および香料をさらに含んでもよい。
【００８４】
シロップ剤とエリキシル剤は、甘味剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、スクロース）と共に調製されてもよい。かかる調製物は解乳化剤、防腐剤、香料、および着色剤をさらに含んでもよい。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤の形をしていてもよい。かかる懸濁剤は、上述した適切な分散または湿潤剤と懸濁剤とを使用して周知技術に従って製剤化されてよい。無菌の注射可能な調製物は。非毒性・非経口の許容される希釈剤または溶剤の形をした無菌注射剤溶液または懸濁剤であってもよい（例えば１，３−ブタンジオールの溶液として）。使用可能な許容される賦形剤および溶剤には、水、リンゲル液および生理食塩液がある。さらに、無菌の固定油が溶剤または懸濁剤として従来通りに使用される。この目的のためには、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意無味無臭の固定油が使用されてもよい。さらに、オレイン酸等の脂肪酸は注射物質の調製に用途がある。
【００８５】
Ｌ−ＤＯＰＡおよびＬ−ＤＯＰＡ類似体の鼻腔内投与のための特定方法が当該技術分野で周知であり；例えばKao et al., Pharmaceutical Research 17(8):978-984 (2000)を参照されたい。
【００８６】
用量域は、化合物の選択、投与経路、製剤の性質、患者の症状の性質、および関与する医師の判断によって決まる。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高用量が必要であると予想される。当該技術分野でよく理解されるように、かかる投薬レベルの違いは、最適化のための標準の経験的ルーチンを使用して調節することが可能である。ある実施形態では、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡＳ類似体は、１０ｍｇ／日から１５００ｍｇ／日の間の用量で投与することが可能であり、種々の好ましい実施形態では、投与が２０ｍｇと１２００ｍｇ／日の間、５０ｍｇと１０００ｍｇ／日の間、１００ｍｇと５００ｍｇ／日の間、および２００ｍｇと４００ｍｇ／日の間であってよい。
【００８７】
本明細書で説明している化合物を含む医薬組成物は、それを必要とする個体に投与される。好ましい実施形態では患者は哺乳動物であり、より好ましい実施形態では患者はヒトである。治療の用途では、組成物は本発明の方法を実施するのに十分な量で投与される。これらの使用に有効な量は、化合物の性質（比放射能等）、投与経路、疾患の段階ならびに重篤度、患者の体重ならびに健康の全身状態、および規定する医師の判断を含むがこれらに限定されない要因によって決まる。活性化合物は広い用量域にわたって有効であるが、実際に投与される化合物の量は上記の関連する状況に照らして医師により決定されるであろうことが理解される。したがって、上記の用量域はいかようにも本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００８８】
第３態様では、本発明は以下の（ａ）および（ｂ）を含む組成物を提供する：
（ａ）ＡＭＤの治療またはＡＭＤの進行の制限に有効な量のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体；
（ｂ）ＡＭＤの治療またはＡＭＤの進行の制限に有効な量の、ビタミンＣ源、ビタミンＥ源、ビタミンＡ源、亜鉛源および銅源を含む組成物。
【００８９】
組成物中のＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡＳ類似体の量は、１０ｍｇ／日から１５００ｍｇ／日の間の用量での投与を与えるのに適しており、種々の好ましい実施形態では、投与は２０ｍｇと１２００ｍｇ／日の間、５０ｍｇと１０００ｍｇ／日の間、１００ｍｇと５００ｍｇ／日の間、および２００ｍｇと４００ｍｇ／日の間である。
【００９０】
アスコルビン酸は対象錠剤中のビタミンＣの好ましい供給源であるが、例えばアスコルビン酸ナトリウムのような他の供給源を代わりに使用してもよい。
Ｄ１−α酢酸トコフェロールはビタミンＥの好ましい供給源であるが、例えばトリメチル酢酸トコフェリルおよび／またはコハク酸ビタミンＥのような他の供給源を代わりに使用してもよい。
【００９１】
β−カロチンは容易に商業的に入手できるため対象組成物に好ましいが、ビタミンＡの代替カロテノイド代用形も同様に使用することが可能である。
亜鉛は、亜鉛元素を最も濃縮した形で供給し、消化器系によく許容されるため対象錠剤には酸化亜鉛の形が好まれるが、例えばグルコン酸亜鉛のような他の亜鉛の形式も代わりに使用でき、または対象組成物中の酸化亜鉛と組み合わせて使用してもよい。
【００９２】
酸化第二銅の形をした銅は、亜鉛誘導性の銅欠乏貧血の予防を促すのに対象錠剤に好ましいが、例えばグルコン酸銅のような他の銅の形式も代わりに使用でき、または対象組成物中の酸化第二銅と組み合わせて使用してもよい。
【００９３】
本発明のこの第３態様の１つの好ましい実施形態では、組成物（ｂ）は以下の量の各成分の消化摂取を許容するのに適した処方を与える：
アスコルビン酸：少なくとも４５０ｍｇ；
ｄＩαトコフェリル酢酸：４００ＩＵ；
βカロチン：１７．２ｍｇ；
酸化亜鉛：６８ｍｇ；
酸化第二銅：１．６ｍｇ
本発明のこの第３態様の１つの好ましい実施形態では、組成物（ｂ）は以下の量の各成分の摂取を許容するのに適した処方を与える：
５００ｍｇのビタミンＣ；
４００ ＩＵのビタミンＥ；
０ｍｇまたは１５ｍｇのβカロチン；
２５ｍｇまたは８０ｍｇの酸化亜鉛；
２ｍｇの酸化第二銅。
【００９４】
上記に特定したような対象組成物の好ましい毎日用量が、上記に開示したような任意の適切な投与経路を介して、１回、２回、３回または４回以上の投薬形式で投与されてよい。好ましい実施形態では、投薬形式は本明細書で説明しているかかる投薬形式の任意の実施形態によれば、経口または局所の投薬形式である。別の好ましい実施形態では、対象組成物の毎日用量は、１日２回の１回分の投与形式、１日２回の２回分の投与形式、または１日合計４回分の投与形式で与えられる。１日１回の日用量合計をとるのと比較して、１回の用量当たりの１つまたは複数の投薬形式中、日用量合計の半分の１日２回投与は、主成分の吸収を改善すると共に、主成分の血中濃度をより良好に維持する。従って、対象組成物の好ましい製剤の1日に２回の投薬形式が毎日摂取される場合、各投薬形式は好まし
くは経口投与時に少なくとも約２２５ｍｇのアスコルビン酸、約２００ＩＵのｄｌ−αトコフェリル酢酸、約８．６ｍｇのβ−カロチン、約３４ｍｇの酸化亜鉛および約０．８ｍｇの酸化第二銅を提供するよう調剤される。対象組成物の好ましい製剤の４つの錠剤が毎日摂取される場合、各錠剤は好ましくは少なくとも約１１２．５ｍｇのアスコルビン酸、約１００ＩＵのｄｌ−αトコフェリル酢酸、約４．３ｍｇのβ−カロチン、約１７ｍｇの酸化亜鉛、約０．４ｍｇの酸化第二銅、および５ｍｇ−７５０ｍｇの間のＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体を提供するように調剤される。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、組成物は以下を含む：
（ａ）５ｍｇから１５００ｍｇの間のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体；
（ｂ）４５０ｍｇから６００ｍｇの間のビタミンＣ（一日摂取許容量（ＲＤＡ）の約７−１０倍）；
（ｃ）４００ＩＵから５４０ＩＵの間のビタミンＥ（ＲＤＡの約１３−１８倍）；
（ｄ）１７．２ｍｇから２８ｍｇの間のβカロチン（ビタミンＡのＲＤＡの約６−１０倍；βカロチンはビタミンＡのプロドラッグである。）；
（ｅ）６８ｍｇから１００ｍｇの間の亜鉛（亜鉛用のＲＤＡの約４−７倍）；および
（ｆ）少なくとも１．６ｍｇの銅。
【００９６】
種々の好ましい実施形態では、組成物は１０ｍｇから１２００ｍｇの間；２５ｍｇから１０００ｍｇの間；５０ｍｇから５００ｍｇの間；または１００ｍｇから４００ｍｇの間のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体を含んでもよい。
【００９７】
本明細書の別の実施形態と組み合わせてもよいさらに好ましい実施形態では、目の健康を維持するのに有用であると考えられている他の成分を同様にＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡ類似体と組み合わせても良く、例えば、保護網膜効果をさらに提供するのに適切な量、好ましくは１日当たり１ｍｇ−１００ｍｇの間、１ｍｇ−５０ｍｇの間、２ｍｇ−２５ｍｇの間、または２ｍｇ−１０ｍｇの間のルテインおよび／またはゼアキサンシン；保護網膜効果をさらに提供するのに適切な量、好ましくは１日当たり２５０ｍｇ−１０００ｍｇの間、３００ｍｇ−７５０ｍｇの間、３５０ｍｇ−７５０ｍｇの間、または３５０ｍｇ−６５０ｍｇの間のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれるがそれらに限定されない。記載された量を提供する特定の投薬形式に必要な量は、本明細書の教示および１日当たりに投与される剤形の数基づいて当業者には決定することが可能である。
【００９８】
第４の態様では、本発明は、ＡＭＤを治療する化合物を識別するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、細胞を試験化合物と接触させることからなり、細胞は、
（ａ）ＯＡ１を発現している第１の細胞集団；および任意選択で
（ｂ）ＯＡ１を発現していない第２の細胞集団；を含み、
（ｃ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方又は両方を増大させる試験化合物を陽
性試験化合物と識別し；
（ｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）発現および（Ｂ）第２の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現におけるＰＥＤＦ発現のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現；
（ｉｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度および（Ｂ）第２の細胞集団における細胞内カルシウム濃度のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度；
陽性試験化合物は、ＡＭＤの治療およびＡＭＤの進行の制限のうちの少なくとも一方を行う候補化合物である方法を提供する。
【００９９】
上述したように、ヒトＯＡ１（配列番号１−２、ＮＰ０００２６４．１）はＧタンパク質共役受容体であり、本願発明者は本明細書でＬ−ＤＯＰＡをＯＡ１リガンドと確認した。より詳細に以下に開示するように、本願発明者はＬ−ＤＯＰＡを通じてリンクされたＯＡ１とチロシナーゼの間の自己分泌ループの存在を発見した。このループは、少なくとも１つの非常に効き目のある網膜神経栄養因子（ＰＥＤＦ）の分泌と、細胞内カルシウム濃度の増加とを含む。ＯＡ１は、その下流での作用が進行中の網膜の空間のパターニングを左右する選択的Ｌ−ＤＯＰＡ受容体である。したがって、ＯＡ１経路の刺激を介してＰＥＤＦ発現および／または細胞内カルシウム濃度を選択的にアップレギュレートする試験化合物は、ＡＭＤの治療および／またはＡＭＤの進行の制限を行うための候補化合物である。本発明のこの態様の方法は、以下のものを含むが、それらに限定されない任意のＯＡ１同族体を用いて実施することが可能である：
マウス：配列番号３−４（ＮＭ＿０１０９５１）；
アフリカツメガエル(Xenopus tropicalis)：配列番号５−６（ＮＭ＿００１０１１０１８）；
雌ウシ：配列番号７−８（ＸＭ＿００１５０６３１８）；
ラット：配列番号９−１０（ＮＭ＿００１１０６９５８）；
カモノハシ：配列番号１１−１２（ＸＭ＿００１５０６３１８）；
アフリカツメガエル（Xenopus laevis）：配列番号１３−１４ （ＮＭ＿００１０９６８４２）
ニワトリ：配列番号１５−１６（ＸＭ＿４１６８４８）；
ゼブラフィッシュ：配列番号１７−１８（ＮＭ＿２００８２２）；
チンパンジー：配列番号１９（ＸＲ＿０２５６２５）；
アカゲザル：配列番号２１−２２（ＸＭ＿００１０９０１３９）；および
マカクザル：配列番号２３（ＢＶ２０９２５３）。
【０１００】
ＰＥＤＦは色素上皮誘導因子であり（Exp Eye Res 53:411-414）、神経感覚網膜の発達を変更し、かつ血管増殖を阻害する可能性を備えた公知の神経栄養因子である。本発明のこの態様の方法は、以下のものを含むが、それらに限定されない任意のＰＥＤＦ同族体を用いて実施することが可能である：
ヒト：配列番号２５−２６（ＮＭ＿００２６１５）；
ラット：配列番号２７−２８（ＮＭ＿０３１３５６）；
キンカチョウ：配列番号２９−３０（ＸＭ＿００２１９７４１９）；
ウマ：配列番号３１−３２（ＮＭ＿００１１４３９５４）；
アフリカツメガエル(Xenopus tropicalis)：配列番号３３−３４（ＮＭ＿２０３７５５）；
マウス：配列番号３５−３６（ＮＭ＿０１１３４０）；
大西洋サケ：配列番号３７−３８（ＮＭ＿００１１４０３３４）；
ヒツジ：配列番号３９−４０（ＮＭ＿００１１３９４４７）；
モルモット：配列番号４１−４２（ＥＦ６７９７９２）；
雌ウシ：配列番号４３−４４（ＮＭ＿１７４１４０）；
イノシシ：配列番号４５−４６（ＮＭ＿００１０７８６６２）；
カモノハシ：配列番号４７−４８（ＸＭ＿００１５０７１２８）；
オオカミ：配列番号４９−５０（ＮＭ＿００１０７７５８８）；
マカクザル：配列番号５１−５２（ＡＢ１７４２７７）；
チンパンジー：配列番号５３−５４（ＸＭ＿００１１５４６６５）；
アカゲザル：配列番号５５−５６（ＸＭ＿００１１１７３６１）；および
ヒラメ：配列番号５７−５８（ＤＱ１１５４０６）。
【０１０１】
細胞の第１集団および第２集団は任意の適切な真核細胞の種類であってよく、第１の細胞集団は細胞表面受容体タンパク質としてＯＡ１を発現することが可能である。１つの好ましい実施形態では、細胞の第１集団および第２集団は、マウス、ラット、ハムスターまたはヒト細胞等の哺乳類由来の細胞である。特に細胞内カルシウム濃度の分析に関する実施形態に使用される場合、現在までに試験されているすべての真核細胞は、本発明の方法を実施するのに適していることが分かっている。細胞内カルシウム信号および／またはＰＥＤＦ分泌のうちの一方又は両方に関連して本明細書に開示されたＯＡ１シグナル伝達経路の保存に関して現在までに試験されている細胞の種類には、ＭＣＦ７（乳癌上皮細胞）、ＣＯＳ細胞（腎臓繊維芽細胞）、ＭＤＣＫ細胞（腎臓上皮）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、マウスＲＰＥおよび３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ならびに以下の実施例で開示されたものが含まれる。かかる細胞は種々の供給源（メリーランド州Walkersville所在のLifeLine Cell Technology社；ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から入手可能であるか、または当該技術分野で周知かつ以下に説明する方法を用いて単離可能である。
【０１０２】
１実施形態では、細胞表面受容体タンパク質としてＯＡ１を発現している第１の細胞集団の第１部分を試験化合物と接触させ、第１の細胞集団の第２部分は試験化合物と接触させず、第２部分と比較して第１部分におけるＰＥＤＦの発現および／または細胞内カルシウム濃度を増加させる化合物は、ＡＭＤの治療および／またはＡＭＤの進行の制限を行う候補化合物である。
【０１０３】
代わりに、方法は、細胞表面受容体タンパク質としてＯＡ１を発現しない第２の細胞集団の使用を含んでもよく、第２の細胞集団と比較して第１の細胞集団におけるＰＥＤＦの発現および／または細胞内カルシウム濃度を増加させる化合物は、ＡＭＤの治療および／またはＡＭＤの進行の制限を行う候補化合物である。好ましい実施形態では、第１および第２の細胞集団は同じ細胞の種類であり、第１の細胞集団はＯＡ１を発現するよう遺伝子組み換えされ、第２の細胞集団は遺伝子組み換えされない。この実施形態では、第２の細胞集団は第１の細胞集団と同様の発現ベクターでトランスフェクトされてよく、かかるトランスフェクションは、空の発現ベクター（つまりトランスフェクト細胞中のベクターから得られる発現タンパク質がない）または細胞膜へ適切に挿入されない切断型または変異型ＯＡ１を発現することが可能な発現ベクターでのトランスフェクションを含む。代わりに、細胞はＯＡ１シグナル伝達に不活性であることが知られているＯＡ１変異型をコードする発現ベクターまたは異なるＧＰＣＲ経路（例えばｃＡＭＰ）を介してシグナル伝達することが可能な遺伝子組み換えされたＯＡ１をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることも可能である。
【０１０４】
例えば、リガンド結合を変更せずにその活性を変更するために、ＯＡ１の７つの膜貫通領域を異なる細胞内ｃ末端尾部と融合させることが可能である。
本明細書に使用する場合、「ＰＥＤＦ発現の増加」または「細胞内カルシウム濃度の増加」とは、第２の細胞集団で見られるよりも大きいアッセイの経過中の任意の第１の細胞集団における（または第１集団の第２部分に関する第１部分における）ＰＥＤＦ発現の増加または細胞内カルシウム濃度の増加である。この方法は、化合物が対照で見られるより
も大きいＰＥＤＦ発現の増加または細胞内カルシウム濃度の増加を促進する限り、対照に対するＰＥＤＦ発現の増加または細胞内カルシウム濃度の増加の特定量を要求しない。好ましい実施形態では、増加は標準的な統計学的測定により測定される統計学的に有意な増加である。
【０１０５】
細胞内カルシウム濃度の決定は当該技術分野で周知であり、Ｆｕｒａ−２細胞ローディングおよびレシオメトリックイメージングを使用した方法の例が、以下の実施例に記載される。しかしながら、細胞内カルシウム濃度は当業者に周知のいかなる方法を使用して測定してもよく、それにはFu la^TMI（以下を参照）およびFLIPer^TMを用いたハイスループット法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０６】
細胞集団におけるＰＥＤＦの発現レベルの決定は、以下に説明するような当該技術分野の任意の技術を使用してもよく、それにはｍＲＮＡハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、スロットブロット等）、適当なプライマー組を用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびＰＥＤＦを発現／分泌する馴化細胞培地での抗体検出（ウェスタンブロット、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＤＦ抗体は市販されている（例えばマサチューセッツ州Cambridge所在のAbcam社）。タンパク質分析は（ＰＥＤＦが発現タンパク質であるため）馴化細胞培地上で行われて良く、すべてのアッセイは細胞内ＰＥＤＦタンパク質／ｍＲＮＡ生産で行うことが可能である。別の実施形態では、ＰＥＤＦプロモータから検知信号（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ等）の発現を駆動する発現ベクターを有する組換え細胞を生成することが可能である。かかる細胞は、検知可能な蛍光強度の測定またはＰＥＤＦプロモータにより駆動される他の信号の測定を介して「ＰＥＤＦ発現」が測定される第１の細胞集団として使用することが可能である。
【０１０７】
この第４の態様に使用される場合、用語「接触」は、第１の細胞集団の細胞表面に発現されたＯＡ１へのＯＡ１リガンドの結合を促進するのに適した条件下でのｉｎ ｖｉｔｒｏの接触を意味する。本明細書に使用する場合、「接触」は培養の開始時に起こるか、または細胞集団の培養の開始後の任意の時間に起こる。ＰＥＤＦ発現および／または細胞内カルシウム濃度は、所与のアッセイのために適切に決定された試験化合物と接触した後にいつでも測定することが可能である。１実施形態では、経時変化を測定し、接触前に複数のレベルを測定し、接触後に種々の時間で測定する。種々の実施形態で、接触後のカルシウムシグナルの測定が５秒と６０分の間でなされ；より好ましくは１０秒と３０分の間、１０秒と１０分の間、および１０秒と５分の間、１０秒と１分の間、および１０秒と３０秒の間になされる。種々の実施形態では、ＰＥＤＦ発現の測定は１分から７２時間の間の範囲にわたり、ＥＤＦ分泌の分析はＰＥＤＦ ｍＲＮＡ発現、ＰＥＤＦの細胞内タンパク質発現、またはＰＥＤＦプロモータにより駆動される検出信号の発現の分析よりも後の測定が必要とされる。
【０１０８】
所与のアッセイに対して、任意の適切な細胞培養条件が使用可能である。１つの好ましい実施形態では、細胞における内因性Ｌ−ＤＯＰＡの生産を低減させ、かつ細胞表面に存在するＯＡ１の量を維持するために（リガンド結合の際にＯＡ１がエンドソームに内在化するため）、接触が非常に低濃度のチロシン（０．１μｍと１０μｍの間のチロシン）を有する細胞培地またはチロシンがない細胞培養培地で起こる。１つの好ましい実施形態では、細胞表面でのＯＡ１発現および局在化を最大限にするために、細胞は、試験化合物との接触前には低チロシン培地で培養され、次に試験化合物と接触させるためにチロシンを含まない培地に播かれる。別の好ましい実施形態では、接触が低チロシン培地で起こる。上記に開示された別の実施形態と組み合わせてもよい別の好ましい実施形態では、培地は、チロシンからのＬ−ＤＯＰＡの細胞内生産を制限する、フェニルチオ尿素を含むがこれに限定されないチロシン阻害剤を含む。色素性細胞を使用する場合にこの実施形態は特に
好ましい。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、方法は、ＯＡ１への結合の競争相手として、Ｌ−ＤＯＰＡ、チロシンおよびドーパミンのうちの１つまたは複数の使用をさらに含んでもよい。この実施形態は、試験化合物をＯＡ１リガンドであると識別した後に実行されてもよいし、またはＯＡ１に結合する試験化合物の初期スクリーニングで実行されてもよい。以下の実施例で示されるように、１ｍＭ以上の濃度では、チロシンとドーパミンはＯＡ１に対する結合に関しＬ−ＤＯＰＡと競争し得る。したがって、１ｍＭから１００ｍＭの間、好ましくは１ ｍＭと５０ｍＭの間、または１ｍＭと２５ｍＭの間の濃度のチロシンおよび／またはドーパミンを使用した競争アッセイを使用して、試験化合物がＯＡ１経路経由で作用していることをさらに確認できると共に、Ｌ−ＤＯＰＡの置換と比較したチロシンおよびドーパミンがＯＡ１に結合する陽性試験化合物の置換能力を測定することが可能である。同様に、（試験されている試験化合物と同様なモル濃度の）Ｌ−ＤＯＰＡと比較した競争的結合は、Ｌ−ＤＯＰＡと比較してＯＡ１への結合力が増加した化合物を識別するのを支援することが可能である。
【０１１０】
任意の適当な試験化合物を、小分子、ポリペプチドおよび核酸を含む本発明の第４および第５の態様の方法（以下を参照）を使用して評価することが可能である。試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、かかるポリペプチドは化学合成されてもよいし、組み換え発現されてもよい。上記に開示したように、組換え発現は当該技術分野の標準的方法を使用して行うことが可能である。かかる発現ベクターには細菌またはウイルスの発現ベクターが含まれてよく、かかる宿主細胞は原核生物であってもよいし、真核生物であってもよい。固相法、液相法またはペプチド縮合法、またはそれらの任意の組み合わせの周知技術を使用して調製される合成ポリペプチドには、天然または非天然のアミノ酸が含まれ得る。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリング、および洗浄プロトコルによる標準Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護されたＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂または標準の塩基性条件下で分解しやすいＮα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃ Ｎα−アミノ保護アミノ酸は、いずれもSigma社、Cambridge Research Biochemical
社、または当業者に周知の他の化学企業から入手することが可能である。さらに、ポリペプチドは当該技術分野で周知の他のＮα−保護基で合成することも可能である。固相ペプチド合成は当該技術分野の周知技術により達成され、自動シンセサイザの使用等により与えられる。
【０１１１】
試験化合物が抗体を含む場合、かかる抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化抗体であってもよいし、完全ヒト抗体であってもよいし、またはマウス型の抗体でもよい。かかる抗体は例えばHarlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).に記載されているような周知方法により作製することが可能である。
【０１１２】
試験化合物が核酸配列を含む場合、かかる核酸は化学合成されてもよいし、組み換え発現されてもよい。組換え発現技術は、当該技術分野で周知である（例えばSambrookら、1989、前掲参照）。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいし、一本鎖または二本鎖であってもよい。同様に、かかる核酸は、当該技術分野の標準的方法を用いて手動または自動反応により化学的または酵素的に合成することが可能である。化学的に合成されるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素合成により合成される場合、核酸は細胞へ導入される前に精製され得る。例えば、核酸は、溶媒または樹脂での抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィまたはその組み合わせにより、混合物から精製することが可能である。代わりに、核酸は、サンプル処理による損失を回避するため、精製を最低限にして使用してもよい。
【０１１３】
試験化合物がポリペプチド、抗体または核酸以外の化合物を含む場合、かかる化合物は有機化学合成を行なうための当該技術分野の種々の方法により製造することが可能である。
【０１１４】
第２の細胞集団に比べて第１の細胞集団におけるＰＥＤＦおよび／または細胞内カルシウム濃度の発現を増加させると識別された試験化合物は、以下に説明する本発明の第４の態様のインビボ法を含むがこれに限定されないさらなる任意の方法を使用して、ＡＭＤを治療またはＡＭＤの進行を制限する候補化合物として使用するようさらに評価することが可能である。１つの好ましい実施形態では、方法はさらに、上述したように競争量のチロシンおよび／またはドーパミンの存在下でアッセイ中の陽性試験化合物を再試験することを含む。
【０１１５】
第５の態様では、本発明は、ＡＭＤを治療する化合物を識別する方法であって、
（ａ）チロシナーゼ欠損の妊娠している雌の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程であって、試験化合物は胚光受容体および／または網膜神経節の発達中に投与される工程；および
（ｂ）胚または出生後の非ヒト哺乳動物における光受容体および／または網膜神経節発達に対する試験化合物の効果を、試験化合物を投与していない胚または出生後の非ヒト哺乳動物における光受容体および／または網膜神経節の発達と比較する工程であって、光受容体および／または網膜神経節の発達を増大させる試験化合物は、ＡＭＤを治療および／またはＡＭＤの進行を制限する候補化合物である工程；
からなる方法を提供する。
【０１１６】
本願発明者は、チロシナーゼ欠損動物における光受容体および神経節細胞の発達を助けるためにＯＡ１シグナル伝達を使用できることを決定し、プロセス中にＯＡ１シグナル伝達の神経組織栄養効果を確立した。したがって、ＯＡ１シグナル伝達を通じて神経網膜の発達を助ける化合物は、ＡＭＤ治療の良い候補である。本発明は、ＡＭＤ薬物スクリーニングのためのかかる動物モデルを第１に確立する。
【０１１７】
本明細書により詳細に記載するように、チロシナーゼはチロシンに作用してＬ−ＤＯＰＡを生成する。したがって、チロシナーゼ欠損哺乳動物は、Ｌ−ＤＯＰＡを生産せず、かかる哺乳動物を使用すると内因性Ｌ−ＤＯＰＡがない状態で（網膜の進行および／またはＰＥＤＦ発現の増加の救助を介して）ＯＡ１のアクチベータを識別することが可能となる。本明細書に使用する場合、「チロシナーゼ欠損」とは、妊娠している雌の非ヒト哺乳動物が正常な色素形成に適した量のＬ−ＤＯＰＡを生成するのに適当な量のチロシナーゼを生産しないことを意味する。１つの好ましい実施形態では、妊娠している非ヒト哺乳動物は、機能的なチロシナーゼを発現またはやりとりする能力のないノックアウト動物（チロシナーゼ遺伝子の部分または全部が削除されているか、またはチロシナーゼ遺伝子またはチロシナーゼを制御、活性化するかもしくはメラノソームへとチロシナーゼをやりとりする付属遺伝子に自然突然変異を有する）である。かかるチロシナーゼノックアウトは当該技術分野で周知であり、市販で入手可能である（Lexicon Pharmaceuticals社、Jackson Laboratories社、Taconic Farms社）。別の実施形態では、チロシナーゼ欠乏は、チロシナーゼを標的とするｓｉＲＮＡｓの投与や、チロシナーゼ抗体／アプタマーによる治療等を含むがこれらに限定されない当該技術分野の周知方法により一過性に誘発されてもよい。
【０１１８】
非ヒト哺乳動物は、チロシナーゼ欠損（網膜アルビノ）の雌を得ることが可能であればいかなるものでもよく、すべての哺乳動物を含む。種々の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウス、ブタ、サルおよびラットである。
【０１１９】
１つの好ましい実施形態では、試験化合物の投与は、光受容体および／または網膜神経節の発達の出生後期間の間じゅう継続される。種々の非ヒト哺乳動物における胚および出生後の光受容体および／または網膜神経節の発達経路は、当業者によく理解されている。１つの例証的実施形態では、マウスの胚光受容体と網膜神経節の発達は胚の１０日目（Ｅ１０）に始まり、網膜の進行は、生後の１４日目（Ｐ１４）で完了し、この時には子マウスの目が開いている。したがって、種々の実施形態では、試験化合物は、まずＥ７、Ｅ８、Ｅ９またはＥ１０の日に投与され（視覚の発達の最も初期の段階での存在を促進するため）、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３およびＰ１４の日の間または所望に応じてその後に、所与のアッセイに所望される通りに投与を継続することが可能である（出生後１年以内）。当業者によって理解されるように、投与は、胚の時期に妊娠している雌の母体に行うか、出生後は子に行うことになる。別の実施形態では、色素細胞の発達は約日１０．５Ｅ（ＯＡ１とチロシナーゼが現われる時期）に本格的に開始し、したがって１実施形態では、試験化合物の投与は約Ｅ１０、Ｅ１０．５またはＥ１１日目に開始し、所望に応じてＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４日目または所望に応じてその後まで継続される。別の実施形態では、試験化合物の投与はＥ７と、Ｅ１０またはＥ１１との間に限定されてもよい。さらなる実施形態では、網膜神経節の発達は約Ｅ１２日目に本格的に開始し、したがって１実施形態では、試験化合物の投与は約Ｅ１２またはＥ１３日に開始し、所望に応じてＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４日目または所望に応じてその後まで継続される。別の実施形態では、試験化合物の投与は約Ｅ７と、Ｅ１２またはＥ１３との間に限定されてもよい。ほとんどの好ましい実施形態では、試験化合物は、Ｅ７日からＥ１４日まで毎日投与される。当業者に理解されるように、試験化合物の投与の正確なタイミングは、特定のアッセイの目的によって決まり、本明細書での教示に基づいて当業者が決定することが可能である。
【０１２０】
試験化合物は、Ｌ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体の治療用投与のために上記に開示した投与経路を含む、実験動物への使用に適した任意の経路により投与されてよい。好ましい実施形態では、試験化合物は、動物の飲料水に入れて、非経口（上述）または局所（例えば点眼薬または眼軟膏剤で）敵に投与される。試験化合物の投与回数は、所与のアッセイに適した頻度としてよい。好ましい実施形態では、試験化合物は、治療の所望経過じゅう毎日投与される。他の実施形態では、投与は治療経過の間、１日、３日、４日、または５日おきである。投与回数は本明細書の教示および所与のアッセイの特定の目的に基づいて当業者が決定することが可能である。
【０１２１】
本明細書に使用する場合、「光受容体および／または網膜神経節の発達の増加」は、試験化合物で処理した胚／動物対未処理の胚／動物における光受容体および／または網膜神経節の発達の任意の増加である。この方法は、化合物が対照で見られるよりも大きな光受容体および／または網膜神経節の発達の増加を促進する限り、対照に対する光受容体および／または網膜神経節の発達の特定量の増加を要求しない。好ましい実施形態では、増加は標準的な統計学的測定で測定される統計学的に有意な増加である。１実施形態では、動物は適切な時点で安楽死させられ、網膜神経節細胞および／または光受容体は以下の実施例に開示されたものを含むがそれらに限定されない当該技術分野の標準的方法を使用して計数される。
【０１２２】
光受容体および／または網膜神経節の発達を増加させるとして識別された試験化合物を、ＡＭＤを治療またはＡＭＤの発達を制限する候補化合物として使用するためにさらに評価することが可能であり、それには競争量のチロシンおよび／またはドーパミンの存在下で本発明の第３態様で開示したｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を使用して陽性試験化合物を再試験することが含まれるが、それらに限定されるわけではない。以下の実施例に示すように
、１ｍＭ以上の濃度で、チロシンおよびドーパミンはＯＡ１への結合に関しＬ−ＤＯＰＡと競争することが可能である。したがって、１ｍＭから１００ｍＭの間、好ましくは、１ｍＭから５０ｍＭの間または１ｍＭから２５ｍＭの間の濃度のチロシンおよび／またはドーパミンを使用した競争アッセイを使用して、試験化合物がＯＡ１経路を介して作用していることをさらに確認し、かつすることが可能である、経由で作動している、またチロシンおよびドーパミンがＬ−ＤＯＰＡの置換と比較してＯＡ１へ結合する陽性試験化合物と置換する能力を測定することが可能である。
【０１２３】
実施例：Ｌ−ＤＯＰＡはＯＡ１の内因性リガンドである
（背景）：白皮症は色素沈着の損失を特徴とする遺伝子異常である。神経感覚網膜は、色素が沈着せず、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の色素沈着の喪失の次に病理学的変化を示す。ＲＰＥの色素沈着の喪失がどのようにして隣接する神経感覚網膜の発達欠陥を引き起こすかはまだ決定されていないが、これらの重要な２つの組織間の相互作用を研究する固有の機会を与えている。白皮症を引き起こす遺伝子の一方は、ＲＰＥを含む色素沈着細胞にのみ発現されるオーファンＧＰＣＲ（ＯＡ１）をコードしている。
【０１２４】
方法／原理的発見：ＯＡ１の機能およびシグナル電圧を、ＲＰＥおよびトランスフェクト細胞株で調べた。結果は、ＯＡ１が選択的Ｌ−ＤＯＰＡ受容体であり、２つの密接に関連する化合物であるチロシンおよびドーパミンからの測定可能なセカンドメッセンジャー活性はないことを示している。放射性標識リガンド結合により、ＯＡ１がＬ−ＤＯＰＡの一つの飽和結合部位を示すことが確認された。ドーパミンは、その一つのＯＡ１結合部位に関しＬ−ＤＯＰＡと競争したが、これはドーパミンがＯＡ１アンタゴニストとして機能し得ることを示唆している。Ｌ−ＤＯＰＡに対するＯＡ１応答を、細胞内カルシウムの流入およびβ−アレスチンの動員を含むいくつかの一般的なＧＰＣＲ活性化の測定基準により定義した。さらに、Ｌ−ＤＯＰＡを生産する酵素であるチロシナーゼの抑制により、ＲＰＥによるＰＥＤＦ分泌が減少した。さらに、Ｌ−ＤＯＰＡによるＲＰＥでのＯＡ１の刺激により、ＰＥＤＦ分泌が増大した。
【０１２５】
結論／有意性：まとめると、結果は、Ｌ−ＤＯＰＡを介してリンクされたＯＡ１とチロシナーゼとの間の自己分泌ループを示し、このループは少なくとも１つの非常に効き目のある網膜神経栄養因子の分泌を含んでいる。ＯＡ１は、その下流での作用が発達中の網膜の空間パターン形成を左右する選択的Ｌ−ＤＯＰＡ受容体である。結果は、メラニン合成機構の変化により引き起こされる網膜の白皮症の結果がＬ−ＤＯＰＡの補給により治療され得ることを示唆している。
【０１２６】
導入：白皮症は、目、髪または皮膚の色素沈着の可変的な喪失がある、遺伝的遺伝子疾患のグループである。目が罹患した場合、弱視につながる神経感覚網膜発達に著しい変化がある［１−８］。白皮症には２つの大きな分類である眼皮膚白皮症（ＯＣＡ）および眼白皮症（ＯＡ）がある。すべての色素化組織が色素沈着減少を示した場合にＯＣＡが生じ、メラニン合成機構の欠陥を生じさせる遺伝子突然変異を伴う［３および７−９］。ＯＡは皮膚組織に通常に色素がついている場合に生じるが、眼組織の色素沈着が減少している［１０および１１］。すべての組織で同じタンパク質は色素を生産するため、他の組織も通常着色するため、ＯＡは、メラニンを合成する能力がないわけではなく、眼組織中のメラニン生成酵素の発現が不足していることに起因する可能性が高い。
【０１２７】
ＯＡは、Ｘ染色体上に見出される少なくとも１つの遺伝子Ｏａ１に結合され得る。Ｏａ１は、配列決定分析に基づくと、オーファンＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＧＰＲ１４３）［１２および１３］であると考えられる４０４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする［１４］。SchiaffinoらはＯＡ１がＧ_βのみならずいくつかのＧ_αサブユニットと結合していることを実証しており、これはＯＡ１がＧＰＣＲで
あるというさらなる証拠を加えている［１４および１５］。実際、Innamoratiらは、ＯＡ１由来のＧＰＣＲ様活性とβ−アレスチン結合を示すために、組み合わせ発現法を使用した［１６］。この研究は、ＯＡ１がホスホリパーゼＣとイノシトール三リン酸のセカンドメッセンジャーによってＧαｑサブユニットを介してシグナルを送り得ることを示唆した。酵素発現系で、StalevaとOrlowは、メラノソーム区画中の成分により活性化されていると考えられるＯＡ１からのＧＰＣＲシグナル伝達を実証した［１７］。ＯＡ１がＧＰＣＲであるというかなりの量の情況証拠にもかかわらず、リガンドが同定されていないため、確認がなされていない。ＯＡ１がＧＰＣＲであるという考えに、他のデータは疑問を投げかけている。例えば、完全な細胞内タンパク質としてのＯＡ１の局在性は、ＧＰＣＲに一般的なことではなく、これはＯＡ１がＧＰＣＲファミリーの固有のメンバーであろうことを示唆している［１４］。ＯＡ１は細胞表面ではなくリソソーム内区画［１４、１５、１８−２１］およびメラノソーム［１１、１４、２２］に主に局在化している。
【０１２８】
本研究では、ＯＡ１のエンドソームの局在性が培養細胞中の薬物に応答したＯＡ１の内在化によるとの仮説に基づき、潜在的ＧＰＣＲとしてのＯＡ１の機能を調べた。さらに、すべての型のＯＣＡおよびＯＡが同じ網膜の発現型を有し、これはチロシナーゼ活性とＯＡ１シグナル伝達が網膜発達の上流で連結されていることを示唆しているという知見に基づいて、ＯＡ１のリガンドを求めた。したがって、チロシナーゼ活性がＯＡ１のリガンドを生産するか否かの試験を行なった。メラニン合成の副産物はＬ−ＤＯＰＡであり、これは網膜の発達の重大な時間にＲＰＥでのメラニン合成の間に網膜に放出される［２３および２４］。データは、ＯＡ１が非常に選択的なＬ−ＤＯＰＡ受容体であり、Ｌ−ＤＯＰＡがＲＰＥによる神経栄養因子分泌の下流での作用によりＯＡ１のシグナル伝達を引き起こすことを示唆している。したがって、第１の証拠がＯＡ１のリガンドに対して示され、チロシナーゼまたはＯＡ１の欠乏のいずれかにより網膜の発達に変更を生させる機構を提供する。
【０１２９】
結果：
ＯＡ１の細胞表面局在性
ＯＡ１は以前はｉｎ ｓｉｔｕで色素顆粒中に局在化していたが［２２］、種々のトランスフェクト細胞を使用すると、ＯＡ１は原形質膜［１６および１７］および培養細胞のエンドソーム部分［１４、１６−１８、２０、２１］の両方にも局地化していた。このような研究は、細胞表面ビオチン化／ウェスタンブロット法を使用してＯＡ１がヒト組織のどこに存在するかを決定することから始まった。ヒトの目では、ＯＡ１はｉｎ ｓｉｔｕでＲＰＥの頂端細胞表面に存在した（図１Ａ）。細胞表面の、５つのヒトの目のビオチン化ＯＡ１の定量化により、全ＯＡ１のうちの少なくとも３．５＋／−０．７％がｉｎ ｓｉｔｕでＲＰＥの頂端細胞表面に存在することが示された。眼杯調製物を使用したビオチン化試薬へのアクセスは頂端面に限定されており、上皮中のＯＡ１の極性は決定できない。さらに、基底細胞表面へのアクセスが欠如しているため、合計細胞表面ＯＡ１が過小評価されている可能性がある。細胞質タンパク質がビオチン化されなかったことを確認するため、ブロットを対照としてアクチンに対する抗体でプローブした。各実験で、アクチンは未結合の部分でのみ見つかった。
【０１３０】
組換えＯＡ１およびＯＡ１−ＧＦＰが、培養細胞のエンドソーム区画のみにほとんど排他的に局地化されていると報告したものもあった［１４，１５，１７，１８，２０−２２］。しかしながら、過剰発現された場合［１６］や、またはエンドサイトーシスを阻害した場合［１７］、ＯＡ１は細胞表面に蓄積する。ＯＡ１タンパク質がｉｎ ｓｉｔｕでＲＰＥの頂端面に存在するという知見は、この問題を我々にさらに検討するに至らしめた。
【０１３１】
ＯＡ１発現および分布に対するチロシンの影響
ＧＰＣＲのエンドソーム局在性は、通常リガンドへの接触後に生じる。したがって、受
容体のリガンドが、ＯＡ１の内在化を起こさせ得る標準インキュベーション培地に存在するか否かを調べた。標準培地は５００μＭチロシンを含み、チロシンは色素合成の出発物質であるため、受容体分布に対するチロシンの影響を評価した。チロシンが培養細胞中のＯＡ１分布に影響するか否かを調べるため、ＤＭＥＭをチロシンを含まずに調合し、透析したウシ胎仔血清を使用した。チロシンを含まない培地の存在下で、チロシンを含まない（図示しない）培地と低濃度のチロシン（１μＭ、図１Ｂ）を含む培地の両方で、培養ＲＰＥ細胞の原形質膜上でＯＡ１が検知された。５つの実験を平均し、合計ＯＡ１タンパク質の４．５＋／−１％が、１μＭチロシンに維持された培養ＲＰＥの表面で観察され、これはｉｎ ｓｉｔｕのＲＰＥで観察されたのと類似していた。すべての実験で、未結合タンパク質分画でアクチンが観察されたが、これは細胞表面アッセイに細胞質タンパク質が存在しないことを実証している。同様に、ＣＯＳで発現されたＯＡ１−ＧＦＰは、チロシン感受性の細胞表面発現を示した（図１Ｃ）。６つのかかる実験の定量化により、一過性トランスフェクションを使用して細胞表面に見出されるＯＡ１の量の重要な変化が示された。１μＭチロシンに維持されたトランスフェクト細胞の未結合分画のＯＡ１の範囲は５−４０％に及び、再現性があって約５％という内因性ＯＡ１タンパク質の結果とは異なる。
【０１３２】
トランスフェクト細胞のＯＡ１の分布が培地中のチロシンレベルに感受性であるのみならず、合計ＯＡ１−ＧＦＰの発現も１μＭで維持した細胞で５倍に増大した。この差が細胞数ではなくＯＡ１発現量に関連することを確認するために、アクチン発現をペアになったサンプルから評価した。光学濃度単位として示したデータ（図１Ｄ）は、アクチンに差がないことを示している。正常群と低チロシン群との間の細胞表面ＯＡ１の量も比較した。重要なことは、５つのＲＰＥ実験および６つのＣＯＳ中のＯＡ１−ＧＦＰ実験で、標準培地中の細胞の原形質膜部分のＯＡ１は、他の部分に見出されるのと同様に、再現可能に検出されなかった。
【０１３３】
ＲＰＥ細胞におけるＯＡ１の分布を、共焦顕微鏡法によっても評価した。ＯＡ１は、以前に示されたように培養ＲＰＥ細胞のエンドソームタンパク質であると特徴付けられたが（図１Ｅ）、対照的に、低チロシン培地中のＯＡ１の分布は培養ＲＰＥ細胞の原形質膜上で拡散し、エンドソーム蓄積はほとんどなく（図１Ｆ）、この知見は生化学法を使用して得られた結果と一致していた。
【０１３４】
ＯＡ１の天然アゴニストとしてのＬ−ＤＯＰＡ
メラニン形成におけるチロシナーゼの機能は、Ｌ−ＤＯＰＡを生成するようチロシンに作用することから始まり、これはその後ドーパキノンを作成する第２の反応を経て、色素形成に至る［２５］。チロシンとメラニンの間の中間体のうち、Ｌ−ＤＯＰＡは最も大きな半減期を有すると共に、メラニン合成が起こった場合にＬ−ＤＯＰＡはＲＰＥの頂端の網膜下の空間へ放出される［２３および２４］。Ｌ−ＤＯＰＡは、チロシンからドーパ作動性ニューロンにより生産された神経伝達物質であるドーパミンの前駆体でもある。細胞内貯蔵物からのカルシウムの放出はリガンドによるＧＰＣＲ活性化の一般的な下流の作用である。細胞表面でのＯＡ１の発現はチロシン感受性であるようであるため、チロシン、またはその代謝産物であるＬ−ＤＯＰＡおよびドーパミンが、ＯＡ１依存的に細胞質へのＣａ²⁺流入を刺激することが可能か否かを調べた。ＣＨＯ細胞にＯＡ１発現ベクターをトランスフェクトし、該ＣＨＯ細胞を１μＭチロシンを含ｍＤＭＥＭで４８時間維持し、その後チロシンを含まないＤＭＥＭで２４時間維持し、ＯＡ１の細胞表面発現を促進した。細胞内Ｃａ²⁺をＦｕｒａ−２を使用して評価し、［Ｃａ²⁺］ｉをレシオメトリックイメージングで決定した［２６］。リガンドが存在しない状態では、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞との間で［Ｃａ²⁺］ｉの有意差はなかった（図２）。チロシンおよびいくつかのチロシン代謝産物を、１μＭの濃度で、［Ｃａ²⁺］ｉに対する効果を試験した。陽性対照として、各実験を２０ｍＭ ＫＣｌでの処理により終了し、細胞を脱分極さ
せると共に電位型チャネルの活性化により［Ｃａ²⁺］ｉを増加させた。この方法は、Ｆｕｒａ−２装填および試験されている細胞の反応性を確認する役割を果たした（図２）。Ｌ−ＤＯＰＡだけが［Ｃａ²⁺］ｉの有意な増加を誘発した（図２Ａ）。チロシンとドーパミンは１ｍＭ（図示しない）まで細胞内［Ｃａ²⁺］ｉ濃度に陽性の効果がなかった。１μＭドーパミンのわずかに陰性の効果は、統計学的に有意ではなかったが、ドーパミンを用いた１１の実験で再現可能であった（図２Ｂ）。
【０１３５】
非天然細胞株におけるＧＰＣＲの過剰発現は、偽のシグナル伝達の結合につながり得る。Ｌ−ＤＯＰＡに応じたＯＡ１シグナル伝達が確かに天然の応答であったことを確認するために、ＯＡ１をＲＰＥ細胞で発現させた（図２Ｃ）。トランスフェクトＲＰＥ細胞を使用した結果は、トランスフェクトＣＨＯ細胞で達成された結果に類似していた。ＯＡ１を発現するようトランスフェクトされたＲＰＥ細胞は、［Ｃａ²⁺］ｉの増加に伴い１．０μＭ Ｌ−ＤＯＰＡに応答した。次に、内因性ＯＡ１受容体を発現しているＲＰＥ細胞が内因性レベルでＬ−ＤＯＰＡ反応を示すか否かを決定した。すべてのトランスフェクト細胞実験のように、ＯＡ１を発現するＲＰＥは、１．０μＭ Ｌ−ＤＯＰＡでの処理後に［Ｃａ²⁺］ｉの増加を示した（図２Ｃ）。
【０１３６】
ＯＡ１のシグナル伝達活性をさらに特徴づけるために、百日咳毒素を使用してＧｑ共役［Ｃａ²⁺］ｉシグナル伝達とＧｉリンクシグナル伝達（図２Ｃ）とを区別した。研究されたすべての細胞で、百日咳毒素は［Ｃａ²⁺］ｉの基準レベルを低下させ、これはＧｉサブユニット活性によるバックグラウンドシグナル伝達の阻害に対するその活性を示した。ＣＨＯとＲＰＥの両方を含むＯＡ１を発現するようトランスフェクトされた細胞ならびに天然レベルで内因性ＯＡ１タンパク質を発現するＲＰＥで行なわれた実験に、百日咳毒素を使用した。試験したすべてのトランスフェクト細胞で、Ｌ−ＤＯＰＡに対して測定した［Ｃａ²⁺］ｉ応答は毒素がない場合よりも大きく（図２）、この大部分は最初の［Ｃａ²⁺］ｉが低いことによる。したがって、［Ｃａ²⁺］ｉの増加が生じるＬ−ＤＯＰＡに応答したＯＡ１を介したシグナル伝達は、百日咳毒素感受性ではなく、Ｇｑサブユニット媒介性である可能性がある。ＯＡ１を発現するようトランスフェクトされたＣＨＯ細胞でのセカンドメッセンジャーｃＡＭＰも測定した（図２Ｄ）。不活性細胞または最大未満のホルスコリン処理を使用して、Ｌ−ＤＯＰＡに応じたｃＡＭＰの増加または減少のいずれかを測定するように実験を設定した。６回のかかる実験では、ｃＡＭＰの変化は観察されず、これはＧｓサブユニットもＧｉサブユニットもＯＡ１シグナル伝達に関与しないことを示唆している。
【０１３７】
放射性標識リガンド結合の標準的方法を使用して、ＯＡ１とＬ−ＤＯＰＡの間の相互作用を特徴付けた（図３Ａ）。ＣＨＯ細胞をＯＡ１を発現するようトランスフェクトし、次に、Ｌ−ＤＯＰＡの結合を濃度依存的に定量し、その結果をさらにScatchardプロット分
析で特徴付けた（図３Ｅ）。結果は、９．３５×１０^-6のＫｄのＯＡ１発現細胞へのＬ−ＤＯＰＡの飽和結合を示す。非トランスフェクトＣＨＯ細胞では特異的結合は観察されず、これは細胞が内因性Ｌ−ＤＯＰＡ受容体（図示しない）を有していないことを示している。すべての結合パラメータ、すなわち合計結合、特異的結合、および非特異的結合を、補助データ（図６Ａ）として示す。チロシンは、ＯＡ１と相互作用する可能性を示した。が、チロシンもドーパミンもＯＡ１シグナル伝達を刺激しなかった（図２参照）。競争リガンド結合を使用して、チロシンまたはドーパミンのいずれかがＯＡ１に結合するためにＬ−ＤＯＰＡと競争したか否かを判断した。高濃度（１ｍＭ）では、チロシンとドーパミンはいずれもＯＡ１との結合のためにＬ−ＤＯＰＡと競争した（図３Ｂ）。これをさらに特徴付けるために、Ｌ−ＤＯＰＡとドーパミン（図３Ｃ）またはチロシン（図６Ｂ）のうちの一方との間の競争の動力学を調べた。ドーパミンは、２．３３×１０^-6＋／−０．２×１０^-6ＭのＫｉのＬ−ＤＯＰＡとの単一部位への競争的結合を示した。チロシンによる同様の実験は、高濃度（図６Ｂ）でのみＬ−ＤＯＰＡ結合の阻害を実証した。チロシンは
高濃度でも親和性が低くおよび不溶性であるためにチロシンに関する飽和速度は不可能であった。
【０１３８】
Ｌ−ＤＯＰＡに対するＯＡ１の親和性が比較的低いことから、そのシグナル伝達活動がこの結合親和性の範囲で用量依存的であるかどうかを決定した。結合データをＬ−ＤＯＰＡとＯＡ１との関連で最も急激な上昇を示唆する濃度である１．０−１０μＭで試験し、結果を［Ｃａ²⁺］ｉにより測定された濃度依存的ＧＰＣＲ応答を示す（図３Ｃ）。このように、Ｌ−ＤＯＰＡおよびＯＡ１の活性化速度は、放射性標識リガンド結合実験で観察された濃度範囲と一致した。
【０１３９】
リガンド結合に応じて、ＧＰＣＲは、β−アレスチンを原形質膜へ動員し、これに続きリガンド受容体複合体が内在化した［２７−３３］。その後、β−アレスチン局在化に対するＬ−ＤＯＰＡの効果を試験した（図４）。細胞をＯＡ１を発現するようトランスフェクトし、次に１μＭチロシンのＤＭＥＭで４８時間培養し、それからタンパク質の細胞表面発現を可能にすべく分析を行った。その後、細胞を１μＭ Ｌ−ＤＯＰＡで処理し、氷冷メタノールで迅速に固定した。最初、アゴニストが存在しない休止状態では、ＯＡ１−ＧＦＰは細胞表面で見つかり、β−アレスチンは細胞質中に拡散し（図４Ａ−Ｃ）、タンパク質間の同時局在化はなかった。Ｌ−ＤＯＰＡでの刺激後、ＯＡ１およびβ−アレスチンは原形質膜に同時局在化した（図４ Ｄ−Ｆ）。非トランスフェクト細胞はＬ−ＤＯＰＡ処理に対する反応を示さず（図４Ｇ，Ｈ）、これはβ−アレスチン分布に対するＬ−ＤＯＰＡの効果が、［Ｃａ²⁺］ｉのついて得られた結果と同様に、ＯＡ１依存的であることを示している。
【０１４０】
ＰＥＤＦ分泌に対する１−ＤＯＰＡの効果
ＯＡ１の突然変異は、神経感覚網膜の発達の欠陥を引き起こす。以前の研究では、色素沈着ＲＰＥが非色素沈着ＲＰＥよりも有意に多くのＰＥＤＦを分泌すること［３４］、およびＰＥＤＦは神経感覚網膜の発達を変化させる可能性のある神経栄養因子である［３５−４１］ことが示された。ＯＡ１の突然変異は、ＲＰＥの色素沈着の喪失を引き起こすが、これはＯＡ１活性がＲＰＥの色素沈着を制御していることを示唆している。したがって、色素化ＲＰＥ細胞のＬ−ＤＯＰＡ刺激がＰＥＤＦの分泌の増加を引き起こすか否かを決定した（図５）。このアッセイは幾分困難であったが、その理由は色素沈着ＲＰＥ細胞はＬ−ＤＯＰＡを生産し、Ｌ−ＤＯＰＡはＯＡ１のアゴニストであるが、ＲＰＥの非色素沈着培養物ではＯＡ１は容易に検知できないためである。したがって、色素化ＲＰＥを使用して、Ｌ−ＤＯＰＡ刺激がＰＥＤＦ発現／分泌を増加させるか否かを決定した。ＲＰＥ細胞をチロシンを含まない培地に２４時間置き、次に１μＭ Ｌ−ＤＯＰＡで１時間処理した。処理後、細胞を外因性Ｌ−ＤＯＰＡを含まない標準培地に３日間戻した。対照細胞はＬ−ＤＯＰＡで処理しないが培地を同じ時間に交換し、実験細胞を通常の培地に戻したものである。３日後に馴化培地を収集し、ＰＥＤＦを測定した。結果は、ペアになった色素化ＲＰＥの対照単一層と比較すると、Ｌ−ＤＯＰＡで処理した色素化細胞ではＰＥＤＦ分泌が有意に増加することを示している（図５Ａ）。重要なことには、この有意な増加は、着色し、従ってＯＡ１を発現し、基本レベルのＰＥＤＦ発現をしていた細胞で起こった。
【０１４１】
チロシナーゼ活性およびＯＡ１シグナル伝達を伴う自己分泌ループを介して色素化ＲＰＥ細胞がＰＥＤＦを分泌するか否かを決定するために、特異的チロシナーゼ阻害剤であるフェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を使用して、色素沈着およびＬ−ＤＯＰＡ生産を阻害した（図５Ｂ）。これらの実験では、色素化ＲＰＥ細胞は、ＤＭＥＭで維持するか、または２００μＭ ＰＴＵを含むＤＭＥＭで３日間維持し、次にＰＥＤＦ分泌を測定した。色素化ＲＰＥはかなりのＰＥＤＦを分泌したが、ＰＴＵは、ＰＥＤＦ分泌の有意な減少を引き起こし、これは色素化ＲＰＥ細胞で観察される高レベルのＰＥＤＦ分泌にチロシナーゼ活性が必要であることを示している。ＰＥＤＦ分泌の減少を引き起こしたのがＰＴＵ処理細胞に
おけるＬ−ＤＯＰＡの欠如であることを確認するために、色素化ＲＰＥの３つの異なる培養物を使用して、４８時間ＰＴＵに曝露し、その後引き続きＰＴＵが存在する状態で１．０μＭ Ｌ−ＤＯＰＡで処理し、７２時間後にＰＥＤＦを測定した（図５Ｃ）。データはこの実験の対照に対する割合（パーセント）として示したが、その理由は、使用される培養物の色素沈着およびＰＥＤＦ発現が実験開始前に変化したためである。ＰＴＵ処理したＲＰＥは、ＰＥＤＦ分泌を増加させることにより添加Ｌ−ＤＯＰＡに応答したが、これはＰＥＤＦ分泌に対するＰＴＵの効果が、チロシナーゼが阻害された場合のＬ−ＤＯＰＡ生産の不足により引き起こされることを示している。
【０１４２】
考察：
ＲＰＥと神経感覚網膜の間には複雑な組織間関係がある。この関係の１態様は、ＲＰＥ色素沈着および重大な神経感覚網膜の変化を生じさせるメラニン合成の欠如［８、２３、４２］を基軸とする。データは、少なくとも１つの効き目のある神経栄養因子であるＰＥＤＦの分泌を規制するＬ−ＤＯＰＡを介して自己分泌ループにＯＡ１とチロシナーゼが関与していることを示唆している。データはまた、白皮症で起こる網膜の発達における病理学的変化がＯＡ１シグナル伝達経路の活性の変化に起因し得ることも示唆している。ＯＡ１シグナル伝達活性の減少は、ＯＡ１の突然変異により直接的に、またはチロシナーゼ活性によるＬ−ＤＯＰＡ生産の変化により間接的もたらされ得る。したがって、白皮症の種々の形式に伴う同様な網膜の発現型が一つの共通の経路であるＯＡ１シグナル伝達と調整され得ると仮定される。
【０１４３】
研究では、ｉｎ ｓｉｔｕでヒトＲＰＥの先端面にＯＡ１が観察された。以前の報告は、ＯＡ１がマウスではメラノソーム［２２］に、および培養細胞ではエンドソーム区画［１５−１８、２０−２２、４３］に局在化していることを示唆していた。ｉｎ ｓｉｔｕＲＰＥ調製物からの結果は、ＯＡ１がＲＰＥの頂端面に分布することを示している。ＲＰＥ（合計ＯＡ１の約３．５％）の表面のＯＡ１が限られた量であることは、免疫金電子顕微鏡法を使用した以前の研究におけるかかるＯＡ１タンパク質の観察が不十分であることを説明している可能性がある。多くの細胞表面ＧＰＣＲと同様、ＯＡ１は豊富なタンパク質ではない。
【０１４４】
培養細胞を使用した以前の研究で報告されたＯＡ１のエンドソーム局在は、内因性タンパク質および遺伝子組換えタンパク質の両方に対する本研究で再現された。通常の培地で試験した場合、細胞表面に検出可能なＯＡ１タンパク質はほとんど見あたらず、これは以前の研究と合致していた。しかしながら、培地でのチロシン減少により内因性および組換えＯＡ１タンパク質の両方の細胞表面受容体の蓄積が増大した。これは、培養細胞における細胞表面へのＯＡ１の分布がチロシン感受性であることを示唆している。以前の研究は、エンドサイトーシスが阻害され［１７］、ヒトＲＰＥの頂端面でＯＡ１が観察された時に、ＯＡ１が細胞表面に局在化され得ることを実証した。データは、ＯＡ１が細胞表面ＧＰＣＲであるが、チロシンまたはチロシンの代謝産物により刺激されてもよいエンドサイトーシスの標的でもあることを示唆している。この点で、本結果は、ＯＡ１を細胞内ＧＰＣＲの固有の種類として分類したＯＡ１局在化の過去の報告とは異なる。ほとんどのＧＰＣＲは種々の信号により内在化される細胞表面タンパク質であり、データはＯＡ１がほとんどの他のＧＰＣＲと類似していることを示唆している。
【０１４５】
ＯＡ１シグナル伝達活性はＬ−ＤＯＰＡにより刺激されるが、その前駆体であるチロシンによっても、そのニューロン代謝産物であるドーパミンでも刺激されない。この結果は、結局Ｌ−ＤＯＰＡとチロシンが一つの水酸基だけ異なるため、密接に関連する分子を識別することが可能である非常に感度の高い受容体の活性を示唆している。チロシンが培養細胞でのＯＡ１の細胞内局在化を引き起こすため、ＯＡ１はチロシン感受性である。しかしながら、チロシンに対するシグナル伝達応答がないことに注意すべきであり、競争結合
研究は、チロシンがＯＡ１に対して低い親和性を有することを示唆している。データは、正常な培地中に存在する高濃度のチロシンへの細胞を連続的に曝露すると、ＯＡ１の内在化に十分であるが、測定可能なＯＡ１活性化を生じさせる可能性は低いことを示唆している。Ｌ−ＤＯＰＡとドーパミンの間の競争的相互作用は一つの部位であるという強い証拠が見出された。ドーパミンに対して観察されたＫｉは、Ｌ−ＤＯＰＡに対して観察されたＫｄと類似しており、これは２つのチロシン代謝産物の親和性が類似していることを示唆している。結果は、ドーパミンからのＯＡ１シグナル伝達がわずかではあるが再生可能に減少していることを示し、ドーパミンがＯＡ１のための有能なアンタゴニストまたはインバースアゴニストであってもよいことを示唆している。
【０１４６】
オーファンＧＰＣＲとして、そのシグナル伝達経路が以前には同定されていない。本研究では、Ｌ−ＤＯＰＡに応じたＯＡ１シグナル伝達が［Ｃａ²⁺］ｉの増加を引き起こすことが例証された。データは、Ｌ−ＤＯＰＡに応答して観察された［Ｃａ²⁺］ｉの増大が百日咳毒素には無反応であり、ｃＡＭＰに対する効果は見出されず、ＯＡ１がＧｑサブユニットを介して恐らくシグナル伝達していることを示している。以前の研究は、ＯＡ１がＧ₀、ＧｉおよびＧｑサブユニットファミリーのメンバーを含むトランスフェクト細胞中の
多数のサブユニットと会合可能であることを示唆した。Innamoratiらは、過剰発現されたＯＡ１の自発的活性がＧｑサブユニットを介して示される可能性が高いことを示した［１６］。データは、ＲＰＥにおける内因性ＯＡ１からのリガンド依存性シグナル伝達が、Ｇｑを介して起こる可能性が最も高く、ＲＰＥ中で発現された天然ＯＡ１とＣＨＯおよびＲＰＥにおける過剰発現ＯＡ１とを比較すると乱雑な結合活性は観察されなかったことを示している。興味深いことに、Ｇｑサブユニットの２つの過剰活性変異型が、皮膚および髪の過剰色素沈着を引き起こす［４４］が、それらがＲＰＥに影響を及ぼすかどうかは不明である。ＲＰＥおよび皮膚のメラノサイトは、色素沈着を生じさせるのに同じ酵素を使用するが、メラニン形成の制御は異なっている。最近の報告は、ＯＡ１^-/-およびＧαｉ３^-/-の網膜発現型が同様であるため、ＯＡ１がＧαｉ３を介してシグナル伝達することを示唆している［４５］。この研究は、Ｇαｉ３とＯＡ１の間の相互作用またはシグナル伝達に関するデータを提供せず、結果はＧαｉ３を介したＯＡ１のシグナル伝達をサポートしていない。しかしながら、ＯＡ１とＧαｉ３はいずれも、網膜の発達の複合系のある部分を制御する、収束経路に活性を有し得る。
【０１４７】
Ｌ−ＤＯＰＡに対するＯＡ１の応答は、［Ｃａ²⁺］ｉの増加、原形質膜ＯＡ１へのβ−アレスチンの動員、およびＰＥＤＦ分泌の増加の３つの方法で測定した。さらに、色素化ＲＰＥにおけるチロシナーゼ活性の阻害はＬ−ＤＯＰＡ生産を抑制し、ＰＥＤＦ分泌の減少を生じさせる。まとめると、これらの研究は、Ｌ−ＤＯＰＡとＯＡ１の間の生産的なリガンド：受容体の関係に対する説得力のある論拠を提示している。さらにデータは、Ｌ−ＤＯＰＡのみがＯＡ１に対する生産的なリガンドであったため、チロシンとその代謝産物の間の選択性を示唆している。本願発明者は、ＯＡ１とＬ−ＤＯＰＡの間の結合反応速度を決定し、２者の間の典型的な一部位の受容体：リガンド関係を観察した。μＭの範囲のＫｄのＯＡ１とＬ−ＤＯＰＡの間の結合親和性は、内因性リガンド：受容体の関係では珍しくない。ＯＡ１に対する特異的で高親和性のアンタゴニストの将来の同定は、ＯＡ１とＬ−ＤＯＰＡの間の相互作用のさらなる生化学的特徴付けを支援し、ドーパミンがインバースアゴニストか否かを決定するのに役立つだろう。
【０１４８】
本研究は、メラニン合成の中間生成物であるＬ−ＤＯＰＡによる、オーファンＧＰＣＲであるＯＡ１の選択的な活性化を示した。本研究は、ＯＡ１活性が、ＲＰＥによる、正常な網膜の発達を支援する能力のある分子であるＰＥＤＦの分泌を刺激することも示した［４０および４１］。ヒトでは、これはＯＡ１活性化を介した薬理学的介入がメラニン生成機構（ＯＣＡ １−４）の欠損により引き起こされた白皮症に有用であり得ることを示唆している。不運にも、データはかかる薬理学的介入にＯＡ１が必要であり、Ｏａ１の突然
変異が白皮症の最も一般的な原因であることも示唆している。
方法：
細胞培養
ＲＰＥ− 細胞を［４６］に記載したように分離し、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変必須培地（ＤＭＥＭ）に維持した。チロシン濃度を低下させる実験では、JRH Biosciences社（カンザス州Lenexa所在）によりチロシンを含まないよ
うに特注製造したＤＭＥＭを使用した。透析ＦＢＳをInvitrogen社（カリフォルニア州San Diego所在）から購入した。
【０１４９】
ＣＯＳ−７およびＣＨＯ− 細胞はＡＴＣＣから入手し、５％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭで培養した。ＯＡ１分布の分析には、細胞を１μＭチロシンと５％ＦＢＳを補給したチロシンを含まないＤＭＥＭで２−４日間培養し、次に実験のために上記のチロシンを含まない培地で培養した。
細胞表面ビオチン化
ｉｎ ｓｉｔｕのヒトＲＰＥ 眼球赤道の約２ｍｍ前で切開し、前部を除去することによりヒト眼杯を作製した。硝子体および網膜を、その下にあるＲＰＥ単層を傷つけずに除去し、網膜を視神経頭で切断した。ＲＰＥが露出された得られた眼杯を反応緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ８．０）で３回リンスし、スルホ−Ｎ
ＨＳ−ＬＣビオチン（１ｍｇ／ｍｌ）を３０分間に２回入れた。反応はをＴＧ緩衝液（２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、ｐＨ８．３）で停止し、停止プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶解緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ トリトンＸおよび１％ トゥイーン２０、Ｔｒｉｓ塩基性塩類緩衝液）中で細胞を収集した。インタクトな細胞と色素顆粒を２０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離により除去した。ビオチン化されたタンパク質を、固定化ストレプトアビジンビーズで一晩捕獲し、次に４×還元緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ ６．８、８％ ＳＤＳ、４０％ グリセリン、２０％ β−メルカプトエタノール、０．０８％ ブロモフェノールブルー）と混合した。ＯＡ１タンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタンブロット解析用のポリクローナルウサギＯＡ１抗体を用いて同定した。ペアにしたウェスタンブロットを、アクチンに対するモノクローナル抗体でプローブした。
【０１５０】
培養細胞− ＲＰＥおよびトランスフェクト細胞を、実験に関して説明したチロシン濃度を含むＤＭＥＭに維持した。培養物を反応緩衝液で３回リンスし、次に、ｉｎ ｓｉｔｕ調製物のために上述したようにビオチン化した。
Ｏａ１のクローニング
ｃＤＮＡライブラリーを６人のヒトドナーの眼からプールされた組織から構築した。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬を使用して収集し、次にｃＤＮＡを、第１鎖の合成にポリチミジル酸プライマーを、第２鎖の合成にランダムヘキサマーを使用して合成した。ｃＤＮＡの合成に続いて、リボヌクレアーゼＡを使用してＲＮＡを除去した。ＯＡ１のコーディング配列を５’および３’末端への制限部位を加え、かつ天然停止コドンを除去した末端プライマーを使用してＰＣＲにより得た。ＰＣＲ生成物をｐＥＧＦＰ Ｎ−１ベクター（Clontech社）中にＧＦＰと共にフレーム内にライゲートした。配列は配列全体にわたり両方向で自動シーケンシングにより確認された。
免疫細胞化学
スライド上の細胞を室温にて３％ パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ トリトンＸ−１００の１０％ミルクＴＢＳＴ溶液でリンスし、次に１０％ミルクＴＢＳＴ溶液でブロッキングした。β−アレスチンをβ−アレスチンに対するポリクローナル抗体を使用して可視化し、４℃で一晩インキュベートした。５０％のグリセリンを使用してカバースリップを載せ、Compix Confocal Imaging Systemsソフトウェア（Simple PCI Version 4.0.6.1605）を搭載したNikon Eclipse E800 レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて光学切片
により免疫染色を分析した。ＯＡ１−ＧＦＰおよびβ−アレスチン分布の三次元分析はIm
age J 1.32で行なった。
［Ｃａ²⁺］ｉの測定
ガラスカバースリップ上に配置したＯＡ１−ＧＦＰを発現しているＣＨＯ細胞を、スリップする、Ｃａ²⁺含有ＨＥＰＥＳ干渉ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（ｐＨ７．４５）でリンスし、次に２．５μＭ Ｆｕｒａ−２（無水ジメチルスルホキシドおよび０．００２％ プルロン酸で可溶化）で２０分間、３７℃、５％ ＣＯ₂でインキュベートした
。Ｆｕｒａ−２で満たされた細胞をＨＢＳＳで１５分間、３７℃、５％ ＣＯ₂でインキ
ュベートし、染料をその活性型へ十分に開裂させた。各カバースリップを、４０×１．３５ ＮＡ 紫外線−蛍光対物レンズを備えた倒立型Olympus IX70顕微鏡のステージ上で３７℃に維持したチャンバに入れて１ｍｌのＨＢＳＳ中でインキュベートした。
【０１５１】
フィルタホイールを使用して、２００Ｗ Ｘｅ（キセノン）球からの励起光を３４０および３８０ｎｍのフィルタに交互に通過させた。中心が５１０ｎｍの１０ｎｍバンドパスフィルタを、ＣＣＤカメラに通過させる（Photometrics CH-250）放射蛍光のために選択
した。各実験に関し、画像の対を最初の３分間の間、毎分撮影し、これは安定した基準線を設定した。その後、Ｌ−ＤＯＰＡ（最終濃度１μＭ）を加え、画像の組を次の３分間の間、３０秒毎に撮影した。最後に、細胞にＦｕｒａ−２が装填されていることを確認するために、ＫＣｌ（最終濃度２０ｍＭ）を各実験の終了の１分前に陽性対照として加えた。同じ作業を、チロシンおよびドーパミン（いずれも最終濃度１μＭ）に対して独立して繰り返した。Silicon Graphics Personal IRISコンピュータを使用して、細胞内の各ピクセルについて３４０／３８０ｎｍ比を計算し、次にMicrosoft Excel version 4.0を使用し
て分析した（Microsoft社、ワシントン州Redmond所在）。一旦３４０／３８０ｎｍの比が決定されたら、各比を１（自身で割った時間０の比）で正規化し、遊離イオン濃度を以下の方程式を使用して計算した：
［Ｃａ_i］＃＝Ｋｄ＃^*（Ｒ-Ｒ_min＃）／Ｒ_max＃−Ｒ）
式中、Ｒ、Ｒ_min、およびＲ_maxはそれぞれ実測比、最小比および最大比である。Ｒ_max
は、完全に脱プロトン化した条件下でのイオン感受性波長の蛍光強度の比を表わし、Ｒ_minは完全にプロトン化した場合の染料の比である。Ｆｕｒａ−２の場合、ＲはＣａ²⁺が増
加するにつれて増加する。従って、Ｒ_minはＣａ²⁺（Ｃａ²⁺＜１ｎＭ）が存在しない状態
のＦｕｒａ−２を表わし、Ｒ_maxは以前に説明したＣａ²⁺−Ｆｕｒａ−２キレートを表す
［２６］。Ｒ_min、Ｒ_maxおよびＫｄをＦｕｒａ−２装填細胞で独立した実験にて決定し、続いて実験手順の遊離Ｃａ²⁺の計算のために利用した。
放射性標識リガンド結合
ＯＡ１−ＧＦＰを発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を２４ウェルプレートに播いた。細胞を−２℃まで冷却し、次に、冷やした結合緩衝液（２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５μＭ ジギトニン（ｐＨ ７．４５））でリンスした。細胞を、１０^-4Ｍ〜１０^-9Ｍの間の濃度の［³Ｈ］−Ｌ−ＤＯＰＡ（Moravek
Biochemicals社、カリフォルニア州Brea所在）を含む結合緩衝液中で２時間インキュベ
ートした。分析のどの工程でも、温度を−２℃を超えないようにした。対照は、非トランスフェクトＣＨＯに対して行った分析を含み、特異的結合を１０^-3Ｍの未標識の過剰Ｌ−ＤＯＰＡとの競争により決定した。結合したＬ−ＤＯＰＡをシンチレーション分光法で定量化された。
ｃＡＭＰの測定
細胞をホルスコリン（１５分）で前処理し、次に以前に説明したアッセイ設定を使用してＬ−ＤＯＰＡで攻撃した［４７］。リガンドへの曝露の１分後、細胞を氷冷緩衝液中にこすり落とし、ボイルし、遠心分離した。その後、それぞれ等量（５０μｌ）の上澄液および³Ｈ ｃＡＭＰ（New England Nuclear社）を合一して１００μｌ 冷ＰＫＡとした。２時間後、溶液を活性炭上に通過させ、上澄液をシンチレーション計数器で数える。結果を、５０μｌのｃＡＭＰ（０．２５−３２．０ｐｍｏｌｅ／５０μｌ）を使用して生成した、細胞質ゾルの代わりに標準曲線を使用して達成されたものと比較する。
実施例２：生体内のＯＡ１ループ機能
ＯＡ欠損マウスにおけるＰＥＤＦ分泌を野性型マウスと比較したところ、野生型マウスはＯＡ１−／ｙマウスよりも有意に多くのＰＥＤＦを分泌することが示された。使用される培地（Ｃ．Ｍ．）はＰＥＤＦを含み、ＯＡ１ −／ｙからのＣＭ中のＰＥＤＦは、ＲＰＥ由来ではなく使用される培地に由来する可能性が考えられる。結果（図７）を定量化し、グラフに要約する。両群のＣＭ中のバックグラウンドＰＥＤＦを用いても、差は有意である。ｔ検定分析結果を示す。
【０１５２】
チロシナーゼ欠損の妊娠マウスを、正常条件で（Ｌ−ＤＯＰＡは無し）または妊娠マウスの仔の胚７日目から該マウスの飲料水に１．０ｍｇ／ｍｌ Ｌ−ＤＯＰＡを補給して維持した。動物を、視覚の発達が終わり眼が開く出生後１４日目まで、Ｌ−ＤＯＰＡを補給して維持した。
【０１５３】
白皮症では２つの細胞の種類の数が減少している：網膜神経節細胞および光受容体。図８Ａは、Ｌ−ＤＯＰＡの補給が、正常な野性型マウスで予想されるものと比較して網膜神経節細胞数を増加させることを実証している。図８Ｂは、光受容体に関する同じ結果を示す。光受容体は密集しすぎているため、直接数えられない。逆に、光受容体の核により占められた領域を光受容体数の基準として測定する。Ｌ−ＤＯＰＡの補給により光受容体の核領域が増加し、光受容体の数も増加した。繰り返すが、これはアルビノ動物を標準レベルに戻したかのように見えた。
【０１５４】
図８Ｃに示されるように、４匹のペアになった同腹仔マウス、２匹の野生型、および２匹のＯＡ１ −／ｙ（雌、ＯＡ１欠損）を安楽死させ、各動物からの網膜をレーンに独立して載せ、次にタンパク質をウェスタンブロットしてＰＥＤＦを検出した。ＰＥＤＦは野生型マウス由来の網膜では容易に観察された。対照的にＰＥＤＦはＯＡ１−／ｙマウス由来の網膜では容易に検出されない。
【０１５５】
要約すると、このデータは、ＯＡ１−／ｙマウスが野性型マウスよりもＰＥＤＦを少なく生産することを示している。チロシナーゼ欠損マウスにおけるＬ−ＤＯＰＡ刺激は、白皮症の２つの最も顕著な神経感覚網膜欠陥である光受容細胞および網膜神経節細胞の損失を助ける。最後に、ＰＥＤＦレベルはＯＡ１欠損マウスの網膜では低下するため、ＯＡ１自己分泌ループがｉｎ ｖｉｖｏで機能し、経口Ｌ−ＤＯＰＡにより刺激可能であることが結論付けられる。
【０１５６】
データはまとめると、ＲＰＥ色素沈着とＡＭＤの間のつながり（リンケージ）が、ＯＡ１のシグナル伝達活性を介している可能性を示している。データは、ＯＡ１のリガンドがＬ−ＤＯＰＡであり、Ｌ−ＤＯＰＡから生じたＯＡ１シグナル伝達がＰＥＤＦの発現を制御することを示している。ＰＥＤＦはＲＰＥにより作製される最も効き目のある神経栄養因子である。したがって、ＰＥＤＦ発現を制御するＯＡ１のリガンドとしてのＬ−ＤＯＰＡの同定は、Ｌ−ＤＯＰＡとＲＰＥにおける神経組織栄養活性とを結びつける。Ｌ−ＤＯＰＡが色素形成の副産物として生産されるため、これは初めてＲＰＥ色素沈着と神経組織栄養活性との間のつながりを確立した。この系はＯＡ１自己分泌ループとして定義される。チロシナーゼは色素を形成し、Ｌ−ＤＯＰＡを放出する。放出されたＬ−ＤＯＰＡはＯＡ１に結合し、ＯＡ１を介したシグナル伝達を開始する。ＯＡ１シグナル伝達は、チロシナーゼとＰＥＤＦの両方の発現を制御する。
【０１５７】
これまで、データは上記モデルを生化学的に、培養細胞で、および生体内で例証している。食事のＬ−ＤＯＰＡを使用してアルビノ動物における網膜の発達を助けることが可能であるという事実は、ＲＰＥの栄養要因発現を生体内で刺激するのに食事のＬ−ＤＯＰＡが使用可能であることを示している。ＡＭＤは、色素沈着に幾分関連するＲＰＥ欠損と明
らかに関係している。青い目の個体は黒い目の個体よりはるかに大きな頻度でＡＭＤになり、したがってＲＰＥの色素沈着レベルはＡＭＤプロセスを制御する。ＲＰＥの色素沈着レベルはＯＡ１シグナル伝達により制御され、これは上述したのと同じＯＡ１自己分泌ループの一部である。したがって、ＡＭＤはＲＰＥにおけるＯＡ１シグナル伝達と関連付けられる。したがって、ＲＰＥの色素沈着がより低い者は、チロシナーゼがより低く、Ｌ−ＤＯＰＡがより低く、ＯＡ１がより低く、およびＰＥＤＦ生産がより低いだろう。本願発明者はＯＡ１のリガンドとして食事Ｌ−ＤＯＰＡまたは関連化合物を使用し、その活性を刺激することが可能である。神経感覚網膜の健康の最終決定因子はＰＥＤＦであるが、本願発明者はＯＡ１を使用して、ＯＡ１ループ活性を増加させると共に、ＲＰＥの神経組織栄養の活性を増加させることが可能である。ＯＡ１シグナル伝達の効果はニューロンの生存を促進するだろう。
【０１５８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療する方法であって、
ＡＭＤの治療に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストをＡＭＤ患者に投与することからなる方法。
【請求項２】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の進行を制限する方法であって、
ＡＭＤの進行の制限に有効な量のＯＡ１受容体のアゴニストをＡＭＤが進行する危険性のある患者に投与することからなる方法。
【請求項３】
ＯＡ１受容体のアゴニストはＬ−ＤＯＰＡおよびＬ−ＤＯＰＡ類似体からなるグループから選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＡ１受容体のアゴニストはＬ−ＤＯＰＡを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＡ１受容体のアゴニストはＬ−ＤＯＰＡプロドラッグを含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−ＤＯＰＡプロドラッグはＬ−ＤＯＰＡエステルを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−ＤＯＰＡプロドラッグはＬ−ＤＯＰＡの胆汁酸抱合体を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−ＤＯＰＡプロドラッグはジペプチドまたはトリペプチドのＬ−ＤＯＰＡ類似体を含む請求項５に記載に記載の方法。
【請求項９】
Ｌ−ＤＯＰＡプロドラッグはアミドＬ−ＤＯＰＡ類似体を含む請求項５に記載に記載の方法。
【請求項１０】
患者が６０歳以上である請求項１−９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法がＡＭＤを治療する方法であり、患者は滲出型ＡＭＤを有する請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法がＡＭＤを治療する方法であり、患者は萎縮型ＡＭＤを有する請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法がＡＭＤの進行を制限する方法であり、患者はドルーセン沈着物を有する請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
患者は白色人種である請求項１３に記載に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＭＤを治療する化合物を識別する方法であって、
細胞を試験化合物と接触させることからなり、該細胞は、
（ａ）ＯＡ１を発現している第１の細胞集団；および任意選択で
（ｂ）ＯＡ１を発現していない第２の細胞集団；を含み、
（ｃ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方を増大させる試験化合物を陽性試験化合物と識別し；
（ｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）発現および（Ｂ）第２の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現；
（ｉｉ）（Ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度および（Ｂ）第２の細胞集団における細胞内カルシウム濃度のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度；
陽性試験化合物は、ＡＭＤの治療およびＡＭＤの進行の制限のうちの少なくとも一方を行う候補化合物である、方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）は、
（ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）発現、および
（ｂ）第２の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現
のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団におけるＰＥＤＦ発現を増加させる試験化合物を陽性試験化合物であると識別することを含む請求項１５に記載に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）は、
（ａ）試験化合物と接触させない第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度、および
（ｂ）第２の細胞集団における細胞内カルシウム濃度
のうちの一方又は両方に対する、第１の細胞集団における細胞内カルシウム濃度を増加させる試験化合物を陽性試験化合物であると識別することを含む請求項１５に記載に記載の方法。
【請求項１８】
第１の細胞集団および第２の細胞集団は、マウス、ラット、ハムスターおよびヒト細胞からなるグループから選択される請求項１５−１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の細胞集団および第２の細胞集団は、網膜色素上皮細胞である請求項１５−１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
接触が０μｍ−１０μｍの間のチロシンの存在下で起こる請求項１５−１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
接触がチロシナーゼ阻害剤の存在下で起こる請求項１５−２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＭＤを治療する化合物を識別する方法であって、
（ａ）チロシナーゼ欠損の妊娠している雌の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程であって、試験化合物は胚の光受容体および網膜神経節のうちの少なくとも一方の発達中に投与される工程；および
（ｂ）胚または出生後の非ヒト哺乳動物における光受容体および網膜神経節のうちの少なくとも一方の発達に対する試験化合物の効果を、試験化合物を投与しなかった胚または出生後非ヒト哺乳動物における光受容体および網膜神経節のうちの少なくとも一方の発達と比較する工程であって、光受容体および網膜神経節のうちの少なくとも一方の発達を増加させる試験化合物が、ＡＭＤの治療およびＡＭＤの進行の制限のうちの少なくとも一方を行う候補化合物である工程；からなる方法。
【請求項２３】
試験化合物の投与を出生後に継続する工程をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物はマウスである請求項２２または２３に記載に記載の方法。
【請求項２５】
試験化合物の投与は、胚７日目と胚１２日目の間に開始される請求項２２−２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試験化合物の投与を生後１日目から生後１４日目まで出生後に継続することをさらに含む請求項２２−２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
測定される結果は、網膜ニューロンの数を測定することを含む請求項２２−２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
測定される結果は、網膜神経節細胞の数を測定することを含む請求項２２−２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
測定される結果は、光受容体の数を測定することを含む請求項２２−２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ビタミンＣ源、ビタミンＥ源、β−カロチン源、亜鉛源、および銅源の組み合わせを患者に投与することをさらに含む請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
４５０ｍｇから６００ｍｇの間のビタミンＣ；
４００ＩＵから５４０ＩＵの間のビタミンＥ；
１７．２ｍｇから２８ｍｇの間のβカロチン；
６８ｍｇから１００ｍｇの間の亜鉛；および
１．６ｍｇから２．４ｍｇの間の銅；
を投与することを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）ＡＭＤの進行を治療または制限するのに有効な量のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体；および
（ｂ）ビタミンＣ源、ビタミンＥ源、ビタミンＡ源、亜鉛源および銅源を含む、ＡＭＤの進行を治療または制限するのに有効な量の組成物；
を含む組成物。
【請求項３３】
５ｍｇから１５００ｍｇの間のＬ−ＤＯＰＡまたはＬ−ＤＯＰＡ類似体；
４５０ｍｇから６００ｍｇの間のビタミンＣ；
４００ＩＵから５４０ＩＵの間のビタミンＥ；
１７．２ｍｇから２８ｍｇの間のβカロチン；
６８ｍｇから１００ｍｇの間の亜鉛；および
少なくとも１．６ｍｇの銅；
を含む請求項３２に記載の組成物。

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図３Ｅ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【公表番号】特表２０１１−５２０７８８（Ｐ２０１１−５２０７８８Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０５２４０（Ｐ２０１１−５０５２４０）
【出願日】平成２１年４月１７日（２００９．４．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１０２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２９４９７
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５１０２７３７３２）アリゾナ　ボード　オブ　リージェンツ　ア　ボディー　コープ．オブ　ザ　ステイト　オブ　アリゾナ　アクティング　フォー　アンド　オン　ビハーフ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　アリゾナ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＩＺＯＮＡ　ＢＯＡＲＤ　ＯＦ　ＲＥＧＥＮＴＳ，Ａ　ＢＯＤＹ　ＣＯＲＰ．ＯＦ　ＴＨＥ　ＳＴＡＴＥ　ＯＦ　ＡＲＩＺＯＮＡ，ＡＣＴＩＮＧ　ＦＯＲ　ＡＮＤ　ＯＮ　ＢＥＨＡＬＦ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＡＲＩＺＯＮＡ
【Ｆターム（参考）】