動物の識別用プライマーセット、およびプライマーキット
【課題】 食品中の異物が由来する動物種を簡便かつ効率的に検出するためのプライマーセットを提供する。
【解決手段】 被験物に含まれる異物が由来する動物種の検出の為に、混合した状態でも良好にＰＣＲ反応が行われるようなプライマーセットを作製し用いることで、検出に必要なＰＣＲ反応の回数を減少させることが可能となる。また、それぞれのプライマーセットは、プライマーセットに含まれる全てのプライマー対が同じ条件でＰＣＲ反応を行うことが出来るように作製されているため、検出に必要なプライマー対のみを、異なるプライマーセットに含まれるプライマー対と同時にＰＣＲ反応を行うことが可能となり、さらに反応の回数を減少させることが可能となる。
【解決手段】 被験物に含まれる異物が由来する動物種の検出の為に、混合した状態でも良好にＰＣＲ反応が行われるようなプライマーセットを作製し用いることで、検出に必要なＰＣＲ反応の回数を減少させることが可能となる。また、それぞれのプライマーセットは、プライマーセットに含まれる全てのプライマー対が同じ条件でＰＣＲ反応を行うことが出来るように作製されているため、検出に必要なプライマー対のみを、異なるプライマーセットに含まれるプライマー対と同時にＰＣＲ反応を行うことが可能となり、さらに反応の回数を減少させることが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中に混在する動物由来の物質を試料とし、迅速かつ簡便に、由来となる動物種を検出する為のプライマーセットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品の安全性に対する要求の高まりから、食品混入異物における動物種の検出の需要が急増している。
近年、遺伝子工学の一つの手法であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が、食品や食品混入異物の由来となる動物種の検出の為に用いられている。ＰＣＲ法は、プライマーという２つの短いＤＮＡの断片を用いて、試料中に含まれる動物種由来のＤＮＡを鋳型とし、その特定の一部分を何十万倍にもコピーして増やす方法である。そのため、微量な試料に含まれるＤＮＡであっても高感度に検出が可能であり、また短時間で増幅させる技術であるために、簡便性、迅速性や正確性の点から食品中や飼料中の動物種の検出に応用できると期待されている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２３０３８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のＰＣＲ法を用いた検出方法は、食品混入異物における動物種の検出を行う場合、今まで報告されている既存のプライマー対がそれぞれのＰＣＲ反応の反応条件が異なっている為、同時にＰＣＲ反応を行うことが出来ず、サンプル数に依存してＰＣＲ反応を行う回数も増加するという問題点がある。
また、ＰＣＲ反応の回数を減らすために、単純に異なる動物種に対するプライマーを混合してＰＣＲ反応を行おうとしても、相互に結合してしまう可能性が高い。
【０００５】
そこで、本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討し、同じ条件でＰＣＲ反応が可能で、さらに他のプライマー対が同時に存在する状況においても、ＰＣＲ反応を良好に行うことが出来るプライマー対から成る、動物種を識別可能なプライマーセットを開発するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、核遺伝子と比較してコピー数の多いミトコンドリアゲノムに注目した。その中でも、ＤＮＡ配列情報が最も多いシトクロムｂ遺伝子を選択し、食品に混入した異物の同定の必要性が高い１２種類の哺乳動物のアライメントを基にプライマーを設計し、本発明を完成させた。
【０００７】
請求項１に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウシに特異的な下記の配列番号１と２のプライマー対、ブタに特異的な下記の配列番号３と４のプライマー対、及びトリに特異的な下記の配列番号５と６のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴ
配列番号２
ＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴ
配列番号３
ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧ
配列番号４
ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣ
配列番号５
ＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣ
配列番号６
ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣ
請求項１の動物種において、ウシとは「Bos taurus」種を示し、ブタとは「Sus scrofa」種を示し、トリとは「Gallus gallus」種を示している。
【０００８】
請求項２に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウマに特異的な下記の配列番号７と８のプライマー対、ヒツジに特異的な下記の配列番号９と１０のプライマー対、及びヤギに特異的な下記の配列番号１１と１２のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号７
ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＴＣ
配列番号９
ＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＧ
配列番号１０
ＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号１１
ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＡＧ
配列番号１２
ＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣ
請求項２の動物種において、ウマとは「Equus caballus」種を示し、ヒツジとは「Ovis aries」種を示し、ヤギとは「Capra hircus」種を示している。
【０００９】
請求項３に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウサギに特異的な下記の配列番号１３と１４のプライマー対、イヌに特異的な下記の配列番号１５と１６のプライマー対、ネコに特異的な下記の配列番号１７と１８のプライマー対、及びネコに特異的な下記の配列番号１７と２５のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１３
ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡ
配列番号１４
ＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ
配列番号１５
ＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＴＡＴＧ
配列番号１６
ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＣ
配列番号１７
ＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡ
配列番号１８
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＣＧ
配列番号２５
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＧＣＧ
請求項３の動物種において、ウサギとは「Oryctolagus cuniculus」種を示し、イヌとは「Canis familiaris」種を示し、ネコとは「Felis catus」種を示している。
【００１０】
請求項４に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ドブネズミに特異的な下記の配列番号１９と２０のプライマー対、クマネズミに特異的な下記の配列番号２１と２２のプライマー対、及びハツカネズミに特異的な下記の配列番号２３と２４のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１９
ＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧ
配列番号２０
ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣ
配列番号２１
ＧＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＡＧ
配列番号２２
ＧＡＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡ
配列番号２３
ＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡ
配列番号２４
ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡ
請求項４の動物種において、ドブネズミとは「Rattus norvegicus」種を示し、クマネズミとは「Rattus rattus」種を示し、ハツカネズミとは「Mus musuculus」種を示している。
【００１１】
請求項５に記載された発明は、請求項１に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第一プライマー対と、請求項２に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第二プライマー対と、請求項３に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第三プライマー対と、請求項４に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第四プライマー対とからなるプライマー対群の中から選択された少なくとも２つ以上のプライマー対によって構成された動物種の識別用プライマーキットである。
【発明の効果】
【００１２】
請求項１〜４のプライマーセットは、１つのプライマーセットに、相互に結合を生じない３種類の動物に対応するプライマーが含まれており、同一のチューブでＰＣＲ反応を同時に行うことが可能なため、検出に必要なＰＣＲ反応の回数を減少させることが可能となる。
また、１つのプライマーセットで合成されるＰＣＲ産物は、３種類の動物それぞれに対して異なる大きさに合成される為、試料中のＤＮＡがどの動物由来のものかを容易に推測できる。
さらに、請求項５のプライマーキットは、４つの異なるプライマーセットに含まれる全てのプライマーが同じ反応条件でＰＣＲ反応を行うことが出来るため、４つのプライマーセットを一度に同じＰＣＲのマシーンで反応させることが出来、さらに必要なＰＣＲ反応の回数を減らすことが出来る。
これらの特徴的効果により、食品や飲料等に混入した異物の正体を容易かつ迅速に判別出来るようになり、混入の原因や混入回避の手段の検討および開発を容易に行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のプライマーセット、およびプライマーキットと、それを用いた使用方法とは、下記の様な条件で実施されるのが好ましいが、決してこれに限定されるものではない。
【００１４】
（プライマー）
本発明のプライマーは、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行った後に、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることが出来る。
【００１５】
本発明中に示されたプライマー対は、それぞれの種の標的ＤＮＡの上流でセンス鎖（配列番号奇数）を、下流でアンチセンス鎖（配列番号偶数）を選んで構成されている。但し、ネコに対するプライマー対に関しては、ネコの種内の多型のため、配列番号１７はセンス鎖として、配列番号１８はアンチセンス鎖として、また配列番号２５はアンチセンス鎖として使用している。
それぞれの配列は、左端が５’側に相当し、右端が３’側に相当する。記号５’と３’はＤＮＡを構成する糖の炭素の位置を示す。また記号Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇは公知の塩基の種類を示す。
またさらに、本発明中に示された増幅サイズは、それぞれの種特異的プライマー対によって増幅されるＰＣＲ産物の長さのことであり、その単位ｂｐは塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）のことである。
【００１６】
（プライマーの使用量）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応に用いるプライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、最終濃度０．２〜０．５μＭで使用するのが好ましく、さらに０．２５〜０．４μＭで使用するのがより好ましい。
【００１７】
（ＤＮＡ抽出方法）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応に用いる食品混入異物からのＤＮＡの抽出は、公知の方法を採用することができる。例えば、このような方法としては、Ｍａｒｍｕｒ法、酵素法、塩化ベンジル法、ＣＴＡＢ法等が挙げられる。Ｐｒｅｐｍａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）のような、短時間で簡便にＤＮＡを粗抽出する市販キットを使用することも可能である。
また、加熱等の処理がされ、微量のＤＮＡしか含まれない動物毛などの被験異物からの効率的なＤＮＡの抽出には、プロテナーゼＫ等によるタンパク質分解酵素の使用が望ましく、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のような、ごく微量のＤＮＡを抽出・精製する市販キットを使用することも可能である。
【００１８】
（測定される試料）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応で測定される試料としては、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する試料、肥料、および飼料添加物などが挙げられる。
【００１９】
（ＰＣＲ)
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応において、ＰＣＲ装置としてはブロックタイプ又はキャピラリータイプの装置を使用できる。ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、検体毎に最適条件を定めればよいが、例えば本出願に係るプライマーセットを用いる場合、以下の条件が好ましい。
・二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性：９０℃から９８℃程度、好ましくは９２℃から９６℃程度で、１秒から１分程度、好ましくは３秒から３０秒程度加熱する。
・アニーリング：５０℃から７５℃程度、好ましくは５０℃から７０℃程度、さらに好ましくは、５５℃から６５℃程度で、１秒から１分３０秒程度、好ましくは５秒から３０秒程度加熱する。
・ＤＮＡ伸長反応：５０℃から７５℃程度、好ましくは７０℃から７４℃程度で、３秒から２分程度、好ましくは５秒から１分程度加熱する。
・反応液中のＭｇイオン濃度：通常１．０から３．５ｍＭ程度、好ましくは２．０から３．０ｍＭ程度である。
以上の反応を２５から４０サイクル程度行うことにより、目的のシトクロムｂの特定遺伝子領域を検出可能な程度にまで増幅することができる。
【００２０】
（ＤＮＡ検出工程）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応終了後の反応物の検出については、この増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド又はサイバーグリーン等で核酸染色を行うことによって可視化することができる。
（仮に、ＰＣＲ産物の量をサイバーグリーン等の蛍光検出を利用してモニタリング可能なＰＣＲ装置を用いる場合には、ＰＣＲ反応後に融解曲線分析を用いて、ＰＣＲ産物の融解温度によって目的増幅産物を検出することができる。）
【００２１】
本発明のＰＣＲ反応終了後に、アガロース電気泳動による目的バンドが検出された場合、又は融解曲線分析においてＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡの融解温度のピークが検出された場合、そのプライマー対が標的とする動物種のシトクロムｂ遺伝子が被験食品中に存在していたことが分かり、つまりは何の動物種由来の原料が存在していたかが明らかになる。
【００２２】
なお、本発明においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし得る（すなわち、特定の動物種を特異的に検出し得る）配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【実施例】
【００２３】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない
【００２４】
〈実施例１〉
実施例１は、ウシ、ブタ、及びトリの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＡという）を作製し、その特異性を調べた。
【００２５】
プライマーの作製
配列番号１〜６の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、６種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００２６】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００２７】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＡの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００２８】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って添加し、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＡを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００２９】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００３０】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ａ））。
【００３１】
図１（ａ）からは、プライマーセットＡに含まれるウシ、ブタ、及びトリに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００３２】
[複数の動物由来のＤＮＡが混在する場合におけるプライマーセットＡの使用方法]
ウシ、ブタ、トリの各ＤＮＡは、それぞれの市販の肉を細分化した後、８：１：１又は１：８：１、もしくは１：１：８の重量比で混合し、該混合肉から市販の動物組織からのトータルＤＮＡを精製するためのキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００３３】
上記精製したウシ、ブタ及びトリの混合ＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーについては、上記したように、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、プライマーセットＡに含まれる６種類のプライマーが、最終濃度がそれぞれ０．２５μＭになるように反応液に添加した。つまり、３種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００３４】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００３５】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図２）。
【００３６】
図２に示す様に、プライマーセットＡを用い、３種類のＤＮＡを混合した鋳型を基にＰＣＲ反応を行った場合においても、それぞれ３種の動物に対応するＰＣＲ反応を良好に実施可能であることが、電気泳動により出現した３本のバンドから確認できた。
また、標的とする動物種のＤＮＡ量が、添加された全体のＤＮＡにおいて極めて少ない割合の場合でも、ＰＣＲ反応は正常に行われ、添加された鋳型ＤＮＡの割合におおよそ相関するように、対応するバンドの濃さが変化していることが明らかになった。
つまり、プライマーセットＡは、動物種由来の異物の中に複数の動物種由来のＤＮＡが含まれていたとしても、検出可能なプライマーセットとして有用であることが確認された。
【００３７】
〈実施例２〉
実施例２は、ウマ、ヒツジ、及びヤギの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＢという）を作製し、その特異性を調べた。
【００３８】
プライマーの作製
配列番号７〜１２の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、６種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００３９】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００４０】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＢの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００４１】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＢを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００４２】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００４３】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｂ））。
【００４４】
図１（ｂ）からは、プライマーセットＢに含まれるウマ、ヒツジ、及びヤギに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００４５】
〈実施例３〉
実施例３は、ウサギ、イヌ、及びネコの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＣという）を作製し、その特異性を調べた。
【００４６】
プライマーの作製
配列番号１３〜１８、及び２５の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、７種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００４７】
プライマーセットの作製
上記７種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭ（配列番号１８と２５のみ、最終濃度が０．１２５μＭ）になるように混合したプライマーセットを得た。
【００４８】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＣの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００４９】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＣを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００５０】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００５１】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｃ））。
【００５２】
図１（ｃ）からは、プライマーセットＣに含まれるウサギ、イヌ、及びネコに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００５３】
〈実施例４〉
実施例４は、ドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＤという）を作製し、その特異性を調べた。
【００５４】
プライマーの作製
配列番号１９〜２４の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、ドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミに種特異的に増幅可能なプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００５５】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００５６】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＤの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００５７】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーについては、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＤを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００５８】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００５９】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色、続いて１０分間脱染を行った後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｄ））。
【００６０】
図１（ｄ）からは、プライマーセットＤに含まれるドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００６１】
〈実施例５〉
実施例５は、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤからなるプライマーキットＥを用いた同一条件でのＰＣＲ反応における特異性を調べた。
【００６２】
プライマーの作製
配列番号１〜２５の配列番号の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、２５種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００６３】
プライマーセットの作製
上記プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれに含まれる６種類（プライマーセットＣのみ７種類）のプライマーを使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭ（配列番号１８と２５のみ、最終濃度が０．１２５μＭ）になるように混合した各プライマーセットを作製した。
【００６４】
[プライマーセットＡ〜ＤからなるプライマーキットＥの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００６５】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤをそれぞれ添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが存在するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００６６】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００６７】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した。
【００６８】
その結果、プライマーキットＥ中の、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに含まれるプライマー対は、同じＰＣＲ反応条件において、プライマーキットＥが対象とする１２種類の各動物種に対して、標的とする動物種のシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。よって一台のＰＣＲマシーンで、複数の動物種の検出を一度に実施可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】動物特異的配列を有するプライマーセットを用いて、各動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応を行った後の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】ウシ、ブタ及びトリのＤＮＡが同一チューブに混在する場合における、プライマーセットＡによるＤＮＡ検出の結果を示す電気泳動写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中に混在する動物由来の物質を試料とし、迅速かつ簡便に、由来となる動物種を検出する為のプライマーセットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品の安全性に対する要求の高まりから、食品混入異物における動物種の検出の需要が急増している。
近年、遺伝子工学の一つの手法であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が、食品や食品混入異物の由来となる動物種の検出の為に用いられている。ＰＣＲ法は、プライマーという２つの短いＤＮＡの断片を用いて、試料中に含まれる動物種由来のＤＮＡを鋳型とし、その特定の一部分を何十万倍にもコピーして増やす方法である。そのため、微量な試料に含まれるＤＮＡであっても高感度に検出が可能であり、また短時間で増幅させる技術であるために、簡便性、迅速性や正確性の点から食品中や飼料中の動物種の検出に応用できると期待されている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２３０３８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のＰＣＲ法を用いた検出方法は、食品混入異物における動物種の検出を行う場合、今まで報告されている既存のプライマー対がそれぞれのＰＣＲ反応の反応条件が異なっている為、同時にＰＣＲ反応を行うことが出来ず、サンプル数に依存してＰＣＲ反応を行う回数も増加するという問題点がある。
また、ＰＣＲ反応の回数を減らすために、単純に異なる動物種に対するプライマーを混合してＰＣＲ反応を行おうとしても、相互に結合してしまう可能性が高い。
【０００５】
そこで、本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討し、同じ条件でＰＣＲ反応が可能で、さらに他のプライマー対が同時に存在する状況においても、ＰＣＲ反応を良好に行うことが出来るプライマー対から成る、動物種を識別可能なプライマーセットを開発するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、核遺伝子と比較してコピー数の多いミトコンドリアゲノムに注目した。その中でも、ＤＮＡ配列情報が最も多いシトクロムｂ遺伝子を選択し、食品に混入した異物の同定の必要性が高い１２種類の哺乳動物のアライメントを基にプライマーを設計し、本発明を完成させた。
【０００７】
請求項１に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウシに特異的な下記の配列番号１と２のプライマー対、ブタに特異的な下記の配列番号３と４のプライマー対、及びトリに特異的な下記の配列番号５と６のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴ
配列番号２
ＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴ
配列番号３
ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧ
配列番号４
ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣ
配列番号５
ＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣ
配列番号６
ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣ
請求項１の動物種において、ウシとは「Bos taurus」種を示し、ブタとは「Sus scrofa」種を示し、トリとは「Gallus gallus」種を示している。
【０００８】
請求項２に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウマに特異的な下記の配列番号７と８のプライマー対、ヒツジに特異的な下記の配列番号９と１０のプライマー対、及びヤギに特異的な下記の配列番号１１と１２のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号７
ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＴＣ
配列番号９
ＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＧ
配列番号１０
ＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号１１
ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＡＧ
配列番号１２
ＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣ
請求項２の動物種において、ウマとは「Equus caballus」種を示し、ヒツジとは「Ovis aries」種を示し、ヤギとは「Capra hircus」種を示している。
【０００９】
請求項３に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ウサギに特異的な下記の配列番号１３と１４のプライマー対、イヌに特異的な下記の配列番号１５と１６のプライマー対、ネコに特異的な下記の配列番号１７と１８のプライマー対、及びネコに特異的な下記の配列番号１７と２５のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１３
ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡ
配列番号１４
ＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ
配列番号１５
ＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＴＡＴＧ
配列番号１６
ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＣ
配列番号１７
ＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡ
配列番号１８
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＣＧ
配列番号２５
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＧＣＧ
請求項３の動物種において、ウサギとは「Oryctolagus cuniculus」種を示し、イヌとは「Canis familiaris」種を示し、ネコとは「Felis catus」種を示している。
【００１０】
請求項４に記載された発明は、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、ドブネズミに特異的な下記の配列番号１９と２０のプライマー対、クマネズミに特異的な下記の配列番号２１と２２のプライマー対、及びハツカネズミに特異的な下記の配列番号２３と２４のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセットである。
配列番号１９
ＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧ
配列番号２０
ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣ
配列番号２１
ＧＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＡＧ
配列番号２２
ＧＡＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡ
配列番号２３
ＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡ
配列番号２４
ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡ
請求項４の動物種において、ドブネズミとは「Rattus norvegicus」種を示し、クマネズミとは「Rattus rattus」種を示し、ハツカネズミとは「Mus musuculus」種を示している。
【００１１】
請求項５に記載された発明は、請求項１に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第一プライマー対と、請求項２に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第二プライマー対と、請求項３に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第三プライマー対と、請求項４に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第四プライマー対とからなるプライマー対群の中から選択された少なくとも２つ以上のプライマー対によって構成された動物種の識別用プライマーキットである。
【発明の効果】
【００１２】
請求項１〜４のプライマーセットは、１つのプライマーセットに、相互に結合を生じない３種類の動物に対応するプライマーが含まれており、同一のチューブでＰＣＲ反応を同時に行うことが可能なため、検出に必要なＰＣＲ反応の回数を減少させることが可能となる。
また、１つのプライマーセットで合成されるＰＣＲ産物は、３種類の動物それぞれに対して異なる大きさに合成される為、試料中のＤＮＡがどの動物由来のものかを容易に推測できる。
さらに、請求項５のプライマーキットは、４つの異なるプライマーセットに含まれる全てのプライマーが同じ反応条件でＰＣＲ反応を行うことが出来るため、４つのプライマーセットを一度に同じＰＣＲのマシーンで反応させることが出来、さらに必要なＰＣＲ反応の回数を減らすことが出来る。
これらの特徴的効果により、食品や飲料等に混入した異物の正体を容易かつ迅速に判別出来るようになり、混入の原因や混入回避の手段の検討および開発を容易に行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のプライマーセット、およびプライマーキットと、それを用いた使用方法とは、下記の様な条件で実施されるのが好ましいが、決してこれに限定されるものではない。
【００１４】
（プライマー）
本発明のプライマーは、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行った後に、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることが出来る。
【００１５】
本発明中に示されたプライマー対は、それぞれの種の標的ＤＮＡの上流でセンス鎖（配列番号奇数）を、下流でアンチセンス鎖（配列番号偶数）を選んで構成されている。但し、ネコに対するプライマー対に関しては、ネコの種内の多型のため、配列番号１７はセンス鎖として、配列番号１８はアンチセンス鎖として、また配列番号２５はアンチセンス鎖として使用している。
それぞれの配列は、左端が５’側に相当し、右端が３’側に相当する。記号５’と３’はＤＮＡを構成する糖の炭素の位置を示す。また記号Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇは公知の塩基の種類を示す。
またさらに、本発明中に示された増幅サイズは、それぞれの種特異的プライマー対によって増幅されるＰＣＲ産物の長さのことであり、その単位ｂｐは塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）のことである。
【００１６】
（プライマーの使用量）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応に用いるプライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、最終濃度０．２〜０．５μＭで使用するのが好ましく、さらに０．２５〜０．４μＭで使用するのがより好ましい。
【００１７】
（ＤＮＡ抽出方法）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応に用いる食品混入異物からのＤＮＡの抽出は、公知の方法を採用することができる。例えば、このような方法としては、Ｍａｒｍｕｒ法、酵素法、塩化ベンジル法、ＣＴＡＢ法等が挙げられる。Ｐｒｅｐｍａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）のような、短時間で簡便にＤＮＡを粗抽出する市販キットを使用することも可能である。
また、加熱等の処理がされ、微量のＤＮＡしか含まれない動物毛などの被験異物からの効率的なＤＮＡの抽出には、プロテナーゼＫ等によるタンパク質分解酵素の使用が望ましく、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のような、ごく微量のＤＮＡを抽出・精製する市販キットを使用することも可能である。
【００１８】
（測定される試料）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応で測定される試料としては、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する試料、肥料、および飼料添加物などが挙げられる。
【００１９】
（ＰＣＲ)
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応において、ＰＣＲ装置としてはブロックタイプ又はキャピラリータイプの装置を使用できる。ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、検体毎に最適条件を定めればよいが、例えば本出願に係るプライマーセットを用いる場合、以下の条件が好ましい。
・二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性：９０℃から９８℃程度、好ましくは９２℃から９６℃程度で、１秒から１分程度、好ましくは３秒から３０秒程度加熱する。
・アニーリング：５０℃から７５℃程度、好ましくは５０℃から７０℃程度、さらに好ましくは、５５℃から６５℃程度で、１秒から１分３０秒程度、好ましくは５秒から３０秒程度加熱する。
・ＤＮＡ伸長反応：５０℃から７５℃程度、好ましくは７０℃から７４℃程度で、３秒から２分程度、好ましくは５秒から１分程度加熱する。
・反応液中のＭｇイオン濃度：通常１．０から３．５ｍＭ程度、好ましくは２．０から３．０ｍＭ程度である。
以上の反応を２５から４０サイクル程度行うことにより、目的のシトクロムｂの特定遺伝子領域を検出可能な程度にまで増幅することができる。
【００２０】
（ＤＮＡ検出工程）
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応終了後の反応物の検出については、この増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド又はサイバーグリーン等で核酸染色を行うことによって可視化することができる。
（仮に、ＰＣＲ産物の量をサイバーグリーン等の蛍光検出を利用してモニタリング可能なＰＣＲ装置を用いる場合には、ＰＣＲ反応後に融解曲線分析を用いて、ＰＣＲ産物の融解温度によって目的増幅産物を検出することができる。）
【００２１】
本発明のＰＣＲ反応終了後に、アガロース電気泳動による目的バンドが検出された場合、又は融解曲線分析においてＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡの融解温度のピークが検出された場合、そのプライマー対が標的とする動物種のシトクロムｂ遺伝子が被験食品中に存在していたことが分かり、つまりは何の動物種由来の原料が存在していたかが明らかになる。
【００２２】
なお、本発明においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし得る（すなわち、特定の動物種を特異的に検出し得る）配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【実施例】
【００２３】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない
【００２４】
〈実施例１〉
実施例１は、ウシ、ブタ、及びトリの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＡという）を作製し、その特異性を調べた。
【００２５】
プライマーの作製
配列番号１〜６の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、６種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００２６】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００２７】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＡの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００２８】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って添加し、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＡを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００２９】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００３０】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ａ））。
【００３１】
図１（ａ）からは、プライマーセットＡに含まれるウシ、ブタ、及びトリに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００３２】
[複数の動物由来のＤＮＡが混在する場合におけるプライマーセットＡの使用方法]
ウシ、ブタ、トリの各ＤＮＡは、それぞれの市販の肉を細分化した後、８：１：１又は１：８：１、もしくは１：１：８の重量比で混合し、該混合肉から市販の動物組織からのトータルＤＮＡを精製するためのキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００３３】
上記精製したウシ、ブタ及びトリの混合ＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーについては、上記したように、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、プライマーセットＡに含まれる６種類のプライマーが、最終濃度がそれぞれ０．２５μＭになるように反応液に添加した。つまり、３種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００３４】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００３５】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図２）。
【００３６】
図２に示す様に、プライマーセットＡを用い、３種類のＤＮＡを混合した鋳型を基にＰＣＲ反応を行った場合においても、それぞれ３種の動物に対応するＰＣＲ反応を良好に実施可能であることが、電気泳動により出現した３本のバンドから確認できた。
また、標的とする動物種のＤＮＡ量が、添加された全体のＤＮＡにおいて極めて少ない割合の場合でも、ＰＣＲ反応は正常に行われ、添加された鋳型ＤＮＡの割合におおよそ相関するように、対応するバンドの濃さが変化していることが明らかになった。
つまり、プライマーセットＡは、動物種由来の異物の中に複数の動物種由来のＤＮＡが含まれていたとしても、検出可能なプライマーセットとして有用であることが確認された。
【００３７】
〈実施例２〉
実施例２は、ウマ、ヒツジ、及びヤギの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＢという）を作製し、その特異性を調べた。
【００３８】
プライマーの作製
配列番号７〜１２の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、６種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００３９】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００４０】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＢの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００４１】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＢを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００４２】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００４３】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｂ））。
【００４４】
図１（ｂ）からは、プライマーセットＢに含まれるウマ、ヒツジ、及びヤギに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００４５】
〈実施例３〉
実施例３は、ウサギ、イヌ、及びネコの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＣという）を作製し、その特異性を調べた。
【００４６】
プライマーの作製
配列番号１３〜１８、及び２５の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、７種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００４７】
プライマーセットの作製
上記７種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭ（配列番号１８と２５のみ、最終濃度が０．１２５μＭ）になるように混合したプライマーセットを得た。
【００４８】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＣの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００４９】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＣを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００５０】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００５１】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｃ））。
【００５２】
図１（ｃ）からは、プライマーセットＣに含まれるウサギ、イヌ、及びネコに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００５３】
〈実施例４〉
実施例４は、ドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミの種類を判別するためのプライマーセット（以下プライマーセットＤという）を作製し、その特異性を調べた。
【００５４】
プライマーの作製
配列番号１９〜２４の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、ドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミに種特異的に増幅可能なプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００５５】
プライマーセットの作製
上記６種類のプライマーを、使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭになるように混合したプライマーセットを得た。
【００５６】
[１種類のＤＮＡのみが存在する場合におけるプライマーセットＤの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００５７】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーについては、上記したように、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＤを添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが共存するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００５８】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００５９】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色、続いて１０分間脱染を行った後、UVランプ下でバンドを撮影した（図１（ｄ））。
【００６０】
図１（ｄ）からは、プライマーセットＤに含まれるドブネズミ、クマネズミ、及びハツカネズミに対するプライマーは、同じセットに含まれる他の動物種に対応するプライマーの存在下でも、標的とする動物種のみのシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。また、１つのプライマーセット内に含まれる３種類の動物由来のＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動での分離によって全て異なった場所に位置し、どの動物種由来のＤＮＡが増幅されたのかを容易に確認できることも明らかになった。
【００６１】
〈実施例５〉
実施例５は、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤからなるプライマーキットＥを用いた同一条件でのＰＣＲ反応における特異性を調べた。
【００６２】
プライマーの作製
配列番号１〜２５の配列番号の塩基配列を基に、フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し、次いでＯＰＣカラムにより精製することによって、２５種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは、使用直前まで−８０℃にて保管し、融解後直ちに使用するようにし、凍結融解は３回以上繰り返さないようにした。
【００６３】
プライマーセットの作製
上記プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれに含まれる６種類（プライマーセットＣのみ７種類）のプライマーを使用前に蒸留水にて溶解し、被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し、それぞれの最終濃度が０．２５μＭ（配列番号１８と２５のみ、最終濃度が０．１２５μＭ）になるように混合した各プライマーセットを作製した。
【００６４】
[プライマーセットＡ〜ＤからなるプライマーキットＥの使用方法]
ウシ、ブタ、トリ、ウマ、ヒツジの各ＤＮＡをそれぞれ市販の肉から、又、ドブネズミ、クマネズミ、ハツカネズミの各ＤＮＡをそれぞれ切断した尾の断片から、動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコの各ＤＮＡは、それぞれの体毛から、微量サンプルからのゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡを精製するキットであるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。コントロールとして用いたモルモットＤＮＡとヒトのＤＮＡは、それぞれ体毛及び頭毛から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００６５】
上記精製した動物１４種類のＤＮＡの濃度を測定し、滅菌水を加え、被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈する。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを、ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え、総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
プライマーの使用については、１４種類の動物の被験ＤＮＡ液をそれぞれ含む反応液に対し、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤをそれぞれ添加した。つまり、１種類の動物ＤＮＡに対し、１種類のプライマーセットが存在するＰＣＲ反応液に調整されている。
【００６６】
ＰＣＲ反応の条件としては、反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後、熱変性反応を９６℃で５秒、アニーリング反応を６０℃で５秒、ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い、以上の反応を４５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００６７】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により、１００V ４５分間電気泳動し、エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後、UVランプ下でバンドを撮影した。
【００６８】
その結果、プライマーキットＥ中の、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに含まれるプライマー対は、同じＰＣＲ反応条件において、プライマーキットＥが対象とする１２種類の各動物種に対して、標的とする動物種のシトクロムｂを特異的に増幅させることが分かった。よって一台のＰＣＲマシーンで、複数の動物種の検出を一度に実施可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】動物特異的配列を有するプライマーセットを用いて、各動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応を行った後の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】ウシ、ブタ及びトリのＤＮＡが同一チューブに混在する場合における、プライマーセットＡによるＤＮＡ検出の結果を示す電気泳動写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウシに特異的な下記の配列番号１と２のプライマー対、ブタに特異的な下記の配列番号３と４のプライマー対、及びトリに特異的な下記の配列番号５と６のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴ
配列番号２
ＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴ
配列番号３
ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧ
配列番号４
ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣ
配列番号５
ＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣ
配列番号６
ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣ
【請求項２】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウマに特異的な下記の配列番号７と８のプライマー対、ヒツジに特異的な下記の配列番号９と１０のプライマー対、及びヤギに特異的な下記の配列番号１１と１２のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号７
ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＴＣ
配列番号９
ＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＧ
配列番号１０
ＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号１１
ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＡＧ
配列番号１２
ＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣ
【請求項３】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウサギに特異的な下記の配列番号１３と１４のプライマー対、イヌに特異的な下記の配列番号１５と１６のプライマー対、ネコに特異的な下記の配列番号１７と１８のプライマー対、及びネコに特異的な下記の配列番号１７と２５のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１３
ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡ
配列番号１４
ＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ
配列番号１５
ＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＴＡＴＧ
配列番号１６
ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＣ
配列番号１７
ＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡ
配列番号１８
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＣＧ
配列番号２５
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＧＣＧ
【請求項４】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ドブネズミに特異的な下記の配列番号１９と２０のプライマー対、クマネズミに特異的な下記の配列番号２１と２２のプライマー対、及びハツカネズミに特異的な下記の配列番号２３と２４のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１９
ＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧ
配列番号２０
ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣ
配列番号２１
ＧＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＡＧ
配列番号２２
ＧＡＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡ
配列番号２３
ＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡ
配列番号２４
ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡ
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第一プライマー対と、請求項２に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第二プライマー対と、請求項３に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第三プライマー対と、請求項４に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第四プライマー対とからなるプライマー対群の中から選択された少なくとも２つ以上のプライマー対によって構成された動物種の識別用プライマーキット。
【請求項１】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウシに特異的な下記の配列番号１と２のプライマー対、ブタに特異的な下記の配列番号３と４のプライマー対、及びトリに特異的な下記の配列番号５と６のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴ
配列番号２
ＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴ
配列番号３
ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧ
配列番号４
ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣ
配列番号５
ＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣ
配列番号６
ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣ
【請求項２】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウマに特異的な下記の配列番号７と８のプライマー対、ヒツジに特異的な下記の配列番号９と１０のプライマー対、及びヤギに特異的な下記の配列番号１１と１２のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号７
ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＴＣ
配列番号９
ＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＧ
配列番号１０
ＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号１１
ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＡＧ
配列番号１２
ＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣ
【請求項３】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ウサギに特異的な下記の配列番号１３と１４のプライマー対、イヌに特異的な下記の配列番号１５と１６のプライマー対、ネコに特異的な下記の配列番号１７と１８のプライマー対、及びネコに特異的な下記の配列番号１７と２５のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１３
ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡ
配列番号１４
ＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ
配列番号１５
ＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＴＡＴＧ
配列番号１６
ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＡＣ
配列番号１７
ＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡ
配列番号１８
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＣＧ
配列番号２５
ＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＧＣＧ
【請求項４】
ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子配列に由来した動物に特異的な遺伝子配列を検出するためのプライマーセットであって、
ドブネズミに特異的な下記の配列番号１９と２０のプライマー対、クマネズミに特異的な下記の配列番号２１と２２のプライマー対、及びハツカネズミに特異的な下記の配列番号２３と２４のプライマー対から成る動物種の識別用プライマーセット。
配列番号１９
ＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧ
配列番号２０
ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣ
配列番号２１
ＧＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＡＴＡＧ
配列番号２２
ＧＡＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡ
配列番号２３
ＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡ
配列番号２４
ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡ
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第一プライマー対と、請求項２に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第二プライマー対と、請求項３に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第三プライマー対と、請求項４に記載のプライマーセットに含まれる少なくとも１つ以上の第四プライマー対とからなるプライマー対群の中から選択された少なくとも２つ以上のプライマー対によって構成された動物種の識別用プライマーキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−６５９３９（Ｐ２００９−６５９３９Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４００２３（Ｐ２００７−２４００２３）
【出願日】平成１９年９月１４日（２００７．９．１４）
【出願人】（０００１１６６２２）愛知県 (99)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１４日（２００７．９．１４）
【出願人】（０００１１６６２２）愛知県 (99)
【Ｆターム（参考）】
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