動脈硬化改善・予防効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法
【課題】被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供する。
【解決手段】動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における２９種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。
【解決手段】動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における２９種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化改善・予防効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標して、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する動脈硬化改善・予防効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる動脈硬化改善・予防効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態の総称である。動脈硬化にはいくつかの種類があるが、アテローム動脈硬化（粥状硬化）と呼ばれる病態が最も多くみられる。特に注記しない場合には、動脈硬化とはアテローム動脈硬化を指すことも多い。アテローム動脈硬化は、動脈内壁に粥状のプラーク（アテローム）が沈着して血流に支障をきたす状態であり、脳、心臓、腎臓、手足などに重篤な損傷をもたらすおそれがある。すなわち、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、腎不全、手足の壊死など、生命に直接かかわる症状につながるおそれがある。動脈硬化が起こる原因については、まだ完全には解明されていない部分もあるが、上記のように肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等が発症の危険因子とされている。
【０００４】
動脈硬化のような生活習慣病に属する疾病については、予防することの重要性が強調されている。すなわち、生活習慣病は徐々に進行するものが多く、発症初期には自覚症状があまりないことが多い。その結果、発見されたときにはすでに重篤な状態まで進んでいることがあり、予防の重要性が特に高い。このような背景の下、疾病の将来の発症リスクを検出することができるようなバイオマーカー、すなわち「予防マーカー」あるいは「リスクマーカー」と呼ばれるマーカー物質の探索が盛んに行われている。生活習慣病の予防マーカーを用いれば、例えば、当該疾病の将来の発症リスクを判定することが可能となり、事前に生活習慣の是正、食事制限、運動等の適切な処置を行って当該疾病の発症を予防することが可能となる。また、予防マーカーを用いることで、被検物質が当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有するか容易に調べることも可能となり、食品素材の機能性評価やスクリーニングにも有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、生活習慣病を容易に予防することが可能となる。
【０００５】
生活習慣病関連では、例えば特許文献１に糖尿病の予防マーカー、特許文献２に高脂血症の予防マーカーについての開示がある。ただし、これらは動脈硬化に特化したバイオマーカーではない。一方、動脈硬化に特化したバイオマーカーを探索する試みもあり、例えば特許文献３には炎症のバイオマーカーであるＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）が、特許文献４には腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が動脈硬化のバイオマーカーとしても使えるとの記載がある。しかしながら、ＣＲＰやＡＦＰについては動脈硬化とは全く異なる臨床的意義（炎症や発がん）が確立しており、動脈硬化のバイオマーカーとしては特異性の面で使いにくい。したがって、動脈硬化の将来の発症リスク診断や、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を可能にする新たなマーカー物質を特定することが望まれている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７３１９５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−０６４７４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５２５０５８号公報
【特許文献４】特開２００７−０１０５６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、動脈硬化の予防マーカーとなり得るマーカー物質を新たに特定し、該マーカー物質を用いて被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の２９種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１０】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約３３５０」、「約８４４０」、「約６６０００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約３３５０は概ね３３５０±０．２％、約８４４０は概ね８４４０±０．２％、約６６０００は概ね６６０００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍ０２）、（Ｍ０３）、（Ｍ０８）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１６）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、及び（Ｍ２９）の濃度はより低値を示し、（Ｍ０１）、（Ｍ０４）、（Ｍ０５）、（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ１１）、（Ｍ１２）、（Ｍ１３）、（Ｍ１４）、（Ｍ１５）、（Ｍ１７）、（Ｍ１８）、（Ｍ１９）、（Ｍ２０）、（Ｍ２１）、（Ｍ２４）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、（Ｍ２７）、及び（Ｍ２８）の濃度はより高値を示す。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００１２】
アポリポタンパク質Ａ２、血清アルブミン、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ３、トランスサイレチン、レチノール結合タンパク質、及びアポリポタンパク質Ａ１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によればマーカー物質（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１５）、（Ｍ１６）、（Ｍ２１）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、及び（Ｍ２７）の解析が容易である。
【００１３】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１４】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【００１５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属するマーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、血清アルブミン、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ３、トランスサイレチン、レチノール結合タンパク質、及びアポリポタンパク質Ａ１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属するマーカー物質は、いずれも主に血液中に存在する。
【００１６】
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１７】
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１８】
かかる構成により、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００１９】
請求項５に記載の発明は、前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。かかる構成により、動物の飼育が容易となり、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウス（以下、「アポＥ欠損マウス」と略記する。）が挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常の飼育でアテロームを形成し、動脈硬化発症モデル動物の標準として各分野で採用されているものである。
【００２１】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２２】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２３】
請求項７に記載の発明は、前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２４】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２５】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２６】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２７】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２８】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２９】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００３０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３１】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３２】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質および上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質および上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材の場合は、動脈硬化の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３３】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３５】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３６】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３７】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３９】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００４０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４３】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、動脈硬化の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ｍ０２）、（Ｍ０３）、（Ｍ０８）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１６）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、及び（Ｍ２９）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被検物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ｍ０１）、（Ｍ０４）、（Ｍ０５）、（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ１１）、（Ｍ１２）、（Ｍ１３）、（Ｍ１４）、（Ｍ１５）、（Ｍ１７）、（Ｍ１８）、（Ｍ１９）、（Ｍ２０）、（Ｍ２１）、（Ｍ２４）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、（Ｍ２７）、及び（Ｍ２８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被検物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
【００４４】
Ｎ末端アミノ酸解析の結果と質量／電荷比の情報から、マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２の断片と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン、マーカー物質（Ｍ０９）と（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１、マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３、マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ２５）と（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質、（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１と同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たす。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００４５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の他の様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【００４６】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４７】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４８】
例えば、血清アルブミン（配列番号６）のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）から５６５（Ａｌａ）の部分に相当するタンパク質断片（配列番号８）は「血清アルブミンの修飾体」に含まれる。
【００４９】
例えば、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ｃ１(配列番号１４）のＮ末端アミノ酸配列は「Ａｌａ−Ｐｒｏ」から始まるが、これら２つのアミノ酸は切断され得ることが報告されている（Oleg Chertov et al., Proteomics, Vol. 4, No. 4, 2004）。このようなＮ末端の２アミノ酸が欠損したアポリポタンパク質Ｃ１の断片（配列番号１５）は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
【００５０】
トランスサイレチン（配列番号３０）については、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。例えば、トランスサイレチンのＣｙｓ残基にスルホン基が付加した「Ｓ−スルホン化トランスサイレチン」や、グルタチオンが付加した「グルタチオン化トランスサイレチン」は、「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００５１】
レチノール結合タンパク質（配列番号３８）については、その一部のアミノ酸残基が欠損した数種類のタンパク質断片が血清中に見出されている。これらのタンパク質断片は「レチノール結合タンパク質の修飾体」に含まれる。
【００５２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質並びに（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５３】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被検物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５４】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物に、普通食又は被検物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５５】
さらに、基準値として、（４）動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被検物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。「動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アゼルニジピン等の降圧剤（カルシウム拮抗薬）が挙げられる。
【００５６】
「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、動脈硬化の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、アポＥ欠損マウスが挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常飼育で動脈硬化を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００５７】
なお、アポＥ欠損マウスを通常飼育するといずれ動脈硬化を発症するが、その発症は飼育２０週目ごろから検出可能となることが分かっている（例えば、Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology; 2004; 24; 1006-1014）。よって、飼育２０週目以前、例えば飼育１４週目のアポＥ欠損マウスは、動脈硬化の発症直前段階にあるといえる。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法で用いるマーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）及び（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属するマーカー物質は、飼育１４週目のアポＥ欠損マウスの体液中に存在し、動脈硬化の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてアポＥ欠損マウスを用いる場合には、例えば、飼育１４週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００５８】
一方、高コレステロール食を摂取するとアテローム形成するような動脈硬化自然発症モデル動物を用いることもできる。この場合には、例えば、被検物質とコレステロールとを同時摂取させることにより、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００５９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００６０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００６１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６２】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６３】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６４】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６５】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６７】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６８】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６９】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００７０】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７１】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７２】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７３】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７５】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
１．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験
動脈硬化発症モデル動物としてアポＥ欠損マウス（The Jackson Laboratory社）、正常動物としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（日本チャールス・リバー社。以下、単に「正常マウス」と略記する。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ−２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アゼルニジピンを０．００６％（３ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ−２（以下、単に「アゼルニジピン含有飼料」と略記する。）を採用した。アゼルニジピンとしては、カルブロック（登録商標、三共株式会社製）を採用した。
【００７８】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：アポＥ欠損マウスを通常飼料で飼育
第３群：アポＥ欠損マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
第４群：正常マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は動脈硬化を発症しない群、第２群は動脈硬化を発症する群、第３群は動脈硬化の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアゼルニジピンの作用検証用の群である。
【００７９】
アポＥ欠損マウスにおいて動脈硬化が発症し始める飼育期間である１４週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、動脈硬化の発症直前段階の体液試料が得られた。
【００８０】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８１】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として２９個の候補ピークを選抜した。
【００８２】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アゼルニジピン効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８３】
３．マーカー物質（Ｍ０１）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３５２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【００８４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３３５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８５】
４．マーカー物質（Ｍ０２）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４１７４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４１３であった。
【００８６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４１７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４１７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８７】
５．マーカー物質（Ｍ０３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４２８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０００９であった。
【００８８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４２８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４２８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８９】
６．マーカー物質（Ｍ０４）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４７５４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８６０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１２６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【００９０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４７５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４７５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９１】
７．マーカー物質（Ｍ０５）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が５１２６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１２６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２３３であった。
【００９２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５１３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５１３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９３】
８．マーカー物質（Ｍ０６）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が５２０３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【００９４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９５】
９．マーカー物質（Ｍ０７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００８２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９７】
１０．マーカー物質（Ｍ０８）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６１０３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４１であった。
【００９８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６１００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９９】
１１．マーカー物質（Ｍ０９）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が６８６１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１００】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６８６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６８６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０１】
１２．マーカー物質（Ｍ１０）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７００５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４１であった。
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１０））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１０）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０３】
１３．マーカー物質（Ｍ１１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０９５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０００２であった。
【０１０４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７１００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０５】
１４．マーカー物質（Ｍ１２）の特定
画分４（有機溶剤）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７５７２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００７、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１０６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７５７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７５７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０７】
１５．マーカー物質（Ｍ１３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８４３９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４９４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００１９であった。
【０１０８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８４４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８４４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０９】
１６．マーカー物質（Ｍ１４）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が８５３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【０１１０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１１】
１７．マーカー物質（Ｍ１５）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８７２３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００７、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８４であった。
【０１１２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１３】
１８．マーカー物質（Ｍ１６）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８８４０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４１３であった。
【０１１４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８８４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８８４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１５】
１９．マーカー物質（Ｍ１７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１００１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００３２であった。
【０１１６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１００００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１００００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１７】
２０．マーカー物質（Ｍ１８）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１０４５１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８４であった。
【０１１８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１０５００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１０５００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１９】
２１．マーカー物質（Ｍ１９）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１０７０４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１９、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００６５であった。
【０１２０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１０７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１０７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２１】
２２．マーカー物質（Ｍ２０）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が１１６６９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１２２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１１７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２０））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２０）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１１７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２３】
２３．マーカー物質（Ｍ２１）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７４２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１２４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２５】
２４．マーカー物質（Ｍ２２）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３９５８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００３２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１０２であった。
【０１２６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１４０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１４０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２７】
２５．マーカー物質（Ｍ２３）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１４１６７（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１９、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１２８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１４２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１４２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２９】
２６．マーカー物質（Ｍ２４）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２０４４１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【０１３０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２０４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２０４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３１】
２７．マーカー物質（Ｍ２５）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２０９０８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００６５であった。
【０１３２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２０９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２０９００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３３】
２８．マーカー物質（Ｍ２６）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２１３５３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１３４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３５】
２９．マーカー物質（Ｍ２７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２８１６１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１９１であった。
【０１３６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２８２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２８２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３７】
３０．マーカー物質（Ｍ２８）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が３４３９３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１５６であった。
【０１３８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３４４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３４４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３９】
３１．マーカー物質（Ｍ２９）の特定
画分４（有機溶剤）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６６０９０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００１９であった。
【０１４０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６６０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６６０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１４１】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、動脈硬化の発症の有無、又は将来の発症リスクを診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１４２】
マーカー物質（Ｍ０６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１４３】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）にて平衡化した。分取したピーク画分に対して等量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）を添加・混合し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、約１ｍＬずつ分取した。各画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、３〜５番目の画分に、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ０６）の質量／電荷比（平均値：５２０３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１４４】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３０）。図３０中、レーン１〜５はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５．２ｋＤａのバンド（図３０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３１の矢印）。
【０１４５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約５．２ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号１で表される１０アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列はマウスアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）の一部と完全一致していた。さらに、配列番号２のアミノ酸番号１５（Ｐｈｅ）〜６０（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片の予想される等電点が６．７７、分子量が５１９５であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２の断片と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号２のアミノ酸番号１５（Ｐｈｅ）〜６０（Ｌｅｕ）の部分のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【実施例３】
【０１４６】
マーカー物質（Ｍ０７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、３３．３％ ２−プロパノール／１６．７％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１４７】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）にて平衡化した。分取した画分の全量を平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出した。溶出した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０７）の質量／電荷比（平均値：６０２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１４８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３２）。図３２中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．０ｋＤａのバンド（図３２の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０７）の質量／電荷比（平均値：６０２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３３の矢印）。
【０１４９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８５０．８４」及び「１９８１．９９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４，５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血清アルブミン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報のマウス血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約６．０ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号７で表される１２アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列は血清アルブミン（配列番号６）のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）から５６５（Ａｌａ）の１２アミノ酸と完全一致していた。さらに、配列番号６のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）の部分に相当するタンパク質断片の予想される等電点が５．６５、分子量が６０１９であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミンの断片と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号６のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）の部分のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【実施例４】
【０１５２】
マーカー物質（Ｍ０９）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収し、さらに、
平衡化バッファーで溶出されたピーク画分を回収した。
【０１５３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３４）。図３４中、レーン１は回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．８ｋＤａのバンド（図３４の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ０９）の質量／電荷比（平均値：６８６１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３５の矢印）。
【０１５４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「７８１．４８」及び「１０４２．４０」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号９，１０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ｃ１のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
アポリポタンパク質Ｃ１については、Ｎ末端の２アミノ酸残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」（配列番号１５）が血清中に存在することが確認されている。本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは後述の実施例５と同じタンパク質（アポリポタンパク質Ｃ１）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ０９）はその電荷／質量比（平均値：６８６０）から、当該アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体（配列番号１５）であると考えられた。
【実施例５】
【０１５７】
マーカー物質（Ｍ１０）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収した。
【０１５８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３６）。図３６中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａのバンド（図３６の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１０）の質量／電荷比（平均値：７００５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３７のａ）。
【０１５９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」のペプチドはそれぞれ配列番号１１〜１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」（配列番号１４）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは実施例４と同じタンパク質（アポリポタンパク質Ｃ１）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ１０）はその電荷／質量比（平均値：７００５）から、アポリポタンパク質Ｃ１の全長と考えられた。
【０１６２】
なお、図３７に示すように、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析においてマーカー物質（Ｍ１０）よりも小さい質量（約６．８ｋＤａ）を示すピークも検出された（図３７のｂ）。これら２種のタンパク質は性質が非常に似ていること、並びに、質量の値の比較から、ピークｂのタンパク質は、実施例４で述べた、アポリポタンパク質Ｃ１（配列番号１４）のＮ末端の２アミノ酸（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」（配列番号１５）であると考えられた。アミノ酸配列から計算される質量は、ピークａが６９９３Ｄａ、ピークｂが６８２５Ｄａであった。
【実施例６】
【０１６３】
マーカー物質（Ｍ１５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（Innovative Research社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、５０％ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１６４】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３８）。図３８中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．７ｋＤａのバンド（図３８の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ１５）の質量／電荷比（平均値：８７２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３９の矢印）。
【０１６５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８３２．０１」及び「１１９３．６９」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１８３２．０１」と「１１９３．６９」のペプチドはそれぞれ配列番号１６，１７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１６６】
【表４】
【実施例７】
【０１６７】
マーカー物質（Ｍ１６）の精製と同定
実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約８．８ｋＤａのバンド（図３８の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ１６）の質量／電荷比（平均値：８８４０）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４０の矢印）。
【０１６８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１９８８．０８」、「１０６２．４８」、及び「２６２９．２６」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１８〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ３」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ｃ３のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【０１６９】
【表５】
【実施例８】
【０１７０】
マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ （１ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)でカラムを順次洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１７１】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４１）。図４１中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１４．０ｋＤａのバンド（図４１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の質量／電荷比（平均値：１３７４２，１３９５８，１４１６７）と同等の質量／電荷比を示す複数のピークを確認した（図４２）。
【０１７２】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１４．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「１５１０．７５」、「１３８２．６５」、「１５８７．７９」、「２４３８．２５」、「８６９．４６」、「１５５４．８５」、「２５１７．２８」、及び「２５９７．３８」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２２〜２９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第６表に示す。既報のマウストランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の各電荷／質量比（平均値：１３７４２，１３９５８，１４１６７）から、マーカー物質（Ｍ２１）は「Ｓ−スルホン化トランスサイレチン」、マーカー物質（Ｍ２２）は「グルタチオン化トランスサイレチン」とそれぞれ同定された。マーカー物質（Ｍ２３）はグルタチオン化トランスサイレチンにマトリクス（ＳＰＡ−Ｈ）が結合した複合体と考えられた。
【実施例９】
【０１７５】
マーカー物質（Ｍ２５）の精製と同定
実施例２と同様にして強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを充填したカラム（１ｍＬ)の平衡化、並びに、Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）の変性処理とフィルターろ過を行い、カラムにサンプルを添加した。非吸着画分を回収した。
【０１７６】
強陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）にて平衡化した。回収した非吸着画分を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で１０倍希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０），２００ｍＭ ＮａＣｌにてカラムを洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０），４００ｍＭ ＮａＣｌにて溶出した。ピーク画分を分取した。このピーク画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２５）の質量／電荷比（平均値：２０９０８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１７７】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４３）。図４３中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約２１．０ｋＤａのバンド（図４３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２５）の質量／電荷比（平均値：２０９０８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４４の矢印）。
【０１７８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１５５．６６」、「２４０７．３１」、「１５０１．８３」、「１２２６．６８」、「２７０５．２７」、「２０８０．０３」、及び「１３６０．７２」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１１５５．６６」、「２４０７．３１」、「１５０１．８３」、「１２２６．６８」、「２７０５．２７」、「２０８０．０３」、及び「１３６０．７２」のペプチドはそれぞれ配列番号３１〜３７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「レチノール結合タンパク質」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第７表に示す。既報のマウスレチノール結合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。
【０１７９】
【表７】
【０１８０】
レチノール結合タンパク質については、一部のアミノ酸残基が欠損した数種類の「レチノール結合タンパク質の修飾体」が血清中に存在することが確認されている。本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは後述の実施例９と同じタンパク質（レチノール結合タンパク質）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ２５）はその電荷／質量比（平均値：２０９０８）から、レチノール結合タンパク質の一部のアミノ酸残基が欠損した「レチノール結合タンパク質の修飾体」であると考えられた。
【実施例１０】
【０１８１】
マーカー物質（Ｍ２６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）３．０ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を３．７５ｍＬ加えて変性処理した。この変性処理サンプルに平衡化バッファー６．２５ｍＬを加えて希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収し、さらに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)で溶出されたピーク画分を回収した。
【０１８２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４５）。図４５中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約２１．４ｋＤａのバンド（図４５の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２６）の質量／電荷比（平均値：２１３５３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４６の矢印）。
【０１８３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．４ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１５５．６２」、「１４８５．７７」、「１２２６．６４」、「２０７９．９４」、及び「１３６０．６６」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号３９〜４３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「レチノール結合タンパク質」（配列番号３８）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第８表に示す。
【０１８４】
【表８】
【０１８５】
なお、本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは実施例９と同じタンパク質（レチノール結合タンパク質）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ２６）はその電荷／質量比（平均値：２１３５３）から、レチノール結合タンパク質の全長と考えられた。
【実施例１１】
【０１８６】
マーカー物質（Ｍ２７）の精製と同定
実施例１０で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約２８．０ｋＤａのバンド（図４５の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２７）の質量／電荷比（平均値：２８１６１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４７の矢印）。
【０１８７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２８．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも１２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８５２．５３」、「１３９４．０６」、「１２３６．８６」、「１５９６．３５」、「１３４０．０１」、「１０９８．７７」、「１３１７．９６」、「８２６．４７」、「１２９６．９０」、「１９９７．８０」、「１３３０．９３」、及び「１０３９．７１」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４４〜５５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第９表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ａ１のアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
【０１８８】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】質量／電荷比が３３５２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が４１４７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が４２８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が４７５４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が５１２６（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が５２０３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が６０２３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が６１０３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】質量／電荷比が６８６１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１０】質量／電荷比が７００５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１１】質量／電荷比が７０９５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１２】質量／電荷比が７５７２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１３】質量／電荷比が８４３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１４】質量／電荷比が８５３４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１５】質量／電荷比が８７２３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１６】質量／電荷比が８８４０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１７】質量／電荷比が１００１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１８】質量／電荷比が１０４５１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１９】質量／電荷比が１０７０４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２０】質量／電荷比が１１６６９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２１】質量／電荷比が１３７４２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２２】質量／電荷比が１３９５８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２３】質量／電荷比が１４１６７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２４】質量／電荷比が２０４４１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２５】質量／電荷比が２０９０８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２６】質量／電荷比が２１３５３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２７】質量／電荷比が２８１６１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２８】質量／電荷比が３４３９３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２９】質量／電荷比が６６０９０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３０】実施例２のマーカー物質（Ｍ０６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３１】実施例２のマーカー物質（Ｍ０６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３２】実施例３のマーカー物質（Ｍ０７）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３３】実施例３のマーカー物質（Ｍ０７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３４】実施例４のマーカー物質（Ｍ０９）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３５】実施例４のマーカー物質（Ｍ０９）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３６】実施例５のマーカー物質（Ｍ１０）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３７】実施例５のマーカー物質（Ｍ１０）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３８】実施例６のマーカー物質（Ｍ１５）並びに実施例７のマーカー物質（Ｍ１６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３９】実施例６のマーカー物質（Ｍ１５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４０】実施例７のマーカー物質（Ｍ１６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４１】実施例８のマーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４２】実施例８のマーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４３】実施例９のマーカー物質（Ｍ２５）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４４】実施例９のマーカー物質（Ｍ２５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４５】実施例１０のマーカー物質（Ｍ２６）並びに実施例１１のマーカー物質（Ｍ２７）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４６】実施例１０のマーカー物質（Ｍ２６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４７】実施例１１のマーカー物質（Ｍ２７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化改善・予防効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標して、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する動脈硬化改善・予防効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる動脈硬化改善・予防効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態の総称である。動脈硬化にはいくつかの種類があるが、アテローム動脈硬化（粥状硬化）と呼ばれる病態が最も多くみられる。特に注記しない場合には、動脈硬化とはアテローム動脈硬化を指すことも多い。アテローム動脈硬化は、動脈内壁に粥状のプラーク（アテローム）が沈着して血流に支障をきたす状態であり、脳、心臓、腎臓、手足などに重篤な損傷をもたらすおそれがある。すなわち、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、腎不全、手足の壊死など、生命に直接かかわる症状につながるおそれがある。動脈硬化が起こる原因については、まだ完全には解明されていない部分もあるが、上記のように肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等が発症の危険因子とされている。
【０００４】
動脈硬化のような生活習慣病に属する疾病については、予防することの重要性が強調されている。すなわち、生活習慣病は徐々に進行するものが多く、発症初期には自覚症状があまりないことが多い。その結果、発見されたときにはすでに重篤な状態まで進んでいることがあり、予防の重要性が特に高い。このような背景の下、疾病の将来の発症リスクを検出することができるようなバイオマーカー、すなわち「予防マーカー」あるいは「リスクマーカー」と呼ばれるマーカー物質の探索が盛んに行われている。生活習慣病の予防マーカーを用いれば、例えば、当該疾病の将来の発症リスクを判定することが可能となり、事前に生活習慣の是正、食事制限、運動等の適切な処置を行って当該疾病の発症を予防することが可能となる。また、予防マーカーを用いることで、被検物質が当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有するか容易に調べることも可能となり、食品素材の機能性評価やスクリーニングにも有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、生活習慣病を容易に予防することが可能となる。
【０００５】
生活習慣病関連では、例えば特許文献１に糖尿病の予防マーカー、特許文献２に高脂血症の予防マーカーについての開示がある。ただし、これらは動脈硬化に特化したバイオマーカーではない。一方、動脈硬化に特化したバイオマーカーを探索する試みもあり、例えば特許文献３には炎症のバイオマーカーであるＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）が、特許文献４には腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が動脈硬化のバイオマーカーとしても使えるとの記載がある。しかしながら、ＣＲＰやＡＦＰについては動脈硬化とは全く異なる臨床的意義（炎症や発がん）が確立しており、動脈硬化のバイオマーカーとしては特異性の面で使いにくい。したがって、動脈硬化の将来の発症リスク診断や、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を可能にする新たなマーカー物質を特定することが望まれている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７３１９５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−０６４７４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５２５０５８号公報
【特許文献４】特開２００７−０１０５６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、動脈硬化の予防マーカーとなり得るマーカー物質を新たに特定し、該マーカー物質を用いて被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の２９種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１０】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約３３５０」、「約８４４０」、「約６６０００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約３３５０は概ね３３５０±０．２％、約８４４０は概ね８４４０±０．２％、約６６０００は概ね６６０００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍ０２）、（Ｍ０３）、（Ｍ０８）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１６）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、及び（Ｍ２９）の濃度はより低値を示し、（Ｍ０１）、（Ｍ０４）、（Ｍ０５）、（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ１１）、（Ｍ１２）、（Ｍ１３）、（Ｍ１４）、（Ｍ１５）、（Ｍ１７）、（Ｍ１８）、（Ｍ１９）、（Ｍ２０）、（Ｍ２１）、（Ｍ２４）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、（Ｍ２７）、及び（Ｍ２８）の濃度はより高値を示す。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００１２】
アポリポタンパク質Ａ２、血清アルブミン、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ３、トランスサイレチン、レチノール結合タンパク質、及びアポリポタンパク質Ａ１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によればマーカー物質（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１５）、（Ｍ１６）、（Ｍ２１）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、及び（Ｍ２７）の解析が容易である。
【００１３】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１４】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【００１５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属するマーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、血清アルブミン、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ３、トランスサイレチン、レチノール結合タンパク質、及びアポリポタンパク質Ａ１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属するマーカー物質は、いずれも主に血液中に存在する。
【００１６】
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１７】
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１８】
かかる構成により、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００１９】
請求項５に記載の発明は、前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。かかる構成により、動物の飼育が容易となり、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウス（以下、「アポＥ欠損マウス」と略記する。）が挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常の飼育でアテロームを形成し、動脈硬化発症モデル動物の標準として各分野で採用されているものである。
【００２１】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２２】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２３】
請求項７に記載の発明は、前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２４】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２５】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２６】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２７】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２８】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２９】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００３０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３１】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３２】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質および上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質および上記（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材の場合は、動脈硬化の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３３】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３５】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３６】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３７】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３９】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００４０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４３】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、動脈硬化の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ｍ０２）、（Ｍ０３）、（Ｍ０８）、（Ｍ０９）、（Ｍ１０）、（Ｍ１６）、（Ｍ２２）、（Ｍ２３）、及び（Ｍ２９）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被検物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ｍ０１）、（Ｍ０４）、（Ｍ０５）、（Ｍ０６）、（Ｍ０７）、（Ｍ１１）、（Ｍ１２）、（Ｍ１３）、（Ｍ１４）、（Ｍ１５）、（Ｍ１７）、（Ｍ１８）、（Ｍ１９）、（Ｍ２０）、（Ｍ２１）、（Ｍ２４）、（Ｍ２５）、（Ｍ２６）、（Ｍ２７）、及び（Ｍ２８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被検物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
【００４４】
Ｎ末端アミノ酸解析の結果と質量／電荷比の情報から、マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２の断片と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン、マーカー物質（Ｍ０９）と（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１、マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３、マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ２５）と（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質、（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１と同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たす。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００４５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の他の様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【００４６】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４７】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４８】
例えば、血清アルブミン（配列番号６）のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）から５６５（Ａｌａ）の部分に相当するタンパク質断片（配列番号８）は「血清アルブミンの修飾体」に含まれる。
【００４９】
例えば、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ｃ１(配列番号１４）のＮ末端アミノ酸配列は「Ａｌａ−Ｐｒｏ」から始まるが、これら２つのアミノ酸は切断され得ることが報告されている（Oleg Chertov et al., Proteomics, Vol. 4, No. 4, 2004）。このようなＮ末端の２アミノ酸が欠損したアポリポタンパク質Ｃ１の断片（配列番号１５）は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
【００５０】
トランスサイレチン（配列番号３０）については、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。例えば、トランスサイレチンのＣｙｓ残基にスルホン基が付加した「Ｓ−スルホン化トランスサイレチン」や、グルタチオンが付加した「グルタチオン化トランスサイレチン」は、「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００５１】
レチノール結合タンパク質（配列番号３８）については、その一部のアミノ酸残基が欠損した数種類のタンパク質断片が血清中に見出されている。これらのタンパク質断片は「レチノール結合タンパク質の修飾体」に含まれる。
【００５２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の各マーカー物質並びに（Ｎ１）〜（Ｎ７）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５３】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被検物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５４】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物に、普通食又は被検物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５５】
さらに、基準値として、（４）動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被検物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被検物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。「動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アゼルニジピン等の降圧剤（カルシウム拮抗薬）が挙げられる。
【００５６】
「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、動脈硬化の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、アポＥ欠損マウスが挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常飼育で動脈硬化を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００５７】
なお、アポＥ欠損マウスを通常飼育するといずれ動脈硬化を発症するが、その発症は飼育２０週目ごろから検出可能となることが分かっている（例えば、Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology; 2004; 24; 1006-1014）。よって、飼育２０週目以前、例えば飼育１４週目のアポＥ欠損マウスは、動脈硬化の発症直前段階にあるといえる。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法で用いるマーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）及び（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属するマーカー物質は、飼育１４週目のアポＥ欠損マウスの体液中に存在し、動脈硬化の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてアポＥ欠損マウスを用いる場合には、例えば、飼育１４週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００５８】
一方、高コレステロール食を摂取するとアテローム形成するような動脈硬化自然発症モデル動物を用いることもできる。この場合には、例えば、被検物質とコレステロールとを同時摂取させることにより、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００５９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００６０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００６１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６２】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６３】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６４】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６５】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６７】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６８】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６９】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００７０】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７１】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７２】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７３】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７５】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
１．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験
動脈硬化発症モデル動物としてアポＥ欠損マウス（The Jackson Laboratory社）、正常動物としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（日本チャールス・リバー社。以下、単に「正常マウス」と略記する。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ−２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アゼルニジピンを０．００６％（３ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ−２（以下、単に「アゼルニジピン含有飼料」と略記する。）を採用した。アゼルニジピンとしては、カルブロック（登録商標、三共株式会社製）を採用した。
【００７８】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：アポＥ欠損マウスを通常飼料で飼育
第３群：アポＥ欠損マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
第４群：正常マウスをアゼルニジピン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は動脈硬化を発症しない群、第２群は動脈硬化を発症する群、第３群は動脈硬化の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアゼルニジピンの作用検証用の群である。
【００７９】
アポＥ欠損マウスにおいて動脈硬化が発症し始める飼育期間である１４週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、動脈硬化の発症直前段階の体液試料が得られた。
【００８０】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８１】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として２９個の候補ピークを選抜した。
【００８２】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アゼルニジピン効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８３】
３．マーカー物質（Ｍ０１）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３５２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【００８４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３３５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８５】
４．マーカー物質（Ｍ０２）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４１７４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４１３であった。
【００８６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４１７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４１７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８７】
５．マーカー物質（Ｍ０３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４２８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０００９であった。
【００８８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４２８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４２８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８９】
６．マーカー物質（Ｍ０４）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４７５４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８６０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１２６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【００９０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４７５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４７５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９１】
７．マーカー物質（Ｍ０５）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が５１２６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１２６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２３３であった。
【００９２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５１３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５１３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９３】
８．マーカー物質（Ｍ０６）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が５２０３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【００９４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９５】
９．マーカー物質（Ｍ０７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００８２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９７】
１０．マーカー物質（Ｍ０８）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６１０３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４１であった。
【００９８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６１００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９９】
１１．マーカー物質（Ｍ０９）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が６８６１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１００】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６８６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ０９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ０９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６８６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０１】
１２．マーカー物質（Ｍ１０）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７００５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４１であった。
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１０））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１０）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０３】
１３．マーカー物質（Ｍ１１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０９５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０００２であった。
【０１０４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７１００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０５】
１４．マーカー物質（Ｍ１２）の特定
画分４（有機溶剤）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７５７２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００７、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１０６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７５７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７５７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０７】
１５．マーカー物質（Ｍ１３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８４３９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４９４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００１９であった。
【０１０８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８４４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８４４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０９】
１６．マーカー物質（Ｍ１４）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が８５３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【０１１０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８５３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１１】
１７．マーカー物質（Ｍ１５）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８７２３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００７、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８４であった。
【０１１２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８７２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１３】
１８．マーカー物質（Ｍ１６）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８８４０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４１３であった。
【０１１４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８８４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８８４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１５】
１９．マーカー物質（Ｍ１７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１００１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００３２であった。
【０１１６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１００００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１００００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１７】
２０．マーカー物質（Ｍ１８）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１０４５１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８４であった。
【０１１８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１０５００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１０５００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１９】
２１．マーカー物質（Ｍ１９）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１０７０４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１９、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００６５であった。
【０１２０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１０７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１０７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２１】
２２．マーカー物質（Ｍ２０）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が１１６６９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１２２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１１７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２０））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２０）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１１７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２３】
２３．マーカー物質（Ｍ２１）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７４２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１２４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２１）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２５】
２４．マーカー物質（Ｍ２２）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３９５８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００３２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１０２であった。
【０１２６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１４０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２２）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１４０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２７】
２５．マーカー物質（Ｍ２３）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１４１６７（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１９、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００８２であった。
【０１２８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１４２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２３）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１４２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１２９】
２６．マーカー物質（Ｍ２４）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２０４４１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４３であった。
【０１３０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２０４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２４）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２０４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３１】
２７．マーカー物質（Ｍ２５）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２０９０８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００６５であった。
【０１３２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２０９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２５）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２０９００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３３】
２８．マーカー物質（Ｍ２６）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２１３５３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９４０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４９４であった。
【０１３４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２６）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３５】
２９．マーカー物質（Ｍ２７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２８１６１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１９１であった。
【０１３６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２８２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２７）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２８２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３７】
３０．マーカー物質（Ｍ２８）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が３４３９３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１５、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１５６であった。
【０１３８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３４４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２８）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３４４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１３９】
３１．マーカー物質（Ｍ２９）の特定
画分４（有機溶剤）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６６０９０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９００、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００１２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００１９であった。
【０１４０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６６０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被検物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２９）の濃度を指標として、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６６０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１４１】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、動脈硬化の発症の有無、又は将来の発症リスクを診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１４２】
マーカー物質（Ｍ０６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１４３】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）にて平衡化した。分取したピーク画分に対して等量の５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）を添加・混合し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、約１ｍＬずつ分取した。各画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、３〜５番目の画分に、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ０６）の質量／電荷比（平均値：５２０３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１４４】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３０）。図３０中、レーン１〜５はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５．２ｋＤａのバンド（図３０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３１の矢印）。
【０１４５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約５．２ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号１で表される１０アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列はマウスアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）の一部と完全一致していた。さらに、配列番号２のアミノ酸番号１５（Ｐｈｅ）〜６０（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片の予想される等電点が６．７７、分子量が５１９５であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２の断片と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号２のアミノ酸番号１５（Ｐｈｅ）〜６０（Ｌｅｕ）の部分のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【実施例３】
【０１４６】
マーカー物質（Ｍ０７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、３３．３％ ２−プロパノール／１６．７％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１４７】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）にて平衡化した。分取した画分の全量を平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出した。溶出した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０７）の質量／電荷比（平均値：６０２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１４８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３２）。図３２中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．０ｋＤａのバンド（図３２の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ０７）の質量／電荷比（平均値：６０２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３３の矢印）。
【０１４９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８５０．８４」及び「１９８１．９９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４，５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血清アルブミン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報のマウス血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約６．０ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号７で表される１２アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列は血清アルブミン（配列番号６）のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）から５６５（Ａｌａ）の１２アミノ酸と完全一致していた。さらに、配列番号６のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）の部分に相当するタンパク質断片の予想される等電点が５．６５、分子量が６０１９であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミンの断片と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号６のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）の部分のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【実施例４】
【０１５２】
マーカー物質（Ｍ０９）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収し、さらに、
平衡化バッファーで溶出されたピーク画分を回収した。
【０１５３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３４）。図３４中、レーン１は回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．８ｋＤａのバンド（図３４の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ０９）の質量／電荷比（平均値：６８６１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３５の矢印）。
【０１５４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「７８１．４８」及び「１０４２．４０」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号９，１０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ｃ１のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
アポリポタンパク質Ｃ１については、Ｎ末端の２アミノ酸残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」（配列番号１５）が血清中に存在することが確認されている。本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは後述の実施例５と同じタンパク質（アポリポタンパク質Ｃ１）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ０９）はその電荷／質量比（平均値：６８６０）から、当該アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体（配列番号１５）であると考えられた。
【実施例５】
【０１５７】
マーカー物質（Ｍ１０）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収した。
【０１５８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３６）。図３６中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａのバンド（図３６の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１０）の質量／電荷比（平均値：７００５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３７のａ）。
【０１５９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」のペプチドはそれぞれ配列番号１１〜１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」（配列番号１４）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは実施例４と同じタンパク質（アポリポタンパク質Ｃ１）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ１０）はその電荷／質量比（平均値：７００５）から、アポリポタンパク質Ｃ１の全長と考えられた。
【０１６２】
なお、図３７に示すように、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析においてマーカー物質（Ｍ１０）よりも小さい質量（約６．８ｋＤａ）を示すピークも検出された（図３７のｂ）。これら２種のタンパク質は性質が非常に似ていること、並びに、質量の値の比較から、ピークｂのタンパク質は、実施例４で述べた、アポリポタンパク質Ｃ１（配列番号１４）のＮ末端の２アミノ酸（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」（配列番号１５）であると考えられた。アミノ酸配列から計算される質量は、ピークａが６９９３Ｄａ、ピークｂが６８２５Ｄａであった。
【実施例６】
【０１６３】
マーカー物質（Ｍ１５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（Innovative Research社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、５０％ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１６４】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３８）。図３８中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．７ｋＤａのバンド（図３８の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ１５）の質量／電荷比（平均値：８７２３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３９の矢印）。
【０１６５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８３２．０１」及び「１１９３．６９」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１８３２．０１」と「１１９３．６９」のペプチドはそれぞれ配列番号１６，１７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１６６】
【表４】
【実施例７】
【０１６７】
マーカー物質（Ｍ１６）の精製と同定
実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約８．８ｋＤａのバンド（図３８の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ１６）の質量／電荷比（平均値：８８４０）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４０の矢印）。
【０１６８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１９８８．０８」、「１０６２．４８」、及び「２６２９．２６」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１８〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ３」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ｃ３のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【０１６９】
【表５】
【実施例８】
【０１７０】
マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ （１ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)でカラムを順次洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。
【０１７１】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４１）。図４１中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１４．０ｋＤａのバンド（図４１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の質量／電荷比（平均値：１３７４２，１３９５８，１４１６７）と同等の質量／電荷比を示す複数のピークを確認した（図４２）。
【０１７２】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１４．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「１５１０．７５」、「１３８２．６５」、「１５８７．７９」、「２４３８．２５」、「８６９．４６」、「１５５４．８５」、「２５１７．２８」、及び「２５９７．３８」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２２〜２９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第６表に示す。既報のマウストランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。マーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の各電荷／質量比（平均値：１３７４２，１３９５８，１４１６７）から、マーカー物質（Ｍ２１）は「Ｓ−スルホン化トランスサイレチン」、マーカー物質（Ｍ２２）は「グルタチオン化トランスサイレチン」とそれぞれ同定された。マーカー物質（Ｍ２３）はグルタチオン化トランスサイレチンにマトリクス（ＳＰＡ−Ｈ）が結合した複合体と考えられた。
【実施例９】
【０１７５】
マーカー物質（Ｍ２５）の精製と同定
実施例２と同様にして強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを充填したカラム（１ｍＬ)の平衡化、並びに、Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）の変性処理とフィルターろ過を行い、カラムにサンプルを添加した。非吸着画分を回収した。
【０１７６】
強陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）にて平衡化した。回収した非吸着画分を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で１０倍希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０），２００ｍＭ ＮａＣｌにてカラムを洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０），４００ｍＭ ＮａＣｌにて溶出した。ピーク画分を分取した。このピーク画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２５）の質量／電荷比（平均値：２０９０８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１７７】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４３）。図４３中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約２１．０ｋＤａのバンド（図４３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２５）の質量／電荷比（平均値：２０９０８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４４の矢印）。
【０１７８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１５５．６６」、「２４０７．３１」、「１５０１．８３」、「１２２６．６８」、「２７０５．２７」、「２０８０．０３」、及び「１３６０．７２」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１１５５．６６」、「２４０７．３１」、「１５０１．８３」、「１２２６．６８」、「２７０５．２７」、「２０８０．０３」、及び「１３６０．７２」のペプチドはそれぞれ配列番号３１〜３７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「レチノール結合タンパク質」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第７表に示す。既報のマウスレチノール結合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。
【０１７９】
【表７】
【０１８０】
レチノール結合タンパク質については、一部のアミノ酸残基が欠損した数種類の「レチノール結合タンパク質の修飾体」が血清中に存在することが確認されている。本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは後述の実施例９と同じタンパク質（レチノール結合タンパク質）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ２５）はその電荷／質量比（平均値：２０９０８）から、レチノール結合タンパク質の一部のアミノ酸残基が欠損した「レチノール結合タンパク質の修飾体」であると考えられた。
【実施例１０】
【０１８１】
マーカー物質（Ｍ２６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）３．０ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を３．７５ｍＬ加えて変性処理した。この変性処理サンプルに平衡化バッファー６．２５ｍＬを加えて希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収し、さらに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)で溶出されたピーク画分を回収した。
【０１８２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４５）。図４５中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約２１．４ｋＤａのバンド（図４５の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２６）の質量／電荷比（平均値：２１３５３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４６の矢印）。
【０１８３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．４ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１５５．６２」、「１４８５．７７」、「１２２６．６４」、「２０７９．９４」、及び「１３６０．６６」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号３９〜４３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「レチノール結合タンパク質」（配列番号３８）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第８表に示す。
【０１８４】
【表８】
【０１８５】
なお、本実施例のペプチドマスフィンガープリンティングでは実施例９と同じタンパク質（レチノール結合タンパク質）がヒットしたが、マーカー物質（Ｍ２６）はその電荷／質量比（平均値：２１３５３）から、レチノール結合タンパク質の全長と考えられた。
【実施例１１】
【０１８６】
マーカー物質（Ｍ２７）の精製と同定
実施例１０で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約２８．０ｋＤａのバンド（図４５の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ｍ２７）の質量／電荷比（平均値：２８１６１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図４７の矢印）。
【０１８７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２８．０ｋＤａのバンドを切り出し、実施例３と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも１２個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８５２．５３」、「１３９４．０６」、「１２３６．８６」、「１５９６．３５」、「１３４０．０１」、「１０９８．７７」、「１３１７．９６」、「８２６．４７」、「１２９６．９０」、「１９９７．８０」、「１３３０．９３」、及び「１０３９．７１」と算出された。これらのデータを元に実施例３と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４４〜５５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第９表に示す。既報のマウスアポリポタンパク質Ａ１のアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
【０１８８】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】質量／電荷比が３３５２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が４１４７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が４２８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が４７５４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が５１２６（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が５２０３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が６０２３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が６１０３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】質量／電荷比が６８６１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１０】質量／電荷比が７００５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１１】質量／電荷比が７０９５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１２】質量／電荷比が７５７２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１３】質量／電荷比が８４３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１４】質量／電荷比が８５３４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１５】質量／電荷比が８７２３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１６】質量／電荷比が８８４０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１７】質量／電荷比が１００１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１８】質量／電荷比が１０４５１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１９】質量／電荷比が１０７０４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２０】質量／電荷比が１１６６９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２１】質量／電荷比が１３７４２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２２】質量／電荷比が１３９５８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２３】質量／電荷比が１４１６７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２４】質量／電荷比が２０４４１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２５】質量／電荷比が２０９０８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２６】質量／電荷比が２１３５３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２７】質量／電荷比が２８１６１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２８】質量／電荷比が３４３９３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２９】質量／電荷比が６６０９０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３０】実施例２のマーカー物質（Ｍ０６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３１】実施例２のマーカー物質（Ｍ０６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３２】実施例３のマーカー物質（Ｍ０７）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３３】実施例３のマーカー物質（Ｍ０７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３４】実施例４のマーカー物質（Ｍ０９）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３５】実施例４のマーカー物質（Ｍ０９）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３６】実施例５のマーカー物質（Ｍ１０）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３７】実施例５のマーカー物質（Ｍ１０）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図３８】実施例６のマーカー物質（Ｍ１５）並びに実施例７のマーカー物質（Ｍ１６）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３９】実施例６のマーカー物質（Ｍ１５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４０】実施例７のマーカー物質（Ｍ１６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４１】実施例８のマーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４２】実施例８のマーカー物質（Ｍ２１）〜（Ｍ２３）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４３】実施例９のマーカー物質（Ｍ２５）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４４】実施例９のマーカー物質（Ｍ２５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４５】実施例１０のマーカー物質（Ｍ２６）並びに実施例１１のマーカー物質（Ｍ２７）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４６】実施例１０のマーカー物質（Ｍ２６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図４７】実施例１１のマーカー物質（Ｍ２７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項３】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【請求項４】
前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項５】
前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項７】
前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１４】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ０１）〜（Ｍ２９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ｍ０１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７１００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７５７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８４４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１００００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ１９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１０７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４０００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１４２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２０９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３４４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６６０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（ａ）マーカー物質（Ｍ０６）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ｍ０７）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ｍ０９）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ｍ１０）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ｍ１５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ｍ１６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ｍ２１）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ｍ２２）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ｍ２３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｊ）マーカー物質（Ｍ２５）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｋ）マーカー物質（Ｍ２６）はレチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（ｌ）マーカー物質（Ｍ２７）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項３】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ｎ１）〜（Ｎ７）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被検物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ｎ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｎ２）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ｎ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｎ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｎ５）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｎ６）レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ｎ７）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
【請求項４】
前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項５】
前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項７】
前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被検物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１４】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図３７】
【図３９】
【図４０】
【図４２】
【図４４】
【図４６】
【図４７】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３６】
【図３８】
【図４１】
【図４３】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図３７】
【図３９】
【図４０】
【図４２】
【図４４】
【図４６】
【図４７】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３６】
【図３８】
【図４１】
【図４３】
【図４５】
【公開番号】特開２００９−２２２６９８（Ｐ２００９−２２２６９８Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４６９４８（Ｐ２００８−１４６９４８）
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【Ｆターム（参考）】
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