化合物のキャラクタリゼーション法
宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のインビトロキャラクタリゼーション法であって、生細胞で非破壊的に実施される方法について開示する。本発明の方法はイメージング装置及びコンピューター化されたデータ処理装置と共に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、情報伝達経路及び細胞プロセスに対する化合物又は分子の影響のキャラクタリゼーション又はプロファイリング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬の開発は一般に、ハイスループット一次スクリーニングでの多数の化合物の評価とその後の二次スクリーニングにおける化合物の活性及び特異性のさらに詳しい検査を伴う。一次スクリーニング分析は通例リガンド結合性のような簡単な分子検定であり、最も活性な化合物を選択すべくさらに評価するための被験分子の活性に関しては低レベルの情報しか得られない。従って、作用モード、特異性、細胞毒性その他のパラメーターに対処し得る様々な機能検定に基づいて化合物を進展すべきか決定がなされるのは二次スクリーニングである。化合物の進展はこの時点を過ぎるとコストが増大するので、リード化合物の有効なキャラクタリゼーション又はプロファイリング及び最適特性をもつ化合物の選択が、創薬プロセス全体でのキイポイントとなる活動である。有効なリードプロファイリングを達成するには、二次スクリーニングアッセイで、化合物特性の包括的かつ詳細な調査を得る必要があり、そのため創薬業界では多岐にわたるパネルのリードプロファイリング細胞アッセイを並列的に多数のリード化合物に効率的に適用する手段が望まれている。
【０００３】
分子アッセイのアレイを用いた化合物のプロファイリングについては様々な方法が考案されている。米国特許第５８１１２３１号には、化合物によって引き起こされる細胞の生化学的及び生物物理的ホメオスタシスに対する毒性障害を同定する方法が記載されている。米国特許第６５０９１５３号には、核酸ハイブリダイゼーションを用いて細胞での調節解除細胞生存性又は増殖に特徴的な遺伝子の発現を決定するための被験化合物の潜在的毒性の決定法が記載されている。国際公開第０３０４２６５４号には、同定された疾病特色及び薬剤特色遺伝子の各々に対してスコア値を導き出して、その疾病を治療するのに効果的な薬剤の指標を得ることによって、有効な治療の指標となる１以上の遺伝子を選択する方法が記載されている。国際公開第００３９３３６号には、コンセンサスプロファイルを用いた薬剤活性のキャラクタリゼーションによって、所定の生物学的応答に対する薬剤の有効性又は毒性に関連する応答プロファイルを得る方法が記載されている。
【０００４】
従来の方法は総じて、化合物のプロファイリングの際に、遺伝子発現パターンを分析することを特徴とする。かかるパターンはリード化合物の活性の指標となり得るが、規定された細胞経路及び過程に対する化合物の活性の標的又は種類に関する直接的な情報は得られない。別のリードプロファイリング法では、細胞アッセイにおける特定の読取値に基づく分析を用いて、化合物の活性のより直接的なキャラクタリゼーション法を採用している。
【０００５】
国際公開第０２３４８８１号には、組込みレポーター遺伝子を有する安定な株化細胞を生成、使用し、薬剤候補のライブラリーをスクリーニングして潜在的な治療剤を同定し、組込みレポーターを調節する遺伝子を同定する方法が記載されている。米国特許第５９２８８８８号には、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を細胞のゲノムに挿入することによって遺伝子発現を直接的又は間接的に調節するタンパク質又は化合物を同定し、この細胞を所定濃度のモジュレーターと接触させ、細胞のβ−ラクタマーゼ活性を検出する方法が記載されている。国際公開第９７０６２７７号には、標的生物の別々に単離された複数の異なる細胞の各々からレポーター遺伝子産物シグナルを検出することによって候補薬剤の生理学的特異性を評価する方法が記載されており、ここで各々の細胞は異なる内因性転写調節要素に連結されたレポーター遺伝子を含有しており、細胞の合計は候補薬剤の生理学的特異性の評価に十分な生物の転写調節要素の全体を含んでいる。
【０００６】
これらの検定では、上述の遺伝子発現の広範な調査を用いるアプローチよりも化合物の活性に関して直接的な指標が得られるが、レポーター遺伝子検定が情報伝達経路の終点に位置付けられることと、細胞情報伝達経路内及びそれらの間の相互作用の複雑な性質とが相俟って、プロファイリングプロセスにおいてリード化合物の可能な作用モード間の有効な識別を達成するには、多数のかかる検定を同時に遂行する必要が生じる。さらに、かかるアプローチ用の多数の安定に工学処理された株化細胞を生成し、維持し、有効に利用することの必要性のため、重大な論理学的問題が生じる（Ｐａｇｌｉａｒｏ ＆ Ｐｒａｅｓｔｅｇａａｒｄ， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）， １３３−１３６）。
【０００７】
安定に工学処理された細胞を使用することの制限を克服し、従って多様なセットのアッセイを化合物プロファイリングに適用できるようにするべく、細胞を工学処理してアッセイ成分を一過的に発現させるために幾つかの技術が開発されている。米国特許第６５４４７９０号には、核酸を含有する複数の混合物をある表面上の離散し規定された位置にデポジットすることによって核酸を発現するトランスフェクトされた細胞のアレイを生成し、その混合物をその表面上で乾燥させ、その表面上で哺乳動物細胞を核酸が細胞に入り込むのに適当な条件下で平板培養する方法が記載されている。この方法によって、多数の異なるアッセイレポーターを哺乳動物細胞で同時に発現させることができる（一般に「細胞アレイ」と呼ばれる）。その後、細胞アレイを被験化合物に曝露することによって、細胞アッセイのパネルに対する化合物の活性を読み取ることができる。リードプロファイリング用のハイスループットの小型化フォーマットが得られるが、この細胞アレイの生成法には２つの欠点がある。すなわち、使用するプラスミドに基づく化学的トランスフェクション法はトランスフェクション効率にばらつきがあり、その使用が限られた数の細胞型に制限され、また、必要とされるプリントされたアレイの固定フォーマットは手順及び／又は検定における変化を包含するためのこの方法の柔軟性を制限する。
【０００８】
アデノウィルスベクターは、プラスミドベクターよりも優れた利点があることがよく知られており、トランスジェニックＤＮＡを発現する細胞を高い割合で生成し、広範な宿主細胞を形質導入することが可能であり（Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９１（２）， ３９２−８、Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．８（１）：１５８−６６）、従って哺乳動物細胞で広範なリードプロファイリング検定を有効に利用するための取扱い易いルートを与える。アデノウィルスベクターは、機能性ゲノミクスにおいて、遺伝子機能を決定するルートとしてタンパク質を発現させるために広く使用されている。米国特許第６４１３７７６号には、アデノウィルスベクター中で核酸ライブラリーを構築し、宿主細胞で発現させて１以上の表現型を変更し、その変化した表現型に関連する核酸にコードされた産物に生物学的機能を割り当てることによって、核酸及びその産物の機能を同定するハイスループット法が記載されている。
【０００９】
細胞にレポーター遺伝子を形質導入するためにアデノウィルスベクターを用いた幾つかの限られた使用例も既に記載されている（Ｈａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．６６（１）：８２−９０）。これらの著者らは、公知の一連の内分泌攪乱物質を評価するために細胞溶解を必要とするルシフェラーゼレポーター系に基づくインビトロの検定を開発した。残念ながら、かかるインビトロの技術は細胞溶解に起因する人為的な影響を受け易い可能性があり、生細胞に対するリアルタイムの研究には使用することができない。
【００１０】
国際公開第０１／８１６０８号には、細胞に感染するＨＩＶウィルスから発現されたＨＩＶタンパク質の存在下でその活性が増大するレポーター遺伝子をコードするウィルスベクターを用いて細胞に形質導入する方法が記載されている。ＨＩＶ誘導性プロモーターの制御下にＧＦＰレポーターを含むアデノウィルスベクターが記載されており、これは臨床試料中のＨＩＶの存在を検出したり、又は抗−ＨＩＶ薬剤をスクリーニングしたりするのに使用することができる。この方法によって、単一のアナライトの量を測定することによって、ＨＩＶ感染の存在を検出したり、及び／又はＨＩＶに対する薬剤の効果をスクリーニングしたりする手段が提供される。
【特許文献１】米国特許第５８１１２３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６５０９１５３号明細書
【特許文献３】国際公開第０３／０４２６５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／３９３３６号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／３４８８１号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５９２８８８８号明細書
【特許文献７】国際公開第９７０６２７７号明細書
【特許文献８】米国特許第６５４４７９０号明細書
【特許文献９】米国特許第６４１３７７６号明細書
【特許文献１０】国際公開第０１／８１６０８号パンフレット
【非特許文献１】Ｐａｇｌｉａｒｏ ＆ Ｐｒａｅｓｔｅｇａａｒｄ， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）， １３３−１３６
【非特許文献２】Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９１（２）， ３９２−８
【非特許文献３】Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．８（１）：１５８−６６
【非特許文献４】Ｈａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．６６（１）：８２−９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上の先行技術文献のいずれにも、広範な細胞経路及び過程を標的とする、多様な範囲のアデノウィルスにコードされた細胞アッセイに同時に適用して、創薬における化合物の機能及び活性の詳細なプロファイリングを可能とすることは記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様では、宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のインビトロキャラクタリゼーション方法であって、
ａ）複数のウィルスコード化アッセイの第１のセットからのアッセイを、複数の容器を含む第２のセット内に位置する宿主細胞で一過的に発現させ、
ｂ）適宜、被験因子を１以上の容器に添加し、
ｃ）１以上のアッセイの測定を実施し、
ｄ）アッセイの測定値を組合せてデータセットを生成し、
ｅ）データセットを分析して被験因子の機能的特性を求める
ことを含んでなり、上記アッセイの測定を生細胞で非破壊的に実施することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
「一過的」という用語は、ウィルス形質導入によって宿主細胞に導入された物質の発現が本質的に安定でないことをいう。
【００１４】
「複数」とは、２以上を意味する。好適には、複数とは２、３、４、５、６、７，８、９又は１０を意味する。好ましくは、複数とは１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０を意味する。さらに好ましくは、複数とは７５、１００、１２５、１５０、１７５又は２００を意味する。
【００１５】
「セット」という用語は集合を定義するために用いる。セットは、各アッセイ及び／又は容器の位置が既知である特定のフォーマット（例えば、９６ウェルマイクロプレート）を有するアレイの形態を取り得る。別の実施形態では、セットはアッセイ又は容器の集合であって、その集合における各アッセイ又は容器の位置が既知であるものであってもよい。
【００１６】
好適には、１種以上の異なるウィルスコード化アッセイが各容器内の宿主細胞で発現される。
【００１７】
好適には、各容器は異なる宿主細胞を含む。適宜、各容器は同一の宿主細胞又は同一の宿主細胞の遺伝的変異体を含む。
【００１８】
好ましくは、アデノウィルスベクター又はレンチウィルスベクターを用いて、ウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる。
【００１９】
好適には、組換え昆虫ウィルスベクター、例えばＢａｃＭａｍ（Ａｍｅｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ， Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ． ２００４；１０（３−４）：１１７−２４．）を用いて、ウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる。
【００２０】
好適には、アッセイは検出可能なタンパク質を含む。好ましくは、検出可能なタンパク質は蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質及び色素タンパク質の蛍光タンパク質誘導体は、Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｎｅｍｏｎｉａ種（例えば、Ａ．ｍａｊａｎｏ及びＡ．ｓｕｌｃａｔａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種、Ｃｌａｕｌａｒｉａ種、Ｄｅｎｄｒｏｎｅｐｈｔｈｙｌａ種、Ｒｉｃｏｒｄｉａ種、Ｓｃｏｌｙｍｉａ種、Ｚｏａｎｔｈｕｓ種、Ｍｏｎｔａｓｔｒａｅａ種、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ種、Ｃｏｎｙｌａｃｔｉｓ種及びＧｏｎｉｏｐａｒａ種を始めとする広範な生物から単離されている。
【００２１】
さらに好ましくは、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである。最も好ましくは、改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３１、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ，１１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む。
【００２２】
好適には、検出可能なタンパク質は酵素である。好ましくは、酵素は、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される。これらのタンパク質は、細胞に添加した適当な基質に対するその酵素作用によって検出できる。かかる基質の例としては、ニトロ消光性ＣｙＤｙｅｓＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニトロ還元酵素基質）、ＥＬＦ ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、アルカリホスファターゼ基質）及びＣＣＦ２（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、β−ラクタマーゼ基質）がある。
【００２３】
好適には、アッセイは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＮＦｋＢ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃｌからなる群から選択される。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、ＥＲＫ１、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１緑色蛍光タンパク質アッセイは市販されている（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ））。
【００２４】
好適には、宿主細胞は真核細胞であり、遺伝子改変されたものでも、遺伝子改変されていないものでもよい。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。
【００２５】
好適には、被験因子は化学作用因子又は物理作用因子である。
【００２６】
好適には、化学作用因子は有機又は無機化合物である。かかる有機及び無機化合物が潜在的な薬剤又は医薬として、本発明の方法に従って試験される。これらの化合物は通例低分子量（３００ダルトン未満）の合成分子である。好ましくは、有機化合物はペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群から選択される。
【００２７】
好適には、物理作用因子は電磁放射線である。
【００２８】
好適には、ステップｂ）を行わずに、被験因子の非存在下で当該方法を実施する。
【００２９】
好適には、本発明の方法の分析ステップｅ）は、被験因子の存在下で得られた各アッセイ測定値を、被験因子の非存在下で得られた同じアッセイの測定値と比較することからなる。
【００３０】
適宜、被験因子の非存在下でのアッセイ測定値は既知であり、データベースに記憶されている。これによって、本発明の方法の実施に要する時間が短縮され、スクリーニングスループットを増大させることができる。
【００３１】
好ましくは、本発明方法のアッセイは、特にアッセイが緑色蛍光タンパク質のような蛍光性レポーターに基づく場合、イメージング装置を用いて測定される。適当なイメージング装置としては、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ））がある。
【００３２】
本発明の第２の態様では、上記方法をイメージング装置及びコンピューター化されたデータ処理装置と共に使用することを含む、細胞集団に対する被験因子の活性及び／又は機能を自動化キャラクタリゼーション装置が提供される。
【００３３】
本発明の第３の態様では、宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のキャラクタリゼーションのための複数のウィルスコード化アッセイを備える部品のキットが提供される。
【００３４】
好適には、ウィルスコード化アッセイはアデノウィルスベクター又は組換えヒト昆虫ウィルスベクターからなる。
【００３５】
好ましくは、アッセイはＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される。
【００３６】
好適には、アッセイは検出可能なタンパク質からなる。好ましくは、検出可能なタンパク質は蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である。さらに好ましくは、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである。最も好ましくは、改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３１、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、１１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む。
【００３７】
好適には、検出可能なタンパク質は酵素である。好ましくは、酵素はβ−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される。
【００３８】
好ましくは、キットはさらに、酵素に対する基質を含んでいる。従って、タンパク質は、細胞に加えられた適当な基質に対する酵素の作用によって検出することができる。かかる基質の例としては、ニトロでクエンチされるＣｙＤｙｅｓＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニトロ還元酵素基質）、ＥＬＦ ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、アルカリホスファターゼ基質）及びＣＣＦ２（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、β−ラクタマーゼ基質）がある。
【００３９】
最も好ましくは、酵素がニトロ還元酵素であり、基質がその基質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の方法を説明する上で、以下、図を参照する。
【００４１】
本発明の方法は幾つかの変形で利用することができ、そのうちの幾つかを図１に示す。
【００４２】
図１Ａは本発明の方法の一つの適用例を示し、コードされるアッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入するが、第１及び第２のセット又はアレイは要素の大きさと数が同じであり、例えば、９６ウェルの第１のアレイを単一の細胞型を含有する９６ウェルの第２のアレイにレプリカ平板培養するものである。
図１Ｂは本発明の方法の一つの適用例を示し、ウィルスコード化アッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入し、第２のセット又はアレイが第１のアレイの４倍であるが、第１のアレイの要素の大きさと間隔を保持しており、例えば９６ウェルの第１のアレイから４つの同じ９６ウェルの第２のアレイにレプリカ平板培養するものであり、各々の第２のアレイは異なる細胞型を含有している。図１Ｃは第３の可能な構成を示しており、ウィルスコード化アッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入するものであり、第２のセット又はアレイが第１のアレイと異なる要素の大きさと間隔で第１のアレイの４倍であり、例えば９６ウェルの第１のアレイから４倍レプリカ平板培養して３８４ウェルのプレートにして各々のアッセイに対して４倍の複製を提供するものである。
【００４３】
本発明の様々な実施形態のこれらの例は、リード化合物のプロファイリングに対するいろいろなアプローチを可能とする本方法の適用における大きな柔軟性を示している。本方法のさらなる柔軟性が、表１に示す例で例示される。
【００４４】
【表１】
本発明の方法では、第１のセット又はアレイは、離散した容器のセット又はアレイ、通例９６ウェルマイクロプレート内に配置されたウィルスコード化アッセイを含んでいる。これらのアッセイで表される異なるアナライトの数は２〜Ｎであることができ、ここでＮは第１のアレイ内の要素の数である（すなわち、９６ウェルプレートの場合、Ｎ＝２〜９６）。本発明の方法では、ウィルスコード化アッセイは、離散した容器の第２のアレイ、例えば第２の９６ウェルプレート中の増殖する細胞に適用される。第２のアレイで増殖する細胞型の数は１〜ｎであることができ、ここでｎは第２のアレイ内の要素の数である（すなわち、９６ウェルプレートの場合、ｎ＝１〜９６）。第１及び第２のアレイのフォーマットにおけるこれらの変動は被験化合物の可変の数と組合せることができ、ここで第２のアレイに適用される被験化合物の数は第１のアレイのアッセイの数と反比例して変動する。例えば、第１のアレイが９６の別々のアッセイの９６ウェルプレートからなり、これを使用して単一の細胞型を用いる第２のアレイを調製する場合、その第２のアレイを使用して単一の被験化合物の９６のアッセイのプロファイリングを実施することができる（表１でＮ：１：１）。
【００４５】
他の変形も可能であり、例えば、細胞型間における内因性経路成分の発現が異なるために異なる宿主細胞型が検定に必要とされる場合には、９６の別々のアッセイを含む第１のセット又はアレイを使用して幾つかの細胞型（この例では２〜９６）を用いる第２のセット又はアレイを調製することができ、その後これを使用して単一の被験化合物をプロファイリングする（表１でＮ：ｎ：１）。
【００４６】
プロファイリング研究の目的が遺伝的バックグランドが被験化合物の活性又は機能に及ぼす影響を決定することであれば、本方法のさらに別の変形を適用することができ、例えば、第１のアレイが２つの異なるアッセイを含有する９６ウェルプレートからなり、このアレイを使用して４８の異なる細胞型を用いる第２のアレイを調製する場合、この第２のアレイを使用して４８の遺伝的バックグランドにおける単一の被験化合物のプロファイリングをすることができる（表１でＮ：ｎ：１）。以上の例は限定的なものではなく、別の可能な変形は当業者には明らかであろう。
【００４７】
本発明の方法に使用する組換えアデノウィルスベクターは、幾つかの方法によって生成することができる（Ｗａｎｇ ＆ Ｈｕａｎｇ、２０００， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｔｏｄａｙ ５、１０−１６）。最も一般的な方法の１つで、後述の実施例で使用した方法は、２プラスミドレスキュー法に基づくものである。この方法は他で詳細に記載されている（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ， １９９３， ＰＮＡＳ ９１、８８０２−８８０６、米国特許第６１４００８７号、遺伝子療法用アデノウィルスベクター）。
【００４８】
ｃＤＮＡ（例えば、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、又はヒトグルココルチコイド受容体−ＧＣＣＲ、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡと融合している）を、「シャトルプラスミド」と呼ばれる第１の核酸構築物の発現カセット中にクローニングした。シャトルプラスミドは、パッケージングシグナル及び逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むアデノウィルス５型ゲノムの左の約３４０ヌクレオチド、ポリクローニング部位並びにアデノウィルスＥ１遺伝子領域の右端付近のウィルス配列を含有している。第２の核酸構築物は比較的大きく、ｐＢＨＧ１０として知られている（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ， １９９３， ＰＮＡＳ ９１、８８０２−８８０６）。
【００４９】
ｐＢＨＧ１０プラスミドは、ウィルスゲノムの大部分を含有しており、パッケージングシグナル及びＥ１遺伝子領域の部分の欠失がなければ感染性のウィルスを生成することができるであろう。シャトルプラスミド内のＥ１の右端付近のウィルス配列はｐＢＨＧ１０プラスミド内の配列と重複している。クローニングは標準的な実験室技術を用いて行った。両方のプラスミドを、細菌を形質転換した後一晩ＬＢで増殖することによって増幅させた。細菌を遠心分離で沈降させ、変性アルカリ溶解法で処理した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。第１及び第２の核酸構築物を、標準的なリン酸カルシウム共沈でＨＥＫ ２９３細胞（アデノウィルス５型で形質転換されたヒト胚性腎株化細胞）に同時にトランスフェクトした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。トランスフェクションの１日後、細胞に、０．５％アガロースを含有する組織培養培地（１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ）を被せた。これら２つのプラスミドをＨＥＫ ２９３細胞内に同時トランスフェクションすると、第１及び第２の核酸構築物内の重複している配列間で相同組換えが起こる。得られる組換えアデノウィルスベクターは、シャトルプラスミドに由来するパッケージングシグナルと、シャトルプラスミドのポリクローニング部位にクローニングされたｃＤＮＡを含有している。いずれのプラスミドも複製ウィルスを生成する能力をもっておらず、ウィルスの子孫は組換えの結果としてのみ生成することができる。Ｅ１領域における欠失は２９３細胞での構成的産生によって相補される。組換えアデノウィルスＤＮＡは、Ｅ１相補的パッケージング細胞で複製し増殖して組換えアデノウィルスベクターを生成することができる。約２週間後、組換えアデノウィルスベクターは２９３細胞でプラークを形成した。これらをアガロース含有培地下で肉眼で観察した。以下に記載する実験に適する力価を有するアデノウィルスベクターを生成するために、単離されたプラークを増殖させることによってストックを生成した。滅菌ピペットの先端でプラークを培地から取り出し、２００ｕｌのＰＢＳに加え、２９３細胞（Ｅ１相補的パッケージング細胞）のコンフルエントな単層の付近に加えた。約４８時間後、組換えアデノウィルスベクターによる感染の結果として細胞が剥がされるようになり、これを集めて組織培養培地に入れた。３サイクルの瞬間冷凍／解凍によって、アデノウィルスベクターを生産細胞から放出させた。溶解物を３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離で清澄にし、陰イオン交換クロマトグラフィーで組換えアデノウィルスベクターを精製した（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔ／ＨＴＭＬ／１２６０．ｓｈｔｍｌ）。
【００５０】
組換えアデノウィルスベクターの濃度の評価は免疫細胞化学試験を用いて行った（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ａｒｃｈｉｖｅ／ＡＰＲ０２ＵＰＤ／ｐｄｆ／Ａｄｅｎｏ−Ｘ．ｐｄｆ ）。この組換えアデノウィルスベクターは標的細胞に導入することができ、これを増殖させて、ベクター中にクローニングされたｃＤＮＡにコードされた産物の十分な発現を可能にすることができる。ＧＦＰと融合したタンパク質の発現によって、そのタンパク質の生物学的活性の検出及び分析が可能になる。下記実施例に記載する２つのタンパク質（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２及びＧＣＣＲ）の場合、生物学的活性は、遺伝子と融合したＧＦＰの細胞の１つの領域から別の領域へのトランスロケーションによって評価することができる（Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ １１、１−５ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ライブラリー中のある化合物の生物学的効果の同定の結果として、ヒト疾病の治療用の小分子薬剤を得ることができる。
【００５１】
ウィルスにコードされた別々のアッセイのセット又はアレイを用いる本発明の一実施形態に係る、細胞アッセイにおけるリード化合物の活性のプロファイリングへの適用を、図２に示した代表的な例で例証する。ウィルスコード化アッセイのアレイ［１］を使用して、細胞経路及び過程のある範囲のセンサーを宿主細胞［２］内で発現させる。第１のセンサー［７］が細胞表面受容体タンパク質［３］の活性化をモニターし、この受容体タンパク質は第２のタンパク質［４］を活性化し、この第２のタンパク質は第２のセンサー［８］でモニターされ、次に遺伝子発現［５］を活性化し、これが第３のセンサー［９］でモニターされる。ウィルスにコードされたセンサーのこの組合せによって、成分［３］、［４］及び［５］を含む細胞経路に対する被験化合物［６］の活性を、３つのセンサー［１０］、［１１］及び［１２］からの読取値の分析によって決定することができる。本発明のこの実施形態では、ウィルスにコードされたさらに別のアッセイをアレイ［１］中に設けて、さらに追加の細胞経路及び過程を同時に取り扱うために使用する。
【００５２】
本発明のこの実施形態は、ある範囲の細胞経路に対する被験化合物の活性を決定するのに適用することができる一般的なアプローチを表している。中間の分子を介して細胞表面受容体に到達するシグナルを最終の遺伝子発現事象に変換するために多くの細胞情報伝達経路が存在する（Ｇｏｍｐｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００３）。ウィルスコード化アッセイを用いて検知点が適用される、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を起源とするかかる経路の典型的な例を図３に示す。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）［１４］はＥＧＦ応答性細胞の細胞膜［２０］中に存在しており、ここで受容体とＥＧＦが結合する。ＥＧＦ［１３］が結合すると、受容体が活性化され、シグナルが細胞質［２１］内でＥＲＫ１［１６］に変換され、ＥＧＦＲ［１５］のインターナリゼーションが起こる。活性化されたＥＲＫ１が細胞質から核［２２］にトランスロケーションすると、その活性化されたＥＲＫ１［１７］はＥＲＫ１応答性制御要素からの遺伝子発現［１８］を促進し、ｃＦＯＳ［１９］及びその他の遺伝子の発現に至る。従って、この情報伝達経路は３つの事象を有しており、それに対して情報伝達経路に沿ったシグナル変換を報告するようにウィルスコード化アッセイを工学処理することができる。これらの３つの事象とは、受容体のインターナリゼーション［２３］、ＥＲＫ１のトランスロケーション［２４］、及びＥＲＫ１に誘発された遺伝子発現［２６］である。
【００５３】
ＥＧＦＲインターナリゼーションは、受容体が酸性小胞中に取り込まれたときに蛍光を変化させるｐＨ応答性蛍光性分子でタグ付けされるように工学処理された受容体のウィルス発現によって測定することができる（Ａｄｉｅ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３（５）：１１５２−４、１１５６−７）。ＥＲＫ１トランスロケーションは、ＧＦＰ−ＥＲＫ１融合タンパク質のウィルス発現によって測定することができる（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＆ Ｈａｈｎ、２０００ Ｔｒａｆｆｉｃ Ｏｃｔ；１（１０）：７５５−６２）。ＥＲＫ１で誘発された遺伝子発現は、ＥＲＫ１応答性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子のウィルス発現によって測定することができる。国際公開第０１５７２３７号には、生細胞でのレポーター遺伝子の発現をモニターするのに適した方法が記載されている。かかるアッセイは細胞以下のイメージング及び画像分析によって定量的に測定することができる。米国特許第６４００４８７号には、多数の化合物をスクリーニングし、生細胞アッセイを始めとする広範な蛍光アッセイを実施する方法及び装置が記載されている。これらの方法は高速、高分解能及び多波長能を備えたレーザー線走査共焦点顕微鏡及びリアルタイムデータ処理を利用しており、本発明のアッセイの測定に適している。
【００５４】
本発明の方法では、図３の情報伝達経路は、各々がマイクロウェルプレートの別々のウェル内の別々の細胞集団で発現される、ウィルスにコードされた３つの別々のアッセイによって探査されて、被験化合物の活性のプロファイリング手段が提供されるであろう。被験化合物の３つの可能な活性点は図３に示されており、ＥＧＦ受容体のレベル［２７］、ＥＲＫ１のレベル［２８］、及び遺伝子発現のレベル［２９］である。従って、個々のアッセイからのデータの組合せと検査によって、その経路に対して活性な被験化合物の作用点を決定することができる。例えば、ＧＦＰトランスロケーション［２４］と遺伝子発現［２５］に対して正の結果を示すが受容体活性化［２３］は示さない被験化合物は受容体の下流で作用する。被験化合物の刺激又は抑制活性の識別はＥＧＦの存在下及び非存在下で反復アッセイを実施することによって容易に達成される。例えば、ＥＧＦの存在下で試験したとき遺伝子発現［２５］に対して負の結果を示すがアッセイ［２３］及び［２４］では正の結果を示す被験化合物は遺伝子発現のレベルでその経路を抑制する。
【００５５】
本発明の方法では、別々であるが重複している情報伝達経路の特定の点について、ウィルスコード化アッセイの複数のセット又はアレイの発現によって、多くのかかる情報伝達経路を平行して同時に調べることができる。これらのアッセイのアレイからのデータによって、ある化合物の活性及び特異性を広範な生物学的経路に対してプロファイリングすることができる。このプロセスの概略図を図４に示す。
【００５６】
ある化合物のプロファイリングを達成するには、ウィルスコード化アッセイのあるセット又はアレイ［２７］を、アッセイのセット又はアレイの各々の成分が別々の細胞集団で発現されるように、対応するセット又はアレイの細胞集団で発現させる。各々の細胞集団に対して、各々の細胞［４２］が、特定の細胞経路又は過程の１つの要素について報告する。アッセイアレイ及び対応する細胞アレイ内で、アレイの下位要素［２８］が、規定された経路又は過程の個々の成分に対処する。ここで、下位要素［２８］内の各々のアッセイが、別々であるがリンクされた成分［２９］、［３０］及び［３１］に対処して、図３について上述の通りシグナル変換を報告する。アレイ内の別の下位要素が別の経路及び過程［３２］、［３３］、［３４］、［３５］及び［３６］に対処する。各々の細胞がウィルスにコードされた別々のアッセイを発現するアレイ内の複数の細胞集団を被験化合物［３７］に曝露することで、アレイ内の全てのアッセイで得られたデータを検査することによって、その被験化合物の活性及び特異性を決定することができる。細胞表面受容体［３８］に作用する被験化合物［３７］は、その受容体がシグナル変換分子［３９］とカップルしており、そのシグナル変換分子がさらに遺伝子発現の活性化［４１］とカップルすると共に第２の変換分子［４０］にもカップルしており、さらにこの変換分子が遺伝子発現［４２］とカップルしていると、センサーが発現される細胞で正のアッセイシグナルを生じ、これが図３について上述の手段で点［３８］、［３９］、［４０］、［４１］、及び［４２］での活性を報告する。この同じアレイで、他の情報伝達経路及び成分に対処するアレイの下位要素［２８］、［３２］、［３３］及び［３４］からのシグナルがないことは、これらの経路に対してその被験化合物が不活性であることを示しており、下位要素［３５］と［３６］が対処する相互作用する経路に対する特異性が確認される。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例で、単一の９６ウェルプレートの標的細胞での組換えアデノウィルスベクターを用いたアッセイ手順を説明する。
【００５８】
アッセイの４８時間前に、対数増殖期のＨｅＬａ細胞をトリプシン処理で剥がした。細胞数をカウントして１×１０６／ｍｌに調整し、最終体積を培地で２０ｍｌに調節した。組換えアデノウィルスベクター粒子（実施例１及び２参照）を１００個／細胞の割合（この数は感染効率（ＭＯＩ）といわれる）で細胞に加えた。細胞とウィルスを混合し、組織培養フラスコ内で平板培養した。２４時間後、細胞を培養プレートから剥がした（上記と同様）。細胞を４×１０３細胞／１００ｕｌで９６ウェルプレートのウェルに播種した。さらに２４時間培養後、細胞を以下に記載の通りアッセイした。
【００５９】
実施例１：ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２アッセイ
本例に記載するアッセイは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２が核から細胞質へトランスロケーションする過程の拮抗作用（アンタゴニスト）と作動作用（アゴニスト）の両方を含む。ヒトの疾病の治療用化合物を同定しようとするときには、アゴニスト又はアンタゴニストの代わりにライブラリーの化合物を使用することができる。培地をデカントして細胞から除去した。幾つかのウェルでは、培地を新しい培地と交換した。他のウェルでは、培地を３００ナノモル濃度のアニソマイシン（アゴニスト）を含有する培地と交換した。その他のウェルでは、培地をアゴニスト及びアンタゴニスト（１００マイクロモル濃度のＳＢ２０３５８０−ＨＣＩ）を含有する培地と交換した。細胞を９０分、３７℃でインキュベートした。培地をデカントして細胞から除去し、細胞を２％ホルマリン溶液で１５分固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の２．５マイクロモル濃度溶液を加えて核を染色した。このアッセイの結果を図５に示す。
【００６０】
実施例２：グルココルチコイド受容体アッセイ
第２のアッセイでは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）が細胞質から核へトランスロケーションする過程の作動作用を例示する。ＧＦＰに連結されたＧＲを含有する１００ＭＯＩの組換えアデノウィルスベクターを用い、上述の通りＨｅＬａ細胞を調製した。アッセイの１時間前に、組織培養培地を、活性炭で処理した血清を含有する培地で１時間３７℃で交換した。この培地をデカントし、同じ血清と様々な濃度のデキサメタゾン（８００、４００、２００、１００、５０、２５ナノモル濃度）を含有する培地で２０分３７℃で交換した。ＧＲの細胞質から核へのトランスロケーションに影響し得るライブラリーからの化合物を含ませることができる。次に、培地をデカントして細胞から除去し、細胞を固定し、上述の通り処理した。このアッセイの結果を図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ウィルスコード化アッセイを発現する細胞アレイの調製。
【図２】ウィルスコード化アッセイのセット又はアレイを用いた細胞情報伝達経路の調査。
【図３】ＥＧＦＲ−ＥＲＫ細胞情報伝達経路。
【図４】ウィルスコード化アッセイのセット又はアレイを用いた複数の細胞情報伝達経路の調査。
【図５】ウィルスコード化ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２情報伝達アッセイからのデータ。
【図６】ウィルスコード化グルココルチコイド受容体情報伝達アッセイからのデータ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、情報伝達経路及び細胞プロセスに対する化合物又は分子の影響のキャラクタリゼーション又はプロファイリング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬の開発は一般に、ハイスループット一次スクリーニングでの多数の化合物の評価とその後の二次スクリーニングにおける化合物の活性及び特異性のさらに詳しい検査を伴う。一次スクリーニング分析は通例リガンド結合性のような簡単な分子検定であり、最も活性な化合物を選択すべくさらに評価するための被験分子の活性に関しては低レベルの情報しか得られない。従って、作用モード、特異性、細胞毒性その他のパラメーターに対処し得る様々な機能検定に基づいて化合物を進展すべきか決定がなされるのは二次スクリーニングである。化合物の進展はこの時点を過ぎるとコストが増大するので、リード化合物の有効なキャラクタリゼーション又はプロファイリング及び最適特性をもつ化合物の選択が、創薬プロセス全体でのキイポイントとなる活動である。有効なリードプロファイリングを達成するには、二次スクリーニングアッセイで、化合物特性の包括的かつ詳細な調査を得る必要があり、そのため創薬業界では多岐にわたるパネルのリードプロファイリング細胞アッセイを並列的に多数のリード化合物に効率的に適用する手段が望まれている。
【０００３】
分子アッセイのアレイを用いた化合物のプロファイリングについては様々な方法が考案されている。米国特許第５８１１２３１号には、化合物によって引き起こされる細胞の生化学的及び生物物理的ホメオスタシスに対する毒性障害を同定する方法が記載されている。米国特許第６５０９１５３号には、核酸ハイブリダイゼーションを用いて細胞での調節解除細胞生存性又は増殖に特徴的な遺伝子の発現を決定するための被験化合物の潜在的毒性の決定法が記載されている。国際公開第０３０４２６５４号には、同定された疾病特色及び薬剤特色遺伝子の各々に対してスコア値を導き出して、その疾病を治療するのに効果的な薬剤の指標を得ることによって、有効な治療の指標となる１以上の遺伝子を選択する方法が記載されている。国際公開第００３９３３６号には、コンセンサスプロファイルを用いた薬剤活性のキャラクタリゼーションによって、所定の生物学的応答に対する薬剤の有効性又は毒性に関連する応答プロファイルを得る方法が記載されている。
【０００４】
従来の方法は総じて、化合物のプロファイリングの際に、遺伝子発現パターンを分析することを特徴とする。かかるパターンはリード化合物の活性の指標となり得るが、規定された細胞経路及び過程に対する化合物の活性の標的又は種類に関する直接的な情報は得られない。別のリードプロファイリング法では、細胞アッセイにおける特定の読取値に基づく分析を用いて、化合物の活性のより直接的なキャラクタリゼーション法を採用している。
【０００５】
国際公開第０２３４８８１号には、組込みレポーター遺伝子を有する安定な株化細胞を生成、使用し、薬剤候補のライブラリーをスクリーニングして潜在的な治療剤を同定し、組込みレポーターを調節する遺伝子を同定する方法が記載されている。米国特許第５９２８８８８号には、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を細胞のゲノムに挿入することによって遺伝子発現を直接的又は間接的に調節するタンパク質又は化合物を同定し、この細胞を所定濃度のモジュレーターと接触させ、細胞のβ−ラクタマーゼ活性を検出する方法が記載されている。国際公開第９７０６２７７号には、標的生物の別々に単離された複数の異なる細胞の各々からレポーター遺伝子産物シグナルを検出することによって候補薬剤の生理学的特異性を評価する方法が記載されており、ここで各々の細胞は異なる内因性転写調節要素に連結されたレポーター遺伝子を含有しており、細胞の合計は候補薬剤の生理学的特異性の評価に十分な生物の転写調節要素の全体を含んでいる。
【０００６】
これらの検定では、上述の遺伝子発現の広範な調査を用いるアプローチよりも化合物の活性に関して直接的な指標が得られるが、レポーター遺伝子検定が情報伝達経路の終点に位置付けられることと、細胞情報伝達経路内及びそれらの間の相互作用の複雑な性質とが相俟って、プロファイリングプロセスにおいてリード化合物の可能な作用モード間の有効な識別を達成するには、多数のかかる検定を同時に遂行する必要が生じる。さらに、かかるアプローチ用の多数の安定に工学処理された株化細胞を生成し、維持し、有効に利用することの必要性のため、重大な論理学的問題が生じる（Ｐａｇｌｉａｒｏ ＆ Ｐｒａｅｓｔｅｇａａｒｄ， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）， １３３−１３６）。
【０００７】
安定に工学処理された細胞を使用することの制限を克服し、従って多様なセットのアッセイを化合物プロファイリングに適用できるようにするべく、細胞を工学処理してアッセイ成分を一過的に発現させるために幾つかの技術が開発されている。米国特許第６５４４７９０号には、核酸を含有する複数の混合物をある表面上の離散し規定された位置にデポジットすることによって核酸を発現するトランスフェクトされた細胞のアレイを生成し、その混合物をその表面上で乾燥させ、その表面上で哺乳動物細胞を核酸が細胞に入り込むのに適当な条件下で平板培養する方法が記載されている。この方法によって、多数の異なるアッセイレポーターを哺乳動物細胞で同時に発現させることができる（一般に「細胞アレイ」と呼ばれる）。その後、細胞アレイを被験化合物に曝露することによって、細胞アッセイのパネルに対する化合物の活性を読み取ることができる。リードプロファイリング用のハイスループットの小型化フォーマットが得られるが、この細胞アレイの生成法には２つの欠点がある。すなわち、使用するプラスミドに基づく化学的トランスフェクション法はトランスフェクション効率にばらつきがあり、その使用が限られた数の細胞型に制限され、また、必要とされるプリントされたアレイの固定フォーマットは手順及び／又は検定における変化を包含するためのこの方法の柔軟性を制限する。
【０００８】
アデノウィルスベクターは、プラスミドベクターよりも優れた利点があることがよく知られており、トランスジェニックＤＮＡを発現する細胞を高い割合で生成し、広範な宿主細胞を形質導入することが可能であり（Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９１（２）， ３９２−８、Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．８（１）：１５８−６６）、従って哺乳動物細胞で広範なリードプロファイリング検定を有効に利用するための取扱い易いルートを与える。アデノウィルスベクターは、機能性ゲノミクスにおいて、遺伝子機能を決定するルートとしてタンパク質を発現させるために広く使用されている。米国特許第６４１３７７６号には、アデノウィルスベクター中で核酸ライブラリーを構築し、宿主細胞で発現させて１以上の表現型を変更し、その変化した表現型に関連する核酸にコードされた産物に生物学的機能を割り当てることによって、核酸及びその産物の機能を同定するハイスループット法が記載されている。
【０００９】
細胞にレポーター遺伝子を形質導入するためにアデノウィルスベクターを用いた幾つかの限られた使用例も既に記載されている（Ｈａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．６６（１）：８２−９０）。これらの著者らは、公知の一連の内分泌攪乱物質を評価するために細胞溶解を必要とするルシフェラーゼレポーター系に基づくインビトロの検定を開発した。残念ながら、かかるインビトロの技術は細胞溶解に起因する人為的な影響を受け易い可能性があり、生細胞に対するリアルタイムの研究には使用することができない。
【００１０】
国際公開第０１／８１６０８号には、細胞に感染するＨＩＶウィルスから発現されたＨＩＶタンパク質の存在下でその活性が増大するレポーター遺伝子をコードするウィルスベクターを用いて細胞に形質導入する方法が記載されている。ＨＩＶ誘導性プロモーターの制御下にＧＦＰレポーターを含むアデノウィルスベクターが記載されており、これは臨床試料中のＨＩＶの存在を検出したり、又は抗−ＨＩＶ薬剤をスクリーニングしたりするのに使用することができる。この方法によって、単一のアナライトの量を測定することによって、ＨＩＶ感染の存在を検出したり、及び／又はＨＩＶに対する薬剤の効果をスクリーニングしたりする手段が提供される。
【特許文献１】米国特許第５８１１２３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６５０９１５３号明細書
【特許文献３】国際公開第０３／０４２６５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／３９３３６号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／３４８８１号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５９２８８８８号明細書
【特許文献７】国際公開第９７０６２７７号明細書
【特許文献８】米国特許第６５４４７９０号明細書
【特許文献９】米国特許第６４１３７７６号明細書
【特許文献１０】国際公開第０１／８１６０８号パンフレット
【非特許文献１】Ｐａｇｌｉａｒｏ ＆ Ｐｒａｅｓｔｅｇａａｒｄ， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）， １３３−１３６
【非特許文献２】Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９１（２）， ３９２−８
【非特許文献３】Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．８（１）：１５８−６６
【非特許文献４】Ｈａｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．６６（１）：８２−９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上の先行技術文献のいずれにも、広範な細胞経路及び過程を標的とする、多様な範囲のアデノウィルスにコードされた細胞アッセイに同時に適用して、創薬における化合物の機能及び活性の詳細なプロファイリングを可能とすることは記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様では、宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のインビトロキャラクタリゼーション方法であって、
ａ）複数のウィルスコード化アッセイの第１のセットからのアッセイを、複数の容器を含む第２のセット内に位置する宿主細胞で一過的に発現させ、
ｂ）適宜、被験因子を１以上の容器に添加し、
ｃ）１以上のアッセイの測定を実施し、
ｄ）アッセイの測定値を組合せてデータセットを生成し、
ｅ）データセットを分析して被験因子の機能的特性を求める
ことを含んでなり、上記アッセイの測定を生細胞で非破壊的に実施することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
「一過的」という用語は、ウィルス形質導入によって宿主細胞に導入された物質の発現が本質的に安定でないことをいう。
【００１４】
「複数」とは、２以上を意味する。好適には、複数とは２、３、４、５、６、７，８、９又は１０を意味する。好ましくは、複数とは１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０を意味する。さらに好ましくは、複数とは７５、１００、１２５、１５０、１７５又は２００を意味する。
【００１５】
「セット」という用語は集合を定義するために用いる。セットは、各アッセイ及び／又は容器の位置が既知である特定のフォーマット（例えば、９６ウェルマイクロプレート）を有するアレイの形態を取り得る。別の実施形態では、セットはアッセイ又は容器の集合であって、その集合における各アッセイ又は容器の位置が既知であるものであってもよい。
【００１６】
好適には、１種以上の異なるウィルスコード化アッセイが各容器内の宿主細胞で発現される。
【００１７】
好適には、各容器は異なる宿主細胞を含む。適宜、各容器は同一の宿主細胞又は同一の宿主細胞の遺伝的変異体を含む。
【００１８】
好ましくは、アデノウィルスベクター又はレンチウィルスベクターを用いて、ウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる。
【００１９】
好適には、組換え昆虫ウィルスベクター、例えばＢａｃＭａｍ（Ａｍｅｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ， Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ． ２００４；１０（３−４）：１１７−２４．）を用いて、ウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる。
【００２０】
好適には、アッセイは検出可能なタンパク質を含む。好ましくは、検出可能なタンパク質は蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質及び色素タンパク質の蛍光タンパク質誘導体は、Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｎｅｍｏｎｉａ種（例えば、Ａ．ｍａｊａｎｏ及びＡ．ｓｕｌｃａｔａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種、Ｃｌａｕｌａｒｉａ種、Ｄｅｎｄｒｏｎｅｐｈｔｈｙｌａ種、Ｒｉｃｏｒｄｉａ種、Ｓｃｏｌｙｍｉａ種、Ｚｏａｎｔｈｕｓ種、Ｍｏｎｔａｓｔｒａｅａ種、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ種、Ｃｏｎｙｌａｃｔｉｓ種及びＧｏｎｉｏｐａｒａ種を始めとする広範な生物から単離されている。
【００２１】
さらに好ましくは、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである。最も好ましくは、改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３１、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ，１１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む。
【００２２】
好適には、検出可能なタンパク質は酵素である。好ましくは、酵素は、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される。これらのタンパク質は、細胞に添加した適当な基質に対するその酵素作用によって検出できる。かかる基質の例としては、ニトロ消光性ＣｙＤｙｅｓＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニトロ還元酵素基質）、ＥＬＦ ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、アルカリホスファターゼ基質）及びＣＣＦ２（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、β−ラクタマーゼ基質）がある。
【００２３】
好適には、アッセイは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＮＦｋＢ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃｌからなる群から選択される。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、ＥＲＫ１、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１緑色蛍光タンパク質アッセイは市販されている（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ））。
【００２４】
好適には、宿主細胞は真核細胞であり、遺伝子改変されたものでも、遺伝子改変されていないものでもよい。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。
【００２５】
好適には、被験因子は化学作用因子又は物理作用因子である。
【００２６】
好適には、化学作用因子は有機又は無機化合物である。かかる有機及び無機化合物が潜在的な薬剤又は医薬として、本発明の方法に従って試験される。これらの化合物は通例低分子量（３００ダルトン未満）の合成分子である。好ましくは、有機化合物はペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群から選択される。
【００２７】
好適には、物理作用因子は電磁放射線である。
【００２８】
好適には、ステップｂ）を行わずに、被験因子の非存在下で当該方法を実施する。
【００２９】
好適には、本発明の方法の分析ステップｅ）は、被験因子の存在下で得られた各アッセイ測定値を、被験因子の非存在下で得られた同じアッセイの測定値と比較することからなる。
【００３０】
適宜、被験因子の非存在下でのアッセイ測定値は既知であり、データベースに記憶されている。これによって、本発明の方法の実施に要する時間が短縮され、スクリーニングスループットを増大させることができる。
【００３１】
好ましくは、本発明方法のアッセイは、特にアッセイが緑色蛍光タンパク質のような蛍光性レポーターに基づく場合、イメージング装置を用いて測定される。適当なイメージング装置としては、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ））がある。
【００３２】
本発明の第２の態様では、上記方法をイメージング装置及びコンピューター化されたデータ処理装置と共に使用することを含む、細胞集団に対する被験因子の活性及び／又は機能を自動化キャラクタリゼーション装置が提供される。
【００３３】
本発明の第３の態様では、宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のキャラクタリゼーションのための複数のウィルスコード化アッセイを備える部品のキットが提供される。
【００３４】
好適には、ウィルスコード化アッセイはアデノウィルスベクター又は組換えヒト昆虫ウィルスベクターからなる。
【００３５】
好ましくは、アッセイはＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される。
【００３６】
好適には、アッセイは検出可能なタンパク質からなる。好ましくは、検出可能なタンパク質は蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である。さらに好ましくは、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである。最も好ましくは、改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３１、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、１１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む。
【００３７】
好適には、検出可能なタンパク質は酵素である。好ましくは、酵素はβ−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される。
【００３８】
好ましくは、キットはさらに、酵素に対する基質を含んでいる。従って、タンパク質は、細胞に加えられた適当な基質に対する酵素の作用によって検出することができる。かかる基質の例としては、ニトロでクエンチされるＣｙＤｙｅｓＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニトロ還元酵素基質）、ＥＬＦ ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、アルカリホスファターゼ基質）及びＣＣＦ２（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、β−ラクタマーゼ基質）がある。
【００３９】
最も好ましくは、酵素がニトロ還元酵素であり、基質がその基質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の方法を説明する上で、以下、図を参照する。
【００４１】
本発明の方法は幾つかの変形で利用することができ、そのうちの幾つかを図１に示す。
【００４２】
図１Ａは本発明の方法の一つの適用例を示し、コードされるアッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入するが、第１及び第２のセット又はアレイは要素の大きさと数が同じであり、例えば、９６ウェルの第１のアレイを単一の細胞型を含有する９６ウェルの第２のアレイにレプリカ平板培養するものである。
図１Ｂは本発明の方法の一つの適用例を示し、ウィルスコード化アッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入し、第２のセット又はアレイが第１のアレイの４倍であるが、第１のアレイの要素の大きさと間隔を保持しており、例えば９６ウェルの第１のアレイから４つの同じ９６ウェルの第２のアレイにレプリカ平板培養するものであり、各々の第２のアレイは異なる細胞型を含有している。図１Ｃは第３の可能な構成を示しており、ウィルスコード化アッセイの第１のセット又はアレイを使用して第２のセット又はアレイの細胞に形質導入するものであり、第２のセット又はアレイが第１のアレイと異なる要素の大きさと間隔で第１のアレイの４倍であり、例えば９６ウェルの第１のアレイから４倍レプリカ平板培養して３８４ウェルのプレートにして各々のアッセイに対して４倍の複製を提供するものである。
【００４３】
本発明の様々な実施形態のこれらの例は、リード化合物のプロファイリングに対するいろいろなアプローチを可能とする本方法の適用における大きな柔軟性を示している。本方法のさらなる柔軟性が、表１に示す例で例示される。
【００４４】
【表１】
本発明の方法では、第１のセット又はアレイは、離散した容器のセット又はアレイ、通例９６ウェルマイクロプレート内に配置されたウィルスコード化アッセイを含んでいる。これらのアッセイで表される異なるアナライトの数は２〜Ｎであることができ、ここでＮは第１のアレイ内の要素の数である（すなわち、９６ウェルプレートの場合、Ｎ＝２〜９６）。本発明の方法では、ウィルスコード化アッセイは、離散した容器の第２のアレイ、例えば第２の９６ウェルプレート中の増殖する細胞に適用される。第２のアレイで増殖する細胞型の数は１〜ｎであることができ、ここでｎは第２のアレイ内の要素の数である（すなわち、９６ウェルプレートの場合、ｎ＝１〜９６）。第１及び第２のアレイのフォーマットにおけるこれらの変動は被験化合物の可変の数と組合せることができ、ここで第２のアレイに適用される被験化合物の数は第１のアレイのアッセイの数と反比例して変動する。例えば、第１のアレイが９６の別々のアッセイの９６ウェルプレートからなり、これを使用して単一の細胞型を用いる第２のアレイを調製する場合、その第２のアレイを使用して単一の被験化合物の９６のアッセイのプロファイリングを実施することができる（表１でＮ：１：１）。
【００４５】
他の変形も可能であり、例えば、細胞型間における内因性経路成分の発現が異なるために異なる宿主細胞型が検定に必要とされる場合には、９６の別々のアッセイを含む第１のセット又はアレイを使用して幾つかの細胞型（この例では２〜９６）を用いる第２のセット又はアレイを調製することができ、その後これを使用して単一の被験化合物をプロファイリングする（表１でＮ：ｎ：１）。
【００４６】
プロファイリング研究の目的が遺伝的バックグランドが被験化合物の活性又は機能に及ぼす影響を決定することであれば、本方法のさらに別の変形を適用することができ、例えば、第１のアレイが２つの異なるアッセイを含有する９６ウェルプレートからなり、このアレイを使用して４８の異なる細胞型を用いる第２のアレイを調製する場合、この第２のアレイを使用して４８の遺伝的バックグランドにおける単一の被験化合物のプロファイリングをすることができる（表１でＮ：ｎ：１）。以上の例は限定的なものではなく、別の可能な変形は当業者には明らかであろう。
【００４７】
本発明の方法に使用する組換えアデノウィルスベクターは、幾つかの方法によって生成することができる（Ｗａｎｇ ＆ Ｈｕａｎｇ、２０００， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｔｏｄａｙ ５、１０−１６）。最も一般的な方法の１つで、後述の実施例で使用した方法は、２プラスミドレスキュー法に基づくものである。この方法は他で詳細に記載されている（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ， １９９３， ＰＮＡＳ ９１、８８０２−８８０６、米国特許第６１４００８７号、遺伝子療法用アデノウィルスベクター）。
【００４８】
ｃＤＮＡ（例えば、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、又はヒトグルココルチコイド受容体−ＧＣＣＲ、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡと融合している）を、「シャトルプラスミド」と呼ばれる第１の核酸構築物の発現カセット中にクローニングした。シャトルプラスミドは、パッケージングシグナル及び逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むアデノウィルス５型ゲノムの左の約３４０ヌクレオチド、ポリクローニング部位並びにアデノウィルスＥ１遺伝子領域の右端付近のウィルス配列を含有している。第２の核酸構築物は比較的大きく、ｐＢＨＧ１０として知られている（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ， １９９３， ＰＮＡＳ ９１、８８０２−８８０６）。
【００４９】
ｐＢＨＧ１０プラスミドは、ウィルスゲノムの大部分を含有しており、パッケージングシグナル及びＥ１遺伝子領域の部分の欠失がなければ感染性のウィルスを生成することができるであろう。シャトルプラスミド内のＥ１の右端付近のウィルス配列はｐＢＨＧ１０プラスミド内の配列と重複している。クローニングは標準的な実験室技術を用いて行った。両方のプラスミドを、細菌を形質転換した後一晩ＬＢで増殖することによって増幅させた。細菌を遠心分離で沈降させ、変性アルカリ溶解法で処理した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。第１及び第２の核酸構築物を、標準的なリン酸カルシウム共沈でＨＥＫ ２９３細胞（アデノウィルス５型で形質転換されたヒト胚性腎株化細胞）に同時にトランスフェクトした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。トランスフェクションの１日後、細胞に、０．５％アガロースを含有する組織培養培地（１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ）を被せた。これら２つのプラスミドをＨＥＫ ２９３細胞内に同時トランスフェクションすると、第１及び第２の核酸構築物内の重複している配列間で相同組換えが起こる。得られる組換えアデノウィルスベクターは、シャトルプラスミドに由来するパッケージングシグナルと、シャトルプラスミドのポリクローニング部位にクローニングされたｃＤＮＡを含有している。いずれのプラスミドも複製ウィルスを生成する能力をもっておらず、ウィルスの子孫は組換えの結果としてのみ生成することができる。Ｅ１領域における欠失は２９３細胞での構成的産生によって相補される。組換えアデノウィルスＤＮＡは、Ｅ１相補的パッケージング細胞で複製し増殖して組換えアデノウィルスベクターを生成することができる。約２週間後、組換えアデノウィルスベクターは２９３細胞でプラークを形成した。これらをアガロース含有培地下で肉眼で観察した。以下に記載する実験に適する力価を有するアデノウィルスベクターを生成するために、単離されたプラークを増殖させることによってストックを生成した。滅菌ピペットの先端でプラークを培地から取り出し、２００ｕｌのＰＢＳに加え、２９３細胞（Ｅ１相補的パッケージング細胞）のコンフルエントな単層の付近に加えた。約４８時間後、組換えアデノウィルスベクターによる感染の結果として細胞が剥がされるようになり、これを集めて組織培養培地に入れた。３サイクルの瞬間冷凍／解凍によって、アデノウィルスベクターを生産細胞から放出させた。溶解物を３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離で清澄にし、陰イオン交換クロマトグラフィーで組換えアデノウィルスベクターを精製した（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔ／ＨＴＭＬ／１２６０．ｓｈｔｍｌ）。
【００５０】
組換えアデノウィルスベクターの濃度の評価は免疫細胞化学試験を用いて行った（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ａｒｃｈｉｖｅ／ＡＰＲ０２ＵＰＤ／ｐｄｆ／Ａｄｅｎｏ−Ｘ．ｐｄｆ ）。この組換えアデノウィルスベクターは標的細胞に導入することができ、これを増殖させて、ベクター中にクローニングされたｃＤＮＡにコードされた産物の十分な発現を可能にすることができる。ＧＦＰと融合したタンパク質の発現によって、そのタンパク質の生物学的活性の検出及び分析が可能になる。下記実施例に記載する２つのタンパク質（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２及びＧＣＣＲ）の場合、生物学的活性は、遺伝子と融合したＧＦＰの細胞の１つの領域から別の領域へのトランスロケーションによって評価することができる（Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ １１、１−５ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ライブラリー中のある化合物の生物学的効果の同定の結果として、ヒト疾病の治療用の小分子薬剤を得ることができる。
【００５１】
ウィルスにコードされた別々のアッセイのセット又はアレイを用いる本発明の一実施形態に係る、細胞アッセイにおけるリード化合物の活性のプロファイリングへの適用を、図２に示した代表的な例で例証する。ウィルスコード化アッセイのアレイ［１］を使用して、細胞経路及び過程のある範囲のセンサーを宿主細胞［２］内で発現させる。第１のセンサー［７］が細胞表面受容体タンパク質［３］の活性化をモニターし、この受容体タンパク質は第２のタンパク質［４］を活性化し、この第２のタンパク質は第２のセンサー［８］でモニターされ、次に遺伝子発現［５］を活性化し、これが第３のセンサー［９］でモニターされる。ウィルスにコードされたセンサーのこの組合せによって、成分［３］、［４］及び［５］を含む細胞経路に対する被験化合物［６］の活性を、３つのセンサー［１０］、［１１］及び［１２］からの読取値の分析によって決定することができる。本発明のこの実施形態では、ウィルスにコードされたさらに別のアッセイをアレイ［１］中に設けて、さらに追加の細胞経路及び過程を同時に取り扱うために使用する。
【００５２】
本発明のこの実施形態は、ある範囲の細胞経路に対する被験化合物の活性を決定するのに適用することができる一般的なアプローチを表している。中間の分子を介して細胞表面受容体に到達するシグナルを最終の遺伝子発現事象に変換するために多くの細胞情報伝達経路が存在する（Ｇｏｍｐｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００３）。ウィルスコード化アッセイを用いて検知点が適用される、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を起源とするかかる経路の典型的な例を図３に示す。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）［１４］はＥＧＦ応答性細胞の細胞膜［２０］中に存在しており、ここで受容体とＥＧＦが結合する。ＥＧＦ［１３］が結合すると、受容体が活性化され、シグナルが細胞質［２１］内でＥＲＫ１［１６］に変換され、ＥＧＦＲ［１５］のインターナリゼーションが起こる。活性化されたＥＲＫ１が細胞質から核［２２］にトランスロケーションすると、その活性化されたＥＲＫ１［１７］はＥＲＫ１応答性制御要素からの遺伝子発現［１８］を促進し、ｃＦＯＳ［１９］及びその他の遺伝子の発現に至る。従って、この情報伝達経路は３つの事象を有しており、それに対して情報伝達経路に沿ったシグナル変換を報告するようにウィルスコード化アッセイを工学処理することができる。これらの３つの事象とは、受容体のインターナリゼーション［２３］、ＥＲＫ１のトランスロケーション［２４］、及びＥＲＫ１に誘発された遺伝子発現［２６］である。
【００５３】
ＥＧＦＲインターナリゼーションは、受容体が酸性小胞中に取り込まれたときに蛍光を変化させるｐＨ応答性蛍光性分子でタグ付けされるように工学処理された受容体のウィルス発現によって測定することができる（Ａｄｉｅ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３（５）：１１５２−４、１１５６−７）。ＥＲＫ１トランスロケーションは、ＧＦＰ−ＥＲＫ１融合タンパク質のウィルス発現によって測定することができる（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＆ Ｈａｈｎ、２０００ Ｔｒａｆｆｉｃ Ｏｃｔ；１（１０）：７５５−６２）。ＥＲＫ１で誘発された遺伝子発現は、ＥＲＫ１応答性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子のウィルス発現によって測定することができる。国際公開第０１５７２３７号には、生細胞でのレポーター遺伝子の発現をモニターするのに適した方法が記載されている。かかるアッセイは細胞以下のイメージング及び画像分析によって定量的に測定することができる。米国特許第６４００４８７号には、多数の化合物をスクリーニングし、生細胞アッセイを始めとする広範な蛍光アッセイを実施する方法及び装置が記載されている。これらの方法は高速、高分解能及び多波長能を備えたレーザー線走査共焦点顕微鏡及びリアルタイムデータ処理を利用しており、本発明のアッセイの測定に適している。
【００５４】
本発明の方法では、図３の情報伝達経路は、各々がマイクロウェルプレートの別々のウェル内の別々の細胞集団で発現される、ウィルスにコードされた３つの別々のアッセイによって探査されて、被験化合物の活性のプロファイリング手段が提供されるであろう。被験化合物の３つの可能な活性点は図３に示されており、ＥＧＦ受容体のレベル［２７］、ＥＲＫ１のレベル［２８］、及び遺伝子発現のレベル［２９］である。従って、個々のアッセイからのデータの組合せと検査によって、その経路に対して活性な被験化合物の作用点を決定することができる。例えば、ＧＦＰトランスロケーション［２４］と遺伝子発現［２５］に対して正の結果を示すが受容体活性化［２３］は示さない被験化合物は受容体の下流で作用する。被験化合物の刺激又は抑制活性の識別はＥＧＦの存在下及び非存在下で反復アッセイを実施することによって容易に達成される。例えば、ＥＧＦの存在下で試験したとき遺伝子発現［２５］に対して負の結果を示すがアッセイ［２３］及び［２４］では正の結果を示す被験化合物は遺伝子発現のレベルでその経路を抑制する。
【００５５】
本発明の方法では、別々であるが重複している情報伝達経路の特定の点について、ウィルスコード化アッセイの複数のセット又はアレイの発現によって、多くのかかる情報伝達経路を平行して同時に調べることができる。これらのアッセイのアレイからのデータによって、ある化合物の活性及び特異性を広範な生物学的経路に対してプロファイリングすることができる。このプロセスの概略図を図４に示す。
【００５６】
ある化合物のプロファイリングを達成するには、ウィルスコード化アッセイのあるセット又はアレイ［２７］を、アッセイのセット又はアレイの各々の成分が別々の細胞集団で発現されるように、対応するセット又はアレイの細胞集団で発現させる。各々の細胞集団に対して、各々の細胞［４２］が、特定の細胞経路又は過程の１つの要素について報告する。アッセイアレイ及び対応する細胞アレイ内で、アレイの下位要素［２８］が、規定された経路又は過程の個々の成分に対処する。ここで、下位要素［２８］内の各々のアッセイが、別々であるがリンクされた成分［２９］、［３０］及び［３１］に対処して、図３について上述の通りシグナル変換を報告する。アレイ内の別の下位要素が別の経路及び過程［３２］、［３３］、［３４］、［３５］及び［３６］に対処する。各々の細胞がウィルスにコードされた別々のアッセイを発現するアレイ内の複数の細胞集団を被験化合物［３７］に曝露することで、アレイ内の全てのアッセイで得られたデータを検査することによって、その被験化合物の活性及び特異性を決定することができる。細胞表面受容体［３８］に作用する被験化合物［３７］は、その受容体がシグナル変換分子［３９］とカップルしており、そのシグナル変換分子がさらに遺伝子発現の活性化［４１］とカップルすると共に第２の変換分子［４０］にもカップルしており、さらにこの変換分子が遺伝子発現［４２］とカップルしていると、センサーが発現される細胞で正のアッセイシグナルを生じ、これが図３について上述の手段で点［３８］、［３９］、［４０］、［４１］、及び［４２］での活性を報告する。この同じアレイで、他の情報伝達経路及び成分に対処するアレイの下位要素［２８］、［３２］、［３３］及び［３４］からのシグナルがないことは、これらの経路に対してその被験化合物が不活性であることを示しており、下位要素［３５］と［３６］が対処する相互作用する経路に対する特異性が確認される。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例で、単一の９６ウェルプレートの標的細胞での組換えアデノウィルスベクターを用いたアッセイ手順を説明する。
【００５８】
アッセイの４８時間前に、対数増殖期のＨｅＬａ細胞をトリプシン処理で剥がした。細胞数をカウントして１×１０６／ｍｌに調整し、最終体積を培地で２０ｍｌに調節した。組換えアデノウィルスベクター粒子（実施例１及び２参照）を１００個／細胞の割合（この数は感染効率（ＭＯＩ）といわれる）で細胞に加えた。細胞とウィルスを混合し、組織培養フラスコ内で平板培養した。２４時間後、細胞を培養プレートから剥がした（上記と同様）。細胞を４×１０３細胞／１００ｕｌで９６ウェルプレートのウェルに播種した。さらに２４時間培養後、細胞を以下に記載の通りアッセイした。
【００５９】
実施例１：ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２アッセイ
本例に記載するアッセイは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２が核から細胞質へトランスロケーションする過程の拮抗作用（アンタゴニスト）と作動作用（アゴニスト）の両方を含む。ヒトの疾病の治療用化合物を同定しようとするときには、アゴニスト又はアンタゴニストの代わりにライブラリーの化合物を使用することができる。培地をデカントして細胞から除去した。幾つかのウェルでは、培地を新しい培地と交換した。他のウェルでは、培地を３００ナノモル濃度のアニソマイシン（アゴニスト）を含有する培地と交換した。その他のウェルでは、培地をアゴニスト及びアンタゴニスト（１００マイクロモル濃度のＳＢ２０３５８０−ＨＣＩ）を含有する培地と交換した。細胞を９０分、３７℃でインキュベートした。培地をデカントして細胞から除去し、細胞を２％ホルマリン溶液で１５分固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の２．５マイクロモル濃度溶液を加えて核を染色した。このアッセイの結果を図５に示す。
【００６０】
実施例２：グルココルチコイド受容体アッセイ
第２のアッセイでは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）が細胞質から核へトランスロケーションする過程の作動作用を例示する。ＧＦＰに連結されたＧＲを含有する１００ＭＯＩの組換えアデノウィルスベクターを用い、上述の通りＨｅＬａ細胞を調製した。アッセイの１時間前に、組織培養培地を、活性炭で処理した血清を含有する培地で１時間３７℃で交換した。この培地をデカントし、同じ血清と様々な濃度のデキサメタゾン（８００、４００、２００、１００、５０、２５ナノモル濃度）を含有する培地で２０分３７℃で交換した。ＧＲの細胞質から核へのトランスロケーションに影響し得るライブラリーからの化合物を含ませることができる。次に、培地をデカントして細胞から除去し、細胞を固定し、上述の通り処理した。このアッセイの結果を図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ウィルスコード化アッセイを発現する細胞アレイの調製。
【図２】ウィルスコード化アッセイのセット又はアレイを用いた細胞情報伝達経路の調査。
【図３】ＥＧＦＲ−ＥＲＫ細胞情報伝達経路。
【図４】ウィルスコード化アッセイのセット又はアレイを用いた複数の細胞情報伝達経路の調査。
【図５】ウィルスコード化ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２情報伝達アッセイからのデータ。
【図６】ウィルスコード化グルココルチコイド受容体情報伝達アッセイからのデータ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のインビトロキャラクタリゼーション方法であって、
ａ）複数のウィルスコード化アッセイの第１のセットからのアッセイを、複数の容器を含む第２のセット内に位置する宿主細胞で一過的に発現させ、
ｂ）適宜、被験因子を１以上の容器に添加し、
ｃ）１以上のアッセイの測定を実施し、
ｄ）アッセイの測定値を組合せてデータセットを生成し、
ｅ）データセットを分析して被験因子の機能的特性を求める
ことを含んでなり、上記アッセイの測定を生細胞で非破壊的に実施することを特徴とする方法。
【請求項２】
１種以上の異なるウィルスコード化アッセイを各容器内の宿主細胞で発現させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各容器が異なる宿主細胞を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
各容器が同一の宿主細胞又は同一の宿主細胞の遺伝的変異体を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
アデノウィルスベクターを用いてウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
組換えヒト昆虫ウィルスベクターを用いてウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイが検出可能なタンパク質を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】
改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｉ、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能なタンパク質が酵素である、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が真核細胞であり、該細胞が遺伝子改変されたものでも或いは遺伝子改変されていないものでもよい、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記被験因子が化学作用因子又は物理作用因子である、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記化学作用因子が有機又は無機化合物である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記有機化合物が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記物理作用因子が電磁放射線である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）を行わずに、前記被験因子の非存在下で当該方法を実施する、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
分析ステップｅ）が、被験因子の存在下で得られた各アッセイ測定値を、被験因子の非存在下での同じアッセイの測定値と比較する、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
被験因子の非存在下でのアッセイ測定値が既知であってデータベースに記憶されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイをイメージング装置を用いて測定する、請求項１乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記イメージング装置がＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
細胞集団に対する被験因子の活性及び／又は機能の自動化キャラクタリゼーション装置であって、請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法をイメージング装置及びコンピューター化されたデータ処理装置と共に用いることを含む、装置。
【請求項２７】
宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のキャラクタリゼーションのための複数のウィルスコード化アッセイを備える部品のキット。
【請求項２８】
前記ウィルスコード化アッセイがアデノウィルスベクター又は組換えヒト昆虫ウィルスベクターを含む、請求項２７記載の部品のキット。
【請求項２９】
前記アッセイが、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される、請求項２７又は請求項２８記載の部品のキット。
【請求項３０】
前記アッセイが検出可能なタンパク質を含む、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の部品のキット。
【請求項３１】
前記検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である、請求項３０記載の部品のキット。
【請求項３２】
前記検出可能なタンパク質が酵素である、請求項３０記載の部品のキット。
【請求項３３】
前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項３２記載の部品のキット。
【請求項３４】
前記キットがさらに酵素に対する基質を備える、請求項３２又は請求項３３記載の部品のキット。
【請求項３５】
前記酵素がニトロ還元酵素であり、前記基質がその基質である、請求項３４記載の部品のキット。
【請求項１】
宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のインビトロキャラクタリゼーション方法であって、
ａ）複数のウィルスコード化アッセイの第１のセットからのアッセイを、複数の容器を含む第２のセット内に位置する宿主細胞で一過的に発現させ、
ｂ）適宜、被験因子を１以上の容器に添加し、
ｃ）１以上のアッセイの測定を実施し、
ｄ）アッセイの測定値を組合せてデータセットを生成し、
ｅ）データセットを分析して被験因子の機能的特性を求める
ことを含んでなり、上記アッセイの測定を生細胞で非破壊的に実施することを特徴とする方法。
【請求項２】
１種以上の異なるウィルスコード化アッセイを各容器内の宿主細胞で発現させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各容器が異なる宿主細胞を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
各容器が同一の宿主細胞又は同一の宿主細胞の遺伝的変異体を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
アデノウィルスベクターを用いてウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
組換えヒト昆虫ウィルスベクターを用いてウィルスコード化アッセイを宿主細胞で発現させる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイが検出可能なタンパク質を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は変性ＧＦＰである、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】
改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、Ｆ６４Ｌ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｉ、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群から選択される１以上の突然変異を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能なタンパク質が酵素である、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が真核細胞であり、該細胞が遺伝子改変されたものでも或いは遺伝子改変されていないものでもよい、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記被験因子が化学作用因子又は物理作用因子である、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記化学作用因子が有機又は無機化合物である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記有機化合物が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記物理作用因子が電磁放射線である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）を行わずに、前記被験因子の非存在下で当該方法を実施する、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
分析ステップｅ）が、被験因子の存在下で得られた各アッセイ測定値を、被験因子の非存在下での同じアッセイの測定値と比較する、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
被験因子の非存在下でのアッセイ測定値が既知であってデータベースに記憶されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイをイメージング装置を用いて測定する、請求項１乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記イメージング装置がＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
細胞集団に対する被験因子の活性及び／又は機能の自動化キャラクタリゼーション装置であって、請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法をイメージング装置及びコンピューター化されたデータ処理装置と共に用いることを含む、装置。
【請求項２７】
宿主細胞内での情報伝達経路及び／又は細胞プロセスに対する被験因子の活性及び／又は機能のキャラクタリゼーションのための複数のウィルスコード化アッセイを備える部品のキット。
【請求項２８】
前記ウィルスコード化アッセイがアデノウィルスベクター又は組換えヒト昆虫ウィルスベクターを含む、請求項２７記載の部品のキット。
【請求項２９】
前記アッセイが、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、グルココルチコイド受容体（ＧＣＣＲ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＲＫ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＳＴＡＴ３、ＮＦＡＴ１、ＳＭＡＤ２、ＡＫＴ１−ＰＨ、ＦＹＶＥ−ＰＨ、ＰＬＣ−ＰＨ及びＲａｃ１からなる群から選択される、請求項２７又は請求項２８記載の部品のキット。
【請求項３０】
前記アッセイが検出可能なタンパク質を含む、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の部品のキット。
【請求項３１】
前記検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質又は改変蛍光タンパク質である、請求項３０記載の部品のキット。
【請求項３２】
前記検出可能なタンパク質が酵素である、請求項３０記載の部品のキット。
【請求項３３】
前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、アルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼからなる群から選択される、請求項３２記載の部品のキット。
【請求項３４】
前記キットがさらに酵素に対する基質を備える、請求項３２又は請求項３３記載の部品のキット。
【請求項３５】
前記酵素がニトロ還元酵素であり、前記基質がその基質である、請求項３４記載の部品のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５３５９６２（Ｐ２００７−５３５９６２Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１２３１７（Ｐ２００７−５１２３１７）
【出願日】平成１７年５月５日（２００５．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１７０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０９００３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月５日（２００５．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１７０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０９００３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]