化合物及び前記化合物を有する造影剤
【課題】診断および治療のための医用イメージング技術において、標的結合部と信号発生部からなる化合物が造影に用いられる。しかし造影のための化合物は生体内に存在するプロテアーゼによって切断される場合がある。切断によって、信号発生部が遊離すれば、病変部位に局在せず生体内に分散し、その結果、バックグラウンドノイズが大きくなり問題であった。本発明は生体内での安定性を向上させた化合物、およびそれを用いた腫瘍の検出方法を提供することを課題とする。
【解決手段】抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物を提供する。本発明の化合物は、アルブミン結合部にアルブミンが結合し、分子が安定し、プロテアーゼによって切断されることを防ぐ。
【解決手段】抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物を提供する。本発明の化合物は、アルブミン結合部にアルブミンが結合し、分子が安定し、プロテアーゼによって切断されることを防ぐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
化合物及び前記化合物を有する造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断、治療などを目的とし、生体、臓器、あるいはそれらに含まれる病変部位等を画像化する技術を医用イメージングという。医用イメージングにおいては、造影剤を用いることで、病変部位等の有無、存在量、あるいは生理活性を画像として表示する（造影）ことができる。造影剤は病変部位（腫瘍または感染性病変など）に局在して、信号を発する。
【０００３】
高コントラストに病変部位を造影するために、信号発生部のシグナルをできるだけ特異的に病変部位へ局在させ、その他の部位のバックグラウンドノイズを低下させることが求められる。このため、信号発生部に病変のマーカーと結合する標的結合部位を結合した化合物（このような構造をとる化合物を本明細書中でコンジュゲート分子という場合がある）が造影剤として用いられる。コンジュゲート分子の標的結合部位は病変部位に関連するマーカーなどの分子を特異的に認識する。
【０００４】
コンジュゲート分子において、信号発生部を標的結合部に直接結合すると標的結合部の結合能が妨げられる場合がある。この点を改善するために、信号発生部と標的結合部の間にリンカーを設けたコンジュゲート分子が知られる。一方、リンカー部は、二次構造をとらないため、プロテアーゼによって切断され易いという問題があった。
【０００５】
血清タンパク質の中で最も多く含まれるのはアルブミンである。血清アルブミンは生体内の特定の物質に結合して保持や運搬といった機能を果たす。生物学的に活性なタンパク質を生体内に投与すると、免疫反応を生じることがあるが、そのタンパク質にアルブミンを結合していると、免疫反応が減るということが知られている。
【０００６】
特許文献１は、生体内に投与する、生物学的に活性なタンパク質と血清アルブミンが結合した分子を記載する。ただし、アルブミンを結合させることで、リンカー部の切断を抑制することについては開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５３１７８８号公報
【特許文献２】特表２００４−５３５３７３号公報
【特許文献３】特表２００８−５１５８８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅａｓ Ｊｏｎｓｓｏｎ, ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．， ２１， ５１５−５２７， ２００８
【非特許文献２】Ｍａｒｋ Ｓ． Ｄｅｎｎｉｓ， ｅｔ． ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７７， ３５０３５−３５０４３， ２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
診断および治療のための医用イメージング技術において、標的結合部と信号発生部からなる化合物を生体内へ投与した場合、特に分子内のリンカー部が生体内に存在するプロテアーゼによって切断される場合がある。切断によって、信号発生部が遊離すれば、病変部位に局在せず生体内に分散し、その結果、バックグラウンドノイズが大きくなり問題であった。
【００１０】
本願は生体内での安定性を向上させた化合物、およびそれを用いた腫瘍の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化合物は、血中等において、そのアルブミン結合部にアルブミンが結合し、分子が安定し、プロテアーゼによって切断されることを防ぐ。その結果、切断された状態の信号発生部が非特異的に局在することがなく、バックグラウンドを低減することができる。また、本発明の化合物は、アルブミンと結合することで分子量が増大し、その滞留性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の化合物の模式図を示す。
【図２】マウス血清アルブミン溶液（灰色線）、および分子Ａとマウス血清アルブミンとの混合溶液（黒線）のゲルろ過クロマトグラムを示す。
【図３】分子ＢのＭＭＰ２基質配列の残存率を示す。黒はアルブミン非存在下、白はアルブミン存在下を示す。
【図４】アルブミン存在下での、分子Ｂと分子ＣのＭＭＰ２基質配列の残存率を示す。黒は分子Ｃ、白は分子Ｂを示す。
【図５】分子ＤのＭＭＰ２基質切断率の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗体部と、信号発生部と、アルブミン結合部を有し、アルブミン結合部が化合物の切断を阻害することを特徴とする化合物を提供する。本発明の化合物においては、アルブミン結合部に、アルブミンが結合することで、プロテアーゼによって切断されることを妨げる。その結果、切断された状態の信号発生部が非特異的に局在することがなく、バックグラウンドを低減することができる。
【００１５】
図１に、本発明の化合物の模式図を示す。図１中１は抗体部、２はアルブミン結合部、３は信号発生部、４はリンカー部、５はアルブミンを示す。アルブミン結合部２に、５で示すアルブミンが結合することで、抗体部２および、信号発生部３および、リンカー部４の近傍は立体的に混み合った状態となる。これによって大きな流体力学的半径を持つプロテアーゼの接近を妨げ、特にリンカー部がプロテアーゼにより切断されることを阻害する効果を奏する。
【００１６】
なお、図１に示した模式図は本発明の化合物の１例であり、本発明の範囲はこの分子形態に限定されない。
【００１７】
（抗体部）
本発明の化合物において、抗体部は、抗体または人工抗体、あるいはその誘導体である。抗体とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーのタンパク質の総称であり、特定の標的分子を認識し、かつこの標的分子に結合することが可能である。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であり得、または他の種から由来し得る。抗体は、可変ドメインと定常ドメインから成り、可変ドメインは、抗体の結合特異性を決定するものであり、一方、定常ドメインは様々な生理活性機能をもたらす。
【００１８】
人工抗体とは、抗体の一部分であり、標的分子結合能を有するそれらの誘導体のことをいう。人工抗体の例としては、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン等であり、特に好ましくはペプチドリンカーで重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結した一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）が挙げられる。人工抗体は、抗体に比べ、分子サイズが小さくなる結果、高い組織浸透性や早いクリアランス速度を有する事から造影剤としての応用が期待されている。一方、抗体に比べると、人工抗体は生体内安定性が低いことが知られている。本発明の化合物においては、人工抗体を用いた場合であっても、実施例で後述するように、抗体部として、人工抗体を用いた場合、本発明の分子安定性、人工抗体の長所を生かした優れた造影剤として機能する。
【００１９】
標的分子としては、例えば癌関連抗原であるＶａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ファミリー、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、エンドグリン、ＭＵＣファミリーなどが例示される。標的となる抗原に応じた抗体を用いる事で、その標的に結合する本発明にかかる化合物を調製することができる。特に好ましくは、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａであり、実施例で後述するように、本発明の化合物は、これらの標的に対して高い結合性を有する。
【００２０】
抗体部として、好ましい配列の例は配列番号５で示される次の配列である。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号５）
【００２１】
（アルブミン結合部）
アルブミン結合部は、少なくとも下記のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。なお、配列番号６から９は非特許文献１を参照することができる。また、配列番号１０から４７は特許文献２、３あるいは非特許文献２を参照することができる。
【００２２】
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVKALIDEILAALP（配列番号６）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP（配列番号７）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP（配列番号８）
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP（配列番号９）
RLIEDICLPRWGCLWEDD（配列番号１０）
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF（配列番号１１）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK（配列番号１２）
GEWWEDICLPRWGCLWEEED（配列番号１３）
QRQMVDFCLPQWGCLWGDGF（配列番号１４）
QRHPEDICLPRWGCLWGDDD（配列番号１５）
NRQMEDICLPQWGCLWGDDF（配列番号１６）
QRLMEDICLPRWGCLWGDRF（配列番号１７）
QWHMEDICLPQWGCLWQDVL（配列番号１８）
QWQMENVCLPKWGCLWEELD（配列番号１９）
LWAMEDICLPKWGCLWEDDF（配列番号２０）
LRLMDNICLPRWGCLWDDGF（配列番号２１）
HSQMEDICLPRWGCLWGDEL（配列番号２２）
QWQVMDICLPRWGCLWADEY（配列番号２３）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号２４）
HRLVEDICLPRWGCLWGNDF（配列番号２５）
QMHMMDICLPKWGCLWGDTS（配列番号２６）
LRIFEDICLPKWGCLWGEGF（配列番号２７）
QSYMEDICLPRWGCLSDDAS（配列番号２８）
QGDFWDICLPRWGCLSGEGY（配列番号２９）
RWQTEDVCLPKWGCLFGDGV（配列番号３０）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号３１）
LIFMEDVCLPQWGCLWEDGV（配列番号３２）
QRDMGDICLPRWGCLWEDGV（配列番号３３）
QRHMMDFCLPLWGCLWGDGY（配列番号３４）
QRPIMDFCLPKWGCLWEDGF（配列番号３５）
ERQMVDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３６）
QGYMVDFCLPRWGCLWGDAN（配列番号３７）
KMGRVDFCLPKWGCLWGDEL（配列番号３８）
QSQLEDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３９）
QGGMGDFCLPQWGCLWGEDL（配列番号４０）
QRLMWEICLPLWGCLWGDGL（配列番号４１）
QRQIMDFCLPHWGCLWGDGF（配列番号４２）
GRQVVDFCLPKWGCLWEEGL（配列番号４３）
QMQMSDFCLPQWGCLWGDGY（配列番号４４）
KSRMGDFCLPEWGCLWGDEL（配列番号４５）
ERQMEDFCLPQWGCLWGDGV（配列番号４６）
QRQVVDFCLPQWGCLWGDGS（配列番号４７）
【００２３】
（信号発生部）
信号発生部は、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、蛍光性化合物、燐光性化合物から選択される。信号発生部の具体例として、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒおよび８２Ｂｒなどの放射性ハロゲンが挙げられる。また、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、２０３Ｐｂ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１６１Ｔｂ、７２Ａｓ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、４７Ｓｃ、１４０Ｌａ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、２２７Ｔｈなどの放射性同位元素も使用できる。常磁性金属の例として、Ｇｄ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋、Ｍｎ２＋などを用いることができる。近赤外蛍光化合物の例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７９０、Ｖｉｖｏｔａｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社商標）６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ７５０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ７５０（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）、ＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、Ｃｙ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社商標）５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）などが使用できる。
【００２４】
信号発生部は、リンカー部を介して、あるいは直接アルブミン結合部に結合する。なお、それ以外のところに追加的に結合しても本発明を妨げるものではない。信号発生部とリンカー部あるいはアルブミン結合部との結合方法は限定されず、間に結合のための分子を介して結合してもよい。結合の方法としては、カルボキシル基とアミノ基、チオール基あるいはヒドロキシル基とのカップリング、あるいは、アミノ基と、スルホン酸基、ヒドロキシスクシンイミド基、アルデヒド基、チオール基、イソチオシアネート基、グリシジル基とのカップリングカップリング、あるいは、ヒドロキシル基またはチオール基とカルボキシル基、スルホン酸基、ハロゲン、ジスルヒド、マレイミド基とのカップリングなどを挙げることができる。また、信号発生部が金属または同位元素の場合は、カルボキシル、ホスホン酸またはスルホン酸基を有する残基で置換された、ジエチレントリアミンもしくはポリアミン大員環からキレート基を誘導し、これを介して結合することができる。
【００２５】
なお、信号発生部としては近赤外波長領域において吸収および発光する近赤外蛍光化合物が特に好ましい。
【００２６】
信号発生部として好ましい構造は、以下で示す化学式１の構造あるいはその誘導体、および化学式２の構造あるいはその誘導体である。
【化１】
【化２】
【００２７】
（リンカー部）
リンカー部は存在してもしなくてもよいが存在する場合はアルブミン結合部と信号発生部の間、あるいは抗体部とアルブミン結合部の間、あるいはその両方に存在する。図１で示されるのは、両方に存在する場合である。リンカー部の配列は任意のポリペプチドであってよい。リンカー部の配列の例として、本実施例で用いたアミノ酸配列AAA、アミノ酸配列HHHHHHGGC（配列番号４８）を含むポリペプチドを挙げることができる。
【００２８】
（リンカー部の長さ）
ヒト血清アルブミンと、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａのアルブミン結合部であるＧＡモジュールとの複合体の結晶構造はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）のＰＤＢ ＩＤ：１ＴＦ０で示される。配列番号６乃至９は上記ＧＡモジュールと相同性があり、この構造に基づき、本発明の化合物の構造を推定することができる。本発明の化合物に対してアルブミンが結合した際に、プロテアーゼの切断からリンカー部が保護されるためには、リンカー部の長さが６nm以下であることが望ましく、そのためには、リンカー部は０残基以上１５残基以下のアミノ酸配列であることが望ましい。
【００２９】
（検出方法）
本発明の化合物は、生体分子、例えば腫瘍関連抗原のイメージングに用いることができ、さらに、腫瘍に関連した分子の異常な発現のイメージング方法に用いることができる。
本発明の化合物は、培養された細胞や組織を対象として使用することができ、あるいは、動物、ヒトなどの生体を対象として用いることもできる。それぞれ対象の大きさなどを考慮し、測定方法を決定し、それに応じた信号発生部を選択することができる。
本発明の化合物の検出は、信号発生部に応じた検出系を用いる。検出系の例として、蛍光検出系あるいは光音響信号検出系などを挙げることができる。本発明の化合物を用いた検出は、本発明は本発明にかかる化合物を対象の標的分子と接触させる工程と、信号発生部由来の信号から生体分子の存在あるいは量、あるいは位置を検出する工程により行うことができる。
また、本発明の化合物を用いた検出は、化合物を培養細胞、生体から採取した細胞もしくは組織、又は生体に作用させる工程と、疾病に関連した抗原分子を検出することにより疾病の位置と状態をモニタリングする工程により行うことができる。
【００３０】
（造影剤）
本発明の化合物は、疾病に関連した標的分子を検出することが出来る診断用組成物、特に造影剤として用いることが出来る。
より具体的には、本発明の造影剤は腫瘍の部位で高発現している抗原分子を捕捉可能とする造影剤であり、より好ましくは、ＨＥＲ２陽性の腫瘍部位あるいはＶＥＧＦ陽性腫瘍部位の検出を可能とする造影剤である。本発明の造影剤は、疾病の診断を高感度に実施することができる低侵襲性の手段を可能とする。
本発明の造影剤は、上記化合物のほかに分散媒を含むことができる。分散媒は、本発明の化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本発明の造影剤は、あらかじめ本発明の化合物を分散媒に予め分散させておいてもよいし、あるいは本発明の化合物と分散媒とを生体内に投与する前に化合物を分散媒に分散させて使用してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例では具体的な試薬や反応条件を挙げてはいるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂されるものとする。従って以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００３２】
（実施例１ 抗体部とアルブミン結合部からなる化合物）
始めに、ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、プロテインＧ由来のアルブミン結合部からなる化合物（以下分子Ａと呼ぶ）を大腸菌発現系にて作製した（配列番号１）。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる粗精製の後、ゲルろ過によってマウス血清アルブミンとの結合を確認した（図２）。マウス血清アルブミンのみをゲルろ過した場合（灰色線）、１４ｍＬ（７０ｋＤａ）付近に溶出が確認された。一方で分子Ａとマウス血清アルブミンを混合しゲルろ過した場合（黒線）、１３ｍＬ付近（１１０ｋＤａ）に両者の複合体の溶出が確認された。この図より、分子Ａはアルブミンと結合することが示された。
【００３３】
（実施例２ 本発明の化合物）
ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、アルブミン結合部およびＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を有する化合物を大腸菌発現系にて作製した（配列番号２）。更にこの化合物のＭＭＰ２基質配列の末端に信号発生部としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０をコンジュゲートした。この化合物を以下では分子Ｂと呼ぶ。分子Ｂを、２倍量のヒト血清アルブミン存在下、または非存在下で、分子Ｂに対して４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。反応後の溶液をゲルろ過し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０に由来する吸収プロファイルを観察した。吸収プロファイルから、全蛍光色素吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されなかった蛍光色素吸収強度の割合を、基質配列の残存率としてグラフにまとめた（図３）。その結果、血清アルブミン非存在下（黒）の場合と比較して、存在下（白）ではＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３４】
（比較例１ アルブミン結合部を持たない化合物）
ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を有する化合物を大腸菌発現系にて作製した（配列番号３）。更にこの化合物のリンカー部に相当するＭＭＰ２基質配列の末端に信号発生部としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０をコンジュゲートした。この化合物を以下では分子Ｃと呼ぶ。同濃度の分子Ｂおよび分子Ｃを、２倍量のヒト血清アルブミン存在下で、４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。反応後の溶液をゲルろ過し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０に由来する吸収プロファイルを観察した。ゲルろ過の結果から、全蛍光色素吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されなかった蛍光色素吸収強度の割合を、基質配列の残存率としてグラフにまとめた（図４）。その結果分子Ｃ（黒）と比較して、分子Ｂ（白）はＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３５】
（実施例３ アルブミン結合部と信号発生部からなる化合物）
アルブミン結合部にＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を結合した配列番号４からなる配列に信号発生部としてＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）を結合した分子を作製した（以下では分子Ｄと呼ぶ）。分子Ｄを、２倍量のマウス血清アルブミン存在下、または非存在下で、分子Ｄに対して４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃でインキュベートした。インキュベート開始時を０時間として、７時間後まで適宜反応溶液を回収しゲルろ過によってＦＩＴＣの吸収プロファイルを観察した。ゲルろ過の結果から、全ＦＩＴＣ吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されたＦＩＴＣの吸収強度の割合を、基質配列の切断率としてグラフにまとめた（図５）。その結果、血清アルブミン非存在下（黒丸）の場合と比較して、存在下（白丸）ではＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３６】
更に、アルブミン結合部を持たない化合物を用いて同様の実験をおこなった結果、血清アルブミンの有無に関わらず、ＭＭＰ２によるリンカーの切断が観察された。
【技術分野】
【０００１】
化合物及び前記化合物を有する造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断、治療などを目的とし、生体、臓器、あるいはそれらに含まれる病変部位等を画像化する技術を医用イメージングという。医用イメージングにおいては、造影剤を用いることで、病変部位等の有無、存在量、あるいは生理活性を画像として表示する（造影）ことができる。造影剤は病変部位（腫瘍または感染性病変など）に局在して、信号を発する。
【０００３】
高コントラストに病変部位を造影するために、信号発生部のシグナルをできるだけ特異的に病変部位へ局在させ、その他の部位のバックグラウンドノイズを低下させることが求められる。このため、信号発生部に病変のマーカーと結合する標的結合部位を結合した化合物（このような構造をとる化合物を本明細書中でコンジュゲート分子という場合がある）が造影剤として用いられる。コンジュゲート分子の標的結合部位は病変部位に関連するマーカーなどの分子を特異的に認識する。
【０００４】
コンジュゲート分子において、信号発生部を標的結合部に直接結合すると標的結合部の結合能が妨げられる場合がある。この点を改善するために、信号発生部と標的結合部の間にリンカーを設けたコンジュゲート分子が知られる。一方、リンカー部は、二次構造をとらないため、プロテアーゼによって切断され易いという問題があった。
【０００５】
血清タンパク質の中で最も多く含まれるのはアルブミンである。血清アルブミンは生体内の特定の物質に結合して保持や運搬といった機能を果たす。生物学的に活性なタンパク質を生体内に投与すると、免疫反応を生じることがあるが、そのタンパク質にアルブミンを結合していると、免疫反応が減るということが知られている。
【０００６】
特許文献１は、生体内に投与する、生物学的に活性なタンパク質と血清アルブミンが結合した分子を記載する。ただし、アルブミンを結合させることで、リンカー部の切断を抑制することについては開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５３１７８８号公報
【特許文献２】特表２００４−５３５３７３号公報
【特許文献３】特表２００８−５１５８８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅａｓ Ｊｏｎｓｓｏｎ, ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．， ２１， ５１５−５２７， ２００８
【非特許文献２】Ｍａｒｋ Ｓ． Ｄｅｎｎｉｓ， ｅｔ． ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７７， ３５０３５−３５０４３， ２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
診断および治療のための医用イメージング技術において、標的結合部と信号発生部からなる化合物を生体内へ投与した場合、特に分子内のリンカー部が生体内に存在するプロテアーゼによって切断される場合がある。切断によって、信号発生部が遊離すれば、病変部位に局在せず生体内に分散し、その結果、バックグラウンドノイズが大きくなり問題であった。
【００１０】
本願は生体内での安定性を向上させた化合物、およびそれを用いた腫瘍の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化合物は、血中等において、そのアルブミン結合部にアルブミンが結合し、分子が安定し、プロテアーゼによって切断されることを防ぐ。その結果、切断された状態の信号発生部が非特異的に局在することがなく、バックグラウンドを低減することができる。また、本発明の化合物は、アルブミンと結合することで分子量が増大し、その滞留性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の化合物の模式図を示す。
【図２】マウス血清アルブミン溶液（灰色線）、および分子Ａとマウス血清アルブミンとの混合溶液（黒線）のゲルろ過クロマトグラムを示す。
【図３】分子ＢのＭＭＰ２基質配列の残存率を示す。黒はアルブミン非存在下、白はアルブミン存在下を示す。
【図４】アルブミン存在下での、分子Ｂと分子ＣのＭＭＰ２基質配列の残存率を示す。黒は分子Ｃ、白は分子Ｂを示す。
【図５】分子ＤのＭＭＰ２基質切断率の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗体部と、信号発生部と、アルブミン結合部を有し、アルブミン結合部が化合物の切断を阻害することを特徴とする化合物を提供する。本発明の化合物においては、アルブミン結合部に、アルブミンが結合することで、プロテアーゼによって切断されることを妨げる。その結果、切断された状態の信号発生部が非特異的に局在することがなく、バックグラウンドを低減することができる。
【００１５】
図１に、本発明の化合物の模式図を示す。図１中１は抗体部、２はアルブミン結合部、３は信号発生部、４はリンカー部、５はアルブミンを示す。アルブミン結合部２に、５で示すアルブミンが結合することで、抗体部２および、信号発生部３および、リンカー部４の近傍は立体的に混み合った状態となる。これによって大きな流体力学的半径を持つプロテアーゼの接近を妨げ、特にリンカー部がプロテアーゼにより切断されることを阻害する効果を奏する。
【００１６】
なお、図１に示した模式図は本発明の化合物の１例であり、本発明の範囲はこの分子形態に限定されない。
【００１７】
（抗体部）
本発明の化合物において、抗体部は、抗体または人工抗体、あるいはその誘導体である。抗体とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーのタンパク質の総称であり、特定の標的分子を認識し、かつこの標的分子に結合することが可能である。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であり得、または他の種から由来し得る。抗体は、可変ドメインと定常ドメインから成り、可変ドメインは、抗体の結合特異性を決定するものであり、一方、定常ドメインは様々な生理活性機能をもたらす。
【００１８】
人工抗体とは、抗体の一部分であり、標的分子結合能を有するそれらの誘導体のことをいう。人工抗体の例としては、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン等であり、特に好ましくはペプチドリンカーで重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結した一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）が挙げられる。人工抗体は、抗体に比べ、分子サイズが小さくなる結果、高い組織浸透性や早いクリアランス速度を有する事から造影剤としての応用が期待されている。一方、抗体に比べると、人工抗体は生体内安定性が低いことが知られている。本発明の化合物においては、人工抗体を用いた場合であっても、実施例で後述するように、抗体部として、人工抗体を用いた場合、本発明の分子安定性、人工抗体の長所を生かした優れた造影剤として機能する。
【００１９】
標的分子としては、例えば癌関連抗原であるＶａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ファミリー、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ファミリー、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、エンドグリン、ＭＵＣファミリーなどが例示される。標的となる抗原に応じた抗体を用いる事で、その標的に結合する本発明にかかる化合物を調製することができる。特に好ましくは、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａであり、実施例で後述するように、本発明の化合物は、これらの標的に対して高い結合性を有する。
【００２０】
抗体部として、好ましい配列の例は配列番号５で示される次の配列である。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号５）
【００２１】
（アルブミン結合部）
アルブミン結合部は、少なくとも下記のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。なお、配列番号６から９は非特許文献１を参照することができる。また、配列番号１０から４７は特許文献２、３あるいは非特許文献２を参照することができる。
【００２２】
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVKALIDEILAALP（配列番号６）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP（配列番号７）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP（配列番号８）
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP（配列番号９）
RLIEDICLPRWGCLWEDD（配列番号１０）
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF（配列番号１１）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK（配列番号１２）
GEWWEDICLPRWGCLWEEED（配列番号１３）
QRQMVDFCLPQWGCLWGDGF（配列番号１４）
QRHPEDICLPRWGCLWGDDD（配列番号１５）
NRQMEDICLPQWGCLWGDDF（配列番号１６）
QRLMEDICLPRWGCLWGDRF（配列番号１７）
QWHMEDICLPQWGCLWQDVL（配列番号１８）
QWQMENVCLPKWGCLWEELD（配列番号１９）
LWAMEDICLPKWGCLWEDDF（配列番号２０）
LRLMDNICLPRWGCLWDDGF（配列番号２１）
HSQMEDICLPRWGCLWGDEL（配列番号２２）
QWQVMDICLPRWGCLWADEY（配列番号２３）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号２４）
HRLVEDICLPRWGCLWGNDF（配列番号２５）
QMHMMDICLPKWGCLWGDTS（配列番号２６）
LRIFEDICLPKWGCLWGEGF（配列番号２７）
QSYMEDICLPRWGCLSDDAS（配列番号２８）
QGDFWDICLPRWGCLSGEGY（配列番号２９）
RWQTEDVCLPKWGCLFGDGV（配列番号３０）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号３１）
LIFMEDVCLPQWGCLWEDGV（配列番号３２）
QRDMGDICLPRWGCLWEDGV（配列番号３３）
QRHMMDFCLPLWGCLWGDGY（配列番号３４）
QRPIMDFCLPKWGCLWEDGF（配列番号３５）
ERQMVDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３６）
QGYMVDFCLPRWGCLWGDAN（配列番号３７）
KMGRVDFCLPKWGCLWGDEL（配列番号３８）
QSQLEDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３９）
QGGMGDFCLPQWGCLWGEDL（配列番号４０）
QRLMWEICLPLWGCLWGDGL（配列番号４１）
QRQIMDFCLPHWGCLWGDGF（配列番号４２）
GRQVVDFCLPKWGCLWEEGL（配列番号４３）
QMQMSDFCLPQWGCLWGDGY（配列番号４４）
KSRMGDFCLPEWGCLWGDEL（配列番号４５）
ERQMEDFCLPQWGCLWGDGV（配列番号４６）
QRQVVDFCLPQWGCLWGDGS（配列番号４７）
【００２３】
（信号発生部）
信号発生部は、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、蛍光性化合物、燐光性化合物から選択される。信号発生部の具体例として、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒおよび８２Ｂｒなどの放射性ハロゲンが挙げられる。また、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、２０３Ｐｂ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１６１Ｔｂ、７２Ａｓ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、４７Ｓｃ、１４０Ｌａ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、２２７Ｔｈなどの放射性同位元素も使用できる。常磁性金属の例として、Ｇｄ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋、Ｍｎ２＋などを用いることができる。近赤外蛍光化合物の例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７９０、Ｖｉｖｏｔａｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社商標）６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ７５０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ７５０（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）、ＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、Ｃｙ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社商標）５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）などが使用できる。
【００２４】
信号発生部は、リンカー部を介して、あるいは直接アルブミン結合部に結合する。なお、それ以外のところに追加的に結合しても本発明を妨げるものではない。信号発生部とリンカー部あるいはアルブミン結合部との結合方法は限定されず、間に結合のための分子を介して結合してもよい。結合の方法としては、カルボキシル基とアミノ基、チオール基あるいはヒドロキシル基とのカップリング、あるいは、アミノ基と、スルホン酸基、ヒドロキシスクシンイミド基、アルデヒド基、チオール基、イソチオシアネート基、グリシジル基とのカップリングカップリング、あるいは、ヒドロキシル基またはチオール基とカルボキシル基、スルホン酸基、ハロゲン、ジスルヒド、マレイミド基とのカップリングなどを挙げることができる。また、信号発生部が金属または同位元素の場合は、カルボキシル、ホスホン酸またはスルホン酸基を有する残基で置換された、ジエチレントリアミンもしくはポリアミン大員環からキレート基を誘導し、これを介して結合することができる。
【００２５】
なお、信号発生部としては近赤外波長領域において吸収および発光する近赤外蛍光化合物が特に好ましい。
【００２６】
信号発生部として好ましい構造は、以下で示す化学式１の構造あるいはその誘導体、および化学式２の構造あるいはその誘導体である。
【化１】
【化２】
【００２７】
（リンカー部）
リンカー部は存在してもしなくてもよいが存在する場合はアルブミン結合部と信号発生部の間、あるいは抗体部とアルブミン結合部の間、あるいはその両方に存在する。図１で示されるのは、両方に存在する場合である。リンカー部の配列は任意のポリペプチドであってよい。リンカー部の配列の例として、本実施例で用いたアミノ酸配列AAA、アミノ酸配列HHHHHHGGC（配列番号４８）を含むポリペプチドを挙げることができる。
【００２８】
（リンカー部の長さ）
ヒト血清アルブミンと、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａのアルブミン結合部であるＧＡモジュールとの複合体の結晶構造はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）のＰＤＢ ＩＤ：１ＴＦ０で示される。配列番号６乃至９は上記ＧＡモジュールと相同性があり、この構造に基づき、本発明の化合物の構造を推定することができる。本発明の化合物に対してアルブミンが結合した際に、プロテアーゼの切断からリンカー部が保護されるためには、リンカー部の長さが６nm以下であることが望ましく、そのためには、リンカー部は０残基以上１５残基以下のアミノ酸配列であることが望ましい。
【００２９】
（検出方法）
本発明の化合物は、生体分子、例えば腫瘍関連抗原のイメージングに用いることができ、さらに、腫瘍に関連した分子の異常な発現のイメージング方法に用いることができる。
本発明の化合物は、培養された細胞や組織を対象として使用することができ、あるいは、動物、ヒトなどの生体を対象として用いることもできる。それぞれ対象の大きさなどを考慮し、測定方法を決定し、それに応じた信号発生部を選択することができる。
本発明の化合物の検出は、信号発生部に応じた検出系を用いる。検出系の例として、蛍光検出系あるいは光音響信号検出系などを挙げることができる。本発明の化合物を用いた検出は、本発明は本発明にかかる化合物を対象の標的分子と接触させる工程と、信号発生部由来の信号から生体分子の存在あるいは量、あるいは位置を検出する工程により行うことができる。
また、本発明の化合物を用いた検出は、化合物を培養細胞、生体から採取した細胞もしくは組織、又は生体に作用させる工程と、疾病に関連した抗原分子を検出することにより疾病の位置と状態をモニタリングする工程により行うことができる。
【００３０】
（造影剤）
本発明の化合物は、疾病に関連した標的分子を検出することが出来る診断用組成物、特に造影剤として用いることが出来る。
より具体的には、本発明の造影剤は腫瘍の部位で高発現している抗原分子を捕捉可能とする造影剤であり、より好ましくは、ＨＥＲ２陽性の腫瘍部位あるいはＶＥＧＦ陽性腫瘍部位の検出を可能とする造影剤である。本発明の造影剤は、疾病の診断を高感度に実施することができる低侵襲性の手段を可能とする。
本発明の造影剤は、上記化合物のほかに分散媒を含むことができる。分散媒は、本発明の化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本発明の造影剤は、あらかじめ本発明の化合物を分散媒に予め分散させておいてもよいし、あるいは本発明の化合物と分散媒とを生体内に投与する前に化合物を分散媒に分散させて使用してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例では具体的な試薬や反応条件を挙げてはいるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂されるものとする。従って以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００３２】
（実施例１ 抗体部とアルブミン結合部からなる化合物）
始めに、ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、プロテインＧ由来のアルブミン結合部からなる化合物（以下分子Ａと呼ぶ）を大腸菌発現系にて作製した（配列番号１）。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる粗精製の後、ゲルろ過によってマウス血清アルブミンとの結合を確認した（図２）。マウス血清アルブミンのみをゲルろ過した場合（灰色線）、１４ｍＬ（７０ｋＤａ）付近に溶出が確認された。一方で分子Ａとマウス血清アルブミンを混合しゲルろ過した場合（黒線）、１３ｍＬ付近（１１０ｋＤａ）に両者の複合体の溶出が確認された。この図より、分子Ａはアルブミンと結合することが示された。
【００３３】
（実施例２ 本発明の化合物）
ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、アルブミン結合部およびＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を有する化合物を大腸菌発現系にて作製した（配列番号２）。更にこの化合物のＭＭＰ２基質配列の末端に信号発生部としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０をコンジュゲートした。この化合物を以下では分子Ｂと呼ぶ。分子Ｂを、２倍量のヒト血清アルブミン存在下、または非存在下で、分子Ｂに対して４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。反応後の溶液をゲルろ過し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０に由来する吸収プロファイルを観察した。吸収プロファイルから、全蛍光色素吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されなかった蛍光色素吸収強度の割合を、基質配列の残存率としてグラフにまとめた（図３）。その結果、血清アルブミン非存在下（黒）の場合と比較して、存在下（白）ではＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３４】
（比較例１ アルブミン結合部を持たない化合物）
ＨＥＲ２へ結合するｓｃＦｖ（抗体部）と、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を有する化合物を大腸菌発現系にて作製した（配列番号３）。更にこの化合物のリンカー部に相当するＭＭＰ２基質配列の末端に信号発生部としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０をコンジュゲートした。この化合物を以下では分子Ｃと呼ぶ。同濃度の分子Ｂおよび分子Ｃを、２倍量のヒト血清アルブミン存在下で、４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。反応後の溶液をゲルろ過し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０に由来する吸収プロファイルを観察した。ゲルろ過の結果から、全蛍光色素吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されなかった蛍光色素吸収強度の割合を、基質配列の残存率としてグラフにまとめた（図４）。その結果分子Ｃ（黒）と比較して、分子Ｂ（白）はＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３５】
（実施例３ アルブミン結合部と信号発生部からなる化合物）
アルブミン結合部にＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２（ＭＭＰ２）の基質配列からなるリンカー部を結合した配列番号４からなる配列に信号発生部としてＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）を結合した分子を作製した（以下では分子Ｄと呼ぶ）。分子Ｄを、２倍量のマウス血清アルブミン存在下、または非存在下で、分子Ｄに対して４０００分の１量のＭＭＰ２と共に３７℃でインキュベートした。インキュベート開始時を０時間として、７時間後まで適宜反応溶液を回収しゲルろ過によってＦＩＴＣの吸収プロファイルを観察した。ゲルろ過の結果から、全ＦＩＴＣ吸収強度に対する、ＭＭＰ２によって切断されたＦＩＴＣの吸収強度の割合を、基質配列の切断率としてグラフにまとめた（図５）。その結果、血清アルブミン非存在下（黒丸）の場合と比較して、存在下（白丸）ではＭＭＰ２による酵素的切断が抑制されていることが確認できた。
【００３６】
更に、アルブミン結合部を持たない化合物を用いて同様の実験をおこなった結果、血清アルブミンの有無に関わらず、ＭＭＰ２によるリンカーの切断が観察された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】
抗体部と、信号発生部とが、アルブミン結合部を介して結合していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
抗体部とアルブミン結合部の間、あるいは信号発生部とアルブミン結合部の間、あるいはその両方にリンカー部を有することを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
抗体部が一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
抗体部がＨＥＲ２に結合することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
抗体部が、以下の配列番号５の下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号５）
【請求項７】
アルブミン結合部が、以下の配列番号６から４７のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVKALIDEILAALP（配列番号６）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP（配列番号７）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP（配列番号８）
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP（配列番号９）
RLIEDICLPRWGCLWEDD（配列番号１０）
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF（配列番号１１）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK（配列番号１２）
GEWWEDICLPRWGCLWEEED（配列番号１３）
QRQMVDFCLPQWGCLWGDGF（配列番号１４）
QRHPEDICLPRWGCLWGDDD（配列番号１５）
NRQMEDICLPQWGCLWGDDF（配列番号１６）
QRLMEDICLPRWGCLWGDRF（配列番号１７）
QWHMEDICLPQWGCLWQDVL（配列番号１８）
QWQMENVCLPKWGCLWEELD（配列番号１９）
LWAMEDICLPKWGCLWEDDF（配列番号２０）
LRLMDNICLPRWGCLWDDGF（配列番号２１）
HSQMEDICLPRWGCLWGDEL（配列番号２２）
QWQVMDICLPRWGCLWADEY（配列番号２３）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号２４）
HRLVEDICLPRWGCLWGNDF（配列番号２５）
QMHMMDICLPKWGCLWGDTS（配列番号２６）
LRIFEDICLPKWGCLWGEGF（配列番号２７）
QSYMEDICLPRWGCLSDDAS（配列番号２８）
QGDFWDICLPRWGCLSGEGY（配列番号２９）
RWQTEDVCLPKWGCLFGDGV（配列番号３０）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号３１）
LIFMEDVCLPQWGCLWEDGV（配列番号３２）
QRDMGDICLPRWGCLWEDGV（配列番号３３）
QRHMMDFCLPLWGCLWGDGY（配列番号３４）
QRPIMDFCLPKWGCLWEDGF（配列番号３５）
ERQMVDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３６）
QGYMVDFCLPRWGCLWGDAN（配列番号３７）
KMGRVDFCLPKWGCLWGDEL（配列番号３８）
QSQLEDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３９）
QGGMGDFCLPQWGCLWGEDL（配列番号４０）
QRLMWEICLPLWGCLWGDGL（配列番号４１）
QRQIMDFCLPHWGCLWGDGF（配列番号４２）
GRQVVDFCLPKWGCLWEEGL（配列番号４３）
QMQMSDFCLPQWGCLWGDGY（配列番号４４）
KSRMGDFCLPEWGCLWGDEL（配列番号４５）
ERQMEDFCLPQWGCLWGDGV（配列番号４６）
QRQVVDFCLPQWGCLWGDGS（配列番号４７）
【請求項８】
リンカー部が、以下の配列番号４８または以下に示す配列のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
HHHHHHGGC（配列番号４８）
AAA
【請求項９】
信号発生部が、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、蛍光性化合物、燐光性化合物を少なくとも１つ以上含んでいる請求項１乃至８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
信号発生部が次の化学式１で表される構造またはその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１】
【請求項１１】
信号発生部が次の化学式２で表される構造またはその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の化合物。
【化２】
【請求項１２】
前記請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物と、分散媒とを有することを特徴とする造影剤。
【請求項１】
抗体部と、アルブミン結合部と、信号発生部を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】
抗体部と、信号発生部とが、アルブミン結合部を介して結合していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
抗体部とアルブミン結合部の間、あるいは信号発生部とアルブミン結合部の間、あるいはその両方にリンカー部を有することを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
抗体部が一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
抗体部がＨＥＲ２に結合することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
抗体部が、以下の配列番号５の下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号５）
【請求項７】
アルブミン結合部が、以下の配列番号６から４７のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVKALIDEILAALP（配列番号６）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP（配列番号７）
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP（配列番号８）
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP（配列番号９）
RLIEDICLPRWGCLWEDD（配列番号１０）
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF（配列番号１１）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK（配列番号１２）
GEWWEDICLPRWGCLWEEED（配列番号１３）
QRQMVDFCLPQWGCLWGDGF（配列番号１４）
QRHPEDICLPRWGCLWGDDD（配列番号１５）
NRQMEDICLPQWGCLWGDDF（配列番号１６）
QRLMEDICLPRWGCLWGDRF（配列番号１７）
QWHMEDICLPQWGCLWQDVL（配列番号１８）
QWQMENVCLPKWGCLWEELD（配列番号１９）
LWAMEDICLPKWGCLWEDDF（配列番号２０）
LRLMDNICLPRWGCLWDDGF（配列番号２１）
HSQMEDICLPRWGCLWGDEL（配列番号２２）
QWQVMDICLPRWGCLWADEY（配列番号２３）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号２４）
HRLVEDICLPRWGCLWGNDF（配列番号２５）
QMHMMDICLPKWGCLWGDTS（配列番号２６）
LRIFEDICLPKWGCLWGEGF（配列番号２７）
QSYMEDICLPRWGCLSDDAS（配列番号２８）
QGDFWDICLPRWGCLSGEGY（配列番号２９）
RWQTEDVCLPKWGCLFGDGV（配列番号３０）
QGLIGDICLPRWGCLWGDSV（配列番号３１）
LIFMEDVCLPQWGCLWEDGV（配列番号３２）
QRDMGDICLPRWGCLWEDGV（配列番号３３）
QRHMMDFCLPLWGCLWGDGY（配列番号３４）
QRPIMDFCLPKWGCLWEDGF（配列番号３５）
ERQMVDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３６）
QGYMVDFCLPRWGCLWGDAN（配列番号３７）
KMGRVDFCLPKWGCLWGDEL（配列番号３８）
QSQLEDFCLPKWGCLWGDGF（配列番号３９）
QGGMGDFCLPQWGCLWGEDL（配列番号４０）
QRLMWEICLPLWGCLWGDGL（配列番号４１）
QRQIMDFCLPHWGCLWGDGF（配列番号４２）
GRQVVDFCLPKWGCLWEEGL（配列番号４３）
QMQMSDFCLPQWGCLWGDGY（配列番号４４）
KSRMGDFCLPEWGCLWGDEL（配列番号４５）
ERQMEDFCLPQWGCLWGDGV（配列番号４６）
QRQVVDFCLPQWGCLWGDGS（配列番号４７）
【請求項８】
リンカー部が、以下の配列番号４８または以下に示す配列のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
HHHHHHGGC（配列番号４８）
AAA
【請求項９】
信号発生部が、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、蛍光性化合物、燐光性化合物を少なくとも１つ以上含んでいる請求項１乃至８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
信号発生部が次の化学式１で表される構造またはその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１】
【請求項１１】
信号発生部が次の化学式２で表される構造またはその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の化合物。
【化２】
【請求項１２】
前記請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物と、分散媒とを有することを特徴とする造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１７２８１（Ｐ２０１２−１７２８１Ａ）
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５４８２７（Ｐ２０１０−１５４８２７）
【出願日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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