化学修飾した細胞接着性ポリペプチド
【課題】低濃度においても細胞接着性が優れ、細胞増殖性に優れた細胞接着性ポリペプチドを提供する。
【解決手段】少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチド。
【解決手段】少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学修飾した細胞接着性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工の細胞接着性ポリペプチドとして、プロネクチンＦ｛Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝及びプロネクチンＬ｛Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝（非特許文献１）が知られている。また、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有し、（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００個数％である細胞接着性ポリペプチド（特許文献１）が知られている。さらに、化学修飾した人工の細胞接着性ポリペプチドとして、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド等）で修飾した水溶性の直鎖状ポリペプチド（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ハンドブック オブ バイオデグラダブル ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド アカデミック パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Ａｂｒａｈａｍ Ｊ． Ｄｏｍｂら著， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９７年）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１０６号公報
【特許文献２】特表平１０−５００７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、従来の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性が不十分であり、細胞増殖性が低いという問題点がある。一方、細胞接着性ポリペプチドを高濃度で用いることにより細胞接着性を補うこともできるが、経済的に問題がある。
本発明の目的は、低濃度においても細胞接着性が優れ、細胞増殖性に優れた細胞接着性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドに特定の官能基を化学修飾することにより上記目的を達成を達成することを見出し本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、
カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチドである。
【０００８】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、上記の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）を含むものである。
【０００９】
また、本発明の細胞又は細胞集合体の生産方法は、上記の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含むものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、低濃度であっても、細胞接着性が優れている。したがって、基材等の細胞接着表面に対する細胞接着性ポリペプチドのコーティング量を減らしても、高い接着性を得られ、それにより高い細胞増殖性を得られる。また、細胞接着性ポリペプチドを高濃度で用いる必要がないため、経済的にも優れる。
【００１１】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、上記の細胞接着性ポリペプチドを含むため、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、低濃度においても細胞接着性が優れ、優れた細胞増殖性を発揮する。
【００１２】
また、本発明の細胞又は細胞集合体の生産方法は、上記の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養するため、効率よく細胞又は細胞集合体を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞接着活性の変化を表したグラフである。
【図２】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞接着活性の変化を表したグラフである。
【図３】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞増殖活性の変化を表したグラフである。
【図４】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
「細胞増殖性」とは細胞が基材に接着することにより細胞内シグナル伝達経路が活性化され、成長、分裂、生存する性質を意味する（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ 細胞生物学、第２版、７０６頁、２００５年）。
【００１５】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００１６】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ 配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）、Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ配列（１２）、Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ配列（１３）、Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ配列（１４）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ配列（１５）、Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ配列（９５）、Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ配列（９６）、Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（９７）及びＰｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ配列（９８）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）及びＡｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列である。
【００１７】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むことが好ましい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）以外のアミノ酸配列が含まれ、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及び／又はヒスチジン（Ｈｉｓ）等から構成されるアミノ酸配列が含まれる。
【００１８】
介在アミノ酸配列（Ｚ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（６３）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６４）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６５）、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６６）、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６７）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６８）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７１）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７２）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７３）及びＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ配列（７４）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していることが好ましく、さらに好ましくはＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（６３）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６４）及びＡｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６５）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していること、特に好ましくはＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）を結合していることである。
【００１９】
介在アミノ酸配列（Ｚ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（７６）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７７）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ配列（７８）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（８０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８１）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８２）、Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（８３）、Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８４）及びＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していることが好ましく、さらに好ましくはＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（７６）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７７）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ配列（７８）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（８０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８１）及びＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８２）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していること、特に好ましくはＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）を結合していることである。
【００２０】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１８個有するものである。
なお、２種以上の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００２１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、耐熱性、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、Ｇｌｙ及び／又はＡｌａを有するものが好ましく、例えば（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ）ｉ、（Ａｌａ）ｊ、（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｋ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列、（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ）ｏ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ）ｐ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ）ｑ配列を有するものが好ましい。これらのうち、熱に対する安定性の観点から、（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有するものであり、特に好ましくは（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列を有するものである。
【００２２】
なお、ａは５〜１００の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは１〜｛２００／（６＋ｆ）の小数点以下を切り捨てした数｝の整数、ｈは２〜４０の整数、ｉ及びｊは１０〜２００の整数、ｋは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００２３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン（Ｇｌｙ）及び／又はアラニン（Ａｌａ）を含むことが好ましい。グリシン（Ｇｌｙ）及び／又はアラニン（Ａｌａ）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
【００２４】
補助アミノ酸配列（Ｙ）にグリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
【００２５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）等｝を含んでいてもよい。
【００２６】
（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１６）〜（１８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１９）〜（２１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２２）〜（２４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２５）〜（２７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２８）〜（３０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３１）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ）ｉ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３８）〜（４０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ａｌａ）ｊ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４１）〜（４３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｋ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４４）〜（４６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４７）〜（４９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５０）〜（５２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５３）〜（５５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５６）〜（５８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５９）〜（６１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２７】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱に対する安定性の観点から、配列番号（１６）、（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２８）、（２９）、（３１）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（３９）、（４１）、（４２）、（４４）、（４５）、（４７）、（４８）、（５０）、（５１）、（５３）、（５４）、（５６）、（５７）、（５９）又は（６０）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２３）、（２６）、（２９）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３９）、（４２）、（４５）、（４８）、（５１）、（５４）、（５７）又は（６０）で表されるアミノ酸配列であり、特に好ましくは配列番号（１９）、（２０）又は（３７）で表されるアミノ酸配列である。
【００２８】
ポリペプチド（Ｐ）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、熱安定性、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個有するものである。また、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が１分子中に含まれてもよい。
【００２９】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、さらに好ましくは細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造である。この場合、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１８である。
【００３０】
ポリペプチド（Ｐ）は、直鎖構造を有するものである（分岐構造、環状構造及び架橋構造を持たない。）。なお、直鎖構造にはβ構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００３１】
ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、３００〜３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは３，０００〜３００，０００。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。
【００３２】
ポリペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
（１）細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）がＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）の場合
配列（ｘ１）の１３個と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）（ｙ１）の１２個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド（８６）｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
配列（ｘ１）の５個と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）３配列（１９）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（８７）（「プロネクチンＦ２」）；
配列（ｘ１）の３個と（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）２ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）３配列（３７）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（８８）（「プロネクチンＦ３」）等。
【００３３】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＩｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）をＩｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）（ｘ２）に変更したポリペプチド（８９）「プロネクチンＬ」、ポリペプチド（９０）「プロネクチンＬ２」、又はポリペプチド（９１）「プロネクチンＬ３」等。
【００３４】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＴｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）をＴｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）（ｘ３）に変更したポリペプチド（９２）「プロネクチンＹ」、ポリペプチド（９３）「プロネクチンＹ２」、又はポリペプチド（９４）「プロネクチンＹ３」等。
【００３５】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００３６】
化合物（Ａ）は、カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の官能基（Ｋ）を有する化合物であれば制限なく使用でき、カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）、スルホ基を有する化合物（Ａ２）及びヒドロキシル基を有する化合物（Ａ３）が含まれる。なお、上記の官能基（Ｋ）は、ポリペプチド（Ｐ）と、化合物（Ａ）とを化学反応させることにより導入される官能基である。
【００３７】
カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物｛ハロゲン化アシル（酸ハロゲン化物）ではなく、ハロゲン置換カルボン酸｝、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸及び炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン等が含まれる。
【００３８】
炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物としては、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、ω−クロロオクタデカン酸、ω−ブロモエイコサン酸及びω−クロロトリコサン酸等が挙げられる。
【００３９】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとしては、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、パントテン酸、グルクロン酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ基含有アミノ酸（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）、ω−ヒドロキシオクタデカン酸、ω−ヒドロキシエイコサン酸及びω−ヒドロキシトリコサン酸等が挙げられる。
【００４０】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸としては、スルホ酢酸、スルホコハク酸、ｏ−スルホ安息香酸、ｍ−スルホ安息香酸、ｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等が挙げられる。
【００４１】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンとしては、炭素数２〜２０のアミノカルボン酸及び炭素数４〜３０のペプチドが含まれ、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸、ω−アミノオクタデカン酸、ω−アミノエイコサン酸、アミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）等｝及びアミノ酸が２〜１５個結合したペプチド等が挙げられる。
【００４２】
これらのカルボキシル基を含有する化合物（Ａ１）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、カルボン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロ酢酸である。
【００４３】
スルホ基を有する化合物（Ａ２）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物（ハロゲン置換スルホン酸）、炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミン等が含まれる。
【００４４】
炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物としては、クロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）、クロロエタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、ω−クロロオクタデカンスルホン酸、ω−ブロモエイコサンスルホン酸及びω−クロロトリコサンスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）等が挙げられる。
【００４５】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールとしては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ω−ヒドロキシオクタデカンスルホン酸、ω−ヒドロキシエイコサンスルホン酸、ω−ヒドロキシトリコサンスルホン酸、スルホエチレングリコール、２−スルホプロピレングリコール、１，２−ジスルホプロピレングリコール、２−スルホブタンジオール、２−スルホヘキサンジオール、３−スルホヘキサンジオール、１，５−ジスルホヘキサンジオール、２，５−ジスルホヘキサンジオール、１，３，５−トリスルホヘキサンジオール、１，２，４−トリスルホヘキサンジオール、２−スルホウンデカンジオール、４−スルホウンデカンジオール、６−スルホウンデカンジオール、２，４−ジスルホウンデカンジオール及び２，６，１０−トリスルホウンデカンジオール等が挙げられる。
【００４６】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸としては、上記のカルボキシル基を有するスルホン酸と同様である。
【００４７】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンとしては、スルファニル酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ω−アミノオクタデカンスルホン酸、ω−アミノエイコサンスルホン酸及び、ω−アミノトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００４８】
これらのスルホ基を含有する化合物（Ａ２）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、スルホン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタンスルホン酸である。
【００４９】
ヒドロキシル基を有する化合物（Ａ３）としては、炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物（ハロゲン置換体アルコール）及び炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸等が含まれる。
【００５０】
炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物としては、２−フルオロエタノール、クロロエタノール、３−ブロモプロピルアルコール、ｐ−クロロフェノール、ω−クロロオクタデシルアルコール、ω−ブロモエイコシルアルコール及び、ω−クロロトリコシルアルコール等が挙げられる。
【００５１】
炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸としては、カルボキシル基を有するアルコールと同様である。
【００５２】
これらのヒドロキシル基を含有する化合物（Ａ３）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、アルコールのハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタノールである。
【００５３】
これらの化合物（Ａ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）及びスルホ基を有する化合物（Ａ２）が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸のハロゲン化物及びスルホン酸のハロゲン化物、特に好ましくはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）、最も好ましくはクロロ酢酸及び２−クロロエタンスルホン酸ナトリウムである。
【００５４】
また、これらの化合物（Ａ）のうち、ポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との反応性の観点から、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物及びアルコールのハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸のフッ化物又は塩化物、スルホン酸のフッ化物又は塩化物及びアルコールのフッ化物又は塩化物、特に好ましくはクロロ酢酸、フルオロ酢酸、フルオロスルホン酸、フルオロスルホン酸の塩（アルカリ金属塩）、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸の塩（アルカリ金属塩）、２−フルオロエタノール及びクロロエタノールである。
【００５５】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基とは、化合物（Ａ）と反応する反応性基を有するアミノ酸の残基を意味し、好ましくはポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基である。
【００５６】
反応性基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基及び１級又は２級アミノ基等が挙げられる。反応性基のうち、結合形成の容易さの観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。
【００５７】
反応性基含有アミノ酸残基としては、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート テクニークス、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。これらの反応性基含有アミノ酸残基のうち、化合物（Ａ）との反応性の観点から、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基及びアルギニン残基が好ましく、さらに好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基、特に好ましくはセリン残基及びトレオニン残基である。
【００５８】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾するには、ポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との化学反応によって、化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝を介して、化合物（Ａ）を結合させることが好ましいが、化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）との物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）により化学修飾してもよい。
【００５９】
化合物（Ａ）と、ポリペプチド（Ｐ）とを化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合のうち、結合の強さの観点等から、共有結合が好ましい。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジスルフォキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及びこれらの少なくとも１種を含む混合溶媒等が挙げられる。
【００６０】
化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）とを共有結合させる方法としては、例えば、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がヒドロキシル基の場合、化合物（Ａ）のうち、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物又はアルコールのハロゲン化物（以下、ハロゲン化物と略する）を使用してエーテル化反応（ウイリアムソン合成法）する方法、化合物（Ａ）のうち、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、カルボキシ化合物と略する）を使用してエステル化反応する方法が挙げられる。
【００６１】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がカルボキシル基の場合、カルボキシル基を有するアミン又はスルホ基を有するアミンを使用してアミド化反応する方法、カルボキシル基を有するアルコール又はスルホ基を有するアルコールを使用して、エステル化反応する方法等が挙げられる。
【００６２】
化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）とをイオン結合させる方法としては、例えば、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がアミノ基の場合、カルボキシル基を有するスルホン酸、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、酸化合物と略する）を用いて中和反応する方法、アミノ基を塩酸等の酸を用いてアンモニウム塩にしてから、酸化合物を使用してイオン交換反応する方法が挙げられる。
【００６３】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾する方法としては、以上のようなポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との直接的な化学結合を形成させる方法等の他に、縮合剤を用いて、間接的に化学結合を形成させてもよい。
【００６４】
縮合剤としては、カルボジイミド、ジフェニルリン酸アジド、ＢＯＰ試薬、ＤＭＴ−ＭＭ及び向山試薬等が挙げられる。これらのうち、反応性の観点から、向山試薬が好ましい。なお、縮合剤を用いる方法は公知の縮合方法（エステル化反応、アミド化反応）等が適用できる。
【００６５】
本発明の細胞接着性ポリペプチドにおいて、反応性基含有アミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数（個）は、本発明の細胞接着性ポリペプチド１分子あたり、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、１〜１５６が好ましく、さらに好ましくは１０〜１２０、特に好ましくは３０〜１１５、最も好ましくは６０〜９０である。
【００６６】
官能基（Ｋ）の平均個数は、ハロゲン化物を使用してエーテル化反応により化学修飾した場合、ポリペプチド（Ｐ）及び細胞接着性ポリペプチドを構成する各アミノ酸数をポストラベル法によるＨＰＬＣ測定により求めた各アミノ酸のピーク面積から、下記式により求めることができる（ポリペプチドに塩酸等の酸を加え加熱することにより、ポリペプチドをアミノ酸に加水分解してから、オルトフタルアルデヒド又はニンヒドリンを用いてラベル化したアミノ酸をＨＰＬＣにより、アミノ酸のピーク面積を求める方法）。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いる。
【００６７】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa／αａ）／（β０／α０）×γ｝
【００６８】
α０：ポリペプチド（Ｐ）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：ポリペプチド（Ｐ）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：細胞接着性ポリペプチド中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：細胞接着性ポリペプチド中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ： ポリペプチド（Ｐ）中の各アミノ酸の数
【００６９】
ハロゲン化物以外の化合物（Ａ）により化学修飾した場合、官能基（Ｋ）の平均個数は、ポリペプチド（Ｐ）及び細胞接着性ポリペプチドについて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを測定し、ｍ／ｚ値およびそのピーク強度を求め、下記式に当てはめることにより求めることができる。
【００７０】
官能基の平均個数＝｛［Σ（ＰＭｎ×Ｎｎ）／１００］−ＰＭ０｝／Ｌ
【００７１】
ＰＭ０：ポリペプチド（Ｐ）のｍ／ｚ値
ＰＭｎ：細胞接着性ポリペプチドのｍ／ｚ値
Ｎｎ：細胞接着性ポリペプチドの全ピーク強度の和を１００％とした場合のＰＭｎのピーク強度の割合（％）
Ｌ：化合物（Ａ）１分子がポリペプチド（Ｐ）１分子に結合した際に増加する分子量
Ｌは、例えば、化合物（Ａ）がパントテン酸であり、パントテン酸のヒドロキシル基とポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基のカルボキシル基（反応性基）とを脱水縮合反応させた場合、下記のように計算できる。
Ｌ＝２１９（パントテン酸の分子量）−１８（水の分子量）＝２０１
したがって、この場合、Ｌは２０１である。
【００７２】
細胞接着性ポリペプチドは、細胞表面タンパク質であるインテグリンとの結合により細胞と接着する。
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基をカルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）で化学修飾することにより、ポリペプチド（Ｐ）では接着できない種類のインテグリンと結合できるようになるため（多種のインテグリンと結合できるため）、細胞接着性ペプチドが低濃度であっても接着活性に優れると考えられる。
【００７３】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質、形状、及び細胞接着性ポリペプチドの基材（Ｂ）への結合方法は、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
【００７４】
本発明のポリペプチド含有基材に含まれる細胞接着性ポリペプチドの含有量（以下、コーティング量と記載することがある。）は、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、本発明のポリペプチド含有基材の単位面積あたり、０．１μｇ／ｃｍ２〜４μｇ／ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ／ｃｍ２〜３μｇ／ｃｍ２、特に好ましくは０．４μ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２である。
【００７５】
なお、本発明において、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的な方法としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
【００７６】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００７７】
本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含む細胞又は細胞集合体の生産方法としては、公知の細胞接着性ポリペプチド又は培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド又は細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
【００７８】
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド及び本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。
【００７９】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては特に制限がないが、生体組織や臓器の実質細胞、成熟細胞、肝細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、上皮細胞、内皮細胞及び表皮細胞等が挙げられる。主に医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。具体的には特開２００５−２１０６号公報に記載された細胞等が挙げられる。
【００８０】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地としては、特に制限は無く、一般の細胞培養に用いられるものが利用できる。また、これら培地に必要に応じて、血清、細胞増殖因子及び／又は抗菌剤等を添加したものも利用できる。培地、血清及びその使用量、細胞増殖因子及びその使用量、並びに抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００８１】
細胞の播取量、培養条件、培養後の細胞回収方法についても、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００８２】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）ポリペプチド（Ｐ１−０）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万のペプチド（８６）を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製してポリペプチド（Ｐ１−０）を得た。
【００８４】
（２）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）の作製
ポリペプチド（Ｐ１−０）５０ｍｇとクロロ酢酸２３０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−１）を得た。
【００８５】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］の作製
化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で希釈して、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）溶液（Ａ１〜Ａ３）｛細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）の濃度； Ａ１：０．００５、Ａ２：５及びＡ３：５０μｇ／ｍＬ｝を作製した。この溶液（Ａ１〜Ａ３）を９６穴（９６ウェル）のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴（８ウェル）ずつにそれぞれ５０μＬ／ウェルで投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄して、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］（コーティング量が異なるＰＢ１−１〜ＰＢ１−３）を得た。
【００８６】
＜実施例２＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエタンスルホン酸ナトリウム４０５ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−２）を得た。
【００８７】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］（コーティング量が異なるＰＢ２−１〜ＰＢ２−３）を得た。
【００８８】
＜実施例３＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−３）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール９４ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−３）を得た。
【００８９】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］（コーティング量が異なるＰＢ３−１〜ＰＢ３−３）を得た。
【００９０】
＜実施例４＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−４）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「フルオロ酢酸１９１ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−４）を得た。
【００９１】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］（コーティング量が異なるＰＢ４−１〜ＰＢ４−３）を得た。
【００９２】
＜実施例５＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−５）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「フルオロスルホン酸ナトリウム２２１ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−５）を得た。
【００９３】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−５）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］（コーティング量が異なるＰＢ５−１〜ＰＢ５−３）を得た。
【００９４】
＜実施例６＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−６）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−フルオロエタノール７５．４ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−６）を得た。
【００９５】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］（コーティング量が異なるＰＢ６−１〜ＰＢ６−３）を得た。
【００９６】
＜比較例１＞（特許文献１）
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］（コーティング量が異なるＰＢ７−１〜ＰＢ７−３）を得た。
【００９７】
＜比較例２＞（特許文献２）
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−７）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド１５０ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−７）を得た。
【００９８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材[ＰＢ８]の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−７）」に変更した以外、実施例１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］（コーティング量が異なるＰＢ８−１〜ＰＢ８−３）を得た。
【００９９】
＜コーティング量の測定＞
Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］（コーティング量の異なるＰＢ１−１〜ＰＢ８−３）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
【０１００】
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得た。これらの結果を表１〜４に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。
【０１０１】
＜化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数の測定＞
化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｇを６Ｎ 塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。次に、エバポレーターを用いて６Ｎ 塩酸を試料希釈液（アミノ酸自動分析用試料希釈液 Ｎａ型 ｐＨ２．２０）に置換した後、２ｍｌに試料希釈液でフィルアップ(full up)した。フィルアップした溶液を試料希釈液で１０倍希釈し、０．２μｍのフィルターを通し測定用試料とした。
【０１０２】
分析はポストラベル法によるＨＰＬＣ測定を用いて行い、ラベル化試薬としてはオルトフタルアルデヒド、スタンダードとしてはアミノ酸混合標準液 Ｈ型を用いて、ＨＰＬＣでの溶出時間からアミノ酸の種類を同定した。
上記において、（Ｐ１−１）にかえて（Ｐ１−０）を用いる以外は同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
【０１０３】
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ−Ｎａ
カラム温度：６０℃
移動相：アミノ酸分析移動相セット（Ｎａ 型）（メーカー名：株式会社島津製作所）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：励起波長３５０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ
（Ｐ１−０）及び（Ｐ１−１）のＨＰＬＣのピーク面積から、下記式により官能基（Ｋ）の平均個数を算出した。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いた。
【０１０４】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa／αａ）／（β０／α０）×γ｝
【０１０５】
α０：ポリペプチド（Ｐ１−０）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：ポリペプチド（Ｐ１−０）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：ポリペプチド（Ｐ１−０）中の各アミノ酸の数
【０１０６】
上記において、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）に変えて細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−７）を用いたこと以外、上記と同様にして、化学修飾された細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−７）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。これらの結果を表１〜４に示す。
【０１０７】
＜評価：ＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞接着活性＞
ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に５０μＬ／ウェルで投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＧＥ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３０℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１０８】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１０９】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＧＥ１細胞の細胞接着活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図１）。
【０１１０】
＜評価：ＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性＞
［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３３℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＧＥ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３３℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１１】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次に１０容量％の血清を含むＤＭＥＭを１００μＬ／ウェルで添加し、３３℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に１５日間培養した。また、５日間ごとに培地を交換した。
【０１１２】
１５日後に、テトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞増殖活性とした。細胞増殖活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表３に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＧＥ１細胞の細胞増殖活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図３）。
【０１１３】
＜評価：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）の細胞接着活性＞
ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に５０μＬ／ウェルで投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１４】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１１５】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞接着活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図２）。
【０１１６】
＜評価：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性＞
［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１７】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次に１０容量％の血清を含むＤＭＥＭを１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に１５日間培養した。また、５日間ごとに培地を交換した。
【０１１８】
１５日後に、テトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞増殖活性とした。細胞増殖活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表４に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞増殖活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図４）。
【０１１９】
＜評価：インテグリンの抗体添加による細胞接着阻害活性＞
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に４００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁した。この細胞懸濁液に各インテグリン（α３、α４、αＶ、α６、β１及びβ４）の抗体（入手先；α３：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、β４：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、αＶ：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、α４，α6，β１：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）のいずれかを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中で３０分間放置して、インテグリン抗体結合細胞を得た。これらのインテグリン抗体結合細胞と、基材［ＰＢ１−３、ＰＢ２−３、ＰＢ３−３、ＰＢ７−３及びＰＢ８−３］とを用いて、上記と同様にして、細胞接着活性を測定し、この細胞接着活性の測定値（Ｇ１）と表２の細胞接着活性（Ｇ０）とから、細胞接着阻害（％）を下記式により求め、下記の基準で評価した。
【０１２０】
細胞接着阻害（％）＝｛（Ｇ０）−（Ｇ１）｝／（Ｇ０）×１００
−：細胞接着阻害０％以上１０％未満
＋：細胞接着阻害１０％以上２０％未満
＋＋：細胞接着阻害２０％以上４０％未満
＋＋＋：細胞接着阻害４０％以上
【０１２１】
インテグリンの抗体を加えると、細胞表面のインテグリンがインテグリン抗体によりマスクされ、細胞接着が阻害されるため、細胞が細胞接着性ポリペプチドに接着できなくなる。したがって、それぞれのインテグリン抗体の添加による細胞接着阻害が大きいほど、細胞接着性ポリペプチドがそのインテグリンと結合していたことを意味する。これらの結果を表５に示す。
【０１２２】
【表１】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２３】
表１において、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）をコーティングした基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ６］（実施例１〜６）は、官能基を導入していないポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ７］（比較例１）と比較して、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ６−１）、すべての実施例の基材が比較例１（ＰＢ７−１）の基材よりも細胞接着活性が優れていた。特に、実施例１、２及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞接着活性が、比較例１の基材の細胞接着活性よりも有意に高かった。さらに、コーティング量が２μｇ／ｃｍ２近辺である場合（実施例１〜６の基材（ＰＢ１−２〜ＰＢ６−２）と比較例１の基材（ＰＢ７−２）を比較した場合）も、本発明の実施例の基材が比較例の基材よりも細胞接着性が優れていた。このことは、図１からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、コーティング量を減らしても細胞接着性が極めて優れていることがわかる。
【０１２４】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材は、化学修飾されたアミノ酸の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。
【０１２５】
【表２】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２６】
表２において、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ７−１を比較した場合）、すべての実施例の基材が比較例１の基材よりも細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。特に、実施例１、２、４、５及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞接着活性が、比較例１の基材の細胞接着活性よりも有意に高かった。このことは図２からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、様々な細胞種で細胞接着性が優れていることがわかる。
【０１２７】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材は、化学修飾されたアミノ酸の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。
【０１２８】
【表３】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２９】
表３において、本発明の細胞接着性ポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ６］（実施例１〜６）は、官能基を導入していないポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ７］（比較例１）及び第３級アミノ基を導入した基材［ＰＢ８］（比較例２）と比較して、コーティング量が低濃度である０．５μｇ／ｃｍ２近辺（ＰＢ１−１〜ＰＢ８−１を比較した場合）での細胞増殖活性が高かった。特に、官能基の平均個数が６０〜９０である実施例１、２、及び６の基材において有意に高かった。このことは、図３からも明らかである。
【０１３０】
さらに、比較例２の基材は、化学修飾された官能基の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３１】
【表４】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１３２】
表４において、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ８−１を比較した場合）、すべての実施例の基材が比較例１及び２の基材よりも細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。特に、実施例１、２及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞増殖活性が、比較例１の基材の細胞増殖活性よりも有意に高かった。このことは図４からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、様々な細胞種で細胞増殖性が優れていることが分かる。
【０１３３】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材に対して、実施例１〜６の基材は２μｇ／ｃｍ２近辺での細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３４】
さらに、比較例２の基材は、化学修飾された官能基の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
表５において、カルボキシル基又はスルホ基により化学修飾された本発明の細胞接着性ポリペプチド（実施例１及び２）及び第３級アミノ基を導入した細胞接着性ポリペプチド（比較例２）は、インテグリン（α３、α４、αＶ、α６、β１及びβ４）の抗体により細胞接着が阻害されており、比較例１の細胞接着性ポリペプチドと比べて、新たに、細胞表面のインテグリン（αＶ、α６及びβ４）と接着していることが分かった。また、カルボキシル基又はスルホ基により化学修飾された本発明の細胞接着性ポリペプチド（実施例１及び２）は、同様に、比較例２の細胞接着性ポリペプチドと比べて、新たに、細胞表面のインテグリン（αＶ）と接着していることが分かった。以上の通り、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、比較例１、２の細胞接着性ポリペプチドと比較して、より多くの種類のインテグリンと結合するため、細胞接着性ポリペプチドが低濃度であっても細胞接着性が優れると考えられる。
【０１３７】
＜実施例７〜１２＞
実施例１〜６で得た細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を用いたマウス胎児由来線維芽細胞の細胞集合体の作製
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液をコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ ＣｅｌＳｔｉｒ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、ＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）８ｍｌ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）懸濁液１ｍｌ（１０７cells/ｍｌ）、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて旋回培養を行った。
また、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−６）についても上記と同様にして、旋回培養を行った。
【０１３８】
培養６時間後、培養液３００μＬをそれぞれのフラスコから回収し、回収しなかった培養液については、７日間培養を継続した。
回収した各培養液を、Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加した。その後、それぞれのウェルについて、細胞集合体の顕微鏡画像（倍率４０倍、ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を取得し、画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ Ｊ、アメリカ国立衛生研究所）及びマイクロメーター（目盛１０μｍ、目盛長１ｍｍ）を用いて解析することにより、得られた細胞集合体（１）〜（６）の粒子径と粒度分布を測定した。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値及びばらつきで示した。結果を表６に示す。
なお、画像解析ソフトにより得られる数値の単位が「ピクセル」であるため、マイクロメーターにより画像を計測して、１ピクセルが何μｍに相当するのかを算出し、実際の単位「μｍ」に換算した。
【０１３９】
＜比較例３及び４＞
比較例１〜２で使用した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を用いたマウス胎児由来線維芽細胞の細胞集合体の作製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）に変更したこと以外、実施例７〜１２と同様にして、細胞集合体（７）〜（８）を作成し、細胞集合体の粒子径と粒度分布を測定した。結果を表６に示す。
【０１４０】
＜比較例５＞
Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１５分間放置した。１５分後、ポリビニルアルコール水溶液を除去し、ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで加えて２回洗浄した。
洗浄したウェルに、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）懸濁液１ｍｌ（１０４cells /ｍｌ）を加え、３７℃で７日間培養した。
【０１４１】
＜細胞集合体の活性評価；ミトコンドリア活性＞
培養して７日後の実施例７〜１２、比較例３〜５の培養液を、それぞれＵ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１４２】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。生細胞数は細胞集合体に核放出溶液（０．２重量％クリスタルバイオレット、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、２重量％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、１時間置くことで生細胞の核を細胞から放出させ、血球計数盤を用いて核数を測定した。ホルマザン生成量を生細胞数で標準化し、細胞集合体のミトコンドリア活性とした。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値で評価した。また、実施例７〜１２、比較例３及び４のミトコンドリア活性は、比較例５のミトコンドリア活性を１００とした場合の相対値で表した。これらの結果を表６に示す。
【０１４３】
【表６】
【０１４４】
表６から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用して得た細胞集合体（１）〜（６）（実施例７〜１２；６時間培養後）の粒径は７１〜１０７μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を使用して得た細胞集合体（７）及び（８）（比較例３、４；６時間培養後）の粒径５３μｍ及び６４μｍよりも有意に大きかった。
【０１４５】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体（１）〜（６）の粒径のばらつきは±１０μｍ〜±３０μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体（７）及び（８）の粒径のばらつき±３１μｍ及び±３２μｍより小さかった。
したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、比較用の細胞集合体に比べて、粒径の大きな細胞集合体を得ることができた。また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、粒径のばらつきの小さな細胞集合体を得ることができた。
【０１４６】
また、表６の培養７日間後のミトコンドリア活性の測定結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用した細胞培養（実施例７〜１２）では８９以上と、細胞接着性ポリペプチドを用いていない細胞培養（比較例５）と同等程度又はそれ以上であり、活性の高い細胞集合体を得られた。特に、実施例７〜１０の細胞培養では１０５〜１４０と比較例５の細胞培養よりも高く、得られた細胞集合体の活性が非常に高かった。
【０１４７】
＜実施例１３〜１８＞
実施例１〜６で得た細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を用いた肝臓由来細胞の細胞集合体の作製
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液でコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ ＣｅｌＳｔｉｒ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、ＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）８ｍｌ、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓由来細胞）懸濁液１ｍｌ（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて旋回培養を行った。
また、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−６）についても上記と同様にして、旋回培養を行った。
【０１４８】
培養６時間後、培養液３００μＬをそれぞてのフラスコから回収し、回収しなかった培養液については、７日間培養を継続した。
回収した各培養液を、Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加した。その後、それぞれのウェルについて、細胞集合体の顕微鏡画像を取得し、得られた細胞集合体（９）〜（１４）の粒子径と粒度分布を測定した。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値及びばらつきで示した。結果を表７に示す。
【０１４９】
＜比較例６及び７＞
比較例１〜２で使用した細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を用いた肝臓由来細胞の細胞集合体の作製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）に変更したこと以外、実施例７〜１２と同様にして、細胞集合体（１５）〜（１６）を作成し、細胞集合体の粒子径と粒度分布を測定した。結果を表７に示す。
【０１５０】
＜比較例８＞
Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１５分間放置した。１５分後、ポリビニルアルコール水溶液を除去し、ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで加えて２回洗浄した。
洗浄したウェルに、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓由来細胞）懸濁液１ｍｌ（１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で７日間培養した。
【０１５１】
＜細胞集合体の活性評価；チトクローム活性＞
培養して７日後の実施例１３〜１８、比較例６〜８の培養液を、それぞれＵ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、さらにＰ４５０−ＧＬＯＴＭＣＹＰ３Ａ４ ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いてチトクローム活性を測定した。生細胞数は細胞集合体に核放出溶液（０．２重量％クリスタルバイオレット、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、２重量％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、１時間置くことで生細胞の核を細胞から放出させ、血球計数盤を用いて核数を測定した。チトクローム活性を生細胞数で標準化し、細胞集合体のチトクローム活性とした。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値で評価した。また、実施例１３〜１８、比較例６及び７のチトクローム活性は、比較例８のチトクローム活性を１００とした場合の相対値で表した。これらの結果を表７に示す。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
表７から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用して得た細胞集合体（９）〜（１４）（実施例１３〜１８；６時間培養後）の粒径は１０１〜１５０μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を使用して得た細胞集合体（１５）及び（１６）（比較例６、７；６時間培養後）の粒径８３μｍ及び９４μｍよりも有意に大きかった。
【０１５４】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体の粒径のばらつきは±１４μｍ〜±３３μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体の粒径のばらつき±３６μｍ及び±３９μｍより小さかった。
したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、比較用の細胞集合体に比べて、粒径の大きな細胞集合体を得ることができた。また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、粒径のばらつきの小さな細胞集合体を得ることができた。
【０１５５】
また、表７の培養７日間後のチトクローム活性の測定結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）のチトクローム活性は１０１以上と、細胞接着性ポリペプチドを用いていない比較例８と同等程度又はそれ以上であり、活性の高い細胞集合体を得られた。特に、実施例１３〜１７のチトクローム活性は１２１〜１５０と比較例８のそれよりも極めて高く、得られた細胞集合体の活性が非常に高かった。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、低濃度においても細胞接着性及び細胞増殖性が極めて高いため、従来は無血清培養条件下において接着が困難であった細胞（ＧＥ１細胞等）を基材上に効率良く接着させることができる。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
【０１５７】
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
【０１５８】
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
【０１５９】
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学修飾した細胞接着性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工の細胞接着性ポリペプチドとして、プロネクチンＦ｛Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝及びプロネクチンＬ｛Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝（非特許文献１）が知られている。また、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有し、（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００個数％である細胞接着性ポリペプチド（特許文献１）が知られている。さらに、化学修飾した人工の細胞接着性ポリペプチドとして、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド等）で修飾した水溶性の直鎖状ポリペプチド（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ハンドブック オブ バイオデグラダブル ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド アカデミック パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Ａｂｒａｈａｍ Ｊ． Ｄｏｍｂら著， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９７年）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１０６号公報
【特許文献２】特表平１０−５００７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、従来の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性が不十分であり、細胞増殖性が低いという問題点がある。一方、細胞接着性ポリペプチドを高濃度で用いることにより細胞接着性を補うこともできるが、経済的に問題がある。
本発明の目的は、低濃度においても細胞接着性が優れ、細胞増殖性に優れた細胞接着性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドに特定の官能基を化学修飾することにより上記目的を達成を達成することを見出し本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、
カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチドである。
【０００８】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、上記の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）を含むものである。
【０００９】
また、本発明の細胞又は細胞集合体の生産方法は、上記の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含むものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、低濃度であっても、細胞接着性が優れている。したがって、基材等の細胞接着表面に対する細胞接着性ポリペプチドのコーティング量を減らしても、高い接着性を得られ、それにより高い細胞増殖性を得られる。また、細胞接着性ポリペプチドを高濃度で用いる必要がないため、経済的にも優れる。
【００１１】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、上記の細胞接着性ポリペプチドを含むため、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、低濃度においても細胞接着性が優れ、優れた細胞増殖性を発揮する。
【００１２】
また、本発明の細胞又は細胞集合体の生産方法は、上記の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養するため、効率よく細胞又は細胞集合体を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞接着活性の変化を表したグラフである。
【図２】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞接着活性の変化を表したグラフである。
【図３】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞増殖活性の変化を表したグラフである。
【図４】実施例１〜６、比較例１及び２で得た細胞接着性ポリペプチドについて、細胞接着性ポリペプチドのコーティング量に対するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
「細胞増殖性」とは細胞が基材に接着することにより細胞内シグナル伝達経路が活性化され、成長、分裂、生存する性質を意味する（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ 細胞生物学、第２版、７０６頁、２００５年）。
【００１５】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００１６】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ 配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）、Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ配列（１２）、Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ配列（１３）、Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ配列（１４）、Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ配列（１５）、Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ配列（９５）、Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ配列（９６）、Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（９７）及びＰｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ配列（９８）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）及びＡｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ（１５）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列である。
【００１７】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むことが好ましい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）以外のアミノ酸配列が含まれ、アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及び／又はヒスチジン（Ｈｉｓ）等から構成されるアミノ酸配列が含まれる。
【００１８】
介在アミノ酸配列（Ｚ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（６３）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６４）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６５）、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６６）、Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６７）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６８）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（６９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７１）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７２）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（７３）及びＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ配列（７４）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していることが好ましく、さらに好ましくはＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（６３）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６４）及びＡｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６５）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していること、特に好ましくはＧｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ配列（６２）を結合していることである。
【００１９】
介在アミノ酸配列（Ｚ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（７６）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７７）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ配列（７８）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（８０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８１）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８２）、Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（８３）、Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８４）及びＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していることが好ましく、さらに好ましくはＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（７６）、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７７）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ配列（７８）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙｓ配列（７９）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ配列（８０）、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８１）及びＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ配列（８２）からなる群より選ばれる少なくとも１種を結合していること、特に好ましくはＳｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ配列（７５）を結合していることである。
【００２０】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１８個有するものである。
なお、２種以上の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００２１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、耐熱性、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、Ｇｌｙ及び／又はＡｌａを有するものが好ましく、例えば（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ）ｉ、（Ａｌａ）ｊ、（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｋ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列、（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ）ｏ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ）ｐ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ）ｑ配列を有するものが好ましい。これらのうち、熱に対する安定性の観点から、（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び／又は（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有するものであり、特に好ましくは（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列を有するものである。
【００２２】
なお、ａは５〜１００の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは１〜｛２００／（６＋ｆ）の小数点以下を切り捨てした数｝の整数、ｈは２〜４０の整数、ｉ及びｊは１０〜２００の整数、ｋは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００２３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン（Ｇｌｙ）及び／又はアラニン（Ａｌａ）を含むことが好ましい。グリシン（Ｇｌｙ）及び／又はアラニン（Ａｌａ）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
【００２４】
補助アミノ酸配列（Ｙ）にグリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
【００２５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）等｝を含んでいてもよい。
【００２６】
（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１６）〜（１８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１９）〜（２１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２２）〜（２４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２５）〜（２７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２８）〜（３０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３１）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ）ｉ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３８）〜（４０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ａｌａ）ｊ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４１）〜（４３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｋ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４４）〜（４６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４７）〜（４９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５０）〜（５２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５３）〜（５５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５６）〜（５８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５９）〜（６１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２７】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱に対する安定性の観点から、配列番号（１６）、（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２８）、（２９）、（３１）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（３９）、（４１）、（４２）、（４４）、（４５）、（４７）、（４８）、（５０）、（５１）、（５３）、（５４）、（５６）、（５７）、（５９）又は（６０）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２３）、（２６）、（２９）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３９）、（４２）、（４５）、（４８）、（５１）、（５４）、（５７）又は（６０）で表されるアミノ酸配列であり、特に好ましくは配列番号（１９）、（２０）又は（３７）で表されるアミノ酸配列である。
【００２８】
ポリペプチド（Ｐ）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、熱安定性、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個有するものである。また、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が１分子中に含まれてもよい。
【００２９】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、さらに好ましくは細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造である。この場合、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１８である。
【００３０】
ポリペプチド（Ｐ）は、直鎖構造を有するものである（分岐構造、環状構造及び架橋構造を持たない。）。なお、直鎖構造にはβ構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００３１】
ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、３００〜３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは３，０００〜３００，０００。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。
【００３２】
ポリペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
（１）細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）がＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）の場合
配列（ｘ１）の１３個と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）（ｙ１）の１２個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド（８６）｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
配列（ｘ１）の５個と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）３配列（１９）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（８７）（「プロネクチンＦ２」）；
配列（ｘ１）の３個と（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）２ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）３配列（３７）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（８８）（「プロネクチンＦ３」）等。
【００３３】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＩｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）をＩｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）（ｘ２）に変更したポリペプチド（８９）「プロネクチンＬ」、ポリペプチド（９０）「プロネクチンＬ２」、又はポリペプチド（９１）「プロネクチンＬ３」等。
【００３４】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＴｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列（ｘ１）をＴｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）（ｘ３）に変更したポリペプチド（９２）「プロネクチンＹ」、ポリペプチド（９３）「プロネクチンＹ２」、又はポリペプチド（９４）「プロネクチンＹ３」等。
【００３５】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００３６】
化合物（Ａ）は、カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の官能基（Ｋ）を有する化合物であれば制限なく使用でき、カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）、スルホ基を有する化合物（Ａ２）及びヒドロキシル基を有する化合物（Ａ３）が含まれる。なお、上記の官能基（Ｋ）は、ポリペプチド（Ｐ）と、化合物（Ａ）とを化学反応させることにより導入される官能基である。
【００３７】
カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物｛ハロゲン化アシル（酸ハロゲン化物）ではなく、ハロゲン置換カルボン酸｝、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸及び炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン等が含まれる。
【００３８】
炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物としては、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、ω−クロロオクタデカン酸、ω−ブロモエイコサン酸及びω−クロロトリコサン酸等が挙げられる。
【００３９】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとしては、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、パントテン酸、グルクロン酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ基含有アミノ酸（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）、ω−ヒドロキシオクタデカン酸、ω−ヒドロキシエイコサン酸及びω−ヒドロキシトリコサン酸等が挙げられる。
【００４０】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸としては、スルホ酢酸、スルホコハク酸、ｏ−スルホ安息香酸、ｍ−スルホ安息香酸、ｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等が挙げられる。
【００４１】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンとしては、炭素数２〜２０のアミノカルボン酸及び炭素数４〜３０のペプチドが含まれ、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸、ω−アミノオクタデカン酸、ω−アミノエイコサン酸、アミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）等｝及びアミノ酸が２〜１５個結合したペプチド等が挙げられる。
【００４２】
これらのカルボキシル基を含有する化合物（Ａ１）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、カルボン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロ酢酸である。
【００４３】
スルホ基を有する化合物（Ａ２）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物（ハロゲン置換スルホン酸）、炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミン等が含まれる。
【００４４】
炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物としては、クロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）、クロロエタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、ω−クロロオクタデカンスルホン酸、ω−ブロモエイコサンスルホン酸及びω−クロロトリコサンスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）等が挙げられる。
【００４５】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールとしては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ω−ヒドロキシオクタデカンスルホン酸、ω−ヒドロキシエイコサンスルホン酸、ω−ヒドロキシトリコサンスルホン酸、スルホエチレングリコール、２−スルホプロピレングリコール、１，２−ジスルホプロピレングリコール、２−スルホブタンジオール、２−スルホヘキサンジオール、３−スルホヘキサンジオール、１，５−ジスルホヘキサンジオール、２，５−ジスルホヘキサンジオール、１，３，５−トリスルホヘキサンジオール、１，２，４−トリスルホヘキサンジオール、２−スルホウンデカンジオール、４−スルホウンデカンジオール、６−スルホウンデカンジオール、２，４−ジスルホウンデカンジオール及び２，６，１０−トリスルホウンデカンジオール等が挙げられる。
【００４６】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸としては、上記のカルボキシル基を有するスルホン酸と同様である。
【００４７】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンとしては、スルファニル酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ω−アミノオクタデカンスルホン酸、ω−アミノエイコサンスルホン酸及び、ω−アミノトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００４８】
これらのスルホ基を含有する化合物（Ａ２）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、スルホン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタンスルホン酸である。
【００４９】
ヒドロキシル基を有する化合物（Ａ３）としては、炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物（ハロゲン置換体アルコール）及び炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸等が含まれる。
【００５０】
炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物としては、２−フルオロエタノール、クロロエタノール、３−ブロモプロピルアルコール、ｐ−クロロフェノール、ω−クロロオクタデシルアルコール、ω−ブロモエイコシルアルコール及び、ω−クロロトリコシルアルコール等が挙げられる。
【００５１】
炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸としては、カルボキシル基を有するアルコールと同様である。
【００５２】
これらのヒドロキシル基を含有する化合物（Ａ３）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、アルコールのハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタノールである。
【００５３】
これらの化合物（Ａ）のうち、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、カルボキシル基を有する化合物（Ａ１）及びスルホ基を有する化合物（Ａ２）が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸のハロゲン化物及びスルホン酸のハロゲン化物、特に好ましくはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）、最も好ましくはクロロ酢酸及び２−クロロエタンスルホン酸ナトリウムである。
【００５４】
また、これらの化合物（Ａ）のうち、ポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との反応性の観点から、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物及びアルコールのハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸のフッ化物又は塩化物、スルホン酸のフッ化物又は塩化物及びアルコールのフッ化物又は塩化物、特に好ましくはクロロ酢酸、フルオロ酢酸、フルオロスルホン酸、フルオロスルホン酸の塩（アルカリ金属塩）、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸の塩（アルカリ金属塩）、２−フルオロエタノール及びクロロエタノールである。
【００５５】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基とは、化合物（Ａ）と反応する反応性基を有するアミノ酸の残基を意味し、好ましくはポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基である。
【００５６】
反応性基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基及び１級又は２級アミノ基等が挙げられる。反応性基のうち、結合形成の容易さの観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。
【００５７】
反応性基含有アミノ酸残基としては、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート テクニークス、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。これらの反応性基含有アミノ酸残基のうち、化合物（Ａ）との反応性の観点から、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基及びアルギニン残基が好ましく、さらに好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基、特に好ましくはセリン残基及びトレオニン残基である。
【００５８】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾するには、ポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との化学反応によって、化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝を介して、化合物（Ａ）を結合させることが好ましいが、化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）との物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）により化学修飾してもよい。
【００５９】
化合物（Ａ）と、ポリペプチド（Ｐ）とを化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合のうち、結合の強さの観点等から、共有結合が好ましい。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジスルフォキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及びこれらの少なくとも１種を含む混合溶媒等が挙げられる。
【００６０】
化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）とを共有結合させる方法としては、例えば、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がヒドロキシル基の場合、化合物（Ａ）のうち、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物又はアルコールのハロゲン化物（以下、ハロゲン化物と略する）を使用してエーテル化反応（ウイリアムソン合成法）する方法、化合物（Ａ）のうち、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、カルボキシ化合物と略する）を使用してエステル化反応する方法が挙げられる。
【００６１】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がカルボキシル基の場合、カルボキシル基を有するアミン又はスルホ基を有するアミンを使用してアミド化反応する方法、カルボキシル基を有するアルコール又はスルホ基を有するアルコールを使用して、エステル化反応する方法等が挙げられる。
【００６２】
化合物（Ａ）とポリペプチド（Ｐ）とをイオン結合させる方法としては、例えば、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基の反応性基がアミノ基の場合、カルボキシル基を有するスルホン酸、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、酸化合物と略する）を用いて中和反応する方法、アミノ基を塩酸等の酸を用いてアンモニウム塩にしてから、酸化合物を使用してイオン交換反応する方法が挙げられる。
【００６３】
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾する方法としては、以上のようなポリペプチド（Ｐ）と化合物（Ａ）との直接的な化学結合を形成させる方法等の他に、縮合剤を用いて、間接的に化学結合を形成させてもよい。
【００６４】
縮合剤としては、カルボジイミド、ジフェニルリン酸アジド、ＢＯＰ試薬、ＤＭＴ−ＭＭ及び向山試薬等が挙げられる。これらのうち、反応性の観点から、向山試薬が好ましい。なお、縮合剤を用いる方法は公知の縮合方法（エステル化反応、アミド化反応）等が適用できる。
【００６５】
本発明の細胞接着性ポリペプチドにおいて、反応性基含有アミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数（個）は、本発明の細胞接着性ポリペプチド１分子あたり、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、１〜１５６が好ましく、さらに好ましくは１０〜１２０、特に好ましくは３０〜１１５、最も好ましくは６０〜９０である。
【００６６】
官能基（Ｋ）の平均個数は、ハロゲン化物を使用してエーテル化反応により化学修飾した場合、ポリペプチド（Ｐ）及び細胞接着性ポリペプチドを構成する各アミノ酸数をポストラベル法によるＨＰＬＣ測定により求めた各アミノ酸のピーク面積から、下記式により求めることができる（ポリペプチドに塩酸等の酸を加え加熱することにより、ポリペプチドをアミノ酸に加水分解してから、オルトフタルアルデヒド又はニンヒドリンを用いてラベル化したアミノ酸をＨＰＬＣにより、アミノ酸のピーク面積を求める方法）。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いる。
【００６７】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa／αａ）／（β０／α０）×γ｝
【００６８】
α０：ポリペプチド（Ｐ）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：ポリペプチド（Ｐ）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：細胞接着性ポリペプチド中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：細胞接着性ポリペプチド中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ： ポリペプチド（Ｐ）中の各アミノ酸の数
【００６９】
ハロゲン化物以外の化合物（Ａ）により化学修飾した場合、官能基（Ｋ）の平均個数は、ポリペプチド（Ｐ）及び細胞接着性ポリペプチドについて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを測定し、ｍ／ｚ値およびそのピーク強度を求め、下記式に当てはめることにより求めることができる。
【００７０】
官能基の平均個数＝｛［Σ（ＰＭｎ×Ｎｎ）／１００］−ＰＭ０｝／Ｌ
【００７１】
ＰＭ０：ポリペプチド（Ｐ）のｍ／ｚ値
ＰＭｎ：細胞接着性ポリペプチドのｍ／ｚ値
Ｎｎ：細胞接着性ポリペプチドの全ピーク強度の和を１００％とした場合のＰＭｎのピーク強度の割合（％）
Ｌ：化合物（Ａ）１分子がポリペプチド（Ｐ）１分子に結合した際に増加する分子量
Ｌは、例えば、化合物（Ａ）がパントテン酸であり、パントテン酸のヒドロキシル基とポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基のカルボキシル基（反応性基）とを脱水縮合反応させた場合、下記のように計算できる。
Ｌ＝２１９（パントテン酸の分子量）−１８（水の分子量）＝２０１
したがって、この場合、Ｌは２０１である。
【００７２】
細胞接着性ポリペプチドは、細胞表面タンパク質であるインテグリンとの結合により細胞と接着する。
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基をカルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）で化学修飾することにより、ポリペプチド（Ｐ）では接着できない種類のインテグリンと結合できるようになるため（多種のインテグリンと結合できるため）、細胞接着性ペプチドが低濃度であっても接着活性に優れると考えられる。
【００７３】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質、形状、及び細胞接着性ポリペプチドの基材（Ｂ）への結合方法は、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
【００７４】
本発明のポリペプチド含有基材に含まれる細胞接着性ポリペプチドの含有量（以下、コーティング量と記載することがある。）は、細胞接着性及び細胞増殖性の観点等から、本発明のポリペプチド含有基材の単位面積あたり、０．１μｇ／ｃｍ２〜４μｇ／ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ／ｃｍ２〜３μｇ／ｃｍ２、特に好ましくは０．４μ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２である。
【００７５】
なお、本発明において、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的な方法としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
【００７６】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００７７】
本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含む細胞又は細胞集合体の生産方法としては、公知の細胞接着性ポリペプチド又は培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド又は細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
【００７８】
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド及び本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。
【００７９】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては特に制限がないが、生体組織や臓器の実質細胞、成熟細胞、肝細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、上皮細胞、内皮細胞及び表皮細胞等が挙げられる。主に医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。具体的には特開２００５−２１０６号公報に記載された細胞等が挙げられる。
【００８０】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地としては、特に制限は無く、一般の細胞培養に用いられるものが利用できる。また、これら培地に必要に応じて、血清、細胞増殖因子及び／又は抗菌剤等を添加したものも利用できる。培地、血清及びその使用量、細胞増殖因子及びその使用量、並びに抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００８１】
細胞の播取量、培養条件、培養後の細胞回収方法についても、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００８２】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）ポリペプチド（Ｐ１−０）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）と（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万のペプチド（８６）を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製してポリペプチド（Ｐ１−０）を得た。
【００８４】
（２）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）の作製
ポリペプチド（Ｐ１−０）５０ｍｇとクロロ酢酸２３０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−１）を得た。
【００８５】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］の作製
化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で希釈して、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）溶液（Ａ１〜Ａ３）｛細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）の濃度； Ａ１：０．００５、Ａ２：５及びＡ３：５０μｇ／ｍＬ｝を作製した。この溶液（Ａ１〜Ａ３）を９６穴（９６ウェル）のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴（８ウェル）ずつにそれぞれ５０μＬ／ウェルで投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄して、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］（コーティング量が異なるＰＢ１−１〜ＰＢ１−３）を得た。
【００８６】
＜実施例２＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエタンスルホン酸ナトリウム４０５ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−２）を得た。
【００８７】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］（コーティング量が異なるＰＢ２−１〜ＰＢ２−３）を得た。
【００８８】
＜実施例３＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−３）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール９４ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−３）を得た。
【００８９】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］（コーティング量が異なるＰＢ３−１〜ＰＢ３−３）を得た。
【００９０】
＜実施例４＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−４）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「フルオロ酢酸１９１ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−４）を得た。
【００９１】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−４）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］（コーティング量が異なるＰＢ４−１〜ＰＢ４−３）を得た。
【００９２】
＜実施例５＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−５）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「フルオロスルホン酸ナトリウム２２１ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−５）を得た。
【００９３】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−５）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］（コーティング量が異なるＰＢ５−１〜ＰＢ５−３）を得た。
【００９４】
＜実施例６＞
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−６）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−フルオロエタノール７５．４ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−６）を得た。
【００９５】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］（コーティング量が異なるＰＢ６−１〜ＰＢ６−３）を得た。
【００９６】
＜比較例１＞（特許文献１）
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］（コーティング量が異なるＰＢ７−１〜ＰＢ７−３）を得た。
【００９７】
＜比較例２＞（特許文献２）
（１）化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−７）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド１５０ｍｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、水溶性の直鎖状ポリペプチド（化学修飾した細胞接着性ポリペプチド；Ｐ１−７）を得た。
【００９８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材[ＰＢ８]の作製
「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）」を「化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−７）」に変更した以外、実施例１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］（コーティング量が異なるＰＢ８−１〜ＰＢ８−３）を得た。
【００９９】
＜コーティング量の測定＞
Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］（コーティング量の異なるＰＢ１−１〜ＰＢ８−３）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
【０１００】
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得た。これらの結果を表１〜４に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。
【０１０１】
＜化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数の測定＞
化学修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｇを６Ｎ 塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。次に、エバポレーターを用いて６Ｎ 塩酸を試料希釈液（アミノ酸自動分析用試料希釈液 Ｎａ型 ｐＨ２．２０）に置換した後、２ｍｌに試料希釈液でフィルアップ(full up)した。フィルアップした溶液を試料希釈液で１０倍希釈し、０．２μｍのフィルターを通し測定用試料とした。
【０１０２】
分析はポストラベル法によるＨＰＬＣ測定を用いて行い、ラベル化試薬としてはオルトフタルアルデヒド、スタンダードとしてはアミノ酸混合標準液 Ｈ型を用いて、ＨＰＬＣでの溶出時間からアミノ酸の種類を同定した。
上記において、（Ｐ１−１）にかえて（Ｐ１−０）を用いる以外は同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
【０１０３】
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ−Ｎａ
カラム温度：６０℃
移動相：アミノ酸分析移動相セット（Ｎａ 型）（メーカー名：株式会社島津製作所）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：励起波長３５０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ
（Ｐ１−０）及び（Ｐ１−１）のＨＰＬＣのピーク面積から、下記式により官能基（Ｋ）の平均個数を算出した。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いた。
【０１０４】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa／αａ）／（β０／α０）×γ｝
【０１０５】
α０：ポリペプチド（Ｐ１−０）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：ポリペプチド（Ｐ１−０）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：ポリペプチド（Ｐ１−０）中の各アミノ酸の数
【０１０６】
上記において、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）に変えて細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−７）を用いたこと以外、上記と同様にして、化学修飾された細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−７）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。これらの結果を表１〜４に示す。
【０１０７】
＜評価：ＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮由来細胞）の細胞接着活性＞
ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に５０μＬ／ウェルで投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＧＥ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３０℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１０８】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１０９】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＧＥ１細胞の細胞接着活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図１）。
【０１１０】
＜評価：ＧＥ１細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性＞
［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３３℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＧＥ１細胞（大日本製薬株式会社製）を１０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３３℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１１】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次に１０容量％の血清を含むＤＭＥＭを１００μＬ／ウェルで添加し、３３℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に１５日間培養した。また、５日間ごとに培地を交換した。
【０１１２】
１５日後に、テトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞増殖活性とした。細胞増殖活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表３に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＧＥ１細胞の細胞増殖活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図３）。
【０１１３】
＜評価：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）の細胞接着活性＞
ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に５０μＬ／ウェルで投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１４】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１１５】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞接着活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図２）。
【０１１６】
＜評価：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス歯肉上皮細胞由来細胞）の細胞増殖活性＞
［ＰＢ１］〜［ＰＢ８］の評価基材に血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【０１１７】
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／ウェルで添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次に１０容量％の血清を含むＤＭＥＭを１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に１５日間培養した。また、５日間ごとに培地を交換した。
【０１１８】
１５日後に、テトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞増殖活性とした。細胞増殖活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表４に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。また、得られた結果について、縦軸をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞増殖活性、横軸をコーティング量としてプロットし、グラフを作成した（図４）。
【０１１９】
＜評価：インテグリンの抗体添加による細胞接着阻害活性＞
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を血清を含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に４００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁した。この細胞懸濁液に各インテグリン（α３、α４、αＶ、α６、β１及びβ４）の抗体（入手先；α３：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、β４：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、αＶ：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、α４，α6，β１：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）のいずれかを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中で３０分間放置して、インテグリン抗体結合細胞を得た。これらのインテグリン抗体結合細胞と、基材［ＰＢ１−３、ＰＢ２−３、ＰＢ３−３、ＰＢ７−３及びＰＢ８−３］とを用いて、上記と同様にして、細胞接着活性を測定し、この細胞接着活性の測定値（Ｇ１）と表２の細胞接着活性（Ｇ０）とから、細胞接着阻害（％）を下記式により求め、下記の基準で評価した。
【０１２０】
細胞接着阻害（％）＝｛（Ｇ０）−（Ｇ１）｝／（Ｇ０）×１００
−：細胞接着阻害０％以上１０％未満
＋：細胞接着阻害１０％以上２０％未満
＋＋：細胞接着阻害２０％以上４０％未満
＋＋＋：細胞接着阻害４０％以上
【０１２１】
インテグリンの抗体を加えると、細胞表面のインテグリンがインテグリン抗体によりマスクされ、細胞接着が阻害されるため、細胞が細胞接着性ポリペプチドに接着できなくなる。したがって、それぞれのインテグリン抗体の添加による細胞接着阻害が大きいほど、細胞接着性ポリペプチドがそのインテグリンと結合していたことを意味する。これらの結果を表５に示す。
【０１２２】
【表１】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２３】
表１において、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）をコーティングした基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ６］（実施例１〜６）は、官能基を導入していないポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ７］（比較例１）と比較して、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ６−１）、すべての実施例の基材が比較例１（ＰＢ７−１）の基材よりも細胞接着活性が優れていた。特に、実施例１、２及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞接着活性が、比較例１の基材の細胞接着活性よりも有意に高かった。さらに、コーティング量が２μｇ／ｃｍ２近辺である場合（実施例１〜６の基材（ＰＢ１−２〜ＰＢ６−２）と比較例１の基材（ＰＢ７−２）を比較した場合）も、本発明の実施例の基材が比較例の基材よりも細胞接着性が優れていた。このことは、図１からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、コーティング量を減らしても細胞接着性が極めて優れていることがわかる。
【０１２４】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材は、化学修飾されたアミノ酸の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。
【０１２５】
【表２】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２６】
表２において、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ７−１を比較した場合）、すべての実施例の基材が比較例１の基材よりも細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。特に、実施例１、２、４、５及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞接着活性が、比較例１の基材の細胞接着活性よりも有意に高かった。このことは図２からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、様々な細胞種で細胞接着性が優れていることがわかる。
【０１２７】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材は、化学修飾されたアミノ酸の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞接着活性が高く、細胞接着性が優れていた。
【０１２８】
【表３】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１２９】
表３において、本発明の細胞接着性ポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ１］〜［ＰＢ６］（実施例１〜６）は、官能基を導入していないポリペプチドをコーティングした基材［ＰＢ７］（比較例１）及び第３級アミノ基を導入した基材［ＰＢ８］（比較例２）と比較して、コーティング量が低濃度である０．５μｇ／ｃｍ２近辺（ＰＢ１−１〜ＰＢ８−１を比較した場合）での細胞増殖活性が高かった。特に、官能基の平均個数が６０〜９０である実施例１、２、及び６の基材において有意に高かった。このことは、図３からも明らかである。
【０１３０】
さらに、比較例２の基材は、化学修飾された官能基の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３１】
【表４】
アスタリスクは比較例１との有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。なお、ｔ検定により有意差を判定した。
【０１３２】
表４において、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺である場合（ＰＢ１−１〜ＰＢ８−１を比較した場合）、すべての実施例の基材が比較例１及び２の基材よりも細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。特に、実施例１、２及び６の基材は、コーティング量が０．５μｇ／ｃｍ２近辺での細胞増殖活性が、比較例１の基材の細胞増殖活性よりも有意に高かった。このことは図４からも明らかである。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、様々な細胞種で細胞増殖性が優れていることが分かる。
【０１３３】
また、第３級アミノ基を導入した比較例２の基材に対して、実施例１〜６の基材は２μｇ／ｃｍ２近辺での細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３４】
さらに、比較例２の基材は、化学修飾された官能基の平均個数が同程度である実施例２の基材と比較して、全てのコーティング量において実施例２の基材の方が細胞増殖活性が高く、細胞増殖性が優れていた。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
表５において、カルボキシル基又はスルホ基により化学修飾された本発明の細胞接着性ポリペプチド（実施例１及び２）及び第３級アミノ基を導入した細胞接着性ポリペプチド（比較例２）は、インテグリン（α３、α４、αＶ、α６、β１及びβ４）の抗体により細胞接着が阻害されており、比較例１の細胞接着性ポリペプチドと比べて、新たに、細胞表面のインテグリン（αＶ、α６及びβ４）と接着していることが分かった。また、カルボキシル基又はスルホ基により化学修飾された本発明の細胞接着性ポリペプチド（実施例１及び２）は、同様に、比較例２の細胞接着性ポリペプチドと比べて、新たに、細胞表面のインテグリン（αＶ）と接着していることが分かった。以上の通り、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、比較例１、２の細胞接着性ポリペプチドと比較して、より多くの種類のインテグリンと結合するため、細胞接着性ポリペプチドが低濃度であっても細胞接着性が優れると考えられる。
【０１３７】
＜実施例７〜１２＞
実施例１〜６で得た細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を用いたマウス胎児由来線維芽細胞の細胞集合体の作製
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液をコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ ＣｅｌＳｔｉｒ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、ＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）８ｍｌ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）懸濁液１ｍｌ（１０７cells/ｍｌ）、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて旋回培養を行った。
また、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−６）についても上記と同様にして、旋回培養を行った。
【０１３８】
培養６時間後、培養液３００μＬをそれぞれのフラスコから回収し、回収しなかった培養液については、７日間培養を継続した。
回収した各培養液を、Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加した。その後、それぞれのウェルについて、細胞集合体の顕微鏡画像（倍率４０倍、ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を取得し、画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ Ｊ、アメリカ国立衛生研究所）及びマイクロメーター（目盛１０μｍ、目盛長１ｍｍ）を用いて解析することにより、得られた細胞集合体（１）〜（６）の粒子径と粒度分布を測定した。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値及びばらつきで示した。結果を表６に示す。
なお、画像解析ソフトにより得られる数値の単位が「ピクセル」であるため、マイクロメーターにより画像を計測して、１ピクセルが何μｍに相当するのかを算出し、実際の単位「μｍ」に換算した。
【０１３９】
＜比較例３及び４＞
比較例１〜２で使用した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を用いたマウス胎児由来線維芽細胞の細胞集合体の作製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）に変更したこと以外、実施例７〜１２と同様にして、細胞集合体（７）〜（８）を作成し、細胞集合体の粒子径と粒度分布を測定した。結果を表６に示す。
【０１４０】
＜比較例５＞
Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１５分間放置した。１５分後、ポリビニルアルコール水溶液を除去し、ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで加えて２回洗浄した。
洗浄したウェルに、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（マウス胎児由来線維芽細胞）懸濁液１ｍｌ（１０４cells /ｍｌ）を加え、３７℃で７日間培養した。
【０１４１】
＜細胞集合体の活性評価；ミトコンドリア活性＞
培養して７日後の実施例７〜１２、比較例３〜５の培養液を、それぞれＵ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／ウェルで添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【０１４２】
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。生細胞数は細胞集合体に核放出溶液（０．２重量％クリスタルバイオレット、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、２重量％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、１時間置くことで生細胞の核を細胞から放出させ、血球計数盤を用いて核数を測定した。ホルマザン生成量を生細胞数で標準化し、細胞集合体のミトコンドリア活性とした。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値で評価した。また、実施例７〜１２、比較例３及び４のミトコンドリア活性は、比較例５のミトコンドリア活性を１００とした場合の相対値で表した。これらの結果を表６に示す。
【０１４３】
【表６】
【０１４４】
表６から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用して得た細胞集合体（１）〜（６）（実施例７〜１２；６時間培養後）の粒径は７１〜１０７μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を使用して得た細胞集合体（７）及び（８）（比較例３、４；６時間培養後）の粒径５３μｍ及び６４μｍよりも有意に大きかった。
【０１４５】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体（１）〜（６）の粒径のばらつきは±１０μｍ〜±３０μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体（７）及び（８）の粒径のばらつき±３１μｍ及び±３２μｍより小さかった。
したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、比較用の細胞集合体に比べて、粒径の大きな細胞集合体を得ることができた。また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、粒径のばらつきの小さな細胞集合体を得ることができた。
【０１４６】
また、表６の培養７日間後のミトコンドリア活性の測定結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用した細胞培養（実施例７〜１２）では８９以上と、細胞接着性ポリペプチドを用いていない細胞培養（比較例５）と同等程度又はそれ以上であり、活性の高い細胞集合体を得られた。特に、実施例７〜１０の細胞培養では１０５〜１４０と比較例５の細胞培養よりも高く、得られた細胞集合体の活性が非常に高かった。
【０１４７】
＜実施例１３〜１８＞
実施例１〜６で得た細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を用いた肝臓由来細胞の細胞集合体の作製
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液でコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ ＣｅｌＳｔｉｒ Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、ＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）８ｍｌ、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓由来細胞）懸濁液１ｍｌ（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）１ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて旋回培養を行った。
また、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）〜（Ｐ１−６）についても上記と同様にして、旋回培養を行った。
【０１４８】
培養６時間後、培養液３００μＬをそれぞてのフラスコから回収し、回収しなかった培養液については、７日間培養を継続した。
回収した各培養液を、Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加した。その後、それぞれのウェルについて、細胞集合体の顕微鏡画像を取得し、得られた細胞集合体（９）〜（１４）の粒子径と粒度分布を測定した。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値及びばらつきで示した。結果を表７に示す。
【０１４９】
＜比較例６及び７＞
比較例１〜２で使用した細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を用いた肝臓由来細胞の細胞集合体の作製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）に変更したこと以外、実施例７〜１２と同様にして、細胞集合体（１５）〜（１６）を作成し、細胞集合体の粒子径と粒度分布を測定した。結果を表７に示す。
【０１５０】
＜比較例８＞
Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１５分間放置した。１５分後、ポリビニルアルコール水溶液を除去し、ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで加えて２回洗浄した。
洗浄したウェルに、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓由来細胞）懸濁液１ｍｌ（１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で７日間培養した。
【０１５１】
＜細胞集合体の活性評価；チトクローム活性＞
培養して７日後の実施例１３〜１８、比較例６〜８の培養液を、それぞれＵ底９６ｗｅｌｌプレートに３カ所ずつ、それぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、さらにＰ４５０−ＧＬＯＴＭＣＹＰ３Ａ４ ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いてチトクローム活性を測定した。生細胞数は細胞集合体に核放出溶液（０．２重量％クリスタルバイオレット、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、２重量％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、１時間置くことで生細胞の核を細胞から放出させ、血球計数盤を用いて核数を測定した。チトクローム活性を生細胞数で標準化し、細胞集合体のチトクローム活性とした。測定した結果は、３カ所のウェルの平均値で評価した。また、実施例１３〜１８、比較例６及び７のチトクローム活性は、比較例８のチトクローム活性を１００とした場合の相対値で表した。これらの結果を表７に示す。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
表７から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）を使用して得た細胞集合体（９）〜（１４）（実施例１３〜１８；６時間培養後）の粒径は１０１〜１５０μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−０）又は（Ｐ１−７）を使用して得た細胞集合体（１５）及び（１６）（比較例６、７；６時間培養後）の粒径８３μｍ及び９４μｍよりも有意に大きかった。
【０１５４】
また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体の粒径のばらつきは±１４μｍ〜±３３μｍであり、比較の細胞接着性ポリペプチドを使用して作製した細胞集合体の粒径のばらつき±３６μｍ及び±３９μｍより小さかった。
したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、比較用の細胞集合体に比べて、粒径の大きな細胞集合体を得ることができた。また、本発明の細胞接着性ポリペプチドを用いれば、粒径のばらつきの小さな細胞集合体を得ることができた。
【０１５５】
また、表７の培養７日間後のチトクローム活性の測定結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−６）のチトクローム活性は１０１以上と、細胞接着性ポリペプチドを用いていない比較例８と同等程度又はそれ以上であり、活性の高い細胞集合体を得られた。特に、実施例１３〜１７のチトクローム活性は１２１〜１５０と比較例８のそれよりも極めて高く、得られた細胞集合体の活性が非常に高かった。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、低濃度においても細胞接着性及び細胞増殖性が極めて高いため、従来は無血清培養条件下において接着が困難であった細胞（ＧＥ１細胞等）を基材上に効率良く接着させることができる。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
【０１５７】
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
【０１５８】
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
【０１５９】
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、
カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチド。
【請求項２】
化合物（Ａ）がカルボキシル基又はスルホ基を有する化合物である請求項１に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項３】
化合物（Ａ）がクロロ酢酸又は２−クロロエタンスルホン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項４】
反応性基含有アミノ酸残基が、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項５】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列及びＴｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項６】
補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列 、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、ａは５〜１００の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは１〜｛２００／（６＋ｆ）の小数点以下を切り捨てした数｝の整数、ｈは２〜４０の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数である。
【請求項７】
ポリペプチド（Ｐ）が、さらに細胞接着性最少アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含み、
細胞接着性最少アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造である請求項１〜６のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項８】
反応性基含有アミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数が１〜１５６個である請求項１〜７のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチド（Ｐ）が、配列（８６）、配列（８７）、配列（８８）、配列（８９）、配列（９０）、配列（９１）、配列（９２）、配列（９３）又は配列（９４）で表されるポリペプチドである請求項１〜８のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）を含む細胞接着性ポリペプチド含有基材。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含む細胞又は細胞集合体の生産方法。
【請求項１】
少なくとも細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）から構成され、反応性基含有アミノ酸残基を有するポリペプチド（Ｐ）と、
カルボキシル基、スルホ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ａ）とを化学反応させることにより、
ポリペプチド（Ｐ）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基を化学修飾した細胞接着性ポリペプチド。
【請求項２】
化合物（Ａ）がカルボキシル基又はスルホ基を有する化合物である請求項１に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項３】
化合物（Ａ）がクロロ酢酸又は２−クロロエタンスルホン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項４】
反応性基含有アミノ酸残基が、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項５】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ配列（７）、Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ配列、Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ配列（８）、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ配列（１０）、Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ配列及びＴｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項６】
補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Ｇｌｙ Ａｌａ）ａ配列 、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）ｂ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｃ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ）ｄ配列、（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｅ配列、｛Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ （Ａｌａ）ｆ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ｝ｇ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ）ｈ配列、（Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ）ｍ配列及び（Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ）ｎ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、ａは５〜１００の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは１〜｛２００／（６＋ｆ）の小数点以下を切り捨てした数｝の整数、ｈは２〜４０の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数である。
【請求項７】
ポリペプチド（Ｐ）が、さらに細胞接着性最少アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含み、
細胞接着性最少アミノ酸配列（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造である請求項１〜６のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項８】
反応性基含有アミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数が１〜１５６個である請求項１〜７のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチド（Ｐ）が、配列（８６）、配列（８７）、配列（８８）、配列（８９）、配列（９０）、配列（９１）、配列（９２）、配列（９３）又は配列（９４）で表されるポリペプチドである請求項１〜８のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）を含む細胞接着性ポリペプチド含有基材。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチドを用いて細胞培養する工程を含む細胞又は細胞集合体の生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１２６７０７（Ｐ２０１２−１２６７０７Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４２００４（Ｐ２０１１−２４２００４）
【出願日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【出願人】（５９９０２９４２０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【出願人】（５９９０２９４２０）
【Ｆターム（参考）】
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