化学修飾リガーゼ補因子、ドナーおよびアクセプター

本明細書では、修飾ライゲーション構成要素、特に修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーを含有するポリヌクレオチドのライゲーション方法を提供する。該方法は、修飾補因子の使用によってマッチ鋳型とミスマッチ鋳型の識別が改善される、核酸配列を検出するためのライゲーション系アッセイに容易に適用される。さらに、修飾ライゲーション構成要素の使用によって、核酸鋳型が存在しない場合のライゲーションが低減または排除される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年７月６日出願の「化学修飾リガーゼ補因子、ドナーおよびアクセプター」と題する米国特許仮出願第６１／２２３，３６４号に基づく優先権を主張し、その全体はあらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の説明
米国政府は、国立一般医科学研究所による認可番号ＧＭ０８５８６０に従って本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書では、核酸ライゲーションのための方法および組成物を提供する。特定の態様および実施形態では、該方法および組成物は、マッチ核酸標的とミスマッチ核酸標的の間のリガーゼ特異性を改善し、かつ／または修飾リガーゼ補因子、ドナーおよびアクセプターならびにその組合せを使用して鋳型非依存性ライゲーションを低減もしくは阻害する。
【背景技術】
【０００４】
以下の説明は、読み手の理解を支援するために提供されるものである。提供される情報または引用される参考文献はいずれも、本発明に対する従来技術であると認めるものではない。
【０００５】
核酸リガーゼは、ＡＴＰまたはＮＡＤ＋などの補因子の存在下で、核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）の隣接する３’−ヒドロキシル末端と５’−ホスホリル末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒する種類の酵素に属する。リガーゼは、核酸配列検出、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、タンパク質検出、ライゲーションによるシークエンシングおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むいくつかの分子生物学用途において用いられる。
【０００６】
生化学的忠実度の実験では、ＤＮＡリガーゼは、様々な核酸基質のミスマッチに許容性を示すことが見出されている。例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ミスマッチに対する許容性を有する結果、１０³個のミスマッチ二本鎖のうち１個を封鎖する傾向がある。Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ａ．Ｋ．ら、１０６Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ、３４０〜３６０頁（２００６年）。それと比較して、従来のＤＮＡポリメラーゼの誤差率は、１０⁵〜１０⁶個のｄＮＴＰ挿入のうち約１個という誤差であり、これはリガーゼよりも数桁高い忠実度である。ＤＮＡリガーゼの他の非定型接合反応には、分子内のループ形成（Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、８０９〜８１３頁（１９９１年））、非オーバーラップの平滑末端二本鎖の接合（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、８９Ｇｅｎｅ、１１７〜１２２頁（１９９０年）、Ｃａｏ，Ｗ．、２２ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８〜４４頁（２００４年））および鋳型非依存性反応（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｋｕｈｎ，Ｈ．ら、２７２ＦＥＢＳＪ、５９９１〜６０００頁（２００５年））が含まれる。
【０００７】
ＤＮＡライゲーションの忠実度を改善するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｌｕｏ，Ｊ．ら、２４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、３０７９〜３０８５頁（１９９６年）は、３’−ＯＨから上流の３番目のヌクレオチドの修飾、ユニバーサル塩基である３−ニトロピロールを有するアクセプターおよびリガーゼタンパク質の部位特異的な突然変異誘発を開示している。Ｔｏｎｇ，Ｊ．ら、２７ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、７８８〜７９４頁（１９９９年）；Ｆｅｎｇ，Ｈ．ら、４３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２６４８〜１２６５９頁（２００４年）；Ｊｅｏｎ，Ｈ．ら、２３７ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．、１１１〜１１８頁（２００４年）；Ｌｉｍ，Ｊ．ら、３８８ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．、２５３〜２６０頁（２００１年）；およびＬｕｏ，Ｊ．ら、２４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、３０７１〜３０７８頁（１９９６年）は、ＤＮＡリガーゼの変異するアミノ酸残基を開示している。Ｃａｏ，Ｗ．、２２ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８〜４４頁（２００４年）は、ライゲーション反応におけるエンドヌクレアーゼの使用を開示している。Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら、ＵＳ特許第６，２９７，０１６は、アクセプターの修飾を開示している。Ｆｕｎｇ，Ｓ．ら、ＵＳ特許第５，５９３，８２６号は、３’−ＮＨ₂置換アクセプタープローブを開示している。Ｂａｎｄａｒｕ，Ｒ．ら、ＵＳ特許第６，８１１，９８６号および同第６，６３５，４２５号は、ドナーの（５’−リン酸）鎖における５’−チオリン酸の使用を開示している。
【０００８】
修飾リガーゼ補因子は、リガーゼ補因子依存性を決定するために、ライゲーション阻害剤として使用されている。例えば、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ａ．ら、２７１ＢｉｏｃｈｅｍＪ．、２６５〜２６８頁（１９９０年）；Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．、３４Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６１３８〜１６１４７頁（１９９５年）；Ｒａａｅ，Ａ．ら、８１Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４〜２７頁（１９７８年）；Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．ら、２６９Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９９３〜５９９９頁（２００２年）；Ｂｅｌｆｏｒｄ，Ｈ．Ｇ．ら、２６８ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２４４４〜２４５０頁（１９９３年）；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．ら、２７１ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、１１０８３〜１１０８９頁（１９９６年）；Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．ら、７１ＪＶｉｒｏｌ、１９３１〜１９３７頁（１９９７年）；Ｌａｉ，Ｘ．ら、６Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、４６９〜４７７頁（２００２年）；およびＳｒｉｓｋａｎｄａ，Ｖ．ら、２８ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、２２２１〜２２２８頁（２０００年）参照。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書では、核酸ライゲーションのための方法および組成物を提供する。これらの方法は、核酸ライゲーション反応における核酸リガーゼ、核酸基質、リガーゼ補因子、ドナー、アクセプターの使用を含む。特定の態様では、該方法は、修飾リガーゼ補因子、修飾ドナー、修飾アクセプターまたはその組合せ（本明細書ではまとめて「修飾リガーゼ構成要素」と呼ぶ）の使用を伴い、これにより、核酸ライゲーションの忠実度を改善する。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、修飾ＡＴＰおよび修飾ＮＡＤ＋である。
【００１０】
一態様によれば、標的核酸の変異を検出する方法を提供する。本発明で提供する諸態様の特定の実施形態では、該方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は修飾されており、そして、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターすることを含み、ここで、ライゲーションの量は、変異の有無を示すことを特徴とする。
【００１１】
第２の態様では、標的核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）部位における代替塩基の１つの有無を検出する方法を提供する。本発明で提供する諸態様の特定の実施形態では、該方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は修飾されており、そして、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターすることを含み、ここで、ライゲーションの量は、標的核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）部位において代替塩基の１つの有無を示すことを特徴とする。
【００１２】
第３の態様では、標的核酸中の第１の核酸配列または第２の核酸配列の存在を識別する方法を提供する。本発明で提供する諸態様の特定の実施形態では、該方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は修飾されており、そして、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターすることを含み、ここで、ライゲーションした核酸の存在または量は、標的核酸中の第１の核酸配列の存在もしくは量を示し、および／または標的核酸中の第２の核酸配列の非存在を示し、ライゲーションの非存在は、標的核酸中の第１の核酸配列の非存在を示すことを特徴とする。
【００１３】
第４の態様では、標的核酸の特定の位置における特定のヌクレオチドの有無を決定する方法を提供する。本発明で提供する諸態様の特定の実施形態では、該方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は修飾されており、そして、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターすることを含み、ここで、ライゲーションした核酸の存在は、標的核酸の特定の位置における特定のポリヌクレオチドの存在を示し、ライゲーションの非存在は、標的核酸の特定の位置における特定のポリヌクレオチドの非存在を示すことを特徴とする。
【００１４】
第５の態様では、本発明で提供する組成物を含むキットおよび本発明で提供する方法を実施するためのキットを提供する。本明細書に記載の通りライゲーションを実施するための修飾ライゲーション構成要素を含むキットも提供する。例えばキットは、酵素であるリガーゼおよび修飾補因子を含有して、対立遺伝子に特異的な産物などの共通の核酸標的を検出することができる。修飾ライゲーション構成要素を含有するキットは、核酸ライゲーション用に印を付された容器、核酸ライゲーションを実施するための指示、ならびに／または修飾補因子、核酸リガーゼおよび反応バッファーからなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を含むことができる。修飾ライゲーション構成要素を含有するキットは、１つまたは複数のドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドを含むこともできる。一実施形態では、修飾ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドは修飾されている。キットは、核酸ライゲーション用に印を付された容器、核酸ライゲーションを実施するための指示、ならびに少なくとも１つの修飾ライゲーション構成要素および／またはリガーゼ補因子、核酸リガーゼ、マグネシウム、ドナー配列、アクセプター配列および反応バッファーからなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を含むことができる。
【００１５】
本発明で提供される第６の態様では、本明細書に記載の通りライゲーションを実施するための修飾ライゲーション構成要素を同定する方法も提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、天然ライゲーション構成要素または他の修飾ライゲーション構成要素と比較して高い特異性を有する修飾補因子を同定する。例えば、該方法は、マッチ鋳型またはミスマッチ鋳型の存在下での修飾補因子の性能を評価することができる。いくつかの実施形態では、ミスマッチ領域はドナープローブにハイブリダイズし、他の実施形態では、ミスマッチ領域はアクセプタープローブにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、修飾補因子の性能は、核酸鋳型が存在しない場合のライゲーション活性の低減または阻害について評価される。いくつかの実施形態では、該方法は、天然または非修飾補因子と比較して、改善されたライゲーション特異性を有する修飾ライゲーション構成要素を同定する。いくつかの実施形態では、該方法は、修飾ライゲーション構成要素の使用が、天然または非修飾補因子と比較して類似のライゲーション率をマッチ核酸に提供するような修飾ライゲーション構成要素を同定することができる。他の実施形態では、該方法は、天然または非修飾補因子と比較して、ミスマッチ核酸の存在下で改善されたライゲーション特異性を有する修飾ライゲーション構成要素を同定することができる。さらなる他の実施形態では、該方法は、ライゲーション接合点またはライゲーション接合点の１０塩基以内において１つまたは複数の塩基対のミスマッチが存在する場合のライゲーションの量または収率について、修飾ライゲーション構成要素を評価する。またさらなる実施形態では、該方法は、核酸鋳型が存在しない場合のライゲーションを低減または阻害する能力について、修飾ライゲーション構成要素を評価する。
【００１６】
第７の態様では、標的核酸が存在しない場合のライゲーションを低減または阻害するための方法を提供する。本発明で提供する諸態様の特定の実施形態では、該方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートすることを含み、ここで、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は修飾されており、この方法では、その修飾ライゲーション構成要素が存在する場合、標的核酸が存在しない場合のライゲーションが低減または阻害される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する組成物および方法は、修飾ライゲーション構成要素、特に修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプター、修飾ドナーおよびそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、修飾ライゲーション構成要素には、本明細書でさらに詳説する式Ｉ〜ＩＩＩに図示のものが含まれる。
【００１８】
本発明で提供する方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、著しい利点を有する。例えば、最終使用者は、非修飾／天然補因子（すなわち、ＡＴＰおよびＮＡＤ＋）、非修飾ドナープローブまたは非修飾アクセプタープローブを用いて既に行っているのと同じまたは類似のライゲーションプロトコルおよび方法を使用することができる。本発明で提供する方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、既存のライゲーション系および試薬と適合性があり、追加の酵素または試薬を必要としないが、それらを使用することもできる。
【００１９】
本発明で提供する方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、相補的な標的の存在下での核酸ライゲーションについて、非修飾ライゲーション構成要素と比較して、好ましくは少なくともほぼ同じ効率を有する。好ましくは、修飾ライゲーション構成要素が、その対応する非修飾ライゲーション構成要素と比較して、ライゲーション反応における試薬として少なくとも５０％有効性が低い場合、好ましくはその対応する非修飾ライゲーション構成要素と比較して、ライゲーション反応における試薬として少なくとも６０％有効性が低い、好ましくは少なくとも７０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも８０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９５％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９９％有効性が低い、最も好ましくは１００％有効性が低い場合に、非相補的またはミスマッチ標的核酸の存在下でのライゲーションが損なわれるとみなされる。当業者は、修飾ライゲーション構成要素のライゲーション活性および効率のレベルを容易に決定することができる。
【００２０】
本発明で提供する方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、非修飾ライゲーション構成要素と比較して、好ましくはミスマッチ標的の存在下での核酸ライゲーション効率をもたず、またはその効率が低い。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「リガーゼ補因子」は、リガーゼのリシンのε−アミノ基が、補因子（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤ＋）のαリン酸（すなわち、アデノシン構成要素の５’酸素に直接結合しているリン酸）を攻撃して共有結合性のホスホルアミド酸結合を形成するように（例えば、図１に示す通り）、リガーゼと相互作用する化合物を指す。特定の実施形態では、リガーゼ補因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋またはＧＴＰである。一般にリガーゼは、ＡＴＰ依存性またはＮＡＤ＋依存性である。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「修飾リガーゼ補因子」は、置換基が結合しているリガーゼ補因子を指す。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、修飾ＡＴＰまたは修飾ＮＡＤ＋である。いくつかの実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、２つ以上の置換基を有する。修飾補因子には、本明細書に図示した、例えば式Ｉのものが含まれる。特定の実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、ＡＴＰ−αＳ（すなわち、５’−α−チオアデノシン三リン酸）、ＡＴＰ−γＳ（すなわち、５’−［γ−チオ］−三リン酸）またはＡＭＰ−ＰＮＰ（すなわち、５’−［β，γ−イミド］−三リン酸）ではない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「修飾リガーゼ補因子」に関連する用語「非修飾リガーゼ補因子」または「天然リガーゼ補因子」は、置換基を含まない対応するリガーゼ補因子を指す。例えば、修飾ＡＴＰに対する非修飾リガーゼ補因子は、ＡＴＰである。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「ドナー」、「ドナーポリヌクレオチド」、「５’−リン酸化ドナーポリヌクレオチド」または「ドナープローブ」は、アクセプターにライゲーションすることができる５’リン酸を有するポリヌクレオチドを指す。ドナーは、核酸ライゲーションに適した条件下で、相補的な標的核酸上のアクセプターの近接でハイブリダイズする場合のライゲーションに適しており、好ましくは、アクセプターおよびドナーは、相補的な標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的核酸と相補的でない（ミスマッチである）少なくとも１つの核酸部位を有する。特定の実施形態では、ミスマッチは、対象となるヌクレオチド（例えばＳＮＰ部位）に存在する。本発明で提供する方法および組成物に適したさらなる代替のポリヌクレオチドには、それに限定されるものではないが、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−主鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、ドナーはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「修飾ドナー」、「修飾ドナーポリヌクレオチド」または「修飾ドナープローブ」は、置換基を有するドナーを指す。好ましくは、置換基は、ライゲーション接合点に近接している（例えば、ライゲーション接合点の１、２、３、４または５ヌクレオチド下流）。好ましい実施形態では、置換基は、リボースおよび／または１つもしくは複数のヌクレオチド間リン酸の２’位置にある。いくつかの実施形態では、修飾ドナーは、２つ以上の置換基を有する。修飾ドナーには、本明細書に図示した、例えば式ＩＩＩのものが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「アクセプター」、「アクセプターポリヌクレオチド」、「３’−ヒドロキシル末端アクセプターポリヌクレオチド」または「アクセプタープローブ」は、ドナーにライゲーションすることができる３’ＯＨ基を有するポリヌクレオチドを指す。アクセプターは、核酸ライゲーションに適した条件下で、相補的な標的核酸上のドナーの近接でハイブリダイズする場合のライゲーションに適しており、好ましくは、アクセプターおよびドナーは、相補的な標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、アクセプターは、標的核酸と相補的でない（ミスマッチである）少なくとも１つの核酸部位を有する。特定の実施形態では、ミスマッチは、対象となるヌクレオチド（例えばＳＮＰ部位）にある。本発明で提供する方法および組成物に適したさらなる代替のポリヌクレオチドには、それに限定されるものではないが、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−主鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、アクセプターはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「修飾アクセプター」、「修飾アクセプターポリヌクレオチド」または「修飾アクセプタープローブ」は、置換基を有するアクセプターを指す。好ましくは、置換基は、ライゲーション接合点に近接している（例えば、ライゲーション接合点の１、２、３、４または５ヌクレオチド上流）。好ましい実施形態では、置換基は、リボースおよび／または１つもしくは複数のヌクレオチド間リン酸の２’位置にある。いくつかの実施形態では、修飾アクセプターは、２つ以上の置換基を有する。修飾アクセプターには、本明細書に図示した、例えば式ＩＩのものが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「置換基」は、リガーゼ補因子、ドナーまたはアクセプターに結合することができる任意の化学的な部分を指す。置換基は、それに限定されるものではないが、リン酸、糖、三リン酸、ヌクレオシド塩基部分およびヌクレオチド間結合を含む位置に結合することができる。置換基は、核酸ライゲーションの過程と適合性のある任意の性質の基であってよい。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、核酸ライゲーションの特異性または忠実度を増大する（例えば、相補的な核酸をライゲーションし、非相補的な核酸をライゲーションしないか、またはそのライゲーションを低減する能力）。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、置換基が存在しない場合のライゲーションと比較して、非相補的な核酸のライゲーションを低減、阻害または排除する。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、相補的な核酸のライゲーションと比較して、非相補的な核酸のライゲーションを低減、阻害または排除する。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、鋳型が存在しない場合のライゲーションを低減、阻害または排除する。一実施形態では、置換基は、検出可能な標識を含むことができる。したがって標識化核酸は、ライゲーション後に、その大きさ、質量、アフィニティーキャプチャーおよび／または色によって同定することができる。検出可能な標識には、それに限定されるものではないが、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、リン光基、放射性材料、化学発光部分および電気化学的な検出部分が含まれる。検出可能な標識は、好ましくは蛍光色素であり、好ましいアフィニティーキャプチャー標識はビオチンである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「修飾ライゲーション構成要素」は、修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーを指し、各構成要素を個々に、まとめて、またはそれらの組合せによって指す。例えば、修飾ライゲーション構成要素は、修飾リガーゼ補因子のみ；１種類の修飾を有する修飾リガーゼ補因子；２種類以上の修飾を有する修飾リガーゼ補因子；修飾リガーゼ補因子および修飾ドナー；修飾リガーゼ補因子および修飾アクセプター；または修飾リガーゼ補因子、修飾リガーゼアクセプターおよび修飾リガーゼドナーを指すことができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ライゲーション」または「ライゲーションする」は、ポリヌクレオチドを接合するための、当技術分野で公知の方法を指す。好ましくは、ライゲーションは、アクセプターポリヌクレオチドの３’末端を、ドナーポリヌクレオチドの５’末端に接合することを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸のニックがライゲーションされて、ホスホジエステル結合または等価なヌクレオチド間結合を形成し、それによって鋳型核酸配列のより長い相補的なコピーが形成される。ニック付き二本鎖核酸は、相補的な核酸鋳型にハイブリダイズした３’−ヒドロキシル末端アクセプターオリゴヌクレオチドと、アクセプターオリゴヌクレオチドのすぐ下流にハイブリダイズした５’−リン酸化ドナーオリゴヌクレオチドからなる。本発明で提供する組成物および方法を伴うライゲーションは、核酸リガーゼによる接合と共に、１つまたは複数の修飾補因子、１つまたは複数の修飾ドナーおよび修飾アクセプターポリヌクレオチドを用いることができる。標的核酸上でのドナーおよびアクセプタープローブのライゲーションは、ライゲーションされるプローブのターンオーバーを伴って、またはそれなしに生じ得る。好ましくは、ライゲーションはターンオーバーを伴って生じる。鋳型核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／もしくは修飾核酸鋳型、またはそれらの任意の組合せであってよい。以下に記載の例示的な方法はライゲーションに関するものであるが、本発明で提供する方法および組成物に適した核酸の酵素的ライゲーションのための数々の他の方法が、当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、用語「ライゲーション接合点」は、ドナープローブとアクセプタープローブがライゲーションされる、鋳型に沿った２つの隣接する核酸の位置を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「リガーゼ」または「核酸リガーゼ」は、核酸をライゲーションすることができる酵素を指す。好ましくは、リガーゼは、アクセプターポリヌクレオチドの３’末端を、ドナーポリヌクレオチドの５’末端にライゲーションすることができる。他の実施形態では、ニック付き二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／もしくは他の修飾ヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含有することができる。いくつかの実施形態では、リガーゼは、以下のものの１つである。バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＲＮＡリガーゼ、フェロプラズマ・アシディフィルム（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、ヒトＤＮＡリガーゼＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＶ、ワクチニアウイルスＤＮＡリガーゼ、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスＤＮＡリガーゼ、ピュロコックス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘｖｏｌｃａｎｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、アシディアヌス・アムビバレンス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓａｍｂｉｖａｌｅｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ）ＤＮＡリガーゼ、ケナルケオン・シュンビオスム（Ｃｅｎａｒｃｈｅｏｎｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）ＤＮＡリガーゼ、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、ナトロノモナス・パラオシス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓｐｈａｒａｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、ハロクアドラタム・ウォルズビイ（Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍｗａｌｓｂｙｉ）ＤＮＡリガーゼ、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｌｉｎａｒｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノコッコイデス・ブルトニ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノスピリラム・ヒュンガテイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｈｕｎｇａｔｅｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノカルドコックス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓｋａｎｄｌｅｒｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノコックス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサエタ・テルモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡリガーゼ、メタノスパエラ・スタドトマナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａｓｔａｄｔｍａｎａｅ）ＤＮＡリガーゼ、メタノテルモバクター・テルムアウトトロフィクス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、ナノアルカエウム・エクゥィタンス（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍｅｑｕｉｔａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、パイロコックス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ）ＤＮＡリガーゼ、ピロバクルム・アエロフィルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、パイロコックス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ピクロフィルス・トリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓｔｏｒｒｉｄｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｈｉｂａｔａｅ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｔｏｋｏｄａｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、テルモプラズマ・アキドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス・カダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス種ＮＡ１ＤＮＡリガーゼ、テルモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｖｏｌｃａｎｉｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＮＡＤ⁺−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス種ＡＫ１６ＤのＤＮＡリガーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡリガーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザＤＮＡリガーゼ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、デイノコックス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）ＲＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＲＮＡリガーゼ、ロドテルムス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）ＲＮＡリガーゼ、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）ＲＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ１、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、およびバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「ライゲーションをモニターする」とは、ライゲーションされた核酸の存在を検出すること、非存在を検出すること、および／またはその量を測定することを指す。ライゲーションは、例えば、ゲル電気泳動法もしくは検出可能な標識（例えば、蛍光または化学発光プローブ）を使用してライゲーション産物を検出し、かつ／もしくはその量を定量化することによって、またはその後の過程による産物の存在および／もしくは量を、ライゲーション産物の存在および／もしくは量と関連付けることによって（例えば、ライゲーションされた産物のその後の増幅の存在および／または量を、ライゲーション産物の量と直接関連付けることによって）、モニターすることができる。またライゲーションをモニターすることは、核酸の大きさを評価してライゲーションが生じたか否かを示し、または試料内に存在するすべての核酸のどの部分がライゲーションされ、どの部分がライゲーションされなかったかを評価する任意の方法を含み、かかる結果は、百分率または比率として表すことができる。ライゲーションをモニターすることは、本明細書に開示の方法ならびに当技術分野で公知の方法のいずれかを含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはその任意のフラグメント、任意のリボ誘導体もしくはデオキシリボ誘導体を指し、天然および／または修飾ヌクレオチド残基およびヌクレオチド間結合を含有する、天然に存在するまたは合成の分子を指す。これらの句はまた、一本鎖、二本鎖、三本鎖もしくは四本鎖であってよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖であってよい天然起源の（例えばゲノムの）もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡを指し、または任意のＤＮＡのようなもしくはＲＮＡのような材料を指す。ＤＮＡ配列に関する「ＲＮＡ等価物」は、窒素性塩基であるチミンのすべてまたはほとんどの存在がウラシルで置き換えられ、糖主鎖が２’−デオキシリボースの代わりにリボースから構成されていることを除き、参照ＤＮＡ配列と同じ直線状ヌクレオチド配列から構成される。本発明で提供する方法および組成物に適したさらなる代替の核酸主鎖には、それに限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、アルキルホスホトリエステル、アリールホスホトリエステル、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）およびホスホボロネート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒｏｎａｔｅ）、ならびにそれらの組合せが含まれる。ＲＮＡは、本明細書に記載の方法において使用することができ、かつ／または本明細書に記載の方法において使用するために、逆転写によってｃＤＮＡに変換することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、通常は単一鎖の核酸鎖を指し、これは天然に存在するものまたは合成のものであってよい。本願を通して、核酸は５’末端から３’末端に向かって表記される。標準の核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡは、「３’から５’に向かって」、すなわち成長する核酸の５’末端にヌクレオチドを付加することによって化学的に合成されることが多い。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、他の修飾ヌクレオシドまたはそれらの組合せが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸基、５−炭素糖および窒素性塩基からなる核酸のサブユニットを指す。ＲＮＡにおいて見出される５’−炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５’−炭素糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、かかるサブユニットの類似体も含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、約５〜約２００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約７０、より好ましくは約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約３０ヌクレオチド、またはより好ましくは約１５〜約２５ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも６５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、または２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６５ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、５５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、またはそれらの組合せの長さの配列を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」は、酵素をベースとする核酸の伸長反応、例えば増幅およびライゲーションを開始するのに適したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。当業者は、標的配列の伸長に適したプライマーを設計し、調製することができる。本発明で提供する方法および組成物において使用するためのプライマーの長さは、ヌクレオチド配列の同一性、およびこれらの核酸をハイブリダイズする温度またはインビトロでの核酸の伸長中に使用される温度を含むいくつかの因子に応じて変わる。特定の配列同一性のプライマーの好ましい長さを決定するのに必要な考慮すべき点は、当業者に知られている。例えば、短い核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、そのハイブリダイゼーションの特異性または選択性に関係し得る。本明細書で使用される場合、用語「プライマー結合性配列」または「ＰＢＳ」は、特異的プライマーに特異的にハイブリダイズし、またはアニールする核酸領域を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、特異的な核酸の有無を検出するのに適したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」は、対象となる任意の核酸を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「鋳型核酸」は、ドナーおよび／またはアクセプターに結合することができる核酸を指す。好ましくは、鋳型核酸は標的核酸を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「変異」は、第２の核酸配列と比較した場合の第１の核酸配列の配列の差異を指す。例えば変異は、第２の核酸配列と比較した第１の標的核酸配列における、核酸の置換（一塩基多型など）、欠失、挿入および転移を含む。第２の核酸配列は、野生型配列または代替の変異部位の配列であってよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「ミスマッチ」は、標的ヌクレオチドまたは核酸と相補的でないヌクレオチドまたは核酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「ミスマッチ鋳型」または「ミスマッチな鋳型」は、一方の鎖上の少なくとも１つの塩基残基が、任意の残基と対になっていないか、または不正確な塩基と対になっている（例えば、Ｔと対になっていないＡ、またはＧと対になっていないＣ）二重鎖核酸を指す。１００％未満の忠実度／特異性を有するライゲーション反応は、ミスマッチライゲーション産物を形成する。本明細書で使用される場合、用語「マッチ鋳型」は、あらゆる塩基がドナーおよびアクセプタープローブと相補的な標的核酸を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、ある種または他の特異的な集団の異なる個体間における一塩基の遺伝的配列変異を指す。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、ある集団（複数可）の正常な個体において異なる配列代替物（対立遺伝子）が存在する、ゲノムＤＮＡの特異的な核酸部位における一塩基対の位置のことであり、この場合最も頻度の低い対立遺伝子は、１％以上、または０．８％以上、または０．５％以上、または０．４％以上、または０．３％以上、または０．２％以上、または０．１％以上の存在度を有する。いくつかの実施形態では、対象となるＳＮＰは当業者に公知であり、例えば特定のＳＮＰは、Ｐｕｂｍｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／で利用可能）を介して利用できる、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ、ＰＮＡＳおよびＮＥＪＭなどの科学誌により発表されている。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、ＥｎｔｒｅｚＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｓｎｐで利用可能）に見出されるものなどの多型のデータベースまたはヒトＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／で利用可能）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、集団は、特定の人種、国籍、地理上の領域、家系、宗教、性別、年齢または特定の時期もしくは時代のヒトの群などのヒト全体またはそのサブセットとしてのあらゆるヒトを含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「一塩基多型部位」、「ＳＮＰ部位」または「ＳＮＰ位置」は、ＳＮＰが存在することが知られている核酸の位置を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド（好ましくはオリゴヌクレオチド）に関連する用語「末端」は、ポリヌクレオチドの３’または５’末端におけるヌクレオチドを指す。好ましくは、ポリヌクレオチドの末端は、末端の６つのヌクレオチド、より好ましくは末端の５つのヌクレオチド、より好ましくは末端の４つのヌクレオチド、より好ましくは末端の３つのヌクレオチド、より好ましくは末端の２つのヌクレオチド、またはより好ましくは末端のヌクレオチドを含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「標識」または「検出可能な標識」は、標識を検出することによって分子を直接的または間接的に検出できるように分子と結合することができ、またはその他の方法で連結することができる任意の化合物または化合物の組合せを指す。検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、炭素、リン、ヨウ素、インジウム、硫黄、トリチウム等）、質量同位体（例えば、Ｈ²、Ｃ¹³またはＮ¹⁵）、色素もしくはフルオロフォア（例えば、シアニン、フルオレセインまたはローダミン）、ハプテン（例えば、ビオチン）、または直接的もしくは間接的に検出され得る任意の他の薬剤であってよい。標識は、標識化ＮＴＰをアンプリコンまたは他の重合化生成物に組み込んだ後に検出することができる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」は、２つの相補的な核酸鎖が、適切には厳密な条件下で互いにアニールする過程を指す。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、一般に、好ましくはプローブの長さの、好ましくは２０〜１００ヌクレオチド長の核酸分子を用いて実施される。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）参照。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、完全に相補的でない２つの核酸をハイブリダイゼーションすることができないハイブリダイゼーション条件を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「試料」または「試験試料」は、対象となる核酸を含むと考えられる任意の液体または固体材料を指す。試験試料は、培養物もしくは組織試料中の細胞などの任意の生物学的な供給源（すなわち生物学的試料）から得ることができ、または化学的に合成された鋳型を含み、合成により生成することができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの文脈（すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）における用語「補体」、「相補的な」または「相補性」は、標準のワトソン／クリック塩基対合則を指す。補体配列は、ＤＮＡの配列またはそのＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡまたはその補体配列であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’」と相補的である。天然核酸には一般に見出されず、または化学的に合成される特定のヌクレオチドは、本明細書に記載の核酸に含まれ、これらには、それに限定されるものではないが、イノシン、７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ならびにそれらの組合せなどの、塩基および糖修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸が含まれる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対、縮重またはマッチしていないヌクレオチドを含有することができる。核酸技術の分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、ミスマッチ塩基対の発生率、イオン強度、他のハイブリダイゼーションバッファーの構成要素および条件を含むいくつかの変数を考慮して、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる。
【００４８】
相補性は部分的であってよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基の一部のみが、塩基対合則に従ってマッチしている。相補性は、完全または全体的であってよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが、塩基対合則に従ってマッチしている。相補性がなくてもよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基はいずれも、塩基対合則に従ってマッチしていない。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著しい効果を有する。このことは、ライゲーションおよび増幅反応、ならびに核酸間の結合に応じて変わる検出方法では特に重要である。これらの用語は、個々のヌクレオチドに関連して、特にポリヌクレオチドの文脈において使用することもできる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける特定のヌクレオチドは、別の核酸鎖におけるヌクレオチドとのその相補性または相補性の欠如について、オリゴヌクレオチドの残りと核酸鎖の間の相補性と対照または比較して言及することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に相補的な」は、ほぼ厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者は、実質的に相補的な配列が、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解されよう。特に、実質的に相補的な配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続配列の３’または５’に位置する、標的配列にハイブリダイズしない塩基の連続配列を含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション配列が、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸が整列しているときの核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合に、核酸に「特異的」である。核酸に特異的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは、適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、対象となる標的にハイブリダイズすることができ、対象とならない核酸配列には実質的にハイブリダイズしないプライマーである。高レベルの配列同一性が好ましく、それには、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、より好ましくは１００％の配列同一性が含まれる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」には、天然の核酸に見出されるあらゆる形態のヌクレオシド塩基およびフラノシドを含む、天然に存在するすべてのヌクレオシドが含まれる。天然に存在するヌクレオシドに最も一般的に見出される塩基環は、プリン環およびピリミジン環である。天然に存在するプリン環には、例えばアデニン、グアニンおよびＮ⁶−メチルアデニンが含まれる。天然に存在するピリミジン環には、例えば、シトシン、チミンおよび５−メチルシトシンが含まれる。天然に存在するヌクレオシドには、例えば、それに限定されるものではないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、７−デアザグアノシン、７−メチルグアノシンのリボ誘導体および２’−デオキシリボ誘導体が含まれる。天然に存在するヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチルウリジンに見られるものなどのリボース糖への修飾も含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド類似体」、「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド誘導体」は、本明細書に記載の合成ヌクレオシドを含む。ヌクレオシド誘導体には、保護基を伴うまたは伴わない修飾塩基または／および糖部分を有するヌクレオシドも含まれる。かかる類似体には、例えば２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン等が含まれる。本発明で提供する化合物および方法は、かかる塩基環およびその合成類似体、ならびに非天然の複素環で置換された塩基糖、さらに非環式置換塩基糖を含む。さらに、ヌクレオシド誘導体には、他のプリンおよびピリミジン誘導体、例えばハロゲン置換プリン（例えば、６−フルオロプリン）、ハロゲン置換ピリミジン、Ｎ⁶−エチルアデニン、Ｎ⁴−（アルキル）−シトシン、５−エチルシトシン等が含まれる。ヌクレオシド誘導体および類似体は、米国特許第６，７６２，２９８号に記載のものなどの多様な修飾を包含する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサル塩基」、「縮重塩基」、「ユニバーサル塩基類似体」および「縮重塩基類似体」は、例えば、好ましくはｄＡ、Ａ、ｄＴ、ｄＵ、Ｕ、ｄＣ、Ｃ、ｄＧ、Ｇなどのヌクレオシドの任意の特異的核酸塩基および他の特異的核酸塩基の代用として核酸リガーゼによって認識され得る人工塩基を有する類似体を含む。ユニバーサル塩基または縮重塩基を含有するヌクレオシドを使用することもでき、その例は、Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．、２９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４３７〜２４４７頁（２００１年）；Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．ら、３３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５３２〜１５４３頁（２００５年）；Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．ら、３３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６２０〜２６２８頁（２００５年）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ、Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ、１１Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５３〜７６５頁（２００４年）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．ら、９５ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ４２５８〜４２６３頁（１９９８年）に見出すことができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド間結合」は、オリゴヌクレオチドプライマーまたは核酸の２つのヌクレオシドをつなぐ１つまたは複数の結合を指し、天然ホスホジエステル結合または修飾結合であってよい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒ^aを示し、Ｒ^aは、水素、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール等である。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「置換アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒ^a'を示し、Ｒ^a'は、置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アリール、置換ヘテロアリール等である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「アシルオキシ」は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒ^bを示し、Ｒ^bは、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール等である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「アルカン」は、炭素原子および水素原子を含み、Ｃ−Ｈ結合を含み、さらにメタン以外のアルカンにおいてＣ−Ｃ単結合を含む有機化合物を指す。用語「アルカン」は、１〜２０個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンを含む。いくつかの実施形態では、アルカンは、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの１〜８個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンを含む。用語「アルカン」はまた、それに限定されるものではないが、２−メチルプロパン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２，２−ジメチルブタン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルペンタン、３−エチル−２−メチルペンタン、３−エチルヘキサンなどの、それに限定されるものではないが１〜２０個の炭素原子を有する、いくつかの実施形態では１〜８個の炭素原子を有する分岐鎖アルカンなどの分岐鎖アルカンを含む。アルカンのＣ−ＣまたはＣ−Ｈ結合は、ヒドロキシル基、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩなどのハロゲン、スルフヒドリル基、またはアミン基などの別の基との結合で置き換えることができる。かかる基で置き換えられたアルカンは、それぞれ、ヒドロキシアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカンなどのハロアルカン、メルカプトアルカンおよびアミノアルカンと呼ぶことができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、１つまたは複数の二重結合を有し、別段特定されない限り、約２〜約２０個の炭素原子、好ましくは約２〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭素原子、最も好ましくは約２〜約６個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルケニル基の例には、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニル等が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニルアリール」は、アルケニルで置換されたアリール基を指し、「置換アルケニルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルケニルアリール基を指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、一般に、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を含有する二価の直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルケニレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルケニレン基を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、通常は１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子の単結合鎖の炭化水素を指し、その例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等が含まれる。かかるアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニル等が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルキル」は、通常は１〜６個の炭素原子、好ましくは２〜５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。その例には、エチル、プロピル、イソプロピル等が含まれる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、２つの水素原子が、同じ炭素原子または異なる炭素原子から除去されている、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１５個の炭素原子を含有する直鎖または分岐の二価のヒドロカルビルを指す。アルキレンの例には、それに限定されるものではないが、メチレン（−ＣＨ₂−）、エチレン（−ＣＨ₂ＣＨ₂−）等が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を有し、約２〜２０個の炭素原子、好ましくは約２〜１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜８個の炭素原子、最も好ましくは約２〜６個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニル等が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニルアリール」は、アルキニルで置換されたアリール基を指し、「置換アルキニルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキニルアリール基を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、基−ＯＲ^cを示し、Ｒ^cは、定義通りの低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキルである。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルコキシ」は、基−ＯＲ^dを示し、Ｒ^dは低級アルキルである。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルアリール」は、アルキルで置換されたアリール基を指し、「置換アルキルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキルアリール基を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルカルボニルアミノ」は、基−ＮＲ^eＣ（Ｏ）Ｒ^fを示し、Ｒ^eは、任意に置換されていてもよいアルキルであり、Ｒ^fは、水素またはアルキルである。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）Ｒ^gを示し、Ｒ^gは、任意に置換されていてもよいアルキルである。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^gを示し、Ｒ^gは、任意に置換されていてもよいアルキルである。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルホニルアミノ」は、基−ＮＲ^eＳ（Ｏ）₂Ｒ^fを示し、Ｒ^eは、任意に置換されていてもよいアルキルであり、Ｒ^fは、水素またはアルキルである。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルチオ」は、基−Ｓ−Ｒ^hを示し、Ｒ^hはアルキルである。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「置換アルキルチオ」は、基−Ｓ−Ｒⁱを示し、Ｒⁱは置換アルキルである。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、一般に、約２〜１２個の炭素原子、好ましくは約２〜８個の炭素原子を有する二価の直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルキニレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキニレン基を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「アミド」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^jＲ^j'を示し、Ｒ^jおよびＲ^j'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであってよい。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「置換アミド」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^kＲ^k'を示し、Ｒ^kおよびＲ^k'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、但し、Ｒ^kおよびＲ^k'の少なくとも一方は水素ではない。Ｒ^kＲ^k'は、窒素と組み合わさって、任意に置換されていてもよい複素環式環またはヘテロアリール環を形成することができる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「アミジノ」は、基−Ｃ（＝ＮＲ^m）ＮＲ^m'Ｒ^m''を示し、Ｒ^m、Ｒ^m'およびＲ^m''は、独立に、水素または任意に置換されていてもよいアルキル、アリールもしくはヘテロアリールである。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ」または「アミン」は、基−ＮＲⁿＲ^n'を示し、ＲⁿおよびＲ^n'は、独立に、水素、本明細書に定義の低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであってよい。「二価のアミン」は、基−ＮＨ−を示す。「置換されている二価のアミン」は、基−ＮＲ−を示し、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「置換アミノ」または「置換アミン」は、基−ＮＲ^pＲ^p'を示し、Ｒ^pおよびＲ^p'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールであり、但し、Ｒ^pおよびＲ^p'の少なくとも一方は水素ではない。Ｒ^pＲ^p'は、窒素と組み合わさって、任意に置換されていてもよい複素環式環またはヘテロアリール環を形成することができる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキニル」は、アリールで置換されたアルキニル基を指し、「置換アリールアルキニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリールアルキニル基を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「アラルキル」は、アルキルの水素原子が本明細書に定義のアリールによって置き換えられている、本明細書に定義のアルキルを指す。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、３−ナフチルブチル等が含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「アロイル」は、ベンゾイルなどのアリール−カルボニル種を指し、「置換アロイル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアロイル基を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」は、アリールで置換されたアルキル基を指し、「置換アリールアルキル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリールアルキル基を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、単独または組合せで、任意に、好ましくは５〜７個、より好ましくは５〜６個の環員のシクロアルキルを有していてもよく、かつ／またはハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意に一置換もしくは二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で任意に置換されていてもよい尿素、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意にＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１〜３個の基もしくは置換基で任意に置換されていてもよい、フェニル、ナフチルまたは縮合芳香族複素環を指す。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「アリールカルボニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＣ（Ｏ）Ｒ^rを示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルまたはアルキルであり、Ｒ^rは、任意に置換されていてもよいアリールである。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「アリーレン」は、一般に６個〜最大１４個の炭素原子を有する二価の芳香族基を指し、「置換アリーレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリーレン基を指す。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、基−ＯＡｒを示し、Ａｒは、アリールまたは置換アリール基である。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「アリールスルホニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＳ（Ｏ）₂Ｒ^rを示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルまたはアルキルであり、Ｒ^rは、任意に置換されていてもよいアリールである。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「カルバメート基」は、基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ₂を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「ジチオカルバメート基」は、基−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ₂を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「炭素環」は、結合した炭素原子から構成される単環または複数の縮合環を有する、飽和、不飽和または芳香族の基を指す。環（複数可）は、任意に非置換であってよく、または例えばハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換されていてもよい。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルケニル」は、３〜２０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する環式環を含有する基を指し、「置換シクロアルケニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルケニル基を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、３〜１５個の炭素原子を含有する単環式または多環式アルキル基を指し、「置換シクロアルキル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルキル基を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキレン」は、約３〜１２個の炭素原子を含有する二価の環を含有する基を指し、「置換シクロアルキレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルキレン基を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「グアニジニル」は、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ₂）₂を示し、「置換グアニジニル」は、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ₂）₂を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、あらゆるハロゲン、すなわち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）およびヨード（Ｉ）を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、５個もしくは６個の環原子を含有する単環式の芳香族環構造を指し、または８〜１０個の原子を有し、Ｏ、ＳおよびＮの群から独立に選択される１つまたは複数の、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個のヘテロ原子を含有し、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意に一置換もしくは二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で任意に置換されていてもよい尿素、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意にＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１〜３個の基もしくは置換基で任意に置換されていてもよい二環式芳香族基を指す。ヘテロアリールはまた、スルフィニル、スルホニルおよび第３級の環窒素のＮ−オキシドなどの、酸化したＳまたはＮを含むことを企図する。炭素または窒素原子は、安定な芳香族環が保持されるようなヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例は、フタルイミド、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフリル、インドリル等である。置換ヘテロアリールは、利用可能な炭素または窒素に結合して安定な化合物をもたらす置換基を含有する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「置換ヘテロアリール」は、１つまたは複数の官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で任意に一置換または多置換されていてもよい複素環を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールカルボニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＣ（Ｏ）Ｒ^rを示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルであり、Ｒ^rは、任意に置換されていてもよいアリールである。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールオキシ」は、基−ＯＨｅｔを示し、Ｈｅｔは、任意に置換されていてもよいヘテロアリール基である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールスルホニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＳ（Ｏ）₂Ｒ^sを示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルであり、Ｒ^sは、任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「複素環」は、単環（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、ナフトピリジル（ｎａｐｈｔｈｐｙｒｉｄｙｌ）、キノキサリル、キノリニル、インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し、その環中に炭素原子とＮ、ＯまたはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を有する、飽和、不飽和または芳香族の基を指し、これは任意に非置換であってもよく、または例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換されていてもよい。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「置換複素環」は、任意の利用可能な点に結合して安定な化合物をもたらす、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルケニル、任意に置換されていてもよいアルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、アミド、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で任意に置換されていてもよい尿素、アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意にＮ−一置換またはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アシル、カルボキシル、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルホンアミドおよびオキソからなる群から選択される、１つまたは複数の、例えば１個、２個または３個の置換基で置換されている複素環を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」は、その主鎖が炭素および水素だけを含む任意の有機基を指す。したがってヒドロカルビルは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アルケニルアリール、アリールアルキニル、アルキニルアリール等を包含する。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「置換ヒドロカルビル」は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（式中、Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ’）−、−Ｃ（＝ＣＲ’₂）−（式中、Ｒ’は、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）₂−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）₂−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ₂−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｒ₂−、または−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）Ｒ₂−（式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）などのリンカー／スペーサー部分によってヒドロカルビル部分に結合している前述の基の２つ以上を含む、ヒドロキシ、ヒドロカルビルオキシ、置換ヒドロカルビルオキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、カルボキシ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ₂（式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、ニトロ、シアノ、ハロ、−ＳＯ₃Ｍまたは−ＯＳＯ₃Ｍ（式中、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃａまたはメグルミンである）、グアニジニル、置換グアニジニル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、置換ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、置換ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ、アシル、アシルオキシ、複素環式、置換複素環式、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、カルバメート基、ジチオカルバメート基、アロイル、置換アロイル、オルガノスルホニル、置換オルガノスルホニル、オルガノスルフィニル、置換アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、置換アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、置換アリールスルホニルアミノ、スルホンアミド基、スルフリル等から選択される１つまたは複数の置換基をさらに有している、先に参照したヒドロカルビル基のいずれかを指す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルオキシ」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−ヒドロカルビル基を示し、「置換ヒドロカルビルオキシ」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルオキシ基を指す。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルカルボニル」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルカルボニル基を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルオキシカルボニル」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ヒドロカルビルを指し、「置換ヒドロカルビルオキシカルボニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルオキシカルボニル基を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルカルボニルオキシ」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルカルボニルオキシ基を指す。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビレン」は、その主鎖が炭素および水素だけを含む任意の二価の有機基を指す。したがってヒドロカルビレンは、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリールアルキレン、アリールアルケニレン、アルケニルアリーレン、アリールアルキニレン、アルキニルアリーレン等を包含し、「置換ヒドロカルビレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有している、先に参照したヒドロカルビレン基のいずれかを指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」は、基−ＯＨを指す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「オルガノスルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）−オルガノを示し、オルガノは、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノおよびアリール部分、ならびに置換アルキル、アルコキシ、アルキルアミノおよびアリール部分を包含する。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「オルガノスルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）₂−オルガノを示し、オルガノは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノ部分、ならびに置換アルキル、アルコキシまたはアルキルアミノ部分を包含する。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「オキソ」は、結合炭素と二重結合している酸素の置換基を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「スルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）−を示す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）Ｒ^tを示し、Ｒ^tは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「スルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）₂−を示す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^tを示し、Ｒ^tは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「スルホニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＳ（Ｏ）₂−を示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルである。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルホニルアミノ」は、基−ＮＲ^qＳ（Ｏ）₂Ｒ^uを示し、Ｒ^qは、水素または低級アルキルであり、Ｒ^uは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「スルフリル」は、基−Ｓ（Ｏ）₂−を示す。
【０１２４】
用語「ほぼ」または「約」は、本明細書で数値に関連して使用される場合、表示値の１０％を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＡＴＰ依存性およびＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼによるホスホジエステル結合形成の機構を示す概略図である。
【図２】リガーゼが存在しない場合のライゲーション反応（レーン２）、ＡＴＰが存在しない場合のライゲーション反応（レーン３）、核酸鋳型が存在しない場合のライゲーション反応（レーン４）、および陽性対照（ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼおよび鋳型）（レーン５）のＰＡＧＥゲルの結果を示す図である。
【図３】ライゲーション産物を検出するためのリアルタイムＰＣＲ実験の結果を示す図である。Ａは鋳型が存在しない状態で実施したライゲーションから得た対照（ＮＴＣ）を含む６倍希釈系列のライゲーション産物の増幅曲線である。Ｂは実施した反応から得たＡの解離曲線である。Ｃは抽出したＣｔ値を希釈係数に対してプロットした標準曲線である。
【図４】アクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｃ−Ａ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション反応と比較した、以下の修飾補因子、７−デアザ−ＡＴＰ、Ｎ１−メチル−ＡＴＰ、２−アミノ−ＡＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰを用いるライゲーション反応から得られたＰＡＧＥゲルの結果を示す図である。
【図５】アクセプター鎖の３’末端における３つの異なる鋳型であるミスマッチ塩基対（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、１０種類の修飾ＡＴＰ補因子を評価する一連の散布図である。好ましくは、非修飾補因子と比較して特異性が改善された修飾補因子は、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸の１に近似の値）およびｘ軸の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図６】実施例１に記載の通り、アクセプター鎖の３’末端における３つの異なるミスマッチ塩基対（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾アクセプターを評価する一連の散布図である。研究した修飾アクセプターは、以下の単一置換基を含有していた。式ＩＩに定義の通り、ＰＳ（Ｘ１）は、Ｘ¹位置のＳを示し、ＰＳ（Ｘ２）は、Ｘ²位置のＳを示し、ＰＭｅ（Ｘ１）は、Ｘ¹位置のＭｅを示し、ＰＭｅ（Ｘ２）は、Ｘ²位置のＭｅを示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ１）は、Ｙ¹位置のＯＣＨ₃を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ２）は、Ｙ²位置のＯＣＨ₃を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ３）は、Ｙ³位置のＯＣＨ₃を示し、２’−Ｆ（Ｙ１）は、Ｙ¹位置のＦを示し、２’−Ｆ（Ｙ２）は、Ｙ²位置のＦを示し、２’−Ｆ（Ｙ３）は、Ｙ³位置のＦを示す。好ましくは、非修飾アクセプターと比較して特異性が改善された候補修飾アクセプターは、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸の１に近似の値）およびｘ軸の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図７】実施例１に記載の通り、アクセプター鎖の３’末端における２つの異なるミスマッチ塩基対（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾ドナーを評価する一連の散布図である。修飾ドナーは、以下の単一置換基を含有していた。式ＩＩＩに定義の通り、ＰＭｅ（Ｘ１）は、Ｘ¹位置のＭｅを示し、ＰＭｅ（Ｘ２）は、Ｘ²位置のＭｅを示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ１）は、Ｙ¹位置のＯＣＨ₃を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ２）は、Ｙ²位置のＯＣＨ₃を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ３）は、Ｙ³位置のＯＣＨ₃を示す。好ましくは、非修飾ドナーと比較して特異性が改善された修飾ドナーは、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸の１に近似の値）およびｘ軸の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図８】糖および主鎖を修飾したアクセプター鎖を異なる修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせて使用した、相対的ライゲーション収率の表である。これらの値は、実施例１に記載の通り、天然アクセプター鎖ならびにアクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｔ−Ｃ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション収率に対するものである。マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には、点の網掛けセルの値は、０．８５を超える相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．７０〜０．８５の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０〜０．７０の相対的ライゲーション収率を表す。ミスマッチの場合（Ｔ−Ｃ）には、点の網掛けセルの値は、０．０〜０．０１の相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．０１〜０．１０の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０．１０〜１．００の相対的ライゲーション収率を表す。好ましい性能基準を有する組合せは、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には０．８５を超える相対的収率を有し（例えば、図８の点の網掛けセル、上の表）、ミスマッチ鋳型（Ｔ−Ｃ）の存在下では０．０１未満の相対的ライゲーション収率を有する（例えば、図８の点の網掛けセル、下の表）。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
核酸ライゲーション反応は、（ａ）酵素であるリガーゼのアデニル化、（ｂ）標的核酸へのドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後（ｃ）アデニル酸をドナー鎖に転移し、ライゲーションして、核酸リガーゼによって接合した核酸配列の相補的なコピーを形成することを含む。しかし、ドナーおよびアクセプターのライゲーションは、１）ドナーおよびもしくはアクセプターが、鋳型核酸に対してミスマッチを有する（非相補的である）場合、または２）鋳型核酸が存在しない場合に生じ得る。
【０１２７】
本明細書の方法および組成物は、核酸ライゲーションのための改善された方法および組成物を提供する。特定の態様では、該方法および組成物は、酵素的ライゲーション反応において修飾されたライゲーション構成要素を使用することを対象とする。他の態様では、核酸ライゲーション法は、１つまたは複数の修飾補因子、修飾ドナーおよび／または修飾アクセプターを使用し、その存在は、鋳型が存在しない場合またはミスマッチが存在する場合の望ましくないライゲーション産物の形成に障害を与える。
【０１２８】
修飾リガーゼ補因子
本発明で提供される組成物および方法の特定の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子を含む。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、１つまたは複数の置換基を有する修飾ＡＴＰである。
【０１２９】
本明細書の諸態様の実施形態では、本発明の修飾ＡＴＰおよびその誘導体として、式ＩＡの化合物を提供する。
【０１３０】
【化１】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
Ｚ¹は、Ｈ、Ｆ、Ｒ²、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^-Ｍ⁺およびＣ（Ｙ）Ｒ⁴からなる群から選択され、
Ｍ⁺はカチオンであり、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択され、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択される。
【０１３１】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１３２】
【化２】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ⁺−ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＮＨＣＨ₃、Ｃ−Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−Ｎ₃およびＣ−ＯＨからなる群から選択され、
Ｚ¹は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、フェニル、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＳｅＨ、ＳｅＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＮＨＯＣＨ₃、ＮＣＨ₃ＯＣＨ₃、ＮＨ−ＮＨ₂、ＮＨ−ＮＨＣＨ₃、ＮＨ−ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＮＣＨ₃−ＮＨ₂、ＮＣＨ₃−ＮＨＣＨ₃、ＮＣＨ₃−ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＣＮ、Ｎ₃および（ＢＨ₃）^-Ｍ⁺からなる群から選択され、
Ｍ⁺はカチオンであり、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ⁴は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１３３】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１３４】
【化３】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１３５】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１３６】
【化４】

式中、
Ｚ¹は、Ｈ、Ｆ、Ｒ¹、ＯＲ¹、ＳＲ¹、ＳｅＲ¹、ＮＲ¹Ｒ²、ＮＲ¹ＯＲ¹、ＮＲ¹−ＮＲ¹Ｒ¹、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^-Ｍ⁺およびＣ（Ｙ）Ｒ²からなる群から選択され、
Ｍ⁺はカチオンであり、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ¹、ＳＲ¹、ＳｅＲ¹、ＮＲ¹Ｒ¹、Ｃ（Ｙ）Ｒ¹および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１３９】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１４０】
【化６】

式中、
Ｚ¹は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、フェニル、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＳｅＨ、ＳｅＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、ＳｅＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＮＨＯＣＨ₃、ＮＣＨ₃ＯＣＨ₃、ＮＨ−ＮＨ₂、ＮＨ−ＮＨＣＨ₃、ＮＨ−ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＮＣＨ₃−ＮＨ₂、ＮＣＨ₃−ＮＨＣＨ₃、ＮＣＨ₃−ＮＣＨ₃ＣＨ₃、ＣＮ、Ｎ₃および（ＢＨ₃）^-Ｍ⁺からなる群から選択され、
Ｍ⁺はカチオンである。
【０１４１】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１４２】
【化７】

式中、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１４３】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１４４】
【化８】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＮＨ（ＣＨ₃）およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ⁴は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１４５】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１４６】
【化９】

式中、
Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１４７】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１４８】
【化１０】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１４９】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１５０】
【化１１】

式中、
Ｘ¹およびＸ²は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１５１】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１５２】
【化１２】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１５３】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１５４】
【化１３】

式中、
Ｗ¹およびＷ²は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１５５】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１５６】
【化１４】

式中、
Ｗ¹およびＷ²は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ⁺−ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ、Ｃ−Ｎ₃、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＮＨＣＨ₃、Ｃ−Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＣ−ＯＨからなる群から選択される。
【０１５７】
修飾ＡＴＰの特定の好ましい実施形態は、以下の通りである。
【０１５８】
【化１５−１】

７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート
７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
７−メチル−７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート
７−メチル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
Ｎ１−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート
Ｎ１−メチル−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
８−クロロ−アデノシン−５’−トリホスフェート
８−クロロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
８−アザ−アデノシン−５’−トリホスフェート
８−アザ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
８−アジド−アデノシン−５’−トリホスフェート
８−アジド−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
Ｎ６−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート
Ｎ６−メチル−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２−クロロプリン−２’−デオキシリボシド−５’−トリホスフェート
２−アミノプリン−２’−デオキシリボシド−５’−トリホスフェート
イノシン−５’−トリホスフェート
２’−デオキシ−イノシン−５’−トリホスフェート
２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
２−アミノ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
２−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
【０１５９】
【化１５−２】

３’−アミノ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−アジド−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アジド−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−フルオロ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−フルオロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アザ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メチル−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
３’−チオ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
３’−チオ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メチルアミノ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メチルアミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メトキシ−３’−デオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−メトキシ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メトキシ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−メトキシ−２’−デオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート
【０１６０】
【化１５−３】

５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
【０１６１】
本発明で提供される組成物および方法の特定の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子を含む。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、１つまたは複数の置換基を有する修飾ＮＡＤ＋である。
【０１６２】
本明細書の諸態様の実施形態では、本発明の修飾ＮＡＤ＋およびその誘導体は、式ＩＢの化合物を提供する。
【０１６３】
【化１６】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒおよび置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（Ｒ¹）₂およびＮＲ¹からなる群から選択され、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択される。
【０１６４】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１６５】
【化１７】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ⁺−ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＮＨＣＨ₃、Ｃ−Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−Ｎ₃およびＣ−ＯＨからなる群から選択され、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＮＨ（ＣＨ₃）およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ⁴は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１６６】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１６７】
【化１８】

式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１６８】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１６９】
【化１９】

式中、
Ｗ²、Ｗ³、Ｗ⁴およびＷ⁵は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ⁺−ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＮＨＣＨ₃、Ｃ−Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−Ｎ₃およびＣ−ＯＨからなる群から選択される。
【０１７０】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１７１】
【化２０】

式中、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１７２】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１７３】
【化２１】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＮＨ（ＣＨ₃）およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ⁴は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１７４】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１７５】
【化２２】

式中、
Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１７６】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１７７】
【化２３】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、ＮＨ₂、ＯＨ、ＮＨＣＨ₃およびＮ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ³は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１７８】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１７９】
【化２４】

式中、
Ｘ¹およびＸ²は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１８０】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１８１】
【化２５】

式中、
Ｘ¹は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ₃、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＮ₃からなる群から選択される。
【０１８２】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１８３】
【化２６】

式中、
Ｗ¹およびＷ²は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択される。
【０１８４】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１８５】
【化２７】

式中、
Ｗ¹およびＷ²は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ⁺−ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｎ⁺−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ、Ｃ−Ｎ₃、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＮＨＣＨ₃、Ｃ−Ｎ（ＣＨ₃）₂およびＣ−ＯＨからなる群から選択される。
【０１８６】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する。
【０１８７】
【化２８】

２’−デオキシ−ＮＡＤ⁺
２’−デオキシ−２−アミノ−ＮＡＤ⁺
２−アミノ−ＮＡＤ⁺
２’−デオキシ−３’−アミノ−ＮＡＤ⁺
２’−デオキシ−３’−アミノ−２−アミノＮＡＤ⁺
２−アミノ−３’−アミノ−ＮＡＤ⁺
【０１８８】
修飾アクセプター
本発明で提供される組成物および方法の特定の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾アクセプターを含む。好ましい実施形態では、修飾アクセプターは、１つまたは複数の置換基を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を伴う使用に適した修飾アクセプターには、当技術分野で説明されているもの、例えばＥｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら、ＵＳ特許第６，２９７，０１６号のＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブおよび３’−ＮＨ₂置換プローブ（Ｆｕｎｇ，Ｓ．ら、ＵＳ特許第５，５９３，８２６号）が含まれる。
【０１８９】
本明細書の諸態様の実施形態では、本発明の修飾アクセプターおよびその誘導体は、式ＩＩの化合物を提供する。
【０１９０】
【化２９】

式中、
Ｂ¹、Ｂ²およびＢ³は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ¹は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃およびＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｘ²は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃およびＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される。
【０１９３】
修飾ドナー
本発明で提供される組成物および方法の特定の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾ドナーを含む。好ましい実施形態では、修飾ドナーは、１つまたは複数の置換基を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を伴う使用に適した修飾アクセプターには、当技術分野で説明されているもの、例えばドナーの（５’−リン酸）鎖における５’−チオリン酸の使用が含まれる（Ｂａｎｄａｒｕ，Ｒ．ら、ＵＳ特許第６，８１１，９８６号および同第６，６３５，４２５号）。
【０１９４】
本明細書の諸態様の実施形態では、本発明の修飾ドナーおよびその誘導体は、式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１９５】
【化３１】

式中、
Ｂ¹、Ｂ²およびＢ³は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ¹およびＸ²は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃またはＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される。
【０１９８】
修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの組合せ
本発明で提供される組成物および方法の特定の態様および実施形態は、修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの組合せの使用を含む。２つ以上の任意の可能な組合せを使用することができる。いくつかの実施形態では、２種類以上のリガーゼ補因子、修飾アクセプターまたは修飾ドナーを使用することができる。
【０１９９】
例示的な組合せは、以下の群から選択される修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの２つ以上の組合せを含む。
【０２００】
修飾アクセプター
【化３３】

５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−チオ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−メチルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
５’−α−フェニルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
【０２０５】
修飾リガーゼ構成要素の特に好ましい組合せは、以下の修飾アクセプター、修飾ドナーおよび修飾補因子から選択される。
【０２０６】
修飾アクセプター
【化３６】

式中、
Ｂ¹、Ｂ²およびＢ³は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ¹は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃およびＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｘ²は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃およびＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される。
【０２０７】
修飾ドナー
【化３７】

５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２’−フルオロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート
Ｎ１−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート
７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート
２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート
【０２０９】
一態様では、本明細書の方法および組成物は、修飾リガーゼ構成要素を提供する。いくつかの実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、１つのみの置換基を有することができる。他の実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、塩基、三リン酸鎖、糖またはそれらの組合せにおける修飾などの２つ以上の置換基を含有することができる。他の実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、２種類以上の置換基を含有することができる。修飾リガーゼ構成要素は、本明細書に記載の式Ｉ〜ＩＩＩの化学式を有することができる。
【０２１０】
本明細書の別の態様では、本明細書にさらに記載の式Ｉ〜ＩＩＩに図示した化学構造を有する修飾リガーゼ構成要素の合成方法を提供する。置換基は、既存の合成法または酵素的方法を使用することによって、リガーゼ補因子、アクセプターまたはドナーに組み込むことができる。本発明で提供する方法および組成物の修飾リガーゼ構成要素は、当技術分野で知られる任意の方法によって合成することができる。修飾リガーゼ構成要素の合成および精製後、いくつかの異なる手順を利用して、構造および純度の観点から修飾リガーゼ構成要素の受容性を決定することができる。かかる手順の例は、核磁気共鳴分光法、質量分析、蛍光分光法、紫外分光法、高速液体クロマトグラフィーである。これらの手順は当業者に知られている。当技術分野の分離、精製および分析に用いられている現在の方法は、本発明で提供する方法および組成物の修飾リガーゼ構成要素に対しても同様に適用することができる。
【０２１１】
本発明で提供する方法および組成物の目的を達成する置換基であれば、いずれも利用することができる。置換基は、その使用が、修飾リガーゼ構成要素が用いられるライゲーション反応条件下で望ましくないライゲーション産物の形成を低減し、またはそれに障害を与える置換基であるべきである。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、対応する非修飾リガーゼ構成要素と比較してライゲーション特異性が改善される。ライゲーションの改善とは、マッチ核酸とミスマッチ核酸を識別するリガーゼの能力を指す。好ましくは、修飾ライゲーション構成要素が存在する場合、標的核酸（例えば、鋳型）と比較して、ドナーおよび／またはアクセプターにおいてミスマッチがある場合、ライゲーションが低減または防止される。他の実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、ミスマッチ（非相補的な）核酸標的のライゲーション効率が低下することにより、ライゲーション特異性が改善される。好ましい実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、マッチ核酸と比較して、少なくとも１つの塩基対のミスマッチを有する核酸のライゲーション効率が低下することにより、ライゲーション特異性が改善される。好ましい実施形態では、修飾ライゲーション構成要素を伴うライゲーションによって、ライゲーション特異性が、少なくとも０．１％、０．２％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも４００％改善される。
【０２１３】
いくつかのライゲーション反応では、ライゲーション反応におけるすべてのリガーゼ補因子、アクセプターおよび／またはドナー分子が、置換基を含有するわけではない。好ましくは、修飾リガーゼ補因子と非修飾リガーゼ補因子の両方の均等な混合物によって、修飾リガーゼ補因子を全く使用しない場合と比較して、混合集団におけるライゲーションの効率および特異性が改善される。好ましくは、初期の変性温度におけるインキュベーションの前に、修飾リガーゼ補因子は、すべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも２５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも５０％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも７５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９０％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９８％、より好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９９％、より好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の１００％を構成する。別の実施形態では、２種、３種、４種またはそれ以上の種類のリガーゼ補因子分子を、ライゲーション反応において用いることができる。
【０２１４】
一実施形態では、１種類のみの修飾リガーゼ補因子が、ライゲーション反応において存在する。他の実施形態では、様々な種類の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在する。別の実施形態では、２種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在する。別の実施形態では、３種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在する。別の実施形態では、４種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在する。
【０２１５】
本発明で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した例示的なライゲーション方法には、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、２４１Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０７７〜１０８０頁（１９８８年））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎ，Ｍ．ら、３ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ、Ｓ５１〜６４頁（１９９４年））、リガーゼ媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、２４６Ｓｃｉｅｎｃｅ、７８０〜７８６頁（１９８９年）、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、２４６Ｓｃｉｅｎｃｅ、８１０〜８１３頁（１９８９年））、ＰＣＲライゲーション検出反応（ＰＣＲ−ＬＤＲ）（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら、１６ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、２８２〜２８９頁（２００６年））、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ（Ａｎｔｓｏｎ，Ｄ．ら、２８ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、ｅ５８頁（２０００年））、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ，Ｃ．ら、５８ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ、１２３９〜１２４６頁（１９９６年））、ギャップＬＣＲ手法（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら、２３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、６７５〜６８２頁（１９９５年））、ＳＮＰｌｅｘ（ＤｅｌａＶｅｇａ，Ｆ．Ｍ．ら、５７３ＭｕｔａｔＲｅｓ、１１１〜１３５頁（２００５年）、Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．１４ＧｅｎｅｔＡｎａｌ、１４３〜１４９頁（１９９９年））、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．ら、３０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、ｅ５７頁（２００２年））、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型解析アッセイ（Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．ら、６８ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ、６９〜７８頁（２００３年）、Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ａ．ら、ＳｕｐｐｌＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５６〜５８頁、６０〜５１頁（２００２年）、Ｓｈｅｎ，Ｒ．ら、５７３ＭｕｔａｔＲｅｓ、７０〜８２頁（２００５年））、および分子反転プローブアッセイ（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ら、２５１Ｓｃｉｅｎｃｅ、７６７〜７７３頁（１９９１年）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．Ｓ．ら、１ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、１０９〜１１１頁（２００４年）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１４ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、４１４〜４２５頁（２００４年）、Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．ら、９１ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、５０２２〜５０２６頁（１９９４年））、近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５年）、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｏ．ら、２８ＧｅｎｅｔＥｎｇ（ＮＹ）、８５〜９３頁（２００７年））、およびライゲーションによる次世代シークエンシングが含まれる。
【０２１６】
本発明で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した配列検出のための例示的なライゲーション系手法には、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、ＵＳ特許第７，２４４，８３１号、同第６，３１２，８９２号に記載のもの、ならびに高い忠実度の熱安定性リガーゼの使用（ＵＳ特許第６，９４９，３７０号）、ＬＤＲおよびＰＣＲの組合せ（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、ＵＳ特許第７，０９７，９８０号、同第６，７９７，４７０号、同第６，２６８，１４８号、同第６，０２７，８８９号、同第７，１６６，４３４号）、エンドヌクレアーゼを使用するライゲーション（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、ＵＳ特許第７，１９８，８９４号、同第７，０１４，９９４号）、ＯＬＡ／ＰＣＲ（Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ，Ｆ．、ＵＳ特許第５，９１２，１４８号、同第６，１３０，０７３号）、ライゲーション／増幅（Ｌａｏ，Ｋ．Ｑ．、ＵＳ特許第７，２５５，９９４号）、段階的ライゲーションおよび切断（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ら、ＵＳ特許第５，７１４，３３０号、同第５，５５２，２７８号）、近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５年）、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｏ．ら、２８ＧｅｎｅｔＥｎｇ（ＮＹ）、８５〜９３頁（２００７年）、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．ら、２０ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７３〜４７７頁（２００２年））、病原体検出のための近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、５２ＣｌｉｎＣｈｅｍ、１１５２〜１１６０頁（２００６年））、サイトカイン検出（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．ら、１０１ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８４２０〜８４２４頁（２００４年））、胞子検出（Ｐａｉ，Ｓ．ら、３３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、ｅ１６２頁（２００５年））、癌バイオマーカー検出（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．ら、４ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、３２７〜３２９頁（２００７年））、ならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用の強度を測定するための近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５年）、Ｓｃｈａｌｌｍｅｉｎｅｒ，Ｅ．ら、４ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、１３５〜１３７頁（２００７年））が含まれる。
【０２１７】
本発明で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した例示的なライゲーション系診断アッセイには、ＨＩＶ薬物耐性株の検出（Ｌａｌｏｎｄｅ，Ｍ．ら、４５ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６０４〜２６１５頁（２００７年））、対立遺伝子に特異的な産物の多重検出（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｓ．Ｊ．ら、６ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ、Ｒ１０５頁（２００５年））、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を含むライゲーションによるＳＮＰ検出（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、２４１Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０７７〜１０８０頁（１９８８年））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎ，Ｍ．ら、３ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ、Ｓ５１〜６４頁（１９９４年））、ライゲーションとリガーゼ媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）を含むＰＣＲの組合せを使用するＳＮＰ検出（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、２４６Ｓｃｉｅｎｃｅ、７８０〜７８６頁（１９８９年）、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、２４６Ｓｃｉｅｎｃｅ、８１０〜８１３頁（１９８９年））、ＰＣＲライゲーション検出反応（ＰＣＲ−ＬＤＲ）（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら、１６ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、２８２〜２８９頁（２００６年））、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ（Ａｎｔｓｏｎ，Ｄ．ら、２８ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、ｅ５８頁（２０００年））、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ，Ｃ．ら、５８ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ、１２３９〜１２４６頁（１９９６年））、ならびにギャップＬＣＲ手法（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら、２３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、６７５〜６８２頁（１９９５年））、ＳＮＰｌｅｘ（ＤｅｌａＶｅｇａ，Ｆ．Ｍ．ら、５７３ＭｕｔａｔＲｅｓ、１１１〜１３５頁（２００５年）、Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．１４ＧｅｎｅｔＡｎａｌ、１４３〜１４９頁（１９９９年））、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．ら、３０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、ｅ５７頁（２００２年））、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型解析アッセイ（Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．ら、６８ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ、６９〜７８頁（２００３年）、Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ａ．ら、ＳｕｐｐｌＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５６〜５８頁、６０〜５１頁（２００２年）、Ｓｈｅｎ，Ｒ．ら、５７３ＭｕｔａｔＲｅｓ、７０〜８２頁（２００５年））、ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ上での分子反転プローブアッセイ（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ら、２５１Ｓｃｉｅｎｃｅ、７６７〜７７３頁（１９９１年）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ、１０９〜１１１頁（２００４年）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１４ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、４１４〜４２５頁（２００４年）、Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．ら、９１ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、５０２２〜５０２６頁（１９９４年））が含まれる。
【０２１８】
本発明で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適したさらなる例示的なライゲーションアッセイには、従来のＳａｎｇｅｒジデオキシシークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、７４ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、５４６３〜５４６７頁（１９７７年）および４５４シークエンシングシステムなどの次世代シークエンシングアッセイ、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析器、Ｋｎｏｍｅ’ｓＫｎｏｍｅＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）ゲノムシークエンシングサービス、ならびにＡＢＩＳＯＬｉＤ（商標）システムによるシークエンシング技術およびライゲーションアッセイなどの他のシークエンシング（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．、１１ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ、３〜１１頁（２００１年）、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．、１２ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７〜３２頁（１９９４年）、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇ，Ｄ．ら、２０Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、３０６６〜３０７７頁（１９９９年））が含まれる。
【０２１９】
ここで、本発明で提供する方法および組成物を、以下の非限定的な実施例を参照することによってより詳細に記載する。
【実施例１】
【０２２０】
ＰＡＧＥ分析を使用するライゲーション収率の検出
プライマー結合性配列（「ＰＢＳ」）を有するドナーおよびアクセプター（それぞれＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＣｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ）を、相補的な鋳型（Ａｌｇ鋳型）の存在下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって接合されるそれらの能力について評価した。４つの設定で実験を実施した（図２）。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、鋳型を含み、リガーゼを含まない第１のライゲーション反応混合物を設定した。ライゲーションは検出されなかった。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼを含み、鋳型を含まない第２のライゲーション反応混合物を設定した。ライゲーションは検出されなかった。ドナー、アクセプター、リガーゼ、鋳型を含む第３のライゲーション反応混合物を設定し、追加のＡＴＰ補因子は添加しなかった。少量のライゲーション産物を検出したが、これは、精製過程中に単離された少量のアデニル化リガーゼによる可能性が高い。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼおよび鋳型を含む第４のライゲーション反応混合物を設定した。大部分のドナーおよびアクセプターが消費され、接合ライゲーション産物に効率的に変換された。
【０２２１】
各２０μＬの反応を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのジチオトレイトール、２５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で実施した。１ｍＭのＡＴＰを、バッファーに別個に添加した。ドナー（ＬＰ３’Ｔ／ＰＢＳ）、アクセプター（Ｃｏｍ３Ｆ／ＰＢＳ）および鋳型（Ａｌｇ）は、０．１μＭの等モル量であった。アクセプター、ドナーおよび鋳型を９５℃で３分間変性させ、４℃で３分間アニールした。Ｔ４リガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）４００単位を各反応物に添加することによって、ライゲーションを開始した。ライゲーションを１６℃で２０分間進行させた。反応物を６５℃で１０分間加熱し、同体積の２×ＴＢＥ−尿素バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって、ライゲーションを終了させた。試料を、６％ＴＢＥ−尿素Ｎｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動した。ゲルを、製造者のプロトコルに従ってＳＹＢＲＧｏｌｄ核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０２２２】
【表１】

【実施例２】
【０２２３】
リアルタイムＰＣＲ分析を使用するライゲーション収率の検出
ドナーポリヌクレオチドとアクセプターポリヌクレオチド（それぞれＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＣｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ）の間のライゲーション産物を、リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して検出した。ライゲーション反応を、相補的な鋳型（Ａｌｇ鋳型）の存在下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて実施し、リアルタイムＰＣＲを使用して検出した。ライゲーション反応から得た産物の連続希釈物（１０⁴〜１０⁹倍希釈のライゲーション産物）を、その後のＰＣＲ反応における鋳型として使用した。反応混合物は、反応物２５μｌ中、１×ＰＣＲバッファー（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂）、アクセプター（ＬＰ３’ＴＦｏｒ）の５’末端およびドナー（Ｃｏｍ３ＦＲｅｖ）の３’末端（各０．１μＭ）に設計したプライマー結合性部位に特異的なＰＣＲプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ核酸色素（１：６０，０００希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＯＸ参照色素（１：３０，０００希釈）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からなっていた。熱サイクル条件は、初期変性では９５℃で１０分間とし、その後は９５℃で４０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル行い、最終的な伸長ステップを７２℃で７分間行なって終了した。反応は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３００５Ｐ（登録商標）ＱＰＣＲシステム機器で実施した。図３からわかる通り、増幅プロットを使用して６つの希釈物のそれぞれを検出すると（図３Ａ）、ＮＴＣ（鋳型が存在しない状態で実施したライゲーション）は、著しく遅いＣｔを伴う増幅曲線を有していた。解離曲線（図３Ｂ）によって、鋳型の存在下で実施したすべてのライゲーションが同じ融解温度を有しており、ＮＴＣは低い融解温度を有していることが明らかになったが、このことは、Ｃｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳに沿ってＣｏｍ３ＦＲｅｖが伸長したことに起因する可能性が高い。最後に、Ｃｔ値を標準曲線から抽出し、ライゲーション反応のすべての希釈物を、良好な直線性を伴って検出することができた（図３Ｃ）。このアッセイは、核酸標的を定量化するその能力に起因して、修飾ライゲーション構成要素の、この場合は修飾リガーゼ補因子の効率におけるわずかな差異を引き出すのに重要性が高い。
【実施例３】
【０２２４】
ＰＡＧＥ分析を使用するマッチ鋳型とミスマッチ鋳型の間の修飾補因子の識別評価
ＡＴＰ類似体を、マッチ鋳型およびミスマッチ鋳型を接合するそれらの能力について、対応する天然ＡＴＰ補因子と比較した（図４）。ＡＴＰ類似体を、マッチ鋳型（ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端におけるＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について、ミスマッチ鋳型（ＬＰ３’Ｃアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＣ−Ａミスマッチ塩基対）を使用した場合の相対的収率に対して評価した。反応は、対象となる補因子を濃度１ｍＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。天然ＡＴＰ基質を、以下の修飾補因子、７−デアザ−ＡＴＰ（７−デアザ−アデノシン−５’−三リン酸）、Ｎ１−メチル−ＡＴＰ（Ｎ１−メチル−アデノシン−５’−三リン酸）、２−アミノ−ＡＴＰ（２−アミノ−アデノシン−５’−三リン酸）、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸）、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）と比較した（図４）。マッチ鋳型を用いた場合には、あらゆる修飾補因子によって、天然ＡＴＰと類似の効率でライゲーションが支持された。しかし、ミスマッチ鋳型を用いた場合には、修飾補因子の使用によって、天然ＡＴＰと比較してライゲーション収率が著しく低下した。
【実施例４】
【０２２５】
特異性数値の決定
対象となるライゲーション構成要素（例えば、修飾リガーゼ補因子、修飾ドナーまたは修飾アクセプター）のライゲーション収率を決定する一方法は、特異性数値を割り当てることである。特異性数値は、例えばマッチしている場合のライゲーション収率を、そのマッチしている場合と比較して一塩基対が一致していないミスマッチの場合のライゲーション収率で割ることによって決定することができる。まず、実施例１に示す通り、ＰＡＧＥゲルの濃度測定の読取りによってライゲーション収率を決定する。次いで、その収率を同じ反応における鋳型の読取りに対して正規化し、その後１．０の正規化収率を有する天然（ＡＴＰ）補因子を含む反応物のライゲーション収率に対して正規化する。例えば、２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸；図４）の場合、マッチしている場合（ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）のライゲーション収率は、１．３４であった。ミスマッチの場合（ＬＰ３’Ｃアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＣ−Ａミスマッチ塩基対）には、ライゲーション収率は０．１８であった。したがって、Ｃ−Ａミスマッチの場合の２’−デオキシ−ＡＴＰに割り当てられた特異性数値は、１．３４÷０．１８、すなわち７．４４であった。これを超える値は、改善されたライゲーション特異性を示す。これ未満の値は、低いライゲーション特異性を示す。
【実施例５】
【０２２６】
マッチ鋳型とミスマッチ鋳型の間の修飾補因子の識別を同定するためのマトリックス評価
ＡＴＰ類似体を、アクセプターの３’末端上にミスマッチ塩基対を含有する鋳型：１）ＬＰ３’Ｃアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；Ｃ−Ａミスマッチ、２）ＬＰ３’Ｇアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；Ｇ−Ａミスマッチ、ならびに３）ＬＰ３’Ａアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；Ａ−Ａミスマッチの収率に対して、マッチ鋳型（ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率に関して、マッチ鋳型およびミスマッチ鋳型を接合するそれらの能力について天然ＡＴＰ補因子と比較した（図５）。反応は、対象となる補因子を濃度１ｍＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。天然ＡＴＰ補因子を、以下の１０種類の修飾補因子、５’−α−チオ−アデノシン−５’−三リン酸（１−チオ−ＡＴＰ）、２’アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、２−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（２−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、２’−フルオロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（２’−フルオロ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ）、３’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（３’−デオキシ−ＡＴＰ）、７−デアザ−アデノシン−５’−三リン酸（７−デアザ−ＡＴＰ）、２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（２’−デオキシ−ＡＴＰ）、Ｌ−異性体−２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸（２’−デオキシ−ＡＴＰのＬ−異性体）、およびＮ１−メチル−アデノシン−５’−三リン酸（Ｎ１−メチル−ＡＴＰ）と比較した。対象となる４つの異なる塩基対Ｔ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｃ−ＡおよびＡ−Ａに関するライゲーション収率のＰＡＧＥ分析から得た積分結果を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチ鋳型（Ｔ−Ａ）について正規化した収率を、３つの異なるミスマッチ鋳型（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）のそれぞれについて正規化した収率と比較する（図５）。対象となる主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には天然ＡＴＰに匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチ鋳型（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）の存在下ではライゲーション収率は低い。類似体のこのパネルから、５’−α−チオ−アデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸および３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸が、対象となる主な修飾と同定された。
【実施例６】
【０２２７】
マッチ鋳型とミスマッチ鋳型の間の修飾アクセプターの識別を同定するためのマトリックス評価
様々な糖および主鎖修飾アクセプター鎖を、マッチ鋳型およびミスマッチ鋳型を接合するそれらの能力について、天然非修飾アクセプター鎖と比較した。修飾アクセプター鎖を、鋳型の３’末端においてミスマッチ塩基対を含有する鋳型：１）ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＧｌｇ鋳型；Ｔ−Ｇミスマッチ、２）ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＣｌｇ鋳型；Ｔ−Ｃミスマッチ、ならびに３）ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＴｌｇ鋳型；Ｔ−Ｔミスマッチの収率に対して、マッチ鋳型（ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプターの３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について評価した。反応は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、対象となるアクセプター鎖を濃度１μＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。ＮＡＤ依存性リガーゼである大腸菌リガーゼを使用してさらなる実験を実施して（示さず）、天然アクセプター鎖の性能を、以下に示す式を有する１０種類の修飾アクセプターと比較した。
【０２２８】
【化３９】

式中、
Ｘ¹および²は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨおよびＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、それぞれ独立に、Ｈ、ＦおよびＯＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｗは、オリゴヌクレオチジル残基である。
【０２２９】
天然アクセプターでは、Ｘ¹およびＸ²はＯＨであり、Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³はＨである（図６、修飾なし）。１０種類の修飾アクセプターのそれぞれは、天然アクセプターと比較して、Ｘ¹がＳＨまたはＣＨ₃であり（図６、それぞれＰＳ（Ｘ１）およびＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ²がＳＨまたはＣＨ₃であり（図６、それぞれＰＳ（Ｘ２）およびＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ¹がＦまたはＯＣＨ₃であり（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ１）または２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、Ｙ²がＦまたはＯＣＨ₃であり（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ２）または２’−ＯＭｅ（Ｙ２））、Ｙ³がＦまたはＯＣＨ₃である（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ３）または２’−ＯＭｅ（Ｙ３））ように、部位Ｘ¹、Ｘ²、Ｙ¹、Ｙ²またはＹ³の１つにおいて修飾を有する。
【０２３０】
対象となる４つの異なる塩基対Ｔ−Ａ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定したライゲーション収率を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチ鋳型（Ｔ−Ａ）について正規化した収率を、３つの異なるミスマッチ鋳型（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）のそれぞれについて正規化した収率と比較した（図６）。対象となる主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）にはＡＴＰに匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチ鋳型（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）の存在下ではライゲーション収率は低い。修飾アクセプターのこのパネルから、Ｘ¹位置におけるＣＨ₃修飾（図６、ＰＭｅ（Ｘ１））およびＹ²位置におけるＯＣＨ₃修飾（図６、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））が、対象となる主なアクセプター修飾と同定された。
【実施例７】
【０２３１】
マッチ鋳型とミスマッチ鋳型の間の修飾ドナーの識別を同定するためのマトリックス評価
様々な糖および主鎖修飾ドナー鎖を、マッチ鋳型およびミスマッチ鋳型を接合するそれらの能力について、天然ドナー鎖と比較した。修飾ドナー鎖を、鋳型の３’末端においてミスマッチ塩基対を含有する鋳型：１）Ｃｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＣｌｇ鋳型；Ｔ−Ｃミスマッチ、ならびに２）Ｃｏｍ３Ｆ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｃ／ＰＢＳおよびＡｌｇ；Ｃ−Ａミスマッチの収率に対して、マッチ鋳型（Ｃｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について評価した。反応は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび対象となるドナー鎖を濃度１μＭで各反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。ＮＡＤ依存性リガーゼである大腸菌リガーゼを使用してさらなる実験を実施した（示さず）。天然ドナー鎖を、以下の５種類の修飾ドナーと比較した。
【０２３２】
【化４０】

式中、Ｘ¹およびＸ²は、それぞれ別個にＯＨまたはＣＨ₃で置換されており、Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、それぞれ別個にＨまたはＯＣＨ₃で置換されている。
【０２３３】
天然ドナーでは、Ｘ¹およびＸ²はＯＨであり、Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³はＨである（図７、修飾なし）。５種類の修飾ドナーのそれぞれは、天然ドナーと比較して、Ｘ¹がＣＨ₃であり（図７、ＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ²がＣＨ₃であり（図７、ＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ¹がＯＣＨ₃であり（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、Ｙ²がＯＣＨ₃であり（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））、またはＹ³がＯＣＨ₃である（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ３））ように、部位Ｘ¹、Ｘ²、Ｙ¹、Ｙ²またはＹ³の１つにおいて修飾を有する。
【０２３４】
対象となる３つの異なる塩基対Ｔ−Ａ、Ｔ−ＣおよびＣ−Ａについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定した正規化ライゲーション収率を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチ鋳型（Ｔ−Ａ）を、３つの異なるミスマッチ鋳型（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）のそれぞれと比較した（図７）。対象となる主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）におけるＡＴＰと匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチ（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）の存在下では、ライゲーション収率は低い。修飾アクセプターのこのパネルから、Ｘ¹（ＰＭｅＸ¹）およびＸ²（ＰＭｅＸ²）位置におけるＣＨ₃修飾が、対象となる主なドナー修飾と同定された。
【実施例８】
【０２３５】
マッチ鋳型とミスマッチ鋳型を最も良好に識別する修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせた修飾アクセプターの同定の評価
実施例１、３、４および５に記載した研究に続き、いくつかの修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせたいくつかの糖および主鎖修飾アクセプター鎖を、マッチ鋳型対ミスマッチ鋳型を接合するそれらの能力について、天然アクセプター鎖およびＡＴＰと比較した。これらの研究によって、鋳型鎖の３’末端上にミスマッチ塩基対を含有する単一鋳型：１）Ｃｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＣｌｇ鋳型；Ｔ−Ｃミスマッチを用いた場合の相対的収率に対する、マッチ鋳型（Ｃｏｍ３Ｆドナー／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプター／ＰＢＳおよびＡｌｇ鋳型；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾アクセプター鎖と修飾ＡＴＰ補因子の組合せを評価した。反応は、対象となるアクセプター鎖を濃度１μＭで各反応物に入れ、ＡＴＰ補因子を濃度１ｍＭで入れて、実施例１に記載の通り実施した。これらの研究では、天然アクセプター鎖の性能を、以下の５種類の修飾アクセプターと比較した。
【０２３６】
【化４１】

式中、Ｘ¹は、独立に、ＯＨ、ＳＨおよびＣＨ₃からなる群から選択され、Ｘ²は、独立に、ＯＨおよびＣＨ₃からなる群から選択され、Ｙ¹およびＹ²は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ₃からなる群から選択される。
【０２３７】
天然アクセプターでは（図８、修飾なし）、Ｘ¹およびＸ²はＯＨであり、Ｙ¹およびＹ²はＨである。５種類の修飾アクセプターのそれぞれは、天然アクセプターと比較して、Ｘ¹がＳＨであり（図８、ＰＳ（Ｘ１））、Ｘ¹がＣＨ₃であり（図８、ＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ²がＣＨ₃であり（図８、ＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ¹がＯＣＨ₃であり（図８、２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、またはＹ²がＯＣＨ₃である（図８、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））ように、部位Ｘ¹、Ｘ²、Ｙ¹またはＹ²の１つにおいて修飾を有する。
【０２３８】
これらの５種類の修飾アクセプター鎖を、２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）、１−チオ−ＡＴＰ（５’−α−チオ−アデノシン−５’−三リン酸）、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）、２−アミノ−ＡＴＰ（２−アミノ−アデノシン−５’−三リン酸）、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）、および２−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）を含む６種類の修飾ＡＴＰ類似体と組み合わせてアッセイした。ＡＴＰ類似体および修飾アクセプター鎖のあらゆる可能な組合せを試験した。
【０２３９】
対象となる２つの異なる塩基対Ｔ−ＡおよびＴ−Ｃについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定したライゲーション収率（ＡＴＰに対して正規化）を、表（図８）に記録した。これらの表は、糖および主鎖修飾アクセプター鎖を異なる修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせて使用する相対的ライゲーション収率を含む。これらの値は、実施例１に記載の通り、天然アクセプター鎖ならびにアクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｔ−Ｃ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション収率に対するものである。マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には、点の網掛けセルの値は、０．８５を超える相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．７０〜０．８５の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０〜０．７０の相対的ライゲーション収率を表す。ミスマッチの場合（Ｔ−Ｃ）には、点の網掛けセルは、０〜０．０１の相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルは、０．０１〜０．１の相対的ライゲーション収率を表し、灰色のセルは、０．１０〜１．００の相対的ライゲーション収率を表す。提示されたすべての収率を、ＡＴＰと非修飾アクセプター鎖の組合せに対して正規化した。好ましい性能基準を有する組合せは、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には０．８５を超える相対的収率を有し（例えば、図８の点の網掛けセル、上の表）、ミスマッチ鋳型（Ｔ−Ｃ）の存在下では０．０１未満の相対的ライゲーション収率を有する（例えば、図８の点の網掛けセル、下の表）。これらの可能な組合せから、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）を伴うＸ¹位置におけるＣＨ₃の修飾（図８、ＰＭｅ（Ｘ１））が、対象となる主な修飾補因子および修飾アクセプターの組合せと同定され、マッチ収率は１．２２であり、ミスマッチ収率は０．００であった。
【０２４０】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２４１】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限なしに適切に実施され得る。したがって、本発明を説明する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）における、例えば「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および類似の指示対象は、本明細書で別段指定されない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含み」、「含有する」等は、広範囲に解釈されるものであり、限定的ではない（例えば、「それに限定されるものではないが含む」を意味する）。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書で別段指定されない限り、単にその範囲に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照するための省略法として働くことを企図され、それぞれ別個の値は、それがあたかも本明細書に個々に列挙されるように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のあらゆる方法は、本明細書で別段指定されない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本発明で提供される任意のすべての例または例示的用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより明らかにするためのものであり、別段特許請求されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に必須のものとして特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で用いた用語および表現は、限定的ではない説明用語として使用されており、示し記載した特徴またはその一部の任意の等価物を排除するような用語および表現の使用を企図するものではないが、特許請求される本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを認識されたい。したがって、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書に開示の実施形態において具体化される本発明の任意の特徴、改変および変更を用いることができ、かかる改変および変更は、本発明の範囲に含まれるとみなされることを理解されたい。したがって、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書に開示の実施形態において具体化される本発明の任意の特徴、改変、改善および変更を用いることができ、かかる改変、改善および変更は、本発明の範囲に含まれるとみなされることを理解されたい。ここで提供される材料、方法および例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【０２４２】
本発明は、本明細書において広範に一般的に記載されている。属の開示に含まれる下位の種および亜属群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。本発明は、条件付きで本発明の属の説明を含み、またはその属から任意の対象を除去する否定的な制限を、削除されるその材料が本明細書に具体的に列挙されるか否かに関わらず含む。
【０２４３】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から説明される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたは複数メンバーのサブグループの観点からも説明されることを当業者は認識されよう。
【０２４４】
本明細書で言及したあらゆる刊行物、特許出願文書、特許文書および他の参考文献は、あたかもそのそれぞれが参照によって個々に組み込まれるのと同程度に、それらの全体が参照によって明確に組み込まれる。不一致が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【０２４５】
出願人らは、かかる任意の論文、特許文書、特許出願文書または他の物質的文書および電子文書からの任意のあらゆる材料および情報を本願に物理的に組み込む権利を有する。
【０２４６】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の変異を検出する方法であって、
前記標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、前記リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾されており、そして
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターする、
ことを含み、ライゲーションの量は、変異の有無を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
標的核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）部位における代替塩基の１つの有無を検出する方法であって、
前記標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、前記リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾されており、そして
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターする、
ことを含み、ライゲーションの量は、前記標的核酸の前記一塩基多型（ＳＮＰ）部位において前記代替塩基の１つの有無を示すことを特徴とする方法。
【請求項３】
標的核酸中の第１の核酸配列または第２の核酸配列の存在を識別する方法であって、
前記標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、修飾リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、前記リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾されており、そして
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターする、
ことを含み、ライゲーションした核酸の存在または量は、標的核酸中の第１の核酸配列の存在もしくは量または標的核酸中の第２の核酸配列の非存在を示し、ライゲーションの非存在は、標的核酸中の第１の核酸配列の非存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項４】
標的核酸の特定の位置における特定のヌクレオチドの有無を決定する方法であって、
前記標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートし、ここで、前記リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾されており、そして
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターする、
ことを含み、ライゲーションした核酸の存在は、標的核酸の特定の位置における特定のポリヌクレオチドの存在を示し、ライゲーションの非存在は、標的核酸の特定の位置における特定のポリヌクレオチドの非存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５】
ドナーポリヌクレオチドが、式５’−リン酸−Ｘ_(n1)−Ｙ_(n2)−Ｚ_(n3)−３’を有し、アクセプターポリヌクレオチドが式５’−Ｄ_(n4)−Ｅ_(n5)−Ｆ_(n6)−ヒドロキシ−３’を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法
［式中、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ４）および（ｎ５）は、それぞれ独立に、０または任意の正の整数であり、
（ｎ１）および（ｎ６）は、それぞれ独立に、０、１、２、３または４であり、
Ｘ、Ｚ、ＤおよびＦは、標的核酸に相補的なヌクレオチド位置であり、
ＹまたはＥの少なくとも一方は、対象となるヌクレオチド位置である］。
【請求項６】
（ｎ２）および（ｎ５）が、それぞれ独立に、０、１または２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドが前記標的核酸にハイブリダイズすると、ドナーの５’末端がアクセプターの３’末端に隣接する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドが、それらをライゲーションに適した条件下で相補的な核酸鋳型にハイブリダイズしたときに、一緒になってライゲーションすることができる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
修飾リガーゼ補因子が存在する場合、対応する非修飾リガーゼ補因子のライゲーション効率と比較して、非相補的な核酸のライゲーションが低減または阻害される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
修飾リガーゼ補因子が存在する場合、相補的な核酸のライゲーション特異性と比較して、非相補的な核酸のライゲーションが低減または阻害される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
修飾リガーゼ補因子が存在する場合、対応する非修飾リガーゼ補因子と比較してライゲーション特異性が改善される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
修飾補因子、修飾アクセプターまたは修飾ドナーが存在する場合、アクセプターの３’末端またはドナーの５’末端のいずれかが標的核酸に対してミスマッチなヌクレオチドを含む場合と比較してアクセプターの３’末端とドナーの５’末端の両方が標的核酸にマッチする場合に、ライゲーション特異性が上昇する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
修飾補因子、修飾アクセプターまたは修飾ドナーが存在する場合、ミスマッチ核酸のライゲーションが阻害または低減され、非修飾補因子、アクセプターまたはドナーと比較して、マッチ核酸のライゲーション効率が少なくともほぼ同じになる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ライゲーション接合点の両側１０塩基以内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチが存在する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ミスマッチが、ライゲーション接合点のいずれかの側に存在する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ミスマッチが、アクセプターポリヌクレオチドの３’末端に存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ミスマッチが、ドナーポリヌクレオチドの５’末端に存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
修飾リガーゼ補因子、修飾ドナーまたは修飾アクセプターが存在する場合、対応する非修飾リガーゼ構成要素と比較して、標的核酸が存在しない場合のライゲーションが低減または阻害される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リガーゼが、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
リガーゼが、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＲＮＡリガーゼ、フェロプラズマ・アシディフィルム（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、ヒトＤＮＡリガーゼＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＶ、ワクチニアウイルスＤＮＡリガーゼ、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスＤＮＡリガーゼ、ピュロコックス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘｖｏｌｃａｎｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、アシディアヌス・アムビバレンス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓａｍｂｉｖａｌｅｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ）ＤＮＡリガーゼ、ケナルケオン・シュンビオスム（Ｃｅｎａｒｃｈｅｏｎｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）ＤＮＡリガーゼ、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、ナトロノモナス・パラオシス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓｐｈａｒａｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、ハロクアドラタム・ウォルズビイ（Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍｗａｌｓｂｙｉ）ＤＮＡリガーゼ、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｌｉｎａｒｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノコッコイデス・ブルトニ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノスピリラム・ヒュンガテイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｈｕｎｇａｔｅｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノカルドコックス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓｋａｎｄｌｅｒｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ）ＤＮＡリガーゼ、メタノコックス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノサエタ・テルモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡリガーゼ、メタノスパエラ・スタドトマナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａｓｔａｄｔｍａｎａｅ）ＤＮＡリガーゼ、メタノテルモバクター・テルムアウトトロフィクス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、ナノアルカエウム・エクゥィタンス（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍｅｑｕｉｔａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、パイロコックス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ）ＤＮＡリガーゼ、ピロバクルム・アエロフィルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、パイロコックス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ピクロフィルス・トリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓｔｏｒｒｉｄｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｈｉｂａｔａｅ）ＤＮＡリガーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、スルフォロブス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｔｏｋｏｄａｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、テルモプラズマ・アキドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス・カダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルモコックス種ＮＡ１ＤＮＡリガーゼ、テルモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｖｏｌｃａｎｉｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＮＡＤ⁺−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス種ＡＫ１６ＤのＤＮＡリガーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＤＮＡリガーゼ、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡリガーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザＤＮＡリガーゼ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、デイノコックス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）ＲＮＡリガーゼ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＲＮＡリガーゼ、ロドテルムス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）ＲＮＡリガーゼ、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）ＲＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ１、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、およびバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２からなる群から選択される１つまたは複数のリガーゼを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ライゲーションが、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）、ＰＣＲライゲーション検出反応（ＰＣＲ−ＬＤＲ）、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）、ギャップＬＣＲ手法、ＳＮＰｌｅｘ、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型解析アッセイおよび分子反転プローブアッセイ、近接ライゲーション、ならびにライゲーションによる次世代シークエンシングからなる群から選択される１つまたは複数の酵素的ライゲーション方法を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子が、修飾アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）および修飾ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）からなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子が修飾ＡＴＰである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
修飾ＡＴＰが式ＩＡの構造：
【化１】

［式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｎ₃、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
Ｚ¹は、Ｈ、Ｆ、Ｒ²、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、（ＢＨ₃）^-Ｍ⁺およびＣ（Ｙ）Ｒ⁴からなる群から選択され、
Ｍ⁺はカチオンであり、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ¹Ｒ¹およびＮＲ¹からなる群から選択され、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択される］
を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾ＡＴＰが、７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、７−メチル−７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート、７−メチル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチル−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、８−クロロ−アデノシン−５’−トリホスフェート、８−クロロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、８−アザ−アデノシン−５’−トリホスフェート、８−アザ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジド−アデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジド−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチル−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２−クロロプリン−２’−デオキシリボシド−５’−トリホスフェート、２−アミノプリン−２’−デオキシリボシド−５’−トリホスフェート、イノシン−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−イノシン−５’−トリホスフェート、２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、２−アミノ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、２−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−チオ−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−チオ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−チオ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−［Ｐ−ボラノ］−アデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−［Ｐ−ボラノ］−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−［Ｐ−ボラノ］−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−メチルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−メチルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−メチルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−メチルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−フェニルホスホネート−アデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−フェニルホスホネート−２’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−フェニルホスホネート−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、５’−α−フェニルホスホネート−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−アミノ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−アジド−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アジド−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−フルオロ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−フルオロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アラ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メチル−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−チオ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−チオ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メチルアミノ−３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メチルアミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メトキシ−３’−デオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−メトキシ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メトキシ−３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、３’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２’−メトキシ−２’−デオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、および２’−メトキシ−２’，３’−ジデオキシ−２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェートからなる群から選択される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
修飾ＡＴＰが、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、５’−α−チオ−アデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸、３’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸、７−デアザ−アデノシン−５’−三リン酸、および３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸からなる群から選択される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子が修飾ＮＡＤ＋である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
修飾ＮＡＤ＋が式ＩＢの構造：
【化２】

［式中、
Ｗ¹、Ｗ²、Ｗ³およびＷ⁴は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ¹およびＮ⁺Ｒ¹からなる群から選択され、
各Ｒ¹は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ⁴および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ²および各Ｒ³は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｒ⁴は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ²、ＳＲ²、ＳｅＲ²、ＮＲ²Ｒ³、Ｃ（Ｙ）Ｒ²および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意に含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（Ｒ¹）₂およびＮＲ¹からなる群から選択され、
Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³およびＸ⁴は、それぞれ独立に、Ｒ¹、ＮＲ²ＯＲ²、ＮＲ²−ＮＲ²Ｒ³、ＣＮ、Ｎ₃、ＮＯ、ＮＯ₂、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ²からなる群から選択される］
を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
修飾ＮＡＤ＋が、２’−デオキシ−ＮＡＤ＋、２’−デオキシ−２−アミノ−ＮＡＤ＋、２−アミノ−ＮＡＤ＋、２’−デオキシ−３’−アミノ−ＮＡＤ＋、２’−デオキシ−３’−アミノ−２−アミノ−ＮＡＤ＋、および２−アミノ−３’−アミノ−ＮＡＤ＋からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの修飾アクセプターがライゲーション反応に追加される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの修飾アクセプターが、式ＩＩの構造：
【化３】

［式中、
各Ｂ¹、Ｂ²およびＢ³は、独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
各Ｘ¹およびＸ²は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ₃およびＯＣＨ₂ＣＨ₃からなる群から選択され、
各Ｙ¹、Ｙ²およびＹ³は、独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ₃からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される］
を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
核酸ライゲーションを実施するための指示と、修飾リガーゼ補因子、修飾ドナーおよび修飾アクセプターからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ライゲーション構成要素とを含む、核酸ライゲーションのためのキット。
【請求項３５】
少なくとも１つの修飾ライゲーション構成要素が、請求項１から３３のいずれかに記載の構成要素である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
核酸ライゲーション用に印を付された容器および反応バッファーからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項３４から３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
核酸ライゲーション用に印を付された容器、リガーゼおよび反応バッファーからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
核酸リガーゼと、核酸ポリメラーゼ、第２の核酸リガーゼ、逆転写酵素または制限酵素からなる群から選択される少なくとも１つの追加の酵素とをさらに含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
別のライゲーション構成要素に対するライゲーション特異性を改善する修飾ライゲーション構成要素を同定する方法であって、
修飾ライゲーション構成要素を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドからなる群から選択される１つまたは複数を含む反応混合物中でインキュベートし、そして
ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターする、
ことを含み、ライゲーションの量は、修飾ライゲーション構成要素の特異性を示すことを特徴とする方法。
【請求項４０】
鋳型非依存性ライゲーションを阻害または低減する方法であって、
補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートすることを含み、ここで、前記リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾されており、
修飾リガーゼ補因子、修飾ドナーまたは修飾アクセプターが存在する場合、対応する非修飾リガーゼ構成要素と比較して、標的核酸が存在しない場合のライゲーションが低減または阻害される、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２０１２−５３１９２８（Ｐ２０１２−５３１９２８Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】

化学；冶金 (1,075,549)
- 生化学；ビール；酒精；ぶどう酒；酢；微生物学；酵素学；突然変異... (115,607)
  - 酵素または微生物を含む測定または試験方法そのための組成物または... (20,915)
    - 酵素または微生物を含む測定または試験方法；そのための組成物；そ... (20,907)
      - 核酸を含むもの (9,829)
  - 微生物または酵素；その組成物 (68,222)
    - 突然変異または遺伝子工学；遺伝子工学に関するＤＮＡまたはＲＮＡ... (28,831)
      - 組換えＤＮＡ技術 (27,772)

【出願番号】特願２０１２−５１９６６９（Ｐ２０１２−５１９６６９）
【出願日】平成２２年７月６日（２０１０．７．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４１０６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００５７６２
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５０８３５３００８）トリリンク　バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】

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