化学発光測定装置および化学発光測定方法
【課題】被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても化学発光強度を正確に測定することができる装置および方法を提供する
【解決手段】化学発光測定装置１は、試料容器１０、測定部２０、記憶部３０および演算部４０を備える。測定部２０は、試料容器１０に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から発生した化学発光を受光し、その受光強度に応じた化学発光強度測定値Ｅを取得し、その化学発光強度測定値Ｅを電気信号として演算部４０へ出力する。演算部４０は、記憶部３０により規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを所定の補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める。
【解決手段】化学発光測定装置１は、試料容器１０、測定部２０、記憶部３０および演算部４０を備える。測定部２０は、試料容器１０に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から発生した化学発光を受光し、その受光強度に応じた化学発光強度測定値Ｅを取得し、その化学発光強度測定値Ｅを電気信号として演算部４０へ出力する。演算部４０は、記憶部３０により規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを所定の補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光測定装置および化学発光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化学発光測定（特許文献１〜４や非特許文献１を参照）は、例えば、ヒト免疫細胞の免疫応答機構を利用した新しい食品機能性評価に用いられる。自然免疫の最大の担い手である白血球の一種の好中球細胞は、外部からの病原体等の侵入に対して活性酸素（スーパーオキシド）を産生して放出し、このスーパーオキシドにより病原体を攻撃する役割を担っている。外敵侵入の刺激を受けた好中球細胞は、内部にカルシウムイオンを取り込み、このカルシウムイオンをトリガーとしてスーパーオキシドを産生する。
【０００３】
好中球細胞内のカルシウムイオン量の検出には、カルシウム検出用蛍光試薬（例えばＦｌｕｏ３−ＡＭ等）が用いられる。好中球細胞が産生したスーパーオキシド量の検出には、スーパーオキシド検出用化学発光試薬（例えばＣＬＡやＭＣＬＡ等）が用いられる。すなわち、蛍光試薬から発生した蛍光の強度に基づいて好中球細胞内のカルシウムイオン量が検出され、化学発光試薬から発生した化学発光の強度に基づいて好中球細胞内のスーパーオキシド産生量が検出される。
【０００４】
このようなアッセイ系に評価対象の被検物質を添加すると、被検物質の免疫機構への作用により、蛍光および化学発光それぞれ強度の経時変化が様々に変化する。複数の刺激剤を使用して各々の光強度変化を解析することで、被検物質の作用機序を推測することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２１７７９４号公報
【特許文献２】特許第３２９０１９３号公報
【特許文献３】特開２００６−１２６１５２号公報
【特許文献４】特開２００８−２０３０８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Eugene H. Ratzlaff and S. R.Crouch, "Absorption-Corrected Chemiluminescence Measurements with aDual-Pathlength Spectroscopy", Anal. Chem., Vol.55, No.2, pp.348-352, 1983.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
評価対象である一部の被検物質は、化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合がある。このような場合、化学発光が被検物質により吸収されるので、実際に検出される化学発光強度は、本来検出されるべき化学発光強度より小さくなる。被検物質が活性酸素を除去する作用を有していると、実際に検出された化学発光強度の変化が被検物質の活性酸素除去能および被検物質の光吸収率の何れの変化に因るのかを区別することができない。
【０００８】
複数ある化学発光試薬の中で被検物質の光吸収の影響を受けにくい発光波長を持つ試薬を選択して用いることが可能である。しかし、蛍光および化学発光を同時に測定する場合には、蛍光波長，化学発光波長および励起光波長を互いに区別する必要があり、試薬の選択が大幅に制限される。
【０００９】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても化学発光強度を正確に測定することができる装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の化学発光測定装置は、試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する装置であって、(1) 試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得する測定部と、(2) 化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、試料容器に容れられた試料液中の各発光位置から測定部の受光位置までの光路に基づいて、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める演算部と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
本発明の化学発光測定方法は、試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する方法であって、(1) 測定部により、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得し、(2) 演算部により、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、試料容器に容れられた試料液中の各発光位置から測定部の受光位置までの光路に基づいて、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めることを特徴とする。
【００１２】
本発明の化学発光測定装置は、演算部が、試料容器の奥行きをｄとして、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めるのが好適である。また、本発明の化学発光測定方法は、演算部により、試料容器の奥行きをｄとして、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めるのが好適である。
【００１３】
【数１】
【００１４】
本発明の化学発光測定装置は、(a) 試料容器に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射する励起部を更に備え、(b) 測定部が、励起部により励起光が照射されていないときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、励起部により励起光が照射されているときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、(c) 演算部が、測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、試料容器に容れられた被検物質から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求めるのが好適である。
【００１５】
本発明の化学発光測定方法は、(a) 励起部により、試料容器に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射し、(b) 測定部により、励起部により励起光が照射されていないときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、励起部により励起光が照射されているときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、(c) 演算部により、測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、試料容器に容れられた被検物質から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求めるのが好適である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても、化学発光強度を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１実施形態の化学発光測定装置１の構成図である。
【図２】補正式の導出について説明する図である。
【図３】実施例における規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)を示す図である。
【図４】実施例における被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を示す図である。
【図５】実施例における吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示す図である。
【図６】実施例における補正結果を示す図である。
【図７】第２実施形態の化学発光測定装置２の構成図である。
【図８】第３実施形態の化学発光測定装置３の構成図である。
【図９】点光源と微小面との関係を示す図である。
【図１０】第４実施形態の第１計算例について説明する図である。
【図１１】第４実施形態の第１計算例による数値積分を用いて吸光度Ａと補正係数δ１との関係を求めた結果を示すグラフである。
【図１２】第４実施形態の第２計算例について説明する図である。
【図１３】第４実施形態の第２計算例によるモンテカルロ法を用いて吸光度Ａと補正係数δ２との関係を求めた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
（第１実施形態）
【００２０】
図１は、第１実施形態の化学発光測定装置１の構成図である。第１実施形態の化学発光測定装置１は、試料容器１０、測定部２０、記憶部３０および演算部４０を備える。試料容器１０は、免疫細胞（例えば好中球細胞）、化学発光試薬および被検物質を含む試料液を容れる容器である。これは、免疫細胞を刺激した際に産出される活性酸素を化学発光試薬で検出するというアッセイで、被検物質が免疫細胞の活性酸素産生能に如何に影響するかを研究するものである。
【００２１】
測定部２０は、試料容器１０に容れられた試料液に含まれる化学発光試薬から発生した化学発光のうち該試料液から到達した化学発光を受光し、その受光強度に応じた化学発光強度測定値Ｅを取得し、その化学発光強度測定値Ｅを電気信号として演算部４０へ出力する。
【００２２】
記憶部３０は、試料容器１０中の試料液に含まれる化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、および、試料容器１０中の試料に含まれる被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を、予め記憶している。規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)は、波長λについて積分した結果が所定値（例えば値１）になるように規格化されている。
【００２３】
演算部４０は、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを受け取り、また、記憶部３０により記憶されている規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ) を受け取る。そして、演算部４０は、規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める。ここで、波長範囲λ１〜λ２は化学発光波長領域を含む。
【００２４】
【数２】
【００２５】
次に、本実施形態における上記補正式の導出について説明する。図２は、補正式の導出について説明する図である。或る波長において、光吸収を有する試料液のモル吸光係数をεとし、その試料液に対して外部から入射する光の強度をＩinとし、その試料液を透過して外部へ出射する光の強度をＩoutとし、また、その試料液における光路長をｄとする。このとき、この試料液における吸光度Ａはランベルトベールの法則から下記（３）式で表される。
【００２６】
【数３】
【００２７】
ここで、図２に示されるように、測定部２０側の試料容器１０内表面から深さｚの位置Ｐで化学発光試薬が強度Ｉ０で発光したとする。この場合、測定部２０により観測される光強度Ｉ(ｚ) は、同様にランベルトベールの法則により下記（４）式で表される。吸光度Ａが既知であるとすると、（３）式を用いて（４）式は下記（５）式となる。
【００２８】
【数４】
【００２９】
【数５】
【００３０】
化学発光は奥行き方向の全範囲で起こっていると考えられるので、測定部２０により観測される化学発光強度Ｉは、（５）式をｚ（奥行き）方向に０からｄまで積分することで得られ、下記（６）式で表される。
【００３１】
【数６】
【００３２】
ここで、被検物質が存在しない場合の化学発光強度、すなわち、被検物質の影響を除いた本来求めるべき化学発光強度ＩＣを考える。被検物質が存在しないことから、Ａ＝０を（６）式に代入すると下記（７）式が得られる。
【００３３】
【数７】
【００３４】
したがって、ＩＣを用いて（６）式を書き直すと下記（８）式となる。この（８）式から、被検物質が存在する溶液中で化学発光Ｉが観測された場合における本来の化学発光強度ＩＣは下記（９）式により得られる。この（９）式が、被検物質が存在する場合の化学発光強度から本来の化学発光強度を得るための補正式である。
【００３５】
【数８】
【００３６】
【数９】
【００３７】
実際には、化学発光や被検物質の吸収は一定の波長幅を持っているので、ＩＣ、Ｉ、Ａそれぞれは、波長λの関数であり、各々スペクトルＩｃ (λ)、Ｉ(λ)、Ａ(λ)となる。したがって、（８）式および（９）式は、それぞれ下記（１０）式、（１１）式のように表現される。
【００３８】
【数１０】
【００３９】
【数１１】
【００４０】
被検物質が存在する場合に実際に測定部２０から出力される信号強度Ｅは、化学発光スペクトルＩ(λ)を波長λで積分したものとなり、下記（１２）式で表される。（１０）式から、この（１２）式は下記（１３）式のようになる。
【００４１】
【数１２】
【００４２】
【数１３】
【００４３】
一方、被検物質の影響を補正した本来求めるべき信号強度Ｅ０は、補正された化学発光スペクトルＩＣ(λ)の波長積分で表現され、下記（１４）式で表される。
【００４４】
【数１４】
【００４５】
ここで、下記（１５）式で定義される規格化された関数ｉＣ(λ)を導入する。
【００４６】
【数１５】
【００４７】
よって、（１４）式から、下記（１６）式が得られる。この（１６）式を（１３）式に代入すると、下記（１７）式が得られる。この（１７）式から、上記（２）式の補正式が得られる。
【００４８】
【数１６】
【００４９】
【数１７】
【００５０】
上記（２）式は、前もって計測された被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)および規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)に基づいて、実際に光吸収のある被検物質が存在する状況下での化学発光の信号強度Ｅを補正することで、正しい化学発光の信号強度Ｅ０を得ることができることを示すものである。
【００５１】
以上のように、本実施形態では、測定部２０により、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得される。そして、演算部３０により、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅが補正式（２）式に従って補正されて、当該補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。このようにすることにより、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても、化学発光強度を正確に測定することができる。
【００５２】
次に、図３〜図６を用いて実施例について説明する。ここでは、被検物質として大豆醤油を用い、化学発光試薬としてＭＣＬＡを用いた。図３は、実施例における規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)を示す図である。図４は、実施例における被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について吸光度スペクトルＡ(λ)を示す。
【００５３】
図５は、実施例における吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示し、また、規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)をも示す。この化学発光スペクトルＩ(λ)を波長について積分した値が補正後の化学発光強度Ｅ０となる。
【００５４】
図６は、実施例における補正結果を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について、吸光度一定として補正したときの発光強度Ｅ、および、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を用いて補正したときの発光強度Ｅ、を示す。被検物質の濃度が０.０３％であるとき、被検物質の吸光度が一定と仮定して補正したときの発光強度Ｅと、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を用いて正確に補正したときの発光強度Ｅとでは、１５.５％の誤差が認められた。
【００５５】
（第２実施形態）
【００５６】
図７は、第２実施形態の化学発光測定装置２の構成図である。第２実施形態の化学発光測定装置２は、試料容器１０、測定部２０、分光器２１、記憶部３０、演算部４０および光源５０を備える。図１に示された第１実施形態の化学発光測定装置１の構成と比較すると、この図７に示される第２実施形態の化学発光測定装置２は、分光器２１および光源５０を更に備える点で相違する。
【００５７】
光源５０は試料容器１０に対して光を照射する。光源５０の出力光の波長域は、試料容器１０に容れられる試料液に含まる化学発光試薬の発光波長帯域を含む。分光器２１は、光源５０から出力されて試料容器１０を透過した光を入力し、その入力光を分光して測定部２０へ出力する。測定部２０は、分光器２１により分光されて出力された光を受光し、その受光強度測定値を電気信号として演算部４０へ出力する。
【００５８】
この化学発光測定装置２は、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)および化学発光試薬の化学発光スペクトルをも測定することができ、これらを用いて第１実施形態と同様にして（２）式に従って補正後の化学発光強度Ｅ０を求めることができる。
【００５９】
被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)は以下のようにして測定される。被検物質のみを含む試料液が試料容器１０に容れられる。この試料液は化学発光試薬を含まない。そして、光源５０から出力された光のうち試料容器１０を透過した光は、分光器２１により分光され測定部２０により検出される。測定部２０による受光強度測定値は電気信号として演算部４０へ与えられる。これにより、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)は、演算部４０において求められ、記憶部３０により記憶される。
【００６０】
化学発光試薬の化学発光スペクトルは以下のようにして測定される。免疫細胞（例えば好中球細胞）および化学発光試薬を含む試料液が試料容器１０に容れられる。この試料液は被検物質を含まない。そして、免疫細胞を刺激して活性酸素を産生させ、化学発光試薬を発光させる。化学発光試薬で生じた化学発光は、分光器２１により分光され測定部２０により検出される。測定部２０による受光強度測定値は電気信号として演算部４０へ与えられる。これにより、演算部４０により、化学発光試薬の化学発光スペクトルが取得され、さらに、規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) が求められる。この規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) は記憶部３０により記憶される。
【００６１】
以上のようにして規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)が求められて記憶部３０により記憶された後、第１実施形態と同様にして補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。すなわち、免疫細胞、化学発光試薬および被検物質を含む試料液が試料容器１０に容れられる。測定部２０により、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得される。そして、演算部３０により、記憶部３０に記憶されている規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅが補正式（２）式に従って補正されて、当該補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。
【００６２】
この第２実施形態では、化学発光スペクトル、吸収スペクトルおよび活性酸素のアッセイが同一の装置で行えるだけでなく、試料液のｐＨ等の影響により化学発光スペクトルまたは吸収スペクトルが変化しているような場合においても、正確に化学発光強度を補正することができる。
【００６３】
（第３実施形態）
【００６４】
図８は、第３実施形態の化学発光測定装置３の構成図である。第３実施形態の化学発光測定装置３は、試料容器１０、レンズ２２、光フィルタ２３、光電子増倍管２４、フォトンカウンタ２５、記憶部３０、演算部４０、励起光源６０、レンズ６１、光フィルタ６２、撹拌部７０および温度調整部８０を備える。
【００６５】
図１に示された第１実施形態の化学発光測定装置１の構成と比較すると、この図８に示される第３実施形態の化学発光測定装置３は、測定部２０として光電子増倍管２４およびフォトンカウンタ２５を備える点で相違し、また、レンズ２２、光フィルタ２３、励起光源６０、レンズ６１、光フィルタ６２、撹拌部７０および温度調整部８０を更に備える点で相違する。
【００６６】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内の試料液を撹拌する撹拌部７０を備えることにより、試料容器１０内の試料液が懸濁液である場合であっても該試料液を一定分布に維持することができる。この撹拌部７０は、例えば、試料容器１０内に入れられるマグネティックスターラ、および、このマグネティックスターラを制御するマグネティックスターラコントローラを含む。
【００６７】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内の試料液の温度を調整する温度調整部８０を備えることにより、試料容器１０内の試料液を所定温度に維持することができる。この温度調整部８０は、例えば、試料容器１０に対して配管を介して接続されるサーモバスを含む。
【００６８】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内で発生した化学発光の強度を求めることができるだけでなく、試料容器１０に容れられた試料液に含まれる蛍光試薬を励起するための励起光源６０等を備えることにより、試料容器１０内で発生した蛍光の強度をも求めることができる。
【００６９】
また、この化学発光測定装置３は、試料容器１０に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光を励起光源６０によりパルス的に繰り返し照射することにより、化学発光強度および蛍光強度を実質的に同時に測定することもできる。
【００７０】
試料容器１０に容れられた試料液は、蛍光試薬が導入された免疫細胞（例えば好中球細胞）、化学発光試薬および被検物質を含む。これは、免疫細胞を刺激した際の細胞内カルシウムの濃度変化を蛍光試薬で検出するとともに、刺激の結果として産出される活性酸素を化学発光試薬で同時に検出するというアッセイであり、被検物質が免疫細胞の細胞内カルシウム濃度変化および活性酸素産生能に如何に影響するかを研究するものである。
【００７１】
励起光源６０から出力されたパルス励起光のうち、光フィルタ６２を透過した特定波長成分の光は、レンズ６１により試料容器１０内の試料液に集光照射される。したがって、試料容器１０内の試料液では、蛍光試薬に由来する蛍光が発生するとともに、化学発光試薬に由来する化学発光が発生する。
【００７２】
試料液で発生した蛍光および化学発光は、レンズ２２および光フィルタ２３を経て、光電子増倍管２４により受光される。なお、試料液において散乱された励起光は、光フィルタ２３により遮断される。蛍光または化学発光のフォトンが光電子増倍管２４に入射すると、そのフォトン入射の事象に応じて光電子増倍管２４から電流パルスが出力され、そのパルスがフォトンカウンタ２５により計数される。その計数結果は演算部４０に与えられる。
【００７３】
試料液に励起光が照射されているときに蛍光が発生し、試料液への励起光の照射および非照射に拘わらず化学発光が発生する。したがって、光電子増倍管２４およびフォトンカウンタ２５により、励起光が照射されていないときに、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得され、励起光が照射されているときに、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度が測定されて当該全光強度測定値が取得される。
【００７４】
そして、演算部４０により、全光強度測定値から化学発光強度測定値が差し引かれることで、試料容器１０に容れられた試料液から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値が求められる。また、演算部４０により、第１実施形態と同様にして補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。
【００７５】
（第４実施形態）
【００７６】
以上までに説明した第１〜第３の実施形態では、試料容器１０に容れられた試料液で発生した光のうち一方向に進む光を測定部２０が受光することを前提としていた。このような前提による補正式を用いることで、簡易な計算で正確に補正された化学発光強度Ｅ０を求めることができる。しかし、より正確に補正された化学発光強度Ｅ０を求めるには、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に加えて、試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮した補正係数δを用いた下記（１８）式の補正式に従って補正をするのが好ましい。
【００７７】
【数１８】
【００７８】
第４実施形態では、試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮して補正をする。なお、第４実施形態は、第１〜第３の実施形態を一般化したものに相当する。以下では、試料容器１０および測定部２０について詳細に説明するが、他の構成要素については第１〜第３の実施形態の場合と同様である。
【００７９】
図９に示されるように、放射強度Ｉの任意の点光源からの光線と微小面の法線とのなす角をθとし、点光源と微小面との距離をrとすると、点光源から微小面に入射する光の強度Ｅ０は次式で表される。
【００８０】
【数１９】
【００８１】
試料液中に光吸収性の被検物質が存在する場合、測定部２０に到達する光の強度はランベルトベールの法則に従って減衰する。被検物質の吸光度をＡ(λ)とすると、測定部２０に到達する光の強度ＥＡは次式となる。
【００８２】
【数２０】
【００８３】
化学発光計測において、上記の点光源は試料容器１０内の試料液中の化学発光分子に相当し、微小面は受光部２０の受光面の一部に相当する。したがって、受光部２０の微小面に入射する化学発光の総和ＰＡは、受光部２０の微小面の視野にある試料液の立体領域Ｖで（２０）式を三重積分したものとなり、次式で表される。
【００８４】
【数２１】
【００８５】
さらに、測定部２０の受光面が或る面積を持つ場合、測定部２０の受光面に入射する光の総和ＰＡは、上で述べた微小面に対して測定部２０の受光面の領域Ｓで二重積分したものとなり、次式で表される。
【００８６】
【数２２】
【００８７】
なお、試料容器１０の厚みなどで測定部１２０と化学発光試薬との間に隙間がある場合、この隙間の分だけ吸収に関わる光路長が短くなる。隙間の長さをｕとすると、隙間を通過する光路の長さはｕ／cosθ となるので、試料液を通過する光路長は ｒ−(ｕ／cosθ) となる。したがって、隙間を考慮した光の総和ＰＡは、上記（２２）式を変形した次式となる。
【００８８】
【数２３】
【００８９】
この（２３）式は、試料容器１０内の立体領域Ｖの試料液からの化学発光を測定部２０の面領域Ｓの受光面で検出した場合に観測される光の強度を求めるための一般式となる。試料液中に光吸収性の被検物質に対する化学発光強度の補正係数δは、被検物質が存在しない場合の光強度Ｐ０と、存在する場合の光強度ＰＡとの比で計算され、次式で表される。
【００９０】
【数２４】
【００９１】
これまでに述べた数式を実際に適用する場合、試料容器１０内の立体領域Ｖおよび測定部２０の面領域Ｓそれぞれに適当な座標系を適用し、実際の立体領域Ｖおよび面領域Ｓそれぞれに対応した積分区間を求めて積分すればよい。積分を解析的に解くのが困難である場合、数値積分やモンテカルロ法を使って解くことができる。
【００９２】
また、試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光学系によっては、補正係数δの計算に時間がかかる場合がある。このような場合は、前もって十分な精度で吸光度Ａと補正係数δとの関係を計算し、この関係を使ってより単純な近似式を求め、この近似式を使って実際の補正係数は求めても良い。以下、いくつかの代表的な光学系における補正係数の計算例を示す。なお、試料容器１０の光吸収や屈折率による影響は無視できるものとした。
【００９３】
第１計算例では、図１０に示されるように、試料容器１０として各辺１ｃｍの立方体形状の容積を有し厚みが０.１ｃｍであるものを用い、試料容器１０内に化学発光試薬を含む試料液を満たし、測定部２０としてポイントセンサを用い、試料容器１０の或る一面の中央に測定部２０を密着して配置した場合を想定する。なお、受光部２０の受光面が面積を有する場合であっても、試料容器１０の或る一面の中央にピンホールを密着して配置して、このピンホールを通過した光を受光部２０により受光する場合や、このピンホールを通過した光を分光器により分光した後に受光部２０により受光する場合にも、この第１計算例が適用され得る。
【００９４】
この場合、光強度ＰＡの計算に際しては上記（２３）式を用いればよいが、ポイントセンサである測定部２０の受光面を微小面積と考えれば、Ｓ領域についての積分は不要である。測定部２０の受光面を原点とし、積分領域Ｖ内の任意の点をｘｙｚ直交座標系で（ｘ，ｙ，ｚ）とする。光強度ＰＡは下記（２５）式で計算できる。積分領域Ｖは、試料容器１０内の領域となり、次式で表される領域である。
【００９５】
【数２５】
【００９６】
【数２６】
【００９７】
第１計算例による補正係数δ１は次式で計算される。この式を解析的に解くのは困難である。図１１は、第４実施形態の第１計算例による数値積分を用いて吸光度Ａと補正係数δ１との関係を求めた結果を示すグラフである。
【００９８】
【数２７】
【００９９】
第２計算例では、図１２に示されるように、試料容器１０として直径１ｃｍで高さ１ｃｍの円柱体形状の容積を有し厚みが０.１ｃｍであるものを用い、試料容器１０内に化学発光試薬を含む試料液を満たし、測定部２０として直径１ｃｍの円形の受光部を有するセンサを用い、試料容器１０の一方の底辺に測定部２０の受光面を密着して配置した場合を想定する。
【０１００】
この場合、受光部２０の受光面が面積を持つので、上記（２２）式および（２３）式においてＳ領域についての積分も必要となる。積分領域Ｖは円筒型の試料容器１０内の領域となる。受光部２０の受光面の中心を原点とし、積分領域Ｓの任意の点を直交座標（ｎ，ｍ）とし、積分領域Ｖの任意の点を直交座標（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、光強度ＰＡは、先と同様に下記（２８）式で計算できる。積分領域Ｖ，Ｓは次）式で表される。
【０１０１】
【数２８】
【０１０２】
【数２９】
【０１０３】
第２計算例による補正係数δ２は次式で計算される。この式の積分は五重積分で被積分関数も複雑であるので、実際に数値積分を行った場合、計算に時間がかかる。このような計算の場合はモンテカルロ法による積分が適している。図１３は、第４実施形態の第２計算例によるモンテカルロ法を用いて吸光度Ａと補正係数δ２との関係を求めた結果を示すグラフである。
【０１０４】
【数３０】
【０１０５】
試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮した補正係数δを求める計算例として、これまで第１計算例および第２計算例について説明したが、本実施形態はこれらに限られるものではない。このような補正係数δを用いて（１８）式の補正式に従って補正をすることで、被検物質が光吸収物質である場合においても、化学発光の正確な値を得ることができる。
【符号の説明】
【０１０６】
１〜３…化学発光測定装置、１０…試料容器、２０…測定部、２１…分光器、２２…レンズ、２３…光フィルタ、２４…光電子増倍管、２５…フォトンカウンタ、３０…記憶部、４０…演算部、５０…光源、６０…励起光源、６１…レンズ、６２…光フィルタ、７０…撹拌部、８０…温度調整部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光測定装置および化学発光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化学発光測定（特許文献１〜４や非特許文献１を参照）は、例えば、ヒト免疫細胞の免疫応答機構を利用した新しい食品機能性評価に用いられる。自然免疫の最大の担い手である白血球の一種の好中球細胞は、外部からの病原体等の侵入に対して活性酸素（スーパーオキシド）を産生して放出し、このスーパーオキシドにより病原体を攻撃する役割を担っている。外敵侵入の刺激を受けた好中球細胞は、内部にカルシウムイオンを取り込み、このカルシウムイオンをトリガーとしてスーパーオキシドを産生する。
【０００３】
好中球細胞内のカルシウムイオン量の検出には、カルシウム検出用蛍光試薬（例えばＦｌｕｏ３−ＡＭ等）が用いられる。好中球細胞が産生したスーパーオキシド量の検出には、スーパーオキシド検出用化学発光試薬（例えばＣＬＡやＭＣＬＡ等）が用いられる。すなわち、蛍光試薬から発生した蛍光の強度に基づいて好中球細胞内のカルシウムイオン量が検出され、化学発光試薬から発生した化学発光の強度に基づいて好中球細胞内のスーパーオキシド産生量が検出される。
【０００４】
このようなアッセイ系に評価対象の被検物質を添加すると、被検物質の免疫機構への作用により、蛍光および化学発光それぞれ強度の経時変化が様々に変化する。複数の刺激剤を使用して各々の光強度変化を解析することで、被検物質の作用機序を推測することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２１７７９４号公報
【特許文献２】特許第３２９０１９３号公報
【特許文献３】特開２００６−１２６１５２号公報
【特許文献４】特開２００８−２０３０８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Eugene H. Ratzlaff and S. R.Crouch, "Absorption-Corrected Chemiluminescence Measurements with aDual-Pathlength Spectroscopy", Anal. Chem., Vol.55, No.2, pp.348-352, 1983.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
評価対象である一部の被検物質は、化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合がある。このような場合、化学発光が被検物質により吸収されるので、実際に検出される化学発光強度は、本来検出されるべき化学発光強度より小さくなる。被検物質が活性酸素を除去する作用を有していると、実際に検出された化学発光強度の変化が被検物質の活性酸素除去能および被検物質の光吸収率の何れの変化に因るのかを区別することができない。
【０００８】
複数ある化学発光試薬の中で被検物質の光吸収の影響を受けにくい発光波長を持つ試薬を選択して用いることが可能である。しかし、蛍光および化学発光を同時に測定する場合には、蛍光波長，化学発光波長および励起光波長を互いに区別する必要があり、試薬の選択が大幅に制限される。
【０００９】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても化学発光強度を正確に測定することができる装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の化学発光測定装置は、試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する装置であって、(1) 試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得する測定部と、(2) 化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、試料容器に容れられた試料液中の各発光位置から測定部の受光位置までの光路に基づいて、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める演算部と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
本発明の化学発光測定方法は、試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する方法であって、(1) 測定部により、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得し、(2) 演算部により、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、試料容器に容れられた試料液中の各発光位置から測定部の受光位置までの光路に基づいて、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めることを特徴とする。
【００１２】
本発明の化学発光測定装置は、演算部が、試料容器の奥行きをｄとして、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めるのが好適である。また、本発明の化学発光測定方法は、演算部により、試料容器の奥行きをｄとして、測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求めるのが好適である。
【００１３】
【数１】
【００１４】
本発明の化学発光測定装置は、(a) 試料容器に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射する励起部を更に備え、(b) 測定部が、励起部により励起光が照射されていないときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、励起部により励起光が照射されているときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、(c) 演算部が、測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、試料容器に容れられた被検物質から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求めるのが好適である。
【００１５】
本発明の化学発光測定方法は、(a) 励起部により、試料容器に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射し、(b) 測定部により、励起部により励起光が照射されていないときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、励起部により励起光が照射されているときに、試料容器に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、(c) 演算部により、測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、試料容器に容れられた被検物質から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求めるのが好適である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても、化学発光強度を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１実施形態の化学発光測定装置１の構成図である。
【図２】補正式の導出について説明する図である。
【図３】実施例における規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)を示す図である。
【図４】実施例における被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を示す図である。
【図５】実施例における吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示す図である。
【図６】実施例における補正結果を示す図である。
【図７】第２実施形態の化学発光測定装置２の構成図である。
【図８】第３実施形態の化学発光測定装置３の構成図である。
【図９】点光源と微小面との関係を示す図である。
【図１０】第４実施形態の第１計算例について説明する図である。
【図１１】第４実施形態の第１計算例による数値積分を用いて吸光度Ａと補正係数δ１との関係を求めた結果を示すグラフである。
【図１２】第４実施形態の第２計算例について説明する図である。
【図１３】第４実施形態の第２計算例によるモンテカルロ法を用いて吸光度Ａと補正係数δ２との関係を求めた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
（第１実施形態）
【００２０】
図１は、第１実施形態の化学発光測定装置１の構成図である。第１実施形態の化学発光測定装置１は、試料容器１０、測定部２０、記憶部３０および演算部４０を備える。試料容器１０は、免疫細胞（例えば好中球細胞）、化学発光試薬および被検物質を含む試料液を容れる容器である。これは、免疫細胞を刺激した際に産出される活性酸素を化学発光試薬で検出するというアッセイで、被検物質が免疫細胞の活性酸素産生能に如何に影響するかを研究するものである。
【００２１】
測定部２０は、試料容器１０に容れられた試料液に含まれる化学発光試薬から発生した化学発光のうち該試料液から到達した化学発光を受光し、その受光強度に応じた化学発光強度測定値Ｅを取得し、その化学発光強度測定値Ｅを電気信号として演算部４０へ出力する。
【００２２】
記憶部３０は、試料容器１０中の試料液に含まれる化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、および、試料容器１０中の試料に含まれる被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を、予め記憶している。規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)は、波長λについて積分した結果が所定値（例えば値１）になるように規格化されている。
【００２３】
演算部４０は、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを受け取り、また、記憶部３０により記憶されている規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ) を受け取る。そして、演算部４０は、規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める。ここで、波長範囲λ１〜λ２は化学発光波長領域を含む。
【００２４】
【数２】
【００２５】
次に、本実施形態における上記補正式の導出について説明する。図２は、補正式の導出について説明する図である。或る波長において、光吸収を有する試料液のモル吸光係数をεとし、その試料液に対して外部から入射する光の強度をＩinとし、その試料液を透過して外部へ出射する光の強度をＩoutとし、また、その試料液における光路長をｄとする。このとき、この試料液における吸光度Ａはランベルトベールの法則から下記（３）式で表される。
【００２６】
【数３】
【００２７】
ここで、図２に示されるように、測定部２０側の試料容器１０内表面から深さｚの位置Ｐで化学発光試薬が強度Ｉ０で発光したとする。この場合、測定部２０により観測される光強度Ｉ(ｚ) は、同様にランベルトベールの法則により下記（４）式で表される。吸光度Ａが既知であるとすると、（３）式を用いて（４）式は下記（５）式となる。
【００２８】
【数４】
【００２９】
【数５】
【００３０】
化学発光は奥行き方向の全範囲で起こっていると考えられるので、測定部２０により観測される化学発光強度Ｉは、（５）式をｚ（奥行き）方向に０からｄまで積分することで得られ、下記（６）式で表される。
【００３１】
【数６】
【００３２】
ここで、被検物質が存在しない場合の化学発光強度、すなわち、被検物質の影響を除いた本来求めるべき化学発光強度ＩＣを考える。被検物質が存在しないことから、Ａ＝０を（６）式に代入すると下記（７）式が得られる。
【００３３】
【数７】
【００３４】
したがって、ＩＣを用いて（６）式を書き直すと下記（８）式となる。この（８）式から、被検物質が存在する溶液中で化学発光Ｉが観測された場合における本来の化学発光強度ＩＣは下記（９）式により得られる。この（９）式が、被検物質が存在する場合の化学発光強度から本来の化学発光強度を得るための補正式である。
【００３５】
【数８】
【００３６】
【数９】
【００３７】
実際には、化学発光や被検物質の吸収は一定の波長幅を持っているので、ＩＣ、Ｉ、Ａそれぞれは、波長λの関数であり、各々スペクトルＩｃ (λ)、Ｉ(λ)、Ａ(λ)となる。したがって、（８）式および（９）式は、それぞれ下記（１０）式、（１１）式のように表現される。
【００３８】
【数１０】
【００３９】
【数１１】
【００４０】
被検物質が存在する場合に実際に測定部２０から出力される信号強度Ｅは、化学発光スペクトルＩ(λ)を波長λで積分したものとなり、下記（１２）式で表される。（１０）式から、この（１２）式は下記（１３）式のようになる。
【００４１】
【数１２】
【００４２】
【数１３】
【００４３】
一方、被検物質の影響を補正した本来求めるべき信号強度Ｅ０は、補正された化学発光スペクトルＩＣ(λ)の波長積分で表現され、下記（１４）式で表される。
【００４４】
【数１４】
【００４５】
ここで、下記（１５）式で定義される規格化された関数ｉＣ(λ)を導入する。
【００４６】
【数１５】
【００４７】
よって、（１４）式から、下記（１６）式が得られる。この（１６）式を（１３）式に代入すると、下記（１７）式が得られる。この（１７）式から、上記（２）式の補正式が得られる。
【００４８】
【数１６】
【００４９】
【数１７】
【００５０】
上記（２）式は、前もって計測された被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)および規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)に基づいて、実際に光吸収のある被検物質が存在する状況下での化学発光の信号強度Ｅを補正することで、正しい化学発光の信号強度Ｅ０を得ることができることを示すものである。
【００５１】
以上のように、本実施形態では、測定部２０により、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得される。そして、演算部３０により、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅが補正式（２）式に従って補正されて、当該補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。このようにすることにより、被検物質が化学発光波長領域に光吸収帯を有している場合であっても、化学発光強度を正確に測定することができる。
【００５２】
次に、図３〜図６を用いて実施例について説明する。ここでは、被検物質として大豆醤油を用い、化学発光試薬としてＭＣＬＡを用いた。図３は、実施例における規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)を示す図である。図４は、実施例における被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について吸光度スペクトルＡ(λ)を示す。
【００５３】
図５は、実施例における吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について吸収補正後の化学発光スペクトルＩ(λ)を示し、また、規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)をも示す。この化学発光スペクトルＩ(λ)を波長について積分した値が補正後の化学発光強度Ｅ０となる。
【００５４】
図６は、実施例における補正結果を示す図である。同図は、被検物質（大豆醤油）の濃度を０.０３％、０.０１％および０.００１％の各値とした場合について、吸光度一定として補正したときの発光強度Ｅ、および、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を用いて補正したときの発光強度Ｅ、を示す。被検物質の濃度が０.０３％であるとき、被検物質の吸光度が一定と仮定して補正したときの発光強度Ｅと、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)を用いて正確に補正したときの発光強度Ｅとでは、１５.５％の誤差が認められた。
【００５５】
（第２実施形態）
【００５６】
図７は、第２実施形態の化学発光測定装置２の構成図である。第２実施形態の化学発光測定装置２は、試料容器１０、測定部２０、分光器２１、記憶部３０、演算部４０および光源５０を備える。図１に示された第１実施形態の化学発光測定装置１の構成と比較すると、この図７に示される第２実施形態の化学発光測定装置２は、分光器２１および光源５０を更に備える点で相違する。
【００５７】
光源５０は試料容器１０に対して光を照射する。光源５０の出力光の波長域は、試料容器１０に容れられる試料液に含まる化学発光試薬の発光波長帯域を含む。分光器２１は、光源５０から出力されて試料容器１０を透過した光を入力し、その入力光を分光して測定部２０へ出力する。測定部２０は、分光器２１により分光されて出力された光を受光し、その受光強度測定値を電気信号として演算部４０へ出力する。
【００５８】
この化学発光測定装置２は、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)および化学発光試薬の化学発光スペクトルをも測定することができ、これらを用いて第１実施形態と同様にして（２）式に従って補正後の化学発光強度Ｅ０を求めることができる。
【００５９】
被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)は以下のようにして測定される。被検物質のみを含む試料液が試料容器１０に容れられる。この試料液は化学発光試薬を含まない。そして、光源５０から出力された光のうち試料容器１０を透過した光は、分光器２１により分光され測定部２０により検出される。測定部２０による受光強度測定値は電気信号として演算部４０へ与えられる。これにより、被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)は、演算部４０において求められ、記憶部３０により記憶される。
【００６０】
化学発光試薬の化学発光スペクトルは以下のようにして測定される。免疫細胞（例えば好中球細胞）および化学発光試薬を含む試料液が試料容器１０に容れられる。この試料液は被検物質を含まない。そして、免疫細胞を刺激して活性酸素を産生させ、化学発光試薬を発光させる。化学発光試薬で生じた化学発光は、分光器２１により分光され測定部２０により検出される。測定部２０による受光強度測定値は電気信号として演算部４０へ与えられる。これにより、演算部４０により、化学発光試薬の化学発光スペクトルが取得され、さらに、規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) が求められる。この規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) は記憶部３０により記憶される。
【００６１】
以上のようにして規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ) および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)が求められて記憶部３０により記憶された後、第１実施形態と同様にして補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。すなわち、免疫細胞、化学発光試薬および被検物質を含む試料液が試料容器１０に容れられる。測定部２０により、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得される。そして、演算部３０により、記憶部３０に記憶されている規格化化学発光スペクトルｉＣ(λ)および吸光度スペクトルＡ(λ)に基づいて、測定部２０により取得された化学発光強度測定値Ｅが補正式（２）式に従って補正されて、当該補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。
【００６２】
この第２実施形態では、化学発光スペクトル、吸収スペクトルおよび活性酸素のアッセイが同一の装置で行えるだけでなく、試料液のｐＨ等の影響により化学発光スペクトルまたは吸収スペクトルが変化しているような場合においても、正確に化学発光強度を補正することができる。
【００６３】
（第３実施形態）
【００６４】
図８は、第３実施形態の化学発光測定装置３の構成図である。第３実施形態の化学発光測定装置３は、試料容器１０、レンズ２２、光フィルタ２３、光電子増倍管２４、フォトンカウンタ２５、記憶部３０、演算部４０、励起光源６０、レンズ６１、光フィルタ６２、撹拌部７０および温度調整部８０を備える。
【００６５】
図１に示された第１実施形態の化学発光測定装置１の構成と比較すると、この図８に示される第３実施形態の化学発光測定装置３は、測定部２０として光電子増倍管２４およびフォトンカウンタ２５を備える点で相違し、また、レンズ２２、光フィルタ２３、励起光源６０、レンズ６１、光フィルタ６２、撹拌部７０および温度調整部８０を更に備える点で相違する。
【００６６】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内の試料液を撹拌する撹拌部７０を備えることにより、試料容器１０内の試料液が懸濁液である場合であっても該試料液を一定分布に維持することができる。この撹拌部７０は、例えば、試料容器１０内に入れられるマグネティックスターラ、および、このマグネティックスターラを制御するマグネティックスターラコントローラを含む。
【００６７】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内の試料液の温度を調整する温度調整部８０を備えることにより、試料容器１０内の試料液を所定温度に維持することができる。この温度調整部８０は、例えば、試料容器１０に対して配管を介して接続されるサーモバスを含む。
【００６８】
化学発光測定装置３は、試料容器１０内で発生した化学発光の強度を求めることができるだけでなく、試料容器１０に容れられた試料液に含まれる蛍光試薬を励起するための励起光源６０等を備えることにより、試料容器１０内で発生した蛍光の強度をも求めることができる。
【００６９】
また、この化学発光測定装置３は、試料容器１０に容れられた試料液に被検物質および化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光を励起光源６０によりパルス的に繰り返し照射することにより、化学発光強度および蛍光強度を実質的に同時に測定することもできる。
【００７０】
試料容器１０に容れられた試料液は、蛍光試薬が導入された免疫細胞（例えば好中球細胞）、化学発光試薬および被検物質を含む。これは、免疫細胞を刺激した際の細胞内カルシウムの濃度変化を蛍光試薬で検出するとともに、刺激の結果として産出される活性酸素を化学発光試薬で同時に検出するというアッセイであり、被検物質が免疫細胞の細胞内カルシウム濃度変化および活性酸素産生能に如何に影響するかを研究するものである。
【００７１】
励起光源６０から出力されたパルス励起光のうち、光フィルタ６２を透過した特定波長成分の光は、レンズ６１により試料容器１０内の試料液に集光照射される。したがって、試料容器１０内の試料液では、蛍光試薬に由来する蛍光が発生するとともに、化学発光試薬に由来する化学発光が発生する。
【００７２】
試料液で発生した蛍光および化学発光は、レンズ２２および光フィルタ２３を経て、光電子増倍管２４により受光される。なお、試料液において散乱された励起光は、光フィルタ２３により遮断される。蛍光または化学発光のフォトンが光電子増倍管２４に入射すると、そのフォトン入射の事象に応じて光電子増倍管２４から電流パルスが出力され、そのパルスがフォトンカウンタ２５により計数される。その計数結果は演算部４０に与えられる。
【００７３】
試料液に励起光が照射されているときに蛍光が発生し、試料液への励起光の照射および非照射に拘わらず化学発光が発生する。したがって、光電子増倍管２４およびフォトンカウンタ２５により、励起光が照射されていないときに、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光の強度が測定されて当該化学発光強度測定値Ｅが取得され、励起光が照射されているときに、試料容器１０に容れられた試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度が測定されて当該全光強度測定値が取得される。
【００７４】
そして、演算部４０により、全光強度測定値から化学発光強度測定値が差し引かれることで、試料容器１０に容れられた試料液から測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値が求められる。また、演算部４０により、第１実施形態と同様にして補正後の化学発光強度Ｅ０が求められる。
【００７５】
（第４実施形態）
【００７６】
以上までに説明した第１〜第３の実施形態では、試料容器１０に容れられた試料液で発生した光のうち一方向に進む光を測定部２０が受光することを前提としていた。このような前提による補正式を用いることで、簡易な計算で正確に補正された化学発光強度Ｅ０を求めることができる。しかし、より正確に補正された化学発光強度Ｅ０を求めるには、化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)および被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)に加えて、試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮した補正係数δを用いた下記（１８）式の補正式に従って補正をするのが好ましい。
【００７７】
【数１８】
【００７８】
第４実施形態では、試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮して補正をする。なお、第４実施形態は、第１〜第３の実施形態を一般化したものに相当する。以下では、試料容器１０および測定部２０について詳細に説明するが、他の構成要素については第１〜第３の実施形態の場合と同様である。
【００７９】
図９に示されるように、放射強度Ｉの任意の点光源からの光線と微小面の法線とのなす角をθとし、点光源と微小面との距離をrとすると、点光源から微小面に入射する光の強度Ｅ０は次式で表される。
【００８０】
【数１９】
【００８１】
試料液中に光吸収性の被検物質が存在する場合、測定部２０に到達する光の強度はランベルトベールの法則に従って減衰する。被検物質の吸光度をＡ(λ)とすると、測定部２０に到達する光の強度ＥＡは次式となる。
【００８２】
【数２０】
【００８３】
化学発光計測において、上記の点光源は試料容器１０内の試料液中の化学発光分子に相当し、微小面は受光部２０の受光面の一部に相当する。したがって、受光部２０の微小面に入射する化学発光の総和ＰＡは、受光部２０の微小面の視野にある試料液の立体領域Ｖで（２０）式を三重積分したものとなり、次式で表される。
【００８４】
【数２１】
【００８５】
さらに、測定部２０の受光面が或る面積を持つ場合、測定部２０の受光面に入射する光の総和ＰＡは、上で述べた微小面に対して測定部２０の受光面の領域Ｓで二重積分したものとなり、次式で表される。
【００８６】
【数２２】
【００８７】
なお、試料容器１０の厚みなどで測定部１２０と化学発光試薬との間に隙間がある場合、この隙間の分だけ吸収に関わる光路長が短くなる。隙間の長さをｕとすると、隙間を通過する光路の長さはｕ／cosθ となるので、試料液を通過する光路長は ｒ−(ｕ／cosθ) となる。したがって、隙間を考慮した光の総和ＰＡは、上記（２２）式を変形した次式となる。
【００８８】
【数２３】
【００８９】
この（２３）式は、試料容器１０内の立体領域Ｖの試料液からの化学発光を測定部２０の面領域Ｓの受光面で検出した場合に観測される光の強度を求めるための一般式となる。試料液中に光吸収性の被検物質に対する化学発光強度の補正係数δは、被検物質が存在しない場合の光強度Ｐ０と、存在する場合の光強度ＰＡとの比で計算され、次式で表される。
【００９０】
【数２４】
【００９１】
これまでに述べた数式を実際に適用する場合、試料容器１０内の立体領域Ｖおよび測定部２０の面領域Ｓそれぞれに適当な座標系を適用し、実際の立体領域Ｖおよび面領域Ｓそれぞれに対応した積分区間を求めて積分すればよい。積分を解析的に解くのが困難である場合、数値積分やモンテカルロ法を使って解くことができる。
【００９２】
また、試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光学系によっては、補正係数δの計算に時間がかかる場合がある。このような場合は、前もって十分な精度で吸光度Ａと補正係数δとの関係を計算し、この関係を使ってより単純な近似式を求め、この近似式を使って実際の補正係数は求めても良い。以下、いくつかの代表的な光学系における補正係数の計算例を示す。なお、試料容器１０の光吸収や屈折率による影響は無視できるものとした。
【００９３】
第１計算例では、図１０に示されるように、試料容器１０として各辺１ｃｍの立方体形状の容積を有し厚みが０.１ｃｍであるものを用い、試料容器１０内に化学発光試薬を含む試料液を満たし、測定部２０としてポイントセンサを用い、試料容器１０の或る一面の中央に測定部２０を密着して配置した場合を想定する。なお、受光部２０の受光面が面積を有する場合であっても、試料容器１０の或る一面の中央にピンホールを密着して配置して、このピンホールを通過した光を受光部２０により受光する場合や、このピンホールを通過した光を分光器により分光した後に受光部２０により受光する場合にも、この第１計算例が適用され得る。
【００９４】
この場合、光強度ＰＡの計算に際しては上記（２３）式を用いればよいが、ポイントセンサである測定部２０の受光面を微小面積と考えれば、Ｓ領域についての積分は不要である。測定部２０の受光面を原点とし、積分領域Ｖ内の任意の点をｘｙｚ直交座標系で（ｘ，ｙ，ｚ）とする。光強度ＰＡは下記（２５）式で計算できる。積分領域Ｖは、試料容器１０内の領域となり、次式で表される領域である。
【００９５】
【数２５】
【００９６】
【数２６】
【００９７】
第１計算例による補正係数δ１は次式で計算される。この式を解析的に解くのは困難である。図１１は、第４実施形態の第１計算例による数値積分を用いて吸光度Ａと補正係数δ１との関係を求めた結果を示すグラフである。
【００９８】
【数２７】
【００９９】
第２計算例では、図１２に示されるように、試料容器１０として直径１ｃｍで高さ１ｃｍの円柱体形状の容積を有し厚みが０.１ｃｍであるものを用い、試料容器１０内に化学発光試薬を含む試料液を満たし、測定部２０として直径１ｃｍの円形の受光部を有するセンサを用い、試料容器１０の一方の底辺に測定部２０の受光面を密着して配置した場合を想定する。
【０１００】
この場合、受光部２０の受光面が面積を持つので、上記（２２）式および（２３）式においてＳ領域についての積分も必要となる。積分領域Ｖは円筒型の試料容器１０内の領域となる。受光部２０の受光面の中心を原点とし、積分領域Ｓの任意の点を直交座標（ｎ，ｍ）とし、積分領域Ｖの任意の点を直交座標（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、光強度ＰＡは、先と同様に下記（２８）式で計算できる。積分領域Ｖ，Ｓは次）式で表される。
【０１０１】
【数２８】
【０１０２】
【数２９】
【０１０３】
第２計算例による補正係数δ２は次式で計算される。この式の積分は五重積分で被積分関数も複雑であるので、実際に数値積分を行った場合、計算に時間がかかる。このような計算の場合はモンテカルロ法による積分が適している。図１３は、第４実施形態の第２計算例によるモンテカルロ法を用いて吸光度Ａと補正係数δ２との関係を求めた結果を示すグラフである。
【０１０４】
【数３０】
【０１０５】
試料容器１０に容れられた試料液中の各発光位置から測定部２０の受光位置までの光路をも考慮した補正係数δを求める計算例として、これまで第１計算例および第２計算例について説明したが、本実施形態はこれらに限られるものではない。このような補正係数δを用いて（１８）式の補正式に従って補正をすることで、被検物質が光吸収物質である場合においても、化学発光の正確な値を得ることができる。
【符号の説明】
【０１０６】
１〜３…化学発光測定装置、１０…試料容器、２０…測定部、２１…分光器、２２…レンズ、２３…光フィルタ、２４…光電子増倍管、２５…フォトンカウンタ、３０…記憶部、４０…演算部、５０…光源、６０…励起光源、６１…レンズ、６２…光フィルタ、７０…撹拌部、８０…温度調整部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する装置であって、
前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得する測定部と、
前記化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、前記被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、前記試料容器に容れられた前記試料液中の各発光位置から前記測定部の受光位置までの光路に基づいて、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める演算部と、
を備えることを特徴とする化学発光測定装置。
【請求項２】
前記演算部が、前記試料容器の奥行きをｄとして、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
【数１】
ことを特徴とする請求項１に記載の化学発光測定装置。
【請求項３】
前記試料容器に容れられた前記試料液に前記被検物質および前記化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射する励起部を更に備え、
前記測定部が、前記励起部により励起光が照射されていないときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、前記励起部により励起光が照射されているときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、
前記演算部が、前記測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、前記試料容器に容れられた前記試料液から前記測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求める、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の化学発光測定装置。
【請求項４】
試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する方法であって、
測定部により、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得し、
演算部により、前記化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、前記被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、前記試料容器に容れられた前記試料液中の各発光位置から前記測定部の受光位置までの光路に基づいて、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
ことを特徴とする化学発光測定方法。
【請求項５】
前記演算部により、前記試料容器の奥行きをｄとして、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
【数２】
ことを特徴とする請求項４に記載の化学発光測定方法。
【請求項６】
励起部により、前記試料容器に容れられた前記試料液に前記被検物質および前記化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射し、
前記測定部により、前記励起部により励起光が照射されていないときに、前記試料容器に容れられた前記試料から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、前記励起部により励起光が照射されているときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、
前記演算部により、前記測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、前記試料容器に容れられた前記試料液から前記測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求める、
ことを特徴とする請求項４または５に記載の化学発光測定方法。
【請求項１】
試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する装置であって、
前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得する測定部と、
前記化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、前記被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、前記試料容器に容れられた前記試料液中の各発光位置から前記測定部の受光位置までの光路に基づいて、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める演算部と、
を備えることを特徴とする化学発光測定装置。
【請求項２】
前記演算部が、前記試料容器の奥行きをｄとして、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
【数１】
ことを特徴とする請求項１に記載の化学発光測定装置。
【請求項３】
前記試料容器に容れられた前記試料液に前記被検物質および前記化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射する励起部を更に備え、
前記測定部が、前記励起部により励起光が照射されていないときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、前記励起部により励起光が照射されているときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、
前記演算部が、前記測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、前記試料容器に容れられた前記試料液から前記測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求める、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の化学発光測定装置。
【請求項４】
試料容器に容れられた試料液に被検物質とともに含まれる化学発光試薬から生じた化学発光を測定する方法であって、
測定部により、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値Ｅを取得し、
演算部により、前記化学発光試薬で生じる化学発光の規格化された化学発光スペクトルｉＣ(λ)、前記被検物質の吸光度スペクトルＡ(λ)、および、前記試料容器に容れられた前記試料液中の各発光位置から前記測定部の受光位置までの光路に基づいて、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
ことを特徴とする化学発光測定方法。
【請求項５】
前記演算部により、前記試料容器の奥行きをｄとして、前記測定部により取得された化学発光強度測定値Ｅを下記補正式に従って補正して、当該補正後の化学発光強度Ｅ０を求める、
【数２】
ことを特徴とする請求項４に記載の化学発光測定方法。
【請求項６】
励起部により、前記試料容器に容れられた前記試料液に前記被検物質および前記化学発光試薬とともに含まれる蛍光試薬を励起する励起光をパルス的に繰り返し照射し、
前記測定部により、前記励起部により励起光が照射されていないときに、前記試料容器に容れられた前記試料から到達した化学発光の強度を測定して当該化学発光強度測定値を取得し、前記励起部により励起光が照射されているときに、前記試料容器に容れられた前記試料液から到達した化学発光および蛍光の全強度を測定して当該全光強度測定値を取得し、
前記演算部により、前記測定部により取得された化学発光強度測定値および全光強度測定値に基づいて、前記試料容器に容れられた前記試料液から前記測定部に到達した蛍光の強度を表す蛍光強度測定値を求める、
ことを特徴とする請求項４または５に記載の化学発光測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−６８２２６（Ｐ２０１２−６８２２６Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４７６５３（Ｐ２０１１−４７６５３）
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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