化学誘引物質に対する増大させた感受性を有する幹細胞およびそれを産生および使用する方法
本発明は、化学的誘引物質に対する増大された感受性を示す幹細胞、さらに詳細には、幹細胞移植を含む臨床用途でのようなそれらの産生および使用の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的誘引物質（chemoattractant）に対する増大された感受性を示す幹細胞、さらに詳細には、幹細胞移植を含む臨床用途でのようなそれらの産生および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常な臓器機能により引き起こされる障害の臨床的治療では、典型的にはこのような異常な臓器機能を補正するか、または機能不全の臓器組織を治療するために設計される薬剤を使用する。しかし、ある種の場合には、薬学的治療は、臓器機能がしばしば複雑であり、および／または、完全には理解されていないので授けられ得ない。
【０００３】
このような場合には、唯一の生存可能な選択肢は、非機能的臓器の外科的置換であり、そしてそれは、現在、急性および慢性の両方の肝臓および腎臓不全の治療のために、並びに、癌および特定の先天性異常の治療のために広く使用されている。しかし、提供者の臓器の必要性は、その供給をはるかに超過している。臓器不足は、移植用の成人臓器を分割などの新たな外科的技術を生じた。十分に素晴らしい結果にもかかわらず、このような技術は、なお、提供者の組織の不足に悩んでいる。
【０００４】
生存可能なドナー組織の不足は、幹細胞の柔軟性、すなわち、新しい場所において幹細胞が配置されるその臓器には通常は存在しない細胞種を生じる能力に依存する幹細胞交換療法の出現をもたらした。
【０００５】
幹細胞は、一般に、それらの起源、特に成人、胚性または新生児の起源によって分類される。胚盤胞の内細胞塊に由来する胚性幹細胞は、多能性であり、そして全３つの胚葉に見出される細胞になり得る。長年信じられてきたにもかかわらず、成人の幹細胞は、以前に考えられていたようには、系統的に限定されない。特に、造血および神経系の幹細胞は、系統的境界を越えて最も多様性があるように見える。たとえば、最近の報告は、ヒト起源の造血幹細胞（ＨＳＣ）が、肝性の（hepatic）潜在性を有することを示唆している。性別の不一致の提供者からの肝臓または骨髄移植の研究では、レシピエントにおいて骨髄由来の造血細胞を確認した［Alison（2000年）Nature 406巻：257頁、Theise（2000年）Hepatology 32巻：11-16頁、Korbling（2002年）N Engl J Med 346巻：738−746頁］。マウスおよびラットＨＳＣも、照射または損傷を受けた成体肝臓に移動し、そして肝細胞に分化することも明らかになった［Petersen（1999年）、Science 284巻：1168−1170頁、Theise（2000年）Hepatology 31巻：235−240頁、Lagasse（2000年）Nat Med 6巻：1229−1234頁］。さらに、マウス造血幹細胞の単回移植では、照射を受けたレシピエントの肝臓において、肝上皮細胞の免疫組織化学的および形態学的特性を示す低い含有率の移植細胞を有するＨＳＣ由来の細胞を検出した［Krause（2001年）、Cell 105巻：369−377頁］。
【０００６】
造血幹細胞の循環を誘導する機構は、幹細胞移植の成功がレシピエント標的組織に対する移植細胞の十分な標的化（ホーミングとも称される）によるので、臨床的に重要である［Mazoおよびvon Adrian（1999年）、Journal of leukocyte Biology 66巻、25−32頁］。あらゆる他の臓器の移植での場合と同様に、骨髄移植は浸潤的手術を必要としないが、むしろ単純な静脈灌流により達成される可能性があるのは、移植細胞のこのホーミングによる。
【０００７】
ＨＳＣのホーミングは、循環中のＨＳＣに、骨髄上皮細胞を識別させ、それに付着させ、そしてそれに渡って移動させる一連の分子相互作用として定義され、そして骨髄の特徴的な造血促進微環境（hematopoiesis-promoting microenvironment）でのＨＳＣの蓄積を生じうる。前駆細胞のホーミングは、多段階現象として考えられうる［Voermans（2001年）、J.Hematother.Stem Cell Res．10巻：725−738頁、Lapidot（2002年）、Leukemia 16巻：1992−2003頁］。骨髄に出現するＨＳＣは、骨髄内皮の管腔表面と最初に相互作用する必要がある。この相互作用は、ＨＳＣが微小血管（microvasculature）に入った後数秒以内に起こるはずであり、そして粘着細胞が、流動中の血液によって発揮されるずれ応力（shear force）に抵抗することを可能にするのに十分な物理的強度を供する。付着したＨＳＣは、その後、内皮層を通過して、造血区分に入るに違いない。溢出した後にＨＳＣは、系統特異的ＨＳＣ分化、増殖および成熟に加えて、ストローマ細胞由来のサイトカインおよび他の成長シグナルに関与する過程である、ジャクスタポジションが自己更新過程により未熟なプールの維持をサポートする特化されたストローマ細胞に出会う。
【０００８】
幹細胞ホーミングに関与するほんの限定された数の因子が、現在までに知られている；これらには、ｃ−キット（c-kit）用のリガンド、幹細胞因子が含まれ、そしてそれは、基質に対するＨＳＣの接着での主要な役割を果たすことが示された［Peled（1999年）Science 283巻：845−848頁］；さらにインテグリン相互作用（たとえば、β１−インテグリン）が含まれ、そしてそれは、胎児の肝臓へのＨＳＣの遊走に重要であることが示された［Zanjani（1999年）Blood94巻：2515−2522頁］。
【０００９】
ＨＳＣホーミングに重要であると見なされる１つの重要な分子相互作用は、ケモカインであるストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）およびそれの同種の受容体ＣＸＣＲ４によるものである。
【００１０】
ＳＤＦ−１は、今までに知られているヒト［Aiuti（1997年）J.Exp.Med.185巻：111−120頁］およびマウス［Wright（2002年）J.Exp.Med.195巻：１145−1154頁］両方の起源の造血幹細胞に対する唯一の強力な化学誘引物質である。ＳＤＦ−１は、たとえば肝臓［Shirozu（1995年）Genomics 28巻：495−500頁；Nagasawa（1996年）Nature 382巻：635−638頁；Goddard（2001年）Transplantation 72巻：1957−1967頁］など、発生過程［McGrath（1999年）Dev.Biol.213巻：442−456頁］から成人期［Nagasawa（1994年）Proc Natl Acad Sci USA 91巻：2305−2309頁；Imai（1999年）Br J Haematol 106巻：905−911頁；Pablos（1999年）Am J Pathol 155巻：1577−1586頁］にわたって幅広く多数の組織で広く発現されている。これまでに本発明者らは、ソートしたヒトＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低幹細胞を、照射を受けた免疫欠損種ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍヌルマウスの尾部静脈に、移植したことによって、骨髄へのホーミングおよび再構築（repopulation）が、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用に依存することを示せた［Peled（1999年）Science 283巻：845−848頁；Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁］。
【００１１】
より最近、本発明者らは、マウスおよびヒト幹細胞のＧ−ＣＳＦ誘導可動化（G-CSF-induced mobilization）におけるこれらの相互作用についての役割も確立した［Petit（2002年）Nat Immunol 3巻：687−694頁］。
【００１２】
幹細胞療法の用途をいっそう拡張していくことの観点から、細胞置換療法（cell replacement therapy）の効率および成功率を改善するために、幹細胞ホーミングおよび標的再構築の背後の機構をさらに解明することは非常に望ましい。
【００１３】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、成熟肝細胞に対する強力な分裂促進因子として最初に発見されており、プラスミノーゲンと構造相同性を有するクリングル含有ポリペプチド成長因子（kringle-containing polypeptide growth factor）である［Nakamura（1984年）Biochem.Biophys.Res.Commun.122巻：1450頁；Nakamura（1987年）FEBS Lett 224巻：311頁；Gohda（1988年）J.Clin.Invest.81巻：414頁；Zanegar Cancer Res.49巻：3314頁；Nakamura（1989年）Nature 342巻：440頁］。
【００１４】
ＨＧＦは、様々な種類の細胞において、細胞成長、細胞運動性および形態形成を調節する間葉由来の多面因子（pleiotropic factor）である［Matsumoto（1993年）Goldberg ID,Rosen EM（編）：Hepatocyte Growth Factor-Scatter Factor（HG-SF） and C-met Receptor,スイス国バーゼル、ビルクハウザー・ベルラグ、1993年、225頁；Gherardi（1990年）Nature 346巻：228頁；Weidner（1990年）J.Cell Biol.111巻：2097頁；Higasho（1990年）Biochem.Biophys.Res.Commun.170巻：397頁；Rubin（1991年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88巻：415頁］。Ｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子（C-met proto-oncogene）は、今までに唯一知られている天然のＨＧＦ受容体である。ＨＧＦは、様々な組織および臓器の器官形成、臓器の再生および成長、腫瘍細胞の浸潤および転移、に起因する上皮−間葉相互作用の液体メディエーター（humoral mediator）と考えられている［Matzumoto（1996年）J.Biochem.119巻：591頁］。造血系においてＨＧＦは、造血前駆細胞の成長を促進する［Kmiecik（1992年）Blood 80巻：2454頁；Nishino（1995年）Blood 85巻：3093頁；Mizuno（1993年）Biochem.Biophys.Res.Commun.194巻：178頁；Galimi（1994年）J.Cell Biol. 127巻：1743頁］。興味深いことに、ラットの肝臓を四塩化炭素で刺激した後に、ＨＧＦをインサイチューハイブリダイゼーション（in-situ hybridization）で測定したところ、急性肝障害がＨＧＦの発現を誘発することが報告された［CCl4、Armbrust（2002年）Liver 22巻：486−494頁］。
【００１５】
造血系において考えられる役割が示唆されてはいるが、ＨＧＦと造血細胞との相互作用に関する情報は不完全である。ＨＧＦは、ヒト骨髄ストローマ細胞により構造的に（constitutively）産生されることが発見された［Takai（1997年）Blood 89巻：1560−1565頁］。最近、骨髄（ＢＭ）または胎児肝臓から濃縮された、マウスミエロイド前駆体細胞株およびマウス造血前駆細胞（ＨＰＣ）の増殖においてＨＧＦがＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３と相乗作用をすることが発見された［Kmiecik（1992年）Blood 80巻：2454−2457頁；Mizuno（1993年）上記；Nishino（1995年）Blood 85巻：3093−3100頁］。さらには、ヒトＨＰＣにおける他の成長因子とＨＧＦとの相乗的な増殖効果が観察され、そしてＣＤ３４＋ＨＰＣにおけるＣ−ｍｅｔの発現もまた検出された［Galami（1994年）J.Cell Biol.127巻：1743−1754頁；Goff（1996年）Stem Cells 14巻：592−602頁；Weimer（1998年）Exp.Hematol.26巻：885−894頁］。
【００１６】
本発明を実施化しつつ、本発明者らは、ＨＧＦが、ＣＸＣＲ４発現をアップレギュレート（upregulate)でき、そしてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４依存的幹細胞運動性および標的組織への遊走を促進することを解明した。これらの所見は、標的組織への幹細胞補充を刺激する新規アプローチを供し、そしてそれだけで、様々な細胞および組織交換プロトコールで使用されうる。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、幹細胞を、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベル（level）を増大させて、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすことを包含する、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、それを必要とする対象（subject）に、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それによりその対象における細胞または組織交換を必要とする障害を処理する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で予備処理した幹細胞の治療上有効な量を供することを包含する、細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、それを必要とする対象に、該幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それにより細胞または組織交換を必要とする障害を処理する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の治療上有効な量を供することを包含する、細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、標的組織に対する幹細胞のホーミングを増大させるための医薬品の製造のためのＨＧＦまたはそれの活性部分の用途が提供される。
【００２１】
（ａ）幹細胞を採取（collect）すること、
（ｂ）該幹細胞を、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすこと、および
（ｃ）所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞を単離して、それにより、移植に適した幹細胞を産生させることを包含するものである、移植に適した幹細胞を産生させる方法が提供される。
【００２２】
下に記述される本発明の好ましい実施態様での別の特徴によれば、該幹細胞を採取することは、（ｉ）幹細胞可動化手段（stem cell mobilization procedure）；および／または（ii）外科的手段によって達成される。
【００２３】
記述される好ましい実施態様でのさらに別の特徴によれば、該所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞を単離することは、ＦＡＣＳによって達成される。
【００２４】
記述される好ましい実施態様でのさらに別の特徴によれば、その方法は、さらに、段階（ｃ）に続いて所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞のホーミング能力を決定することを包含する。
【００２５】
本発明のさらに追加の態様によって、ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする第一のポリヌクレオチド配列、および細胞中のポリヌクレオチドの発現を指示する誘導性シス作用調節因子（cis-acting regulationary element)を包含する核酸構築物が提供される。
【００２６】
記述される好ましい実施態様におけるさらに別の特徴によれば、誘導性シス作用調節因子は、ずれ応力活性化因子（shear stress activation element）である。
【００２７】
記述される好ましい実施態様におけるさらに別の特徴によれば、核酸構築物は、さらに、第一のポリヌクレオチド配列に翻訳で融合される(translationally fused）第二のポリヌクレオチド配列を包含し、そしてその第二のポリヌクレオチド配列は、細胞の中から外へのＨＧＦまたはそれの活性部分の分泌を指示する能力のある単独ペプチドをコードする。
【００２８】
本発明のさらに追加の態様によれば、核酸構築物を包含する真核生物の細胞が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するために形質転換した幹細胞を包含する細胞株の提供がある。
【００３０】
本発明のさらに別の態様によれば、（ｉ）幹細胞；および（ii）該幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分のそれぞれを発現するフィーダー細胞を包含する細胞培養物（cell culture）の提供がある。
【００３１】
本発明のさらに別の態様によれば、さらに、幹細胞の内因性ＨＧＦまたはそれの活性部分の発現または活性をアップレギュレートして、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることを包含するものである、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する、幹細胞運動性を増大させる方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様によれば、少なくとも１つの化学誘引物質受容体がＣＸＣＲ４である。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様によれば、その方法は、さらに、成長因子および／またはサイトカインに幹細胞をさらすことを包含する。
【００３５】
本発明のさらに別の実施態様によれば、該成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様によれば、幹細胞は、造血幹細胞である。
【００３７】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、ＣＤ３４+造血幹細胞である。
【００３８】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である。
【００３９】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、間葉幹細胞である。
【００４０】
本発明のさらに別の実施態様によれば、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、（ｉ）幹細胞中のＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または（ii）ＨＧＦまたはそれの該活性部分と、幹細胞を接触させることによって達成される。
【００４１】
本発明のさらに別の実施態様によれば、その方法は、さらに、ＨＧＦ−受容体に幹細胞をさらすことを包含する。
【００４２】
本発明のさらに別の実施態様によれば、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象に、ＨＧＦまたはそれの活性部分単独、またはＳＣＦと一緒に投与すること包含する、損傷臓器に対する自家前駆細胞（self progenitor cells）の自家再増殖（self repopulation）および／または自家移植（self engraftment）を促進する方法の提供がある。
【００４３】
本発明のさらに別の実施態様によれば、幹細胞およびＳＣＦの運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物を提供し、そしてさらに詳細には、細胞または組織交換を必要とする障害を治療するための医薬組成物を提供する。
【００４４】
本発明は、化学誘引物質に対する感受性が増大したことを示す幹細胞、およびそれを産出および使用する方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。
【００４５】
別段の規定のない限り、ここに使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を示す。ここに記述されるものに類似か、または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験に使用されうるが、適切な方法および材料は以下に記述される。論争の場合には、定義を含めた特許明細書がコントロールするであろう。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみであって、限定することが意図されない。多数の指示。
【００４６】
本発明を、添付の図面を参照して、実施例としてのみによって記述する。ここで、詳細に図面に関して特に、示される詳細は、実施例により、そして本発明の好ましい実施形態の例示の検討の目的のみであり、そして本発明の原理および概念上の実施態様の最も有用で十分に理解される説明を提供する根拠に現れると強調される。これに関して、本発明を基本的に理解するのに必要であるよりさらに詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされておらず、図面と一緒になった説明は、本発明のいくつかの形態がどのように実際に実現されうるかを当業者に明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、化学誘引物質に対して増大した感受性を示す幹細胞、およびそれを産生および使用する方法に関する。特に、本発明は、たとえば慢性または急性肝臓損傷を治療するような細胞または組織交換を必要とする障害を治療することを可能にする。
【００４８】
本発明の原理および操作は、図面および付随の説明を参照してよりよく理解されうる。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、以下の記述で開示されるか、または実施例によって具体化された詳細にその用途が限定されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態を含むことができ、または種々の方法で実施または実行されうる。さらに、ここに使用される語法および用語は、説明の目的のためであって、限定すると見なされるべきでないことを理解されるべきである。
【００５０】
細胞療法の用途は急速に成長しており、そして種々の障害の治療において次第に重要な治療様式になりつつある。造血幹細胞（ＨＳＣ）（たとえば、骨髄から、臍帯血（umbilical cord blood ）または可動化末梢血（mobilized peripheral blood））移植は、日常的に実施される保証償還細胞療法（insurance-reimbursed cellular therapy）の１つの例である。しかし、癌および感染性疾患についての免疫療法、軟骨欠損のための軟骨細胞療法、神経変性疾患のための神経細胞療法、および膨大な用途のための幹細胞療法を含めた多くの他の細胞療法が、同様に開発されつつある［Forbes（2002年）Clinical Science 103巻：355−369頁］。
【００５１】
幹細胞療法に関連した問題の１つは、標的組織における細胞の長期間にわたる首尾よい移植を達成することの困難さである。最近、首尾よく移植された患者でも、非常に低いレベルの幹細胞および望ましい表現型を示す細胞を産生する未熟な前駆体（immature progenitors）を示している。
【００５２】
したがって、幹細胞移植の成功は、静脈内注入した幹細胞が標的組織（たとえば、骨髄）に留まる幹細胞の能力に依存するのであり、そしてこのプロセスは、ホーミングと称される。ホーミングは多段階プロセスであり、骨髄洞様毛細血管の内皮細胞への幹細胞の接着、続いて化学誘引物質により導かれるトランス内皮遊走（transendothelial migration）により構成され、そして最後に、増殖および分化が起こる骨髄空間管外（extravascular bone marrow spaces）に定着することからなると仮定されている。
【００５３】
研究により、接着分子、サイトカインおよび成長因子を含めた膨大な因子が、ホーミング過程に関与することが示された。１９９７年に、研究は、ＣＤ３４+細胞の遊走（migration）が、化学誘引物質ＳＤＦ−１によって支配されることを明らかにした。継続的研究は、インビトロにおいて、ＳＤＦ−１がＨＳＣ上のインテグリンを活性化させ、ＨＳＣのトランス内皮遊走を誘発することを示した。ＳＤＦ−１の受容体は、Ｇタンパク質に連動した受容体（G-protein coupled receptor）であり、ＣＸＣＲ−４と称される。ＳＤＦ−１またはＣＸＣＲ−４ノックアウトマウスにおいて造血前駆体が、胎児発生のあいだに骨髄に移行しないことは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ−４相互作用が、幹細胞遊走において重要な役割を担うことを示唆する［総説としては、Voermans（2001年）J.Hematother.Stem Cell Res.10巻：725−738頁、Lapidot（2002年）Leukemia 16巻：1992−2003頁を参照］。
【００５４】
ホーミングプロセスの予備段階の理解にもかかわらず、幹細胞の遊走の調節についての情報は、いまだに、不完全および散漫である。幹細胞移植の効率の向上は、標的組織にホーミングする幹細胞の能力を調節することによって達成されうるであろうことは、十分に理解される。
【００５５】
本発明を実施化しつつ、本発明者らは、ＨＧＦが、ＣＸＣＲ４発現をアップレギュレートし、そして損傷を受けた臓器組織へのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４を介した幹細胞運動性および遊走を促進することを明らかにした。
【００５６】
以下に説明され、そして続く実施例部分で示されるとおり、本発明者らは、肝臓損傷が、細胞骨格再編を誘導するＨＧＦをアップレギュレートし、運動性を増大させ、そしてＣＸＣＲ４発現を誘導し、そして幹細胞因子（ＳＣＦ）と相乗作用することによって、ＳＤＦ−１信号発生に対する未熟なＣＤ３４＋細胞の応答を助長することを示す。
【００５７】
ＨＧＦは、肝臓損傷の後にアップレギュレーションされること［Armbrust Liver 2002 Dec；22（6）巻：486−94頁］が先に示されたが、本発明者らは、ＨＧＦ活性におけるこのアップレギュレーションが、細胞骨格再編に対するＣＸＣＲ４発現でのアップレギュレーションを導き、そしてそれを発現した細胞のホーミングを促進することを最初に示した。
【００５８】
本所見は、幹細胞の産生を可能にし、そしてそれは、標的組織に有効に補充され得て、そしてそのようなものとして、肝臓損傷の修復、および肝臓または骨髄移植のような膨大な臨床用途で使用されうる。
【００５９】
したがって、本発明の１つの態様によれば、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様によれば、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象へのＨＧＦの投与をして、細胞血液循環における前駆幹細胞レベルが増大されたことにより、損傷を受けた臓器に対する自己再増殖および／または自己移植を促進することを包含する方法が提供される。
【００６１】
ここに使用されるとおり、用語「幹細胞」は、特定の特化された機能（すなわち、「十分に分化された」細胞）を有する他の細胞種に分化しうる能力を有する細胞を意味する。
【００６２】
本発明のこの態様による方法としては、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させ、それによって化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させうる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことが挙げられる。
【００６３】
もう１つの方法として、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることは、幹細胞の内因性ＨＧＦの発現または活性をアップレギュレートすることによっても達成されうる。
【００６４】
下記でさらに記述されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、その細胞を、該タンパク質またはそれの活性部分と接触させるか、または、これらの細胞内で、もしくはそれと共に培養された非幹細胞（たとえば、供給層（feeder layer）として使用される繊維芽細胞）中でＨＧＦまたはそれの活性部分を発現させるかのいずれかによって達成されうる。
【００６５】
続く実施例部分で明瞭に示されるとおり、ＨＧＦに幹細胞をさらすことは、それらの運動性、およびそれの化学誘引物質、すなわちＳＤＦ−１に遊走するそれらの能力をかなり増大させた。
【００６６】
本発明は、HGFおよびその塩、機能性誘導体、前駆体および活性分画（active fractions）、並びにそれの活性変異体に関するものであって、これらはHGFと同じ活性を有するポリペプチドまたはたんぱく質を得るために、その構造中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、除去、または他のアミノ酸で置換される、または、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、その配列に加えられた他のタンパク質またはポリペプチド、および対応する「融合タンパク質」、すなわちＨＧＦまたは他のタンパク質に融合したそれの突然変異体からなるポリペプチドをも包含するものである他のタンパク質またはポリペプチドである。したがって、ＨＧＦは、たとえば免疫グロブリンのような別のタンパク質と融合されうる。
【００６７】
ここで用語「塩」は、本発明のＨＧＦタンパク質またはそれの突然変異タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ酸の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野で知られている手段によって形成されうるのであって、無機塩たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩など、およびたとえば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと形成されるもののような有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、およびたとえば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩が挙げられる。もちろん、あらゆるこのような塩は、本発明のＨＧＦタンパク質またはそれの突然変異タンパク質に対して実質的に類似の活性を示すに違いない。
【００６８】
ここに使用されるところの、定義「機能性誘導体（functional derivative）」は、既知方法によってアミノ酸部分の側鎖に、またはＮ−またはＣ−末端に存在する官能基から作製されうる誘導体を意味し、そしてそれらが、薬学上許容しうる場合、すなわち、それらが、タンパク質活性を破壊しないか、またはそれらを含有する医薬組成物に毒性を与えない場合に、本発明に含まれる。このような誘導体としては、たとえばカルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、そしてたとえばアルカノイルまたはアロイル基などのアシル基を用いて形成される。
【００６９】
本発明のタンパク質の「フラグメント」は、該化合物それ自体のポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体それ自体単独、またはそれに結合した関連分子または残基、たとえば、糖またはホスフェートの残基の組み合わせ、またはそのようなフラグメントまたは前駆体が、薬剤としてHGFと同じ活性を示す場合にポリペプチド分子の凝集体を意味する。
【００７０】
ここに使用されるところの、用語「環状にて入れ替えた（circularly permuted）」とは、直線状分子の末端同士が、環状分子を生成するために直接的に、またはリンカーを介して一緒に連結され、そしてその後環状分子が、当初の分子中の末端と異なる末端を有する新たな直鎖分子を生成する別の位置で開環されるものである直鎖状分子を意味する。環状の入れ替え（circular permutation）としては、その構造が環状にされ、その後開環された分子に等価な分子が挙げられる。したがって、環状にて入れ替えた分子は、おそらく線状分子としデノボ（de novo）で合成されて、環状化および開環工程を経由しない。分子の特別の環状での入れ替えは、そのあいだでペプチド結合が除去されたアミノ酸残基を含有するブラケット（brackets）によって明示される。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含みうる、環状で入れ替えた分子は、しばしばリンカーと融合したそれらの正常な末端を有し、そして別の位置で新たな末端を含む一本鎖状分子である。Goldenbergら、J.Mol.Biol.165巻：407−413頁（1983年）およびPanら、Gene 125巻：111−114頁（1993年）を参照。両者は、ここに参照することによって組込まれる（both incorporated by reference herein）。環状での入れ替えは、直鎖状分子の末端を融合して、環状分子を形成し、そしてその後、様々な位置で環状分子を切断して、様々な末端を有する新たな直鎖分子を形成したものと機能的に等価である。そのように得られる環状での入れ替えは、その配列を基本的に保存する効果を示し、そして様々な位置で新たな末端を産生しつつ、タンパク質のアミノ酸の同一性を示す。
【００７１】
本明細書中、用語「ポリペプチドおよびタンパク質」は、置き換え可能である。
【００７２】
本発明は、本発明の上記ＨＧＦタンパク質の突然変異タンパク質にも関し、そしてその突然変異タンパク質は、基本的にＨＧＦの天然に生じる配列のみを有するＨＧＦタンパク質と基本的に同じ生物学的活性を保持する。そのような「突然変異タンパク質」は、約２０および１０個までのアミノ酸残基が、この種の修飾が、タンパク質それ自体に関してタンパク質突然変異タンパク質の生物学上の活性を実質的に変化させないように、ＨＧＦタンパク質においてそれぞれ、欠失されるか、付加されるか、または他のもので置換されうるものでありうる。
【００７３】
これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法により、および／または部位特異的突然変異誘発技術により、またはそれに適切ないずれかの他の既知技術により調製される。
【００７４】
あらゆるこのような突然変異タンパク質は、好ましくは、それと実質的に類似の活性を示す基本のＨＧＦのものの十分な複製であるアミノ酸配列を有する。したがって、突然変異タンパク質を下記の実施例で説明される生物学的活性試験に付することからなる日常的な実験の手段によって、いずれかの所定の突然変異タンパク質が、本発明の基本的タンパク質と実質的に同じ活性を示すかどうかが決定されうる。
【００７５】
本発明によって使用されうるＨＧＦタンパク質の突然変異タンパク質、またはそれをコードする核酸は、ここに表される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、当業者によって日常的に得られうる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的にＨＧＦに対応する配列の限定された組が挙げられる。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Schulz,G.E．ら、Principles of Protein Structure、Springer−Verlag、New York、1978年；およびCreighton,T.E.Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.、サンフランシスコ、1983年を参照。これらは、ここに参照して組込まれる。コドン優先のようなヌクレオチド配列置換の表示については、See Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publications and Wiley Interscience、ニューヨーク、ニューヨーク州、1987−1995年；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年を参照。
【００７６】
本発明による突然変異タンパク質についての好ましい変化は、「保存的（conservative）」置換として知られるものである。基本的に天然に生じるＨＧＦ配列を有するタンパク質中の保存的アミノ酸置換は、グループ内の同義のアミノ酸を含み得て、そしてそれは、グループの構成要素間の置換は、分子の生物学上の機能を保存するのに十分に類似の物理化学的特性を有する。Grantham、Science 185巻、862−864頁（1974年）を参照。特に、挿入または欠失が、わずかなアミノ酸のみ、たとえば５０個以下、そして好ましくは、２０個以下下のＨＧＦを包含し、そして機能的配座、たとえばシステイン残基に重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合、アミノ酸の挿入および欠失も、それの機能を改変せずに、上で定義された配列で行われうることも明らかである。Anfinsen、「Principles That Govern The Folding of Protein Chains」，Science 181巻、223−230頁（1973年）。このような欠失および／または挿入により産生される突然変異タンパク質は、本発明の範囲内になる。
【００７７】
好ましくは、同義アミノ酸のグループ（synonymous amino acid group）は、表Ａで定義されるものである。さらに好ましくは、同義アミノ酸のグループは、表Ｂで定義されるものである；そして最も好ましくは、同義アミノ酸のグループは、表Ｃで定義されるものである。
【００７８】
表Ａ 同義アミノ酸のグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ
Ａｒｇ Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ
Ｖａｌ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００７９】
表Ｂ 同義アミノ酸のさらに好ましいグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒｓ Ｓｅｒｓ
Ａｒｃ Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ、Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ、Ａｌａ
Ｖａｌ Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅａ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
Ｔｒｙ Ｐｈｉ、Ｔｒｙ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ａｓｐ、Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ａｒｇ、Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｎ、Ａｓｐ
Ｇｌｕ ＦＬＮ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００８０】
表Ｃ 同義アミノ酸の最も好ましいグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒｓ Ｓｅｒｓ
Ａｒｃ Ａｒｃ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈａｒ
Ａｌａｎ Ａｌａｎ
Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅａ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｈｉ Ｐｈｉ
Ｔｒｙ Ｔｒｙ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００８１】
本発明で使用するためのタンパク質の突然変異タンパク質を得るために使用されうるタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、Markらに対する米国特許番号ＲＥ３３，６５３号、４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号および４，７３７，４６２号；Kothsらに対する５，１１６，９４３号、Namenらに対する４，９６５，１９５号；Chongらに対する４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する５，０１７，６９１号で表されるもの；および米国特許第４，９０４，５８４号（Strawら）で表されるリシン置換タンパク質のような、あらゆる公知の工程が挙げられる。
【００８２】
本発明の別の好ましい実施形態で、本発明で使用するためのＨＧＦタンパク質のあらゆる突然変異タンパク質は、本発明の上に明記されるＨＧＦタンパク質のものに原則的に相当するアミノ酸配列を有する。用語「〜に原則的に相当する（essentially corresponding to）」とは、基本となるタンパク質の配列に対し、そのタンパク質の基本的な特徴に影響を及ぼさない程度の些細な変化を伴う突然変異タンパク質を含むことが意図され、ＨＧＦとしての能力についての（基本的な特徴に影響を及ぼさないことが）重要である。「〜に原則的に相当する」言語の範囲に入ると一般的にみなされる変化のタイプは、本発明のＨＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異誘発技術（mutagenesis techniques）から生じるものであり、そしていくつかのマイナーな修飾を生じたり、たとえば化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させるような望みの活性をスクリーニングする。
【００８３】
本発明は、ＨＧＦ変異体（HGF variant）をも包含する。好ましいＨＧＦ変異体は、ＨＧＦアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％アミノ酸同一性を示すものであり、さらに好ましいＨＧＦ変異体は、少なくとも９０％同一性を示し、そして最も好ましい変異体は、少なくとも９５％同一性を示すものである。
【００８４】
ここに示される場合、用語「配列の同一性（sequence identity）」は、アミノ酸配列が、HanksおよびQuinn（１９９１年）による配列によって比較され、低相同性領域の微細な区分においては、ＣｌｕｓｔａｌＷ多配列の配列プログラムについてのウインドウズインターフェース（Thompsonら、１９９４年）であるＣｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムを用いてリファインメントすることを意味する。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／でインターネットじゅうで利用可能である。もちろん、このリンクが、無効になった場合、当業者は、過度な実験なしに、標準インターネット検索技術を使用して、他のリンクでこのプログラムのバージョンを見出しうるということが、理解されるべきである。別段の規定のない限り、本発明の有効出願日現在で最新版の、ここで参照したいずれかのプログラムは、本発明を実施するために使用されるものである。
【００８５】
「配列の同一性」を測定する別の方法は、以下のものである。配列は、−１２のギャップ開放ペナルティー（ギャップの第一のヌルについて）および−４のギャップ拡張ペナルティー（ギャップでの個々の追加の連続ヌル当たり）を示すデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（値−４から＋１１まで）を使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＤＡＰ（グローバル・アラインメント・プログラム）のバージョン９を使用して配列する。配列の後、同一性百分率は、請求された配列中のアミノ酸の数の百分率として適合の数を表すことによって計算される。
【００８６】
本発明による突然変異タンパク質としては、ストリンジェントな条件下でＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッドを形成し、そして本発明によるＨＧＦタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるものが挙げられるのであって、基本的にＨＧＦをコードする天然に生じる配列、および、遺伝子コードの縮重に基づいてそれのヌクレオチド配列で、天然に由来するヌクレオチド配列と異なる可能性のある、すなわちある程度異なる核酸が、この縮重により、なお、同じアミノ酸配列をコードする可能性がある配列の全てを包含するものである。
【００８７】
ここに使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が、塩基対を通して相補的な鎖と連結するあらゆる過程を包含するべきである（Coombs J、1994年、Dictionary of Biotechnology、ストックトン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州）。「増幅」は、核酸配列をさらに複写した産物として定義され、そして一般に、当技術分野で周知であるポリメラーゼ連鎖反応技術（DieffenbachおよびDveksler、1995年、PCR Primer、a Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州プレインビュー（Plainview NY））を使用して行われる。
【００８８】
「ストリンジェンシー」は、特に、約Ｔｍ−５℃（プローブの溶融温度（melting temperature）より５℃低い）から、Ｔｍより下の約２０℃〜２５℃までの範囲に生じる。
用語「「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションおよびそれにひきつづく洗浄（washing）の条件に該当し、それを当業者では、従来「ストリンジェント」と呼ばれる。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン・パブリケーションズ・アンド・ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク州ニューヨーク、1987-1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年を参照。
【００８９】
ここで使用される場合、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション実験で使用される温度、一価陽イオンのモル濃度、およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの含有率の関数である。あらゆる特定の組の条件に含まれるストリンジェンシーの程度を決定するために、ひとつとしては、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍとして表される１００％同一性のハイブリッドの安定性を測定するためにMeinkothら（１９８４年）の方程式を使用する。
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％from）−５００／Ｌ
【００９０】
式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドの含有率であり、％formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの含有率であり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。各１Ｃ毎に、１００％同一性ハイブリッドについて計算されたＴｍから減じられ、許容されるミスマッチの量は、約１％ずつ増加される。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度でのいずれかの所定のハイブリダイゼーション実験のために使用されるＴｍが、Meinkothの方程式によって１００％ハイブリッドについて計算されたＴｍより１０Ｃ下である場合、ハイブリダイゼーションは、約１０％までミスマッチある場合でさえ生じる。
【００９１】
ここで使用される場合、「高度にストリンジェントな条件（highly stringent conditions）」は、上の方程式により計算される場合、または実際に測定される場合のいずれかにおいて、完全な二重鎖について存在するであろうＴｍより１０Ｃよりは低くない標的配列のＴｍを提供するものである。「中程度にストリンジェントな条件（moderately stringent conditions）」とは、上の方程式により計算される場合、または実際に測定される場合のいずれかにおいて、完全な二重鎖について存在するであろうＴｍより下に２０Ｃよりは低くない標識配列のＴｍを提供するものである。制限することなく、高度にストリンジェントな（ハイブリッドの計算または測定されたＴｍより５−１０Ｃ低い）および中程度のストリンジェントな（ハイブリッドの計算または測定されたＴｍより１５−２０Ｃ低い）条件の例では、ハイブリッドの計算されたＴｍより下の適切な温度で、２×ＳＳＣ（標準クエン酸生理食塩水）および５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を使用する。非常に高度なストリンジェントな条件（ultimate stringency of the conditions）は、第一に、洗浄条件によるのであって、とくに用いられるハイブリダイゼーションの条件がそれらである場合、安定性の低いハイブリッドが安定なハイブリッドと共に形成されうる。その後非常に高度なストリンジェントの洗浄条件は、安定性の低いハイブリッドを取り除く。上に記述される非常にストリンジェントから中程度にストリンジェントな洗浄条件までで使用されうる一般のハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍよりおよそ２０から２５Ｃまで低い温度で、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）（標準リン酸生理食塩水−ＥＤＴＡ）、５×デンハート（Denhard's）の試薬、０．５％ＳＤＳ、１００およびマイクロ；ｇ／ｍｌ変性された断片化サーモン精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい（Ausubel、1987、1999）。
【００９２】
本発明の本態様によって使用されうる幹細胞の限定されないの例は、あらゆる年齢での個体の骨髄組織から、または新生児個体の臍帯血から得られる造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉幹細胞（ＭＳＣ）、懐胎後形成した胚性組織から得られる胚性幹（ＥＳ）細胞（たとえば、胚盤胞）、または懐胎のあいだのいずれの時期、好ましくは懐胎の１０週前の胎児の生殖組織から得られる胚性原基（ＥＧ）細胞である。本発明の本態様によって使用されうる幹細胞についてのさらなるの説明を、下記に要約する。
【００９３】
ＨＳＣ−造血幹細胞（ＨＳＣ）は、中でも、赤血球、リンパ球、マクロファージおよび巨核球のような造血または血液細胞の特定の種類のいずれかに分化する能力がある骨髄、胎児肝臓、臍帯血および末梢血に見出される形態形成的に多能性芽球細胞formative pluripotential blast cells）である。ＨＳＣは特に骨髄内を適所として存在し、それらの能力を維持するために必要な全ての因子および全ての接着特性をサポートし、そして生体の寿命を超えて、成熟前駆体を適当なバランスがとれた生産をする［Whetton（1999年）Trends Cell Biol 9巻：233−238頁；Weissman（2000年）Cell 100巻：157−168頁；Jankowska−Wieczorek（2001年）Stem Cells 19巻：99−107頁；Chan（2001年）Br.J.Haematol.112巻：541−557頁］。
【００９４】
本発明の本態様によるＨＳＣは、好ましくは、ＣＤ３４+細胞、そしてさらに好ましくはＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低細胞であり、そしてそれは、いっそう未発達の幹細胞集団であり、したがって、系統制限（lineage-restricted）されておらず、そして主要な長期骨髄再構築細胞（major long-term bone marrow repopulating cells ）である。
【００９５】
ＭＳＣ−間葉幹細胞は、サイトカインのような生物活性因子からの種々の影響によって、間葉または結合組織（すなわち、特化された要素をサポートする体の組織；たとえば、脂肪、骨性、基質、軟骨性、弾性および繊維性結合組織）の１つ以上の特定の型に分化する能力のある、特に骨髄、血、真皮および骨膜で見出される形成多能性芽球細胞（formative pluripotential blast cells）である。
【００９６】
およそ、プラスチックに粘着する３０％のヒト骨髄アスピレート細胞（human marrow aspirate cells）は、ＭＳＣであると考えられている。これらの細胞は、インビトロで展開され、そしてその後、分化誘導される。成熟したＭＳＣが、インビトロで展開され、そして刺激により、骨、軟骨、腱、筋肉、または脂肪細胞を形成しうるという事実は、組織工学および遺伝子療法戦略にとって魅力である。インビボアッセイは、ＭＳＣ機能を分析するために開発された。その循環に注入されたＭＳＣは、上記された多量の組織に組込みうる。特に、骨格および心臓の筋肉は、５−アザシチジンにさらすことにより誘発され得て、そして培養中のラットおよびヒトＭＳＣの神経系の分化は、β−メルカプトエタノール、ＤＭＳＯまたはブチル化ヒドロキシアニソールにさらすことによって誘発されうる［Tomita（1999年）100巻：11247−11256頁；Woodbury（2000年）J.Neurosci.Res.61巻：364−370頁］。さらに、ＭＳＣ由来の細胞は、末梢注入の後、並びにラットの脳へのヒトＭＳＣの直接注入の後に、脳に深く組込まれることが見られた；それらは、神経幹細胞の発生時の遊走に使用される経路にそって遊走し、広く分布されるようになり、そしてＨＳＣ特化のマーカーを失い始める［Azizi（1998年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95巻：3908−3913頁］。間葉幹および系統特化（lineage-specific）細胞増殖を促進する方法は、米国特許第６，２４８，５８７号に開示される。
【００９７】
米国特許第５，４８６，３５９号で記述されるＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４のようなヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）表面のエピトープは、たとえば骨髄で存在するような、異種細胞集団から得られる間葉幹細胞集合をスクリーニングおよび捕捉する試薬として使用されうる。これらの前駆体間葉幹細胞は、種々の間葉系統に分化しうるので、ＣＤ４５について陽性である前駆体間葉幹細胞は、好ましくは、本発明の本態様によって使用される。
【００９８】
本発明の本態様による好ましい幹細胞は、ヒト幹細胞である。
【００９９】
下の表１は、成人幹細胞（adult stem cell）の例を提供し、そしてそれは、本発明の本態様によって、目的の標的組織中の指標表現型を得るために使用されうる。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
上記のとおり、本発明の本態様による幹細胞は、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらされる。
【０１０２】
ＨＧＦは、６２ｋＤａのα−サブユニットおよび３４ｋＤａのβ−サブユニットを含んでいる、ヘテロダイマーなポリペプチドである。α−サブユニットは、２７個のアミノ酸、続いて３つの内部ジスルフィド架橋によって安定化された８０−アミノ酸二重ループ状構造である４つの標準的なクリングルドメインを含めたＮ末端ヘアピンドメインを含有する［Comoglio（1999年）Exp.Cell Res.253巻：88−99頁；Comoglio（1993年）Exs 65巻：131−65頁；Comoglio（1996年）Gene Cells 1巻：347−54頁］。クリングルドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に重要である。第一のクリングルドメインは、ＨＧＦ−受容体についての高い親和性結合ドメインを含有する一方で、第二のクリングルドメインは、膜結合ヘパラン−硫酸・プロテオグリカンに対して低い親和性結合部位を含有する。低い親和性相互作用は、標的細胞近傍に高い濃度のＨＧＦを維持する。ＨＧＦ遺伝子は、単一のプロＨＧＦタンパク質（single pro-HGF protein）をコードしており、それが切断されて活性型異種二量体分子を形成することで、受容体に高い親和性を示す。
【０１０３】
ここで使用されるように、ＨＧＦの活性部分は、化学誘引物質に対する本発明の幹細胞の感度を増大させるのに十分である最小ＨＧＦ配列を意味する。ここで使用されるように、ＨＧＦの活性部分は、突然変異タンパク質、融合タンパク質、官能性誘導体、フラグメント、環状にて入れ替えたＨＧＦおよび／またはそれの塩をも意味する。
【０１０４】
本発明によるＨＧＦの活性部分を決定するために、幹細胞は、ＨＧＦセグメントと接触され得て、そしてそこへの細胞の応答は、当業者に周知であり、そしてさらに下記の方法を使用して、分子的に、生化学的に、または機能的に（たとえば、運動性、ホーミング、移動アッセイ）モニターされうる。
【０１０５】
ここで上に記述されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる。
【０１０６】
多数の走化性細胞受容体（chemotactic cell receptors）が、幹細胞のトランス内皮遊走（transendothelial migration）に関与することが知られている。これらの受容体の多くは、Ｇタンパク質連動型７膜貫通受容体（G protein-coupled seven-transmembrane receptors）（７−ＴＭＲ）のファミリーに属する。Ｇタンパク質、特にＧｉタンパク質を介したシグナリングは、対応するリガンドの勾配に向かう細胞の走化性応答を生じる［Voermans（2001年）J.Hematother.Stem Cell Res.10巻：725−738頁］。最近の研究において、走化性効果を強力に仲介しうる未熟な造血前駆細胞でのいくつかの７−ＴＭＲの発現についての証拠を提供した：ケモカイン受容体（たとえば、ＣＸＣＲ４、ストローマ細胞由来因子−１のための受容体）、脂質メディエーターのための受容体（たとえば、システイニルロイコトリエン受容体（cysteinyl leukotriene receptor）ｃｙｓＬＴ１および末梢カナビノイド受容体（peripheral cannabinoid receptor）ｃｂ２）およびニューロエンドクラインホルモンのための受容体（たとえば、ソマトスタチン受容体ｓｓｔ２）。これらの研究から、造血前駆体および幹細胞の遊走が、単一のケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）によるよりむしろ多様な走化性因子によって制御されると結論づけられうる。
【０１０７】
本発明の本態様の好ましい実施態様によれば、走化性受容体はＣＸＣＲ４である。
【０１０８】
ＨＧＦは、ＨＧＦ受容体、すなわち、ｃ−ｍｅｔに対する結合を介してその生物学上の活性を発揮するので、本発明は、ＨＧＦシグナリングにおける制限因子（limiting factor）でありうるＨＧＦ受容体、すなわち、ｃ−ｍｅｔに細胞をさらすことも目論まれる。
【０１０９】
上記に明記されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、幹細胞を、該タンパク質と接触させるか、または幹細胞内で該タンパク質を発現させることによって達成されうる。
【０１１０】
本発明は、組織から循環への幹細胞の可動化、およびＨＧＦまたはそれの活性部分に循環中の幹細胞をさらすことをも目論んでいるが、幹細胞をＨＧＦと接触させることは、好ましくは、収穫した細胞（harvested）を使用して達成される。
【０１１１】
成人幹細胞は、骨髄吸引のような外科的手段を使用して得られうるか、または米国カリフォルニア州アービンのネックスエル・セラピューティックス・インク．から入手可能なもののような市販のシステムを使用して収穫されうる。
【０１１２】
本発明により利用される幹細胞は、好ましくは、幹細胞可動化手段（stem cell mobilization procedure）を使用して採取（すなわち収穫）されるのであって化学療法または対象の循環へのＨＳＣの放出に対するサイトカイン刺激を利用する。幹細胞は、好ましくは、可動化（mobilization）が、骨髄手術より多くのＨＳＣおよび前駆細胞を生じることが知られているので、この手段を使用して回収される。
【０１１３】
幹細胞の可動は、多数の分子によって誘導されうる。例としては、それに限定はされないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ−３リガンドのようなサイトカイン；ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１α、Ｇｒｏβ、またはＳＤＦ−１のようなケモカイン；および化学療法剤シクロホスホアミド（Ｃｙ）およびパクリタキセル（paclitaxel）が挙げられる。これらの分子は、反応速度論および効率で異なることが予測されるが、最近知られる実施態様によれば、Ｇ−ＣＳＦは、好ましくは、単独で、または幹細胞を可動化するシクロホスホアミドのようなものと組み合わせて使用されることが予測される。特に、Ｇ−ＣＳＦは、５−１０日間、５−１０μｇ／ｋｇの用量で毎日投与される。幹細胞を流動化する方法は、米国特許第６，４４７，７６６号および第６，１６２，４２７号に開示される。
【０１１４】
ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離されうる。ヒト胚盤胞は、特に、インビボにおいて、着床前の胚から、またはインビトロ受精（ＩＶＦ）胚から得られる。代わりに、単細胞ヒト胚は、胚盤胞段階まで延長されうる。ヒトＥＳ細胞の単離については、透明帯状物（zona pellucida）を、胚盤胞から除去し、そして内細胞塊（ＩＣＭ）を、免疫手術により除去し、そしてそれは、栄養外胚葉細胞（trophectoderm）を溶解させ、そして穏やかなピペッティングにより無傷のＩＣＭから取り出す。その後、ＩＣＭを、それの生長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコで培養する。９から１５日に続いて、ＩＣＭで誘導された生産物は、機械的解離によるか、または酵素的分解によるかのいずれかにより、凝集塊（clumps）に解離され、そしてその後、細胞を、新たな組織培養培地上で再度培養させる。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットにより個々に選択され、機械的に、凝集塊に解離され、そして再度平板培養される。その後、生じるＥＳ細胞を、１−２週間ごとに定期的に分割する。ヒトＥＳ細胞を作製する方法についてさらに詳細には、Thomsonら［米国特許第５，８４３，７８０号；Science 282巻：1145頁、1988年；Curr.Top.Dev.Biol.38巻：133頁、1998年；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92巻：7844、1995年］；Bongsoら［Hum Reprod 4巻：706頁、1989年］；Gardnerら［Fertil.Steril.69巻：84頁、1998年］を参照。
【０１１５】
市販で入手可能な幹細胞は、本発明の本態様によっても使用されうることが予想される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリー（＜ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）から購入されうる。市販で入手可能な胚性幹細胞株の制限なしの例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ３２である。
【０１１６】
ヒトＥＧ細胞は、当業者に知られる実験技術を使用して、妊娠約８−１１週のヒト胎児から得られる原初の生殖細胞から回収されうる。生殖隆起（genital ridges）は、解離され、したがって、機械的解離により分けられる小さな塊に切断される。その後、ＥＧ細胞は、適切な培地を用いて組織培養フラスコ中で育成される。ＥＧ細胞と一致する細胞形態学が、大体７−３０日後、または１−４世代に観察されるまで、細胞を毎日培地を交換して培養する。ＥＧ細胞を作製する方法における別の詳細のために、Shamblottら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95巻：13726頁、1998年］および米国特許第６，０９０，６２２号を参照。
【０１１７】
多分化能を示す幹細胞個体群（population）の濃縮（enrichment）は、好ましくは達成されうることが評価される。したがって、たとえば、ここで上に概説されるとおり、ＣＤ３４+幹細胞は、下記でさらに記述されるとおり、アフィニティーカラムまたはＦＡＣＳを使用して濃縮されうる。
【０１１８】
増殖条件下で幹細胞を培養することは、幹細胞数が治療で使用するのには少なすぎる場合にも達成されうる。幹細胞の培養は、米国特許第６，５１１，９５８号、第６，４３６，７０４号、第６，２８０，７１８号、第６，２５８，５９７号、第６，１８４，０３５号、第６，１３２７０８号および第５，８３７，５７３９号に記述される。
【０１１９】
いったん幹細胞が得られると、それらは、ＨＧＦまたはそれの活性部分と接触される。
【０１２０】
可溶性ＨＧＦ、そして特に、その活性部分は、たとえば標準的固相技術を使用することによって生化学的に合成されうる。これらの方法は、限定的固相合成（exclusive solid phase synthesis）、部分的固相合成法（partial solid phase synthesis）、フラグメント圧縮（fragment condensation）、古典的溶液合成（classical solution synthesis）が含まれる。固相ペプチド合成手段は、当技術分野で周知であり、そしてJohn Morrow StewartおよびJanis Dillaha Young、Solid Phase Peptide Syntheses（2版、ピアス・ケミカル・カンパニー、1984年）によりさらに詳述される。
【０１２１】
合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー［Creighton T.（1983年）Proteins, structures and molecular principles，ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・シーオー．ニューヨーク］によって精製され得て、そしてそれの組成物は、アミノ酸配列決定を介して確認されうる。
【０１２２】
ＨＧＦは、シグマ−アルドリッチ（イスラエル国レホボト）のような商業上の供給者からも得られうる；製品番号Ｈ１４０４号。
【０１２３】
大量のＨＧＦまたはそれの活性部分が望まれる場合には、このようなポリペプチドは、好ましくは、組換え技術（recombinant techniques）を使用して得られる。
【０１２４】
このようなポリペプチドを組換え体で合成するためには、プロモーターのような調節因子の転写制御の下流にＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを含めた発現構築物（すなわち、発現ベクター）を、宿主細胞に導入される。
【０１２５】
「形質転換された」細胞を、ポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養する。
【０１２６】
予備測定期間に続いて、発現したタンパク質は、細胞または細胞培養物から回収され、そして精製が達成される。
【０１２７】
多様な原核生物または真核生物の細胞の多様性は、修飾されたポリペプチドコーディング配列を発現する宿主−発現系として使用されうる。これらとしては、それに制限はされないが、所望のコーディング配列を含有する組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリアのような微生物が挙げられる；真核生物の細胞は、翻訳後での修飾タンパク質の産生を可能にするので、好ましくは、哺乳類発現系は、ＨＧＦまたはそれの活性部分を発現するために使用される。しかし、細菌系は、それらが、低費用で高生産量を可能にするので、特に、組換え体タンパク質を産生させるために使用される。したがって、宿主系は、産生されるべき組換えタンパク質およびそれの最終用途によって選択される。
【０１２８】
バクテリアの系では、発現された修飾ポリペプチドとして意図される用途によって、多数の発現ベクターが都合よく有利に選択されうる。たとえば多量の接合体が望まれる場合は、おそらく疎水性シグナル配列との融合として、タンパク質産物が容易に精製されうるように、バクテリアのペリプラズムまたは培養培地に発現産物を導くように、高濃度のタンパク質産物の発現を指示するベクターが、望まれる可能性がある。コンジュゲートからの回収を助けるために特定の切断部位が設計された融合タンパク質も望ましい。このような操作に適合性のあるこのようなベクターとしては、それに限定されないが、イー．コリ（大腸菌）発現ベクターのｐＥＴシリーズ［Studierら（1990年）Methods in Enzymol.185巻：60−89頁］が挙げられる。
【０１２９】
当技術分野で周知である昆虫および哺乳類宿主細胞系のような他の発現系も、本発明によって使用されうる（米国特許第６，５４１，６２３号を参照）。
【０１３０】
どのような場合でも、形質転換細胞は、有効な条件下で培養され、そしてそれは、多量の組換えポリペプチドの発現に対処する。有効な培養条件は、それに限定されないが、有効な培地（effective media）、生物反応器（bioreactor）、温度、ｐＨおよびタンパク質生産を可能にする酸素条件が挙げられる。有効な培地は、細胞が、本発明の組換え修飾ポリペプチドを産生するために培養されるあらゆる培地に該当する。このような培地としては、特に、同化できる炭素、窒素およびリン酸源、および適切な塩、ミネラル、金属およびビタミン類のような他の栄養分を有する水性溶液が挙げられる。本発明の細胞は、従来の発酵生物反応器、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿で培養されうる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行われうる。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内にある。
【０１３１】
結果物の本発明の組換え体タンパク質は、好ましくは、成長（たとえば、発酵）培地に分泌される。
【０１３２】
培養中の所定の時間に続いて、組換えタンパク質の回収が達成される。語句「組換えタンパク質を回収すること」は、タンパク質を含有する全成長培地を採取することに該当し、そして分離または精製の別の段階を意味する必要はない（実施例区分の実施例２を参照）。本発明のタンパク質は、それに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、およびディファレンシャル可溶化のような多様な標準タンパク質精製技術を使用して精製されうる。
【０１３３】
本発明のタンパク質は、好ましくは、「十分に純粋な（substantially pure）」形態で回収される。ここに使用される場合、「十分に純粋な」は、ここで下に記述された多様な用途においてタンパク質を有効に使用できる純度に該当する。
【０１３４】
本発明のＨＧＦまたはそれの活性部分の組換え体産物は、インビトロでも達成されうることが予測される。
【０１３５】
ＨＧＦまたはそれの活性部分は、収穫された幹細胞を培養または維持するために利用される培養培地に含まれうる。このような培養培地としては、特に、幹細胞培養のために適した緩衝溶液（すなわち、成長培地）が挙げられる。培養培地は、幹細胞の成長および生存を支持する成長因子を含む血清または血清置換も含まれうる。培養培地は、ＳＤＦ−１、ＩＬ−６、ＳＣＦなどのようなホーミング剤も含み得る。さらに、本発明の成長培地は、白血病阻害剤因子（ＬＩＦ）のような分化阻害剤も含みうる。
【０１３６】
本発明の幹細胞は、ＨＧＦ分泌細胞とも接触されうる。これは、ＨＧＦまたはそれの活性部分を発現する細胞との本発明の幹細胞を共培養することによって達成されうる。たとえば、未分化状態でそれ（幹細胞）の増殖をサポートするために幹細胞としばしば共培養される繊維芽細胞フィーダー細胞は、ＨＧＦを発現して、それにより二重の役割、すなわち、幹細胞の成長支持および移動および運動性能力の増大を行うことができる。
【０１３７】
しかし、本発明の幹細胞は、好ましくは、臨床用途に使用されるので、幹細胞の少なくとも１つの化学誘引物質受容体の十分な濃度の誘導に続く第二のＨＧＦ−発現細胞集合から幹細胞を単離する手段が取られる。細胞集合を分類する方法は、ここで下にさらに記述される。
【０１３８】
代わりに、本発明の幹細胞は、幹細胞中のＨＧＦまたはそれの活性部分を発現するために、上に記述されるもののような発現構築物で形質転換されうる。
【０１３９】
このような場合に、発現構築物としては、好ましくは誘導性成長特異的または組織特異的条件下で、哺乳類細胞（上の例）で活性なシス作用調節要素が挙げられる。
【０１４０】
細胞型特異的および／または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的［Pinkertら、（1987年）Genes Dev． 1巻：268−277頁］、リンパ系特異的プロモーター［Calameら（1988年）Adv.Immunol.43巻：235−275頁］であるアルブミンのようなプロモーター；特にＴ細胞受容体のプロモーター［Winotoら、（1989年）EMBO J.8巻：729−733頁］および免疫グロブリン；［Banerjiら、（1983年）Cell 33729−740］、ニューロフィラメントプロモーターのような神経単位特異的プロモーター［Byrneら，（1989年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86巻：5473−5477頁］、膵臓特異的プロモーター［Edlunchら、（1985年）Science 230巻：912−916頁］またはミルクホエイプロモーターのような乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願広報番号第２６４，１６６号）が挙げられる。本発明の核酸構築物は、さらに、プロモーター配列に隣接または遠位にあるうるエンハンサーを含むことができ、そしてそこから転写をアップレギュレートするのに機能できる。
【０１４１】
好ましくは、誘導性シス作用調節因子（cis-acting regulationary element)は、ホーミング−移植過程のあいだに幹細胞の環境変化によって調節可能である。
【０１４２】
これらの移動のあいだに、幹細胞は、循環中の血液内の細胞の運動によって発生するせん断力（shear forces）を受ける。いったん移植されると、幹細胞は、もはやそのようなせん断力を受けない。ＨＧＦは、好ましくは、ホーミング段階（移動）のあいだに活性であるので、移動の段階でのみ活性であるシス作用調節要素は、特に利点を有する。１つのこのような調節因子は、Resnickら、PNAS USA90巻：4591−4595頁、１９９３年により記述されたせん断応力応答性因子である。
【０１４３】
間葉幹細胞の遺伝的修飾（genetic modification）は、米国特許第５，５９１，６２５号で検討される。ＨＳＣの遺伝子修飾は、Zheng 2000年 Nat.Biotechnol.18巻：176−180頁およびLotti、2002年、J.Virol.76（8）巻、3996−4007頁で検討される。
【０１４４】
いったんＨＧＦまたはそれの活性部分にさらされると、化学誘引物質受容体の発現レベルが増大し結果として、化学誘引物質に対する感度が増大したことを示す幹細胞は、好ましくは識別され、単離される。そのような段階は、走化性が高い細胞で濃縮されているが、濃縮されていないＨＧＦ処理細胞郡の使用も、本発明に想定される。
【０１４５】
本発明の本態様によるこのような細胞の識別および単離は、当技術分野で周知である多数の細胞学上、生化学上および分子の方法を使用して達成されうる
【０１４６】
たとえば、受容体レベルの分析は、フローサイトメトリーによって達成されうる。このアプローチは、液体培地中において励起源をフローする単一の細胞をスキャンする装置を使用する。その技術は、可視および蛍光発光の測定をもとに、単一の生存（または死滅）細胞を高速、定量、マルチパラメーター分析を提供しうる。この基本的プロトコールでは、細胞結合分子を特異的に結合する蛍光標識抗体およびリガンドによって発せられる蛍光強度の測定を中心とする。本発明の蛍光活性化セルソーターを使用して細胞個体群を単離するために、本発明の幹細胞をＲ＆Ｄ、ミネソタ州エヌイー・ミネアポリス、マッキンレイ・パレス６１４から市販で入手可能な抗ＣＸＣＲ４と接触させる。
【０１４７】
走化性受容体発現のレベルを定量的に評価するための他の細胞学上または生化学的方法としては、それに限定はされないが、標識（たとえば、放射性標識）ケモカイン、ウエスタン・プロット分析、細胞表面ビオチン化および免疫蛍光染色を用いたバインディングアッセイが挙げられる。
【０１４８】
受容体の発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでも測定されうることが予測される。たとえば、ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡは、特異的プローブに対するハイブリダイゼーションにより細胞中で検出されうる。このようなプローブは、クローン化ＤＮＡまたはそれのフラグメント、特にインビトロ転写によって作製されるＲＮＡ、または固相合成により通常に生産されるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。特異的ハイブリダイゼーションに適したプローブを産生および使用する方法は、周知であり、そして当技術分野で使用される。ｍＲＮＡレベルの定量は、増幅反応［たとえば、ＰＣＲ、「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）］を使用して、目的の走化性受容体のｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成するプライマーを使用しても達成されうる。
【０１４９】
多様なコントロールが、ｍＲＮＡ検出アッセイでの精度を改善するために有効に使用されうる。たとえば、サンプルは、関連性のないプローブにハイブリッド形成され、そしてハイブリダイゼーションの前にＲＮＡｓｅＡで処理して、偽ハイブリダイゼーションを見極めうる。
【０１５０】
機能性アッセイは、走化性受容体発現を測定するためにも使用されうる。たとえば、走化性試薬（たとえば、ＳＤＦ−１）の勾配を用いた走化性試薬に向かって膜を貫通して幹細胞の遊走を使用する走化性アッセイは、走化性が増大したことを示す幹細胞を識別および単離するために利用されうる。細胞が、十分なレベルの走化性受容体（たとえば、ＣＸＣＲ４）を発現しない場合、それにより、細胞の大半は、膜上に保持される。しかし、本発明の化学誘引物質受容体の発現が増大されたことにより、細胞は、膜を貫通して遊走し、そして走化性プレート（実施例区分の実施例１を参照）のウエルの底に定着する。
【０１５１】
機能性ホーミングアッセイが、本発明の方法によっても利用されうることが予想される。このようなアッセイは、Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁に記述される。
【０１５２】
免疫蛍光染色は、ＨＧＦへさらすことに続いて細胞の形態学を測定するための機能性アッセイでも使用されうる。実施例１の図１Ａで示されるとおり、抗ＣＸＣＲ４および抗可動化アクチン抗体を用いた同時染色は、ＨＧＦでの処理に続く幹細胞形態学における変化（すなわち、細胞分散およびラメリポジア形成）を解明した。
【０１５３】
化学誘引物質に対する感度が増大したことを示す幹細胞は、広範な臨床用途で使用されうる。
【０１５４】
したがって、本発明の別の態様によって、細胞または組織交換を要求する傷害を治療する方法の提供がある。本発明は、それを必要とする対象に、ここで上に記述されるとおりの幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で予め処理された治療上有効な量の幹細胞を供して、それにより対象における細胞または組織交換を必要とする障害を処理することによって達成される。
【０１５５】
細胞または組織交換を必要とする障害としては、それに限定はされないが、Ｔおよび／またはＢリンパ球で、またはリューマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）のような免疫障害のような種々の免疫欠損が挙げられる。このような免疫欠損は、ウイルス感染、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＨＴＬＶＩＩＩ、重篤な放射線被爆、癌治療、または他の医療上の治療の結果でありうる；血液不全（hematological deficiencies）は、それに限定されないが、重篤な複合免疫不全（severe combined immunodeficiency）（ＳＣＩＤ）症候群［たとえば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）不全およびＸ−リンク（X-linked）ＳＣＩＤ（ＸＳＣＩＤ）］、大理石骨病（osteopetriosis）、再生不良性貧血（aplastic anemia）、ゴシュ病（Gaucher's disease）、サラセミアおよび他の先天的または遺伝子的に決定された造血異常（hematopoietic abnormalities）でありうる；細胞または組織交換を必要とする他の障害としては、肝不全、膵不全、神経学上の障害に関連したもの、骨形成が増大されることを必要とする障害として変形性関節炎（osteoartbritis）および骨粗しょう症（osteoporosis）；骨欠損、結合組織欠損、骨格欠損または軟骨欠損のような結合組織のいずれかに関与する外傷性の、または病理学上の症状のようなものが挙げられる。
【０１５６】
本発明による好ましい個体の対象は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシおよび好ましくはヒトのような哺乳類である。
【０１５７】
本発明の本態様による幹細胞は、好ましくは、治療されるべき対象から得られる。しかし、幹細胞は、同一遺伝子の、同種異系の、そして好ましくなくは異種のドナーからも得られうる。
【０１５８】
同種異系または異種の幹細胞が使用される場合、対象のレシピエントおよび／または細胞は、好ましくは、移植片対宿主および宿主対移植片拒絶を防止するために治療されることが予測される。免疫抑制プロトコールは、当技術分野で周知であり、そしてある種のものは、米国特許第６，４４７，７６５号に開示される。
【０１５９】
本発明の幹細胞は、米国特許第５，９２８，６３８号で記述される肝炎に対する抗ウイルス剤のようないずれかの治療的遺伝子を発現するように遺伝子で修飾されうる。
【０１６０】
幹細胞は、対象のレシピエントに移植される。これは、一般に、当技術分野で周知な方法を使用して達成され、そして通常には、当業者に周知の医療のツールを使用して、処理された幹細胞（treated stem cells）を対象に注入または導入することを含む（米国特許第６，４４７，７６５号、第６，３８３，４８１号、第６，１４３，２９２号および第６，３２６，１９８号）。
【０１６１】
たとえば、本発明の幹細胞を導入することは、静脈内または動脈内投与、腹腔内投与などを含めた血管内投与を介して達成されうる。細胞は、滅菌シリンジまたは他の滅菌トランスファーメカニズムを使用して、５０モル・フェンウォール注入バック（50 mol Fenwall infusion bag）に注入されうる。その後、細胞は、たとえば１５分間をかけてＩＶ投与を介して、患者にフリーフローＩＶラインに直ぐに注入されうる。ある種の実施形態では、緩衝液または塩のような別の試薬も同様に添加しうる。投与のための組成物は、適切な滅菌性および安定性を伴う標準的な方法によって、配合、生産および保存されなければならない。
【０１６２】
幹細胞投与量は、処方された使用法によって決定されうる。一般に、非経口投与の場合には、レシピエントの体重の１キログラム当たり約０．０１から約５百万個までの細胞を投与するのが通例である。使用される細胞の数は、レシピエントの体重および症状、投与の回数または頻度、そして当業者に知られる他の変数に依存する。
【０１６３】
細胞を対象に投与した後、治療の効果は、所望であれば、当技術分野で知られるとおりに評価されうる。処置は、必要な場合、または要求される場合、繰り返されうる。
【０１６４】
本発明は、単独で投与されるか、またはＳＣＦと同時投与されるべき、治療上有効な量のＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物も提供する。さらに詳細には、本発明は、細胞または組織交換を必要とする傷害を処置するための医薬組成物を提供する。
【０１６５】
本発明の別の目的、利点、または新規特性は、限定されることを意図されることなく以下の実施例の試験により当業者に明らかになろう。さらに、ここに上で概説されるとおり、そして下の請求項区分で請求されるとおり本発明の種々の実施形態および態様の各々は、以下の実施例における実験上のサポートを見出す。
【実施例】
【０１６６】
ここで、以下の実施例の参照を行い、そしてそれは、上の説明と一緒に、限定なしの形態で本発明を示す。
【０１６７】
一般に、ここに使用される専門用語および本発明で利用される実験室手段としては、分子、生化学、微生物学上および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献で十分に説明される。たとえば、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Sambrookら（1989年）；「Current Protocols in Molecular Biology」、I-III巻、Ausubel,R.M.編（1994年）；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、メリーランド州ボルチモア（1989年）；Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1988年）；Watsonら、「Recombinant DNA」、サイエンティフィック・アメリカン・ブックス、ニューヨーク；Birrenら（編）「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」、1−4巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（1998年）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号で説明されるとおりの方法論；「Cell Biology:A Laboratory Handbook」、I−III巻、Cellis，J.E.編（1994年）；「Current Protocols in Immunology」、I−III巻 Coligan J.E.編（1994年）；Stitesら（編）、「Basic and Clinical Immunology」（8版）、アップルトン・アンド・レンジ、コネチカット州ノーウォーク（1994年）；MishellおよびShiigi（編）、「Selected Methods in Cellular Immunology」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・シーオー．、ニューヨーク（1980年を参照；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で集約的に記述され、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号を参照；「Oligonucleotide Synthesis」、Gait,M.J.編（1984年）；「Nucleic Acid Hybridization」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編（1985年）；「Transcription and Translation」Hames,B.D.およびHiggins S.J.編（1984年）;「Animal Cell Culture」、Freshney,R.I.編（1986年ｑ;「Immobilized Cells and Enzymes」、IRL Press、（1986年）;「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal,B.、（1984年）および「Methods in Enzymology」、1巻-317、アカデミック・プレス；「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（1990年）;Marshakら、「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」、CSHLプレス（1996年）を参照;その全ては、ここで十分に説明されるように参照により組込まれる。他の一般的文献は、この文書に渡って供される。そこにある手段は、当技術分野で周知であり、そして読み手の便宜を与えると考えられる。そこに含まれる全ての情報は、参照してここに組込まれる。
【０１６８】
実施例１
ＨＧＦを介した運動性およびＣＸＣＲ４が増大されることは、損傷を受けた肝臓へのヒトＣＤ３４+前駆細胞の遊走を仲介する。
【０１６９】
ＨＧＦが、損傷を受けた肝臓でアップレギュレートされること［Armbrust（2002年）Liver 22巻：486−494頁］、そしてヒトＨＧＦの添加は、移植された免疫不全キメラマウスにおけるＣＣｌ4で損傷を受けた肝臓でのヒトアルブミン産生細胞のレベルを増大させること［Wang（2003年）Blood（印刷に先立つ電子公表）］は、周知である。したがって、ＨＧＦは、損傷を受けた肝臓へのヒトＣＤ３４+細胞遊走および補充の調節にも関与することが仮定された。
【０１７０】
ヒト細胞 − ワインズマン研究所（Weinzmann Institute）の人間倫理委員会により承認された手段によって承諾を得た後、臍帯血および成人可動化末梢血（ＭＰＢ）細胞を得た。ＣＤ３４+細胞の濃縮は、先に記述［Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁］されるとおりマグネットビーズでの分離を使用して得られた。ＣＸＣＲ４の発現は、精製抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン１２Ｇ５、アール・アンド・ディー、ミネソタ州ミネアポリス）および二次としてヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣの二次Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ジャクソン、ペンシルベニア州ウエスト・グローブ）を用いて、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１７１】
肝臓損傷 − マウス腹腔内（ＩＰ）にＣＣｌ4を１０、１５または３０μｌ／マウスあたり注入し、そして肝臓サンプルを、示されるとおり注入し続いて数時間、または１−２日以内に採取した。
【０１７２】
免疫細胞化学 − 臍帯血のＣＤ３４+濃縮細胞を、サイトカインの非存在下、またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック（PeproTech））または両方のサイトカインの存在下で、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中で、４０時間インキュベートした。細胞を、フィブロネクチン（１０μｇ／ｃｍ2、カルバイオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ（San Diego,CA））でコートしたカバーガラススリップ（２時間、３７℃、５％ＣＯ２）で平板培養し、ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドで２５分間固定させ、ＰＢＳ中０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中で５分間浸透させた。細胞を、ウサギ抗ヒトＣＸＣＲ４ポリクローナルＡｂ（ケミコン（Chemicon）、カリフォルニア州テメクラ（Temecula,CA））で間接的に免疫標識し、ＰＢＳで頻繁に洗浄し、そしてファロイジン−ＴＲＩＴＣ（シグマ（Sigma）、イスラエル国レホボト（Rehovot,IL））およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）、オレゴン州ユージーン（Eugene,OR））とインキュベートした。ＰＢＳで頻繁に洗浄した後に、サンプルをエルバトール（Elvanol）（Mowiol４−８８；ヘキスト（Hoechst）、ドイツ国フランクフルト（Frankfurt，Germany））にマウントした；全ての手順は、室温で、加湿雰囲気下で行われた。免疫蛍光を観察し、そして１００×倍率で、バイオラッド（BioRad）の共焦点顕微鏡を使用して分析した。
【０１７３】
走化性 − ＳＤＦ−１の勾配に向かってのＣＤ３４+濃縮細胞の遊走は、記述されるとおりにトランスウエルアッセイによって測定した[Ｐｅｌｅｄ(１９９９年)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻：８４５−８４８頁]。ＣＤ３４+細胞を、１２５ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１に向かう遊走の前に、ヒトサイトカインの非存在下、またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、ミネソタ州ミネアポリス、マッキンレイ・プレイス・エヌイー ６１４（614 McKinley Place NE Minneapolis, MN））、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック（PeproTech）、ニュージャージー州ロッキーヒル（Rocky Hill,NJ））、または両方のサイトカインの存在下、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中で、４０時間インキュベートした。
【０１７４】
結果
臍帯血のＣＤ３４+濃縮細胞を、サイトカインの非存在下、またはＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１依存性遊走［Peled（1999年）Science 283巻:845−848頁］を誘導することが知られている、幹細胞因子、HGFまたは両方のサイトカインの組合せの存在下において、４０時間培養した。その後細胞を、抗ＣＸＣＲ４および／または抗重合化アクチンとインキュベートし、ＰＢＳで頻繁に洗浄し、そしてファロイジン−ＴＲＩＴＣおよびヤギ抗ウサギAlexa４８８とインキュベートした。サイトカインの非存在で培養されたＣＤ３４+細胞は、丸い形態を維持する一方で、ＳＣＦで培養した細胞は広がっており、そして分極していた。興味深くは、ＨＧＦは単独で、細胞表面からアクチンをベースとする突起部の形成を誘導し、そしてＳＣＦとＨＧＦの組合せは、ＳＣＦまたはＨＧＦ単独で観察されるもの（データは示されず）と異なる表現型であるラメリポジウム形成（lamellipodia formation）を促進した。最も重要なことに、これらの細胞骨格再編成は、ＣＸＣＲ４アップレギュレーション（図１Ａ）およびＳＤＦ−１に対し機能的に増強された走化性応答（図１Ｂ）と関連があった。ＨＧＦは、ヒト前駆体単独の走化性を誘導しなかった（データは示されず）。しかし、ＨＧＦは、ヒト前駆体の運動性を増大させ、そしてＳＣＦと相乗作用して、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１で誘導される方向性遊走（directional migration）の両方を可能とした。
【０１７５】
これらの予想外の所見は、損傷を受けた肝臓ストレス信号に応答したヒトＣＤ３４+細胞の運動性および方向性遊走を促進する上でのＨＧＦにおける重要な役割を示唆する。
【０１７６】
照射を受けたマウスの骨髄および肝臓でのＨＧＦｍＲＮＡの発現を増大した。
【０１７７】
実施例２
照射は、肝臓および骨髄でのＨＧＦをアップレギュレートする
移植前に使用され、そしてＳＤＦ−１のような様々なサイトカインをアップレギュレートすることが知られている照射が、肝臓そして骨髄でのＨＧＦのアップレギュレーションを誘導しうるかを探索した。
【０１７８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、致死量近くまで照射した（３７５ｃＧｙ）。非照射マウスから得たサンプルと一緒に、２４および４８時間後に採取された肝臓および骨髄サンプルを、Ｔｒｙ試薬（Tryreagent）（ＭＲＣ）でホモジナイズした。ｍＲＮＡを抽出し、そして特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにかけた。図２は、ＨＧＦの発現が、骨髄および肝臓両方において照射により増大されることを示す。
【０１７９】
実施例３
ＨＧＦはＳＣＦと相乗作用して、臍帯血のＣＤ３４＋細胞の再構築能力を増大させる。
【０１８０】
実施例１で示されるとおり、ＨＧＦは、ヒト前駆体の運動性を増大させ、そしてＳＣＦと相乗作用して、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１で誘導される方向性遊走の両方を可能とした。
【０１８１】
ＨＧＦが、ＳＣＦと相乗作用して、造血前駆体の再構築能力を増大させうるか探査するために、別の実験を行った。したがって、ヒト臍帯血のＣＤ３４＋細胞を、ＳＣＦ、ＨＧＦまたは両方の組合せの存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、照射し（３７５ｃＧｙ）、そして培養細胞で移植した。１ヶ月後、移植されたマウスの骨髄は、ヒト移植細胞のレベルを調査した。
【０１８２】
臍帯血のＣＤ３４＋細胞を、３６時間、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ中のＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（群当たり３匹）を、照射し（３７５ｃＧｙ）、そして２×１０５細胞／マウスに由来する培養細胞で、２４時間後移植した。１ヶ月後、抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ ＡｂおよびＦＡＣＳカリブル（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用することによって、移植されたマウスの骨髄において、ヒト移植細胞のレベルを調査した。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】
表２での結果は、ＨＧＦで処理された細胞のみが、コントロール細胞に類似して、そしてＳＣＦで前処理された細胞より明らかに少ない範囲で、骨髄を再構築することを示す。対照的に、ＳＣＦおよびＨＧＦで同時刺激された細胞は、ＨＧＦまたはＳＣＦ単独で処理された細胞と比較して再構築能力が増大されたことを示す。
【０１８５】
実施例４
ＨＧＦは、ＣＣｌ４損傷に続いて、ＳＤＦ−１に向かって遊走する骨髄細胞の能力、および前駆細胞可動化の速度を増大させる。
【０１８６】
実施例１で示されるとおり、幹細胞前駆体へのエキソビボＨＧＦ投与は、細胞表面におけるＣＸＣＲ４発現を誘導し、そしてＳＤＦ−１への細胞の遊走を増強する。
【０１８７】
臓器損傷に続く再構築におけるＨＧＦのインビボ投与の効果を知るために、以下の実験を行った。
【０１８８】
その目的のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４単独で（損傷を誘導するために）、ＣＣｌ４続いてＨＧＦの組合せで、処理するか、または未処理（コントロール）のままにした。マウスを屠殺し、骨髄細胞を抽出し、そしてＳＤＦ−１へのこのような骨髄細胞の遊走を、インビトロでモニターした（図３）。
【０１８９】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４単独の単回注射（１０ｍｌ ＣＣｌ４）で、またはＣＣｌ４、続いて２日後に始まるＨＧＦの４回の連続毎日注射（１．５ｍｇ／マウス、ＣＣｌ４＋ＨＧＦ）で処理した。これらの処理マウスに由来する骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導性遊走を、非処理マウス（ｃｔｒｌ）から、またはＧ−ＳＣＦ（３００ｍｇ／Ｋｇ、５日連続）で処理したマウスに由来する骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導性遊走と比較した。
【０１９０】
ＣＣｌ４処理マウスから単離された骨髄細胞は、コントロールの非処理マウスから得られる骨髄細胞で得られる遊走のレベルと類似のレベルのＳＤＦ−１依存性遊走を示した。対照的に、Ｇ−ＳＣＦ処理マウスから単離された骨髄細胞は、コントロールの非処理マウスから得られる骨髄で観察される遊走のレベルと比較して、増強されたレベルのＳＤＦ−１依存性遊走を示した。予想外にも、ＨＧＦおよびＣＣｌ４での混合処理を受けるマウスから単離された骨髄細胞は、ＣＣｌ４処理または未処理マウスから得られる骨髄細胞で観察された遊走のレベルに比較して、ＳＤＦ−１依存性遊走のレベルが増強されたことを示した。
【０１９１】
ＨＧＦ／ＣＣｌ４処理されたマウスで観察される骨髄細胞の遊走能力における増大の点で、ＨＧＦ／ＣＣｌ４処理されたマウスが、その結果として骨髄可動化、血流中の原種前駆体細胞（progenitor precursor cells）のレベルを増大しうるであろうと仮説を立てた。
【０１９２】
この仮説を検証するために、循環中の原種前駆体の数が、ＣＣｌ４処理で、ＣＣｌ４およびＨＧＦ処理対未処理マウスでモニターされた（図３）。
【０１９３】
得られた結果は、ＣＣｌ４処理による損傷または炎症の誘導が、血液循環での原種前駆体の数を増大させたことを示した。この結果は、ＣＣｌ４処理による損傷または炎症の誘導が、骨髄から血液までであり、可動化についてのポジティブコントロールより少ない程度で、原種前駆体の可動化を促進することを示唆する（Ｇ−ＳＣＦを参照）。しかし、ＨＧＦ投与との組合せでのＣＣｌ４処理により誘導される炎症または損傷は、血液循環での原種前駆体のレベルにおけるさらなる増大を誘導した。
【０１９４】
得られた結果は、細胞血液循環における前駆体レベルが増大したことにより、損傷を受けた臓器へ自家再構築（self repopulation)および／または自家移植（self engraftment)を促進するために、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象へのＨＧＦの投与を示唆する。
【０１９５】
明瞭さのため、別個の実施形態の内容で記述される本発明の特定の特徴は、単独の実施形態での組合わせでも提供されうることが予測される。反対に、簡潔さのため、単独の実施形態の内容で記述される本発明の種々の特徴は、別個に、またはいずれかの適切な従属の組合わせでも供されうる。
【０１９６】
本発明は、それの特定の実施形態と関連して記述されたが、多くの代替物、修飾および変異は、当業者に明らかであることは明白である。したがって、付随の請求項の概念および広範な範囲に入る全てのこのような代替物、修飾および変異を受け入れることが意図される。本明細書で明記される全ての出版物、特許および特許出願は、個別の出版物、特許または特許出願が、参照してここに組込まれることが特定に、そして個々に示される場合に、同じ範囲までそれらの全体に参照して明細書に組込まれる。さらに、本出願でのいずれの参照文献の引用および同一性は、かかる参照文献が、本発明に先行技術として利用可能であるという認可と見なされるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１Ａ】図１Ａは、フローサイトメトリーを使用して測定された場合の臍帯血の ＣＤ３４+細胞中のＣＸＣＲ４のサイトカイン誘導発現を描くグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、トランスウエル遊走アッセイを使用して測定された場合のＨＧＦ、ＳＣＦまたはそれの組合せの存在下で、ＣＤ３４+細胞のＳＤＦ−１を介した方向性遊走（SDF-1 mediated directed migration）を描く棒グラフである。データは、遊走の百分率を表す。（ａ）文字は、ＳＤＦ−１の不在下で自律遊走を示す。
【図２】図２は、照射を受けたマウスの骨髄および肝臓におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現が増大したことを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、致死的に照射（３７５ｃＧｙ）した。非照射マウスから得られたサンプルと一緒に２４時間および４８時間後に採取した肝臓および骨髄サンプルを、Ｔｒｙ試薬（Tryreagent）（ＭＲＣ）中でホモジナイズさせた。ｍＲＮＡを、標準プロトコールを使用して抽出させた。ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲにかけた。
【図３】図３は、ＨＧＦが、ＣＣｌ４損傷に続いてＳＤＦ−１に向かって遊走する骨髄細胞の能力、および前駆細胞可動化の速度を増大することを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４（１０ｍｌ、ＣＣｌ４）単独の単回注入、またはＣＣｌ４、続いて２日後に始まるＨＧＦの４回継続の毎日注入（１．５ｍｇ／マウス、ＣＣｌ４＋ＨＧＦ）で処理した。これらのマウスの骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導遊走、および血流中の前駆体のレベルを、非処理マウス（コントロール）と、またはＧ−ＳＣＦ（３００ｍｇ／Ｋｇ、５日間連続）で処理したマウスと比較した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的誘引物質（chemoattractant）に対する増大された感受性を示す幹細胞、さらに詳細には、幹細胞移植を含む臨床用途でのようなそれらの産生および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常な臓器機能により引き起こされる障害の臨床的治療では、典型的にはこのような異常な臓器機能を補正するか、または機能不全の臓器組織を治療するために設計される薬剤を使用する。しかし、ある種の場合には、薬学的治療は、臓器機能がしばしば複雑であり、および／または、完全には理解されていないので授けられ得ない。
【０００３】
このような場合には、唯一の生存可能な選択肢は、非機能的臓器の外科的置換であり、そしてそれは、現在、急性および慢性の両方の肝臓および腎臓不全の治療のために、並びに、癌および特定の先天性異常の治療のために広く使用されている。しかし、提供者の臓器の必要性は、その供給をはるかに超過している。臓器不足は、移植用の成人臓器を分割などの新たな外科的技術を生じた。十分に素晴らしい結果にもかかわらず、このような技術は、なお、提供者の組織の不足に悩んでいる。
【０００４】
生存可能なドナー組織の不足は、幹細胞の柔軟性、すなわち、新しい場所において幹細胞が配置されるその臓器には通常は存在しない細胞種を生じる能力に依存する幹細胞交換療法の出現をもたらした。
【０００５】
幹細胞は、一般に、それらの起源、特に成人、胚性または新生児の起源によって分類される。胚盤胞の内細胞塊に由来する胚性幹細胞は、多能性であり、そして全３つの胚葉に見出される細胞になり得る。長年信じられてきたにもかかわらず、成人の幹細胞は、以前に考えられていたようには、系統的に限定されない。特に、造血および神経系の幹細胞は、系統的境界を越えて最も多様性があるように見える。たとえば、最近の報告は、ヒト起源の造血幹細胞（ＨＳＣ）が、肝性の（hepatic）潜在性を有することを示唆している。性別の不一致の提供者からの肝臓または骨髄移植の研究では、レシピエントにおいて骨髄由来の造血細胞を確認した［Alison（2000年）Nature 406巻：257頁、Theise（2000年）Hepatology 32巻：11-16頁、Korbling（2002年）N Engl J Med 346巻：738−746頁］。マウスおよびラットＨＳＣも、照射または損傷を受けた成体肝臓に移動し、そして肝細胞に分化することも明らかになった［Petersen（1999年）、Science 284巻：1168−1170頁、Theise（2000年）Hepatology 31巻：235−240頁、Lagasse（2000年）Nat Med 6巻：1229−1234頁］。さらに、マウス造血幹細胞の単回移植では、照射を受けたレシピエントの肝臓において、肝上皮細胞の免疫組織化学的および形態学的特性を示す低い含有率の移植細胞を有するＨＳＣ由来の細胞を検出した［Krause（2001年）、Cell 105巻：369−377頁］。
【０００６】
造血幹細胞の循環を誘導する機構は、幹細胞移植の成功がレシピエント標的組織に対する移植細胞の十分な標的化（ホーミングとも称される）によるので、臨床的に重要である［Mazoおよびvon Adrian（1999年）、Journal of leukocyte Biology 66巻、25−32頁］。あらゆる他の臓器の移植での場合と同様に、骨髄移植は浸潤的手術を必要としないが、むしろ単純な静脈灌流により達成される可能性があるのは、移植細胞のこのホーミングによる。
【０００７】
ＨＳＣのホーミングは、循環中のＨＳＣに、骨髄上皮細胞を識別させ、それに付着させ、そしてそれに渡って移動させる一連の分子相互作用として定義され、そして骨髄の特徴的な造血促進微環境（hematopoiesis-promoting microenvironment）でのＨＳＣの蓄積を生じうる。前駆細胞のホーミングは、多段階現象として考えられうる［Voermans（2001年）、J.Hematother.Stem Cell Res．10巻：725−738頁、Lapidot（2002年）、Leukemia 16巻：1992−2003頁］。骨髄に出現するＨＳＣは、骨髄内皮の管腔表面と最初に相互作用する必要がある。この相互作用は、ＨＳＣが微小血管（microvasculature）に入った後数秒以内に起こるはずであり、そして粘着細胞が、流動中の血液によって発揮されるずれ応力（shear force）に抵抗することを可能にするのに十分な物理的強度を供する。付着したＨＳＣは、その後、内皮層を通過して、造血区分に入るに違いない。溢出した後にＨＳＣは、系統特異的ＨＳＣ分化、増殖および成熟に加えて、ストローマ細胞由来のサイトカインおよび他の成長シグナルに関与する過程である、ジャクスタポジションが自己更新過程により未熟なプールの維持をサポートする特化されたストローマ細胞に出会う。
【０００８】
幹細胞ホーミングに関与するほんの限定された数の因子が、現在までに知られている；これらには、ｃ−キット（c-kit）用のリガンド、幹細胞因子が含まれ、そしてそれは、基質に対するＨＳＣの接着での主要な役割を果たすことが示された［Peled（1999年）Science 283巻：845−848頁］；さらにインテグリン相互作用（たとえば、β１−インテグリン）が含まれ、そしてそれは、胎児の肝臓へのＨＳＣの遊走に重要であることが示された［Zanjani（1999年）Blood94巻：2515−2522頁］。
【０００９】
ＨＳＣホーミングに重要であると見なされる１つの重要な分子相互作用は、ケモカインであるストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）およびそれの同種の受容体ＣＸＣＲ４によるものである。
【００１０】
ＳＤＦ−１は、今までに知られているヒト［Aiuti（1997年）J.Exp.Med.185巻：111−120頁］およびマウス［Wright（2002年）J.Exp.Med.195巻：１145−1154頁］両方の起源の造血幹細胞に対する唯一の強力な化学誘引物質である。ＳＤＦ−１は、たとえば肝臓［Shirozu（1995年）Genomics 28巻：495−500頁；Nagasawa（1996年）Nature 382巻：635−638頁；Goddard（2001年）Transplantation 72巻：1957−1967頁］など、発生過程［McGrath（1999年）Dev.Biol.213巻：442−456頁］から成人期［Nagasawa（1994年）Proc Natl Acad Sci USA 91巻：2305−2309頁；Imai（1999年）Br J Haematol 106巻：905−911頁；Pablos（1999年）Am J Pathol 155巻：1577−1586頁］にわたって幅広く多数の組織で広く発現されている。これまでに本発明者らは、ソートしたヒトＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低幹細胞を、照射を受けた免疫欠損種ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍヌルマウスの尾部静脈に、移植したことによって、骨髄へのホーミングおよび再構築（repopulation）が、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用に依存することを示せた［Peled（1999年）Science 283巻：845−848頁；Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁］。
【００１１】
より最近、本発明者らは、マウスおよびヒト幹細胞のＧ−ＣＳＦ誘導可動化（G-CSF-induced mobilization）におけるこれらの相互作用についての役割も確立した［Petit（2002年）Nat Immunol 3巻：687−694頁］。
【００１２】
幹細胞療法の用途をいっそう拡張していくことの観点から、細胞置換療法（cell replacement therapy）の効率および成功率を改善するために、幹細胞ホーミングおよび標的再構築の背後の機構をさらに解明することは非常に望ましい。
【００１３】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、成熟肝細胞に対する強力な分裂促進因子として最初に発見されており、プラスミノーゲンと構造相同性を有するクリングル含有ポリペプチド成長因子（kringle-containing polypeptide growth factor）である［Nakamura（1984年）Biochem.Biophys.Res.Commun.122巻：1450頁；Nakamura（1987年）FEBS Lett 224巻：311頁；Gohda（1988年）J.Clin.Invest.81巻：414頁；Zanegar Cancer Res.49巻：3314頁；Nakamura（1989年）Nature 342巻：440頁］。
【００１４】
ＨＧＦは、様々な種類の細胞において、細胞成長、細胞運動性および形態形成を調節する間葉由来の多面因子（pleiotropic factor）である［Matsumoto（1993年）Goldberg ID,Rosen EM（編）：Hepatocyte Growth Factor-Scatter Factor（HG-SF） and C-met Receptor,スイス国バーゼル、ビルクハウザー・ベルラグ、1993年、225頁；Gherardi（1990年）Nature 346巻：228頁；Weidner（1990年）J.Cell Biol.111巻：2097頁；Higasho（1990年）Biochem.Biophys.Res.Commun.170巻：397頁；Rubin（1991年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88巻：415頁］。Ｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子（C-met proto-oncogene）は、今までに唯一知られている天然のＨＧＦ受容体である。ＨＧＦは、様々な組織および臓器の器官形成、臓器の再生および成長、腫瘍細胞の浸潤および転移、に起因する上皮−間葉相互作用の液体メディエーター（humoral mediator）と考えられている［Matzumoto（1996年）J.Biochem.119巻：591頁］。造血系においてＨＧＦは、造血前駆細胞の成長を促進する［Kmiecik（1992年）Blood 80巻：2454頁；Nishino（1995年）Blood 85巻：3093頁；Mizuno（1993年）Biochem.Biophys.Res.Commun.194巻：178頁；Galimi（1994年）J.Cell Biol. 127巻：1743頁］。興味深いことに、ラットの肝臓を四塩化炭素で刺激した後に、ＨＧＦをインサイチューハイブリダイゼーション（in-situ hybridization）で測定したところ、急性肝障害がＨＧＦの発現を誘発することが報告された［CCl4、Armbrust（2002年）Liver 22巻：486−494頁］。
【００１５】
造血系において考えられる役割が示唆されてはいるが、ＨＧＦと造血細胞との相互作用に関する情報は不完全である。ＨＧＦは、ヒト骨髄ストローマ細胞により構造的に（constitutively）産生されることが発見された［Takai（1997年）Blood 89巻：1560−1565頁］。最近、骨髄（ＢＭ）または胎児肝臓から濃縮された、マウスミエロイド前駆体細胞株およびマウス造血前駆細胞（ＨＰＣ）の増殖においてＨＧＦがＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３と相乗作用をすることが発見された［Kmiecik（1992年）Blood 80巻：2454−2457頁；Mizuno（1993年）上記；Nishino（1995年）Blood 85巻：3093−3100頁］。さらには、ヒトＨＰＣにおける他の成長因子とＨＧＦとの相乗的な増殖効果が観察され、そしてＣＤ３４＋ＨＰＣにおけるＣ−ｍｅｔの発現もまた検出された［Galami（1994年）J.Cell Biol.127巻：1743−1754頁；Goff（1996年）Stem Cells 14巻：592−602頁；Weimer（1998年）Exp.Hematol.26巻：885−894頁］。
【００１６】
本発明を実施化しつつ、本発明者らは、ＨＧＦが、ＣＸＣＲ４発現をアップレギュレート（upregulate)でき、そしてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４依存的幹細胞運動性および標的組織への遊走を促進することを解明した。これらの所見は、標的組織への幹細胞補充を刺激する新規アプローチを供し、そしてそれだけで、様々な細胞および組織交換プロトコールで使用されうる。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、幹細胞を、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベル（level）を増大させて、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすことを包含する、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、それを必要とする対象（subject）に、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それによりその対象における細胞または組織交換を必要とする障害を処理する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で予備処理した幹細胞の治療上有効な量を供することを包含する、細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、それを必要とする対象に、該幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それにより細胞または組織交換を必要とする障害を処理する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の治療上有効な量を供することを包含する、細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、標的組織に対する幹細胞のホーミングを増大させるための医薬品の製造のためのＨＧＦまたはそれの活性部分の用途が提供される。
【００２１】
（ａ）幹細胞を採取（collect）すること、
（ｂ）該幹細胞を、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすこと、および
（ｃ）所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞を単離して、それにより、移植に適した幹細胞を産生させることを包含するものである、移植に適した幹細胞を産生させる方法が提供される。
【００２２】
下に記述される本発明の好ましい実施態様での別の特徴によれば、該幹細胞を採取することは、（ｉ）幹細胞可動化手段（stem cell mobilization procedure）；および／または（ii）外科的手段によって達成される。
【００２３】
記述される好ましい実施態様でのさらに別の特徴によれば、該所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞を単離することは、ＦＡＣＳによって達成される。
【００２４】
記述される好ましい実施態様でのさらに別の特徴によれば、その方法は、さらに、段階（ｃ）に続いて所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを示す幹細胞のホーミング能力を決定することを包含する。
【００２５】
本発明のさらに追加の態様によって、ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする第一のポリヌクレオチド配列、および細胞中のポリヌクレオチドの発現を指示する誘導性シス作用調節因子（cis-acting regulationary element)を包含する核酸構築物が提供される。
【００２６】
記述される好ましい実施態様におけるさらに別の特徴によれば、誘導性シス作用調節因子は、ずれ応力活性化因子（shear stress activation element）である。
【００２７】
記述される好ましい実施態様におけるさらに別の特徴によれば、核酸構築物は、さらに、第一のポリヌクレオチド配列に翻訳で融合される(translationally fused）第二のポリヌクレオチド配列を包含し、そしてその第二のポリヌクレオチド配列は、細胞の中から外へのＨＧＦまたはそれの活性部分の分泌を指示する能力のある単独ペプチドをコードする。
【００２８】
本発明のさらに追加の態様によれば、核酸構築物を包含する真核生物の細胞が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するために形質転換した幹細胞を包含する細胞株の提供がある。
【００３０】
本発明のさらに別の態様によれば、（ｉ）幹細胞；および（ii）該幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分のそれぞれを発現するフィーダー細胞を包含する細胞培養物（cell culture）の提供がある。
【００３１】
本発明のさらに別の態様によれば、さらに、幹細胞の内因性ＨＧＦまたはそれの活性部分の発現または活性をアップレギュレートして、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることを包含するものである、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する、幹細胞運動性を増大させる方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様によれば、少なくとも１つの化学誘引物質受容体がＣＸＣＲ４である。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様によれば、その方法は、さらに、成長因子および／またはサイトカインに幹細胞をさらすことを包含する。
【００３５】
本発明のさらに別の実施態様によれば、該成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様によれば、幹細胞は、造血幹細胞である。
【００３７】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、ＣＤ３４+造血幹細胞である。
【００３８】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である。
【００３９】
本発明のさらに別の実施態様によれば、造血幹細胞は、間葉幹細胞である。
【００４０】
本発明のさらに別の実施態様によれば、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、（ｉ）幹細胞中のＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または（ii）ＨＧＦまたはそれの該活性部分と、幹細胞を接触させることによって達成される。
【００４１】
本発明のさらに別の実施態様によれば、その方法は、さらに、ＨＧＦ−受容体に幹細胞をさらすことを包含する。
【００４２】
本発明のさらに別の実施態様によれば、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象に、ＨＧＦまたはそれの活性部分単独、またはＳＣＦと一緒に投与すること包含する、損傷臓器に対する自家前駆細胞（self progenitor cells）の自家再増殖（self repopulation）および／または自家移植（self engraftment）を促進する方法の提供がある。
【００４３】
本発明のさらに別の実施態様によれば、幹細胞およびＳＣＦの運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物を提供し、そしてさらに詳細には、細胞または組織交換を必要とする障害を治療するための医薬組成物を提供する。
【００４４】
本発明は、化学誘引物質に対する感受性が増大したことを示す幹細胞、およびそれを産出および使用する方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。
【００４５】
別段の規定のない限り、ここに使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を示す。ここに記述されるものに類似か、または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験に使用されうるが、適切な方法および材料は以下に記述される。論争の場合には、定義を含めた特許明細書がコントロールするであろう。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみであって、限定することが意図されない。多数の指示。
【００４６】
本発明を、添付の図面を参照して、実施例としてのみによって記述する。ここで、詳細に図面に関して特に、示される詳細は、実施例により、そして本発明の好ましい実施形態の例示の検討の目的のみであり、そして本発明の原理および概念上の実施態様の最も有用で十分に理解される説明を提供する根拠に現れると強調される。これに関して、本発明を基本的に理解するのに必要であるよりさらに詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされておらず、図面と一緒になった説明は、本発明のいくつかの形態がどのように実際に実現されうるかを当業者に明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、化学誘引物質に対して増大した感受性を示す幹細胞、およびそれを産生および使用する方法に関する。特に、本発明は、たとえば慢性または急性肝臓損傷を治療するような細胞または組織交換を必要とする障害を治療することを可能にする。
【００４８】
本発明の原理および操作は、図面および付随の説明を参照してよりよく理解されうる。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、以下の記述で開示されるか、または実施例によって具体化された詳細にその用途が限定されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態を含むことができ、または種々の方法で実施または実行されうる。さらに、ここに使用される語法および用語は、説明の目的のためであって、限定すると見なされるべきでないことを理解されるべきである。
【００５０】
細胞療法の用途は急速に成長しており、そして種々の障害の治療において次第に重要な治療様式になりつつある。造血幹細胞（ＨＳＣ）（たとえば、骨髄から、臍帯血（umbilical cord blood ）または可動化末梢血（mobilized peripheral blood））移植は、日常的に実施される保証償還細胞療法（insurance-reimbursed cellular therapy）の１つの例である。しかし、癌および感染性疾患についての免疫療法、軟骨欠損のための軟骨細胞療法、神経変性疾患のための神経細胞療法、および膨大な用途のための幹細胞療法を含めた多くの他の細胞療法が、同様に開発されつつある［Forbes（2002年）Clinical Science 103巻：355−369頁］。
【００５１】
幹細胞療法に関連した問題の１つは、標的組織における細胞の長期間にわたる首尾よい移植を達成することの困難さである。最近、首尾よく移植された患者でも、非常に低いレベルの幹細胞および望ましい表現型を示す細胞を産生する未熟な前駆体（immature progenitors）を示している。
【００５２】
したがって、幹細胞移植の成功は、静脈内注入した幹細胞が標的組織（たとえば、骨髄）に留まる幹細胞の能力に依存するのであり、そしてこのプロセスは、ホーミングと称される。ホーミングは多段階プロセスであり、骨髄洞様毛細血管の内皮細胞への幹細胞の接着、続いて化学誘引物質により導かれるトランス内皮遊走（transendothelial migration）により構成され、そして最後に、増殖および分化が起こる骨髄空間管外（extravascular bone marrow spaces）に定着することからなると仮定されている。
【００５３】
研究により、接着分子、サイトカインおよび成長因子を含めた膨大な因子が、ホーミング過程に関与することが示された。１９９７年に、研究は、ＣＤ３４+細胞の遊走（migration）が、化学誘引物質ＳＤＦ−１によって支配されることを明らかにした。継続的研究は、インビトロにおいて、ＳＤＦ−１がＨＳＣ上のインテグリンを活性化させ、ＨＳＣのトランス内皮遊走を誘発することを示した。ＳＤＦ−１の受容体は、Ｇタンパク質に連動した受容体（G-protein coupled receptor）であり、ＣＸＣＲ−４と称される。ＳＤＦ−１またはＣＸＣＲ−４ノックアウトマウスにおいて造血前駆体が、胎児発生のあいだに骨髄に移行しないことは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ−４相互作用が、幹細胞遊走において重要な役割を担うことを示唆する［総説としては、Voermans（2001年）J.Hematother.Stem Cell Res.10巻：725−738頁、Lapidot（2002年）Leukemia 16巻：1992−2003頁を参照］。
【００５４】
ホーミングプロセスの予備段階の理解にもかかわらず、幹細胞の遊走の調節についての情報は、いまだに、不完全および散漫である。幹細胞移植の効率の向上は、標的組織にホーミングする幹細胞の能力を調節することによって達成されうるであろうことは、十分に理解される。
【００５５】
本発明を実施化しつつ、本発明者らは、ＨＧＦが、ＣＸＣＲ４発現をアップレギュレートし、そして損傷を受けた臓器組織へのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４を介した幹細胞運動性および遊走を促進することを明らかにした。
【００５６】
以下に説明され、そして続く実施例部分で示されるとおり、本発明者らは、肝臓損傷が、細胞骨格再編を誘導するＨＧＦをアップレギュレートし、運動性を増大させ、そしてＣＸＣＲ４発現を誘導し、そして幹細胞因子（ＳＣＦ）と相乗作用することによって、ＳＤＦ−１信号発生に対する未熟なＣＤ３４＋細胞の応答を助長することを示す。
【００５７】
ＨＧＦは、肝臓損傷の後にアップレギュレーションされること［Armbrust Liver 2002 Dec；22（6）巻：486−94頁］が先に示されたが、本発明者らは、ＨＧＦ活性におけるこのアップレギュレーションが、細胞骨格再編に対するＣＸＣＲ４発現でのアップレギュレーションを導き、そしてそれを発現した細胞のホーミングを促進することを最初に示した。
【００５８】
本所見は、幹細胞の産生を可能にし、そしてそれは、標的組織に有効に補充され得て、そしてそのようなものとして、肝臓損傷の修復、および肝臓または骨髄移植のような膨大な臨床用途で使用されうる。
【００５９】
したがって、本発明の１つの態様によれば、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様によれば、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象へのＨＧＦの投与をして、細胞血液循環における前駆幹細胞レベルが増大されたことにより、損傷を受けた臓器に対する自己再増殖および／または自己移植を促進することを包含する方法が提供される。
【００６１】
ここに使用されるとおり、用語「幹細胞」は、特定の特化された機能（すなわち、「十分に分化された」細胞）を有する他の細胞種に分化しうる能力を有する細胞を意味する。
【００６２】
本発明のこの態様による方法としては、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させ、それによって化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させうる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことが挙げられる。
【００６３】
もう１つの方法として、化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることは、幹細胞の内因性ＨＧＦの発現または活性をアップレギュレートすることによっても達成されうる。
【００６４】
下記でさらに記述されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、その細胞を、該タンパク質またはそれの活性部分と接触させるか、または、これらの細胞内で、もしくはそれと共に培養された非幹細胞（たとえば、供給層（feeder layer）として使用される繊維芽細胞）中でＨＧＦまたはそれの活性部分を発現させるかのいずれかによって達成されうる。
【００６５】
続く実施例部分で明瞭に示されるとおり、ＨＧＦに幹細胞をさらすことは、それらの運動性、およびそれの化学誘引物質、すなわちＳＤＦ−１に遊走するそれらの能力をかなり増大させた。
【００６６】
本発明は、HGFおよびその塩、機能性誘導体、前駆体および活性分画（active fractions）、並びにそれの活性変異体に関するものであって、これらはHGFと同じ活性を有するポリペプチドまたはたんぱく質を得るために、その構造中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、除去、または他のアミノ酸で置換される、または、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、その配列に加えられた他のタンパク質またはポリペプチド、および対応する「融合タンパク質」、すなわちＨＧＦまたは他のタンパク質に融合したそれの突然変異体からなるポリペプチドをも包含するものである他のタンパク質またはポリペプチドである。したがって、ＨＧＦは、たとえば免疫グロブリンのような別のタンパク質と融合されうる。
【００６７】
ここで用語「塩」は、本発明のＨＧＦタンパク質またはそれの突然変異タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ酸の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野で知られている手段によって形成されうるのであって、無機塩たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩など、およびたとえば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと形成されるもののような有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、およびたとえば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩が挙げられる。もちろん、あらゆるこのような塩は、本発明のＨＧＦタンパク質またはそれの突然変異タンパク質に対して実質的に類似の活性を示すに違いない。
【００６８】
ここに使用されるところの、定義「機能性誘導体（functional derivative）」は、既知方法によってアミノ酸部分の側鎖に、またはＮ−またはＣ−末端に存在する官能基から作製されうる誘導体を意味し、そしてそれらが、薬学上許容しうる場合、すなわち、それらが、タンパク質活性を破壊しないか、またはそれらを含有する医薬組成物に毒性を与えない場合に、本発明に含まれる。このような誘導体としては、たとえばカルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、そしてたとえばアルカノイルまたはアロイル基などのアシル基を用いて形成される。
【００６９】
本発明のタンパク質の「フラグメント」は、該化合物それ自体のポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体それ自体単独、またはそれに結合した関連分子または残基、たとえば、糖またはホスフェートの残基の組み合わせ、またはそのようなフラグメントまたは前駆体が、薬剤としてHGFと同じ活性を示す場合にポリペプチド分子の凝集体を意味する。
【００７０】
ここに使用されるところの、用語「環状にて入れ替えた（circularly permuted）」とは、直線状分子の末端同士が、環状分子を生成するために直接的に、またはリンカーを介して一緒に連結され、そしてその後環状分子が、当初の分子中の末端と異なる末端を有する新たな直鎖分子を生成する別の位置で開環されるものである直鎖状分子を意味する。環状の入れ替え（circular permutation）としては、その構造が環状にされ、その後開環された分子に等価な分子が挙げられる。したがって、環状にて入れ替えた分子は、おそらく線状分子としデノボ（de novo）で合成されて、環状化および開環工程を経由しない。分子の特別の環状での入れ替えは、そのあいだでペプチド結合が除去されたアミノ酸残基を含有するブラケット（brackets）によって明示される。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含みうる、環状で入れ替えた分子は、しばしばリンカーと融合したそれらの正常な末端を有し、そして別の位置で新たな末端を含む一本鎖状分子である。Goldenbergら、J.Mol.Biol.165巻：407−413頁（1983年）およびPanら、Gene 125巻：111−114頁（1993年）を参照。両者は、ここに参照することによって組込まれる（both incorporated by reference herein）。環状での入れ替えは、直鎖状分子の末端を融合して、環状分子を形成し、そしてその後、様々な位置で環状分子を切断して、様々な末端を有する新たな直鎖分子を形成したものと機能的に等価である。そのように得られる環状での入れ替えは、その配列を基本的に保存する効果を示し、そして様々な位置で新たな末端を産生しつつ、タンパク質のアミノ酸の同一性を示す。
【００７１】
本明細書中、用語「ポリペプチドおよびタンパク質」は、置き換え可能である。
【００７２】
本発明は、本発明の上記ＨＧＦタンパク質の突然変異タンパク質にも関し、そしてその突然変異タンパク質は、基本的にＨＧＦの天然に生じる配列のみを有するＨＧＦタンパク質と基本的に同じ生物学的活性を保持する。そのような「突然変異タンパク質」は、約２０および１０個までのアミノ酸残基が、この種の修飾が、タンパク質それ自体に関してタンパク質突然変異タンパク質の生物学上の活性を実質的に変化させないように、ＨＧＦタンパク質においてそれぞれ、欠失されるか、付加されるか、または他のもので置換されうるものでありうる。
【００７３】
これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法により、および／または部位特異的突然変異誘発技術により、またはそれに適切ないずれかの他の既知技術により調製される。
【００７４】
あらゆるこのような突然変異タンパク質は、好ましくは、それと実質的に類似の活性を示す基本のＨＧＦのものの十分な複製であるアミノ酸配列を有する。したがって、突然変異タンパク質を下記の実施例で説明される生物学的活性試験に付することからなる日常的な実験の手段によって、いずれかの所定の突然変異タンパク質が、本発明の基本的タンパク質と実質的に同じ活性を示すかどうかが決定されうる。
【００７５】
本発明によって使用されうるＨＧＦタンパク質の突然変異タンパク質、またはそれをコードする核酸は、ここに表される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、当業者によって日常的に得られうる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的にＨＧＦに対応する配列の限定された組が挙げられる。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Schulz,G.E．ら、Principles of Protein Structure、Springer−Verlag、New York、1978年；およびCreighton,T.E.Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.、サンフランシスコ、1983年を参照。これらは、ここに参照して組込まれる。コドン優先のようなヌクレオチド配列置換の表示については、See Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publications and Wiley Interscience、ニューヨーク、ニューヨーク州、1987−1995年；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年を参照。
【００７６】
本発明による突然変異タンパク質についての好ましい変化は、「保存的（conservative）」置換として知られるものである。基本的に天然に生じるＨＧＦ配列を有するタンパク質中の保存的アミノ酸置換は、グループ内の同義のアミノ酸を含み得て、そしてそれは、グループの構成要素間の置換は、分子の生物学上の機能を保存するのに十分に類似の物理化学的特性を有する。Grantham、Science 185巻、862−864頁（1974年）を参照。特に、挿入または欠失が、わずかなアミノ酸のみ、たとえば５０個以下、そして好ましくは、２０個以下下のＨＧＦを包含し、そして機能的配座、たとえばシステイン残基に重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合、アミノ酸の挿入および欠失も、それの機能を改変せずに、上で定義された配列で行われうることも明らかである。Anfinsen、「Principles That Govern The Folding of Protein Chains」，Science 181巻、223−230頁（1973年）。このような欠失および／または挿入により産生される突然変異タンパク質は、本発明の範囲内になる。
【００７７】
好ましくは、同義アミノ酸のグループ（synonymous amino acid group）は、表Ａで定義されるものである。さらに好ましくは、同義アミノ酸のグループは、表Ｂで定義されるものである；そして最も好ましくは、同義アミノ酸のグループは、表Ｃで定義されるものである。
【００７８】
表Ａ 同義アミノ酸のグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ
Ａｒｇ Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ
Ｖａｌ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００７９】
表Ｂ 同義アミノ酸のさらに好ましいグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒｓ Ｓｅｒｓ
Ａｒｃ Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ、Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ、Ａｌａ
Ｖａｌ Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅａ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
Ｔｒｙ Ｐｈｉ、Ｔｒｙ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ａｓｐ、Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ａｒｇ、Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｎ、Ａｓｐ
Ｇｌｕ ＦＬＮ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００８０】
表Ｃ 同義アミノ酸の最も好ましいグループ
アミノ酸 同義のグループ
Ｓｅｒｓ Ｓｅｒｓ
Ａｒｃ Ａｒｃ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈａｒ
Ａｌａｎ Ａｌａｎ
Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅａ Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
Ｐｈｉ Ｐｈｉ
Ｔｒｙ Ｔｒｙ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ、Ｃｙｓ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｔｒｐ
【００８１】
本発明で使用するためのタンパク質の突然変異タンパク質を得るために使用されうるタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、Markらに対する米国特許番号ＲＥ３３，６５３号、４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号および４，７３７，４６２号；Kothsらに対する５，１１６，９４３号、Namenらに対する４，９６５，１９５号；Chongらに対する４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する５，０１７，６９１号で表されるもの；および米国特許第４，９０４，５８４号（Strawら）で表されるリシン置換タンパク質のような、あらゆる公知の工程が挙げられる。
【００８２】
本発明の別の好ましい実施形態で、本発明で使用するためのＨＧＦタンパク質のあらゆる突然変異タンパク質は、本発明の上に明記されるＨＧＦタンパク質のものに原則的に相当するアミノ酸配列を有する。用語「〜に原則的に相当する（essentially corresponding to）」とは、基本となるタンパク質の配列に対し、そのタンパク質の基本的な特徴に影響を及ぼさない程度の些細な変化を伴う突然変異タンパク質を含むことが意図され、ＨＧＦとしての能力についての（基本的な特徴に影響を及ぼさないことが）重要である。「〜に原則的に相当する」言語の範囲に入ると一般的にみなされる変化のタイプは、本発明のＨＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異誘発技術（mutagenesis techniques）から生じるものであり、そしていくつかのマイナーな修飾を生じたり、たとえば化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させるような望みの活性をスクリーニングする。
【００８３】
本発明は、ＨＧＦ変異体（HGF variant）をも包含する。好ましいＨＧＦ変異体は、ＨＧＦアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％アミノ酸同一性を示すものであり、さらに好ましいＨＧＦ変異体は、少なくとも９０％同一性を示し、そして最も好ましい変異体は、少なくとも９５％同一性を示すものである。
【００８４】
ここに示される場合、用語「配列の同一性（sequence identity）」は、アミノ酸配列が、HanksおよびQuinn（１９９１年）による配列によって比較され、低相同性領域の微細な区分においては、ＣｌｕｓｔａｌＷ多配列の配列プログラムについてのウインドウズインターフェース（Thompsonら、１９９４年）であるＣｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムを用いてリファインメントすることを意味する。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／でインターネットじゅうで利用可能である。もちろん、このリンクが、無効になった場合、当業者は、過度な実験なしに、標準インターネット検索技術を使用して、他のリンクでこのプログラムのバージョンを見出しうるということが、理解されるべきである。別段の規定のない限り、本発明の有効出願日現在で最新版の、ここで参照したいずれかのプログラムは、本発明を実施するために使用されるものである。
【００８５】
「配列の同一性」を測定する別の方法は、以下のものである。配列は、−１２のギャップ開放ペナルティー（ギャップの第一のヌルについて）および−４のギャップ拡張ペナルティー（ギャップでの個々の追加の連続ヌル当たり）を示すデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（値−４から＋１１まで）を使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＤＡＰ（グローバル・アラインメント・プログラム）のバージョン９を使用して配列する。配列の後、同一性百分率は、請求された配列中のアミノ酸の数の百分率として適合の数を表すことによって計算される。
【００８６】
本発明による突然変異タンパク質としては、ストリンジェントな条件下でＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッドを形成し、そして本発明によるＨＧＦタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるものが挙げられるのであって、基本的にＨＧＦをコードする天然に生じる配列、および、遺伝子コードの縮重に基づいてそれのヌクレオチド配列で、天然に由来するヌクレオチド配列と異なる可能性のある、すなわちある程度異なる核酸が、この縮重により、なお、同じアミノ酸配列をコードする可能性がある配列の全てを包含するものである。
【００８７】
ここに使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が、塩基対を通して相補的な鎖と連結するあらゆる過程を包含するべきである（Coombs J、1994年、Dictionary of Biotechnology、ストックトン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州）。「増幅」は、核酸配列をさらに複写した産物として定義され、そして一般に、当技術分野で周知であるポリメラーゼ連鎖反応技術（DieffenbachおよびDveksler、1995年、PCR Primer、a Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州プレインビュー（Plainview NY））を使用して行われる。
【００８８】
「ストリンジェンシー」は、特に、約Ｔｍ−５℃（プローブの溶融温度（melting temperature）より５℃低い）から、Ｔｍより下の約２０℃〜２５℃までの範囲に生じる。
用語「「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションおよびそれにひきつづく洗浄（washing）の条件に該当し、それを当業者では、従来「ストリンジェント」と呼ばれる。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン・パブリケーションズ・アンド・ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク州ニューヨーク、1987-1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年を参照。
【００８９】
ここで使用される場合、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション実験で使用される温度、一価陽イオンのモル濃度、およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの含有率の関数である。あらゆる特定の組の条件に含まれるストリンジェンシーの程度を決定するために、ひとつとしては、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍとして表される１００％同一性のハイブリッドの安定性を測定するためにMeinkothら（１９８４年）の方程式を使用する。
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％from）−５００／Ｌ
【００９０】
式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドの含有率であり、％formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの含有率であり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。各１Ｃ毎に、１００％同一性ハイブリッドについて計算されたＴｍから減じられ、許容されるミスマッチの量は、約１％ずつ増加される。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度でのいずれかの所定のハイブリダイゼーション実験のために使用されるＴｍが、Meinkothの方程式によって１００％ハイブリッドについて計算されたＴｍより１０Ｃ下である場合、ハイブリダイゼーションは、約１０％までミスマッチある場合でさえ生じる。
【００９１】
ここで使用される場合、「高度にストリンジェントな条件（highly stringent conditions）」は、上の方程式により計算される場合、または実際に測定される場合のいずれかにおいて、完全な二重鎖について存在するであろうＴｍより１０Ｃよりは低くない標的配列のＴｍを提供するものである。「中程度にストリンジェントな条件（moderately stringent conditions）」とは、上の方程式により計算される場合、または実際に測定される場合のいずれかにおいて、完全な二重鎖について存在するであろうＴｍより下に２０Ｃよりは低くない標識配列のＴｍを提供するものである。制限することなく、高度にストリンジェントな（ハイブリッドの計算または測定されたＴｍより５−１０Ｃ低い）および中程度のストリンジェントな（ハイブリッドの計算または測定されたＴｍより１５−２０Ｃ低い）条件の例では、ハイブリッドの計算されたＴｍより下の適切な温度で、２×ＳＳＣ（標準クエン酸生理食塩水）および５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を使用する。非常に高度なストリンジェントな条件（ultimate stringency of the conditions）は、第一に、洗浄条件によるのであって、とくに用いられるハイブリダイゼーションの条件がそれらである場合、安定性の低いハイブリッドが安定なハイブリッドと共に形成されうる。その後非常に高度なストリンジェントの洗浄条件は、安定性の低いハイブリッドを取り除く。上に記述される非常にストリンジェントから中程度にストリンジェントな洗浄条件までで使用されうる一般のハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍよりおよそ２０から２５Ｃまで低い温度で、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）（標準リン酸生理食塩水−ＥＤＴＡ）、５×デンハート（Denhard's）の試薬、０．５％ＳＤＳ、１００およびマイクロ；ｇ／ｍｌ変性された断片化サーモン精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい（Ausubel、1987、1999）。
【００９２】
本発明の本態様によって使用されうる幹細胞の限定されないの例は、あらゆる年齢での個体の骨髄組織から、または新生児個体の臍帯血から得られる造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉幹細胞（ＭＳＣ）、懐胎後形成した胚性組織から得られる胚性幹（ＥＳ）細胞（たとえば、胚盤胞）、または懐胎のあいだのいずれの時期、好ましくは懐胎の１０週前の胎児の生殖組織から得られる胚性原基（ＥＧ）細胞である。本発明の本態様によって使用されうる幹細胞についてのさらなるの説明を、下記に要約する。
【００９３】
ＨＳＣ−造血幹細胞（ＨＳＣ）は、中でも、赤血球、リンパ球、マクロファージおよび巨核球のような造血または血液細胞の特定の種類のいずれかに分化する能力がある骨髄、胎児肝臓、臍帯血および末梢血に見出される形態形成的に多能性芽球細胞formative pluripotential blast cells）である。ＨＳＣは特に骨髄内を適所として存在し、それらの能力を維持するために必要な全ての因子および全ての接着特性をサポートし、そして生体の寿命を超えて、成熟前駆体を適当なバランスがとれた生産をする［Whetton（1999年）Trends Cell Biol 9巻：233−238頁；Weissman（2000年）Cell 100巻：157−168頁；Jankowska−Wieczorek（2001年）Stem Cells 19巻：99−107頁；Chan（2001年）Br.J.Haematol.112巻：541−557頁］。
【００９４】
本発明の本態様によるＨＳＣは、好ましくは、ＣＤ３４+細胞、そしてさらに好ましくはＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低細胞であり、そしてそれは、いっそう未発達の幹細胞集団であり、したがって、系統制限（lineage-restricted）されておらず、そして主要な長期骨髄再構築細胞（major long-term bone marrow repopulating cells ）である。
【００９５】
ＭＳＣ−間葉幹細胞は、サイトカインのような生物活性因子からの種々の影響によって、間葉または結合組織（すなわち、特化された要素をサポートする体の組織；たとえば、脂肪、骨性、基質、軟骨性、弾性および繊維性結合組織）の１つ以上の特定の型に分化する能力のある、特に骨髄、血、真皮および骨膜で見出される形成多能性芽球細胞（formative pluripotential blast cells）である。
【００９６】
およそ、プラスチックに粘着する３０％のヒト骨髄アスピレート細胞（human marrow aspirate cells）は、ＭＳＣであると考えられている。これらの細胞は、インビトロで展開され、そしてその後、分化誘導される。成熟したＭＳＣが、インビトロで展開され、そして刺激により、骨、軟骨、腱、筋肉、または脂肪細胞を形成しうるという事実は、組織工学および遺伝子療法戦略にとって魅力である。インビボアッセイは、ＭＳＣ機能を分析するために開発された。その循環に注入されたＭＳＣは、上記された多量の組織に組込みうる。特に、骨格および心臓の筋肉は、５−アザシチジンにさらすことにより誘発され得て、そして培養中のラットおよびヒトＭＳＣの神経系の分化は、β−メルカプトエタノール、ＤＭＳＯまたはブチル化ヒドロキシアニソールにさらすことによって誘発されうる［Tomita（1999年）100巻：11247−11256頁；Woodbury（2000年）J.Neurosci.Res.61巻：364−370頁］。さらに、ＭＳＣ由来の細胞は、末梢注入の後、並びにラットの脳へのヒトＭＳＣの直接注入の後に、脳に深く組込まれることが見られた；それらは、神経幹細胞の発生時の遊走に使用される経路にそって遊走し、広く分布されるようになり、そしてＨＳＣ特化のマーカーを失い始める［Azizi（1998年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95巻：3908−3913頁］。間葉幹および系統特化（lineage-specific）細胞増殖を促進する方法は、米国特許第６，２４８，５８７号に開示される。
【００９７】
米国特許第５，４８６，３５９号で記述されるＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４のようなヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）表面のエピトープは、たとえば骨髄で存在するような、異種細胞集団から得られる間葉幹細胞集合をスクリーニングおよび捕捉する試薬として使用されうる。これらの前駆体間葉幹細胞は、種々の間葉系統に分化しうるので、ＣＤ４５について陽性である前駆体間葉幹細胞は、好ましくは、本発明の本態様によって使用される。
【００９８】
本発明の本態様による好ましい幹細胞は、ヒト幹細胞である。
【００９９】
下の表１は、成人幹細胞（adult stem cell）の例を提供し、そしてそれは、本発明の本態様によって、目的の標的組織中の指標表現型を得るために使用されうる。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
上記のとおり、本発明の本態様による幹細胞は、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらされる。
【０１０２】
ＨＧＦは、６２ｋＤａのα−サブユニットおよび３４ｋＤａのβ−サブユニットを含んでいる、ヘテロダイマーなポリペプチドである。α−サブユニットは、２７個のアミノ酸、続いて３つの内部ジスルフィド架橋によって安定化された８０−アミノ酸二重ループ状構造である４つの標準的なクリングルドメインを含めたＮ末端ヘアピンドメインを含有する［Comoglio（1999年）Exp.Cell Res.253巻：88−99頁；Comoglio（1993年）Exs 65巻：131−65頁；Comoglio（1996年）Gene Cells 1巻：347−54頁］。クリングルドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に重要である。第一のクリングルドメインは、ＨＧＦ−受容体についての高い親和性結合ドメインを含有する一方で、第二のクリングルドメインは、膜結合ヘパラン−硫酸・プロテオグリカンに対して低い親和性結合部位を含有する。低い親和性相互作用は、標的細胞近傍に高い濃度のＨＧＦを維持する。ＨＧＦ遺伝子は、単一のプロＨＧＦタンパク質（single pro-HGF protein）をコードしており、それが切断されて活性型異種二量体分子を形成することで、受容体に高い親和性を示す。
【０１０３】
ここで使用されるように、ＨＧＦの活性部分は、化学誘引物質に対する本発明の幹細胞の感度を増大させるのに十分である最小ＨＧＦ配列を意味する。ここで使用されるように、ＨＧＦの活性部分は、突然変異タンパク質、融合タンパク質、官能性誘導体、フラグメント、環状にて入れ替えたＨＧＦおよび／またはそれの塩をも意味する。
【０１０４】
本発明によるＨＧＦの活性部分を決定するために、幹細胞は、ＨＧＦセグメントと接触され得て、そしてそこへの細胞の応答は、当業者に周知であり、そしてさらに下記の方法を使用して、分子的に、生化学的に、または機能的に（たとえば、運動性、ホーミング、移動アッセイ）モニターされうる。
【０１０５】
ここで上に記述されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる。
【０１０６】
多数の走化性細胞受容体（chemotactic cell receptors）が、幹細胞のトランス内皮遊走（transendothelial migration）に関与することが知られている。これらの受容体の多くは、Ｇタンパク質連動型７膜貫通受容体（G protein-coupled seven-transmembrane receptors）（７−ＴＭＲ）のファミリーに属する。Ｇタンパク質、特にＧｉタンパク質を介したシグナリングは、対応するリガンドの勾配に向かう細胞の走化性応答を生じる［Voermans（2001年）J.Hematother.Stem Cell Res.10巻：725−738頁］。最近の研究において、走化性効果を強力に仲介しうる未熟な造血前駆細胞でのいくつかの７−ＴＭＲの発現についての証拠を提供した：ケモカイン受容体（たとえば、ＣＸＣＲ４、ストローマ細胞由来因子−１のための受容体）、脂質メディエーターのための受容体（たとえば、システイニルロイコトリエン受容体（cysteinyl leukotriene receptor）ｃｙｓＬＴ１および末梢カナビノイド受容体（peripheral cannabinoid receptor）ｃｂ２）およびニューロエンドクラインホルモンのための受容体（たとえば、ソマトスタチン受容体ｓｓｔ２）。これらの研究から、造血前駆体および幹細胞の遊走が、単一のケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）によるよりむしろ多様な走化性因子によって制御されると結論づけられうる。
【０１０７】
本発明の本態様の好ましい実施態様によれば、走化性受容体はＣＸＣＲ４である。
【０１０８】
ＨＧＦは、ＨＧＦ受容体、すなわち、ｃ−ｍｅｔに対する結合を介してその生物学上の活性を発揮するので、本発明は、ＨＧＦシグナリングにおける制限因子（limiting factor）でありうるＨＧＦ受容体、すなわち、ｃ−ｍｅｔに細胞をさらすことも目論まれる。
【０１０９】
上記に明記されるとおり、ＨＧＦまたはそれの活性部分に幹細胞をさらすことは、幹細胞を、該タンパク質と接触させるか、または幹細胞内で該タンパク質を発現させることによって達成されうる。
【０１１０】
本発明は、組織から循環への幹細胞の可動化、およびＨＧＦまたはそれの活性部分に循環中の幹細胞をさらすことをも目論んでいるが、幹細胞をＨＧＦと接触させることは、好ましくは、収穫した細胞（harvested）を使用して達成される。
【０１１１】
成人幹細胞は、骨髄吸引のような外科的手段を使用して得られうるか、または米国カリフォルニア州アービンのネックスエル・セラピューティックス・インク．から入手可能なもののような市販のシステムを使用して収穫されうる。
【０１１２】
本発明により利用される幹細胞は、好ましくは、幹細胞可動化手段（stem cell mobilization procedure）を使用して採取（すなわち収穫）されるのであって化学療法または対象の循環へのＨＳＣの放出に対するサイトカイン刺激を利用する。幹細胞は、好ましくは、可動化（mobilization）が、骨髄手術より多くのＨＳＣおよび前駆細胞を生じることが知られているので、この手段を使用して回収される。
【０１１３】
幹細胞の可動は、多数の分子によって誘導されうる。例としては、それに限定はされないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ−３リガンドのようなサイトカイン；ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１α、Ｇｒｏβ、またはＳＤＦ−１のようなケモカイン；および化学療法剤シクロホスホアミド（Ｃｙ）およびパクリタキセル（paclitaxel）が挙げられる。これらの分子は、反応速度論および効率で異なることが予測されるが、最近知られる実施態様によれば、Ｇ−ＣＳＦは、好ましくは、単独で、または幹細胞を可動化するシクロホスホアミドのようなものと組み合わせて使用されることが予測される。特に、Ｇ−ＣＳＦは、５−１０日間、５−１０μｇ／ｋｇの用量で毎日投与される。幹細胞を流動化する方法は、米国特許第６，４４７，７６６号および第６，１６２，４２７号に開示される。
【０１１４】
ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離されうる。ヒト胚盤胞は、特に、インビボにおいて、着床前の胚から、またはインビトロ受精（ＩＶＦ）胚から得られる。代わりに、単細胞ヒト胚は、胚盤胞段階まで延長されうる。ヒトＥＳ細胞の単離については、透明帯状物（zona pellucida）を、胚盤胞から除去し、そして内細胞塊（ＩＣＭ）を、免疫手術により除去し、そしてそれは、栄養外胚葉細胞（trophectoderm）を溶解させ、そして穏やかなピペッティングにより無傷のＩＣＭから取り出す。その後、ＩＣＭを、それの生長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコで培養する。９から１５日に続いて、ＩＣＭで誘導された生産物は、機械的解離によるか、または酵素的分解によるかのいずれかにより、凝集塊（clumps）に解離され、そしてその後、細胞を、新たな組織培養培地上で再度培養させる。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットにより個々に選択され、機械的に、凝集塊に解離され、そして再度平板培養される。その後、生じるＥＳ細胞を、１−２週間ごとに定期的に分割する。ヒトＥＳ細胞を作製する方法についてさらに詳細には、Thomsonら［米国特許第５，８４３，７８０号；Science 282巻：1145頁、1988年；Curr.Top.Dev.Biol.38巻：133頁、1998年；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92巻：7844、1995年］；Bongsoら［Hum Reprod 4巻：706頁、1989年］；Gardnerら［Fertil.Steril.69巻：84頁、1998年］を参照。
【０１１５】
市販で入手可能な幹細胞は、本発明の本態様によっても使用されうることが予想される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリー（＜ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）から購入されうる。市販で入手可能な胚性幹細胞株の制限なしの例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ３２である。
【０１１６】
ヒトＥＧ細胞は、当業者に知られる実験技術を使用して、妊娠約８−１１週のヒト胎児から得られる原初の生殖細胞から回収されうる。生殖隆起（genital ridges）は、解離され、したがって、機械的解離により分けられる小さな塊に切断される。その後、ＥＧ細胞は、適切な培地を用いて組織培養フラスコ中で育成される。ＥＧ細胞と一致する細胞形態学が、大体７−３０日後、または１−４世代に観察されるまで、細胞を毎日培地を交換して培養する。ＥＧ細胞を作製する方法における別の詳細のために、Shamblottら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95巻：13726頁、1998年］および米国特許第６，０９０，６２２号を参照。
【０１１７】
多分化能を示す幹細胞個体群（population）の濃縮（enrichment）は、好ましくは達成されうることが評価される。したがって、たとえば、ここで上に概説されるとおり、ＣＤ３４+幹細胞は、下記でさらに記述されるとおり、アフィニティーカラムまたはＦＡＣＳを使用して濃縮されうる。
【０１１８】
増殖条件下で幹細胞を培養することは、幹細胞数が治療で使用するのには少なすぎる場合にも達成されうる。幹細胞の培養は、米国特許第６，５１１，９５８号、第６，４３６，７０４号、第６，２８０，７１８号、第６，２５８，５９７号、第６，１８４，０３５号、第６，１３２７０８号および第５，８３７，５７３９号に記述される。
【０１１９】
いったん幹細胞が得られると、それらは、ＨＧＦまたはそれの活性部分と接触される。
【０１２０】
可溶性ＨＧＦ、そして特に、その活性部分は、たとえば標準的固相技術を使用することによって生化学的に合成されうる。これらの方法は、限定的固相合成（exclusive solid phase synthesis）、部分的固相合成法（partial solid phase synthesis）、フラグメント圧縮（fragment condensation）、古典的溶液合成（classical solution synthesis）が含まれる。固相ペプチド合成手段は、当技術分野で周知であり、そしてJohn Morrow StewartおよびJanis Dillaha Young、Solid Phase Peptide Syntheses（2版、ピアス・ケミカル・カンパニー、1984年）によりさらに詳述される。
【０１２１】
合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー［Creighton T.（1983年）Proteins, structures and molecular principles，ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・シーオー．ニューヨーク］によって精製され得て、そしてそれの組成物は、アミノ酸配列決定を介して確認されうる。
【０１２２】
ＨＧＦは、シグマ−アルドリッチ（イスラエル国レホボト）のような商業上の供給者からも得られうる；製品番号Ｈ１４０４号。
【０１２３】
大量のＨＧＦまたはそれの活性部分が望まれる場合には、このようなポリペプチドは、好ましくは、組換え技術（recombinant techniques）を使用して得られる。
【０１２４】
このようなポリペプチドを組換え体で合成するためには、プロモーターのような調節因子の転写制御の下流にＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを含めた発現構築物（すなわち、発現ベクター）を、宿主細胞に導入される。
【０１２５】
「形質転換された」細胞を、ポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養する。
【０１２６】
予備測定期間に続いて、発現したタンパク質は、細胞または細胞培養物から回収され、そして精製が達成される。
【０１２７】
多様な原核生物または真核生物の細胞の多様性は、修飾されたポリペプチドコーディング配列を発現する宿主−発現系として使用されうる。これらとしては、それに制限はされないが、所望のコーディング配列を含有する組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリアのような微生物が挙げられる；真核生物の細胞は、翻訳後での修飾タンパク質の産生を可能にするので、好ましくは、哺乳類発現系は、ＨＧＦまたはそれの活性部分を発現するために使用される。しかし、細菌系は、それらが、低費用で高生産量を可能にするので、特に、組換え体タンパク質を産生させるために使用される。したがって、宿主系は、産生されるべき組換えタンパク質およびそれの最終用途によって選択される。
【０１２８】
バクテリアの系では、発現された修飾ポリペプチドとして意図される用途によって、多数の発現ベクターが都合よく有利に選択されうる。たとえば多量の接合体が望まれる場合は、おそらく疎水性シグナル配列との融合として、タンパク質産物が容易に精製されうるように、バクテリアのペリプラズムまたは培養培地に発現産物を導くように、高濃度のタンパク質産物の発現を指示するベクターが、望まれる可能性がある。コンジュゲートからの回収を助けるために特定の切断部位が設計された融合タンパク質も望ましい。このような操作に適合性のあるこのようなベクターとしては、それに限定されないが、イー．コリ（大腸菌）発現ベクターのｐＥＴシリーズ［Studierら（1990年）Methods in Enzymol.185巻：60−89頁］が挙げられる。
【０１２９】
当技術分野で周知である昆虫および哺乳類宿主細胞系のような他の発現系も、本発明によって使用されうる（米国特許第６，５４１，６２３号を参照）。
【０１３０】
どのような場合でも、形質転換細胞は、有効な条件下で培養され、そしてそれは、多量の組換えポリペプチドの発現に対処する。有効な培養条件は、それに限定されないが、有効な培地（effective media）、生物反応器（bioreactor）、温度、ｐＨおよびタンパク質生産を可能にする酸素条件が挙げられる。有効な培地は、細胞が、本発明の組換え修飾ポリペプチドを産生するために培養されるあらゆる培地に該当する。このような培地としては、特に、同化できる炭素、窒素およびリン酸源、および適切な塩、ミネラル、金属およびビタミン類のような他の栄養分を有する水性溶液が挙げられる。本発明の細胞は、従来の発酵生物反応器、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿で培養されうる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行われうる。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内にある。
【０１３１】
結果物の本発明の組換え体タンパク質は、好ましくは、成長（たとえば、発酵）培地に分泌される。
【０１３２】
培養中の所定の時間に続いて、組換えタンパク質の回収が達成される。語句「組換えタンパク質を回収すること」は、タンパク質を含有する全成長培地を採取することに該当し、そして分離または精製の別の段階を意味する必要はない（実施例区分の実施例２を参照）。本発明のタンパク質は、それに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、およびディファレンシャル可溶化のような多様な標準タンパク質精製技術を使用して精製されうる。
【０１３３】
本発明のタンパク質は、好ましくは、「十分に純粋な（substantially pure）」形態で回収される。ここに使用される場合、「十分に純粋な」は、ここで下に記述された多様な用途においてタンパク質を有効に使用できる純度に該当する。
【０１３４】
本発明のＨＧＦまたはそれの活性部分の組換え体産物は、インビトロでも達成されうることが予測される。
【０１３５】
ＨＧＦまたはそれの活性部分は、収穫された幹細胞を培養または維持するために利用される培養培地に含まれうる。このような培養培地としては、特に、幹細胞培養のために適した緩衝溶液（すなわち、成長培地）が挙げられる。培養培地は、幹細胞の成長および生存を支持する成長因子を含む血清または血清置換も含まれうる。培養培地は、ＳＤＦ−１、ＩＬ−６、ＳＣＦなどのようなホーミング剤も含み得る。さらに、本発明の成長培地は、白血病阻害剤因子（ＬＩＦ）のような分化阻害剤も含みうる。
【０１３６】
本発明の幹細胞は、ＨＧＦ分泌細胞とも接触されうる。これは、ＨＧＦまたはそれの活性部分を発現する細胞との本発明の幹細胞を共培養することによって達成されうる。たとえば、未分化状態でそれ（幹細胞）の増殖をサポートするために幹細胞としばしば共培養される繊維芽細胞フィーダー細胞は、ＨＧＦを発現して、それにより二重の役割、すなわち、幹細胞の成長支持および移動および運動性能力の増大を行うことができる。
【０１３７】
しかし、本発明の幹細胞は、好ましくは、臨床用途に使用されるので、幹細胞の少なくとも１つの化学誘引物質受容体の十分な濃度の誘導に続く第二のＨＧＦ−発現細胞集合から幹細胞を単離する手段が取られる。細胞集合を分類する方法は、ここで下にさらに記述される。
【０１３８】
代わりに、本発明の幹細胞は、幹細胞中のＨＧＦまたはそれの活性部分を発現するために、上に記述されるもののような発現構築物で形質転換されうる。
【０１３９】
このような場合に、発現構築物としては、好ましくは誘導性成長特異的または組織特異的条件下で、哺乳類細胞（上の例）で活性なシス作用調節要素が挙げられる。
【０１４０】
細胞型特異的および／または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的［Pinkertら、（1987年）Genes Dev． 1巻：268−277頁］、リンパ系特異的プロモーター［Calameら（1988年）Adv.Immunol.43巻：235−275頁］であるアルブミンのようなプロモーター；特にＴ細胞受容体のプロモーター［Winotoら、（1989年）EMBO J.8巻：729−733頁］および免疫グロブリン；［Banerjiら、（1983年）Cell 33729−740］、ニューロフィラメントプロモーターのような神経単位特異的プロモーター［Byrneら，（1989年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86巻：5473−5477頁］、膵臓特異的プロモーター［Edlunchら、（1985年）Science 230巻：912−916頁］またはミルクホエイプロモーターのような乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願広報番号第２６４，１６６号）が挙げられる。本発明の核酸構築物は、さらに、プロモーター配列に隣接または遠位にあるうるエンハンサーを含むことができ、そしてそこから転写をアップレギュレートするのに機能できる。
【０１４１】
好ましくは、誘導性シス作用調節因子（cis-acting regulationary element)は、ホーミング−移植過程のあいだに幹細胞の環境変化によって調節可能である。
【０１４２】
これらの移動のあいだに、幹細胞は、循環中の血液内の細胞の運動によって発生するせん断力（shear forces）を受ける。いったん移植されると、幹細胞は、もはやそのようなせん断力を受けない。ＨＧＦは、好ましくは、ホーミング段階（移動）のあいだに活性であるので、移動の段階でのみ活性であるシス作用調節要素は、特に利点を有する。１つのこのような調節因子は、Resnickら、PNAS USA90巻：4591−4595頁、１９９３年により記述されたせん断応力応答性因子である。
【０１４３】
間葉幹細胞の遺伝的修飾（genetic modification）は、米国特許第５，５９１，６２５号で検討される。ＨＳＣの遺伝子修飾は、Zheng 2000年 Nat.Biotechnol.18巻：176−180頁およびLotti、2002年、J.Virol.76（8）巻、3996−4007頁で検討される。
【０１４４】
いったんＨＧＦまたはそれの活性部分にさらされると、化学誘引物質受容体の発現レベルが増大し結果として、化学誘引物質に対する感度が増大したことを示す幹細胞は、好ましくは識別され、単離される。そのような段階は、走化性が高い細胞で濃縮されているが、濃縮されていないＨＧＦ処理細胞郡の使用も、本発明に想定される。
【０１４５】
本発明の本態様によるこのような細胞の識別および単離は、当技術分野で周知である多数の細胞学上、生化学上および分子の方法を使用して達成されうる
【０１４６】
たとえば、受容体レベルの分析は、フローサイトメトリーによって達成されうる。このアプローチは、液体培地中において励起源をフローする単一の細胞をスキャンする装置を使用する。その技術は、可視および蛍光発光の測定をもとに、単一の生存（または死滅）細胞を高速、定量、マルチパラメーター分析を提供しうる。この基本的プロトコールでは、細胞結合分子を特異的に結合する蛍光標識抗体およびリガンドによって発せられる蛍光強度の測定を中心とする。本発明の蛍光活性化セルソーターを使用して細胞個体群を単離するために、本発明の幹細胞をＲ＆Ｄ、ミネソタ州エヌイー・ミネアポリス、マッキンレイ・パレス６１４から市販で入手可能な抗ＣＸＣＲ４と接触させる。
【０１４７】
走化性受容体発現のレベルを定量的に評価するための他の細胞学上または生化学的方法としては、それに限定はされないが、標識（たとえば、放射性標識）ケモカイン、ウエスタン・プロット分析、細胞表面ビオチン化および免疫蛍光染色を用いたバインディングアッセイが挙げられる。
【０１４８】
受容体の発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでも測定されうることが予測される。たとえば、ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡは、特異的プローブに対するハイブリダイゼーションにより細胞中で検出されうる。このようなプローブは、クローン化ＤＮＡまたはそれのフラグメント、特にインビトロ転写によって作製されるＲＮＡ、または固相合成により通常に生産されるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。特異的ハイブリダイゼーションに適したプローブを産生および使用する方法は、周知であり、そして当技術分野で使用される。ｍＲＮＡレベルの定量は、増幅反応［たとえば、ＰＣＲ、「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）］を使用して、目的の走化性受容体のｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成するプライマーを使用しても達成されうる。
【０１４９】
多様なコントロールが、ｍＲＮＡ検出アッセイでの精度を改善するために有効に使用されうる。たとえば、サンプルは、関連性のないプローブにハイブリッド形成され、そしてハイブリダイゼーションの前にＲＮＡｓｅＡで処理して、偽ハイブリダイゼーションを見極めうる。
【０１５０】
機能性アッセイは、走化性受容体発現を測定するためにも使用されうる。たとえば、走化性試薬（たとえば、ＳＤＦ−１）の勾配を用いた走化性試薬に向かって膜を貫通して幹細胞の遊走を使用する走化性アッセイは、走化性が増大したことを示す幹細胞を識別および単離するために利用されうる。細胞が、十分なレベルの走化性受容体（たとえば、ＣＸＣＲ４）を発現しない場合、それにより、細胞の大半は、膜上に保持される。しかし、本発明の化学誘引物質受容体の発現が増大されたことにより、細胞は、膜を貫通して遊走し、そして走化性プレート（実施例区分の実施例１を参照）のウエルの底に定着する。
【０１５１】
機能性ホーミングアッセイが、本発明の方法によっても利用されうることが予想される。このようなアッセイは、Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁に記述される。
【０１５２】
免疫蛍光染色は、ＨＧＦへさらすことに続いて細胞の形態学を測定するための機能性アッセイでも使用されうる。実施例１の図１Ａで示されるとおり、抗ＣＸＣＲ４および抗可動化アクチン抗体を用いた同時染色は、ＨＧＦでの処理に続く幹細胞形態学における変化（すなわち、細胞分散およびラメリポジア形成）を解明した。
【０１５３】
化学誘引物質に対する感度が増大したことを示す幹細胞は、広範な臨床用途で使用されうる。
【０１５４】
したがって、本発明の別の態様によって、細胞または組織交換を要求する傷害を治療する方法の提供がある。本発明は、それを必要とする対象に、ここで上に記述されるとおりの幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で予め処理された治療上有効な量の幹細胞を供して、それにより対象における細胞または組織交換を必要とする障害を処理することによって達成される。
【０１５５】
細胞または組織交換を必要とする障害としては、それに限定はされないが、Ｔおよび／またはＢリンパ球で、またはリューマチ様関節炎（rheumatoid arthritis）のような免疫障害のような種々の免疫欠損が挙げられる。このような免疫欠損は、ウイルス感染、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＨＴＬＶＩＩＩ、重篤な放射線被爆、癌治療、または他の医療上の治療の結果でありうる；血液不全（hematological deficiencies）は、それに限定されないが、重篤な複合免疫不全（severe combined immunodeficiency）（ＳＣＩＤ）症候群［たとえば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）不全およびＸ−リンク（X-linked）ＳＣＩＤ（ＸＳＣＩＤ）］、大理石骨病（osteopetriosis）、再生不良性貧血（aplastic anemia）、ゴシュ病（Gaucher's disease）、サラセミアおよび他の先天的または遺伝子的に決定された造血異常（hematopoietic abnormalities）でありうる；細胞または組織交換を必要とする他の障害としては、肝不全、膵不全、神経学上の障害に関連したもの、骨形成が増大されることを必要とする障害として変形性関節炎（osteoartbritis）および骨粗しょう症（osteoporosis）；骨欠損、結合組織欠損、骨格欠損または軟骨欠損のような結合組織のいずれかに関与する外傷性の、または病理学上の症状のようなものが挙げられる。
【０１５６】
本発明による好ましい個体の対象は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシおよび好ましくはヒトのような哺乳類である。
【０１５７】
本発明の本態様による幹細胞は、好ましくは、治療されるべき対象から得られる。しかし、幹細胞は、同一遺伝子の、同種異系の、そして好ましくなくは異種のドナーからも得られうる。
【０１５８】
同種異系または異種の幹細胞が使用される場合、対象のレシピエントおよび／または細胞は、好ましくは、移植片対宿主および宿主対移植片拒絶を防止するために治療されることが予測される。免疫抑制プロトコールは、当技術分野で周知であり、そしてある種のものは、米国特許第６，４４７，７６５号に開示される。
【０１５９】
本発明の幹細胞は、米国特許第５，９２８，６３８号で記述される肝炎に対する抗ウイルス剤のようないずれかの治療的遺伝子を発現するように遺伝子で修飾されうる。
【０１６０】
幹細胞は、対象のレシピエントに移植される。これは、一般に、当技術分野で周知な方法を使用して達成され、そして通常には、当業者に周知の医療のツールを使用して、処理された幹細胞（treated stem cells）を対象に注入または導入することを含む（米国特許第６，４４７，７６５号、第６，３８３，４８１号、第６，１４３，２９２号および第６，３２６，１９８号）。
【０１６１】
たとえば、本発明の幹細胞を導入することは、静脈内または動脈内投与、腹腔内投与などを含めた血管内投与を介して達成されうる。細胞は、滅菌シリンジまたは他の滅菌トランスファーメカニズムを使用して、５０モル・フェンウォール注入バック（50 mol Fenwall infusion bag）に注入されうる。その後、細胞は、たとえば１５分間をかけてＩＶ投与を介して、患者にフリーフローＩＶラインに直ぐに注入されうる。ある種の実施形態では、緩衝液または塩のような別の試薬も同様に添加しうる。投与のための組成物は、適切な滅菌性および安定性を伴う標準的な方法によって、配合、生産および保存されなければならない。
【０１６２】
幹細胞投与量は、処方された使用法によって決定されうる。一般に、非経口投与の場合には、レシピエントの体重の１キログラム当たり約０．０１から約５百万個までの細胞を投与するのが通例である。使用される細胞の数は、レシピエントの体重および症状、投与の回数または頻度、そして当業者に知られる他の変数に依存する。
【０１６３】
細胞を対象に投与した後、治療の効果は、所望であれば、当技術分野で知られるとおりに評価されうる。処置は、必要な場合、または要求される場合、繰り返されうる。
【０１６４】
本発明は、単独で投与されるか、またはＳＣＦと同時投与されるべき、治療上有効な量のＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物も提供する。さらに詳細には、本発明は、細胞または組織交換を必要とする傷害を処置するための医薬組成物を提供する。
【０１６５】
本発明の別の目的、利点、または新規特性は、限定されることを意図されることなく以下の実施例の試験により当業者に明らかになろう。さらに、ここに上で概説されるとおり、そして下の請求項区分で請求されるとおり本発明の種々の実施形態および態様の各々は、以下の実施例における実験上のサポートを見出す。
【実施例】
【０１６６】
ここで、以下の実施例の参照を行い、そしてそれは、上の説明と一緒に、限定なしの形態で本発明を示す。
【０１６７】
一般に、ここに使用される専門用語および本発明で利用される実験室手段としては、分子、生化学、微生物学上および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献で十分に説明される。たとえば、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Sambrookら（1989年）；「Current Protocols in Molecular Biology」、I-III巻、Ausubel,R.M.編（1994年）；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、メリーランド州ボルチモア（1989年）；Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1988年）；Watsonら、「Recombinant DNA」、サイエンティフィック・アメリカン・ブックス、ニューヨーク；Birrenら（編）「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」、1−4巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（1998年）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号で説明されるとおりの方法論；「Cell Biology:A Laboratory Handbook」、I−III巻、Cellis，J.E.編（1994年）；「Current Protocols in Immunology」、I−III巻 Coligan J.E.編（1994年）；Stitesら（編）、「Basic and Clinical Immunology」（8版）、アップルトン・アンド・レンジ、コネチカット州ノーウォーク（1994年）；MishellおよびShiigi（編）、「Selected Methods in Cellular Immunology」、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・シーオー．、ニューヨーク（1980年を参照；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で集約的に記述され、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号を参照；「Oligonucleotide Synthesis」、Gait,M.J.編（1984年）；「Nucleic Acid Hybridization」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編（1985年）；「Transcription and Translation」Hames,B.D.およびHiggins S.J.編（1984年）;「Animal Cell Culture」、Freshney,R.I.編（1986年ｑ;「Immobilized Cells and Enzymes」、IRL Press、（1986年）;「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal,B.、（1984年）および「Methods in Enzymology」、1巻-317、アカデミック・プレス；「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（1990年）;Marshakら、「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」、CSHLプレス（1996年）を参照;その全ては、ここで十分に説明されるように参照により組込まれる。他の一般的文献は、この文書に渡って供される。そこにある手段は、当技術分野で周知であり、そして読み手の便宜を与えると考えられる。そこに含まれる全ての情報は、参照してここに組込まれる。
【０１６８】
実施例１
ＨＧＦを介した運動性およびＣＸＣＲ４が増大されることは、損傷を受けた肝臓へのヒトＣＤ３４+前駆細胞の遊走を仲介する。
【０１６９】
ＨＧＦが、損傷を受けた肝臓でアップレギュレートされること［Armbrust（2002年）Liver 22巻：486−494頁］、そしてヒトＨＧＦの添加は、移植された免疫不全キメラマウスにおけるＣＣｌ4で損傷を受けた肝臓でのヒトアルブミン産生細胞のレベルを増大させること［Wang（2003年）Blood（印刷に先立つ電子公表）］は、周知である。したがって、ＨＧＦは、損傷を受けた肝臓へのヒトＣＤ３４+細胞遊走および補充の調節にも関与することが仮定された。
【０１７０】
ヒト細胞 − ワインズマン研究所（Weinzmann Institute）の人間倫理委員会により承認された手段によって承諾を得た後、臍帯血および成人可動化末梢血（ＭＰＢ）細胞を得た。ＣＤ３４+細胞の濃縮は、先に記述［Kollet（2001年）Blood 97巻：3283−3291頁］されるとおりマグネットビーズでの分離を使用して得られた。ＣＸＣＲ４の発現は、精製抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン１２Ｇ５、アール・アンド・ディー、ミネソタ州ミネアポリス）および二次としてヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣの二次Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ジャクソン、ペンシルベニア州ウエスト・グローブ）を用いて、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１７１】
肝臓損傷 − マウス腹腔内（ＩＰ）にＣＣｌ4を１０、１５または３０μｌ／マウスあたり注入し、そして肝臓サンプルを、示されるとおり注入し続いて数時間、または１−２日以内に採取した。
【０１７２】
免疫細胞化学 − 臍帯血のＣＤ３４+濃縮細胞を、サイトカインの非存在下、またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック（PeproTech））または両方のサイトカインの存在下で、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中で、４０時間インキュベートした。細胞を、フィブロネクチン（１０μｇ／ｃｍ2、カルバイオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ（San Diego,CA））でコートしたカバーガラススリップ（２時間、３７℃、５％ＣＯ２）で平板培養し、ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドで２５分間固定させ、ＰＢＳ中０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中で５分間浸透させた。細胞を、ウサギ抗ヒトＣＸＣＲ４ポリクローナルＡｂ（ケミコン（Chemicon）、カリフォルニア州テメクラ（Temecula,CA））で間接的に免疫標識し、ＰＢＳで頻繁に洗浄し、そしてファロイジン−ＴＲＩＴＣ（シグマ（Sigma）、イスラエル国レホボト（Rehovot,IL））およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）、オレゴン州ユージーン（Eugene,OR））とインキュベートした。ＰＢＳで頻繁に洗浄した後に、サンプルをエルバトール（Elvanol）（Mowiol４−８８；ヘキスト（Hoechst）、ドイツ国フランクフルト（Frankfurt，Germany））にマウントした；全ての手順は、室温で、加湿雰囲気下で行われた。免疫蛍光を観察し、そして１００×倍率で、バイオラッド（BioRad）の共焦点顕微鏡を使用して分析した。
【０１７３】
走化性 − ＳＤＦ−１の勾配に向かってのＣＤ３４+濃縮細胞の遊走は、記述されるとおりにトランスウエルアッセイによって測定した[Ｐｅｌｅｄ(１９９９年)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻：８４５−８４８頁]。ＣＤ３４+細胞を、１２５ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１に向かう遊走の前に、ヒトサイトカインの非存在下、またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、ミネソタ州ミネアポリス、マッキンレイ・プレイス・エヌイー ６１４（614 McKinley Place NE Minneapolis, MN））、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック（PeproTech）、ニュージャージー州ロッキーヒル（Rocky Hill,NJ））、または両方のサイトカインの存在下、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中で、４０時間インキュベートした。
【０１７４】
結果
臍帯血のＣＤ３４+濃縮細胞を、サイトカインの非存在下、またはＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１依存性遊走［Peled（1999年）Science 283巻:845−848頁］を誘導することが知られている、幹細胞因子、HGFまたは両方のサイトカインの組合せの存在下において、４０時間培養した。その後細胞を、抗ＣＸＣＲ４および／または抗重合化アクチンとインキュベートし、ＰＢＳで頻繁に洗浄し、そしてファロイジン−ＴＲＩＴＣおよびヤギ抗ウサギAlexa４８８とインキュベートした。サイトカインの非存在で培養されたＣＤ３４+細胞は、丸い形態を維持する一方で、ＳＣＦで培養した細胞は広がっており、そして分極していた。興味深くは、ＨＧＦは単独で、細胞表面からアクチンをベースとする突起部の形成を誘導し、そしてＳＣＦとＨＧＦの組合せは、ＳＣＦまたはＨＧＦ単独で観察されるもの（データは示されず）と異なる表現型であるラメリポジウム形成（lamellipodia formation）を促進した。最も重要なことに、これらの細胞骨格再編成は、ＣＸＣＲ４アップレギュレーション（図１Ａ）およびＳＤＦ−１に対し機能的に増強された走化性応答（図１Ｂ）と関連があった。ＨＧＦは、ヒト前駆体単独の走化性を誘導しなかった（データは示されず）。しかし、ＨＧＦは、ヒト前駆体の運動性を増大させ、そしてＳＣＦと相乗作用して、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１で誘導される方向性遊走（directional migration）の両方を可能とした。
【０１７５】
これらの予想外の所見は、損傷を受けた肝臓ストレス信号に応答したヒトＣＤ３４+細胞の運動性および方向性遊走を促進する上でのＨＧＦにおける重要な役割を示唆する。
【０１７６】
照射を受けたマウスの骨髄および肝臓でのＨＧＦｍＲＮＡの発現を増大した。
【０１７７】
実施例２
照射は、肝臓および骨髄でのＨＧＦをアップレギュレートする
移植前に使用され、そしてＳＤＦ−１のような様々なサイトカインをアップレギュレートすることが知られている照射が、肝臓そして骨髄でのＨＧＦのアップレギュレーションを誘導しうるかを探索した。
【０１７８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、致死量近くまで照射した（３７５ｃＧｙ）。非照射マウスから得たサンプルと一緒に、２４および４８時間後に採取された肝臓および骨髄サンプルを、Ｔｒｙ試薬（Tryreagent）（ＭＲＣ）でホモジナイズした。ｍＲＮＡを抽出し、そして特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにかけた。図２は、ＨＧＦの発現が、骨髄および肝臓両方において照射により増大されることを示す。
【０１７９】
実施例３
ＨＧＦはＳＣＦと相乗作用して、臍帯血のＣＤ３４＋細胞の再構築能力を増大させる。
【０１８０】
実施例１で示されるとおり、ＨＧＦは、ヒト前駆体の運動性を増大させ、そしてＳＣＦと相乗作用して、ＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１で誘導される方向性遊走の両方を可能とした。
【０１８１】
ＨＧＦが、ＳＣＦと相乗作用して、造血前駆体の再構築能力を増大させうるか探査するために、別の実験を行った。したがって、ヒト臍帯血のＣＤ３４＋細胞を、ＳＣＦ、ＨＧＦまたは両方の組合せの存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、照射し（３７５ｃＧｙ）、そして培養細胞で移植した。１ヶ月後、移植されたマウスの骨髄は、ヒト移植細胞のレベルを調査した。
【０１８２】
臍帯血のＣＤ３４＋細胞を、３６時間、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ中のＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（群当たり３匹）を、照射し（３７５ｃＧｙ）、そして２×１０５細胞／マウスに由来する培養細胞で、２４時間後移植した。１ヶ月後、抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ ＡｂおよびＦＡＣＳカリブル（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用することによって、移植されたマウスの骨髄において、ヒト移植細胞のレベルを調査した。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】
表２での結果は、ＨＧＦで処理された細胞のみが、コントロール細胞に類似して、そしてＳＣＦで前処理された細胞より明らかに少ない範囲で、骨髄を再構築することを示す。対照的に、ＳＣＦおよびＨＧＦで同時刺激された細胞は、ＨＧＦまたはＳＣＦ単独で処理された細胞と比較して再構築能力が増大されたことを示す。
【０１８５】
実施例４
ＨＧＦは、ＣＣｌ４損傷に続いて、ＳＤＦ−１に向かって遊走する骨髄細胞の能力、および前駆細胞可動化の速度を増大させる。
【０１８６】
実施例１で示されるとおり、幹細胞前駆体へのエキソビボＨＧＦ投与は、細胞表面におけるＣＸＣＲ４発現を誘導し、そしてＳＤＦ−１への細胞の遊走を増強する。
【０１８７】
臓器損傷に続く再構築におけるＨＧＦのインビボ投与の効果を知るために、以下の実験を行った。
【０１８８】
その目的のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４単独で（損傷を誘導するために）、ＣＣｌ４続いてＨＧＦの組合せで、処理するか、または未処理（コントロール）のままにした。マウスを屠殺し、骨髄細胞を抽出し、そしてＳＤＦ−１へのこのような骨髄細胞の遊走を、インビトロでモニターした（図３）。
【０１８９】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４単独の単回注射（１０ｍｌ ＣＣｌ４）で、またはＣＣｌ４、続いて２日後に始まるＨＧＦの４回の連続毎日注射（１．５ｍｇ／マウス、ＣＣｌ４＋ＨＧＦ）で処理した。これらの処理マウスに由来する骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導性遊走を、非処理マウス（ｃｔｒｌ）から、またはＧ−ＳＣＦ（３００ｍｇ／Ｋｇ、５日連続）で処理したマウスに由来する骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導性遊走と比較した。
【０１９０】
ＣＣｌ４処理マウスから単離された骨髄細胞は、コントロールの非処理マウスから得られる骨髄細胞で得られる遊走のレベルと類似のレベルのＳＤＦ−１依存性遊走を示した。対照的に、Ｇ−ＳＣＦ処理マウスから単離された骨髄細胞は、コントロールの非処理マウスから得られる骨髄で観察される遊走のレベルと比較して、増強されたレベルのＳＤＦ−１依存性遊走を示した。予想外にも、ＨＧＦおよびＣＣｌ４での混合処理を受けるマウスから単離された骨髄細胞は、ＣＣｌ４処理または未処理マウスから得られる骨髄細胞で観察された遊走のレベルに比較して、ＳＤＦ−１依存性遊走のレベルが増強されたことを示した。
【０１９１】
ＨＧＦ／ＣＣｌ４処理されたマウスで観察される骨髄細胞の遊走能力における増大の点で、ＨＧＦ／ＣＣｌ４処理されたマウスが、その結果として骨髄可動化、血流中の原種前駆体細胞（progenitor precursor cells）のレベルを増大しうるであろうと仮説を立てた。
【０１９２】
この仮説を検証するために、循環中の原種前駆体の数が、ＣＣｌ４処理で、ＣＣｌ４およびＨＧＦ処理対未処理マウスでモニターされた（図３）。
【０１９３】
得られた結果は、ＣＣｌ４処理による損傷または炎症の誘導が、血液循環での原種前駆体の数を増大させたことを示した。この結果は、ＣＣｌ４処理による損傷または炎症の誘導が、骨髄から血液までであり、可動化についてのポジティブコントロールより少ない程度で、原種前駆体の可動化を促進することを示唆する（Ｇ−ＳＣＦを参照）。しかし、ＨＧＦ投与との組合せでのＣＣｌ４処理により誘導される炎症または損傷は、血液循環での原種前駆体のレベルにおけるさらなる増大を誘導した。
【０１９４】
得られた結果は、細胞血液循環における前駆体レベルが増大したことにより、損傷を受けた臓器へ自家再構築（self repopulation)および／または自家移植（self engraftment)を促進するために、臓器炎症および／または損傷に罹っている対象へのＨＧＦの投与を示唆する。
【０１９５】
明瞭さのため、別個の実施形態の内容で記述される本発明の特定の特徴は、単独の実施形態での組合わせでも提供されうることが予測される。反対に、簡潔さのため、単独の実施形態の内容で記述される本発明の種々の特徴は、別個に、またはいずれかの適切な従属の組合わせでも供されうる。
【０１９６】
本発明は、それの特定の実施形態と関連して記述されたが、多くの代替物、修飾および変異は、当業者に明らかであることは明白である。したがって、付随の請求項の概念および広範な範囲に入る全てのこのような代替物、修飾および変異を受け入れることが意図される。本明細書で明記される全ての出版物、特許および特許出願は、個別の出版物、特許または特許出願が、参照してここに組込まれることが特定に、そして個々に示される場合に、同じ範囲までそれらの全体に参照して明細書に組込まれる。さらに、本出願でのいずれの参照文献の引用および同一性は、かかる参照文献が、本発明に先行技術として利用可能であるという認可と見なされるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１Ａ】図１Ａは、フローサイトメトリーを使用して測定された場合の臍帯血の ＣＤ３４+細胞中のＣＸＣＲ４のサイトカイン誘導発現を描くグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、トランスウエル遊走アッセイを使用して測定された場合のＨＧＦ、ＳＣＦまたはそれの組合せの存在下で、ＣＤ３４+細胞のＳＤＦ−１を介した方向性遊走（SDF-1 mediated directed migration）を描く棒グラフである。データは、遊走の百分率を表す。（ａ）文字は、ＳＤＦ−１の不在下で自律遊走を示す。
【図２】図２は、照射を受けたマウスの骨髄および肝臓におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現が増大したことを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、致死的に照射（３７５ｃＧｙ）した。非照射マウスから得られたサンプルと一緒に２４時間および４８時間後に採取した肝臓および骨髄サンプルを、Ｔｒｙ試薬（Tryreagent）（ＭＲＣ）中でホモジナイズさせた。ｍＲＮＡを、標準プロトコールを使用して抽出させた。ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲにかけた。
【図３】図３は、ＨＧＦが、ＣＣｌ４損傷に続いてＳＤＦ−１に向かって遊走する骨髄細胞の能力、および前駆細胞可動化の速度を増大することを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＣＣｌ４（１０ｍｌ、ＣＣｌ４）単独の単回注入、またはＣＣｌ４、続いて２日後に始まるＨＧＦの４回継続の毎日注入（１．５ｍｇ／マウス、ＣＣｌ４＋ＨＧＦ）で処理した。これらのマウスの骨髄細胞によるＳＤＦ−１誘導遊走、および血流中の前駆体のレベルを、非処理マウス（コントロール）と、またはＧ−ＳＣＦ（３００ｍｇ／Ｋｇ、５日間連続）で処理したマウスと比較した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法であって、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、幹細胞を、成長因子および／またはサイトカインにさらすことを包含する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、造血幹細胞である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項６記載の方法。
【請求項８】
造血幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＧＦまたはそれの前記活性部分に幹細胞をさらすことは、
（ｉ）幹細胞中で該ＨＧＦまたはそれの該活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）その幹細胞を、該ＨＧＦまたはそれの該活性部分と接触させることによって達成される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
さらに、幹細胞をＨＧＦ−受容体にさらすことを包含する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、前記幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それによりその対象における細胞または組織交換を必要とする障害を治療する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で処理した治療上有効な量の幹細胞を供することを包含する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、幹細胞の前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体の該レベルを増大させる能力がある、成長因子および／またはサイトカインで、前記幹細胞を処置することを包含する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させ、それにより細胞または組織交換を必要とする障害を治療する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の治療上有効な量を供することを包含する方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
さらに、幹細胞の前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体の該レベルを増大させる能力のある、成長因子および／またはサイトカインの治療上有効な量を、前記それを必要とする対象に供することを包含する請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記それを必要とする対象に、幹細胞を供することを包含する請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
標的組織に対する幹細胞のホーミングを増大させるための医薬品の製造のためのＨＧＦまたはそれの活性部分の用途。
【請求項２８】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項２７記載の用途。
【請求項２９】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項２８記載の用途。
【請求項３０】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項２９記載の用途。
【請求項３１】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項２７記載の用途。
【請求項３２】
前記標的組織が、骨髄、血管、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経系、皮膚、骨および骨格筋よりなる群から選択される請求項２７記載の用途。
【請求項３３】
さらに、成長因子および／またはサイトカインを包含する請求項２７〜３２のいずれかに記載の用途。
【請求項３４】
前記成長因子および／またはサイトカインは、ＳＣＦおよびＩＬ−６より構成される群から選択される請求項３３記載の用途。
【請求項３５】
該成長因子が、ＳＣＦである請求項３４記載の用途。
【請求項３６】
移植に適した幹細胞を産生させる方法であって、
（ａ）幹細胞を採取すること、
（ｂ）該幹細胞を、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすこと、
（ｃ）所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞を単離して、それにより、移植に適した幹細胞を産生させること、
を包含する方法。
【請求項３７】
前記幹細胞を採取することが、
（ｉ）幹細胞可動化手段；および／または
（ii）外科的手段によって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
さらに、ＣＸＣＲ４の発現を増大させる能力のある成長因子および／またはサイトカインに前記幹細胞をさらすことを包含する請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記造血幹細胞が、間葉幹細胞である請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分に前記幹細胞をさらすことが、
（ｉ）該幹細胞中で該ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）該幹細胞を、該ＨＧＦまたはそれの活性部分と接触させることによって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
前記所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞を単離することが、ＦＡＣＳによって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項４６】
さらに、工程（ｃ）に続いて前記所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する前記幹細胞のホーミング能力を測定することを包含する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする第一のポリヌクレオチド配列、および細胞中の該ポリヌクレオチドの発現を指示する誘導性シス作用調節因子、および前記第一のポリヌクレオチド配列に翻訳で融合されるべき第二のポリヌクレオチド配列を包含し、前記第二のポリヌクレオチド配列は、前記細胞の中から外へ前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分の分泌を指示する能力のあるシグナルペプチドをコードするものである核酸構築物を包含する幹細胞。
【請求項４８】
さらに、ＩＬ−６およびＳＣＦよりなる群から選択されるサイトカインまたは成長因子をコードする第三のポリヌクレオチド配列を包含する請求項４７記載の幹細胞。
【請求項４９】
ＳＣＦである第三のポリヌクレオチドを包含する請求項４８記載の幹細胞。
【請求項５０】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項４７〜４９のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項５１】
ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする内因性ポリヌクレオチドを発現するように形質転換された幹細胞を包含する細胞株。
【請求項５２】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項５０または５１記載の細胞株。
【請求項５３】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５２記載の細胞株。
【請求項５４】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項５３記載の細胞株。
【請求項５５】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項５２記載の細胞株。
【請求項５６】
細胞培養物であって、
（ｉ）幹細胞；および
（ii）前記幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分のそれぞれを発現するフィーダー細胞を包含する細胞培養物。
【請求項５７】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項５６記載の細胞培養物。
【請求項５８】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５７記載の細胞培養物。
【請求項５９】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項５８記載の細胞培養物。
【請求項６０】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項５６記載の細胞培養物。
【請求項６１】
化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法であって、
幹細胞の内因性ＨＧＦまたはそれの活性部分の発現または活性をアップレギュレートして、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることを包含する方法。
【請求項６２】
幹細胞運動性を増大させる方法であって、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する方法。
【請求項６３】
さらに、成長因子および／またはサイトカインに幹細胞をさらすことを包含する請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
サイトカインが、ＳＣＦである請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項６２記載の方法。
【請求項６７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
幹細胞が、間葉幹細胞である請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分に幹細胞をさらすことが、
（ｉ）幹細胞中の該ＨＧＦまたはそれの該活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）該ＨＧＦまたはそれの該活性部分と、幹細胞を接触させることによって達成される請求項６２記載の方法。
【請求項７１】
臓器炎症および／または損傷に罹っている対象における損傷臓器に対する自家再増殖および／または自家移植を促進する方法であって、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の投与を包含する方法。
【請求項７２】
さらに、ＳＣＦを包含する、請求項７１記載の自家再増殖および／または自家移植を促進する方法。
【請求項７３】
幹細胞およびＳＣＦの運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物。
【請求項７４】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療するための請求項７３記載の医薬組成物。
【請求項１】
化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法であって、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、幹細胞を、成長因子および／またはサイトカインにさらすことを包含する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、造血幹細胞である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項６記載の方法。
【請求項８】
造血幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＧＦまたはそれの前記活性部分に幹細胞をさらすことは、
（ｉ）幹細胞中で該ＨＧＦまたはそれの該活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）その幹細胞を、該ＨＧＦまたはそれの該活性部分と接触させることによって達成される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
さらに、幹細胞をＨＧＦ−受容体にさらすことを包含する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、前記幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させて、それによりその対象における細胞または組織交換を必要とする障害を治療する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分で処理した治療上有効な量の幹細胞を供することを包含する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、幹細胞の前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体の該レベルを増大させる能力がある、成長因子および／またはサイトカインで、前記幹細胞を処置することを包含する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させ、それにより細胞または組織交換を必要とする障害を治療する能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の治療上有効な量を供することを包含する方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの化学誘引物質受容体が、ＣＸＣＲ４である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
さらに、幹細胞の前記少なくとも１種の化学誘引物質受容体の該レベルを増大させる能力のある、成長因子および／またはサイトカインの治療上有効な量を、前記それを必要とする対象に供することを包含する請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記それを必要とする対象に、幹細胞を供することを包含する請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
標的組織に対する幹細胞のホーミングを増大させるための医薬品の製造のためのＨＧＦまたはそれの活性部分の用途。
【請求項２８】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項２７記載の用途。
【請求項２９】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項２８記載の用途。
【請求項３０】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項２９記載の用途。
【請求項３１】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項２７記載の用途。
【請求項３２】
前記標的組織が、骨髄、血管、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経系、皮膚、骨および骨格筋よりなる群から選択される請求項２７記載の用途。
【請求項３３】
さらに、成長因子および／またはサイトカインを包含する請求項２７〜３２のいずれかに記載の用途。
【請求項３４】
前記成長因子および／またはサイトカインは、ＳＣＦおよびＩＬ−６より構成される群から選択される請求項３３記載の用途。
【請求項３５】
該成長因子が、ＳＣＦである請求項３４記載の用途。
【請求項３６】
移植に適した幹細胞を産生させる方法であって、
（ａ）幹細胞を採取すること、
（ｂ）該幹細胞を、ＨＧＦまたはそれの活性部分にさらすこと、
（ｃ）所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞を単離して、それにより、移植に適した幹細胞を産生させること、
を包含する方法。
【請求項３７】
前記幹細胞を採取することが、
（ｉ）幹細胞可動化手段；および／または
（ii）外科的手段によって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
さらに、ＣＸＣＲ４の発現を増大させる能力のある成長因子および／またはサイトカインに前記幹細胞をさらすことを包含する請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記造血幹細胞が、間葉幹細胞である請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分に前記幹細胞をさらすことが、
（ｉ）該幹細胞中で該ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）該幹細胞を、該ＨＧＦまたはそれの活性部分と接触させることによって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
前記所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞を単離することが、ＦＡＣＳによって達成される請求項３６記載の方法。
【請求項４６】
さらに、工程（ｃ）に続いて前記所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する前記幹細胞のホーミング能力を測定することを包含する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする第一のポリヌクレオチド配列、および細胞中の該ポリヌクレオチドの発現を指示する誘導性シス作用調節因子、および前記第一のポリヌクレオチド配列に翻訳で融合されるべき第二のポリヌクレオチド配列を包含し、前記第二のポリヌクレオチド配列は、前記細胞の中から外へ前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分の分泌を指示する能力のあるシグナルペプチドをコードするものである核酸構築物を包含する幹細胞。
【請求項４８】
さらに、ＩＬ−６およびＳＣＦよりなる群から選択されるサイトカインまたは成長因子をコードする第三のポリヌクレオチド配列を包含する請求項４７記載の幹細胞。
【請求項４９】
ＳＣＦである第三のポリヌクレオチドを包含する請求項４８記載の幹細胞。
【請求項５０】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項４７〜４９のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項５１】
ＨＧＦまたはそれの活性部分をコードする内因性ポリヌクレオチドを発現するように形質転換された幹細胞を包含する細胞株。
【請求項５２】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項５０または５１記載の細胞株。
【請求項５３】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５２記載の細胞株。
【請求項５４】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項５３記載の細胞株。
【請求項５５】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項５２記載の細胞株。
【請求項５６】
細胞培養物であって、
（ｉ）幹細胞；および
（ii）前記幹細胞の少なくとも１種の化学誘引物質受容体のレベルを増大させる能力のあるＨＧＦまたはそれの活性部分のそれぞれを発現するフィーダー細胞を包含する細胞培養物。
【請求項５７】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項５６記載の細胞培養物。
【請求項５８】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項５７記載の細胞培養物。
【請求項５９】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項５８記載の細胞培養物。
【請求項６０】
前記幹細胞が、間葉幹細胞である請求項５６記載の細胞培養物。
【請求項６１】
化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させる方法であって、
幹細胞の内因性ＨＧＦまたはそれの活性部分の発現または活性をアップレギュレートして、それにより化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増大させることを包含する方法。
【請求項６２】
幹細胞運動性を増大させる方法であって、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分に、幹細胞をさらすことを包含する方法。
【請求項６３】
さらに、成長因子および／またはサイトカインに幹細胞をさらすことを包含する請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記成長因子および／またはサイトカインが、ＳＣＦおよびＩＬ−６よりなる群から選択される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
サイトカインが、ＳＣＦである請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記幹細胞が、造血幹細胞である請求項６２記載の方法。
【請求項６７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/低造血幹細胞である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
幹細胞が、間葉幹細胞である請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
前記ＨＧＦまたはそれの該活性部分に幹細胞をさらすことが、
（ｉ）幹細胞中の該ＨＧＦまたはそれの該活性部分をコードするポリヌクレオチドを発現させ；および／または
（ii）該ＨＧＦまたはそれの該活性部分と、幹細胞を接触させることによって達成される請求項６２記載の方法。
【請求項７１】
臓器炎症および／または損傷に罹っている対象における損傷臓器に対する自家再増殖および／または自家移植を促進する方法であって、幹細胞の運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分の投与を包含する方法。
【請求項７２】
さらに、ＳＣＦを包含する、請求項７１記載の自家再増殖および／または自家移植を促進する方法。
【請求項７３】
幹細胞およびＳＣＦの運動性を増大させる能力があるＨＧＦまたはそれの活性部分を包含する医薬組成物。
【請求項７４】
細胞または組織交換を必要とする障害を治療するための請求項７３記載の医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５２２６０４（Ｐ２００６−５２２６０４Ａ）
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７６０３（Ｐ２００６−５０７６０３）
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１２１
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ウィンドウズ
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１２１
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ウィンドウズ
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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