北アメリカ薬用人参分留物の形成方法、それらを含む生成物および免疫賦活剤としての使用
【課題】北アメリカ薬用人参（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）から分留物を調製する化学的形成方法およびこれらの分留物を含有する薬学的組成物を提供する。
【解決手段】アメリカ薬用人参につき、アルコール、水等の溶媒により一定温度における数時間の抽出と、分離を繰り返すことによって得られた沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ２、ＰＱ２２３を生成する。
【解決手段】アメリカ薬用人参につき、アルコール、水等の溶媒により一定温度における数時間の抽出と、分離を繰り返すことによって得られた沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ２、ＰＱ２２３を生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は、北アメリカ薬用人参（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）からの分留物の化学的形成方法およびこれらの分留物を含有する組成物に関する。本発明の生成物は、抗体の生成を賦活するのに、あるいは、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌などの低免疫により特徴付けられる健康状態を対象とする治療法として、用いられ得る。また、本発明の生成物は、免疫系の深刻な抑制を引き起こす化学療法や放射線療法を受ける癌患者に対するサプリメントとして用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
数百年の間、薬草化合物などのある種の無毒性薬品の使用は、さまざまな生理学的状態に、特に東洋で受け入れられてきた。Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒは最もよく知られた伝統的な中国薬である。薬用人参抽出物の重要な薬理学的活性は、単独で、あるいは他の薬品との組み合わせで、腎臓損傷の緩和、発癌の抑制およびストレスの予防を含む。また、固体の免疫学的反応性に対する薬用人参の影響について数多くの報告がなされている。報告されたある免疫賦活特性は、細胞レベルでのある基本的な免疫機能の賦活と同様に、感染に対する宿主抵抗の増強、抗炎症効果、腫瘍成長の抑制を含む。アメリカ薬用人参（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）は、多くの有益な健康上の効果を有する健康サプリメントとしての評判を得た薬用人参のもう一つの種である。いくつかの科学者グループが、薬用人参中に存在するポリサッカライドの単離および構造の特定を試みた。あるポリサッカライドは免疫系の賦活に活性があることが示された。
【０００３】
薬用人参ポリサッカライドの単離、特徴付けおよび生物学的評価についての一連の研究が、共立薬科大学（日本）のＴｏｍｏｄａのグループによりなされた。ある一連の研究では、薬用人参ポリサッカライドが酸性度に基づいて分留された。朝鮮薬用人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）の根から免疫学的に活性な２つの酸性のポリサッカライドが単離された［１，２］。スライスされた根がお湯で抽出された。抽出物は、硫酸ナトリウムの存在下においてセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）で処理された。沈殿物は、分離され、透析され、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用され、２つの純粋なポリサッカライドが得られ、それらはｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡおよびｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢと名付けられた。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｆ上のゲルクロマトグラフィーは、ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡおよびｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢの分子量として、それぞれ１．６×１０5、および、５．５×１０4の値を与えた。定量分析は、ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡが２１．３％のアラビノース、５３．４％のガラクトース、２．０％のラムノース、１６．０％のガラクツロン酸および２．７％のグルクロン酸を含むことを示した。これらの成分糖のモル比は１１：２２：１：６：１であった。ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢは、１１．０％のアラビノース、３２．３％のガラクトース、８．１％のラムノース、３９．９％のガラクツロン酸および５．０％のグルクロン酸を含んでいた。これらの成分糖のモル比は３：７：２：８：１であった。両ポリサッカライドとも、投与量に依存して、炭素除去試験における著しい細胞内皮系の有力な活性、際立った抗補体活性およびアルカリホスファターゼ誘導活性を示した。
【０００４】
別の研究［３］において、ＣＴＡＢで処理された上記の抽出物の上澄みから２つの追加のポリサッカライドが単離された。即ち、上澄みがエタノール中に移された。沈殿物は分離され、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５の各カラムに適用され、Ｓ−ＩＡおよびＳ−ＩＩＡと名付けられた２つの純粋なポリサッカライドを与えた。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｆ上のゲルクロマトグラフィーは、Ｓ−ＩＡおよびＳ−ＩＩＡの分子量として、それぞれ５．６×１０4、および、１．０×１０5の値を与えた。ｇｉｎｓｅｎａｎ Ｓ−ＩＡは、４２．３％のアラビノース、５０．８％のガラクトース、６．９％のガラクツロン酸を８：８：１のモル比で含む。ｇｉｎｓｅｎａｎ Ｓ−ＩＩＡは、４２．０％のＬ−アラビノース、３２．６％のガラクトース、６．２％のグルコース、１９，２％のガラクツロン酸を含む。モル比は１５：１０：２：５である。
【０００５】
Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇの葉および根からのいくつかのポリサッカライド分留物は、日本の北里大学のオリエンタル・メディシン・リサーチセンターにおけるＹａｍａｄａのグループにより分離された。化学特性および生物学的活性が調査および比較された［４］。
【０００６】
中国産の薬用人参の根と葉は、それらのジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）を取り除くためにエタノールで処理した後、水で抽出され、残渣が０．５ＭのＮａＯＨで抽出されて、水溶性およびアルカリ可溶性のポリサッカライド分留物（水溶性の分留物はＧＲ−２およびＧＬ−２、アルカリ可溶性の分留物はＧＲＡ−２およびＧＬＡ−２とそれぞれ名付けられる）を与えた。成分ポリサッカライドの酸性度に基づいて、セチルトリメチルアンモニウムとの処理により、全ての分留物が、強酸性（ＧＲ−３、ＧＬ−３、ＧＲＡ−３、およびＧＬＡ−３と名付けられた）、弱酸性（ＧＲ−４、ＧＬ−４、ＧＲＡ−４、およびＧＬＡ−４と名付けられた）、中性（ＧＲ−５、ＧＬ−５、ＧＲＡ−５、およびＧＬＡ−５と名付けられた）のポリサッカライド分留物にさらに分留された。根は葉よりもポリサッカライドをより多量に含んでいた。根からの強酸性のポリサッカライド分留物は５０％以上にもおよぶ高率のウロン酸含有量を有していた。似た成分糖は全ての分留物から検出された。それらは、ラムノース、アラビノース、ガラクトース、グルコース、ガラクツロン酸およびグルクロン酸であった。ガラクツロン酸は、主なウロン酸成分であった。
【０００７】
最も高い抗補体活性を有する分留物であるＧＬ−３は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌのカラム処理、およびエタノール沈殿によりさらに分留されて、ＧＬ−ＰＩからＧＬ−ＰＩＶよ名付けられた分留物を与えた［５］。全ての分留物は３２〜４４％のウロン酸を含んでいた。分留物ＰＩは５００００という最も高い分子量を有していた。ＰＩおよびＰＩＩは主としてＲｈａ、Ｇａｌ、およびＧａｌＡからなり、ＰＩＩＩはさらにＦｕｃを含んでおり、一方、ＰＩＶはＧａｌ、Ｇｌｃ、およびＧａｌＡからなっていた。詳細な構造決定が行われた。
【０００８】
抗潰瘍ペクチンポリサッカライド（ＧＬ−ＢＩＩＩ）が、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６ＢおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂのクロマトグラフィーによって、弱酸性のポリサッカライド分留物ＧＬ−４から単離された。主としてＲｈａ、Ａｒａ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、ＧａｌＡ、およびＧｌｃＡから、３：４：２：１０：１：７：４のモル比で構成されていた。詳細な構造決定が行われた［６］。
【０００９】
他のマクロファージＦｃレセプタ発現増強ポリサッカライド（ＧＬ−４ＩＩｂ２）が、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂのアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＧＬ−４から分離された。化学分析は、試料が６５％の炭水化物と３３．７％のウロン酸を含むことを示した。成分分析と構造決定が行われた［７］。
【００１０】
抗補体活性を有する他のＰａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ抽出物、Ｇ−１１５が同じグループによって研究された［８］。Ｇ−１１５は、抗補体活性およびマイトジェン活性に対する活性物質を特徴付けるために分留された。最も効力のある抗補体活性は、未分留のポリサッカライド分留物Ｇ−１１５Ｇにおいて観測され、一方、水溶性で透析できる分留物であるＧ−１１５Ｅは最も効力のあるマイトジェン活性を示した。Ｇ−１１５Ｇは、さらにセチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの沈殿形成、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアニオン交換クロマトグラフィー、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂでのゲル濾過によって精製され、目立って効力のある抗補体のポリサッカライドであるＧ−１１５Ｉ１−ＩＩａ−２−３が得られた。このポリサッカライドは均質であった。その分子量は３．６８×１０5であると見積もられた。それは、主としてアラビノース、ガラクトースおよびグルコースと、これに加えて少量のガラクツロン酸、グルクロン酸、およびラムノースからなる。
【００１１】
薬用人参ポリサッカライドが、日本の東北大学薬学部のＨｉｋｉｎｏのグループにより、韓国、中国、および日本の薬用人参から単離された。薬用人参ポリサッカライドの低血糖活性がテストされた。組成と構造のある特色が明らかにされた［９−１４］。
【００１２】
３つのポリサッカライド、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃがアメリカの薬用人参から単離された［１４］。それらの分子量は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００上のゲルクロマトグラフィーから２．０×１０6より大きいと見積もられた。中性糖成分は、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａに対してマンノースおよびグルコース（モル比は１．０：２．３）、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ｂに対してマンノースおよびグルコース（モル比は１．０：５．５）、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ｃに対してキシロースであった。ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃ中の酸性糖成分は、それぞれ１０．８、１１．７、および７．１％であることがわかった。これらのポリサッカライド中のペプチド部分の含有率は、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃに対してそれぞれ２．７、２．９、および２．３％であった。これらのポリサッカライドの全てが、通常のマウスおよびアロキサンで減じられた低血糖のマウスにおいて低血糖効果を示した。
【００１３】
分子量が１５０，０００の酸性のポリサッカライドは、ｇｉｎｓａｎと呼ばれるが、韓国、ソウルの韓国癌センター病院の免疫学研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｋｏｒｅａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の研究グループにより、Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇから単離された［１５］。このポリサッカライドは３．７％のタンパク質、４７．１％のヘキソース（グルコースおよびガラクトース）、４３．１％のウロン酸（ガラクツロン酸）からなっていた。薬用人参は、Ｔ細胞とＢ細胞の増殖を誘発し、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞の両方から、内生的に生成されたマルチプルサイトカインを通してリンフォカイン活性化障害性細胞を発生させた［１６］。
【００１４】
中国のノースウエスト・ノーマル・ユニバーシティ（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＭｉａｏらは、アメリカの薬用人参からポリサッカライドを単離した。精製および構造解析が行われた［１７］。
【００１５】
アメリカの薬用人参からのポリサッカライドの生物学的活性は、ノーマン・ブスーン・ユニバーシティ・オブ・メディカル・サイエンス（Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の研究グループにより研究された［１８，１９］。彼らは、アメリカの薬用人参からのポリサッカライド（ＰＰＱ）がリンパ球転換を増強することを発見した。マウスの脾臓リンパ球からのサイトカインのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での生成に対するＰａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ（ＰＰＱ−１）からのポリサッカライドの影響が研究された。データは、ＰＰＱ−１が免疫機能を調整することを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，２２−５（１９９３）． 非特許文献１は、朝鮮薬用人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）の根から免疫学的に活性な２つの酸性のポリサッカライドが単離されることについて開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明のまとめ）
本発明者らは、あるアメリカの薬用人参の抽出物が免疫調整特性を有することを発見した。ＣＶＴ−Ｅ００２、およびそれから精製された分留物ＰＱ2およびＰＱ223が特にマウスの脾臓細胞がＢ細胞を増殖するように刺激を与え、それは次に多量の抗体を生成させる。また、分留物は血清免疫グロブリン（例えばトータルＩｇＧ）レベルを増加させ、マクロファージにＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αを生成するように刺激を与える。これらの分留物は、一般的伝染病および他の免疫不全関連症の防止あるいは治療に使用される可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明は、アメリカの薬用人参の試料から薬用人参分留物ＰＱ2、ＰＱ223、ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法に注目する。
具体的に述べると、薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法は、以下を有する：
−アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
−その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
−少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
−その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
−その後で、アルコールを含む第３の溶媒に以前の工程において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
−上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2を生成すること。
【００１９】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法は、以下を有する：
−上述のように、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
−上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
−上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること。
【００２０】
薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法は、以下を有する：
−薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で、アルコールを含む第１の溶媒にアメリカの薬用人参を混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
−その後で、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、薬用人参残渣溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
−その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、薬用人参抽出物を含む抽出物水溶液を生成すること；および
−上記抽出物水溶液を乾燥させて薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を生成すること。
【００２１】
本発明は、また、上述の方法で調製された薬用人参分留物ＰＱ2、ＰＱ223、およびＣＶＴ−Ｅ００２を含む。
【００２２】
本発明は、特定の炭水化物内容物を有する薬用人参分留物をさらに含む。
第１の薬用人参分留物は、約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
第２の薬用人参分留物は、約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
第３の薬用人参分留物は、約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
【００２３】
本発明は、また、本発明の薬用人参分留物を有し、薬学的に許容なキャリアに混合した薬学的組成物を含む。
本発明は、本発明による薬用人参分留物の、低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製において、単独でのあるいは他の薬剤との組み合わせての使用をさらに含む。
【００２４】
本発明は、また、ＩＬ−１、ＩＬ−６、および／またはＴＮＦ−αの細胞中の生成を刺激するための本発明に係る薬用人参分留物の使用を含む。
本発明は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫グロブリンの生成を刺激するための本発明に係る薬用人参分留物の使用をさらに含む。
また、Ｂリンパ球の増殖とそれらからの抗体の生成を活性化するための本発明に係る薬用人参分留物の使用が含まれる。
【００２５】
本発明は、また、健康状態を治療するのに効果的な量の本発明に係る薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態を治療する方法を含む。
【００２６】
（本発明の詳細な記述）
薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
（ｅ）少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
（ｆ）その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
（ｇ）その後で、アルコールを含む第３の溶媒にステップ（ｆ）において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
（ｈ）上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2 を生成すること。
【００２７】
第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおけるアルコールは、薬用人参に不活性で、所望の生成物から容易に分離可能であるアルコールを含む。当業者は、これらの必要条件を満たすアルコールをたやすく選ぶことができるだろう。好ましくは、それぞれのアルコールが、他と関係なく、飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む。より好ましくは、それぞれのアルコールが、他と関係なく、エタノールあるいはメタノールを含む。
【００２８】
ステップ（ａ）と（ｃ）のそれぞれにおいて、得られる溶液を約３時間の間加熱することが好ましい。ステップ（ａ）において、第１の溶媒および薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で混合されることが好ましく、最も好ましくは薬用人参１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される。ステップ（ｃ）において、水および第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で混合されることが好ましく、最も好ましくは薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合される。
【００２９】
上述の方法においてステップ（ｄ）に続いてすぐ、第１の薬用人参抽出物が随意に濃縮されてもよい。これは、当業者によく知られた手順によるどんな方法によって行われてもよい。例えば、第１の薬用人参抽出物を含む第１の水溶液は遠心分離機で（例えば２５００〜１００００ｒｐｍの速さで約５〜１５分）分離されてもよい。また、第１の水溶液は濾過されてもよい。第１の薬用人参抽出物の濃縮に替えて、あるいはこれに追加して、第１の薬用人参抽出物は後で使用するようにフリーズドライされてもよい。
【００３０】
ステップ（ｅ）において、第２の抽出物水溶液は、少なくとも第１の薬用人参抽出物の一部を含んでいる。第２の抽出物水溶液中の第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２であり、より好ましくは１：２０であることが重要である。これは、多くの方法のいずれでも達成できる。上述のように、第１の薬用人参抽出物が、ステップ（ｄ）に続いて濃縮される、および／または、フリーズドライされるならば、所望の比率を達成するように第１の薬用人参抽出物に水が加えられるべきである。あるいは、第１の抽出物水溶液の一部あるいは全部が第２の抽出物水溶液に用いられてもよい。必要なら、所望の比率を達成するために、追加の水を加えてもよい。所望の量の第１の薬用人参抽出物を含有する第１の抽出物水溶液の少なくとも一部を使用することは、ステップ（ｄ）と（ｅ）の間に追加の濃縮またはフリーズドライステップを実施する必要を逃れるだろう。
【００３１】
ステップ（ｆ）において、第２の溶媒の水に対する比率は約３：４であることが好ましい。
ステップ（ｇ）において、第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約２：１であることが好ましい。
【００３２】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）上述の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
（ｂ）上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
（ｃ）上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること。
【００３３】
第１の溶出分留物はＰＱ2Ａとしても知られており、第２の溶出分留物はＰＱ2Ｂとしても知られている。これらの溶出分留物は別々に単離され得る。また、追加の溶出分留物ＰＱ2Ｃ（溶出体積が９５および１１０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致する）、およびＰＱ2Ｄ（溶出体積が１２０および２５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致する）を生成するために、上述と同じ方法が用いられてもよい。これらの分留物は別々に単離され得る。また、ＰＱ223の他に、ＰＱ2ＡからＰＱ2Ｄの２以上の分留物からなる組成物も形成されることができる。
【００３４】
薬用人参分留物ＰＱ2は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分留されることが好ましい。しかしながら、当業者に知られている他のいずれの種類の分留も適している。
ゲル濾過クロマトグラフィーを行う手順は、フローレート、試料体積、および手順が実施される温度に関して、製作者の推薦に従って、当業者によく知られている。これらの要因の製作者の指定範囲内の変動は、クロマトグラフィー試験の結果に対する明らかな影響はない。
【００３５】
炭水化物内容物の決定は、当業者に知られたいずれの手順によって行われてもよい。分留物の炭水化物組成を決定するのに、マイクロフィルタープレートアッセイ（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ）が実施されることが好ましい。そのようなアッセイは当業者によく知られている。例えば、Ｄｕｂｏｉｓら、Ａｎａｌ．ｃｈｅｍ．２８：３５０−５６（１９５６）を参照されたい。この結果、参照により組み込まれる。マイクロフィルタープレートアッセイに用いるのにもたらされた試料の吸収は、好ましくは４９２ｎｍで実施される。
【００３６】
薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で、アルコールを含む第１の溶媒にアメリカの薬用人参を混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、薬用人参残渣溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、薬用人参抽出物を含む抽出物水溶液を生成すること；および
（ｅ）上記抽出物水溶液を乾燥あるいは濃縮させて薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を生成すること。
【００３７】
第１の溶媒におけるアルコールは、薬用人参に不活性で、所望の生成物から容易に分離可能であるアルコールを含む。当業者は、これらの必要条件を満たすアルコールをたやすく選ぶことができるだろう。好ましくは、このアルコールが飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む。より好ましくは、このアルコールがエタノールあるいはメタノールを含む。
【００３８】
ステップ（ａ）において、第１の溶媒および試料が、試料１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合されることが好ましい。ステップ（ｃ）において、水および第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合されることが好ましい。
ステップ（ａ）と（ｃ）において、第１の薬用人参溶液を約３時間の間加熱することが好ましい。
【００３９】
本発明は、また、いくつかの薬用人参分留物を含む。
第１の薬用人参分留物は、約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約３〜５モル％のラムノース、約４３〜４７モル％のガラクツロン酸、約１４〜１６モル％のグルコース、約１８〜２０モル％のガラクトース、および約１４〜１７モル％のアラビノースを含む。最も好ましくは、炭水化物内容物が、約４モル％のラムノース、約４５モル％のガラクツロン酸、約１５モル％のグルコース、約１９モル％のガラクトース、および約１５モル％のアラビノースを含む。
【００４０】
本発明に係る第２の薬用人参分留物は、約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約４〜７モル％のラムノース、約３７〜４２モル％のガラクツロン酸、約３〜６モル％のグルコース、約２７〜３２モル％のガラクトース、および約１９〜２４モル％のアラビノースを含む。最も好ましくは、炭水化物内容物が、約５モル％のラムノース、約３９モル％のガラクツロン酸、約４モル％のグルコース、約２９モル％のガラクトース、および約２１モル％のアラビノースを含む。
【００４１】
本発明に係る第３の薬用人参分留物は、約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約１〜３モル％のラムノース、約１３〜２０モル％のガラクツロン酸、約４２〜５７モル％のグルコース、約１２〜１７モル％のガラクトース、および約１３〜１７モル％のアラビノースを含む。
【００４２】
本発明は、また、本発明に係る薬用人参分留物のいずれかを有し、薬学的に許容なキャリアに混合した薬学的組成物を含む。当業者は、このことについて有効であるだろういずれの薬学的に許容なキャリアにも熟知しており、従って、本発明に係る薬学的組成物を形成する手順は詳細に議論しない。薬学的組成物は、適当に、タブレット、カプセル、液体、菱形（ｌｏｚｅｎｇｅ）、ローション、あるいは座薬の形態をとる。
【００４３】
本発明は、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌などの低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製における本発明に係る薬用人参分留物の使用を含む。薬用人参分留物は、単独で、あるいは他の薬剤を組み合わせて用いられ得る。癌患者は免疫系に深刻なサプレッションを有することが知られているので、本発明の薬用人参分留物は、化学療法の試薬とともに投与するのに、あるいは、放射線療法でのサプリメントとして、特に適している。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、クロマトグラフィーカラムで溶出された標準デキストラン試料の分子量のｌｏｇ値に対して溶出体積をプロットした図を示す。
【図２】図２は、薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２のクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、薬用人参分留物ＰＱ1のクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、薬用人参分留物ＰＱ2のクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、薬用人参分留物ＰＱ3のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、薬用人参分留物ＰＱ223のクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、マウスの脾臓細胞のＢ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図８】図８は、マウスの脾臓細胞のＴ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図９】図９は、マウスの脾臓細胞のＴおよびＢ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果の特異性を示す。
【図１０】図１０は、マウスの脾臓によるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）抗体生成に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図１１】図１１は、薬用人参分留物ＰＱ223が注入されたマウスのプラーク形成細胞（ＰＦＣ）の増強を示す。
【００４５】
本発明は、また、健康状態を治療するのに効果的な量の本発明に係る薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態の治療方法を含む。好ましくは、健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される。本発明に係る薬用人参分留物の投与量は、年齢、性別、および患者の一般的な健康状態はもちろん、治療される個々の健康状態にも依存する。しかしながら、適切な投与量は、１日に１〜１０回の投与範囲において、１日あたり、１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に見つかるだろう。薬用人参分留物は、経口で、注射もしくは点滴で、局部的に、鼻から吸って、点眼で、膣に、あるいは直腸に、投与できる。
本発明は、下記の実施例により、さらに説明される。
【実施例１】
【００４６】
（実施例１：分留物ＣＶＴ−Ｅ００２の調製およびこの分留物の精製のための第１の方法）
アメリカの薬用人参の根が化学的に抽出され、引き続いて精製され、分留物ＣＶＴ−Ｅ００１およびＣＶＴ−Ｅ００２を与えた。ＣＶＴ−Ｅ００２の総量がさらに精製され、分留物Ｇ1、Ｇ2、およびＧ3を与えた。この手順の詳細な記述は以下の通りである。
【００４７】
乾燥してすり砕いた薬用人参の根５００グラムが、４リットルの８５％エタノールあるいは３リットルの９０％メタノールにより、８０〜８５℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出され、濾過されてアルコール溶液と残渣を与えた。アルコール溶液は濃縮され、スプレードライされて、全サポニンの生成物（ＣＶＴ−Ｅ００１）を与えた。残渣は４リットルの水により、９５〜１００℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出された。抽出物はモスリン袋を通して濾過され、遠心分離機で分離されて、ＣＶＴ−Ｅ００２を含む水溶液を与え、また、残りの残渣は廃棄された。
【００４８】
水溶液部分はさらなる精製に用いられ、同体積の９５％エタノールが水溶液中に加えられ、それは沈殿を引き起こした。沈殿物は遠近分離機で分離され、減圧下で凍結乾燥され、分留物Ｇ1を与えた。上澄みは蒸発濃縮により体積を減らされた。同体積の９５％エタノールが加えられ、次の沈殿Ｇ2を与え、残りの上澄みはエタノールとともに除去され、減圧下で凍結乾燥され、粉末Ｇ3を生成した。
【００４９】
Ｇ2のさらなる精製が以下のように実施された。２グラムのＧ2が８０ｍｌの水に溶解され、１２００の分子量で切り離すＳｉｇｍａ Ｄ−７８８４透析チューブ中で３倍の水に対して透析された。透析は、２４時間毎に２回透析物を集めながら、４℃で７２時間行われた。得られた透析物は１５ｍｌまで濃縮され、その後、同体積のメタノールで沈殿された。沈殿物は水に溶かされ、減圧下で凍結乾燥されて、粉末Ｇ22を生じた。
【００５０】
Ｇ22のさらなる精製が以下のように実施された。１．５グラムのＧ22が６０ｍｌの水に溶解され、１０００の分子量で切り離すフィッシャー・スペクトラル／ポー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌ／Ｐｏｒ）モレキュラー・ポーラス・メンブレン・チューブ中で６００ｍｌの水に対して４℃で透析された。２４時間後に集められた第１の透析物は、蒸発乾燥を用いて１５ｍｌに濃縮され、その後に減圧下で凍結乾燥された。得られた乾燥粉末はＧ221で示された。同様の方法で、４８時間後に透析物の第２バッチが集められ、Ｇ222で示された。保持物質は濃縮され、減圧下で凍結乾燥されて、Ｇ223と呼ばれる粉末を与えた。
【実施例２】
【００５１】
（実施例２：分留物ＣＶＴ−Ｅ００２の調製およびこの分留物の精製のための第２の方法）
本発明に係る薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する別の方法は下記のようである。
乾燥してすり砕いたアメリカの薬用人参の根１０００グラムが、８リットルの８５％エタノールにより、９５〜１００℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出され、濾過されてアルコール溶液と残渣を与えた。残渣は、３時間の間攪拌しながら湯浴にて水と混合（１：８）された。室温まで冷却した後、混合物が濾過された。濾過液は５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけられた。上澄みは濃縮され、フリーズドライされて、抽出物ＣＶＴ−Ｅ００２を与えた。この方法により生成されたＣＶＴ−Ｅ００２の量は、実施例１において生成されたのとほぼ同じ量、即ち、元の生の薬用人参の重量の１０％であった。
【００５２】
ＣＶＴ−Ｅ００２部分は、以下のようにさらに分留された。１００グラムのＣＶＴ−Ｅ００２粉末を２０００ｍｌの水に溶いた溶液中に、１６００ｍｌの９５％エタノールが加えられた。沈殿物はＰＱ1として単離された。上澄みは５００ｍｌにまで濃縮された。この濃縮された溶液中に、別の部分の９５％エタノール（１０００ｍｌ）が再び加えられ、第２の沈殿分留物を与えた。沈殿物は単離され、フリーズドライされて、分留物ＰＱ2を与えた。上澄みは濃縮され、フリーズドライされてＰＱ3を与えた。
【実施例３】
【００５３】
（実施例３：マイトジェン活性試験）
種々のレベルに精製したアメリカの薬用人参の分留物が、そのリンパ球のマイトジェン特性に基づいたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のスクリーニングにより選択された。分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は、免疫系においてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で生じる通常のイベントに対して、むしろ人工的イベントであると考えられるが、マイトジェンは可能なエフェクタ機能のよい指示を提供する。
【００５４】
マイトジェン活性のテスト方法は、以下の通りである：Ｂａｌｂ／ＣあるいはＣ５７Ｂ１／６Ｊのマウスがテストに用いられた。Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、ヘルス・サイエンス・ラボラトリー・アニマル・サービス・ファシリティ（ユニバーシティ・オブ・アルバータ、エドモントン、カナダ）（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ））から得られた。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、ジャクソン・ラボラトリー（バー・ハーバー、ＭＥ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂａｒ，ＭＥ））から得られた。生後７〜１０週間のマウスが各実験に歳と性別を適合された。マウスは頸部のずれにより命を絶たれた。脾臓が無菌の技術を用いて取り出され、２枚のスライドガラスのすり加工された界面の間で押しつぶされた。ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）中での遠心分離により洗浄した後、細胞は、ＲＰＭＩ１６４０に中間のｐＨ７．４で（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）懸濁され、それは１０％の牛の胎児の血清（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ）、５０ｍＭのメルカプトエタノール（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含んでいた。培養液は、９６のウェルを持つ底部が平坦なＬｉｎｂｒｏプレートに、最終濃度の１ｍｌあたり１．２５×１０6個の細胞で３重にセットされた。実験グループは、前もって濾過で滅菌され、ＨＢＳＳに溶解された試験分留物とともに、セットされた。対照培養液は、マイトジェンなしのグループと、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を２０μｇ／ｍｌあるいはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を２５μｇ／ｍｌ有するグループからなっていた。ＰＨＡは特にＴ型の脾臓細胞を刺激し、一方でＬＰＳはＢ型の脾臓細胞を刺激することが知られている。培養液は、３７℃の温度、加湿された５％のＣＯ2雰囲気下で７２時間の間培養された。７２時間の培養の終了時から４時間前に、１μＣｉのトリチウム化したチミジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が各ウェルに加えられた。細胞は自動試料採取機（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により採取され、その後に組み込まれた放射能がシンチレーション計測により分析された。結果は対照に対する％として計算された（平均±標準偏差、３重で）。
【００５５】
水中でのＣＶＴ−Ｅ００２の濃度や沈殿に用いられるエタノールの体積など、実施例１および２に示される異なる抽出条件は、ＣＶＴ−Ｅ００２のさらなる分留に影響を与える。これら２つの方法から得られた生成物は、マイトジェン活性で比較された。結果は下記の表に示される。各テストは３つのバッチにより３重で実施された。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
表１および２が示すように、実施例１および２の間の抽出手順の変化は、Ｇ1分留物からＰＱ2分留物への生物学的活性の移動に相関する。
【実施例４】
【００５９】
（実施例４：ＰＱ2の分留および分留物ＰＱ223の調製の方法）
実施例２に係るＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ3は、分子量分布に従い、アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ハイレゾリューションカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１６６−０１）上のゲル濾過クロマトグラフィーによって、さらに分留される。デキストラン試料（ＭＷ＝７１．４ｋ、３７．５ｋ、１９．５ｋ、および９．５ｋ）はＳｉｇｍａから購入され、標準試料として用いられた。各試料５ｍｇが１ｍｌの水に溶解され、カラムに導入され、かつ、環境温度４℃で、０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌバッファにより、フローレート０．３ｍｌ／分で溶出された。多くの溶出液がいくつもの個々の５ｍｌ部分として集められた。
【００６０】
個々の溶出部分のそれぞれの炭水化物の内容物は、全て、炭水化物内容物全てに対してマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートアッセイによりテストされた。これは、ＤｕｂｏｉｓらのＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−５６（１９５６）に記載された方法を一部変更した方法である。溶出液中の炭水化物全ては、所定の吸収スペクトルで検出可能とするために誘導体に合成される。Ｄ−グルコースが標準試料として用いられ、また、用いられる他の材料は濃硫酸（９８％）とフェノール（５％）であった。ポリスチレンマイクロタイタープレートはＳＡＲＳＴＤＴ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入された。マイクロタイタープレートの各ウェルに、１〜１０μｇのＤ−グルコースを含有する４０μｌの標準試料溶液が加えられ、４０μｌの５％フェノールが加えられて混合された。その後、２００μｌの濃硫酸が丁寧に加えられた。試薬と個々の溶出部分をマルチチャンネルピペットで混合した後、プレートが８０℃の下、１時間の間培養された。室温まで冷却した後、マルチスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）マイクロタイタプレートリーダにより４９２ｎｍにおいて試料の吸収が測定された。データは保存され、マイクロソフトエクセルプログラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーの結果がプロットされた。
【００６１】
分子量がよく知られた一連の標準デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を同一のカラムにかけることにより、標準曲線が形成された（図１）。ＣＶＴ−Ｅ００２、および、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ3の組２１に対するクロマトグラムが図２〜５に示される。各図において、Ｘ軸上の点は溶出体積を実際の体積の１／５に換算して示す。このため、正しい溶出体積の値を得るには、図の結果に５がかけられなければならない。
【００６２】
ＣＶＴ−Ｅ００２のゲル濾過クロマトグラム（図２）は、主たる３つのピークを示した。第１のピーク（溶出分留７〜１０）の分子量は、標準曲線（図１）によると７０，０００あるいはそれ以上と見積もられた。第３のピーク（溶出分留１８〜２２）の分子量は約１０００と見積もられた。小さな幅広の第２のピーク（溶出分留１０〜１７）も観測された。これら３つのピークの比は５７．２：８．５：３４．４であった。
【００６３】
ＰＱ1のクロマトグラム（図３）は、ＣＶＴ−Ｅ００２の高分子量分留物に合致する、１つの主たるピーク（溶出分留７〜１０）と、弱いピーク（溶出分留１８〜２１）を示した。この２つのピークの比は８６．８：１３．２であった。
【００６４】
ＰＱ2のクロマトグラム（図４）は、主たる３つのピークを示した。Ａ（溶出分留７〜１０）およびＣ（溶出分留１９〜２２）と名付けられたピークは、ＣＶＴ−Ｅ００２の２つの主たるピークに合致する。Ｂ（溶出分留１０〜１７）と名付けられた、もう一つの幅広のピークが、ピークＡとＣの間に観測された。このピークに対する分子量は約２，０００〜６０，０００と見積もられた。３つのピークＡ〜Ｃの比は３４．１：４５．７：２０．３であった。Ｄ（溶出分留２４〜５０であり、その部分は図４にて示されている）と名付けられた小さなピークの領域も観測された。
【００６５】
ＰＱ3のクロマトグラム（図５）は、１つの主たるピーク（溶出体積１８〜２１）のみを示し、これはＣＶＴ−Ｅ００２の低い分子量分留物に合致する。
【００６６】
ＰＱ2の分留物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、集められ、フリーズドライされる。乾燥された粉末は、それぞれＰＱ2Ａ、ＰＱ2Ｂ、ＰＱ2Ｃ、およびＰＱ2Ｄと新たに命名される。また、分留物ＡおよびＢは混合され、混合された分留物はＰＱ223（そのクロマトグラムは図６に示される）と呼ばれた。ＰＱ2Ａ、ＰＱ2Ｂ、ＰＱ2Ｃ、およびＰＱ2Ｄのマイトジェン活性がテストされ、分留物ＰＱ223、ＰＱ2およびＣＶＴ−Ｅ００２の活性と比較された。結果は以下の表に示される。
【００６７】
【表３】
【００６８】
結果が示すように、有効性の序列はＰＱ223＞ＰＱ2＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。
【実施例５】
【００６９】
（実施例５：ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の炭水化物総量およびタンパク質組成の化学的決定）
各分留物ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の３バッチが得られ、各分留物に対する炭水化物およびタンパク質の総量の組成が測定された。炭水化物の総量の含有量は、従来より知られたフェノール−サルファリック（ｓｕｌｆｕｒｉｃ）法によって決定された。タンパク質の含有量は、従来より知られたＬｏｗｒｙ法によって検査され、ウシ血清アルブミンが標準として用いられた。結果は以下の表に示される。
【００７０】
【表４】
【実施例６】
【００７１】
（実施例６：ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223のモノサッカライド組成の化学的決定）
炭水化物の総量の含有量は主にポリサッカライドとオリゴサッカライドの量を表しているので、所定の分留物に対するモノサッカライドのモル比もまた決定された。
【００７２】
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の分留物の組は、その構造単位であるモノサッカライドを遊離させるため、酸触媒加水分解された。遊離したモノサッカライドは、ＭＰＰ（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）と誘導体を合成された後、その定性的および定量的解析がＨＰＬＣにより行われた。詳細な方法が以下の通りである：２ＮのＨＣｌ中の試料溶液が９５〜１００℃に６時間加熱された。混合物はＮａＯＨ溶液で中和された。内部標準が加えられた。ＭｅＯＨおよびＮａＯＨ水溶液（０．３Ｎ）がこの混合物に加えられた。その後、これが５０〜６０℃で８時間（あるいは室温で１週間）攪拌された。混合物は水で（１：１０）に希釈され、ＨＰＬＣで解析された。ＭＰＰで誘導体が合成された試料は、Ｃ−１８カラムで、０．１Ｍもリン酸バッファ（ｐＨ７）中の１８％アセトニトリル溶液からなる溶離液を用い、フローレート１ｍｌ／分、２４５ｎｍでのＵＶ検出にて、解析された。下記の表は、ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ223のモノサッカライドのモル比を示す。グルクロン酸のトレース量は、あるＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、およびＰＱ2の試料中に見つかった。
【００７３】
【表５】
【００７４】
結果が示すように、グルコースの含有量の序列は次の通りである：ＰＱ１＞ＣＶＴ−Ｅ００２＞ＰＱ２＞ＰＱ３；また、ガラクツロン酸の含有量は次の通りである：ＰＱ２＞ＰＱ２２３＞ＣＶＴ−Ｅ００２＞ＰＱ１。
【実施例７】
【００７５】
（実施例７：薬用人参分留物の免疫調節）
１．マクロファージ活性
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、Ｇ2、およびＰＱ223マウスのマクロファージに対する効果は、細胞性反応を優先的にマウントするＣ５７Ｂ１／６マウスと、抗体性反応を優先的にマウントするＢａｌｂ／ｃからの腹膜滲出マクロファージを用いて、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）に研究された。マクロファージが１００μｇ／ｍｌのテスト試料で刺激された後、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αの生成が測定された。その方法は下記の通りである。
【００７６】
Ａ．腹膜滲出細胞および細胞上澄みからのマクロファージの調製
１）３％チオグリコレート１ｍｌがマウスの腹膜腔に注入され、３日後に腹膜腔から腹膜滲出マクロファージが採取された。
２）細胞懸濁液がＨａｎｋｓバッファとともに、４℃にて１１００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて２回洗浄された。
３）マクロファージがＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳ媒体中に懸濁された。
４）細胞が計測され、ＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳ媒体で１０6／ｍｌの最終濃度に希釈された。
５）マクロファージが、３７℃、１０×１０6／１０ｍｌ ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳにて２時間培養された。上澄みが廃棄され、沈殿したマクロファージが１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄された。
６）マクロファージが採取され、ＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳに再び懸濁された。
７）マクロファージ（５×１０5）が、１０ｍｇ／ｍｌのＬＰＳあるいは１００ｍｇ／ｍｌのテスト試料とともに、２４あるいは４８時間培養された。その後で、バイオアッセイ（ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−α）のために、上澄みが集められ、濾過滅菌された。実験は３重に行われた。
【００７７】
Ｂ．上澄み中のＩＬ−１の決定
ＮＯＢ１細胞系は、ＩＬ−１に応答して活性（ＩＬ−２）を刺激するＣＴＬＬ成長を生成するＥＬ４細胞系のＴＫ変異種である。ＮＯＢ１細胞は3ＨＴｄＲを組み込まないので、ＩＬ−１への応答はＣＴＬＬ系による取り込みの点から測定できる。手順は下記に示す通りである。
１）９６のウェルを持つ底部が平坦なマイクロタイタープレートの各ウェルにおいて、１０4個のＣＴＬＬ細胞が、ＩＭＤＭ中の５％ＦＢＳ溶液２００μｌ中で、４×１０4個のＮＯＢ１細胞と混合された。ＩＬ−１標準の４、８、１６、または３２倍、あるいは連続的な希釈液である一続きに希釈されたＩＬ−１テスト試料が加えられた。各ウェルの最終的な体積は２００μｌであった。各試料は３重に調製された。
２）プレートが、３７℃、加湿された５％ＣＯ2の培養器において、２４時間の間培養された。
３）［3Ｈ］−チミジンが培養の最後の５時間の間加えられた。
４）細胞が採取され、液体シンチレーション計測により［3Ｈ］−チミジン組み込みが測定された。
５）ＩＬ−１濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００７８】
【表６】
【００７９】
結果は、ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、Ｇ2、およびＰＱ223は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのマクロファージを明らかに刺激してＩＬ−１を生成したことを示す。全てのテスト試料はＩＬ−１生成を刺激する同様な能力を示した。
【００８０】
Ｃ．ＩＬ−６の決定
マウスのＢ細胞ハイブリドーマ細胞系であるＢ９の増殖はＩＬ−６に依存する。Ｂ９細胞は、濃度を減らしているテスト試料を含む一連のマイクロウェル中で培養された。手順は下記に示す通りであった。
１）貯蔵培養フラスコから移した一部試料中のＢ９細胞の数が、それらの成長の対数期において計測された。
２）細胞は、１８０ｘｇ、４℃の卓上遠心分離機にて５分間遠心分離され、ペレットが、１０ｍｌの完全なＲＰＭＩ−１０媒体中に再懸濁された。この手順が２回繰り返され、細胞は、完全なＲＰＭＩ−１０媒体中に、２×１０3個の細胞／ｍｌで再懸濁された。
３）洗浄された細胞（２×１０3個の細胞／ｍｌ）の１００μｌが、９６のウェルを持つマイクロタイタープレートの各ウェルに加えられた。
４）テスト試料の２倍連続希釈液１００μｌが、各ウェルに加えられ、プレートの２または３列がＩＬ−６標準のために残しておいた。
５）プレートが、加湿された、３７℃、５％ＣＯ2の培養器で７２時間培養された。
６）［3Ｈ］−チミジンが加えられ、プレートが３７℃で４時間培養された。
７）細胞が採取され、液体シンチレーションカウンタを用いて、［3Ｈ］−チミジンの組み込みが決められた。
８）ＩＬ−６濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００８１】
【表７】
【００８２】
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、およびＰＱ223は、Ｃ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂ／ｃからのマクロファージの上澄み中でのＩＬ−６の生成を増加させた。能力は、ＰＱ223＞ＰＱ2＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。
【００８３】
Ｄ．ＴＮＦ−αの測定
下記のプロトコルは、細胞培養物から得られた上澄み中のＴＮＦ活性を定量するため、ＴＮＦに感度があり、アクチノマイシンＤ処理されたマウスのＬ９２９繊維芽細胞を採用した。１）ＩＭＤＭ−５％ＦＳＣ ５０μｌ中の４×１０4個のＬ９２９細胞が各ウェルに加えられた。
２）テスト試料５０μｌが各列の２番目のウェル（カラム２）に加えられた。ウェル２の内容物を静かに混合させることで２倍連続希釈液が形成され、ウェル２からウェル３に５０μｌ移された。ウェル３の内容物は静かに混合され、ウェル３から５０μｌがウェル４に移された。この手順がウェル１２まで続けられた。最後に、カラム１２の全てのウェルの内容物が静かに混合され、各ウェルから５０μｌが廃棄された。この点で、全てのウェルは５０μｌを含んだ。
３）アクチノマイシンＤ溶液５０μｌが各ウェルに加えられた（２μｌ ｍｌ）。
４）プレートが、３７℃、５％ＣＯ2の空気中で２４時間培養された。
５）ナチュラルレッド５μｌが各ウェルに加えられ、プレートが２．５時間培養された。
６）各ウェルの上澄みが直ちに、注意深くすすがれ、移されて、プレートが２００μｌのＰＢＳで２回洗浄された。
７）ＰＢＳが吸い出され、０．０５ＭのＮａＨ2ＰＯ4中５０％エタノール溶液１００μｌが各ウェルに加えられ、室温で５分間攪拌された。
８）マイクロタイタープレートリーダにより、５７０ｎｍにける吸光度において、各ウェルが直ちに読まれた。
９）ＴＮＦ−α濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００８４】
【表８】
【００８５】
ＴＮＦ−αの生成は、Ｂａｌｂ／ｃあるいはＣ５７Ｂ１／６細胞系からのマクロファージの上澄みにおいてＣＶＴ−Ｅ００２およびＰＱ223により誘発された。Ｂａｌｂ／ｃマウスからのマクロファージの上澄みにおけるＴＮＦ−αは、明らかにＧ2により刺激を受けた。ＰＱ2はマクロファージによるＴＮＦ−α生成に刺激を与えないようであった。
【００８６】
２．血清免疫グロブリン生成
血清免疫グロブリン生成（トータルＩｇＧ）は、水を与えられたマウスに比べて、ＣＶＴ−Ｅ００２を与えられたマウスにおいては２１％、ＰＱ2 を与えられたマウスにおいては２６％、ＰＱ223を与えられたマウスにおいては３１％、増加した。能力は、ＰＱ２２３＞ＰＱ２＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。結果は表９に示される。
【００８７】
【表１０】
【００８８】
３．ＰＨＡあるいはＬＰＳなどのよく知られたマイトジェンは、それらが刺激する細胞の種類について特異性を示す。脾臓細胞のどの特定の種類が薬用人参分留物により刺激を受けるかを知ることは重要である。従って、われわれは、アフィニティカラムによってＴ細胞を分離し、Ｔ細胞を減らすことによって、Ｂ細胞を濃縮した。
【００８９】
Ａ．Ｔ細胞濃縮
赤い血液細胞を除去するため、脾臓細胞の単一細胞懸濁液がリンパ球−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）上に積層された。その後、マウスの免疫グロブリンで被覆されたビーズへの吸着によりＢ細胞を取り除くアフィニティクリマトグラフィーカラム（Ｂｉｏｔｅｘ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ）にリンパ球を通過させた。溶出液は、濃縮された集団のＴ細胞からなっていた。他の細胞種に対するＴ細胞の割合の決定は、抗ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体と補体処理を用いた生存能力テストによってなされた。
【００９０】
Ｂ．Ｂ細胞濃縮
脾臓細胞集団からの赤い血液細胞の除去の後で、リンパ球は、モノクローナル抗ｔｈｙ１．２抗体とともに３７℃で１時間培養された。低毒のウサギの補体が加えられ、４℃で３０分培養された。この手順はＴ細胞の細胞懸濁を減らし、Ｂ細胞集団を濃縮する結果となる。
【００９１】
Ｃ．ＰＱ223との培養
ＢまたはＴ細胞はＰＱ223の適用量を変えながら培養され、応答がトリチウム化されたチミジンの組み込みによって測定された。図７および８は、それぞれ、相対的に精製されたＢおよびＴ細胞に対するＰＱ223の増殖効果を示す。対照グループは、Ｂ細胞に特異的なマイトジェンであるＬＰＳ、およびＴ細胞に特異的なマイトジェンであるＰＨＡで処理された細胞を含んだ。ＰＱ223はＢ細胞に特異的であることが発見された（図９参照）。
【００９２】
４．インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での抗体生成に対するＰＱ223の効果
脾臓細胞は、適用量を変えたＰＱ223の存在下において７２時間培養された。対照培養物は、２５μｇのＬＰＳが加えられたグループと、マイトジェンが加えられなかったもう一つのグループから構成された。上澄みは、エンザイム・リンクト・イムノソーベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））を用いて、可溶性の免疫グロブリンの存在がテストされた。可溶性の免疫グロブリンを含む上澄みは、０．１Ｍのトリスバッファ（ｐＨ９）中に連続的に希釈された。マイクロタイタープレートが、この上澄みで被覆され、４℃で終夜培養された。プレートは、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄され、その後、抗体−酵素複合Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１００μｌが１：１０００の希釈率で加えられた。プレートは室温で１時間培養された。プレートは再びＰＢＳで３回洗浄され、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ Ｉｎｃ．）が各ウェルに加えられた。１時間後、４０５ｎｍの波長での吸光度がフローマルチスキャン（Ｆｌｏｗ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）ＥＬＩＳＡリーダによって測定された。
【００９３】
図１０は、５０μｇ／ｍｌのＰＱ223が、ＬＰＳ２５μｇの場合と同程度に、免疫グロブリンの生成物を刺激したことを示す。高濃度のＰＱ223、５００μｇ／ｍｌは、より高い水準の抗体生成を誘い出さなかった。この適用量応答曲線は、異種の脾臓細胞集団および精製されたＢ細胞の増殖応答と一致する。これらの結果は、４つの実験に基づいた。
【００９４】
５．インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗体プラーク形成細胞
３つの濃度のＰＱ223がそれぞれ３匹のマウスからなる３グループに静脈注射された。対照グループは、平衡塩溶液が注射された。ＰＱ223での静脈処理の７日後に、マウスはＨＢＳＳ中の１０％ＳＲＢＣ懸濁液０．２ｍｌにより免疫性を与えられた。免疫性を与えられてから５日後に、マウスは犠牲となり、脾臓からの単一細胞懸濁液が調製され、１ｍｌあたり４×１０6個の細胞に調節された。この細胞懸濁液の０．１ｍｌの一部試料がテンジクネズミ補体の１０％ＳＲＢＣ溶液０．３ｍｌとＲＰＭＩ媒体０．５ｍｌと混合された。この混合物の７０μｌがカニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）チャンバ−に移された。チャンバーはパラプラスト（ｐａｒａｐｌａｓｔ）ワックスで封止され、プラーク形成細胞を計測する前に、３７℃で１時間培養された。全てのＰＦＣレベルは１００万個の脾臓細胞あたりとして表現される。図１１は、三種の適用量が全て、化合物が注射されたマウス内で、明らかに抗体生成を増強したことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
まとめると、本研究の結果は、マクロファージが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを生成するのを本発明の薬用人参分留物が活性化することを示す。また、それらは、リンパ球、特にＢリンパ球の増殖および抗体生成も活性化する。体液が媒介する免疫系の全体が刺激され、感染に対する予防効果を示した。報告されたＴＮＦ−α生成の活動は、抗ウイルスおよび抗腫瘍の恩恵を含む。ＴＮＦ−αは、また、種々の寄生感染の治療のためにもなると報告されている。
【００９６】
以下の本発明の背景において言及された引用文献は、ここに参照により本発明に組み込まれる。
１．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，２２−５（１９９３）．
２．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１７，１２８７−９１（１９９４）．
３．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，１０８７−９０（１９９３）．
４．Ｇａｏら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，５５，９−１２（１９８９）．
５．Ｇａｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８１，１７５−８７（１９８８）．
６．Ｋｉｙｏｈａｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２６３，８９−１０１（１９９４）．
７．Ｓｈｉｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３００，２３９−４９（１９９７）．
８．Ｙａｍａｄａら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓ．，９，２６４−９（１９９５）．
９．Ｋｏｎｎｏら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，５０，４３４−６（１９８４）．
１０．Ｈｉｋｉｎｏら、未発表．
１１．Ｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４，２５５−９（１９８５）．
１２．Ｋｏｎｎｎｏら、Ｊ．Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，２５，５３−５（１９８７）．
１３．Ｋｏｎｎｎｏら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４，６９−７４（１９８５）．
１４．Ｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，５０，１８８−９９０（１９８７）．
１５．Ｌｅｅら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７，３２３−３２（１９９７）．
１６．Ｋｉｍら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６４，１１０−５（１９９８）．
１７．Ｍｉａｏら、Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｈｕａｘｕｅ ＺａＺｈｉ，９，６１０−４（１９９３）．
１８．Ｍａら、Ｂａｉｑｉｕｅｎ Ｙｉｋｅ Ｄａｘｕｅ Ｘｕｅｂａｏ，２３，２３６−８（１９９７）．
１９．Ｚｈｕら、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏｌｉｘｕｅ Ｔｏｎｇｂａｏ，１３，７６−８（１９９７）．
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は、北アメリカ薬用人参（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）からの分留物の化学的形成方法およびこれらの分留物を含有する組成物に関する。本発明の生成物は、抗体の生成を賦活するのに、あるいは、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌などの低免疫により特徴付けられる健康状態を対象とする治療法として、用いられ得る。また、本発明の生成物は、免疫系の深刻な抑制を引き起こす化学療法や放射線療法を受ける癌患者に対するサプリメントとして用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
数百年の間、薬草化合物などのある種の無毒性薬品の使用は、さまざまな生理学的状態に、特に東洋で受け入れられてきた。Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒは最もよく知られた伝統的な中国薬である。薬用人参抽出物の重要な薬理学的活性は、単独で、あるいは他の薬品との組み合わせで、腎臓損傷の緩和、発癌の抑制およびストレスの予防を含む。また、固体の免疫学的反応性に対する薬用人参の影響について数多くの報告がなされている。報告されたある免疫賦活特性は、細胞レベルでのある基本的な免疫機能の賦活と同様に、感染に対する宿主抵抗の増強、抗炎症効果、腫瘍成長の抑制を含む。アメリカ薬用人参（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）は、多くの有益な健康上の効果を有する健康サプリメントとしての評判を得た薬用人参のもう一つの種である。いくつかの科学者グループが、薬用人参中に存在するポリサッカライドの単離および構造の特定を試みた。あるポリサッカライドは免疫系の賦活に活性があることが示された。
【０００３】
薬用人参ポリサッカライドの単離、特徴付けおよび生物学的評価についての一連の研究が、共立薬科大学（日本）のＴｏｍｏｄａのグループによりなされた。ある一連の研究では、薬用人参ポリサッカライドが酸性度に基づいて分留された。朝鮮薬用人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）の根から免疫学的に活性な２つの酸性のポリサッカライドが単離された［１，２］。スライスされた根がお湯で抽出された。抽出物は、硫酸ナトリウムの存在下においてセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）で処理された。沈殿物は、分離され、透析され、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用され、２つの純粋なポリサッカライドが得られ、それらはｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡおよびｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢと名付けられた。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｆ上のゲルクロマトグラフィーは、ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡおよびｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢの分子量として、それぞれ１．６×１０5、および、５．５×１０4の値を与えた。定量分析は、ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＡが２１．３％のアラビノース、５３．４％のガラクトース、２．０％のラムノース、１６．０％のガラクツロン酸および２．７％のグルクロン酸を含むことを示した。これらの成分糖のモル比は１１：２２：１：６：１であった。ｇｉｎｓｅｎａｎ ＰＢは、１１．０％のアラビノース、３２．３％のガラクトース、８．１％のラムノース、３９．９％のガラクツロン酸および５．０％のグルクロン酸を含んでいた。これらの成分糖のモル比は３：７：２：８：１であった。両ポリサッカライドとも、投与量に依存して、炭素除去試験における著しい細胞内皮系の有力な活性、際立った抗補体活性およびアルカリホスファターゼ誘導活性を示した。
【０００４】
別の研究［３］において、ＣＴＡＢで処理された上記の抽出物の上澄みから２つの追加のポリサッカライドが単離された。即ち、上澄みがエタノール中に移された。沈殿物は分離され、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５の各カラムに適用され、Ｓ−ＩＡおよびＳ−ＩＩＡと名付けられた２つの純粋なポリサッカライドを与えた。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５Ｆ上のゲルクロマトグラフィーは、Ｓ−ＩＡおよびＳ−ＩＩＡの分子量として、それぞれ５．６×１０4、および、１．０×１０5の値を与えた。ｇｉｎｓｅｎａｎ Ｓ−ＩＡは、４２．３％のアラビノース、５０．８％のガラクトース、６．９％のガラクツロン酸を８：８：１のモル比で含む。ｇｉｎｓｅｎａｎ Ｓ−ＩＩＡは、４２．０％のＬ−アラビノース、３２．６％のガラクトース、６．２％のグルコース、１９，２％のガラクツロン酸を含む。モル比は１５：１０：２：５である。
【０００５】
Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇの葉および根からのいくつかのポリサッカライド分留物は、日本の北里大学のオリエンタル・メディシン・リサーチセンターにおけるＹａｍａｄａのグループにより分離された。化学特性および生物学的活性が調査および比較された［４］。
【０００６】
中国産の薬用人参の根と葉は、それらのジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）を取り除くためにエタノールで処理した後、水で抽出され、残渣が０．５ＭのＮａＯＨで抽出されて、水溶性およびアルカリ可溶性のポリサッカライド分留物（水溶性の分留物はＧＲ−２およびＧＬ−２、アルカリ可溶性の分留物はＧＲＡ−２およびＧＬＡ−２とそれぞれ名付けられる）を与えた。成分ポリサッカライドの酸性度に基づいて、セチルトリメチルアンモニウムとの処理により、全ての分留物が、強酸性（ＧＲ−３、ＧＬ−３、ＧＲＡ−３、およびＧＬＡ−３と名付けられた）、弱酸性（ＧＲ−４、ＧＬ−４、ＧＲＡ−４、およびＧＬＡ−４と名付けられた）、中性（ＧＲ−５、ＧＬ−５、ＧＲＡ−５、およびＧＬＡ−５と名付けられた）のポリサッカライド分留物にさらに分留された。根は葉よりもポリサッカライドをより多量に含んでいた。根からの強酸性のポリサッカライド分留物は５０％以上にもおよぶ高率のウロン酸含有量を有していた。似た成分糖は全ての分留物から検出された。それらは、ラムノース、アラビノース、ガラクトース、グルコース、ガラクツロン酸およびグルクロン酸であった。ガラクツロン酸は、主なウロン酸成分であった。
【０００７】
最も高い抗補体活性を有する分留物であるＧＬ−３は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌのカラム処理、およびエタノール沈殿によりさらに分留されて、ＧＬ−ＰＩからＧＬ−ＰＩＶよ名付けられた分留物を与えた［５］。全ての分留物は３２〜４４％のウロン酸を含んでいた。分留物ＰＩは５００００という最も高い分子量を有していた。ＰＩおよびＰＩＩは主としてＲｈａ、Ｇａｌ、およびＧａｌＡからなり、ＰＩＩＩはさらにＦｕｃを含んでおり、一方、ＰＩＶはＧａｌ、Ｇｌｃ、およびＧａｌＡからなっていた。詳細な構造決定が行われた。
【０００８】
抗潰瘍ペクチンポリサッカライド（ＧＬ−ＢＩＩＩ）が、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６ＢおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂのクロマトグラフィーによって、弱酸性のポリサッカライド分留物ＧＬ−４から単離された。主としてＲｈａ、Ａｒａ、Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、ＧａｌＡ、およびＧｌｃＡから、３：４：２：１０：１：７：４のモル比で構成されていた。詳細な構造決定が行われた［６］。
【０００９】
他のマクロファージＦｃレセプタ発現増強ポリサッカライド（ＧＬ−４ＩＩｂ２）が、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂのアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＧＬ−４から分離された。化学分析は、試料が６５％の炭水化物と３３．７％のウロン酸を含むことを示した。成分分析と構造決定が行われた［７］。
【００１０】
抗補体活性を有する他のＰａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ抽出物、Ｇ−１１５が同じグループによって研究された［８］。Ｇ−１１５は、抗補体活性およびマイトジェン活性に対する活性物質を特徴付けるために分留された。最も効力のある抗補体活性は、未分留のポリサッカライド分留物Ｇ−１１５Ｇにおいて観測され、一方、水溶性で透析できる分留物であるＧ−１１５Ｅは最も効力のあるマイトジェン活性を示した。Ｇ−１１５Ｇは、さらにセチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの沈殿形成、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアニオン交換クロマトグラフィー、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂでのゲル濾過によって精製され、目立って効力のある抗補体のポリサッカライドであるＧ−１１５Ｉ１−ＩＩａ−２−３が得られた。このポリサッカライドは均質であった。その分子量は３．６８×１０5であると見積もられた。それは、主としてアラビノース、ガラクトースおよびグルコースと、これに加えて少量のガラクツロン酸、グルクロン酸、およびラムノースからなる。
【００１１】
薬用人参ポリサッカライドが、日本の東北大学薬学部のＨｉｋｉｎｏのグループにより、韓国、中国、および日本の薬用人参から単離された。薬用人参ポリサッカライドの低血糖活性がテストされた。組成と構造のある特色が明らかにされた［９−１４］。
【００１２】
３つのポリサッカライド、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃがアメリカの薬用人参から単離された［１４］。それらの分子量は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００上のゲルクロマトグラフィーから２．０×１０6より大きいと見積もられた。中性糖成分は、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａに対してマンノースおよびグルコース（モル比は１．０：２．３）、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ｂに対してマンノースおよびグルコース（モル比は１．０：５．５）、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ｃに対してキシロースであった。ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃ中の酸性糖成分は、それぞれ１０．８、１１．７、および７．１％であることがわかった。これらのポリサッカライド中のペプチド部分の含有率は、ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌａｎ Ａ〜Ｃに対してそれぞれ２．７、２．９、および２．３％であった。これらのポリサッカライドの全てが、通常のマウスおよびアロキサンで減じられた低血糖のマウスにおいて低血糖効果を示した。
【００１３】
分子量が１５０，０００の酸性のポリサッカライドは、ｇｉｎｓａｎと呼ばれるが、韓国、ソウルの韓国癌センター病院の免疫学研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｋｏｒｅａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の研究グループにより、Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇから単離された［１５］。このポリサッカライドは３．７％のタンパク質、４７．１％のヘキソース（グルコースおよびガラクトース）、４３．１％のウロン酸（ガラクツロン酸）からなっていた。薬用人参は、Ｔ細胞とＢ細胞の増殖を誘発し、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞の両方から、内生的に生成されたマルチプルサイトカインを通してリンフォカイン活性化障害性細胞を発生させた［１６］。
【００１４】
中国のノースウエスト・ノーマル・ユニバーシティ（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＭｉａｏらは、アメリカの薬用人参からポリサッカライドを単離した。精製および構造解析が行われた［１７］。
【００１５】
アメリカの薬用人参からのポリサッカライドの生物学的活性は、ノーマン・ブスーン・ユニバーシティ・オブ・メディカル・サイエンス（Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の研究グループにより研究された［１８，１９］。彼らは、アメリカの薬用人参からのポリサッカライド（ＰＰＱ）がリンパ球転換を増強することを発見した。マウスの脾臓リンパ球からのサイトカインのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での生成に対するＰａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ（ＰＰＱ−１）からのポリサッカライドの影響が研究された。データは、ＰＰＱ−１が免疫機能を調整することを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，２２−５（１９９３）． 非特許文献１は、朝鮮薬用人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）の根から免疫学的に活性な２つの酸性のポリサッカライドが単離されることについて開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明のまとめ）
本発明者らは、あるアメリカの薬用人参の抽出物が免疫調整特性を有することを発見した。ＣＶＴ−Ｅ００２、およびそれから精製された分留物ＰＱ2およびＰＱ223が特にマウスの脾臓細胞がＢ細胞を増殖するように刺激を与え、それは次に多量の抗体を生成させる。また、分留物は血清免疫グロブリン（例えばトータルＩｇＧ）レベルを増加させ、マクロファージにＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αを生成するように刺激を与える。これらの分留物は、一般的伝染病および他の免疫不全関連症の防止あるいは治療に使用される可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明は、アメリカの薬用人参の試料から薬用人参分留物ＰＱ2、ＰＱ223、ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法に注目する。
具体的に述べると、薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法は、以下を有する：
−アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
−その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
−少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
−その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
−その後で、アルコールを含む第３の溶媒に以前の工程において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
−上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2を生成すること。
【００１９】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法は、以下を有する：
−上述のように、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
−上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
−上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること。
【００２０】
薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法は、以下を有する：
−薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で、アルコールを含む第１の溶媒にアメリカの薬用人参を混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
−その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
−その後で、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、薬用人参残渣溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
−その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、薬用人参抽出物を含む抽出物水溶液を生成すること；および
−上記抽出物水溶液を乾燥させて薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を生成すること。
【００２１】
本発明は、また、上述の方法で調製された薬用人参分留物ＰＱ2、ＰＱ223、およびＣＶＴ−Ｅ００２を含む。
【００２２】
本発明は、特定の炭水化物内容物を有する薬用人参分留物をさらに含む。
第１の薬用人参分留物は、約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
第２の薬用人参分留物は、約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
第３の薬用人参分留物は、約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。
【００２３】
本発明は、また、本発明の薬用人参分留物を有し、薬学的に許容なキャリアに混合した薬学的組成物を含む。
本発明は、本発明による薬用人参分留物の、低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製において、単独でのあるいは他の薬剤との組み合わせての使用をさらに含む。
【００２４】
本発明は、また、ＩＬ−１、ＩＬ−６、および／またはＴＮＦ−αの細胞中の生成を刺激するための本発明に係る薬用人参分留物の使用を含む。
本発明は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫グロブリンの生成を刺激するための本発明に係る薬用人参分留物の使用をさらに含む。
また、Ｂリンパ球の増殖とそれらからの抗体の生成を活性化するための本発明に係る薬用人参分留物の使用が含まれる。
【００２５】
本発明は、また、健康状態を治療するのに効果的な量の本発明に係る薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態を治療する方法を含む。
【００２６】
（本発明の詳細な記述）
薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
（ｅ）少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
（ｆ）その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
（ｇ）その後で、アルコールを含む第３の溶媒にステップ（ｆ）において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
（ｈ）上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2 を生成すること。
【００２７】
第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおけるアルコールは、薬用人参に不活性で、所望の生成物から容易に分離可能であるアルコールを含む。当業者は、これらの必要条件を満たすアルコールをたやすく選ぶことができるだろう。好ましくは、それぞれのアルコールが、他と関係なく、飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む。より好ましくは、それぞれのアルコールが、他と関係なく、エタノールあるいはメタノールを含む。
【００２８】
ステップ（ａ）と（ｃ）のそれぞれにおいて、得られる溶液を約３時間の間加熱することが好ましい。ステップ（ａ）において、第１の溶媒および薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で混合されることが好ましく、最も好ましくは薬用人参１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される。ステップ（ｃ）において、水および第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で混合されることが好ましく、最も好ましくは薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合される。
【００２９】
上述の方法においてステップ（ｄ）に続いてすぐ、第１の薬用人参抽出物が随意に濃縮されてもよい。これは、当業者によく知られた手順によるどんな方法によって行われてもよい。例えば、第１の薬用人参抽出物を含む第１の水溶液は遠心分離機で（例えば２５００〜１００００ｒｐｍの速さで約５〜１５分）分離されてもよい。また、第１の水溶液は濾過されてもよい。第１の薬用人参抽出物の濃縮に替えて、あるいはこれに追加して、第１の薬用人参抽出物は後で使用するようにフリーズドライされてもよい。
【００３０】
ステップ（ｅ）において、第２の抽出物水溶液は、少なくとも第１の薬用人参抽出物の一部を含んでいる。第２の抽出物水溶液中の第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２であり、より好ましくは１：２０であることが重要である。これは、多くの方法のいずれでも達成できる。上述のように、第１の薬用人参抽出物が、ステップ（ｄ）に続いて濃縮される、および／または、フリーズドライされるならば、所望の比率を達成するように第１の薬用人参抽出物に水が加えられるべきである。あるいは、第１の抽出物水溶液の一部あるいは全部が第２の抽出物水溶液に用いられてもよい。必要なら、所望の比率を達成するために、追加の水を加えてもよい。所望の量の第１の薬用人参抽出物を含有する第１の抽出物水溶液の少なくとも一部を使用することは、ステップ（ｄ）と（ｅ）の間に追加の濃縮またはフリーズドライステップを実施する必要を逃れるだろう。
【００３１】
ステップ（ｆ）において、第２の溶媒の水に対する比率は約３：４であることが好ましい。
ステップ（ｇ）において、第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約２：１であることが好ましい。
【００３２】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）上述の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
（ｂ）上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
（ｃ）上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること。
【００３３】
第１の溶出分留物はＰＱ2Ａとしても知られており、第２の溶出分留物はＰＱ2Ｂとしても知られている。これらの溶出分留物は別々に単離され得る。また、追加の溶出分留物ＰＱ2Ｃ（溶出体積が９５および１１０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致する）、およびＰＱ2Ｄ（溶出体積が１２０および２５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致する）を生成するために、上述と同じ方法が用いられてもよい。これらの分留物は別々に単離され得る。また、ＰＱ223の他に、ＰＱ2ＡからＰＱ2Ｄの２以上の分留物からなる組成物も形成されることができる。
【００３４】
薬用人参分留物ＰＱ2は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分留されることが好ましい。しかしながら、当業者に知られている他のいずれの種類の分留も適している。
ゲル濾過クロマトグラフィーを行う手順は、フローレート、試料体積、および手順が実施される温度に関して、製作者の推薦に従って、当業者によく知られている。これらの要因の製作者の指定範囲内の変動は、クロマトグラフィー試験の結果に対する明らかな影響はない。
【００３５】
炭水化物内容物の決定は、当業者に知られたいずれの手順によって行われてもよい。分留物の炭水化物組成を決定するのに、マイクロフィルタープレートアッセイ（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ）が実施されることが好ましい。そのようなアッセイは当業者によく知られている。例えば、Ｄｕｂｏｉｓら、Ａｎａｌ．ｃｈｅｍ．２８：３５０−５６（１９５６）を参照されたい。この結果、参照により組み込まれる。マイクロフィルタープレートアッセイに用いるのにもたらされた試料の吸収は、好ましくは４９２ｎｍで実施される。
【００３６】
薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する方法は、下記を含む：
（ａ）薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で、アルコールを含む第１の溶媒にアメリカの薬用人参を混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、薬用人参残渣溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、薬用人参抽出物を含む抽出物水溶液を生成すること；および
（ｅ）上記抽出物水溶液を乾燥あるいは濃縮させて薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を生成すること。
【００３７】
第１の溶媒におけるアルコールは、薬用人参に不活性で、所望の生成物から容易に分離可能であるアルコールを含む。当業者は、これらの必要条件を満たすアルコールをたやすく選ぶことができるだろう。好ましくは、このアルコールが飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む。より好ましくは、このアルコールがエタノールあるいはメタノールを含む。
【００３８】
ステップ（ａ）において、第１の溶媒および試料が、試料１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合されることが好ましい。ステップ（ｃ）において、水および第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合されることが好ましい。
ステップ（ａ）と（ｃ）において、第１の薬用人参溶液を約３時間の間加熱することが好ましい。
【００３９】
本発明は、また、いくつかの薬用人参分留物を含む。
第１の薬用人参分留物は、約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約３〜５モル％のラムノース、約４３〜４７モル％のガラクツロン酸、約１４〜１６モル％のグルコース、約１８〜２０モル％のガラクトース、および約１４〜１７モル％のアラビノースを含む。最も好ましくは、炭水化物内容物が、約４モル％のラムノース、約４５モル％のガラクツロン酸、約１５モル％のグルコース、約１９モル％のガラクトース、および約１５モル％のアラビノースを含む。
【００４０】
本発明に係る第２の薬用人参分留物は、約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約４〜７モル％のラムノース、約３７〜４２モル％のガラクツロン酸、約３〜６モル％のグルコース、約２７〜３２モル％のガラクトース、および約１９〜２４モル％のアラビノースを含む。最も好ましくは、炭水化物内容物が、約５モル％のラムノース、約３９モル％のガラクツロン酸、約４モル％のグルコース、約２９モル％のガラクトース、および約２１モル％のアラビノースを含む。
【００４１】
本発明に係る第３の薬用人参分留物は、約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する。好ましくは、炭水化物内容物が、約１〜３モル％のラムノース、約１３〜２０モル％のガラクツロン酸、約４２〜５７モル％のグルコース、約１２〜１７モル％のガラクトース、および約１３〜１７モル％のアラビノースを含む。
【００４２】
本発明は、また、本発明に係る薬用人参分留物のいずれかを有し、薬学的に許容なキャリアに混合した薬学的組成物を含む。当業者は、このことについて有効であるだろういずれの薬学的に許容なキャリアにも熟知しており、従って、本発明に係る薬学的組成物を形成する手順は詳細に議論しない。薬学的組成物は、適当に、タブレット、カプセル、液体、菱形（ｌｏｚｅｎｇｅ）、ローション、あるいは座薬の形態をとる。
【００４３】
本発明は、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌などの低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製における本発明に係る薬用人参分留物の使用を含む。薬用人参分留物は、単独で、あるいは他の薬剤を組み合わせて用いられ得る。癌患者は免疫系に深刻なサプレッションを有することが知られているので、本発明の薬用人参分留物は、化学療法の試薬とともに投与するのに、あるいは、放射線療法でのサプリメントとして、特に適している。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、クロマトグラフィーカラムで溶出された標準デキストラン試料の分子量のｌｏｇ値に対して溶出体積をプロットした図を示す。
【図２】図２は、薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２のクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、薬用人参分留物ＰＱ1のクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、薬用人参分留物ＰＱ2のクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、薬用人参分留物ＰＱ3のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、薬用人参分留物ＰＱ223のクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、マウスの脾臓細胞のＢ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図８】図８は、マウスの脾臓細胞のＴ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図９】図９は、マウスの脾臓細胞のＴおよびＢ細胞の増殖に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果の特異性を示す。
【図１０】図１０は、マウスの脾臓によるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）抗体生成に対する薬用人参分留物ＰＱ223の効果を示す。
【図１１】図１１は、薬用人参分留物ＰＱ223が注入されたマウスのプラーク形成細胞（ＰＦＣ）の増強を示す。
【００４５】
本発明は、また、健康状態を治療するのに効果的な量の本発明に係る薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態の治療方法を含む。好ましくは、健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される。本発明に係る薬用人参分留物の投与量は、年齢、性別、および患者の一般的な健康状態はもちろん、治療される個々の健康状態にも依存する。しかしながら、適切な投与量は、１日に１〜１０回の投与範囲において、１日あたり、１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に見つかるだろう。薬用人参分留物は、経口で、注射もしくは点滴で、局部的に、鼻から吸って、点眼で、膣に、あるいは直腸に、投与できる。
本発明は、下記の実施例により、さらに説明される。
【実施例１】
【００４６】
（実施例１：分留物ＣＶＴ−Ｅ００２の調製およびこの分留物の精製のための第１の方法）
アメリカの薬用人参の根が化学的に抽出され、引き続いて精製され、分留物ＣＶＴ−Ｅ００１およびＣＶＴ−Ｅ００２を与えた。ＣＶＴ−Ｅ００２の総量がさらに精製され、分留物Ｇ1、Ｇ2、およびＧ3を与えた。この手順の詳細な記述は以下の通りである。
【００４７】
乾燥してすり砕いた薬用人参の根５００グラムが、４リットルの８５％エタノールあるいは３リットルの９０％メタノールにより、８０〜８５℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出され、濾過されてアルコール溶液と残渣を与えた。アルコール溶液は濃縮され、スプレードライされて、全サポニンの生成物（ＣＶＴ−Ｅ００１）を与えた。残渣は４リットルの水により、９５〜１００℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出された。抽出物はモスリン袋を通して濾過され、遠心分離機で分離されて、ＣＶＴ−Ｅ００２を含む水溶液を与え、また、残りの残渣は廃棄された。
【００４８】
水溶液部分はさらなる精製に用いられ、同体積の９５％エタノールが水溶液中に加えられ、それは沈殿を引き起こした。沈殿物は遠近分離機で分離され、減圧下で凍結乾燥され、分留物Ｇ1を与えた。上澄みは蒸発濃縮により体積を減らされた。同体積の９５％エタノールが加えられ、次の沈殿Ｇ2を与え、残りの上澄みはエタノールとともに除去され、減圧下で凍結乾燥され、粉末Ｇ3を生成した。
【００４９】
Ｇ2のさらなる精製が以下のように実施された。２グラムのＧ2が８０ｍｌの水に溶解され、１２００の分子量で切り離すＳｉｇｍａ Ｄ−７８８４透析チューブ中で３倍の水に対して透析された。透析は、２４時間毎に２回透析物を集めながら、４℃で７２時間行われた。得られた透析物は１５ｍｌまで濃縮され、その後、同体積のメタノールで沈殿された。沈殿物は水に溶かされ、減圧下で凍結乾燥されて、粉末Ｇ22を生じた。
【００５０】
Ｇ22のさらなる精製が以下のように実施された。１．５グラムのＧ22が６０ｍｌの水に溶解され、１０００の分子量で切り離すフィッシャー・スペクトラル／ポー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌ／Ｐｏｒ）モレキュラー・ポーラス・メンブレン・チューブ中で６００ｍｌの水に対して４℃で透析された。２４時間後に集められた第１の透析物は、蒸発乾燥を用いて１５ｍｌに濃縮され、その後に減圧下で凍結乾燥された。得られた乾燥粉末はＧ221で示された。同様の方法で、４８時間後に透析物の第２バッチが集められ、Ｇ222で示された。保持物質は濃縮され、減圧下で凍結乾燥されて、Ｇ223と呼ばれる粉末を与えた。
【実施例２】
【００５１】
（実施例２：分留物ＣＶＴ−Ｅ００２の調製およびこの分留物の精製のための第２の方法）
本発明に係る薬用人参分留物ＣＶＴ−Ｅ００２を調製する別の方法は下記のようである。
乾燥してすり砕いたアメリカの薬用人参の根１０００グラムが、８リットルの８５％エタノールにより、９５〜１００℃の湯浴で３時間の間攪拌しながら抽出され、濾過されてアルコール溶液と残渣を与えた。残渣は、３時間の間攪拌しながら湯浴にて水と混合（１：８）された。室温まで冷却した後、混合物が濾過された。濾過液は５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけられた。上澄みは濃縮され、フリーズドライされて、抽出物ＣＶＴ−Ｅ００２を与えた。この方法により生成されたＣＶＴ−Ｅ００２の量は、実施例１において生成されたのとほぼ同じ量、即ち、元の生の薬用人参の重量の１０％であった。
【００５２】
ＣＶＴ−Ｅ００２部分は、以下のようにさらに分留された。１００グラムのＣＶＴ−Ｅ００２粉末を２０００ｍｌの水に溶いた溶液中に、１６００ｍｌの９５％エタノールが加えられた。沈殿物はＰＱ1として単離された。上澄みは５００ｍｌにまで濃縮された。この濃縮された溶液中に、別の部分の９５％エタノール（１０００ｍｌ）が再び加えられ、第２の沈殿分留物を与えた。沈殿物は単離され、フリーズドライされて、分留物ＰＱ2を与えた。上澄みは濃縮され、フリーズドライされてＰＱ3を与えた。
【実施例３】
【００５３】
（実施例３：マイトジェン活性試験）
種々のレベルに精製したアメリカの薬用人参の分留物が、そのリンパ球のマイトジェン特性に基づいたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のスクリーニングにより選択された。分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は、免疫系においてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で生じる通常のイベントに対して、むしろ人工的イベントであると考えられるが、マイトジェンは可能なエフェクタ機能のよい指示を提供する。
【００５４】
マイトジェン活性のテスト方法は、以下の通りである：Ｂａｌｂ／ＣあるいはＣ５７Ｂ１／６Ｊのマウスがテストに用いられた。Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、ヘルス・サイエンス・ラボラトリー・アニマル・サービス・ファシリティ（ユニバーシティ・オブ・アルバータ、エドモントン、カナダ）（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ））から得られた。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、ジャクソン・ラボラトリー（バー・ハーバー、ＭＥ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂａｒ，ＭＥ））から得られた。生後７〜１０週間のマウスが各実験に歳と性別を適合された。マウスは頸部のずれにより命を絶たれた。脾臓が無菌の技術を用いて取り出され、２枚のスライドガラスのすり加工された界面の間で押しつぶされた。ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）中での遠心分離により洗浄した後、細胞は、ＲＰＭＩ１６４０に中間のｐＨ７．４で（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）懸濁され、それは１０％の牛の胎児の血清（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ）、５０ｍＭのメルカプトエタノール（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含んでいた。培養液は、９６のウェルを持つ底部が平坦なＬｉｎｂｒｏプレートに、最終濃度の１ｍｌあたり１．２５×１０6個の細胞で３重にセットされた。実験グループは、前もって濾過で滅菌され、ＨＢＳＳに溶解された試験分留物とともに、セットされた。対照培養液は、マイトジェンなしのグループと、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を２０μｇ／ｍｌあるいはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を２５μｇ／ｍｌ有するグループからなっていた。ＰＨＡは特にＴ型の脾臓細胞を刺激し、一方でＬＰＳはＢ型の脾臓細胞を刺激することが知られている。培養液は、３７℃の温度、加湿された５％のＣＯ2雰囲気下で７２時間の間培養された。７２時間の培養の終了時から４時間前に、１μＣｉのトリチウム化したチミジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が各ウェルに加えられた。細胞は自動試料採取機（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により採取され、その後に組み込まれた放射能がシンチレーション計測により分析された。結果は対照に対する％として計算された（平均±標準偏差、３重で）。
【００５５】
水中でのＣＶＴ−Ｅ００２の濃度や沈殿に用いられるエタノールの体積など、実施例１および２に示される異なる抽出条件は、ＣＶＴ−Ｅ００２のさらなる分留に影響を与える。これら２つの方法から得られた生成物は、マイトジェン活性で比較された。結果は下記の表に示される。各テストは３つのバッチにより３重で実施された。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
表１および２が示すように、実施例１および２の間の抽出手順の変化は、Ｇ1分留物からＰＱ2分留物への生物学的活性の移動に相関する。
【実施例４】
【００５９】
（実施例４：ＰＱ2の分留および分留物ＰＱ223の調製の方法）
実施例２に係るＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ3は、分子量分布に従い、アリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ハイレゾリューションカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１６６−０１）上のゲル濾過クロマトグラフィーによって、さらに分留される。デキストラン試料（ＭＷ＝７１．４ｋ、３７．５ｋ、１９．５ｋ、および９．５ｋ）はＳｉｇｍａから購入され、標準試料として用いられた。各試料５ｍｇが１ｍｌの水に溶解され、カラムに導入され、かつ、環境温度４℃で、０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌバッファにより、フローレート０．３ｍｌ／分で溶出された。多くの溶出液がいくつもの個々の５ｍｌ部分として集められた。
【００６０】
個々の溶出部分のそれぞれの炭水化物の内容物は、全て、炭水化物内容物全てに対してマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートアッセイによりテストされた。これは、ＤｕｂｏｉｓらのＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−５６（１９５６）に記載された方法を一部変更した方法である。溶出液中の炭水化物全ては、所定の吸収スペクトルで検出可能とするために誘導体に合成される。Ｄ−グルコースが標準試料として用いられ、また、用いられる他の材料は濃硫酸（９８％）とフェノール（５％）であった。ポリスチレンマイクロタイタープレートはＳＡＲＳＴＤＴ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入された。マイクロタイタープレートの各ウェルに、１〜１０μｇのＤ−グルコースを含有する４０μｌの標準試料溶液が加えられ、４０μｌの５％フェノールが加えられて混合された。その後、２００μｌの濃硫酸が丁寧に加えられた。試薬と個々の溶出部分をマルチチャンネルピペットで混合した後、プレートが８０℃の下、１時間の間培養された。室温まで冷却した後、マルチスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）マイクロタイタプレートリーダにより４９２ｎｍにおいて試料の吸収が測定された。データは保存され、マイクロソフトエクセルプログラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーの結果がプロットされた。
【００６１】
分子量がよく知られた一連の標準デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を同一のカラムにかけることにより、標準曲線が形成された（図１）。ＣＶＴ−Ｅ００２、および、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ3の組２１に対するクロマトグラムが図２〜５に示される。各図において、Ｘ軸上の点は溶出体積を実際の体積の１／５に換算して示す。このため、正しい溶出体積の値を得るには、図の結果に５がかけられなければならない。
【００６２】
ＣＶＴ−Ｅ００２のゲル濾過クロマトグラム（図２）は、主たる３つのピークを示した。第１のピーク（溶出分留７〜１０）の分子量は、標準曲線（図１）によると７０，０００あるいはそれ以上と見積もられた。第３のピーク（溶出分留１８〜２２）の分子量は約１０００と見積もられた。小さな幅広の第２のピーク（溶出分留１０〜１７）も観測された。これら３つのピークの比は５７．２：８．５：３４．４であった。
【００６３】
ＰＱ1のクロマトグラム（図３）は、ＣＶＴ−Ｅ００２の高分子量分留物に合致する、１つの主たるピーク（溶出分留７〜１０）と、弱いピーク（溶出分留１８〜２１）を示した。この２つのピークの比は８６．８：１３．２であった。
【００６４】
ＰＱ2のクロマトグラム（図４）は、主たる３つのピークを示した。Ａ（溶出分留７〜１０）およびＣ（溶出分留１９〜２２）と名付けられたピークは、ＣＶＴ−Ｅ００２の２つの主たるピークに合致する。Ｂ（溶出分留１０〜１７）と名付けられた、もう一つの幅広のピークが、ピークＡとＣの間に観測された。このピークに対する分子量は約２，０００〜６０，０００と見積もられた。３つのピークＡ〜Ｃの比は３４．１：４５．７：２０．３であった。Ｄ（溶出分留２４〜５０であり、その部分は図４にて示されている）と名付けられた小さなピークの領域も観測された。
【００６５】
ＰＱ3のクロマトグラム（図５）は、１つの主たるピーク（溶出体積１８〜２１）のみを示し、これはＣＶＴ−Ｅ００２の低い分子量分留物に合致する。
【００６６】
ＰＱ2の分留物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、集められ、フリーズドライされる。乾燥された粉末は、それぞれＰＱ2Ａ、ＰＱ2Ｂ、ＰＱ2Ｃ、およびＰＱ2Ｄと新たに命名される。また、分留物ＡおよびＢは混合され、混合された分留物はＰＱ223（そのクロマトグラムは図６に示される）と呼ばれた。ＰＱ2Ａ、ＰＱ2Ｂ、ＰＱ2Ｃ、およびＰＱ2Ｄのマイトジェン活性がテストされ、分留物ＰＱ223、ＰＱ2およびＣＶＴ−Ｅ００２の活性と比較された。結果は以下の表に示される。
【００６７】
【表３】
【００６８】
結果が示すように、有効性の序列はＰＱ223＞ＰＱ2＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。
【実施例５】
【００６９】
（実施例５：ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の炭水化物総量およびタンパク質組成の化学的決定）
各分留物ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の３バッチが得られ、各分留物に対する炭水化物およびタンパク質の総量の組成が測定された。炭水化物の総量の含有量は、従来より知られたフェノール−サルファリック（ｓｕｌｆｕｒｉｃ）法によって決定された。タンパク質の含有量は、従来より知られたＬｏｗｒｙ法によって検査され、ウシ血清アルブミンが標準として用いられた。結果は以下の表に示される。
【００７０】
【表４】
【実施例６】
【００７１】
（実施例６：ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223のモノサッカライド組成の化学的決定）
炭水化物の総量の含有量は主にポリサッカライドとオリゴサッカライドの量を表しているので、所定の分留物に対するモノサッカライドのモル比もまた決定された。
【００７２】
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、ＰＱ3、およびＰＱ223の分留物の組は、その構造単位であるモノサッカライドを遊離させるため、酸触媒加水分解された。遊離したモノサッカライドは、ＭＰＰ（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）と誘導体を合成された後、その定性的および定量的解析がＨＰＬＣにより行われた。詳細な方法が以下の通りである：２ＮのＨＣｌ中の試料溶液が９５〜１００℃に６時間加熱された。混合物はＮａＯＨ溶液で中和された。内部標準が加えられた。ＭｅＯＨおよびＮａＯＨ水溶液（０．３Ｎ）がこの混合物に加えられた。その後、これが５０〜６０℃で８時間（あるいは室温で１週間）攪拌された。混合物は水で（１：１０）に希釈され、ＨＰＬＣで解析された。ＭＰＰで誘導体が合成された試料は、Ｃ−１８カラムで、０．１Ｍもリン酸バッファ（ｐＨ７）中の１８％アセトニトリル溶液からなる溶離液を用い、フローレート１ｍｌ／分、２４５ｎｍでのＵＶ検出にて、解析された。下記の表は、ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、ＰＱ2、およびＰＱ223のモノサッカライドのモル比を示す。グルクロン酸のトレース量は、あるＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ1、およびＰＱ2の試料中に見つかった。
【００７３】
【表５】
【００７４】
結果が示すように、グルコースの含有量の序列は次の通りである：ＰＱ１＞ＣＶＴ−Ｅ００２＞ＰＱ２＞ＰＱ３；また、ガラクツロン酸の含有量は次の通りである：ＰＱ２＞ＰＱ２２３＞ＣＶＴ−Ｅ００２＞ＰＱ１。
【実施例７】
【００７５】
（実施例７：薬用人参分留物の免疫調節）
１．マクロファージ活性
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、Ｇ2、およびＰＱ223マウスのマクロファージに対する効果は、細胞性反応を優先的にマウントするＣ５７Ｂ１／６マウスと、抗体性反応を優先的にマウントするＢａｌｂ／ｃからの腹膜滲出マクロファージを用いて、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）に研究された。マクロファージが１００μｇ／ｍｌのテスト試料で刺激された後、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αの生成が測定された。その方法は下記の通りである。
【００７６】
Ａ．腹膜滲出細胞および細胞上澄みからのマクロファージの調製
１）３％チオグリコレート１ｍｌがマウスの腹膜腔に注入され、３日後に腹膜腔から腹膜滲出マクロファージが採取された。
２）細胞懸濁液がＨａｎｋｓバッファとともに、４℃にて１１００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて２回洗浄された。
３）マクロファージがＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳ媒体中に懸濁された。
４）細胞が計測され、ＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳ媒体で１０6／ｍｌの最終濃度に希釈された。
５）マクロファージが、３７℃、１０×１０6／１０ｍｌ ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳにて２時間培養された。上澄みが廃棄され、沈殿したマクロファージが１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄された。
６）マクロファージが採取され、ＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳに再び懸濁された。
７）マクロファージ（５×１０5）が、１０ｍｇ／ｍｌのＬＰＳあるいは１００ｍｇ／ｍｌのテスト試料とともに、２４あるいは４８時間培養された。その後で、バイオアッセイ（ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−α）のために、上澄みが集められ、濾過滅菌された。実験は３重に行われた。
【００７７】
Ｂ．上澄み中のＩＬ−１の決定
ＮＯＢ１細胞系は、ＩＬ−１に応答して活性（ＩＬ−２）を刺激するＣＴＬＬ成長を生成するＥＬ４細胞系のＴＫ変異種である。ＮＯＢ１細胞は3ＨＴｄＲを組み込まないので、ＩＬ−１への応答はＣＴＬＬ系による取り込みの点から測定できる。手順は下記に示す通りである。
１）９６のウェルを持つ底部が平坦なマイクロタイタープレートの各ウェルにおいて、１０4個のＣＴＬＬ細胞が、ＩＭＤＭ中の５％ＦＢＳ溶液２００μｌ中で、４×１０4個のＮＯＢ１細胞と混合された。ＩＬ−１標準の４、８、１６、または３２倍、あるいは連続的な希釈液である一続きに希釈されたＩＬ−１テスト試料が加えられた。各ウェルの最終的な体積は２００μｌであった。各試料は３重に調製された。
２）プレートが、３７℃、加湿された５％ＣＯ2の培養器において、２４時間の間培養された。
３）［3Ｈ］−チミジンが培養の最後の５時間の間加えられた。
４）細胞が採取され、液体シンチレーション計測により［3Ｈ］−チミジン組み込みが測定された。
５）ＩＬ−１濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００７８】
【表６】
【００７９】
結果は、ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、Ｇ2、およびＰＱ223は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのマクロファージを明らかに刺激してＩＬ−１を生成したことを示す。全てのテスト試料はＩＬ−１生成を刺激する同様な能力を示した。
【００８０】
Ｃ．ＩＬ−６の決定
マウスのＢ細胞ハイブリドーマ細胞系であるＢ９の増殖はＩＬ−６に依存する。Ｂ９細胞は、濃度を減らしているテスト試料を含む一連のマイクロウェル中で培養された。手順は下記に示す通りであった。
１）貯蔵培養フラスコから移した一部試料中のＢ９細胞の数が、それらの成長の対数期において計測された。
２）細胞は、１８０ｘｇ、４℃の卓上遠心分離機にて５分間遠心分離され、ペレットが、１０ｍｌの完全なＲＰＭＩ−１０媒体中に再懸濁された。この手順が２回繰り返され、細胞は、完全なＲＰＭＩ−１０媒体中に、２×１０3個の細胞／ｍｌで再懸濁された。
３）洗浄された細胞（２×１０3個の細胞／ｍｌ）の１００μｌが、９６のウェルを持つマイクロタイタープレートの各ウェルに加えられた。
４）テスト試料の２倍連続希釈液１００μｌが、各ウェルに加えられ、プレートの２または３列がＩＬ−６標準のために残しておいた。
５）プレートが、加湿された、３７℃、５％ＣＯ2の培養器で７２時間培養された。
６）［3Ｈ］−チミジンが加えられ、プレートが３７℃で４時間培養された。
７）細胞が採取され、液体シンチレーションカウンタを用いて、［3Ｈ］−チミジンの組み込みが決められた。
８）ＩＬ−６濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００８１】
【表７】
【００８２】
ＣＶＴ−Ｅ００２、ＰＱ2、およびＰＱ223は、Ｃ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂ／ｃからのマクロファージの上澄み中でのＩＬ−６の生成を増加させた。能力は、ＰＱ223＞ＰＱ2＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。
【００８３】
Ｄ．ＴＮＦ−αの測定
下記のプロトコルは、細胞培養物から得られた上澄み中のＴＮＦ活性を定量するため、ＴＮＦに感度があり、アクチノマイシンＤ処理されたマウスのＬ９２９繊維芽細胞を採用した。１）ＩＭＤＭ−５％ＦＳＣ ５０μｌ中の４×１０4個のＬ９２９細胞が各ウェルに加えられた。
２）テスト試料５０μｌが各列の２番目のウェル（カラム２）に加えられた。ウェル２の内容物を静かに混合させることで２倍連続希釈液が形成され、ウェル２からウェル３に５０μｌ移された。ウェル３の内容物は静かに混合され、ウェル３から５０μｌがウェル４に移された。この手順がウェル１２まで続けられた。最後に、カラム１２の全てのウェルの内容物が静かに混合され、各ウェルから５０μｌが廃棄された。この点で、全てのウェルは５０μｌを含んだ。
３）アクチノマイシンＤ溶液５０μｌが各ウェルに加えられた（２μｌ ｍｌ）。
４）プレートが、３７℃、５％ＣＯ2の空気中で２４時間培養された。
５）ナチュラルレッド５μｌが各ウェルに加えられ、プレートが２．５時間培養された。
６）各ウェルの上澄みが直ちに、注意深くすすがれ、移されて、プレートが２００μｌのＰＢＳで２回洗浄された。
７）ＰＢＳが吸い出され、０．０５ＭのＮａＨ2ＰＯ4中５０％エタノール溶液１００μｌが各ウェルに加えられ、室温で５分間攪拌された。
８）マイクロタイタープレートリーダにより、５７０ｎｍにける吸光度において、各ウェルが直ちに読まれた。
９）ＴＮＦ−α濃度が算出された。結果は下記の表に示される。
【００８４】
【表８】
【００８５】
ＴＮＦ−αの生成は、Ｂａｌｂ／ｃあるいはＣ５７Ｂ１／６細胞系からのマクロファージの上澄みにおいてＣＶＴ−Ｅ００２およびＰＱ223により誘発された。Ｂａｌｂ／ｃマウスからのマクロファージの上澄みにおけるＴＮＦ−αは、明らかにＧ2により刺激を受けた。ＰＱ2はマクロファージによるＴＮＦ−α生成に刺激を与えないようであった。
【００８６】
２．血清免疫グロブリン生成
血清免疫グロブリン生成（トータルＩｇＧ）は、水を与えられたマウスに比べて、ＣＶＴ−Ｅ００２を与えられたマウスにおいては２１％、ＰＱ2 を与えられたマウスにおいては２６％、ＰＱ223を与えられたマウスにおいては３１％、増加した。能力は、ＰＱ２２３＞ＰＱ２＞ＣＶＴ−Ｅ００２である。結果は表９に示される。
【００８７】
【表１０】
【００８８】
３．ＰＨＡあるいはＬＰＳなどのよく知られたマイトジェンは、それらが刺激する細胞の種類について特異性を示す。脾臓細胞のどの特定の種類が薬用人参分留物により刺激を受けるかを知ることは重要である。従って、われわれは、アフィニティカラムによってＴ細胞を分離し、Ｔ細胞を減らすことによって、Ｂ細胞を濃縮した。
【００８９】
Ａ．Ｔ細胞濃縮
赤い血液細胞を除去するため、脾臓細胞の単一細胞懸濁液がリンパ球−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）上に積層された。その後、マウスの免疫グロブリンで被覆されたビーズへの吸着によりＢ細胞を取り除くアフィニティクリマトグラフィーカラム（Ｂｉｏｔｅｘ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ）にリンパ球を通過させた。溶出液は、濃縮された集団のＴ細胞からなっていた。他の細胞種に対するＴ細胞の割合の決定は、抗ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体と補体処理を用いた生存能力テストによってなされた。
【００９０】
Ｂ．Ｂ細胞濃縮
脾臓細胞集団からの赤い血液細胞の除去の後で、リンパ球は、モノクローナル抗ｔｈｙ１．２抗体とともに３７℃で１時間培養された。低毒のウサギの補体が加えられ、４℃で３０分培養された。この手順はＴ細胞の細胞懸濁を減らし、Ｂ細胞集団を濃縮する結果となる。
【００９１】
Ｃ．ＰＱ223との培養
ＢまたはＴ細胞はＰＱ223の適用量を変えながら培養され、応答がトリチウム化されたチミジンの組み込みによって測定された。図７および８は、それぞれ、相対的に精製されたＢおよびＴ細胞に対するＰＱ223の増殖効果を示す。対照グループは、Ｂ細胞に特異的なマイトジェンであるＬＰＳ、およびＴ細胞に特異的なマイトジェンであるＰＨＡで処理された細胞を含んだ。ＰＱ223はＢ細胞に特異的であることが発見された（図９参照）。
【００９２】
４．インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での抗体生成に対するＰＱ223の効果
脾臓細胞は、適用量を変えたＰＱ223の存在下において７２時間培養された。対照培養物は、２５μｇのＬＰＳが加えられたグループと、マイトジェンが加えられなかったもう一つのグループから構成された。上澄みは、エンザイム・リンクト・イムノソーベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））を用いて、可溶性の免疫グロブリンの存在がテストされた。可溶性の免疫グロブリンを含む上澄みは、０．１Ｍのトリスバッファ（ｐＨ９）中に連続的に希釈された。マイクロタイタープレートが、この上澄みで被覆され、４℃で終夜培養された。プレートは、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄され、その後、抗体−酵素複合Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２抗マウスＩｇセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１００μｌが１：１０００の希釈率で加えられた。プレートは室温で１時間培養された。プレートは再びＰＢＳで３回洗浄され、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ Ｉｎｃ．）が各ウェルに加えられた。１時間後、４０５ｎｍの波長での吸光度がフローマルチスキャン（Ｆｌｏｗ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）ＥＬＩＳＡリーダによって測定された。
【００９３】
図１０は、５０μｇ／ｍｌのＰＱ223が、ＬＰＳ２５μｇの場合と同程度に、免疫グロブリンの生成物を刺激したことを示す。高濃度のＰＱ223、５００μｇ／ｍｌは、より高い水準の抗体生成を誘い出さなかった。この適用量応答曲線は、異種の脾臓細胞集団および精製されたＢ細胞の増殖応答と一致する。これらの結果は、４つの実験に基づいた。
【００９４】
５．インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗体プラーク形成細胞
３つの濃度のＰＱ223がそれぞれ３匹のマウスからなる３グループに静脈注射された。対照グループは、平衡塩溶液が注射された。ＰＱ223での静脈処理の７日後に、マウスはＨＢＳＳ中の１０％ＳＲＢＣ懸濁液０．２ｍｌにより免疫性を与えられた。免疫性を与えられてから５日後に、マウスは犠牲となり、脾臓からの単一細胞懸濁液が調製され、１ｍｌあたり４×１０6個の細胞に調節された。この細胞懸濁液の０．１ｍｌの一部試料がテンジクネズミ補体の１０％ＳＲＢＣ溶液０．３ｍｌとＲＰＭＩ媒体０．５ｍｌと混合された。この混合物の７０μｌがカニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）チャンバ−に移された。チャンバーはパラプラスト（ｐａｒａｐｌａｓｔ）ワックスで封止され、プラーク形成細胞を計測する前に、３７℃で１時間培養された。全てのＰＦＣレベルは１００万個の脾臓細胞あたりとして表現される。図１１は、三種の適用量が全て、化合物が注射されたマウス内で、明らかに抗体生成を増強したことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
まとめると、本研究の結果は、マクロファージが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを生成するのを本発明の薬用人参分留物が活性化することを示す。また、それらは、リンパ球、特にＢリンパ球の増殖および抗体生成も活性化する。体液が媒介する免疫系の全体が刺激され、感染に対する予防効果を示した。報告されたＴＮＦ−α生成の活動は、抗ウイルスおよび抗腫瘍の恩恵を含む。ＴＮＦ−αは、また、種々の寄生感染の治療のためにもなると報告されている。
【００９６】
以下の本発明の背景において言及された引用文献は、ここに参照により本発明に組み込まれる。
１．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，２２−５（１９９３）．
２．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１７，１２８７−９１（１９９４）．
３．Ｔｏｍｏｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６，１０８７−９０（１９９３）．
４．Ｇａｏら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，５５，９−１２（１９８９）．
５．Ｇａｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８１，１７５−８７（１９８８）．
６．Ｋｉｙｏｈａｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２６３，８９−１０１（１９９４）．
７．Ｓｈｉｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３００，２３９−４９（１９９７）．
８．Ｙａｍａｄａら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓ．，９，２６４−９（１９９５）．
９．Ｋｏｎｎｏら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，５０，４３４−６（１９８４）．
１０．Ｈｉｋｉｎｏら、未発表．
１１．Ｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４，２５５−９（１９８５）．
１２．Ｋｏｎｎｎｏら、Ｊ．Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，２５，５３−５（１９８７）．
１３．Ｋｏｎｎｎｏら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４，６９−７４（１９８５）．
１４．Ｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，５０，１８８−９９０（１９８７）．
１５．Ｌｅｅら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７，３２３−３２（１９９７）．
１６．Ｋｉｍら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６４，１１０−５（１９９８）．
１７．Ｍｉａｏら、Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｈｕａｘｕｅ ＺａＺｈｉ，９，６１０−４（１９９３）．
１８．Ｍａら、Ｂａｉｑｉｕｅｎ Ｙｉｋｅ Ｄａｘｕｅ Ｘｕｅｂａｏ，２３，２３６−８（１９９７）．
１９．Ｚｈｕら、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏｌｉｘｕｅ Ｔｏｎｇｂａｏ，１３，７６−８（１９９７）．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法であって、当該方法は、
（ａ）アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
（ｅ）少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
（ｆ）その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
（ｇ）その後で、アルコールを含む第３の溶媒にステップ（ｆ）において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
（ｈ）上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2を生成すること
を具備する薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法。
【請求項２】
上記第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおける上記アルコールが、他と関係なく、飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む
請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおける上記アルコールが、他と関係なく、エタノールあるいはメタノールを含む
請求項１記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）において、上記第２の抽出物水溶液が、少なくとも上記第１の抽出物水溶液の一部を含む
請求項１記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において、上記得られた溶液を約３時間の間加熱する
請求項１記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）において、上記得られた溶液を約３時間の間加熱する
請求項１記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｅ）において、上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率が約１：２０である
請求項１記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｆ）において、上記第２の溶媒の水に対する比率が約３：４である
請求項１記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｇ）において、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率が約２：１である
請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）において、上記第１の溶媒および上記薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において、上記第１の溶媒および上記薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）において、上記水および上記第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）において、上記水および上記第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2。
【請求項１５】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法であって、当該方法は、
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
（ｂ）上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
（ｃ）上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること
を具備する薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法。
【請求項１６】
薬用人参分留物ＰＱ2がゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分留される
請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ223。
【請求項１８】
約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項１９】
上記炭水化物内容物が、約３〜５モル％のラムノース、約４３〜４７モル％のガラクツロン酸、約１４〜１６モル％のグルコース、約１８〜２０モル％のガラクトース、および約１４〜１７モル％のアラビノースを含む
請求項１８記載の薬用人参分留物。
【請求項２０】
上記炭水化物内容物が、約４モル％のラムノース、約４５モル％のガラクツロン酸、約１５モル％のグルコース、約１９モル％のガラクトース、および約１５モル％のアラビノースを含む
請求項１８記載の薬用人参分留物。
【請求項２１】
約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項２２】
上記炭水化物内容物が、約４〜７モル％のラムノース、約３７〜４２モル％のガラクツロン酸、約３〜６モル％のグルコース、約２７〜３２モル％のガラクトース、および約１９〜２４モル％のアラビノースを含む
請求項２１記載の薬用人参分留物。
【請求項２３】
上記炭水化物内容物が、約５モル％のラムノース、約３９モル％のガラクツロン酸、約４モル％のグルコース、約２９モル％のガラクトース、および約２１モル％のアラビノースを含む
請求項２１記載の薬用人参分留物。
【請求項２４】
約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項２５】
上記炭水化物内容物が、約１〜３モル％のラムノース、約１３〜２０モル％のガラクツロン酸、約４２〜５７モル％のグルコース、約１２〜１７モル％のガラクトース、および約１３〜１７モル％のアラビノースを含む
請求項２４記載の薬用人参分留物。
【請求項２６】
請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物を有し、薬学的に許容なキャリアに混合した
薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の、低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製において、単独でのあるいは他の薬剤との組み合わせての使用方法。
【請求項２８】
上記健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される
請求項２７記載の使用方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１、ＩＬ−６、および／またはＴＮＦ−αの細胞中の生成を刺激するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３０】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫グロブリンの生成を刺激するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３１】
Ｂリンパ球の増殖とそれらからの抗体の生成を活性化するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３２】
健康状態を治療するのに効果的な量の請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態の治療方法。
【請求項３３】
上記健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される 請求項３２記載の方法。
【請求項１】
薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法であって、当該方法は、
（ａ）アメリカの薬用人参をアルコールを含む第１の溶媒に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、第１の薬用人参溶液を生成すること；
（ｂ）その後で、上記第１の薬用人参溶液を分離して、アルコール／薬用人参溶液と第１の薬用人参残渣を生成すること；
（ｃ）その後で、上記第１の薬用人参残渣を水に混合し、得られた溶液を約８０〜１００℃の温度で約２〜４時間の間加熱し、薬用人参残渣溶液を生成すること；
（ｄ）その後で、上記薬用人参残渣溶液を分離して、第２の薬用人参残渣と、第１の薬用人参抽出物を含む第１の抽出物水溶液を生成すること；
（ｅ）少なくとも上記第１の薬用人参抽出物の一部を含む第２の抽出物水溶液を提供すること、ここで、上記第２の抽出物水溶液中の上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率は約１：１８〜１：２２である；
（ｆ）その後で、アルコールを含む第２の溶媒に上記第２の抽出物水溶液を混合して、第１の沈殿と第１の上澄みを生成すること、ここで、上記第２の溶媒の水に対する比率は約１：１〜３：５である；
（ｇ）その後で、アルコールを含む第３の溶媒にステップ（ｆ）において生成された上記第１の上澄みを混合して、第２の沈殿と第２の上澄みを生成すること、ここで、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率は約３：２〜３：１である；および
（ｈ）上記第２の沈殿物を単離して薬用人参分留物ＰＱ2を生成すること
を具備する薬用人参分留物ＰＱ2を調製する方法。
【請求項２】
上記第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおける上記アルコールが、他と関係なく、飽和あるいは不飽和のＣ1〜Ｃ6アルコールを含む
請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記第１の溶媒、第２の溶媒、および第３の溶媒のそれぞれにおける上記アルコールが、他と関係なく、エタノールあるいはメタノールを含む
請求項１記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）において、上記第２の抽出物水溶液が、少なくとも上記第１の抽出物水溶液の一部を含む
請求項１記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において、上記得られた溶液を約３時間の間加熱する
請求項１記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）において、上記得られた溶液を約３時間の間加熱する
請求項１記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｅ）において、上記第１の薬用人参抽出物の水に対する比率が約１：２０である
請求項１記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｆ）において、上記第２の溶媒の水に対する比率が約３：４である
請求項１記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｇ）において、上記第３の溶媒の第１の上澄みに対する比率が約２：１である
請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）において、上記第１の溶媒および上記薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約７〜９ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において、上記第１の溶媒および上記薬用人参が、薬用人参１グラムあたり約８ｍｌの第１の溶媒の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）において、上記水および上記第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約７〜９ｍｌの水の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）において、上記水および上記第１の薬用人参残渣が、薬用人参残渣１グラムあたり約８ｍｌの水の比率で混合される
請求項１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2。
【請求項１５】
薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法であって、当該方法は、
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ2を提供すること；
（ｂ）上記薬用人参分留物ＰＱ2を分留して第１溶出分留物および第２溶出分留物を生成すること、ここで、第１溶出分留物は溶出体積が３５および５０ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、第２溶出分留物は溶出体積が５０および８５ｍｌの間に観測される炭水化物ピークに合致し、これらは下記の材料を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される：
（１）アリルデキストランおよびＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドからなる架橋した球形の共重合体のマトリックスを含み、１６×６００ｍｍのベッド寸法および１２０ｍｌのベッド体積と、球状のタンパク質に対して５０００〜２５０，０００、デキストランに対して１０００〜８０，０００の分留範囲（ＭＷ）を有するクロマトグラフィーカラム、および
（２）０．１Ｎ ＨＣｌおよびｐＨが７．０の０．３Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−ＨＣｌの溶出バッファ；および
（ｃ）上記第１溶出分留物および上記第２溶出分留物を単離し、かつ混合して、薬用人参分留物ＰＱ223を生成すること
を具備する薬用人参分留物ＰＱ223を調製する方法。
【請求項１６】
薬用人参分留物ＰＱ2がゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分留される
請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法によって生成された、薬用人参分留物ＰＱ223。
【請求項１８】
約２〜６モル％のラムノース、約４１〜４９モル％のガラクツロン酸、約１２〜１８モル％のグルコース、約１６〜２２モル％のガラクトース、および約１２〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項１９】
上記炭水化物内容物が、約３〜５モル％のラムノース、約４３〜４７モル％のガラクツロン酸、約１４〜１６モル％のグルコース、約１８〜２０モル％のガラクトース、および約１４〜１７モル％のアラビノースを含む
請求項１８記載の薬用人参分留物。
【請求項２０】
上記炭水化物内容物が、約４モル％のラムノース、約４５モル％のガラクツロン酸、約１５モル％のグルコース、約１９モル％のガラクトース、および約１５モル％のアラビノースを含む
請求項１８記載の薬用人参分留物。
【請求項２１】
約３〜８モル％のラムノース、約３６〜４４モル％のガラクツロン酸、約２〜７モル％のグルコース、約２５〜３３モル％のガラクトース、および約１７〜２５モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項２２】
上記炭水化物内容物が、約４〜７モル％のラムノース、約３７〜４２モル％のガラクツロン酸、約３〜６モル％のグルコース、約２７〜３２モル％のガラクトース、および約１９〜２４モル％のアラビノースを含む
請求項２１記載の薬用人参分留物。
【請求項２３】
上記炭水化物内容物が、約５モル％のラムノース、約３９モル％のガラクツロン酸、約４モル％のグルコース、約２９モル％のガラクトース、および約２１モル％のアラビノースを含む
請求項２１記載の薬用人参分留物。
【請求項２４】
約０．５〜５モル％のラムノース、約１１〜２２モル％のガラクツロン酸、約４０〜６０モル％のグルコース、約１０〜１９モル％のガラクトース、および約１１〜１９モル％のアラビノースを含む炭水化物内容物を有する
薬用人参分留物。
【請求項２５】
上記炭水化物内容物が、約１〜３モル％のラムノース、約１３〜２０モル％のガラクツロン酸、約４２〜５７モル％のグルコース、約１２〜１７モル％のガラクトース、および約１３〜１７モル％のアラビノースを含む
請求項２４記載の薬用人参分留物。
【請求項２６】
請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物を有し、薬学的に許容なキャリアに混合した
薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の、低免疫で特徴付けられる健康状態を治療するのに適した薬学的組成物の調製において、単独でのあるいは他の薬剤との組み合わせての使用方法。
【請求項２８】
上記健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される
請求項２７記載の使用方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１、ＩＬ−６、および／またはＴＮＦ−αの細胞中の生成を刺激するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３０】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫グロブリンの生成を刺激するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３１】
Ｂリンパ球の増殖とそれらからの抗体の生成を活性化するための請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物の使用方法。
【請求項３２】
健康状態を治療するのに効果的な量の請求項１４、１７、または１８〜２５のいずれかに記載の薬用人参分留物を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の低免疫で特徴付けられる健康状態の治療方法。
【請求項３３】
上記健康状態が、通常の風邪、インフルエンザ、慢性疲労症候群、ＡＩＤＳ、癌からなるグループから選択される 請求項３２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２５６３８７（Ｐ２００９−２５６３８７Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８６０２７（Ｐ２００９−１８６０２７）
【出願日】平成２１年８月１０日（２００９．８．１０）
【分割の表示】特願２０００−５３８７０５（Ｐ２０００−５３８７０５）の分割
【原出願日】平成１０年１２月１１日（１９９８．１２．１１）
【出願人】（５０９０３１４０８）エフエックス ライフ サイエンシズ アクチェンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１０日（２００９．８．１０）
【分割の表示】特願２０００−５３８７０５（Ｐ２０００−５３８７０５）の分割
【原出願日】平成１０年１２月１１日（１９９８．１２．１１）
【出願人】（５０９０３１４０８）エフエックス ライフ サイエンシズ アクチェンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
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