医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法
【課題】
ビオチン結合タンパク質化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供すること。
【解決手段】
生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。ビオチン結合タンパク質を有する生理活性物質を選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。
ビオチン結合タンパク質化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供すること。
【解決手段】
生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。ビオチン結合タンパク質を有する生理活性物質を選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンはビオチン結合性タンパク質と特異的に結合反応を生じることは古くから知られており、その結合力は抗原−抗体反応の１００万倍以上と強く、ほとんど非可逆反応に近い結合性を示す。この特性を活かし、ビオチン−ビオチン結合タンパク質反応は、生化学分野における検出反応によく用いられる。
【０００３】
ビオチンは分子量２４４の分子で分子末端にカルボシキル基を有することからヒドロキシスクシンイミドなどで活性エステル化することで簡便にアミノ残基を有する物質と結合でき、ビオチン標識することが可能となり、これらのことによりアビジン−ビオチン結合を用いた分子認識反応が広く用いられるようになった。
【０００４】
一方ビオチン結合タンパク質で最も古くから利用されている物質はアビジンであり、アビジンは生卵白由来のタンパク質である。また、微生物であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉからストレプトアビジンが精製されるようになってからは、入手もしやすくなり、汎用されるようになった。また、アビジンを脱グリコシル化することでレクチン等、糖鎖との相互作用により発生する非特異吸着を抑えたニュートラアビジンが開発され、元来のアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンと、ビオチン結合タンパク質群として機能タンパク質のグループを形成している。
【０００５】
前記のようなビオチン−ビオチン結合タンパク質群の反応をより簡便に用い、生体物質固定化やそれを用いた免疫分析のための、種々のシステムが開発されているが、その多くはビオチン結合性タンパク質群を基材に結合させる方法が取られている。
【０００６】
基材にビオチンを固定化させる系は、ビオチンを固定化して、その上にビオチン結合性タンパク質群を結合させるために使用されることが多い。
これは、ビオチン結合タンパク質が、ビオチンとの結合部位を1分子中に複数持つものもが多く（例えば、ストレプトアビジン1分子中に４箇所のビオチン結合部位）、基材上に固定化したビオチンに、ビオチン結合タンパク質を結合させた後、更に、ビオチンを含む生理活性物質等を捕捉させるためのものである。
例えば、特許文献１には、水不溶性ポリマー粒子にビオチンを固定化する方法が記載されている。これは、水不溶性ポリマー粒子にカゼイン分子を結合させ、該カゼイン分子をバインダーにしてビオチンを固定化する方法である。
【０００７】
一方、特許文献２には、スライドグラス上にビオチン分子を固定化し、そのビオチン分子を介して、アビジン、更に、ＤＮＡのプローブ分子を固定化したビオチン分子を
基材−ビオチン−アビジン−ビオチン−プローブ
の順に固定化した生体分子マイクロアレイの作製方法が記載されている。
この方法も、特許文献２と同様に非特異吸着に対する対策が講じておられず、対象物が、夾雑物の場合等による、非特異吸着によるブックグランド値の上昇、Ｓ／Ｎ比の悪化に対応しきれないという欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−１９２１８６
【特許文献２】特開２００２−１５３２７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記（１）〜（１２）に記載の本発明により達成される。
（１）生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体の側鎖末端にビオチン誘導体を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）ビオチン誘導体は、ビオチン末端カルボキシル基にアミノ基を導入し末端アミノ基修飾ビオチンである少なくとも一種以上である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体である（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（６）に記載の医療用粒子。
【化１】
（８）前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（９）前記無機材料が、無機酸化物である（８）に記載の医療用粒子。
（１０）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記粒子状の基材表面にシランカップリング剤を介して導入された重合性官能基が、前記重合体合成時に重合体中に取り込まれることにより、前記粒子状の基材と前記重合体とが共有結合で固定化されている（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（１２）（１）ないし（１１）のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法について説明する。
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の生理活性物質の捕捉方法は、上記に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする。
【００１３】
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有するものである。具体的には、ビオチン結合タンパク質を捕捉する機能を有する医療用粒子に関するものであり、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の結合反応を利用するものである。さらに具体的には、ビオチン誘導体を結合させた基材にビオチン結合タンパク質を含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチン結合タンパク質を含む生体分子、例えば、ビオチン結合タンパク質と結合した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
【００１４】
また、ビオチン結合タンパク質は、ビオチンとの結合部位を1分子中に複数持つものもが多く（例えば、ストレプトアビジン1分子中に４箇所のビオチン結合部位）、粒子上のビオチン誘導体に、ビオチン結合タンパク質を結合させた後、更に、ビオチン結合性タンパク質を結合させた粒子にビオチンを含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチンを含む生体分子、例えば、ビオチン化した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
【００１５】
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。
【００１６】
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
【００１７】
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
【００１８】
前記粒子状の基材の表面には、重合体が固定されている。この重合体は、ビオチン誘導体を効率良く、かつ簡易に粒子状基材に結合することを可能とするものである。さらに、このビオチン誘導体と反応する別の物質（検出対象以外のタンパク質等）の非特異吸着を効果的に抑制するものである。
【００１９】
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットがビオチン結合生理活性物質を捕捉することができるものである。
【００２０】
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
【００２１】
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００２２】
【化１】
【００２３】
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。 前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２４】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２５】
また、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットのビオチン誘導体は、生理活性物質に結合したビオチン結合タンパク質と特異的に反応する分子が好ましい。
また、ビオチン結合タンパク質は、具体的にはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。ビオチンと前記アビジン類との相互作用は非常に強く、特異性も高いためである。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入する事も容易な為、物質固定化の為の強力なツールとすることができる。
【００２６】
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述したビオチン結合性タンパク質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットにビオチン結合性タンパク質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。
【００２７】
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いてビオチン結合性タンパク質を固定化したものであっても良い。
【００２８】
【化２】
【００２９】
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、ビオチン誘導体と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端にビオチン誘導体を配置することが容易となる。
【００３０】
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、ビオチン化合物の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００３１】
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在するビオチン誘導体が分散するために、有効に作用することができる。
【００３２】
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００３３】
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。
【００３４】
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
【００３５】
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。
【００３６】
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐことができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、ビオチン誘導体とビオチン結合タンパク質の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
【００３７】
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記のビオチン結合タンパク質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３８】
（ビオチン誘導体の固定化）
本発明において、基材に固定化するビオチン誘導体は、ビオチン結合タンパク質誘導体と特異的に反応するビオチン分子が好ましく、特に末端アミノ基修飾ビオチンが好ましい。例えば、Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｙｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｙｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−Ｂｉｏｔｙｎなどの分子があげられる。これらの分子の特徴は、ビオチンと末端のアミノ基の間にＰＥＯやＰＥＧなどのスペーサーを有していることで、これは、ビオチンを固定化した際に、基材との間にある程度の距離を持たせて、それによりビオチン−ビオチン結合タンパク質の相互作用において立体障害による結合不足を解消する狙いがある。
【００３９】
本発明においてビオチン誘導体をビーズ上に固定化する際には、ビオチン誘導体を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。ビオチン誘導体を溶解又は分散した液体は、前記試薬により水溶性溶媒、有機溶媒または両溶媒の混合物を用いることができる。水溶性溶媒の場合、ｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０がより好ましい。この範囲外だと、基材、ポリマーおよびビオチン誘導体が変性するおそれがある。
【００４０】
また、有機溶媒を用いる場合には、第二繰り返しユニットのビオチン誘導体を結合させる官能基と反応を起さないものであれば特に限定しないが、メタノールやエタノールのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどの極性溶媒、トルエン、ベンゼンなどの非極性溶媒があげられるが、ビーズやビーズ表面の高分子物質が侵されないことが必要であるので、アルコール類やジメチルスルホキシドを用いることが好ましい。
ビーズへのビオチン誘導体の固定化反応が終了したら、ビーズを洗浄して未反応物を除去する。洗浄剤としては特に限定するものではないが、純水や各種緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコールなどが好ましい。
【００４１】
（生理活性物質の捕捉）
ビーズ上に固定化したビオチン誘導体を用いて捕捉する生理活性物質は、ビオチン結合タンパク質と結合している必要がある。
一方、ビオチン結合タンパク質のみをビーズ上に固定化したビオチン誘導体と結合させた後、更にビオチン誘導体と結合させた生理活性物質を捕捉させることも可能である。
【００４２】
（ビオチン結合タンパク質の修飾により捕捉する生理活性物質の構造）
捕捉する生理活性物質は、ビオチン結合タンパク質により修飾する必要がある。
この反応は、市販の二官能性の架橋剤を用いることで簡単に作製可能である。
市販の二官能性の架橋剤としては、たとえば、グルタルアルデヒド、ピアースバイオテクノロジー社製のBASED、DSS、N-[κ-Maleimidoundecanoyloxy]-Sulfosuccinimide Ester、N-Succinimidyl Iodoacetate、Succinimidyl-6-[(β-Maleimidopropionamido)Hexanoate]を好適に用いることができる。
【００４３】
（ビオチン修飾により捕捉する生理活性物質の構造）
まず、第一段階として、ビーズ表面に固定化されたビオチン誘導体にビオチン誘導体を捕捉させる必要がある。この捕捉反応は、一般的なビオチンーアビジン反応条件で間単に作製可能である。
続いて、捕捉する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を、一般的な方法で導入する事で、基材表面に捕捉されたビオチン結合タンパク質によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
ビオチンまたはビオチン誘導体を導入する一般的な方法としては、市販のビオチン標識キット（例えば、同人化学製、Dojin Labling Kit）を用いて生理活性物質をビオチン標識することが可能である。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
（ビオチンビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００４６】
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０、８０：２０、７０：３０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
【００４７】
得られたシリカビーズ約１００ｍｇを０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＥＺ-Ｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｉｎ-ＬＣ-ＰＥＯ-ＡｍｉｎｅをＤＭＳＯで希釈）と混合し３７℃で４時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、純水で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。 遠心分離により上澄みを除去した後、純水で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い乾燥させた。また、ビオチンを固定化せず、ポリマーコートと不活性化のみを上述の方法で行ったビーズを作製した。
【００４８】
（ビオチンビーズおよび不活化ビーズの測定）
得られたシリカビーズ（ビオチン固定化ビーズおよび不活化のみ行ったビーズ）各１ｍｇに５μｇ／ｍＬに調整したＨＲＰ標識化ストレプトアビジン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ製ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ，ＨＲＰ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤをＰＢＳで希釈）２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面のＨＲＰ標識化ストレプトアビジンとを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度は、上記操作においてビオチン固定化ビーズを使用した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの量が反映され、不活化ビーズを使用した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの量が反映される。
【００４９】
（比較例１）
前記アビジンビーズの作製と同様の方法で、ＰＥＧＭＡ４７５とＭＥＯＮＰとの比率を、順に９９：１、２０：８０に変更したものを作製した。前記と同様、ビオチン化ビーズと不活化ビーズに対してＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００５０】
（比較例２）
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）に実施例１の処理の施さずそのまま用い、ビオチン化ビーズと不活化ビーズに対してＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００５１】
表１には実施例１、比較例１及び２のビオチン固定化ビーズおよび不活化ビーズに対する、ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は、比較例１および２のビーズに比較して、ビオチン固定化ビーズに対するＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる吸光度（１）と不活性化ビーズに対するＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするストレプトアビジンを捕捉できていることがわかる。
【００５２】
表１
【００５３】
（実施例２）
（アビジン固定化ビーズの作製）
実施例１で作製したビオチン化ビーズ各約３７ｍｇを５０μｇ／ｍＬのアビジン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈）１ｍＬと混合し３７℃で４時間処理した。次いで、遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い、さらにＰＢＳで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を１回行った。
【００５４】
（アビジン固定化ビーズの測定）
得られたシリカビーズ１ｍｇにアビジンと特異的に結合する５μｇ／ｍＬのビオチン標識化ＨＲＰ溶液（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅをＰＢＳで２００倍に希釈）２７０μＬ、または５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識化抗体溶液２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰ、又は非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化ＨＲＰ溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰの量が反映され、ＨＲＰ標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。
【００５５】
（比較例３）
実施例１で作製した不活化ビーズに対して実施例２と同じ操作を行った。
【００５６】
表２には実施例２、比較例３のビーズに対する、特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は比較例３のシリカビーズに比較してビオチン標識化ＨＲＰによる吸光度（１）とＨＲＰ標識化抗体による吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするタンパク質を捕捉できていることがわかる。
【００５７】
表２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンはビオチン結合性タンパク質と特異的に結合反応を生じることは古くから知られており、その結合力は抗原−抗体反応の１００万倍以上と強く、ほとんど非可逆反応に近い結合性を示す。この特性を活かし、ビオチン−ビオチン結合タンパク質反応は、生化学分野における検出反応によく用いられる。
【０００３】
ビオチンは分子量２４４の分子で分子末端にカルボシキル基を有することからヒドロキシスクシンイミドなどで活性エステル化することで簡便にアミノ残基を有する物質と結合でき、ビオチン標識することが可能となり、これらのことによりアビジン−ビオチン結合を用いた分子認識反応が広く用いられるようになった。
【０００４】
一方ビオチン結合タンパク質で最も古くから利用されている物質はアビジンであり、アビジンは生卵白由来のタンパク質である。また、微生物であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉからストレプトアビジンが精製されるようになってからは、入手もしやすくなり、汎用されるようになった。また、アビジンを脱グリコシル化することでレクチン等、糖鎖との相互作用により発生する非特異吸着を抑えたニュートラアビジンが開発され、元来のアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンと、ビオチン結合タンパク質群として機能タンパク質のグループを形成している。
【０００５】
前記のようなビオチン−ビオチン結合タンパク質群の反応をより簡便に用い、生体物質固定化やそれを用いた免疫分析のための、種々のシステムが開発されているが、その多くはビオチン結合性タンパク質群を基材に結合させる方法が取られている。
【０００６】
基材にビオチンを固定化させる系は、ビオチンを固定化して、その上にビオチン結合性タンパク質群を結合させるために使用されることが多い。
これは、ビオチン結合タンパク質が、ビオチンとの結合部位を1分子中に複数持つものもが多く（例えば、ストレプトアビジン1分子中に４箇所のビオチン結合部位）、基材上に固定化したビオチンに、ビオチン結合タンパク質を結合させた後、更に、ビオチンを含む生理活性物質等を捕捉させるためのものである。
例えば、特許文献１には、水不溶性ポリマー粒子にビオチンを固定化する方法が記載されている。これは、水不溶性ポリマー粒子にカゼイン分子を結合させ、該カゼイン分子をバインダーにしてビオチンを固定化する方法である。
【０００７】
一方、特許文献２には、スライドグラス上にビオチン分子を固定化し、そのビオチン分子を介して、アビジン、更に、ＤＮＡのプローブ分子を固定化したビオチン分子を
基材−ビオチン−アビジン−ビオチン−プローブ
の順に固定化した生体分子マイクロアレイの作製方法が記載されている。
この方法も、特許文献２と同様に非特異吸着に対する対策が講じておられず、対象物が、夾雑物の場合等による、非特異吸着によるブックグランド値の上昇、Ｓ／Ｎ比の悪化に対応しきれないという欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−１９２１８６
【特許文献２】特開２００２−１５３２７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記（１）〜（１２）に記載の本発明により達成される。
（１）生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体の側鎖末端にビオチン誘導体を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）ビオチン誘導体は、ビオチン末端カルボキシル基にアミノ基を導入し末端アミノ基修飾ビオチンである少なくとも一種以上である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体である（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（６）に記載の医療用粒子。
【化１】
（８）前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（９）前記無機材料が、無機酸化物である（８）に記載の医療用粒子。
（１０）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記粒子状の基材表面にシランカップリング剤を介して導入された重合性官能基が、前記重合体合成時に重合体中に取り込まれることにより、前記粒子状の基材と前記重合体とが共有結合で固定化されている（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（１２）（１）ないし（１１）のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法について説明する。
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の生理活性物質の捕捉方法は、上記に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする。
【００１３】
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有するものである。具体的には、ビオチン結合タンパク質を捕捉する機能を有する医療用粒子に関するものであり、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の結合反応を利用するものである。さらに具体的には、ビオチン誘導体を結合させた基材にビオチン結合タンパク質を含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチン結合タンパク質を含む生体分子、例えば、ビオチン結合タンパク質と結合した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
【００１４】
また、ビオチン結合タンパク質は、ビオチンとの結合部位を1分子中に複数持つものもが多く（例えば、ストレプトアビジン1分子中に４箇所のビオチン結合部位）、粒子上のビオチン誘導体に、ビオチン結合タンパク質を結合させた後、更に、ビオチン結合性タンパク質を結合させた粒子にビオチンを含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチンを含む生体分子、例えば、ビオチン化した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
【００１５】
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。
【００１６】
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
【００１７】
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
【００１８】
前記粒子状の基材の表面には、重合体が固定されている。この重合体は、ビオチン誘導体を効率良く、かつ簡易に粒子状基材に結合することを可能とするものである。さらに、このビオチン誘導体と反応する別の物質（検出対象以外のタンパク質等）の非特異吸着を効果的に抑制するものである。
【００１９】
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットがビオチン結合生理活性物質を捕捉することができるものである。
【００２０】
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
【００２１】
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００２２】
【化１】
【００２３】
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。 前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２４】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２５】
また、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットのビオチン誘導体は、生理活性物質に結合したビオチン結合タンパク質と特異的に反応する分子が好ましい。
また、ビオチン結合タンパク質は、具体的にはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。ビオチンと前記アビジン類との相互作用は非常に強く、特異性も高いためである。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入する事も容易な為、物質固定化の為の強力なツールとすることができる。
【００２６】
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述したビオチン結合性タンパク質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットにビオチン結合性タンパク質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。
【００２７】
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いてビオチン結合性タンパク質を固定化したものであっても良い。
【００２８】
【化２】
【００２９】
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、ビオチン誘導体と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端にビオチン誘導体を配置することが容易となる。
【００３０】
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、ビオチン化合物の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００３１】
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在するビオチン誘導体が分散するために、有効に作用することができる。
【００３２】
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００３３】
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。
【００３４】
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
【００３５】
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。
【００３６】
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐことができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、ビオチン誘導体とビオチン結合タンパク質の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
【００３７】
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記のビオチン結合タンパク質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３８】
（ビオチン誘導体の固定化）
本発明において、基材に固定化するビオチン誘導体は、ビオチン結合タンパク質誘導体と特異的に反応するビオチン分子が好ましく、特に末端アミノ基修飾ビオチンが好ましい。例えば、Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｙｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｙｎｅ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−Ｂｉｏｔｙｎなどの分子があげられる。これらの分子の特徴は、ビオチンと末端のアミノ基の間にＰＥＯやＰＥＧなどのスペーサーを有していることで、これは、ビオチンを固定化した際に、基材との間にある程度の距離を持たせて、それによりビオチン−ビオチン結合タンパク質の相互作用において立体障害による結合不足を解消する狙いがある。
【００３９】
本発明においてビオチン誘導体をビーズ上に固定化する際には、ビオチン誘導体を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。ビオチン誘導体を溶解又は分散した液体は、前記試薬により水溶性溶媒、有機溶媒または両溶媒の混合物を用いることができる。水溶性溶媒の場合、ｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０がより好ましい。この範囲外だと、基材、ポリマーおよびビオチン誘導体が変性するおそれがある。
【００４０】
また、有機溶媒を用いる場合には、第二繰り返しユニットのビオチン誘導体を結合させる官能基と反応を起さないものであれば特に限定しないが、メタノールやエタノールのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどの極性溶媒、トルエン、ベンゼンなどの非極性溶媒があげられるが、ビーズやビーズ表面の高分子物質が侵されないことが必要であるので、アルコール類やジメチルスルホキシドを用いることが好ましい。
ビーズへのビオチン誘導体の固定化反応が終了したら、ビーズを洗浄して未反応物を除去する。洗浄剤としては特に限定するものではないが、純水や各種緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコールなどが好ましい。
【００４１】
（生理活性物質の捕捉）
ビーズ上に固定化したビオチン誘導体を用いて捕捉する生理活性物質は、ビオチン結合タンパク質と結合している必要がある。
一方、ビオチン結合タンパク質のみをビーズ上に固定化したビオチン誘導体と結合させた後、更にビオチン誘導体と結合させた生理活性物質を捕捉させることも可能である。
【００４２】
（ビオチン結合タンパク質の修飾により捕捉する生理活性物質の構造）
捕捉する生理活性物質は、ビオチン結合タンパク質により修飾する必要がある。
この反応は、市販の二官能性の架橋剤を用いることで簡単に作製可能である。
市販の二官能性の架橋剤としては、たとえば、グルタルアルデヒド、ピアースバイオテクノロジー社製のBASED、DSS、N-[κ-Maleimidoundecanoyloxy]-Sulfosuccinimide Ester、N-Succinimidyl Iodoacetate、Succinimidyl-6-[(β-Maleimidopropionamido)Hexanoate]を好適に用いることができる。
【００４３】
（ビオチン修飾により捕捉する生理活性物質の構造）
まず、第一段階として、ビーズ表面に固定化されたビオチン誘導体にビオチン誘導体を捕捉させる必要がある。この捕捉反応は、一般的なビオチンーアビジン反応条件で間単に作製可能である。
続いて、捕捉する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を、一般的な方法で導入する事で、基材表面に捕捉されたビオチン結合タンパク質によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
ビオチンまたはビオチン誘導体を導入する一般的な方法としては、市販のビオチン標識キット（例えば、同人化学製、Dojin Labling Kit）を用いて生理活性物質をビオチン標識することが可能である。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
（ビオチンビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００４６】
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０、８０：２０、７０：３０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
【００４７】
得られたシリカビーズ約１００ｍｇを０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＥＺ-Ｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｉｎ-ＬＣ-ＰＥＯ-ＡｍｉｎｅをＤＭＳＯで希釈）と混合し３７℃で４時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、純水で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。 遠心分離により上澄みを除去した後、純水で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い乾燥させた。また、ビオチンを固定化せず、ポリマーコートと不活性化のみを上述の方法で行ったビーズを作製した。
【００４８】
（ビオチンビーズおよび不活化ビーズの測定）
得られたシリカビーズ（ビオチン固定化ビーズおよび不活化のみ行ったビーズ）各１ｍｇに５μｇ／ｍＬに調整したＨＲＰ標識化ストレプトアビジン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ製ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ，ＨＲＰ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤをＰＢＳで希釈）２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面のＨＲＰ標識化ストレプトアビジンとを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度は、上記操作においてビオチン固定化ビーズを使用した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの量が反映され、不活化ビーズを使用した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの量が反映される。
【００４９】
（比較例１）
前記アビジンビーズの作製と同様の方法で、ＰＥＧＭＡ４７５とＭＥＯＮＰとの比率を、順に９９：１、２０：８０に変更したものを作製した。前記と同様、ビオチン化ビーズと不活化ビーズに対してＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００５０】
（比較例２）
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）に実施例１の処理の施さずそのまま用い、ビオチン化ビーズと不活化ビーズに対してＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００５１】
表１には実施例１、比較例１及び２のビオチン固定化ビーズおよび不活化ビーズに対する、ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は、比較例１および２のビーズに比較して、ビオチン固定化ビーズに対するＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる吸光度（１）と不活性化ビーズに対するＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによる吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするストレプトアビジンを捕捉できていることがわかる。
【００５２】
表１
【００５３】
（実施例２）
（アビジン固定化ビーズの作製）
実施例１で作製したビオチン化ビーズ各約３７ｍｇを５０μｇ／ｍＬのアビジン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈）１ｍＬと混合し３７℃で４時間処理した。次いで、遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回行い、さらにＰＢＳで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を１回行った。
【００５４】
（アビジン固定化ビーズの測定）
得られたシリカビーズ１ｍｇにアビジンと特異的に結合する５μｇ／ｍＬのビオチン標識化ＨＲＰ溶液（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅをＰＢＳで２００倍に希釈）２７０μＬ、または５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識化抗体溶液２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰ、又は非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化ＨＲＰ溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰの量が反映され、ＨＲＰ標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。
【００５５】
（比較例３）
実施例１で作製した不活化ビーズに対して実施例２と同じ操作を行った。
【００５６】
表２には実施例２、比較例３のビーズに対する、特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は比較例３のシリカビーズに比較してビオチン標識化ＨＲＰによる吸光度（１）とＨＲＰ標識化抗体による吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするタンパク質を捕捉できていることがわかる。
【００５７】
表２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
【請求項２】
前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体の側鎖末端にビオチン誘導体を結合させたものである請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのランダム共重合体である請求項１または２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項５】
ビオチン誘導体は、ビオチン末端カルボキシル基にアミノ基を導入し末端アミノ基修飾ビオチンである少なくとも一種以上である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである請求項６に記載の医療用粒子。
【化１】
【請求項８】
前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項９】
前記無機材料が、無機酸化物である請求項８に記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記粒子状の基材表面にシランカップリング剤を介して導入された重合性官能基が、前記重合体合成時に重合体中に取り込まれることにより、前記粒子状の基材と前記重合体とが共有結合で固定化されている請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【請求項１】
生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン誘導体を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
【請求項２】
前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体の側鎖末端にビオチン誘導体を結合させたものである請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのランダム共重合体である請求項１または２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項５】
ビオチン誘導体は、ビオチン末端カルボキシル基にアミノ基を導入し末端アミノ基修飾ビオチンである少なくとも一種以上である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである請求項６に記載の医療用粒子。
【化１】
【請求項８】
前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項９】
前記無機材料が、無機酸化物である請求項８に記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記粒子状の基材表面にシランカップリング剤を介して導入された重合性官能基が、前記重合体合成時に重合体中に取り込まれることにより、前記粒子状の基材と前記重合体とが共有結合で固定化されている請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【公開番号】特開２０１２−９３２９０（Ｐ２０１２−９３２９０Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４２１６７（Ｐ２０１０−２４２１６７）
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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