医薬組成物および保健機能食品の添加物
【課題】簡単な構造であってＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性に作用を及ぼす医薬組成物および保健機能食品の添加物を提供する。
【解決手段】一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有している医薬組成物および保健機能食品の添加物であってＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する、またはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるものである。主成分がジペプチドという簡単な構造であるので、手に入れやすく安価であり、生体内に入っても安全性が高い。
【解決手段】一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有している医薬組成物および保健機能食品の添加物であってＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する、またはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるものである。主成分がジペプチドという簡単な構造であるので、手に入れやすく安価であり、生体内に入っても安全性が高い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物および保健機能食品に関し、特にＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を作動させる作用又は阻害する作用を有する医薬組成物および保健機能食品の添加物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳神経系の神経伝達は、神経細胞の興奮によって行われることはよく知られている。この伝達は興奮性神経伝達物質の受容体の活性化により引き起こされ、神経興奮の度合いは抑制性や興奮性の神経伝達物質によって調節されている。興奮性神経伝達物質にはアセチルコリンやグルタミン酸などがよく知られている。抑制性神経伝達物質としては、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）やグリシンが挙げられる。これらのうち、グルタミン酸は中枢の神経細胞興奮の５０％以上に関わっていると考えられており、神経伝達物質として最重要な位置を占めている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
L-グルタミン酸とその受容体であるグルタミン酸受容体は中枢神経系における興奮性神経伝達に働いているだけでなく、記憶や学習などの高次神経機能にも深く関わっている。グルタミン酸受容体の機能不全は、様々な脳神経疾患（脳虚血、アルツハイマー病など）や精神疾患（精神分裂病、てんかん、躁鬱病など）の原因の一つと考えられている。このようなグルタミン酸の多岐にわたる生理機能の発現には、グルタミン酸とその受容体との結合が引き金になっている。つまり神経接合部（シナプス）でのグルタミン酸とその受容体との結合機構の解明は、脳神経研究にとっての重要な課題の一つである。
【０００４】
グルタミン酸受容体は、イオンチャンネルを内在したイオンチャンネル型受容体（iGluR）と、GTP結合蛋白質を介して細胞内カルシウムイオン上昇（Group １型）やcAMP産生抑制（Group 2,3型）などの細胞内代謝経路を活性化する代謝調節型受容体（mGluR）に大別されている。イオンチャンネル型受容体は外因性の作動薬（アゴニスト）に対する感受性の違いから、Ｎ−メチルアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型、カイニン酸（ＫＡ）型、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）型の３種類に分類され、これらはさらに数種類のサブタイプに分類されている。代謝調節型受容体はアミノ酸配列の相同性やアゴニスト選択性、細胞内情報伝達系の違いにより３つのグループ（Group１，２，３型）に分類されている。
【０００５】
上記のグルタミン酸受容体のうち、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、脳神経系において記憶や学習に重要な働きをしているとともに、脳卒中を起こしたときの神経細胞死にも重要な働きをしていることが解明されている。また、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして知られている物質の中には統合失調症様の症状を示すものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１２２８３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大船泰史、島本啓子（1997）興奮性神経伝達機構を探る化合物現代化学、18-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を部分的に阻害する医薬であるメマンチンは欧米において抗認知症薬として使用されている。また特許文献１には、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対し(s)-α-アミノ-3,4-ジオキソ-2-ヒドロキシ-1-シクロブテン-1-プロピオニックアシッドは結合活性を有していること、および (s)-α-アミノ-3,4-ジオキソ-2-ヒドロキシ-1-シクロブテン-1-ブチリックアシッドは強い結合活性を有してアゴニストとして機能していることが開示されている。
【０００９】
しかしながら、上記の物質は比較的複雑な構造であるので製造コストが大きく、また副作用も有している。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、簡単な構造であってＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性に作用を及ぼす医薬組成物および保健機能食品の添加物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明の第１の医薬組成物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する作用を有する構成とした。
【００１２】
本発明の保健機能食品の添加物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有する構成である。ここで保健機能食品とは、いわゆる健康食品のうち、厚生労働省が有効性や安全性を考慮して設定した規格基準などを満たす食品のことであり、食品の目的や機能などの違いにより、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類に分けられている。
【００１３】
ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸であってもよい。
【００１４】
α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸であってもよい。
【００１５】
本発明の第２の医薬組成物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用を有する構成である。ここでＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を部分的に作動させるいわゆるパーシャルアゴニスト（部分作動剤）としての作用であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を阻害またはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるので、神経保護、抗認知症、精神疾患等の治療や予防などに安全に且つ安価に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１に係るジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図２】アスパルチルグルタミン酸のＮＭＤＡ受容体活性への阻害活性を示す図である。
【図３】実施例１に係るジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【図４】ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の構造を示す図である。
【図５】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図６】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図７】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【図８】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態について説明をする前に、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体について詳しく説明をし、この受容体の活性に作用を及ぼすとどのような効果があるかについて説明をする。
【００１９】
既に述べたとおり、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体はグルタミン酸受容体の一種であり、記憶や学習、また脳虚血などに深く関わる受容体であると考えられている。この受容体は中枢神経系を中心に生体内に広く分布し、リガンドであるグルタミン酸の結合を経て、陽イオンを透過させるイオンチャネル共役型受容体である。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体がリガンドと結合したときに透過させる陽イオンは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）やカリウムイオン（Ｋ＋）の他に、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）も透過し易いことが知られている。
【００２０】
図４は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の構造を示す図である。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＮＲ１とＮＲ２のヘテロ２量体２セットからなる４つのサブユニットで構成されている。ＮＲ２サブユニットはさらにＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２Ｄの４種類に分類されており、それぞれ生体内での発現部位や発現時期が異なる。主要サブユニットの一つであるＮＲ１サブユニットにはグリシンを受容するサイトがあり、グリシンを受容していないＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、活動できない。ＮＲ２サブユニットにはグルタミン酸を受容するサイトがある。また通常、細胞外マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）によって活動が阻害されているため、脱分極刺激などでＭｇ２＋が外れないと活動できない。つまり、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活動には２種のリガンドとＭｇ２＋の除去が必要と言える。ＮＲ１とＮＲ２とに、それぞれグリシンとグルタミン酸とが結合することでチャンネルが開口し、細胞内にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が進入する。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ＭＫ−８０１、及びメマンチンは、不競合阻害をする物質で、受容体のチャンネル部分に結合することで活性を阻害する。
【００２１】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストを表１に示す。上側のａに示しているものはＮＲ１サブユニットに結合するアゴニストであり、自然環境において体内に存在するものはグルタミン酸だけである。下側のｂに示しているものはＮＲ２サブユニットに結合するアゴニストであり、自然環境において体内に存在するものはグリシンおよびセリンである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストを表２に示す。上側のａに示しているものはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に不競合的（uncompetitive）な作用をするアンタゴニストであり、下側のｂに示しているものは非競合的（non-competitive）に作用するアンタゴニストである（J.N.C.Kew, J.A.Kemp, Pscychopharmacology 179:4-29,2005参照）。
【００２４】
【表２】
【００２５】
以上のような特徴を有するＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、記憶や学習に深く関わるとともに、アンタゴニストが与えられると統合失調症様の症状を示すことから、活性を亢進する物質には、統合失調症のような精神疾患の治療薬や神経保護薬としての効果があり、活性を阻害する物質には抗認知症薬としての効果があることになる。例えば既に述べたように、部分アンタゴニストであるメマンチンは抗認知症薬として既に、ヨーロッパ、アメリカで使用されている。神経細胞が死ぬと分解されてアミノ酸が放出され、その中のグルタミン酸やグリシンがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を上げて神経細胞内に過剰の陽イオンを透過させて神経細胞を死に至らせるため、アンタゴニストは神経細胞死が増えることを抑制する効果も有している。ただし、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は適切なタイミング且つ適切な期間で開閉しないと、記憶や学習に支障が生じたり精神疾患の症状が発生したりするので、活性を亢進したり阻害したりする度合いが強すぎても薬としての使用が難しくなる。
【００２６】
以上の知見に基づいて、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下に述べる実施形態は本発明の例示であり、本発明はこの例に限定されない。
【００２７】
本実施形態においては、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるジペプチドを準備してＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させた。
【００２８】
前記のジペプチドとしては、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンなどを例として挙げることができる。グリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸と結合する他方のアミノ酸としては、α−アミノ酸であって、蛋白質を構成している２０種類のアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリン）から選ばれた一種類であると、前記ジペプチドが安価であって手に入れやすく、生体に対して安全性も高いので好ましい。
【００２９】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を阻害するかどうかは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の２種類のリガンドであるグリシンおよびグルタミン酸と本実施形態のジペプチドとを一緒にしてＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させ、受容体が作動するとイオンの通過すなわち電流が生じるので、受容体活性を二電極膜電位固定法による電流測定の方法を用いて測定した。
【００３０】
ジペプチドを加えないで、グリシンおよびグルタミン酸のみを加えた（control）との比較により活性を阻害するか否かを判定したところ、本実施形態のジペプチドの中にはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性に阻害作用を示すものがあることが確認された。本実施形態のジペプチドはリガンドとサイトへの結合を争う拮抗的な活性阻害剤であり、パーシャルアンタゴニスト（部分阻害剤）であることが判明した。
【００３１】
次に本実施形態のジペプチドがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるかどうかについて確認を行った。この確認は、グリシンまたはグルタミン酸の何れか一方と本実施形態のジペプチドとをＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させ、受容体活性を二電極膜電位固定法による電流測定の方法を用いて測定することによりおこなった。
【００３２】
その結果、濃度等の条件によって程度の差はあるが本実施形態のジペプチドにはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用があることが確認された。なお作動させる程度は、濃度等の条件やジペプチドの種類によって異なるが、約５〜７０％であって、本実施形態のジペプチドはパーシャルアゴニストであることが判明した。
【実施例】
【００３３】
以下に、ジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害作用及び作動作用についての実施例を説明する。
【００３４】
（実施例１）
１．測定方法
アフリカツメガエル卵母細胞に外来のｍＲＮＡを注入すると、効率よく外来タンパク質が発現することが知られている。これまで発明者は、マウスのＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体についてこの発現系を用いて研究してきた（Yamada, Y. et al., J. Biol. Chem. 274, 6647-6652, 1999、Yamada, Y. et al., J. Neurochem. 81, 758-764, 2002、Iwamoto, K. et al., J. Neurochem. 89, 100-108, 2004）。そこでこの技術を用いてジペプチドのＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対する作用を測定した。
【００３５】
［ｃＲＮＡの合成］
マウス脳のＮＭＤＡ受容体のＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢサブユニットのｃＤＮＡは、pBKSA ＮＲ１Ａ、pBKSA ＮＲ２Ａ、pBKSA ＮＲ２Ｂプラスミドのかたちで提供されたものを使用した。これを鋳型として、in vitroで、T3 ＲＮＡポリメラーゼを用いてＮＭＤＡ受容体のｃＲＮＡを合成した。
【００３６】
［アフリカツメガエル卵母細胞の発現］
アフリカツメガエルのステージＶまたはＶＩ卵母細胞を採取し、２ mg/ml コラゲナーゼ入りのバース液（88 mM NaCl、1 mM KCl、0.33 mM Ca(NO3)2、0.41 mM CaCl2、0.82 mM MgSO4、2.4 mM NaHCO3、7.7 mM Tris-HCl、pH 7.2）に室温で２時間インキュベーションした。その後、卵胞膜をピンセットで取り除いた卵母細胞にＮＲ１とＮＲ２Ａ、ＮＲ１とＮＲ２ＢのｃＲＮＡのモル比が１：２になるよう注入した。ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ１、ＮＲ２ＢのｃＲＮＡ注入後、18単位/mlのペニシリンG・18単位/mlのストレプトマイ
シンを含むバース液で、４０〜４８時間、１９℃でインキュベーションしたのち活性を測定した。
【００３７】
アフリカツメガエル卵母細胞の発現系では、外来のｍＲＮＡを注入すると効率よくそのタンパク質を発現できることが知られている。しかし、神経細胞では、グルタミン酸によって全てのグルタミン酸受容体が活性化し、神経細胞への直接的なグルタミン酸の投与ではＮＭＤＡ受容体単独の活性をみることは非常に難しい。そこで、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いることで、目的であるＮＭＤＡ受容体のタンパク質のみを卵母細胞内に発現させ、効率よく活性を測定することができる。
【００３８】
［ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の測定］
TEV-200 Two Electrode Voltage Clamp System （Dagon Corp. Minneapolis, MN）を用いて、二電極膜電位固定法で計測した。電極には3 M KClを満たしたガラス管（抵抗値1〜5 MΩ）を使用した。卵母細胞を標準Ba2+リンゲル液（115 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM BaCl2、10 mM HEPES, pH 7.2）還流条件下、２３〜２５℃において、卵母細胞内を細胞外液に対して-70 mVに固定して計測した。通常の電流計測では、ＮＭＤＡ受容体のリガンド（グルタミン酸、グリシン）を２０秒間流し、そのとき流れた電流を計測した。各計測後に標準Ba2+リンゲル液で洗浄した。
【００３９】
２．ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性へのジペプチドの効果
１）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性への阻害作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの阻害効果を検討した。その際ジペプチドとして、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）を用いた。
【００４０】
図１は、上記のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を、Ｌ−グリシン100 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を10 μMとして、300 μMのグリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸の阻害活性を測定した結果を示している。また、Ｌ−グリシン10 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を100 μMとして、300 μMのグリシルグリシン、アスパルチルグリシンの阻害活性を測定した結果を示している。その結果、上記の条件においてはアスパルチルグルタミン酸（AspGlu）がＮＲ１／ＮＲ２Ａ及び、ＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体への阻害活性を示した。ＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体では５０％、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体では３２％の阻害を示した。
【００４１】
図２は、アスパルチルグルタミン酸の阻害活性を示したものである。具体的には、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）の阻害活性を詳細に見るために、AspGluを10, 100, 300, 1000 μMのそれぞれの濃度にしてＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させて生じた阻害活性を示している。その結果容量依存的に阻害することが、明らかになった。またＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体の方がより阻害されやすいことも明らかになった。
【００４２】
２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性作動作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの作動効果を検討した。その際ジペプチドとして、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）を用いた。
【００４３】
図３は、上記ジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体測定の際に、リガンドであるＬ−グリシン100 μMと、300 μMのグリシルグルタミン酸またはアスパルチルグルタミン酸とを加えてアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。また、Ｌ−グルタミン酸100 μMとし、300 μMグリシルグリシン、アスパルチルグリシンのアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。その結果、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンはかなり高いアゴニスト活性があることがわかった。また、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸にも弱いながらもアゴニスト活性があることがわかった。
【００４４】
以上のことから、グリシルグルタミン酸、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンはＮＲ１／ＮＲ２Ａ、及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した。
【００４５】
また、アスパルチルグルタミン酸はＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性をもち競合的アンタゴニストとして作用しており、弱いながらもアゴニスト活性があることがわかった。
【００４６】
上述のことから考えられることは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のリガンドとしてはグリシンとグルタミン酸の２種類があるが、グリシンを構成要素とするジペプチドおよびグルタミン酸を構成要素とするジペプチドも、これらのグリシン部分およびグルタミン酸部分が受容体の結合サイトに結合することができて、アゴニスト活性を有するという仮説である。一般的には、生体における種々の受容体に結合するリガンドは、結合サイトによってそれぞれ特有の化合物であってその構造が少しでも変わると当該結合サイトに結合できないのであるが、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体においてはジペプチド程度の小さい分子であり一方の末端に本来のリガンドであるグリシンやグルタミン酸が存在すれば、結合サイトにある程度は結合できると考えられる。また、アゴニスト活性を有するということは、本来のリガンドと拮抗的に結合サイトに結合しようとする物質であるということであるので、アンタゴニストでもあると言える。
【００４７】
また、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチルアスパラギン酸）がＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであるので、アスパラギン酸を一方の構成要素とするジペプチドについても上記と同様の理由でアゴニスト活性を有すると考えられる。
【００４８】
以上の結果から、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸を含むジペプチドはＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持ち、幾つかのジペプチドはアンタゴニスト活性を持っていると考えられる。そのアンタゴニストとしての作用は弱いため、緩やかな神経保護効果を有すると考えられ、アゴニストとしての活性も、緩やかな神経活動賦活作用をもたらすことが見込まれる。メマンチンの作用から考えると、抗認知症の効果が上記ジペプチドにあると考えられる。
【００４９】
（実施例２）
実施例１で測定した４種のジペプチドであるグリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）に加えて、アラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アラニルグリシン（AlaGly）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の６種のジペプチドについても、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害作用及び作動作用を検討した。
【００５０】
なお、本実施例では、Ｌ−セリンを使用しているが、Ｄ−セリンを使用することもできる。
また、測定方法、ｃＲＮＡの合成方法、アフリカツメガエル卵母細胞の発現、及びＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の測定は、実施例１と同様である。
【００５１】
１）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性への阻害作用
図５及び図６は、上記の１０種のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を、Ｌ−グリシン（Gly）を100 μMとし、Ｌ−グルタミン酸（Glu）を10 μMとして、300 μMのアラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）の阻害活性を測定した結果を示している。
【００５２】
また、当該リガンドの濃度を、Ｌ−グリシンを10 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を100 μMとして、300 μMのアラニルグリシン（AlaGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）、グリシルグリシン（GlyGly）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の阻害活性を測定した結果を示している。
【００５３】
なお、各ジペプチドの濃度を300 μMとしているが、図２に示されるように、300 μM以外の濃度においても活性が示される。従って、ジペプチドの濃度は、任意であり、好ましくは10 μM〜1000 μM、さらに好ましくは100 μM〜300 μMである。
【００５４】
その結果、上記の条件においては、実施例１において活性が示されたアスパルチルグルタミン酸（AspGlu）に加えて、ベータアスパチルグリシン（β-AspGly）及びアラニルグリシン（AlaGly）がＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性を示した。ベータアスパルチルグリシンは４１％の阻害を示し、また、アラニルグリシンは２３％の阻害を示した。また、アスパルチルグルタミン酸は、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体に対して３３％、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体に対して２２％の阻害を示した。
【００５５】
２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性作動作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの作動効果を検討した。その際、実施例１で測定した４種のジペプチドであるグリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）に加えて、アラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アラニルグリシン（AlaGly）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の６種のジペプチドについても作動作用を検討した。
【００５６】
図７及び図８は、上記の１０種のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体測定の際に、リガンドであるＬ−グリシン（Gly）を100 μMと、300 μMのアラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）とを加えてアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。
【００５７】
また、リガンドであるＬ−グルタミン酸（Glu）を100 μMとし、300 μMのアラニルグリシン（AlaGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）、グリシルグリシン（GlyGly）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）のアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。
【００５８】
図７及び図８に示されるジペプチドのアゴニストとしての活性の割合を表３に示す。実施例１でＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した４種のジペプチドであるグリシルグリシン、アスパルチルグリシン、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸に加えて、アラニルグルタミン酸、アラニルグリシン、グルタミルグルタミン酸、ベータアスパルチルグリシン、ヒスチジルグリシン、グリシルセリンの６種のジペプチドについてもアゴニスト活性（作動活性）があることがわかった。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる割合は、ジペプチドの種類によって異なるが、約３〜７３％であった。
【００５９】
【表３】
【００６０】
以上のことから、上記の１０種のジペプチドはＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した。
【００６１】
また、ベータアスパルチルグリシン及びアラニルグリシンは、ＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性をもち、競合的アンタゴニストとして作用しており、さらに、アゴニスト活性があることがわかった。
【００６２】
以上の結果から、実施例１で示されたグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸に加えて、セリンを含む全てのジペプチドはＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を持っていると考えられる。
【００６３】
ＮＭＤＡ受容体は記憶や学習に深く関わるとともに、アンタゴニスト（活性阻害剤）が与えられると統合失調症の症状を示すことから、活性を亢進する物質には統合失調症のような精神疾患の治療薬や精神保護薬としての効果があり、活性を阻害する物質には抗認知症薬としての効果があることになる。しかし、抗認知症薬として使用されるアンタゴニストは、神経細胞死が増えることを抑制する一方で、効果が強すぎると学習に支障が生じたり、統合失調症などの精神疾患の症状を引き起こしたりするため、活性の亢進や阻害の度合いが強すぎても薬としての使用が難しくなる。本実施例の結果のように、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を程よく阻害または作動させるジペプチドは、神経保護、抗認知症、精神疾患等の治療や予防などに役立つ可能性が示唆された。
【００６４】
即ち、上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬組成物や保健機能食品は、緩やかな神経保護効果や緩やかな神経活動賦活作用を発揮するものである。
【００６５】
本実施例では、神経細胞レベルにおける実験結果であり、ＮＭＤＡ受容体の活性を直接測定している。従って、本実験結果は、in vivoでの実験結果と同様の結果であると判断されるものである。
また、上記ジペプチドは、生体を構成する物質であるため、副作用がないと判断される。
【００６６】
上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬組成物の剤形は、内服薬、注射薬、座薬、吸入薬などを挙げることができる。当該医薬組成物は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。また、上記の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、および他の医薬品を含有させることもできる。当該医薬は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。医薬の用量は任意であり、年齢、体重などの患者の状態、投与経路などを考慮した上で決定することができる。
【００６７】
また、上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする保健機能食品（即ちジペプチドが添加物となっている食品）は、液体、固形物、スラリー状物、粉末物などの形態が考えられ、食べやすいように種々の既知の食材と混ぜ合わせられていることが好ましい。当該食材には、必要に応じ、甘味料、旨味調味料、無機塩、酸味料、アミノ酸類、核酸、糖類、賦形剤、香辛料、旨味以外の調味料、抗酸化剤、着色料、保存料、強化剤、乳化剤、ハーブ、スパイス、エタノール等の食品に使用可能な各種添加物を使用することができる。
【００６８】
上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬や保健機能食品を投与・摂取できる患者、患蓄としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等）を例示することができるが、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等、任意である。
【００６９】
上記１０種のジペプチドに化学的・酵素的修飾をすることもできる。化学的・酵素的に修飾された当該ジペプチドを構成成分とする医薬や保健機能食品とすることもできる。また、ジペプチドの製法は任意である。
【００７０】
また、上記の複数のジペプチドを組み合わせた医薬や保健機能食品とすることもできる。組み合わせる種類や割合は任意であり、例えば、アンタゴニスト活性があるベータアスパルチルグリシンとアゴニスト活性があるヒスチジルグリシンとを１：１の割合で組み合わせたり、アラニルグリシンとヒスチジルグリシンとグリシルセリンとを１：２：３の割合で組み合わせたりすることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上説明したように、本発明に係る医薬組成物及び保健機能食品の添加物は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害又は作動する作用を有し、神経保護効果等を発揮する医薬や保健機能食品などとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物および保健機能食品に関し、特にＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を作動させる作用又は阻害する作用を有する医薬組成物および保健機能食品の添加物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳神経系の神経伝達は、神経細胞の興奮によって行われることはよく知られている。この伝達は興奮性神経伝達物質の受容体の活性化により引き起こされ、神経興奮の度合いは抑制性や興奮性の神経伝達物質によって調節されている。興奮性神経伝達物質にはアセチルコリンやグルタミン酸などがよく知られている。抑制性神経伝達物質としては、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）やグリシンが挙げられる。これらのうち、グルタミン酸は中枢の神経細胞興奮の５０％以上に関わっていると考えられており、神経伝達物質として最重要な位置を占めている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
L-グルタミン酸とその受容体であるグルタミン酸受容体は中枢神経系における興奮性神経伝達に働いているだけでなく、記憶や学習などの高次神経機能にも深く関わっている。グルタミン酸受容体の機能不全は、様々な脳神経疾患（脳虚血、アルツハイマー病など）や精神疾患（精神分裂病、てんかん、躁鬱病など）の原因の一つと考えられている。このようなグルタミン酸の多岐にわたる生理機能の発現には、グルタミン酸とその受容体との結合が引き金になっている。つまり神経接合部（シナプス）でのグルタミン酸とその受容体との結合機構の解明は、脳神経研究にとっての重要な課題の一つである。
【０００４】
グルタミン酸受容体は、イオンチャンネルを内在したイオンチャンネル型受容体（iGluR）と、GTP結合蛋白質を介して細胞内カルシウムイオン上昇（Group １型）やcAMP産生抑制（Group 2,3型）などの細胞内代謝経路を活性化する代謝調節型受容体（mGluR）に大別されている。イオンチャンネル型受容体は外因性の作動薬（アゴニスト）に対する感受性の違いから、Ｎ−メチルアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型、カイニン酸（ＫＡ）型、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）型の３種類に分類され、これらはさらに数種類のサブタイプに分類されている。代謝調節型受容体はアミノ酸配列の相同性やアゴニスト選択性、細胞内情報伝達系の違いにより３つのグループ（Group１，２，３型）に分類されている。
【０００５】
上記のグルタミン酸受容体のうち、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、脳神経系において記憶や学習に重要な働きをしているとともに、脳卒中を起こしたときの神経細胞死にも重要な働きをしていることが解明されている。また、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして知られている物質の中には統合失調症様の症状を示すものもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１２２８３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大船泰史、島本啓子（1997）興奮性神経伝達機構を探る化合物現代化学、18-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を部分的に阻害する医薬であるメマンチンは欧米において抗認知症薬として使用されている。また特許文献１には、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対し(s)-α-アミノ-3,4-ジオキソ-2-ヒドロキシ-1-シクロブテン-1-プロピオニックアシッドは結合活性を有していること、および (s)-α-アミノ-3,4-ジオキソ-2-ヒドロキシ-1-シクロブテン-1-ブチリックアシッドは強い結合活性を有してアゴニストとして機能していることが開示されている。
【０００９】
しかしながら、上記の物質は比較的複雑な構造であるので製造コストが大きく、また副作用も有している。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、簡単な構造であってＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性に作用を及ぼす医薬組成物および保健機能食品の添加物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明の第１の医薬組成物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する作用を有する構成とした。
【００１２】
本発明の保健機能食品の添加物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有する構成である。ここで保健機能食品とは、いわゆる健康食品のうち、厚生労働省が有効性や安全性を考慮して設定した規格基準などを満たす食品のことであり、食品の目的や機能などの違いにより、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類に分けられている。
【００１３】
ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸であってもよい。
【００１４】
α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸であってもよい。
【００１５】
本発明の第２の医薬組成物は、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用を有する構成である。ここでＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を部分的に作動させるいわゆるパーシャルアゴニスト（部分作動剤）としての作用であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を阻害またはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるので、神経保護、抗認知症、精神疾患等の治療や予防などに安全に且つ安価に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１に係るジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図２】アスパルチルグルタミン酸のＮＭＤＡ受容体活性への阻害活性を示す図である。
【図３】実施例１に係るジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【図４】ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の構造を示す図である。
【図５】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図６】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示す図である。
【図７】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【図８】実施例２に係るジペプチドによるＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体作動活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態について説明をする前に、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体について詳しく説明をし、この受容体の活性に作用を及ぼすとどのような効果があるかについて説明をする。
【００１９】
既に述べたとおり、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体はグルタミン酸受容体の一種であり、記憶や学習、また脳虚血などに深く関わる受容体であると考えられている。この受容体は中枢神経系を中心に生体内に広く分布し、リガンドであるグルタミン酸の結合を経て、陽イオンを透過させるイオンチャネル共役型受容体である。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体がリガンドと結合したときに透過させる陽イオンは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）やカリウムイオン（Ｋ＋）の他に、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）も透過し易いことが知られている。
【００２０】
図４は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の構造を示す図である。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、ＮＲ１とＮＲ２のヘテロ２量体２セットからなる４つのサブユニットで構成されている。ＮＲ２サブユニットはさらにＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２Ｄの４種類に分類されており、それぞれ生体内での発現部位や発現時期が異なる。主要サブユニットの一つであるＮＲ１サブユニットにはグリシンを受容するサイトがあり、グリシンを受容していないＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、活動できない。ＮＲ２サブユニットにはグルタミン酸を受容するサイトがある。また通常、細胞外マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）によって活動が阻害されているため、脱分極刺激などでＭｇ２＋が外れないと活動できない。つまり、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活動には２種のリガンドとＭｇ２＋の除去が必要と言える。ＮＲ１とＮＲ２とに、それぞれグリシンとグルタミン酸とが結合することでチャンネルが開口し、細胞内にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が進入する。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ＭＫ−８０１、及びメマンチンは、不競合阻害をする物質で、受容体のチャンネル部分に結合することで活性を阻害する。
【００２１】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストを表１に示す。上側のａに示しているものはＮＲ１サブユニットに結合するアゴニストであり、自然環境において体内に存在するものはグルタミン酸だけである。下側のｂに示しているものはＮＲ２サブユニットに結合するアゴニストであり、自然環境において体内に存在するものはグリシンおよびセリンである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアンタゴニストを表２に示す。上側のａに示しているものはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に不競合的（uncompetitive）な作用をするアンタゴニストであり、下側のｂに示しているものは非競合的（non-competitive）に作用するアンタゴニストである（J.N.C.Kew, J.A.Kemp, Pscychopharmacology 179:4-29,2005参照）。
【００２４】
【表２】
【００２５】
以上のような特徴を有するＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、記憶や学習に深く関わるとともに、アンタゴニストが与えられると統合失調症様の症状を示すことから、活性を亢進する物質には、統合失調症のような精神疾患の治療薬や神経保護薬としての効果があり、活性を阻害する物質には抗認知症薬としての効果があることになる。例えば既に述べたように、部分アンタゴニストであるメマンチンは抗認知症薬として既に、ヨーロッパ、アメリカで使用されている。神経細胞が死ぬと分解されてアミノ酸が放出され、その中のグルタミン酸やグリシンがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を上げて神経細胞内に過剰の陽イオンを透過させて神経細胞を死に至らせるため、アンタゴニストは神経細胞死が増えることを抑制する効果も有している。ただし、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は適切なタイミング且つ適切な期間で開閉しないと、記憶や学習に支障が生じたり精神疾患の症状が発生したりするので、活性を亢進したり阻害したりする度合いが強すぎても薬としての使用が難しくなる。
【００２６】
以上の知見に基づいて、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下に述べる実施形態は本発明の例示であり、本発明はこの例に限定されない。
【００２７】
本実施形態においては、一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるジペプチドを準備してＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させた。
【００２８】
前記のジペプチドとしては、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンなどを例として挙げることができる。グリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸と結合する他方のアミノ酸としては、α−アミノ酸であって、蛋白質を構成している２０種類のアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリン）から選ばれた一種類であると、前記ジペプチドが安価であって手に入れやすく、生体に対して安全性も高いので好ましい。
【００２９】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性を阻害するかどうかは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の２種類のリガンドであるグリシンおよびグルタミン酸と本実施形態のジペプチドとを一緒にしてＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させ、受容体が作動するとイオンの通過すなわち電流が生じるので、受容体活性を二電極膜電位固定法による電流測定の方法を用いて測定した。
【００３０】
ジペプチドを加えないで、グリシンおよびグルタミン酸のみを加えた（control）との比較により活性を阻害するか否かを判定したところ、本実施形態のジペプチドの中にはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性に阻害作用を示すものがあることが確認された。本実施形態のジペプチドはリガンドとサイトへの結合を争う拮抗的な活性阻害剤であり、パーシャルアンタゴニスト（部分阻害剤）であることが判明した。
【００３１】
次に本実施形態のジペプチドがＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させるかどうかについて確認を行った。この確認は、グリシンまたはグルタミン酸の何れか一方と本実施形態のジペプチドとをＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させ、受容体活性を二電極膜電位固定法による電流測定の方法を用いて測定することによりおこなった。
【００３２】
その結果、濃度等の条件によって程度の差はあるが本実施形態のジペプチドにはＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用があることが確認された。なお作動させる程度は、濃度等の条件やジペプチドの種類によって異なるが、約５〜７０％であって、本実施形態のジペプチドはパーシャルアゴニストであることが判明した。
【実施例】
【００３３】
以下に、ジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害作用及び作動作用についての実施例を説明する。
【００３４】
（実施例１）
１．測定方法
アフリカツメガエル卵母細胞に外来のｍＲＮＡを注入すると、効率よく外来タンパク質が発現することが知られている。これまで発明者は、マウスのＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体についてこの発現系を用いて研究してきた（Yamada, Y. et al., J. Biol. Chem. 274, 6647-6652, 1999、Yamada, Y. et al., J. Neurochem. 81, 758-764, 2002、Iwamoto, K. et al., J. Neurochem. 89, 100-108, 2004）。そこでこの技術を用いてジペプチドのＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に対する作用を測定した。
【００３５】
［ｃＲＮＡの合成］
マウス脳のＮＭＤＡ受容体のＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢサブユニットのｃＤＮＡは、pBKSA ＮＲ１Ａ、pBKSA ＮＲ２Ａ、pBKSA ＮＲ２Ｂプラスミドのかたちで提供されたものを使用した。これを鋳型として、in vitroで、T3 ＲＮＡポリメラーゼを用いてＮＭＤＡ受容体のｃＲＮＡを合成した。
【００３６】
［アフリカツメガエル卵母細胞の発現］
アフリカツメガエルのステージＶまたはＶＩ卵母細胞を採取し、２ mg/ml コラゲナーゼ入りのバース液（88 mM NaCl、1 mM KCl、0.33 mM Ca(NO3)2、0.41 mM CaCl2、0.82 mM MgSO4、2.4 mM NaHCO3、7.7 mM Tris-HCl、pH 7.2）に室温で２時間インキュベーションした。その後、卵胞膜をピンセットで取り除いた卵母細胞にＮＲ１とＮＲ２Ａ、ＮＲ１とＮＲ２ＢのｃＲＮＡのモル比が１：２になるよう注入した。ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ１、ＮＲ２ＢのｃＲＮＡ注入後、18単位/mlのペニシリンG・18単位/mlのストレプトマイ
シンを含むバース液で、４０〜４８時間、１９℃でインキュベーションしたのち活性を測定した。
【００３７】
アフリカツメガエル卵母細胞の発現系では、外来のｍＲＮＡを注入すると効率よくそのタンパク質を発現できることが知られている。しかし、神経細胞では、グルタミン酸によって全てのグルタミン酸受容体が活性化し、神経細胞への直接的なグルタミン酸の投与ではＮＭＤＡ受容体単独の活性をみることは非常に難しい。そこで、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いることで、目的であるＮＭＤＡ受容体のタンパク質のみを卵母細胞内に発現させ、効率よく活性を測定することができる。
【００３８】
［ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の測定］
TEV-200 Two Electrode Voltage Clamp System （Dagon Corp. Minneapolis, MN）を用いて、二電極膜電位固定法で計測した。電極には3 M KClを満たしたガラス管（抵抗値1〜5 MΩ）を使用した。卵母細胞を標準Ba2+リンゲル液（115 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM BaCl2、10 mM HEPES, pH 7.2）還流条件下、２３〜２５℃において、卵母細胞内を細胞外液に対して-70 mVに固定して計測した。通常の電流計測では、ＮＭＤＡ受容体のリガンド（グルタミン酸、グリシン）を２０秒間流し、そのとき流れた電流を計測した。各計測後に標準Ba2+リンゲル液で洗浄した。
【００３９】
２．ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性へのジペプチドの効果
１）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性への阻害作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの阻害効果を検討した。その際ジペプチドとして、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）を用いた。
【００４０】
図１は、上記のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を、Ｌ−グリシン100 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を10 μMとして、300 μMのグリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸の阻害活性を測定した結果を示している。また、Ｌ−グリシン10 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を100 μMとして、300 μMのグリシルグリシン、アスパルチルグリシンの阻害活性を測定した結果を示している。その結果、上記の条件においてはアスパルチルグルタミン酸（AspGlu）がＮＲ１／ＮＲ２Ａ及び、ＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体への阻害活性を示した。ＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体では５０％、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体では３２％の阻害を示した。
【００４１】
図２は、アスパルチルグルタミン酸の阻害活性を示したものである。具体的には、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）の阻害活性を詳細に見るために、AspGluを10, 100, 300, 1000 μMのそれぞれの濃度にしてＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用させて生じた阻害活性を示している。その結果容量依存的に阻害することが、明らかになった。またＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体の方がより阻害されやすいことも明らかになった。
【００４２】
２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性作動作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの作動効果を検討した。その際ジペプチドとして、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）を用いた。
【００４３】
図３は、上記ジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体測定の際に、リガンドであるＬ−グリシン100 μMと、300 μMのグリシルグルタミン酸またはアスパルチルグルタミン酸とを加えてアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。また、Ｌ−グルタミン酸100 μMとし、300 μMグリシルグリシン、アスパルチルグリシンのアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。その結果、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンはかなり高いアゴニスト活性があることがわかった。また、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸にも弱いながらもアゴニスト活性があることがわかった。
【００４４】
以上のことから、グリシルグルタミン酸、グリシルグリシン、アスパルチルグリシンはＮＲ１／ＮＲ２Ａ、及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した。
【００４５】
また、アスパルチルグルタミン酸はＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性をもち競合的アンタゴニストとして作用しており、弱いながらもアゴニスト活性があることがわかった。
【００４６】
上述のことから考えられることは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のリガンドとしてはグリシンとグルタミン酸の２種類があるが、グリシンを構成要素とするジペプチドおよびグルタミン酸を構成要素とするジペプチドも、これらのグリシン部分およびグルタミン酸部分が受容体の結合サイトに結合することができて、アゴニスト活性を有するという仮説である。一般的には、生体における種々の受容体に結合するリガンドは、結合サイトによってそれぞれ特有の化合物であってその構造が少しでも変わると当該結合サイトに結合できないのであるが、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体においてはジペプチド程度の小さい分子であり一方の末端に本来のリガンドであるグリシンやグルタミン酸が存在すれば、結合サイトにある程度は結合できると考えられる。また、アゴニスト活性を有するということは、本来のリガンドと拮抗的に結合サイトに結合しようとする物質であるということであるので、アンタゴニストでもあると言える。
【００４７】
また、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチルアスパラギン酸）がＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであるので、アスパラギン酸を一方の構成要素とするジペプチドについても上記と同様の理由でアゴニスト活性を有すると考えられる。
【００４８】
以上の結果から、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸を含むジペプチドはＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持ち、幾つかのジペプチドはアンタゴニスト活性を持っていると考えられる。そのアンタゴニストとしての作用は弱いため、緩やかな神経保護効果を有すると考えられ、アゴニストとしての活性も、緩やかな神経活動賦活作用をもたらすことが見込まれる。メマンチンの作用から考えると、抗認知症の効果が上記ジペプチドにあると考えられる。
【００４９】
（実施例２）
実施例１で測定した４種のジペプチドであるグリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）に加えて、アラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アラニルグリシン（AlaGly）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の６種のジペプチドについても、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性への阻害作用及び作動作用を検討した。
【００５０】
なお、本実施例では、Ｌ−セリンを使用しているが、Ｄ−セリンを使用することもできる。
また、測定方法、ｃＲＮＡの合成方法、アフリカツメガエル卵母細胞の発現、及びＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の測定は、実施例１と同様である。
【００５１】
１）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性への阻害作用
図５及び図６は、上記の１０種のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体活性への阻害効果を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を、Ｌ−グリシン（Gly）を100 μMとし、Ｌ−グルタミン酸（Glu）を10 μMとして、300 μMのアラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）の阻害活性を測定した結果を示している。
【００５２】
また、当該リガンドの濃度を、Ｌ−グリシンを10 μMとし、Ｌ−グルタミン酸を100 μMとして、300 μMのアラニルグリシン（AlaGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）、グリシルグリシン（GlyGly）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の阻害活性を測定した結果を示している。
【００５３】
なお、各ジペプチドの濃度を300 μMとしているが、図２に示されるように、300 μM以外の濃度においても活性が示される。従って、ジペプチドの濃度は、任意であり、好ましくは10 μM〜1000 μM、さらに好ましくは100 μM〜300 μMである。
【００５４】
その結果、上記の条件においては、実施例１において活性が示されたアスパルチルグルタミン酸（AspGlu）に加えて、ベータアスパチルグリシン（β-AspGly）及びアラニルグリシン（AlaGly）がＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性を示した。ベータアスパルチルグリシンは４１％の阻害を示し、また、アラニルグリシンは２３％の阻害を示した。また、アスパルチルグルタミン酸は、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体に対して３３％、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体に対して２２％の阻害を示した。
【００５５】
２）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性作動作用
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて発現させたマウスのＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体活性へのジペプチドの作動効果を検討した。その際、実施例１で測定した４種のジペプチドであるグリシルグルタミン酸（GlyGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グリシルグリシン（GlyGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）に加えて、アラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アラニルグリシン（AlaGly）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）の６種のジペプチドについても作動作用を検討した。
【００５６】
図７及び図８は、上記の１０種のジペプチドによるＮＭＤＡ受容体作動活性を示したものである。具体的には、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体測定の際に、リガンドであるＬ−グリシン（Gly）を100 μMと、300 μMのアラニルグルタミン酸（AlaGlu）、アスパルチルグルタミン酸（AspGlu）、グルタミルグルタミン酸（GluGlu）、グリシルグルタミン酸（GlyGlu）とを加えてアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。
【００５７】
また、リガンドであるＬ−グルタミン酸（Glu）を100 μMとし、300 μMのアラニルグリシン（AlaGly）、アスパルチルグリシン（AspGly）、グリシルグリシン（GlyGly）、ベータアスパルチルグリシン（β-AspGly）、ヒスチジルグリシン（HisGly）、グリシルセリン（GlySer）のアゴニストとしての活性を測定した結果を示している。
【００５８】
図７及び図８に示されるジペプチドのアゴニストとしての活性の割合を表３に示す。実施例１でＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した４種のジペプチドであるグリシルグリシン、アスパルチルグリシン、グリシルグルタミン酸、アスパルチルグルタミン酸に加えて、アラニルグルタミン酸、アラニルグリシン、グルタミルグルタミン酸、ベータアスパルチルグリシン、ヒスチジルグリシン、グリシルセリンの６種のジペプチドについてもアゴニスト活性（作動活性）があることがわかった。ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる割合は、ジペプチドの種類によって異なるが、約３〜７３％であった。
【００５９】
【表３】
【００６０】
以上のことから、上記の１０種のジペプチドはＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２ＢサブタイプＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性を持つことが判明した。
【００６１】
また、ベータアスパルチルグリシン及びアラニルグリシンは、ＮＲ１／ＮＲ２ＡサブタイプＮＭＤＡ受容体に対して阻害活性をもち、競合的アンタゴニストとして作用しており、さらに、アゴニスト活性があることがわかった。
【００６２】
以上の結果から、実施例１で示されたグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸に加えて、セリンを含む全てのジペプチドはＮＭＤＡ受容体に対してアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を持っていると考えられる。
【００６３】
ＮＭＤＡ受容体は記憶や学習に深く関わるとともに、アンタゴニスト（活性阻害剤）が与えられると統合失調症の症状を示すことから、活性を亢進する物質には統合失調症のような精神疾患の治療薬や精神保護薬としての効果があり、活性を阻害する物質には抗認知症薬としての効果があることになる。しかし、抗認知症薬として使用されるアンタゴニストは、神経細胞死が増えることを抑制する一方で、効果が強すぎると学習に支障が生じたり、統合失調症などの精神疾患の症状を引き起こしたりするため、活性の亢進や阻害の度合いが強すぎても薬としての使用が難しくなる。本実施例の結果のように、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を程よく阻害または作動させるジペプチドは、神経保護、抗認知症、精神疾患等の治療や予防などに役立つ可能性が示唆された。
【００６４】
即ち、上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬組成物や保健機能食品は、緩やかな神経保護効果や緩やかな神経活動賦活作用を発揮するものである。
【００６５】
本実施例では、神経細胞レベルにおける実験結果であり、ＮＭＤＡ受容体の活性を直接測定している。従って、本実験結果は、in vivoでの実験結果と同様の結果であると判断されるものである。
また、上記ジペプチドは、生体を構成する物質であるため、副作用がないと判断される。
【００６６】
上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬組成物の剤形は、内服薬、注射薬、座薬、吸入薬などを挙げることができる。当該医薬組成物は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。また、上記の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、および他の医薬品を含有させることもできる。当該医薬は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。医薬の用量は任意であり、年齢、体重などの患者の状態、投与経路などを考慮した上で決定することができる。
【００６７】
また、上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする保健機能食品（即ちジペプチドが添加物となっている食品）は、液体、固形物、スラリー状物、粉末物などの形態が考えられ、食べやすいように種々の既知の食材と混ぜ合わせられていることが好ましい。当該食材には、必要に応じ、甘味料、旨味調味料、無機塩、酸味料、アミノ酸類、核酸、糖類、賦形剤、香辛料、旨味以外の調味料、抗酸化剤、着色料、保存料、強化剤、乳化剤、ハーブ、スパイス、エタノール等の食品に使用可能な各種添加物を使用することができる。
【００６８】
上記実施形態に係るジペプチドを構成成分とする医薬や保健機能食品を投与・摂取できる患者、患蓄としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等）を例示することができるが、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等、任意である。
【００６９】
上記１０種のジペプチドに化学的・酵素的修飾をすることもできる。化学的・酵素的に修飾された当該ジペプチドを構成成分とする医薬や保健機能食品とすることもできる。また、ジペプチドの製法は任意である。
【００７０】
また、上記の複数のジペプチドを組み合わせた医薬や保健機能食品とすることもできる。組み合わせる種類や割合は任意であり、例えば、アンタゴニスト活性があるベータアスパルチルグリシンとアゴニスト活性があるヒスチジルグリシンとを１：１の割合で組み合わせたり、アラニルグリシンとヒスチジルグリシンとグリシルセリンとを１：２：３の割合で組み合わせたりすることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上説明したように、本発明に係る医薬組成物及び保健機能食品の添加物は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害又は作動する作用を有し、神経保護効果等を発揮する医薬や保健機能食品などとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する作用を有する医薬組成物。
【請求項２】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項１に記載されている医薬組成物。
【請求項３】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項２に記載されている医薬組成物。
【請求項４】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有する、保健機能食品の添加物。
【請求項５】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項４に記載されている保健機能食品の添加物。
【請求項６】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項５に記載されている保健機能食品の添加物。
【請求項７】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用を有する医薬組成物。
【請求項８】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項７に記載されている医薬組成物。
【請求項９】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項８に記載されている医薬組成物。
【請求項１】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体活性を阻害する作用を有する医薬組成物。
【請求項２】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項１に記載されている医薬組成物。
【請求項３】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項２に記載されている医薬組成物。
【請求項４】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有する、保健機能食品の添加物。
【請求項５】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項４に記載されている保健機能食品の添加物。
【請求項６】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項５に記載されている保健機能食品の添加物。
【請求項７】
一方のアミノ酸がグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびセリンからなる群から選ばれたアミノ酸であるジペプチドを含有し、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を作動させる作用を有する医薬組成物。
【請求項８】
前記ジペプチドの他方のアミノ酸は、α−アミノ酸である、請求項７に記載されている医薬組成物。
【請求項９】
前記α−アミノ酸は、蛋白質を構成しているアミノ酸である、請求項８に記載されている医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２０９１３１（Ｐ２００９−２０９１３１Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０８７４（Ｐ２００９−２０８７４）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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