単細胞の分化万能性幹細胞の培養
本発明は、分化万能性幹細胞培養の分野、および、産業レベルで分化万能性幹細胞培養を容易にするための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
本発明は、分化万能性幹細胞培養の分野、および、産業レベルで分化万能性幹細胞培養を容易にするための方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
例えば胚性幹細胞のような分化万能性幹細胞は、あらゆる成熟細胞型へと分化する能力を有する。このように、胚性幹細胞は、疾患、感染、または先天性異常の結果、損傷された器官に対する置換細胞および置換組織の原料であるかもしれない。その細胞の分化万能性を維持しながらin vitroで細胞を増殖することが困難なため、胚性幹細胞が置換細胞の原料として用いられる可能性が妨げられている。
【０００３】
未分化の胚性幹細胞を培養する従来方法は、例えば、支持細胞層の存在下で胚性幹細胞を培養することのような、複雑な培養条件を必要としている。あるいは、支持細胞培養物に曝すことにより入手された培地が、胚性幹細胞を培養するために用いられるかもしれない。これらの方法を用いる培養システムは、培養されるべき幹細胞とは異なる種から入手された細胞（異種細胞）をしばしば用いる。付加的に、これらの培養システムに、動物血清を補ってもよい。
【０００４】
例えば、Reubinoff他（Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)）、およびThompson他（Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp.1145-1147）が、マウスの胚線維芽細胞の支持細胞層を用いたヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株の培養を開示している。
【０００５】
別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。国際公開第2005014799号は、「本発明により作られる培養培地は、マウス細胞、特に、ＭＭＨ（Met Murine Hepatocyte）と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。」と述べている。
【０００６】
しかしながら、異種細胞、または異種細胞産物の使用によって、このような方法で作られた結果的な胚性幹細胞集団が、免疫原性のウイルスタンパク質、および／または、異種タンパク質により汚染されているかもしれない危険性が高まる。
【０００７】
Richards他（Stem Cells 21: 546-556, 2003）は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、１１個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。Richards他は、「成人皮膚線維芽細胞支持細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。」と述べている。
【０００８】
米国特許第6642048号は、支持細胞を含まない培養において、霊長類分化万能性幹細胞（ｐＰＳ）の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。」と述べている。
【０００９】
米国特許出願公開第20020072117号は、細胞株であって、支持細胞を含まない培養で霊長類分化万能性幹細胞の成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。用いられた細胞株は、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株である。米国特許出願公開第20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。
【００１０】
別の例では、Wang他（Stem Cells 23: 1221-1227, 2005）が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト胚性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。
【００１１】
別の例では、Xu他（Stem Cells 22: 972-980, 2004）が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。
【００１２】
別の例では、Stojkovic他（Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005）が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。
【００１３】
さらなる例では、Miyamoto他（Stem Cells 22: 433-440, 2004）が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。
【００１４】
Amit他（Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003）は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。
【００１５】
別の例では、Inzunza他（Stem Cells 23: 544-549, 2005）が、ヒト出生後包皮線維芽細胞由来の支持細胞層を開示している。
【００１６】
別の培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することができる成長因子（growth factor）を補った、血清を含まない培地を用いる。例えば、Cheon他（BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005）が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地（ＳＲ）であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた、血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。
【００１７】
別の例では、Levenstein他（Stem Cells 24: 568-574, 2006）が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、ｂＦＧＦを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。
【００１８】
別の例では、米国特許出願公開第20050148070号が、血清も線維芽細胞支持細胞も含まない限定培地において、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示しており、その方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリンまたはトランスフェリン置換体、少なくとも１つのインスリンまたはインスリン置換体を含む培養培地で幹細胞を培養することであって、培養培地が本質的に哺乳類胎児血清を含まず、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体を活性化することができる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子を含み、成長因子が線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われ、培地が、支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。
【００１９】
別の例では、米国特許出願公開第20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のｂＦＧＦ、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。
【００２０】
別の例では、米国特許第6800480号が「１つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む、細胞培養培地が提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第１の成長因子とをさらに含む。」と述べている。
【００２１】
別の例では、米国特許出願公開第20050244962号が、「１つの態様では、本発明は、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳類胎児血清を本質的に含まず（好ましくは、任意の動物血清を本質的に含まず）、線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。好ましい形態において、従来幹細胞培養を持続するために必要とされていた線維芽細胞支持細胞層は、十分な線維芽細胞成長因子の添加により不必要になる。」と述べている。
【００２２】
さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、（ａ）基礎培地と、（ｂ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のｂＦＧＦと、（ｃ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、（ｄ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸とを含む、培地を開示している。
【００２３】
別の例では、国際公開第2005086845号が、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示しており、その方法は、未分化状態の細胞を維持するのに十分な量のタンパク質の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーの一員、タンパク質の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。
【００２４】
胚性幹細胞は、研究および薬剤スクリーニングのための潜在的な資源を提供する。現在のところ、ヒトＥＳ細胞株の大規模培養は、問題があり、実質的な課題を提供する。これらの課題に対して可能性のある解決策は、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し、培養することである。例えば、計数、トランスフェクション、および同様のものといった標準的な組織培養技術に、単細胞はより適している。
【００２５】
例えば、Nicolas他は、レンチウイルスベクターによる遺伝子組換え後、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離された単細胞から、ｈＥＳ細胞株を産生し増殖するための方法を提供する。Stem Cells and Development (2007), 16(1), 109-118参照。
【００２６】
別の例では、米国特許出願公開第2005158852号が、「単細胞のヒト胚性幹細胞の成長及び生存を改善するための」方法を開示している。「その方法には、単細胞の未分化のＨＥＳ細胞を入手する工程と、単細胞の未分化の細胞を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と混合し、細胞を取り囲む工程と、成長環境で栄養培地とともに、支持細胞上にその混合物を播種する工程と、が含まれる。」
【００２７】
別の例では、Sidhu, KS他（Stem Cells Dev. 2006 Feb; 15(1): 61-9）が、「フローサイトメトリーで単細胞調製物を分取することによる、親株ｈＥＳ３に由来する３つのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）クローン（ｈＥＳ３．１、３．２、および３．３）についての最初の報告を開示している。細胞分取前後の単細胞調製物の生存率は、９８％を超えたままであった」。
【００２８】
しかしながら、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し培養することにより、遺伝子異常、および分化万能性消失が引き起こされる。培養条件は、分化万能性および遺伝的安定性の維持において重要である。概して、ｈＥＳ細胞株の継代は、手動で実施されるか、コラーゲナーゼ、リベラーゼ、またはディスパーゼのような酵素剤とともに実施される。
【００２９】
例えば、Draper JS他は、「３つの独立したヒト胚性幹細胞株における、５つの独立した場合での第１７染色体長腕の獲得を伴う核型変化」の存在について記している。（Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):53-4. Epub 2003 Dec 7）
【００３０】
別の例では、Buzzard他が、「我々は、１つの核型変化事象を検出したのみであった。・・・・用いた培養方法は、我々の結果といくつかの関連があるかもしれない。というのも、我々の方法は、他の大部分のグループが用いたものとはかなり異なっているからである。一般的に、先欠けピペットの角でコロニーをまず切除することにより、ヒトＥＳ細胞を７日後に継代する。・・・細胞分離の酵素的方法、または化学的方法を、この方法は全く伴わない。我々は、このことが、我々のｈＥＳ細胞の相対的な細胞遺伝学的回復力を説明するかもしれないと推測する。」と述べている。（Nat Biotechnol. 2004 Apr; 22(4): 381-2; author reply 382）
【００３１】
別の例では、Mitalipova MM他が、「バルク継代方法・・・は、培養における増殖継代後、異数性細胞集団を存続させうるが、より短期間（最大少なくとも１５代継代）に、核型を危険に曝すことなく用いられてもよい。・・・、手動継代方法単独が提供できるよりも多い量のｈＥＳ細胞を必要とする実験において、長期間の手動増殖条件後、その後、限定バルク継代をすることにより、ｈＥＳ細胞における正常核型を維持することが可能かもしれない。」と述べている。（Nat Biotechnol. 2005 Jan; 23(1): 19-20）
【００３２】
別の例では、Heng BC他が、「結果は、２番目のプロトコル（ゆるやかなピペッティングを伴うトリプシン処理）が、１番目のプロトコル（スクラッチングを伴うコラーゲナーゼ処理）よりも、細胞の生存率に対してそれほど有害ではないということを示した。このことは同じく、より高い凍結解凍生存率を説明する。」と述べている。（Biotechnology and Applied Biochemistry (2007), 47(1), 33-37）
【００３３】
別の例では、Hasegawa K.他が、「我々は、完全解離に耐性のあるｈＥＳＣサブラインを確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率を示し、高いクローニング効率をも示しており、３つの胚葉に分化する能力を維持している。」と述べている。（Stem Cells. 2006 Dec; 24(12): 2649-60. Epub 2006 Aug 24）
【００３４】
〔発明の概要〕
本発明は、酵素を用いて単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。特に、本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全く存在しないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。
【００３５】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）細胞を分化させる工程と、を含む。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を維持するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞を入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【００３７】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を継代するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、（ｅ）単細胞の分化万能性幹細胞を放出する工程と、（ｆ）単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【００３８】
〔図面の簡単な説明〕
図１：ＭＥＦ馴化培地中１：３０のreduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｃｃｐ３３ヒトＥＳ細胞の４倍拡大図。
【００３９】
図２：最終内胚葉を導くための分化処理後のＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合（％）。暗灰色：４５〜５５代継代のＨ１細胞クラスター（Ｈ１ｃｃ）による６つのＤＥ分化実験の平均。黒色：４７〜５４代継代のＨ１単細胞（Ｈ１ｓｃ）による２つのＤＥ分化実験の平均。白色：３７〜５５代継代のＨ９細胞クラスター（Ｈ９ｃｃ）による５つのＤＥ分化実験の平均。明灰色：３６〜４８代継代のＨ９単細胞（Ｈ９ｓｃ）による３つのＤＥ分化実験の平均。エラーバーは、反復実験の標準偏差を示す。
【００４０】
図３：膵臓内分泌分化プロトコルに１４日または１７日曝した後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析。（Ａ）Ｈ９単細胞およびＨ９細胞クラスターを３７代継代で分析した。（Ｂ）Ｈ１ｐ４７およびＨ９ｐ３７の細胞クラスターおよび単細胞の膵臓内胚葉段階への継続。１４日および１７日後のＰｄｘ１の発現。未処理細胞に対する指示マーカーの遺伝子発現を、各データセットについての値１として設定した。
【００４１】
図４：ＭＥＦ馴化培地中１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｓｃｐ２２ヒトＥＳ単細胞の４倍拡大図。
【００４２】
図５：ｈＥＳ細胞の分化万能性マーカー発現についてのＦＡＣＳによる評価。Ｘ軸上に列記された指示マーカーについて陽性の細胞の割合（％）。
【００４３】
図６：クラスターとして３８回継代した後、単細胞として２０代継代したＨ９ｈＥＳ単細胞の染色体標本。
【００４４】
図７：最終内胚葉分化の間のＨ９単細胞およびＨ９細胞クラスターの比較。細胞を最終内胚葉分化プロトコルに曝した後のＣＸＣＲ４について陽性の細胞の割合（％）を示す。Ｈ９ｓｃ−ｐについてはＮ＝２、Ｈ９ｃｃについてはＮ＝５である。エラーバーは、反復実験の平均の標準偏差を示す。
【００４５】
図８：Ｈ９単細胞（２２代継代）を分化させた後の膵臓内胚葉マーカーにおける増加。膵臓内分泌分化の１１日、１４日、または１７日後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析を示す。１４日および１７日の値は、６ウェルプレートのうちの２つのウェルの平均である。
【００４６】
図９：ｈＥＳ単細胞は、ＭＥＦ上で分化することができる。ＦＡＣＳは、ＭＥＦ支持細胞上で育てられ、最終内胚葉に分化したＨ１ｓｃｐ４細胞の結果である。最終内胚葉マーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）は、未分化細胞０％に対し、細胞のうちの８９％で発現した（図５参照）。
【００４７】
図１０：ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１８）は、９６ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。Ｓｏｘ１７陽性検出についての免疫蛍光データを示す。８つのウェルを、実験の間、ＭＥＦ馴化培地で処理した：ＭＥＦ培地。８つのウェルを、成分を含まない基礎分化培地で処理した：成分なし。８つのウェルの反復データセットを、各データバーについて平均した。全４０個のウェルを、それぞれＷｎｔ３ａまたはＧｓｋ３ｂ阻害剤で処理し、各データセットについて平均した。エラーバーは、各反復セットについての標準偏差を示す。
【００４８】
図１１：ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１９）によるファーマコフォアスクリーニング。全１３個の実験的な小分子化合物を、最終内胚葉分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａを置換する能力について試験した。３つの有効な可能物を示す。データセットは、２つ以上のウェルにおけるＳｏｘ１７陽性細胞の平均を示す。ＭＥＦ馴化培地または基礎培地により処理された細胞を、陰性対照として用いた。
【００４９】
図１２：Ｈ９ｐ３３ｈＥＳ細胞クラスターおよびＨ９ｐ３３単細胞間のトランスフェクション効率の評価。８μＬのLipofectamine 200（Invitrogen；Carlesbad, CA）、および４μｇＤＮＡ（黒色バー）または８μｇＤＮＡ（灰色バー）を用いて、ＣＭＶ−ＧＦＰを細胞にトランスフェクションした。
【００５０】
図１３：ＭＥＦ上で育て、その後クラスターまたは単細胞としてMATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へと、コラーゲナーゼにより継代した３７代継代のＨ１ｈＥＳ細胞は、いくつかのゆるく分化した細胞とともに別々の密接に固まったコロニーを形成する。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により１回継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、密接に固まった分化細胞のポケットを伴う単層の培養物を形成する。
【００５１】
図１４：ＭＥＦから、単細胞として直接MATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、自発的に分化する。パネルＡ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後も集団のままである細胞の割合（％）。パネルＢ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後のｈＥＳ細胞での分化万能性および分化についてのマーカー発現。パネルＣ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後のＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。
【００５２】
〔発明の詳細な説明〕
開示を明確にするために、しかし限定を目的とするものではないが、発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施態様、または適用を開示し例示している以下のサブセクションに分割する。
【００５３】
●定義
幹細胞は、自己再生するとともに、子孫細胞を産生するために分化することができるような、単細胞レベルでの能力により規定される未分化細胞であり、自己再生性子孫細胞、非再生性子孫細胞、および最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、in vitroで、多様な胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へと分化する能力によっても特徴付けられ、移植後、多様な胚葉の組織を生じる能力や、胚盤胞への注入後、すべてとは限らないが、実質的にほとんどの組織に寄与する能力によっても特徴付けられる。
【００５４】
幹細胞は発生能力に応じて、以下のように分類される。（１）すべての胚性細胞型および胚外性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化全能性（totipotent）、（２）すべての胚性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化万能性（pluripotent）、（３）すべてではないが特定の組織、器官、または生理系内の細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、分化多能性（multipotent）［例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された複分化性前駆体、ならびに血液の正常成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫細胞を生み出すことができる。］、（４）分化多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、複分化性（oligopotent）、（５）単一の細胞系統（例えば、精原幹細胞）を生み出すことができることを意味する、単分化性（unipotent）である。
【００５５】
分化は、まだ特殊化されていない（「まだコミットしていない」）細胞、またはあまり特殊化されていない細胞が、例えば神経細胞または筋細胞のような、特殊化された細胞の特徴を獲得する過程である。分化した細胞、または分化を誘導された細胞は、細胞系統内のより特殊化された（「コミットした」）地位に就いたものである。用語「コミットした」とは、分化過程に適用される場合、分化経路をある時点まで進んだ細胞をいい、その時点とは、通常環境下で、特殊な細胞型または細胞型のサブセットへと分化し続けるだろうが、通常環境下で、異なる細胞型へと分化することができず、または、あまり分化していない細胞型へと戻ることができない時点である。脱分化とは、細胞系統内のあまり特殊化していない（すなわち、あまりコミットしていない）地位へと戻る過程をいう。本願で用いるように、細胞系統とは、細胞の遺伝的性質（すなわち、細胞がどの細胞に由来するか、どんな細胞を生み出すことができるか）を規定する。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキーム内に細胞を配置する。系統特異的マーカーとは、目的の細胞系統の表現型と特異的に関連付けられる特徴をいい、まだコミットしていない細胞の目的の系統に対する分化を評価するために用いられ得る。
【００５６】
培養における細胞を説明するために、様々な用語が用いられる。「維持」とは、概して、細胞の成長および／または分裂を促進するが、細胞のより大きな集団を結果的に生じさせるかもしれないし、生じさせないかもしれないような条件下で、成長培地に細胞を置くことをいう。「継代」とは、ある培養容器から細胞を取り除き、細胞成長および／または分裂を促進するような条件下で、それらをその次の培養容器に置く過程をいう。
【００５７】
特異的な細胞集団、または細胞株とは、時折、継代されてきた回数をいい、または、その回数で特徴付けられる。たとえば、１０回継代されてきた培養細胞集団を、Ｐ１０培養と呼んでもよい。初代培養（すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養）を、Ｐ０と表す。最初の継代培養後、その細胞を二次培養（Ｐ１または１代継代）という。２回目の継代培養後、その細胞は三次培養（Ｐ２または２代継代）となる。以下同様である。本分野の当業者には、継代中に多くの集団倍化があるかもしれず、したがって、培養の集団倍化数は、継代数よりも多いということが理解されるだろう。継代の間の期間中の細胞増殖（すなわち、集団倍化数）は、多くの因子に依存し、その因子には、播種密度、基質、培地、成長条件、および継代間の時間が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本願で用いられる「ＡＦＰ」または「alpha-fetoprotein protein（α−フェトプロテインタンパク質）」とは、肝臓発生のはじまりに産生される抗原をいう。また、ＡＦＰは、胚外細胞で発現するかもしれない。
【００５９】
「β細胞系統」とは、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子のうちの少なくとも１つとについて遺伝子発現が陽性の細胞をいう。その転写因子とは、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、NeuroD、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６である。β細胞系統に特異的なマーカーを発現する細胞には、β細胞が含まれる。
【００６０】
本願で用いられる「Brachyury」とは、Ｔ−ボックス遺伝子ファミリーの一員である。それは、原条および中胚葉細胞についてのマーカーである。
【００６１】
本願で用いられる「最終内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Cer1、Nodal、ＦＧＦ８、Brachyury、Mix-like homeobox protein、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、eomesodermin（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、またはＯＴＸ２である。最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、原条前駆細胞、原条細胞、中内胚葉細胞、および最終内胚葉細胞が含まれる。
【００６２】
本願で用いられる「ＣＤ９９」とは、アクセッション番号NM_002414の遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【００６３】
本願で用いられる「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、またはＨＢ９である。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内胚葉細胞が含まれる。
【００６４】
本願で用いられる「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＮＧＮ−３、NeuroD、Islet-1、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、またはＰＴＦ−１αである。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、および、膵臓ホルモン分泌細胞、ならびにβ細胞系統の細胞が含まれる。
【００６５】
本願で用いられる「ＣＸＣＲ４」とは、stromal cell-derived factor 1（ＳＤＦ−１）receptor（ストロマ細胞由来因子１受容体）をいい、「ＬＥＳＴＲ」または「fusin（フーシン）」としても知られている。原腸形成したマウス胚において、ＣＸＣＲ４は、最終内胚葉および中胚葉で発現するが、胚外内胚葉では発現しない。
【００６６】
本願で用いられる「最終内胚葉（Definitive endoderm）」とは、原腸形成中に胚盤葉上層から生じた細胞の特徴を有し、胃腸管およびその派生物を形成するような細胞をいう。最終内胚葉は、以下のマーカーを発現する。そのマーカーは、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Cerberus、ＯＴＸ２、goosecoid、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、およびＭｉｘｌ１である。
【００６７】
本願で用いられる「胚外内胚葉」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞集団をいう。そのマーカーは、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、およびＳＰＡＲＣである。
【００６８】
「ＧＡＴＡ−４」および「ＧＡＴＡ−６」は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーの一員である。この転写因子ファミリーは、ＴＧＦ−βシグナル伝達により誘導され、初期内胚葉マーカーの維持に貢献する。
【００６９】
本願で用いられる「ＧＬＵＴ−２」とは、膵臓、肝臓、腸、脳、および腎臓を含む数多くの胎児組織および成人組織で発現するグルコース輸送体分子をいう。
【００７０】
本願で用いられる「goosecoid」または「ＧＳＣ」とは、原口の原口背唇で発現するホメオドメイン転写因子をいう。
【００７１】
本願で用いられる「Islet-1」または「Ｉｓｌ−１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーの一員であり、発生中の膵臓で発現する。
【００７２】
本願で用いられる「ＭａｆＡ」は、膵臓で発現する転写因子であり、インスリンの生合成や分泌に関わる遺伝子の発現を制御する。
【００７３】
本願で用いられる「マーカー」は、目的の細胞において差異のある発現をする核酸、またはポリペプチド分子である。本内容において、差異のある発現とは、陽性マーカーについては、増加したレベルを意味し、陰性マーカーについては、低下したレベルを意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、目的の細胞において、他の細胞と比較して十分に高いものであるか、低いものであり、その結果、本分野で既知の、任意の様々な方法を用いて、目的の細胞を同定し、他の細胞と区別することができる。
【００７４】
本願で用いられる「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、ＣＤ４８、eomesodermin（EOMES）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６である。
【００７５】
本願で用いられる「Nodal」は、タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーの一員である。
【００７６】
「Ｏｃｔ−４」は、ＰＯＵドメイン転写因子の一員であり、分化万能性幹細胞の特徴として広く考えられている。分化万能性幹細胞に対するＯｃｔ−４の関係は、未分化の分化万能性幹細胞に密接に限定された発現により示される。体細胞系統への分化の際、Ｏｃｔ−４の発現は急速に消失する。
【００７７】
本願で用いられる「膵臓内分泌細胞」または「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。
【００７８】
本願で用いられる「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。
【００７９】
本願で用いられる「Ｐａｘ−４」および「Ｐａｘ−６」は、膵島発生と関連する膵臓β細胞特異的転写因子である。
【００８０】
本願で用いられる「ＰＤＸ−１」とは、膵臓発生と関連するホメオドメイン転写因子をいう。
【００８１】
本願で用いられる「前原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、NodalまたはＦＧＦ８である。
【００８２】
本願で用いられる「原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、Brachyury、Mix-like homeobox protein、またはＦＧＦ４である。
【００８３】
本願で用いられる「ＰＴＦ−１α」とは、三量体のpancreas transcription factor-1（ＰＴＦ１）（膵臓転写因子１）の配列特異的ＤＮＡ結合サブユニットである、４８ｋＤの基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質をいう。
【００８４】
本願で用いられる「ＳＰＡＲＣ」は、「secreted protein acidic and rich in cystein（酸性でシステインリッチな分泌性タンパク質）」としても知られている。
【００８５】
「ＳＳＥＡ−１」［Stage Specific Embryonic Antigen-1（ステージ特異的胚性抗原１）］は、マウスのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、マウスおよびヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびマウスの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８６】
「ＳＳＥＡ−３」［Stage Specific Embryonic Antigen-3（ステージ特異的胚性抗原３）］は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８７】
「ＳＳＥＡ−４」［Stage Specific Embryonic Antigen-4（ステージ特異的胚性抗原４）］は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８８】
「ＴＲＡ１−６０」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に発現される硫酸ケラチン関連抗原である。
【００８９】
「ＴＲＡ１−８１」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に発現されるケラチン硫酸関連抗原である。
【００９０】
「ＴＲＡ２−４９」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面で発現するアルカリホスファターゼアイソザイムである。
【００９１】
本発明は、酵素を用いて、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。特に、本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全くないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。
【００９２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を分化させる工程と、を含む。
【００９３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標）Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【００９４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。
【００９５】
酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度で用いられてもよい。
【００９６】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【００９７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。
【００９８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【００９９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１００】
１つの実施態様では、組織培養基質は、MATRIGEL（商標）である。MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：１０希釈で用いられる。
【０１０１】
単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１０２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を維持するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【０１０３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標）Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【０１０４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。
【０１０５】
酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜２．５ｇ／Ｌの濃度で用いられてもよい。
【０１０６】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【０１０７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。
【０１０８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はgrowth factor-reduced MATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【０１０９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１１０】
１つの実施態様では、組織培養基質は、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である。Growth factor-reduced MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：３０希釈で用いられる。
【０１１１】
単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１１２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を継代するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手することと、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出することと、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔くことと、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させることと、（ｅ）単細胞の分化万能性幹細胞を放出することと、（ｆ）単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔くことと、を含む。
【０１１３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標） Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【０１１４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜２．５ｇ／Ｌ酵素の濃度で用いられてもよい。
【０１１５】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【０１１６】
１つの実施態様では、単細胞の分化万能性細胞は、細胞を再び新しい組織培養基質上への酵素的な継代を行う前に、約７０〜８０％の密度まで育てられる。単細胞の分化万能性幹細胞を１回継代してもよいし、本発明の方法を用いて、１回よりも多く継代してもよい。
【０１１７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は、胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞は、ヒト由来である。
【０１１８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はgrowth factor-reduced MATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【０１１９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１２０】
１つの実施態様では、組織培養基質は、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である。Growth factor-reduced MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：３０希釈で用いられる。
【０１２１】
●分化万能性幹細胞の単離、増殖、および培養のための他の方法
○分化万能性幹細胞の特徴づけ
分化万能性幹細胞は、stage-specific embryonic antigens（ＳＳＥＡ）３および４、ならびにＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１に対して設計された抗体を用いて検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現してもよい（Thomson他、Science 282:1145, 1998）。分化万能性幹細胞のin vitroでの分化により、結果的に、（もし存在するならば）ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現が消失し、ＳＳＥＡ−１の発現が高まる。一般的に、未分化の分化万能性細胞は、アルカリホスファターゼ活性を有し、その活性は、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、その後、業者（Vector Laboratories；Burlingame Calif）が説明しているとおり、Vector Redを基質として染色することにより検出することができる。また、未分化の分化万能性幹細胞は一般的に、Ｏｃｔ−４およびＴＥＲＴを発現し、これはＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【０１２２】
増殖された分化万能性幹細胞の望ましい別の表現型は、３つの胚葉すべて（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞へと分化する能力である。幹細胞の分化万能性は、たとえば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに細胞を注入し、４％パラホルムアルデヒドを用いて生じたテラトーマを固定し、その後、３つの胚葉に由来する細胞型のエビデンスについて、それらを組織学的に試験することによって、確認することができる。あるいは、分化万能性は、胚様体を作り出し、３つの胚葉に関係するマーカーの存在について、その胚様体を評価することにより、決定されてもよい。
【０１２３】
増殖された分化万能性幹細胞株を、標準的なＧバンド法を用いて、核型決定してもよいし、対応する霊長類種の公知の核型と比較してもよい。「正常な核型」を有する細胞を入手することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数性であり、すべてのヒト染色体が存在し、著しく変化していないということを意味する。
【０１２４】
○分化万能性幹細胞の原料
用いられてもよい分化万能性幹細胞の種類には、妊娠後に形成された組織に由来する、確立された分化万能性幹細胞株が含まれる。その組織は、前胚性組織（例えば、胚盤胞）、胚性組織、または、妊娠中の任意の時（一般的に、妊娠約１０〜１２週目の前だが、必ずしもこれに限らない）に採取された胎児組織を含む。非限定的な例は、たとえば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、およびＨ９（WiCell）といったヒト胚性幹細胞またはヒト胚性胚細胞の確立された株である。また、このような細胞の初期の確立または安定化の間に本開示の組成物を使用することも考慮すべきである。この場合、原料細胞は、原料組織から直接採取された初代分化万能性細胞である。また、支持細胞の不存在下ですでに培養された分化万能性幹細胞集団から採取された細胞も適切である。また、たとえばＢＧ０１ｖ（BresaGen；Athens, GA）のような変異ヒト胚性幹細胞株も適切である。
【０１２５】
１つの実施態様では、ヒト胚性幹細胞を、Thomson他（米国特許第5,843,780号；Science 282:1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995）で説明されたように準備する。
【０１２６】
○分化万能性幹細胞の培養
１つの実施態様では、一般的に、分化万能性幹細胞は、様々なやり方で分化万能性幹細胞を支持する支持細胞層上で培養される。あるいは、分化万能性幹細胞は、培養システムであって、本質的に支持細胞を含まないにもかかわらず、実質的な分化を経験することなく、かつ、分化万能性幹細胞の増殖を助けるような培養システム上で培養される。支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、それまでに別の細胞型で培養することにより馴化された培地を用いることで、助けられる。あるいは、支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、化学的に規定された培地を用いることで助けられる。
【０１２７】
例えば、Reubinoff他（Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)）、およびThompson他（Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp.1145-1147）が、マウスの胚線維芽細胞の支持細胞層を用いたヒト胚盤胞由来の分化万能性幹細胞株の培養を開示している。
【０１２８】
Richards他（Stem Cells 21: 546-556, 2003）は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、１１個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。Richards他は、「成人皮膚線維芽細胞支持細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。」と述べている。
【０１２９】
米国特許出願公開第20020072117号は、細胞株であって、支持細胞を含まない培養で霊長類分化万能性幹細胞の成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。用いられた細胞株は、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株である。米国特許出願公開第20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。
【０１３０】
別の例では、Wang他（Stem Cells 23: 1221-1227, 2005）が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト分化万能性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。
【０１３１】
別の例では、Stojkovic他（Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005）が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。
【０１３２】
さらなる例では、Miyamoto他（Stem Cells 22: 433-440, 2004）が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。
【０１３３】
Amit他（Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003）は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。
【０１３４】
別の例では、Inzunza他（Stem Cells 23: 544-549, 2005）が、ヒト出生後包皮線維芽細胞由来の支持細胞層を開示している。
【０１３５】
米国特許第6642048号は、支持細胞を含まない培養において、霊長類分化万能性幹細胞（ｐＰＳ）の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。」と述べている。
【０１３６】
別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。国際公開第2005014799号は、「本発明により作られる培養培地は、マウス細胞、特に、ＭＭＨ（Met Murine Hepatocyte）と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。」と述べている。
【０１３７】
別の例では、Xu他（Stem Cells 22: 972-980, 2004）が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。
【０１３８】
別の例では、米国特許出願公開第20070010011号が、分化万能性幹細胞を維持するための化学的に規定された培養培地を開示している。
【０１３９】
別の培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することができる成長因子（growth factor）を補った、血清を含まない培地を用いる。例えば、Cheon他（BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005）が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地（ＳＲ）であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。
【０１４０】
別の例では、Levenstein他（Stem Cells 24: 568-574, 2006）が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、ｂＦＧＦを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。
【０１４１】
別の例では、米国特許出願公開第20050148070号が、血清も線維芽細胞支持細胞も含まない限定培地において、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示しており、その方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリンまたはトランスフェリン置換体、少なくとも１つのインスリンまたはインスリン置換体を含む培養培地で幹細胞を培養することであって、培養培地が本質的に哺乳類胎児血清を含まず、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体を活性化することができる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子を含み、成長因子が線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われ、培地が支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。
【０１４２】
別の例では、米国特許出願公開第20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のｂＦＧＦ、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。
【０１４３】
別の例では、米国特許第6800480号が「１つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む細胞培養培地が、提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第１の成長因子とをさらに含む。」と述べている。
【０１４４】
別の例では、米国特許出願公開第20050244962号が、「１つの態様では、本発明は、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳類胎児血清を本質的に含まず（好ましくは、任意の動物血清を本質的に含まず）、線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。好ましい形態において、従来幹細胞培養を持続するために必要とされていた線維芽細胞支持細胞層は、十分な線維芽細胞成長因子の添加により不必要になる。」と述べている。
【０１４５】
さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、（ａ）基礎培地と、（ｂ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のｂＦＧＦと、（ｃ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、（ｄ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸と、を含む培地を開示している。
【０１４６】
別の例では、国際公開第2005086845号が、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示しており、その方法は、未分化状態の細胞を維持するのに十分な量のタンパク質の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーの一員、タンパク質の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。
【０１４７】
分化万能性幹細胞は、適切な培養基質上に蒔かれてもよい。１つの実施態様では、適切な基質は、たとえば、基底膜に由来するか、接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成してもよいような細胞外マトリックス成分である。１つの実施態様では、適切な培養培地は、MATRIGEL（商標）（Becton Dickenson）である。MATRIGEL（商標）は、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍細胞由来の可溶性調製物であり、室温でゲル化して、再構成された基底膜を形成する。
【０１４８】
他の細胞外マトリックス成分、および成分混合物が、代替物として適している。増殖されるべき細胞型に応じて、これには、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ヘパラン硫酸、および同様のものが単独で、あるいは様々な組み合わせで含まれてよい。
【０１４９】
分化万能性幹細胞を、適切な分布で、また、望ましい特徴の細胞生存、増殖、および保持を促進する培地の存在下で、基質上に蒔いてもよい。これらの特徴すべてが、播種分布に注意深く配慮することにより利益を得るし、本分野の当業者により容易に決定されることができる。
【０１５０】
適切な培養培地は、以下の成分から作られてもよい。その成分はたとえば、Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）（Gibco # 11965-092）（ダルベッコ変法イーグル培地）、Knockout Dulbecco's modified Eagle's medium（ＫＯ ＤＭＥＭ）（Gibco # 10829-018）（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、Ham's F12/50% DMEM basal medium; 200 mM L-glutamine（Gibco # 15039-027）（ハムＦ１２／５０％基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン）、non-essential amino acid solution（Gibco 11140-050）（非必須アミノ酸溶液）、β- mercaptoethanol（Sigma # M7522）（β−メルカプトエタノール）；human recombinant basic fibroblast growth factor（ｂＦＧＦ）（Gibco # 13256-029）（ヒト組換え基礎線維芽細胞成長因子）である。
【０１５１】
●分化万能性幹細胞の分化
本発明の１つの実施態様では、分化万能性を維持しながら、分化万能性幹細胞を培地で増殖する。経時的な細胞の分化万能性の変化は、分化万能性に関連するマーカーの発現レベルの変化を検出することで決定できる。あるいは、分化万能性の変化は、別の細胞型と関連した分化、またはマーカーと関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって観察することができる。
【０１５２】
別の実施態様では、分化万能性幹細胞を培養で増殖し、その後、別の細胞型への分化を促進するようなやり方で処理する。他の細胞型は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。
【０１５３】
本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、本分野における任意の適切な方法により、他の様々な細胞型へと分化してもよい。たとえば、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞、および同様のものへと分化してもよい。
【０１５４】
たとえば、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、国際公開第2007030870号に記載の方法にしたがって、神経前駆細胞、および心筋細胞へと分化してもよい。
【０１５５】
別の例では、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、米国特許第6,458,589号に開示の方法にしたがって、肝細胞へと分化してもよい。
【０１５６】
●最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５７】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５８】
たとえば、分化万能性幹細胞は、Shinozaki他（Development 131, 1651-1662 (2004)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５９】
たとえば、分化万能性幹細胞は、McLean他（Stem Cells 25, 29-38 (2007)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６０】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６１】
最終内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Cerl、Nodal、ＦＧＦ８、Brachyury、Mix-like homeobox protein、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、eomesodermin（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、およびＯＴＸ２から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原条前駆細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、最終内胚葉である。
【０１６２】
●膵臓内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６３】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６４】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９、およびＰＲＯＸ１から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１６５】
●膵臓内分泌系統のマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６６】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６７】
たとえば、分化万能性幹細胞は、Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６８】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’ Amour他（Nature Biotechnology, 2006）に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６９】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、NeuroD、Islet-1、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＰＴＦ−１αから成る群から選択される。１つの実施態様では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。本発明での使用に適しているのは、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。あるいは、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【０１７０】
本発明の１つの態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１と、以下の転写因子のうちの少なくとも１つとを発現する。その転写因子とは、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、NeuroD、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６である。本発明の１つの態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１７１】
●三次元支持体
本発明の目的で使用するために適切な支持材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の合成材料および天然材料が含まれ、それは生物組織を再構築または再生するためにも、組織成長を誘導するための走化性剤を送達するためにも、in vitroおよびin vivoで用いられ、本願発明の方法を実施する際に使用するのに適切である。たとえば、米国特許第5,770,417号、同第6,022,743号、同第5,567,612号、同第5,759,830号、同第6,626,950号、同第6,534,084号、同第6,306,424号、同第6,365,149号、同第6,599,323号、同第6,656,488号、米国特許出願公開第2004/0062753 A1号、米国特許第4,557,264、同第6,333,029号に開示された材料を参照のこと。
【０１７２】
薬剤を組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成する前に、薬剤をポリマー溶液と混合することができる。あるいは、織られた支持体上に薬剤をコーティングすることができ、それは好ましくは薬学的キャリアの存在下である。薬剤は、液体、細かく分割された固体、または他の任意の適当な物理的形態で存在してもよい。あるいは、薬剤の放出速度を変えるために賦形剤が支持体に加えられてもよい。別の実施態様では、支持体は、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,509,369号に開示された化合物のような、抗炎症性化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれる。
【０１７３】
支持体は、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,793,945号に開示された化合物のような、抗アポトーシス化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７４】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,331,298号に開示された化合物のような、線維症阻害剤である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７５】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許出願公開第2004/0220393号、および同第2004/0209901号に開示された化合物のような、血管形成を促進することができる、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７６】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許出願公開第2004/0171623号に開示された化合物のような、免疫抑制化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７７】
以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、それらにより限定するものではない。
【０１７８】
〔実施例〕
●実施例１ 細胞クラスターでのｈＥＳＣの継代および維持
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１およびＨ９を、マイトマイシンＣ不活性化初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した。ｈＥＳ細胞を、反復継代の後、ＭＥＦ支持細胞からMATRIGEL（商標）へと移した。
【０１７９】
○組織培養皿のMATRIGEL（商標）コーティング
Growth Factor Reduced MATRIGEL（商標）（Becton-Dickinson；Bedford, Mass.）を４℃で解凍し、その後、冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen；Carlsbad, CA）で１：３０に希釈した。各６ｃｍディッシュ（２ｍＬ）または６ウェルプレート（１ｍＬ）の各ウェルに、覆うのに十分な量を加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートは、数時間以内に使用するか、４℃で２週間目まで保存した。
【０１８０】
○ヒト胚性幹細胞培養
未分化のヒト胚性幹細胞コロニー（Ｈ９およびＨ１）を、１ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼＩＶ（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、１０分間インキュベーションし、その後、ピペットで掻爬することにより、支持細胞から採取した。１０００ｒｐｍで４分間遠心分離することにより、細胞の塊をペレット化し、ペレットを２ｍＬピペットでやさしく分散して、コロニーを細胞の小さなクラスターへと砕いた。これらの細胞クラスターを、ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems；Minneapolis, MN）を補ったＭＥＦ−ＣＭを入れたMATRIGEL（商標）コーティングのディッシュ上に、５ｍＬの成長培地を入れた６ｃｍディッシュ当たり５０〜１５０個のコロニーで播種した。培地は毎日交換した。ＭＥＦ−ＣＭ中のMATRIGEL（商標）上のコロニーが大きくなり、それらが表面領域の７０〜８０％を占めると、約３〜４日ごとに継代した。コロニー中のｈＥＳ細胞は、高い核対細胞質比率を有し、顕著な核小体を有していた。これは、支持細胞上で維持されたｈＥＳ細胞と同様である（図１）。分化した細胞は、培養中の全細胞の５％未満であった。
【０１８１】
MATRIGEL（商標）上のＭＥＦ−ＣＭ中の細胞の定期的な継代のために、１ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼＩＶを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で、最大６０分間、細胞をインキュベーションし、掻爬とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２の強力な水流により、ディッシュから除去した。細胞をペレット化し、分散し、そして１：３または１：４の比率で播種した。
【０１８２】
●実施例２ 単細胞としての胚性幹細胞の継代：酵素の評価
ｈＥＳ細胞の取扱いを容易にするために、継代技術は、他の酵素溶液であって、より短いインキュベーション時間が必要だが、掻爬の工程を含まないような酵素溶液を用いてもよい。なお、細胞を細胞クラスターとしてコラーゲナーゼにより継代することは、播種される細胞の数値定量化を可能にしない。多くの酵素溶液が、１つの迅速な工程で単細胞を放出するために利用可能である。以下の実験により、最小の細胞損傷をもたらし、細胞付着または細胞成長を遅らせないような即効性の酵素が同定された。
【０１８３】
クラスターとして６ウェルディッシュ中で成長したヒト胚性幹細胞Ｈ９ｐ３３細胞を、以下の酵素とともに、３６℃で２分間インキュベーションした。その酵素とは、TrypLE（商標）Express、TrypLE（商標）Select、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％）、またはトリプシン（０．２５％）である。トリプシンを除き、すべての酵素が２分間以内に細胞を放出した。トリプシンによる放出は、３６℃で５分後に達成された。MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに、細胞を２００，０００細胞／ウェルで再播種し、３日間増殖させた。また、ヒト胚性幹細胞もコラーゲナーゼによりクラスターとして継代し（３０分インキュベーション）、そしてMATRIGEL（商標）コーティングウェル上に１：５希釈で再播種した。これは、計数したTrypLE（商標）Express細胞と同様である。３日後、TrypLE（商標）Expressによる５分間のインキュベーションにより、ｈＥＳＣを放出した。細胞を、０．０１％トリパンブルーとともにインキュベーションし、その後計数した（表１）。放出直後の細胞の生存率は、試験したすべての酵素で９８％を超えていた。コラーゲナーゼによるヒト胚性幹細胞の継代は、標準的な継代方法である。TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressは、３日間の培養後、コラーゲナーゼと同様の回復した細胞計数をもたらした。細胞の付着／成長を維持することについて、トリプシン／ＥＤＴＡ、およびトリプシンは明らかに効果が少なかった。TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressは、評価したなかで最も良い酵素であり、実施例３のタイムコース実験でさらに試験した。
【０１８４】
●実施例３ 単細胞としてのヒト胚性幹細胞の継代：酵素曝露時間の最適化
TrypLE（商標） Select、およびTrypLE（商標）Expressは、試験したすべての酵素のなかで最適であることが明らかになった。ｈＥＳ細胞に対するこれらの酵素の理想的なインキュベーション時間を決定するために、TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressを、Ｈ９ｐ３４ｈＥＳＣクラスターとともに、３７℃で２分間または１０分間インキュベーションした。細胞をウェルから取り除き、計数し、遠心分離によりペレット化した。２００，０００細胞／ウェルの分量を、６ウェルプレートに播種した。細胞を３日間成長させ、その後、TrypLE（商標）Expressにより放出し、０．０１％トリパンブルーの存在下で計数した。
【０１８５】
両方の酵素の両方のインキュベーション時間について、細胞生存率は９８％を超えていた。表３は、播種後３６時間の回復した細胞／ウェル数を示している。TrypLE（商標）Expressにより継代した細胞は、３日後に開始播種密度に到達した。このことは、大部分の細胞が、播種後再付着しないこと、および付着した細胞も増殖し増えることができるということを示している。一度付着すると細胞が同じ速度で増殖すると仮定するならば、これらのデータは、TrypLE（商標）Expressによる２分間の処理が、結果的に最も良い付着速度を生ずるということを示している。それゆえ、すべてのその後の実験において、単細胞を作るために２分間のTrypLE（商標）Express処理を用いた。
【０１８６】
●実施例４ ヒト胚性幹細胞の単細胞、および細胞クラスターの最終内胚葉への分化
胚性幹細胞は複数の細胞系統へと分化することができる。単細胞として継代されたヒトＥＳ細胞によって、細胞入力の定量化、および取扱いの容易さを助けるための顕著な改良がもたらされる。これらの単細胞のｈＥＳ細胞の分化能力を決定した。
【０１８７】
○細胞クラスターおよび単細胞の播種
Reduced growth factor MATRIGEL（商標）上のＨ９またはＨ１細胞クラスターの入った６ｃｍプレートを、２ｍＬのコラーゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２とともに、３７℃で最大６０分間インキュベーションした。細胞を、ピペッティングおよび掻爬により取り除き、９００ｒｐｍで４分間遠心分離した。その後、１：１５または１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに、細胞クラスターを播種した。この継代方法は、結果的に、細胞クラスター（ｃｃ）を播種することをもたらす。あるいは、reduced growth factor MATRIGEL（商標）上のＨ９またはＨ１細胞クラスターの入った６ｃｍプレートを、TrypLE（商標）Express（２ｍＬ）とともに、３７℃で５分間インキュベーションし、ピペッティングにより分散した。９００ｒｐｍで４分間の遠心分離の後、その後、１：１０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに細胞を播種し、それを単細胞（ｓｃ）と命名した。
【０１８８】
○最終内胚葉分化
約６０〜７０％コンフルエントのＨ９およびＨ１のｓｃおよびｃｃ培養物を、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ（R&D Systems）、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ；R&D Systems）を補ったＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に２日間曝露した。その後、２％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地により、さらに３日間処理した。
【０１８９】
ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現については、ＦＡＣＳにより、また、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α-fetal protein（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、Brychyury（Ｂｒｙ）、goosecoid（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、およびＧＡＴＡ４については、リアルタイムＰＣＲにより、培養物を分析した。ＡＦＰ、およびＳＯＸ−７は臓側内胚葉マーカーと考えられる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、およびＳＯＸ−１７は最終内胚葉マーカーであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、およびＣＸＣＲ４は原条のマーカーである。結果として生じたＣＸＣＲ４陽性細胞の割合（％）を観察すると（図２）、単細胞は、細胞クラスターと同様程度まで、ＤＥに分化した。
【０１９０】
●実施例５ ｈＥＳ単細胞および細胞クラスターの膵臓内胚葉への分化
ｈＥＳ単細胞の分化能力を決定するために、改良したNovocell（Baetge, EE他；Nature Biotechnology (2006), 24(11), 1392-1401）に開示されたプロトコルにしたがって、さらなる分化を試験した。細胞は、実施例４に記載されたＤＥプロトコルの後、膵臓内胚葉へとさらに分化した。
【０１９１】
○膵臓内胚葉分化
実施例４からの細胞クラスターおよび単細胞を用いた、Ｈ９（ｐ３７）ＤＥ実験のうちの１つが膵臓内胚葉へとさらに分化した。最終内胚葉プロトコルの完了後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems）、sonic hedgehog（ソニックヘッジホッグ）阻害剤、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ；Sigma-Aldrich）、および２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地とともに、細胞を３日間インキュベーションした。その後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ)、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、レチノイン酸（１μＭ；Sigma-Aldrich）、および１％Ｂ２７（Invitrogen）を含むDMEM-low glucose（ＤＭＥＭ低グルコース）とともに、細胞をさらに３日間インキュベーションした。その後、エキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）、ＤＡＰＴ（１μＭ；Calbiochem）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucoseとともに、細胞をさらに３日間インキュベーションした。６ウェルプレートのうちの１つのウェルから、各細胞型について、ＲＮＡサンプルを採取し、その後、膵臓マーカーＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、NeuroD、ＨＮＦ３ｂ、Ｐｔｆ１ａ、Insulin（インスリン）、およびＡＦＰについて、リアルタイムＰＣＲにより、この段階で分析した。５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、ＩＧＦ（R&D Systems）、およびエキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ならびに１％Ｂ２７を含むＣＭＲＬ培地（Invitrogen）により、３日間、分化が継続した。この段階で、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。処理したサンプルと平行して、同じ株の未処理のｈＥＳ細胞由来のＲＮＡサンプルに対して、リアルタイムＰＣＲを行った。未処理の対照に対して１の倍数変化を設定し、処理したサンプルを正規化した。Ｐｄｘ１発現を観察し、単細胞と細胞クラスターとを比較した。膵臓内胚葉マーカー発現の誘導は、単細胞と細胞クラスターの間で同等であった（図３）。したがって、ｈＥＳ単細胞は、ｈＥＳ細胞クラスターと同様の遺伝的な分化能力を有している。
【０１９２】
●実施例６ 単細胞としてのｈＥＳ細胞の継代
単細胞としてｈＥＳ細胞を継代することは、培養をスケールアップし、製造過程を容易にすることを可能にするだろう。
【０１９３】
○単細胞の生成および継代についての説明
Ｈ９細胞をMATRIGEL（商標）上で、上記のとおり成長させた。３８代継代時に、Ｈ９細胞の６ｃｍプレートを、２ｍＬ TrypLE（商標）Expressとともに、３７℃で５分間インキュベーションした。細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２に再懸濁し、９００ｒｐｍで４分間遠心分離した。１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）コーティングしたプレート上に１：４の比率で、細胞を再播種した。約５代継代後、再播種し、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で蒔く前に、細胞を計数した。この密度で継代し再播種することを、各４日間の間隔で継続した。細胞は、単細胞から成長したが、密集したクラスターを形成することがないような緻密な構造を保持していた（図１と図４を比較のこと）。
【０１９４】
●実施例７ ｈＥＳ単細胞の分化万能性の分析
ｈＥＳ細胞の分化万能性の維持は、あらゆる継代技術で必要とされる。したがって、TrypLE（商標）Expressを用いた複数の継代後の分化万能性について、単細胞を評価した。
【０１９５】
○ＦＡＣＳ分化万能性分析
Ｈ９単細胞を、クラスターとして３８代継代培養した後、単細胞として１６代継代培養した。これには凍結保存の凍結解凍が１回含まれる。その後、分化万能性マーカーの発現について、ＦＡＣＳで細胞を分析した。TrypLE（商標）Express溶液とともに５分間インキュベーションすることにより、付着細胞を培養プレートから取り除いた。放出された細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に再懸濁し、遠心分離により回収し、洗浄し、２％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳから成る染色バッファーに再懸濁した。必要に応じて、０．１％γグロブリン（Sigma）溶液を１５分間用いて、細胞をＦｃ受容体についてブロッキングした。表３に示したとおり、モノクローナル抗体を結合したフィコエリスリン（ＰＥ）もしくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（１０６細胞あたり５μＬ抗体）のいずれかとともに、または非結合一次抗体とともに、分量（約１０５細胞）をインキュベーションした。対照には、抗体と適合する適当なアイソタイプ、未染色の細胞、二次結合抗体のみで染色された細胞が含まれた。抗体によるすべてのインキュベーションを４℃で３０分間行い、その後、染色バッファーで細胞を洗浄した。非結合一次抗体により染色されたサンプルを、ＰＥまたはＡＰＣで標識した二次結合抗体とともに、４℃でさらに３０分間インキュベーションした。用いられた２次抗体の一覧については表３を参照のこと。洗浄された細胞をペレット化し、染色バッファーに再懸濁して、細胞表面分子を、FACS Array instrument（ＦＡＣＳアレイ装置）（BD Biosciences）を用いて同定し、少なくとも１０，０００回の事象を収集した。ｈＥＳＣコラーゲナーゼ継代したＨ１ｐ４０およびＨ９ｓｃｐ１６は、同等の分化万能性タンパク質の発現プロファイルを有している（図５）。
【０１９６】
●実施例８ ヒト胚性幹細胞の単細胞の核型安定性の分析
ｈＥＳ単細胞の核型は、複数の継代の後も安定なままであるべきである。Ｈ９単細胞を、クラスターとして３８代継代培養し、その後、単細胞として複数継代培養した。Ｈ９細胞の核型を、standard G-banding karyotype analysis（標準Ｇバンド核型分析）（Cell Line Genetics；Madison, WI）により決定した。全体で２０個のＧバンド染色した細胞を評価し、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）により２００個の中期の細胞核を分析した。分析した細胞では、染色体異常は全く見られなかった。細胞遺伝学的分析は、細胞が正常な数の常染色体を有し、様式的な染色体数は４６本であることを示した。Ｈ９単細胞の核型決定を、１３代継代および２０代継代で実施した。２０代継代の細胞は、冷凍保存の凍結解凍事象を１回経験していた。１３代継代の細胞および２０代継代の細胞は、核型としては正常だった（図６）。
【０１９７】
●実施例９ ｈＥＳ単細胞およびｈＥＳ細胞クラスターの最終内胚葉への分化
最終的な利用のために、単細胞として継代されたｈＥＳ細胞は、分化能力を保持しなくてはならない。以下のとおり、単細胞に対して最終内胚葉分化プロトコルを行った。TrypLE（商標）Expressによる複数の継代（ｓｃ−ｐ）後のＨ９細胞を、分化のためのMATRIGEL（商標）（１：１０希釈）上の継代された単細胞（６代継代および２１代継代）から、TrypLE（商標）Expressにより放出した（ｓｃ）。約６０〜７０％のコンフルエントな単層のＨ９ｓｃを、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、および１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に２日間曝露し、その後、さらに３日間、２％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地により処理した。
【０１９８】
５日目に、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現について、ＦＡＣＳにより、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α-fetal protein（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、Brychyury（Ｂｒｙ）、goosecoid（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、およびＧＡＴＡ４については、リアルタイムＰＣＲにより、細胞を分析した。ＡＦＰ、およびＳＯＸ−７は臓側内胚葉マーカーと考えられ、一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、およびＳＯＸ−１７は最終内胚葉マーカーであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、およびＣＸＣＲ４は原条のマーカーである。複数回（６代継代および２１代継代）継代した単細胞は、細胞クラスター（３６〜５５代継代）と同様に、ＤＥへと分化する能力を保持している（図７）。
【０１９９】
●実施例１０ ｈＥＳ単細胞の膵臓内胚葉への分化
以下の工程をその後行うことにより、細胞は膵臓内胚葉へとさらに分化した。その工程とは、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、sonic hedgehog阻害剤、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、および２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地とともに３日間インキュベーションすることと、その後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ)、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、レチノイン酸（１μＭ）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucose（ＤＭＥＭ低グルコース）とともに３日間インキュベーションすることである。細胞の評価は１１日目に行なった。一部の培養物は、エキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＡＰＴ（１μＭ）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucoseとともに３日間にわたり処理を続けた。１４日目に、膵臓マーカーＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、NeuroD、ＨＮＦ３ｂ、Ｐｔｆ１ａ、Insulin、およびＡＦＰについて、リアルタイムＰＣＲにより、サンプルを分析した。５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、ＩＧＦ、およびエキセンディン４、ならびに１％Ｂ２７を含むＣＭＲＬ培地により、いくつかの培養が分化を継続させた。１７日目の終わりに、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。１４日および１７日目の終わりで、膵臓内胚葉マーカーＮｋｘ２．２、NeuroD、ＨＮＦ６、ＨＮＦ３ｂが主に発現した。Ｐｄｘ１発現は、各処理段階で段階的に高まった（図８）。
【０２００】
●実施例１１ ＭＥＦ支持細胞上のｈＥＳ単細胞の分化
ｈＥＳ細胞の膵臓内胚葉への最適な分化を達成するために、最終内胚葉集団は最大数でなければならない。従来、ＭＥＦ支持細胞上でｈＥＳを育てると、最終内胚葉および膵臓内胚葉の達成可能な最も高い濃度がもたらされている。ｈＥＳ単細胞がこの目的を達成できるかどうか決定するために、Ｈ１ｓｃｐ４を、ＭＥＦ支持細胞上に１４，０００細胞／ｃｍ２で播種した。２０％Knock-out Serum Replacement（Invitrogen）（ノックアウト血清置換）、１×non-essential Amino Acids（Invitrogen）（１×非必須アミノ酸）、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液を含んだＤＭＥＭ−Ｆ１２を含むＥＳ細胞培地上で、細胞を成長させた。７日後、細胞は６０〜７０％のコンフルエントになり、最終内胚葉プロトコルを細胞に適用した。具体的には、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、および０．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を、２日間、ウェル当たり１００μＬ加え、その後、３日間、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で処理した。その後、TrypLE（商標）Expressで細胞を取り除き、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現について、ＦＡＣＳにより分析した（図９）。９０％を超える細胞がＣＸＣＲ４、およびＣＤ９９を発現した。予想したとおり、８％未満の細胞がＣＤ９を発現した。ＣＸＣＲ４陽性細胞数により決定されるように、単細胞のＨ１細胞をＭＥＦ支持細胞上に播種することにより、最終内胚葉分化が改良される。
【０２０１】
●実施例１２ ９６ウェルプレートにおけるｈＥＳ単細胞の分化
ｈＥＳ細胞をクラスターで継代することに伴う、ある共通の困難性は、定量することが難しく、等しい割合で成長させられないことである。単細胞は、コンフルエントな単層に成長することができ、実験目的のための等しい播種を確実にするように、継代の前に計数することができるという利点を有する。これらの特質は、成功したスクリーニングを検証するための必須条件である。
【０２０２】
ｈＥＳＨ９ｓｃｐ１８を、１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）でコーティングしたPackard View 96-well plates（９６ウェルプレート）（Perkin-Elmer）上に、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３〜４日間、ＭＥＦ馴化培地で細胞を成長させ、その後、ＤＥ分化プロトコルを用いて処理した。４０ウェルのサブセットを、標準プロトコルで（１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で２日間）処理した。第２の４０ウェルのサブセットを、Ｗｎｔ３ａの代わりに、ＧＳＫ３ｂ阻害剤ＩＸ（１００ｎＭ；EMD Chemicals；La Jolla, CA）で処理した。その後、両方のサブセットを１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で３日間処理した。培養の終わりで、４％パラホルムアルデヒドにより、室温で２０分間、細胞を固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬ ＰＢＳで一晩保存した。０．５％Triton X-100（Sigma-Aldrich）により、室温で２０分間か、４℃で５分間のいずれかで、細胞を透過処理し、その後ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Invitrogen-Gibco；Carlesbad, CA）の入ったＰＢＳにより、室温で３０分間ブロッキングした。一次抗体［goat-anti-hSox17（ヤギ抗ｈＳｏｘ１７）（R&D Systems）］を、４％ニワトリ血清の中に１：１００希釈し、室温で一時間加えた。二次抗体［Alexa Fluor 488 chicken-anti goat IgG（ニワトリ−抗ヤギＩｇＧ）（Invitrogen-Molecular Probes；Carlesbad, CA）］をＰＢＳの中に１：２００希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した後の細胞に加えた。核を対比染色するために、５μＭ Draq5（Alexis Platform；Laufelfingen, Switzerland）を、室温で５分間細胞に加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、画像化するため、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に残し、分化したＤＥ細胞の数を決定した。細胞数およびＳｏｘ１７染色をウェルごとに定量するために、IN Cell 1000 Analyzer（GE Healthcare；Piscataway, NJ）でプレートを読み取った。Ｗｎｔ３ａによる処理により、ウェル間の変動がほとんど存在しない、最も多いウェル当たりの細胞核数がもたらされた（図１０）。Ｇｓｋ３β阻害剤による処理は、低い細胞生存率を示した。９６ウェルフォーマットにおけるロバストで再現性のあるやり方において、Ｗｎｔ３ａ処理により、単細胞のＥＳ細胞がＤＥを形成することができることは明らかである。
【０２０３】
●実施例１３ ｈＥＳ単細胞によるスクリーニング解析
単細胞が９６ウェルフォーマットに播種し分化することができることを示した後、新規化合物による処理の感度を決定した。ｈＥＳＨ９ｓｃｐ１９を、１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）でコーティングした９６ウェルプレートに、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３〜４日間、ＭＥＦ馴化培地で細胞を成長させ、その後、ＤＥ分化実験を進めた。ＤＥ分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａを小分子阻害剤で置換して、全体で１３個の新規化合物を、１μＭまたは３μＭの濃度で３回繰り返し試験した。Ｗｎｔ３ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧｓｋ３ｂ阻害剤ＩＸ（１００ｎＭ）を含むウェルを、陽性対照として用いた。単一の化合物を１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２を加えたもので、すべての分化ウェルを２日間処理し、その後、化合物を含まない１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で２日間処理した。上記の実施例１１に記載したとおり、プロトコルの終わりで、細胞を固定し、透過化し、ブロッキングし、染色して、Ｓｏｘ１７発現および核を決定した。その後、プレートをIN Cell 1000 Analyzer上で読み取った。このスクリーニングは、Ｈ９ｓｃｐ２１が、ＤＥ分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａと同様のやり方で、１３個の化合物のうちの３つに対して応答したことを示した（図１１）。化合物Ａは１μＭ未満の用量で効果的であり、化合物Ｂおよび化合物Ｃは、１μＭおよび３μＭで効果的であった。効果的な処理範囲（６０％を超えるＳｏｘ１７陽性細胞）では、ウェル間の標準偏差は小さかった。したがって、スクリーニング技術により新規の化合物を同定する能力において、単細胞は一貫している。
【０２０４】
●実施例１４ ローラーボトルにおける単細胞のｈＥＳ細胞の増殖
目的物を製造するためのスケールアップを容易にするために、ｈＥＳ細胞は、多くの量になるまで容易に増殖される必要がある。従来、ｈＥＳ細胞を継代するためのコラーゲナーゼ処理では、ローラーボトルまたはシェーカーフラスコでスケールアップすることができない。単細胞として繰り返し増殖し、成長してきたＨＥＳ細胞は、異なる表面に均等に付着する能力を有する。本実施例では、可能性があるスケールアップ容器として、ローラーボトルを試験した。Ｈ９ｓｃｐ１９を、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした４８０ｃｍ２ローラーボトル（Corning；Acton, MA）に１４，０００細胞／ｃｍ２で播種した（６．７×１０６細胞）。細胞を維持するために、ボトル当たり１００ｍＬ量のＭＥＦ馴化培地を用い、２日ごとに交換した。ボトルを、２４時間２０ｒｅｖ／時に設定し、残りの時間で６０ｒｅｖ／時まで増加させた。細胞はローラーボトルに均等に付着し、４日目の評価時点の後も視認できるほど増殖した。TrypLE（商標）Expressを用いて細胞を取り除き、計数した。ボトル当たり１３×１０６細胞を示す回復した計数を入手し、これは元の播種と比較して、最小の細胞倍化を示している。開始播種細胞の半分未満の細胞がローラーボトルに付着したと推量され、これはより多い実際の細胞増殖がローラーボトルの中で起こったということを示唆している。このことは、単細胞として継代したｈＥＳ細胞を、自動化されたローラーボトルシステムで増殖することが可能であることを示している。分化万能性を維持しながらの増殖速度を決定するためのさらなる実験を実施するだろう。
【０２０５】
●実施例１５ 単細胞ｈＥＳ細胞のトランスフェクション
形質転換した細胞型を作るためにＤＮＡを細胞に導入することは、有用な特徴である。ＤＮＡには、分化を促進し、または、細胞の選択を可能にする発現ベクター、またはレポーター遺伝子が含まれてもよい。ｈＥＳ細胞は、クラスターではトランスフェクションすることが困難であることが示されてきた。しかしながら、ｈＥＳ単細胞は、トランスフェクション技術を適用できるかもしれない。
【０２０６】
Ｈ９ｐ３３細胞を、TrypLE（商標）Expressにより継代し、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）コーティングのプレート上に、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。Ｈ９ｐ３３細胞を、コラゲナーゼにより継代し、６ｃｍプレートから、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）コーティングの６ウェルプレートの１つのウェル中に播種した。３日後、細胞をＣＭＶ−ＧＦＰによりトランスフェクションした。ここで、ＧＦＰはＣＭＶウイルスプロモーター下でいずれの細胞でも発現する。具体的には、２μｇまたは４μｇのＤＮＡを、２５０μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、および８μＬのLipofectamine 2000（リポフェクタミン２０００）（Invitrogen）を含む２５０μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した。５分後に、混合物を室温で組み合わせる。培養細胞を２ｍＬのＭＥＦ馴化培地に加える前に、室温で２０分間、組み合わされた試薬をインキュベーションした。その後２４時間ごとに、培地をＭＥＦ馴化培地で置換した。３日後、４％パラホルムアルデヒドにより、室温で２０分間、細胞を固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に４℃一晩放置した。核の対比染色のために、５μＭ Draq5（Alexis Platform）を、室温で５分間、細胞に加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、IN Cell 1000 Analyzer上で画像化するため、１ｍＬ／ウェルのＰＢＳ中に残し、トランスフェクション効率を決定した（図１２）。ＨＥＳ単細胞は、ｈＥＳクラスターよりも、トランスフェクション効率において２倍の改良を示している。したがって、ｈＥＳ単細胞は、改良されたトランスフェクション能力を有し、遺伝子組換えすることがより容易である。最適化とともに、おそらく他のトランスフェクション方法、または試薬を用いることにより、単細胞ＥＳ細胞トランスフェクションの、より劇的な改良を達成することが可能になるかもしれない。
【０２０７】
●実施例１６ 支持細胞層上で培養されたｈＥＳ細胞クラスターを、細胞外マトリックス上で培養された単細胞のｈＥＳ細胞へ変換することは、支持細胞の除去を必要とする
研究および製造上の設定における、トリプシン、組換えトリプシン（TrypLE（商標））、またはAccutase（商標）（無脊椎動物由来のトリプシン様酵素）のような酵素による哺乳動物細胞の継代は、初代細胞株および不死化細胞株の両方の細胞培養について、従来の標準である。これらの酵素は、細胞の均質な単細胞懸濁液を生み出し、それは、高いスループットフォーマットの３８４ウェルプレート、またはマルチリットルで測量可能な培養容器と同様の多様な設定で播種することが可能な再現性のあるやり方で、計数し、分析し、操作し、または継代することができる。
【０２０８】
単細胞継代に明確に利点がある場合、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代する方法を開発することは非常に興味深い。しかしながら、従来の、ヒト胚性幹細胞による最良の実施形態は、胚性細胞をクラスターで維持するような、手動による分解または酵素（コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ）による継代のいずれかによって、クラスターとして細胞を継代することを必要とする。本分野における過去の研究は、単細胞として支持細胞上で継代することができる細胞の誘導（Cellartis SCEDTM461株）、または、Accutase（商標）による、コラーゲナーゼ継代クラスターからMATRIGEL（商標）上の単細胞への細胞の誘導（R. Bajpai他, 2008）をもたらしてきた。
【０２０９】
本願は、TrypLE（商標）またはAccutase（商標）のいずれかを用いたバルク継代方法において、支持細胞から直接MATRIGELへとｈＥＳ細胞を採取するための単細胞の継代方法を開発するための試みである。この結果は、クラスター状の支持細胞から直接MATRIGEL（商標）へ、ｈＥＳ細胞を継代する方法を採用することは、分化した細胞集団の外観、および外観のために均質でロバストな細胞培養をもたらさない見込みがあるので、不適当であるということを示している。ここで、その方法として、TrypLE（商標）またはAccutase（商標）バルク継代のいずれかであって、MATRIGEL（商標）上へのコラーゲナーゼ継代に基づくクラスターの中間工程を有さないバルク継代を用いている。
【０２１０】
○結果
支持細胞に基づく培養から、支持細胞のないｈＥＳ細胞の培養へと移行する目的で、Ｈ１の３７代継代のｈＥＳ細胞を継代した。そのｈＥＳ細胞は、ｈＥＳＣ培地のＭＥＦ支持細胞層により支持され、６ウェルプレートの１０ｃｍ２ウェル上で５日間育てられてきた。TrypLE（商標）、Accutase（商標）、または１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼのいずれかにより、細胞を継代した。
【０２１１】
酵素を細胞に加える前に、使用済みの培地を吸引し、１ｍＬ ＰＢＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を全く含まない）を各ウェルに加え、その後、１ｍＬの室温の酵素（コラーゲナーゼ、Accutase（商標）、またはTrypLE（商標））を、各ウェルに加えた。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）を、室温にした後のストック濃度で用いた。コラーゲナーゼは、−８０℃の冷凍装置から移し、解凍し、９ｍＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とともに混合し、滅菌ろ過し、使用前に室温にした。
【０２１２】
細胞を酵素中で、３７℃で１０分間インキュベーションした。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により、１０分間処理の後、全細胞が完全にディッシュから浮き上がった。コラーゲナーゼは、１０分間のインキュベーション後、細胞を浮き上がらせなかった。そこで、１０分間のインキュベーション後、１０ｍＬガラスピペットで、細胞をスクラッピングした。１ｍＬの２％Probumin（プロブミン）を含んだＤＭＥＭ−Ｆ１２を各ウェルに加え、ウェル中の組み合わせた全量を、５０ｍＬ滅菌コニカルチューブに移して、可能な限り多くの細胞を浮き上がらせ、懸濁した。
【０２１３】
細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離し、その後、２％Probuminによりさらに洗浄し、２００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞をＭＥＦ馴化培地に再懸濁し、１〜３．５比率でMATRIGEL（商標）（ＤＭＥＭ中に１：３０希釈）コーティングしたＴ２５フラスコに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の高湿度インキュベーター中に置いた。
【０２１４】
Improved Neubauer hemocytometer（改良Neubauer血球計数器）により計数することで、細胞数を計算した。Accutase（商標）により浮き上がった細胞は、３．８×１０６細胞／１０ｃｍ２ウェルの密度であった。TrypLE（商標）により浮き上がった細胞は、３．７×１０６細胞／１０ｃｍ２ウェルの密度であった。コラーゲナーゼは、コロニー状のため、計数できなかった。１〜３．５分割比である場合、Accutase処理細胞を、２．７２×１０６細胞／Ｔ２５フラスコ、すなわち１０８，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で蒔き、TrypLE（商標）処理細胞を、２．６５×１０６細胞／Ｔ２５フラスコ、すなわち１０５，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で蒔いた。コラーゲナーゼ処理細胞は同様の密度（１０５，０００〜１０８，０００細胞／ｃｍ２）で蒔いたとみなす。というのも、酵素処理前のウェルからウェルへのｈＥＳ密度に、感知できるほどの違いがないからである。次の継代で計数する目的のために、さらなるフラスコを、コラーゲナーゼで浮き上がらせた細胞によりプレーティングした。
【０２１５】
１６μｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地を毎日交換して、４日間、細胞を維持した。培養４日後、培養物はコンフルエントになり、単細胞処理したｈＥＳ細胞は、線維芽細胞の偶発的なポケットを有するｈＥＳ細胞の単層を形成した。一方、ｈＥＳ細胞を継代したクラスターは、ｈＥＳ細胞の大きなコロニー状のクラスターを形成した（図１３）。その後、これらの細胞を再び継代した。
【０２１６】
上記に説明したとおり、細胞を酵素中で、３７℃で１０分間インキュベーションした。Accutase（商標）およびTrypLE（商標）により、１０分間処理の後、細胞がプラスチックおよびMATRIGEL（商標）から浮き上がった。コラーゲナーゼは細胞を浮き上がらせなかった。そこで、細胞をさらに、３７℃で、全体で４５分間インキュベーションした。Accutase（商標）でさらなるフラスコを浮き上がらせた。その後、Improved Neubauer hemocytometerにより単細胞を計数した。
【０２１７】
その後、２ｍＬの２％Probuminを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２を、酵素インキュベーション後、各フラスコに加えた。フラスコの全量（〜４ｍＬ）を５〜１０回ピペッティングで上下させ、可能な限り多くの細胞が懸濁するようにした。その後、懸濁液を、５０ｍＬコニカルチューブに移し、２００×ｇで５分間遠心分離した。その後、１６μｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地に、細胞を再懸濁し、その後、１：３０MATRIGEL（商標）をプレコーティングしたＴ２５フラスコに、１：４の比率で蒔いた。
【０２１８】
培養４日後のAccutase（商標）継代細胞は、全部で５．６×１０６細胞（２２３，０００細胞／ｃｍ２）の密度であり、培養４日後のTrypLE（商標）継代細胞は、全部で５．０５×１０６細胞（２０２，０００細胞／ｃｍ２）の密度であり、培養４日後のコラーゲナーゼ継代細胞は、３．４５×１０６細胞（１３８，０００細胞／ｃｍ２）の密度であった。細胞を１：４比率で継代したならば、Accutase（商標）継代については、５８，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を蒔き、TrypLE（商標）継代については、５１，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を蒔き、３５，０００細胞／ｃｍ２であった。
【０２１９】
その後、１６ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地を毎日交換して、細胞をさらに６日間成長させた。コラーゲナーゼにより継代した細胞は、密で均質な細胞の大きなコロニーを形成し、分化した線維芽様細胞はあまり見られない。一方、Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により継代した細胞は、ゆっくりと、成長を止める時点を超えて成長するか、または、分化中のｈＥＳ細胞から形成されたような線維芽様細胞を過剰成長させた（図１４）。
【０２２０】
これらの結果は、クラスター状の継代（コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ）を助けるような手動継代または酵素を用いた、支持細胞から支持細胞のない（MATRIGEL（商標））培養へと移行させる中間段階が、単細胞継代を開始する前に、細胞をMATRIGEL（商標）上の支持細胞のない培養に慣れさせるのに最も良いということを示唆している。
【０２２１】
本明細書全体を通じて引用された文献を、参照により、その全体を本願に組み入れる。実施例や好ましい実施態様を参照することにより、本発明の様々な態様を例示してきたが、本発明を、前述の記載により規定するものではなく、特許法の理念の下、適切に解釈された特許請求の範囲により規定するということが、よく理解されるだろう。
【０２２２】
〔実施の態様〕
なお、本願の実施態様は以下のとおりである。
（１）分化万能性幹細胞を分化させるための方法において、
（ａ）前記分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を分化させる工程と、
を含む、方法。
（２）実施態様（１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（５）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２３】
（６）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（７）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（８）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（９）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（１０）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２４】
（１１）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（１２）実施態様（１）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
（１３）実施態様（１２）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）である、方法。
（１４）実施態様（１３）に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
（１５）実施態様（１４）に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、１：１０希釈で用いられる、方法。
【０２２５】
（１６）実施態様（１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（１７）実施態様（１６）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
（１８）実施態様（１）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
（１９）分化万能性幹細胞を維持するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
（２０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２６】
（２１）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２２）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２３）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２４）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２５）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２７】
（２６）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２７）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２８）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２９）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【０２２８】
（３１）実施態様（３０）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
（３２）実施態様（３１）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
（３３）実施態様（３２）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
（３４）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（３５）実施態様（３４）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【０２２９】
（３６）実施態様（１９）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
（３７）分化万能性幹細胞を継代するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、
（ｅ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を放出する工程と、
（ｆ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
（３８）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３９）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４０）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２３０】
（４１）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４２）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４３）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４４）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４５）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２３１】
（４６）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４７）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４８）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
（４９）実施態様（４８）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
（５０）実施態様（４９）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【０２３２】
（５１）実施態様（５０）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
（５２）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（５３）実施態様（５２）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
（５４）実施態様（３７）に記載の方法において、
新しい組織培養基質上の単細胞の前記分化万能性幹細胞が、前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。
（５５）実施態様（３７）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】ＭＥＦ馴化培地中１：３０のreduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｃｃｐ３３ヒトＥＳ細胞の４倍拡大図。
【図２】最終内胚葉を導くための分化処理後のＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合（％）。
【図３】膵臓内分泌分化プロトコルに１４日または１７日曝した後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析。
【図４】ＭＥＦ馴化培地中１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｓｃｐ２２ヒトＥＳ単細胞の４倍拡大図。
【図５】ｈＥＳ細胞の分化万能性マーカー発現についてのＦＡＣＳによる評価。
【図６】クラスターとして３８回継代した後、単細胞として２０代継代したＨ９ｈＥＳ単細胞の染色体標本。
【図７】最終内胚葉分化の間のＨ９単細胞およびＨ９細胞クラスターの比較。
【図８】Ｈ９単細胞（２２代継代）を分化させた後の膵臓内胚葉マーカーにおける増加。
【図９】ｈＥＳ単細胞はＭＥＦ上で分化することができる。
【図１０】ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１８）は、９６ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。
【図１１】ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１９）によるファーマコフォアスクリーニング。
【図１２】Ｈ９ｐ３３ｈＥＳ細胞クラスターおよびＨ９ｐ３３単細胞間のトランスフェクション効率の評価。
【図１３】ＭＥＦ上で育て、その後クラスターまたは単細胞としてMATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。
【図１４】ＭＥＦから単細胞として直接MATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、自発的に分化する。
【開示の内容】
【０００１】
本発明は、分化万能性幹細胞培養の分野、および、産業レベルで分化万能性幹細胞培養を容易にするための方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
例えば胚性幹細胞のような分化万能性幹細胞は、あらゆる成熟細胞型へと分化する能力を有する。このように、胚性幹細胞は、疾患、感染、または先天性異常の結果、損傷された器官に対する置換細胞および置換組織の原料であるかもしれない。その細胞の分化万能性を維持しながらin vitroで細胞を増殖することが困難なため、胚性幹細胞が置換細胞の原料として用いられる可能性が妨げられている。
【０００３】
未分化の胚性幹細胞を培養する従来方法は、例えば、支持細胞層の存在下で胚性幹細胞を培養することのような、複雑な培養条件を必要としている。あるいは、支持細胞培養物に曝すことにより入手された培地が、胚性幹細胞を培養するために用いられるかもしれない。これらの方法を用いる培養システムは、培養されるべき幹細胞とは異なる種から入手された細胞（異種細胞）をしばしば用いる。付加的に、これらの培養システムに、動物血清を補ってもよい。
【０００４】
例えば、Reubinoff他（Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)）、およびThompson他（Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp.1145-1147）が、マウスの胚線維芽細胞の支持細胞層を用いたヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株の培養を開示している。
【０００５】
別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。国際公開第2005014799号は、「本発明により作られる培養培地は、マウス細胞、特に、ＭＭＨ（Met Murine Hepatocyte）と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。」と述べている。
【０００６】
しかしながら、異種細胞、または異種細胞産物の使用によって、このような方法で作られた結果的な胚性幹細胞集団が、免疫原性のウイルスタンパク質、および／または、異種タンパク質により汚染されているかもしれない危険性が高まる。
【０００７】
Richards他（Stem Cells 21: 546-556, 2003）は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、１１個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。Richards他は、「成人皮膚線維芽細胞支持細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。」と述べている。
【０００８】
米国特許第6642048号は、支持細胞を含まない培養において、霊長類分化万能性幹細胞（ｐＰＳ）の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。」と述べている。
【０００９】
米国特許出願公開第20020072117号は、細胞株であって、支持細胞を含まない培養で霊長類分化万能性幹細胞の成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。用いられた細胞株は、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株である。米国特許出願公開第20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。
【００１０】
別の例では、Wang他（Stem Cells 23: 1221-1227, 2005）が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト胚性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。
【００１１】
別の例では、Xu他（Stem Cells 22: 972-980, 2004）が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。
【００１２】
別の例では、Stojkovic他（Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005）が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。
【００１３】
さらなる例では、Miyamoto他（Stem Cells 22: 433-440, 2004）が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。
【００１４】
Amit他（Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003）は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。
【００１５】
別の例では、Inzunza他（Stem Cells 23: 544-549, 2005）が、ヒト出生後包皮線維芽細胞由来の支持細胞層を開示している。
【００１６】
別の培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することができる成長因子（growth factor）を補った、血清を含まない培地を用いる。例えば、Cheon他（BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005）が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地（ＳＲ）であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた、血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。
【００１７】
別の例では、Levenstein他（Stem Cells 24: 568-574, 2006）が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、ｂＦＧＦを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。
【００１８】
別の例では、米国特許出願公開第20050148070号が、血清も線維芽細胞支持細胞も含まない限定培地において、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示しており、その方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリンまたはトランスフェリン置換体、少なくとも１つのインスリンまたはインスリン置換体を含む培養培地で幹細胞を培養することであって、培養培地が本質的に哺乳類胎児血清を含まず、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体を活性化することができる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子を含み、成長因子が線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われ、培地が、支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。
【００１９】
別の例では、米国特許出願公開第20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のｂＦＧＦ、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。
【００２０】
別の例では、米国特許第6800480号が「１つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む、細胞培養培地が提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第１の成長因子とをさらに含む。」と述べている。
【００２１】
別の例では、米国特許出願公開第20050244962号が、「１つの態様では、本発明は、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳類胎児血清を本質的に含まず（好ましくは、任意の動物血清を本質的に含まず）、線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。好ましい形態において、従来幹細胞培養を持続するために必要とされていた線維芽細胞支持細胞層は、十分な線維芽細胞成長因子の添加により不必要になる。」と述べている。
【００２２】
さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、（ａ）基礎培地と、（ｂ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のｂＦＧＦと、（ｃ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、（ｄ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸とを含む、培地を開示している。
【００２３】
別の例では、国際公開第2005086845号が、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示しており、その方法は、未分化状態の細胞を維持するのに十分な量のタンパク質の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーの一員、タンパク質の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。
【００２４】
胚性幹細胞は、研究および薬剤スクリーニングのための潜在的な資源を提供する。現在のところ、ヒトＥＳ細胞株の大規模培養は、問題があり、実質的な課題を提供する。これらの課題に対して可能性のある解決策は、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し、培養することである。例えば、計数、トランスフェクション、および同様のものといった標準的な組織培養技術に、単細胞はより適している。
【００２５】
例えば、Nicolas他は、レンチウイルスベクターによる遺伝子組換え後、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離された単細胞から、ｈＥＳ細胞株を産生し増殖するための方法を提供する。Stem Cells and Development (2007), 16(1), 109-118参照。
【００２６】
別の例では、米国特許出願公開第2005158852号が、「単細胞のヒト胚性幹細胞の成長及び生存を改善するための」方法を開示している。「その方法には、単細胞の未分化のＨＥＳ細胞を入手する工程と、単細胞の未分化の細胞を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と混合し、細胞を取り囲む工程と、成長環境で栄養培地とともに、支持細胞上にその混合物を播種する工程と、が含まれる。」
【００２７】
別の例では、Sidhu, KS他（Stem Cells Dev. 2006 Feb; 15(1): 61-9）が、「フローサイトメトリーで単細胞調製物を分取することによる、親株ｈＥＳ３に由来する３つのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）クローン（ｈＥＳ３．１、３．２、および３．３）についての最初の報告を開示している。細胞分取前後の単細胞調製物の生存率は、９８％を超えたままであった」。
【００２８】
しかしながら、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し培養することにより、遺伝子異常、および分化万能性消失が引き起こされる。培養条件は、分化万能性および遺伝的安定性の維持において重要である。概して、ｈＥＳ細胞株の継代は、手動で実施されるか、コラーゲナーゼ、リベラーゼ、またはディスパーゼのような酵素剤とともに実施される。
【００２９】
例えば、Draper JS他は、「３つの独立したヒト胚性幹細胞株における、５つの独立した場合での第１７染色体長腕の獲得を伴う核型変化」の存在について記している。（Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):53-4. Epub 2003 Dec 7）
【００３０】
別の例では、Buzzard他が、「我々は、１つの核型変化事象を検出したのみであった。・・・・用いた培養方法は、我々の結果といくつかの関連があるかもしれない。というのも、我々の方法は、他の大部分のグループが用いたものとはかなり異なっているからである。一般的に、先欠けピペットの角でコロニーをまず切除することにより、ヒトＥＳ細胞を７日後に継代する。・・・細胞分離の酵素的方法、または化学的方法を、この方法は全く伴わない。我々は、このことが、我々のｈＥＳ細胞の相対的な細胞遺伝学的回復力を説明するかもしれないと推測する。」と述べている。（Nat Biotechnol. 2004 Apr; 22(4): 381-2; author reply 382）
【００３１】
別の例では、Mitalipova MM他が、「バルク継代方法・・・は、培養における増殖継代後、異数性細胞集団を存続させうるが、より短期間（最大少なくとも１５代継代）に、核型を危険に曝すことなく用いられてもよい。・・・、手動継代方法単独が提供できるよりも多い量のｈＥＳ細胞を必要とする実験において、長期間の手動増殖条件後、その後、限定バルク継代をすることにより、ｈＥＳ細胞における正常核型を維持することが可能かもしれない。」と述べている。（Nat Biotechnol. 2005 Jan; 23(1): 19-20）
【００３２】
別の例では、Heng BC他が、「結果は、２番目のプロトコル（ゆるやかなピペッティングを伴うトリプシン処理）が、１番目のプロトコル（スクラッチングを伴うコラーゲナーゼ処理）よりも、細胞の生存率に対してそれほど有害ではないということを示した。このことは同じく、より高い凍結解凍生存率を説明する。」と述べている。（Biotechnology and Applied Biochemistry (2007), 47(1), 33-37）
【００３３】
別の例では、Hasegawa K.他が、「我々は、完全解離に耐性のあるｈＥＳＣサブラインを確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率を示し、高いクローニング効率をも示しており、３つの胚葉に分化する能力を維持している。」と述べている。（Stem Cells. 2006 Dec; 24(12): 2649-60. Epub 2006 Aug 24）
【００３４】
〔発明の概要〕
本発明は、酵素を用いて単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。特に、本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全く存在しないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。
【００３５】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）細胞を分化させる工程と、を含む。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を維持するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞を入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【００３７】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を継代するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、（ｅ）単細胞の分化万能性幹細胞を放出する工程と、（ｆ）単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【００３８】
〔図面の簡単な説明〕
図１：ＭＥＦ馴化培地中１：３０のreduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｃｃｐ３３ヒトＥＳ細胞の４倍拡大図。
【００３９】
図２：最終内胚葉を導くための分化処理後のＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合（％）。暗灰色：４５〜５５代継代のＨ１細胞クラスター（Ｈ１ｃｃ）による６つのＤＥ分化実験の平均。黒色：４７〜５４代継代のＨ１単細胞（Ｈ１ｓｃ）による２つのＤＥ分化実験の平均。白色：３７〜５５代継代のＨ９細胞クラスター（Ｈ９ｃｃ）による５つのＤＥ分化実験の平均。明灰色：３６〜４８代継代のＨ９単細胞（Ｈ９ｓｃ）による３つのＤＥ分化実験の平均。エラーバーは、反復実験の標準偏差を示す。
【００４０】
図３：膵臓内分泌分化プロトコルに１４日または１７日曝した後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析。（Ａ）Ｈ９単細胞およびＨ９細胞クラスターを３７代継代で分析した。（Ｂ）Ｈ１ｐ４７およびＨ９ｐ３７の細胞クラスターおよび単細胞の膵臓内胚葉段階への継続。１４日および１７日後のＰｄｘ１の発現。未処理細胞に対する指示マーカーの遺伝子発現を、各データセットについての値１として設定した。
【００４１】
図４：ＭＥＦ馴化培地中１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｓｃｐ２２ヒトＥＳ単細胞の４倍拡大図。
【００４２】
図５：ｈＥＳ細胞の分化万能性マーカー発現についてのＦＡＣＳによる評価。Ｘ軸上に列記された指示マーカーについて陽性の細胞の割合（％）。
【００４３】
図６：クラスターとして３８回継代した後、単細胞として２０代継代したＨ９ｈＥＳ単細胞の染色体標本。
【００４４】
図７：最終内胚葉分化の間のＨ９単細胞およびＨ９細胞クラスターの比較。細胞を最終内胚葉分化プロトコルに曝した後のＣＸＣＲ４について陽性の細胞の割合（％）を示す。Ｈ９ｓｃ−ｐについてはＮ＝２、Ｈ９ｃｃについてはＮ＝５である。エラーバーは、反復実験の平均の標準偏差を示す。
【００４５】
図８：Ｈ９単細胞（２２代継代）を分化させた後の膵臓内胚葉マーカーにおける増加。膵臓内分泌分化の１１日、１４日、または１７日後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析を示す。１４日および１７日の値は、６ウェルプレートのうちの２つのウェルの平均である。
【００４６】
図９：ｈＥＳ単細胞は、ＭＥＦ上で分化することができる。ＦＡＣＳは、ＭＥＦ支持細胞上で育てられ、最終内胚葉に分化したＨ１ｓｃｐ４細胞の結果である。最終内胚葉マーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）は、未分化細胞０％に対し、細胞のうちの８９％で発現した（図５参照）。
【００４７】
図１０：ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１８）は、９６ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。Ｓｏｘ１７陽性検出についての免疫蛍光データを示す。８つのウェルを、実験の間、ＭＥＦ馴化培地で処理した：ＭＥＦ培地。８つのウェルを、成分を含まない基礎分化培地で処理した：成分なし。８つのウェルの反復データセットを、各データバーについて平均した。全４０個のウェルを、それぞれＷｎｔ３ａまたはＧｓｋ３ｂ阻害剤で処理し、各データセットについて平均した。エラーバーは、各反復セットについての標準偏差を示す。
【００４８】
図１１：ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１９）によるファーマコフォアスクリーニング。全１３個の実験的な小分子化合物を、最終内胚葉分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａを置換する能力について試験した。３つの有効な可能物を示す。データセットは、２つ以上のウェルにおけるＳｏｘ１７陽性細胞の平均を示す。ＭＥＦ馴化培地または基礎培地により処理された細胞を、陰性対照として用いた。
【００４９】
図１２：Ｈ９ｐ３３ｈＥＳ細胞クラスターおよびＨ９ｐ３３単細胞間のトランスフェクション効率の評価。８μＬのLipofectamine 200（Invitrogen；Carlesbad, CA）、および４μｇＤＮＡ（黒色バー）または８μｇＤＮＡ（灰色バー）を用いて、ＣＭＶ−ＧＦＰを細胞にトランスフェクションした。
【００５０】
図１３：ＭＥＦ上で育て、その後クラスターまたは単細胞としてMATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へと、コラーゲナーゼにより継代した３７代継代のＨ１ｈＥＳ細胞は、いくつかのゆるく分化した細胞とともに別々の密接に固まったコロニーを形成する。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により１回継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、密接に固まった分化細胞のポケットを伴う単層の培養物を形成する。
【００５１】
図１４：ＭＥＦから、単細胞として直接MATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、自発的に分化する。パネルＡ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後も集団のままである細胞の割合（％）。パネルＢ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後のｈＥＳ細胞での分化万能性および分化についてのマーカー発現。パネルＣ：ＭＥＦからMATRIGEL（商標）へのAccutase（商標）による２代継代後のＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。
【００５２】
〔発明の詳細な説明〕
開示を明確にするために、しかし限定を目的とするものではないが、発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施態様、または適用を開示し例示している以下のサブセクションに分割する。
【００５３】
●定義
幹細胞は、自己再生するとともに、子孫細胞を産生するために分化することができるような、単細胞レベルでの能力により規定される未分化細胞であり、自己再生性子孫細胞、非再生性子孫細胞、および最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、in vitroで、多様な胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へと分化する能力によっても特徴付けられ、移植後、多様な胚葉の組織を生じる能力や、胚盤胞への注入後、すべてとは限らないが、実質的にほとんどの組織に寄与する能力によっても特徴付けられる。
【００５４】
幹細胞は発生能力に応じて、以下のように分類される。（１）すべての胚性細胞型および胚外性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化全能性（totipotent）、（２）すべての胚性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化万能性（pluripotent）、（３）すべてではないが特定の組織、器官、または生理系内の細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、分化多能性（multipotent）［例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された複分化性前駆体、ならびに血液の正常成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫細胞を生み出すことができる。］、（４）分化多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、複分化性（oligopotent）、（５）単一の細胞系統（例えば、精原幹細胞）を生み出すことができることを意味する、単分化性（unipotent）である。
【００５５】
分化は、まだ特殊化されていない（「まだコミットしていない」）細胞、またはあまり特殊化されていない細胞が、例えば神経細胞または筋細胞のような、特殊化された細胞の特徴を獲得する過程である。分化した細胞、または分化を誘導された細胞は、細胞系統内のより特殊化された（「コミットした」）地位に就いたものである。用語「コミットした」とは、分化過程に適用される場合、分化経路をある時点まで進んだ細胞をいい、その時点とは、通常環境下で、特殊な細胞型または細胞型のサブセットへと分化し続けるだろうが、通常環境下で、異なる細胞型へと分化することができず、または、あまり分化していない細胞型へと戻ることができない時点である。脱分化とは、細胞系統内のあまり特殊化していない（すなわち、あまりコミットしていない）地位へと戻る過程をいう。本願で用いるように、細胞系統とは、細胞の遺伝的性質（すなわち、細胞がどの細胞に由来するか、どんな細胞を生み出すことができるか）を規定する。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキーム内に細胞を配置する。系統特異的マーカーとは、目的の細胞系統の表現型と特異的に関連付けられる特徴をいい、まだコミットしていない細胞の目的の系統に対する分化を評価するために用いられ得る。
【００５６】
培養における細胞を説明するために、様々な用語が用いられる。「維持」とは、概して、細胞の成長および／または分裂を促進するが、細胞のより大きな集団を結果的に生じさせるかもしれないし、生じさせないかもしれないような条件下で、成長培地に細胞を置くことをいう。「継代」とは、ある培養容器から細胞を取り除き、細胞成長および／または分裂を促進するような条件下で、それらをその次の培養容器に置く過程をいう。
【００５７】
特異的な細胞集団、または細胞株とは、時折、継代されてきた回数をいい、または、その回数で特徴付けられる。たとえば、１０回継代されてきた培養細胞集団を、Ｐ１０培養と呼んでもよい。初代培養（すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養）を、Ｐ０と表す。最初の継代培養後、その細胞を二次培養（Ｐ１または１代継代）という。２回目の継代培養後、その細胞は三次培養（Ｐ２または２代継代）となる。以下同様である。本分野の当業者には、継代中に多くの集団倍化があるかもしれず、したがって、培養の集団倍化数は、継代数よりも多いということが理解されるだろう。継代の間の期間中の細胞増殖（すなわち、集団倍化数）は、多くの因子に依存し、その因子には、播種密度、基質、培地、成長条件、および継代間の時間が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本願で用いられる「ＡＦＰ」または「alpha-fetoprotein protein（α−フェトプロテインタンパク質）」とは、肝臓発生のはじまりに産生される抗原をいう。また、ＡＦＰは、胚外細胞で発現するかもしれない。
【００５９】
「β細胞系統」とは、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子のうちの少なくとも１つとについて遺伝子発現が陽性の細胞をいう。その転写因子とは、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、NeuroD、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６である。β細胞系統に特異的なマーカーを発現する細胞には、β細胞が含まれる。
【００６０】
本願で用いられる「Brachyury」とは、Ｔ−ボックス遺伝子ファミリーの一員である。それは、原条および中胚葉細胞についてのマーカーである。
【００６１】
本願で用いられる「最終内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Cer1、Nodal、ＦＧＦ８、Brachyury、Mix-like homeobox protein、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、eomesodermin（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、またはＯＴＸ２である。最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、原条前駆細胞、原条細胞、中内胚葉細胞、および最終内胚葉細胞が含まれる。
【００６２】
本願で用いられる「ＣＤ９９」とは、アクセッション番号NM_002414の遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【００６３】
本願で用いられる「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、またはＨＢ９である。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内胚葉細胞が含まれる。
【００６４】
本願で用いられる「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、ＮＧＮ−３、NeuroD、Islet-1、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、またはＰＴＦ−１αである。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、および、膵臓ホルモン分泌細胞、ならびにβ細胞系統の細胞が含まれる。
【００６５】
本願で用いられる「ＣＸＣＲ４」とは、stromal cell-derived factor 1（ＳＤＦ−１）receptor（ストロマ細胞由来因子１受容体）をいい、「ＬＥＳＴＲ」または「fusin（フーシン）」としても知られている。原腸形成したマウス胚において、ＣＸＣＲ４は、最終内胚葉および中胚葉で発現するが、胚外内胚葉では発現しない。
【００６６】
本願で用いられる「最終内胚葉（Definitive endoderm）」とは、原腸形成中に胚盤葉上層から生じた細胞の特徴を有し、胃腸管およびその派生物を形成するような細胞をいう。最終内胚葉は、以下のマーカーを発現する。そのマーカーは、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Cerberus、ＯＴＸ２、goosecoid、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、およびＭｉｘｌ１である。
【００６７】
本願で用いられる「胚外内胚葉」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞集団をいう。そのマーカーは、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、およびＳＰＡＲＣである。
【００６８】
「ＧＡＴＡ−４」および「ＧＡＴＡ−６」は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーの一員である。この転写因子ファミリーは、ＴＧＦ−βシグナル伝達により誘導され、初期内胚葉マーカーの維持に貢献する。
【００６９】
本願で用いられる「ＧＬＵＴ−２」とは、膵臓、肝臓、腸、脳、および腎臓を含む数多くの胎児組織および成人組織で発現するグルコース輸送体分子をいう。
【００７０】
本願で用いられる「goosecoid」または「ＧＳＣ」とは、原口の原口背唇で発現するホメオドメイン転写因子をいう。
【００７１】
本願で用いられる「Islet-1」または「Ｉｓｌ−１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーの一員であり、発生中の膵臓で発現する。
【００７２】
本願で用いられる「ＭａｆＡ」は、膵臓で発現する転写因子であり、インスリンの生合成や分泌に関わる遺伝子の発現を制御する。
【００７３】
本願で用いられる「マーカー」は、目的の細胞において差異のある発現をする核酸、またはポリペプチド分子である。本内容において、差異のある発現とは、陽性マーカーについては、増加したレベルを意味し、陰性マーカーについては、低下したレベルを意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、目的の細胞において、他の細胞と比較して十分に高いものであるか、低いものであり、その結果、本分野で既知の、任意の様々な方法を用いて、目的の細胞を同定し、他の細胞と区別することができる。
【００７４】
本願で用いられる「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、ＣＤ４８、eomesodermin（EOMES）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６である。
【００７５】
本願で用いられる「Nodal」は、タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーの一員である。
【００７６】
「Ｏｃｔ−４」は、ＰＯＵドメイン転写因子の一員であり、分化万能性幹細胞の特徴として広く考えられている。分化万能性幹細胞に対するＯｃｔ−４の関係は、未分化の分化万能性幹細胞に密接に限定された発現により示される。体細胞系統への分化の際、Ｏｃｔ−４の発現は急速に消失する。
【００７７】
本願で用いられる「膵臓内分泌細胞」または「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。
【００７８】
本願で用いられる「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。
【００７９】
本願で用いられる「Ｐａｘ−４」および「Ｐａｘ−６」は、膵島発生と関連する膵臓β細胞特異的転写因子である。
【００８０】
本願で用いられる「ＰＤＸ−１」とは、膵臓発生と関連するホメオドメイン転写因子をいう。
【００８１】
本願で用いられる「前原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、NodalまたはＦＧＦ８である。
【００８２】
本願で用いられる「原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、Brachyury、Mix-like homeobox protein、またはＦＧＦ４である。
【００８３】
本願で用いられる「ＰＴＦ−１α」とは、三量体のpancreas transcription factor-1（ＰＴＦ１）（膵臓転写因子１）の配列特異的ＤＮＡ結合サブユニットである、４８ｋＤの基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質をいう。
【００８４】
本願で用いられる「ＳＰＡＲＣ」は、「secreted protein acidic and rich in cystein（酸性でシステインリッチな分泌性タンパク質）」としても知られている。
【００８５】
「ＳＳＥＡ−１」［Stage Specific Embryonic Antigen-1（ステージ特異的胚性抗原１）］は、マウスのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、マウスおよびヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびマウスの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８６】
「ＳＳＥＡ−３」［Stage Specific Embryonic Antigen-3（ステージ特異的胚性抗原３）］は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８７】
「ＳＳＥＡ−４」［Stage Specific Embryonic Antigen-4（ステージ特異的胚性抗原４）］は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８８】
「ＴＲＡ１−６０」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に発現される硫酸ケラチン関連抗原である。
【００８９】
「ＴＲＡ１−８１」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、ヒトの胚性胚細胞（ＥＧ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面に発現されるケラチン硫酸関連抗原である。
【００９０】
「ＴＲＡ２−４９」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞（ＥＣ）、およびヒトの胚性幹細胞（ＥＳ）の表面で発現するアルカリホスファターゼアイソザイムである。
【００９１】
本発明は、酵素を用いて、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。特に、本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全くないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。
【００９２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を分化させる工程と、を含む。
【００９３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標）Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【００９４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。
【００９５】
酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度で用いられてもよい。
【００９６】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【００９７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。
【００９８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【００９９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１００】
１つの実施態様では、組織培養基質は、MATRIGEL（商標）である。MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：１０希釈で用いられる。
【０１０１】
単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１０２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を維持するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。
【０１０３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標）Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【０１０４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。
【０１０５】
酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜２．５ｇ／Ｌの濃度で用いられてもよい。
【０１０６】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【０１０７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。
【０１０８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はgrowth factor-reduced MATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【０１０９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１１０】
１つの実施態様では、組織培養基質は、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である。Growth factor-reduced MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：３０希釈で用いられる。
【０１１１】
単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。あるいは、単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１１２】
１つの実施態様では、本発明は、分化万能性幹細胞を継代するための方法を提供し、その方法は、（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手することと、（ｂ）分化万能性幹細胞を単細胞として放出することと、（ｃ）単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔くことと、（ｄ）単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させることと、（ｅ）単細胞の分化万能性幹細胞を放出することと、（ｆ）単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔くことと、を含む。
【０１１３】
分化万能性幹細胞のクラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE（商標）Express、あるいはTrypLE（商標） Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン／ＥＤＴＡによるものであってもよい。
【０１１４】
酵素処理は、約２分〜約５分間であってもよい。あるいは、酵素処理は、約５分間である。酵素は、約０．５ｇ／Ｌ〜２．５ｇ／Ｌ酵素の濃度で用いられてもよい。
【０１１５】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞のクラスターは、TrypLE（商標）EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。
【０１１６】
１つの実施態様では、単細胞の分化万能性細胞は、細胞を再び新しい組織培養基質上への酵素的な継代を行う前に、約７０〜８０％の密度まで育てられる。単細胞の分化万能性幹細胞を１回継代してもよいし、本発明の方法を用いて、１回よりも多く継代してもよい。
【０１１７】
１つの実施態様では、分化万能性幹細胞は、胚性幹細胞である。別の実施態様では、胚性幹細胞は、ヒト由来である。
【０１１８】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はgrowth factor-reduced MATRIGEL（商標）であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。
【０１１９】
１つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも１つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。
【０１２０】
１つの実施態様では、組織培養基質は、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である。Growth factor-reduced MATRIGEL（商標）は、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられてもよい。１つの実施態様では、MATRIGEL（商標）は、１：３０希釈で用いられる。
【０１２１】
●分化万能性幹細胞の単離、増殖、および培養のための他の方法
○分化万能性幹細胞の特徴づけ
分化万能性幹細胞は、stage-specific embryonic antigens（ＳＳＥＡ）３および４、ならびにＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１に対して設計された抗体を用いて検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現してもよい（Thomson他、Science 282:1145, 1998）。分化万能性幹細胞のin vitroでの分化により、結果的に、（もし存在するならば）ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現が消失し、ＳＳＥＡ−１の発現が高まる。一般的に、未分化の分化万能性細胞は、アルカリホスファターゼ活性を有し、その活性は、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、その後、業者（Vector Laboratories；Burlingame Calif）が説明しているとおり、Vector Redを基質として染色することにより検出することができる。また、未分化の分化万能性幹細胞は一般的に、Ｏｃｔ−４およびＴＥＲＴを発現し、これはＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【０１２２】
増殖された分化万能性幹細胞の望ましい別の表現型は、３つの胚葉すべて（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞へと分化する能力である。幹細胞の分化万能性は、たとえば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに細胞を注入し、４％パラホルムアルデヒドを用いて生じたテラトーマを固定し、その後、３つの胚葉に由来する細胞型のエビデンスについて、それらを組織学的に試験することによって、確認することができる。あるいは、分化万能性は、胚様体を作り出し、３つの胚葉に関係するマーカーの存在について、その胚様体を評価することにより、決定されてもよい。
【０１２３】
増殖された分化万能性幹細胞株を、標準的なＧバンド法を用いて、核型決定してもよいし、対応する霊長類種の公知の核型と比較してもよい。「正常な核型」を有する細胞を入手することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数性であり、すべてのヒト染色体が存在し、著しく変化していないということを意味する。
【０１２４】
○分化万能性幹細胞の原料
用いられてもよい分化万能性幹細胞の種類には、妊娠後に形成された組織に由来する、確立された分化万能性幹細胞株が含まれる。その組織は、前胚性組織（例えば、胚盤胞）、胚性組織、または、妊娠中の任意の時（一般的に、妊娠約１０〜１２週目の前だが、必ずしもこれに限らない）に採取された胎児組織を含む。非限定的な例は、たとえば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、およびＨ９（WiCell）といったヒト胚性幹細胞またはヒト胚性胚細胞の確立された株である。また、このような細胞の初期の確立または安定化の間に本開示の組成物を使用することも考慮すべきである。この場合、原料細胞は、原料組織から直接採取された初代分化万能性細胞である。また、支持細胞の不存在下ですでに培養された分化万能性幹細胞集団から採取された細胞も適切である。また、たとえばＢＧ０１ｖ（BresaGen；Athens, GA）のような変異ヒト胚性幹細胞株も適切である。
【０１２５】
１つの実施態様では、ヒト胚性幹細胞を、Thomson他（米国特許第5,843,780号；Science 282:1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995）で説明されたように準備する。
【０１２６】
○分化万能性幹細胞の培養
１つの実施態様では、一般的に、分化万能性幹細胞は、様々なやり方で分化万能性幹細胞を支持する支持細胞層上で培養される。あるいは、分化万能性幹細胞は、培養システムであって、本質的に支持細胞を含まないにもかかわらず、実質的な分化を経験することなく、かつ、分化万能性幹細胞の増殖を助けるような培養システム上で培養される。支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、それまでに別の細胞型で培養することにより馴化された培地を用いることで、助けられる。あるいは、支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、化学的に規定された培地を用いることで助けられる。
【０１２７】
例えば、Reubinoff他（Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)）、およびThompson他（Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp.1145-1147）が、マウスの胚線維芽細胞の支持細胞層を用いたヒト胚盤胞由来の分化万能性幹細胞株の培養を開示している。
【０１２８】
Richards他（Stem Cells 21: 546-556, 2003）は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、１１個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。Richards他は、「成人皮膚線維芽細胞支持細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。」と述べている。
【０１２９】
米国特許出願公開第20020072117号は、細胞株であって、支持細胞を含まない培養で霊長類分化万能性幹細胞の成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。用いられた細胞株は、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株である。米国特許出願公開第20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。
【０１３０】
別の例では、Wang他（Stem Cells 23: 1221-1227, 2005）が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト分化万能性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。
【０１３１】
別の例では、Stojkovic他（Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005）が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。
【０１３２】
さらなる例では、Miyamoto他（Stem Cells 22: 433-440, 2004）が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。
【０１３３】
Amit他（Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003）は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。
【０１３４】
別の例では、Inzunza他（Stem Cells 23: 544-549, 2005）が、ヒト出生後包皮線維芽細胞由来の支持細胞層を開示している。
【０１３５】
米国特許第6642048号は、支持細胞を含まない培養において、霊長類分化万能性幹細胞（ｐＰＳ）の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。」と述べている。
【０１３６】
別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。国際公開第2005014799号は、「本発明により作られる培養培地は、マウス細胞、特に、ＭＭＨ（Met Murine Hepatocyte）と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。」と述べている。
【０１３７】
別の例では、Xu他（Stem Cells 22: 972-980, 2004）が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。
【０１３８】
別の例では、米国特許出願公開第20070010011号が、分化万能性幹細胞を維持するための化学的に規定された培養培地を開示している。
【０１３９】
別の培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することができる成長因子（growth factor）を補った、血清を含まない培地を用いる。例えば、Cheon他（BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005）が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地（ＳＲ）であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。
【０１４０】
別の例では、Levenstein他（Stem Cells 24: 568-574, 2006）が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、ｂＦＧＦを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。
【０１４１】
別の例では、米国特許出願公開第20050148070号が、血清も線維芽細胞支持細胞も含まない限定培地において、ヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示しており、その方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリンまたはトランスフェリン置換体、少なくとも１つのインスリンまたはインスリン置換体を含む培養培地で幹細胞を培養することであって、培養培地が本質的に哺乳類胎児血清を含まず、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体を活性化することができる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子を含み、成長因子が線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われ、培地が支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。
【０１４２】
別の例では、米国特許出願公開第20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のｂＦＧＦ、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。
【０１４３】
別の例では、米国特許第6800480号が「１つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む細胞培養培地が、提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第１の成長因子とをさらに含む。」と述べている。
【０１４４】
別の例では、米国特許出願公開第20050244962号が、「１つの態様では、本発明は、霊長類胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳類胎児血清を本質的に含まず（好ましくは、任意の動物血清を本質的に含まず）、線維芽細胞支持細胞層以外の原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。好ましい形態において、従来幹細胞培養を持続するために必要とされていた線維芽細胞支持細胞層は、十分な線維芽細胞成長因子の添加により不必要になる。」と述べている。
【０１４５】
さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、（ａ）基礎培地と、（ｂ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のｂＦＧＦと、（ｃ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、（ｄ）実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸と、を含む培地を開示している。
【０１４６】
別の例では、国際公開第2005086845号が、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示しており、その方法は、未分化状態の細胞を維持するのに十分な量のタンパク質の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーの一員、タンパク質の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。
【０１４７】
分化万能性幹細胞は、適切な培養基質上に蒔かれてもよい。１つの実施態様では、適切な基質は、たとえば、基底膜に由来するか、接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成してもよいような細胞外マトリックス成分である。１つの実施態様では、適切な培養培地は、MATRIGEL（商標）（Becton Dickenson）である。MATRIGEL（商標）は、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍細胞由来の可溶性調製物であり、室温でゲル化して、再構成された基底膜を形成する。
【０１４８】
他の細胞外マトリックス成分、および成分混合物が、代替物として適している。増殖されるべき細胞型に応じて、これには、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ヘパラン硫酸、および同様のものが単独で、あるいは様々な組み合わせで含まれてよい。
【０１４９】
分化万能性幹細胞を、適切な分布で、また、望ましい特徴の細胞生存、増殖、および保持を促進する培地の存在下で、基質上に蒔いてもよい。これらの特徴すべてが、播種分布に注意深く配慮することにより利益を得るし、本分野の当業者により容易に決定されることができる。
【０１５０】
適切な培養培地は、以下の成分から作られてもよい。その成分はたとえば、Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ）（Gibco # 11965-092）（ダルベッコ変法イーグル培地）、Knockout Dulbecco's modified Eagle's medium（ＫＯ ＤＭＥＭ）（Gibco # 10829-018）（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、Ham's F12/50% DMEM basal medium; 200 mM L-glutamine（Gibco # 15039-027）（ハムＦ１２／５０％基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン）、non-essential amino acid solution（Gibco 11140-050）（非必須アミノ酸溶液）、β- mercaptoethanol（Sigma # M7522）（β−メルカプトエタノール）；human recombinant basic fibroblast growth factor（ｂＦＧＦ）（Gibco # 13256-029）（ヒト組換え基礎線維芽細胞成長因子）である。
【０１５１】
●分化万能性幹細胞の分化
本発明の１つの実施態様では、分化万能性を維持しながら、分化万能性幹細胞を培地で増殖する。経時的な細胞の分化万能性の変化は、分化万能性に関連するマーカーの発現レベルの変化を検出することで決定できる。あるいは、分化万能性の変化は、別の細胞型と関連した分化、またはマーカーと関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって観察することができる。
【０１５２】
別の実施態様では、分化万能性幹細胞を培養で増殖し、その後、別の細胞型への分化を促進するようなやり方で処理する。他の細胞型は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。あるいは、細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。
【０１５３】
本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、本分野における任意の適切な方法により、他の様々な細胞型へと分化してもよい。たとえば、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞、および同様のものへと分化してもよい。
【０１５４】
たとえば、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、国際公開第2007030870号に記載の方法にしたがって、神経前駆細胞、および心筋細胞へと分化してもよい。
【０１５５】
別の例では、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、米国特許第6,458,589号に開示の方法にしたがって、肝細胞へと分化してもよい。
【０１５６】
●最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５７】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５８】
たとえば、分化万能性幹細胞は、Shinozaki他（Development 131, 1651-1662 (2004)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１５９】
たとえば、分化万能性幹細胞は、McLean他（Stem Cells 25, 29-38 (2007)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６０】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６１】
最終内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Cerl、Nodal、ＦＧＦ８、Brachyury、Mix-like homeobox protein、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、eomesodermin（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、およびＯＴＸ２から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原条前駆細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、最終内胚葉である。
【０１６２】
●膵臓内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６３】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６４】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９、およびＰＲＯＸ１から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１６５】
●膵臓内分泌系統のマーカーを発現する細胞の形成
分化万能性幹細胞は、本分野における任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６６】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’Amour他（Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)）に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６７】
たとえば、分化万能性幹細胞は、Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６８】
たとえば、分化万能性幹細胞は、D’ Amour他（Nature Biotechnology, 2006）に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。
【０１６９】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、NeuroD、Islet-1、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＰＴＦ−１αから成る群から選択される。１つの実施態様では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することができる。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。本発明での使用に適しているのは、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。あるいは、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【０１７０】
本発明の１つの態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１と、以下の転写因子のうちの少なくとも１つとを発現する。その転写因子とは、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、NeuroD、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６である。本発明の１つの態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１７１】
●三次元支持体
本発明の目的で使用するために適切な支持材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の合成材料および天然材料が含まれ、それは生物組織を再構築または再生するためにも、組織成長を誘導するための走化性剤を送達するためにも、in vitroおよびin vivoで用いられ、本願発明の方法を実施する際に使用するのに適切である。たとえば、米国特許第5,770,417号、同第6,022,743号、同第5,567,612号、同第5,759,830号、同第6,626,950号、同第6,534,084号、同第6,306,424号、同第6,365,149号、同第6,599,323号、同第6,656,488号、米国特許出願公開第2004/0062753 A1号、米国特許第4,557,264、同第6,333,029号に開示された材料を参照のこと。
【０１７２】
薬剤を組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成する前に、薬剤をポリマー溶液と混合することができる。あるいは、織られた支持体上に薬剤をコーティングすることができ、それは好ましくは薬学的キャリアの存在下である。薬剤は、液体、細かく分割された固体、または他の任意の適当な物理的形態で存在してもよい。あるいは、薬剤の放出速度を変えるために賦形剤が支持体に加えられてもよい。別の実施態様では、支持体は、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,509,369号に開示された化合物のような、抗炎症性化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれる。
【０１７３】
支持体は、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,793,945号に開示された化合物のような、抗アポトーシス化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７４】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,331,298号に開示された化合物のような、線維症阻害剤である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７５】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許出願公開第2004/0220393号、および同第2004/0209901号に開示された化合物のような、血管形成を促進することができる、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７６】
支持体はまた、少なくとも１つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許出願公開第2004/0171623号に開示された化合物のような、免疫抑制化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。
【０１７７】
以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、それらにより限定するものではない。
【０１７８】
〔実施例〕
●実施例１ 細胞クラスターでのｈＥＳＣの継代および維持
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１およびＨ９を、マイトマイシンＣ不活性化初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した。ｈＥＳ細胞を、反復継代の後、ＭＥＦ支持細胞からMATRIGEL（商標）へと移した。
【０１７９】
○組織培養皿のMATRIGEL（商標）コーティング
Growth Factor Reduced MATRIGEL（商標）（Becton-Dickinson；Bedford, Mass.）を４℃で解凍し、その後、冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen；Carlsbad, CA）で１：３０に希釈した。各６ｃｍディッシュ（２ｍＬ）または６ウェルプレート（１ｍＬ）の各ウェルに、覆うのに十分な量を加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートは、数時間以内に使用するか、４℃で２週間目まで保存した。
【０１８０】
○ヒト胚性幹細胞培養
未分化のヒト胚性幹細胞コロニー（Ｈ９およびＨ１）を、１ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼＩＶ（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、１０分間インキュベーションし、その後、ピペットで掻爬することにより、支持細胞から採取した。１０００ｒｐｍで４分間遠心分離することにより、細胞の塊をペレット化し、ペレットを２ｍＬピペットでやさしく分散して、コロニーを細胞の小さなクラスターへと砕いた。これらの細胞クラスターを、ｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems；Minneapolis, MN）を補ったＭＥＦ−ＣＭを入れたMATRIGEL（商標）コーティングのディッシュ上に、５ｍＬの成長培地を入れた６ｃｍディッシュ当たり５０〜１５０個のコロニーで播種した。培地は毎日交換した。ＭＥＦ−ＣＭ中のMATRIGEL（商標）上のコロニーが大きくなり、それらが表面領域の７０〜８０％を占めると、約３〜４日ごとに継代した。コロニー中のｈＥＳ細胞は、高い核対細胞質比率を有し、顕著な核小体を有していた。これは、支持細胞上で維持されたｈＥＳ細胞と同様である（図１）。分化した細胞は、培養中の全細胞の５％未満であった。
【０１８１】
MATRIGEL（商標）上のＭＥＦ−ＣＭ中の細胞の定期的な継代のために、１ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼＩＶを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で、最大６０分間、細胞をインキュベーションし、掻爬とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２の強力な水流により、ディッシュから除去した。細胞をペレット化し、分散し、そして１：３または１：４の比率で播種した。
【０１８２】
●実施例２ 単細胞としての胚性幹細胞の継代：酵素の評価
ｈＥＳ細胞の取扱いを容易にするために、継代技術は、他の酵素溶液であって、より短いインキュベーション時間が必要だが、掻爬の工程を含まないような酵素溶液を用いてもよい。なお、細胞を細胞クラスターとしてコラーゲナーゼにより継代することは、播種される細胞の数値定量化を可能にしない。多くの酵素溶液が、１つの迅速な工程で単細胞を放出するために利用可能である。以下の実験により、最小の細胞損傷をもたらし、細胞付着または細胞成長を遅らせないような即効性の酵素が同定された。
【０１８３】
クラスターとして６ウェルディッシュ中で成長したヒト胚性幹細胞Ｈ９ｐ３３細胞を、以下の酵素とともに、３６℃で２分間インキュベーションした。その酵素とは、TrypLE（商標）Express、TrypLE（商標）Select、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％）、またはトリプシン（０．２５％）である。トリプシンを除き、すべての酵素が２分間以内に細胞を放出した。トリプシンによる放出は、３６℃で５分後に達成された。MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに、細胞を２００，０００細胞／ウェルで再播種し、３日間増殖させた。また、ヒト胚性幹細胞もコラーゲナーゼによりクラスターとして継代し（３０分インキュベーション）、そしてMATRIGEL（商標）コーティングウェル上に１：５希釈で再播種した。これは、計数したTrypLE（商標）Express細胞と同様である。３日後、TrypLE（商標）Expressによる５分間のインキュベーションにより、ｈＥＳＣを放出した。細胞を、０．０１％トリパンブルーとともにインキュベーションし、その後計数した（表１）。放出直後の細胞の生存率は、試験したすべての酵素で９８％を超えていた。コラーゲナーゼによるヒト胚性幹細胞の継代は、標準的な継代方法である。TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressは、３日間の培養後、コラーゲナーゼと同様の回復した細胞計数をもたらした。細胞の付着／成長を維持することについて、トリプシン／ＥＤＴＡ、およびトリプシンは明らかに効果が少なかった。TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressは、評価したなかで最も良い酵素であり、実施例３のタイムコース実験でさらに試験した。
【０１８４】
●実施例３ 単細胞としてのヒト胚性幹細胞の継代：酵素曝露時間の最適化
TrypLE（商標） Select、およびTrypLE（商標）Expressは、試験したすべての酵素のなかで最適であることが明らかになった。ｈＥＳ細胞に対するこれらの酵素の理想的なインキュベーション時間を決定するために、TrypLE（商標）Select、およびTrypLE（商標）Expressを、Ｈ９ｐ３４ｈＥＳＣクラスターとともに、３７℃で２分間または１０分間インキュベーションした。細胞をウェルから取り除き、計数し、遠心分離によりペレット化した。２００，０００細胞／ウェルの分量を、６ウェルプレートに播種した。細胞を３日間成長させ、その後、TrypLE（商標）Expressにより放出し、０．０１％トリパンブルーの存在下で計数した。
【０１８５】
両方の酵素の両方のインキュベーション時間について、細胞生存率は９８％を超えていた。表３は、播種後３６時間の回復した細胞／ウェル数を示している。TrypLE（商標）Expressにより継代した細胞は、３日後に開始播種密度に到達した。このことは、大部分の細胞が、播種後再付着しないこと、および付着した細胞も増殖し増えることができるということを示している。一度付着すると細胞が同じ速度で増殖すると仮定するならば、これらのデータは、TrypLE（商標）Expressによる２分間の処理が、結果的に最も良い付着速度を生ずるということを示している。それゆえ、すべてのその後の実験において、単細胞を作るために２分間のTrypLE（商標）Express処理を用いた。
【０１８６】
●実施例４ ヒト胚性幹細胞の単細胞、および細胞クラスターの最終内胚葉への分化
胚性幹細胞は複数の細胞系統へと分化することができる。単細胞として継代されたヒトＥＳ細胞によって、細胞入力の定量化、および取扱いの容易さを助けるための顕著な改良がもたらされる。これらの単細胞のｈＥＳ細胞の分化能力を決定した。
【０１８７】
○細胞クラスターおよび単細胞の播種
Reduced growth factor MATRIGEL（商標）上のＨ９またはＨ１細胞クラスターの入った６ｃｍプレートを、２ｍＬのコラーゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２とともに、３７℃で最大６０分間インキュベーションした。細胞を、ピペッティングおよび掻爬により取り除き、９００ｒｐｍで４分間遠心分離した。その後、１：１５または１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに、細胞クラスターを播種した。この継代方法は、結果的に、細胞クラスター（ｃｃ）を播種することをもたらす。あるいは、reduced growth factor MATRIGEL（商標）上のＨ９またはＨ１細胞クラスターの入った６ｃｍプレートを、TrypLE（商標）Express（２ｍＬ）とともに、３７℃で５分間インキュベーションし、ピペッティングにより分散した。９００ｒｐｍで４分間の遠心分離の後、その後、１：１０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした６ウェルプレートに細胞を播種し、それを単細胞（ｓｃ）と命名した。
【０１８８】
○最終内胚葉分化
約６０〜７０％コンフルエントのＨ９およびＨ１のｓｃおよびｃｃ培養物を、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ（R&D Systems）、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＡＡ；R&D Systems）を補ったＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に２日間曝露した。その後、２％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地により、さらに３日間処理した。
【０１８９】
ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現については、ＦＡＣＳにより、また、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α-fetal protein（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、Brychyury（Ｂｒｙ）、goosecoid（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、およびＧＡＴＡ４については、リアルタイムＰＣＲにより、培養物を分析した。ＡＦＰ、およびＳＯＸ−７は臓側内胚葉マーカーと考えられる一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、およびＳＯＸ−１７は最終内胚葉マーカーであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、およびＣＸＣＲ４は原条のマーカーである。結果として生じたＣＸＣＲ４陽性細胞の割合（％）を観察すると（図２）、単細胞は、細胞クラスターと同様程度まで、ＤＥに分化した。
【０１９０】
●実施例５ ｈＥＳ単細胞および細胞クラスターの膵臓内胚葉への分化
ｈＥＳ単細胞の分化能力を決定するために、改良したNovocell（Baetge, EE他；Nature Biotechnology (2006), 24(11), 1392-1401）に開示されたプロトコルにしたがって、さらなる分化を試験した。細胞は、実施例４に記載されたＤＥプロトコルの後、膵臓内胚葉へとさらに分化した。
【０１９１】
○膵臓内胚葉分化
実施例４からの細胞クラスターおよび単細胞を用いた、Ｈ９（ｐ３７）ＤＥ実験のうちの１つが膵臓内胚葉へとさらに分化した。最終内胚葉プロトコルの完了後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems）、sonic hedgehog（ソニックヘッジホッグ）阻害剤、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ；Sigma-Aldrich）、および２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地とともに、細胞を３日間インキュベーションした。その後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ)、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、レチノイン酸（１μＭ；Sigma-Aldrich）、および１％Ｂ２７（Invitrogen）を含むDMEM-low glucose（ＤＭＥＭ低グルコース）とともに、細胞をさらに３日間インキュベーションした。その後、エキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）、ＤＡＰＴ（１μＭ；Calbiochem）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucoseとともに、細胞をさらに３日間インキュベーションした。６ウェルプレートのうちの１つのウェルから、各細胞型について、ＲＮＡサンプルを採取し、その後、膵臓マーカーＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、NeuroD、ＨＮＦ３ｂ、Ｐｔｆ１ａ、Insulin（インスリン）、およびＡＦＰについて、リアルタイムＰＣＲにより、この段階で分析した。５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、ＩＧＦ（R&D Systems）、およびエキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ならびに１％Ｂ２７を含むＣＭＲＬ培地（Invitrogen）により、３日間、分化が継続した。この段階で、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。処理したサンプルと平行して、同じ株の未処理のｈＥＳ細胞由来のＲＮＡサンプルに対して、リアルタイムＰＣＲを行った。未処理の対照に対して１の倍数変化を設定し、処理したサンプルを正規化した。Ｐｄｘ１発現を観察し、単細胞と細胞クラスターとを比較した。膵臓内胚葉マーカー発現の誘導は、単細胞と細胞クラスターの間で同等であった（図３）。したがって、ｈＥＳ単細胞は、ｈＥＳ細胞クラスターと同様の遺伝的な分化能力を有している。
【０１９２】
●実施例６ 単細胞としてのｈＥＳ細胞の継代
単細胞としてｈＥＳ細胞を継代することは、培養をスケールアップし、製造過程を容易にすることを可能にするだろう。
【０１９３】
○単細胞の生成および継代についての説明
Ｈ９細胞をMATRIGEL（商標）上で、上記のとおり成長させた。３８代継代時に、Ｈ９細胞の６ｃｍプレートを、２ｍＬ TrypLE（商標）Expressとともに、３７℃で５分間インキュベーションした。細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２に再懸濁し、９００ｒｐｍで４分間遠心分離した。１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）コーティングしたプレート上に１：４の比率で、細胞を再播種した。約５代継代後、再播種し、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で蒔く前に、細胞を計数した。この密度で継代し再播種することを、各４日間の間隔で継続した。細胞は、単細胞から成長したが、密集したクラスターを形成することがないような緻密な構造を保持していた（図１と図４を比較のこと）。
【０１９４】
●実施例７ ｈＥＳ単細胞の分化万能性の分析
ｈＥＳ細胞の分化万能性の維持は、あらゆる継代技術で必要とされる。したがって、TrypLE（商標）Expressを用いた複数の継代後の分化万能性について、単細胞を評価した。
【０１９５】
○ＦＡＣＳ分化万能性分析
Ｈ９単細胞を、クラスターとして３８代継代培養した後、単細胞として１６代継代培養した。これには凍結保存の凍結解凍が１回含まれる。その後、分化万能性マーカーの発現について、ＦＡＣＳで細胞を分析した。TrypLE（商標）Express溶液とともに５分間インキュベーションすることにより、付着細胞を培養プレートから取り除いた。放出された細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に再懸濁し、遠心分離により回収し、洗浄し、２％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳから成る染色バッファーに再懸濁した。必要に応じて、０．１％γグロブリン（Sigma）溶液を１５分間用いて、細胞をＦｃ受容体についてブロッキングした。表３に示したとおり、モノクローナル抗体を結合したフィコエリスリン（ＰＥ）もしくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（１０６細胞あたり５μＬ抗体）のいずれかとともに、または非結合一次抗体とともに、分量（約１０５細胞）をインキュベーションした。対照には、抗体と適合する適当なアイソタイプ、未染色の細胞、二次結合抗体のみで染色された細胞が含まれた。抗体によるすべてのインキュベーションを４℃で３０分間行い、その後、染色バッファーで細胞を洗浄した。非結合一次抗体により染色されたサンプルを、ＰＥまたはＡＰＣで標識した二次結合抗体とともに、４℃でさらに３０分間インキュベーションした。用いられた２次抗体の一覧については表３を参照のこと。洗浄された細胞をペレット化し、染色バッファーに再懸濁して、細胞表面分子を、FACS Array instrument（ＦＡＣＳアレイ装置）（BD Biosciences）を用いて同定し、少なくとも１０，０００回の事象を収集した。ｈＥＳＣコラーゲナーゼ継代したＨ１ｐ４０およびＨ９ｓｃｐ１６は、同等の分化万能性タンパク質の発現プロファイルを有している（図５）。
【０１９６】
●実施例８ ヒト胚性幹細胞の単細胞の核型安定性の分析
ｈＥＳ単細胞の核型は、複数の継代の後も安定なままであるべきである。Ｈ９単細胞を、クラスターとして３８代継代培養し、その後、単細胞として複数継代培養した。Ｈ９細胞の核型を、standard G-banding karyotype analysis（標準Ｇバンド核型分析）（Cell Line Genetics；Madison, WI）により決定した。全体で２０個のＧバンド染色した細胞を評価し、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）により２００個の中期の細胞核を分析した。分析した細胞では、染色体異常は全く見られなかった。細胞遺伝学的分析は、細胞が正常な数の常染色体を有し、様式的な染色体数は４６本であることを示した。Ｈ９単細胞の核型決定を、１３代継代および２０代継代で実施した。２０代継代の細胞は、冷凍保存の凍結解凍事象を１回経験していた。１３代継代の細胞および２０代継代の細胞は、核型としては正常だった（図６）。
【０１９７】
●実施例９ ｈＥＳ単細胞およびｈＥＳ細胞クラスターの最終内胚葉への分化
最終的な利用のために、単細胞として継代されたｈＥＳ細胞は、分化能力を保持しなくてはならない。以下のとおり、単細胞に対して最終内胚葉分化プロトコルを行った。TrypLE（商標）Expressによる複数の継代（ｓｃ−ｐ）後のＨ９細胞を、分化のためのMATRIGEL（商標）（１：１０希釈）上の継代された単細胞（６代継代および２１代継代）から、TrypLE（商標）Expressにより放出した（ｓｃ）。約６０〜７０％のコンフルエントな単層のＨ９ｓｃを、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、および１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に２日間曝露し、その後、さらに３日間、２％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地により処理した。
【０１９８】
５日目に、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現について、ＦＡＣＳにより、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α-fetal protein（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、Brychyury（Ｂｒｙ）、goosecoid（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、およびＧＡＴＡ４については、リアルタイムＰＣＲにより、細胞を分析した。ＡＦＰ、およびＳＯＸ−７は臓側内胚葉マーカーと考えられ、一方、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、およびＳＯＸ−１７は最終内胚葉マーカーであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、およびＣＸＣＲ４は原条のマーカーである。複数回（６代継代および２１代継代）継代した単細胞は、細胞クラスター（３６〜５５代継代）と同様に、ＤＥへと分化する能力を保持している（図７）。
【０１９９】
●実施例１０ ｈＥＳ単細胞の膵臓内胚葉への分化
以下の工程をその後行うことにより、細胞は膵臓内胚葉へとさらに分化した。その工程とは、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、sonic hedgehog阻害剤、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、および２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地とともに３日間インキュベーションすることと、その後、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ)、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、レチノイン酸（１μＭ）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucose（ＤＭＥＭ低グルコース）とともに３日間インキュベーションすることである。細胞の評価は１１日目に行なった。一部の培養物は、エキセンディン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＡＰＴ（１μＭ）、および１％Ｂ２７を含むDMEM-low glucoseとともに３日間にわたり処理を続けた。１４日目に、膵臓マーカーＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、NeuroD、ＨＮＦ３ｂ、Ｐｔｆ１ａ、Insulin、およびＡＦＰについて、リアルタイムＰＣＲにより、サンプルを分析した。５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、ＩＧＦ、およびエキセンディン４、ならびに１％Ｂ２７を含むＣＭＲＬ培地により、いくつかの培養が分化を継続させた。１７日目の終わりに、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。１４日および１７日目の終わりで、膵臓内胚葉マーカーＮｋｘ２．２、NeuroD、ＨＮＦ６、ＨＮＦ３ｂが主に発現した。Ｐｄｘ１発現は、各処理段階で段階的に高まった（図８）。
【０２００】
●実施例１１ ＭＥＦ支持細胞上のｈＥＳ単細胞の分化
ｈＥＳ細胞の膵臓内胚葉への最適な分化を達成するために、最終内胚葉集団は最大数でなければならない。従来、ＭＥＦ支持細胞上でｈＥＳを育てると、最終内胚葉および膵臓内胚葉の達成可能な最も高い濃度がもたらされている。ｈＥＳ単細胞がこの目的を達成できるかどうか決定するために、Ｈ１ｓｃｐ４を、ＭＥＦ支持細胞上に１４，０００細胞／ｃｍ２で播種した。２０％Knock-out Serum Replacement（Invitrogen）（ノックアウト血清置換）、１×non-essential Amino Acids（Invitrogen）（１×非必須アミノ酸）、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液を含んだＤＭＥＭ−Ｆ１２を含むＥＳ細胞培地上で、細胞を成長させた。７日後、細胞は６０〜７０％のコンフルエントになり、最終内胚葉プロトコルを細胞に適用した。具体的には、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、および０．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を、２日間、ウェル当たり１００μＬ加え、その後、３日間、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で処理した。その後、TrypLE（商標）Expressで細胞を取り除き、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、およびＣＤ９発現について、ＦＡＣＳにより分析した（図９）。９０％を超える細胞がＣＸＣＲ４、およびＣＤ９９を発現した。予想したとおり、８％未満の細胞がＣＤ９を発現した。ＣＸＣＲ４陽性細胞数により決定されるように、単細胞のＨ１細胞をＭＥＦ支持細胞上に播種することにより、最終内胚葉分化が改良される。
【０２０１】
●実施例１２ ９６ウェルプレートにおけるｈＥＳ単細胞の分化
ｈＥＳ細胞をクラスターで継代することに伴う、ある共通の困難性は、定量することが難しく、等しい割合で成長させられないことである。単細胞は、コンフルエントな単層に成長することができ、実験目的のための等しい播種を確実にするように、継代の前に計数することができるという利点を有する。これらの特質は、成功したスクリーニングを検証するための必須条件である。
【０２０２】
ｈＥＳＨ９ｓｃｐ１８を、１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）でコーティングしたPackard View 96-well plates（９６ウェルプレート）（Perkin-Elmer）上に、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３〜４日間、ＭＥＦ馴化培地で細胞を成長させ、その後、ＤＥ分化プロトコルを用いて処理した。４０ウェルのサブセットを、標準プロトコルで（１０ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で２日間）処理した。第２の４０ウェルのサブセットを、Ｗｎｔ３ａの代わりに、ＧＳＫ３ｂ阻害剤ＩＸ（１００ｎＭ；EMD Chemicals；La Jolla, CA）で処理した。その後、両方のサブセットを１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で３日間処理した。培養の終わりで、４％パラホルムアルデヒドにより、室温で２０分間、細胞を固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬ ＰＢＳで一晩保存した。０．５％Triton X-100（Sigma-Aldrich）により、室温で２０分間か、４℃で５分間のいずれかで、細胞を透過処理し、その後ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Invitrogen-Gibco；Carlesbad, CA）の入ったＰＢＳにより、室温で３０分間ブロッキングした。一次抗体［goat-anti-hSox17（ヤギ抗ｈＳｏｘ１７）（R&D Systems）］を、４％ニワトリ血清の中に１：１００希釈し、室温で一時間加えた。二次抗体［Alexa Fluor 488 chicken-anti goat IgG（ニワトリ−抗ヤギＩｇＧ）（Invitrogen-Molecular Probes；Carlesbad, CA）］をＰＢＳの中に１：２００希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した後の細胞に加えた。核を対比染色するために、５μＭ Draq5（Alexis Platform；Laufelfingen, Switzerland）を、室温で５分間細胞に加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、画像化するため、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中に残し、分化したＤＥ細胞の数を決定した。細胞数およびＳｏｘ１７染色をウェルごとに定量するために、IN Cell 1000 Analyzer（GE Healthcare；Piscataway, NJ）でプレートを読み取った。Ｗｎｔ３ａによる処理により、ウェル間の変動がほとんど存在しない、最も多いウェル当たりの細胞核数がもたらされた（図１０）。Ｇｓｋ３β阻害剤による処理は、低い細胞生存率を示した。９６ウェルフォーマットにおけるロバストで再現性のあるやり方において、Ｗｎｔ３ａ処理により、単細胞のＥＳ細胞がＤＥを形成することができることは明らかである。
【０２０３】
●実施例１３ ｈＥＳ単細胞によるスクリーニング解析
単細胞が９６ウェルフォーマットに播種し分化することができることを示した後、新規化合物による処理の感度を決定した。ｈＥＳＨ９ｓｃｐ１９を、１：３０growth factor reduced MATRIGEL（商標）でコーティングした９６ウェルプレートに、１４，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３〜４日間、ＭＥＦ馴化培地で細胞を成長させ、その後、ＤＥ分化実験を進めた。ＤＥ分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａを小分子阻害剤で置換して、全体で１３個の新規化合物を、１μＭまたは３μＭの濃度で３回繰り返し試験した。Ｗｎｔ３ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧｓｋ３ｂ阻害剤ＩＸ（１００ｎＭ）を含むウェルを、陽性対照として用いた。単一の化合物を１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２を加えたもので、すべての分化ウェルを２日間処理し、その後、化合物を含まない１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、および０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２で２日間処理した。上記の実施例１１に記載したとおり、プロトコルの終わりで、細胞を固定し、透過化し、ブロッキングし、染色して、Ｓｏｘ１７発現および核を決定した。その後、プレートをIN Cell 1000 Analyzer上で読み取った。このスクリーニングは、Ｈ９ｓｃｐ２１が、ＤＥ分化プロトコルにおけるＷｎｔ３ａと同様のやり方で、１３個の化合物のうちの３つに対して応答したことを示した（図１１）。化合物Ａは１μＭ未満の用量で効果的であり、化合物Ｂおよび化合物Ｃは、１μＭおよび３μＭで効果的であった。効果的な処理範囲（６０％を超えるＳｏｘ１７陽性細胞）では、ウェル間の標準偏差は小さかった。したがって、スクリーニング技術により新規の化合物を同定する能力において、単細胞は一貫している。
【０２０４】
●実施例１４ ローラーボトルにおける単細胞のｈＥＳ細胞の増殖
目的物を製造するためのスケールアップを容易にするために、ｈＥＳ細胞は、多くの量になるまで容易に増殖される必要がある。従来、ｈＥＳ細胞を継代するためのコラーゲナーゼ処理では、ローラーボトルまたはシェーカーフラスコでスケールアップすることができない。単細胞として繰り返し増殖し、成長してきたＨＥＳ細胞は、異なる表面に均等に付着する能力を有する。本実施例では、可能性があるスケールアップ容器として、ローラーボトルを試験した。Ｈ９ｓｃｐ１９を、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）でコーティングした４８０ｃｍ２ローラーボトル（Corning；Acton, MA）に１４，０００細胞／ｃｍ２で播種した（６．７×１０６細胞）。細胞を維持するために、ボトル当たり１００ｍＬ量のＭＥＦ馴化培地を用い、２日ごとに交換した。ボトルを、２４時間２０ｒｅｖ／時に設定し、残りの時間で６０ｒｅｖ／時まで増加させた。細胞はローラーボトルに均等に付着し、４日目の評価時点の後も視認できるほど増殖した。TrypLE（商標）Expressを用いて細胞を取り除き、計数した。ボトル当たり１３×１０６細胞を示す回復した計数を入手し、これは元の播種と比較して、最小の細胞倍化を示している。開始播種細胞の半分未満の細胞がローラーボトルに付着したと推量され、これはより多い実際の細胞増殖がローラーボトルの中で起こったということを示唆している。このことは、単細胞として継代したｈＥＳ細胞を、自動化されたローラーボトルシステムで増殖することが可能であることを示している。分化万能性を維持しながらの増殖速度を決定するためのさらなる実験を実施するだろう。
【０２０５】
●実施例１５ 単細胞ｈＥＳ細胞のトランスフェクション
形質転換した細胞型を作るためにＤＮＡを細胞に導入することは、有用な特徴である。ＤＮＡには、分化を促進し、または、細胞の選択を可能にする発現ベクター、またはレポーター遺伝子が含まれてもよい。ｈＥＳ細胞は、クラスターではトランスフェクションすることが困難であることが示されてきた。しかしながら、ｈＥＳ単細胞は、トランスフェクション技術を適用できるかもしれない。
【０２０６】
Ｈ９ｐ３３細胞を、TrypLE（商標）Expressにより継代し、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）コーティングのプレート上に、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。Ｈ９ｐ３３細胞を、コラゲナーゼにより継代し、６ｃｍプレートから、１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）コーティングの６ウェルプレートの１つのウェル中に播種した。３日後、細胞をＣＭＶ−ＧＦＰによりトランスフェクションした。ここで、ＧＦＰはＣＭＶウイルスプロモーター下でいずれの細胞でも発現する。具体的には、２μｇまたは４μｇのＤＮＡを、２５０μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、および８μＬのLipofectamine 2000（リポフェクタミン２０００）（Invitrogen）を含む２５０μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した。５分後に、混合物を室温で組み合わせる。培養細胞を２ｍＬのＭＥＦ馴化培地に加える前に、室温で２０分間、組み合わされた試薬をインキュベーションした。その後２４時間ごとに、培地をＭＥＦ馴化培地で置換した。３日後、４％パラホルムアルデヒドにより、室温で２０分間、細胞を固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に４℃一晩放置した。核の対比染色のために、５μＭ Draq5（Alexis Platform）を、室温で５分間、細胞に加えた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、IN Cell 1000 Analyzer上で画像化するため、１ｍＬ／ウェルのＰＢＳ中に残し、トランスフェクション効率を決定した（図１２）。ＨＥＳ単細胞は、ｈＥＳクラスターよりも、トランスフェクション効率において２倍の改良を示している。したがって、ｈＥＳ単細胞は、改良されたトランスフェクション能力を有し、遺伝子組換えすることがより容易である。最適化とともに、おそらく他のトランスフェクション方法、または試薬を用いることにより、単細胞ＥＳ細胞トランスフェクションの、より劇的な改良を達成することが可能になるかもしれない。
【０２０７】
●実施例１６ 支持細胞層上で培養されたｈＥＳ細胞クラスターを、細胞外マトリックス上で培養された単細胞のｈＥＳ細胞へ変換することは、支持細胞の除去を必要とする
研究および製造上の設定における、トリプシン、組換えトリプシン（TrypLE（商標））、またはAccutase（商標）（無脊椎動物由来のトリプシン様酵素）のような酵素による哺乳動物細胞の継代は、初代細胞株および不死化細胞株の両方の細胞培養について、従来の標準である。これらの酵素は、細胞の均質な単細胞懸濁液を生み出し、それは、高いスループットフォーマットの３８４ウェルプレート、またはマルチリットルで測量可能な培養容器と同様の多様な設定で播種することが可能な再現性のあるやり方で、計数し、分析し、操作し、または継代することができる。
【０２０８】
単細胞継代に明確に利点がある場合、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代する方法を開発することは非常に興味深い。しかしながら、従来の、ヒト胚性幹細胞による最良の実施形態は、胚性細胞をクラスターで維持するような、手動による分解または酵素（コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ）による継代のいずれかによって、クラスターとして細胞を継代することを必要とする。本分野における過去の研究は、単細胞として支持細胞上で継代することができる細胞の誘導（Cellartis SCEDTM461株）、または、Accutase（商標）による、コラーゲナーゼ継代クラスターからMATRIGEL（商標）上の単細胞への細胞の誘導（R. Bajpai他, 2008）をもたらしてきた。
【０２０９】
本願は、TrypLE（商標）またはAccutase（商標）のいずれかを用いたバルク継代方法において、支持細胞から直接MATRIGELへとｈＥＳ細胞を採取するための単細胞の継代方法を開発するための試みである。この結果は、クラスター状の支持細胞から直接MATRIGEL（商標）へ、ｈＥＳ細胞を継代する方法を採用することは、分化した細胞集団の外観、および外観のために均質でロバストな細胞培養をもたらさない見込みがあるので、不適当であるということを示している。ここで、その方法として、TrypLE（商標）またはAccutase（商標）バルク継代のいずれかであって、MATRIGEL（商標）上へのコラーゲナーゼ継代に基づくクラスターの中間工程を有さないバルク継代を用いている。
【０２１０】
○結果
支持細胞に基づく培養から、支持細胞のないｈＥＳ細胞の培養へと移行する目的で、Ｈ１の３７代継代のｈＥＳ細胞を継代した。そのｈＥＳ細胞は、ｈＥＳＣ培地のＭＥＦ支持細胞層により支持され、６ウェルプレートの１０ｃｍ２ウェル上で５日間育てられてきた。TrypLE（商標）、Accutase（商標）、または１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼのいずれかにより、細胞を継代した。
【０２１１】
酵素を細胞に加える前に、使用済みの培地を吸引し、１ｍＬ ＰＢＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を全く含まない）を各ウェルに加え、その後、１ｍＬの室温の酵素（コラーゲナーゼ、Accutase（商標）、またはTrypLE（商標））を、各ウェルに加えた。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）を、室温にした後のストック濃度で用いた。コラーゲナーゼは、−８０℃の冷凍装置から移し、解凍し、９ｍＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とともに混合し、滅菌ろ過し、使用前に室温にした。
【０２１２】
細胞を酵素中で、３７℃で１０分間インキュベーションした。Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により、１０分間処理の後、全細胞が完全にディッシュから浮き上がった。コラーゲナーゼは、１０分間のインキュベーション後、細胞を浮き上がらせなかった。そこで、１０分間のインキュベーション後、１０ｍＬガラスピペットで、細胞をスクラッピングした。１ｍＬの２％Probumin（プロブミン）を含んだＤＭＥＭ−Ｆ１２を各ウェルに加え、ウェル中の組み合わせた全量を、５０ｍＬ滅菌コニカルチューブに移して、可能な限り多くの細胞を浮き上がらせ、懸濁した。
【０２１３】
細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離し、その後、２％Probuminによりさらに洗浄し、２００×ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞をＭＥＦ馴化培地に再懸濁し、１〜３．５比率でMATRIGEL（商標）（ＤＭＥＭ中に１：３０希釈）コーティングしたＴ２５フラスコに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の高湿度インキュベーター中に置いた。
【０２１４】
Improved Neubauer hemocytometer（改良Neubauer血球計数器）により計数することで、細胞数を計算した。Accutase（商標）により浮き上がった細胞は、３．８×１０６細胞／１０ｃｍ２ウェルの密度であった。TrypLE（商標）により浮き上がった細胞は、３．７×１０６細胞／１０ｃｍ２ウェルの密度であった。コラーゲナーゼは、コロニー状のため、計数できなかった。１〜３．５分割比である場合、Accutase処理細胞を、２．７２×１０６細胞／Ｔ２５フラスコ、すなわち１０８，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で蒔き、TrypLE（商標）処理細胞を、２．６５×１０６細胞／Ｔ２５フラスコ、すなわち１０５，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で蒔いた。コラーゲナーゼ処理細胞は同様の密度（１０５，０００〜１０８，０００細胞／ｃｍ２）で蒔いたとみなす。というのも、酵素処理前のウェルからウェルへのｈＥＳ密度に、感知できるほどの違いがないからである。次の継代で計数する目的のために、さらなるフラスコを、コラーゲナーゼで浮き上がらせた細胞によりプレーティングした。
【０２１５】
１６μｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地を毎日交換して、４日間、細胞を維持した。培養４日後、培養物はコンフルエントになり、単細胞処理したｈＥＳ細胞は、線維芽細胞の偶発的なポケットを有するｈＥＳ細胞の単層を形成した。一方、ｈＥＳ細胞を継代したクラスターは、ｈＥＳ細胞の大きなコロニー状のクラスターを形成した（図１３）。その後、これらの細胞を再び継代した。
【０２１６】
上記に説明したとおり、細胞を酵素中で、３７℃で１０分間インキュベーションした。Accutase（商標）およびTrypLE（商標）により、１０分間処理の後、細胞がプラスチックおよびMATRIGEL（商標）から浮き上がった。コラーゲナーゼは細胞を浮き上がらせなかった。そこで、細胞をさらに、３７℃で、全体で４５分間インキュベーションした。Accutase（商標）でさらなるフラスコを浮き上がらせた。その後、Improved Neubauer hemocytometerにより単細胞を計数した。
【０２１７】
その後、２ｍＬの２％Probuminを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２を、酵素インキュベーション後、各フラスコに加えた。フラスコの全量（〜４ｍＬ）を５〜１０回ピペッティングで上下させ、可能な限り多くの細胞が懸濁するようにした。その後、懸濁液を、５０ｍＬコニカルチューブに移し、２００×ｇで５分間遠心分離した。その後、１６μｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地に、細胞を再懸濁し、その後、１：３０MATRIGEL（商標）をプレコーティングしたＴ２５フラスコに、１：４の比率で蒔いた。
【０２１８】
培養４日後のAccutase（商標）継代細胞は、全部で５．６×１０６細胞（２２３，０００細胞／ｃｍ２）の密度であり、培養４日後のTrypLE（商標）継代細胞は、全部で５．０５×１０６細胞（２０２，０００細胞／ｃｍ２）の密度であり、培養４日後のコラーゲナーゼ継代細胞は、３．４５×１０６細胞（１３８，０００細胞／ｃｍ２）の密度であった。細胞を１：４比率で継代したならば、Accutase（商標）継代については、５８，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を蒔き、TrypLE（商標）継代については、５１，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を蒔き、３５，０００細胞／ｃｍ２であった。
【０２１９】
その後、１６ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補ったＭＥＦ馴化培地を毎日交換して、細胞をさらに６日間成長させた。コラーゲナーゼにより継代した細胞は、密で均質な細胞の大きなコロニーを形成し、分化した線維芽様細胞はあまり見られない。一方、Accutase（商標）またはTrypLE（商標）により継代した細胞は、ゆっくりと、成長を止める時点を超えて成長するか、または、分化中のｈＥＳ細胞から形成されたような線維芽様細胞を過剰成長させた（図１４）。
【０２２０】
これらの結果は、クラスター状の継代（コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ）を助けるような手動継代または酵素を用いた、支持細胞から支持細胞のない（MATRIGEL（商標））培養へと移行させる中間段階が、単細胞継代を開始する前に、細胞をMATRIGEL（商標）上の支持細胞のない培養に慣れさせるのに最も良いということを示唆している。
【０２２１】
本明細書全体を通じて引用された文献を、参照により、その全体を本願に組み入れる。実施例や好ましい実施態様を参照することにより、本発明の様々な態様を例示してきたが、本発明を、前述の記載により規定するものではなく、特許法の理念の下、適切に解釈された特許請求の範囲により規定するということが、よく理解されるだろう。
【０２２２】
〔実施の態様〕
なお、本願の実施態様は以下のとおりである。
（１）分化万能性幹細胞を分化させるための方法において、
（ａ）前記分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を分化させる工程と、
を含む、方法。
（２）実施態様（１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（５）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２３】
（６）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（７）実施態様（２）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（８）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（９）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（１０）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２４】
（１１）実施態様（３）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（１２）実施態様（１）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
（１３）実施態様（１２）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）である、方法。
（１４）実施態様（１３）に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
（１５）実施態様（１４）に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、１：１０希釈で用いられる、方法。
【０２２５】
（１６）実施態様（１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（１７）実施態様（１６）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
（１８）実施態様（１）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
（１９）分化万能性幹細胞を維持するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
（２０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２６】
（２１）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２２）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２３）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２４）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２５）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２２７】
（２６）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２７）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２８）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（２９）実施態様（２１）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【０２２８】
（３１）実施態様（３０）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
（３２）実施態様（３１）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
（３３）実施態様（３２）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
（３４）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（３５）実施態様（３４）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【０２２９】
（３６）実施態様（１９）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
（３７）分化万能性幹細胞を継代するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、
（ｅ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を放出する工程と、
（ｆ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
（３８）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（３９）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４０）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２３０】
（４１）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４２）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４３）実施態様（３８）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４４）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４５）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【０２３１】
（４６）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４７）実施態様（３９）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
（４８）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
（４９）実施態様（４８）に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
（５０）実施態様（４９）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【０２３２】
（５１）実施態様（５０）に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
（５２）実施態様（３７）に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
（５３）実施態様（５２）に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
（５４）実施態様（３７）に記載の方法において、
新しい組織培養基質上の単細胞の前記分化万能性幹細胞が、前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。
（５５）実施態様（３７）に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】ＭＥＦ馴化培地中１：３０のreduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｃｃｐ３３ヒトＥＳ細胞の４倍拡大図。
【図２】最終内胚葉を導くための分化処理後のＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合（％）。
【図３】膵臓内分泌分化プロトコルに１４日または１７日曝した後のリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析。
【図４】ＭＥＦ馴化培地中１：３０reduced growth factor MATRIGEL（商標）上で育てられたＨ９ｓｃｐ２２ヒトＥＳ単細胞の４倍拡大図。
【図５】ｈＥＳ細胞の分化万能性マーカー発現についてのＦＡＣＳによる評価。
【図６】クラスターとして３８回継代した後、単細胞として２０代継代したＨ９ｈＥＳ単細胞の染色体標本。
【図７】最終内胚葉分化の間のＨ９単細胞およびＨ９細胞クラスターの比較。
【図８】Ｈ９単細胞（２２代継代）を分化させた後の膵臓内胚葉マーカーにおける増加。
【図９】ｈＥＳ単細胞はＭＥＦ上で分化することができる。
【図１０】ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１８）は、９６ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。
【図１１】ｈＥＳ単細胞（Ｈ９ｓｃｐ１９）によるファーマコフォアスクリーニング。
【図１２】Ｈ９ｐ３３ｈＥＳ細胞クラスターおよびＨ９ｐ３３単細胞間のトランスフェクション効率の評価。
【図１３】ＭＥＦ上で育て、その後クラスターまたは単細胞としてMATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞の位相顕微鏡写真。
【図１４】ＭＥＦから単細胞として直接MATRIGEL（商標）へと継代したＨ１ｈＥＳ細胞は、自発的に分化する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化万能性幹細胞を分化させるための方法において、
（ａ）前記分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を分化させる工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【請求項１９】
分化万能性幹細胞を維持するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２８】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３０】
請求項１９に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
【請求項３４】
請求項１９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項３６】
請求項１９に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【請求項３７】
分化万能性幹細胞を継代するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、
（ｅ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を放出する工程と、
（ｆ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４５】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４６】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４７】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４８】
請求項３７に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
【請求項５２】
請求項３７に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項５４】
請求項３７に記載の方法において、
新しい組織培養基質上の単細胞の前記分化万能性幹細胞が、前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。
【請求項５５】
請求項３７に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【請求項１】
分化万能性幹細胞を分化させるための方法において、
（ａ）前記分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を分化させる工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、
前記MATRIGEL（商標）が、１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【請求項１９】
分化万能性幹細胞を維持するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２８】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３０】
請求項１９に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
【請求項３４】
請求項１９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項３６】
請求項１９に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【請求項３７】
分化万能性幹細胞を継代するための方法において、
（ａ）分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、
（ｂ）前記分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、
（ｃ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、
（ｄ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、
（ｅ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を放出する工程と、
（ｆ）単細胞の前記分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、
を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、トリプシン、TrypLE（商標）SELECT、TrypLE（商標）EXPRESS、およびトリプシン／ＥＤＴＡから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、２．５ｇ／Ｌの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約２分〜約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、酵素による約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、約１×〜約０．００１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４５】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、１×の濃度のTrypLE（商標）EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４６】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約２分〜約５分の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４７】
請求項３９に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、TrypLE（商標）EXPRESSによる約５分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。
【請求項４８】
請求項３７に記載の方法において、
前記組織培養基質が、MATRIGEL（商標）、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法において、
前記組織培養基質が、growth factor-reduced MATRIGEL（商標）である、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、約１：３０〜約１：１０希釈で用いられる、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、
前記growth factor-reduced MATRIGEL（商標）が、１：３０希釈で用いられる、方法。
【請求項５２】
請求項３７に記載の方法において、
前記分化万能性幹細胞が、胚性幹細胞である、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、
前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。
【請求項５４】
請求項３７に記載の方法において、
新しい組織培養基質上の単細胞の前記分化万能性幹細胞が、前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。
【請求項５５】
請求項３７に記載の方法において、
単細胞の前記分化万能性幹細胞が、その後分化する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５３２１７２（Ｐ２０１０−５３２１７２Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１５２２１（Ｐ２０１０−５１５２２１）
【出願日】平成２０年６月３０日（２００８．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８７８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００６３９９
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５９６１５９５００）ライフスキャン・インコーポレイテッド (100)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１０００ Ｇｉｂｒａｌｔａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０３５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月３０日（２００８．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８７８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００６３９９
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５９６１５９５００）ライフスキャン・インコーポレイテッド (100)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１０００ Ｇｉｂｒａｌｔａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０３５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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